MXPA01000352A

MXPA01000352A - Varientes de glucoamilasa.

Info

Publication number: MXPA01000352A
Application number: MXPA01000352A
Authority: MX
Inventors: Allan Svendsen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2002-06-04
Also published as: AU4769999A; JP2010154865A; KR20010071910A; JP2002520047A; EP1097196A1; CN1309700A; CA2331340A1; EP1097196B2; CN100402645C; KR100764528B1; WO2000004136A1; EP1097196B1

Abstract

La invencion se refiere a una variante de una glucoamilasa fungica progenitora, que muestra estabilidad termica mejorada y/o actividad especifica incrementada utilizando sustratos sacaridos.

Description

VARIANTES DE GLUCOAMI ASA CAMPO DE LA INVENCIÓN 5 La invención se refiere a las novedosas variantes de glucoamilasa (mutantes) de la .AMG progenitora, en particular con estabilidad térmica mejorada y/o actividad especifica incrementada adecuada para, por ejemplo, la conversión de 10 almidón, por ejemplo, para la producción de glucosa a partir del almidón. Más específicamente, la presente invención se refiere a las variantes de la enzima glucoamilasa y al uso de tales enzimas variantes . 15 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La glucoamilasa ( 1 , -a-D-glucan- glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que 20 cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores del almidón o de las moléculas relacionadas de sligo- y polisacárids . Las glucoamilasas son producidas por varios hongos filamentosos y levaduras, con aquellos de 25 Aspergi l l us que son comercialmente más importantes.

Ref: 126045 -ti.

Comercialmente, la enzima glucoamilasa se utiliza para convertir el almidón de maiz que está ya parcialmente hidrolizado por una a-amilasa, a glucosa. La glucosa es posteriormente convertida por la glucosa-isomerasa a una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o la mezcla adicionalmente enriquecida con fructosa, es el jarabe de maiz con alto contenido de fructosa, comúnmente utilizado, comercializado en todo el mundo. Este jarabe es el producto de más alto tonelaje en el mundo producido por un proceso enzimático. Las tres enzimas involucradas en la conversión de almidón a fructosa están entre las enzimas industriales producidas más importantes. Uno de los principales problemas que existen con respecto al uso comercial de la glucoamilasa en la producción de jarabe de maiz con alto contenido de fructosa, es la estabilidad térmica relativamente baja de la glucoamilasa. La glucoamilasa no es tan térmicamente estable como la a-amilasa o la glucosa-isomerasa, y ésta es más activa y estable a pH menores que cualquier a- amilasa o glucosa-isomerasa. En consecuencia, ésta debe ser utilizada en un recipiente separado a una temperatura y pH menores.

La glucoamilasa proveniente de Aspergillus niger tiene un dominio catalítico (aa 1-440) y un dominio de enlace al almidón (aa 509-616) separados por un enlazador largo y altamente O-glucosilado (Svensson et al. (1983), Carisberg Res. Commun. 48, 529-544, 1983 y (1986), Eur. J. Biochem. 154, 497-502). El dominio catalítico (aa 1-471) de la glucoamilasa proveniente de A. awamori variante XlOO adopta un plegamiento (a/a) 6 en el cual seis segmentos de rizo a->a conservados conectan los barriles exterior e interior (Aleshin et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 19291-19298). Las escrituras cristalinas de la glucoamilasa en complejo con la 1-desoxinoj irimicina (Harris et al. (1983), Biochemistry, • 32, 1618-1626) y los inhibidores de pseudotetrasacárido, acarbosa y D-gluco-dihidroacarbosa (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328) son además compatibles con los ácidos glutámicos 179 y 400 actuando como ácido y base general, respectivamente. El papel crucial de estos residuos durante la catálisis ha sido también estudiado utilizando la ingeniería de proteinas (Sierks et al. (1990), Protein Engng. 3, 193-198; Frandsen et al. (1994), Biochemistry, 33, 13808-13816) . Las interacciones glucoamilasa-carbohidrato en los subsitios de enlace de cuatro residuos de glucosilo, -1, +1, +2 y +3 son puestos de manifiesto en las estructuras con el complejo de glucoamilasa (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328) y los residuos importantes para el enlace y la catálisis han sido extensamente investigados utilizando mutantes dirigidos al sitio aunados con análisis cinético (Sierks et al. (1989), Protein Engng. 2, 621-625; Sierks et al. (1990), Protein Engng. 3, 193-198; Berland et al. (1995), Biochemistry, 34, 10153-10161; Frandsen et al. (1995), Biochemistry, 34, 10162-10169. Han sido descritas diferentes sustituciones en la glucoamilasa de A. niger para mejorar la estabilidad térmica: i) la sustitución de las glicinas a-helicoidales : G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); ii) eliminación de los enlaces peptidicos frágiles Asp-X, D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); iii) prevención de la desamidación en N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); iv) manipulación mediante ingeniería del enlace disulfuro adicional, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; y v) introducción de residuos Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Pro t ein Engng . 10, 1199-1204. Además, Clark Ford presentó un documento el 17 de octubre de 1997, ENZYME ENGINEERING 14, Beij ing/China Oct. 12-17, 97, número de Extracto: libro de Extracto páginas 0-61. El extracto sugiere mutaciones en las posiciones G137A, N20C/A27C, y S30P en una glucoamilasa de Aspergi l l us a wamori (no descrita) para mejorar la estabilidad térmica. La información adicional concerniente a la glucoamilasa puede ser encontrada en una página de Internet (http: //www.public. iastate.edu/~pedro/glase/glase.html) "Glucoamylase WWW page" (último cambio 97/10/08) por Pedro M. Coutinho que describe informaciones concernientes a las glucoamilasas , incluyendo glucoamilasas derivables de las cepas de Aspergi l l us . Se listan las modificaciones químicas y dirigidas al sitio en la glucoamilasa de Aspergill us niger .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objetivo de la presente invención es proporcionar variantes mejoradas de glucoamilasa con termoestabilidad mejorada y/o actividad especifica incrementada adecuadas para el uso por ejemplo en el paso de sacarificación en los procesos de conversión de almidón. El término "una variante de glucoamilasa con termoestabilidad mejorada" significa en el contexto de la presente invención una variante de glucoamilasa que tiene un más alto Ti 2 (tiempo medio) que la glucoamilasa progenitora correspondiente. La determinación de Ti 2 (Método I y Método II) se describe más adelante en la sección "Materiales y Métodos". El término "una variante de glucoamilasa con actividad especifica incrementada" significa, en el contexto de la presente invención, una variante de glucoamilasa con actividad especifica incrementada hacia los enlaces a-1,4 en el sacárido en cuestión. La actividad especifica es determinada como kcat o AGU/mg (medida como se describe más adelante en la sección "Materiales y Métodos") . Una actividad especifica incrementada significa que los valores de kcat o AGU/mg son más altos cuando se comparan con los valores de kcat o AGU/mg, respectivamente, de la glucoamilasa progenitora correspondiente . Los inventores de la presente invención han proporcionado un número de variantes mejoradas de una glucoamilasa progenitora con termoestabilidad mejorada y/o actividad especifica incrementada en comparación a la enzima progenitora correspondiente. La estabilidad térmica mejorada es obtenida mediante la sustitución de las posiciones seleccionadas en una glucoamilasa progenitora. Ésta será descrita con detalle más adelante.

Nomenclatura En la presente descripción y reivindicaciones, se utilizan los códigos convencionales de una sola letra y de tres letras para los residuos de aminoácidos. Para facilidad de referencia, las variantes de glucoamilasa de la invención se describen por el uso de la siguiente nomenclatura : Aminoácido ( s ) original (es) : posición ( es) : aminoácido ( s ) sustituido ( s ) De acuerdo a esta nomenclatura, por ejemplo la sustitución de la alanina por asparagina en la posición 30 es mostrada como: Ala30Asn o A30N una supresión de la alanina en la misma posición es mostrada como: Ala30* o A30* y la inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como lisina, es mostrada como: ala30AlaLys o A30AK Una supresión de un tramo consecutivo de residuos de aminoácidos, tales como los residuos de aminoácidos 30-33, es indicado como (30-33)* o ? (A30-N33) . Donde una glucoamilasa especifica contiene una "supresión" en comparación con otras glucoamilasas y se realiza una inserción en tal posición y ésta es indicada como: *36Asp o *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Las mutaciones múltiples están separadas por signos de más, por ejemplo: Ala30Asp + Glu34Ser o A30N+E34S que representan mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo la alanina y ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente. La mutación múltiple puede también ser separada como sigue, por ejemplo, significando lo mismo que el signo de más: Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos pueden ser insertados en una posición dada, ésta es indicada como A30N,E o A30N/E o A30N o A30E Además, cuando una posición adecuada para la modificación es identificada en la presente sin ninguna modificación especifica que sea sugerida, se debe entender que cualquier residuo de aminoácidos puede ser sustituido por el residuo de aminoácido presente en la posición. De este modo, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una alanina en la posición 30, pero no se especifica, se debe entender que la alanina puede ser suprimida o sustituida por cualquier otro aminoácido, por ejemplo, cualquiera de: R,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO La Figura 1 muestra el plásmido pCAMG91 que contiene el gen de la glucoamilasa Gl de Aspergi l l us ni ger .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una meta del trabajo subyacente a la presente invención fue mejorar la estabilidad térmica y/o incrementar la actividad especifica de glucoamilasas particulares, las cuales son obtenibles a partir de organismos fúngicos, en particular cepas del género Aspergi l l us y las cuales por si mismas hablan sido seleccionadas con base en sus propiedades adecuadas en la conversión del almidón o fermentación alcohólica.

Posiciones de identificación y/o regiones a ser mutadas para obtener Termoestabilidad Mejorada y/o Actividad Especifica Incrementada Las simulaciones de la dinámica molecular (MD) indican la movilidad de los aminoácidos en la estructura de la proteina (ver McCammon, JA y Harvey, SC, (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids". Cambridge University Press.) . Tales dinámicas proteicas son frecuentemente comparadas a los factores B cristalográficos (ver Stout, GH y Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley) . Al correr la simulación MD a diferentes estados de protonación de los residuos titulables, se simula la movilidad de los residuos relacionada al pH . Las regiones que tienen la más alta movilidad o flexibilidad (aqui las fluctuaciones isotrópicas) se seleccionan para la mutagénesis aleatoria. Se entiende aquí que la alta movilidad encontrada en ciertas áreas de la proteina, puede ser térmicamente mejorada al sustituir los residuos en estos residuos. Las sustituciones son dirigidas contra los residuos que cambiarán el comportamiento dinámico de los residuos por ejemplo a cadenas laterales más grandes y/o residuos que tienen capacidad de formar contactos mejorados a los residuos en el ambiente cercano. Se utilizó el AMG proveniente de Aspergi l l u s ni ger para la simulación de MD . En la sección de "Materiales y Métodos" se describe cómo llevar a cabo la simulación MD . Las regiones encontradas por las simulaciones de dinámica molecular (MD) para ser adecuadas para la mutación cuando se desea obtener estabilidad térmica mejorada y/o actividad específica incrementada, son las siguientes: Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 73-80, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 407-411, Región: 445-470, Las regiones encontradas como de interés para incrementar la actividad específica y/o la termoestabilidad mejorada, son las regiones en proximidad al sitio activo. Las regiones colocadas entre las hélices a, y las cuales pueden incluir posiciones sobre cada lado del extremo N y C de las hélices a, en el sitio de enlace al sustrato, son de importancia para la actividad de la enzima. Estas regiones constituyen las siguientes regiones: Región: 40-62, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 388-414, Rhi zopus , Tal aromyces , tales como Tal aromyces emers oni i (descrito en WO 99/28448), y Thi el a vi a tienen alta actividad específica hacia las maltodextrinas, incluyendo la maltosa y la altohepatosa . Por lo tanto, las regiones que son de interés especial respecto a la actividad específica incrementada (transferencia) son: Región: 200-212, Región: 287-300, Región: 305-319. Los presentes inventores han encontrado que es de hecho posible mejorar la estabilidad térmica y/o incrementar la actividad específica de una glucoamilasa progenitora mediante modificación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa progenitora. La presente invención está basada en este hallazgo. En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una variante mejorada de una glucoamilasa progenitora que comprende una o más mutaciones en las regiones y posiciones descritas más adelante en la presente.

Glucoamilasas Progenitoras Las glucoamilasas progenitoras contempladas de acuerdo a la presente invención incluyen glucoamilasas fúngicas, en particular glucoamilasas fúngicas obtenibles a partir de una cepa de Aspergillus , tales como glucoamilasas y variantes o mutantes de las mismas de Aspergillus niger o Aspergillus awamori , glucoamilasas homologas, y glucoamilasas adicionales que son estructural y/o funcionalmente similares a la SEQ. ID. NO: 2. Específicamente contempladas están las glucoamilasas Gl y G2 de Aspergillus niger, descritas en Boel et al. (1984), "Glucoamylases Gl and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs", EMBO J. 3(5), p. 1097-1102. La glucoamilasa G2 se describe en la SEQ. ID. NO: 2. La glucoamilasa Gl se describe en la SEQ. ID. NO: 13. Otra columna vertebral de AMG contemplada es Talaromyces emersonii , especialmente DSM de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448 (Novo Nordisk) .

Glucoamilasas Progenitoras Comercialmente Disponibles Las glucoamilasas progenitoras comercialmente disponibles incluyen .AMG de Novo Nordisk, y también glucoamilasa de las compañías Genencor, Inc. USA, y Gist-Brocades, Delft, Holanda.

Variantes de glucoamilasa En el primer aspecto, la invención se refiere a una variante de una glucoamilasa progenitora que comprende una o más mutaciones en la o las siguientes posiciones o región(es) en la secuencia de aminoácidos mostrada en NO: 2: Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 40-62, Región: 73-80, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 388-414, Región: 445-470, y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa que muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2, con la excepción de las siguientes sustituciones: N20C, A27C, S30P, Y48W, Y50F, W52F, R54K/L, D55G/V, G57A, K108R, D112Y, Y116A/W, SI 19C/W/E/G/Y/P, W120H/L/F/Y, G121T/A, R122Y, P123G, Q124H, R125K, W170F, N171S, Q172N, T173G, G174C, Y175F, D176N/E, L177H/D, W178R/D, E179Q/D, E180D/Q, V181D/A/T, NI 82A/D/Q/Y/S, G183K, S184H, W212F, R241K, A246C, D293E/Q, A302V, R305K, Y306F, D309N/E, Y312W, W317F, E389D/Q, H391W, A392D, A393P, N395Q, G396S, E400Q/C, Q401E, G407D, E408P, L410F, S411A/G/C/H/D, S460P. En una modalidad, la región mutada es la Región: 1-18. Las posiciones preferidas especificas, contempladas, incluyen una o más de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: AlV, T2P/Q/R/H/M/E/K, L3N, N9A, A11E/P, I18V. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen uno o más de: A1V+L66R+Y 02F+N427S+S486G, T2K+S30P+N427M+S44G+V470M, T2E+T379A+S386K+A393R, T2Q+A11P+S394R, T2R+L66V+S394P+Y402F T2M+N9A+T390R+D406N+L410R, T2R+S386R+A393R, A11P+T2Q+S394R, A11E+E408R, I18V+T51S+S56A+V59T+L60A. En una modalidad, la región mutada es la Región: 19-35. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 21-26, 31-35. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: L19N, N20T, G23A, A24S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N. En una modalidad, la región mutada es la Región: 40-62. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 40-47, 58-62. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 61, 62. Las mutaciones especificas incluyen una o más de: S40C/A/G, T43R, T51S/D, T53D, S56A/C, V59T/A, L60A. Las combinaciones preferidas de las mutaciones incluyen una o más de: T51S+S56A+V59T+L60A+I18V V59A+A393R+T490A+PLASD (extensión N-terminal) . En una modalidad, la región mutada es la Región: 73-80. Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: S73P/D/T/N/Q/E, L74I/D, L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V, se prefieren I /N/D, S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, preferida T/A) T77V/T, I78V, E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V, se prefieren Q/R/K) N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, se prefieren H/D/E/R/K/T/S/Y . En una modalidad, la región mutada es la Región: 93-127. En una modalidad adicional la subregión es: Región: 93-124. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 93-107, 109-111, 113-115. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: N93T, P94V, S95N, D97S, L98S/P, S100T/D, A102S/*, P107M/L/A/G/S/T/V/I, N110T, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/A, Y116F, S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V, se prefiere A, R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V, G127A. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S119P+G447S, S119P+Y402F, S119P+A393R, S119P+I189T+223F+F227Y+Y402F S119P+T416H+Y402F+Y312Q. En una modalidad, la región mutada es la Región: 170-184. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: N171R/K/Q/E/W/F/Y, Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T173K/R/S/N/Q, G174A, S, Y175N/Q/D/E, D176L L177I E180N/M V181I/T N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V. G183A S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K. En una modalidad, la región mutada es la Región: 200-212. Las sub-regiones preferidas incluyen: 200-211.

Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, W212N/A/T. En una modalidad, la región mutada es la Región: 234-246. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 234-240, 242-245. Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245. Las mutaciones especificas incluyen una o más de: L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V. A235S F237Y/H/N/D. D238T/S. S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V. S240G S242S/P/T/A/Y/H/N/D. G243S/P/T/A/Y/H/N/D. K244R, A246T.

Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: A246T+T72I. En una modalidad, la región mutada es la Región: 287-319. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 287-292, 294-301, 313-316. Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V, I288L/N/Q, Y289F, T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V, L291I/D/N, N292D, D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V, G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/.T/V, L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V, S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V, D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V, E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V, V301T/I, A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, se prefiere S, V303T/I, G304A, R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V, Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V. E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, preferida Q, D309L, T310V/S, Y311N, Y312Q/N, N313T/S/G N315Q/E/R, F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V, se prefiere Y. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: Y312Q+S119P+T416H+Y402F, Y312Q+S119P+Y402F+T416H+S411V, Y312Q+T416H N313G+F318Y. En una modalidad, la región mutada es la Región: 334-341.

Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V, K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V. Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V. G339S/P/T/A. S340I/T/N/V/A/D/G. L341F/L/I/V. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S340G+D357S+T360V+S386P. En una modalidad, la región mutada es la Región : 353-374. Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S356P+S366T, D357S+T360V+S371H. D357S+T360V+S386P+S340G. En una modalidad, la región mutada es la Región: 388-414. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 397-399, 402-406, 412-414. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414.

Las mutaciones específicas incluyen una o más de: T390R, A393R, S394P/R, M398L, S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, se prefieren T/Q/C, Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V, se prefiere F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, A409R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, se prefiere P, L410R/I, S411R/N/Q/E/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V/, se prefiere V, A 12C, R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V. D414A. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: A393R+T490A+V59A+PLASD (extensión N-terminal) S394R+T2Q+A11P, Y402F+S411V, Y402F+S411V+S119P Y402F+S411V+S119P+A393R, Y402F+Y312Q+S119P+T416H, E408R+S386N, E408R+A425T+S465P+T494A, L410R+A393R, Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R. En una modalidad, la región mutada es la Región: 445-470. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 445-459, 461-470. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: G447S, G456C/P, S465P . Las variantes específicas incluyen variantes que tienen una o más de las siguientes sustituciones: AlV, T2E/P/Q/R/H/M, L3P/N, N9A, A11P/E, I18V, L19N, N20T, G23A, A24S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N, S40C, T43R, T51D/S, T53D, S56A/C, V59T/A, L60A, N93T, P94V, S95N, D97S, L98P/S, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A, N182E, A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, W212N/A/T, A246T, Y312Q, N313T/S/G, A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/L/P/H/R/ I/T/N/S/V/A/D/G, T390R, A393R, S394R/P, M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, L410I/R, S411V, A412C, D414A, G447S, S465P.

Estabilidad térmica mejorada En un segundo aspecto, la invención se refiere a una variante de una glucoamilasa progenitora con estabilidad térmica mejorada, en particular en el intervalo de 40-80°C, preferentemente 60-80°C, y preferentemente a pH 4-5, la variante comprende una o más mutaciones en las siguientes posiciones o regiones en la secuencia de aminoácidos mostradas en NO: 2: Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 73-80, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 388-414, Región: 445-470, y/o en una posición correspondiente o en una región correspondiente en una glucoamilasa homologa que muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2, con la excepción de las siguientes sustituciones: N20C, A27C, S30P, A246C. Ya que el enlace al sustrato puede mejorar la región de estabilidad 93-127, Región: 170-184, Región: 305-319 son también contempladas para la termoestabilización de acuerdo a la presente invención . En una modalidad, la región mutada es la Región: 1-18.

Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: AlV, T2P/Q/R/H/M/E, N9A, A11E/P. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G, T2K+S30P+N427M+S44G+V470M, T2E+T379A+S386K+A393R, T2R+S386R+A393R, A11P+T2Q+S394R, T2Q+A11P+S394R, T2R+L66V+S394P+Y402F, T2M+N9A+T390R+D406N+L410R, T2R+S386R+A393R, A11E+E408R. En una modalidad, la región mutada es la Región: 19-35. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 21-26, 31-35. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: L19N, N20T, G23A, A24S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N. En una modalidad, la región mutada es la Región: 73-80. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: S73P/D/T/N/Q/E, L74I/D, L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V, se prefieren I /N/D, S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, se prefiere T/A) T77V/T, I78V, E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V, se prefieren Q/R/K) N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, se prefieren H/D/E/R/K/T/S/Y . En una modalidad, la región mutada es la Región: 93-127.

En una modalidad adicional, la sub-región es: Región: 93-124. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 93-107, 109-111, 113-115. Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127. Las mutaciones preferidas incluyen una o más de: P107M/L/A/G/S/T/V/I, S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V, se prefiere A, R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S119P+G447S. S119P+A393R. En una modalidad, la región mutada es la Región: 170-184. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: N171R/K/Q/E/W/F/Y, Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T173K/R/S/N/Q, G174A, S, Y175N/Q/D/E, D176L L177I E180N/M V181I/T N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V. G183A S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K. En una modalidad, la región mutada es la Región: 200-212. Las sub-regiones preferidas incluyen: 200-211. Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: A203L, S211P. En una modalidad, la región mutada es la Región: 234-246. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 234-240, 242-245.

Las posiciones específicas preferidas contempladas incluyen una o más de: 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V, A235S, F237Y/H/N/D, D238T/S, S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V, S240G, S242S/P/T/A/Y/H/N/D, G243S/P/T/A/Y/H/N/D, K244R, A246T. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: A246T+T72I . En una modalidad, la región mutada es la Región: 287-319. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 287-292, 294-301, 313-316. En una modalidad adicional, la sub-región incluye: 305-319.

Las posiciones preferidas específicas contempladas incluyen una o más de: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: Y312Q, F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V, se prefiere Y. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más deí N313G+F318Y, Y302Q+S119P+T416H+Y402F. En una modalidad, la región mutada es la Región: 334-341. Las posiciones preferidas específicas, contempladas incluyen una o más de: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V. K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V. Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V. G339S/P/T/A.

S340I/T/N/V/A/D/G. L341F/L/I/V. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S340G+D357S+T360V+S386P. En una modalidad, la región mutada es la Región: 353-374. Las posiciones preferidas específicas, contempladas incluyen una o más de: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S356P+S366T, D357S+T360V+S371H D357S+T360V+S386P+S340G. En una modalidad, la región mutada es la Región: 388-414. Las sub-regiones incluyen una o más de: 397-399, 402-406, 412-414. En una modalidad adicional, la sub-región es: 407-411. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: T390R, A393R, S394P/R, S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, se prefieren T/Q/C, Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V, se prefiere F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, Q409A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, se prefiere P, L410I/R, S411V, A412C, R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, D414A. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: A393R+T2R+S386R, A393R+T490A+V59A+PLASD (extensión N-terminal), S394R+T2Q+A11P, Y402F+T2R+L66V+S394P, Y402F+S411V+S119P Y402F+S411V, Y402F+312Q+S119P+T416H, S411V+A393R, E408R+S386N, E408R+A425T+S465P+T494A, L410R+A393R, S411V+S119P+402F+A393R, S411V+S119P+402F+A393R+T416H. En una modalidad, la región mutada es la Región: 445-470. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 445-459, 461-470. Las posiciones preferidas específicas, contempladas incluyen una o más de: 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: G447S, G456C/P, S465P. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: G447S+S119P, S465P+E408R+A425T+T494A.

Actividad específica incrementada En un tercer aspecto, la invención se refiere a una variante de una glucoamilasa progenitora con actividad específica incrementada, que comprende una o más mutaciones en las siguientes posiciones o regiones en la secuencia de aminoácidos mostrada en NO: 2: Región: 1-18, Región: 40-62, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 388-414, y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa la cual muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2, con la excepción de las siguientes sustituciones: S411G. En una modalidad, la región mutada es la Región: 1-18. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19. Las mutaciones específicas son: L3N, I18V. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: I18V+T51S+S56A+V59T+L60A.

En una modalidad, la región mutada es la Región: 40-62. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 40-47, 58-62. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 61, 62. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: S40C, T43R, T51S/D, T53D, S56A/C, V59T, L60A. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: T51S+S56A+V59T+L60A+I18V. En una modalidad, la región mutada es la Región: 93-127. En una modalidad adicional, la sub-región es: Región: 93-124. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 93-107, 109-111, 113-115. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127.

Las mutaciones específicas incluyen una o más de: N93T, P94V, S95N, D97S, L98S/P, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: S119P+Y402F, S119P+Y402F+I189T+Y223F+F227Y. En una modalidad, la región mutada es la Región: 170-184. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: N171R/K/Q/E/W/F/Y, Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T173K/R/S/N/Q, G174A, S, Y175N/Q/D/E, D176L L177I E180N/M V181I/T N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V, se prefiere E, G183A S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K.

En una modalidad, la región mutada es la Región: 200-212. Las sub-regiones preferidas incluyen: 200-211. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, W212N/A/T. En una modalidad, la región mutada es la Región: 234-246. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 234-240, 242-245. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245. En una modalidad, la región mutada es la Región: 287-319. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 287-292, 294-301, 313-316. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V, I288L/N/Q, Y289F, T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V, L291I/D/N, N292D, D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V, G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V, L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V, S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V, D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V, E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V. V301T/I, A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, preferida S, V303T/I, G304A, R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V, Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.

E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, preferida Q, D309L, T310V/S, Y311N, Y312Q/N, se prefiere Q, N313T/S/G, se prefiere S, N315Q/E/R. En una modalidad, la región mutada es la Región: 388-414. Las sub-regiones preferidas incluyen una o más de: 397-399, 402-406, 412-414. Las posiciones preferidas específicas, contempladas, incluyen una o más de: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414. Las mutaciones específicas incluyen una o más de: M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, E408C/R, S411V, A412C, D414A. Las combinaciones preferidas de mutaciones incluyen una o más de: Y402F+S119P, Y402F+S119P+I189T+Y223F+F227Y. En una modalidad preferida de la invención, las regiones que van a ser mutadas son: Región: 287-300, Región: 305-319, y/o las posiciones o regiones correspondientes en una glucoamilasa homologa la cual muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2.

Homología (identidad) La homología a la que se hace referencia anteriormente de la glucoamilasa progenitora, es determinada como el grado de identidad entre dos secuencias de proteína que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede ser adecuadamente determinada por medio de programas de computadora conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p. 443-453). Utilizando Gap con los siguientes ajustes para la comparación de la secuencia de polipéptidos: penalidad por creación de Gap de 3.0 y penalidad por extensión de Gap de 0.1, la parte madura de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN análoga de la invención muestra un grado de identidad preferentemente de al menos 60%, tal como 70%, al menos 80%, al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 97%, y lo más preferentemente al menos 99% con la parte madura de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2. Preferentemente, la glucoamilasa progenitora comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ. ID. NO: 2; o las variantes alélicas de las mismas; o los fragmentos de la misma que tienen actividad de glucoamilasa. Un fragmento de la SEQ. ID. NO: 2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos suprimidos del extremo amino y/o carboxilo de esta secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el AMG G2 (SEQ. ID. NO: 2) es un fragmento de la glucoamilasa Gl de Aspergi l l us ni ger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) que tiene actividad de glucoamilasa. Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar como resultado polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen secuencias alteradas de aminoácidos. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. La secuencia de aminoácidos de las glucoamilasas progenitoras homologas pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. NO: 2 por una inserción o supresión de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por diferentes residuos de aminoácidos. Preferentemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente el plegamiento y/o la actividad de la proteína; supresiones pequeñas, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones pequeñas amino- o carboxilo-terminales , tales como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido ligador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación mediante el cambio de la carga neta u otra función, tal como un tramo de poli-histidina, un epítope antigénico o un dominio de enlace. En otra modalidad más, la glucoamilasa progenitora aislada es codificada por una secuencia de ácido nucleico la cual se híbrida bajo condiciones de muy baja exigencia, preferentemente condiciones de baja exigencia, más preferentemente, condiciones de exigencia media, más preferentemente condiciones de exigencia media-alta, aún más preferentemente condiciones de alta exigencia, y lo más preferentemente condiciones de muy alta exigencia con una sonda de ácido nucleico que se híbrida bajo las mismas condiciones con (i) la secuencia de ácido nucleico de la SEQ. ID. NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la SEQ. ID. NO: 1, (iii) una sub-secuencia de (i) o (ii), o (iv) una hebra complementaria de (i), (ii) o (iii) (J.

Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Mol ecul ar Cl oning , A Labora tory Man ual , 2a edición, Cold Spring Harbor, New York) . La sub-secuencia de la SEQ. ID. NO: 1 puede ser al menos de 100 nucleótidos o preferentemente de al menos 200 nucleótidos. Además, la sub-secuencia puede codificar para un fragmento polipeptídico el cual tiene actividad de glucoamilasa. Los polipéptidos progenitores pueden también ser variantes alélicas o fragmentos de los polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa. La secuencia de ácido nucleico de la SEQ. ID. NO: 1 o una sub-secuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. NO: 2, o un fragmento de la misma, se puede utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar el ADN que codifica para los polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa, a partir de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas pueden ser utilizadas para la hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo los procedimientos de transferencia o manchado de Southern, estándares, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en éstos. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben ser al menos de 15, preferentemente de al menos de 25, y más preferentemente de al menos 35 nucleótidos de longitud. Se pueden también utilizar sondas más largas. Las sondas de ADN y ARN pueden ser utilizadas. Las sondas son típicamente marcadas para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Tales sondas son abarcadas por la presente invención. De este modo, el ADN genómico o la genoteca de ADNc preparada a partir de tales organismos puede ser seleccionado para el ADN que se híbrida con las sondas descritas anteriormente, y el cual codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa. El ADN genómico u otro ADN proveniente de tales organismos puede ser separado mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN proveniente de las genotecas o el ADN separado puede ser transferido a e inmovilizado sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con el fin de identificar un clon o ADN el cual sea homólogo con la SEQ. ID. NO: 1, o las sub-secuencias del mismo, el material portador es utilizado en un manchado de Southern. Para fines de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácido nucleico se hibrida a una sonda de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ. ID. NO: 1, su hebra complementaria, o una sub-secuencia de la misma, bajo condiciones de exigencia muy baja a muy alta.

