ES3035568T3 - Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers - Google Patents

Abstract

Se describen variantes de enzimas alfa-amilasa para su uso en procesos industriales, como la licuefacción del almidón. Estas variantes presentan una mayor actividad específica, lo que permite una reducción más rápida de la viscosidad máxima durante los procesos de licuefacción. La alfa-amilasa se modifica introduciendo en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de alfa-amilasa parental de la Familia 13 una mutación en un residuo de aminoácido del surco de unión al almidón; dicho surco está formado por residuos de aminoácidos en la hélice alfa que precede a la primera cadena beta del dominio A, el bucle entre la sexta hélice alfa y la séptima cadena beta del dominio A, el bucle entre la séptima hélice alfa y la octava cadena beta del dominio A, y el bucle que conecta el dominio A con el dominio C; y la mutación altera la unión del almidón al polipéptido de alfa-amilasa variante en comparación con el polipéptido de alfa-amilasa parental. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Alfa amilasas variantes con actividad potenciada sobre polímeros de almidón

Campo técnico

Se describen composiciones y métodos que se refieren a enzimas a-amilasa variantes para su uso en procesos industriales, tales como licuación del almidón. Las variantes de a-amilasa tienen actividad específica aumentada que permite reducir más rápidamente la viscosidad de pico durante los procesos de licuación.

Antecedentes

Las a-amilasas se usan en una diversidad de procesos industriales y comerciales, incluyendo la licuación del almidón, el desencolado de textiles, la preparación de alimentos, la limpieza de ropa y el lavado de vajilla. En dichas aplicaciones, las a-amilasas pueden descomponer el almidón para liberar carbohidratos más pequeños. Sin embargo, los haces de almidón pueden ser resistentes a la hidrólisis por a-amilasas porque los polímeros organizados del almidón excluyen las enzimas. Como resultado, usar una a-amilasa con actividad específica aumentada solo se mejora marginalmente la hidrólisis del almidón porque no se aborda el problema de la accesibilidad. Existe la necesidad de a-amilasas que sean más eficaces en acceder a los polímeros de almidón en los haces de almidón.

El documento US7498158B2 describe variantes de alfa-amilasas similares a Termamyl con propiedades alteradas en comparación con la original.

El documento US2011/0033882A1 describe variantes de la alfa amilasa de B. licheniformis con una función enzimática mejorada en comparación con la original.

Sumario

La invención proporciona métodos para producir polipéptidos de a-amilasa variantes, como se define por las reivindicaciones. Los aspectos y realizaciones de la presente invención se resumen en los siguientes párrafos numerados por separado.

1. En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un polipéptido de a-amilasa variante, que comprende:

introducir en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido original de a-amilasa de la familia 13 una mutación en un residuo aminoacídico del surco de unión al almidón;

en donde el surco de unión al almidón corresponde a los residuos aminoacídicos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249 257, 278-282, 309-320, 354-359, 391 y 395-402, en referencia a SEQ ID NO: 2 para la numeración;

en donde el original tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2; y en donde la mutación altera la unión del almidón al polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original y aumenta la estabilidad térmica, aumenta la estabilidad al pH y/o aumenta la estabilidad en detergente del polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original.

2. En algunas realizaciones del método del párrafo 1, el original tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

3. En algunas realizaciones del método del párrafo 1 o 2, la variante tiene al menos un 60 %, al menos un 65 % o al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

4. En algunas realizaciones del método de uno cualquiera de los párrafos precedentes, la variante presenta una licuación del almidón, una sacarificación del almidón o un rendimiento de limpieza mejorados en comparación con el original.

5. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una mutación en un residuo aminoacídico en el surco de unión al almidón de un polipéptido original de a-amilasa de la familia 13 para producir un polipéptido de aamilasa variante con (i) unión alterada a los haces de almidón en comparación con la a-amilasa original, y (ii) estabilidad térmica aumentada, estabilidad al pH y/o estabilidad en detergente aumentada en comparación con la a-amilasa original,

en donde el surco de unión al almidón corresponde a los residuos aminoacídicos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249 257, 278-282, 309-320, 354-359, 391 y 395-402, en referencia a SEQ ID NO: 2 para la numeración;

en donde el original tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

6. En algunas realizaciones del uso del párrafo 5, el original tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

7. En algunas realizaciones del uso del párrafo 5 o 6, la variante tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

8. En algunas realizaciones del uso del párrafo 5 a 7, la mutación aumenta la estabilidad térmica, aumenta la estabilidad al pH y/o aumenta la estabilidad en detergente del polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original.

9. En algunas realizaciones del uso del párrafo 5 a 8, la variante presenta una licuación del almidón, una sacarificación del almidón o rendimiento de limpieza mejorados en comparación con el original.

Estos aspectos y realizaciones de la presente invención se describen a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un modelo de cintas de la amilasa manipulada derivada de Pyrococcus woesei, que muestra la ubicación de una ciclodextrina unida.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos y la ubicación de las características de estructura secundaria en la amilasa manipulada de P. woesei.

La figura 3 es una alineación de varias a-amilasas de la familia 13 [a-amilasa de Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus, a-amilasa de Bacillus licheniformis(LAT) y a-amilasa de Cytophaga sp. (AAF00561.1, GI n.° 6006681)] realizada usando Clustal W con los parámetros por defecto.

La figura 4 es una estructura en bastones de la amilasa de B. stearothermophilus (AmyS) que muestra los residuos del surco en el lado izquierdo de la molécula resaltados como bastones en negrita. La región de unión al sustrato (es decir, hendidura del sitio activo) está en el lado derecho de la molécula.

La figura 5 es una estructura en bastones de la amilasa de B. stearothermophilus (AmyS) mirando hacia abajo en el surco, con los residuos que forman el surco resaltados como bastones en negrita.

La figura 6 es un histograma que muestra la distribución de los valores de PI para la actividad de todas las variantes SEL que tienen un PI para la expresión >0,3.

La figura 7 es un histograma que muestra la distribución de valores de PI para la actividad de las variantes SEL que tienen sustituciones solo en posiciones del surco y que tienen un PI para la expresión >0,3.

Las figuras 8A y 8B son una tabla que muestra los resultados del cribado de variantes individuales obtenidas de la colección SEL usando un sustrato de amilosa.

Las figuras 9A y 9B son una tabla que muestra los resultados del cribado de variantes individuales obtenidas de la colección SEL usando un sustrato de amilopectina.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la amilasa de Pyrococcus woesei.

SEQ ID NO: 2 expone la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la a-amilasa de Bacillus licheniformis (LAT). SEQ ID NO: 3 expone la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la a-amilasa de Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus.

SEQ ID NO: 4 expone la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la a-amilasa de Cytophaga sp. (AAF00561.1, GI n.26006681).

SEQ ID NO: 5 expone la secuencia de aminoácidos de la forma madura de una amilasa variante de P. woesei, uPWA. Descripción detallada

1. Introducción

La presente invención se refiere a polipéptidos de a-amilasa variantes que comprenden mutaciones en un surco de unión al almidón recientemente descubierto situado en el sitio opuesto de la molécula con respecto al sitio de unión al sustrato. Las mutaciones en el surco de unión al almidón alteran la unión de los polipéptidos de a-amilasa variantes a los haces de almidón, alterando de este modo el rendimiento de las moléculas en términos de, por ejemplo, actividad, estabilidad térmica, estabilidad al pH, estabilidad en detergentes, dependencia del calcio y similares.

Estos y otros aspectos de la invención se describen en detalle a continuación.

2. Definiciones y abreviaturas

De acuerdo con la presente descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe señalar que las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de dichas enzimas, y la referencia a "la dosificación" incluye la referencia a una o más dosificaciones y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, etc.

El presente documento está organizado en varias secciones para facilitar su lectura; sin embargo, el lector apreciará que las afirmaciones realizadas en una sección pueden aplicarse a otras secciones. De esta forma, los encabezados usados para las diferentes secciones de la divulgación no deberán interpretarse como limitantes.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos normalmente por los expertos en la materia. Las siguientes abreviaturas y/o términos se definen para mayor claridad:

2.1 Abreviaturas/acrónimos

Las siguientes abreviaturas/acrónimos tienen los siguientes significados salvo que se indique lo contrario:

ADNc ADN complementario

ADN ácido desoxirribonucleico

EC comisión de enzimas

EDTA ácido etilendiaminatetraacético

GA glucoamilasa

IPTG isopropil-p-D-tiogalactósido

kDa kilodalton

LAT amilasa de B. licheniformis

MW peso molecular

MWU unidad Wohlgemuth modificada; 1,6x10-5 mg/MWU = unidad de actividad

NOBS nonanoiloxibencenosulfonato

NTA ácido nitriloacético

PEG polietilenglicol

pI punto isoeléctrico

PVA poli(alcohol vinílico)

PVP poli(vinilpirrolidona)

ARN ácido ribonucleico

SAS alcanosulfonato

SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

sp.especie

p/v peso/volumen

p/p peso/peso

v/v volumen/volumen

% en peso porcentaje en peso

°C grados Celsius

H<2>O agua

dH<2>O o DI agua desionizada

dIH<2>O agua desionizada, filtración Milli-Q

g gramos

pg microgramos

mg miligramos

kg kilogramos

pl microlitros

ml mililitros

mm milímetros

Á angstromios

pm micrómetros

M molar

mM milimolar

pM micromolar

U unidades

s segundos

Min minuto/minutos

h hora/horas

Ncm Newton centímetro

ETOH etanol

eq. equivalentes

N normal

ds o DS contenido de sólidos secos

uPWA a-amilasa variante derivada de Pyrococcus woesei

PWA a-amilasa de Pyrococcus woesei

MWCO límite de peso molecular

SSRL fuente de luz de radiación sincrotrón de Stanford

PDB base de datos de proteínas

CAZy base de datos de enzimas activas en carbohidratos

Tris-HCl clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano

HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico

2.2 Definiciones

Los términos "amilasa" o "enzima amilolítica" se refieren a una enzima que puede, entre otras cosas, catalizar la degradación del almidón. Las a-amilasas son hidrolasas que escinden los enlaces a-D-(1^-4) O-glucosídicos en el almidón. Generalmente, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D-(1^-4)-glucano glucanohidrolasa) se definen como enzimas endoactivas que escinden enlaces a-D -(1^4) O-glucosídicos dentro de la molécula de almidón de forma aleatoria produciendo polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa con enlaces (1-4)-a. Por el contrario, las enzimas amilolíticas exoactivas, tales como las p-amilasas (EC 3.2.1.2; a-D-(1-4)-glucano maltohidrolasa) y algunas amilasas específicas de producto como la a-amilasa maltógena (EC 3.2.1.133) escinden la molécula de polisacárido desde el extremo no reductor del sustrato. Las p-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; a-D-glucósido glucohidrolasa), glucoamilasa (EC 3.2.1.3; a-D-(1^4)-glucano glucohidrolasa) y amilasas específicas de producto como las maltotetraosidasas (EC 3.2.1.60) y las maltohexaosidasas (EC 3.2.1.98) pueden producir maltooligosacáridos de una longitud específica. Algunas a-amilasas bacterianas producen predominantemente maltotetraosa (G4), maltopentaosa (G5) o maltohexaosa (G6) a partir de almidón y a-1,4-glucanos relacionados, mientras que la mayoría de las a-amilasas los convierten además en glucosa y/o maltosa como productos finales. Para los propósitos de las presentes composiciones y métodos, no se hace distinción entre las a-amilasas verdaderas, de acción endo, y las amilasas G4, G5, G6 y similares.

