[go: up one dir, main page]

ES2978034T3 - Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa-amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2) - Google Patents

Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa-amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2) Download PDF

Info

Publication number
ES2978034T3
ES2978034T3 ES21193640T ES21193640T ES2978034T3 ES 2978034 T3 ES2978034 T3 ES 2978034T3 ES 21193640 T ES21193640 T ES 21193640T ES 21193640 T ES21193640 T ES 21193640T ES 2978034 T3 ES2978034 T3 ES 2978034T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amylase
variant
starch
acid
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES21193640T
Other languages
English (en)
Inventor
Luis Cascao-Pereira
David Estell
Marc Kolkman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Danisco US Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48626134&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2978034(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Danisco US Inc filed Critical Danisco US Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2978034T3 publication Critical patent/ES2978034T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A23L2/382—Other non-alcoholic beverages fermented
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
    • C11D2111/10—Objects to be cleaned
    • C11D2111/12—Soft surfaces, e.g. textile
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
    • C11D2111/10—Objects to be cleaned
    • C11D2111/14—Hard surfaces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)

Abstract

Se describen composiciones y métodos relacionados con alfa-amilasas variantes. Las alfa-amilasas variantes son útiles, por ejemplo, para la licuefacción y sacarificación del almidón, para limpiar manchas de almidón en la ropa, el lavado de vajilla y otras aplicaciones, para el procesamiento de textiles (por ejemplo, desencolado), en piensos para animales para mejorar la digestibilidad y para la panadería y la elaboración de cerveza. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa-amilasa deCytophaga sp.amylasei (CspAmy2)
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Se divulgan composiciones y procedimientos relacionados con a-amilasas variantes. Las a-amilasa variantes son útiles, por ejemplo, para la licuefacción y la sacarificación de almidón, la limpieza de manchas de almidón, el desencolado de textiles, la panificación y la elaboración de cerveza.
ANTECEDENTES
El almidón consiste en una mezcla de amilosa (15-30% p/p) y amilopectina (70-85% p/p). La amilosa consiste en cadenas lineales de unidades de glucosa enlazadas en a-1,4 que tienen un peso molecular (PM) de aproximadamente 60.000 a aproximadamente 800.000. La amilopectina es un polímero ramificado que contiene puntos de ramificación a-1,6 cada 24-30 unidades de glucosa; su PM puede alcanzar 100 millones.
Actualmente se producen azúcares a partir de almidón en forma de jarabes de dextrosa concentrados por medio de un proceso de catalización enzimática que implica: (1) licuefacción (o reducción de viscosidad) de almidón sólido con una a-amilasa en dextrinas que presentan un grado medio de polimerización de aproximadamente 7-10, y (2) sacarificación del almidón licuado resultante (es decir, hidrolizado de almidón) con amiloglucosidasa (también denominada glucoamilasa o GA). El jarabe resultante presenta un alto contenido de glucosa. Subsiguientemente, gran parte del jarabe de glucosa que se produce comercialmente se isomeriza enzimáticamente para dar una mezcla de dextrosa/fructosa conocida como isojarabe. El jarabe resultante también puede fermentarse con microorganismos, tales como levadura, para producir productos comerciales que incluyen, por ejemplo, etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido itacónico, glutamato monosódico, gluconatos, lisina, otros ácidos orgánicos, otros aminoácidos y otras sustancias bioquímicas. La fermentación y la sacarificación pueden realizarse simultáneamente (es decir, un proceso SSF) para lograr mayor economía y eficacia.
Las a-amilasas hidrolizan almidón, glucógeno, y polisacáridos relacionados mediante la escisión aleatoria de enlaces internos a-1,4-glucosídicos. Se han utilizado a-amilasas, especialmente deBacilli,para varios fines distintos, incluidos la licuefacción y la sacarificación de almidón, el desencolado de textiles, la modificación de almidón en la industria del papel y de la pasta de papel, la elaboración de cerveza, la panificación, la producción de jarabes para la industria alimentaria, la producción de materias primas para procesos de fermentación, y para aumentar la digestibilidad en alimentación animal. Estas enzimas pueden emplearse también para eliminar manchas y suciedad de almidón durante el lavado de vajillas y el lavado de ropa.
El documento WO 2011/080352 divulga alfa-amilasas, ácidos nucleicos que codifican las alfa-amilasas y procedimientos para producir y utilizar las alfa-amilasas. El documento US 7498158 y el documento WO 02/092797 divulgan variantes (mutantes) de alfa-amilasas parentales de tipo Xermamyl, que presentan actividad de alfa-amilasa y que muestran propiedades alteradas con respecto a la alfa-amilasa parental. El documento US 2011/033882 divulga variantes de alfa-amilasa deB. licheniformis.Declerck et al (J. Mol. Biol. 301, 1041-1057) divulgan procedimientos para examinar determinantes estructurales que especifican la alta termoestabilidad de la alfaamilasa deB. licheniformis.El documento WO 03/14358 divulga alfa-amilasas que se derivan de a-amilasas de las especies bacterianasBacillus amyloliquefaciensyBacillus licheniformispara su uso en lavado y limpieza. El documento WO 2009/149130 divulga variantes de una alfa-amilasa deGeobacillus Sterothermophilusy su uso en la conversión de almidón, la producción de etanol, el lavado de ropa, la limpieza de superficies duras, el desencolado de textiles y la producción de edulcorantes.
SUMARIO
La presente invención proporciona un polipéptido de a-amilasa variante derivado de un polipéptido de a-amilasa parental que comprende al menos una pluralidad de mutaciones combinables en posiciones de aminoácidos productivas; en el que:
(i) cada mutación combinable es una mutación que mejora al menos una propiedad enzimática y bioquímica deseable de la a-amilasa variante en comparación con la a-amilasa parental, sin disminuir significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad de la a-amilasa variante, en comparación con la a-amilasa parental,
(ii) cada posición productiva es una posición de aminoácido que puede sustituirse por una pluralidad de residuos de aminoácidos diferentes, dando como resultado cada una de dichas sustituciones una a-amilasa variante que cumple los requisitos de (i), y
(iii) cada mutación combinable está incluida en las listas A, B, C, D, E o F, o en la tabla D, que utiliza la SEQ ID NO: 1 para la numeración, y
en el que la a-amilasa variante tiene al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2,
en el que la pluralidad de mutaciones combinables incluye una mutación combinable en la posición productiva correspondiente a la posición 5 de la SEQ ID NO: 1, que es una sustitución por Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr, tal como se define en las reivindicaciones.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable produce una amilasa variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a la amilasa parental para (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad y (iii) la estabilidad o la termoestabilidad en detergente son superiores o iguales a 0,9, y el IR para una cualquiera de (i), (ii) o (iii) es superior o igual a 1,0, calculándose el IR para la variante comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa parental (valor teórico) a la misma concentración de proteína.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable produce una amilasa variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a la amilasa parental para (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad y (iii) la estabilidad o la termoestabilidad en detergente son superiores o iguales a 0,8, y el IR para una cualquiera de (i), (ii) o (iii) es superior o igual a 1,2, calculándose el IR para la variante comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa parental (valor teórico) a la misma concentración de proteína.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable produce una amilasa variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a la amilasa parental para (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad y (iii) la estabilidad o la termoestabilidad en detergente son superiores o iguales a 0,5, y el IR para una cualquiera de (i), (ii) o (iii) es superior o igual a 1,5, calculándose el IR para la variante comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa parental (valor teórico) a la misma concentración de proteína.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++, +++ o ++++, con referencia a la tabla C.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de +++ o ++++, con referencia a la tabla C.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++++, con referencia a la tabla C.
En algunas formas de realización, cada mutación combinable tiene una puntuación de productividad de 1 o 2, con referencia a la tabla B.
En algunas formas de realización, la amilasa variante comprende además una deleción correspondiente a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Arg-178, Gly-179, Thr-180 y Gly-181, usando la SEQ ID NO: 1 para la numeración.
En algunas formas de realización, la amilasa variante comprende además deleciones correspondientes a los residuos Arg-178 y Gly-179, usando la SEQ ID NO: 1 para la numeración.
En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende la amilasa variante reivindicada, tal como se define en las reivindicaciones.
En algunas formas de realización, la composición es una composición detergente.
En algunas formas de realización, la composición es un detergente para ropa o un aditivo para detergente para ropa. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para sacarificar una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, tal como se define en las reivindicaciones.
En algunas formas de realización, la sacarificación se realiza en un intervalo de temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 75°C.
En algunas formas de realización, el intervalo de temperatura es de 47°C-74°C.
En algunas formas de realización, la sacarificación se realiza en un intervalo de pH de 2,0-7,5.
En algunas formas de realización, el intervalo de pH es de pH 3,5-5,5.
En algunas formas de realización, el intervalo de pH es de pH 3,5-4,5.
En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además fermentar la composición de glucosa para producir un producto de fermentación final (EOF).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
La SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de amilasa deCytophagasp. (CspAmy2).
La SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos de la forma madura de una amilasa deCytophagasp. variante (CspAmy2-v1) que tiene deleciones tanto de arginina 178 como de glicina 179.
La SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos de la forma inmadura/precursora de la forma variante de amilasa deCytophagasp. (CspAmy2-v1) que tiene un péptido señal.
La SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN sintético (ADNCspAmy2-v1)que codifica la amilasa de CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se divulgan composiciones y procedimientos relacionados con enzimas de a-amilasa variante. Las variantes se descubrieron mediante una combinación de enfoques experimentales, tal como se detalla en los ejemplos adjuntos. Los enfoques incluyen el uso de bibliotecas de evaluación de sitios (SEL) y análisis basado en estructura. Los ejemplos de aplicaciones para las enzimas de amilasa variante son para la licuefacción y la sacarificación del almidón, para la limpieza de manchas de almidón en lavado de ropa, lavado de vajillas y otras aplicaciones, para el procesamiento de textiles (por ejemplo, el desencolado), en la alimentación animal para mejorar la digestibilidad y para la panificación y la elaboración de cerveza. Estos y otros aspectos de las composiciones y procedimientos se describen en detalle a continuación. La invención se define por las reivindicaciones.
Antes de describir los diversos aspectos y formas de realización de las presentes composiciones y procedimientos, se describen las siguientes definiciones y abreviaturas.
1. Definiciones y abreviaturas
De acuerdo con la presente descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe señalar que las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales enzimas, y la referencia a "la dosis" incluye la referencia a una o más dosis y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, etc.
El presente documento está organizado en varias secciones para facilitar su lectura; sin embargo, el lector apreciará que las afirmaciones realizadas en una sección pueden aplicarse a otras secciones. De esta forma, los encabezamientos utilizados para las diferentes secciones de la divulgación no deberán interpretarse como limitativos. A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la técnica. A continuación, se proporcionan los términos siguientes.
1.1. Abreviaturas y acrónimos
Los acrónimos/abreviaturas siguientes tienen los significados siguientes a menos que se especifique lo contrario:
1.2. Definiciones
Los términos "amilasa" o "enzima amilolítica" se refieren a una enzima que es, entre otras cosas, capaz de catalizar la degradación del almidón. Las a-amilasas son hidrolasas que escinden los enlaces a-D -(1^4) O-glucosídicos en el almidón. Generalmente, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D-(1^4)-glucano glucanohidrolasa) se definen como enzimas endoactivas que escinden enlaces a-D -(1^4) O-glucosídicos dentro de la molécula de almidón de forma aleatoria produciendo polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa enlazadas en (1-4)-a. Por el contrario, las enzimas amilolíticas exoactivas, tales como las p-amilasas (EC 3.2.1.2; a-D-(1-4)-glucano maltohidrolasa) y algunas amilasas específicas de productos tales como la a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133 ) escinden la molécula de polisacárido desde el extremo no reductor del sustrato. Las p-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; a-D-glucósido glucohidrolasa), glucoamilasa (EC 3.2.1.3; a-D-(1^4)-glucano glucohidrolasa) y amilasas específicas de producto tales como las maltotetraosidasas (EC 3.2.1.60) y las maltohexaosidasas (EC 3.2.1.98) pueden producir maltooligosacáridos de una longitud específica o jarabes enriquecidos de maltooligosacáridos específicos.
"Unidades enzimáticas", en el presente documento, se refiere a la cantidad de producto formado por unidad de tiempo en las condiciones especificadas del ensayo. Por ejemplo, una "unidad de actividad de glucoamilasa" (GAU) se define como la cantidad de enzima que produce 1 g de glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble (4% de DS) a 60°C, pH 4,2. Una "unidad de almidón soluble" (SSU) es la cantidad de enzima que produce 1 mg de glucosa por minuto a partir de un sustrato de almidón soluble (4% de DS) a pH 4,5, 50°C. DS se refiere a "sólidos secos".
El término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto por carbohidratos de polisacáridos complejos de plantas, compuesto por amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H1üO5)x, en la que X puede ser cualquier número. El término incluye materiales de origen vegetal tales como granos, cereales, hierbas, tubérculos y raíces, y más específicamente materiales obtenidos de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, mandioca, mijo, milo, patata, boniato y tapioca. El término "almidón" incluye almidón granular. El término "almidón granular" se refiere a almidón crudo, es decir, almidón no cocido, por ejemplo, almidón que no se ha sometido a gelatinización.
Los términos "de tipo silvestre", "parental" o "de referencia" con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido de origen natural que no incluye ninguna sustitución, inserción o deleción artificial en una o más posiciones de aminoácidos. De forma similar, los términos "de tipo silvestre", "parental" o "de referencia" con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido de origen natural que no incluye ningún cambio de nucleósido artificial. No obstante, cabe señalar que un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo silvestre, parental o de referencia no se limita a un polinucleótido de origen natural y abarca cualquier polinucleótido que codifica el polipéptido de tipo silvestre, parental o de referencia.
Se entiende que la referencia al polipéptido de tipo silvestre incluye la forma madura del polipéptido. Un polipéptido "maduro" o variante del mismo es aquel en el que una secuencia señal está ausente, por ejemplo, escindida de una forma inmadura del polipéptido durante o después de la expresión del polipéptido.
El término "variante", con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de tipo silvestre, parental o de referencia específico en que incluye una o más sustituciones, inserciones o deleciones naturales o artificiales de un aminoácido. De forma similar, el término "variante", con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de tipo silvestre, parental o de referencia específico. La identidad del polipéptido o polinucleótido de tipo silvestre, parental o de referencia será evidente a partir del contexto.
En el caso de las presentes a-amilasas, "actividad" se refiere a la actividad de a-amilasa, que puede medirse tal como se describe en el presente documento.
El término "recombinante", cuando se usa con referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector en cuestión, indica que el sujeto ha sido modificado a partir de su estado nativo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos en niveles diferentes o en condiciones diferentes a las que se encuentran en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes se diferencian de una secuencia nativa en uno o más nucleótidos y/o están unidos operativamente a secuencias heterólogas, por ejemplo, un promotor heterólogo en un vector de expresión. Las proteínas recombinantes pueden diferir de una secuencia nativa en uno o más aminoácidos y/o están fusionadas con secuencias heterólogas. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una amilasa es un vector recombinante
Las "variantes combinatorias" son variantes que comprenden dos o más mutaciones, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., sustituciones, deleciones y/o inserciones.
Las "mutaciones combinables" son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que pueden usarse para crear variantes combinatorias. Las mutaciones combinables mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula (en este caso, una amilasa), sin reducir significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad. Las mutaciones combinables se pueden agrupar de la forma siguiente:
Grupo A:Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a una proteína parental definida para: (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad de micromuestras CS-28 a pH 8 (25°C) o pH 10 (50°C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente a pH 5,0 o pH 5,7 son superiores o iguales a 0,9, y además tiene un IR para uno cualquiera de estos ensayos que es superior o igual a 1,0.
Grupo B:Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a una proteína parental definida para: (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad de micromuestras CS-28 a pH 8 (25°C) o pH 10 (50°C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente a pH 5,0 o pH 5,7 es superior o igual a 0,8, y además tiene un IR para uno cualquiera de estos análisis que es superior o igual a 1,2.
Grupo C:Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a una proteína parental definida para: (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad de micromuestras CS-28 a pH 8 (25°C) o pH 10 (50°C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente a pH 5,0 o pH 5,7 es superior o igual a 0,5, y además tiene un IR para uno cualquiera de estos análisis que es superior o igual a 1,5.
Las propiedades y perfiles de mutaciones combinables se resumen en la tabla siguiente.
Tabla A. Propiedades de rendimiento perfiles para cada rupo de mutaciones combinables
Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en "posiciones productivas", tal como se describe a continuación. En el caso de las presentes amilasas, "actividad" se refiere a la actividad de amilasa, que puede medirse tal como se describe en el presente documento.
Las "posiciones productivas" son posiciones de aminoácidos que son tolerantes a la sustitución con diferentes residuos de aminoácidos, en las que las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se ha expuesto anteriormente. A las posiciones productivas se les puede asignar una puntuación de productividad de la forma siguiente: las posiciones en las que menos del 15% de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "1". Las posiciones en las que menos del 30%, pero una cantidad superior o igual al 15% de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "2". Las posiciones en las que menos del 50%, pero una cantidad superior o igual al 30% de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "3". las posiciones en las que el 50% o más de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "4". Las puntuaciones de productividad se describen en la tabla siguiente:
Criterios de rendimiento asociados a puntuaciones de productividad
Las posiciones productivas preferidas son mutaciones combinables.
La puntuación de idoneidad se refiere a la capacidad de una o más mutaciones combinables para usarse para crear variantes combinatorias, según los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se ha expuesto anteriormente) en el que se incluye cada una de las mutaciones. Una puntuación de idoneidad más alta indica una mutación o mutaciones que son más adecuadas para su uso en la creación de variantes combinatorias. Las puntuaciones de idoneidad se describen en la tabla siguiente:
Tabla C. D fini i n l n i n i n i
Los términos "recuperado", "aislado" y "separado" se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente específico que se retira de al menos otro material o componente con el que se asocia de forma natural tal como se encuentra en la naturaleza. Un polipéptido "aislado", del mismo, incluye, pero sin limitación, un caldo de cultivo que contiene un polipéptido secretado expresado en una célula huésped heteróloga.
El término "purificado" se refiere al material (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislado) que se encuentra en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente el 90% puro, al menos aproximadamente el 95% puro, al menos aproximadamente el 98% puro o incluso al menos aproximadamente el 99% puro.
El término "enriquecido" se refiere al material (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislado) que es aproximadamente el 50% puro, al menos aproximadamente el 60% puro, al menos aproximadamente el 70% puro o incluso al menos aproximadamente el 70% puro.
Los términos "termoestable" y "termoestabilidad", en referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima para conservar la actividad después de la exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como la enzima amilasa, se mide por su semivida (t<1 / 2>) dada en minutos, horas o días, durante la cual se pierde la mitad de la actividad enzimática en condiciones definidas. La semivida puede calcularse midiendo la actividad de la a-amilasa residual después de la exposición a (es decir, la provocación mediante) una temperatura elevada.
Un "intervalo de pH", en referencia a una enzima, se refiere al intervalo de valores de pH en los que la enzima muestra actividad catalítica.
Los términos "pH estable" y "estabilidad de pH", en referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima para conservar la actividad en un amplio intervalo de valores de pH durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 15 min, 30 min, 1 hora).
El término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo de los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido" y se usan indistintamente. Cuando tales secuencias de aminoácidos muestran actividad, pueden denominarse "enzima". Se utilizan los códigos convencionales de una o tres letras para los residuos de aminoácidos, presentándose las secuencias de aminoácidos en la orientación estándar amino a carboxi terminal (es decir, N ^C ).
El término "ácido nucleico" abarca ADN, ARN, heterodúplex y moléculas sintéticas capaces de codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden ser modificaciones químicas. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente. Dado que el código genético está degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un aminoácido particular, y las presentes composiciones y procedimientos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos particular. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácidos nucleicos se presentan en orientación 5' a 3'.
La "hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico forma un dúplex, es decir, pares de bases, con una cadena complementaria, tal como sucede durante las técnicas de hibridación por inmunotransferencia y las técnicas de PCR. Como ejemplo de condiciones rigurosas de hibridación, se puede mencionar la hibridación en las condiciones siguientes: 65°C y 0,1X SSC (en el que 1X SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de Na<3>, pH 7,0). Los ácidos nucleicos dúplex hibridados se caracterizan por una temperatura de fusión (T<f>), en los que una mitad de los ácidos nucleicos hibridados están mal emparejados con la cadena complementaria. Los nucleótidos mal emparejados en el dúplex reducen la T<f>. Un ácido nucleico que codifica una a-amilasa variante puede presentar una T<f>reducida en 1°C - 3°C o más en comparación con un dúplex formado entre el nucleótido de SEQ ID NO: 2 y su complemento idéntico.
Una molécula "sintética" se produce mediante síntesis química o enzimáticain vitroen lugar de mediante un organismo.
Los términos "transformado", "transformado de forma estable" y "transgénico", utilizados en referencia a una célula, significan que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o portada como un episoma que se mantiene a lo largo de múltiples generaciones.
El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección", "transformación" o "transducción", tal como se conoce en la técnica.
Una "cepa huésped" o "célula huésped" es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus u otro constructo de ADN, incluido un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, una amilasa). Ejemplos de cepas huésped son células de microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos filamentosos y levaduras) capaces de expresar el polipéptido de interés y/o fermentar sacáridos. El término "célula huésped" incluye protoplastos creados a partir de células.
El término "heterólogo", en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no se encuentra de forma natural en una célula huésped.
El término "endógeno", en referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que se produce de forma natural en la célula huésped.
El término "expresión" se refiere al proceso mediante el que se produce un polipéptido basándose en una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.
Un "marcador selectivo" o "marcador seleccionable" se refiere a un gen que puede expresarse en un huésped para facilitar la selección de células huésped que portan el gen. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, sustancias antimicrobianas (por ejemplo, higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional, en la célula huésped.
Un "vector" se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fagos, casetes y similares.
Un "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia de codificación está operativamente unida a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Dichas secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosomas adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción.
El término "unido operativamente" significa que los componentes específicos se encuentran en una relación (que incluye, pero sin limitación, la yuxtaposición) que les permite funcionar de una forma prevista. Por ejemplo, una secuencia reguladora está operativamente unida a una secuencia de codificación de forma que la expresión de la secuencia de codificación se encuentra bajo el control de las secuencias reguladoras.
Una "secuencia señal" es una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteína, lo que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de una proteína extracelular carece de la secuencia señal, que se escinde durante el proceso de secreción.
"Biológicamente activo" se refiere a una secuencia que tiene una actividad biológica específica, tal como una actividad enzimática.
El término "actividad específica" se refiere al número de moles de sustrato que pueden convertirse en producto mediante una enzima o preparación enzimática por unidad de tiempo en condiciones específicas. La actividad específica se expresa generalmente en unidades (U)/mg de proteína.
Tal como se utiliza en el presente documento, "dureza del agua" es una medida de los minerales (por ejemplo, calcio y magnesio) presentes en el agua.
Una "muestra" es una pieza de material, tal como un tejido, a la que se le ha aplicado una mancha. El material puede ser, por ejemplo, tejidos de algodón, poliéster o mezclas de fibras naturales y sintéticas. La muestra puede ser además papel, tal como papel de filtro o nitrocelulosa, o una pieza de un material duro tal como cerámica, metal o vidrio. En el caso de las amilasas, la mancha está basada en almidón, pero puede incluir sangre, leche, tinta, hierba, té, vino, espinacas, salsa, chocolate, huevo, queso, barro, pigmento, aceite o mezclas de estos compuestos.
Una "muestra más pequeña" es una sección de la muestra que se ha cortado con un dispositivo perforador de un solo orificio, o que se ha cortado con un dispositivo perforador de 96 orificios fabricado a medida, en la que el patrón del perforador de múltiples orificios coincide con placas de microvaloración de 96 pocillos estándar, o la sección se ha extraído de la muestra de otra forma. La muestra puede ser de material textil, papel, metal u otro material adecuado. A la muestra más pequeña se le puede aplicar la mancha antes o después de colocarla en el pocillo de una placa de microvaloración de 24, 48 o 96 pocillos. La muestra más pequeña también se puede producir aplicando una mancha a una pieza pequeña de material. Por ejemplo, la muestra más pequeña puede ser una pieza de tejido manchada de 5/8" o 0,25" de diámetro. El perforador fabricado a medida está diseñado de tal manera que proporciona 96 muestras simultáneamente a la totalidad de los pocillos de una placa de 96 pocillos. El dispositivo permite proporcionar más de una muestra por pocillo simplemente cargando la misma placa de 96 pocillos varias veces. El dispositivo perforador de múltiples agujeros puede estar diseñado para proporcionar muestras simultáneamente en una placa de cualquier formato, incluidas, pero sin limitación, placas de 24, 48 o 96 pocillos. En otro procedimiento posible, la plataforma de ensayo sucia puede ser una perla fabricada de metal, plástico, vidrio, cerámica u otro material adecuado que se recubre con el sustrato de suciedad. Las, una o más, perlas recubiertas se colocan entonces en placas de 96, 48 o 24 pocillos o en formatos más grandes, que contienen tampón y enzima adecuados.
"Un material celular cultivado que comprende una amilasa" o expresiones similares, se refiere a un lisado o sobrenadante celular (incluido el medio) que incluye una amilasa como componente. El material celular puede ser de un huésped heterólogo que se cultiva en cultivo con el fin de producir la amilasa.
"Porcentaje de identidad de secuencia" significa que una secuencia particular presenta al menos un determinado porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos a los de una secuencia de referencia específica, al alinearse utilizando el algoritmo CLUSTAL W con parámetros por defecto. Véase Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res.
22:4673-4680. Los parámetros por defecto para el algoritmo CLUSTAL W son:
Las deleciones se cuentan como residuos no idénticos, en comparación con una secuencia de referencia. Se incluyen las deleciones que se producen en cualquier extremo terminal. Por ejemplo, una variante con cinco deleciones de aminoácidos del extremo C del polipéptido CspAmy2 maduro de SEQ ID NO: 1 tendría un porcentaje de identidad de secuencia del 99% (612/617 residuos idénticos x 100, redondeado al número entero más cercano) con respecto al polipéptido maduro. Dicha variante estaría abarcada por una variante que tenga "al menos el 99% de identidad de secuencia" con un polipéptido de amilasa maduro.
Las secuencias polipeptídicas "fusionadas" están conectadas, es decir, unidas operativamente, por medio de un enlace peptídico entre dos secuencias polipeptídicas en cuestión.
El término "hongos filamentosos" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina, en particular la especie Pezizomycotina.
El término "grado de polimerización" (DP) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Ejemplos de DP1 son los monosacáridos glucosa y fructosa. Ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. El término "DE" o "equivalente de dextrosa" se define como el porcentaje de azúcar reductor, es decir, D-glucosa, como fracción del total de carbohidratos en un jarabe.
El término "contenido de sólidos secos" (ds) se refiere a los sólidos totales de una suspensión en porcentaje de peso seco. El término "suspensión" se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.
La expresión "sacarificación y fermentación simultáneas (SSF)" se refiere a un proceso en la producción de productos bioquímicos en el que un organismo microbiano, tal como un microorganismo etanologénico, y al menos una enzima, tal como una amilasa, están presentes durante la misma etapa del proceso. La SSF incluye la hidrólisis simultánea de sustratos de almidón (granular, licuado o solubilizado) para dar sacáridos, incluida la glucosa, y la fermentación de los sacáridos en alcohol u otro bioquímico o biomaterial en el mismo recipiente de reacción.
Un "microorganismo etanologénico" se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azúcar u oligosacárido en etanol.
El término "bebida fermentada" se refiere a cualquier bebida producida mediante un procedimiento que comprende un proceso de fermentación, tal como una fermentación microbiana, por ejemplo, una fermentación bacteriana y/o fúngica. La "cerveza" es un ejemplo de dicha bebida fermentada, y se considera que el término "cerveza" comprende cualquier mosto fermentado que se ha producido mediante un proceso de fermentación/elaboración de cerveza de un material vegetal que contiene almidón. A menudo, la cerveza se produce exclusivamente a partir de malta o adjunto, o cualquier combinación de malta y adjunto. Los ejemplos de cervezas incluyen: cerveza de pura malta, cerveza elaborada según la ley de pureza "Reinheitsgebot", cerveza de fermentación alta (ale), India pale ale, cerveza de baja fermentación (lager), pilsner, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida afín a la cerveza, cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza baja en calorías, porter, bock, dopplebock, stout, porter, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares, pero también bebidas a base de malta y cereales alternativas, tales como bebidas de malta con sabor a fruta, por ejemplo, bebidas de malta con sabor a cítrico, tales como con sabor a limón, naranja, lima o bayas, bebidas a base de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila o bebidas de malta con sabor a café, tales como licor de malta con sabor a cafeína, y similares.
El término "malta" se refiere a cualquier grano de cereal malteado, tal como cebada o trigo malteados.
El término "adjunto" se refiere a cualquier material vegetal que contenga almidón y/o azúcar que no sea malta, tal como la malta de cebada o trigo. Entre los ejemplos de adjuntos, se incluye sémola de maíz común, sémola de maíz refinada, levadura de cerveza molida, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereal torrefacto, copos de cereal, centeno, avena, patata, tapioca, mandioca y jarabes, tales como jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabes de cebada y/o de trigo y similares.
El término "macerado" se refiere a una suspensión acuosa de cualquier material vegetal que contenga almidón y/o azúcar, tal como malta molida, por ejemplo, que comprende malta de cebada triturada, cebada triturada y/u otro adjunto o una combinación de los mismos, mezclada con agua para después separarse en mosto y bagazo.
El término "mosto" se refiere al extracto de licor no fermentado después de extraer la malta molida durante la maceración.
"Almidón positivo a yodo" o "IPS" se refiere a (1) amilosa que no se hidroliza después de la licuefacción y sacarificación, o (2) un polímero de almidón retrogradado. Al analizar almidón sacarificado o licor de sacárido con yodo, la amilosa de alto DPn o el polímero de almidón retrogradado se une al yodo y produce un color azul característico. Por lo tanto, el licor de sacárido se denomina "sacárido positivo a yodo", "sacárido azul" o "sac azul".
Los términos "almidón retrogradado" o "retrogradación del almidón" se refieren a cambios que se producen espontáneamente en una pasta o gel de almidón al envejecer.
El término "aproximadamente" se refiere a ±15% del valor de referencia.
2. Variantes de a-amilasa
Un aspecto de las presentes composiciones y procedimientos son las enzimas de amilasa variante, que se definen en las reivindicaciones y que se han descubierto utilizando una combinación de enfoques experimentales, incluido el uso de bibliotecas de evaluación de sitios (SEL) y el análisis basado en la estructura.
2.1 Variantes de a-amilasa basadas en una biblioteca SEL de a-amilasa de Cytophaga sp.
Una a-amilasa deCytophagasp. (en el presente documento, amilasa CspAmy2") se ha descrito anteriormente (Jeang,C-L et al. (2002) Applied and Environmental Microbiology, 68:3651-54). La secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido de amilasa CspAmy2 se muestra a continuación (SEQ ID NO: 1):
AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS
QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD WMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSRIFKFRGT GKAWDWEVSS ENGNYDYLMY ADIDYDHPDV VNEMKKWGVW YANEVGLDGY RLDAVKHIKF SFLKDWVDNA RAATGKEMFT VGEYWQNDLG ALNNYLAKVN YNQSLFDAPL HYNFYAASTG GGYYDMRNIL NNTLVASNPT KAVTLVENHD TQPGQSLEST VQPWFKPLAY AFILTRSGGY PSVFYGDMYG TKGTTTREIP ALKSKIEPLL KARKDYAYGT QRDYIDNPDV IGWTREGDST KAKSGLATVI TDGPGGSKRM YVGTSNAGEI WYDLTGNRTD KITIGSDGYA TFPVNGGSVS VWVQQ
En la SEQ ID NO: 1 la arginina 178 y la glicina 179 están subrayadas. Se ha descrito también una variante de la aamilasa deCytophaga sp.que presenta una deleción tanto de arginina 178 como de glicina 179 (en el presente documento, CspAmy2-v1) (Shiau, R-J. et al. (2003) Applied and Environmental Microbiology, 69:2383-85). La secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido de amilasa CspAmy2-v1 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 2:
AATNGTMMQY FEWYVPNDGQ QWNRLRTDAP YLSSVGITAV WTPPAYKGTS QADVGYGPYD LYDLGEFNQK GTVRTKYGTK GELKSAVNTL HSNGIQVYGD WMNHKAGAD YTENVTAVEV NPSNRNQETS GEYNIQAWTG FNFPGRGTTY SNFKWQWFHF DGTDWDQSRS LSRIFKFTGK AWDWEVSSEN GNYDYLMYAD IDYDHPDWN EMKKWGVWYA NEVGLDGYRL DAVKHIKFSF LKDWVDNARA ATGKEMFTVG EYWQNDLGAL NNYLAKVNYN QSLFDAPLHY NFYAASTGGG YYDMRNILNN TLVASNPTKA VTLVENHDTQ PGQSLESTVQ PWFKPLAYAF ILTRSGGYPS VFYGDMYGTK GTTTREIPAL KSKIEPLLKA RKDYAYGTQR DYIDNPDVIG WTREGDSTKA KSGLATVITD GPGGSKRMYV GTSNAGEIWY DLTGNRTDKI TIGSDGYATF PVNGGSVSVW VQQ
Se identificaron variantes de a-amilasa que incluyen mutaciones combinables creando una biblioteca de evaluación de sitios (SEL) basada en CspAmy2-v1 y analizando las variantes resultantes para la hidrólisis de la harina y el almidón de maíz, el ensayo de termoestabilidad, el rendimiento de limpieza, la estabilidad en detergente y la actividad en un ensayo de amilasa normalizado y niveles de expresión, cuyos procedimientos detallados se describen en los ejemplos o se conocen de otro modo. Cada variante se analizó para determinar las diferentes propiedades enzimáticas y bioquímicas y se caracterizó mediante un valor de índice de rendimiento (IR), que comparó el rendimiento relativo de la variante con la amilasa CspAmy2-v1 para cada criterio de rendimiento. Un IR superior a 1 (es decir, IR>1) indicó un rendimiento mejorado por parte de una variante en comparación con CspAmy2-v1, mientras que un IR de 1 (es decir, IR=1) indicó una variante con el mismo rendimiento que CspAmy2-v1, y un IR inferior a 1 (es decir, IR<1) indicó una variante con un rendimiento peor que CspAmy2-v1. A continuación, se utilizaron los valores de IR para identificar mutaciones combinables y posiciones productivas.
Las mutaciones combinables son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras que no reducen significativamente la expresión, la actividad ni la estabilidad. Las mutaciones combinables se asignan a uno de los tres grupos (es decir, A, B o C), tal como se establecen en el presente documento. Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en las posiciones productivas establecidas en las reivindicaciones. Las posiciones productivas son posiciones de aminoácidos que son tolerantes a la sustitución por distintos residuos de aminoácidos, en las que las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se establece en el presente documento.
Las mutaciones combinables y las posiciones productivas no deben confundirse con mutaciones de sitio único previamente identificadas, algunas de las cuales posteriormente se ha descubierto, mediante ensayo y error, que funcionan en combinación con otras mutaciones. Las mutaciones de sitio único previamente identificadas son invariablemente "ganadoras" con respecto a la mejora de cualquier característica de rendimiento o estabilidad. Si bien esto las convierte en mutaciones atractivas para incluir en amilasas variantes, estas "ganadoras" tienden a afectar negativamente a otras características de rendimiento o estabilidad de las variantes, lo que a menudo requiere realizar mutaciones adicionales para corregir los defectos.
Por el contrario, las mutaciones combinables pueden ser solo progresivamente beneficiosas para mejorar cualquier característica de rendimiento o estabilidad de una amilasa variante. Sin embargo, se seleccionan cuidadosamente para que sean mínimamente perjudiciales para otras características deseadas de rendimiento o estabilidad, lo que las hace muy adecuadas para su uso en combinación con otras mutaciones combinables para construir amilasas variantes que tengan propiedades enzimáticas y bioquímicas mejoradas deseadas sin verse perjudicadas en otras, lo que da como resultado variantes robustas que presentan un buen equilibrio entre rendimiento, estabilidad y potencial de expresión.
Además, basándose en las propiedades enzimáticas y bioquímicas medidas de las amilasas variantes, se determinaron las puntuaciones de idoneidad de las diferentes mutaciones para crear variantes combinatorias. La puntuación de idoneidad se refiere a la capacidad de una o más mutaciones combinables de usarse para crear variantes combinatorias, según los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se han expuesto anteriormente), en los que se incluye cada una de las mutaciones.
Las puntuaciones de idoneidad de las sustituciones individuales en CspAmy2-v1 se muestran en la tabla D. La numeración de posiciones se basa en la secuencia de aminoácidos del polipéptido CspAmy2 maduro (SEQ ID NO: 1). A los residuos de tipo silvestre en las posiciones indicadas se les asigna una puntuación de idoneidad de ++. Las sustituciones que tienen más probabilidades de poder combinarse con otras mutaciones reciben una puntuación de idoneidad de +++, o incluso ++++. En general, las puntuaciones de idoneidad preferidas son ++, +++ o ++++, +++ o ++++, o incluso ++++.