Las moléculas a las cuales se hibrida la sonda de ácido nucleico bajo estas condiciones, son detectadas utilizando la película de rayos X. Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada vez por 15 minutos utilizando 2 x SSC, SDS al 0.2% preferentemente al menos a 45°C (exigencia muy baja), más preferentemente al menos a 50°C (baja exigencia), más preferentemente al menos a 55°C (exigencia media), más preferentemente al menos a 60°C (exigencia media-alta) , aún más preferentemente al menos a 65°C (exigencia alta), y lo más preferentemente al menos a 70°C (exigencia muy alta) . Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de exigencia son definidas como prehibridación, hibridación, y post-hibridación de lavado a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada, utilizando el cálculo de acuerdo a Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the Na ti onal Academy of Sci ences USA 48: 1390) en cloruro de sodio 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M, pH 7.6, EDTA 6 mM, NP-40 al 0.5%, solución de Denhardt IX, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM, y 0.2 mg de ARN de levadura por ml, siguiendo los procedimientos de manchado de Southern, estándares. Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador es lavado una vez en SSC 6X más 0.1% de SDS por 15 minutos y dos veces cada vez por 15 minutos utilizando SSC 6X a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada . La presente invención también se refiere a las secuencias aisladas de ácido nucleico producidas mediante (a) hibridación de un ADN bajo condiciones de exigencia muy baja, baja, media, media-alta, alta, o muy alta, con la secuencia de la SEQ. ID. NO: 1, o su hebra complementaria, o una subsecuencia de la misma; y (b) el aislamiento de la secuencia de ácido nucleico. La sub-secuencia es preferentemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que codifica para un fragmento polipeptídico que tiene actividad de glucoamilasa . Las glucoamilasas progenitoras contempladas tienen al menos 20%, preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 60%, aún más preferentemente al menos 80%, todavía más preferentemente al menos 90%, y lo más preferentemente al menos 100% de la actividad de glucoamilasa del polipéptido maduro de la SEQ. ID. NO: 2. En una modalidad preferida, la variante de la invención tiene estabilidad térmica mejorada y/o actividad especifica incrementada, preferentemente dentro del intervalo de temperatura de aproximadamente 60-80°C, preferentemente 63-75°C, preferentemente a un pH de 4-5, en particular 4.2-4.7, utilizando maltodextrina como el sustrato. En otra modalidad preferida, una variante de la invención es utilizada para, por ejemplo, fermentación alcohólica. En una modalidad preferida, la glucoamilasa progenitora es la glucoamilasa Gl de Aspergi l l us ni ger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) . La glucoamilasa progenitora puede ser una glucoamilasa truncada, por ejemplo, la glucoamilasa G2 de AMG.

Clonación de una Secuencia de ADN que Codifica para una Glucoamilasa Progenitora La secuencia de ADN que codifica para una glucoamilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produzca la glucoamilasa en cuestión, utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. Primeramente, un ADN genómico y/o una genoteca de ADNc deben ser construidos utilizando el ADN cromosómico o el ARN mensajero proveniente del organismo que produce la glucoamilasa que va a ser estudiada. Luego, si la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa es conocida, las sondas oligonucleotídicas marcadas pueden ser sintetizadas y utilizadas para identificar clones que codifican para la glucoamilasa a partir de una biblioteca genómica preparada a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda oligonucleotídica marcada que contiene las secuencias homologas a otro gen de glucoamilasa conocido, podría ser utilizada como una sonda para identificar los clones que codifican para la glucoamilasa, utilizando las condiciones de hibridación y de lavado de muy baja hasta muy alta exigencia. Esto se describe anteriormente . Otro método más para identificar los clones que codifican para la glucoamilasa podría involucrar la inserción de fragmentos de ADN genómico dentro de un vector de expresión, tal como un plásmido, la transformación de bacterias glucoamilasa-negativas con la biblioteca genómica de ADN resultante, y luego sembrando en placa las bacterias transformadas sobre agar que contiene un sustrato para la glucoamilasa (por ejemplo, maltosa), con lo cual se permite que los clones expresen la glucoamilasa que va a ser identificada. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica para la enzima puede ser preparada sintéticamente mediante métodos estándares establecidos, por ejemplo, el método de fosforoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p. 801-805. En el método de la fosforoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificados, recocidos, ligados y clonados en vectores apropiados.

Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen genómico y sintético mixto, de origen sintético y de ADNc mixto o de origen genómico y de ADNc mixto, preparada mediante la ligadura de fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (como sea apropiado, correspondiendo los fragmentos a diversas partes de la secuencia de ADN completa) , de acuerdo con las técnicas estándares. La secuencia de ADN puede también ser preparada mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,683,202 o R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491.

Mutagénesis dirigida al sitio Una vez que una secuencia de ADN que codifica para la glucoamilasa ha sido aislada, y los sitios deseables para la mutación han sido identificados, pueden ser introducidas mutaciones utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias nucleotídicas que flanquean los sitios de mutación deseados. En un método específico, un tramo de ADN de una sola hebra, la secuencia que codifica para la glucoamilasa, es creado en un vector que posee el gen de la glucoamilasa. Luego el nucleótido sintético, que lleva la mutación deseada, es recocido a una porción homologa del ADN de una sola hebra. El espacio vacío remanente es luego rellenado con la ADN-polimerasa I (fragmento Klenow) y la construcción es ligada utilizando la ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. La Patente de los Estados Unidos No. 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifican para mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del cásete. No obstante, puede ser introducida una variedad mucho mayor de mutaciones a cualquier tiempo mediante el método de Morinaga, debido a que pueden ser introducidos una variedad de oligonucleótidos, de diversas longitudes. Otro método más para introducir mutaciones dentro de las secuencias de ADN que codifican para la glucoamilasa se describe en Nelson y Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Éste involucra la generación de 3 pasos de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida mediante el uso de una hebra de ADN químicamente sintetizada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. A partir del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que posee la mutación puede ser aislado mediante escisión con endonucleasas de restricción y reinsertado dentro de un plásmido de expresión. Además, Sierks et al., (1989), Protein Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990), Protein Eng. Vol. 3, 193-198; también describen la mutagénesis dirigida al sitio en una glucoamilasa de Aspergill us .

Mutagénesis Aleatoria La mutagénesis aleatoria es adecuadamente realizada ya sea como la mutagénesis aleatoria localizada o específica de región, en al menos tres partes del gen que traduce a la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen completo . La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica para una glucoamilasa progenitora puede ser convenientemente realizada mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica . En relación a lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para la generación de una variante de una glucoamilasa progenitora, en donde la variante muestra estabilidad térmica incrementada con relación al progenitor, el método comprende: (a) el sujetar una secuencia de ADN que codifica para la glucoamilasa progenitora, a mutagénesis aleatoria, (b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en el paso (a) en una célula huésped, y (c) seleccionar las células huésped que expresan una variante de glucoamilasa, la cual tiene una propiedad alterada (por ejemplo estabilidad térmica) con relación a la glucoamilasa progenitora. El paso (a) del método anterior de la invención es preferentemente realizado utilizando cebadores impurificados, como se describe en los ejemplos de trabajo más adelante en la presente. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada mediante el uso de un agente de mutagénesis físico o químico adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o al sujetar la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes de mutagénesis. El agente de mutagénesis puede, por ejemplo, ser uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, revoltura, supresiones, y/o inserciones. Los ejemplos de un agente de mutagénesis físico o químico, adecuado para el presente propósito, incluyen irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , O-metil-hidroxilamina, ácido nitroso, metansulfonato de etilo (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos. Cuando tales agentes son utilizados, la mutagénesis es típicamente realizada mediante la incubación de la secuencia de ADN que codifica para la enzima progenitora que va a ser mutagenizada en presencia del agente de mutagénesis de elección, bajo condiciones adecuadas para que la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando el ADN mutado que tiene las propiedades deseadas. Cuando la mutagénesis es realizada mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser impurificado o inutilizado con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que van a ser cambiadas. La purificación o anulación puede ser realizada de modo que los codones para los aminoácidos no deseados sean evitados. El oligonucleótido impurificado o anulado puede ser incorporado dentro del ADN que codifica para la enzima glucoamilasa mediante cualquier técnica publicada, utilizando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier ADN-polimerasa y ligasa como se considere apropiado . Preferentemente, la impurificación se lleva a cabo utilizando "impurificación aleatoria constante", en la cual el porcentaje de tipo silvestre y mutación en cada posición es predefinido. Además, la impurificación puede ser dirigida hacia una preferencia para la introducción de ciertos nucleótidos, y con esto una preferencia para la introducción de uno o más residuos específicos de aminoácidos. La impurificación se puede realizar, por ejemplo, para permitir la introducción de 90% de tipo silvestre y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de impurificación está basada en los constreñimientos genéticos así como de estructura de proteínas. El esquema de impurificación puede ser realizado mediante el uso del programa DOPE el cual, entre otros, asegura que sea evitada la introducción de codones de detención. Cuando se utiliza la mutagénesis generada por PCR, un gen ya sea químicamente tratado o no tratado, que codifica para una glucoamilasa progenitora, se sujeta a PCR bajo condiciones que incrementan la mala incorporación de los nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15). Una cepa mutadora de E . col i (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp . 179-191), S . cerevi sea e o cualquier otro organismo microbiano se puede utilizar para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica para la glucoamilasa por ejemplo, mediante la transformación de un plásmido que contiene la glucosilasa progenitora dentro de la cepa mutadora, desarrollando la cepa mutadora con el plásmido y aislando el plásmido mutado a partir de la cepa mutadora. El plásmido mutado puede ser subsecuentemente transformado dentro del organismo de expresión.

La secuencia de ADN que va a ser mutagenizada puede estar convenientemente presente en una genoteca genómica o de ADNc preparada a partir de un organismo que expresa la glucoamilasa progenitora. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente sobre un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, el cual como tal puede ser incubado con o de otro modo expuesto al agente de mutagénesis. El ADN que va a ser mutagenizado puede también estar presente en una célula huésped ya sea al ser integrado en el genoma de dicha célula o al estar presente sobre un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN que va a ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que va a ser sujeta a mutagénesis aleatoria es preferentemente un ADNc o una secuencia de ADN genómico. En algunos casos puede ser conveniente el amplificar la secuencia de ADN mutado antes de realizar el paso de expresión b) o el paso de selección c) . Tal amplificación puede ser realizada de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, siendo el método actualmente preferido la amplificación generada por PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos preparados con base en la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima progenitora . Subsiguiente a la incubación con o la exposición al agente de mutagénesis, el ADN mutado es expresado mediante cultivo de una célula huésped adecuada que posee la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula huésped utilizada para este propósito puede ser una que ha sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente sobre un vector, o una que llevaba la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora durante el tratamiento de mutagénesis. Los ejemplos de células huésped adecuadas son los siguientes: bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus circulans , Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis , Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram negativas tales como E. coli. La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica para las funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada a una parte de la glucoamilasa progenitora en cuestión. Ésta puede, por ejemplo, ser ventajosa cuando ciertas regiones de la enzima han sido identificadas como de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se espera que la modificación dé como resultado una variante que tenga propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima progenitora ha sido elucidada y relacionada a la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria localizada o específica de región, es convenientemente realizada mediante el uso de técnicas de mutagénesis generadas por PCR como se describe anteriormente, o cualquier otra técnica adecuada conocida en la materia. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica para la parte de la secuencia de ADN que va a ser modificada, puede ser aislada, por ejemplo, mediante la inserción de un vector adecuado, y dicha parte puede ser subsecuentemente sujeta a mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis anteriormente descritos. Los métodos alternativos para la provisión de las variantes de la invención incluyen entremezclado de genes, por ejemplo, como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) o en WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S).

Expresión de Variantes de Glucoamilasa De acuerdo a la invención, una secuencia de ADN que codifica para la variante producida mediante métodos descritos anteriormente, o mediante cualesquiera métodos alternativos conocidos en la materia, puede ser expresada, en forma de enzima, utilizando un vector de expresión el cual incluye típicamente las secuencias de control que codifican para un promotor, un operador, el sitio de enlace al ribosoma, la señal de inicio de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o diversos genes activadores .

Vector de expresión El vector de expresión recombinante que posee la secuencia de ADN que codifica para una variante de glucoamilasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sujeto a procedimientos de ADN recombinantes, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped dentro de la cual éste va a ser introducido. El vector puede ser uno el cual, cuando se introduce dentro de una célula huésped, se integra dentro del genoma de la célula huésped y es replicado junto con el o los cromosomas dentro de los cuales éste ha sido integrado. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen pMT838.

Promotor En el vector, la secuencia de ADN debe ser operablemente conectada a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección, y puede ser derivado de genes que codifican para las proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula huésped.

Los ejemplos de promotores adecuados para la dirección de la transcripción de la secuencia de ADN que codifica para una variante de glucoamilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores dagA del gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de la a-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de la amilasa maltogénica {amyM) de .Baci-Z-Zus stearothermophilus, los promotores de la a-amilasa {amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica para la amilasa TAKA de A. oryzae, el promotor TPI (isomerasa de triosa-fosfato) de S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p. 419-434), la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra de A. niger, la a-amilasa estable al ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la isomerasa de triosa-fosfato de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans .

Vector de expresión El vector de expresión de la invención puede también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en eucariotes, las secuencias de poliadenilación operablemente conectadas a la secuencia de ADN que codifica para la variante de a-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden ser adecuadamente derivadas de las mismas fuentes que el promotor. El vector puede además comprender una secuencia de ADN que hace posible que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl y pIJ702. El vector puede también comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen el producto del cual complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes dai de B . subtil i s o B . l i cheniformi s, o uno que confiere resistencia a antibióticos tales como la resistencia a la ampicilina, a la kanamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergi l l us tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que da origen a la resistencia a la higromicina, o la selección puede ser lograda mediante co-transformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243. Los procedimientos utilizados para ligar la construcción de ADN de la invención que codifica para una variante de glucoamilasa, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos dentro de los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos para las personas expertas en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor, 1989) .

Células Huésped La célula de la invención, que comprende ya sea una construcción de ADN o un vector de expresión de la invención como se define anteriormente, es ventajosamente utilizada como una célula huésped en la producción recombinante de una variante de glucoamilasa de la invención. La célula puede ser transformada con la construcción de ADN de la invención que codifica para la variante, convenientemente mediante la integración de la construcción de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración es en general considerada como una ventaja, ya que la secuencia de ADN es más probable que sea establemente mantenida en la célula. La integración de las construcciones de ADN dentro de los cromosomas huésped puede ser realizada de acuerdo a los métodos convencionales, por ejemplo mediante recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se describe anteriormente en conexión con los diferentes tipos de células huésped. La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferentemente una célula microbiana, por ejemplo, una célula bacteriana o fúngica (incluyendo levadura). Los ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias Gram positivas tales como Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus circulans , Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada mediante transformación de protoplastos o mediante el uso de células competentes de una manera conocida per se. El organismo levadura puede favorablemente ser seleccionado de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae . La célula huésped puede también ser un hongo filamentoso, por ejemplo, una cepa que pertenece a una especie de Aspergillus , más preferentemente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en el estado perfecto llamado Gribberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinónimo con Gibberella roseum y Gibberella roseum f. sp. cerealis) , o Fusarium sulphureum (en el estado perfecto llamado Gibberella puricaris, sinónimo con Fusarium trhichothecioides, Fusarium bactridioides , Fusarium sambucium, Fusarium roseum, y Fusarium roseum variante graminearum) , Fusari um cereali s (sinónimo con Fusari um crokkwellnse) , o Fusari um venena t um . En una modalidad preferida de la invención, la célula huésped es una cepa deficiente en proteasa o negativa a la proteasa. Esta puede por ejemplo ser la cepa deficiente en proteasa Aspergill us oryza e JaL 125 que tiene el gen de la proteasa alcalina llamado "alp" suprimido. Esta cepa se describe en WO 97/35956 (Novo Nordisk) . Las células de hongos filamentosos pueden ser transformadas mediante un proceso que involucra la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos, seguida por la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se . El uso de Aspergil l us como un microorganismo huésped se describe en la Patente Europea EP 238,023 (Novo Nordisk A/S) , los contenidos de la cual se incorporan por referencia en la presente.

Método de Producción de una Variante de Glucoamilasa En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de producir una variante de glucoamilasa de la invención, cuyo método comprende el cultivar una célula huésped bajo condiciones que conducen a la producción de la variante y recuperando la variante de las células y/o del medio de cultivo. El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el desarrollo de la célula huésped en cuestión y obteniendo la expresión de la variante de glucoamilasa de la invención. Los medios adecuados son disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo a las recetas publicadas (por ejemplo como se describe en los catálogos de la Colección Norteamericana de Cultivo de Especies (American Type Culture Collection) ) . La variante de glucoamilasa secretada de las células huésped puede ser convenientemente recuperada del medio de cultivo mediante procedimiento bien conocidos, incluyendo la separación de las células a partir del medio mediante centrifugación o filtración, y precipitando los componentes proteicos del medio por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.