La expresión "amilasa similar a la familia 13" se refiere a cualquier amilasa clasificada como amilasa de la familia 13 CAZy, que tenga al menos un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 -5, y/o descrita hasta ahora como "similar a Termamyl". La expresión "amilasa de la familia 13" se refiere a cualquier amilasa clasificada como amilasa de la familia 13 CAZy.

La expresión "amilasa que tiene el plegamiento de la amilasa de Bacillus sp." se refiere a cualquier amilasa que tenga una estructura que sea sustancialmente superponible a SEQ ID NO: 2 o 3.

La expresión "similar a Termamyl" es como se usa en diversas solicitudes de patente y patentes publicadas.

Como se usa en este documento, el término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto por carbohidratos de polisacárido complejos de plantas, compuesto por amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H1üO5)x, en donde X puede ser cualquier número. El término incluye materiales de origen vegetal tales como cereales, hierbas, tubérculos y raíces, y más específicamente materiales obtenidos de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, mandioca, mijo, patata, boniato y tapioca.

El término "haz de almidón" se refiere a una forma de almidón en la que los polímeros de almidón individuales se disponen, por ejemplo, por gelatinización seguida de retrogradación, de modo que son resistentes a la hidrólisis enzimática por las enzimas a-amilasa. En algunos casos, los polímeros de los haces de almidón son paralelos (decir es, están alineados), lo que impide el acceso de las enzimas.

El término "amilosa" se refiere a un sustrato de almidón no ramificado que consiste en residuos de glucosa en enlaces a-1,4.

El término "amilopectina" se refiere a un sustrato de almidón ramificado que consiste en enlaces a-1,6 y enlaces a-1,4.

Los términos "de tipo silvestre", "original" o "de referencia" con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido de origen natural que no incluye ninguna sustitución, inserción o eliminación artificial en una o más posiciones aminoacídicas. De forma similar, los términos "de tipo silvestre", "original" o "de referencia" con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido de origen natural que no incluye un cambio nucleosídico artificial. Sin embargo, cabe señalar que un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo silvestre, original o de referencia no se limita a un polinucleótido que de origen natural y abarca cualquier polinucleótido que codifique el polipéptido de tipo silvestre, original o de referencia. Las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden realizarse mediante "barajado".

La expresión "uno o varios" significa menos de 10.

El término "variante", con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de tipo silvestre, original o de referencia especificado en que incluye una sustitución, inserción o eliminación artificial en una o más posiciones aminoacídicas. De forma similar, el término "variante", con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de tipo silvestre, original o de referencia específico. La identidad del polipéptido o polinucleótido de tipo silvestre, original o de referencia será evidente a partir del contexto. Las variantes pueden realizarse mediante "barajado".

El término "recombinante", cuando se usa en referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector en cuestión, indica que el sujeto ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína natural, o que la célula deriva de una célula así modificada. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula, o expresan genes naturales en niveles diferentes o en condiciones diferentes a las que se encuentran en la naturaleza.

Los términos "recuperado", "aislado" y "separado" se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente específico que se retira de al menos otro material o componente con el que está asociado de forma natural como se encuentra en la naturaleza.

Como se usa en este documento, el término "purificado" se refiere a material (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislado) que está en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90 % puro, al menos aproximadamente un 95 % puro, al menos aproximadamente un 98 % puro o incluso al menos aproximadamente un 99 % puro.

Los términos "estabilidad potenciada" o "estabilidad aumentada" en el contexto de un entorno oxidante, la presencia de quelantes, la presencia de detergentes, la exposición a temperaturas elevadas y/o la exposición a pH extremos, significan que una amilasa en cuestión conserva más actividad amilolítica a lo largo del tiempo en comparación con otra amilasa (es decir, de referencia).

Los términos "termoestable" y "termoestabilidad", en referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima de conservar la actividad después de la exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como una enzima amilasa, se mide por su semivida (t<1>/<2>) dada en minutos, horas o días, durante la que se pierde la mitad de la actividad enzimática en condiciones definidas. La semivida puede calcularse midiendo la actividad amilasa residual después de la exposición a (es decir, sobrecarga por) una temperatura elevada.

Un "intervalo de pH", en referencia a una enzima, se refiere al intervalo de valores de pH en los que la enzima presenta actividad catalítica.

Como se usa en este documento, los términos "estable al pH" y "estabilidad al pH", en referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima de conservar la actividad en un amplio intervalo de valores de pH durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 15 min, 30 min, 1 hora).

Como se usa en este documento, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo de los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido", y se usan indistintamente. Cuando dichas secuencias de aminoácidos presentan actividad, pueden denominarse "enzima". Se usan los códigos convencionales de una letra o tres letras para los residuos aminoacídicos, presentándose las secuencias de aminoácidos en la orientación convencional del extremo amínico al carboxílico (es decir, N ^C ).

El término "ácido nucleico" abarca ADN, ARN, estructuras heterobicatenarias y moléculas sintéticas que pueden codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden ser modificaciones químicas. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente. Dado que el código genético está degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un aminoácido particular, y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos particular. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico se presentan en orientación 5' a 3'.

El término "homólogo" se refiere a una entidad que tiene un grado específico de identidad con las secuencias de aminoácidos en cuestión y las secuencias de nucleótidos en cuestión. Se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % idéntica a la secuencia en cuestión, usando Clustal W (Thompson J.D. etal. (1994) Nucleic Acids Res.

22:4673-4680) con los parámetros por defecto, es decir:

El término "hibridación" se refiere al proceso por el que una hebra de ácido nucleico forma pares de bases con una hebra complementaria, tal como sucede durante las técnicas de hibridación por transferencia y las técnicas de PCR. Las condiciones de hibridación rigurosas se ejemplifican por las siguientes: 65 °C y 0,1X SSC (donde 1X SSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na30,015 M, pH 7,0).

El término "sacarificación" se refiere a la conversión enzimática del almidón en glucosa.

El término "licuación" se refiere a la fase de la conversión del almidón en la que el almidón gelatinizado se hidroliza para dar dextrinas solubles de bajo peso molecular. El término "grado de polimerización" (DP) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido dado. Ejemplos de DP1 son los monosacáridos glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. Para los propósitos de este documento, los "procesos de licuación comparables" son los que se llevan a cabo en condiciones comparables, preferiblemente condiciones normalizadas en cuanto a temperatura, pH, concentración de sustrato, concentración de iones calcio y similares. Preferiblemente, los procesos de licuación comparables se comparan a igualdad de proteínas o igualdad de unidades de actividad, sin embargo, en algunas realizaciones, las proteínas, o las unidades de actividad o ambas pueden variar en los procesos de licuación comparables. El experto en la materia entenderá las bases sobre las que los procesos de licuación pueden ser "comparables".

Durante los procesos de licuación, la viscosidad de la pasta de almidón se usa frecuentemente como medida de la conversión del almidón en unidades de DP más pequeñas. A veces se usa en este documento la expresión "viscosidad inicial". El experto en la materia apreciará que se trata de un término de la técnica, y que lo que se pretende no es literalmente la viscosidad inicial, sino más bien la viscosidad de pico que se produce, por ejemplo, alrededor del punto de gelatinización del sustrato. La viscosidad inicial se usa para distinguirla de la "viscosidad final", que es la viscosidad de un sustrato, por ejemplo, una pasta de almidón, al concluir un proceso de licuación. Por tanto, como resulta evidente al observar un gráfico de la viscosidad a lo largo del curso temporal de un proceso de licuación, la viscosidad inicial o de pico se produce no inmediatamente, sino tras un determinado paso de tiempo, por ejemplo, menos de un 50 % del tiempo total, y más preferiblemente dentro de aproximadamente el primer 1/3 o incluso 1/4 o 1/5 del tiempo total de licuación. Por ejemplo, en una licuación ejemplificada en este documento, la viscosidad de pico se produce típicamente en los primeros diez minutos, tras los que se añade la enzima y la viscosidad comienza a descender. A medida que los gránulos de almidón se abren durante el proceso de gelatinización, el interior de los gránulos se vuelve más accesible a la actividad amilasa y se produce una mayor escisión, lo que da lugar a un descenso de la viscosidad.

El término "contenido de sólidos secos" (ds) se refiere a la cantidad total de sólidos en una suspensión, en una base de peso seco. El contenido de sólidos secos y la base de peso seco se expresan habitualmente como el peso del material en cuestión como un porcentaje del peso del material seco total. El término "suspensión" se refiere a una mezcla que contiene sólidos insolubles en un líquido, típicamente agua o un disolvente similar. Con frecuencia, el almidón o la harina se suspende en una solución a base de agua para formar una suspensión para ensayar las amilasas o para procesos de licuación.

El término "equivalente de dextrosa" o "DE" se define como el porcentaje de glúcido reductor como una fracción del total de carbohidratos. El término "grado de polimerización" o "DP" se refiere al tamaño de los productos de la degradación del almidón por la amilasa. Cuanto mayor sea el DP, más complejo será el carbohidrato.

El término "mezcla" o "mezcla enzimática" se refiere a una composición que comprende una mezcla de dos o más enzimas que proporciona, por lo tanto, una actividad catalítica combinada que conlleva la actividad de cada una de las enzimas presentes en la mezcla. No es necesario que las mezclas enzimáticas tengan cantidades iguales de cada una de las dos o más enzimas, sino que las mezclas enzimáticas pueden formularse a igualdad de proteínas, o a igualdad de actividad, si se desea. La actividad catalítica combinada puede ser meramente aditiva o promediada, o puede ser antagónica o sinérgica. Las mezclas preferidas para su uso en este documento proporcionan al menos actividad catalítica aditiva y, más preferiblemente, efectos catalíticos sinérgicos.

Para los propósitos de este documento, un "proceso de licuación comparable" significa un proceso similar realizado en condiciones controladas y especificadas (por ejemplo, con respecto a la temperatura, el pH, la concentración de iones calcio y la concentración de sustrato) usando una amilasa diferente o "de control", y que puede compararse con un proceso de licuación en cuestión.

Como se usa en este documento, una "unidad de alfa amilasa (AAU)" es la cantidad de actividad alfa amilasa bacteriana necesaria para hidrolizar 10 mg de almidón por minuto en condiciones especificadas.

Como se usa en este documento, los términos "transformado", "transformado de manera estable" y "transgénico" usados en referencia a una célula, significan que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no natural (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o portada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección", "transformación" o "transducción", como se conoce en la técnica.

Una "cepa hospedadora" o "célula hospedadora" es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus u otra construcción de ADN, incluyendo un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, una amilasa). Cepas hospedadoras ejemplares son células bacterianas. El término "célula hospedadora" incluye protoplastos creados a partir de células, tales como las de Bacillus sp.