Mientras la evaluación de mutaciones basada en la puntuación de idoneidad representa un aspecto refinado de las presentes composiciones y procedimientos, la identificación de posiciones productivas, que son tolerantes a la sustitución con diferentes residuos de aminoácidos, representa una serie de formas de realización significativa, que se establecen en las reivindicaciones.
Cada posición productiva identificada en las siguientes listas con criterios específicos, y cada sustitución identificada entre paréntesis después del identificador numérico de posición en cada una de estas listas, representa una mutación, identificada mediante datos experimentales, que o bien contribuye directamente al rendimiento de una variante de amilasa, o bien se determina que es combinable con otras mutaciones para producir una variante de amilasa con rendimiento mejorado.
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "1", "2", "3" y "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en el polipéptido CspAmy2 maduro (SEQ ID NO: 1).
LISTA A:
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P, Q,R,S); 4(N,Q,T); 5(G,A,C,D,E,F,H, I, K, L, M, N, P, Q, R,S,T,V,Y); 7(M, I); 8(M, F); 11(F,Y); 15(V,C, I, L, N, S,T); 20(Q, E); 21(Q, L,T,W); 23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 26(R,K); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 39(A,S); 40(V,I); 42(T,A,C,I,L,M,V); 45(A,P,S); 46(Y,F,M,T); 48(G,A); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 51(Q,S); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W); 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 57(G,K); 58(P,C); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 71(G,A,N); 72(T,G,H,S); 73(V,T); 75(T,C); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 82(E,Q); 83(L,F); 84(K,I,Q,V); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 87(V,I); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T); 94(G,N); 96(Q,I); 97(V,I); 98(Y,F,W); 101 (V, I); 103(M,I,V); 104(N,D); 106(K,A,I,V); 107(A,G); 108(G,A,K,R,S); 109(A,P); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 113(E,D,Y); 114(N,G); 115(V,A,I,M); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 117(A,C,S); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 119(E,S); 120(V,C); 121(N,K,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 124(N,D); 126(N,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F, G,H,M,P,Q, S, T, Y); 135(I,H,M,R,V); 136(Q , A, F, G , H , I, K, N , T, W, Y); 137(A, V); 138(W, A, D , F, G , H , K, L, M , P, Q , R , S , T, V, Y); 140(G , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , S , T, V, Y); 141(F,H,W); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 151(S,D); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 153(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 157(W,N); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 160(F,C); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 164(D,F,N); 165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); 173(R,K,W); 174(I,L); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 176(K,L); 177(F,G,H); 182(K,H); 183(A,E,K,R); 187(E,P,V); 189(S,A,C,D); 190(S,P); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 195(Y,D); 198(L,A,C,G); 200(Y,E,L); 201(A,L); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 210(V,S); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 216(K,R); 219(V,E,I,L); 222(A,T); 225(V,L); 226(G,C,E,K,Q); 227(L,Y); 232(L,R,V); 235(V,A,C,L,T); 238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q); 240(F,D); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 245(D,E); 246(W,F); 248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 250(A,S); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 254(T,F,I,L,M); 256(K,R); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 259(F,P); 260(T,A,L,S,Y); 262(G,A); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 267(N,D); 269(L,A,I,V); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 271(A,C,S); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 275(Y,F); 276(L,M); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 281(Y,A,D,G); 283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 285(L,A); 286(F,L,M); 288(A,V); 295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R); 301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 302(G,S); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W); 307(R,Q,S); 308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 310(L,D,E,T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V); 312(N,D,G); 313(T,A,S); 316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 321(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 327(E,D); 335(Q,G); 336(S,A,D); 339(S,Q); 342(Q,E,L); 343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 363(V,I,L); 368(M,L,W,Y); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 375(T,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 378(E,Q); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 390(L,C,I); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 392(A,G); 394(K,E,H,M); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K); 397(A,S); 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 401(Q,M); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 403(D,S); 404(Y,W); 405(I,L); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 409(D,N); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 414(T,A,S); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R, T, V,Y); 420(T,A, C,D,E,F, G,H,I,L,P,Q,R, S, V,W, Y); 421(K,A, C,F, G,H,I,L,N,R, S, W, Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 424(S,A); 426(L,C); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 431(T,A,D); 433(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T); 444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V); 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 449(E,Q); 450(I, A, C , D , F, H , K, L , N , P, Q , R , T, V); 452(Y, A, I, L , M , S , V,W); 454(L , A, C , E , F, H , I, K, M , Q , S , T, V, Y); 455(T, A, C , I, L , M , S , V); 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A, D,G, I, L, M, N, P, S,Y); 462(I,V); 463(T,C, E, F, I, K, L, M, N,V,Y); 464(I,V); 465(G,A, M, N, P, Q); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y); 467(D,N); 469(Y,C,F,I,L,S,V); 470(A,G); 471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 474(V, C); 475(N, A , D , F, G , H , I, K, L , M , P,S , T, V); 476(G , A, C , D , E , H , K, N , P,Q , R , S , T, V, Y); 477(G , A, D , E , H , I, K, P,Q , R , S , T, V, Y); 479(V,C,H,W); 480(S,G); 481(VA,C,I,L); 482(W,Y); 483(V,I); 484(Q,A,H,K) y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "2", "3" y "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA B:
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S); 5(G,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 15(V,C,I,L,N,S,T); 21(Q,L,T,W); 23 (N,A,D,E,F ,H,K,M,Q, S, T, V, W, Y); 27(T,D,E,F, G,H,I,K,L,M,N,Q,R, S, W, Y); 28(D,A,E,N); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 42(T,A,C,I,L,M,V); 46(Y,F,M,T); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W); 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 72(T,G,H,S); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 84(K,I,Q,V); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T); 106(K,A,I,V); 108(G,A,K,R,S); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 115(V,A,I,M); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 121(N,K,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 135(I,H,M,R,V); 136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y); 138(W, A, D , F, G , H , K, L , M , P, Q , R , S , T, V, Y); 140(G , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , S , T, V, Y); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 153(F, H ,W, Y); 154(K, A, E , F, H , N , R , S , T); 156(Q , D , F, G , H , I, K, L , M , S , T, V, Y); 158(F, A, C , D , E , G , H , I, L , N , P, R , S , T, V, W, Y); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 183(A,E,K,R); 189(S,A,C,D); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 198(L,A,C,G); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 219(V,E,I,L); 226(G,C,E,K,Q); 235(V,A,C,L,T); 238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 254(T,F,I,L,M); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 260(T,A,L,S,Y); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 269(L,A,I,V); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 281(Y,A,D,G); 283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R); 301(G , A, F, H , K, M , Q , R , S , T, Y); 303(Y, A, F, I, R , T, V,W); 308(N , A, C , D , E , F, G , H , L , M , Q , R , S , T, V, Y); 310(L , D , E , T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V); 316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 321(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 368(M,L,W,Y); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 394(K,E,H,M); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K); 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q, S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R, S,Y); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A, C , D , E , F, G , H , I, L , P, Q , R , S , V,W, Y); 421(K, A, C , F, G , H , I, L , N , R , S ,W, Y); 422(A, C , D , E , I, K, L , M , N , P, Q , R , S , T, V,W, Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 433(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T); 444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V); 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V); 452(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V); 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T, C , E , F, I, K, L , M , N , V, Y); 465(G , A, M , N , P, Q); 466(S , A, C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , R , T, V,W, Y); 469(Y, C , F, I, L , S , V); 471 (T, A, D , E , F, G , H , I, K, N , P, Q , W); 475(N , A, D , F, G , H , I, K, L , M , P, S , T, V); 476(G , A, C , D , E , H , K, N , P, Q , R , S , T, V, Y); 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); 479(V,C,H,W); 481(VA,C,I,L); 484(Q,A,H,K) y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "3" y "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA C:
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, Y); 3(T, A,D,F,G,M,P,Q,R,S) 5(G,A,C,D,E,F,H , I, K, L , M , N , P, Q , R , S , T, V, Y); 15(V, C , I, L , N , S , T); 23(N , A, D , E , F, H , K, M , Q , S , T, V,W, Y) 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W) 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 42(T,A,C,I,L,M,V); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W) 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y) 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V) 111(Y, A, C , D , F, G , H , K, L , M , N , Q , R , S , T, V, W); 112(T, A, C , D , E , F, G , I, L , M , P, Q , R , V,W, Y) 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T) 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y) 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y) 133(Y, A, D , E , F, H , K, L , N , T, V); 134(N , C , D , F, G , H , M , P, Q , S , T, Y); 136(Q , A, F, G , H , I, K, N , T, W, Y) 138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 142(N,A,C,D,E,F ,G,H,I,K,L,M, Q,R,S, T V, W, Y); 144(P,A,C,D,F, G,H,I,K,L,M,N,Q,R, T, Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y) 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y) 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T) 156(Q , D , F, G , H , I, K, L , M , S , T, V, Y); 158(F, A, C , D , E , G , H , I, L , N , P, R , S , T, V,W, Y); 163(T, C , D , F, L , M , N , Q , S , V) 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R, T, V,W) 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T); 171 (L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R, S, V,W, Y) 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y) 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y) 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y) 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y) 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V) 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W) 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y) 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T) 301(G , A , F, H , K, M , Q , R , S , T, Y); 303(Y, A, F, I, R , T, V, W); 308(N ,A , C , D , E , F, G , H , L , M , Q , R , S , T, V, Y); 311(N , D , E , H , K, Q , S , V) 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y) 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V) 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y) 384(S,D,E,G,H,N,P); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K) 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S) 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 416(E,C,D,F ,G,H,K,L,M,N, Q,R, S, T, V) 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y) 421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y) 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W) 444(T,A,E,F ,H,I,K,L,M,N,P,Q, V, Y); 445(S,A,C,D,H,M,R, T, V,W); 44 7(A, G,K, Q,R,S, T, V) 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V); 452(Y,A,I,L,M,S,V,W) 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V); 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y) 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y) 465(G , A , M , N , P, Q); 466(S , A, C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , R , T, V, W, Y); 469(Y, C , F, I, L , S , V); 471(T, A, D , E , F, G , H , I, K, N , P, Q ,W): 475(N , A , D , F, G , H , I, K, L , M , P, S , T, V); 476(G , A , C , D , E , H , K, N , P, Q , R , S , T, V, Y); 477(G , A , D , E , H , I, K, P, Q , R , S , T, V, Y) y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA D:
1 (A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S) 5(G, A , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , P,Q , R , S , T, V, Y); 23(N , A, D , E , F, H , K, M , Q , S , T, V,W,Y); 27(T, D, E , F, G , H , I, K, L , M , N , Q , R , S ,W, Y) 30(P, A , C , D , E , F, G , H , K, L , N , R , S , T, W, Y); 49(T, A, C , D , E , F, G , H , I, K, L , M , N , S , V, Y); 52(A, F, G , H , I, K, N , Q , S , T, W) 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y) 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W) 112(T, A, C , D , E , F, G , I, L , M , P, Q , R , V,W, Y); 116(T, A , C , D , E , G , H , I, K, L , M , N , S , V, W); 118(V, A , C , F, I, K, L , M , N , Q , R , S) 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R, T, V, Y); 128(E, G,I,K, S, V, Y); 129(T,A,F ,G,H,I,K,L,Q,R, S V, Y); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V) 134(N , C , D , F, G , H , M , P, Q , S , T, Y); 136(Q , A , F, G , H , I, K, N , T, W, Y); 138(W, A, D , F, G , H , K, L , M , P, Q , R , S , T, V, Y) 140(G , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , S , T, V, Y); 142(N , A, C , D , E , F, G , H , I, K, L , M , Q , R , S , T, V, W, Y) 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V) 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W) 152(N , A , C , D , E , F, G , H , L , M , Q , R , S , T, V,W); 156(Q , D , F, G , H , I, K, L , M , S , T, V, Y); 158(F, A, C , D , E , G , H , I, L , N , P, R , S , T, V,W, Y) 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W) 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T) 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y) 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y) 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 241(SAC,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y) 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V) 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W) 270(GAC,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y) 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y) 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y) 308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y) 318(N , A , C , D , E , F, H , I, K, L , M , Q , R , S , V,W, Y); 320(T, A, C , D , E , G , H , K, M , N , P, Q , R , V, W, Y); 357(S , A, C , D , E , L , M , N , Q , V, Y) 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P); 388(P,C,D,I,K,L,R,S) 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y) 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y) 420(T,A, C , D , E , F, G , H , I, L , P, Q , R , S , V, W, Y); 421(K, A, C , F, G , H , I, L , N , R , S , W, Y); 422(A , C , D , E , I , K, L , M , N , P, Q , R , S , T, V,W, Y) 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y) 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W) 448(G , A , D , E , F, H , K, L , N , Q , T, W,Y); 450(I, A , C , D , F, H , K, L , N , P, Q , R , T, V); 454(L ,A , C , E , F, H , I , K, M , Q , S , T, V, Y) 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W) 461 (K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y) 471 (T, A, D , E , F, G , H , I, K, N , P, Q , W); 475(N , A, D , F, G , H , I, K, L , M , P, S , T, V); 476(G , A, C , D , E , H , K, N , P, Q , R , S , T, V, Y) 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y) y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA E:
1,5, 15, 23, 30, 31,49, 68, 111, 112, 116, 123, 127, 128, 129, 131, 132, 134, 140, 142, 144, 147, 150, 152, 153, 168, 170, 171, 183, 187, 192, 203, 207, 209, 211, 212, 232, 241, 243, 244, 253, 266, 277, 280, 300, 301, 308, 320, 357, 362, 377, 388, 400, 402, 408, 416, 420, 423, 448, 450, 454, 455, 456, 458, 466, 475 y 485
Las posiciones productivas y las sustituciones dentro de esas posiciones en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA F:
1(A,K,V,Y); 5(G,F,V); 15(V,S); 23(N,K); 30(P,E,K,L,W); 31(Y,F,K,W); 49(T,I); 68(N,Y); 111(Y,D,Q,S,T,W); 112(T,I,W) 116(T,L); 123(S,K); 127(Q,I); 128(E,I,V); 129(T,I); 131(G,H,K); 132(E,G,H,I,M,P,R,T,V,Y); 134(N,D,F,M,Y) 140(G,E,F,H,K); 142(N,D,I,R); 144(P,G,K,L); 147(G,C,E,H,L,R,V); 150(Y,W); 152(N,D,E,L,R); 153(F,H,Y); 168(S,L) 170(S,R); 171(L,H,N,Q,R); 183(A,K); 187(E,P); 192(N,F,Y); 203(I,C); 207(H,E,F); 209(D,G); 211(V,D,E,N,Q) 212(N,D,E); 232(L,R); 241(S,D,E,I,L,W,Y); 243(L,S); 244(K,C); 253(A,R); 266(Q,I,R,W); 277(A,F,L,Y); 280(N,L) 300(G,R); 301(G,H); 308(N,D,E,F,L,R,V,Y); 320(T,E,W); 357(S,E); 362(S,I,V); 377(R,G,H); 388(P,K); 400(T,E,K,L,W,Y) 402(R,F); 408(P,E,R,W); 416(E,C,F,G,H,K,L,N,R,S,V); 420(T,D,E,I,L,R,W); 423(K,E,F,G,M,N,Q,S,V,Y): 448(G,F,H,K,W); 450(I,K,R,T); 454(L,C); 455(T,L,M); 456(G,F,W); 458(R,A,C,D,E,F,I,S); 466(S,I,L); 475(N,D) y 485(Q,E,K,L,Y,Y)
Aunque las mutaciones anteriores se identificaron usando una biblioteca SEL basada en CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2), se sabe que muchas a-amilasas bacterianas (y otras) comparten el mismo plegamiento y, a menudo, comparten una identidad de secuencia de aminoácidos significativa y a menudo se benefician de las mismas mutaciones. En el caso presente, las posiciones de aminoácidos correspondientes en otras a-amilasas pueden identificarse fácilmente mediante la alineación de la secuencia de aminoácidos con CspAmy2 (SEQ ID NO: 1) o CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2), usando Clustal W con parámetros por defecto. Las a-amilasas en las que es probable que las mutaciones anteriores produzcan un beneficio en el rendimiento incluyen aquellas que tienen un plegamiento similar y/o que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos del 60% o superior con cualquiera de las las amilasas conocidas deBacillus(por ejemplo, deB. lichenifomis, B. stearothermophilus, y B. amyloliquifaciens),las amilasas de la familia 13 de la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy), o cualquier amilasa a la que se haya hecho referencia hasta el momento con el término descriptivo "de tipo Termamyl". El lector apreciará que en los casos en los que una a-amilasa tiene de forma natural una mutación enumerada anteriormente (es decir, en los casos en los que la a-amilasa de tipo silvestre ya comprendía un residuo identificado como una mutación), entonces esa mutación particular no se aplica a esa a-amilasa. Sin embargo, otras mutaciones descritas pueden funcionar en combinación con el residuo que se produce de forma natural en esa posición.
Las variantes de a-amilasa definidas en las reivindicaciones tienen un grado definido de homología/identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, que es al menos el 60%, al menos 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 76%, al menos el 77%, al menos el 78%, al menos el 79%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o incluso al menos el 99% de homología/identidad de secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de cada mutación combinable es ++, +++ o ++++. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de cada mutación combinable es +++ o ++++. En algunas formas de realización, la puntuación de idoneidad de cada mutación combinable es ++++. Las variantes definidas en las reivindicaciones tienen una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, o más) de mutaciones combinables.
En algunas formas de realización, las presentes variantes de a-amilasa definidas en las reivindicaciones comprenden además una mutación en el bucle de unión a calcio basada en el trabajo de Suzuki et al. (1989) J. Biol. Chem.
264:18933-938. Los ejemplos de mutaciones incluyen una deleción o sustitución en uno o más residuos correspondientes a Arg-178, Gly-179, Thr-180 o Gly-181 en la SEQ ID NO: 1. En formas de realización particulares, la mutación corresponde a la deleción de Arg-178 y Gly-179 o Thr-180 y Gly-181. (usando la numeración de la SEQ ID NO: 1). Los residuos homólogos en otras amilasas se pueden determinar mediante alineamiento estructural o mediante alineamiento de la estructura primaria, tal como se ilustra en la figura 6.
2.2 Mutaciones adicionales
En algunas formas de realización, además de las mutaciones establecidas en las reivindicaciones, las presentes amilasas incluyen además una o más mutaciones que proporcionan un beneficio adicional de rendimiento o estabilidad. Los ejemplos de beneficios de rendimiento incluyen, pero sin limitación, un aumento de la hidrólisis de un sustrato de almidón, un aumento del rendimiento de licuefacción de un grano, cereal u otro sustrato de almidón, un aumento del rendimiento de limpieza, un aumento de la termoestabilidad, un aumento de la estabilidad de almacenamiento, un aumento de la solubilidad, una alteración del perfil de pH, una reducción de la dependencia al calcio, un aumento de la actividad específica, una modificación de la especificidad de sustrato, una modificación de la unión al sustrato, una modificación de la actividad dependiente del pH, una modificación de la estabilidad dependiente del pH, un aumento de la estabilidad oxidativa, y un aumento de la expresión. En algunos casos, el beneficio de rendimiento se logra a una temperatura relativamente baja. En algunos casos, el beneficio de rendimiento se logra a temperaturas relativamente altas. Además, las presentes amilasas pueden incluir cualquier número de sustituciones de aminoácidos conservadoras, siempre que sean tal como se definen en las reivindicaciones. En la tabla E se enumeran ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Tabla E. Sustituciones conservadoras de aminoácidos
El lector apreciará que algunas de las mutaciones conservadoras mencionadas anteriormente pueden producirse mediante manipulación genética, mientras que otras se producen mediante la introducción de aminoácidos sintéticos en un polipéptido por medios genéticos o de otro tipo.
La presente amilasa puede ser "precursora", "inmadura" o "de longitud completa", en cuyo caso incluye una secuencia señal, o "madura", en cuyo caso carece de una secuencia señal. Las formas maduras de los polipéptidos son generalmente las más útiles. A menos que se indique lo contrario, la numeración de residuos de aminoácidos utilizada en el presente documento se refiere a las formas maduras de los respectivos polipéptidos de amilasa. Los presentes polipéptidos de amilasa también pueden truncarse para eliminar los extremos N o C terminales, siempre que los polipéptidos resultantes conserven la actividad de amilasa.
La presente amilasa puede ser un polipéptido "quimérico" o "híbrido", ya que incluye al menos una porción de un primer polipéptido de amilasa, y al menos una porción de un segundo polipéptido de amilasa (dichas amilasas quiméricas han sido recientemente "redescubiertas" como amilasas de intercambio de dominio). Las presentes amilasas pueden incluir además una secuencia señal heteróloga, un epítopo para permitir el seguimiento o la purificación, o similares. Ejemplos de secuencias señal heterólogas son de amilasa deB. licheniformis(LAT),B. subtilis(AmyE o AprE), y CelA deStreptomyces.
2.3. Nucleótidos que codifican polipéptidos de amilasa variante
También se divulgan en el presente documento ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de amilasa variante establecido en las reivindicaciones. Se apreciará que debido a la degeneración del código genético, una pluralidad de ácidos nucleicos pueden codificar el mismo polipéptido.
Los ácidos nucleicos pueden codificar una amilasa de "longitud completa" ("fl" o "FL"), que incluye una secuencia señal, solo la forma madura de una amilasa, que carece de la secuencia señal, o una forma truncada de una amilasa, que carece del extremo N o C terminal de la forma madura.
Un ácido nucleico que codifica una a-amilasa puede unirse operativamente a diversos promotores y reguladores en un vector adecuado para expresar la a-amilasa en células huésped. Ejemplos de promotores son amilasa de deB. licheniformis(LAT),B. subtilis(AmyE o AprE), y CelA deStreptomyces.Un ácido nucleico de este tipo también puede estar unido a otras secuencias de codificación, por ejemplo, para codificar un polipéptido quimérico.
3. Producción de amilasas variantes
Las amilasas variantes definidas en las reivindicaciones pueden producirse en células huésped, por ejemplo, mediante secreción o expresión intracelular. Un material celular cultivado (por ejemplo, un caldo de células enteras) que comprende una amilasa variante se puede obtener después de la secreción de la amilasa variante en el medio celular. Opcionalmente, la amilasa variante puede aislarse de las células huésped, o incluso aislarse del caldo celular, dependiendo de la pureza deseada de la amilasa variante final. Un gen que codifica una amilasa variante puede clonarse y expresarse según procedimientos bien conocidos en la técnica. Las células huésped adecuadas incluyen células bacterianas, fúngicas (incluidas levaduras y hongos filamentosos) y vegetales (incluidas algas). Las células huésped particularmente útiles incluyenAspergillus niger, Aspergillus oryzaeoTrichoderma reesei.Otras células huésped incluyen células bacterianas, por ejemplo,Bacillus subtilisoB. licheniformis,así comoStreptomyces.
La célula huésped además puede expresar un ácido nucleico que codifica una glucoamilasa homóloga o heteróloga, es decir, una glucoamilasa que no es de la misma especie que la célula huésped, o una o más enzimas diferentes. La glucoamilasa puede ser una glucoamilasa variante, tal como una de las variantes de glucoamilasa divulgadas en la patente de Estados Unidos N° 8.058.033 (Danisco US Inc.), por ejemplo. Además, el huésped puede expresar una o más enzimas, proteínas o péptidos accesorios. Estos pueden beneficiar procesos de licuefacción, sacarificación, fermentación, SSF, etc. Además, la célula huésped puede producir sustancias bioquímicas además de las enzimas utilizadas para digerir las diversas materias primas. Dichas células huésped pueden ser útiles para la fermentación o procesos simultáneos de sacarificación y fermentación para reducir o eliminar la necesidad de añadir enzimas.
3.1. Vectores
Se puede construir un constructo de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica amilasas variantes para que se exprese en una célula huésped. Los ácidos nucleicos representativos que codifican amilasas variantes incluyen la SEQ ID NO: 4. Debido a la conocida degeneración en el código genético, se pueden diseñar y producir polinucleótidos variantes que codifican una secuencia de aminoácidos idéntica mediante técnicas rutinarias. También es conocida en la técnica la optimización del uso de codones para una célula huésped particular. Los ácidos nucleicos que codifican amilasas variantes se pueden incorporar en un vector. Los vectores pueden transferirse a una célula huésped usando técnicas de transformación bien conocidas, tales como las que se divulgan a continuación.
El vector puede ser cualquier vector que pueda transformarse y replicarse dentro de una célula huésped. Por ejemplo, un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una amilasa variante puede transformarse y replicarse en una célula huésped bacteriana como medio para propagar y amplificar el vector. El vector también puede transformarse en un huésped de expresión, de modo que los ácidos nucleicos codificantes puedan expresarse como una amilasa funcional. Las células huésped que sirven como huéspedes de expresión pueden incluir hongos filamentosos, por ejemplo. El catálogo de cepas del Fungal Genetics Stock Center (FGSC) indica vectores adecuados para la expresión de células huésped fúngicas. Véase FGSC, Catalogue of Strains, University of Missouri, en www.fgsc.net (última modificación, 17 de enero de 2007)). Un vector representativo es pJG153, un vector de expresión Cre sin promotor que puede replicarse en un huésped bacteriano. Véase Harrison et al. (Junio 2011) Applied Environ. Microbiol. 77: 3916-22. El pJG153 puede modificarse empleando técnicas rutinarias para que comprenda y exprese un ácido nucleico que codifica una variante de amilasa.
Un ácido nucleico que codifica una amilasa variante puede unirse operativamente a un promotor adecuado, que permite la transcripción en la célula huésped. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivarse de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una amilasa variante, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac deE. coli,los promotores del gen de agarasa dagA o celA deStreptomyces coelicolor,los promotores del gen a-amilasa (amyL) deBacillus licheniformis,los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) deBacillus stearothermophilus,los promotores de la a-amilasa (amyQ) deBacillus amyloliquefaciens,los promotores de los genes xylA y xylB deBacillus subtilis,etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos que se derivan del gen que codifica TAKA amilasa enAspergillus oryzae,proteinasa aspártica enRhizomucor miehei,a-amilasa neutra enAspergillus niger,a-amilasa estable en ácido deA. niger,glucoamilasa deA. niger,lipasa deRhizomucor miehei,proteasa alcalina deA. oryzae,triosa fosfato isomerasa deA. oryzae,o acetamidasa deA. nidulans.Cuando se expresa un gen que codifica una amilasa en una especie bacteriana tal comoE. coli,se puede seleccionar un promotor adecuado, por ejemplo, de entre un promotor bacteriófago, incluyendo un promotor T7 y un promotor fago lambda. Ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura son, pero sin limitación, los promotores Gal 1 y Gal 10 deSaccharomyces cerevisiaey los promotores AOX1 o AOX2 dePichia pastoris.Elcbhles un promotor endógeno e inducible deT. reesei.Véase Liu et al. (2008) "Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbh1) promoter optimization," Acta Biochim. Biophys. Sin (Shanghai) 40(2): 158-65.
La secuencia codificante puede estar operativamente unida a una secuencia señal. El ADN que codifica la secuencia señal puede ser la secuencia de ADN asociada de forma natural con el gen de amilasa que se va a expresar o de un género o especie diferente. Una secuencia señal y una secuencia promotora que comprenden un constructo o un vector de ADN pueden introducirse en una célula huésped fúngica y pueden derivarse de la misma fuente. Por ejemplo, la secuencia señal es la secuencia señalcbhlque está operativamente unida a un promotorcbhl.
Un vector de expresión también puede comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación unidas operativamente a la secuencia de ADN que codifica una amilasa variante. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse de forma adecuada de las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula huésped. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped aislada, tal como los genesdaldeB. subtilisoB. licheniformis,o un gen que confiere resistencia a antibióticos tal como, por ejemplo, resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección deAspergillustales comoamdS, argB, niaDyxxsC,un marcador que da lugar a resistencia a higromicina, o la selección se puede realizar mediante cotransformación, tal como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional PCT WO 91/17243.
La expresión intracelular puede resultar ventajosa en algunos aspectos, por ejemplo cuando se utilizan determinadas bacterias u hongos como células huésped para producir grandes cantidades de amilasa para su posterior enriquecimiento o purificación. La secreción extracelular de amilasa en el medio de cultivo también se puede utilizar para preparar un material celular cultivado que comprenda la amilasa aislada.
El vector de expresión normalmente incluye los componentes de un vector de clonación, tal como, por ejemplo, un elemento que permita la replicación autónoma del vector en el organismo huésped seleccionado y uno o más marcadores fenotípicamente detectables para fines de selección. El vector de expresión normalmente comprende secuencias de nucleótidos de control tales como un promotor, operador, sitio de unión a ribosoma, señal de inicio de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir la amilasa a un orgánulo de la célula huésped tal como un peroxisoma, o a un compartimento particular de la célula huésped. Dicha secuencia de direccionamiento incluye, pero sin limitación, la secuencia SKL. Para la expresión bajo la dirección de secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico de la amilasa está unida operativamente a las secuencias de control de forma adecuada con respecto a la expresión.
Los procedimientos utilizados para ligar el constructo de ADN que codifica una amilasa, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor, 1989, y 3a ed., 2001).
3.2. Transformación y cultivo de células huésped
Una célula aislada, que comprende o bien un constructo de ADN o bien un vector de expresión, se usa ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una amilasa. La célula puede transformarse con el constructo de ADN que codifica la enzima, integrando de forma conveniente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración generalmente se considera una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga de forma estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o heteróloga. Alternativamente, la célula puede transformarse con un vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente con respecto a los diferentes tipos de células huésped.
Ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados son especies bacterianas Gram positivas tales comoBacillaceaeque incluyeBacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus(anteriormenteBacillus) stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megateriumyBacillus thuringiensis; especies de Streptomycestales comoStreptomyces murínus;especies de bacterias acidolácticas que incluyenLactococcussp. tales comoLactococcus lactis; Lactobacillussp. que incluyeLactobacillus reuteri; Leuconostocsp.;Pediococcussp.; yStreptococcussp. Alternativamente, pueden seleccionarse como organismo huésped cepas de especies bacterianas Gram negativas pertenecientes aEnterobacteriaceaeque incluyenE. coli,o aPseudomonadaceae.
Un organismo huésped de levadura adecuado puede seleccionarse de entre especies de levaduras biotecnológicamente relevantes tales como, pero sin limitación, especies de levadura tales comoPichiasp.,Hansenulasp., oKluyveromyces, Yarrowinia,especies deSchizosaccharomyceso una especie deSaccharomyces,que incluyeSaccharomyces cerevisiaeo una especie perteneciente aSchizosaccharomycestal como, por ejemplo, una especie de S.pombe.Una cepa de la especie de levadura metilotrófica,Pichia pastoris,puede utilizarse como organismo huésped. Alternativamente, el organismo huésped puede ser una especie deHansenula.Los organismos huésped adecuados entre los hongos filamentosos incluyen especies deAspergillus,por ejemplo,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamorioAspergillus nidulans.Alternativamente, pueden utilizarse cepas de una especie deFusarium,por ejemplo,Fusarium oxysporumo de una especie deRhizomucortal comoRhizomucor mieheicomo organismo huésped. Otras cepas adecuadas incluyen especies deTermomicesyMucor.Además, se puede utilizar como huéspedTrichoderma sp.Un procedimiento adecuado para la transformación de células huésped deAspergillusincluye, por ejemplo, el descrito en el documento EP 238023. Una amilasa expresada por una célula huésped fúngica puede glicosilarse, es decir, comprenderá un resto glicosilo. El patrón de glicosilación puede ser el mismo o diferente al que presenta la amilasa de tipo silvestre. El tipo y/o grado de glicosilación puede impartir cambios en las propiedades enzimáticas y/o bioquímicas.
Resulta ventajoso eliminar genes de huéspedes de expresión, en los que la deficiencia genética puede curarse mediante el vector de expresión transformado. Se pueden usar procedimientos conocidos para obtener una célula huésped fúngica que tenga uno o más genes inactivados. La inactivación de genes se puede realizar mediante eliminación completa o parcial, mediante inactivación por inserción o mediante cualquier otro medio que provoque que un gen no sea funcional para el fin previsto, de manera que se impida que el gen exprese una proteína funcional. Cualquier gen de unTrichoderma sp.u otro huésped fúngico filamentoso que se haya clonado puede eliminarse, por ejemplo, los genescbh1, cbh2, egl1yegl2.La eliminación de genes se puede realizar insertando una forma del gen deseado que se va a inactivar en un plásmido mediante procedimientos conocidos en la técnica.
La introducción de un constructo o vector de ADN en una célula huésped incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transfección, por ejemplo, transfección mediada por lipofección y transfección mediada por DEAE-dextrina; incubación con precipitado de ADN de fosfato cálcico; bombardeo a alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN; y fusión de protoplastos. Las técnicas generales de transformación son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001), anteriormente. La expresión de proteínas heterólogas enTrichodermase describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 6.022.725. También se hace referencia a Cao et al. (2000) Science 9:991-1001 para la transformación de cepas deAspergillus.Se pueden construir transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores mediante los cuales el ácido nucleico que codifica una amilasa se integra de manera estable en un cromosoma de la célula huésped. A continuación se seleccionan y purifican los transformantes mediante técnicas conocidas.
La preparación deTrichodermasp. para la transformación, por ejemplo, puede implicar la preparación de protoplastos a partir de micelios de hongos. Véase Campbell et al. (1989) Curr. Genet. 16: 53-56. Los micelios se pueden obtener a partir de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiere la pared celular, dando como resultado protoplastos. Los protoplastos están protegidos por la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Normalmente la concentración de estos estabilizadores varía entre 0,8 M y 1,2 M, por ejemplo, se puede utilizar una solución 1,2 M de sorbitol en el medio de suspensión.
La absorción de ADN en la cepa huésped deTrichodermasp depende de la concentración de ion calcio. Generalmente se utiliza CaCl<2>entre aproximadamente 10-50 mM en una solución de absorción. Compuestos adecuados adicionales incluyen un sistema tampón, tal como tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) o MOPS 10 mM, pH 6,0 y polietilenglicol. Se cree que el polietilenglicol fusiona las membranas celulares, permitiendo así que el contenido del medio alcance el citoplasma de la cepa deTrichodermasp. Esta fusión frecuentemente deja múltiples copias del ADN plásmido integradas en el cromosoma del huésped.
Normalmente la transformación deTrichodermasp. utiliza protoplastos o células que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad, normalmente a una densidad de 10<5>a 10<7>/ml, en particular de 2x10<6>/ml. Un volumen de 100 gl de estos protoplastos o células en una solución adecuada (por ejemplo, sorbitol 1,2 M y CaCl<2>50 mM) se puede mezclar con el ADN deseado. Generalmente, se añade una alta concentración de PEG a la solución de absorción. A la suspensión de protoplastos se puede añadir de 0,1 a 1 volúmenes de PEG 4000 al 25%; sin embargo, es útil añadir aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. También se pueden añadir a la solución de absorción aditivos, tales como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloruro potásico y similares, para facilitar la transformación. Están disponibles procedimientos similares para otras células huésped fúngicas. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.022.725.
3.3. Expresión
Un procedimiento para producir una amilasa puede comprender cultivar una célula huésped tal como se ha descrito anteriormente en condiciones propicias para la producción de la enzima y recuperar la enzima de las células y/o del medio de cultivo.
El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de una amilasa. Los medios y componentes de medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo, tal como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).
Se puede utilizar una enzima secretada por las células huésped en una preparación de caldo completo. En los presentes procedimientos, la preparación de un caldo de fermentación completo gastado de un microorganismo recombinante se puede realizar usando cualquier procedimiento de cultivo conocido en la técnica que dé como resultado la expresión de una a-amilasa. Por lo tanto, se puede entender que la fermentación comprende el cultivo en matraz agitado, la fermentación a pequeña o gran escala (incluidas las fermentaciones continuas, discontinuas, por lote alimentado o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la amilasa se exprese o se aísle. El término "caldo de fermentación completo gastado" se define en el presente documento como contenido no fraccionado de material de fermentación que incluye medio de cultivo, proteínas extracelulares (por ejemplo, enzimas) y biomasa celular. Se entiende que el término "caldo de fermentación completo gastado" también abarca biomasa celular que se ha lisado o permeabilizado usando procedimientos bien conocidos en la técnica.
Una enzima secretada por las células huésped puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos bien conocidos, que incluyen la separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, y la precipitación de los componentes proteicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguida del uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares.
El polinucleótido que codifica una amilasa en un vector puede unirse operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por parte de la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión. Las secuencias de control pueden modificarse, por ejemplo mediante la adición de elementos reguladores transcripcionales adicionales para hacer que el nivel de transcripción dirigido por las secuencias de control responda mejor a los moduladores transcripcionales. Las secuencias de control pueden comprender, en particular, promotores.