Conversión de Almidón La presente invención proporciona un método para utilizar las variantes de glucoamilasa de la invención para producir glucosa y similares a partir de almidón. En general, el método incluye los pasos de hidrolizar parcialmente el almidón precursor en presencia de la a-amilasa y luego hidrolizando adicionalmente la liberación de D-glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón o de las moléculas oligo- y polisacáridas relacionadas, en presencia de glucoamilasa mediante la escisión de los enlaces glucosidicos a-(l->4) y a-(l->6). La hidrólisis parcial del almidón precursor utilizando a-amilasa, proporciona un rompimiento inicial de las moléculas de almidón mediante la hidrólisis de los enlaces a-(l*^4) internos. En aplicaciones comerciales, la hidrólisis inicial utilizando a-amilasa es corrida a una temperatura de aproximadamente 105°C. Una concentración de almidón muy alta es procesada, usualmente de 30% a 40% de sólidos. La hidrólisis inicial es usualmente llevada a cabo por cinco minutos a esta temperatura elevada. El almidón parcialmente hidrolizado puede ser transferido a un segundo tanque e incubado por aproximadamente 1 a 2 horas a una temperatura de 85°C a 98°C para derivar un equivalente de dextrosa (D.E.) de 10 a 15. El paso de hidrolizar adicionalmente la liberación de D-glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón o de moléculas oligo- y polisacáridas relacionadas en presencia de glucoamilasa, se lleva a cabo normalmente en un tanque separado a una temperatura reducida entre 30°C y 62°C. Preferentemente, la temperatura del sustrato líquido es disminuida hasta entre 55°C y 60°C. El pH de la solución es disminuido de aproximadamente 5.5 a 6.5 hasta un intervalo entre 3 y 5.5. Preferentemente, el pH de la solución es de 4 a 4.5. La glucoamilasa es agregada a la solución y la reacción se lleva a cabo por 24 a 72 horas, preferentemente 36 a 48 horas. Mediante el uso de una variante de glucoamilasa termoestable de la invención, los procesos de sacarificación pueden ser llevados a cabo a una mayor temperatura que los procesos tradicionales de sacarificación en lotes. De acuerdo a la invención, la sacarificación puede ser llevada a cabo a temperaturas en el intervalo por arriba de 60-80°C, preferentemente 63-75°C. Esto aplica para procesos en lote tradicionales (descritos anteriormente) y para procesos de sacarificación continua. Efectivamente, los procesos de sacarificación continua que incluyen uno o más pasos de separación en membrana, por ejemplo, pasos de filtración, se pueden llevar a cabo a temperaturas por arriba de 60°C para ser capaces de mantener un flujo razonablemente alto sobre la membrana, o para minimizar la contaminación microbiana. Por lo tanto, las variantes termoestables de la invención proporcionan la posibilidad de llevar a cabo procesos de sacarificación continua a gran escala a un precio bajo y/o a una menor dosis de proteína enzimática, dentro de un periodo de tiempo aceptable para los procesos de sacarificación industrial. De acuerdo a la invención, el tiempo de sacarificación puede ser incluso acortado. La actividad de la variante de glucoamilasa (por ejemplo variante de AMG) de la invención es en general sustancialmente más alta a temperaturas entre 60°C-80°C que a las temperaturas tradicionalmente utilizadas entre 30-60°C. Por lo tanto, al incrementar la temperatura a la cual opera la glucoamilasa, el proceso de sacarificación puede ser llevado a cabo dentro de un periodo de tiempo más corto. Además, al mejorar la estabilidad térmica el T? 2 (tiempo medio, como se define en la sección de "Materiales y Métodos") es mejorado. Conforme se mejora la estabilidad térmica de las variantes de glucoamilasa de la invención, se necesita ser agregada una cantidad menor de glucoamilasa para reemplazar la glucoamilasa que es inactivada durante el proceso de sacarificación. Más glucoamilasa es mantenida activa durante el proceso de sacarificación de acuerdo a la presente invención. Además, el riesgo de contaminación microbiana es también reducido cuando se lleva el proceso de sacarificación a temperatura por arriba de 63°C. El rendimiento de la glucosa a partir de una prueba de sacarificación típica con glucoamilasa, amilasa acida y pululanasa es de 95.5-96.5%. Los carbohidratos restantes consisten típicamente de 1% de maltosa, 1.5-2% de isomaltosa y 1-1.5% de oligosacáridos superiores. Los disacáridos son producidos ya que la glucoamilasa a altas concentraciones de glucosa y altos niveles de sólidos secos, tiene una tendencia a formar productos de reversión.

Una glucoamilasa con una actividad específica incrementada hacia los sacáridos presentes en la solución después de la licuefacción y los sacáridos formados durante la sacarificación, podría ser una ventaja ya que podría ser entonces utilizada una dosis reducida de enzima proteica o un tiempo de proceso más corto. En general, la glucoamilasa tiene una preferencia para los sustratos que consisten de sacáridos más largos en combinación a los sacáridos de cadena corta y la actividad específica por ejemplo hacia la maltoheptosa es por lo tanto de aproximadamente 6 veces más alta que hacia la maltosa. Una actividad específica incrementada hacia los sacáridos de cadena corta tal como maltosa (sin reducir la actividad hacia los oligosacáridos) podría por lo tanto permitir el uso de una dosis más baja de enzima y/o un tiempo de proceso más corto. Además, un más alto rendimiento de glucosa puede ser obtenido con una variante de glucoamilasa con una actividad hidrolítica alfa-1,4 incrementada (si la actividad de alfa-1,6 permanece sin cambio o es incluso disminuida) , ya que una cantidad reducida de proteína enzimática está siendo utilizada, y la formación del producto de reversión alfa-1,6 es por lo tanto disminuido (menos isomaltosa) . La actividad específica puede ser medida utilizando el método descrito en la sección de "Materiales y Métodos" a 37°C ó 60°C. El ejemplo del proceso de sacarificación en donde las variantes de glucoamilasa de la invención pueden ser utilizadas, incluye los procesos descritos en las Patentes Japonesas JP 3-224493; JP 1-191693; JP 62-272987; EP 452,238, y WO 99/27124 (todas las referencias son incorporadas aquí por referencia) . En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de sacarificación de una solución de almidón licuado, que comprende los pasos de : (i) un paso de sacarificación durante el cual tienen lugar una o más etapas de sacarificación enzimática, y el paso subsecuente de (ii) uno o más pasos de separación de membrana a alta temperatura en donde la sacarificación enzimática se lleva a cabo utilizando una variante de glucoamilasa termoestable de la invención.

La o las variantes de glucoamilasa de la invención pueden ser utilizadas en el presente proceso inventivo en combinación con una enzima que hidroliza únicamente los enlaces glucosídicos a- (1-^6) en las moléculas con al menos cuatro residuos de glucosilo. Preferentemente, la variante de glucoamilasa de la invención puede ser utilizada en combinación con pululanasa o isoamilasa. El uso de la isoamilasa y la pululanasa para desramificar , las propiedades moleculares de las enzimas, y el uso potencial de las enzimas con glucoamilasa se describe en G.M. A van Beynum et al., Starch Conversión Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una variante de glucoamilasa de la invención en un proceso de conversión de almidón. Además, la variante de glucoamilasa de la invención puede ser utilizada en un proceso de conversión continua de almidón incluyendo un paso de sacarificación continuo. Las variantes de glucoamilasa de la invención pueden también ser utilizadas en forma inmovilizada. Esto es adecuado y frecuentemente utilizado para la producción de jarabes de especialidad, tales como jarabe de maltosa, y además para la corriente de rafinado de oligosacáridos en conexión con la producción de jarabes de fructosa. La glucoamilasa de la invención puede también ser utilizada en un proceso para la producción de etanol para combustible o bebidas, o puede ser utilizado en un proceso de fermentación para producir compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES: Enzimas : AMG Gl : glucoamilasa Gl de Aspergi l l us ni ger descrita en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102, y SEQ. ID. NO: 13, disponible de Novo Nordisk. .AMG G2 : glucoamilasa Gl de Aspergi l l us ni ger truncada, mostrada en la SEQ. ID. NO: 2, disponible de Novo Nordisk) .

Soluciones : Amortiguador: acetato de sodio 0.05 M (6.8 g en 1 litro de mili Q-water), pH 4.5 Solución de Detención: hidróxido de sodio 0.4 M GOD-perid, 124036, Boehringer Mannheim Sustrato Maltosa: 29 mM (1 g de maltosa en 100 ml de acetato de sodio 50 mM, pH 4.5) (Sigma) Maltoheptosa: 10 mM, 115 mg/10 ml (Sigma) Célula Huésped: A . oryza e JaL 125: Aspergi l l us oryza e IFO 4177 disponible del Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku, Osaka, Japón, que tiene el gen de la proteasa alcalina llamado "alp" (descrito por Murakami K et al., (1991), Agrie. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811) suprimido por un método de reemplazo de gen de un solo paso (descrito por G. May en "Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi" (1992), p. 1-25. Eds. J. R. Kinghorn y G. Turner; Blackie Academic and Professional) , utilizando el gen pyrG de A . oryza e como marcador. La cepa JaL 125 es además descrita en WO 97/35956 (Novo Nordisk) .

Microorganismos : Cepa: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATaleu2-?2 ura3-52 his4-539 pep4-?l [cir+ ] Plásmidos : pCAMG91: ver Figura 1. El plásmido que comprende la glucoamilasa Gl de Aspergillus niger (AMG Gl) . La construcción de pCAMG91 se describe en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (7) p. 1581-1585. pMT838: Plásmido que codifica para la glucoamilasa G2 truncada de Aspergillus niger (SEQ. ID. NO: 2) . pJSO026 (plásmido de expresión de S. cerevisiae) (J. S. Okkels, (1996) "una supresión del promotor URA3 en un vector pYES incrementa el nivel de expresión de una lipasa fúngica en Saccharomyces cerevisiae . Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences). Más específicamente, el plásmido de expresión pJS037, es derivado de pYES 2.0 mediante el reemplazo del promotor GALl inducible de pYES 2.0 con el promotor de TPI (isomerasa de fosfato de triosa) expresado constitutivamente proveniente de Sa ccharomyces cerevi si a e (Albert y Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1, 419-434), y suprimiendo una parte del promotor URA3.

MÉTODOS: Transformación de Sa ccharomyces cerevi si a e YNG318 Los fragmentos de ADN y los vectores abiertos se mezclan y se transforman en la levadura Sa ccharomyces cerevi si a e YNG318 mediante métodos estándares.

Determinación de Actividad Específica como kcat (seg."1) 750 micromol de sustrato (1% de maltosa, acetato de sodio 50 mM, pH 4.3) se incuba 5 minutos a temperatura seleccionada, tal como 37°C ó 60°C. Se agregan 50 microlitros de enzima diluida en acetato de sodio. Las alícuotas de 100 microlitros se retiran después de 0, 3, 6, 9 y 12 minutos y se transfieren a 100 microlitros de hidróxido de sodio 0.4 M para detener la reacción. Se incluye un blanco. Se transfieren 20 micromol a placas de microtitulación y se agregan 200 microlitros de la solución de GOD-Perid. La absorbancia se mide a 650 nm después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se utiliza la glucosa como estándar y la actividad específica se calcula como kcat (sec."1) .

Determinación de la Actividad AGU y como AGU/mg Una unidad de amiloglucosidasa Novo (AGU) es definida como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 37°C y pH 4.3.

Una descripción detallada del método analítico (AEL- SM-0131) es disponible a petición de Novo Nordisk. La actividad determinada como AGU/ml mediante un método modificado posteriormente (AEL-SM-0131) utilizando el equipo de Glucosa GOD-Perid de Boehringer Mannheim, 124036. Estándar: estándar AMG, lote 7-1195, 195 AGU/ml. 375 microlitros de sustrato (1% de maltosa en acetato de sodio 50 mM, pH 4.3) se incuba 5 minutos a 37°C. Se agrega 25 micromol de enzima diluida en acetato de sodio. La reacción se detiene después de 10 minutos mediante la adición de 100 microlitros de hidróxido de sodio 0.25 M. Se transfieren 20 microlitros a una placa de microtitulación de 96 pozos y se agregan 200 microlitros de la solución de GOD-Perid. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la absorbancia se mide a 650 nm y la actividad se calcula en AGU/ml a partir del estándar de AMG. La actividad específica en AGU/mg se calcula luego a partir de la actividad (AGU/ml) dividida con la concentración de proteína (mg/ml).

Transformación de Aspergill us oryza e (procedimiento general) 100 ml de YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) se inoculan con esporas de A . oryza e y se incuban con agitación por aproximadamente 24 horas. El micelio se cosecha mediante filtración a través de miracloth y se lava con 200 ml de sulfato de magnesio 0.6 M. El micelio se suspende en 15 ml de sulfato de magnesio 1.2 M, fosfato diácido de sodio 10 mM, pH 5.8. La suspensión se enfría sobre hielo y se agrega 1 ml de amortiguador que contiene 120 mg de NovozymMR 234. Después de 5 minutos, se agrega 1 ml de BSA a 12 mg/ml (Sigma tipo H25) y la incubación con agitación suave se continúa por 1.5-2.5 horas a 37°C hasta que es visible un gran número de protoplastos en una muestra inspeccionada bajo el microscopio . La suspensión se filtra a través de miracloth, el filtrado se transfiere a un tubo estéril y se cubre con 5 ml de sorbitol 0.6 M, Tris-HCl 100 M, pH 7.0. La centrifugación se realiza por 15 minutos a 1000 g y los protoplastos se recolectan de la parte superior del cojín de sulfato de magnesio. Se agregan 2 volúmenes de STC (sorbitol 1.2 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, cloruro de calcio 10 M) a la suspensión de protoplastos, y la mezcla se centrifuga por 5 minutos a 1000 g. El botón o concentrado de protoplastos se resuspende en 3 ml de STC y vuelve a concentrar. Esto es repetido. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 0.2-1 ml de STC. 100 µl de la suspensión de protoplastos se mezclan con 5-25 µg de p3SR2 (un gen amdS de A . ni dul ans descrito en Hynes et al., Mol. and Cel. Biol., Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Agosto 1983) en 10 µl de STC. La mezcla se deja a temperatura ambiente por 25 minutos. Se agregan 0.2 ml de PEG 4000 al 60% (BDH 29576), cloruro de calcio 10 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7.5 y se mezcla cuidadosamente (dos veces), y finalmente se agregan 0.85 ml de la misma solución y se mezclan cuidadosamente. La mezcla se deja a temperatura ambiente por 25 minutos, se centrifuga a 2.500 g por 15 minutos y el botón se resuspende en 2 ml de sorbitol 1.2 M. Después de una sedimentación más, los protoplastos se esparcen sobre placas mínimas (Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56) que contiene sucrosa 1.0 M, pH 7.0, acetamida 10 mM como fuente de nitrógeno y cloruro de cesio 20 mM para inhibir el desarrollo antecedente. Después de la incubación por 4-7 días a 37°C las esporas se recogen, se suspenden en agua estéril y se esparcen para formar colonias simples. Este procedimiento se repite y las esporas de una colonia simple después del segundo reaislamiento se almacenan como un transformante definido.

Fermentación en Lote Alimentado La fermentación en lote alimentado se realiza en un medio que contiene maltodextrina como una fuente de carbono, urea como una fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación en lote alimentado es realizada mediante la inoculación de un cultivo en matraz con agitación de células huésped de A . oryza e en cuestión en un medio que comprende 3.5% de la fuente de carbono y 0.5% de la fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de cultivo a pH 5.0 y 34°C, el suministro continuo de las fuentes de carbono y nitrógeno adicionales es iniciado. La fuente de carbono se mantiene como un factor limitante y se asegura que el oxígeno esté presente en exceso. El cultivo en lote alimentado es continuado por 4 días, después de lo cual las enzimas pueden ser recuperadas mediante centrifugación, ultrafiltración, filtración clara y filtración germinal.

Purificación El caldo de cultivo se filtra y se agrega sulfato de amonio (AMS) a una concentración de AMS 1.7 M y el pH se ajusta a pH 5. El material precipitado se retira mediante centrifugación y la solución que contiene la actividad de glucoamilasa se aplica sobre una columna Toyo Pearl Butyl previamente equilibrada en AMS 1.7 M, acetato de sodio 20 mM, pH 5. El material no enlazado se lava con el amortiguador de equilibrio. Las proteínas enlazadas se eluyen con acetato de sodio 10 M, pH 4.5 utilizando un gradiente lineal de 1.7-0 M de AMS sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen glucoamilasa se recolectan y se dializan contra acetato de sodio 20 mM, pH 4.5. La solución se aplica luego sobre una columna de Q-sepharose, previamente equilibrada en Piperazina 10 mM, Sigma, pH 5.5. El material no enlazado se lava con el amortiguador de equilibrio. Las proteínas enlazadas se eluyen con un gradiente lineal de 0-0.3 M de cloruro de sodio en piperazina 10 mM, pH 5.5 sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen glucoamilasa se recolectan y la pureza se confirma mediante SDS-PAGE.

T?/2 (vida media) Método I La estabilidad térmica de las variantes se determina como un Ti 2 utilizando el siguiente método: 950 microlitros de amortiguador de acetato de sodio 50 mM (pH 4.3) (NaOAc) se incuban por 5 minutos a 68°C ó 70°C. Se agregan 50 microlitros de enzima en amortiguador (4 AGU/ml) . Se toman muestras de 2 x 40 microlitros a los 0, 5, 10, 20, 30 y 40 minutos y se enfrían sobre hielo. La actividad (AGU/ml) medida antes de la incubación (0 minutos) se utiliza como referencia (100%) . La declinación en la estabilidad (en por ciento) se calcula como una función del tiempo de incubación. La actividad de glucoamilasa residual porcentual es determinada a tiempos diferentes. Ti 2 es el periodo de tiempo hasta el cual la actividad relativa porcentual es disminuida hasta 50%.

Ti 2 (vida media) (Método II) La Ti 2 es medida mediante la incubación de la enzima (aproximadamente 0.2 AGU/ml) en cuestión en glucosa al 30%, acetato de sodio 50 mM a pH 4.5 a la temperatura en cuestión (por ejemplo, 70°C) . Las muestras se retiran a los intervalos de tiempo establecidos y se enfrían sobre hielo y la actividad de enzima residual es medida mediante el método pNPG (como se describe más adelante) . La actividad de glucoamilasa residual porcentual es determinada a diferentes tiempos. Ti 2 es el periodo de tiempo hasta el cual la actividad relativa porcentual es disminuida hasta 50%.

Actividad de Enzima Residual (método pNPG) Reactivo pNPG: 0.2 g de pNPG (p-nitrofenilglucopiranósido) se disuelven en amortiguador de acetato 0.1 M (pH 4.3) y se afora hasta 100 ml .

Solución de borato: 3.8 g de Na2B4O7»10 H20 se disuelven en agua Milli-Q y se aforan hasta 100 ml . Se agregan muestras de 25 microlitros a 50 microlitros de sustrato y se incuban 2 horas a 50°C. La reacción se detiene mediante la adición de 150 microlitros de solución de borato. La densidad óptica se mide a 405 nm, y se calcula la actividad residual .

Construcción de p-AMGY El vector pAMGY fue construido como sigue: El gen de la lipasa en pJSO026 fue reemplazado por el gen AMG, el cual fue amplificado por PCR con el cebador delantero: FG2 : 5' -CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' y el cebador inverso: RG2 : 5' -CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT-3' utilizando el plásmido plantilla pLAC103 que contiene el gen AMG. El plásmido pJSO026 fue digerido con Xbal y Smal a 37°C por 2 horas y el amplicon de PCR fue hecho romo en el extremo utilizando el fragmento Klenow y luego digerido con Xbal. El fragmento vector y el amplicon de PCR fueron ligados y transformados dentro de E . col i mediante electrotransformación . El vector resultante es designado p.AMGY .

Construcción de pLaC103 El clon de ADNc AMGII de Aspergi l l us ni ger (Boel et al., (1984), supra) se utiliza como fuente para la construcción de pLaC103 dirigido a la expresión de S . cerevi si a e de la forma Gil de AMG. La construcción tiene lugar en varios pasos, descritos enseguida. pT7-212 (EP37856/Patente de los Estados Unidos No. 5162498) es escindido con Xbal, hecho romo en el extremo con la polimerasa ADN Klenow y dNTP. Después de la escisión con EcoRI el fragmento vector resultante se purifica a partir de electroforesis en gel de agarosa y se liga con 2.05 kb del fragmento EcoRI-EcoRV de pBoel53, con lo cual se recrea el sitio Xbal en el extremo EcoRV del fragmento que codifica para AMG en el plásmido pG2x resultante . Con el fin de remover el ADN corriente arriba (5') del cds de AMG, y proporcionar el ADN que codifica para AMG con un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción apropiado, se elaboró la siguiente construcción: El fragmento EcoRI-PstI de 930 pares de bases de p53 fue aislado y sujeto a escisión con Alul, el fragmento Alu-PstI de 771 pares de bases resultante fue ligado dentro de pBR322 con el sitio EcoRI con extremo romo (ver arriba) y fue escindido con PstI en el plásmido resultante pBR-AMG' , el sitio EcoRI fue recreado justo 34 pares de bases desde el codón de inicio del cds de AMG. A partir de pBR-AMG' fue aislado el fragmento EcoRI-PstI de 775 pares de bases y unido con el fragmento Pstl-Xbal de 1151 pares de bases a partir de pG2x en una reacción de ligadura que incluía el fragmento vector Xbai-EcoRI de pT7-212.

El plásmido pT7GII resultante fue sometido a una escisión con BamHl en presencia de fosfatasa alcalina, seguido por la escisión parcial con Sphl después de la inactivación de la fosfatasa. A partir de esta reacción se creó el fragmento Sphl-BamHI de 2489 pares de bases, que abarcaba el promotor TPI de S.c. ligado al cds de AMGII. El fragmento anterior junto con el fragmento BamHl de 1052 pares de bases de pT7GII fue ligado con el fragmento vector tratado con fosfatasa alcalina, de pMT743 (EP37856/Patente de los Estados Unidos No. 5162498), que resulta de la digestión con Sphl-BamHI. El plásmido resultante es pLaC103.

Selección para las Variantes de AMG Termoestables Las genotecas son seleccionadas en el ensayo de filtro termoestable descrito más adelante.

Ensayo de Filtro para Termoestabilidad Las genotecas de levadura son sembradas en placa sobre un emparedado de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) sobre placas de agar SCFura con 100 µg/ml de ampicilina a 30°C por al menos 72 horas. Las colonias son sembradas por duplicado a filtros de PVDF ( Immobilon-P, Millipore, Bedford) activados con metanol por 1 minuto o alternativamente un filtro Protran (sin activación) y subsecuentemente lavados en acetato de sodio 0.1 M y luego incubados a temperatura ambiente por 2 horas. Las colonias se lavan de los filtros PVDF/Protran con agua de la llave. Cada uno de los emparedados de filtro y los filtros PVDF/Protran son específicamente marcados con una aguja antes de la incubación, con el fin de hacer posible la localización de las variantes positivas sobre los filtros después de la selección. Los filtros PVDF con variantes enlazadas se transfieren a un recipiente con acetato de sodio 0.1 M, pH 4.5 y se incuban a 47°C o alternativamente 67-69°C en el caso de los filtros Protran por 15 minutos. El emparedado de acetato de celulosa y los filtros de nitrocelulosa sobre placas de agar SC ura se almacenan a temperatura ambiente hasta el uso. Después de la incubación, las actividades residuales se detectan sobre las placas que contienen 5% de maltosa, 1% de agarosa, acetato de sodio 50 mM, pH 4.5. Las placas de ensayo con los filtros PVDF se marcan de la misma manera que los emparedados de filtro y se incuban por 2 horas a 50°C. Después del retiro de los filtros PVDF, las placas de ensayo se tiñen con glucosa GOD-Perid (Boehringer Mannheim GMBH, Alemania) . Las variantes con actividad residual se detectan sobre placas de ensayo sobre manchas verde oscuro sobre fondo blanco. Las variantes mejoradas son localizadas en las placas de almacenamiento. Las variantes mejoradas son reseleccionadas dos veces bajo las mismas condiciones que la primera selección.

Método General para la Mutagénesis Aleatoria mediante el Uso del Programa POPE La mutagénesis aleatoria puede ser llevada a cabo mediante los siguientes pasos: 1. Seleccionar las regiones de interés para la modificación en la enzima progenitora. 2. Decidir sobre los sitios de mutación y los sitios no mutados en la región seleccionada. 3. Decidir sobre qué tipo de mutaciones deben ser llevadas a cabo, por ejemplo, con respecto a la estabilidad deseada y/o al funcionamiento de la variante que va a ser construida. 4. Seleccionar las mutaciones estructuralmente razonables. 5. Ajustar los residuos seleccionados por el paso 3 con respecto al paso 4. 6. Analizar mediante el uso de un algoritmo dope adecuado la distribución del nucleótido . 7. Si es necesario, ajustar los residuos deseados al realismo del código genético, por ejemplo, tomando en cuenta los constreñimientos que resultan del código genético, por ejemplo, con el fin de evitar la introducción de los codones de detención; la persona experta estará enterada de que algunas combinaciones de codones no pueden ser utilizadas en la práctica y necesitarán ser adaptadas . 8. Elaborar los cebadores. 9. Realizar la mutagénesis aleatoria mediante el uso de cebadores. 10. Seleccionar las variantes de glucoamilasa resultantes mediante selección para las propiedades mejoradas, deseadas.

Algoritmo DOPE Los algoritmos dope adecuados para el uso en el paso 6 son bien conocidos en la técnica. Un algoritmo de este tipo se describe por Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29-38. Otro algoritmo es DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, y Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26: 697-702) .

Método de Extracción de Regiones Importantes para la Actividad de Temperatura Utilizando Simulación Molecular La estructura de rayos X y/o la estructura construida por modelo de la enzima de interés, aquí AMG, se sujetan a simulaciones dinámicas moleculares. Las simulación de la dinámica molecular se realiza utilizando el programa CHARMM (a partir de simulaciones moleculares (MSI)) u otros programas adecuados, por ejemplo, DISCOVER (de MSI). Las dinámicas se realizan a vacío, o incluyendo cristal Waters, o con la enzima en cuestión incrustada en un Waters apropiado, por ejemplo, una esfera o una caja. La simulación se corre por 300 picosegundos (ps) o más, por ejemplo, 300-1200 ps. Las fluctuaciones isotrópicas son extraídas para los carbonos CA de las estructuras y la comparación entre las estructuras es realizada. Más detalles de cómo obtener las fluctuaciones isotrópicas, pueden ser encontrados en el manual CHARMM (disponible de MSI) e incorporado por referencia en la presente. La simulación de la dinámica molecular se puede llevar a cabo utilizando cargas estándares sobre los aminoácidos cargables. Por ejemplo, Asp y Glu son negativamente cargados y Lys y Arg son positivamente cargados. Esta condición se asemeja al pH medio de aproximadamente 7.0. Para analizar un pH menor, la titulación de la molécula se puede realizar para obtener los pKa's alterados de los residuos titulables normales dentro de pH 2-10; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr y His. También, Ser, Thr y Cys son titulables, pero no están siendo tomados en cuenta aquí. Aquí, las cargas alteradas debidas al pH han sido descritas como todas Arg, Lys negativo a pH alto, y todas Asp, Glu están sin carga. Esto imita un pH alrededor de 4 a 5 donde la titulación de Asp y Glu tiene normalmente lugar. La construcción del modelo de la enzima de interés puede ser obtenida mediante el uso del modelo HOMOLOGY en el paquete de programa MSI. La estructura cristalina de la variante XlOO de Aspergi l l us a wamori se puede encontrar por ejemplo en 3GLY y 1DOG en la base de datos Brookhaven.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de las variantes AMG G2 Mutagénesis dirigida al sitio: Para la construcción de las variantes de AMG G2 (SEQ. ID. NO: 2) el equipo comercial, Chameleon de doble hebra, el equipo de mutagénesis dirigida al sitio fue utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El gen que codifica para la enzima AMG G2 en cuestión está localizado sobre pMT838 preparado mediante la supresión del ADN entre G2 nucleótido 1362 y G2 nucleótido 1530 en el plásmido pCAMG91 (ver Figura 1) que comprende la forma Gl de AMG. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el sitio Seal del gen de la Ampicilina de pMT838 fue cambiado a un sitio Mlul mediante el uso del siguiente cebador: 7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cae 3' (SEQ. ID. NO: 3) . (Cambiando de este modo el sitio Seal encontrado en el gen de resistencia a la ampicilina y utilizado para cortar a un sitio Mlul) . El vector pMT838 que comprende el gen .AMG en cuestión fue luego utilizado como una plantilla para la polimerasa de ADN y el oligo 7258 (SEQ. ID. NO: 3) y 21401 (SEQ. ID. NO: 4) . El cebador No. 21401 (SEQ. ID. NO: 4) se utilizó como el cebador de selección. 21401: 5'p gg gga tea tga tag gac tag cea tat taa tga agg gca tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3' (Cambia el sitio Seal encontrado en el gen de AMG sin cambiar la secuencia de aminoácidos) . La mutación deseada (por ejemplo, la introducción de un residuo de cisteína) es introducida dentro del gen AMG en cuestión mediante la adición de oligos apropiados que comprenden la mutación deseada. El cebador 107581 fue utilizado para introducir T12P. 107581: 5' pgc aac gaa gcg ecc gtg gct cgt ac 3' (SEQ. ID. NO: 5) .

Las mutaciones son verificadas mediante secuenciamiento del gen completo. El plásmido fue transformado dentro de A . oryza e utilizando el método descrito anteriormente en la sección "Materiales y Métodos". La variante fue fermentada y purificada como se describe anteriormente en la sección de "Materiales y Métodos".

EJEMPLO 2 Construcción, mediante mutagénesis impurificada, aleatoria localizada, de las variantes de AMG de A . ni ger que tienen termoestabilidad mejorada en comparación a la enzima progenitora Para mejorar la termoestabilidad de la mutagénesis aleatoria de .AMG de A . ni ger, se realizó la mutagénesis aleatoria en la región preseleccionada .

Residuo: Región: L19-G35 Región: A353-V374 El software DOPE (ver Materiales y Métodos) se utilizó para determinar los codones inutilizados para cada cambio sugerido en las regiones anteriores, minimizando la cantidad de codones de detención (ver Tabla 1). La distribución exacta de los nucleótidos se calculó en las tres posiciones del codón para dar la población sugerida de los cambios de aminoácidos. Las regiones impurificadas fueron impurificadas específicamente en las posiciones indicadas para tener una alta oportunidad de obtener los residuos deseados, pero todavía permitiendo otras posibilidades. La primera columna es el aminoácido que va a ser mutado, la segunda columna es el porcentaje de tipo silvestre y la tercera columna definió los nuevos aminoácidos.

Tabla 1 Impurificación en L19-G35 L19 90% N N20 95% T N21 Constante 122 Constante G23 95% A A24 90% S,T D25 93% S,T,R G26 95% A A27 90% S,T W28 <80% R,Y V29 Constan .te S30 93% T,N G31 95% A A32 95% V D33 80% R,K,H S34 90% N G35 Constante La hebra de oligonucleótido impurificada resultante se muestra en la Tabla 2 como la hebra en sentido: con la secuencia cebadora, la secuencia nucleotídica de tipo silvestre, la secuencia progenitora de aminoácidos y la distribución de los nucleótidos para cada posición impurificada.

Tabla 2 Posición: 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Sec. de A. a. L N N I G A D G A Cebador: 12T A3T .AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT Sec. De tipo silvestre CTG AAT AAC ATC GGG GCG GAC GGT GCT Posición (cont.: 28 29 30 31 32 33 34 35 Sec. de A. a. (cont.): V S G A D S G Cebador: 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC Sec. de tipo silvestre TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC Distribución de nucleótidos para cada posición impurificada . 1 AlO, C90 2 A6, T94 3 A95, C5 4 G95, C5 5 G91, A3, T3, C3 6 G95, A3, C2 7 G3, A95, C2 8 G92, A4, T4 9 A3, T97 10 G95, T5 11 G3, A97 12 G95, A2, C3 13 T5, C95 14 G88, A8, C4 15 G7, A93 16 G4, C96 17 G4, A96 18 G95, A2, C3 Cebador delantero (SEQ. ID. NO: 6) : FAMGII 5'-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC 12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC- 3' Cebador inverso (SEQ. ID. NO: 7) : RAMG1: 5' -GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3' Tabla 3 Impuriaf.icación en la región A353-V374 : A353 <80% D,E,Q,N,Y L354 90% Q,E Y355 90% N,Q S356 90% T,D,N G357 80% P,A,S,T A358 93% S A359 90% S, T,N T360 90% R,K G361 85% A,S,T T362 90% S Y363 Constante S364 93% D S365 93% N,Q,K S366 93% P,D S367 Constante S368 D,N,T T369 93% Q,E Y370 Constante S371 93% N S372 93% N, T 1373 Constante V374 93% N,Y,H La hebra de oligonucleótido impurificado resultante se muestra en la Tabla 4 como la hebra en sentido: con la secuencia cebadora, la secuencia nucleotídica de tipo silvestre, la secuencia progenitora de aminoácidos y la distribución de los nucleótidos para cada posición impurificada.

Tabla 4 Posición : 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 Sec . de A. a . A L Y S D A A T G T Cebador: 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC Sec. de tipo GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT GGC ACC silvestre Posición: (cont.) 363 364 365 366 367 368 369 370 Sec. de A. a. Y S S S S S T Y ( cont . ) Cebador: (cont.) TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T Sec. de tipo TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT silvestre (cont.) Posición: (cont.) 371 372 373 374 Pos. de A. a. (cont.) S S l V Cebador: ( cont . ) A16T 2930T ATT 313233 Sec. de tipo silvestre AGT AGC ATT GTA ( cont . ) Distribución de nucleótidos para cada posición impurificada . G91, A3, T3, C3 A13, C87 A40, T60 G3, A3, C94 A6, T94 G4, A4, T92 G2, A96, C2 G93, A3.5, C3.5 G87, A8, C5 10: A84, C16 11: G93, T7 12: G92, A5, T3 13: A3, C97 14: G3, A97 15: G2, A2, T4, C92 16: G93, A7 17: G93, C7 18: A90, TÍO 19: G4, A96 20: G95, A5 21: G96, A4 22: G3, C97 23: G2, Al, T95, C2 24: A3, C97 25: G95, A3, C2 26: G2, A96, C2 27: A5, C95 28: A95, T5 29: G2, A98 30: G94, A4, C2 31 : G94, A3, TI, C2 32: A4, T96 33: A20, C80 Cebador: FAMGIV (SEQ. ID. NO: 8) 5' -GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A16T 2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3' Cebador RAMGVI (SEQ. ID. NO: 9) 5'-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3' Mutagénesis aleatoria Los oligonucleótidos inutilizados aparentes de la Tabla 2 y 3 (los cuales por un término común son designados FAMG) y los cebadores inversos RAMG para la región L19-G35 y los cebadores de la SEQ. ID. NO: 2 específicos que cubren el extremo N (FG2: 5' -CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3' (SEQ. ID. NO: 10) y el extremo C (RG2: 5'- CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT (SEQ. ID. NO: 11) se utilizan para generar fragmentos de genoteca por PCR mediante el método de extensión en traslape (Horton et al., Gene, 77 (1989), pp . 61-68) con un traslape de 21 pares de bases. El plásmido pAMGY es la plantilla para la Reacción en Cadena de Polimerasa. Los fragmentos de PCR son clonados mediante recombinación homologa en el vector lanzadera pAMGY de E . col i / levadura (ver Materiales y Métodos) .

Selección La genoteca fue seleccionada en los ensayos de filtro de termoestabilidad utilizando un filtro Protran e incubando a 67-69°C como se describe en la sección anterior "Materiales y Métodos".

EJEMPLO 3 Construcción, mediante el entremezclado de PCR inutilizado con oligos de ADN, de variantes de AMG de A . ni ger que tienen termoestabilidad mejorada en comparación a la enzima progenitora Se utilizó el método de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para preparar los fragmentos de ADN que poseen el gen AMG y las regiones flanqueantes. Se digirieron aproximadamente 10 µg de ADN con ADNasa, y se corrió sobre un gel de agarosa al 2%. Los fragmentos de 50-150 pares de bases se purificaron a partir del gel. Se mezcló aproximadamente 1 µg de fragmentos purificados con un exceso molar de 5 a 15 veces de oligos que poseen las mutaciones deseadas. Los oligos fueron del siguiente tipo (para la construcción de Hklibl, Hklib2, Hklib3, etc., respectivamente) : Hklibl: Hkl-T2X: 5' -ATGTGATTTCCAAGCGCGCGVNNTTGGATTCATGGTTGAGCAA Hkl-N9X: 5' -CCTTGGATTCATGGTTGAGCVNNGAAGCGACCGTGGCTCGTAC Hkl-AllX: 5 ' -ATTCATGGTTGAGCAACGAAVNNACCGTGGCTCGTACTGCCAT Hkl-L66X: 5' -TCCTCAAGACCCTCGTCGATVNNTTCCGAAATGGAGATACCAG Hkl-S386X: 5' -CTTTCGCCGATGGCTTCGTCVNNATTGTGGAAACTCACGCCGC Hkl-E389X: 5 ' -ATGGCTTCGTCTCTATTGTGVNNACTCACGCCGCAAGCAACGG Hkl-T390X: 5' -GCTTCGTCTCTATTGTGGAAVNNCACGCCGCAAGCAACGGCTC Hkl-A393X: 5 ' -CTATTGTGGAAACTCACGCCVNNAGCAACGGCTCCATGTCCGA Hkl-S394X: 5' -TTGTGGAAACTCACGCCGCAVNNAACGGCTCCATGTCCGAGCA Hkl-N395X: 5' -TGGAAACTCACGCCGCAAGCVNNGGCTCCATGTCCGAGCAATA Hkl-G396X: 5 ' -AAACTCACGCCGCAAGCAACVNNTCCATGTCCGAGCAATACGA Hkl-K404X: 5' -CCATGTCCGAGCAATACGACVNNTCTGATGGCGAGCAGCTTTC Hkl-D406X: 5' -CCGAGCAATACGACAAGTCTVNNGGCGAGCAGCTTTCCGCTCG Hkl-E408X: 5' -AATACGACAAGTCTGATGGCVNNCAGCTTTCCGCTCGCGACCT Hkl-L410X: 5 ' -ACAAGTCTGATGGCGAGCAGVNNTCCGCTCGCGACCTGACCT Hkl-L423X: 5' -CCTGGTCTTATGCTGCTCTGVNNACCGCCAACAACCGTCGTAA Hkl-N426X: 5' -ATGCTGCTCTGCTGACCGCCVNNAACCGTCGTAACTCCGTCGTG Hkl-N427X: 5' -CTGCTCTGCTGACCGCCAACVNNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCT Hkl-Y402X: 5' -ACGGCTCCATGTCCGAGCAANNCGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCT Hklib2: Hk2-L234X-SENTID0: 5' -CTGGACCGGCAGCTTCATTNNKGCCAACTTCGATAGCAGCC Hk2-A235S-ANTISENTIDO: 5' -GAACGGCTGCTATCGAAGTTAGACAGAATGAAGCTGCCGGTC Hk2-F237X-SENTIDO: 5' -CAGCTTCATTCTGGCCAACNATGATAGCAGCCGTTCCGGCA Hk2-D238T-ANTISENTIDO: 5' -CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGTGAAGTTGGCCAGAATGAAGC Hk2-D238S-ANTISENTIDO: 5 ' -CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGAGAAGTTGGCCAGAATGAAGC Hk2-S239X-SENTIDO: 5' -TCATTCTGGCCAACTTCGATNNCAGCCGTTCCGGCAAGGACG Hk2-S240G-ANTISENTIDO: 5' -TTGCGTCCTTGCCGGAACGACCGCTATCGAAGTTGGCCAGAA Hk2-S242X-ANTISENTIDO: 5' -GGGTGTTTGCGTCCTTGCCAKNACGGCTGCTATCGAAGTTG Hk2-G243X-ANTISENTID0: 5' -GGAGGGTGTTTGCGTCCTTAKNGGAACGGCTGCTATCGAAG Hk2-K244R-SENTID0: 5' -CGATAGCAGCCGTTCCGGCAGAGACGCAAACACCCTCCTGG Hk2-T310V-ANTISENTIDO: 5' -ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAACGTCCTCAGGGTACCGACCC Hk2-T310S-ANTISENTIDO: 5' -ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAGAGTCCTCAGGGTACCGACCC Hk2-Y311N-SENTID0: 5' -TCGGTACCCTGAGGACACGAATTACAACGGCAACCCGTGGT Hk2-7312Q-ANTISENTID0: 5' -GGAACCACGGGTTGCCGTTTTGGTACGTGTCCTCAGGGTAC Hk2-Y312N-ANTISENTID0: 5' -GGAACCACGGGTTGCCGTTATTGTACGTGTCCTCAGGGTAC Hk2-N313T-SENTIDO: 5' -CCCTGAGGACACGTACTACACTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N313S-SENTIDO: 5 ' -CCCTGAGGACACGTACTACTCTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N313G-SENTIDO: 5'-CCCTGAGGACACGTACTACGGTGGCAACCCGTGGTTCCTGT Hk2-N315Q-ANTISENTIDO: 5' -AGGTGCACAGGAACCACGGTTGGCCGTTGTAGTACGTGTCC Hk2-N315E-ANTISENTID0: 5'-AGGTGCACAGGAACCACGGTTCGCCGTTGTAGTACGTGTCC Hk2-N315R-ANTISENTIDO: 5' -AGGTGCACAGGAACCACGGTCTGCCGTTGTAGTACGTGTCC Hk2-F318Y-ANTISENTIDO: 5' -CGGCAGCCAAGGTGCACAGATACCACGGGTTGCCGTTGTAG Hk2-Q409P-SENTIDO: 5'-CGACAAGTCTGATGGCGAGCCACTTTCCGCTCGCGACCTGA Hklib3: Hk3-D336X-SENTID0 : 5'-CGATGCTCTATACCAGTGGNNKAAGCAGGGGTCGTTGGAGG Hk3-K337X-SENTIDO: 5' -TGCTCTATACCAGTGGGACNNKCAGGGGTCGTTGGAGGTCA Hk3-Q338X-ANTISENTID0 : 5' -CTGTGACCTCCAACGACCCGNNCTTGTCCCACTGGTATAGA Hk3-G339X-SENTIDO: 5 ' -ATACCAGTGGGACAAGCAGNCUTCGTTGGAGGTCACAGATG Hk3-S340X' -ANTISENTIDO: 5' -ACACATCTGTGACCTCCAAANTCCCCTGCTTGTCCCACTGG Hk3-S340X' ' -ANTISENTIDO: 5'-ACACATCTGTGACCTCCAAANCCCCCTGCTTGTCCCACTGG Hk3-L341X-SENTID0: 5' -GTGGGACAAGCAGGGGTCGNUUGAGGTCACAGATGTGTCGC Hk3-K352Q-SENTID0: 5'-TGTGTCGCTGGACTTCTTCCAAGCACTGTACAGCGATGCTG Hk3-K352R-SENTID0: 5' -TGTGTCGCTGGACTTCTTCAGAGCACTGTACAGCGATGCTG Hk3-A353D-ANTISENTID0: 5' -TAGCAGCATCGCTGTACAGATCCTTGAAGAAGTCCAGCGAC Hk3-A353S-ANTISENTIDO: 5' -TAGCAGCATCGCTGTACAGAGACTTGAAGAAGTCCAGCGAC Hk3-S356P-SENTID0: 5' -ACTTCTTCAAGGCACTGTACCCAGATGCTGCTACTGGCACCT Hk3-S356N-SENTID0: 5' -ACTTCTTCAAGGCACTGTACAAUGATGCTGCTACTGGCACCTA Hk3-S356D-SENTIDO: 5' -ACTTCTTCAAGGCACTGTACGAUGATGCTGCTACTGGCACCTA Hk3-D357S-ANTISENTID0: 5' -GAGTAGGTGCCAGTAGCAGCAGAGCTGTACAGTGCCTTGAAGA Hk3-A359S-SENTIDO: 5 ' -GGCACTGTACAGCGATGCTTCTACTGGCACCTACTCTTCGT Hk3-T360V-ANTISENTIDO: 5' -TGGACGAAGAGTAGGTGCCAACAGCAGCATCGCTGTACAGT Hk3-G361X-SENTIDO: 5' -TGTACAGCGATGCTGCTACTNCTACCTACTCTTCGTCCAGTTC Hk3-T362R-ANTISENTIDO: 5 ' -GTCG.AACTGGACGAAGAGTATCTGCCAGTAGCAGCATCGCTG Hk3-S364X-SENTIDO: 5' -TGCTGCTACTGGCACCTACNNKTCGTCCAGTTCGACTTATAG Hk3-S365X-SENTIDO: 5' -TGCTACTGGCACCTACTCTNNKTCCAGTTCGACTTATAGTAG Hk3-S366T-ANTISENTIDO: 5' -ATGCTACTATAAGTCGAACTAGTCGAAGAGTAGGTGCCAGTA Hk3-S368X-ANTISENTID0: 5' -TCTACAATGCTACTATAAGTAGNACTGGACGAAGAGTAGGTG Hk3-T369X-SENTIDO: 5' -CTACTCTTCGTCCAGTTCGNNKTATAGTAGCATTGTAGATGCC Hk3-S371X-ANTISENTIDO: 5' -TTCACGGCATCTACAATGCTATNATAAGTCGAACTGGACGAAG Hk3-S372X-SENTID0: 5' -CGTCCAGTTCGACTTATAGTNNTATTGTAGATGCCGTGAAGAC A la mezcla de ADN tratado con ADNasa y los oligos, se agregaron los nucleótidos, amortiguador de PCR y la polimerasa Taq/Pwo. Se realizó una reacción de ensamblaje de PCR, utilizando primeramente 94°C por 2 minutos, luego 35-40 ciclos con los siguientes tiempos de incubación: 94°C, 30 segundos; 45°C, 30 segundos; 72°C, 60 segundos; luego finalmente 72°C por 5 minutos. Se realizó una reacción de amplificación de PCR con 1 µl de la reacción de ensamblaje como plantilla, y agregando los cebadores que se recocen a las regiones que flanquean el gen AMG. Parámetros: primeramente 94°C por 2 minutos, luego 35-40 ciclos con los siguientes tiempos de incubación: 94°C, 30 segundos; 55°C, 30 segundos; 72°C, 90 segundos; luego finalmente 72°C por 10 minutos. El producto de PCR resultante fue purificado a partir de un gel de agarosa al 1%, mezclado con el vector linearizado y transformado dentro de células de levadura competentes, como se describe anteriormente.

EJEMPLO 4 Actividad Específica Las variantes G2 de AMG fueron construidas como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. La actividad específica como kcat se midió sobre las muestras purificadas a pH 4.3, 37°C, utilizando maltosa y maltoheptosa como sustrato como se describe en la sección anterior de "Materiales y Métodos". La actividad específica como AGU/mg se midió también a pH 4.3, 37°C, utilizando maltosa como sustrato como se describe en la sección "Materiales y Métodos" anterior.

EJEMPLO 5 Termoestabilidad a 70°C Una variante S119P de G2 de AMG fue construida utilizando el procedimiento descrito en el Ej emplo 1. La termoestabilidad fue determinada como T1/2 utilizando el Método I, y como la actividad residual porcentual después de la incubación por 30 minutos en NaOAc 50 mM, pH 4.5, 70°C, 0.2 AGU/ml, como se describe en la sección "Materiales y Métodos" anterior. Los resultados de las pruebas se listan en la tabla siguiente y se comparan al G2 de AMG de Aspergi l l us ni ger de tipo silvestre.

EJEMPLO 6 Termoestabilidad a 68°C Las variantes G2 de AMG fueron construidas utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, excepto para las variantes Nos. 1 y 2 en la Tabla siguiente, las cuales fueron preparadas mediante el entremezclado como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.). La termoestabilidad se determinó como T1/2 utilizando el Método I a 68°C como se describe en la sección "Materiales y Métodos" y se comparó a G2 de .AMG de A . ni ger de tipo silvestre bajo las mismas condiciones. La evaluación de las variantes se realizó sobre caldo de cultivo después de la filtración de los sobrenadantes.

Termoestabilidad a 70 C sobre muestras purificadas EJEMPLO 7 Termoestabilidad a 68°C Las variantes G2 de AMG fueron construidas mediante entremezclado utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, seguido por el entremezclado de las variantes positivas.

La termoestabilidad fue determinada como T? 2 utilizando el Método I a 68°C como se describe en la sección "Materiales y Métodos" y comparada a G2 de AMG de A . ni ger de tipo silvestre bajo las mismas condiciones. La evaluación de las variantes se realizó sobre caldo de cultivo después de la filtración de los sobrenadantes. i = extensión N-terminal EJEMPLO 8 Termoestabilidad a 68°C Las variantes G2 de AMG fueron construidas utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3. La termoestabilidad se determinó como ?/2 utilizando el Método I a 68°C como se describe en la sección "Materiales y Métodos" y comparada a G2 de AMG de A . Ní ger tipo silvestre, bajo las mismas condiciones. La evaluación de las variantes se realizó sobre caldo de cultivo después de la filtración de los sobrenadantes.

EJEMPLO 9 Termoestabilidad a 70°C Una variante G2 de AMG se construyó utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, y se evaluó como muestras semi-purificadas (filtración del caldo de cultivo seguido por desalación sobre una columna G-25). La termoestabilidad se determinó como la actividad residual porcentual utilizando el Método I en acetato de sodio 50 mM, pH 4.5, 70°C, como se describe en la sección "Materiales y Métodos" anterior. El resultado de la prueba se lista en la Tabla siguiente y se compara a G2 de AMG de A . ni ger de tipo silvestre.

EJEMPLO 10 Termoestabilidad a 70°C en presencia de 30% de glucosa Las variantes de G2 de AMG fueron construidas utilizando el procedimiento descrito en el Ej emplo 3. La termoestabilidad se determinó como T? 2 utilizando el Método II a 70°C como se describe en la sección "Materiales y Métodos" anterior y se comparó a G2 de AMG de A . ni ger de tipo silvestre bajo las mismas condiciones.

EJEMPLO 11 Funcionamiento de sacarificación de las variantes de AMG S119P+Y402F+S411V PLASD (N- terminal) +V59A+A393R+T490A, respectivamente El funcionamiento de sacarificación de las variantes de AMG S119P+Y402F+S411V y PLASD(N- terminal) +V59A+A393R+T490A, respectivamente, teniendo ambas termoestabilidad mejorada, se probaron a 70°C como se describe más adelante. La enzima de referencia es la G2 de AMG de A . ni ger de tipo silvestre. La sacarificación es corrida bajo las mismas condiciones: Sustrato Maltodextrina 10 DE, Aproximadamente 30% DS (p/p) temperatura 70°C pH inicial 4.3 (a 70°C) Dosis de enzima 0.24 AGU/g DS Sacarificación El sustrato para la sacarificación es elaborado mediante la disolución de maltodextrina (preparada a partir de maíz común) en agua Milli-Q a ebullición y ajustando la sustancia anhidra aproximadamente a 30% (p/p) . El pH se ajusta a 4.3. Alícuotas del sustrato correspondiente a 15 g de sólidos secos se transfieren a matraces de vidrio de 50 ml con tapa azul, y se colocan en un baño de agua con agitación. Se agregan las enzimas y el pH se reajusta si es necesario. El experimento es corrido por duplicado. Se toman muestras periódicamente y se analizan mediante HPLC para la determinación de la composición de carbohidratos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención . 1 LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: NOVO NORDISK A/S (B) CALLE: Novo Alié (C) CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd (E) PAÍS: Dinamarca (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : DK-2880 (G) TELÉFONO: +45 4444 8888 (H) FAX: +45 4449 3256 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de glucoamilasa (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 81 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disquete (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0 Versión #1.25 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1605 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADNc" (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) CEPA: Aspergillus niger (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: sig_péptido (B) LOCALIZACIÓN: 1..72 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACIÓN: 73..1602 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..1602 ( xi ) DE S CRI PC I ÓN DE LA S ECU ENC IA : S EQ I D NO : 1 ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC ACA GGG 48 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly -24 -20 - 15 - 10 TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC GCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC 96 Leu Ala Asn Val lie Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser -5 1 5 AAC GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GCC ATC CTG AAT AAC ATC GGG GCG 144 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala He Leu Asn Asn He Gly Ala 10 15 20 GAC GGT GCT TGG GTG TCG GGC GCG GAC TCT GGC ATT GTC GTT GCT AGT 192 Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Aep Ser Gly He Val Val Ala Ser 25 30 35 40 CCC AGC ACG GAT AAC CCG GAC TAC TTC TAC ACC TGG ACT CGC GAC TCT 240 Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser 45 50 55 GGT CTC GTC CTC AAG ACC CTC GTC GAT CTC TTC CGA AAT GGA GAT ACC 288 Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr 60 65 70 AGT CTC CTC TCC ACC ATT GAG AAC TAC ATC TCC GCC CAG GCA ATT GTC 336 Ser Leu Leu Ser Thr He Glu Asn Tyr He Ser Ala Gln Ala He Val 75 80 85 CAG GGT ATC AGT AAC CCC TCT GGT GAT CTG TCC AGC GGC GCT GGT CTC 384 Gln Gly He Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 90 95 100 GGT GAA CCC AAG TTC AAT GTC GAT GAG ACT GCC TAC ACT GGT TCT TGG 432 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 105 110 115 120 GGA CGG CCG CAG CGA GAT GGT CCG GCT CTG AGA GCA ACT GCT ATG ATC 480 Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met He 125 130 135 GGC TTC GGG CAG TGG CTG CTT GAC AAT GGC TAC ACC AGC ACC GCA ACG 528 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr 140 145 150 GAC ATT GTT TGG CCC CTC GTT AGG AAC GAC CTG TCG TAT GTG GCT CAÁ 576 Asp He Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln 155 160 165 TAC TGG AAC CAG ACA GGA TAT GAT CTC TGG GAA GAA GTC AAT GGC TCG 624 Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser 170 175 180 TCT TTC TTT ACG ATT GCT GTG CAÁ CAC CGC GCC CTT GTC GAA GGT AGT 672 Ser Phe Phe Thr He Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser 185 190 195 200 GCC TTC GCG ACG GCC GTC GGC TCG TCC TGC TCC TGG TGT GAT TCT CAG 720 Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cye Asp Ser Gln 205 210 215 GCA CCC GAA ATT CTC TGC TAC CTG CAG TCC TTC TGG ACC GGC AGC TTC 768 Ala Pro Glu He Leu Cye Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe 220 225 230 ATT CTG GCC AAC TTC GAT AGC AGC CGT TCC GGC AAG GAC GCA AAC ACC 816 He Leu Ala Aen Phe Aep Ser Ser Arg Ser Gly Lys Aep Ala Asn Thr 235 240 245 CTC CTG GGA AGC ATC CAC ACC TTT GAT CCT GAG GCC GCA TGC GAC GAC 864 Leu Leu Gly Ser He Hie Thr Phe .Aep Pro Glu Ala Ala Cye Asp Asp 250 255 260 4 TCC ACC TTC CAG CCC TGC TCC CCG CGC GCG CTC GCC AAC CAC AAG GAG 912 Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu 265 270 275 280 GTT GTA GAC TCT TTC CGC TCA ATC TAT ACC CTC AAC GAT GGT CTC AGT 960 Val Val Asp Ser Phe Arg Ser He Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser 285 290 295 GAC AGC GAG GCT GTT GCG GTG GGT CGG TAC CCT GAG GAC ACG TAC TAC 1008 Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr 300 305 310 AAC GGC AAC CCG TGG TTC CTG TGC ACC TTG GCT GCC GCA GAG CAG TTG 1056 Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu 315 320 325 TAC GAT GCT CTA TAC CAG TGG GAC AAG CAG GGG TCG TTG GAG GTC ACA 1104 Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr 330 335 340 GAT GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG GCA CTG TAC AGC GAT GCT GCT ACT 1152 Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr 345 350 355 360 GGC ACC TAC TCT TCG TCC AGT TCG ACT TAT AGT AGC ATT GTA GAT GCC 1200 Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser He Val Asp Ala 365 370 375 GTG AAG ACT TTC GCC GAT GGC TTC GTC TCT ATT GTG GAA ACT CAC GCC 1248 Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser He Val Glu Thr His Ala 380 385 390 GCA AGC AAC GGC TCC ATG TCC GAG CAÁ TAC GAC AAG TCT GAT GGC GAG 1296 Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lye Ser Asp Gly Glu 395 400 405 CAG CTT TCC GCT CGC GAC CTG ACC TGG TCT TAT GCT GCT CTG CTG ACC 1344 Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr 410 415 420 GCC AAC AAC CGT CGT AAC TCC GTC GTG CCT GCT TCT TGG GGC GAG ACC 1392 Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr 425 430 435 440 TCT GCC AGC AGC GTG CCC GGC ACC TGT GCG GCC ACA TCT GCC ATT GGT 1440 Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cye Ala Ala Thr Ser Ala He Gly 445 450 455 ACC TAC AGC AGT GTG ACT GTC ACC TCG TGG CCG AGT ATC GTG GCT ACT 1488 Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser He Val Ala Thr 460 465 470 GGC GGC ACC ACT ACG ACG GCT ACC CCC ACT GGA TCC GGC AGC GTG ACC 1536 Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr 475 480 485 TCG ACC AGC AAG ACC ACC GCG ACT GCT AGC AAG ACC AGC ACC ACG ACC 1584 Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr 490 495 500 CGC TCT GGT ATG TCA CTG TGA 1605 Arg Ser Gly Met Ser Leu 505 510 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 534 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly -24 -20 -15 -10 Leu Ala Asn Val He Ser Lye Arg Ala Thr Leu Aep Ser Trp Leu Ser -5 1 5 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala He Leu Asn Asn He Gly Ala 10 15 20 Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly He Val Val Ala Ser 25 30 35 40 Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Aep Ser 45 50 55 Gly Leu Val Leu Lye Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr 60 65 70 Ser Leu Leu Ser Thr He Glu Asn Tyr He Ser Ala Gln Ala He Val 75 80 85 Gln Gly He Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 90 95 100 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 105 110 115 120 Gly .Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met He 125 130 135 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr 140 145 150 Asp He Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln 155 160 165 Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser 170 175 180 Ser Phe Phe Thr He Ala Val Gln Hie Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser 185 190 195 200 Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cye Asp Ser Gln 205 210 215 Ala Pro Glu He Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe 220 225 230 He Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr 235 240 245 Leu Leu Gly Ser He His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp 250 255 260 Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu 265 270 275 280 Val Val Asp Ser Phe Arg Ser He Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser 285 290 295 Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr 300 305 310 Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu 315 320 325 Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr 330 335 340 Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr 345 350 355 360 Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser He Val Asp Ala 365 370 375 Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser He Val Glu Thr His Ala 380 385 390 Ala Ser Aen Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Aep Lys Ser Asp Gly Glu 395 400 405 Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ma Ala Leu Leu Thr 410 415 420 Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr 425 430 435 440 Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala He Gly 445 450 455 Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser He Val Ala Thr 460 465 470 Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr 475 480 485 Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr 490 495 500 .Arg Ser Gly Met Ser Leu 505 510 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: misc-caracteristica (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador 7258" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3 gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 68 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 9 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/ CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador 21401" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 ggggatcatg ataggactag ccatattaat gaagggcata taccacgcct tggacctgcg ttatagee 68 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador 107581' (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5 gcaaegaage gcccgtggct cgtac 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 109 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador FAMGII' (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características (B) LOCALIZACIÓN: 30,33,42,44,47,48,51,53,56,57,58 62, 63, 66, 69, 71, 72, 73,74, 75 10 (D) OTRA INFORMACIÓN: /Nota= 1: A10,C90 2: A6, T94 3: A95,C5 4: G95,C5 5: G91,A3,T3,C3 6: G95,A3,C2 7: G3,A95,C2 8: G92,A4,T4 9: A3,T97 10: C95,T5 11: G3,A97 12: G95,A2,C3 13: T5,C95 14: G88,A8,C4 15: G7,A93 16: G4,C96 17: G4,A96 18: G95,A2,C3 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6 CGAAGCGACC GTGGCTCGTA CTGCCATC12 TA3TAACATC G4G5CG67CG 4T8CT91010GT Gl 112CG4CG13G 1415161718TGGCA TTGTCGTTGC TAGTCCCAGC ACGGATAAC 109 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador RAMG1" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7 GATGGCAGTA CGAGCCACGG TCGCTTCG 28 11 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 110 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador FAMGIV (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características LOCALI ZACIÓN: 22, 23, 24, 25, 26, 28, 31, 32, 34, 35, 37, 40, 1, 43, 44, 46, 47, 49, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 67, 68, 70, 71, 74, 77, 79, 80, 85, 86, 87 (D) OTRA INFORMACIÓN: /Nota= : G91,A3,T3,C3 : A13, C87 : A40,T60 : G3,A3,C94 : A6,T94 : G4,A4,T92 : G2,A96,C2 : G93,A3.5,C3.5 : G87,A8,C5 0: A84,C16 1: G93,T7 2: G92,A5,T3 3: A3,C97 4: G3,A97 5: G2,A2,T4,C92 6: G93,A7 7: G93,C7 8: A90,T10 9: G4,A96 0: G95,A5 1: G96,A4 2: G3,C97 12 23: G2,A1,T95,C2 24: A3,C97 25: G95,A3,C2 26: G2,A96,C2 27: A5,C95 28: A95,T5 29: G2,A98 30: G94,A4,C2 31: G94,A3,T1,C2 32: A4,T96 33: A20,C80 (ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8 GTGTCGCTGG ACTTCTTCAA G12345A6AC 78C910T11CT12 13T1415A1617C18C CTAC1920TA2122 2324CAGT1425C26 27GT28TA16T2930 CATT313233GAT GCCGTGAAGA CTTTCGCCGA 110 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: mise-caracter sticas: (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador RAMGVI" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9 CTTGAAGAAG TCCAGCGACA C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /desc = "Cebador FG2" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: CATCCCCAGG ATCCTTACTC AGCAATG 27 13 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS (A) NOMBRE/CLAVE: mise-características: (B) OTRA INFORMACIÓN: /des = "Cebador RG2" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: CTCAAACGAC TCACCAGCCT CTAGAGT 27 <210> 12 <211> 2602 <213> ADN <213> Aspergillus niger <220> <221> sig_péptido <222> (270) ... (323) <221> mat_péptido <222> (342) ... (2438) <221> intrón <222> (484) ... (558) <221> intrón <222> (846) ... (900) <221> intrón <222> (998) ... (1058) <221> intrón <222> (1697) ... (1754) <400> 12 14 ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa actgaagagc ttgaagtggc gagatgtctc 60 tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt gatgcatgtg 120 cttcttcctt cagcttcccc tcgtgcgagt gaggtttggc tataaattga agtggttggt 180 cggggttccg tgaggggctg aagtgcttcc tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc 240 ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg 300 gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt 360 tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg 420 cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg 480 actgtatgtt tcgagctcag atttagtatg agtgtgtcat tgattgattg atgctgactg 540 gcgtgtcgtt tgttgtagac ttctacacct ggactcgcga ctctggtctc gtcctcaaga 600 ccctcgtcga tctcttccga aatggagata ccagtctcct ctccaccatt gagaactaca 660 tctccgccca ggcaattgtc cagggtatca gtaacccctc tggtgatctg tccagcggcg 720 ctggtctcgg tgaacccaag ttcaatgtcg atgagactgc ctacactggt tcttggggac 780 ggccgcagcg agatggtccg gctctgagag caactgctat gatcggcttc gggcagtggc 840 tgcttgtatg ttctccaccc ccttgcgtct gatctgtgac atatgtagct gactggtcag 900 gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc ccctcgttag gaacgacctg 960 tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatggtg tgtttgtttt attttaaatt 1020 tccaaagatg cgccagcaga gctaacccgc gatcgcagat ctctgggaag aagtcaatgg 1080 ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt gtcgaaggta gtgccttcgc 1140 gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag gcacccgaaa ttctctgcta 1200 cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac ttcgatagca gccgttccgg 1260 caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt gatcctgagg ccgcatgcga 1320 cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc aaccacaagg aggttgtaga 1380 ctctttccgc tcaatctata ccctcaacga tggtctcagt gacagcgagg ctgttgcggt 1440 gggtcggtac cctgaggaca cgtactacaa cggcaacccg tggttcctgt gcaccttggc 1500 tgccgcagag cagttgtacg atgctctata ccagtgggac aagcaggggt cgttggaggt 1560 cacagatgtg tcgctggact tcttcaaggc actgtacagc gatgctgcta ctggcaccta 1620 ctcttcgtcc agttcgactt atagtagcat tgtagatgcc gtgaagactt tcgccgatgg 1680 cttcgtctct attgtggtaa gtctacgcta gacaagcgct catgttgaca gagggtgcgt 1740 actaacagaa gtaggaaact cacgccgcaa gcaacggctc catgtccgag caatacgaca 1800 agtctgatgg cgagcagctt tccgctcgcg acctgacctg gtcttatgct gctctgctga 1860 ccgccaacaa ccgtcgtaac tccgtcgtgc ctgcttcttg gggcgagacc tctgccagca 1920 gcgtgcccgg cacctgtgcg gccacatctg ccattggtac ctacagcagt gtgactgtca 1980 cctcgtggcc gagtatcgtg gctactggcg gcaccactac gacggctacc cccactggat 2040 ccggcagcgt gacctcgacc agcaagacca ccgcgactgc tagcaagacc agcaccagta 2100 cgtcatcaac ctcctgtacc actcccaccg ccgtggctgt gactttcgat ctgacagcta 2160 ccaccaccta cggcgagaac atctacctgg tcggatcgat ctctcagctg ggtgactggg 2220 aaaccagcga cggcatagct ctgagtgctg acaagtacac ttccagcgac ccgctctggt 2280 15 atgtcactgt gactctgccg gctggtgagt cgtttgagta caagtttatc cgcattgaga 2340 gcgatgactc cgtggagtgg gagagtgatc ccaaccgaga atacaccgtt cctcaggcgt 2400 gcggaacgtc gaccgcgacg gtgactgaca cctggcggtg acaatcaatc catttcgcta 2460 tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc atgtatgtag tgggtgtgca 2520 taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat cgaccgacgg aattgaggat 2580 atccggaaat acagacaccg gg 2602 <210> SEQ ID NO: 13 <211> LONGITUD: 640 <212> TIPO: PRT <213> ORGANISMO: Aspergillus niger <400> SEQ ID NO: 13 Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly 1 5 10 15 Leu Ala Asn Val He Ser Lye Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser 20 25 30 Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala He Leu Asn Asn He Gly Ala 35 40 45 Aep Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly He Val Val Ala Ser 50 55 60 Pro Ser Thr Asp Aen Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Aep Thr 85 90 95 Ser Leu Leu Ser Thr He Glu Asn Tyr He Ser Ala Gln Ala He Val 100 105 110 Gln Gly He Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu 115 120 125 Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp 130 135 140 Gly Arg Pro GIn Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met He 145 150 155 160 Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr 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Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hkl-N426X <400> SEQ ID NO: 30 atgctgctct gctgaccgcc vnnaacegtc gtaactccgt cgtg 44 <210> SEQ ID NO: 31 <211> LONGITUD: 44 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hkl-N427X 23 <400> SEQ ID NO: 31 CTGCTCTGCT GACCGCCAAC VNNCGTCGTA ACTCCGTCGT GCCT 44 <210> SEQ ID NO: 32 <211> LONGITUD: 46 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hkl-Y402X <400> SEQ ID NO: 32 ACGGCTCCAT GTCCGAGCAA NNCGACAAGT CTGATGGCGA GCAGCT 46 <210> SEQ ID NO: 33 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk2-L234X-sentido <400> SEQ ID NO: 33 ctggaccggc agcttcattn nkgccaactt cgatagcagc c 41 <210> SEQ ID NO: 34 <211> LONGITUD: 42 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS < 22 3 > OT RA IN FORMAC I ÓN : cebador 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Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN : cebador Hk2-N315Q-antisentido <400> SEQ I D NO : 51 aggtgca cag gaa ccacggt tggccgttgt agta cgtgtc c 4 1 <210> SEQ ID NO: 52 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN : cebador Hk2-N315E-antisentido <400 > SEQ I D NO : 52 aggtgcacag gaacca cggt t cgccgttgt agtacgtgtc c 4 1 <210> SEQ I D NO : 53 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial 30 <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk2-N315R-antisentido <400> SEQ ID NO: 53 aggtgacag gaaccacggt ctgccgttgt. agtacgtgtc c 41 <210> SEQ ID NO: 54 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk2-F318Y-antisentido <400> SEQ ID NO: 54 cggcagccaa ggtgcacaga taccacgggt tgccgttgta g 41 <210> SEQ ID NO: 55 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk2-Q409P-sentido <400> SEQ ID NO: 55 cgacaagtct gatggcgagc cactttccgc tcgcgacctg a 41 <210> SEQ ID NO: 56 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-D336X- sentido 31 <400> SEQ ID NO: 56 cgatgctcta taccagtggn nkaagcaggg gtcgttggag g 41 <210> SEQ ID NO: 57 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-K337X-sentido <400> SEQ ID NO: 57 tgctctatac cagtgggacn nkcaggggtc gttggaggtc a 41 <210> SEQ ID NO: 58 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACI ÓN : cebador Hk3-Q338X-antisentido < 400> SEQ I D NO : 58 ctgtgacct c caa cgacccg nncttgtccc actggtatag a 4 1 <210> SEQ ID NO: 59 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-G339X-sentido 32 <400> SEQ ID NO: 59 ataccagtgg gacaagcagn cutcgttgga ggtcacagat g 41 <210> SEQ ID NO: 60 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S340X-antisentido <400> SEQ ID NO: 60 acacatctgt gacctccaaa ntcccctgct tgtcccactg g 41 <210> SEQ ID NO: 61 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S340C-antisentido <400> SEQ ID NO: 61 acacatctgt gacctccaaa nccccctgct tgtcccactg g 41 <210> SEQ ID NO: 62 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-L34 lX-sentido <400> SEQ ID NO: 62 gtgggacaag caggggtcgn uugaggtcac agatgtgtcg c 41 33 <210> SEQ ID NO: 63 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-K352Q-sentido <400> SEQ ID NO: 63 tgtgtcgctg gacttcttcc aagcactgta cagcgatgct g 41 <210> SEQ ID NO: 64 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-K352R-sentido <400> SEQ ID NO: 64 tgtgtcgctg gacttcttca gagcactgta cagcgatgct g 41 <210> SEQ ID NO: 65 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN : cebador Hk3-A352D-antisentido <400> SEQ I D NO : 65 tagcagcatc gctgtacaga t ccttgaaga agt ccagcga c 4 1 <210> SEQ ID NO: 66 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN 34 <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN : cebador Hk3-A353S-antisentido < 400> SEQ I D NO : 66 tagcagcatc gctgtacaga gacttgaaga atccagcga c 4 1 <210> SEQ ID NO: 67 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S356P-sentido <400> SEQ ID NO: 67 acttcttcaag gcactgtacc cagatgctgc tactggcacc t 41 <210> SEQ ID NO: 68 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S356N-sentido <400> SEQ ID NO: 68 acttcttcaa ggcactgtac aaugatgctg ctactggcac cta 43 <210> SEQ ID NO: 69 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial 35 <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S356X-sentido <400> SEQ ID NO: 69 acttcttcaa ggcactgtac gaugatgctg ctactggcac cta 43 <210> SEQ ID NO: 70 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223 > OTRA I N FORMACI ÓN : cebador Hk3-D357S-antisentido < 4 00 > S EQ I D NO : 7 0 gagtaggtgc cagtagcagc agagctgtac agtgccttga aga 43 <210> SEQ ID NO: 71 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-A359S-sentido <400> SEQ ID NO: 71 ggcactgtac agcgatgctt ctactggcac ctactcttcg t 41 <210> SEQ ID NO: 72 <211> LONGITUD: 41 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223 > OTRA INFORMACI ÓN : cebador Hk3-T360V-antisentido 36 <400> SEQ ID NO: 72 tggacgaaga gtaggtgcca acagcagcat cgctgtacag t 41 <210> SEQ ID NO: 73 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-G361X-sentido <400> SEQ ID NO: 73 tgtacagcga tgctgctact nctacctact cttcgtccag ttc 43 <210> SEQ ID NO: 74 <211> LONGITUD: 42 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <22 3 > OTRA IN FORMAC I ÓN : cebador Hk3-T362R-antisentido < 4 00 > S EQ I D NO : 74 gtcgaactgg acgaagagta tctgccagta gcagcatcgc tg 42 <210> SEQ ID NO: 75 <211> LONGITUD: 42 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S364X-sentido <400> SEQ ID NO: 75 tgctgctact ggcacctacn nktcgtccag ttcgacttat ag 42 37 <210> SEQ ID NO: 76 <211> LONGITUD: 42 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S365X-sentido <400> SEQ ID NO: 76 tgctactggc acctactctn nktccagttc gacttatagt ag 42 <210> SEQ ID NO: 77 <211> LONGITUD: 42 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S366T-antisentido <400> SEQ ID NO: 77 atgctactat aagtcgaact agtcgaagag taggtgccag ta 42 <210> SEQ ID NO: 78 <211> LONGITUD: 42 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S368X-antisentido <400> SEQ ID NO: 78 tctacaatgc tactataagt agnactggac gaagagtagg tg 42 38 <210> SEQ ID NO: 79 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-T369X-sentido <400> SEQ ID NO: 79 ctactcttcg tccagttcgn nktatagtag cattgtagat gcc 43 <210> SEQ ID NO: 80 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223 > OTRA INFORMACI ÓN : cebador Hk3-S371X-antisentido < 4 00 > S EQ I D NO : 8 0 ttcacggcat ctacaatgct atnataagtc gaactggacg aag 43 <210> SEQ ID NO: 81 <211> LONGITUD: 43 <212> TIPO: ADN <213> ORGANISMO: Secuencia Artificial <220> CARACTERÍSTICAS: <223> OTRA INFORMACIÓN: cebador Hk3-S372X-sentido <400> SEQ ID NO: 81 cgtccagttc gacttatagt nntattgtag atgccgtaa gac 43