El término "heterólogo", en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no se encuentra de forma natural en una célula hospedadora.

El término "endógeno", en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que se produce de forma natural en la célula hospedadora.

Como se usa en este documento, el término "expresión" se refiere al proceso por el que se produce un polipéptido basándose en una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

Un "marcador selectivo" o "marcador de selección" se refiere a un gen que puede expresarse en un hospedador para facilitar la selección de células hospedadoras que portan el gen. Ejemplos de marcadores de selección incluyen, aunque sin limitación, antimicrobianos (por ejemplo, higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutritiva, a la célula hospedadora.

Un "vector" se refiere a una secuencia polinucleotídica diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas fágicas, casetes y similares.

Un "vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia codificante está unida de forma funcional a una secuencia de control adecuada que puede lograr la expresión del ADN en un hospedador adecuado. Dichas secuencias de control pueden incluir un promotor para lograr la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión de ribosomas adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.

El término "unido de forma funcional" significa que los componentes específicos se encuentran en una relación (que incluye, aunque sin limitación, la yuxtaposición) que les permite funcionar de una forma prevista. Por ejemplo, una secuencia reguladora está unida de forma funcional a una secuencia codificante si la expresión de la secuencia codificante está bajo el control de las secuencias reguladoras.

Una "secuencia señal" es una secuencia de aminoácidos fijada a la parte aminoterminal de una proteína, lo que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de una proteína extracelular carece de la secuencia señal, que se escinde durante el proceso de secreción.

Como se usa en este documento, "biológicamente activo" se refiere a una secuencia que tiene una actividad biológica específica, tal como una actividad enzimática.

Como se usa en este documento, "un material celular cultivado que comprende un polipéptido de a-amilasa" o expresiones similares, se refiere a un lisado o sobrenadante celular (incluyendo el medio) que incluye una a-amilasa como componente. El material celular preferiblemente es de un hospedador heterólogo que se cultiva en cultivo con el propósito de producir el polipéptido de a-amilasa.

3. Identificación de un nuevo sitio de unión al almidón en una a-amilasa

En referencia a los ejemplos adjuntos, se determinó la estructura tridimensional de una a-amilasa variante manipulada de la arquea hipertermófila, Pyrococcus woesei, a una resolución de 2 Á (figuras 1 y 2). Inesperadamente, se encontró una molécula de ciclodextrina asociada a la enzima en los cristales (figura 1). La ciclodextrina no formaba parte del medio de cristalización, lo que sugiere que la ciclodextrina se unió a la molécula durante la expresión o la purificación, y permaneció con la molécula durante la cristalización. La molécula de ciclodextrina no estaba asociada con el sitio de unión al sustrato. En su lugar, estaba unida en un surco situado en el lado opuesto de la molécula al sitio de unión al sustrato.

De forma destacable, varias mutaciones en la a-amilasa de P. woesei variante (es decir, D358Y, S359G, R360D, R361K y P372S) se encuentran cerca de la ciclodextrina unida, lo que sugiere que las mutaciones en estas posiciones modulan la unión. Los residuos adyacentes a menos de 5 Á del uno o más átomos de la ciclodextrina unida que se esperaría que modularan esta unión incluyen Gln7, Lys8, Gly9, Lys241, Pro278, Phe279, Glu307, Gly308, Gln309, Gly338, Gly339, Ser340, Arg355 y Tyr358. Residuos adicionales que forman el surco de unión al almidón incluyen los residuos Ser4, Glu5, Tyr236, Gln268, Ser275, Arg276, Asp277, Lys280, Tyr306, Glu334, Thr341, Asp342, Ile343, Asn356, Asp360 y Lys361.

4. a-amilasas variantes con mutaciones en el surco de unión al almidón

Sin limitarse a teoría alguna, las presentes composiciones y métodos se basan en la hipótesis de que, en la estructura tridimensional descrita anteriormente, la ciclodextrina imita un haz helicoidal de almidón, al que es ventajoso que se una la a-amilasa. La presencia de la región de unión al almidón permite a la amilasa asociarse a un haz de almidón, y quizá incluso deslizarse a lo largo del haz de almidón, hasta ubicaciones alteradas donde la enzima puede hidrolizar cadenas de almidón, que se unen al sitio canónico de unión al sustrato. La capacidad de deslizarse hacia las regiones que favorecen la hidrólisis reduciría la libertad difusional de la difusión tridimensional en solución a la difusión unidimensional a lo largo de las moléculas de almidón. Esto potenciaría la procesividad de la molécula para hidrolizar el almidón, como se evidenciaría en una hidrólisis mejorada del almidón. La unión del almidón por medio del surco puede incluso promover la alteración de un haz de almidón, aumentando de se modo la hidrólisis. Además, la unión del almidón por medio del surco puede conferir estabilidad a la a-amilasa, lo que puede evidenciarse por, por ejemplo, una estabilidad térmica aumentada, una estabilidad al pH aumentada, una estabilidad en detergentes aumentada, una dependencia del calcio disminuida, y similares.

Las estructuras tridimensionales de las amilasas de la familia 13 de la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy) están muy conservadas, consistiendo en tres dominios (véase, por ejemplo, Henrissat, B. (1991) Biochem. J. 280:309-316; Henrissat, B. y Bairoch, A. (1996) Biochem. J. 316:695-696; Henrissat, B. y Davies, G. (1997) Curr. Opin. Biotech. 7:637-644; Nagano, N. et al. (2001) Protein Eng. 14:845-855; Pujadas, G. y Palau, J. (2001) Mol. Biol. Evol. 18:38-54; documento WO 94/02597). En referencia a la figura 2, el dominio A es una estructura en barril TIM en el extremo N del polipéptido. El dominio B es una región de bucle grande entre la tercera hebra p (pA3) y la tercera hélice a (aA<3>) del dominio A. El dominio C incluye el extremo C del polipéptido. Las amilasas de Bacillus licheniformis (AmyL), Bacillus stearothermophilus(AmyS) y Cytophaga sp. son miembros de esta familia. En la figura 3 se muestra una alineación de estas amilasas. Las estructuras de estas amilasas están ejemplificadas por las entradas 1 hxv y 1 bli, respectivamente, en el Banco de Datos de Proteínas, que muestran características de surco aún más pronunciadas localizadas en las regiones correspondientes en estas moléculas.

En cada una de estas enzimas, hay aproximadamente 44 residuos homólogos que forman el surco de unión al almidón. Estos residuos se encuentran en la hélice a corta que precede a la primera hebra p en el dominio A, el bucle entre la sexta hélice a y la séptima hebra p en el dominio A, el bucle entre la séptima hélice a y la octava hebra p en el dominio A, y el bucle que conecta el dominio A y el dominio C. En una amilasa de P. woesei variante, estos residuos corresponden a los residuos Gln7, Lys8, Gly9, Lys241, Pro278, Phe279, Glu307, Gly308, Gln309, Gly338, Gly339, Ser340, Arg355 y Tyr358. Residuos adicionales que forman el surco de unión al almidón incluyen los residuos Ser4, Glu5, Tyr236, Gln268, Ser275, Arg276, Asp277, Lys280, Tyr306, Glu334, Thr341, Asp342, Ile343, Asn 356, Asp360 y Lys361 (en referencia a SEQ ID NO: 5 para la numeración). En la amilasa de B. licheniformis, estos residuos corresponden a los residuos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249-257, 278-282, 309-320, 354-359, 391 y 395-402 (en referencia a SEQ ID NO: 2 para la numeración). En la amilasa de B. stearothermophilus, estos residuos corresponden a los residuos 1-6, 37, 39, 92-98, 227-229, 252-260, 281-285, 312-323, 357-362, 391 y 395-402 (en referencia a SEQ ID NO: 3 para la numeración). En la amilasa de Cytophaga sp., estos residuos corresponden a los residuos 1-4, 36, 38, 91-97, 226-228, 251-259, 280-284, 311-322, 356-361,363, 391 y 395-402 (en referencia a SEQ ID NO: 4).

En algunas realizaciones, las presentes variantes tienen una o más sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 92, 251, 254, 256, 317, 318, 320 y 321 en SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, las variantes incluyen la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a R251y/o K256 en SEQ ID NO: 4 con un residuo aminoacídico menos positivo. En algunas realizaciones, las presentes variantes incluyen la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 92 en SEQ ID NO: 4 con L, la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 251 en SEQ ID NO: 4 con A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T o W, la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 254 en SEQ ID NO: 4 con H, K, W o Y, la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 256 en SEQ ID NO: 4 con A, E, T o V, la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 317 en SEQ ID NO: 4 con C o R, la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 318 en SEQ ID NO: 4 con A, F, H, K, Q o R, la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 320 en SEQ ID NO: 4 con A, H, M, N o P, y/o la sustitución del residuo de tipo silvestre en una posición correspondiente a la posición 321 en SEQ ID NO: 4 con D, G, I o T

En algunas realizaciones, las presentes variantes incluyen las sustituciones particulares correspondientes a S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T, o R251W, T254H, T254K, T254W, o T254Y, K256A, K256E, K256T, o K256V, S317C o S317R, N318A N318F, N318H, N318K, N318Q, o N318R, T320A, T320H, T320M, T320N, o T320P, y/o K321 D, K321G, K3211 o K321T, todos en referencia a SEQ ID NO: 4

En algunas realizaciones, las presentes variantes no incluyen sustituciones de los residuos aminoacídicos de tipo silvestre en una o más posiciones correspondientes a N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y D403 en SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, las presentes variantes no incluyen sustituciones de los residuos aminoacídicos de tipo silvestre en una o más posiciones correspondientes a N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399 y Q401 en SEQ ID NO: 4.

En algunas realizaciones, las presentes variantes incluyen uno o más de los siguientes residuos en las siguientes posiciones correspondientes a SEQ ID NO: 4: N en la posición 88, A en la posición 252, A en la posición 253, N en la posición 308, A en la posición 316, S en la posición 357, T en la posición 400, R en la posición 402 y D en la posición 403 en SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, las presentes variantes incluyen todos los residuos mencionados anteriormente en las posiciones indicadas. En algunas realizaciones, las presentes variantes incluyen uno o más de los siguientes residuos en las siguientes posiciones correspondientes a SEQ ID NO: 4: N en la posición 4, G en la posición 5, T en la posición 38, N en la posición 93, G en la posición 94, I en la posición 95, Q en la posición 96, V en la posición 97, Y en la posición 230, G en la posición 255, V en la posición 315, P en la posición 319, A en la posición 322, L en la posición 354, T en la posición 355, R en la posición 356, G en la posición 359, Y en la posición 396, A en la posición 397, Y en la posición 398, G en la posición 399 y Q en la posición 401 en SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, las presentes variantes incluyen todos los residuos mencionados anteriormente en las posiciones indicadas.

Las posiciones correspondientes en otras amilasas pueden determinarse mediante alineación de secuencias de aminoácidos. Las figuras 4 y 5 ilustran la ubicación del surco en la amilasa de B. stearothermophilus. Los residuos homólogos en otras amilasas pueden determinarse mediante alineación estructural, o mediante alineación de la estructura primaria, como se ilustra en la figura 6.