Las células huésped pueden cultivarse en condiciones adecuadas que permitan la expresión de una amilasa. La expresión de las enzimas puede ser constitutiva, de modo que se produzcan continuamente, o inducible, que requiere un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de expresión inducible, la producción de proteínas puede iniciarse cuando sea necesario, por ejemplo, mediante la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo dexametasona o IPTG o Sophorose. Los polipéptidos también se pueden producir de forma recombinante en un sistema sin célulasin vitro,tal como el sistema de reticulocitos de conejo TNT™ (Promega).
Un huésped de expresión también puede cultivarse en el medio apropiado para el huésped, en condiciones aeróbicas. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, realizándose la producción a la temperatura apropiada para ese huésped, por ejemplo, de aproximadamente 25°C a aproximadamente 75°C (por ejemplo, de 30°C a 45°C), dependiendo de la necesidades del huésped y la producción de la amilasa variante deseada. El cultivo puede realizarse desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 100 horas o más (y cualquier valor de horas entre ese intervalo, por ejemplo, de 24 a 72 horas). Normalmente, el caldo de cultivo tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, dependiendo nuevamente de las condiciones de cultivo necesarias para el huésped con respecto a la producción de una amilasa.
3.4. Identificación de la actividad de amilasa
Para evaluar la expresión de una amilasa en una célula huésped, se puede medir mediante ensayos la proteína expresada, el ARNm correspondiente o la actividad de a-amilasa. Por ejemplo, los ensayos adecuados incluyen inmunotransferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa e hibridaciónin situ,usando una sonda de hibridación marcada apropiadamente. Los ensayos adecuados también incluyen medir la actividad de amilasa en una muestra, por ejemplo, mediante ensayos que miden directamente los azúcares reductores tales como la glucosa en los medios de cultivo. Por ejemplo, la concentración de glucosa se puede determinar usando el kit de reactivos de glucosa N° 15-UV (Sigma Chemical Co.) o un instrumento, tal como el autoanalizador Technicon Autoanalyzer. La actividad de a-amilasa también puede medirse mediante cualquier procedimiento conocido, tal como los ensayos PAHBAH o ABTS, que se describen a continuación.
3.5. Procedimientos para enriquecer y purificar amilasas variantes
Las técnicas de fermentación, separación y concentración son bien conocidas en la técnica y se pueden usar procedimientos convencionales para preparar una solución concentrada que contiene un polipéptido de a-amilasa variante.
Después de la fermentación, se obtiene un caldo de fermentación, las células microbianas y diversos sólidos suspendidos, incluidos los materias primas de fermentación residuales, se eliminan mediante técnicas de separación convencionales para obtener una solución de amilasa. Generalmente se utilizan filtración, centrifugación, microfiltración, filtración en tambor rotatorio de vacío, ultrafiltración, centrifugación seguida de ultrafiltración, extracción o cromatografía, o similares.
Es deseable concentrar una solución que contiene polipéptido de a-amilasa variante para optimizar la recuperación. El uso de soluciones no concentradas requiere un mayor tiempo de incubación para recoger el precipitado enzimático enriquecido o purificado.
La solución que contiene enzimas se concentra usando técnicas de concentración convencionales hasta que se obtiene el nivel de enzimas deseado. La concentración de la solución que contiene enzimas se puede realizar mediante cualquiera de las técnicas analizadas en el presente documento. Los ejemplos de procedimientos de enriquecimiento y purificación incluyen, pero sin limitación, filtración y/o ultrafiltración rotativa al vacío.
La solución enzimática se concentra dando una solución enzimática concentrada hasta que la actividad enzimática de la solución concentrada que contiene el polipéptido de a-amilasa variante se encuentra en un nivel deseado.
La concentración se puede realizar usando, por ejemplo, un agente de precipitación, tal como un agente de precipitación de haluro metálico. Los agentes de precipitación de haluros metálicos incluyen, pero sin limitación, cloruros de metales alcalinos, bromuros de metales alcalinos y mezclas de dos o más de estos haluros metálicos. Los ejemplos de haluros metálicos incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros metálicos. El agente de precipitación de haluro metálico, cloruro de sodio, también se puede utilizar como conservante.
El agente de precipitación de haluro metálico se usa en una cantidad eficaz para precipitar una amilasa. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima de haluro metálico eficaz para provocar la precipitación de la enzima, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima, incluidos el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de la enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica, después de ensayos rutinarios.
Generalmente, se añade al menos de aproximadamente el 5% p/v (peso/volumen) a aproximadamente el 25% p/v de haluro metálico a la solución enzimática concentrada, y normalmente al menos el<8>% p/v. Generalmente, no se añade más de aproximadamente el 25% p/v de haluro metálico a la solución enzimática concentrada y normalmente no más de aproximadamente el 20% p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro metálico dependerá, entre otros factores, de la naturaleza del polipéptido de a-amilasa variante específico y de su concentración en la solución enzimática concentrada.
Otra forma alternativa de precipitar la enzima es utilizar compuestos orgánicos. Los ejemplos de agentes de precipitación de compuestos orgánicos incluyen: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres alquílicos del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. La adición de los agentes de precipitación de compuestos orgánicos puede tener lugar antes, simultáneamente o después de la adición del agente de precipitación de haluro metálico, y la adición de ambos agentes de precipitación, compuesto orgánico y haluro metálico, puede llevarse a cabo de forma secuencial o simultánea.
Generalmente, los agentes de precipitación orgánicos se seleccionan del grupo que consiste en sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, tales como sales de sodio o potasio, y ésteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en los que el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos pueden ser, por ejemplo, ésteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en los que el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los ejemplos de compuestos orgánicos son ésteres alquílicos lineales del ácido 4-hidroxibenzoico, en los que el grupo alquilo contiene de 1 a<6>átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. También se pueden usar ésteres metílicos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres propílicos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres butílicos del ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres etílicos del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Compuestos orgánicos adicionales también incluyen, pero sin limitación, éster metílico del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado metil PARABENO), éster propílico del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado propil PARABENO), que también son agentes conservantes de amilasa. Para más descripciones, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.281.526.
La adición del agente de precipitación del compuesto orgánico proporciona la ventaja de una alta flexibilidad de las condiciones de precipitación con respecto al pH, la temperatura, la concentración de amilasa variante, la concentración del agente de precipitación y el tiempo de incubación.
El agente de precipitación de compuestos orgánicos se usa en una cantidad eficaz para mejorar la precipitación de la enzima por medio del agente de precipitación de haluro metálico. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima de agente de precipitación de compuestos orgánicos, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima, incluidos el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica, a la luz de la presente divulgación, después de ensayos rutinarios.
Generalmente, se añade al menos aproximadamente el 0,01% p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución enzimática concentrada y normalmente al menos aproximadamente el 0,02% p/v. Generalmente, no se añade más de aproximadamente el 0,3% p/v de agente de precipitación de compuesto orgánico a la solución enzimática concentrada y normalmente no más de aproximadamente el<0>,<2>% p/v.
La solución concentrada de polipéptido, que contiene el agente de precipitación de haluro metálico y el agente de precipitación de compuesto orgánico, se puede ajustar a un pH que, necesariamente, dependerá de la enzima que se va a enriquecer o purificar. Generalmente, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico de la amilasa. El pH se puede ajustar a un pH en un intervalo desde aproximadamente 2,5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) hasta aproximadamente 2,5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico.
El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado enzimático enriquecido o purificado depende de la naturaleza de la enzima específica, la concentración de la enzima y el o los agentes de precipitación específicos y su concentración. Generalmente, el tiempo eficaz para precipitar la enzima se encuentra entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 horas; normalmente no supera las 25 horas. En presencia del agente de precipitación de compuesto orgánico, el tiempo de incubación todavía se puede reducir a menos de aproximadamente<1 0>horas y en la mayor parte de los casos incluso a aproximadamente<6>horas.
Generalmente, la temperatura durante la incubación se encuentra entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 50°C. Normalmente, el procedimiento se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 45°C (por ejemplo, entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C). La temperatura óptima para inducir la precipitación varía según las condiciones de la solución y la enzima o agente(s) de precipitación utilizado(s).
La recuperación general del precipitado enzimático enriquecido o purificado y la eficacia con la que se lleva a cabo el proceso se mejoran agitando la solución que comprende la enzima, el haluro metálico añadido y el compuesto orgánico añadido. La etapa de agitación se realiza tanto durante la adición del haluro metálico y el compuesto orgánico, como durante el periodo de incubación posterior. Los procedimientos de agitación adecuados incluyen agitación o agitación mecánica, aireación vigorosa o cualquier técnica similar.
Después del período de incubación, la enzima enriquecida o purificada se separa del pigmento disociado y otras impurezas y se recoge mediante técnicas de separación convencionales, tales como filtración, centrifugación, microfiltración, filtración rotativa al vacío, ultrafiltración, filtración por prensa, microfiltración de membrana cruzada, microfiltración de membrana de flujo cruzado, o similares. Se puede obtener un mayor enriquecimiento o purificación del precipitado enzimático lavando el precipitado con agua. Por ejemplo, el precipitado enzimático enriquecido o purificado se lava con agua que contiene el agente de precipitación de haluro metálico, o con agua que contiene el haluro metálico y los agentes de precipitación de compuestos orgánicos.
Durante la fermentación, un polipéptido a-amilasa variante se acumula en el caldo de cultivo. Para el aislamiento, enriquecimiento o purificación de la a-amilasa variante deseada, el caldo de cultivo se centrifuga o se filtra para eliminar las células, y el líquido desprovisto de células resultante se usa para el enriquecimiento o la purificación enzimática. El caldo desprovisto de células se puede someter a precipitación salina usando sulfato de amonio a aproximadamente el 70% de saturación; a continuación, la fracción de precipitación de saturación del 70% se disuelve en un tampón y se aplica a una columna como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción activa enzimática. Para un mayor enriquecimiento o una mayor purificación, se puede utilizar un procedimiento convencional como la cromatografía de intercambio iónico.
Las enzimas enriquecidas o purificadas son útiles para aplicaciones de limpieza y de lavado de ropa. Por ejemplo, se pueden utilizar en detergentes para lavado de ropa y quitamanchas. Se pueden convertir en un producto final que sea líquido (solución, suspensión) o sólido (granular, polvo).
Un ejemplo más específico de enriquecimiento o purificación, se describe en Sumitani et al. (2000) "New type of starchbinding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading", Biochem. J. 350: 477-484, y se resume sucintamente en el presente documento. La enzima obtenida de 4 litros de un sobrenadante del cultivo deStreptomyces lividansTK24 se trató con (NH<4>)<2>SO<4>al 80% de saturación. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 10.000 x g (20 min y 4°C) y se volvió a disolver en tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía CaCh 5 mM. A continuación se dializó el precipitado solubilizado frente al mismo tampón. Después, la muestra dializada se aplicó a una columna Sephacryl S-200, que se había equilibrado previamente con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0), CaCl<2>5 mM y se eluyó a un caudal lineal de 7 ml/h con el mismo tampón. Se recogieron fracciones de la columna y se evaluó su actividad según se juzga mediante ensayo enzimático y SDS-PAGE. La proteína se purificó adicionalmente de la forma siguiente. Se equilibró una columna Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; N° de cat. 19812) con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía CaCl<2>5 mM y (NH<4>)<2>SO<4>1,5 M. La enzima se eluyó con un gradiente lineal de (NH<4>)<2>SO<4>1,5 a 0 M en tampón Tris/HCl 20 mM, pH 7,0, que contiene CaCl<2>5 mM. Se recogieron las fracciones activas y la enzima se precipitó con (NH<4>)<2>SO<4>al 80% de saturación. El precipitado se recuperó, se volvió a disolver y se dializó tal como se ha descrito anteriormente. La muestra dializada se aplicó después a una columna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia; N° de cat. 17-5167-01) previamente equilibrada con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) que contenía CaCl<2>5 mM, a un caudal de 60 ml/hora. Las fracciones activas se recogen y se añaden a una solución de (NH<4>)<2>SO<4>1,5 M. Las fracciones de enzima activa se volvieron a cromatografiar en una columna Toyopearl HW55, como anteriormente, para producir una enzima homogénea según se determina por SDS-PAGE. Véase Sumitani et al. (2000) Biochem. J.
350: 477-484, para un análisis general del procedimiento y sus variaciones
Para la recuperación a escala de producción, los polipéptidos de a-amilasa variante pueden enriquecerse o purificarse parcialmente tal como se ha descrito en general anteriormente eliminando las células mediante floculación con polímeros. Alternativamente, la enzima se puede enriquecer o purificar mediante microfiltración seguida de concentración mediante ultrafiltración utilizando membranas y equipos disponibles. Sin embargo, para algunas aplicaciones, no es necesario enriquecer ni purificar la enzima, y el caldo de cultivo completo se puede lisar y utilizar sin tratamiento adicional. A continuación, la enzima se puede procesar, por ejemplo para obtener gránulos.
4. Composiciones y usos de amilasas variantes
Las amilasas variantes son útiles para una diversidad de aplicaciones industriales Por ejemplo, las amilasas variantes son útiles en un proceso de conversión de almidón, particularmente en un proceso de sacarificación de un almidón que se ha sometido a licuefacción. El producto final deseado puede ser cualquier producto que pueda producirse mediante la conversión enzimática del sustrato de almidón. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en glucosa y maltosa, que puede usarse en otros procesos, tales como la preparación de HFCS, o que puede convertirse en una serie de otros productos útiles, tales como intermedios del ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L-gulónico; 5-cetogluconato; y 2,5-dicetogluconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos aromáticos (por ejemplo, tirosina, fenilalanina y triptófano); ácidos orgánicos (por ejemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato y oxaloacetato); aminoácidos (por ejemplo, serina y glicina); antibióticos; antimicrobianos; enzimas; vitaminas; y hormonas.
El proceso de conversión de almidón puede ser un precursor o realizarse simultáneamente con un proceso de fermentación diseñado para producir alcohol como combustible o para beber, es decir, alcohol potable). Un experto en la técnica conoce diversas condiciones de fermentación que pueden usarse en la producción de estos productos finales. Las amilasas variantes también son útiles en composiciones y procedimientos de preparación de alimentos. Estos diversos usos de amilasas variantes se describen con más detalle a continuación.
4.1. Preparación de sustratos de almidón
Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos disponibles que pueden usarse para preparar sustratos de almidón para su uso en los procesos divulgados en el presente documento. Por ejemplo, se puede obtener un sustrato de almidón útil a partir de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o granos enteros. Más específicamente, el almidón granular puede obtenerse a partir de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, triticale, milo, sagú, mijo, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, plátanos o patatas. El maíz contiene aproximadamente el 60-68% de almidón; la cebada contiene aproximadamente el 55-65% de almidón; el mijo contiene aproximadamente el 75-80% de almidón; el trigo contiene aproximadamente el 60-65% de almidón; y el arroz pulido contiene aproximadamente el 70-72% de almidón. Los sustratos de almidón específicamente contemplados son almidón de maíz y almidón de trigo. El almidón de un grano puede estar molido o entero e incluye sólidos de maíz, tales como granos, salvado y/o mazorcas. El almidón también puede ser almidón crudo altamente refinado o materia prima procedente de procesos de refinería de almidón. También se encuentran disponibles comercialmente varios almidones. Por ejemplo, el almidón de maíz está disponible en Cerestar, Sigma y Katayama Chemical Industry Co. (Japón); el almidón de trigo está disponible en Sigma; el almidón de batata está disponible en Wako Pure Chemical Industry Co. (Japón); y el almidón de patata está disponible en Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japón).
El sustrato de almidón puede ser un almidón bruto de grano entero molido, que contiene fracciones no amiláceas, por ejemplo, residuos de germen y fibras. La molienda puede comprender molienda en húmedo o molienda o trituración en seco. En la molienda en húmedo, el grano entero se remoja en agua o ácido diluido para separar el grano en sus partes componentes, por ejemplo, almidón, proteínas, germen, aceite, fibras de semilla. La molienda en húmedo separa eficazmente el germen y la harina (es decir, gránulos de almidón y proteínas) y es especialmente adecuado para la producción de jarabes. En la molienda o trituración en seco, los granos enteros se muelen hasta obtener un polvo fino y, a menudo, se procesan sin fraccionar el grano en sus partes componentes. En algunos casos, se recuperan los aceites de las semillas. Por lo tanto, el grano seco molido comprenderá cantidades significativas de compuestos de carbohidratos sin almidón, además de almidón La molienda en seco del sustrato de almidón se puede utilizar para la producción de etanol y otros productos bioquímicos. El almidón que se va a procesar puede ser de una calidad de almidón altamente refinado, por ejemplo, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 99,5% puro.
4.2. Gelatinización y licuefacción de almidón
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "licuefacción" o "licuar" significa un proceso mediante el cual el almidón se convierte en dextrinas menos viscosas y de cadena más corta. Generalmente, este proceso implica la gelatinización del almidón simultáneamente con o seguida de la adición de una a-amilasa, aunque opcionalmente se pueden añadir enzimas inductoras de licuefacción adicionales. En algunas formas de realización, el sustrato de almidón preparado tal como se ha descrito anteriormente se suspende con agua. La suspensión de almidón puede contener almidón como un porcentaje en peso de sólidos secos de aproximadamente el 10-55%, aproximadamente el 20-45%, aproximadamente el 30-45%, aproximadamente el 30-40% o aproximadamente el 30-35%. Se puede añadir a-amilasa (EC 3.2.1.1) a la suspensión, por ejemplo con una bomba dosificadora. La a-amilasa normalmente utilizada para esta aplicación es una a-amilasa bacteriana térmicamente estable, tal como una a-amilasa deGeobacillus stearothermophilus.La a-amilasa se suministra normalmente, por ejemplo, a aproximadamente 1.500 unidades por kg de materia seca de almidón. Para optimizar la estabilidad y la actividad de la a-amilasa, el pH de la suspensión normalmente se ajusta a aproximadamente pH 5,5-6,5 y también se puede añadir aproximadamente 1 mM de calcio (aproximadamente 40 ppm de iones de calcio libres). Las variantes deGeobacillus stearothermophilusu otras aamilasas pueden requerir condiciones diferentes. La a-amilasa bacteriana que queda en la suspensión después de la licuefacción se puede desactivar mediante una diversidad de procedimientos, incluida la reducción del pH en una etapa de reacción posterior o la eliminación del calcio de la suspensión en los casos en que la enzima depende del calcio.
La suspensión de almidón más la a-amilasa se puede bombear continuamente a través de un cocedor de chorro, que se calienta con vapor a 105°C. La gelatinización se produce rápidamente en estas condiciones y la actividad enzimática, combinada con las importantes fuerzas de cizallamiento, inicia la hidrólisis del sustrato de almidón. El tiempo de residencia en el cocedor de chorro es breve. El almidón parcialmente gelatinizado puede hacerse pasar a una serie de tubos de retención mantenidos a 105-110°C y mantenerse durante 5-8 min para completar el proceso de gelatinización ("licuefacción primaria"). La hidrólisis hasta el DE requerido se completa en tanques de retención a temperaturas de 85-95°C o superiores durante aproximadamente 1 a 2 horas ("licuefacción secundaria"). Estos tanques pueden contener deflectores para evitar el retromezclado. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "minutos de licuefacción secundaria" se refiere al tiempo que ha transcurrido desde el inicio de la licuefacción secundaria hasta el momento en que se mide el equivalente de dextrosa (DE). Después se deja que la suspensión se enfríe hasta temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede durar de 30 minutos a<1 8 0>minutos, por ejemplo de 90 minutos a 120 minutos. El almidón licuado normalmente se encuentra en forma de una suspensión que tiene un contenido de sólidos secos (p/p) de aproximadamente el 10-50%; aproximadamente el 10-45%; aproximadamente el 15-40%; aproximadamente el 20-40%; aproximadamente el 25-40%; o aproximadamente el 25-35%.
La licuefacción con amilasas variantes se puede realizar ventajosamente a un pH bajo, eliminando el requisito de ajustar el pH a aproximadamente pH 5,5-6,5. Se pueden utilizar amilasas variantes para licuefacción en un intervalo de pH de 2 a 7, por ejemplo, pH 3,0 - 7,5, pH 4,0 - 6,0 o pH 4,5 - 5,8. Las amilasas variantes pueden mantener la actividad de licuefacción en un intervalo de temperatura de aproximadamente 85°C - 95°C, por ejemplo, 85°C, 90°C o 95°C. Por ejemplo, la licuefacción se puede realizar con 800 pg de amilasa en una solución de almidón de maíz con DS del 25% durante 10 min a pH 5,8 y 85°C, o pH 4,5 y 95°C, por ejemplo. La actividad de licuefacción se puede analizar usando cualquiera de varios ensayos de viscosidad conocidos en la técnica.
4.3. Sacarificación
El almidón licuado se puede sacarificar dando un jarabe rico en sacáridos con DP más bajo (por ejemplo, DP1 DP2) utilizando amilasas variantes, opcionalmente en presencia de otra(s) enzima(s). La composición exacta de los productos de sacarificación depende de la combinación de enzimas utilizadas, así como del tipo de almidón granular procesado. Ventajosamente, el jarabe que se puede obtener usando las amilasas variantes proporcionadas puede contener un porcentaje en peso de DP2 del total de oligosacáridos en el almidón sacarificado que supera el 30%, por ejemplo, el 45% - 65% o el 55% - 65%. El porcentaje en peso de (DP1 DP2) en el almidón sacarificado puede superar aproximadamente el 70%, por ejemplo, el 75% - 85% o el 80% - 85%. Las presentes amilasas también producen un rendimiento relativamente alto de glucosa, por ejemplo, DP1 > 20%, en el producto de jarabe.
Mientras que la licuefacción generalmente se realiza como un proceso continuo, la sacarificación a menudo se realiza como un proceso discontinuo. La sacarificación normalmente es más eficaz a temperaturas de aproximadamente 60-65°C y un pH de aproximadamente 4,0-4,5, por ejemplo un pH de 4,3, lo que requiere enfriar y ajustar el pH del almidón licuado. La sacarificación se puede realizar, por ejemplo, a una temperatura de entre aproximadamente 40°C, a aproximadamente 50°C o de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C o a aproximadamente 65°C. La sacarificación normalmente se lleva a cabo en tanques con agitación, que pueden tardar varias horas en llenarse o vaciarse. Las enzimas normalmente se añaden en una proporción fija con respecto a los sólidos secos a medida que se llenan los tanques o se añaden como una dosis única al comienzo de la etapa de llenado. Una reacción de sacarificación para preparar un jarabe normalmente se produce durante aproximadamente 24-72 horas, por ejemplo, 24-48 horas. Cuando se ha alcanzado un DE máximo o deseado, la reacción se detiene mediante calentamiento a 85°C durante 5 minutos, por ejemplo. Una incubación más larga dará como resultado un DE más bajo, eventualmente hasta aproximadamente 90 de DE, dado que la glucosa acumulada se repolimeriza para dar isomaltosa y/u otros productos de reversión mediante una reacción de reversión enzimática y/o con la aproximación al equilibrio termodinámico. Cuando se utiliza una amilasa, la sacarificación se realiza de manera óptima en un intervalo de temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 75°C, por ejemplo, 45°C - 75°C o 47°C - 74°C. La sacarificación se puede realizar en un intervalo de pH de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, por ejemplo, pH 3,0 - pH 7,5, pH 3,5 - pH 5,5, pH 3,5, pH 3,8 o pH 4,5.
Se puede añadir una amilasa a la suspensión en forma de composición. Se puede añadir amilasa a una suspensión de un sustrato de almidón granular en una cantidad de aproximadamente<0 , 6>-<1 0>ppm de ds, por ejemplo,<2>ppm de ds. Se puede añadir una amilasa como un caldo completo, clarificada, enriquecida, parcialmente purificada o como enzima purificada. La actividad específica de la amilasa puede ser de aproximadamente 300 U/mg de enzima, medida por ejemplo con el ensayo PAHBAH. La amilasa también se puede añadir como un producto de caldo completo.
Puede añadirse una amilasa a la suspensión como una solución enzimática aislada. Por ejemplo, se puede añadir una amilasa en forma de un material celular cultivado producido por células huésped que expresan una amilasa. Una célula huésped también puede secretar una amilasa en el medio de reacción durante el proceso de fermentación o SSF, de modo que la enzima se proporcione continuamente a la reacción. La célula huésped que produce y secreta amilasa también puede expresar una enzima adicional, tal como una glucoamilasa. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.422.267 divulga el uso de una glucoamilasa en levadura para la producción de bebidas alcohólicas. Por ejemplo, una célula huésped, por ejemplo,Trichoderma reeseioAspergillus niger,puede diseñarse para que coexprese una amilasa y una glucoamilasa, por ejemplo, HgGA, TrGA o una variante de TrGA, durante la sacarificación. La célula huésped puede modificarse genéticamente para que no exprese su glucoamilasa endógena y/u otras enzimas, proteínas u otros materiales. La célula huésped se puede diseñar para que exprese un amplio espectro de diversas enzimas sacarolíticas. Por ejemplo, la célula huésped de levadura recombinante puede comprender ácidos nucleicos que codifican una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una enzima que utiliza azúcar pentosa, una a-amilasa, una pululanasa, una isoamilasa y/o una isopululanasa Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/153516 A2.
4.4. Isomerización
El hidrolizado de almidón soluble producido mediante el tratamiento con amilasa se puede convertir en jarabe a base de almidón con alto contenido de fructosa (HFSS), tal como el jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (HFCS). Esta conversión se puede realizar usando una glucosa isomerasa, particularmente una glucosa isomerasa inmovilizada en un soporte sólido. El pH se aumenta hasta aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, por ejemplo, pH 7,5 (dependiendo de la isomerasa) y se elimina Ca2+ mediante intercambio iónico. Las isomerasas adecuadas incluyen Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI y G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquida y GenSweet® IGI. Después de la isomerización, la mezcla normalmente contiene aproximadamente el 40-45% de fructosa, por ejemplo, el 42% de fructosa.
4.5. Fermentación
El hidrolizado de almidón soluble, particularmente un jarabe rico en glucosa, se puede fermentar poniendo en contacto el hidrolizado de almidón con un organismo de fermentación, normalmente a una temperatura de aproximadamente 32°C, tal como de 30°C a 35°C para la levadura productora de alcohol. La temperatura y el pH de la fermentación dependerán del organismo de fermentación. Los productos EOF incluyen metabolitos, tales como ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, ácido itacónico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato de sodio, lisina y otros aminoácidos, ácidos grasos omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y otros biomateriales.
Los microorganismos etanologénicos incluyen levaduras, tales comoSaccharomyces cerevisiaey bacterias, por ejemplo,Zymomonas moblis,que expresa alcohol deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa. El microorganismo etanologénico puede expresar xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, que convierten la xilosa en xilulosa. En la técnica se conocen y pueden usarse cepas mejoradas de microorganismos etanologénicos, que pueden soportar temperaturas más altas, por ejemplo. Véase Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27(7): 1049-56. Las fuentes comerciales de levadura incluyen ETHANOL r Ed O (LeSaffre); Thermosacc® (Lallemand); Re d STAR® (Red Star); FERMIOL® (DSM Specialties); y SUPERSTART® (Alltech). También se conocen en la técnica microorganismos que producen otros metabolitos, tales como ácido cítrico y ácido láctico, mediante fermentación. Véase, por ejemplo, Papagianni (2007) "Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling", Biotechnol. Adv. 25(3): 244-63; John et al. (2009) "Direct lactic acid fermentation: focus on simultaneous saccharification and lactic acid production," Biotechnol. Adv. 27(2): 145-52.
Los procesos de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo como un proceso SSF. La fermentación puede comprender un enriquecimiento, una purificación y una recuperación de etanol posteriores, por ejemplo. Durante la fermentación, el contenido de etanol del caldo o "cerveza" puede alcanzar aproximadamente el 8-18% v/v, por ejemplo, el 14-15% v/v. El caldo se puede destilar para producir soluciones de etanol enriquecidas, por ejemplo, el 96% puras. Además, el CO<2>generado por la fermentación se puede recoger con un purificador de CO<2>, comprimirse y comercializarse para otros usos, por ejemplo, bebidas carbonatadas o producción de hielo seco. Los residuos sólidos del proceso de fermentación pueden utilizarse como productos ricos en proteínas, por ejemplo, para alimento del ganado.
Tal como se ha mencionado anteriormente, se puede realizar un proceso de SSF con células fúngicas que expresan y secretan amilasa continuamente durante toda el proceso SSF. Las células fúngicas que expresan amilasa también pueden ser el microorganismo de fermentación, por ejemplo, un microorganismo etanologénico. Por lo tanto, la producción de etanol se puede llevar a cabo utilizando una célula fúngica que exprese suficiente amilasa para que sea necesario añadir una cantidad inferior o nula de enzima de forma exógena. La célula huésped fúngica puede ser de una cepa fúngica modificada genéticamente de forma adecuada. También se pueden utilizar células huésped fúngicas que expresan y secretan otras enzimas, además de la amilasa. Dichas células pueden expresar glucoamilasa y/o una pululanasa, fitasa, alfa-glucosidasa, isoamilasa, beta-amilasa celulasa, xilanasa, otras hemicelulasas, proteasa, betaglucosidasa, pectinasa, esterasa, enzimas rédox, transferasa u otra enzima.
Una variación de este proceso es un sistema de "fermentación por lote alimentado", en el que el sustrato se añade en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas por lote alimentado son útiles cuando la represión catabolítica puede inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La concentración real de sustrato en los sistemas por lote alimentado se estima mediante los cambios de factores medibles tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases residuales, tales como el CO<2>. Las fermentaciones discontinuas y por lote alimentado son comunes y bien conocidas en la técnica.
La fermentación continua es un sistema abierto en el que se añade continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se retira simultáneamente una cantidad igual de medio acondicionado para su procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad alta constante en la que las células se encuentran principalmente en fase logarítmica de crecimiento. La fermentación continua permite la modulación del crecimiento celular y/o la concentración del producto. Por ejemplo, un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno, se mantiene a una tasa fija y se permite que todos los demás parámetros se moderen. Debido a que el crecimiento se mantiene en un estado estable, la pérdida de células debido a la extracción del medio deberá equilibrarse con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los procedimientos para optimizar los procesos de fermentación continua y maximizar la velocidad de formación del producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial.
4.6. Composiciones que comprenden amilasas variantes
Las amilasas variantes pueden combinarse con una glucoamilasa (EC 3.2.1.3), por ejemplo, una glucoamilasa deTrichodermao variante de la misma. Un ejemplo de glucoamilasa es glucoamilasa deTrichoderma reesei(TrGA) y variantes de la misma que poseen actividad específica y estabilidad térmica superiores. Véanse las solicitudes publicadas de Estados Unidos N° 2006/0094080, 2007/0004018, y 2007/0015266 (Danisco US Inc.). Las variantes adecuadas de TrGA incluyen aquellas con actividad glucoamilasa y al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de identidad de secuencia con la TrGA de tipo silvestre. Las amilasas variantes aumentan ventajosamente el rendimiento de glucosa producida en un proceso de sacarificación catalizado por TrGA.
Alternativamente, la glucoamilasa puede ser otra glucoamilasa derivada de plantas (incluyendo algas), hongos o bacterias. Por ejemplo, las glucoamilasas pueden ser glucoamilasa deAspergillus nigerG1 o G2 o sus variantes (por ejemplo, Boel et al. (1984) EMBO J. 3: 1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136 (Novo Nordisk AS)); y glucoamilasa deA. awamori(por ejemplo, el documento WO 84/02921 (Cetus Corp.)). Otra glucoamilasa deAspergilluscontemplada incluye variantes con termoestabilidad mejorada, por ejemplo, G137A y G139A (Chen et al. (1996) Prot. Eng. 9: 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995) Prot. Eng.<8>: 575-582); N182 (Chen et al. (1994) Biochem. J.
301: 275-281); A246C (Fierobe et al. (1996) Biochemistry, 35: 8698-8704); y variantes con residuos de Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Otras glucoamilasas contempladas incluyen glucoamilasas deTalaromyces,en particular derivadas deT. emersonii(por ejemplo, el documento WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S),T. leycettanus(por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° RE 32.153 (CPC International, Inc.)),T. duponti,oT. thermophilus(por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.587.215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género clostridio, en particularC. thermoamylolyticum(por ejemplo, el documento EP 135,138 (CPC International, Inc.) y C.thermohydrosulfuricum(por ejemplo, el documento WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Las glucoamilasas adecuadas incluyen las glucoamilasas derivadas deAspergillus orizae,tal como una glucoamilasa mostrada en la SEQ ID NO:2 en el documento WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S). También son adecuadas las glucoamilasas comerciales, tales como AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER y AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 y OPTIDEX L-400 (Danisco US Inc.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); y G-ZYME® G990 ZR (glucoamilasa deA. nigercon bajo contenido en proteasa). Otras glucoamilasas adecuadas más incluyen glucoamilasa deAspergillus fumigatus,glucoamilasa deTalaromyces,glucoamilasa deThielavia,glucoamilasa deTrametes,glucoamilasa deThermomyces,glucoamilasa deAthelia,o glucoamilasa deHumicola (por ejemplo,HgGA). Las glucoamilasas normalmente se añaden en una cantidad de aproximadamente 0,1 - 2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g de ds, por ejemplo, aproximadamente 0,16 GAU/g de ds, 0,23 GAU/g de ds o 0,33 GAU/g de ds.
Otras enzimas adecuadas que se pueden usar con amilasa incluyen una fitasa, proteasa, pululanasa, p-amilasa, isoamilasa, una a-amilasa diferente, alfa-glucosidasa, celulasa, xilanasa, otras hemicelulasas, beta-glucosidasa, transferasa, pectinasa, lipasa, cutinasa, esterasa, enzimas rédox o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se puede añadir una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (EC 3.2.1.68), en cantidades eficaces bien conocidas por el experto en la técnica. Una pululanasa (EC 3.2.1.41), por ejemplo, Promozyme®, también es adecuada. Normalmente se añade pululanasa a razón de 100 U/kg de ds. Otras enzimas adecuadas incluyen proteasas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas fúngicas incluyen las obtenidas deAspergillus,tal comoA. niger, A. awamori, A. oryzae; Mucor(por ejemplo,M. miehei); Rhizopus;yTrichoderma.
Las p-amilasas (EC 3.2.1.2) son amilasas maltogénicas exoactivas, que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-aglucosídicos en amilopectina y polímeros de glucosa relacionados, liberando así maltosa. Se han aislado p-amilasas de diversas plantas y microorganismos.VéaseFogarty et al. (1979) in PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, páginas 112-115. Estas p-amilasas tienen temperaturas óptimas en el intervalo de 40°C a 65°C y un pH óptimo en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0. Las p-amilasas contempladas incluyen, pero sin limitación, p-amilasas de cebada Spezyme® BbA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Danisco US Inc.); y Novozym™ WBA (Novozymes A/S).
Las composiciones que comprenden las presentes amilasas pueden ser formulaciones acuosas o no acuosas, gránulos, polvos, geles, suspensiones, pastas, etc., que pueden comprender además una cualquiera o más de las enzimas adicionales enumeradas en el presente documento, junto con tampones, sales y conservantes, agua, codisolventes, tensioactivos y similares. Dichas composiciones pueden funcionar en combinación con enzimas endógenas u otros ingredientes ya presentes en una suspensión, un baño de agua, una lavadora, un producto alimenticio o de bebida, etc., por ejemplo, enzimas endógenas de plantas (incluidas las algas), enzimas residuales de una etapa de procesamiento anterior, y similares.
5. Composiciones y procedimientos para la panificación y la preparación de alimentos
También se divulga en el presente documento una "composición alimenticia", que incluye, pero sin limitación, un producto alimenticio, alimento para animales y/o aditivos para alimentos/piensos, que comprende una amilasa variante definida en las reivindicaciones, y procedimientos para preparar dicha composición alimenticia que comprenden mezclar una amilasa variante definida en las reivindicaciones con uno o más ingredientes alimenticios, o usos de los mismos.
Además, también se divulga en el presente documento el uso de una amilasa variante definida en las reivindicaciones en la preparación de una composición alimenticia, en la que la composición alimenticia se hornea después de la adición del polipéptido de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "composición de panificación" significa cualquier composición y/o aditivo preparado en el proceso de suministro de un producto alimenticio panificado, incluyendo, pero sin limitación, harina de panadería, una masa, un aditivo de panificación y/o un producto panificado. La composición alimenticia o el aditivo puede ser líquido o sólido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "harina" significa grano de cereal molido o triturado. El término "harina" también puede significar productos de sagú o tubérculos que se han molido o triturado. La harina también puede contener componentes además del cereal molido o triturado o material vegetal. Un ejemplo de componente adicional, aunque no pretende ser limitante, es un agente leudante. Los granos de cereales incluyen trigo, avena, centeno y cebada. Los productos de tubérculos incluyen harina de tapioca, harina de yuca y crema pastelera en polvo. El término "harina" también incluye harina de maíz molido, harina de maíz, harina de arroz, harina integral, harina leudante, harina de tapioca, harina de mandioca, arroz molido, flores enriquecidas y crema pastelera en polvo.
Para el uso comercial y doméstico de harina para panificación y producción de alimentos, es importante mantener un nivel apropiado de actividad de a-amilasa en la harina. Un nivel de actividad demasiado alto puede dar como resultado un producto pegajoso y/o pastoso y, por lo tanto, no comercializable. Es posible que la harina con actividad de aamilasa insuficiente no contenga suficiente azúcar para el funcionamiento adecuado de la levadura, lo que da como resultado pan o productos panificados secos y quebradizos. Por consiguiente, se puede añadir a la harina una amilasa, sola o en combinación con otra(s) a-amilasa(s) para aumentar el nivel de actividad de a-amilasa endógena en la harina.
Además, se puede añadir una amilasa sola o en combinación con otras amilasas para prevenir o retardar el envejecimiento, es decir, un reafirmante de miga de productos panificados. La cantidad de amilasa antienvejecimiento normalmente se encontrará en el intervalo de 0,01 a 10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 0,5 mg/kg de ds. Las amilasas anti-envejecimiento adicionales que se pueden usar en combinación con una amilasa incluyen una endoamilasa, por ejemplo, una endoamilasa bacteriana deBacillus.La amilasa adicional puede ser otra a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), por ejemplo, deBacillus.Novamyl® es un ejemplo de una a-amilasa maltogénica deB. stearothermophiluscepa NCIB 11837 y se describe en Christophersen et al. (1997) Starch 50: 39 45. Otros ejemplos de endoamilasas anti-envejecimiento incluyen a-amilasas bacterianas derivadas deBacillus,tales comoB. licheniformisoB. amyloliquefaciens.La amilasa anti-envejecimiento puede ser una exoamilasa, tal como pamilasa, por ejemplo, de fuentes vegetales, tales como soja, o de fuentes microbianas, tales comoBacillus.