Claims

134 RE IVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una variante de una glucoamilasa progenitora, caracterizada porque comprende una o más mutaciones en las siguientes posiciones o regiones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2: Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 40-62, Región: 73-80, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 388-414, Región: 445-470, 135 y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa que muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2, con la excepción de las siguientes sustituciones: N20C, A27C, S30P, Y48 , Y50F, W52F, R54K/L, D55G/V, G57A, K108R, D112Y, Y116A/W, SI 19C/W/E/G/Y/P, W120H/L/F/Y, G121T/A, R122Y, P123G, Q124H, R125K, W170F, N171S, Q172N, T173G, G174C, Y175F, D176N/E, L177H/D, W178R/D, E179Q/D, E180D/Q, V181D/A/T, NI 82A/D/Q/Y/S, G183K, S184H, W212F, R241K, A246C, D293E/Q, A302V, R305K, Y306F, D309N/E, Y312W, W317F, E389D/Q, H391 , A392D, A393P, N395Q, G396S, E400Q/C, Q401E, G407D, E408P, L410F, S411A/G/C/H/D, S460P.

2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende una o más de las siguientes mutaciones: AlV, T2E/P/Q/R/H/M, L3P/N, N9A, A11P/E, I18V, L19N, N20T, G23A, A24S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N, S40C, T43R, T51D/S, T53D, S56A/C, V59T/A, L60A, N93T, P94V, S95N, D97S, L98P/S, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A, N182E, A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, 136 G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, 212N/A/T, A246T, Y312Q, N313T/S/G, A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/ /Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/ /Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G, T390R, A393R, S394R/P, M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, L410I/R, S411V, A412C, D414A, G447S, S465P.

3. Una variante de una glucoamilasa progenitora con termoestabilidad mejorada, caracterizada porque comprende una o más mutaciones en las siguientes posiciones o regiones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2 : Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 73-80, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, 137 Región: 287-319, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 388-414, Región: 445-470, y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa que muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2, con la excepción de las siguientes sustituciones: N20C, A27C, S30P, A246C.

4. Una variante de una glucoamilasa progenitora con actividad específica incrementada, caracterizada porque comprende una o más mutaciones en las siguientes posiciones o regiones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2: Región: 1-18, Región: 40-62, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 388-414, 138 y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa la cual muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2, con la excepción de las siguientes sustituciones: S411G.

5. La variante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque tiene una o más mutaciones en las siguientes regiones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2: Región: 287-300, Región: 305-319, y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa que muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2.

6. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque la glucoamilasa homologa progenitora es la glucoamilasa Gl de Aspergi l l us ni ger . 139

7. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la glucoamilasa es una glucoamilasa truncada, en particular en el extremo C.

8. Una construcción de ADN, caracterizada porque comprende una secuencia de ADN que codifica para una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque posee una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 8.

10. Una célula, caracterizada porque es transformada con una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 8 o un vector de conformidad con la reivindicación 9.

11. Una célula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque es un microorganismo, tal como una bacteria o un hongo. 140

12. La célula de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque es un Aspergill us oryzae o Aspergill us ni ger deficiente en proteasa .

13. Un proceso para la conversión de almidón o almidón parcialmente hidrolizado en un jarabe que contiene dextrosa, el proceso está caracterizado porque incluye el paso de sacarificar el hidrolizado de almidón en presencia de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la dosis de glucoamilasa está presente en el intervalo de 0.05 a 0.5 AGU por gramo de sólidos secos.

15. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque comprende la sacarificación de un hidrolizado de almidón de al menos 30 por ciento en peso de sólidos secos. 141

16. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sacarificación es conducida en presencia de una enzima de desramificación seleccionada del grupo de pululanasa e isoamilasa, preferentemente una pululanasa derivada de Ba ci l l us a ci dopull ulyti cus o Bacill us derami fi cans o una isoamilasa derivada de Pseudomonas amyl oderamosa .

17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sacarificación es conducida a un pH de 3 a 5.5 y a una temperatura de 60-80°C, preferentemente 63-75°C, por 24 a 72 horas, preferentemente por 36-48 horas a un pH de 4 a 4.5.

18. Un método de sacarificación de una solución de almidón licuada, caracterizado el método porque comprende: (i) un paso de sacarificación durante el cual tiene lugar una o más etapas de sacarificación enzimática, y el paso subsecuente de: (ii) uno o más pasos de separación en membrana a alta temperatura 142 en donde la sacarificación enzimática se lleva a cabo utilizando una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

19. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso para la conversión de almidón.

20. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso de conversión continua de almidón.

21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el proceso de conversión continuo de almidón incluye un proceso de sacarificación continuo de conformidad con la reivindicación 18.

22. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso para la producción de oligosacáridos. 143

23. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso para la producción de jarabes de especialidad.

24. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso para la producción de etanol para combustible.

25. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso para la producción de una bebida.

26. El uso de una variante de glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en un proceso de fermentación para la producción de compuestos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, lisina, ácido glutámico .

27. Un método para mejorar la termoestabilidad y/o para incrementar la actividad específica de una glucoamilasa progenitora, caracterizado porque la mejora se efectúa al 144 realizar una mutación en una o más de las siguientes posiciones o regiones en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2: Región: 1-18, Región: 19-35, Región: 40-62, Región: 73-80, Región: 93-127, Región: 170-184, Región: 200-212, Región: 234-246, Región: 287-319, Región: 334-341, Región: 353-374, Región: 388-414, Región: 445-470, y/o en una posición o región correspondiente en una glucoamilasa homologa que muestra al menos 60% de homología con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. NO: 2.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque tiene una o más de las siguientes sustituciones: AlV, T2E/P/Q/R/H/M, L3P/N, N9A, A11P/E, I18V, L19N, N20T, 145 G23A, A24S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, 28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N, S40C, T43R, T51D/S, T53D, S56A/C, V59T/A, L60A, N93T, P94V, S95N, D97S, L98P/S, S100T/D, A102S/*, NllOT, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A, N182E, A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, 212N/A/T, A246T, Y312Q, N313T/S/G, A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G, T390R, A393R, S394R/P, M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, L410I/R, S411V, A412C, D414A, G447S, S465P. 146 í : 3$2 RESUMEN DE. LA INVENCIÓN La invención se refiere a una variante de una glucoamilasa fúngica progenitora, que muestra estabilidad térmica mejorada y/o actividad específica incrementada utilizando sustratos sacáridos .