Amilasa de P. woeseivariante, uPWA (SEQ ID NO: 5)

AKYSELEKGG VIMQAFYWDV PSGGIWWDTI RQKIPEWYDA G IS A IW IP P A

SKGMGGAYSM GYDPYDFFDL GEYDQKGTVE TRFGSKQELV NMINTAHAYG

MKVIADIVIKT HRAGGDLEWN PFVNDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE

LHAGDSGTFG GYPDICHDKS WDQYWLWASQ ESYAAYLRSI GIDAWRFDYV

KGYAPWWKD WLNWWGGWAV GEYWDTNVDA VLNWAYSSGA KVFDFALYYK

MDEAFDNKNI PALVSALQNG Q TW SR D PFK AVTFVANHDT DIIWNKYPAY

AFTTiTYFGQP TTFYRDYEEW T.NKDKT.KNLT WTHFNTAGGS TDTVYYDNDF

LIFVRNGYGD K PG LITY IN L GSSKAGRWVY VPKFAGACIH EYTGNLGGWV

DKYVYSSGWV YLEAPAYDPA NGQYGYSVWS YCGVG

a-Amilasa de Bacillus licheniformis (LAT; SEQ ID NO: 2):

ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS

QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD

WINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH FHFPGRGSTY

SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD

IDYDHPDVAA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHYRE KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG GYDMRKLLNG TW SK HPLK S VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL K H K IEPILK A RKQYAYGAQH DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVWGGSVSIY VQR

Amilasa de Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus (SEQ ID NO: 3):

AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DWFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGNYDYLM YADLDMDHPE WTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FS FFPDWLSY VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT DGTMSLFDAP LHNKFYTASK SGGAFDMRTL MTNILMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA YAFILTRQEG YPCVFYGDYY G IP Q Y N IP S L K S K ID P L L IA RRDYAYGTQH DYLDHSDIIG WTREGGTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPR

a-Amilasa de Cytophaga sp. (AAF00567.1, GI n.° 6006681; SEQ ID NO: 4):

AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD WMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSRIFKFRGT GKAWDWEVSS ENGNYDYLMY ADIDYDHPDV VNEMKKWGVW YANEVGLDGY RLDAVKHIKF S FLKDWVDNA RAATGKEMFT VGEYWQNDLG ALNNYLAKVN YNQSLFDAPL HYNFYAASTG GGYYDMRNIL NNTLVASNPT KAVTLVENHD TQPGQSLEST VQPWFKPLAY AFILTRSGGY PSVFYGDMYG TKGTTTREIP A LK SK IEPLL KARKDYAYGT QRDYIDNPDV IGWTREGDST KAKSGLATVI TDGPGGSKRM YVGTSNAGEI WYDLTGNRTD KITIGSDGYA TFPVNGGSVS VWVQQ

De acuerdo con la presente invención, uno o más de los residuos en los motivos de estructura secundaria mencionados anteriormente, o uno o más de los residuos aminoacídicos mencionados anteriormente, o los residuos correspondientes en otra a-amilasa similar a la familia 13 se mutan con el efecto de alterar la interacción entre el surco de unión al almidón y los haces de almidón, y aumentar la estabilidad térmica, la estabilidad al pH y/o la estabilidad en detergentes del polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original, como se expone en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, se muta un solo residuo. En otras realizaciones, se mutan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43 o incluso 44 residuos. En algunas realizaciones, uno o más de los residuos en los motivos de estructura secundaria mencionados anteriormente, o uno o más de los residuos aminoacídicos mencionados anteriormente, o los residuos correspondientes en otra a-amilasa similar a la familia 13, no se mutan expresamente, mientras que se muta uno o más residuos. En algunas realizaciones, uno o varios de los residuos en los motivos de estructura secundaria mencionados anteriormente, o uno o varios de los residuos aminoacídicos mencionados anteriormente, o los residuos correspondientes en otra a-amilasa similar a la familia 13, no se mutan expresamente, mientras que se muta uno o varios residuos.

En algunas realizaciones, las mutaciones son sustituciones de los residuos aminoacídicos presentes en la amilasa original por residuos aminoacídicos diferentes. En algunas realizaciones, las mutaciones son eliminaciones de los residuos aminoacídicos presentes en la amilasa original, cambiando de ese modo los residuos aminoacídicos en el surco que interactúan con los haces de almidón. En algunas realizaciones, las mutaciones son inserciones de los residuos aminoacídicos presentes en la amilasa original, cambiando de ese modo los residuos aminoacídicos en el surco que interactúan con los haces de almidón.

En algunas realizaciones, las mutaciones aumentan la unión de una a-amilasa similar a la familia 13 a los haces de almidón, por ejemplo, aumentando las interacciones moleculares entre los residuos del surco de unión al almidón con los haces de almidón. Se espera que dichas mutaciones restrinjan la difusión de la amilasa y mejoren la procesividad, aunque también pueden aumentar la estabilidad térmica, la estabilidad al pH o la estabilidad en detergentes, así como disminuir la dependencia del calcio.

En algunas realizaciones, la presente amilasa es una amilasa de la familia 13 CAZy, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la presente amilasa tiene el plegamiento de la amilasa de Bacillus sp. En algunas realizaciones, la presente amilasa es una variante de una amilasa de Bacillus sp. que tiene un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2, por ejemplo, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad de secuencia de aminoácidos.

Además de las mutaciones descritas, en este documento, la presente amilasa puede incluir además una o más mutaciones descritas previamente. Las mutaciones descritas previamente son las que se sabe que confieren propiedades beneficiosas en al menos una amilasa que tenga un plegamiento similar y/o que tenga un 60 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos con las amilasas de Bacillus, o en cualquier amilasa que hasta ahora se haya denominado "similar a Termamyl".

Además, las presentes amilasas pueden incluir cualquier número de sustituciones aminoacídicas conservadoras, en posiciones no mutadas específicamente. En la tabla 1 se enumeran sustituciones aminoacídicas conservadoras ejemplares

Tabla 1. Sustituciones aminoacídicas conservadoras

Las presentes amilasas pueden ser "precursoras", "inmaduras" o "de longitud completa", en cuyo caso incluyen una secuencia señal, o "maduras", en cuyo caso carecen de una secuencia señal. Las formas maduras de los polipéptidos son generalmente las más útiles. Salvo que se indique lo contrario, la numeración de residuos aminoacídicos usada en este documento se refiere a las formas maduras de los respectivos polipéptidos de amilasa. Los presentes polipéptidos de amilasa también pueden truncarse para eliminar los extremos N o C, siempre que los polipéptidos resultantes conserven la actividad amilasa.

Las presentes amilasas pueden ser polipéptidos "quiméricos" o "híbridos", ya que incluyen al menos una parte de un primer polipéptido de amilasa, y al menos una parte de un segundo polipéptido de amilasa (dichas amilasas quiméricas se han "redescubierto" recientemente como amilasas de intercambio de dominio). Las presentes amilasas pueden incluir además una secuencia señal heteróloga, un epítopo para permitir el seguimiento o la purificación, o similares. Secuencias señal heterólogas ejemplares son de amilasa de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE o AprE) y CelA de Streptomyces.

También se describen en este documento ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de amilasa descritos. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido de amilasa particular, o una amilasa que tenga un grado especificado de identidad de secuencia de aminoácidos con la amilasa particular. En un ejemplo, el ácido nucleico codifica una amilasa que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de homología/identidad con una amilasa de referencia. Se apreciará que, debido a la degeneración del código genético, una pluralidad de ácidos nucleicos puede codificar el mismo polipéptido.

El ácido nucleico también puede tener un grado especificado de homología con un polinucleótido ejemplar que codifica un polipéptido de a-amilasa. Por ejemplo, el ácido nucleico puede tener al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia ejemplar. En otro ejemplo, el ácido nucleico hibrida en condiciones rigurosas o muy rigurosas con la secuencia ejemplar. Dichas condiciones se describen aquí, pero también son bien conocidas en la técnica.

Los ácidos nucleicos pueden codificar una amilasa de "longitud completa" ("fl" o "FL"), que incluye una secuencia señal, solo la forma madura de una amilasa, que carece de la secuencia señal, o una forma truncada de una amilasa, que carece del extremo N o C de la forma madura.

Un ácido nucleico que codifica una a-amilasa puede unirse de forma funcional a diversos promotores y reguladores en un vector adecuado para expresar la a-amilasa en células hospedadoras. Promotores ejemplares son de amilasa de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE o AprE), y CelA de Streptomyces. Dicho ácido nucleico también puede unirse a otras secuencias codificantes, por ejemplo, para codificar un polipéptido quimérico.

5. Métodos para fabricar amilasas variantes

Un aspecto de la presente invención es un método para fabricar una amilasa variante mutando específicamente uno o más residuos en el surco de unión al haz de almidón, que se identifican. De este modo, se introducen mutaciones en una característica estructural común de la molécula de amilasa para provocar un efecto deseado relacionado con la unión al almidón. Las mutaciones pueden realizarse usando técnicas de biología molecular bien conocidas y las amilasas variantes resultantes pueden expresarse como polipéptidos secretados usando métodos convencionales. Por ejemplo, los métodos de producción y purificación de proteínas que se secretan en el medio de cultivo de Bacillus son conocidos en la técnica, al igual que las células hospedadoras adecuadas para producir amilasas. A continuación se describen métodos ejemplares para producir las amilasas.

5.1. Materiales y métodos para producir amilasas

Un polipéptido puede expresarse usando un vector de expresión que típicamente incluirá secuencias de control que incluyen un promotor, operador, sitio de unión del ribosoma, señal de inicio de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o diversos genes activadores, adecuados. Existe un gran número de vectores disponibles en el mercado para su uso con procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la que se vaya a introducir. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora aislada, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. El gen integrado también puede amplificarse para crear múltiples copias del gen en el cromosoma mediante el uso de una construcción amplificable dirigida por la selección con antibiótico u otra presión selectiva, tal como un gen regulador esencial o por complementación a través del efecto de la dosis de un gen de una ruta metabólica esencial.

En el vector, la secuencia de ADN debe estar unida de forma funcional a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección y puede obtenerse de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula hospedadora. Promotores ejemplares para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una amilasa, especialmente en un hospedador bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores del gen de agarasa dagA o celA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de a-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltógena (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la a-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un hospedador fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, a-amilasa neutra de Aspergillus niger, a-amilasa estable en ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans. Cuando se expresa un gen que codifica una amilasa en una especie bacteriana tal como E. coli, se puede seleccionar un promotor adecuado, por ejemplo, de un promotor de bacteriófago, incluyendo un promotor de T7 y un promotor de fago lambda. Ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura incluyen, aunque sin limitación, los promotores de Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores de AOX1 o AOX2 de Pichia pastoris. Para la expresión en Trichoderma reesei, puede usarse el promotor de CBHII (celobiohidrolasa II).

Un vector de expresión también puede comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación unidas de forma funcional a la secuencia de ADN que codifica una a-amilasa. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden obtenerse de forma adecuada de las mismas fuentes que el promotor.