La composición de panificación que comprende una amilasa puede comprender además una fosfolipasa o enzima con actividad fosfolipasa. Una enzima con actividad fosfolipasa tiene una actividad que se puede medir en unidades de lipasa (LU). La fosfolipasa puede tener actividad A<1>o A<2>para eliminar ácidos grasos de los fosfolípidos, formando un lisofosfolípido. Puede tener o no actividad de lipasa, es decir, actividad sobre sustratos de triglicéridos. La fosfolipasa normalmente tiene una temperatura óptima en el intervalo de 30-90°C, por ejemplo, 30-70°C. Las fosfolipasas añadidas pueden ser de origen animal, por ejemplo de páncreas, por ejemplo, páncreas bovino o porcino, veneno de serpiente o veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, por ejemplo.
La fosfolipasa se añade en una cantidad que mejora la ternura del pan durante el periodo inicial después de la panificación, particularmente las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa normalmente se encontrará en el intervalo de 0,01 a 10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 0,1-5 mg/kg. Es decir, la actividad de la fosfolipasa generalmente se encontrará en el intervalo de 20-1000 LU/kg de harina, en la que una unidad de lipasa se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 pmol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7,0, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.
Las composiciones de masa comprenden generalmente sémola de trigo o harina de trigo y/u otros tipos de sémola, harina o almidón tales como harina de maíz, almidón de maíz, sémola de centeno, harina de centeno, harina de avena, sémola de avena, harina de soja, sémola de sorgo, harina de sorgo, sémola de patata, harina de patata o almidón de patata. La masa puede ser fresca, congelada o precocida. La masa puede ser una masa leudada o una masa para ser sometida a leudado. La masa se puede leudar de varias maneras, como añadiendo agentes leudantes químicos, por ejemplo, bicarbonato de sodio o añadiendo levadura, es decir, masa fermentada. La masa también puede leudarse añadiendo un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo deSaccharomyces cerevisiae(levadura de panadería), por ejemplo, una cepa comercialmente disponible de S.cerevisiae.
La masa también puede comprender otros ingredientes de masa convencionales, por ejemplo, proteínas, tales como leche en polvo, gluten y soja; huevos (por ejemplo, huevos enteros, yemas o claras); un oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato de potasio, yodato de potasio, azodicarbonamida (ADA) o persulfato de amonio; un aminoácido tal como L-cisteína; un azúcar; o una sal, tal como cloruro de sodio, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de calcio. La masa puede comprender además grasa, por ejemplo, triglicéridos, como grasa granulada o grasa alimentaria. La masa puede comprender además un emulsionante tal como mono- o diglicéridos, ésteres de ácido diacetiltartárico de mono- o diglicéridos, ésteres de azúcar de ácidos grasos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos, ésteres de ácido láctico de monoglicéridos, ésteres de ácido acético de monoglicéridos, estearatos de polioxietileno o lisolecitina. En particular, la masa se puede preparar sin adición de emulsionantes.
El producto de masa puede ser cualquier producto de masa procesado, incluidas masas fritas, fritas en abundante aceite, asadas, horneadas, cocidas al vapor y hervidas, tales como pan y pasteles de arroz cocidos al vapor. El producto alimenticio puede ser un producto de panadería. Los productos típicos de panadería (panificados) incluyen pan, tal como hogazas, bollos, panecillos, rosquillas, bases para pizza, etc., hojaldre, pretzels, tortillas, pasteles, galletas, bizcochos, galletas saladas, etc.
Opcionalmente, se puede usar una enzima adicional junto con la amilasa antienvejecimiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, tal como una amiloglucosidasa, una p-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa, o la enzima adicional puede ser una peptidasa, en particular una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una proteasa, una proteína disulfuro isomerasa, por ejemplo, una proteína disulfuro isomerasa tal como se divulga en el documento WO 95/00636, por ejemplo, una glicosiltransferasa, una enzima ramificadora (enzima ramificadora 1,4-a-glucano), una 4-a-glucanotransferasa (dextrina glicosiltransferasa) o una oxidorreductasa, por ejemplo, una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipooxigenasa, una L-aminoácido oxidasa o una carbohidrato oxidasa. La(s) enzima(s) adicional(es) pueden ser de cualquier origen, incluidos mamíferos y plantas, y particularmente de origen microbiano (bacteriano, levadura u hongo) y pueden obtenerse mediante técnicas utilizadas convencionalmente en la técnica.
La xilanasa es normalmente de origen microbiano, por ejemplo, derivada de una bacteria o un hongo, tal como una cepa deAspergillus.Las xilanasas incluyen Pentopan® y Novozym 384®, por ejemplo, que son preparaciones de xilanasa disponibles comercialmente producidas a partir deTrichoderma reesei.La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa deA. Niger(tal como AMG®). Otros productos de amilasa útiles incluyen Grindamyl® A 1000 o A 5000 (Grindsted Products, Denmark) y Amylase® H o Amylase® P (DSM). La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa fúngica, en particular una glucosa oxidasa deAspergillus niger(tal como Gluzyme®). Un ejemplo de proteasa es Neutrase®.
El proceso se puede utilizar para cualquier tipo de producto panificado preparado a partir de masa, ya sea de carácter blando o crujiente, ya sea de tipo blanco, claro u oscuro. Ejemplos son pan, particularmente pan blanco, integral o de centeno, típicamente en forma de hogazas o panecillos, tales como, pero sin limitación, pan francés tipo baguette, pan de pita, tortillas, pasteles, panqueques, bizcochos, galletas, masas de tarta, pan crujiente, pan cocido al vapor, pizza y similares.
Se puede usar una amilasa en una premezcla que comprende harina junto con una amilasa antienvejecimiento, una fosfolipasa y/o un fosfolípido. La premezcla puede contener otros aditivos mejoradores de la masa y/o del pan, por ejemplo, cualquiera de los aditivos, incluidas las enzimas, mencionados anteriormente. Una amilasa puede ser un componente de una preparación enzimática que comprende una amilasa antienvejecimiento y una fosfolipasa, para su uso como aditivo para panificación.
La preparación enzimática se presenta opcionalmente en forma de un granulado o de un polvo aglomerado. La preparación puede tener una distribución estrecha del tamaño de partículas con más del 95% (en peso) de las partículas en el intervalo de 25 a 500 |um. Los granulados y los polvos aglomerados pueden prepararse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, pulverizando una amilasa sobre un vehículo en un granulador de lecho fluido. El vehículo puede consistir en núcleos de partículas que tienen un tamaño de partícula adecuado. El vehículo puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), un alcohol de azúcar (como sorbitol), almidón, arroz, sémola de maíz o soja.
Las partículas envueltas, es decir, partículas de a-amilasa, pueden comprender una amilasa. Para preparar partículas de a-amilasa envueltas, la enzima se pone en contacto con un lípido de calidad alimentaria en cantidad suficiente para suspender todas las partículas de a-amilasa. Los lípidos de calidad alimentaria, tal como se utilizan en el presente documento, pueden ser cualquier compuesto orgánico natural que sea insoluble en agua pero que sea soluble en disolventes orgánicos no polares tales como hidrocarburos o dietil éter. Los lípidos de calidad alimentaria adecuados incluyen, pero sin limitación, triglicéridos en forma de grasas o aceites saturados o insaturados. Los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos que forman los triglicéridos saturados incluyen, pero sin limitación, butírico (derivado de la grasa láctea), palmítico (derivado de grasa animal y vegetal) y/o esteárico (derivado de grasa animal y vegetal). Los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de los mismos que forman los triglicéridos insaturados incluyen, pero sin limitación, palmitoleico (derivado de grasa animal y vegetal), oleico (derivado de grasa animal y vegetal), linoleico (derivado de aceites vegetales) y /o linolénico (derivado del aceite de linaza). Otros lípidos de calidad alimentaria adecuados incluyen, pero sin limitación, monoglicéridos y diglicéridos derivados de los triglicéridos descritos anteriormente, fosfolípidos y glicolípidos.
El lípido de calidad alimentaria, particularmente en forma líquida, se pone en contacto con una forma en polvo de las partículas de a-amilasa de tal manera que el material lipídico cubra al menos una porción de la superficie de al menos la mayor parte, por ejemplo el 100%, de las partículas de a-amilasa. Así, cada partícula de a-amilasa está envuelta individualmente en un lípido. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las partículas de a-amilasa están provistas de una película envolvente, delgada y continua de lípido. Esto se puede realizar vertiendo en primer lugar una cantidad de lípido en un recipiente y después suspendiendo las partículas de a-amilasa de modo que el lípido humedezca completamente la superficie de cada partícula de a-amilasa. Después de un breve periodo de agitación, se recuperan las partículas de a-amilasa envueltas, que portan una cantidad sustancial de lípidos en sus superficies. El espesor del recubrimiento así aplicado a las partículas de a-amilasa se puede controlar seleccionando el tipo de lípido usado y repitiendo la operación para formar una película más gruesa, cuando se desee.
El almacenamiento, la manipulación y la incorporación del vehículo de suministro cargado se puede realizar mediante una mezcla envasada. La mezcla envasada puede comprender la a-amilasa envuelta. Sin embargo, la mezcla envasada puede contener además ingredientes adicionales según lo requiera el fabricante o el panadero. Una vez incorporada la a-amilasa envuelta a la masa, el panadero continúa con el proceso de producción normal de ese producto.
Las ventajas de envolver las partículas de a-amilasa son dobles. En primer lugar, el lípido de calidad alimentaria protege a la enzima de la desnaturalización térmica durante el proceso de horneado de aquellas enzimas que son termolábiles. En consecuencia, mientras que la a-amilasa se estabiliza y se protege durante las etapas de leudado y horneado, se libera del recubrimiento protector en el producto panificado final, en el que hidroliza los enlaces glucosídicos para dar poliglucanos. El vehículo de suministro cargado también proporciona una liberación mantenida de la enzima activa en el producto panificado. Es decir, después del proceso de panificación, la a-amilasa activa se libera continuamente del recubrimiento protector a una velocidad que contrarresta y, por lo tanto, reduce la velocidad de los mecanismos de envejecimiento.
En general, la cantidad de lípido aplicada a las partículas de a-amilasa puede variar desde un pequeño porcentaje del peso total de la a-amilasa hasta varias veces ese peso, dependiendo de la naturaleza del lípido, la forma en la que se aplica a las partículas de a-amilasa, la composición de la mezcla de masa que se va a tratar y la gravedad de la operación de mezclado de masa involucrada.
El vehículo de suministro cargado, es decir, la enzima envuelta en lípidos, se añade a los ingredientes utilizados para preparar un producto panificado en una cantidad eficaz para prolongar la vida útil del producto panificado. El panadero calcula la cantidad de a-amilasa envuelta, preparada tal como se ha descrito anteriormente, que será necesaria para lograr el efecto anti-envejecimiento deseado. La cantidad de a-amilasa envuelta necesaria se calcula basándose en la concentración de enzima envuelta y en la proporción de a-amilasa con respecto a la harina especificada. Se ha descubierto que es eficaz un amplio intervalo de concentraciones, aunque, como se ha comentado, las mejoras observables en el anti-envejecimiento no se corresponden linealmente con la concentración de a-amilasa, pero por encima de unos determinados niveles mínimos, grandes aumentos en la concentración de a-amilasa producen poca mejora adicional. La concentración de a-amilasa realmente utilizada en una producción de panadería particular podría ser mucho mayor que el mínimo necesario para proporcionar al panadero cierta seguridad contra errores involuntarios de medición insuficiente por parte del panadero. El límite inferior de concentración de enzima está determinado por el efecto anti-envejecimiento mínimo que el panadero desea lograr.
Un procedimiento para preparar un producto panificado puede comprender: a) preparar partículas de a-amilasa recubiertas de lípidos, en el que sustancialmente todas las partículas de a-amilasa están recubiertas; b) mezclar una masa que contiene harina; c) añadir la a-amilasa recubierta de lípidos a la masa antes de que se complete el mezclado y terminar el mezclado antes de que se retire el recubrimiento lipídico de la a-amilasa; d) leudar la masa; y e) hornear la masa para proporcionar el producto panificado, en el que la a-amilasa está inactiva durante las etapas de mezclado, fermentación y horneado y está activa en el producto panificado.
La a-amilasa envuelta se puede añadir a la masa durante el ciclo de mezclado, por ejemplo, cerca del final del ciclo de mezclado. La a-amilasa envuelta se añade en un punto de la etapa de mezclado que permite una distribución suficiente de la a-amilasa envuelta por toda la masa; sin embargo, la etapa de mezclado finaliza antes de que se elimine el recubrimiento protector de la(s) partícula(s) de a-amilasa. Dependiendo del tipo y volumen de la masa, y de la acción y velocidad del mezclador, es posible que se requieran de uno a seis minutos o más para mezclar la aamilasa envuelta en la masa, pero el promedio es de dos a cuatro minutos. Por tanto, varias variables pueden determinar el procedimiento preciso. En primer lugar, la cantidad de a-amilasa envuelta debe tener un volumen total suficiente para permitir que la a-amilasa envuelta se extienda por toda la mezcla de masa. Si la preparación de aamilasa envuelta está altamente concentrada, es posible que sea necesario añadir aceite adicional a la premezcla antes de añadir la a-amilasa envuelta a la masa. Las recetas y los procesos de producción pueden requerir modificaciones específicas; sin embargo, generalmente se pueden lograr buenos resultados cuando el 25% del aceite especificado en una fórmula de masa de pan se mantiene fuera de la masa y se usa como vehículo para una a-amilasa envuelta concentrada cuando se añade cerca del final del ciclo de mezclado. En pan u otros productos panificados, especialmente los que tienen un bajo contenido en grasas, por ejemplo, panes de estilo francés, una mezcla de aamilasa envuelta de aproximadamente el<1>% del peso de la harina seca es suficiente para mezclar adecuadamente la a-amilasa envuelta con la masa. El intervalo de porcentajes adecuados es amplio y depende de la fórmula, el producto terminado y los requisitos de la metodología de producción de cada panadero. En segundo lugar, la suspensión de aamilasa envuelta debe añadirse a la mezcla con el tiempo suficiente para que se mezcle completamente en la masa, pero no durante un tiempo tal que una acción mecánica excesiva elimine la capa protectora de lípidos de las partículas de a-amilasa envueltas.
La composición alimenticia descrita en el presente documento puede ser una composición de aceite, carne o manteca de cerdo que comprende una amilasa. En este contexto, el término "composición [de aceite/carne/manteca de cerdo]" significa cualquier composición basada en, fabricada a partir de y/o que contenga aceite, carne o manteca de cerdo, respectivamente. También se describe un procedimiento para preparar una composición de aceite o carne o manteca y/o aditivo que comprende una amilasa, que comprende mezclar el polipéptido de la invención con una composición de aceite/carne/manteca y/o ingredientes aditivos.
La composición alimenticia descrita en el presente documento puede ser una composición de alimento para animales, un aditivo para alimentos para animales y/o un alimento para mascotas que comprende una amilasa y variantes de la misma.
El término "animal" incluye todos los animales rumiantes y no rumiantes. El animal puede ser un animal no rumiante, tal como un caballo y un animal monogástrico. Los ejemplos de animales monogástricos incluyen, pero sin limitación, cerdos y porcinos, tales como lechones, cerdos en crecimiento, cerdas; aves de corral tales como pavos, patos, pollos, pollos de engorde, ponedoras; pescados tales como salmón, trucha, tilapia, siluros y carpas; y crustáceos tales como gambas y langostinos. El animal puede ser un animal rumiante que incluye, pero sin limitación, ganado vacuno, terneros jóvenes, cabras, ovejas, jirafas, bisontes, alces, alces americanos, yaks, búfalos de agua, ciervos, camellos, alpacas, llamas, antílopes, berrendos y nilgós.
En el presente contexto, se pretende que el término "alimento para mascotas" se entienda como un alimento para un animal doméstico tal como,pero sin limitación, perros, gatos, jerbos, hámsteres, chinchillas, ratas de compañía, cobayas; mascotas aviares, tales como canarios, periquitos y loros; mascotas reptiles, tales como tortugas, lagartos y serpientes; y mascotas acuáticas, tales como peces tropicales y ranas.
Los términos "composición de alimento para animales", "pienso" y "forraje" se usan indistintamente y pueden comprender uno o más materiales de alimento seleccionados del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o cereales grandes tales como maíz o sorgo; b) subproductos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos secos de destilería con solubles (DDGS) (granos secos de destilería con solubles a base de maíz (cDDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, trigo corto, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, palmiste y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, habas, algodón, canola, harina de pescado, proteína de plasma desecada, harina de carne y huesos, proteína de patata, suero, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.
6. Composiciones y uso de desencolado textil
También se contemplan composiciones y procedimientos para tratar tejidos (por ejemplo, para desencolar un textil) usando una amilasa variante tal como se define en las reivindicaciones. Los procedimientos de tratamiento de tejidos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.077.316). Por ejemplo, el tacto y la apariencia de un tejido se pueden mejorar mediante un procedimiento que comprende poner en contacto el tejido con una amilasa en una solución. El tejido se puede tratar con la solución a presión.
Se puede aplicar una amilasa durante o después del tejido de un textil, o durante la etapa de desencolado, o una o más etapas adicionales de procesamiento del tejido. Durante el tejido de textiles, los hilos están expuestos a una tensión mecánica considerable. Antes de tejer en telares mecánicos, los hilos de urdimbre a menudo se recubren con almidón de encolado o derivados del almidón para aumentar su resistencia a la tracción y evitar que se rompan. Se puede aplicar una amilasa durante o después del tejido para eliminar estos almidón o derivados de almidón de encolado. Después de tejer, se puede utilizar una amilasa para eliminar el recubrimiento de encolado antes de seguir procesando la tela para garantizar un resultado homogéneo y resistente al lavado.
Se puede usar una amilasa sola o con otros reactivos químicos desencolantes y/o enzimas desencolantes para desencolar tejidos, incluidos tejidos que contienen algodón, tales como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. También se puede usar una amilasa en composiciones y procedimientos para producir un aspecto lavado a la piedra en tejido y prendas vaqueras con tinte azul. Para la confección de ropa, la tela se puede cortar y coser en ropas o prendas, que después se rematan. En particular, para la fabricación de pantalones vaqueros se han desarrollado diferentes procedimientos de acabado enzimático. El acabado de una prenda vaquera normalmente se inicia con una etapa de desencolado enzimático, durante el cual las prendas se someten a la acción de enzimas amilolíticas para proporcionar suavidad al tejido y hacer que el algodón sea más accesible a las siguientes etapas de acabado enzimático. Se puede utilizar una amilasa en procedimientos de acabado de prendas vaqueras (por ejemplo, un "proceso de biolavado a la piedra (biostoning)"), desencolado enzimático y aporte de suavidad a los tejidos, y/o proceso de acabado.
7. Composiciones de limpieza
Un aspecto de las presentes composiciones y procedimientos es una composición limpiadora que incluye una amilasa variante tal como se define en las reivindicaciones. Se puede usar un polipéptido de amilasa como componente en composiciones detergentes para lavado de manos, lavado de ropa, lavado de vajillas y otras limpiezas de superficies duras.
7.1. Descripción general
Preferentemente, se incorpora una amilasa a los detergentes en o cerca de una concentración utilizada convencionalmente para la amilasa en detergentes. Por ejemplo, se puede añadir un polipéptido de amilasa en una cantidad correspondiente a<0 , 0 0 0 0 1>-<1>mg (calculado como proteína enzimática pura) de amilasa por litro de licor de lavado/lavado de vajillas. En el presente documento se proporcionan ejemplos de formulaciones, tal como se ejemplifica a continuación:
Un polipéptido de amilasa puede ser un componente de una composición detergente, como única enzima o con otras enzimas, incluidas otras enzimas amilolíticas. Como tal, puede incluirse en la composición detergente en forma de un granulado que no forma polvo, un líquido estabilizado o una enzima protegida. Se pueden producir granulados que no generan polvo, por ejemplo, tal como se divulga en las patentes de Estados Unidos N° 4.106.991 y 4.661.452 y opcionalmente puede recubrirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de óxido de polietileno (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1.000 a 20.000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. Se dan ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para su aplicación mediante técnicas de lecho fluido, por ejemplo, en el documento GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse, por ejemplo, añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según procedimientos establecidos. Se conocen en la técnica otros estabilizadores enzimáticos. Las enzimas protegidas se pueden preparar según el procedimiento divulgado, por ejemplo, en el documento EP 238216. Los polioles han sido reconocidos desde hace mucho tiempo como estabilizadores de proteínas, además de mejorar la solubilidad de las proteínas.
La composición detergente puede estar en cualquier forma útil, por ejemplo, en forma de polvos, gránulos, pastas o líquidos. Un detergente líquido puede ser acuoso y normalmente contiene hasta aproximadamente el 70% de agua y del 0% a aproximadamente el 30% de disolvente orgánico. También puede estar en forma de un tipo de gel compacto que contiene solo aproximadamente el 30% de agua.
La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico, catiónico o iónico dipolar. El detergente contendrá normalmente del 0% a aproximadamente el 50% de tensioactivo aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal (LAS); a-olefinsulfonato (AOS); alquilsulfato (sulfato de alcohol graso) (AS); etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES); alcanosulfonatos secundarios (SAS); ésteres metílicos de ácidos asulfograsos; ácido alquil- o alquenilsuccínico; o jabón. La composición también puede contener del 0% a aproximadamente el 40% de tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilados, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglucósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso o amida de ácido graso polihidroxialquilo (tal como se describen, por ejemplo, en el documento WO 92/06154).
La composición detergente puede comprender adicionalmente una o más enzimas diferentes, tales como proteasas, otra enzima amilolítica, cutinasa, lipasa, celulasa, pectato liasa, perhidrolasa, xilanasa, peroxidasa y/o lacasa en cualquier combinación.
El detergente puede contener de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 65% de un adyuvante de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTMPA), ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS<- 6>de Hoechst). El detergente también puede estar sin adyuvantes, es decir, esencialmente desprovisto de adyuvantes de detergente. Las enzimas se pueden usar en cualquier composición compatible con la estabilidad de la enzima. Generalmente, las enzimas pueden protegerse contra componentes nocivos mediante formas conocidas de encapsulación, por ejemplo, mediante granulación o secuestro en hidrogeles. Las enzimas, y específicamente las amilasas, con o sin dominios de unión a almidón, se pueden usar en una diversidad de composiciones que incluyen aplicaciones de lavado de ropa y lavado de vajillas, limpiadores de superficies, así como en composiciones para la producción de etanol a partir de almidón o biomasa.
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema blanqueador, que puede comprender un H<2>O<2>fuente como perborato o percarbonato, que se puede combinar con un activador del blanqueador formador de perácido como tetraacetiletilendiamina (TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS). Alternativamente, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos (por ejemplo, los peroxiácidos de tipo amida, imida o sulfona). El sistema blanqueador también puede ser un sistema blanqueador enzimático, por ejemplo, perhidrolasa, tal como el descrito en la solicitud internacional PCT WO 2005/056783.
Las enzimas de la composición detergente se pueden estabilizar usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol; un azúcar o alcohol de azúcar; ácido láctico; ácido bórico o un derivado del ácido bórico tal como, por ejemplo, un éster de borato aromático; y la composición puede formularse como se describe en, por ejemplo, el documento WO 92/19709 y el documento WO 92/19708.
El detergente también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como por ejemplo, acondicionadores de telas que incluyen arcillas, potenciadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de la suciedad, agentes anti-redeposición de la suciedad, tintes, bactericidas, inhibidores del deslustre, abrillantadores ópticos o perfumes.
El pH (medido en solución acuosa a la concentración de uso) es habitualmente neutro o alcalino, por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 11,0.
A continuación se describen formas particulares de composiciones detergentes para la inclusión de la presente aamilasa.
7.2. Composición detergente para lavado de ropa líquida de gran potencia (HDL)
Los ejemplos de composiciones detergentes para lavado de ropa HDL incluyen un tensioactivo detersivo (10%-40% peso/peso), incluido un tensioactivo detersivo aniónico (seleccionado de un grupo de alquilsulfatos, alquilsulfonatos, alquilsulfatos alcoxilados, sustituidos o no sustituidos, de cadena lineal o ramificada o aleatoria), alquilfosfatos, alquilfosfonatos, alquilcarboxilatos y/o mezclas de los mismos), y opcionalmente tensioactivos no iónicos (seleccionados de un grupo de alcoholes alcoxilados de alquilo sustituidos o no sustituidos, de cadena lineal o ramificada o aleatoria, por ejemplo un alcohol C<8>-C<18>alquiletoxilado y/o alcoxilatos de alquilfenol C<6>-C<12>), en los que la relación en peso de tensioactivo detersivo aniónico (con un índice hidrofílico (HIc) de 6,0 a 9) con respecto a tensioactivo detersivo no iónico es superior a 1:1. Los tensioactivos detersivos adecuados también incluyen tensioactivos detersivos catiónicos (seleccionados de un grupo de compuestos de alquilpiridinio, compuestos de alquilamonio cuaternario, compuestos de alquil-fosfonio cuaternario, compuestos de alquil-sulfonio ternario y/o mezclas de los mismos); tensioactivos detersivos iónicos dipolares y/o anfóteros (seleccionados de un grupo de alcanolamina sulfobetaínas); tensioactivos anfolíticos; tensioactivos no iónicos semipolares y mezclas de los mismos.
La composición puede incluir opcionalmente un polímero potenciador de la tensioactividad que consiste en polímeros limpiadores de grasa alcoxilados anfífilos (seleccionados de un grupo de polímeros alcoxilados que tienen propiedades hidrófilas e hidrófobas ramificadas, tales como polialquileniminas alcoxiladas en el intervalo del 0,05% en peso al 10% en peso) y/o polímeros de injerto aleatorio (que normalmente comprenden un esqueleto hidrófilo que comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos C<1>-C<6>insaturados, éteres, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, unidades de azúcar, unidades alcoxi, anhídrido maleico, polialcoholes saturados tales como glicerol y mezclas de los mismos; y cadena(s) lateral(es) hidrófoba(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en: grupo alquilo C<4>-C<25>, polipropileno, polibutileno, éster vinílico de un grupo ácido monocarboxílico C<1>-C<6>saturado, éster alquílico C<1>-C<6>del ácido acrílico o metacrílico, y mezclas de los mismos.
La composición puede incluir polímeros adicionales tales como polímeros liberadores de suciedad (incluyen poliésteres con extremos rematados aniónicamente, por ejemplo SRP1, polímeros que comprenden al menos una unidad monomérica seleccionada de entre sacárido, ácido dicarboxílico, poliol y combinaciones de los mismos, en configuración aleatoria o en bloque, polímeros a base de tereftalato de etileno) y copolímeros de los mismos en configuración aleatoria o de bloques, por ejemplo Repel-o-tex SF, SF-2 y SRP<6>, Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 y SRN325, Marloquest SL), polímeros antirredeposición (del 0,1% en peso al 10% en peso, incluyen polímeros de carboxilato, tales como polímeros que comprenden al menos un monómero seleccionado de entre ácido acrílico, ácido maleico (o anhídrido maleico), ácido fumárico, ácido itacónico, ácido aconítico, ácido mesacónico, ácido citracónico, ácido metilenmalónico, y cualquier mezcla de los mismos, homopolímero de vinilpirrolidona y/o polietilenglicol, peso molecular en el intervalo de 500 a 100.000 Da); polímero celulósico (incluidos aquellos seleccionados de entre alquilcelulosa, alquilalcoxialquilcelulosa, carboxialquilcelulosa, alquilcarboxialquilcelulosa, ejemplos de los cuales incluyen carboximetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y mezclas de los mismos) y carboxilato polimérico (tal como copolímero aleatorio de maleato/acrilato u homopolímero de poliacrilato).
La composición puede incluir además ácido graso saturado o insaturado, preferentemente ácido graso saturado o insaturado C<12>-C<24>(del<0>% en peso al<1 0>% en peso); coadyuvantes de deposición (ejemplos de los cuales incluyen polisacáridos, preferentemente polímeros celulósicos, haluros de polidialildimetilamonio (DADMAC) y copolímeros de DAD MAC con vinilpirrolidona, acrilamidas, imidazoles, haluros de imidazolinio y mezclas de los mismos, en configuración aleatoria o de bloques, goma guar catiónica, celulosa catiónica tal como hidroxietilcelulosa catiónica, almidón catiónico, poliacilamidas catiónicas y mezclas de los mismos.
La composición puede incluir además agentes inhibidores de la transferencia de tinte, ejemplos de los cuales incluyen ftalocianina de manganeso, peroxidasas, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles y/o mezclas de los mismos; agentes quelantes, ejemplos de los cuales incluyen ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentametilenfosfónico (DTPMP), ácido hidroxietanodifosfónico (HEDP), ácido etilendiamina N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metilglicina-diacético (MGDA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido propilendiaminatetracético (PDT A), N-óxido de 2-hidroxipiridina (HPNO) o ácido metilglicina diacético (MGDA), ácido glutámico-ácido N,N-diacético (sal tetrasódica del ácido N,N-dicarboximetilglutámico (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-dihidroxi-m-bencenodisulfónico, ácido cítrico y cualquiera de sus sales, ácido N-hidroxietiletilendiaminatriacético (HEDTA), ácido trietilentetraaminahexaacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminadiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilendiaminatetrapropiónico (EDTP) y sus derivados.
La composición incluía preferentemente enzimas (generalmente aproximadamente del 0,01% en peso de enzima activa al 0,03% en peso de enzima activa) seleccionadas de entre proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectatoliasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas. aciltransferasas, perhidrolasas, arilesterasas y cualquier mezcla de las mismas. La composición puede incluir un estabilizador enzimático (entre cuyos ejemplos se incluyen polioles tales como propilenglicol o glicerol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, inhibidor de proteasa reversible, ácido bórico o un derivado del ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático o un derivado del ácido fenilborónico tal como el ácido 4-formilfenilborónico).
La composición incluye opcionalmente supresores de espuma a base de silicona o ácidos grasos; colorantes colorantes, cationes de calcio y magnesio, ingredientes de señalización visual, antiespumantes (del<0>,<0 0 1>% en peso a aproximadamente el 4,0% en peso) y/o estructurantes/espesantes (del 0,01% en peso al 5% en peso, seleccionados del grupo que consiste en diglicéridos y triglicéridos, diestearato de etilenglicol, celulosa microcristalina, materiales a base de celulosa, celulosa de microfibra, biopolímeros, goma xantana, goma gellan y mezclas de los mismos).
La composición puede ser cualquier forma líquida, por ejemplo una forma líquida o de gel, o cualquier combinación de los mismos. La composición puede estar en cualquier forma de dosis unitaria, por ejemplo una bolsa.
7.3. Composición detergente para lavado de ropa seca/sólida de gran potencia (HDD)
Los ejemplos de composiciones detergentes para lavado de ropa HDD incluyen un tensioactivo detersivo, que incluye tensioactivos detersivos aniónicos (por ejemplo, alquilsulfatos, alquilsulfonatos, alquilsulfatos alcoxilados, alquilfosfatos, alquilfosfonatos, alquilcarboxilatos y/o mezclas de los mismos, de cadena lineal o ramificada o aleatoria, sustituidos o no sustituidos), tensioactivo detersivo no iónico (por ejemplo, de cadena lineal, ramificada o aleatoria, etoxilatos de alquilo C<8>-C<18>sustituidos o no sustituidos y/o alcoxilatos de alquilfenol C<6>-C<12>), tensioactivos detersivos catiónicos (por ejemplo, compuestos de alquilpiridinio, compuestos de alquil -amonio cuaternario, compuestos de alquil-fosfonio cuaternario, compuestos de alquil-sulfonio ternario y mezclas de los mismos), tensioactivos detersivos iónicos dipolares y/o anfóteros (por ejemplo, alcanolamina sulfobetaínas), tensioactivos anfolíticos, tensioactivos no iónicos semipolares y mezclas de los mismos; adyuvantes que incluyen adyuvantes desprovistos de fosfato (por ejemplo ejemplos de adyuvantes de zeolita que incluyen zeolita A, zeolita X, zeolita P y zeolita MAP en el intervalo del<0>% en peso a menos del<1 0>% en peso%), adyuvantes de fosfato (por ejemplo tripolifosfato de sodio en el intervalo del<0>% en peso a menos del<1 0>% en peso), ácido cítrico, sales de citrato y ácido nitrilotriacético, sal de silicato (por ejemplo, silicato de sodio o potasio o metasilicato de sodio en el intervalo del<0>% en peso a menos del<1 0>% en peso, o silicato en capas (SKS-<6>)); sal carbonatada (por ejemplo, carbonato de sodio y/o bicarbonato de sodio en el intervalo del<0>% en peso a menos del 80% en peso); y agentes blanqueadores, incluidos fotoblanqueadores (por ejemplo, ftalocianinas de zinc sulfonadas, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, colorantes xantenos y mezclas de los mismos) activadores de blanqueo hidrófobos o hidrófilos (por ejemplo, dodecanoil-oxibencenosulfonato, decanoiloxibencenosulfonato, ácido decanoil-oxibenzoico o sus sales, 3,5,5-trimetil-hexanoil-oxibencenosulfonato, tetraacetiletilendiamina-TAED, nonanoiloxibencenosulfonato-NOBS, nitriloquats y mezclas de los mismos), fuentes de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, sales inorgánicas de perhidrato, ejemplos de las cuales incluyen sal sódica monoo tetrahidratada de perborato, percarbonato, persulfato, perfosfato o persilicato), perácidos hidrofílicos y/o hidrofóbicos preformados (por ejemplo, ácidos y sales percarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, y mezclas de los mismos), y/o catalizadores de blanqueo (por ejemplo, potenciadores de blanqueo de imina (ejemplos de los cuales incluyen cationes y poliiones de iminio), compuestos iónicos dipolares de iminio, aminas modificadas, óxidos de amina modificados, N-sulfoniliminas, N-fosfoniliminas, N-aciliminas, dióxidos de tiadiazol, perfluoroiminas, cetonas de azúcares cíclicos, y mezclas de los mismos, y catalizadores de blanqueo que contienen metales (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o manganeso junto con cationes metálicos auxiliares tal como zinc o aluminio y un secuestrante tal como ácido etilendiaminatetraacético, etilendiaminatetra(ácido metilenfosfónico) y sus sales solubles en agua).
La composición incluye preferentemente enzimas, por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectatoliasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa y cualquier mezcla de las mismas.
La composición puede incluir opcionalmente ingredientes detergentes adicionales que incluyen microcápsulas de perfume, acordes de perfume encapsulados en almidón, agentes matizadores, polímeros adicionales, incluyendo polímeros catiónicos y de integridad del tejido, ingredientes que fijan el tinte, agentes suavizantes de tejidos, abrillantadores (por ejemplo, abrillantadores fluorescentes C.I.), floculantes. agentes, agentes quelantes, poliaminas alcoxiladas, coadyuvantes de deposición de tejidos y/o ciclodextrina.
7.4. Composiciones detergentes para lavado de vajillas automático (ADW)
Los ejemplos de composiciones detergentes ADW incluyen tensioactivos no iónicos, incluidos tensioactivos no iónicos etoxilados, tensioactivos alcoxilados con alcohol, alcoholes poli(oxialquilados) con extremos rematados con epoxi o tensioactivos de óxido de amina presentes en cantidades del 0 al 10% en peso; adyuvantes en el intervalo del 5-60%, incluidos adyuvantes de fosfato (por ejemplo, monofosfatos, difosfatos, tripolifosfatos, otros polifosfatos oligoméricos, tripolifosfato de sodio-STPP) y adyuvantes desprovistos de fosfatos (por ejemplo, compuestos a base de aminoácidos que incluyen ácido metilglicina-diacético (MGDA) y sus sales y derivados, ácido glutámico-N,N-diacético (GLDA) y sus sales y derivados, ácido iminodisuccínico (IDS) y sus sales y derivados, carboximetilinulina y sus sales y derivados, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido B-alanindiacético (B-ADA) y sus sales, homopolímeros y copolímeros de ácidos policarboxílicos y sus sales parcial o completamente neutralizadas, ácidos policarboxílicos monoméricos y ácidos hidroxicarboxílicos y sus sales en el intervalo del 0,5% al 50% en peso; polímeros sulfonados/carboxilados en el intervalo de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 50% en peso para proporcionar estabilidad dimensional; coadyuvantes de secado en el intervalo de aproximadamente el<0>,<1>% a aproximadamente el<1 0>% en peso (por ejemplo, poliésteres, en particular poliésteres aniónicos, en caso dado junto con otros monómeros con 3 a<6>funcionalidades, normalmente funcionalidades ácido, alcohol o éster, que favorecen la policondensación, compuestos de policarbonato, poliuretano y/o poliurea-poliorganosiloxano o sus compuestos precursores, particularmente del tipo carbonato cíclico reactivo y urea); silicatos en el intervalo de aproximadamente el<1>% a aproximadamente el<2 0>% en peso (incluidos silicatos de sodio o potasio, por ejemplo disilicato de sodio, metasilicato de sodio y filosilicatos cristalinos); blanqueador inorgánico (por ejemplo, sales de perhidrato tales como sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) y blanqueadores orgánicos (por ejemplo, peroxiácidos orgánicos, incluyendo peróxidos de diacilo y tetraacilo, especialmente ácido diperoxidodecanodioco, ácido diperoxitetradecanodioco y ácido diperoxihexadecanodioco); activadores de lejía (es decir, precursores de perácidos orgánicos en el intervalo de aproximadamente el<0>,<1>% a aproximadamente el<1 0>% en peso); catalizadores de blanqueo (por ejemplo, triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados, bispiridilamina de Co, Cu, Mn y Fe y complejos relacionados, y acetato de cobalto (III) de pentamina y complejos relacionados); agentes para el cuidado de metales en el intervalo de aproximadamente el 0,1% al 5% en peso (por ejemplo, benzatriazoles, sales y complejos metálicos y/o silicatos); enzimas en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 5,0 mg de enzima activa por gramo de composición detergente para lavado de vajillas automático (por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectatoliasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa y mezclas de las mismas); y componentes estabilizadores de enzimas (por ejemplo, oligosacáridos, polisacáridos y sales inorgánicas de metales divalentes).
7.5. Composiciones detergentes adicionales
A continuación, en los párrafos numerados, se describen ejemplos de formulaciones detergentes adicionales a las que se puede añadir la presente amilasa.
1) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 7% a aproximadamente el 12%; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12 - 18>, 1-2 óxido de etileno (EO)) o alquilsulfato (por ejemplo, C<16 - 18>): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<14 - 15>, 7 EO): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 9%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 14% a aproximadamente el 20%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O,<2>SiO2): de aproximadamente el 2 a aproximadamente el<6>%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 22%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): del 0% a aproximadamente el<6>%; citrato de sodio/ácido cítrico (por ejemplo, C6H5Na3O7/C6H8O7): de aproximadamente el 0% a aproximadamente el 15%; perborato de sodio (por ejemplo, NaBO3H2O): de aproximadamente el 11% a aproximadamente el 18%; TAED: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el<6>%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 2%; polímeros (por ejemplo, ácido maleico/acrílico, copolímero, PVP, PEG): el 0-3%; enzimas (calculadas como enzima pura): el 0,0001-0,1% de proteína; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, supresores de espuma, perfumes, abrillantadores ópticos, fotoblanqueadores): el 0-5%.
2) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 11%; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12 - 18>, 1-2 EO) o alquilsulfato (por ejemplo, C<16 - 18>): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<14 - 15>, 7 EO): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 9%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 21%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O, 2SiO2): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 24% a aproximadamente el 34%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%; citrato de sodio/ácido cítrico (por ejemplo, C6HsNa3O7/ C<6>H<8>O<7>): del 0% a aproximadamente el 15%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 2%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG): el 1-6%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; ingredientes minoritarios (por ejemplo, supresores de espuma, perfume): el 0-5%.
3) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 9%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12 - 15>, 7 EO): de aproximadamente el 7% a aproximadamente el 14%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido graso C<16 - 22>): de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 3%; carbonato de sodio (como Na2CO3): de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 17%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O, 2SiO2): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 9%; zeolita (como NaAlSiO4): de aproximadamente el 23% a aproximadamente el 33%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): del 0% a aproximadamente el 4%; perborato de sodio (por ejemplo, NaBO3H2O): de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 16%; TAED: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 8%; fosfonato (por ejemplo, EDTMPA): del 0% a aproximadamente el 1%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 2%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG): el 0-3%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; ingredientes minoritarios (por ejemplo, supresores de espuma, perfume, abrillantador óptico): el 0-5%.
4) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 12%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12 - 15>, 7 EO): de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25%; carbonato de sodio (como Na2CO3): de aproximadamente el 14% a aproximadamente el 22%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O,<2>SiO<2>): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 35%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): del 0% a aproximadamente el 10%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 2%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG): el 1-3%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, supresores de espuma, perfume): el 0-5%.
5) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 21%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12 - 15>, 7 EO o alcohol C<12 - 15>, 5 EO): de aproximadamente el 12% a aproximadamente el 18%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oleico): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 13%; ácido alquenilsuccínico (C<12 - 14>): del 0% a aproximadamente el 13%; aminoetanol: de aproximadamente del 8% a aproximadamente el 18%; ácido cítrico: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 8%; fosfonato: del 0% a aproximadamente el 3%; polímeros (por ejemplo, PVP, PEG): del 0% a aproximadamente el 3%; borato (por ejemplo, B<4>O<7>): del 0% a aproximadamente el 2%; etanol: del 0% a aproximadamente el 3%; propilenglicol: de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 14%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, dispersantes, supresores de espuma, perfume, abrillantador óptico): el 0-5%.
6) Una composición detergente líquida estructurada acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 21%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12 - 15>, 7 EO o alcohol C<12 - 15>, 5 EO): el 3-9%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oleico): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 10%; zeolita (como NaAlSiO4): de aproximadamente el 14% a aproximadamente el 22%; citrato de potasio: de aproximadamente el 9% a aproximadamente el 18%; borato (por ejemplo, B<4>O<7>): del 0% a aproximadamente el 2%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 2%; polímeros (por ejemplo, PEG, PVP): del 0% a aproximadamente el 3%; polímeros de anclaje tales como, por ejemplo, copolímero de metacrilato de laurilo/ácido acrílico; relación molar 25:1, PM 3800): del 0% a aproximadamente el 3%; glicerol: del 0% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, dispersantes, supresores de espuma, perfumes, blanqueadores ópticos): el 0-5%.
7) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende sulfato de alcohol graso: de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%; monoetanolamida de ácido graso etoxilado: de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 9%; jabón como ácido graso: el 0-3%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O,<2>SiO<2>): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 8%; perborato de sodio (por ejemplo, NaBO3H2O): de aproximadamente el 12% a aproximadamente el 18%; TAED: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 7%; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, abrillantador óptico, supresores de espuma, perfume): el 0-5%.
8) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 14%; monoetanolamida de ácido graso etoxilado: de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 11%; jabón como ácido graso: del 0% a aproximadamente el 3%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%; silicato soluble (Na<2>O,<2>SiO<2>): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 11%; citrato de sodio (por ejemplo, C6HsNa3O7): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 12%; polímeros (por ejemplo, PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, supresores de espuma, perfume): el 0-5%.
9) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 12%; tensioactivo no iónico: de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%; jabón como ácido graso: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 6%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 14% a aproximadamente el 22%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 18% a aproximadamente el 32%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na<2>SO<4>): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20%; citrato de sodio (por ejemplo, C6HsNa3O7): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 8%; perborato de sodio (por ejemplo, NaBO<3>H<2>O): de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 9%; activador de lejía (por ejemplo, NOBS o TAED): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 2%; polímeros (por ejemplo, policarboxilato o PEG): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, abrillantador óptico, perfume): el 0-5%.
10) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 23%; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12>-<15>, 2-3 EO): de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 15%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12>-<15>, 7 EO o alcohol C<12>-<15>, 5 EO): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 9%; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido láurico): del 0% a aproximadamente el 3%; aminoetanol: de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; citrato de sodio: de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%; hidrótropo (por ejemplo, toluenosulfonato de sodio): de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 6%; borato (por ejemplo, B<4>O<7>): del 0% a aproximadamente el 2%; carboximetilcelulosa: del 0% a aproximadamente el 1%; etanol: de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3%; propilenglicol: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, polímeros, dispersantes, perfumes, blanqueadores ópticos): el 0-5%.
11) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 32%; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol C<12>-<15>, 7 EO o alcohol C<12>-<15>, 5 EO): el 6-12%; aminoetanol: de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 6%; ácido cítrico: de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 14%; borato (por ejemplo, B<4>O<7>): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3%; polímero (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de anclaje tal como, por ejemplo, copolímero de metacrilato de laurilo/ácido acrílico): del 0% a aproximadamente el 3%; glicerol: de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 8%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, hidrótropos, dispersantes, perfumes, blanqueadores ópticos): el 0-5%.
12) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende tensioactivo aniónico (alquilbencenosulfonato lineal, alquilsulfato, a-olefinsulfonato, ésteres metílicos de ácidos a-sulfograsos, alcanosulfonatos, jabón): de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 40%; tensioactivo no iónico (por ejemplo, etoxilato de alcohol): de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 25%; silicatos solubles (por ejemplo, Na<2>Ü,<2>SÍO<2>): de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 15%; sulfato de sodio (por ejemplo, Na2SO4): del 0% a aproximadamente el 5%; zeolita (NaAlSiO4): de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 28%; perborato de sodio (por ejemplo, NaBO3-4H2O): del 0% a aproximadamente el 20%; activador de blanqueo (TAED o NOBS): de aproximadamente el 0% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; ingredientes minoritarios (por ejemplo, perfume, blanqueadores ópticos): el 0-3%.
13) Composiciones detergentes tal como se describen en las composiciones 1)-12) anteriores, en las que todo o parte del alquilbencenosulfonato lineal se reemplaza por alquilsulfato (C<12>-C<18>).
14) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende alquilsulfato (C<12>-C<18>): de aproximadamente el 9% a aproximadamente el 15%; etoxilato de alcohol: de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 6%; polihidroxialquilamida de ácido graso: de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%; zeolita (por ejemplo, NaAlSiO4): de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20%; disilicato estratificado (por ejemplo, SK56 de Hoechst): de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20%; carbonato de sodio (por ejemplo, Na2CO3): de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 12%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O, 2SiO2): del 0% a aproximadamente el 6%; citrato de sodio: de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 8%; percarbonato de sodio: de aproximadamente el 13% a aproximadamente el 22%; TAED: de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 8%; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP): del 0% a aproximadamente el 5%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, abrillantador óptico, fotoblanqueador, perfume, supresores de espuma): el 0-5%.
15) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l que comprende alquilsulfato (C<12>-C<18>): de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 8%; etoxilato de alcohol: de aproximadamente el 11% a aproximadamente el 15%; jabón: de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%; zeolita MAP o zeolita A: de aproximadamente el 35% a aproximadamente el 45%; carbonato de sodio (como Na2CO3): de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 8%; silicato soluble (por ejemplo, Na<2>O, 2SiO2): del 0% a aproximadamente el 4%; percarbonato de sodio: de aproximadamente el 13% a aproximadamente el 22%; TAED: el 1-8%; carboximetilcelulosa (CMC): del 0% a aproximadamente el 3%; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP): del 0% a aproximadamente el 3%; enzimas (calculadas como proteína enzimática pura): el 0,0001-0,1%; e ingredientes minoritarios (por ejemplo, abrillantador óptico, fosfonato, perfume): el 0-3%.
16) Formulaciones detergentes tal como se han descrito en 1)-15) anteriores, que contienen un perácido estabilizado o encapsulado, ya sea como componente adicional o como sustituto de sistemas de blanqueo ya especificados.
17) Composiciones detergentes tal como se han descrito anteriormente en 1), 3), 7), 9) y 12), en las que el perborato se reemplaza por percarbonato.
18) Composiciones detergentes tal como se han descrito anteriormente en 1), 3), 7), 9), 12), 14), y 15), que contienen adicionalmente un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso, por ejemplo, es uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching,"Nature 369: 637-639 (1994).
19) Composición detergente formulada como un líquido detergente no acuoso que comprende un tensioactivo líquido no iónico tal como, por ejemplo, alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema adyuvante (por ejemplo, fosfato), una enzima(s) y un álcali. El detergente también puede comprender un tensioactivo aniónico y/o un sistema blanqueador.
Como anteriormente, el presente polipéptido de amilasa puede incorporarse en una concentración empleada convencionalmente en detergentes. En el presente documento se contempla que, en la composición detergente, la enzima se pueda añadir en una cantidad correspondiente a 0,00001-1,0 mg (calculado como proteína enzimática pura) de polipéptido de amilasa por litro de licor de lavado.
La composición detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales, por ejemplo, material defloculante, material de relleno, depresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes secuestrantes, agentes anti-redeposición de suciedad, agentes deshidratantes, colorantes, bactericidas, fluorescentes, espesantes y perfumes.
La composición detergente se puede formular como una composición detergente para lavado de ropa a mano (manual) o a máquina (automática), que incluye una composición de aditivo para lavado de ropa adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y una composición suavizante de telas añadida en enjuague, o se puede formular como una composición detergente para su uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar, o formularse para operaciones de lavado de vajillas manual o automático.
Cualquiera de las composiciones limpiadoras descritas en el presente documento puede incluir cualquier número de enzimas adicionales. En general, las enzimas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, con respecto al pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, y similares), y las enzimas deben estar presentes en cantidades eficaces. Las siguientes enzimas se proporcionan como ejemplos.
Proteasas:Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente con proteínas, así como proteínas procesadas de forma natural. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, una proteasa microbiana alcalina, una proteasa similar a tripsina o una proteasa similar a quimotripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente las derivadas deBacillus,por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168(véase, por ejemplo, el documentoWO 89/06279). Ejemplos de proteasas similares a la tripsina son la tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino), y proteasas deFusarium(véanse, por ejemplo, el documento WO 89/06270 y el documento WO 94/25583). Ejemplos de proteasas útiles también incluyen, pero sin limitación, las variantes descritas en los documentos WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946. Las enzimas proteasas disponibles comercialmente incluyen, pero sin limitación: ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE®, KANNASE™, y BLAZE™ (Novo Nordisk A/S and Novozymes A/S); MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP™, FN2™ y FN3™ (Danisco US Inc.). Otros ejemplos de proteasas incluyen NprE deBacillus amyloliquifaciensy ASP deCellulomonassp. cepa 69B4.
Lipasas:Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente, modificados proteolíticamente o modificados genéticamente con proteínas. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen, pero sin limitación, lipasas deHumicola(sinónimoThermomyces),por ejemplo deH. lanuginosa (T. lanuginosus) (véanse, por ejemplo, los documentosEP 258068 y EP 305216), deH. insolens(véase, por ejemplo, el documento WO 96/13580); una lipasa dePseudomonaslipase (por ejemplo deP. alcaligenesoP. pseudoalcaligenes; véase, por ejemplo,el documento EP 218272),P. cepacia(véase, por ejemplo, el documento EP 331 376),P. stutzeri(véase, por ejemplo, el documento GB 1,372,034),P. fluorescens, Pseudomonassp. cepa SD 705 (véanse, por ejemplo, los documentos WO 95/06720 y WO 96/27002),P. wisconsinensis(véase, por ejemplo, el documento WO 96/12012); una lipasa deBacillus(por ejemplo, deB. subtilis;véase, por ejemplo Dartois et al. Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B.stearothermophilus(véase, por ejemplo, el documento JP 64/744992), oB. pumilus(véase, por ejemplo, el documento WO 91/16422). Las variantes de lipasa adicionales contempladas para su uso en las formulaciones incluyen las descritas, por ejemplo, en los documentos: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, y EP 260105. Algunas enzimas lipasa disponibles comercialmente incluyen LIPOLASE® y LIPOLASE ULTRA™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
Poliesterasas:Pueden incluirse poliesterasas adecuadas en la composición, tales como las descritas en, por ejemplo, los documentos WO 01/34899, WO 01/14629 y US6933140.
Amilasas: Las composiciones se pueden combinar con otras amilasas, tales como amilasa mejorada sin producción. Estos pueden incluir amilasas disponibles comercialmente, tales como, pero sin limitación, STAINZYME®, NATALASE®, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL® y BAN™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); RAPIDASE®, POWERASE®, y PURASTAR® (de Danisco US Inc.).
Celulasas:Se pueden añadir celulasas a las composiciones. Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente con proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los génerosBacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium,por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir deHumicola insolens, Myceliophthora thermophilayFusarium oxysporumdivulgadas por ejemplo en las patentes de Estados Unidos N° 4.435.307; 5.648.263; 5.691.178; 5.776.757; y el documento WO 89/09259. Los ejemplos de celulasas contempladas para su uso son aquellas que tienen beneficios para el cuidado del color del textil. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en, por ejemplo, en los documentos EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, y WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa, tales como las descritas en los documentos WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315; y las patentes de Estados Unidos N° 5.457.046; 5.686.593; y 5.763.254. Las celulasas disponibles comercialmente incluyen CELLUZYME® y CAREZYME® (Novo Nordisk A/S and Novozymes A/S); CLAZINASE® y PURADAX HA® (Danisco US Inc.); y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Peroxidasas/Oxidasas:Las peroxidasas/oxidasas adecuadas contempladas para su uso en las composiciones incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados genéticamente con proteínas. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas deCoprinus,por ejemplo, de C.cinereus,y variantes de los mismos tales como las descritas en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, GUARDZYME™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
La composición detergente también puede comprender 2,6-p-D-fructano hidrolasa, que es eficaz para eliminar/limpiar la biopelícula presente en textiles/ropa domésticos y/o industriales.
La(s) enzima(s) detergente(s) se pueden incluir en una composición detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Se puede formular un aditivo detergente, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, por ejemplo, como un granulado, un líquido, una suspensión y similares. Los ejemplos de formulaciones de aditivos detergentes incluyen, pero sin limitación, granulados, en particular granulados que no forman polvo, líquidos, en particular líquidos estabilizados o suspensiones.
Se pueden producir granulados que no generan polvo, por ejemplo, tal como se divulga en las patentes de Estados Unidos N° 4.106.991 y 4.661.452 y opcionalmente puede recubrirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de óxido de polietileno (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1.000 a 20.000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. Se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para su aplicación mediante técnicas de lecho fluido, por ejemplo, en el documento GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse, por ejemplo, añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según procedimientos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar según el procedimiento divulgado en el documento EP 238.216.
La composición detergente puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso y normalmente contiene hasta aproximadamente el 70% de agua y del 0% a aproximadamente el 30% de disolvente orgánico. También se contemplan geles detergentes compactos que contienen aproximadamente el 30% o menos de agua. La composición detergente puede comprender opcionalmente uno o más tensioactivos, que pueden ser no iónicos, incluidos semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o iónicos dipolares. Los tensioactivos pueden estar presentes en un amplio intervalo, de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 60% en peso.
Cuando se incluye en el mismo, el detergente contendrá normalmente de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 40% de un tensioactivo aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal, a-olefinsulfonato, alquilsulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico del ácido a-sulfograso, ácido alquil o alquenilsuccínico, o jabón.
Cuando se incluye en el mismo, el detergente contendrá normalmente de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 40% de un tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxialquilamida de ácido graso, o derivados N-acil-N-alquílicos de glucosamina ("glucamidas").
El detergente puede contener del 0% a aproximadamente el 65% de un adyuvante de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético, ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido soluble. silicatos o silicatos en capas (por ejemplo,SKS-6 de Hoechst).
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos de polímeros incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenglicol) (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, por ejemplo, poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico) y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico.
La(s) enzima(s) de la composición detergente se pueden estabilizar usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, tales como poliol (por ejemplo, propilenglicol o glicerol), un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado del ácido bórico (por ejemplo, un éster de borato aromático), o un derivado del ácido fenilborónico (por ejemplo, ácido 4-formilfenilborónico). La composición puede formularse tal como se describe en los documentos WO 92/19709 y WO 92/19708.
Se contempla que en las composiciones detergentes, en particular las variantes enzimáticas, se puedan añadir una cantidad correspondiente a aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado (por ejemplo, aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5,0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado o 0,1 a aproximadamente 1,0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado).
Aún más ejemplos de formulaciones detergentes a las que se puede añadir la presente amilasa (o en algunos casos se identifica como un componente) se enumeran en las tablas siguientes:
��
��
��
��
Agentes para lavado de vajillas manual
Ingrediente % en peso
Invención Invención Invención Invención Invención Invención Invención 1 2 3 4 5 6 7
Agente detergente/de limpieza con actividad antibacteriana
Detergente que contiene agente anti-agrisado
La matriz 1 basada en ácidos grasos está compuesta por el 20% en peso de la sal sódica de ácido graso de coco, el 50% en peso de polioles no poliméricos (sorbitol, glicerina, propilenglicol, sacarosa y glucosa), el 15% en peso de tensioactivos aniónicos y no iónicos, y el 15% en peso de agua.
La matriz 2 basada en ácidos grasos está compuesta por el 20% en peso de la sal sódica de ácido esteárico, el 3% en peso de la sal sódica de ácido láurico, el 3% en peso de la sal sódica de ácido mirístico, el 50% en peso de sal sódica de ácido mirístico, polioles poliméricos (sorbitol, glicerina y propilenglicol), el 2% en peso de ácido láurico, el 2% en peso de ácido esteárico, el 10% en peso de tensioactivo aniónico y el 10% en peso de agua.
7.6. Procedimientos para evaluar la actividad de amilasa en composiciones detergentes
En la técnica se conocen numerosos ensayos de limpieza de a-amilasa, incluidos ensayos de muestras y micromuestras. Los ejemplos adjuntos describen solo algunos de estos ensayos.
Para ilustrar mejor las composiciones y los procedimientos, y las ventajas de los mismos, se proporcionan los siguientes ejemplos específicos quedando entendido que tienen carácter ilustrativo y no limitativo.
8. Composiciones para la elaboración de cerveza
La amilasa variante definida en las reivindicaciones puede ser un componente de una composición para la elaboración de cerveza utilizada en un proceso de elaboración de cerveza, es decir, la elaboración de una bebida de malta fermentada. Los carbohidratos no fermentables forman la mayor parte de los sólidos disueltos en la cerveza final. Este residuo permanece debido a la incapacidad de las amilasas de malta para hidrolizar los enlaces alfa-1,6 del almidón. Los carbohidratos no fermentables aportan aproximadamente 50 calorías por cada 12 onzas de cerveza. Una amilasa, en combinación con una glucoamilasa y opcionalmente una pululanasa y/o isoamilasa, contribuyen a convertir el almidón en dextrinas y azúcares fermentables, reduciendo la cantidad de carbohidratos residuales no fermentables en la cerveza final.
Las principales materias primas utilizadas en la elaboración de estas bebidas son el agua, el lúpulo y la malta. Además, se pueden utilizar adjuntos tales como sémola de maíz común, sémola de maíz refinada, levadura de cerveza molida, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereal torrefacto, copos de cereales, centeno, avena, patata, tapioca y jarabes, tales como jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabes de cebada y/o trigo, y similares como fuente de almidón.
Por diversas razones, la malta, que se produce principalmente a partir de variedades seleccionadas de cebada, tiene el mayor efecto en el carácter y la calidad generales de la cerveza. En primer lugar, la malta es el principal agente aromatizante de la cerveza. En segundo lugar, la malta proporciona la mayor parte del azúcar fermentable. En tercer lugar, la malta proporciona las proteínas que contribuirán al cuerpo y al carácter espumoso de la cerveza. En cuarto lugar, la malta proporciona la actividad enzimática necesaria durante la maceración. El lúpulo también contribuye significativamente a la calidad de la cerveza, incluido el sabor. En particular, el lúpulo (o los componentes del lúpulo) añaden sustancias amargas deseables a la cerveza. Además, el lúpulo actúa como precipitante de proteínas, establece agentes conservantes y contribuye a la formación y la estabilización de espuma.
También se utilizan cereales tales como la cebada, la avena y el trigo, así como componentes vegetales tales como el maíz, el lúpulo y el arroz, para la elaboración de cerveza, tanto en la industria como en la elaboración de cerveza casera. Los componentes utilizados en la elaboración de cerveza pueden estar sin maltear o malteados, es decir, parcialmente germinados, lo que da como resultado un aumento en los niveles de enzimas, incluida la a-amilasa. Para una elaboración exitosa de la cerveza, se necesitan niveles adecuados de actividad de la enzima a-amilasa a fin de garantizar los niveles apropiados de azúcares para la fermentación. En consecuencia, se puede añadir una amilasa, sola o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), a los componentes usados para la elaboración de cerveza.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "material inicial" significa granos y componentes vegetales que se trituran o se rompen. Por ejemplo, la cebada utilizada en la producción de cerveza es un grano que se ha molido o triturado en trozos grandes para obtener una consistencia apropiada para producir un macerado para la fermentación. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "material inicial" incluye cualquiera de los tipos de plantas y granos mencionados anteriormente en forma triturada o molida en trozos grandes. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para determinar los niveles de actividad de a-amilasa tanto en harinas como en el material inicial.
Los procesos para elaborar cerveza son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Wolfgang Kunze (2004) "Technology Brewing and Malting," Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3a edición. Brevemente, el proceso implica: (a) preparar un macerado, (b) filtrar el macerado para preparar un mosto y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, tal como cerveza. Normalmente, la malta molida o triturada se mezcla con agua y se mantiene durante un periodo de tiempo a temperaturas controladas para permitir que las enzimas presentes en la malta conviertan el almidón presente en la malta en azúcares fermentables. Después, el macerado se transfiere a un filtro de macerado en el que se separa el líquido del residuo de grano. Este líquido dulce se denomina "mosto" y el residuo del grano restante se denomina "bagazo". El macerado normalmente se somete a una extracción, que implica añadir agua al macerado para recuperar el extracto soluble residual del bagazo. Después, el mosto se hierve vigorosamente para esterilizarlo y fomentar el desarrollo del color, el sabor y el olor. El lúpulo se añade en algún momento durante la ebullición. El mosto se enfría y se transfiere a un fermentador.
Después, el mosto se pone en contacto con la levadura en un fermentador. El fermentador se puede enfriar para detener la fermentación. La levadura flocula y se elimina. Finalmente, la cerveza se enfría y se almacena durante un periodo de tiempo, durante el cual la cerveza se clarifica y se desarrolla su sabor, y se deposita cualquier material que pueda perjudicar la apariencia, el sabor y la vida útil de la cerveza. La cerveza normalmente contiene de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 10% v/v de alcohol, aunque se puede obtener cerveza con un contenido de alcohol más alto, por ejemplo, el 18% v/v. Antes del envasado, la cerveza se carbonata y, opcionalmente, se filtra y se pasteuriza.
La composición para la elaboración de cerveza que comprende una amilasa, en combinación con una glucoamilasa y opcionalmente una pululanasa y/o isoamilasa, se puede añadir al macerado de la etapa (a) anterior, es decir, durante la preparación del macerado. Como alternativa, o adicionalmente, la composición para la elaboración de cerveza se puede añadir al macerado de la etapa (b) anterior, es decir, durante la filtración del macerado. Alternativamente, o adicionalmente, la composición para la elaboración de cerveza se puede añadir al mosto de la etapa (c) anterior, es decir, durante la fermentación del mosto.
Se puede producir una bebida fermentada, tal como una cerveza, mediante uno de los procedimientos anteriores. La bebida fermentada puede ser una cerveza, tal como cerveza de pura malta, cerveza elaborada según la ley de pureza "Reinheitsgebot", cerveza de fermentación alta (ale), IPA, cerveza de baja fermentación (lager), bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, bebida afín a la cerveza, cerveza ligera, cerveza de bajo contenido alcohólico, cerveza baja en calorías, porter, bock, stout, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares, pero también bebidas a base de malta y cereales alternativas, tales como bebidas de malta con sabor a fruta, por ejemplo, bebidas de malta con sabor a cítrico, tales como con sabor a limón, naranja, lima o bayas, bebidas a base de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron o tequila o bebidas de malta con sabor a café, tales como licor de malta con sabor a cafeína, y similares.
9. Reducción del almidón positivo a yodo
Las amilasas variantes pueden reducir el almidón positivo a yodo (IPS), cuando se usan en un procedimiento de licuefacción y/o sacarificación. Una fuente de IPS es la amilosa que escapa a la hidrólisis y/o el polímero de almidón retrogradado. La retrogradación del almidón se produce espontáneamente en una pasta o gel de almidón al envejecer, debido a la tendencia de las moléculas de almidón a unirse entre sí, seguida de un aumento de la cristalinidad. Las soluciones de baja concentración se vuelven cada vez más turbias debido a la asociación progresiva de las moléculas de almidón en artículos más grandes. Se produce la precipitación espontánea y el almidón precipitado parece volver a su condición original de insolubilidad en agua fría. Las pastas de mayor concentración al enfriarse forman un gel que al envejecer se vuelve progresivamente más firme debido a la creciente asociación de las moléculas de almidón. Esto se debe a la fuerte tendencia a la formación de enlaces de hidrógeno entre grupos hidroxi en moléculas de almidón adyacentes. Véase J.A. Radley, ed., STARCH AND ITS DERIVATIVES 194-201 (Chapman y Hall, Londres (1968)).
La presencia de IPS en el licor de sacáridos afecta negativamente a la calidad del producto final y representa un problema importante en el procesamiento posterior. El IPS obstruye o ralentiza el sistema de filtración y contamina las columnas de carbón utilizadas para la purificación. Cuando el IPS alcanza niveles suficientemente altos, puede filtrarse a través de las columnas de carbón y reducir la eficacia de la producción. Además, puede obtenerse como resultado un producto final turbio durante el almacenamiento, lo que resulta inaceptable para la calidad del producto final. La cantidad de IPS se puede reducir aislando el tanque de sacarificación y mezclando nuevamente el contenido. Sin embargo, el IPS se acumula, entre otros dispositivos, en columnas de carbón y sistemas de filtrado. Se espera que el uso de amilasas variantes mejore el rendimiento general del proceso al reducir la cantidad de IPS.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Ensayos
A continuación se exponen varios ensayos utilizados en el presente documento para facilitar la lectura. Cualquier desviación de los protocolos en ejemplos posteriores se indica en las secciones pertinentes. En estos experimentos, se utilizó un espectrofotómetro para medir la absorbancia de los productos formados después de completar las reacciones. Todos los ensayos se realizaron con sobrenadantes de cultivo tratados con perlas chelex
A. Tratamiento con perlas Chelex de sobrenadantes de cultivo
Las placas de microvaloración (MTP) de 96 pocillos que contenían cultivos en crecimiento se extrajeron de las incubadoras y las tapas Enzyscreen se reemplazaron por selladores de plástico desechables (Nunc N° de cat. 236366; Rochester, NY, Estados Unidos). Las células se separaron del sobrenadante del cultivo mediante centrifugación (1118 RCF, 5 minutos). Se retiraron 150 pl de sobrenadante de cada pocillo y se transfirieron a placas de filtro (Millipore Multiscreen HTS, Billerica, MA, Estados Unidos) que contenían perlas Chelex preparadas tal como se describe a continuación. Las placas se agitaron vigorosamente durante 5 minutos y el sobrenadante de 3 placas de cultivo replicadas se recogió en una única placa de microvaloración de pocillos profundos (Axygen, PDW-11-C) utilizando un dispositivo colector de vacío. Las placas que contenían los sobrenadantes se sellaron y se almacenaron a 4°C.
Se lavaron dos veces perlas Chelex-100, malla 200-400 (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos) con 2 volúmenes de lecho de HCl 1 M seguidos de 5 volúmenes de lecho de agua ultrapura en un aparato de filtro de vidrio sinterizado. Se usaron 2 volúmenes de lecho de KOH 1 M para lavar las perlas y seguidamente se realizó otro lavado con 5 volúmenes de lecho con agua ultrapura. Las perlas filtradas se transfirieron a un vaso de precipitados y se suspendieron con suficiente agua ultrapura para producir una suspensión capaz de mezclarse. El pH de la suspensión se ajustó a 8-8,5 usando HCl. Se eliminó el líquido y las perlas se secaron usando un filtro de vidrio sinterizado. Se preparó una suspensión de perlas (40% p/v) en agua ultrapura y su pH se ajustó a 8,0 usando KOH/HCI. Se mantuvo una suspensión que tenía una consistencia constante mediante mezclado vigorosa. Se utilizó un dispositivo de depósito de paleta de burbujas (V&P Scientific, San Diego, CA, Estados Unidos) para transferir 100 pl de suspensión a todos los pocillos de las placas de filtro. El líquido se eliminó usando un dispositivo colector de vacío.
B. Ensayo de determinación de proteínas
Los ensayos de determinación de proteínas se realizaron utilizando sobrenadante de cultivo tratado con perlas chelex a partir de cultivos cultivados en placas de microvaloración (MTP) de 96 pocillos durante 3 días a 37°C con agitación a 300 rpm y el 80% de humedad. Se utilizó una MTP nueva de fondo redondo de 96 pocillos que contenía 25 pl de sobrenadante por pocillo para el procedimiento de determinación de proteínas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los sobrenadantes se diluyeron cuatro veces en acetato de sodio 25 mM, pH 5,5, y se analizaron 10 pl de cada muestra diluida. Se utilizó una HPLC Agilent 1200 (Hewlett Packard) equipada con una columna Poroshell 300SB-C8 (Agilent Technologies Santa Clara, CA, Estados Unidos). La muestra se unió a la columna usando acetato de sodio 25 mM, pH 5,5, y se eluyó con un gradiente de hasta el 70% de acetonitrilo. La absorbancia se midió a 220 nm, se integró utilizando el programa informático ChemStation (Agilent Technologies) y la concentración de proteína de las muestras se determinó basándose en una curva patrón de proteína CspAmy2-v1 purificada.
C. Ensayo Ceralpha de actividad de a-amilasa
El ensayo Ceralpha de a-amilasa se realizó utilizando el kit Ceralpha (Megazyme, Wicklow, Irlanda). El ensayo implica incubar el sobrenadante del cultivo con una mezcla de sustrato en condiciones definidas, y la reacción se termina (y el color se desarrolla) mediante la adición de tampón de borato (tampón de ácido bórico/NaOH 200 mM, pH 10). El sustrato es una mezcla del oligosacárido definido "p-nitrofenilmaltoheptaósido bloqueado en el extremo no reductor" (BPNPG7) y niveles excesivos de a-glucosidasa (que no actúa sobre el sustrato nativo debido a la presencia del "grupo de bloqueo"). En la hidrólisis del oligosacárido mediante una a-amilasa endoactiva, las cantidades excesivas de aglucosidasa presentes en la mezcla proporcionan una hidrólisis instantánea y cuantitativa del fragmento de pnitrofenilmaltosacárido para dar glucosa y p-nitrofenol libre. Se midió la absorbancia a 405 nm, que se relaciona directamente con el nivel de amilasa en la muestra analizada.
El equipo utilizado para este ensayo incluyó un robot Biomek FX (Beckman Coulter Brea, CA, Estados Unidos); un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific, Rockford, IL, Estados Unidos). El reactivo y las soluciones utilizados fueron:
1) sustrato de p-nitrofenilmaltoheptaósido (BPNPG7) (kit Ceralpha HR de Megazyme);
2) tampón de malato 50 mM, TWEEN® 80 al 0,005%, pH 5,6 o MOPS 50 mM, TWEEN® 80 al 0,005%, pH 7 (tampones de dilución); y
3) tampón de ácido bórico/NaOH 200 mM, pH 10 (tampón de detección).
Un vial que contenía 54,5 mg de sustrato BPNPG7 se disolvió en 10 ml de agua MilliQ y después se diluyó en 30 ml de tampón de dilución para obtener 40 ml del sustrato de trabajo (1,36 mg/ml). Las muestras de amilasa (sobrenadante de fermentación) se diluyeron 40X con tampón de dilución. El ensayo se realizó añadiendo 5 gl de solución de amilasa diluida en los pocillos de una MTP seguida de la adición de 55 gl de solución de sustrato de trabajo BPNPG7 diluida. Las soluciones se mezclaron y la MTP se selló con un sello de placa y se colocó en una incubadora/agitador (iEMS-Thermo Scientific) durante 4 minutos a 25°C. La reacción se terminó añadiendo 70 gl de tampón de detección y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 400 nm en un lector de MTP. Se utilizó un control no enzimático para corregir los valores de absorbancia de fondo.
D. Ensayo de termoestabilidad
La termoestabilidad de CspAmy2-v1 y sus variantes se midió determinando la actividad de amilasa mediante el ensayo Ceralpha de a-amilasa. El equipo utilizado para este ensayo incluyó un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices), una máquina de PCR Tetrad2DNA Engine (Biorad) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific). Las soluciones de reactivo utilizadas fueron (* no en todos los ensayos):
1) tampones de estrés por calor
a) KOAc 50 mM, pH 4,5 (5 ppm de CaCl<2>, 50 ppm de NaCl)*,
b) KOAc 50 mM, pH 5,0 (10 ppm de CaCl<2>, NaCl 10 mM)
c) KOAc 50 mM, pH 5,7 (5 ppm de CaCl<2>, 50 ppm de NaCl),
d) KOAc 50 mM, pH 5,7 (condición sin sal)*,
2) sustrato de p-nitrofenilmaltoheptaósido (BPNPG7) (kit Ceralpha HR de Megazyme):
3) tampón de malato 50 mM, TWEEN® 80 al 0,005%, pH 5,6 (tampón de dilución); y
4) ácido bórico/NaOH 200 mM, pH 10 (tampón de detección).
5) sobrenadante de cultivo de amilasa: se diluyeron 1:10 placas de enzima de dilución maestra 1:10 en cada uno de los cuatro tampones de estrés por calor en una placa de PCR
Se añadieron 5 gl de las muestras de enzimas diluidas a una placa de PCR de 96 pocillos que contenía 55 gl de solución de sustrato de trabajo BPNPG7 diluida y se determinó la actividad de amilasa inicial de las muestras utilizando el ensayo Ceralpha de a-amilasa tal como se describe en la sección C. Las muestras se sometieron a estrés por calor durante 3 a 6 minutos en un termociclador de PCR de la forma siguiente: Tampones (a) 50°C, (b) 59°-60°C, (c) 65°-70°C y (d) 65°C. Las muestras con estrés por calor se enfriaron inmediatamente a temperatura ambiente y se analizaron partes alícuotas de 5 gl para determinar la actividad de amilasa usando el ensayo Ceralpha de a-amilasa tal como se describe en la sección C. Para cada variante, se usó la relación de las actividades de amilasa inicial y residual para calcular la termoestabilidad de la forma siguiente: Termoestabilidad = [valor de tresidual] / [valor de tinicial], por lo que la relación de actividad de estabilidad al calor se calculó basándose en la actividad enzimática después de la incubación con calor dividida por la actividad enzimática antes de la incubación con calor. Para cada muestra (variantes) se calcula el índice de rendimiento (IR). El índice de rendimiento para la termoestabilidad se determina comparando la termoestabilidad de la enzima variante con la de la enzima CspAmy2-v1 tratada de forma similar (SEQ ID NO: 3).
E. Ensayos de hidrólisis de almidón (ensayos de aplicación de harina de maíz y almidón de maíz)
Se utilizó la hidrólisis de almidón de harina de maíz y almidón de maíz para medir la actividad específica de CspAmy2-v1 y sus variantes. La actividad se midió como extremos reductores generados mediante la descomposición enzimática de la harina de maíz o del almidón de maíz. Los extremos reductores generados durante la incubación con cualquiera de los sustratos se cuantificaron utilizando un ensayo PAHBAH (hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico). El equipo utilizado para el ensayo incluyó un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices), una máquina Tetrad2DNA Engine PCR (Biorad) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific) y un depósito de paleta de burbujas.
Se molió harina de maíz orgánico de Azure Farms (Norco, CA) hasta obtener un polvo fino utilizando un molinillo de café para consumidores y después se tamizó para obtener una fracción de <250 micrómetros. La harina de maíz tamizada se lavó extensamente con agua MilliQ mediante suspensión y centrifugación repetidas. El material de almidón de maíz orgánico de Cargill Farms también se lavó minuciosamente con agua MilliQ mediante suspensión y centrifugación repetidas.
Tanto las fracciones lavadas de harina de maíz como las de almidón de maíz se suspendieron en agua MilliQ que contenía azida sódica al 0,005% como soluciones madre al 20% (p/p). Las soluciones madre se diluyeron adicionalmente con una solución tampón madre 20X para dar soluciones de harina de maíz y almidón de maíz al 10,9% p/v (concentración final de tampón: KOAc 55 mM, pH 5).
Se añadieron 55 pl de los sustratos diluidos de harina de maíz y almidón de maíz a placas de microvaloración de PCR junto con 5 pl de muestras de enzimas diluidas 1:10 usando un depósito de paleta de burbujas. Las placas se sellaron y se dispusieron a 83°C durante 5 minutos, seguidos de una rampa de descenso hasta 45°C. La reacción de hidrólisis del almidón se terminó mediante la adición de 70 pl de NaOH 0,1 N. Las placas se sellaron y se centrifugaron durante 3 minutos a 1610 RCF. Los productos de la reacción de hidrólisis del almidón de ambas reacciones se analizaron mediante el ensayo PAHBAH tal como se describe a continuación.
Ensayo PAHBAH.Se añadieron partes alícuotas de 80 pl de NaOH 0,5 N a todos los pocillos de una placa de PCR vacía (una "placa de reacción PAHBAH"), seguidas de 20 pl de reactivo PAHBAH (5% p/v de hidrazida de ácido phidroxibenzoico (Sigma # H9882, St. Luois, MO), disuelto en HCl 0,5 N). Las soluciones se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Se añadieron 20 pl de los sobrenadantes de la reacción de hidrólisis del almidón a cada pocillo de la placa de reacción PAHBAH. Las placas se sellaron y se dispusieron en un termociclador, se programaron durante 2 minutos a 95°C para desarrollar color y después se enfriaron a 20°C. Se transfirieron muestras de 80 pl de las mezclas de reacción de PAHBAH desarrolladas a una placa nueva y se midió la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro.
F. Ensayo de micromuestras de almidón de arroz CS-28
El principio de este ensayo de amilasa es la liberación de un tinte naranja debido a la hidrólisis del almidón de arroz incorporado en una micromuestra de algodón. Se mide la absorbancia a 488 nm del líquido de lavado y esta se relaciona con el nivel de actividad de amilasa en la muestra analizada en las condiciones deseadas (pH, temperatura y tampón).
El equipo utilizado para este ensayo incluyó un robot Biomek FX (Beckman Coulter), un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific). El reactivo y las soluciones utilizados fueron:
1) Micromuestras CS-28 (almidón de arroz, coloreado);
2) HEPES 10 mM, CaCl<2>2 mM, tampón TWEEN 80 al 0,005%, pH 8,0, conductividad 1 mS/cm;
3) CAPS 25 mM, CaCl<2>2 mM, tampón TWEEN 80 al 0,005%, pH 10,0, conductividad 5 mS/cm (ajustada con NaCl 5 M); y
4) NaCl 10 mM, CaCl<2>0,1 mM, TWEEN 80 al 0,005%.
5) MOPS 50 mM pH 7,15, CaCl<2>0,1 mM.
El Center for Testmaterials (CFT, Vlaardingen, Países Bajos) proporcionó micromuestras CS-28 de 5,5 mm de diámetro circular. Se colocaron dos micromuestras en cada pocillo de una MTP de poliestireno de fondo plano Coming 9017 de 96 pocillos. Los sobrenadantes del cultivo se diluyeron ocho veces en MOPS 50 mM, pH 7,15, CaCl<2>0,1 mM, y posteriormente en solución de NaCl 10 mM, CaCl<2>0,1 mM, TWEEN®80 al 0,005% a aproximadamente 1 ppm, concentración final de enzima.
La incubadora/agitador se ajustó a la temperatura deseada, 25°C (temperatura ambiente) o 50°C. Se añadieron 174 pl o 177 pl de tampón HEPES o CAPS, respectivamente, a cada pocillo de la MTP que contenía la micromuestra y posteriormente se añadieron 6 pl o 3 pl de solución enzimática diluida a cada pocillo, lo que dio como resultado un volumen total de 180 pl/pocillo. La MTP se selló con un sello de placa y se colocó en la incubadora/agitador iEMS y se incubó durante 15 minutos a 1150 rpm a 25°C para limpieza a pH 8, baja conductividad (1 mS/cm), o durante 15 minutos a 1150 rpm a 50°C para limpieza a pH 10, alta conductividad (5 mS/cm). Después de la incubación en las condiciones apropiadas, se transfirieron 100 pl de solución de cada pocillo a una MTP nueva y se midió la absorbancia a 488 nm utilizando un espectrofotómetro de MTP. Se incluyeron controles que contenían dos micromuestras y tampón pero ninguna enzima para restar el rendimiento de limpieza de fondo.
Cada valor de absorbancia se corrigió restando el blanco (obtenido después de la incubación de micromuestras en ausencia de enzima), y la absorbancia resultante proporcionó una medida de la actividad hidrolítica. Se calculó un índice de rendimiento (IR) para cada muestra.
Para el cálculo de los índices de rendimiento (IR) de lavado se usó la ecuación de Langmuir para ajustar los datos basándose en el control de la enzima CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3). Utilizando la concentración de proteína de las variantes, se calculó el rendimiento esperado basado en el ajuste de la curva. El rendimiento observado se dividió por el rendimiento calculado. Después, este valor se dividió por el rendimiento de la enzima CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3).
G. Ensayo de estabilidad en detergente
La estabilidad de la amilasa de referencia (enzima CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3)) y variantes de la misma se determinó midiendo su actividad después de la incubación en condiciones definidas, en presencia de una mezcla de detergente al 10% (detergente Persil Color Gel adquirido comercialmente, Henkel (Düsseldorf, Alemania), adquirido en 2011). El detergente se inactivó por calor antes de su uso y las actividades de amilasa inicial y residual se determinaron usando el ensayo Ceralpha de a-amilasa tal como se describe en la sección C anterior.
El equipo utilizado para este ensayo incluyó un robot Biomek FX (Beckman Coulter); un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340-Molecular Devices), una máquina de PCR Tetrad2DNA Engine (Biorad) y una incubadora/agitador iEMS (Thermo Scientific). Las soluciones de reactivo utilizadas fueron:
1) sustrato de p-nitrofenilmaltoheptaósido (BPNPG7) (kit Ceralpha HR de Megazyme):
2) Detergente líquido (Persil color gel, enzima inactivada por calentamiento durante 2 horas a 80°C);
3) MOPS 50 mM, CaCl<2>0,1 mM, tampón TWEEN®80 al 0,005%, pH 7 (tampón de dilución);
4) solución detergente al 10% diluida en tampón de dilución;
5) Tampón de ácido bórico/NaOH 200 mM, pH 10 (tampón de detección).
6) Sobrenadantes del cultivo de amilasa diluidos ocho veces en MOPS 50 mM, pH 7,15, CaCl<2>0,1 mM que contiene 0-100 pg/ml de proteína
Se añadieron 85 pl de una solución de detergente al 10% a una placa de PCR de 96 pocillos y se mezclaron con 15 pl del sobrenadante del cultivo diluido. Una muestra de la placa de PCR se diluyó 3 veces en tampón de dilución y se usó una parte alícuota de 5 pl de esta dilución para determinar la actividad de amilasa inicial. La placa de PCR se incubó en un bloque de PCR Tetrad a 80,5°C durante 5 minutos. Después de la incubación, la mezcla de detergente y enzima se diluyó 3 veces en tampón de dilución y se midió la actividad residual. La actividad de amilasa inicial (tinicial) y residual (tresidual) se determinó mediante el ensayo Ceralpha de a-amilasa tal como se ha descrito anteriormente en la sección C utilizando una muestra de 5 pl.
Para cada variante, se usó la relación de las actividades de amilasa inicial y residual para calcular la estabilidad en detergente de la forma siguiente: Estabilidad en detergente = [valor de tresidual] / [valor de tinicial].
Para cada muestra (variantes) se calcula el índice de rendimiento (IR). El índice de rendimiento para la estabilidad en detergente se determina comparando la estabilidad en detergente de la variante con la de la enzima CspAmy2-v1 tratada de forma similar (SEQ ID NO: 3).
H. Índice de rendimiento
El índice de rendimiento (IR) compara el rendimiento o la estabilidad de la variante y la enzima original (CspAmy2-v1) a la misma concentración de proteína. Además, los valores teóricos se pueden calcular utilizando los parámetros de la ecuación de Langmuir de la enzima estándar. Un índice de rendimiento (IR) superior a 1 (IR>1) indica un mejor rendimiento de una variante en comparación con la parental (por ejemplo, CspAmy2-v1, SEQ ID NO: 3), mientras que un IR de 1 (IR=1) identifica una variante que tiene el mismo rendimiento que la parental, y un IR inferior a 1 (IR<1) identifica una variante que tiene un peor rendimiento que la parental.
Ejemplo 2
Generación de cepas de B. subtilis que expresan CspAmy2-v1 y variantes de la misma
En este ejemplo se describe la construcción de cepasBacillus subtilisque expresan amilasa CspAmy2-v1 y variantes de la misma. CspAmy2-v1 es una variante de la amilasa CspAmy2 de tipo silvestre (CspAmy2 wt) que tiene una deleción tanto de arginina 178 como de glicina 179. CspAmy2 wt es una amilasa de unCytophagasp., cuya secuencia de nucleótidos fue descrita por Chii-Ling et al. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68(7): 3651-3654. Se describió que la amilasa CspAmy2-v1 tiene una mayor termoestabilidad que la amilasa CspAmy2 wt por Rong-Jen et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69(4): 2383-2385.
Un fragmento de ADN sintético (SEQ ID NO: 4, denominado en el presente documento "ADNCspAmy2-v1’’) que codifica la amilasa CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 2) se produjo por GeneArt AG (Regensburg, Alemania) y sirvió como plantilla de ADN para la construcción de cepas deBacillus subtilisque expresan amilasa CspAmy2-v1 y variantes de la misma.
La SEQ ID NO:4 incluye una secuencia de nucleótidos modificada por codones que codifica la forma madura de amilasa CspAmy2-v1 adyacente a una secuencia que codifica el péptido señal LAT (subrayado):
ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATC TTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTAGCGCAGCAGCGACAAACGGAACAATGATGCA GT ATTTCGAGT GGT ATGT ACCT AACGACGGCC AGC AAT GGAAC AGACTGAGAAC AG ATGCCCCTTACTTGTCATCTGTTGGTATTACAGCAGTATGGACACCGCCGGCTTATA AGGGCACGTCTCAAGCAGATGTGGGGTACGGCCCGTACGATCTGTATGATTTAGGC GAGTTT AATC AAAAAGGT AC AGT C AGAACGAAGT AT GGC AC AAAAGGAGAACTT A AATCTGCTGTTAACACGCTGCATTCAAATGGAATCCAAGTGTATGGTGATGTCGTGA T GA AT C AT A A AGC AGGT GC T GAT T AT AC AGA A A AC GT A AC GGC GGT GGAGGT GA AT CCGTCTAATAGAAATCAGGAAACGAGCGGCGAATATAATATTCAGGCATGGACAGG CTTCAACTTTCCGGGCAGAGGAACAACGTATTCTAACTTCAAATGGCAGTGGTTCCA TTTTGATGGAACGGATTGGGACCAGAGCAGAAGCCTCTCTAGAATCTTCAAATTCA CGGGAAAGGCGT GGGACTGGGAGGTTTCTTC AGAAAACGGAA ATT AT GACTATCTG ATGT ACGCGGAC ATTGATT ATGACC ATCCGGATGTCGT GAAT GAAAT GAAAAAGT G GGGCGTCTGGTATGCCAACGAAGTTGGGTTAGATGGATACAGACTTGACGCGGTCA AAC AT ATT AAATTT AGCTTT CT C AA AGACTGGGT GGAT AACGC AAGAGC AGCGACG GGAAAAGAAAT GTTT ACGGTTGGCGAAT ATT GGC AAAAT GATTT AGGGGCCCTGAA TAACTACCTGGCAAAGGTAAATTACAACCAATCTCTTTTTGATGCGCCGTTGCATTA CAACTTTTACGCTGCCTCAACAGGGGGTGGATATTACGATATGAGAAATATTCTTAA TAACACGTTAGTCGCAAGCAATCCGACAAAGGCTGTTACGTTAGTTGAGAATCATG ACACACAGCCTGGACAATCACTGGAATCAACAGTCCAACCGTGGTTTAAACCGTTA GCCTACGCGTTTATTCTCACGAGAAGCGGAGGCTATCCTTCTGTATTTTATGGAGAT ATGT ACGGT AC AAAAGGAAC GAC AAC AAGAGAGATCCCTGCTCTTAAATCT AAAAT CGAACCTTTGCTTAAGGCTAGAAAAGACTATGCTTATGGAACACAGAGAGACTATA TTGATAACCCGGATGTCATTGGCTGGACGAGAGAAGGGGACTCAACGAAAGCCAA GAGCGGTCTGGCCACAGTGATTACAGATGGGCCGGGCGGTTCAAAAAGAATGTATG TTGGCACGAGCAATGCGGGTGAAATCTGGTATGATTTGACAGGGAATAGAACAGAT AAAAT C ACGATTGGAAGCGAT GGCT AT GC AAC ATTTCCTGT C AAT GGGGGCTC AGT TT C AGT AT GGGT GC AGC AA
La forma precursora del polipéptido CspAmy2-v1 producida a partir del vector pHPLT02-CspAmy2-v1 se muestra, a continuación, como SEQ ID NO: 3. El péptido señal LAT está subrayado:
MKOOKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAASAAATNGTMMOYFEWYVPNDGOOWNRLRTD APYLS S VGITAVWTPPAYKGTSQAD VGY GPYDL YDLGEFNQKGTVRTKY GTKGELKS A VNTLFISN GIQ VY GD VVMNHK AGAD YTEN VT A VE VNP SNRN QET SGEYNIQ AWT GFN FPGRGTT Y SNFKWQWFHFDGTDWDQ SRSL SRIFKFTGK AWDWE Y S SENGNYD Y LM Y ADID YDHPD VVNEMKKW GVW Y ANEV GLDGYRLD AVKHIKF SFLKDWVDNARAATG KEMF TV GE YW QNDL GALNN YL AK VN YN Q SLFD APLH YNF Y A A S T GGGY YDM RN ILN NTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMY GTKGTTTREIP ALK SKIEPLLK ARKD Y AY GT QRD YIDNPD VIGWTREGD S TK AK S GL AT VITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ
La forma madura del polipéptido CspAmy2-v1 producida a partir del vector pHPLT02-CspAmy2-v1 se muestra, a continuación, como SEQ ID NO: 2.
AATNGTMMQYFEW YVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGY GPYDL YDLGEFNQKGTVRTKY GTKGELKS AVNTLFISNGIQVY GD VVMNFIKAGAD YT EN VT A VE VNP SNRN QET S GEYNIQ AWT GFNFPGRGTT Y SNFKW Q WFHFDGTD WDQ SR SL SRIFKFTGK AW DW E V S SEN GNYD YLM Y ADID YDHPD VVNEM KKW GVW Y ANEV GL DGYRLD AVKHIKF SFLKDW VDNARAAT GKEMFT V GEYW QNDLGALNNYL AK VNYN Q SLFD APLHYNF Y AASTGGGYYDMRNILNNTL VASNPTK A V IL VENHDTQPGQ SLEST V QPWFKPLAYAFILTRSGGYP S VF Y GDM Y GTKGTTTREIP ALKSK IEPLLKARKD Y A Y G T QRD YIDNPD VIGWTREGD S TK AK S GL AT VITDGPGGSKRMY V GT SN AGEIW YDLT GN RTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ
Para expresar CspAmy2-v1, el fragmento de ADNCspAmy2-v1se clonó en el vector pHPLT02, una versión modificada del vector pHPLT (Solingen et al. (2001) Extremophiles 5:333-341) por GeneArt y se fusionó en marco con el péptido señalAmyL(LAT) usando los sitios de restricción únicosNheIyXhoI,lo que dio como resultado el plásmido pHPLT02-CspAmy2-v1. El vector de expresión pHPLT contiene el promotor LAT deB. licheniformis(Plat) y elementos adicionales de pUB 110 (McKenzie et al. (1986) Plasmid, 15: 93-103) incluido un gen de replicasa (reppUB), un gen de resistencia a neomicina/kanamicina (neo) y un marcador de resistencia a bleomicina (bleo). Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene) para cambiar los nucleótidos 5'-TCA-3' de serina 28 del péptido señalAmyLpor los nucleótidos 5'-AGC-3' para introducir el sitio de restricción únicoNheI.
Una cepa adecuada deB. subtilisse transformó con ADN de plásmido pHPL T02-CspAmy2-v 1 usando un procedimiento conocido en la técnica (documento WO 02/14490). Los transformantes deB. subtilisse seleccionaron en placas de agar que contenían agar de infusión de corazón (Difco, N° de catálogo 244400, Lawrence, KS, Estados Unidos y 10 mg/l de sulfato de neomicina (Sigma, N° de catálogo N-1876; contiene 732 pg de neomicina por mg, St. Louis, Missouri, Estados Unidos). El cultivo selectivo de los transformantes deB. subtilisque albergan el plásmido pHPLT02-CspAmy2-v1 se realizó en matraces con agitación a 37°C durante ~65 h en medio Mb D (medio semidefinido enriquecido basado en tampón MOP, con urea como principal fuente de nitrógeno, glucosa como principal fuente de carbono y suplementado con el 1% de soja para un crecimiento celular robusto) que contenía CaCl<2>5 mM y 10 ppm de neomicina. El cultivo dio como resultado la producción de amilasa CspAmy2-v1 secretada con actividad hidrolizante de almidón.
Ejemplo 3
Generación de bibliotecas de evaluación de sitios de CspAmy2-v1
La construcción de una biblioteca de evaluación de sitios (SEL) de CspAmy2-v1 se realizó mediante GeneArt usando su plataforma de tecnología para la optimización de genes, la síntesis de genes y la generación de bibliotecas (véanse, por ejemplo las patentes europeas N° 0200362 y 0201 184, las patentes de Estados Unidos N° 4.683.195, 4.683.202 y 6.472.184, y la solicitud de patente internacional número<w>O 2004/059556A3). El ADN del plásmido pHPLT02-CspAmy2-v1 sirvió como plantilla para producir SEL en cada uno de los sitios de la región madura de la proteína CspAmy2-v1 (SEQ ID NO: 3). Se encargó a GeneArt que creara los SEL en las posiciones utilizando sus protocolos estándar. Los codones correspondientes para cada sitio se sustituyeron cada uno por codones para al menos 10 (de 19 posibles) aminoácidos diferentes. Las mezclas pHPLT02-CspAmy2-v1 con codones mutagenizados se usaron para transformar células deB. subtiliscompetentes tal como se conoce en la técnica (documento WO 2002/014490) para generar los SEL de CspAmy2-v1. Se plaquearon mezclas de transformación en placas de agar HI (agar de infusión de corazón) que contenían 10 mg/l de sulfato de neomicina. Para cada biblioteca, se seleccionaron colonias bacterianas individuales y se cultivaron en medio líquido TSB (caldo a base de triptona y soja) con selección de neomicina 10 mg/ml para el posterior aislamiento de ADN y análisis de secuencia génica. Los datos del análisis de secuencia revelaron un máximo de 19 variantes maduras de CspAmy2-v1 por biblioteca. Para generar muestras de CspAmy2-v1 y enzimas variantes para la caracterización bioquímica, se realizó un cultivo selectivo de las variantes en MTP de 96 pocillos a 37°C durante aproximadamente 65 horas con el 70% de humedad en medio MBD. Se obtuvieron en total 7.870 de las 9.139 variantes posibles para 478 de las 481 posiciones mutagenizadas.
Ejemplo 4
Identificación de mutaciones combinables y productivas
Los valores del índice de rendimiento (IR) se determinaron para todas las variantes de amilasa CspAmy2-v1 analizadas utilizando los ensayos descritos en el ejemplo 1: ensayos de aplicación de harina de maíz y almidón de maíz, ensayo de termoestabilidad (a pH 5,0 y pH 5,7), ensayo de micromuestras CS-28 ( a pH 8 y pH 10), ensayo de estabilidad en detergente, ensayo Ceralpha de actividad y determinación de proteínas. Se describen posiciones productivas como aquellas posiciones dentro de una molécula que son más útiles para crear variantes combinatorias que muestran una característica mejorada, en las que cada posición de producción permite al menos una mutación combinable. Las mutaciones combinables son mutaciones en cualquier posición de aminoácido que pueden usarse para crear variantes combinatorias. Las mutaciones combinables mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, sin disminuir significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad. Las mutaciones combinables se pueden agrupar de la forma siguiente:
Grupo A:Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a una proteína parental definida para: (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad de micromuestras CS-28 a pH 8 (25°C) o pH 10 (50°C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente a pH 5.0 o pH 5,7 son superiores o iguales a 0,9, y además tiene un IR para uno cualquiera de estos ensayos que es superior o igual a 1,0.
Grupo B:Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a una proteína parental definida para: (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad de micromuestras CS-28 a pH 8 (25°C) o pH 10 (50°C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente a pH 5.0 o pH 5,7 son superiores o iguales a 0,8, y además tiene un IR para uno cualquiera de estos ensayos que es superior o igual a 1,2.
Grupo C:Una mutación que produce una variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a una proteína parental definida para: (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad de micromuestras CS-28 a pH 8 (25°C) o pH 10 (50°C), o la actividad en el ensayo Ceralpha, o la actividad en ensayos de aplicación de harina de maíz o almidón de maíz, y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente a pH 5.0 o pH 5,7 son superiores o iguales a 0,5, y además tiene un IR para uno cualquiera de estos ensayos que es superior o igual a 1,5.
Las propiedades de mutaciones combinables se resumen en la tabla 4.1.
T l 4.1. Pr i r r m i n m in l
Las mutaciones combinables preferidas se encuentran en "posiciones productivas", tal como se describe a continuación. En el caso de las presentes amilasas, "actividad" se refiere a actividad de a-amilasa, que puede medirse tal como se describe en el presente documento.
Las "posiciones productivas" son posiciones de aminoácidos que son tolerantes a la sustitución por diferentes residuos de aminoácidos, en las que las variantes resultantes cumplen un conjunto de criterios de rendimiento para la combinabilidad, tal como se ha expuesto anteriormente. A las posiciones productivas se les puede asignar una puntuación de productividad de la forma siguiente: Las posiciones en las que menos del 15% de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "1". Las posiciones en las que menos del 30%, pero una cantidad superior o igual al 15% de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "2". Las posiciones en las que menos del 50%, pero una cantidad superior o igual al 30% de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "3". Las posiciones en las que el 50% o más de las sustituciones en una posición determinada se encuentran dentro de los grupos A, B o C reciben una puntuación de productividad de "4".
La puntuación de idoneidad se refiere a la capacidad de una o más mutaciones combinables para usarse para crear variantes combinatorias, basándose en los criterios de rendimiento para la combinabilidad (es decir, A, B y C, tal como se ha expuesto anteriormente) en los que se incluye cada una de las mutaciones. Una puntuación de idoneidad más alta indica una mutación o mutaciones que son más adecuadas para su uso en la creación de variantes combinatorias. Las puntuaciones de idoneidad se describen en la tabla 4.2.
Tabla 4.2. Definiciones de las puntuaciones de idoneidad
Las puntuaciones de idoneidad de sustituciones individuales en CspAmy2-v1 se muestran en la tabla 4.3. Para cada posición de la proteína CspAmy2-v1, las variantes se enumeran según la puntuación de idoneidad que han recibido (+, +, ++, +++ o ++++). La numeración de posiciones se basa en el polipéptido CspAmy2 maduro (SEQ ID NO: 1).
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "1", "2", "3" y "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. Cada posición identificada en la lista, y cada sustitución identificada entre paréntesis después del identificador de posición numérica, representa una mutación que se ha determinado, basándose en datos experimentales, que contribuye al rendimiento de una variante de amilasa, particularmente una variante que comprende más de uno de las mutaciones descritas. La numeración de posiciones se basa en el polipéptido CspAmy2 maduro (SEQ ID NO: 1).
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "1", "2", "3" y "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en el polipéptido CspAmy2 maduro (SEQ ID NO: 1).
LISTA A:
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P, Q,R,S); 4(N,Q,T); 5(G,A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,S,T,V,Y); 7(M, I); 8(M, F); 11(F,Y); 15(V,C, I, L, N, S,T); 20(Q, E); 21(Q, L,T,W); 23(N,A,D,E,F,H,K,M,Q,S,T,V,W,Y); 26(R,K); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 39(A,S); 40(V,I); 42(T,A,C,I,L,M,V); 45(A,P,S); 46(Y,F,M,T); 48(G,A); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 51(Q,S); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W); 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 57(G,K); 58(P,C); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 71(G,A,N); 72(T,G,H,S); 73(V,T); 75(T,C); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 82(E,Q); 83(L,F); 84(K,I,Q,V); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 87(V,I); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T); 94(G,N); 96(Q,I); 97(V,I); 98(Y,F,W); 101 (V, I); 103(M,I,V); 104(N,D); 106(K,A,I,V); 107(A,G); 108(G,A,K,R,S); 109(A,P); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 113(E,D,Y); 114(N,G); 115(V,A,I,M); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 117(A,C,S); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 119(E,S); 120(V,C); 121(N,K,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 124(N,D); 126(N,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E , A, C , G , H , I, L , M , N , P, Q , R , S , T, V, Y); 133(Y, A, D , E , F, H , K, L , N , T, V); 134(N , C , D , F, G , H , M , P, Q , S , T, Y); 135(I, H , M , R , V); 136(Q , A, F, G , H , I, K, N , T, W, Y); 137(A, V); 138(W, A, D , F, G , H , K, L, M , P, Q , R , S , T, V, Y); 140(G , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , S , T, V, Y); 141(F,H,W); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 151(S,D); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 153(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 157(W,N); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 160(F,C); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 164(D,F,N); 165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R,T,V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); 173(R,K,W); 174(I,L); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 176(K,L); 177(F,G,H); 182(K,H); 183(A,E,K,R); 187(E,P,V); 189(S,A,C,D); 190(S,P); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 195(Y,D); 198(L,A,C,G); 200(Y,E,L); 201(A,L); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 210(V,S); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 216(K,R); 219(V,E,I,L); 222(A,T); 225(V,L); 226(G,C,E,K,Q); 227(L,Y); 232(L,R,V); 235(V,A,C,L,T); 238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q); 240(F,D); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 245(D,E); 246(W,F); 248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 250(A,S); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 254(T,F,I,L,M); 256(K,R); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 259(F,P); 260(T,A,L,S,Y); 262(G,A); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 267(N,D); 269(L,A,I,V); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 271(A,C,S); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 275(Y,F); 276(L,M); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 281(Y,A,D,G); 283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 285(L,A); 286(F,L,M); 288(A,V); 295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R); 301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y); 302(G,S); 303(Y,A,F,I,R,T,V,W); 307(R,Q,S); 308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 310(L,D,E,T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V); 312(N,D,G); 313(T,A,S); 316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 321(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 327(E,D); 335(Q,G); 336(S,A,D); 339(S,Q); 342(Q,E,L); 343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 363(V,I,L); 368(M,L,W,Y); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 375(T,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 378(E,Q); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 390(L,C,I); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 392(A,G); 394(K,E,H,M); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K); 397(A,S); 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 401(Q,M); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 403(D,S); 404(Y,W); 405(I,L); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 409(D,N); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 414(T,A,S); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K, P, Q , R , T, V, Y); 420(T, A, C , D , E , F, G , H , I, L , P, Q , R , S , V,W, Y); 421(K, A, C , F, G , H , I, L , N , R , S , W, Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 424(S,A); 426(L,C); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 431(T,A,D); 433(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T); 444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V); 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 449(E,Q); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V); 452(Y, A, I, L, M, S, V,W); 454(L,A,C, E, F, H, I, K, M, Q, S, T, V, Y); 455(T,A,C, I, L, M, S, V); 456(G , A, C , D , E , F, H , K, L , M , N , R , S , T,W, Y); 458(R , A, C , D , E , F, I, M , N , S , W, Y); 459(T, A, C , D , F, G , L , S , V, W); 460(DE , H , N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 462(I,V); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 464(I,V); 465(G,A,M,N,P,Q); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y); 467(D,N); 469(Y,C,F,I,L,S,V); 470(A,G); 471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 474(V, C); 475(N, A, D , F, G , H , I, K, L , M , P,S , T, V); 476(G , A, C , D , E , H , K, N , P,Q , R , S , T, V, Y); 477(G , A, D , E , H , I, K, P,Q , R , S , T, V, Y); 479(V,C,H,W); 480(S,G); 481(VA,C,I,L); 482(W,Y); 483(V,I); 484(Q,A,H,K); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "2", "3" y "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA B: 1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S); 5(G , A, C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , P, Q , R , S , T, V, Y); 15(V, C , I, L , N , S , T); 21(Q , L , T,W); 23(N , A, D , E , F, H , K, M , Q , S , T, V,W, Y); 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 28(D,A,E,N); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W); 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 35(V,H,I,M,N); 38(T,D,N,S); 42(T,A,C,I,L,M,V); 46(Y,F,M,T); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 50(S,D,E,K); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W); 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 70(K,N,R,W); 72(T,G,H,S); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 84(K,I,Q,V); 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V); 93(N,D,M,T); 106(K,A,I,V); 108(G,A,K,R,S); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W); 112(T,A,C,D,E,F,G,I,L,M,P,Q,R,V,W,Y); 115(V,A,I,M); 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 121(N,K,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T); 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y); 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y); 133(Y,A,D,E,F,H,K,L,N,T,V); 134(N,C,D,F,G,H,M,P,Q,S,T,Y); 135(I,H,M,R,V); 136(Q,A,F,G,H,I,K,N,T,W,Y); 138(W, A, D , F, G , H , K, L , M , P, Q , R , S , T, V, Y); 140(G , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , S , T, V, Y); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y); 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 153(F,H,W,Y); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T); 156(Q,D,F,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 158(F,A,C,D,E,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,W,Y); 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 165(W,F,H,P); 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R, T, V,W); 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 183(A,E,K,R); 189(S,A,C,D); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y); 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 198(L,A,C,G); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y); 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y); 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 219(V,E,I,L); 226(G,C,E,K,Q); 235(V,A,C,L,T); 238(I,L,M,P,Q,R); 239(K,C,M,Q); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 242(F,E,I,V,Y); 243(L,A,I,M,S,T); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y); 248(D,A,N,Q); 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V); 254(T,F,I,L,M); 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 260(T,A,L,S,Y); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 269(L,A,I,V); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 281(Y,A,D,G); 283(Q,H,T,V); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 295(Y,H,L,Q); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 299(T,E,I,R); 300(G,A,K,L,Q,R); 301(G , A, F, H , K, M , Q , R , S , T, Y); 303(Y, A, F, I, R , T, V,W); 308(N , A, C , D , E , F, G , H , L , M , Q , R , S , T, V, Y); 310(L , D , E , T); 311(N,D,E,H,K,Q,S,V); 316(A,K,Q,S); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 321(K,H,R); 325(L,F,I,M,V); 343(P,A,M,W); 348(L,C,G,Q,S); 349(A,G,S,W); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 358(G,D,E,Q,S); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V); 368(M,L,W,Y); 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P); 385(K,A,E); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 394(K,E,H,M); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K); 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R, S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R, S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y); 420(T,A,C,D,E,F,G,H,I,L,P,Q,R,S,V,W,Y); 421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 427(A,C,G,S); 429(V,C,L,M); 430(I,C,E,L,M); 433(G,A,H,N,S); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W); 442(V,A,I,L,T); 444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V); 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V); 452(Y,A,I,L,M,S,V,W); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V); 456(G,A, C,D,E,F ,H,K,L,M,N,R, S, T, W, Y); 458(R,A, C,D,E,F ,I,M,N,S,W, Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 460(DE,H,N); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 465(G , A, M , N , P, Q); 466(S , A, C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , R , T, V, W, Y); 469(Y, C , F, I, L , S , V); 471(T, A, D , E , F, G , H , I, K, N , P, Q , W); 475(N , A, D , F, G , H , I, K, L , M , P, S , T, V); 476(G , A, C , D , E , H , K, N , P, Q , R , S , T, V, Y); 477(G , A, D , E , H , I, K, P, Q , R , S , T, V, Y); 479(V,C,H,W); 481(VA,C,I,L); 484(Q,A,H,K); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad de "3" y "4" descritas anteriormente, y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA C:
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, Y); 3(T, A, D, F, G,M,P,Q,R,S) 5(G,A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,S,T,V,Y); 15(V, C, I, L, N,S,T); 23 (N,A, D, E, F, H, K, M,Q, S,T,V,W,Y) 27(T,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,W,Y); 30(P,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,W,Y); 31(Y,E,F,H,K,M,R,W) 33(S,D,E,G,H,K,N,Q,R); 42(T,A,C,I,L,M,V); 49(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,S,V,Y); 52(A,F,G,H,I,K,N,Q,S,T,W) 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y) 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 88(N,A,D,E,H,Q,R,T); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 92(S,A,L,M,R,V) 111(Y, A, C , D , F, G , H , K, L , M , N , Q , R , S , T, V, W); 112(T, A, C , D , E , F, G , I , L , M , P, Q , R , V,W, Y) 116(T,A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,S,V,W); 118(V,A,C,F,I,K,L,M,N,Q,R,S); 122(P,A,K,Q,R,T) 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y) 130(S,A,G,H,I,R,T,V); 131(G,A,F,H,I,K,M,N,P,Q,T,W); 132(E,A,C,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y) 133(Y, A, D , E , F, H , K, L , N , T, V); 134(N , C , D , F, G , H , M , P, Q , S , T, Y); 136(Q , A, F, G , H , I, K, N , T,W, Y) 138(W,A,D,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y); 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 142(N,A,C,D,E,F ,G,H,I,K,L,M, Q,R,S, T V, W, Y); 144(P,A,C,D,F, G,H,I,K,L,M,N,Q,R, T, Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y) 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V); 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T,A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R,S,W,Y) 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W); 152(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W); 154(K,A,E,F,H,N,R,S,T) 156(Q , D , F, G , H , I, K, L , M , S , T, V, Y); 158(F, A, C , D , E , G , H , I, L , N , P, R , S , T, V, W, Y); 163(T, C , D , F, L , M , N , Q , S , V) 166(D,A,C,G,K,M); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R, T, V,W) 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 170(S,C,G,H,N,R,T); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y) 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T); 175(F,A,D,H,L,M,S,V,W,Y); 191(E,A,C,I,L,M,N,T); 192(N,F,H,M,R,S,Y) 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I,A,C,F,H,L,M,N,Q,V,Y); 206(D,A,C,I,M,Q,Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y) 208(P,A,D,E,H,K,L,N,Q,R,S,T); 209(D,C,G,I,K); 211(V,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,S,T); 212(N,A,C,D,E,G,H,I,L,M,Q,R,ST,V,Y) 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y) 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 252(A,C,D,F,H,M,R); 253(A,C,D,E,L,M,N,Q,R,S,T,V) 257(E,A,C,F,G,H,K,L,Q,R,S,V,Y); 258(M,C,F,I,L,Y); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W) 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y); 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y) 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y); 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T) 301(G , A , F, H , K, M , Q , R , S , T, Y); 303(Y, A, F, I, R , T, V, W); 308(N ,A , C , D , E , F, G , H , L , M , Q , R , S , T, V, Y); 311(N , D , E , H , K, Q , S , V) 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y) 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y); 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 362(S,A,C,E,I,Q,T,V) 372(K,A,D,H,M,N,R); 374(T,A,K,N,P,Q,S); 376(T,A,G,H,K,N,Q,S,Y); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y) 384(S,D,E,G,H,N,P); 388(P,C,D,I,K,L,R,S); 391(K,E,F,L,T,V,Y); 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 396(Y,C,F,K) 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 402(R,F,K,L,Q,S,T,V,W,Y); 407(N,A,C,D,E,G,H,Q,S) 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y); 410(V,E,I,K,L,M,R,S,Y); 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V) 418(D , A , C , E , F, G , H , I, K, L, M , N , Q , R , S , T,W, Y); 419(S , A , E , G , K, P, Q , R , T, V, Y); 420(T, A , C , D , E , F, G , H , I, L , P, Q , R , S , V, W, Y) 421(K,A,C,F,G,H,I,L,N,R,S,W,Y); 422(A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y); 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y) 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y); 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 441(Y,C,K,L,N,Q,R,S,W) 444(T,A,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W); 447(A,G,K,Q,R,S,T,V) 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V); 452(Y,A,I,L,M,S,V,W) 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y); 455(T,A,C,I,L,M,S,V); 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y) 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W); 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y) 465(G , A , M , N , P, Q); 466(S , A, C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , R , T, V, W, Y); 469(Y, C , F, I, L , S , V); 471(T, A, D , E , F, G , H , I, K, N , P, Q ,W): 475(N , A , D , F, G , H , I, K, L , M , P, S , T, V); 476(G , A , C , D , E , H , K, N , P, Q , R , S , T, V, Y); 477(G , A , D , E , H , I, K, P, Q , R , S , T, V, Y); and 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 que se encuentran dentro de las puntuaciones de productividad descritas anteriormente de "4", y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables, se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA D:
1(A,E,G,I,K,N,Q,R,T,V,Y); 2(A,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Y); 3(T,A,D,F,G,M,P,Q,R,S) 5(G, A , C , D , E , F, H , I, K, L , M , N , P, Q , R , S , T, V, Y); 23(N , A , D , E , F, H , K, M , Q , S , T, V, W, Y); 27(T, D , E , F, G , H , I, K, L , M , N , Q , R , S ,W, Y) 30(P, A , C , D , E , F, G , H , K, L , N , R , S , T, W, Y); 49(T, A, C , D , E , F, G , H , I, K, L , M , N , S , V, Y); 52(A , F, G , H , I, K, N , Q , S , T, W) 54(V,A,C,D,E,G,I,L,N,Q,R,S,T); 68(N,A,C,E,F,M,S,Y); 81(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y) 85(S,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R); 89(T,C,D,E,H,M,N,Q,R,S,V); 111(Y,A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W) 112(T, A, C , D , E , F, G , I, L , M , P, Q , R , V,W, Y); 116(T, A , C , D , E , G , H , I, K, L , M , N , S , V, W); 118(V, A , C , F, I, K, L , M , N , Q , R , S) 123(S,A,C,E,G,H,K,N,Q,R,T,Y); 127(Q,A,C,E,H,I,K,M,R,T,V,Y); 128(E,G,I,K,S,V,Y); 129(T,A,F,G,H,I,K,L,Q,R,S,V,Y) 131(G , A , F, H , I, K, M , N , P, Q , T, W); 132(E , A, C , G , H , I, L , M , N , P, Q , R , S , T, V, Y); 133(Y, A, D , E , F, H , K, L , N , T, V) 134(N , C , D , F, G , H , M , P, Q , S , T, Y); 136(Q , A , F, G , H , I, K, N , T, W, Y); 138(W, A, D , F, G , H , K, L , M , P, Q , R , S , T, V, Y) 140(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,S,T,V,Y); 142(N,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y) 144(P,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,Y); 145(G,A,E,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y); 147(G,C,E,H,I,K,L,N,Q,R,V) 148(T,A,G,H,I,K,L,S,W,Y); 149(T, A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,R, S,W, Y); 150(Y,D,F,G,H,I,M,P,Q,W) 152(N , A , C , D , E , F, G , H , L , M , Q , R , S , T, V,W); 156(Q , D , F, G , H , I, K, L , M , S , T, V, Y); 158(F, A, C , D , E , G , H , I, L , N , P, R , S , T, V,W, Y) 163(T,C,D,F,L,M,N,Q,S,V); 167(Q,A,C,D,G,H,K,N,R,S,T,V,Y); 168(S,C,D,E,G,I,K,L,M,N,R, T, V,W) 169(R,A,C,D,E,H,K,L,M,Q,T,W,Y); 171(L,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 172(S,A,C,D,E,H,K,N,R,T) 193(G,A,C,F,H,I,K,R,S,T,V); 203(I, A, C, F, H, L, M, N, Q, V, Y); 207(H,A,D,E,F,K,M,N,R,S,Y) 208(P, A, D , E , H , K, L, N , Q , R , S , T); 211(V, C , D , E , F, I, L , M , N , Q , S , T); 212(N , A, C , D , E , G , H , I, L , M , Q , R , ST, V, Y) 215(K,E,F,L,M,N,Q,R,T,Y); 241(S,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W,Y); 244(K,A,C,H,M,N,Q,R,S,T,Y) 249(N,A,C,D,E,F,G,K,M,Q,R,S,T,W); 251(R,A,D,K,L,M,N,Q,S,T); 253(A, C,D,E,L,M,N, Q,R,S, T, V); 257(E,A, C,F G,H,K,L,Q,R, S, V, Y); 266(Q,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,W); 270(G,A,C,D,F,H,I,K,P,Q,R,S,V,W,Y) 273(N,D,E,H,I,K,L,M,Q,S); 277(A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,T,W,Y); 280(N,A,C,D,E,G,H,K,L,Q,T,Y) 284(S,E,F,H,K,M,R,W,Y); 296(A,D,E,F,H,I,K,M,Q,R,S,T); 301(G,A,F,H,K,M,Q,R,S,T,Y) 308(N,A,C,D,E,F,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,Y); 317(S,A,C,D,E,G,H,K,L,M,Q,T,W,Y) 318(N,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y); 320(T,A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y); 357(S,A,C,D,E,L,M,N,Q,V,Y) 360(Y,C,E,F,H,I,L,V); 377(R,A,C,D,G,H,I,K,L,M,S,T,V,Y); 384(S,D,E,G,H,N,P); 388(P,C,D,I,K,L,R,S) 395(D,C,E,F,I,K,M,Q,R,S,W,Y); 400(T,A,C,D,E,H,K,L,M,N,Q,R,S,V,W,Y); 408(P,E,H,K,M,Q,R,S,V,W,Y) 416(E,C,D,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V); 418(D,A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,W,Y); 419(S,A,E,G,K,P,Q,R,T,V,Y) 420(T,A, C , D , E , F, G , H , I, L , P, Q , R , S , V,W, Y); 421(K, A, C , F, G , H , I, L , N , R , S ,W, Y); 422(A, C , D , E , I, K, L , M , N , P, Q , R , S , T, V,W, Y) 423(K,A,C,D,E,F,G,M,N,P,Q,S,V,W,Y); 434(P,D,M,N,Q,R,S); 435(G,A,C,E,I,L,N,Q,R,S,T,V,Y) 437(S,A,D,E,F,H,K,L,Q,Y); 444(TAE,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,V,Y); 445(S,A,C,D,H,M,R,T,V,W) 448(G,A,D,E,F,H,K,L,N,Q,T,W,Y); 450(I,A,C,D,F,H,K,L,N,P,Q,R,T,V); 454(L,A,C,E,F,H,I,K,M,Q,S,T,V,Y) 456(G,A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,R,S,T,W,Y); 458(R,A,C,D,E,F,I,M,N,S,W,Y); 459(T,A,C,D,F,G,L,S,V,W) 461(K,A,D,G,I,L,M,N,P,S,Y); 463(T,C,E,F,I,K,L,M,N,V,Y); 466(S,A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,R,T,V,W,Y) 471(T,A,D,E,F,G,H,I,K,N,P,Q,W); 475(N,A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,S,T,V); 476(G,A,C,D,E,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,Y) 477(G,A,D,E,H,I,K,P,Q,R,S,T,V,Y); y 485(Q,A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,Y)
Las posiciones productivas en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1.
LISTA E:
1, 5, 15, 23, 30, 31,49, 68, 111, 112, 116, 123, 127, 128, 129, 131, 132, 134, 140, 142, 144, 147, 150, 152, 153, 168, 170, 171, 183, 187, 192, 203, 207, 209, 211, 212, 232, 241, 243, 244, 253, 266, 277, 280, 300, 301, 308, 320, 357, 362, 377, 388, 400, 402, 408, 416, 420, 423, 448, 450, 454, 455, 456, 458, 466, 475 y 485
Las posiciones productivas y las sustituciones dentro de esas posiciones en CspAmy2-v1 adecuadas para modificaciones de carga o hidrofobicidad se enumeran a continuación. La numeración de posiciones se basa en la proteína CspAmy2 madura expuesta en la SEQ ID NO: 1
LISTA F:
1(A,K,V,Y); 5(G,F,V); 15(V,S); 23(N,K); 30(P,E,K,L,W); 31(Y,F,K,W); 49(T,I); 68(N,Y); 111(Y,D,Q,S,T,W); 112(T,I,W); 116(T,L); 123(S,K); 127(Q,I); 128(E,I,V); 129(T,I); 131(G,H,K); 132(E,G,H,I,M,P,R,T,V,Y); 134(N,D,F,M,Y); 140(G,E,F,H,K); 142(N,D,I,R); 144(P,G,K,L); 147(G,C,E,H,L,R,V); 150(Y,W); 152(N,D,E,L,R); 153(F,H,Y); 168(S,L); 170(S,R); 171(L,H,N,Q,R); 183(A,K); 187(E,P); 192(N,F,Y); 203(I,C); 207(H,E,F); 209(D,G); 211(V,D,E,N,Q); 212(N,D,E); 232(L,R); 241(S,D,E,I,L,W,Y); 243(L,S); 244(K,C); 253(A,R); 266(Q,I,R,W); 277(A,F,L,Y); 280(N,L); 300(G,R); 301(G,H); 308(N,D,E,F,L,R,V,Y); 320(T,E,W); 357(S,E); 362(S,I,V); 377(R,G,H); 388(P,K); 400(T,E,K,L,W,Y); 402(R,F); 408(P,E,R,W); 416(E,C,F,G,H,K,L,N,R,S,V); 420(T,D,E,I,L,R,W); 423(K,E,F,G,M,N,Q,S,V,Y); 448(G,F,H,K,W); 450(I,K,R,T); 454(L,C); 455(T,L,M); 456(G,F,W); 458(R,A,C,D,E,F,I,S); 466(S,I,L); 475(N,D) y 485(Q,E,K,L,Y,Y)