El vector puede comprender además una secuencia de ADN que posibilite que el vector se replique en la célula hospedadora. Ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

El vector también puede comprender un marcador de selección, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula hospedadora aislada, tal como los genes d a lde B. subtilis o B. licheniformis, o un gen que confiere resistencia a antibióticos tal como, por ejemplo, resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y xxsC, un marcador que da lugar a resistencia a higromicina, o la selección se puede conseguir mediante cotransformación, tal como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT internacional WO 91/17243.

Como se indica anteriormente, aunque la expresión intracelular o la fermentación en estado sólido pueden ser ventajosas en algunos aspectos, por ejemplo, cuando se usan determinadas bacterias u hongos como células hospedadoras, un aspecto de las composiciones y métodos contempla la expresión de una a-amilasa en el medio de cultivo.

En general, las amilasas "de longitud completa", "maduras" o "precursoras" incluyen una secuencia señal en el extremo amínico que permite su secreción en el medio de cultivo. Si es deseable, este péptido señal puede remplazarse por una secuencia diferente, lo que se consigue convenientemente mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican el polipéptido señal respectivo.

El vector de expresión típicamente incluye los componentes de un vector de clonación, tales como, por ejemplo, un elemento que permita la replicación autónoma del vector en el organismo hospedador seleccionado y uno o más marcadores fenotípicamente detectables con propósitos de selección. El vector de expresión normalmente comprende secuencias de nucleótidos de control tales como un promotor, operador, sitio de unión del ribosoma, señal de inicio de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos que puede dirigir la amilasa a un orgánulo de la célula hospedadora tal como un peroxisoma, o a un compartimento particular de la célula hospedadora. Dicha secuencia de dirección incluye, aunque sin limitación, la secuencia SKL. Para la expresión bajo la dirección de secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico de la amilasa está unida de forma funcional a las secuencias de control de forma apropiada con respecto a la expresión.

Los procedimientos usados para ligar la construcción de ADN que codifica una amilasa, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2.a ed., Cold Spring Harbor, 1989, y 3.a ed., 2001).

Una célula aislada, que comprende una construcción de ADN o un vector de expresión, se usa ventajosamente como célula hospedadora en la producción recombinante de una amilasa. La célula puede transformarse con la construcción de ADN que codifica la enzima, convenientemente integrando la construcción de ADN (en una o más copias) en el cromosoma hospedador. Esta integración generalmente se considera una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga de forma estable en la célula. La integración de las construcciones de ADN en el cromosoma hospedador se puede realizar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o heteróloga. Como alternativa, la célula puede transformarse con un vector de expresión como se describe anteriormente con respecto a los diferentes tipos de células hospedadoras.

Ejemplos de organismos hospedadores bacterianos adecuados son especies bacterianas grampositivas tales como Bacillaceae que incluyen Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium y Bacillus thuringiensis; especies de Streptomyces tales como Streptomyces murínus; especies de bacterias acidolácticas que incluyen Lactococcus sp. tales como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp. que incluyen Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; y Streptococcus sp. Como alternativa, puede seleccionarse como organismo hospedador cepas de especies bacterianas gramnegativas pertenecientes a Enterobacteriaceae que incluyen E. coli, o a Pseudomonadaceae.

Un organismo hospedador de levadura adecuado puede seleccionarse de las especies de levadura biotecnológicamente relevantes tales como, aunque sin limitación, especies de levadura tales como Pichia sp., Hansenula sp., o Kluyveromyces, Yarrowinia, especies de Schizosaccharomyces o una especie de Saccharomyces, que incluye Saccharomyces cerevisiae o una especie perteneciente a Schizosaccharomyces tal como, por ejemplo, una especie de S. pombe. Una cepa de la especie de levadura metilotrófica, Pichia pastoris, puede usarse como organismo hospedador. Como alternativa, el organismo hospedador puede ser una especie de Hansenula. Los organismos hospedadores adecuados entre los hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori o Aspergillus nidulans. Como alternativa, pueden usarse cepas de una especie de Fusarium, por ejemplo, Fusarium oxysporum o de una especie de Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei como organismo hospedador. Otras cepas adecuadas incluyen especies de Thermomyces y Mucor. Además, puede usarse Trichoderma reeseicomo hospedador. Un procedimiento adecuado para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus incluye, por ejemplo, el descrito en el documento EP 238023.

En este documento se describe un método de producción de una a-amilasa que comprende cultivar una célula hospedadora como se describe anteriormente en condiciones propicias para la producción de la enzima y recuperar la enzima de las células y/o del medio de cultivo.

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de la célula hospedadora en cuestión y obtener la expresión de una amilasa. Los medios y componentes de medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).

Puede usarse una enzima secretada por las células hospedadoras en una preparación de caldo completo. En los métodos descritos, la preparación de un caldo de fermentación completo gastado de un microorganismo recombinante puede conseguirse usando cualquier método de cultivo conocido en la técnica que provoque la expresión de una alfaamilasa. Por lo tanto, se puede entender que la fermentación comprende el cultivo en matraz agitado, la fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo las fermentaciones continuas, discontinuas, semicontinuas o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la amilasa se exprese o se aísle. El término "caldo de fermentación completo gastado" se define en este documento como el contenido no fraccionado de material de fermentación que incluye medio de cultivo, proteínas extracelulares (por ejemplo, enzimas) y biomasa celular. Se entiende que el término "caldo de fermentación completo gastado" también abarca la biomasa celular que se ha lisado o permeabilizado usando métodos bien conocidos en la técnica.

Una enzima secretada de las células hospedadoras puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, que incluyen la separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, y la precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguida del uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares.

Un aspecto contempla el polinucleótido en un vector unido de forma funcional a una secuencia de control que puede proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedadora, es decir, el vector es un vector de expresión. Las secuencias de control pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de elementos reguladores transcripcionales adicionales para hacer que el nivel de transcripción dirigida por las secuencias de control sea más sensible a los moduladores transcripcionales. Las secuencias de control pueden comprender, en particular, promotores.

Las células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones adecuadas que permitan la expresión de una amilasa. La expresión de las enzimas puede ser constitutiva, de modo que se produzcan continuamente, o inducible, que requiere un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de expresión inducible, la producción de proteínas puede iniciarse cuando se requiera, por ejemplo, mediante la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo, dexametasona o IPTG o Sopharose. Los polipéptidos también se pueden producir de forma recombinante en un sistema sin células in vitro, tal como el sistema de reticulocitos de conejo TNT™ (Promega).

Un hospedador de expresión de amilasa también puede cultivarse en el medio apropiado para el hospedador, en condiciones aeróbicas. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, realizándose la producción a la temperatura apropiada para ese hospedador, por ejemplo, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 75 °C (por ejemplo, de 30 °C a 45 °C), dependiendo de la necesidades del hospedador y la producción de la amilasa deseada. El cultivo puede realizarse desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 100 horas o más (y cualquier valor de horas entre, por ejemplo, de 24 a 72 horas). Típicamente, el caldo de cultivo está a un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,0, dependiendo nuevamente de las condiciones de cultivo necesarias para el hospedador con respecto a la producción de una amilasa.

5.2. Materiales y métodos para la purificación de proteínas

Las técnicas de fermentación, separación y concentración son bien conocidas en la técnica y pueden usarse métodos convencionales para preparar una solución concentrada que contiene un polipéptido de amilasa.

Después de la fermentación, se obtiene un caldo de fermentación, las células microbianas y diversos sólidos suspendidos, incluyendo los materiales de fermentación sin procesar residuales, se eliminan mediante técnicas de separación convencionales para obtener una solución de amilasa. Generalmente se usa filtración, centrifugación, microfiltración, filtración en tambor rotatorio de vacío, ultrafiltración, centrifugación seguida de ultrafiltración, extracción o cromatografía, o similares.

Es deseable concentrar una solución que contiene polipéptido de a-amilasa para optimizar la recuperación. El uso de soluciones no concentradas requiere un tiempo de incubación aumentado para recoger el precipitado enzimático purificado.

La solución que contiene la enzima se concentra usando técnicas de concentración convencionales hasta que se obtiene el nivel de enzima deseado. La concentración de la solución que contiene la enzima puede conseguirse mediante cualquiera de las técnicas analizadas en este documento. Métodos ejemplares de purificación incluyen, aunque sin limitación, filtración y/o ultrafiltración rotatoria de vacío.

La solución enzimática se concentra en una solución enzimática concentrada hasta que la actividad enzimática de la solución concentrada que contiene el polipéptido de amilasa se encuentra en un nivel deseado.

La concentración se puede realizar usando, por ejemplo, un agente de precipitación, tal como un agente de precipitación de haluro metálico. Los agentes de precipitación de haluro metálico incluyen, aunque sin limitación, cloruros de metales alcalinos, bromuros de metales alcalinos y mezclas de dos o más de estos haluros metálicos. Los haluros metálicos ejemplares incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros metálicos. El agente de precipitación de haluro metálico, cloruro de sodio, también se puede usar como conservante.

El agente de precipitación de haluro metálico se usa en una cantidad eficaz para precipitar un polipéptido de a-amilasa. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima de haluro metálico eficaz para provocar la precipitación de la enzima, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima, incluyendo el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de la enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, después de ensayos rutinarios.

Generalmente, se añade al menos de aproximadamente un 5 % p/v (peso/volumen) a aproximadamente un 25 % p/v de haluro metálico a la solución enzimática concentrada, y habitualmente al menos un 8 % p/v. Generalmente, no se añade más de aproximadamente un 25 % p/v de haluro metálico a la solución enzimática concentrada y habitualmente no más de aproximadamente un 20 % p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro metálico dependerá, entre otras cosas, de la naturaleza del polipéptido de amilasa específico y de su concentración en la solución enzimática concentrada.

Otra alternativa para lograr la precipitación de la enzima es usar compuestos orgánicos. Agentes de precipitación de compuestos orgánicos ejemplares incluyen: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres alquílicos del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. La adición de dichos agentes de precipitación de compuestos orgánicos puede tener lugar antes, simultáneamente o después de la adición del agente de precipitación de haluro metálico, y la adición de ambos agentes de precipitación, el compuesto orgánico y el haluro metálico, puede llevarse a cabo de forma secuencial o simultánea.

Generalmente, los agentes de precipitación orgánicos se seleccionan del grupo que consiste en sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, tales como sales de sodio o potasio, y ésteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos pueden ser, por ejemplo, ésteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Compuestos orgánicos ejemplares son ésteres alquílicos lineales del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. También se pueden usar ésteres metílicos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres propílicos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres butílicos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres etílicos del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Compuestos orgánicos adicionales también incluyen, aunque sin limitación, éster metílico del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado metil PARABENO), éster propílico del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado propil PARABENO), que también son agentes conservantes de amilasa. Para más descripciones, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.281.526.

La adición del agente de precipitación de compuesto orgánico proporciona la ventaja de una alta flexibilidad de las condiciones de precipitación con respecto al pH, la temperatura, la concentración de amilasa, la concentración de agente de precipitación y el tiempo de incubación.

El agente de precipitación de compuesto orgánico se usa en una cantidad eficaz para mejorar la precipitación de la enzima por medio del agente de precipitación de haluro metálico. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima de agente de precipitación de compuesto orgánico, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima, incluyendo el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, a la luz de la presente divulgación, después de ensayos rutinarios.

Generalmente, se añade al menos aproximadamente un 0,01 % p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución enzimática concentrada y habitualmente al menos aproximadamente un 0,02 % p/v. Generalmente, no se añade más de aproximadamente un 0,3 % p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución enzimática concentrada y habitualmente no más de aproximadamente un 0,2 % p/v.

La solución concentrada de polipéptido, que contiene el agente de precipitación de haluro metálico y el agente de precipitación de compuesto orgánico, se puede ajustar a un pH que, necesariamente, dependerá de la enzima que se va a purificar. Generalmente, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico de la amilasa. El pH se puede ajustar a un pH en un intervalo de aproximadamente 2,5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) a aproximadamente 2,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico.

El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado enzimático purificado depende de la naturaleza de la enzima específica, la concentración de la enzima y el o los agentes de precipitación específicos y su concentración. Generalmente, el tiempo eficaz para precipitar la enzima es entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 horas; habitualmente no supera de aproximadamente 25 horas. En presencia del agente de precipitación de compuesto orgánico, el tiempo de incubación todavía se puede reducir a menos de aproximadamente 10 horas y en la mayor parte de los casos incluso a aproximadamente 6 horas.

Generalmente, la temperatura durante la incubación es entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 50 °C. Habitualmente, el método se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 45 °C (por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C). La temperatura óptima para inducir la precipitación varía de acuerdo con las condiciones de la solución y la enzima o el uno o más agentes de precipitación usados.

La recuperación global del precipitado enzimático purificado y la eficacia con la que se lleva a cabo el proceso se mejoran agitando la solución que comprende la enzima, el haluro metálico añadido y el compuesto orgánico añadido. La etapa de agitación se realiza tanto durante la adición del haluro metálico y el compuesto orgánico, como durante el periodo de incubación posterior. Los métodos de agitación adecuados incluyen agitación o batido mecánico, aireación vigorosa o cualquier técnica similar.

Después del periodo de incubación, la enzima purificada se separa entonces del pigmento disociado y otras impurezas y se recoge mediante técnicas de separación convencionales, tales como filtración, centrifugación, microfiltración, filtración rotatoria en vacío, ultrafiltración, filtración por prensa, microfiltración de membrana cruzada, microfiltración de membrana de flujo cruzado o similares. Se puede obtener una purificación adicional del precipitado enzimático purificado lavando el precipitado con agua. Por ejemplo, el precipitado enzimático purificado se lava con agua que contiene el agente de precipitación de haluro metálico, o con agua que contiene el haluro metálico y los agentes de precipitación de compuestos orgánicos.

Durante la fermentación, un polipéptido de a-amilasa se acumula en el caldo de cultivo. Para el aislamiento y la purificación de la amilasa deseada, el caldo de cultivo se centrifuga o se filtra para eliminar las células, y el líquido desprovisto de células resultante se usa para la purificación enzimática. El caldo desprovisto de células se puede someter a desalado usando sulfato de amonio a aproximadamente un 70 % de saturación; a continuación, la fracción de precipitación de saturación de un 70 % se disuelve en un tampón y se aplica a una columna tal como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción activa enzimática. Para una purificación adicional, se puede usar un procedimiento convencional tal como cromatografía de intercambio iónico.

Las enzimas purificadas son útiles para aplicaciones de lavado de ropa y de limpieza. Por ejemplo, se pueden usar en detergentes para lavado de ropa y quitamanchas. Se pueden convertir en un producto final que sea líquido (solución, suspensión) o sólido (granular, polvo).

Un ejemplo más específico de purificación, se describe en Sumitani, J. etal. (2000) "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484, y se resume sucintamente aquí. La enzima obtenida de 4 litros de un sobrenadante del cultivo de Streptomyces lividans TK24 se trató con (NH4)2SO4 a un 80 % de saturación. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 10000 x g (20 min y 4 °C) y se volvió a disolver en tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía CaCl<2>5 mM. A continuación se dializó el precipitado solubilizado frente al mismo tampón. Después, la muestra dializada se aplicó a una columna Sephacryl S-200, que se había equilibrado previamente con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0), CaCl<2>5 mM y se eluyó a un caudal lineal de 7 ml/h con el mismo tampón. Se recogieron fracciones de la columna y se evaluó su actividad según se juzga mediante ensayo enzimático y SDS-PAGE. La proteína se purificó adicionalmente como sigue. Se equilibró una columna Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; n.° cat. 19812) con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía CaCl<2>5 mM y (NH4)2SO41,5 M. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de (NH4)2SO41,5 a 0 M en tampón Tris/HCl 20 mM, pH 7,0, que contenía CaCl<2>5 mM. Se recogieron las fracciones activas y la enzima se precipitó con (NH4)2SO4 a un 80 % de saturación. El precipitado se recuperó, se volvió a disolver y se dializó como se describe anteriormente. La muestra dializada se aplicó entonces a una columna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia; n.° cat. 17-5167-01) previamente equilibrada con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía CaCl<2>5 mM, a un caudal de 60 ml/hora. Las fracciones activas se recogen y se añaden a una solución de (NH4)2SO41,5 M. Las fracciones de enzima activa se volvieron a cromatografiar en una columna Toyopearl HW55, como anteriormente, para producir una enzima homogénea según se determina por SDS-PAGE. Véase Sumitani, J. et al. (2000) Biochem. J. 350: 477-484, para un análisis general del método y variaciones en el mismo.

Para la recuperación a escala de producción, un polipéptido de amilasa puede purificarse parcialmente como se describe en general anteriormente eliminando las células mediante floculación con polímeros. Como alternativa, la enzima puede purificarse mediante microfiltración seguida de concentración mediante ultrafiltración usando membranas y equipos disponibles. Sin embargo, para algunas aplicaciones, no es necesario purificar la enzima, y el caldo de cultivo completo se puede lisar y usar sin tratamiento adicional. A continuación, la enzima se puede procesar, por ejemplo, en gránulos.

6. Composiciones que comprenden a-amilasas variantes

También se describen composiciones que comprenden una o más de las a-amilasas variantes descritas. Dichas composiciones incluyen, por ejemplo, concentrados de enzimas, mezclas de enzimas, preparaciones de enzimas purificadas, productos enzimáticos parcialmente purificados, productos de caldo aclarado, productos de caldo completo, aditivos alimenticios y productos de limpieza. Las composiciones pueden proporcionarse en una diversidad de formas físicas, incluyendo líquidos, suspensiones, geles, tortas, polvos, gránulos y similares. Las composiciones pueden liofilizarse, concentrarse, congelarse, secarse por pulverización o procesarse de otro modo de una diversidad de formas conocidas o útiles. Las composiciones pueden proporcionarse en tamaños convencionales para determinadas aplicaciones comerciales, o envasarse a medida, o proporcionarse en recipientes a granel de cualquier tipo.

Las composiciones además pueden comprender o usarse junto con cualquier número de ingredientes de formulación, tales como tampones, sales, quelantes, conservantes, antimicrobianos, polímeros, agentes de volumen y similares. Especialmente cuando las composiciones son de limpieza, pueden comprender además, por ejemplo, tensioactivos, oxidantes, quelantes u otros agentes de limpieza. Composiciones ejemplares son detergentes para ropa y detergentes lavavajillas, incluyendo detergentes para lavavajillas automáticos. Las composiciones pueden comprender además o usarse junto con uno o más polipéptidos adicionales. El uno o más polipéptidos adicionales pueden incluir al menos una enzima. Las enzimas adicionales incluyen, aunque sin limitación, otras a-amilasas, p-amilasas, glucoamilasas, isoamilasas, isomerasas, fitasas, proteasas, celulasas, lignasas, hemicelulasas, lipasas, fosfolipasas y cutinasas.

Las composiciones que comprenden una o más de las presentes amilasas variantes, o mezclas de enzimas que comprenden además una o más enzimas adicionales, son útiles para la licuación del almidón. Las composiciones pueden ser útiles para facilitar la eliminación del almidón de textiles, papel, vidrio, plástico, metal, lona, porcelana y otras superficies. Las composiciones pueden prepararse o formularse para su uso como aditivos alimenticios o auxiliares de procesamiento adecuados para su uso en procesos alimenticios. Las composiciones son particularmente eficaces cuando al menos una parte del almidón está en forma de haces de almidón.

8. Métodos de uso

También se describen en este documento métodos para usar las a-amilasas variantes descritas o composiciones que comprenden dichas variantes. Las a-amilasas variantes pueden usarse en un método para licuar un carbohidrato complejo, tal como una suspensión de almidón, particularmente cuando la suspensión de almidón contiene haces de almidón. El método comprende generalmente hacer una suspensión que comprenda el carbohidrato complejo, calentar la suspensión hasta una temperatura aceptable para la licuación, añadir a la suspensión una composición que comprenda al menos una variante de a-amilasa como se describe en este documento, e incubar la suspensión con la composición durante un tiempo y a una temperatura suficientes para licuar el carbohidrato complejo. Como se usa en este documento, "licuar" no significa que se escindan todos los enlaces del sustrato disponibles, sino que el hidrato de carbono complejo se hidroliza al menos parcialmente, como se evidencia por una reducción medible de la viscosidad final, un aumento de DE de la suspensión, la liberación de fragmentos/productos de bajo DP u otra medida de aumento de grupos reductores, dextrinas o unidades de a-maltosa.

La temperatura de licuación puede variar de la temperatura ambiente a más de 100 °C, pero es más preferiblemente que sea de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 95 °C. La licuación puede conllevar el uso de una curva de temperatura compleja a lo largo del tiempo, por ejemplo, la reacción puede comenzar a una temperatura baja y aumentarse por métodos conocidos en la técnica hasta la temperatura final deseada. La temperatura también puede reducirse después de una cantidad específica de tiempo, o después de que se alcance un punto final deseado en términos de viscosidad, valor de DE u otra medida de licuación. El experto en la materia apreciará, por tanto, que no es necesario que el método implique una temperatura específica durante un tiempo determinado, siempre que la actividad amilasa pueda funcionar a la temperatura y en las condiciones proporcionadas. Otras condiciones que influyen en la actividad incluyen el pH y la concentración de iones calcio, además de la presencia o ausencia de inhibidores o similares.

La suspensión puede incluir aproximadamente un 20-40 % de almidón en peso seco, por ejemplo, entre aproximadamente un 30 y un 36 o un 37,5 % de almidón. Pueden usarse cantidades menores de almidón, pero en general no resultan económicas. La viscosidad máxima y otros factores relacionados, tales como el aporte de energía necesaria para la mezcla, pueden limitar la cantidad máxima de almidón que puede usarse en la suspensión. El experto en la materia apreciará las consideraciones prácticas a la hora de elaborar la suspensión de almidón. El experto en la materia apreciará que, cuanto más se reduzca la viscosidad, cuanto más se licue el almidón, mayor será la producción de dextrinas (o mayor será el DE del almidón licuado resultante). Por tanto, la viscosidad de pico puede reducirse al menos un 10, 20, 25, 30, 40, o incluso un 50 % o más con respecto a la viscosidad de pico de una suspensión comparable licuada por una enzima de tipo silvestre de la que se haya obtenido la variante, o tratada con una preparación enzimática comercial actualmente disponible.

La licuación puede formar parte de una fermentación para producir, por ejemplo, un producto alimenticio, un aditivo alimenticio, un combustible, un aditivo para combustible y similares. La fermentación puede producir un combustible o un aditivo de combustible tal como un alcohol, por ejemplo, etanol, butanol u otro alcohol inferior. Se proporcionan expresamente métodos para producir etanol usando las a-amilasas variantes, composiciones o mezclas de enzimas descritas en este documento. De acuerdo con dichos métodos, después de la adición de la enzima variante, la suspensión de almidón licuada resultante se fermenta con uno o más organismos que pueden producir etanol, en condiciones y durante un tiempo adecuados para la producción de etanol en la fermentación. Como alternativa, la amilasa variante y los organismos están presentes al mismo tiempo, como en el caso de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).

También se describen en este documento métodos de limpieza de una superficie para eliminar un residuo de almidón indeseado o no deseado, en particular cuando al menos una parte del almidón está en forma de haces de almidón. Los métodos comprenden las etapas de proporcionar una superficie que tiene un residuo de almidón a eliminar, poner en contacto la superficie con una composición que comprende una o más a-amilasas variantes, durante un tiempo y a una temperatura suficientes, y en condiciones que permitan provocar la eliminación del residuo de almidón. La superficie puede ser de cualquier material; por ejemplo, puede ser una fuente, un plato, un cristal, etc., o puede ser una prenda de vestir o un tejido. También puede ser, por ejemplo, una encimera o superficie de trabajo, o un recipiente comercial de cualquier tipo que deba limpiarse periódica o regularmente.

También se describen en este documento métodos de tratamiento de un material tejido usando las variantes de aamilasa descritas en este documento. Los métodos de tratamiento de materiales tejidos, tales como telas, con amilasas son conocidos en la técnica y abarcan lo que se denomina "desencolado". Los métodos comprenden poner en contacto el material tejido con un líquido que comprenda una variante de a-amilasa o una composición que comprenda una variante de acuerdo con la presente. El material tejido puede ser una tela o un textil. El material tejido puede tratarse con el líquido bajo presión. El líquido es generalmente una solución acuosa. Las variantes de a-amilasa proporcionadas en este documento pueden usarse solas o con otros reactivos químicos desencolantes, tales como detergentes y/o enzimas desencolantes para desencolar materiales tejidos tales como telas, incluyendo telas de algodón y que contienen algodón.

Los ejemplos prácticos proporcionados a continuación se proporcionan para describir e ilustrar adicionalmente determinados aspectos de las variantes de las a-amilasas y, por tanto, no deben interpretarse como limitantes. Ejemplos

Ejemplo 1. Purificación de uPWA

Una a-amilasa variante derivada de Pyrococcus woesei, uPWA (SEQ ID NO: 2 en la patente de Estados Unidos n.° 7.273.740), se adquirió a Verenium (San Diego, CA, EE. UU.). La uPWA contiene 58 sustituciones aminoacídicas con respecto a la amilasa de P. woesei de tipo silvestre, PWA. La secuencia de aminoácidos de uPWA y PWA se muestran a continuación, como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 1, respectivamente:

Amilasa de P. woesei variante, uPWA (SEQ ID NO: 5)

AKYSELEKGG VIMQAFYWDV PSGGIWWDTI RQKIPEWYDA G IS A IW IP P A SKGMGGAYSM GYDPYDFFDL GEYDQKGTVE TRFGSKQELV NMINTABAYG MKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFVNDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE LHAGDSGTFG GYPDICHDKS WDQYWLWASQ ESYAAYLRSI GIDAWRFDYV KGYAPWWKD WLNWWGGWAV GEYWDTNVDA VLNWAYSSGA KVFDFALYYK MDEAFDNKNI PALVSALQNG Q TW SRD PFK AVT FVANHDT DIIWNKYPAY AFTLTYFGQP TTFYRDYFFW T.NKDKLKNLT WTHFNTAGGS TDTVYYDNDF

LIFVRNGYGD K PG LITY IN L GSSKAGRWVY VPKFAGACIH EYTGNLGGWV DKYVYSSGWV YLEAPAYDPA NGQYGYSVWS YCGVG

Amilasa de P. woesei de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1)

AKYLELEEGG VIMQAFYWDV PGGGIWWDHI RSKIPEWYEA G ISA IW LPPP SKGMSGGYSM GYDPYDYFDL GEYYQKGTVE TRFGSKEELV RLIQTAHAYG I K V I A D W I N HRAGGDLEWN PFVGDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE LHCCDEGTFG GFPDICHHKE WDQYWLWKSN ESYAAYLRSI GFDGWRFDYV KGYGAWWRD WLNWWGGWAV GEYWDTNVDA LLSWAYESGA KVFDFPLYYK MDEAFDNNNI PALVYALQNG Q TW SR D PFK AVT FVANHDT DIIWNKYPAY AFILTYEGQP VIFYRDFEEW LNKDKLINLI WIHDHLAGGS TTIVYYDNDE LIFVRNGDSR R P G L IT Y IN L SPNWVGRWVY VPKFAGACIH EYTGNLGGWV DKRVDSSGWV YLEAPPHDPA NGYYGYSVWS YCGVG

La uPWA se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba y se transfirió a un tampón de pH alto que consistía en glicina 50 mM, pH 10 y CaCl<2>2 mM, y después se mezcló durante veinte minutos. Se añadió sulfato de amonio hasta una concentración final 1 M y se dejó que la solución se mezclara durante otros 30 minutos, para después aplicarla a una columna de fenil Sepharose de 30 ml equilibrada con el mismo tampón. La columna se lavó con el mismo tampón hasta que se alcanzó un valor de referencia estable. Se aplicó un gradiente de 300 ml hasta alcanzar glicina 50 mM, pH 10, CaCl<2>2 mM, seguido de un lavado de 300 ml en el mismo tampón. Finalmente, la proteína se eluyó en glicina 50 mM, pH 10, cloruro de calcio 2 mM, propilenglicol al 40 %.

Las fracciones combinadas se concentraron en un concentrador Vivaspin (MWCO 10000) hasta una concentración final de proteína de 20 mg/ml. La proteína purificada se almacenó en tampón de elución (glicina 50 mM, pH 10, CaCl<2>2 mM, propilenglicol al 40 %) a 4 °C. La concentración se determinó por densidad óptica a 280 nm, y se usó SDS-PAGE para evaluar la pureza. Antes de la cristalización, el tampón de almacenamiento de proteínas se cambió por agua usando un concentrador Vivaspin (MWCO 10000) y la concentración final de proteína se ajustó a 10 mg/ml. Ejemplo 2. Cristalización de uPWA

Los experimentos de cristalización se llevaron a cabo a temperatura ambiente usando gotas de reposo en 24 pocilios en placas Cryschem (Hampton Research). El cribado inicial se realizó usando tamices comerciales disponibles (Hampton y Qiagen). Las gotas se mezclaron como muestra de proteína de 2 gl con una cantidad igual de solución de depósito y se dejaron equilibrar con 250 gl de soluciones de depósito. Los cristales aparecieron después de 5-7 días con condiciones de depósito que consistían en Tris-HCl 0,1 M pH 8,5 y etanol al 20 % (v/v) o NaCl 0,2 M, HEPES 0,1 M pH 7,5 e isopropanol al 10 % (v/v). Antes del análisis por difracción de rayos X, los cristales se crioprotegieron añadiendo granos de sacarosa a la gota, que se dejaron disolver. Los cristales se montaron en bucles de nailon y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Los datos se recogieron usando radiación de sincrotrón en la fuente de luz de radiación sincrotrón de Stanford (SSRL línea de haz BL12-2). Se recogió un conjunto de datos completo, se integró y se cambió de escala a una resolución de 50 - 2,1 Á con XDS (Kabsch, W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26:795-800).

Ejemplo 3. Determinación y refinamiento de la estructura de uPWA

La estructura de uPWA se determinó mediante remplazo molecular usando Phaser (McCoy, A. J. et al. (2007) J. Appl. Crystallogr. 40:658-674) con la estructura de la amilasa de P. woesei de tipo silvestre (código de acceso de PDB: 1MWO; Linden, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:9875-9884) como modelo de búsqueda. El refinamiento del modelo, la interpretación del cartografiado y la construcción del modelo se realizaron usando PHENIX (Adams, P. D. et al. (2002) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58:1948-1954) y COOT (Emsley, P. y Cowtan, K. (2004) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60:2126-2132). Las estadísticas de refinamiento del modelo se enumeran en la tabla 1.

Tabla 1. Estadísticas de refinamiento del modelo

La estructura se determinó a una resolución de 2,1 Á. El modelo final abarcaba los residuos 1 a 435 del polipéptido, 2 moléculas de sacarosa, iones unidos (4 Ca<2+>, 1 Zn<2+>, 1 T ris<+>, 1 SO<42->), 191 moléculas de agua y 1 molécula de pciclodextnna y produce unos valores de R<trabajo>y R<libre>de un 16,5 % y un 20,8 %, respectivamente, a una resolución de 50 - 2,1 Á y con un 94,2 % de residuos en las regiones más favorecidas del diagrama de Ramachandran (Chen, V. B. et al. (2010) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66:12-21).

La estructura de uPWA presentaba el plegamiento canónico de la familia 13 de glucosilhidrolasa CAZy con los dominios A, B y C característicos (figura 1). La estructura secundaria se muestra en la figura 2. A pesar de la presencia de 58 mutaciones con respecto a la amilasa de P. woesei de tipo silvestre, la estructura global era similar a la estructura descrita previamente (wtPWA, código de acceso de PDB: 1MWO; Linden, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:9875-9884), con una desviación cuadrática media de 0,6 Á en las posiciones del la cadena principal Ca. El dominio A central (residuos 1-109 y residuos 170-340) conserva el característico plegamiento en barril TIM y alberga los residuos del sitio activo Asp<289>, Glu<222>y Asp<198>(Banner, D. W. et al. (1975) Nature 255:609-614). El dominio B relativamente pequeño constituye parte de la hendidura de unión del sustrato y posee un centro metálico de Ca,Zn (Linden, A. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:9875-9884). El dominio C carboxiterminal (residuos 341-435) consiste en una lámina p antiparalela de ocho hebras que incluye el motivo clásico de llave griega. Además de los iones Ca<2+>y Zn<2+>en el centro metálico único, se encontraron otros tres sitios de Ca<2+>: dos dentro del dominio A y uno en el dominio C, todos correspondientes a sitios previamente presentados para wtPWA con y sin a-acarbosa (códigos de acceso de PDB 1MXD y 1MWO, respectivamente), o sitios de Mg<2+>para a-acarbosa wtPWA (código de acceso de PDB: 1MXO).

Se observó un fuerte pico anómalo en el sitio de unión a Zn, mientras que no se observaron picos en ninguno de los otros sitios de unión. Sorprendentemente, se encontró una ciclodextrina fuertemente unida en el extremo N del dominio A (figura 1). El sitio de unión está formado por una pequeña hélice que precede a la primera hebra p, los dos bucles de la hélice 6/hebra 7 y la hélice 7/hebra 8, y el bucle que conecta los dominios A y C. Parte del sitio de unión a ciclodextrina se solapa con el sitio de unión a a-acarbosa (Ac-II) observado en el polipéptido de tipo silvestre. Un ion sulfato está situado en el centro del anillo de ciclodextrina.

Además, una molécula de sacarosa está unida entre los dos bucles de la hélice 4/hebra 5 y la hélice 5/hebra 6, muy cerca de la ciclodextrina. Una segunda molécula de sacarosa se encuentra cerca de la hélice 3b y de la parte carboxiterminal del dominio B, solapándose con el sitio de unión del metiltetraglicol del polipéptido de tipo silvestre con a-acarbosa (código de acceso de PDB: 1MXD).

Ninguna de las 58 sustituciones aminoacídicas en uPWA implica residuos en contacto directo con iones metálicos u otros ligandos; sin embargo, C153A, C154G, E156S y H168D están cerca del centro metálico de Ca,Zn y D358Y, S359G, R360D, R361K y P372S están cerca de la ciclodextrina unida. La mayoría de las sustituciones se localizan en la superficie de la enzima.

Ejemplo 4. Correlación entre los aciertos de SEL y las posiciones del surco

Se preparó una colección de evaluación de sitios (SEL) completa, de 488 posiciones, para el cribado de variantes de una amilasa de Cytophaga sp. (AAF00567.1, GI n.° 6006681; SEQ ID NO: 4) que tiene una eliminación en el bucle de unión al almidón (AR178+a G i 79; subrayado en SEQ ID NO: 4).

a-Amilasa de Cytophaga sp. (AAF00567.1, GI n.° 6006681; SEQ ID NO: 4):

AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS

QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD

WMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY

SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSRIFKFRGT GKAWDWEVSS ENGNYDYLMY

ADIDYDHPDV VNEMKKWGVW YANEVGLDGY RLDAVKHIKF SFLKDWVDNA

RAATGKEMFT VGEYWQNDLG ALNNYLAKVN YNQSLFDAPL HYNFYAASTG

GGYYDMRNIL NNTLVASNPT KAVTLVENHD TQPGQSLEST VQPWFKPLAY

AFILTRSGGY PSVFYGDMYG TKGTTTREIP A LK S K IEP LL KARKDYAYGT

QRDYIDNPDV IGWTREGDST KAKSGLATVI TDGPGGSKRM YVGTSNAGEI

WYDLTGNRTD KITIGSDGYA TFPVNGGSVS VWVQQ

Dichas SEL son conocidas en la técnica, y se usan rutinariamente para evaluar el efecto de sustituciones individuales, o combinaciones de mutaciones, en polipéptidos. Se puntuó el rendimiento de los polipéptidos de amilasa de Cytophaga variantes en función de su capacidad de hidrolizar el almidón de maíz. La relación de la actividad de una variante a la actividad de la amilasa de Cytophaga sp. de tipo silvestre, normalizada para la expresión, se denominó índice de rendimiento (PI) para la actividad. Los "aciertos" de SEL fueron variantes que tenían un PI para la actividad >1, lo que indicaba una actividad aumentada sobre el almidón de maíz. Sin embargo, las mutaciones que provocan un PI de actividad <1 a menudo pueden proporcionar beneficios de rendimiento en combinación con otras mutaciones. La relación del nivel de expresión de una variante y el nivel de expresión de la amilasa de Cytophaga sp. de tipo silvestre se denominó PI para la expresión. Al analizar los datos de SEL, a menudo es deseable excluir los datos de las variantes que tienen un PI para la expresión por debajo de un umbral preseleccionado (por ejemplo, <0,3) para evitar los errores que surgen al medir niveles bajos de actividad enzimática.

La figura 6 es un histograma que muestra la distribución de los valores de PI para la actividad de todas las variantes SEL que tienen un PI para la expresión >0,3. El eje X indica el PI para la actividad y el eje Y indica el número de variantes que tienen el correspondiente PI para la actividad. La figura 7 es un histograma que muestra la distribución de los valores de PI para la actividad de las variantes de SEL que tienen sustituciones solo en las posiciones del surco (es decir, las posiciones 1,2, 3, 4, 38, 88, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 230, 251,252, 253, 254, 255, 256, 308, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402 y 403, en referencia a SEQ ID NO: 4) y que tienen un PI para la expresión >0,3. La distribución de las variantes en la posición del surco es más gaussiana, con menos variantes que tengan un PI para la actividad <1. Estos datos indican que las mutaciones en las posiciones del surco tienen más probabilidades de producir una amilasa variante con un PI para la actividad >0,8, >0,9 y >1, y menos probabilidades de producir una amilasa variante con un PI para la actividad <1, <0,9 y <0,8, en comparación con una mutación realizada indiscriminadamente, es decir, en cualquier parte de un polipéptido de amilasa de la posición 1 a la 488.

Ejemplo 5. Correlación entre las posiciones del surco y la actividad sobre sustratos de almidón

Las variantes individuales obtenidas de la colección SEL del ejemplo 4 se ensayaron para la expresión, la actividad sobre un sustrato de amilosa y la actividad sobre un sustrato de amilopectina. La amilosa es un componente no ramificado del almidón que consiste en residuos de glucosa en enlaces a-1,4. Las moléculas de almidón de la amilosa son alargadas y se parecen a las moléculas de almidón encontradas en haces de almidón. La amilopectina es un componente ramificado del almidón, que consiste en enlaces a-1,6 y enlaces a-1,4.

Los resultados de los ensayos se muestran en las figuras 8 y 9. Los números de posición de los aminoácidos (Pos) y los residuos de tipo silvestre presentes en esas posiciones (WT) se muestran en las columnas 1 y 2, respectivamente. Las sustituciones aminoacídicas presentes en la posición indicada en las variantes ensayadas se muestran en las 20 columnas adyacentes. El resaltado gris en las celdas indica que no se elaboró una variante. Las celdas en blanco indican que una variante no se expresó a niveles suficientes para permitir análisis posteriores. Las variantes con sustituciones en las posiciones 2, 3, 88, 92, 251, 252, 253, 254, 256, 308, 316, 317, 318, 320, 321, 357, 400, 402 y 404 (en referencia a SEQ ID NO: 4) se ensayaron para la actividad sobre un sustrato de amilosa (figura 8) y un sustrato de amilopectina (figura 9).

Los valores de los datos se presentan como log (2) del índice de rendimiento (PI), en cuyo caso un número negativo indica actividad disminuida en comparación con una amilasa con el residuo aminoacídico de tipo silvestre en la posición indicada y un número positivo indica actividad aumentada en comparación con una amilasa con el residuo aminoacídico de tipo silvestre en la posición indicada, y donde cada cambio de unidad representa un factor de 2. Los datos de las mutaciones que aumentan la actividad sobre el sustrato se muestran en negrita. El número de variantes ensayadas (n.°), los valores máximos de log(2) PI (Max), el número de variantes con log(2) PI mayor de -2 (# <-2), el porcentaje de variantes con log(2) PI mayor de 2 (% >-2), el número de variantes con log(2) PI mayor de -1 (# <-1), el porcentaje de variantes con log(2) PI mayor de -1 (% >-1), el número de variantes con log(2) PI mayor de 0 (# <0), el porcentaje de variantes con log(2) PI mayor de 0 (% >0) y os valores promedio de log(2) PI (Ave.) se indican en las columnas posteriores.

Las sustituciones en las posiciones 92, 251,254, 256, 317, 318, 320 y 321 (en referencia a SEQ ID NO: 4), mejoraron la actividad sobre el sustrato de amilosa. Las sustituciones en las posiciones 253 y 256 mejoraron la actividad sobre el sustrato de amilosa. Las sustituciones particulares que mejoraron la actividad sobre el sustrato de amilosa fueron S92L, R251A, R251C, R251D, R251E, R251F, R251G, R251H, R251L, R251M, R251N, R251Q, R251S, R251T y R251W, T254H, T254K, T254W y T254Y, K256A, K256E, K256T y K256V, S317C y S317R, N318A N318F, N318H, N318K, N318Q y N318R, T320A, T320H, T320M, T320N y T320P y K321 D, K321G, K3211 y K321T. La sustitución de R251 y K256 por otros residuos aminoacídicos provocó, en general, una actividad aumentada sobre el sustrato de amilosa.

Las sustituciones en las posiciones N88, A252, A253, N308, A316, S357, T400, R402 y D403 no produjeron ninguna mejora en la actividad sobre el sustrato de amilosa o una disminución en la actividad, mientras que las sustituciones en las posiciones N4, G5, T38, N93, G94, I95, Q96, V97, Y230, G255, V315, P319, A322, L354, T355, R356, G359, Y396, A397, Y398, G399 y Q401 provocaron una expresión reducida (en referencia a SEQ ID NO: 4).

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un polipéptido de a-amilasa variante, que comprende:

introducir en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido original de a-amilasa de la familia 13 una mutación en un residuo aminoacídico del surco de unión al almidón;

en donde el surco de unión al almidón corresponde a los residuos aminoacídicos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249 257, 278-282, 309-320, 354-359, 391 y 395-402, en referencia a SEQ ID NO: 2 para la numeración;

en donde el original tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2; y en donde la mutación altera la unión del almidón al polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original y aumenta la estabilidad térmica, aumenta la estabilidad al pH y/o aumenta la estabilidad en detergente del polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el original tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la variante tiene al menos un 60 %, al menos un 65 % o al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la variante presenta una licuación del almidón, una sacarificación del almidón o un rendimiento de limpieza mejorados en comparación con el original.

5. Uso de una mutación en un residuo aminoacídico en el surco de unión al almidón de un polipéptido original de aamilasa de la familia 13 para producir un polipéptido de a-amilasa variante con (i) unión alterada a los haces de almidón en comparación con la a-amilasa original, y (ii) estabilidad térmica aumentada, estabilidad al pH y/o estabilidad en detergente aumentada en comparación con la a-amilasa original,

en donde el surco de unión al almidón corresponde a los residuos aminoacídicos 1-6, 36, 38, 91-97, 224-226, 249 257, 278-282, 309-320, 354-359, 391 y 395-402, en referencia a SEQ ID NO: 2 para la numeración;

en donde el original tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

6. El uso de la reivindicación 5, en donde el original tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

7. El uso de la reivindicación 5 o reivindicación 6, en donde la variante tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la mutación aumenta la estabilidad térmica, aumenta la estabilidad al pH y/o aumenta la estabilidad en detergente del polipéptido de a-amilasa variante en comparación con el polipéptido de a-amilasa original.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la variante presenta una licuación del almidón, una sacarificación del almidón o un rendimiento de limpieza mejorados en comparación con el original.