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de a-amilasa variante derivado de un polipéptido de a-amilasa parental, que comprende una pluralidad de mutaciones combinables en posiciones de aminoácidos productivas; en el que:
(i) cada mutación combinable es una mutación que mejora al menos una propiedad enzimática y bioquímica deseable de la a-amilasa variante en comparación con la a-amilasa parental, sin disminuir significativamente la expresión, la actividad o la estabilidad de la a-amilasa variante, en comparación con la a-amilasa parental,
(ii) cada posición productiva es una posición de aminoácido que puede sustituirse por una pluralidad de residuos de aminoácidos diferentes, dando como resultado cada una de dichas sustituciones una a-amilasa variante que cumple los requisitos de (i), y
(iii) cada mutación combinable está enumerada en las listas A, B, C, D, E o F, o en la tabla D, que utiliza la SEQ ID NO: 1 para la numeración, y
en el que la a-amilasa variante tiene al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, en el que la pluralidad de mutaciones combinables incluye una mutación combinable en la posición productiva correspondiente a la posición 5 de la SEQ ID NO: 1, que es sustitución por Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Tyr.
2. La amilasa variante de la reivindicación 1, en la que la mutación combinable en la posición productiva correspondiente a la posición 5 de la SEQ ID NO: 1 es sustitución por Ala.
3. La amilasa variante de la reivindicación 1 o 2, en la que cada mutación combinable produce una amilasa variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a la amilasa parental para (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente son superiores o iguales a 0,9, y el IR para una cualquiera de (i), (ii) o (iii) es superior o igual a 1,0.
calculándose el IR de la variante comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa parental (valor teórico) a la misma concentración de proteína.
4. La amilasa variante de la reivindicación 1 o 2, en la que cada mutación combinable produce una amilasa variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a la amilasa parental para (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente son superiores o iguales a 0,8, y el IR para una cualquiera de (i), (ii) o (iii) es superior o igual a 1,2.
calculándose el IR de la variante comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa parental (valor teórico) a la misma concentración de proteína.
5. La amilasa variante de la reivindicación 1 o 2, en la que cada mutación combinable produce una amilasa variante en la que los índices de rendimiento (IR) mínimos con respecto a la amilasa parental para (i) la expresión de proteínas, (ii) la actividad y (iii) la estabilidad o termoestabilidad en detergente son superiores o iguales a 0,5, y el IR para una cualquiera de (i), (ii) o (iii) es superior o igual a 1,5.
calculándose el IR de la variante comparando el rendimiento o la estabilidad de la variante (valor medido) y la amilasa parental (valor teórico) a la misma concentración de proteína.
6. La amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++, +++ o ++++, con referencia a la tabla C.
7. La amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de +++ o ++++, con referencia a la tabla C.
8. La amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada mutación combinable tiene una puntuación de idoneidad de ++++, con referencia a la tabla C.
9. La amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada mutación combinable tiene una puntuación de productividad de 1 o 2, con referencia a la tabla B.
10. La amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una deleción correspondiente a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Arg-178, Gly-179, Thr-180 y Gly-181, usando la SEQ ID NO: 1 para la numeración.
11. La amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende deleciones correspondientes a los residuos Arg-178 y Gly-179, usando la SEQ ID NO: 1 para la numeración.
12. Una composición que comprende la amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un tensioactivo, en la que la composición es opcionalmente una composición detergente, por ejemplo un detergente para lavado de ropa o un aditivo para detergente para lavado de ropa.
13. Un procedimiento para sacarificar una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, comprendiendo el procedimiento:
(i) poner en contacto la composición que comprende almidón con una cantidad eficaz de la amilasa variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y
(ii) sacarificar la composición que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; en el que la amilasa variante cataliza la sacarificación de la solución de almidón para dar glucosa,
opcionalmente en el que la composición que comprende almidón comprende almidón licuado, almidón gelatinizado o almidón granular.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la sacarificación se realiza a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 75°C, opcionalmente en el que el intervalo de temperatura es de 47°C-74°C; y/o
en el que la sacarificación se realiza en un intervalo de pH de 2,0-7,5, opcionalmente en el que el intervalo de pH es de 3,5-5,5, opcionalmente además en el que el intervalo de pH es de 3,5-4,5.
15. El procedimiento de la reivindicación 13 o 14, que comprende además fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF).
ES21193640T 2012-06-08 2013-06-03 Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa-amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2) Active ES2978034T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261657501P 2012-06-08 2012-06-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2978034T3 true ES2978034T3 (es) 2024-09-04

Family

ID=48626134

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES21205366T Active ES3035568T3 (en) 2012-06-08 2013-05-24 Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
ES13728877T Active ES2909509T3 (es) 2012-06-08 2013-05-24 Variante de alfa-amilasas con mayor actividad en polímeros de almidón
ES13729864T Active ES2905323T5 (en) 2012-06-08 2013-06-03 Alpha-amylase variants derived from the alpha amylase of cytophaga sp. amylasei(cspamy2).
ES21193640T Active ES2978034T3 (es) 2012-06-08 2013-06-03 Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa-amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2)

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES21205366T Active ES3035568T3 (en) 2012-06-08 2013-05-24 Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
ES13728877T Active ES2909509T3 (es) 2012-06-08 2013-05-24 Variante de alfa-amilasas con mayor actividad en polímeros de almidón
ES13729864T Active ES2905323T5 (en) 2012-06-08 2013-06-03 Alpha-amylase variants derived from the alpha amylase of cytophaga sp. amylasei(cspamy2).

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20150141316A1 (es)
EP (5) EP2825643B2 (es)
CN (2) CN104379737B (es)
BR (1) BR112014030449A2 (es)
CA (2) CA2874061A1 (es)
DK (6) DK2825643T4 (es)
ES (4) ES3035568T3 (es)
HU (3) HUE057894T2 (es)
WO (2) WO2014007921A1 (es)

Families Citing this family (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE449840T1 (de) 2001-05-15 2009-12-15 Novozymes As Alpha-amylasevariante mit veränderten eigenschaften
MX351850B (es) 2011-06-30 2017-10-31 Novozymes As Metodo para el cribado de alfa-amilasas.
DK3336183T4 (da) * 2013-03-11 2025-06-10 Danisco Us Inc Kombinatoriske alfa-amylasevarianter
EP2997143A1 (en) 2013-05-17 2016-03-23 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
EP3786269A1 (en) 2013-06-06 2021-03-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN117165561A (zh) 2013-07-29 2023-12-05 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP3027747B1 (en) 2013-07-29 2018-02-07 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
EP3044301B1 (en) * 2013-09-09 2017-10-25 Ecolab USA Inc. Synergistic stain removal through novel chelator combination
WO2015121134A1 (en) * 2014-02-11 2015-08-20 Novozymes A/S Detergent composition, method and use of detergent composition
CN106103708A (zh) * 2014-04-01 2016-11-09 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
JP6656168B2 (ja) 2014-04-25 2020-03-04 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ アミラーゼ変異体
EP3155097A1 (en) 2014-06-12 2017-04-19 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2016001450A2 (en) 2014-07-04 2016-01-07 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
CN116240202A (zh) 2014-07-04 2023-06-09 诺维信公司 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸
WO2016079110A2 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Novozymes A/S Use of enzyme for cleaning
EP3690037A1 (en) 2014-12-04 2020-08-05 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2016096996A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Novozymes A/S Polypeptides having n-acetyl glucosamine oxidase activity
US10400230B2 (en) 2014-12-19 2019-09-03 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
US11518987B2 (en) 2014-12-19 2022-12-06 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
RU2733987C2 (ru) 2015-05-13 2020-10-09 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Варианты протеазы клады aprl и их применения
ES2670044T3 (es) 2015-06-04 2018-05-29 The Procter & Gamble Company Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano
ES2665989T3 (es) 2015-06-04 2018-04-30 The Procter & Gamble Company Composición detergente líquida para lavado de vajillas a mano
EP3101102B2 (en) 2015-06-05 2023-12-13 The Procter & Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
PL3101100T3 (pl) 2015-06-05 2018-07-31 The Procter And Gamble Company Zagęszczone płynne kompozycje detergentowe do prania
EP3101107B1 (en) 2015-06-05 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
ES2962329T3 (es) 2015-06-09 2024-03-18 Danisco Us Inc Encapsulados de estallido osmótico
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
EP3310688A1 (en) 2015-06-17 2018-04-25 Novozymes A/S Container
WO2016205755A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
EP3872175A1 (en) 2015-06-18 2021-09-01 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
WO2016135351A1 (en) 2015-06-30 2016-09-01 Novozymes A/S Laundry detergent composition, method for washing and use of composition
US20180171315A1 (en) 2015-09-17 2018-06-21 Novozymes A/S Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
CN108026487B (zh) 2015-09-17 2021-04-30 汉高股份有限及两合公司 包含具有黄原胶降解活性的多肽的洗涤剂组合物
CN108291178B (zh) 2015-10-28 2020-08-04 诺维信公司 包含淀粉酶变体和蛋白酶变体的洗涤剂组合物
US20180320158A1 (en) 2015-11-05 2018-11-08 Danisco Us Inc. Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
CN109072208A (zh) 2015-11-05 2018-12-21 丹尼斯科美国公司 类芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶
EP3901257A1 (en) * 2015-12-09 2021-10-27 Danisco US Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
CN105386324B (zh) * 2015-12-18 2017-12-12 江南大学 一种棉或涤棉混纺织物的前处理方法
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
MX2018008051A (es) 2016-01-29 2018-08-23 Novozymes As Variantes de beta-glucanasa y polinucleotidos que las codifican.
WO2017144008A1 (zh) * 2016-02-26 2017-08-31 南京百斯杰生物工程有限公司 α淀粉酶变体及其应用
WO2017174769A2 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Novozymes A/S Detergent compositions and uses of the same
BR112018072530A2 (pt) 2016-05-03 2019-03-26 Danisco Us Inc variantes de protease e usos das mesmas
US20190136218A1 (en) 2016-05-05 2019-05-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
CA3026064A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
EP3464582A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3257931A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-20 The Procter and Gamble Company Detergent composition
CN109563497A (zh) 2016-06-17 2019-04-02 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
US11001787B2 (en) 2016-06-23 2021-05-11 Novozymes A/S Use of enzymes, composition and method for removing soil
MX2018016037A (es) 2016-06-30 2019-05-30 Novozymes As Variantes de lipasa y composiciones que comprenden tensioactivo y variante de lipasa.
EP3284805B1 (en) 2016-08-17 2020-02-19 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising enzymes
US20200140786A1 (en) 2016-09-29 2020-05-07 Novozymes A/S Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition
CN110114450B (zh) * 2016-10-18 2020-07-03 斯特里莱克斯有限责任公司 环境湿气可活化的表面处理粉末
WO2018085524A2 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Danisco Us Inc Laundry detergent composition
EP3571279A1 (en) 2016-12-01 2019-11-27 Basf Se Stabilization of enzymes in compositions
WO2018108865A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Novozymes A/S Use of polypeptides
WO2018118950A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
EP4520820A3 (en) 2016-12-21 2025-04-16 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
ES2965826T3 (es) 2017-02-01 2024-04-17 Procter & Gamble Composiciones limpiadoras que comprenden variantes de amilasa
EP3583210B1 (en) 2017-03-15 2021-07-07 Danisco US Inc. Trypsin-like serine proteases and uses thereof
WO2018183662A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
EP3601549A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
JP7672197B2 (ja) * 2017-03-31 2025-05-07 ダニスコ・ユーエス・インク α－アミラーゼ組み合わせ変異体
US11149233B2 (en) 2017-03-31 2021-10-19 Novozymes A/S Polypeptides having RNase activity
WO2018185048A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novozymes A/S Recovery process
CN114480034A (zh) 2017-04-04 2022-05-13 诺维信公司 糖基水解酶
WO2018185152A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
EP3478811B1 (en) 2017-04-06 2019-10-16 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185280A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
US10968416B2 (en) 2017-04-06 2021-04-06 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
JP7267931B2 (ja) 2017-04-06 2023-05-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 洗剤組成物及びその使用
US20200032170A1 (en) 2017-04-06 2020-01-30 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3401385A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain
WO2018206535A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Novozymes A/S Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same
WO2018232165A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Basf Enzymes Llc Method for increasing oil yield during ethanol production
CN110809624A (zh) 2017-06-30 2020-02-18 丹尼斯科美国公司 低团聚的含酶颗粒
BR112020003097A2 (pt) 2017-08-18 2020-09-01 Danisco Us Inc. variantes de alfa-amilase
CN111247235A (zh) 2017-09-20 2020-06-05 诺维信公司 酶改善吸水性和/或白度的用途
US11505767B2 (en) 2017-11-01 2022-11-22 Novozymes A/S Methods for cleansing medical devices
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
BR112020008711A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-10 Novozymes A/S polipeptídeos e composições que compreendem tais polipeptídeos
EP4379029A1 (en) 2017-11-01 2024-06-05 Novozymes A/S Polypeptides and compositions comprising such polypeptides
CN111295099B (zh) * 2017-11-09 2023-05-02 味之素株式会社 食用肉改良用组合物
WO2019108599A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
EP3717611A1 (en) 2017-11-29 2020-10-07 Basf Se Compositions, their manufacture and use
CN111742041B (zh) 2017-12-21 2023-06-06 丹尼斯科美国公司 包含耐热干燥剂的含酶的热熔细粒
HUE065859T2 (hu) * 2018-01-25 2024-06-28 Procter & Gamble Polimer összetétel
BR112020016068A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-08 Danisco Us Inc. Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima
WO2019175807A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Yeast expressing thermostable alpha-amylases for hydrolysis of starch
CN108841809A (zh) * 2018-03-21 2018-11-20 中国农业科学院饲料研究所 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用
US12188064B2 (en) 2018-03-23 2025-01-07 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
CN112262207B (zh) 2018-04-17 2024-01-23 诺维信公司 洗涤剂组合物中包含碳水化合物结合活性的多肽及其在减少纺织品或织物中的褶皱的用途
EP3784779A1 (en) 2018-04-26 2021-03-03 Basf Se Lipase enzymes
US20210115422A1 (en) 2018-05-03 2021-04-22 Basf Se Amylase enzymes
CN112368394A (zh) * 2018-05-04 2021-02-12 丹尼斯科美国公司 用于生产麦芽糖糊精和特制糖浆的简化方法
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
US12415996B2 (en) 2018-06-19 2025-09-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants
US20210363470A1 (en) 2018-06-19 2021-11-25 Danisco Us Inc Subtilisin variants
WO2020002604A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
US20210189297A1 (en) 2018-06-29 2021-06-24 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
WO2020002608A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
US12012573B2 (en) 2018-07-02 2024-06-18 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020007875A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008024A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3830231A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Danisco US Inc. Variant alpha-amylases having amino acid substitutions that lower the pka of the general acid
WO2020047215A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
WO2020068486A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Danisco Us Inc Compositions for medical instrument cleaning
WO2020070063A2 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
CN112969775A (zh) 2018-10-02 2021-06-15 诺维信公司 清洁组合物
US12146123B2 (en) 2018-10-02 2024-11-19 Novozymes A/S Endonuclease 1 ribonucleases for cleaning
WO2020070209A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition
WO2020070014A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity
WO2020070249A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning compositions
CN113056476A (zh) 2018-10-03 2021-06-29 诺维信公司 具有α-甘露聚糖降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
US20210395651A1 (en) 2018-10-05 2021-12-23 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
US20220112479A1 (en) 2018-10-05 2022-04-14 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
WO2020069915A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
US20220033739A1 (en) 2018-10-11 2022-02-03 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020077331A2 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Danisco Us Inc Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants
EP3647397A1 (en) 2018-10-31 2020-05-06 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins iv
EP3647398B1 (en) 2018-10-31 2024-05-15 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins v
EP3887515A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants having improved stability
EP3891277A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Novozymes A/S Powder detergent compositions
WO2020114965A1 (en) 2018-12-03 2020-06-11 Novozymes A/S LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION
CN113366103A (zh) 2018-12-21 2021-09-07 诺维信公司 具有肽聚糖降解活性的多肽以及编码其的多核苷酸
WO2020127775A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Detergent pouch comprising metalloproteases
WO2020169563A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
MX2021010109A (es) 2019-02-20 2021-09-21 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de un medio definido y una alimentacion de oligoelementos.
EP3702452A1 (en) 2019-03-01 2020-09-02 Novozymes A/S Detergent compositions comprising two proteases
MX2021011287A (es) 2019-03-21 2021-10-13 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
WO2020193534A2 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Amylase enzymes
WO2020193532A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Cleaning composition having amylase enzymes
US20220162576A1 (en) 2019-03-25 2022-05-26 Basf Se Amylase enzymes
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
CN114174504A (zh) 2019-05-24 2022-03-11 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
US20220306968A1 (en) 2019-06-06 2022-09-29 Danisco Us Inc Methods and compositions for cleaning
MX2021015364A (es) 2019-06-13 2022-01-24 Basf Se Metodo de recuperacion de una proteina de un caldo de fermentacion mediante el uso de un cation divalente.
EP3959326B1 (en) 2019-07-05 2023-06-07 Basf Se Industrial fermentation process for microbial cells using a fed-batch pre-culture
EP3997202A1 (en) 2019-07-12 2022-05-18 Novozymes A/S Enzymatic emulsions for detergents
JP7736672B2 (ja) 2019-08-22 2025-09-09 ベーアーエスエフ・エスエー アミラーゼバリアント
US20220315866A1 (en) 2019-09-19 2022-10-06 Novozymes A/S Detergent Composition
AU2020354499A1 (en) * 2019-09-27 2022-02-10 Société des Produits Nestlé S.A. Cocoa and/or malt beverage products
EP4038170A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
US20240132808A1 (en) 2019-10-18 2024-04-25 Basf Se Storage-Stable Hydrolase Containing Liquids
EP4048683A2 (en) 2019-10-24 2022-08-31 Danisco US Inc Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2021105336A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions comprising polymer and enzyme
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
US20230040230A1 (en) 2019-12-20 2023-02-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning composition comprising a dispersin and a carbohydrase
WO2021123307A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
WO2021121394A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novozymes A/S Stabilized liquid boron-free enzyme compositions
AU2020404593A1 (en) 2019-12-20 2022-08-18 Henkel Ag & Co. Kgaa Cleaning compositions comprising dispersins VI
EP4077621A2 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersins viii
US20230167384A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
US20230212548A1 (en) 2020-05-26 2023-07-06 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
CN115836125A (zh) 2020-06-24 2023-03-21 诺维信公司 纤维素酶用于从纺织品去除尘螨的用途
EP3936593A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions and uses thereof
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
WO2022047149A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
EP4204548A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Novozymes A/S Polyester degrading protease variants
JP7510309B2 (ja) * 2020-08-31 2024-07-03 花王株式会社 α－アミラーゼ変異体
WO2022063698A1 (en) 2020-09-22 2022-03-31 Basf Se Liquid composition comprising peptide aldehyde
JP2023544111A (ja) 2020-09-22 2023-10-20 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 第二の酵素を含む、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害薬との改善された組合せ
CN116507725A (zh) 2020-10-07 2023-07-28 诺维信公司 α-淀粉酶变体
WO2022084303A2 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
CN112391369A (zh) * 2020-11-24 2021-02-23 吉林中粮生化有限公司 一种显著提升糖化效果的复配糖化酶及制备方法和用途
EP4015629A1 (en) 2020-12-18 2022-06-22 Basf Se Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents
EP4032966A1 (en) 2021-01-22 2022-07-27 Novozymes A/S Liquid enzyme composition with sulfite scavenger
US20240117275A1 (en) 2021-01-29 2024-04-11 Danisco Us Inc. Compositions for cleaning and methods related thereto
US20250263682A1 (en) 2021-02-12 2025-08-21 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
WO2022171872A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Novozymes A/S Stabilized biological detergents
EP4047088A1 (en) 2021-02-22 2022-08-24 Basf Se Amylase variants
MX2023009756A (es) 2021-02-22 2023-09-04 Basf Se Variantes de amilasa.
US20240301328A1 (en) 2021-03-12 2024-09-12 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP4359518A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
CN117616120A (zh) 2021-06-30 2024-02-27 丹尼斯科美国公司 变体脂肪酶及其用途
CN117916354A (zh) 2021-09-03 2024-04-19 丹尼斯科美国公司 用于清洁的衣物洗涤组合物
CN117957318A (zh) 2021-09-13 2024-04-30 丹尼斯科美国公司 含有生物活性物质的颗粒
EP4448750A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Danisco US Inc. Subtilisin variants and uses thereof
US20250051745A1 (en) 2021-12-16 2025-02-13 Danisco Us Inc. Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
CN118679252A (zh) 2021-12-16 2024-09-20 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
CN118679251A (zh) 2021-12-16 2024-09-20 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
WO2023117926A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Basf Se Environmental attributes for nitrogen containing chemicals
EP4206309A1 (en) 2021-12-30 2023-07-05 Novozymes A/S Protein particles with improved whiteness
US20250163396A1 (en) 2022-03-01 2025-05-22 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
CN118660951A (zh) 2022-03-02 2024-09-17 诺维信公司 木葡聚糖酶用于改善洗涤剂的可持续性的用途
AU2023272468A1 (en) 2022-05-14 2024-11-14 Novonesis Plant Biosolutions A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
EP4555061A1 (en) 2022-07-15 2025-05-21 Basf Se Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations
WO2024033136A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033135A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto
EP4612287A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
CN120693402A (zh) 2022-11-04 2025-09-23 巴斯夫欧洲公司 用于在洗涤剂组合物中使用的具有蛋白酶活性的多肽
EP4612285A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
CN120303400A (zh) 2022-11-09 2025-07-11 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
KR20250121342A (ko) 2022-12-05 2025-08-12 노보자임스 에이/에스 프로테아제 변이체 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드
WO2024137248A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Novozymes A/S Compositions comprising arabinofuranosidases and a xylanase, and use thereof for increasing hemicellulosic fiber solubilization
WO2024137246A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Novozymes A/S Carbohydrate esterase family 1 (ce1) polypeptides having ferulic acid esterase and/or acetyl xylan esterase activity and polynucleotides encoding same
CN120380158A (zh) 2022-12-19 2025-07-25 诺维信公司 用于降低发酵产物生产方法后端的浆体粘度的方法
EP4638725A1 (en) 2022-12-19 2025-10-29 Novozymes A/S Carbohydrate esterase family 3 (ce3) polypeptides having acetyl xylan esterase activity and polynucleotides encoding same
EP4389864A1 (en) 2022-12-20 2024-06-26 Basf Se Cutinases
CN120344647A (zh) 2022-12-23 2025-07-18 诺维信公司 包含过氧化氢酶和淀粉酶的洗涤剂组合物
CN120548189A (zh) * 2023-01-11 2025-08-26 华盛顿大学 淀粉样蛋白生成肽陷阱的设计
CN120435539A (zh) 2023-01-23 2025-08-05 诺维信公司 清洁组合物及其用途
CN120677237A (zh) 2023-02-01 2025-09-19 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
EP4410938A1 (en) 2023-02-02 2024-08-07 AMSilk GmbH Automatic dishwashing composition comprising a structural polypeptide
CN120712348A (zh) 2023-03-06 2025-09-26 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
CN120813242A (zh) 2023-03-16 2025-10-17 营养与生物科学美国第四公司 用于清洁和臭味控制的短芽孢杆菌发酵物提取物及其用途
CN120936668A (zh) 2023-04-14 2025-11-11 巴斯夫欧洲公司 多孔淀粉
AU2024263329A1 (en) 2023-04-26 2025-09-25 Novozymes A/S Cleaning composition and cleaning method
EP4461796A1 (en) 2023-05-10 2024-11-13 Novozymes A/S Detergent composition comprising laccase
EP4461795A1 (en) 2023-05-10 2024-11-13 Novozymes A/S Detergent composition comprising laccase
WO2024256175A1 (en) 2023-06-13 2024-12-19 Basf Se Stabilized cleaning compositions comprising edds and enzymes and their use
WO2025071996A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Danisco Us Inc. Variant cutinase enzymes with improved solubility and uses thereof
WO2025085351A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2025088003A1 (en) 2023-10-24 2025-05-01 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for replacement of optical brightener
WO2025093368A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Basf Se Enzyme stabilization in compositions containing a protease inhibitor
WO2025128568A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 Novozymes A/S Composition and use thereof for increasing hemicellulosic fiber solubilization
WO2025132258A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Basf Se Stabilized enzyme composition comprising a protease
WO2025153046A1 (en) 2024-01-19 2025-07-24 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2025202370A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202372A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202374A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
EP4624572A1 (en) 2024-03-27 2025-10-01 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202379A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2025202369A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
JPS5534046A (en) 1978-09-01 1980-03-10 Cpc International Inc Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
NO840200L (no) 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
US4536477A (en) 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
US5422267A (en) 1984-05-22 1995-06-06 Robert R. Yocum Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US4587215A (en) 1984-06-25 1986-05-06 Uop Inc. Highly thermostable amyloglucosidase
US4628031A (en) 1984-09-18 1986-12-09 Michigan Biotechnology Institute Thermostable starch converting enzymes
ES8706823A1 (es) 1985-03-28 1987-06-16 Cetus Corp Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3684398D1 (de) 1985-08-09 1992-04-23 Gist Brocades Nv Lipolytische enzyme und deren anwendung in reinigungsmitteln.
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
EP0258068B1 (en) 1986-08-29 1994-08-31 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent additive
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
EP0305216B1 (en) 1987-08-28 1995-08-02 Novo Nordisk A/S Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
EP0394352B1 (en) 1988-01-07 1992-03-11 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
WO1989009259A1 (en) 1988-03-24 1989-10-05 Novo-Nordisk A/S A cellulase preparation
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
KR100236540B1 (ko) 1990-04-14 2000-01-15 레클로우크스 라우에르 알카리성 바실러스-리파제, 이를 코-딩하는 dna 서열 및 리파제를 생산하는 바실러스 균주
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
ES2068586T5 (es) 1990-05-09 2004-12-01 Novozymes A/S Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.
US5162210A (en) 1990-06-29 1992-11-10 Iowa State University Research Foundation Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose
AU657278B2 (en) 1990-09-13 1995-03-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CZ57693A3 (en) 1990-09-28 1994-04-13 Procter & Gamble Granulated cleansing preparation with enhanced stability and purifying efficiency of enzyme
ATE423207T1 (de) 1990-12-10 2009-03-15 Genencor Int Verbesserte saccharifizierung von zellulose durch klonierung und vervielfältigung des beta- glukosidase genes aus trichoderma
EP0495258A1 (en) 1991-01-16 1992-07-22 The Procter & Gamble Company Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
DK0583420T3 (da) 1991-04-30 1996-07-29 Procter & Gamble Builderholdige flydende detergenter med borsyre-polyol-kompleks til inhibering af proteolytisk enzym
WO1992019729A1 (en) 1991-05-01 1992-11-12 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
DE69334295D1 (de) 1992-07-23 2009-11-12 Novo Nordisk As MUTIERTE -g(a)-AMYLASE, WASCHMITTEL UND GESCHIRRSPÜLMITTEL
US5792641A (en) 1992-10-06 1998-08-11 Novo Nordisk A/S Cellulase variants and detergent compositions containing cellulase variants
US5281526A (en) 1992-10-20 1994-01-25 Solvay Enzymes, Inc. Method of purification of amylase by precipitation with a metal halide and 4-hydroxybenzic acid or a derivative thereof
DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
KR950702240A (ko) 1993-04-27 1995-06-19 한스 발터 라벤 세제로의 이용을 위한 새로운 리파제 변형체
DK52393D0 (es) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
DK76893D0 (es) 1993-06-28 1993-06-28 Novo Nordisk As
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
WO1995010603A1 (en) 1993-10-08 1995-04-20 Novo Nordisk A/S Amylase variants
AU7853194A (en) 1993-10-13 1995-05-04 Novo Nordisk A/S H2o2-stable peroxidase variants
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
CA2183431A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Allan Svendsen A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
ES2251717T3 (es) 1994-03-08 2006-05-01 Novozymes A/S Nuevas celulasas alcalinas.
DK0755442T3 (da) 1994-05-04 2003-04-14 Genencor Int Lipaser med forbedret resistens over for overfladeaktive midler
AU2884595A (en) 1994-06-20 1996-01-15 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000292A1 (en) 1994-06-23 1996-01-04 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
US5919691A (en) 1994-10-06 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Enzyme and enzyme preparation with endoglucanase activity
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
BR9509525A (pt) 1994-10-26 1995-10-26 Novo Nordisk As Construção de dna vetor de expressão recombinante célula processo para produzir a enzima que exibe atividade lipolítica enzima que exibe atividade lipolítica preparação de enzima aditivo de detergente e composição de detergente
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
CN101173263A (zh) 1995-03-17 2008-05-07 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
DE69633825T2 (de) 1995-07-14 2005-11-10 Novozymes A/S Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität
WO1997004160A1 (en) 1995-07-19 1997-02-06 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
JP4068142B2 (ja) 1995-08-11 2008-03-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規の脂肪分解酵素
JP4290763B2 (ja) 1996-04-30 2009-07-08 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α―アミラーゼ変異体
WO1998008940A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
WO1998012307A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Novo Nordisk A/S Cellulase variants
AU730286B2 (en) 1996-10-08 2001-03-01 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
DE69739020D1 (de) 1996-11-04 2008-11-13 Novozymes As Subtilase varianten und verbindungen
JP4044143B2 (ja) 1996-11-04 2008-02-06 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ズブチラーゼ変異体及び組成物
WO1998034946A1 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis
DE19736591A1 (de) 1997-08-22 1999-02-25 Peter Prof Dr Hegemann Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäurepolymeren
DK2206768T3 (en) 1997-10-13 2015-06-29 Novozymes As Alfa-amylasemutanter
EP1032654B1 (en) 1997-11-26 2009-01-21 Novozymes A/S Thermostable glucoamylase
MXPA01000352A (es) 1998-07-15 2002-06-04 Novozymes As Varientes de glucoamilasa.
US6197565B1 (en) 1998-11-16 2001-03-06 Novo-Nordisk A/S α-Amylase variants
US6254645B1 (en) 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
US6933140B1 (en) 1999-11-05 2005-08-23 Genencor International, Inc. Enzymes useful for changing the properties of polyester
AU2001240473A1 (en) 2000-03-08 2001-09-17 Novozymes A/S Variants with altered properties
DK1309677T4 (da) 2000-08-11 2012-06-25 Genencor Int Bacillustransformation, transformanter og mutantbiblioteker
US20040091994A1 (en) 2000-10-13 2004-05-13 Carsten Andersen Alpha-amylase variant with altered properties
AU2002210380A1 (en) 2000-10-13 2002-04-22 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
CA2438205C (en) 2001-02-21 2015-11-03 Diversa Corporation Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
ATE449840T1 (de) * 2001-05-15 2009-12-15 Novozymes As Alpha-amylasevariante mit veränderten eigenschaften
WO2003001078A1 (fr) 2001-06-22 2003-01-03 Toyo Tire & Rubber Co., Ltd Dispositif anti-vibration
DE10138753B4 (de) * 2001-08-07 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit Hybrid-Alpha-Amylasen
DE10260805A1 (de) 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
PL1654355T3 (pl) * 2003-06-13 2010-09-30 Dupont Nutrition Biosci Aps Warianty polipeptydów Pseudomonas o aktywności niemaltogennej egzoamylazy i ich zastosowanie do wytwarzania produktów żywnościowych
US8703459B2 (en) 2003-12-05 2014-04-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase I having altered metal ion specificity
US7413887B2 (en) 2004-05-27 2008-08-19 Genecor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
EP4269684A3 (en) 2004-07-05 2024-02-21 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
BRPI0812786A2 (pt) * 2007-05-30 2014-10-14 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes melhorados da alfa-amilase de bacillus licheniformis
CA2705941C (en) 2007-11-20 2018-05-22 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
CN102057040A (zh) 2008-06-06 2011-05-11 丹尼斯科美国公司 具有改良特性的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AMYS)变体
WO2010115021A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties
CN102918149A (zh) * 2010-01-04 2013-02-06 诺维信公司 α-淀粉酶
EP2534236B1 (en) 2010-02-10 2018-05-30 Novozymes A/S Variants and compositions comprising variants with high stability in presence of a chelating agent
BR112012031362A2 (pt) 2010-06-03 2015-10-13 Mascoma Corp levedura expressando enzimas sacarolíticas para bioprocessamento consolidado usando amido e celulose
EP3798303A1 (en) 2011-06-30 2021-03-31 Novozymes A/S Alpha-amylase-variants
MX351850B (es) 2011-06-30 2017-10-31 Novozymes As Metodo para el cribado de alfa-amilasas.
WO2013057141A2 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP2748316B1 (en) 2011-10-17 2018-12-19 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
AU2012328562A1 (en) 2011-10-28 2014-03-13 Danisco Us Inc. Variant maltohexaose-forming alpha-amylase variants
US20140342431A1 (en) 2011-12-22 2014-11-20 Danisco Us Inc. Variant Alpha-Amylases and Methods of Use, Thereof
US20160053243A1 (en) * 2012-12-21 2016-02-25 Danisco Us Inc. Alpha-amylase variants

Also Published As

Publication number Publication date
EP2859097B2 (en) 2025-05-14
EP4026902B1 (en) 2025-04-16
EP4389885A2 (en) 2024-06-26
ES2905323T3 (es) 2022-04-07
EP2825643B2 (en) 2025-07-09
ES3035568T3 (en) 2025-09-04
US20150152401A1 (en) 2015-06-04
DK202000115Y3 (da) 2021-04-09
ES2909509T3 (es) 2022-05-06
US20170037387A1 (en) 2017-02-09
EP2859097A1 (en) 2015-04-15
HUE067114T2 (hu) 2024-09-28
DK4026902T3 (da) 2025-07-14
EP2859097B9 (en) 2023-03-08
EP2859097B1 (en) 2021-11-03
DK2825643T4 (da) 2025-10-06
HUE057894T2 (hu) 2022-06-28
CN104379737A (zh) 2015-02-25
ES2905323T5 (en) 2025-09-05
EP3967757A1 (en) 2022-03-16
CN104379737B (zh) 2018-10-23
EP4389885A3 (en) 2024-07-17
WO2014007921A1 (en) 2014-01-09
DK2859097T1 (da) 2021-10-04
EP4026902A1 (en) 2022-07-13
DK2859097T4 (da) 2025-08-18
HUE058058T2 (hu) 2022-07-28
CA2874198A1 (en) 2013-12-12
DK2859097T3 (da) 2021-11-08
EP4389885B1 (en) 2025-09-03
CN104379738A (zh) 2015-02-25
DK3967757T5 (da) 2024-08-05
EP3967757B1 (en) 2024-01-31
DK4389885T3 (da) 2025-11-17
DK3967757T3 (da) 2024-04-22
EP2825643B1 (en) 2021-11-03
EP2825643A1 (en) 2015-01-21
US20150141316A1 (en) 2015-05-21
WO2013184577A1 (en) 2013-12-12
DK2825643T3 (da) 2021-11-08
DK2825643T1 (da) 2021-10-04
BR112014030449A2 (pt) 2017-09-12
CA2874061A1 (en) 2014-01-09
DK202000115U1 (da) 2020-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2978034T3 (es) Variantes de alfa-amilasa derivadas de la alfa-amilasa de Cytophaga sp. amylasei (CspAmy2)
ES2676895T5 (es) Variantes combinatorias de alfa-amilasa
EP3071691B1 (en) Variant alpha-amylases having reduced susceptibility to protease cleavage, and methods of use, thereof
EP3354728A1 (en) Alpha-amylase variants
BR112014010045B1 (pt) Polipeptídeo de alfa-amilase variante formadoras de malto-hexaose, composição compreendendo o mesmo, célula hospedeira, e métodos para remover uma mancha ou sujeira amilácea, para sacarificar uma composição que compreende amido, produção de uma composição alimentícia de desengomagem de um têxtil
JP2015518707A (ja) 糖化のための、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓ由来アルファアミラーゼの使用
US20150240223A1 (en) Method of using alpha-amylase from talaromyces emersonii for saccharification
EP3060659B1 (en) Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
MX2015001823A (es) Metodo para usar alfa-amilasa a partir de aspergillus clavatus e isoamilasa para sacarificacion.
WO2014099525A1 (en) Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof
WO2015050724A1 (en) Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
WO2015021600A1 (en) Beta-amylase and methods of use
WO2017173190A2 (en) Alpha-amylases, compositions &amp; methods
EP2922951B1 (en) Amylase with maltogenic properties
WO2014200656A1 (en) Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
US20160130571A1 (en) Alpha-Amylase from Bacillaceae Family Member
WO2014200658A1 (en) Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200657A1 (en) Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis