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ES3034398T3 - Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells - Google Patents

Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells

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ES3034398T3
ES3034398T3 ES22164162T ES22164162T ES3034398T3 ES 3034398 T3 ES3034398 T3 ES 3034398T3 ES 22164162 T ES22164162 T ES 22164162T ES 22164162 T ES22164162 T ES 22164162T ES 3034398 T3 ES3034398 T3 ES 3034398T3
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ES
Spain
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cell
cells
antigen
cancer
protein
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ES22164162T
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English (en)
Inventor
Jay M Short
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Bioatla Inc
Original Assignee
Bioatla Inc
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Publication date
Application filed by Bioatla Inc filed Critical Bioatla Inc
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Abstract

Esta divulgación se refiere a un receptor de antígeno quimérico para la unión a un antígeno diana. El receptor de antígeno quimérico comprende al menos una región de direccionamiento específica de antígeno desarrollada a partir de una proteína silvestre o un dominio de la misma, y presenta al menos una de las siguientes características: (a) una disminución de la actividad en el ensayo en condiciones fisiológicas normales en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína silvestre o un dominio de la misma, y (b) un aumento de la actividad en el ensayo en condiciones aberrantes en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína silvestre o un dominio de la misma. También se describe un método para generar el receptor de antígeno quimérico y células citotóxicas que lo expresan. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígenos quiméricos condicionalmente activos para células T modificadas
CAMPO DE LA DIVULGACIÓN
[0001] La presente divulgación se refiere al campo de la evolución de proteínas. Específicamente, esta divulgación se refiere aun método para generar un receptor de antígeno quimérico condicionalmente activo a partir de una proteína de tipo salvaje. El receptor de antígeno quimérico condicionalmente activo se inactiva reversible o irreversiblemente en una condición fisiológica normal de tipo salvaje, pero es activo en una condición aberrante.
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN
[0002] Hay una considerable cantidad de bibliografía que describe el potencial de evolución de proteínas para una variedad de características, especialmente enzimas. Por ejemplo, las enzimas pueden evolucionar para estabilizarse para funcionar en diferentes condiciones, como a una temperatura elevada. En situaciones en las que se produce una mejora de la actividad a una temperatura elevada, una parte sustancial de la mejora puede atribuirse a la actividad cinética más alta descrita comúnmente por la regla Ql0, en la que se estima que, en el caso de una enzima, el recambio se duplica por cada aumento de 10 grados Celsius.
[0003] Además, hay ejemplos de mutaciones naturales que desestabilizan las proteínas en sus condiciones de funcionamiento normales. Ciertos mutantes pueden ser activos a una temperatura más baja, pero a un nivel reducido en comparación con las proteínas de tipo salvaje. Esto también se describe típicamente por una reducción de la actividad guiada por las reglas Ql0 o similares.
[0004] Es deseable generar moléculas útiles que se activen condicionalmente. Por ejemplo, es deseable generar moléculas que sean virtualmente inactivas en condiciones de funcionamiento de tipo salvaje, pero que sean activas en condiciones de funcionamiento distintas de las de tipo salvaje a un nivel que sea igual o mejor que en condiciones de funcionamiento de tipo salvaje, o que se activen o inactiven en ciertos microambientes, o que se activen o inactiven a lo largo del tiempo. Además de la temperatura, otras condiciones para las que las proteínas pueden evolucionar u optimizarse incluyen el pH, la presión osmótica, la osmolalidad, el estrés oxidativo y la concentración de electrolitos. Otras propiedades deseables que pueden optimizarse durante la evolución son la resistencia química y la resistencia proteolítica.
[0005] Se han publicado muchas estrategias de evolución o manipulación de moléculas. Sin embargo, la manipulación o evolución de una proteína para que sea inactiva o virtualmente inactiva (menos del 10% de actividad y preferiblemente menos del 1% de actividad) en una condición de funcionamiento de tipo salvaje, a la vez que se mantiene una actividad equivalente o mejor que su proteína de tipo salvaje correspondiente en una condición distinta de una condición de funcionamiento de tipo salvaje, requiere que la mutación o mutaciones desestabilizadoras coexistan con mutaciones que aumentan la actividad que no contrarresten el efecto desestabilizador. Se espera que la desestabilización reduzca la actividad de la proteína en mayor medida que los efectos predichos por reglas estándar como Ql0. Por lo tanto, la capacidad de evolucionar proteínas que funcionan eficazmente a temperaturas más bajas, por ejemplo, mientras están inactivas en las condiciones normales de funcionamiento de la proteína de tipo salvaje correspondiente, crea una nueva clase inesperada de proteínas.
[0006] Los receptores de antígenos quiméricos se han usado en el tratamiento de cánceres. El documento US 2013/0280220 divulga métodos y composiciones que proporcionan células mejoradas que codifican un receptor de antígeno quimérico que es específico para dos o más antígenos, incluyendo antígenos tumorales. Las células que expresan el receptor de antígeno quimérico pueden usarse en terapia celular. Dicha terapia celular puede ser adecuada para cualquier afección médica, aunque en realizaciones específicas la terapia celular es para el cáncer, incluyendo el cáncer que implica tumores sólidos.
[0007] La presente invención proporciona receptores de antígenos quiméricos condicionalmente activos manipulados que son inactivos o menos activos en una condición fisiológica normal pero activos en una condición fisiológica aberrante.
[0008] A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones por autor y fecha. Las divulgaciones de estas publicaciones describen más detalladamente el estado de la técnica conocido por los expertos en la materia en la fecha de la divulgación descrita y reivindicada en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0009]
La Figura 1 representa una representación esquemática de un receptor de antígeno quimérico de acuerdo con una realización de la presente invención. ASTR es una región de direccionamiento específica de antígeno, L es un conector, ESD es un dominio espaciador extracelular, TM es un dominio transmembrana, CSD es un dominio coestimulador, e ISD es un dominio de señalización intracelular.
Las Figuras 2 y 3 muestran que la expresión de los anticuerpos condicionalmente activos del Ejemplo 6 como anticuerpos bivalentes o monovalentes no altera significativamente la selectividad de estos anticuerpos bajo pH 6,0 y sobre pH 7,4.
La Figura 4 es un perfil de un cromatógrafo de tamaño exclusivo que indica que los anticuerpos condicionalmente activos del Ejemplo 7 no se agregan.
La Figura 5 muestra las constantes de asociación y disociación de los anticuerpos condicionalmente activos del Ejemplo 7, medidas mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR).
Las Figuras 6A-6B muestran la selectividad de los anticuerpos condicionalmente activos medida mediante el ensayo de SPR del Ejemplo 7.
SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
[0010] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
[0011] En otro aspecto más, la presente invención proporciona una célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del cáncer en un sujeto, en donde la célula citotóxica manipulada genéticamente se produce introduciendo un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica el receptor de antígeno quimérico para unirse a un antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas, en una célula citotóxica obtenida del sujeto, en donde el receptor de antígeno quimérico comprende: i) por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno que se une al antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas, dicha región de direccionamiento específica de antígeno evolucionada a partir de una proteína parental o un dominio de la misma que se une al antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas y que tiene una disminución de la actividad de unión al antígeno diana en un ensayo a un pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana en un ensayo bajo un pH aberrante, ii) un dominio transmembrana, y iii) un dominio de señalización intracelular; y en donde el antígeno diana es un receptor del factor de crecimiento de tirosina quinasa que está sobreexpresado en la superficie de las células cancerosas. La célula citotóxica puede ser una célula T y puede seleccionarse entre una célula T virgen, una célula T de memoria central y una célula T de memoria efectora.
DEFINICIONES
[0012] Con el fin de facilitar la comprensión de los ejemplos proporcionados en la presente, en la presente se definirán ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia.
[0013] Como se usa en la presente en relación con una cantidad medida, el término "aproximadamente" se refiere a la variación normal de esa cantidad medida que cabría esperar por un experto en la materia que realice la medición y ejerza un nivel de cuidado acorde con el objetivo de la medición y la precisión del equipo de medición usado. A menos que se indique lo contrario, "aproximadamente" se refiere a una variación de /-10% del valor proporcionado.
[0014] El término "agente" se usa en la presente para designar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una matriz de compuestos localizados espacialmente (por ejemplo, una matriz de péptidos VLSIPs , una matriz de polinucleótidos y/o una matriz combinatoria de moléculas pequeñas), una macromolécula biológica, una biblioteca presentación de péptidos bacteriófagos, una biblioteca de presentación de anticuerpos bacteriófagos (por ejemplo, scFv), una biblioteca de presentación de péptidos polisomales o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos como células o tejidos de bacterias, plantas, hongos o animales (en particular de mamíferos). Se evalúan los agentes para determinar la actividad enzimática potencial mediante su inclusión en los ensayos de cribado descritos a continuación. Se evalúa a los agentes para determinar su actividad potencial como enzimas terapéuticas biológicas condicionalmente activas mediante su inclusión en los ensayos de cribado descritos a continuación en la presente.
[0015] El término "aminoácido", como se usa en la presente, se refiere a cualquier compuesto orgánico que contenga un grupo amino (--NH<2>) y un grupo carboxilo (--COOH); preferiblemente como grupos libres o, alternativamente, después de la condensación como parte de enlaces peptídicos. Los "veinte alfa-aminoácidos formadores de polipéptidos codificados de manera natural" se comprenden en la técnica y se refieren a: alanina (ala o A), arginina (arg o R), asparagina (asn o N), ácido aspártico (asp o D), cisteína (cys o C), ácido gluatámico (glu o E), glutamina (gin o Q), glicina (gly o G), histidina (his o H), isoleucina (ile o I), leucina (leu o L), lisina (lys o K), metionina (met o M), fenilalanina (phe o F), prolina (pro o P), serina (ser o S), treonina (thr o T), triptófano (tip o W), tirosina (tyr o Y) y valina (val o V).
[0016] El término "amplificación", como se usa en la presente, significa que se aumenta la cantidad de copias de un polinucleótido.
[0017] El término "anticuerpo", como se usa en la presente, se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas, así como a fragmentos de moléculas de inmunoglobulina, como los fragmentos Fab, Fab', (Fab')2, Fv y SCA, que son capaces de unirse a un epítopo de un antígeno. Estos fragmentos de anticuerpo, que conservan cierta capacidad para unirse selectivamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno polipeptídico) del anticuerpo del que se derivan, pueden elaborarse usando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, supra), y se describen más detalladamente de la siguiente manera. Los anticuerpos pueden usarse para aislar cantidades preparativas del antígeno mediante cromatografía de inmunoafinidad. Varios otros usos de tales anticuerpos son para diagnosticar y/o estadificar enfermedades (por ejemplo, neoplasias) y para su aplicación terapéutica para tratar enfermedades, como por ejemplo: neoplasias, enfermedades autoinmunes, SIDA, enfermedades cardiovasculares, infecciones y similares. Los anticuerpos quiméricos, similares a los humanos, humanizados o totalmente humanos son particularmente útiles para su administración a pacientes humanos.
[0018] Un fragmento Fab consiste en un fragmento monovalente de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, y puede producirse por digestión de una molécula de anticuerpo completa con la enzima papaína, para producir un fragmento consistente en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.
[0019] Un fragmento Fab' de una molécula de anticuerpo puede obtenerse tratando una molécula de anticuerpo completa con pepsina, seguido de reducción, para producir una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de cadena pesada. Por molécula de anticuerpo tratada de esta manera se obtienen dos fragmentos Fab'.
[0020] Un fragmento (Fab')2 de un anticuerpo puede obtenerse tratando una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento (Fab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab', unidos entre sí por dos enlaces disulfuro.
[0021] Un fragmento Fv se define como un fragmento manipulado genéticamente que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada expresadas como dos cadenas.
[0022] El término "antígeno" o "Ag", como se usa en la presente, se define como una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos, la activación de células específicas inmunológicamente competentes, o ambas. Un experto en la materia entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia nucleotídica o una secuencia nucleotídica parcial que codifique una proteína que provoque una respuesta inmunitaria codifica, por lo tanto, un "antígeno" tal como se usa en la presente dicho término. Además, un experto en la materia comprenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia nucleotídica de longitud completa de un gen. Es evidente que la presente invención incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias parciales de nucleótidos de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en varias combinaciones para provocar la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la materia comprenderá que no es necesario en absoluto que un antígeno esté codificado por un "gen". Es evidente que un antígeno puede generarse, sintetizarse o derivarse de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, entre otras, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.
[0023] Las "variantes de escape de pérdida de antígeno", como se usan en la presente, se refieren a células que muestran una expresión reducida o pérdida del antígeno diana, antígenos a los que se dirigen los CAR de la invención.
[0024] El término "enfermedad autoinmune", como se usa en la presente, se define como un trastorno que resulta de una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inapropiada y excesiva a un autoantígeno. Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, entre otras, enfermedad de Addision, alopecia greata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotitis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo 1), epidermólisis bullosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.
[0025] El término "autólogo", como se usa en la presente, se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que se va a reintroducir posteriormente. Por ejemplo, las células T de un paciente pueden aislarse, manipularse genéticamente para que expresen un CAR y luego reintroducirlas en el paciente.
[0026] El término "enfermedades asociadas a células B" como se usa en la presente incluye inmunodeficiencias de células B, enfermedades autoinmunes y/o proliferación celular excesiva/incontrolada asociada a células B (incluyendo linfomas y/o leucemias). Ejemplos de tales enfermedades, en donde los CAR biespecíficos de la invención pueden usarse para enfoques terapéuticos incluyen, entre otras, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, artritis reumatoide (AR), artritis reactiva, esclerosis múltiple (EM), pénfigo vulgar, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad tiroidea autoinmune, agammaglobulinaemis ligada a X, leucemia linfoblástica aguda pre-B, lupus eritematoso sistémico, inmunodeficiencia variable común, leucemia linfocítica crónica, enfermedades asociadas con deficiencia selectiva de IgAy/o deficiencia de subclase IgG, linfomas de linaje B (linfoma de Hodgkin y/o linfoma no Hodgkin), inmunodeficiencia con timoma, hipogammaglobulinemia transitoria y/o síndrome de hiper IgM, así como enfermedades de células B mediadas por virus, como la enfermedad linfoproliferativa mediada por el VEB, e infecciones crónicas en las que las células B participan en la fisiopatología.
[0027] El término "barrera hematoencefálica" o "BBB" se refiere a la barrera fisiológica entre la circulación periférica y el cerebro y la médula espinal que está formada por uniones estrechas dentro de las membranas plasmáticas endoteliales de los capilares cerebrales, creando una barrera hermética que restringe el transporte de moléculas al cerebro, incluso moléculas muy pequeñas como la urea (60 Daltons). La barrera hematoencefálica dentro del cerebro, la barrera hematoencefálica dentro de la médula espinal y la barrera hematorretiniana dentro de la retina son barreras capilares contiguas dentro del sistema nervioso central (SNC), y en la presente se denominan colectivamente "barrera hematoencefálica" o "BBB". La BBB también abarca la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (plexo coroideo), donde la barrera está compuesta de células ependimarias en lugar de células endoteliales capilares.
[0028] Los términos "cáncer" y "canceroso", como se usan en la presente, se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a linfomas de células B (linfomas de Hodgkin y/o linfomas no de Hodgkin), tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral y cáncer de próstata, incluyendo pero no limitado al cáncer de próstata dependiente de andrógenos y al cáncer de próstata independiente de andrógenos.
[0029] El término "receptor de antígeno quimérico" o "CAR" o "CARs", como se usa en la presente, se refiere a receptores manipulados que injertan una especificidad de antígeno en células citotóxicas, por ejemplo células T, células NK y macrófagos. Los CAR de la invención pueden comprender por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno (ASTR), un dominio espaciador extracelular (ESD), un dominio transmembrana (TM), uno o más dominios coestimuladores (CSD) y un dominio de señalización intracelular (ISD). En una realización, el ESD y/o el CSD son opcionales. En otra realización, el CAR es un CAR biespecífico, que es específico de dos antígenos o epítopos diferentes. Después de que la ASTR se una específicamente a un antígeno diana, el ISD activa la señalización intracelular. Por ejemplo, la ISD puede redirigir la especificidad y reactividad de las células T hacia una diana seleccionada de manera no restringida al MHC, aprovechando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos. El reconocimiento de antígenos no restringido al MHC confiere a las células T que expresan el CAR la capacidad de reconocer un antígeno independientemente de su procesamiento, eludiendo por tanto un importante mecanismo de escape tumoral. Además, cuando se expresan en células T, los CAR ventajosamente no dimerizan con las cadenas alfa y beta del receptor de células T (TCR) endógeno.
[0030] El término "coexpresar", como se usa en la presente, se refiere a la expresión simultánea de dos o más genes. Los genes pueden ser ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, una única proteína o una proteína quimérica como una única cadena polipeptídica. Por ejemplo, los CAR de la invención pueden coexpresarse con un control terapéutico (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt)), en donde el CAR está codificado por una primera cadena de polinucleótidos y el control terapéutico está codificado por una segunda cadena de polinucleótidos. En una realización, la primera y la segunda cadenas de polinucleótidos están enlazadas por una secuencia de ácido nucleico que codifica un conector escindible. Alternativamente, el CAR y el control terapéutico están codificados por dos polinucleótidos diferentes que no están enlazados mediante un conector, sino que están codificados, por ejemplo, por dos vectores diferentes.
[0031] El término "afín", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia genética que está relacionada evolutiva y funcionalmente entre especies. Por ejemplo, pero sin limitación, en el genoma humano el gen CD4 humano es el gen afín del gen 3d4 del ratón, ya que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son altamente homólogas y ambos genes codifican una proteína que funciona en la señalización de la activación de células T a través del reconocimiento de antígenos restringido por la MHC de clase II.
[0032] El término "proteína biológica condicionalmente activa" se refiere a una variante, o mutante, de una proteína de tipo salvaje que es más o menos activa que la proteína de tipo salvaje parental en una o más condiciones fisiológicas normales. Esta proteína condicionalmente activa también presenta actividad en regiones seleccionadas del cuerpo y/o presenta una actividad mayor o menor en condiciones fisiológicas aberrantes o permisivas. Las condiciones fisiológicas normales son aquellas de temperatura, pH, presión osmótica, osmolalidad, estrés oxidativo y concentración de electrolitos que se considerarían dentro de un intervalo normal en el sitio de administración, o en el tejido u órgano en el sitio de acción, a un sujeto. Una condición aberrante es aquella que se desvía del intervalo normalmente aceptable para esa condición. En un aspecto, la proteína biológica condicionalmente activa es virtualmente inactiva en condiciones de tipo salvaje, pero es activa en condiciones distintas de las de tipo salvaje a un nivel que es igual o mejor que en condiciones de tipo salvaje. Por ejemplo, en un aspecto, una proteína biológica evolucionada condicionalmente activa es virtualmente inactiva a temperatura corporal, pero es activa a temperaturas más bajas. En otro aspecto, la proteína biológica condicionalmente activa se inactiva de manera reversible o irreversible en las condiciones de tipo salvaje. En un aspecto adicional, la proteína de tipo salvaje es una proteína terapéutica. En otro aspecto, la proteína biológica condicionalmente activa se usa como fármaco o agente terapéutico. En otro aspecto más, la proteína es más o menos activa en sangre altamente oxigenada como, por ejemplo, tras su paso a través del pulmón o en los entornos de pH más bajo que se encuentran en el riñón.
[0033] Las "sustituciones conservadoras de aminoácidos" se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es la serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es la asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, la tirosina y el triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es la lisina, la arginina y la histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
[0034] El término "corresponde a" se usa en la presente para indicar que una secuencia polinucleotídica es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada evolutivamente) a toda o una parte de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. Por el contrario, el término "complementaria a" se usa en la presente para indicar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o parte de una secuencia polinucleotídica de referencia. Por ejemplo, la secuencia nucleotídica "TATAC" corresponde a una "TATAC" de referencia y es complementaria a una secuencia "GTATA" de referencia.
[0035] El término "ligando coestimulador", como se usa en la presente, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, célula dendrítica, célula B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en una célula T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, media una respuesta de células T incluyendo, entre otras, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1<b>B<l>, OX40L, un ligando coestimulador inducible (ICOS-L), una molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, un receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3,<i>L<t>4, HVEM, un agonista o un anticuerpo que se une a un receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T como, entre otras, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, un antígeno-1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83.
[0036] El término "molécula coestimuladora", como se usa en la presente, se refiere a la pareja de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de este modo una respuesta coestimuladora por la célula T como, entre otras, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, una molécula de MHC de clase 1, BTLAy un receptor de ligando Toll.
[0037] El término "señal coestimuladora", como se usa en la presente, se refiere a una señal que, en combinación con una señal primaria, como la ligación TCR/CD3, lleva a la proliferación de células T y/o a la regulación por incremento o a la regulación por disminución de moléculas clave.
[0038] El término "célula citotóxica", como se usa en la presente, significa una célula que puede lesionar o destruir microorganismos invasores, células tumorales u otras células de tejidos enfermos. Se pretende que este término incluya células asesinas naturales (NK), células NK activadas, neutrófilos, células T, eosinófilos, basófilos, células B, macrófagos y células asesinas activadas por linfocinas (LAK), entre otros tipos de células. La célula citotóxica, a través de un anticuerpo, receptor, ligando o fragmentos/derivados de los mismos, se une a una célula diana para formar un complejo estable, y estimula a la célula citotóxica para que destruya la célula diana.
[0039] Las células citotóxicas también pueden incluir otras células inmunitarias con capacidades líticas tumorales incluyendo, entre otras, las células T asesinas naturales (Heczey et al., "Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy," Blood, vol. 124, págs.2824-2833, 2014) y los granulocitos. Además, las células citotóxicas pueden incluir células inmunitarias con capacidad fagocítica, incluyendo, entre otras, macrófagos y granulocitos, células con propiedades de células madre y/o células progenitoras incluyendo, entre otras, células madre/progenitoras hematopoyéticas (Zhen et al., "HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells," Mol Ther., vol. 23, págs.1358-1367, 2015), células madre embrionarias (ESC), células madre de sangre de cordón umbilical y células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (Themeli et al., "New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy," Cell Stem Cell., vol. 16, págs.357-366, 2015). Además, las células citotóxicas incluyen "células sintéticas" como las células T derivadas de iPSC (TiPSC) (Themeli et al., "Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy," Nat Biotechnol., vol.31, pp.928-933, 2013) o las células NK derivadas de<íp>S<c>.
[0040] El término cantidad "degradante eficaz" se refiere a la cantidad de enzima que se requiere para procesar por lo menos el 50% del sustrato, en comparación con el sustrato que no entra en contacto con la enzima.
[0041] El término "ligación direccional" se refiere a una ligación en la que un extremo 5' y un extremo 3' de un polinucleótido son lo suficientemente diferentes como para especificar una orientación de ligación preferida. Por ejemplo, un producto de PCR no tratado y no digerido de otro modo que tiene dos extremos romos no tendrá típicamente una orientación de ligación preferida cuando se ligue en un vector de clonación digerido para producir extremos romos en su sitio de clonación múltiple; así, la ligación direccional no se mostrará típicamente bajo estas circunstancias. Por el contrario, la ligación direccional se mostrará típicamente cuando un producto de PCR digerido que tenga un extremo 5' tratado con EcoR I y uno 3' tratado con BamH I se ligue en un vector de clonación que tenga un sitio de clonación múltiple digerido con EcoR I y BamH I.
[0042] El término "enfermedad a la que se dirigen las células citotóxicas manipuladas genéticamente", como se usa en la presente, abarca el direccionamiento de cualquier célula implicada de cualquier manera en cualquier enfermedad por las células manipuladas genéticamente de la invención, independientemente de si las células manipuladas genéticamente se dirigen a células enfermas o a células sanas para obtener un resultado terapéuticamente beneficioso. Las células manipuladas genéticamente incluyen, entre otras, células T, células NK y macrófagos modificados genéticamente. Las células modificadas genéticamente expresan los CAR de la invención, CAR que pueden dirigirse a cualquiera de los antígenos expresados en la superficie de las células diana. Ejemplos de antígenos a los que pueden dirigirse incluyen, entre otros, antígenos expresados en células B; antígenos expresados en carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinales y blastomas; antígenos expresados en varias células inmunitarias; y antígenos expresados en células asociadas con varias enfermedades hematológicas, enfermedades autoinmunitarias y/o enfermedades inflamatorias. Otros antígenos a los que pueden dirigirse serán evidentes para los expertos en la materia y pueden ser diana de los CAR de la invención en relación con realizaciones alternativas de la misma.
[0043] Los términos "células modificadas genéticamente", "células redirigidas", "células manipuladas genéticamente" o "células modificadas", como se usan en la presente, se refieren a células que expresan los CAR de la invención.
[0044] El término "barajado de ADN" se usa en la presente para indicar la recombinación entre secuencias sustancialmente homólogas pero no idénticas, en algunas realizaciones el barajado de ADN puede implicar el cruce a través de recombinación no homóloga, como a través de sistemas cer/lox y/o flp/frt y similares. El barajado de ADN puede ser aleatorio o no aleatorio.
[0045] El término "fármaco" o "molécula de fármaco" se refiere a un agente terapéutico que incluye una sustancia que tiene un efecto beneficioso sobre un cuerpo humano o animal cuando se administra al cuerpo humano o animal. Preferiblemente, el agente terapéutico incluye una sustancia que puede tratar, curar o aliviar uno o más síntomas, enfermedades o condiciones anormales en un cuerpo humano o animal o mejorar el bienestar de un cuerpo humano o animal.
[0046] Una "cantidad eficaz" es una cantidad de una proteína o fragmento biológico condicionalmente activo que es eficaz para tratar o prevenir una afección en un organismo vivo al que se administra durante algún periodo de tiempo, por ejemplo, proporciona un efecto terapéutico durante un intervalo de dosificación deseado.
[0047] El término "electrolito", como se usa en la presente, define un mineral en la sangre u otros fluidos corporales que transporta una carga. Por ejemplo, en un aspecto, la condición fisiológica normal y la condición aberrante pueden ser condiciones de "concentración de electrolitos". En un aspecto, la concentración de electrolitos a probar se selecciona entre una o más de las concentraciones de calcio, sodio, potasio, magnesio, cloruro, bicarbonato y fosfato ionizados. Por ejemplo, en un aspecto, el intervalo normal de calcio sérico es de 8,5 a 10,2 mg/dl. En este aspecto, la concentración aberrante de calcio sérico puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal, en otro ejemplo, en un aspecto, el intervalo normal de cloruro sérico es de 96 a 106 miliequivalentes por litro (mEq/l). En este aspecto, la concentración aberrante de cloruro sérico puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal; en otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de magnesio sérico es de 1,7-2,2 mg/dl. En este aspecto, una concentración aberrante de magnesio sérico puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal, en otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de fósforo sérico es de 2,4 a 4,1 mg/dl. En este aspecto, la concentración aberrante de fósforo sérico puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal. En otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de sodio sérico, o sanguíneo, es de 135 a 145 mEq/l. En este aspecto, la concentración aberrante de sodio en suero o sangre puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal. En otro ejemplo, en un aspecto, un intervalo normal de potasio sérico, o sanguíneo, es de 3,7 a 5,2 mEq/l. En este aspecto, la concentración aberrante de potasio sérico, o sanguíneo, puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal. En otro aspecto, un intervalo normal de bicarbonato sérico es de 20 a 29 mEq/l. En este aspecto, la concentración aberrante de bicarbonato sérico, o sanguíneo, puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal. En un aspecto diferente, los niveles de bicarbonato pueden usarse para indicar niveles normales de acidez (pH), en la sangre. El término "concentración de electrolitos" también puede usarse para definir el estado de un electrolito concreto en un tejido o fluido corporal distinto de la sangre o el plasma. En este caso, se considera que el estado fisiológico normal es el intervalo clínicamente normal para ese tejido o fluido. En este aspecto, la concentración aberrante de electrolitos en un tejido o fluido puede seleccionarse o por encima o por debajo del intervalo normal.
[0048] El término "epítopo", como se usa en la presente, se refiere a un determinante antigénico en un antígeno, como un polipéptido enzimático, al que se une el paratopo de un anticuerpo, como un anticuerpo específico de enzima. Los determinantes antigénicos consisten normalmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Como se usa en la presente, "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno u otra macromolécula capaz de formar una interacción de unión que interactúa con el cuerpo de unión de la región variable de un anticuerpo. Típicamente, dicha interacción de unión se manifiesta como un contacto intermolecular con uno o más residuos de aminoácidos de una CDR.
[0049] Como se usa en la presente, el término "evolución", o "evolucionar", se refiere al uso de uno o más métodos de mutagénesis para generar un polinucleótido nuevo que codifica un polipéptido nuevo, dicho polipéptido nuevo es en sí mismo una molécula biológica mejorada y/o contribuye a la generación de otra molécula biológica mejorada. En un aspecto particular no limitativo, la presente divulgación se refiere a la evolución de proteínas biológicas condicionalmente activas a partir de una proteína parental de tipo salvaje. En un aspecto, por ejemplo, la evolución se relaciona con un método para realizartanto quimerización de polinucleótidos no estocástica como mutagénesis puntual dirigida al sitio no estocástica divulgado en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2009/0130718. Más particularmente, la presente divulgación proporciona métodos para la evolución de enzimas biológicas condicionalmente activas que muestran una actividad reducida en condiciones fisiológicas normales en comparación con una molécula parental enzimática de tipo salvaje, pero una actividad mejorada en una o más condiciones aberrantes en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la enzima de tipo salvaje.
[0050] Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a un polipéptido de referencia comprenden un polipéptido que retiene por lo menos una función o actividad biológica que es por lo menos esencialmente la misma que la del polipéptido de referencia. Además, los términos "fragmento", "derivado" o "análogo" se ejemplifican con una molécula "proforma", como una proproteína de baja actividad que puede modificarse por escisión para producir una enzima madura con una actividad significativamente mayor.
[0051] El término "gen", como se usa en la presente, significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye las regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y tráiler), así como las secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones).
[0052] El término "heterólogo", como se usa en la presente, significa que una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla es incapaz de hibridarcon otra secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla o su complemento. Por tanto, áreas de heterología significa que áreas de polinucleótidos o los polinucleótidos tienen áreas o regiones dentro de su secuencia que son incapaces de hibridar con otro ácido nucleico o polinucleótido. Tales regiones o zonas son, por ejemplo, zonas de mutaciones.
[0053] Los términos "homóloga" u "homeóloga" como se usan en la presente significan que una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla complementaria. El grado de hibridación puede depender de una serie de factores, incluyendo la cantidad de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridación, como la temperatura y las concentraciones de sal, como se analizará más adelante. Preferiblemente, la región de identidad es mayor de aproximadamente 5 pb, más preferiblemente la región de identidad es mayor de 10 pb.
[0054] Los beneficios de esta divulgación se extienden a "aplicaciones industriales" (o procesos industriales), término que se usa para incluir aplicaciones en la industria comercial propiamente dicha (o simplemente industria) así como aplicaciones industriales no comerciales (por ejemplo, investigación biomédica en una institución sin ánimo de lucro). Las aplicaciones relevantes incluyen aquellas en áreas de diagnóstico, medicina, agricultura, manufactura y academia.
[0055] El término "célula inmunitaria", como se usa en la presente, se refiere a las células del sistema inmunitario de los mamíferos incluyendo, entre otras, las células presentadoras de antígenos, las células B, los basófilos, las células T citotóxicas, las células dendríticas, los eosinófilos, los granulocitos, las células T auxiliares, los leucocitos, los linfocitos, los macrófagos, los mastocitos, las células de memoria, los monocitos, las células asesinas naturales, los neutrófilos, los fagocitos, las células plasmáticas y las células T.
[0056] El término "respuesta inmunitaria", como se usa en la presente, se refiere a inmunidades que incluyen, entre otras, la inmunidad innata, la inmunidad humoral, la inmunidad celular, la inmunidad, la respuesta inflamatoria, la inmunidad adquirida (adaptativa), la autoinmunidad y/o la inmunidad hiperactiva.
[0057] El término "aislado", como se usa en la presente, significa que el material se separa de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido o enzima de origen natural presente en un animal vivo no se aísla, sino que se aísla el mismo polinucleótido o enzima, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tales polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o enzimas podrían formar parte de una composición, y aun así estar aislados en el sentido de que dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural.
[0058] El término "ácido nucleico aislado" se usa en la presente para definir un ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN, que no es inmediatamente contigua con las secuencias flanqueantes 5' y 3' con las que normalmente es inmediatamente contigua cuando está presente en el genoma de origen natural del organismo del que se deriva. El término describe por tanto, por ejemplo, un ácido nucleico que se incorpora en un vector, como un plásmido o un vector viral; un ácido nucleico que se incorpora al genoma de una célula heteróloga (o al genoma de una célula homóloga, pero en un sitio diferente de aquel en el que se produce de manera natural); y un ácido nucleico que existe como una molécula separada, por ejemplo, un fragmento de ADN producido por amplificación por PCR o digestión con enzimas de restricción, o una molécula de ARN producida por transcripción in vitro. El término también describe un ácido nucleico recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica secuencias polipeptídicas adicionales que pueden usarse, por ejemplo, en la producción de una proteína de fusión.
[0059] El término "lentivirus", como se usa en la presente, se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus porque son capaces de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula huésped, por lo que son una de las formas más eficientes de liberar un vector génico. El VIH, el VIS y el VISF son ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus proporcionan los medios para lograr niveles significativos de transferencia de genesin vivo.
[0060] El término "ligando", como se usa en la presente, se refiere a una molécula, como un péptido aleatorio o una secuencia de segmento variable que es reconocida por un receptor particular. Como reconocerá un experto en la materia, una molécula (o complejo macromolecular) puede ser tanto un receptor como un ligando. En general, se denomina ligando al compañero de unión que tiene menor peso molecular y receptor al compañero de unión que tiene mayor peso molecular.
[0061] El término "ligación", como se usa en la presente, se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble (Sambrook et al., (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., p. 146; Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A menos que se indique lo contrario, la ligación puede llevarse a cabo usando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 microgramos de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que deben ligarse.
[0062] Los términos "conector" o "espaciador" usados en la presente se refieren a una molécula o grupo de moléculas que conectan dos moléculas, como una proteína de unión a ADN y un péptido aleatorio, y sirven para colocar las dos moléculas en una configuración preferida, por ejemplo, de tal manera que el péptido aleatorio pueda unirse a un receptor con una impedancia estérica mínima de la proteína de unión al ADN. "Conector" (L), "dominio conector" o "región conectora" como se usa en la presente se refiere a una región oligopeptídica o polipeptídica de aproximadamente 1 a 100 aminoácidos de longitud, que enlaza entre sí cualquiera de los dominios/regiones de los CAR de la invención. Los conectores pueden estar compuestos de residuos flexibles como la glicina y la serina de tal manera que los dominios proteicos adyacentes puedan moverse libremente entre sí. Pueden usarse conectores más largos cuando sea deseable garantizar que dos dominios adyacentes no interfieran estéricamente entre sí. Los conectores pueden ser escindibles o no escindibles. Los ejemplos de conectores escindibles incluyen conectores 2A (por ejemplo T2A), conectores similares a 2A o equivalentes funcionales de los mismos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los conectores incluyen el conector picornaviral similar a 2a , secuencias CHYSEL del teschovirus porcino (P2A), virus Thosea asigna (T2A) o combinaciones, variantes y equivalentes funcionales de los mismos. Otros conectores serán evidentes para los expertos en la materia y pueden usarse en relación con realizaciones alternativas de la invención.
[0063] El término "presentación en la superficie celular de mamíferos", como se usa en la presente, se refiere a una técnica mediante la cual una proteína o anticuerpo, o una porción de un anticuerpo, se expresa y visualiza en la superficie de una célula huésped de mamífero con propósitos de cribado; por ejemplo, mediante el cribado para la unión a antígenos específicos mediante una combinación de perlas magnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia. En un aspecto, los vectores de expresión de mamíferos se usan para la expresión simultánea de inmunoglobulinas tanto en forma secretada como unida a la superficie celular, como en DuBridge et al., US 2009/0136950. En otro aspecto, las técnicas se emplean para el cribado de un vector viral que codifica para una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se muestran en las membranas celulares cuando se expresan en una célula, como en Gao et al., US 2007/0111260. Se conoce la presentación de IgG completas en la superficie de células de mamíferos. Por ejemplo, Akamatsuu et al. desarrollaron un vector de presentación en la superficie celular de mamíferos, adecuado para aislar directamente moléculas de IgG sobre la base de su afinidad de unión al antígeno y su actividad biológica. Usando un vector episomal derivado del virus de Epstein-Barr, las bibliotecas de anticuerpos se presentaron como moléculas de IgG completas en la superficie celular y se cribaron para determinar su unión específica a antígenos mediante una combinación de perlas magnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia. Los plásmidos que codifican anticuerpos con las características de unión deseadas se recuperaron de las células seleccionadas y se convirtieron en una forma adecuada para la producción de IgG soluble. Véase Akamatsuu et al. J. Immunol. Methods, vol. 327, páginas 40-52, 2007. Ho et al. usaron células 293T de riñón embrionario humano que se usan ampliamente para la expresión transitoria de proteínas para la presentación en la superficie celular de anticuerpos Fv de cadena sencilla para la maduración por afinidad. Las células que expresaban un anticuerpo mutante raro con afinidad más alta se enriquecieron 240 veces mediante una clasificación celular de un único pase a partir de un gran exceso de células que expresaban el anticuerpo WT con una afinidad ligeramente más baja. Además, se obtuvo un mutante altamente enriquecido con afinidad de unión aumentada para CD22 después de una única selección de una biblioteca combinatoria que aleatorizaba un punto crítico intrínseco del anticuerpo. Véase Ho et al., "Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 103, páginas 9637-9642, 2006.
[0064] También pueden usarse células B específicas para un antígeno. Tales células B pueden aislarse directamente de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes humanos. Las bibliotecas de Fv de cadena sencilla (scFv) recombinantes específicas de antígeno se generan a partir de este conjunto de células B y se criban mediante presentación en la superficie celular de mamíferos usando un sistema de expresión de virus Sindbis. Las regiones variables (VR) de las cadenas pesadas (HC) y ligeras (LC) pueden aislarse a partir de clones positivos y producirse anticuerpos recombinantes totalmente humanos como IgG completa o fragmentos Fab. De esta manera, pueden aislarse varios anticuerpos hipermutados de alta afinidad que se unen a la partícula similar al virus (VLP) Qp, un antígeno viral modelo, así como anticuerpos específicos para la nicotina. Véase Beerli et al., "Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 105, páginas 14336-14341, 2008.
[0065] En la presente invención también puede usarse la presentación en la superficie de células de levadura, por ejemplo, véase Kondo y Ueda, "Yeast cell-surface display-applications of molecular display," Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 64, páginas 28-40, 2004, que describe, por ejemplo, un sistema de manipulación de la superficie celular usando la levadura Saccharomyces cerevisiae. Varios sistemas de presentación representativos para la expresión en la levadura S. cerevisiae se describen en Lee et al, "Microbial cell-surface display," TRENDS in Bitechnol., vol. 21, páginas 45-52, 2003. También Boder y Wittrup, "Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries", Nature Biotechnol., vol. 15, páginas 553, 1997.
[0066] El término "fabricación", como se usa en la presente, se refiere a la producción de una proteína en una cantidad suficiente para permitir por lo menos las pruebas clínicas de Fase I de una proteína terapéutica, o una cantidad suficiente para la aprobación reglamentaria de una proteína de diagnóstico.
[0067] Como se usa en la presente, el término "microambiente" se refiere a cualquier porción o región de un tejido o cuerpo que tiene una diferencia constante o temporal, física o química, con respecto a otras regiones del tejido u otras regiones del cuerpo.
[0068] Como se usa en la presente, el término "propiedad molecular a evolucionar" incluye una referencia a moléculas compuestas por una secuencia polinucleotídica, moléculas compuestas por una secuencia polipeptídica y moléculas compuestas en parte por una secuencia polinucleotídica y en parte por una secuencia polipeptídica. Ejemplos particularmente relevantes, pero no limitativos, de propiedades moleculares a evolucionar incluyen actividades de proteínas en condiciones específicas como temperatura, salinidad, presión osmótica, pH, estrés oxidativo y concentración de glicerol, DMSO, detergente y/o cualquier otra especie molecular con la que se entre en contacto en un entorno de reacción. Ejemplos particularmente relevantes adicionales, pero no limitativos, de propiedades moleculares que pueden evolucionar incluyen las estabilidades, por ejemplo, la cantidad de una propiedad molecular residual que está presente después de un tiempo especificado de exposición a un entorno específico, como el que puede encontrarse durante el almacenamiento.
[0069] El término "mutaciones", como se usa en la presente, significa cambios en la secuencia de una secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje o cambios en la secuencia de un péptido. Tales mutaciones pueden ser mutaciones puntuales como transiciones o transversiones. Las mutaciones pueden ser deleciones, inserciones o duplicaciones.
[0070] El término "anticuerpo multiespecífico", como se usa en la presente, es un anticuerpo que tiene afinidades de unión para por lo menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos multiespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')<2>). Los anticuerpos manipulados pueden unirse a dos, tres o más (por ejemplo, cuatro) antígenos (véase, por ejemplo, el documento US 2002/0004587 A1). Un anticuerpo condicionalmente activo puede manipularse para que sea multiespecífico, o dos anticuerpos pueden manipularse para que comprendan un heterodímero que se une a dos antígenos. Los anticuerpos multiespecíficos también pueden ser multifuncionales.
[0071] Como se usa en la presente, la secuencia degenerada de nucleótidos "N,N,G/T" representa 32 posibles tripletes, donde "N" puede ser A, C, G o T.
[0072] El término "de origen natural", como se usa en la presente aplicado al objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. En general, el término de origen natural se refiere a un objeto presente en un individuo no patológico (no enfermo), como sería típico para la especie.
[0073] Como se usa en la presente, "condiciones fisiológicas normales", o "condiciones de funcionamiento de tipo salvaje", son aquellas condiciones de pH que se considerarían dentro de un intervalo normal en el sitio de administración, o el sitio de acción, en un sujeto.
[0074] Como se usa en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" se compone de por lo menos una base o un par de bases, dependiendo de si es de cadena sencilla o de cadena doble, respectivamente. Además, una molécula de ácido nucleico puede pertenecer exclusiva o quiméricamente a cualquier grupo de moléculas que contengan nucleótidos, como se ejemplifica, pero no se limita a, los siguientes grupos de moléculas de ácido nucleico: ARN, ADN, ácidos nucleicos genómicos, ácidos nucleicos no genómicos, ácidos nucleicos de origen natural y ácidos nucleicos de origen no natural, y ácidos nucleicos sintéticos. Esto incluye, a modo de ejemplo no limitativo, ácidos nucleicos asociados con cualquier orgánulo, como la mitocondria, ARN ribosómico y moléculas de ácido nucleico compuestas quiméricamente de uno o más componentes que no se producen de manera natural junto con componentes que se producen de manera natural.
[0075] Además, una "molécula de ácido nucleico" puede contener en parte uno o más componentes no basados en nucleótidos como se ejemplifica por, entre otros, aminoácidos y azúcares. Así, a modo de ejemplo, pero no de limitación, una ribozima que está en parte basada en nucleótidos y en parte basada en proteínas se considera una "molécula de ácido nucleico".
[0076] Los términos "secuencia de ácido nucleico que codifica" o "secuencia codificante de ADN de" o "secuencia de nucleótidos que codifica" como se usan en la presente se refieren a una secuencia de ADN que se transcribe y traduce en una enzima cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, como los promotores. Un "promotor" es una región reguladora del ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en sentido descendente (dirección 3'). El promotor forma parte de la secuencia de ADN. Esta región de la secuencia tiene un codón de inicio en su extremo terminal 3'. La secuencia promotora incluye el número mínimo de bases donde se encuentran los elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Sin embargo, después de que la ARN polimerasa se una a la secuencia y se inicie la transcripción en el codón de inicio (extremo terminal 3' con un promotor), la transcripción procede corriente en sentido descendente 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido mediante mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
[0077] El término "oligonucleótido" (o sinónimamente "oligo") se refiere a un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas de polideoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos pueden tener un fosfato 5' o no. Los que no lo tienen no se ligarán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no haya sido desfosforilado.
[0078] Como se usa en la presente, el término "operativamente enlazado" se refiere al enlace de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está enlazado operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que se enlazan son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el marco de lectura.
[0079] Una secuencia codificante está "operativamente enlazada con" otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcribirá las dos secuencias codificantes en un único ARNm, que se traducirá en un único polipéptido que tiene aminoácidos derivados de ambas secuencias codificantes. No es necesario que las secuencias codificantes sean contiguas entre sí, siempre que las secuencias expresadas se procesen en última instancia para producir la proteína deseada.
[0080] Como se usa en la presente, el término "conjunto de polinucleótidos parental" es un conjunto compuesto por una o más especies de polinucleótidos distintas. Generalmente, este término se usa en referencia a un conjunto de polinucleótidos progenie que se obtiene preferiblemente por mutagenización del conjunto parental, en cuyo caso los términos "parental", "de partida" y "plantilla" se usan indistintamente.
[0081] El término "paciente", o "sujeto", se refiere a un animal, por ejemplo un mamífero, como un humano, que es objeto de tratamiento. El sujeto, o paciente, puede ser macho o hembra.
[0082] Como se usa en la presente, el término "condiciones fisiológicas" se refiere a la temperatura, pH, presión osmótica, fuerza iónica, viscosidad y parámetros bioquímicos similares que son compatibles con un organismo viable, y/o que existen típicamente intracelularmente en una célula de levadura cultivada viable o célula de mamífero. Por ejemplo, las condiciones intracelulares en una célula de levadura cultivada en condiciones típicas de cultivo de laboratorio son condiciones fisiológicas. Las condiciones de reacción in vitro adecuadas para cócteles de transcripción in vitro son generalmente condiciones fisiológicas. En general, las condiciones fisiológicas in vitro comprenden 50-200 mM de NaCl o KCl, pH 6,5-8,5, 20-45 grados C y 0,001-10 mM de catión divalente (por ejemplo, Mg++", Ca++); preferiblemente aproximadamente 150 mM de NaCl o KCl, pH 7,2-7,6, 5 mM de catión divalente, y a menudo incluyen 0,01-1,0 por ciento de proteína inespecífica (por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA)). A menudo puede haber un detergente no iónico (Tween, NP-40, Triton X-100), generalmente a aproximadamente de un 0,001 a un 2%, típicamente de un 0,05-0,2% (v/v). El profesional puede seleccionar las condiciones acuosas particulares de acuerdo con los métodos convencionales. Como orientación general, pueden ser aplicables las siguientes condiciones acuosas tamponadas: 10-250 mM de NaCl, 5-50 mM de Tris HCl, pH 5-8, con adición opcional de catión o cationes divalentes y/o quelantes metálicos y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespumantes y/o centelleantes. Las condiciones fisiológicas normales se refieren a las condiciones de temperatura, pH, presión osmótica, osmolalidad, estrés oxidativo y concentración de electrolitos in vivo en un paciente o sujeto en el sitio de administración, o en el sitio de acción, que se considerarían dentro del intervalo normal en un paciente.
[0083] En la presente para describir la secuencia de polinucleótidos de cadena dobles se usa la convención estándar (5' a 3').
[0084] El término "población", como se usa en la presente, significa una colección de componentes como polinucleótidos, porciones o polinucleótidos o proteínas. Una "población mixta" significa una colección de componentes que pertenecen a la misma familia de ácidos nucleicos o proteínas (es decir, están relacionados) pero que difieren en su secuencia (es decir, no son idénticos) y, por lo tanto, en su actividad biológica.
[0085] Una molécula que tiene una "proforma" se refiere a una molécula que experimenta cualquier combinación de una o más modificaciones químicas covalentes y no covalentes (por ejemplo, glicosilación, escisión proteolítica, dimerización u oligomerización, cambio conformacional inducido por temperatura o inducido por pH, asociación con un cofactor, etc.) para alcanzar una forma molecular más madura que tiene una diferencia de propiedades (por ejemplo, un aumento en la actividad) en comparación con la molécula proforma de referencia. Cuando pueden distinguirse dos o más modificaciones químicas (por ejemplo, dos escisiones proteolíticas, o una escisión proteolítica y una desglicosilación) en el camino hacia la producción de una molécula madura, la molécula precursora de referencia puede denominarse molécula "preproforma".
[0086] Como se usa en la presente, el término "receptor" se refiere a una molécula que tiene afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores pueden emplearse en estado inalterado o como agregados con otras especies. Los receptores pueden estar unidos, de manera covalente o no covalente, a un miembro de unión, ya sea directamente o a través de una sustancia de unión específica. Los ejemplos de receptores incluyen, entre otros, anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinantes antigénicos específicos (como en virus, células u otros materiales), receptores de membrana celular, carbohidratos complejos y glicoproteínas, enzimas y receptores hormonales.
[0087] El término "reordenamiento reductor", como se usa en la presente, se refiere al aumento de la diversidad molecular que se acumula a través de eventos de deleción (y/o inserción) mediados por secuencias repetidas.
[0088] El término "sitio de restricción", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de reconocimiento que es necesaria para la manifestación de la acción de una enzima de restricción, e incluye un sitio de escisión catalítica. Se aprecia que un sitio de escisión puede estar contenido o no dentro de una porción de un sitio de restricción que comprende una secuencia de baja ambigüedad (es decir, una secuencia que contiene el determinante principal de la frecuencia de aparición del sitio de restricción). Cuando se dice que una enzima (por ejemplo, una enzima de restricción) "escinde" un polinucleótido, se entiende que significa que la enzima de restricción cataliza o facilita la escisión de un polinucleótido.
[0089] Como se usa en la presente, el término "anticuerpo de cadena sencilla" se refiere a un polipéptido que comprende un dominio VH y un dominio VL en enlace polipeptídico, generalmente enlazado a través de un péptido espaciador, y que puede comprender secuencias de aminoácidos adicionales en los extremos terminales amino y/o carboxi. Por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla puede comprender un segmento de anclaje para enlazarse con el polinucleótido codificante. Por ejemplo, un scFv es un anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla son generalmente proteínas que consisten en uno o más segmentos polipeptídicos de por lo menos 10 aminoácidos contiguos codificados sustancialmente por genes de la superfamilia de inmunoglobulinas (por ejemplo, véase The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams y A. N. Barclay, en Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, y THE. Rabbits, eds., (1989) Academic press: San Diego, California, págs. 361-368), codificados con mayor frecuencia por una secuencia genética de cadena pesada o ligera de roedor, primate no humano, aviar, porcino, bovino, ovino, caprino o humano. Un anticuerpo funcional de cadena sencilla contiene generalmente una porción suficiente de un producto génico de la superfamilia de las inmunoglobulinas para conservar la propiedad de unirse a una molécula diana específica, típicamente un receptor o antígeno (epítopo).
[0090] Se dice que los miembros de un par de moléculas (por ejemplo, un par anticuerpo-antígeno y un par ligandoreceptor) se "unen específicamente" entre sí si se unen entre sí con mayor afinidad que a otras moléculas no específicas. Por ejemplo, un anticuerpo generado contra un antígeno al que se une más eficazmente que a una proteína no específica puede describirse como que se une específicamente al antígeno.
[0091] El término "estimulación", como se usa en la presente significa una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando afín, mediando de este modo un evento de transducción de señales como, entre otros, la transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, como la regulación por disminución de TGF-p, y/o la reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.
[0092] El término "molécula estimuladora", como se usa en la presente, significa una molécula en una célula T que se une específicamente con un ligando estimulador afín presente en una célula presentadora de antígeno.
[0093] El término "ligando estimulador", como se usa en la presente, se refiere a un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse específicamente con un compañero de unión afín (denominado en la presente "molécula estimulante") en una célula T, mediando de este modo una respuesta primaria de la célula T que incluye, entre otras, la activación, el inicio de una respuesta inmunitaria, la proliferación y similares. Los ligandos estimuladores son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula de MHC de Clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28, y un anticuerpo superagonista anti-CD2.
[0094] El término "célula diana", como se usa en la presente, se refiere a las células que están implicadas en una enfermedad y a las que pueden dirigirse las células citotóxicas modificadas genéticamente de la invención (incluyendo, entre otras, las células T, las células NK y los macrófagos modificados genéticamente). Otras células diana serán evidentes para los expertos en la materia y pueden usarse en relación con realizaciones alternativas de la invención.
[0095] Los términos "célula T" y "linfocito T" son intercambiables y en la presente se usan como sinónimos. Los ejemplos incluyen, entre otros, células T vírgenes, células T de memoria central, células T de memoria efectora y combinaciones de las mismas.
[0096] El término "transducción" como se usa en la presente se refiere a la introducción de un ácido nucleico extraño en una célula usando un vector viral. "Transfección", como se usa en la presente, se refiere a la introducción de un ácido nucleico extraño en una célula usando tecnología de ADN recombinante. El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "extraño" (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula huésped, de tal manera que la célula huésped exprese el gen o secuencia introducidos para producir una sustancia deseada, como una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. El gen o secuencia introducido también puede denominarse gen o secuencia "clonado" o "extraño", puede incluir secuencias reguladoras o de control, como secuencias de inicio, parada, promotoras, de señalización, de secreción u otras secuencias usadas por la maquinaria genética de una célula. El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin función conocida. Una célula huésped que recibe y expresa ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformante" o un "clon". El ADN o ARN introducido en una célula huésped puede proceder de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula huésped, o células de un género o especie diferente
[0097] El término "tratar" incluye: (1) prevenir o retrasar la aparición de síntomas clínicos del estado, trastorno o afección en desarrollo en un animal que puede estar afligido o predispuesto al estado, trastorno o afección pero que aún no experimenta o presenta síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o afección; (2) inhibir el estado, trastorno o afección (es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad, o una recaída de la misma en caso de tratamiento de mantenimiento, de por lo menos un síntoma clínico o subclínico de la misma); y/o (3) aliviar la afección (es decir, provocar la regresión del estado, trastorno o afección o de por lo menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos). El beneficio para un paciente a tratar o es estadísticamente significativo o por lo menos perceptible para el paciente o para el médico.
[0098] "Tumor", como se usa en la presente, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligna o benigna, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
[0099] Como se usa en la presente, el término "microambiente tumoral" se refiere a todos y cada uno de los elementos del medio tumoral, incluyendo los elementos que crean un entorno estructural y/o funcional para que la enfermedad maligna sobreviva y/o se expanda y/o se extienda.
[0100] Como se usa en la presente, el término "segmento variable" se refiere a una porción de un péptido naciente que comprende una secuencia de núcleo aleatoria, pseudoaleatoria o definida. Un "segmento variable" se refiere a una porción de un péptido naciente que comprende una secuencia de núcleo aleatoria, pseudoaleatoria o definida. Un segmento variable puede comprender posiciones de residuos tanto variantes como invariantes, y el grado de variación de residuos en una posición de residuo variante puede ser limitado: ambas opciones se seleccionan a discreción del profesional. Típicamente, los segmentos variables tienen aproximadamente de 5 a 20 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, de 8 a 10), aunque los segmentos variables pueden ser más largos y pueden comprender porciones de anticuerpos o proteínas receptoras, como un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión a ácido nucleico, una proteína receptora, y similares.
[0101] "Vector", "vector de clonación" y "vector de expresión", como se usan en la presente, se refieren al vehículo mediante el cual puede introducirse una secuencia polinucleotídica (por ejemplo, un gen extraño) en una célula huésped, para transformar el huésped y promover la expresión (por ejemplo, la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc.
[0102] Como se usa en la presente, el término "de tipo salvaje" significa que el polinucleótido no comprende ninguna mutación. Una "proteína de tipo salvaje" o "proteína biológica de tipo salvaje", se refiere a una proteína que puede aislarse de la naturaleza que será activa a un nivel de actividad que se encuentra en la naturaleza y comprenderá la secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza. Los términos "molécula parental" y "proteína diana" también se refieren a la proteína de tipo salvaje. La "proteína de tipo salvaje" tiene preferiblemente algunas propiedades deseadas, como una mayor afinidad de unión, o actividad enzimática, que puede obtenerse mediante el cribado de una biblioteca de proteínas para una propiedad deseada, incluyendo una mejor estabilidad en diferentes entornos de temperatura o pH, o una selectividad y/o solubilidad mejoradas.
[0103] El término "trabajo", como en "muestra de trabajo", por ejemplo, es simplemente una muestra con la que se está trabajando. De igual manera, una "molécula de trabajo", por ejemplo, es una molécula con la que se está trabajando.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0104] Cabe señalar que, como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la presente los términos "un" (o "uno"), "uno o más" y "por lo menos uno" pueden usarse indistintamente. Los términos "que comprende", "que incluye", "que tiene" y "construido a partir de" también pueden usarse indistintamente.
[0105] La presente divulgación se dirige a un método para producir un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, dicho método comprendiendo los pasos de, generar la por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno que se une a un antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas a partir de una proteína parental o un dominio de la misma que se une específicamente con el antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas:
i) haciendo evolucionar el ADN que codifica la proteína parental o un dominio de la misma usando una o más técnicas evolutivas para crear ADN mutante;
ii) expresando los ADN mutantes para obtener polipéptidos mutantes;
iii) sometiendo los polipéptidos mutantes a un ensayo con un pH fisiológico normal y a un ensayo con un pH aberrante;
iv) seleccionando una región de direccionamiento específica de antígeno condicionalmente activa a partir de los polipéptidos mutantes expresados en el paso (iii) que presente una disminución de la actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo con el pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo con el pH aberrante, y
v) enlazando la por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular para producir el receptor de antígeno quimérico; y en donde el antígeno diana es un receptor de factor de crecimiento tirosina quinasa que está sobreexpresado en la superficie de las células cancerosas.
[0106] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del cáncer en un sujeto, en donde la célula citotóxica manipulada genéticamente se produce introduciendo un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un receptor de antígeno quimérico para unirse con un antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas, en una célula citotóxica obtenida del sujeto, en donde el receptor de antígeno quimérico comprende,
i) por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno que se une al antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas, dicha región de direccionamiento específica de antígeno siendo evolucionada a partir de una proteína parental o un dominio de la misma que se une a un antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas y que tiene una disminución de la actividad de unión al antígeno diana en un ensayo a un pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana en un ensayo a un pH aberrante;
ii) un dominio transmembrana; y
iii) un dominio de señalización intracelular; y
en donde el antígeno diana es un receptor del factor de crecimiento de tirosina quinasa que está sobreexpresado en la superficie de las células cancerosas.
[0107] Los CAR elaborados mediante el presente método tienen una región de direccionamiento específica de antígeno que presenta una disminución de la actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo a pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo a pH aberrante. Estos CAR pueden dirigir células citotóxicas a un sitio de la enfermedad en el que haya una condición aberrante, como un microambiente tumoral. Como resultado de estas propiedades, los CAR pueden dirigir preferentemente las células citotóxicas a un sitio de la enfermedad, mientras que debido a su baja afinidad por el tejido normal. Tales CAR pueden reducir drásticamente los efectos secundarios y permitir el uso de dosis más altas de agentes terapéuticos para aumentar la eficacia terapéutica. Los CAR son especialmente valiosos para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que se requieren durante periodos de tiempo cortos o limitados en un sujeto. Los ejemplos de aplicaciones beneficiosas se incluyen los tratamientos sistémicos a dosificaciones altas, así como los tratamientos localizados a concentraciones altas.
[0108] El receptor de antígeno quimérico puede incluir una región de direccionamiento específica de antígeno que tiene una disminución en una afinidad de unión al antígeno diana en el ensayo a un pH fisiológico normal en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o el dominio de la misma.
[0109] El receptor de antígeno quimérico puede incluir una región de direccionamiento específica de antígeno que tiene una actividad aumentada en el ensayo bajo pH aberrante en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o un dominio de la misma y una disminución en una afinidad de unión al antígeno diana a un pH fisiológico normal en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o el dominio de la misma.
[0110] En cualquiera de los receptores de antígenos quiméricos anteriores, la región de direccionamiento específica de antígeno también puede tener un aumento de selectividad en el ensayo al pH aberrante en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o un dominio de la misma.
[0111] Cualquiera de los receptores de antígenos quiméricos anteriores puede configurarse de tal manera que una proteína que contenga el receptor de antígenos quiméricos tenga un aumento del nivel de expresión en comparación con la proteína parental o un dominio de la misma.
RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS
[0112] El sistema inmunitario de los mamíferos, especialmente de los humanos, tiene células citotóxicas para dirigirse y destruir tejidos enfermos y/o patógenos. El uso de estas células citotóxicas para eliminar tejido no deseado (es decir, tejido diana), como tumores, es un enfoque terapéutico prometedor. Otros tejidos que pueden ser objeto de eliminación son la hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata), las verrugas y el tejido graso no deseado. Sin embargo, este enfoque terapéutico relativamente nuevo sólo ha tenido un éxito limitado hasta la fecha. Por ejemplo, el uso de células T para dirigirse y destruir tumores tiene relativamente pocos beneficios a largo plazo porque las células cancerosas pueden adaptarse a la nueva terapia reduciendo la expresión de antígenos de superficie para reducir la eficacia de esta terapia. Las células cancerosas pueden incluso desdiferenciarse para evadir la detección en respuesta a las células T específicas del tumor. Véase Maher, "Immunotherapy of Malignant Disease Using Chimeric Antigen Receptor Engrafted T Cells", ISRN Oncology, vol. 2012, ID del artículo 278093, 2012.
[0113] Las células citotóxicas que expresan receptores de antígenos quiméricos pueden mejorar significativamente la especificidad y sensibilidad de estas células citotóxicas. Por ejemplo, las células T que expresan un CAR (células CAR-T) son capaces de usar el CAR para dirigir las células T a células tumorales que expresan un antígeno de superficie celular que se une específicamente al CAR. Tales células CAR-T pueden administrar el agente citotóxico de manera más selectiva a las células tumorales. Las células CAR-T pueden reconocer directamente una molécula diana y, por tanto, normalmente no están restringidas por elementos de presentación polimórficos como los antígenos leucocitarios humanos (HLA). Las ventajas de esta estrategia de direccionamiento de CAR son triples. En primer lugar, como la función de las células CAR-T no depende del estatus de HLA, el mismo enfoque basado en CAR puede usarse en principio en todos los pacientes con tumores que expresen el mismo antígeno de superficie diana. En segundo lugar, la corrupción de la maquinaria de procesamiento y presentación de antígenos es un atributo común de las células tumorales y puede facilitar el escape inmunitario. Sin embargo, esto no ofrece ninguna protección frente a las células CAR-T. En tercer lugar, usando este sistema podemos dirigirnos a una variedad de macromoléculas, incluyendo proteínas, carbohidratos y glicolípidos.
[0114] Un receptor de antígeno quimérico del presente método comprende por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno (ASTR), un dominio transmembrana (TM) y un dominio de señalización intracelular (ISD). En algunas realizaciones, el CAR puede comprender además un dominio espaciador extracelular (ESD) y/o un dominio coestimulador (CSD). Véase la Figura 1.
[0115] La ASTR es una región extracelular del CAR para la unión a un antígeno diana específico, incluyendo proteínas, carbohidratos y glicolípidos. En algunas realizaciones, la ASTR comprende un anticuerpo, especialmente un anticuerpo de cadena sencilla, o un fragmento del mismo. La ASTR puede comprender una cadena pesada de longitud completa, un fragmento Fab, un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo divalente de cadena sencilla o un diábolo, cada uno de los cuales es específico del antígeno diana.
[0116] La ASTR también puede comprender otro dominio funcional proteico para reconocer y unirse al antígeno diana. Comoe el antígeno diana puede tener otras funciones biológicas, como actuar como receptor o ligando, la ASTR puede comprender alternativamente un dominio funcional para unirse específicamente al antígeno. Algunos ejemplos de proteínas con dominios funcionales incluyen citoquinas enlazadas (que llevan al reconocimiento de células portadoras del receptor de la citoquina), aficuerpos, dominios de unión a ligandos de receptores de origen natural, ligandos solubles de proteínas/péptidos para un receptor, por ejemplo en una célula tumoral. De hecho, en la ASTR puede usarse casi cualquier molécula que sea capaz de unirse a un antígeno dado con alta afinidad, como apreciarán los expertos en la materia.
[0117] En una realización, el CAR de la invención comprende por lo menos dos ASTR que se dirigen por lo menos a dos antígenos diferentes o a dos epítopos del mismo antígeno. En una realización, el CAR comprende tres o más ASTR que se dirigen por lo menos a tres o más antígenos o epítopos diferentes. Cuando hay una pluralidad de ASTR en el c Ar , las ASTR pueden estar dispuestas en tándem y pueden estar separadas por péptidos conectores (Figura 1).
[0118] En una realización, la ASTR comprende una cadena pesada de IgG de longitud completa que es específica para el antígeno diana y que tiene los dominios de Ig V<h>, CH1, bisagra, y los CH2 y CH3 (Fc), si el dominio V<h>por sí solo es suficiente para conferir especificidad antigénica ("anticuerpos de dominio único"). Si son necesarios tanto el dominio V<h>como el V<l>para generar una ASTR totalmente activa, el CAR que contiene V<h>y la cadena ligera lambda de longitud completa (IgL) se introducen ambas en la misma célula citotóxica para generar una ASTR activa. En otra realización, cada ASTR del CAR comprende por lo menos dos fragmentos variables de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), cada uno específico para un antígeno diana diferente. Los scFv, en los que el extremo C-terminal de un dominio variable (V<h o>V<l>) está conectado al extremo N-terminal del otro dominio variable (V<l o>V<h>, respectivamente) mediante un conector polipeptídico, se han desarrollado sin alterar significativamente la unión al antígeno o la especificidad de la unión (Chaudhary et al., "A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin," Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 87, página 9491, 1990; Bedzyk et al.," "Immunological and structural characterization of a high affinity anti-fluorescein single-chain antibody," J. Biol. Chem., vol. 265, página 18615, 1990). Estos scFv carecen de las regiones constantes (Fc) presentes en las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo nativo. Los scFv, específicos para por lo menos dos antígenos diferentes, están dispuestos en tándem. En una realización, entre la ASTR y el dominio transmembrana puede estar enlazado un dominio espaciador extraceluar.
[0119] En otra realización, un fragmento scFv puede fusionarse a la totalidad o a una parte de los dominios constantes de la cadena pesada. En una realización adicional, una ASTR de la CAR comprende un fragmento variable de cadena sencilla divalente (o bivalente) (di-scFv, bi-scFv). En los CAR que comprenden di-scFv, dos scFv específicos cada uno para un antígeno se enlazan entre sí para formar una única cadena peptídica con dos regiones VHy dos regiones VL(Xiong et al., "Development of tumor targeting anti-MUC-1 multimer: effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation and tumor binding", Protein Engineering Design and Selection, vol. 19, págs. 359-367, 2006; Kufer et al., "A revival of bispecific antibodies", Trends in Biotechnology, vol. 22, págs. 238-244, 2004).
[0120] En otra realización más, una ASTR comprende un diacuerpo. En un diacuerpo, los scFv se crean con péptidos conectores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas, lo que hace que los scFv se dimericen. Los conectores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) llevan a la formación de trímeros, los llamados triacuerpos o tricuerpos. En la ASTR también pueden usarse tetracuerpos.
[0121] Cuando hay dos o más ASTR en un CAR, las ASTR están conectadas entre sí covalentemente en una única cadena polipeptídica, a través de un conector oligo o polipeptídico, una bisagra Fc o una región de bisagra de membrana.
[0122] Los antígenos a los que se dirige el CAR del presente método están presentes en la superficie de las células cancerosas de un tejido que se pretende eliminar, como los tumores. Los antígenos de superficie son reconocidos y unidos más eficientemente por la ASTR de los CAR. Los antígenos diana son preferiblemente específicos del cáncer.
Ejemplos de antígenos diana incluyen antígenos expresados por varias células inmunitarias, carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemia, tumores de células germinales, blastemas y células asociadas a varias enfermedades hematológicas, autoinmunes y/o inflamatorias.
[0123] Los antígenos específicos del cáncer a los que puede dirigirse la ASTR incluyen uno o más de C-MET, EGFR, quinasa receptora del factor dispersante humano, receptor de IGF-1, IGF-I, TGF beta 2, TGF-p, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 o vimentina.
[0124] Ejemplos adicionales de antígenos diana incluyen proteínas de superficie que se encuentran en células cancerosas de manera específica o amplificada, por ejemplo EGF-R para cáncer de pulmón, y la proteína HER-2 que a menudo se amplifica en carcinomas humanos de mama y ovario, El dominio espaciador extracelular del CAR es una región hidrófila que está situada entre la ASTR y el dominio transmembrana. En algunas realizaciones, este dominio facilita el plegamiento proteico correcto del CAR. El dominio espaciador extracelular es un componente opcional del CAR. El dominio espaciador extracelular puede comprender un dominio seleccionado entre fragmentos Fc de anticuerpos, regiones bisagra de anticuerpos, regiones CH2 de anticuerpos, regiones CH3 de anticuerpos, secuencias espaciadoras artificiales o combinaciones de las mismas. Ejemplos de dominios espaciadores extracelulares incluyen la bisagra de CD8a, espaciadores artificiales hechos de polipéptidos que pueden sertan pequeños como, tres glicinas (Gly), así como dominios CH1 y CH3 de IgG (como IgG4 humana).
[0125] El dominio transmembrana del CAR es una región capaz de atravesar la membrana plasmática de las células citotóxicas. El dominio transmembrana se selecciona de una región transmembrana de una proteína transmembrana como, por ejemplo, proteínas transmembrana de Tipo I, una secuencia hidrófoba artificial o una combinación de las mismas. Ejemplos del dominio transmembrana incluyen las regiones transmembrana de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Los dominios transmembrana sintéticos pueden comprender un triplete de fenilalanina, triptófano y valina. Opcionalmente, el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular del CAR lo puede formar un conector oligo- o polipeptídico corto, preferiblemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud,. Un doblete glicina-serina proporciona un conector particularmente adecuado entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular.
[0126] El CAR de la invención también comprende un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular transduce la señal de función efectora y dirige a la célula citotóxica para que realice su función especializada, es decir, dañar y/o destruir las células diana. Ejemplos del dominio de señalización intracelular incluyen la cadena Z del complejo receptor de células T o cualquiera de sus homólogos, por ejemplo, cadena n, cadenas FcsRly y p, cadena MB 1 (iga), cadena B29 (Ig), etc., cadena zeta CD3 humana, polipéptidos de CD3 (A, 8 y £), tirosina quinasas de la familia syk (Syk, ZAP 70, etc.), tirosina quinasas de la familia src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) y otras moléculas implicadas en la transducción de células T, como CD2, CD5 y CD28. Específicamente, el dominio de señalización intracelular puede ser la cadena zeta de CD3 humana, FcyRIII, FcsRI, colas citoplasmáticas de receptores Fc, un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) que lleva receptores citoplasmáticos y combinaciones de los mismos.
[0127] Los dominios de señalización intracelular usados en el CAR pueden incluir dominios de señalización intracelular de varios tipos de varios otros receptores de señalización inmunitaria incluyendo, entre otros, proteínas de señalización de células T de primera, segunda y tercera generación, incluyendo receptores de CD3, costimuladores de la familia B7 y receptores de la superfamilia del Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNFR) (Park et al., "Are all chimeric antigen receptors created equal?" J Clin Oncol., vol. 33, págs. 651-653, 2015). Además, los dominios de señalización intracelular incluyen dominios de señalización usados por las células NK y NKT (Hermanson, et al., "Utilizing chimeric antigen receptors to direct natural killer cell activity," Front Immunol., vol. 6, pág.195, 2015) como los dominios de señalización de NKp30 (B7-H6) (Zhang et al., "An NKp30-based chimeric antigen receptor promotes T cell effector functions and antitumor efficacy in vivo," J Immunol., vol. 189, págs.2290-2299, 2012),y DAP12 (Topfer et al., "DAP12- based activating chimeric antigen receptor for NK cell tumor immunotherapy," J Immunol., vol. 194, págs.3201-3212, 2015), NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10, y CD3z. Además, los dominios de señalización intracelular también incluyen dominios de señalización de receptores de inmunoglobulina humanos que contienen un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) como FcgammaRI, FcgammaRIIA, FcgammaRIIC, FcgammaRIIIA, FcRL5 (Gillis et al., "Contribution of Human F<cy>R<s>to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies," Front Immunol., vol. 5, pág. 254, 2014).
[0128] En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización citoplasmático de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, o CD66d. Se prefiere en particular que el dominio de señalización intracelular en el CAR comprenda un dominio de señalización citoplasmático de CD3 zeta humano.
[0129] El CAR de la presente invención puede comprender un dominio coestimulador, que tiene la función de potenciar la proliferación celular, la supervivencia celular y el desarrollo de células de memoria para las células citotóxicas que expresan el CAR. El c Ar de la invención puede comprender uno o más dominios coestimuladores seleccionados entre dominios coestimuladores de proteínas de la superfamilia TNFR, CD28, CD137 (4-lBB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD7, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD1 la/CD18), Lck, TNFR-I, PD-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS LIGHt , NKG2C, B7-H3, o combinaciones de los mismos. Si el CAR comprende más de un dominio coestimulador, estos dominios pueden disponerse en tándem, opcionalmente separados por un conector. El dominio coestimulador es un dominio intracelular que puede estar situado entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular en el CAR.
[0130] En algunas realizaciones, dos o más componentes del CAR de la invención están separados por uno o más conectores. Por ejemplo, en un CAR que comprende por lo menos dos ASTR, las dos ASTR pueden estar separadas por un conector. Los conectores son regiones oligo- o polipeptídicas de aproximadamente 1 a 100 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los conectores pueden tener, por ejemplo, de 5 a 12 aminoácidos de longitud, de 5 a 15 aminoácidos de longitud o de 5 a 20 aminoácidos de longitud. Los conectores pueden estar compuestos de residuos flexibles como la glicina y la serina, de tal manera que los dominios proteicos adyacentes puedan moverse libremente entre sí. En relación con realizaciones alternativas de la invención pueden usarse conectores más largos, por ejemplo de más de 100 aminoácidos, y pueden seleccionarse, por ejemplo, para garantizar que dos dominios adyacentes no interfieran estéricamente entre sí. Los ejemplos de conectores que pueden usarse en la presente invención incluyen, entre otros, conectores 2A (por ejemplo t 2a ), conectores similares a 2A o equivalentes funcionales de los mismos.
REGIÓN DE DIRECCIONAMIENTO ESPECÍFICA DE ANTÍGENO CONDICIONALMENTE ACTIVA
[0131] Los CAR son proteínas quiméricas que se generan fusionando todos los dominios diferentes analizados con anterioridad para formar una proteína de fusión. El CAR se genera típicamente mediante un vector de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican los diferentes dominios del CAR. La ASTR de la presente invención, que funciona para reconocer y unirse a un antígeno en células diana, es condicionalmente activo. Específicamente, la ASTR presenta una disminución de la actividad en la unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo a un pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad en la unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo a un pH aberrante. La presente invención proporciona un método para generar la ASTR condicionalmente activa a partir de una proteína o dominio parental (ASTR de tipo salvaje).
[0132] La proteína parental que es adecuada para ser usada en su totalidad o en parte para por lo menos su dominio de unión al antígeno diana, como una ASTR en la presente invención puede descubrirse generando una biblioteca de proteínas y cribando la biblioteca para una proteína con una afinidad de unión deseada al antígeno diana. La proteína parental puede descubrirse cribando una biblioteca de ADNc. Una biblioteca de ADNc es una combinación de fragmentos de ADNc clonados (ADN complementario) insertados en una colección de células huésped, que juntos constituyen una parte del transcriptoma del organismo. El ADNc se produce a partir de ARNm completamente transcrito y, por lo tanto, contiene la secuencia codificante de las proteínas expresadas de un organismo. La información contenida en las bibliotecas de ADNc es una herramienta poderosa y útil para descubrir proteínas con las propiedades deseadas mediante el cribado de las bibliotecas para proteínas con la afinidad de unión deseada al antígeno diana.
[0133] En algunas realizaciones en las que las proteínas de tipo salvaje son anticuerpos, los anticuerpos de tipo salvaje pueden descubrirse generando y cribando bibliotecas de anticuerpos. Las bibliotecas de anticuerpos pueden ser bibliotecas de anticuerpos policlonales o bibliotecas de anticuerpos monoclonales. Una biblioteca de anticuerpos policlonales contra un antígeno diana puede generarse por inyección directa del antígeno en un animal o administrando el antígeno a un animal no humano. Los anticuerpos así obtenidos representan una biblioteca de anticuerpos policlonales que se unen al antígeno. Para la preparación de bibliotecas de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma, la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma del VEB (véase, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Las técnicas descritas para la generación de anticuerpos de cadena sencilla (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.946.778) pueden adaptarse para producir una biblioteca de anticuerpos de cadena sencilla.
[0134] Existen otros métodos para la generación y cribado de bibliotecas de anticuerpos para el descubrimiento del anticuerpo de tipo salvaje. Por ejemplo, pueden utilizarse bibliotecas de presentación de anticuerpos completamente humanos. Dicha biblioteca es una población de anticuerpos presentados en la superficie de la célula o células huésped. Preferiblemente, la biblioteca de anticuerpos es representativa del repertorio humano de anticuerpos en el sentido de que tienen la capacidad de unirse a una amplia variedad de antígenos. Como los anticuerpos se presentan en la superficie de las células, se aumenta la afinidad efectiva (debida a la avidez) de cada anticuerpo de la biblioteca. A diferencia de otros tipos de bibliotecas populares, como las bibliotecas de presentación en fagos, en las que la avidez de los anticuerpos para propósitos de cribado e identificación es menos deseable, la superavidez proporcionada por la presentación en la superficie celular en la presente invención, es deseable. Las bibliotecas de presentación en la superficie celular permiten la identificación de anticuerpos con afinidad de unión baja, media y alta, así como la identificación de epítopos no inmunogénicos y débiles en el paso de cribado o selección.
GENERACIÓN DE MOLÉCULAS EVOLUCIONADAS A PARTIR DE LA MOLÉCULA PARENTAL
[0135] La proteína parental, o su dominio de unión (ASTR de tipo salvaje) se somete a un proceso de mutagénesis para producir una población de polipéptidos mutantes, que a continuación pueden cribarse para identificar una ASTR mutante que presenta una disminución de la actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo a un pH fisiológico normal, en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo al pH aberrante.
[0136] Para generar la población de polipéptidos mutantes puede usarse cualquier método químico sintético o mutagénico recombinante. La puesta en práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la capacidad de la técnica. Tales técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de Estados Unidos N° 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Cabs eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymnology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes l-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
[0137] Para generar un mutante de ácido nucleico que codifique un polipéptido mutante condicionalmente activo, los siguientes pasos pueden incluir modificar el ácido nucleico mediante (i) la sustitución de uno o más nucleótidos por un nucleótido diferente, en donde el nucleótido comprende un nucleótido natural o no natural; (ii) la supresión de uno o más nucleótidos, (iii) la adición de uno o más nucleótidos, o (iv) cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, el nucleótido no natural comprende inosina. En otro aspecto, el método comprende además ensayar los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados para actividad enzimática alterada, identificando de este modo el ácido o ácidos nucleicos modificados que codifican un polipéptido que tiene actividad enzimática alterada. En un aspecto, las modificaciones del paso (a) se realizan por<p>C<r>,<p>C<r>propensa a errores, barajado, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis en casete, mutagénesis en conjunto recursiva, mutagénesis en conjunto exponencial, mutagénesis específica del sitio, reensamblaje de genes, mutagénesis saturada de sitio génico, reacción en cadena de la ligasa, mutagénesis in vitro, reacción en cadena de la ligasa, síntesis de oligonucleótidos, cualquier técnica de generación de ADN y cualquier combinación de las mismas. En otro aspecto, el método comprende además por lo menos una repetición del paso de modificación.
[0138] La divulgación proporciona además un método para elaborar un polinucleótido a partir de dos o más ácidos nucleicos, el método comprendiendo: (a) identificar regiones de identidad y regiones de diversidad entre dos o más ácidos nucleicos, en donde por lo menos uno de los ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico de la divulgación; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos que corresponden en secuencia a por lo menos dos de los dos o más ácidos nucleicos; y (c) extender los oligonucleótidos con una polimerasa, elaborando de este modo el polinucleótido.
[0139] En varias realizaciones de la divulgación puede emplearse cualquiertécnica de mutagénesis. La mutagénesis estocástica o aleatoria se ejemplifica mediante una situación en la que una molécula parental es mutada (modificada o cambiada) para producir un conjunto de moléculas progenie que tienen mutación o mutaciones que no están predeterminadas. Por tanto, en una reacción de mutagénesis estocástica in vitro, por ejemplo, no existe un producto predeterminado particular cuya producción se pretenda; más bien hay una incertidumbre, por lo tanto aleatoriedad, con respecto a la naturaleza exacta de las mutaciones logradas y, por tanto, también con respecto a los productos generados. La mutagénesis estocástica se manifiesta en procesos como la PCR propensa a errores y el barajado estocástico, en donde la mutación o mutaciones logradas son aleatorias o no predeterminadas. Las formas variantes pueden generarse por transcripción propensa a errores, como una PCR propensa a errores o el uso de una polimerasa que carece de actividad de lectura de prueba (véase Liao (1990) Gene 88: 107-111), de la primera forma variante, o por replicación de la primera forma en una cepa mutadora (las células huésped mutadoras se analizan con más detalle a continuación, y en general son bien conocidas). Una cepa mutadora puede incluir cualquier mutante de cualquier organismo que tenga alteradas las funciones de reparación de malapareamientos. Estos incluyen productos génicos mutantes de mutS, mutT, mutH, mutL, ovrD, dcm, vsr, umuC, umuD, sbcB, recJ, etc. La alteración se logra por mutación genética, sustitución alélica, inhibición selectiva mediante un reactivo añadido, como un compuesto pequeño o un ARN antisentido expresado, u otras técnicas. La alteración puede ser de los genes indicados o de genes homólogos de cualquier organismo.
[0140] Otros métodos de mutagénesis incluyen las tecnologías de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, las reacciones en cadena de la polimerasa propensas a errores (PCR propensa a errores) y la mutagénesis en casete, en la que una región específica del polinucleótido parental se sustituye por un oligonucleótido mutagenizado sintéticamente. En estos casos, se genera una serie de sitios mutantes alrededor de ciertos sitios de la secuencia parental.
[0141] En la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, una secuencia corta se sustituye por un oligonucleótido mutagenizado sintéticamente. En la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, se elimina una secuencia corta del polinucleótido del polinucleótido usando digestión con enzimas de restricción y se sustituye por un polinucleótido sintético en el que se han alterado varias bases de la secuencia parental. La secuencia polinucleotídica también puede alterarse mediante mutagénesis química. Los mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito sódico, ácido nitroso, hidroxilamina, hidracina o ácido fórmico. Otros agentes que son análogos de los precursores de nucleótidos incluyen la nitrosoguanidina, el 5-bromouracilo, la 2-aminopurina o la acridina. Generalmente, estos agentes se añaden a la reacción de PCR en lugar del precursor nucleotídico, mutando de este modo la secuencia. También pueden usarse agentes intercalantes como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares. La mutagénesis aleatoria de la secuencia polinucleotídica también puede lograrse mediante irradiación con rayos X o luz ultravioleta. Generalmente, los polinucleótidos plasmídicos mutagenizados de este modo se introducen en E. coli y se propagan como un grupo o biblioteca de plásmidos híbridos.
[0142] La PCR propensa a errores usa condiciones de polimerización de baja fidelidad para introducir un bajo nivel de mutaciones puntuales aleatoriamente en una secuencia larga. En una mezcla de fragmentos de secuencia desconocida, para mutagenizar la mezcla puede usarse la PCR propensa a errores.
[0143] En la mutagénesis en casete, un bloque de secuencia de una plantilla única se sustituye típicamente por una secuencia (parcialmente) aleatorizada. Reidhaar-Olson J F y Sauer R T: Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science 241(4861):53-57, 1988.
[0144] Alternativamente, en varias realizaciones de la divulgación puede emplearse cualquier técnica de mutagénesis no estocástica o no aleatoria. La mutagénesis no estocástica se ejemplifica mediante una situación en la que se muta (modifica o cambia) una molécula original para producir una molécula progenie que tiene una o más mutaciones predeterminadas. Se aprecia que la presencia de productos de fondo en cierta cantidad es una realidad en muchas reacciones en las que se produce el procesamiento molecular, y la presencia de estos productos de fondo no resta valor a la naturaleza no estocástica de un proceso de mutagénesis que tiene un producto predeterminado. La mutagénesis por saturación de sitio y el reensamblaje por ligación sintética son ejemplos de técnicas de mutagénesis en las que la estructura o estructuras químicas exactas del producto o productos previstos están predeterminadas.
[0145] Un método de mutagénesis por saturación de sitio se divulga en la publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos 2009/0130718. Este método proporciona un conjunto de cebadores degenerados correspondientes a codones de un polinucleótido plantilla, y realiza elongación polimerasa para producir polinucleótidos progenie, que contienen secuencias correspondientes a los cebadores degenerados. Los polinucleótidos progenie pueden expresarse y cribarse para la evolución dirigida. Específicamente, este es un método para producir un conjunto de polinucleótidos progenie, que comprende los pasos de (a) proporcionar copias de un polinucleótido plantilla, cada una comprendiendo una pluralidad de codones que codifican una secuencia polipeptídica plantilla; y (b) para cada codón del polinucleótido plantilla, realizar los pasos de (1) proporcionar un conjunto de cebadores degenerados, donde cada cebador comprende un codón degenerado correspondiente al codón del polinucleótido plantilla y por lo menos una secuencia adyacente que es homóloga a una secuencia adyacente al codón del polinucleótido plantilla; (2) proporcionar condiciones que permitan que los cebadores se apareen con las copias de los polinucleótidos plantilla; y (3) realizar una reacción de elongación de la polimerasa a partir de los cebadores a lo largo del plantilla; produciendo de este modo polinucleótidos progenie, cada uno de los cuales contiene una secuencia correspondiente al codón degenerado del cebador apareado; produciendo de este modo un conjunto de polinucleótidos progenie. La mutagénesis por saturación de sitio se refiere a la evolución dirigida de ácidos nucleicos y el cribado de clones que contienen los ácidos nucleicos evolucionados para la actividad de unión resultante de interés.
[0146] La mutagénesis por saturación de sitio se refiere en general a un método de: 1) preparar una molécula o moléculas de generación de progenie (incluyendo una molécula que se compone de una secuencia polinucleotídica, una molécula que se compone de una secuencia polipeptídica, y una molécula que se compone en parte de una secuencia polinucleotídica y en parte de una secuencia polipeptídica), que se mutageniza para lograr por lo menos una mutación puntual, adición, deleción, y/o quimerización, a partir de una o más plantillas de generación ancestral o parental; 2) cribar la molécula o moléculas de la generación progenitora, preferiblemente usando un método de alto rendimiento, para obtener la afinidad de unión deseada con el antígeno diana; 3) opcionalmente, obtener y/o catalogar la información estructural y/o funcional referente a las moléculas de la generación parental y/o progenitora; y 4) opcionalmente, repetir cualquiera de los pasos 1) a 3).
[0147] En la mutagénesis por saturación de sitio, se genera (por ejemplo, a partir de una plantilla de polinucleótidos parentales), en lo que se denomina "mutagénesis por saturación de sitio de codones", una generación progenie de polinucleótidos, cada uno teniendo por lo menos un conjunto de hasta tres mutaciones puntuales contiguas (es decir, diferentes bases que comprenden un nuevo codón), de tal manera que cada codón (o cada familia de codones degenerados que codifican el mismo aminoácido) está representado en cada posición de codón. En correspondencia con esta generación de polinucleótidos progenie, y codificados por ella, también se genera un conjunto de polipéptidos progenie, cada uno de los cuales teniendo por lo menos una única mutación puntual de aminoácidos. En un aspecto preferido, se genera, en lo que se denomina "mutagénesis de saturación de sitio de aminoácidos", un polipéptido mutante de este tipo para cada uno de los 19 polipéptidos codificados de manera natural, formando sustituciones de alfa-aminoácidos en todas y cada una de las posiciones de aminoácidos a lo largo del polipéptido. Esto produce, para todas y cada una de las posiciones de aminoácidos a lo largo del polipéptido parental, un total de 20 polipéptidos de progenie distintos que incluyen el aminoácido original, o potencialmente más de 21 polipéptidos progenitores distintos si se usan aminoácidos adicionales en lugar o además de los 20 aminoácidos codificados de manera natural.
[0148] También pueden emplearse otras técnicas de mutagénesis que impliquen recombinación y, más concretamente, un método para preparar polinucleótidos que codifiquen un polipéptido mediante un método de reordenación in vivo de secuencias polinucleotídicas que contengan regiones de homología parcial, ensamblando los polinucleótidos para formar por lo menos un polinucleótido y cribando los polinucleótidos para la producción de polipéptido o polipéptidos que tengan una propiedad útil.
[0149] En otro aspecto, las técnicas de mutagénesis explotan la propiedad natural de las células de recombinar moléculas y/o de mediar procesos reductores que reducen la complejidad de las secuencias y la extensión de secuencias repetidas o consecutivas que poseen regiones de homología.
[0150] Para proporcionar un método para generar polinucleótidos híbridos que codifican polipéptidos híbridos biológicamente activos pueden usarse varias técnicas de mutagénesis de manera individual o en combinación. Para lograr estos y otros objetos, de acuerdo con un aspecto de la divulgación, se ha proporcionado un método para introducir polinucleótidos en una célula huésped adecuada y hacer crecer la célula huésped en condiciones que produzcan polipéptidos híbridos.
[0151] Los genes quiméricos se han elaborado uniendo 2 fragmentos de polinucleótidos usando extremos pegajosos compatibles generados por enzima o enzimas de restricción, donde cada fragmento deriva de una molécula progenitora (o parental) separada. Otro ejemplo es la mutagénesis de una única posición de codón (es decir, para lograr una sustitución, adición o deleción de codón) en un polinucleótido parental para generar un único polinucleótido de progenie que codifique para un único polipéptido mutagenizado en el sitio.
[0152] Además, para generar híbridos de genes se han usado sistemas de recombinación in vivo específica de sitio, así como métodos aleatorios de recombinación in vivo, y recombinación entre genes homólogos pero truncados en un plásmido. También se ha informado de mutagénesis por extensión solapada y PCR.
[0153] Para lograr un mayor número de mutaciones puntuales y/o quimerizaciones se han usado métodos no aleatorios, por ejemplo, se han usado enfoques completos o exhaustivos para generar todas las especies moleculares dentro de una agrupación particular de mutaciones, para atribuir funcionalidad a grupos estructurales específicos en una molécula plantilla (por ejemplo, una posición específica de aminoácido individual o una secuencia compuesta de dos o más posiciones de aminoácidos), y para categorizary comparar agrupaciones específicas de mutaciones.
[0154] En la presente divulgación, para generar una nueva población de polipéptidos mutantes (biblioteca) a partir de la proteína de tipo salvaje pueden emplearse cualquiera de estos u otros métodos de evolución.
EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS EVOLUCIONADAS
[0155] Los polinucleótidos mutantes generados a partir del paso de evolución pueden, o no, fraccionarse por tamaño en un gel de agarosa de acuerdo con protocolos publicados, insertarse en un vector de expresión y transfectarse en una célula huésped apropiada para producir los polipéptidos mutantes (expresión). La expresión puede usar técnicas rutinarias de biología molecular. Por tanto, el paso de expresión puede usar varios métodos conocidos.
[0156] Por ejemplo, brevemente, los polinucleótidos mutantes generados a partir del paso de evolución luego se digieren y ligan en un vector de expresión, como ADN plasmídico usando técnicas estándar de biología molecular. A continuación, el vector se transforma en bacterias u otras células usando protocolos estándar. Esto puede hacerse en un pocillo individual de una bandeja de múltiples pocillos, como una bandeja de 96 pocillos para la expresión y el cribado de alto rendimiento. El proceso se repite para cada polinucleótido mutante.
[0157] Los polinucleótidos seleccionados y aislados como se ha descrito se introducen en una célula huésped adecuada. Una célula huésped adecuada es cualquier célula que sea capaz de promover la recombinación y/o el reordenamiento reductor. Los polinucleótidos seleccionados se encuentran preferiblemente ya en un vector que incluye secuencias de control apropiadas. La célula huésped puede ser una célula eucariota superior, como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, como una célula de levadura, o preferiblemente, la célula huésped puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede realizarse mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano o electroporación (por ejemplo, Eckery Davis, 1986, Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense<r>N<a>, Proc Natl Acad Sci USA, 83:5372-5376).
[0158] Como ejemplos representativos de vectores de expresión que pueden usarse, pueden mencionarse partículas víricas, baculovirus, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fosmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN viral (por ejemplo, vaccinia, adenovirus, virus de la viruela, pseudorabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales basados en Pl, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura y cualquier otro vector específico para huéspedes específicos de interés (como bacilos, aspergilos y levaduras). Así, por ejemplo, el ADN puede incluirse en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los expertos en la materia conocen una gran cantidad de vectores adecuados, que están disponibles comercialmente. A modo de ejemplo, se proporcionan los siguientes vectores; Bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). No obstante, puede usarse cualquier otro plásmido u otro vector siempre que sean replicables y viables en el huésped. Con respecto a la presente divulgación pueden emplearse vectores de bajo número de copias o de alto número de copias.
[0159] La secuencia polinucleotídica mutante en el vector de expresión está enlazada operativamente a una secuencia o secuencias de control de expresión apropiadas (promotoras) para dirigir la síntesis de ARN. Los promotores bacterianos particularmente nombrados incluyen lad, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucariotas incluyen el CMV temprano inmediato, la timidina quinasa del HSV, el SV40 temprano y tardío, los LTR de retrovirus y la metalotioneína-1 de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados está al alcance de cualquier experto en la materia. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Las regiones promotoras pueden seleccionarse a partir de cualquier gen deseado usando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables. Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células huésped transformadas, como la dihidrofolato reductasa o la resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucariotas, o como la resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli.
[0160] La transcripción del ADN eucariota puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector de expresión. Los potenciadores son secuencias que actúan en cis de entre 10 y 300 pb que aumentan la transcripción por un promotor. Los potenciadores pueden aumentar eficazmente la transcripción cuando se encuentran 5' o 3' de la unidad de transcripción. También son eficaces si se localizan dentro de un intrón o dentro de la propia secuencia codificante. Normalmente, se usan potenciadores virales, incluyendo potenciadores de SV40, potenciadores de citomegalovirus, potenciadores de polioma y potenciadores de adenovirus. También se usan comúnmente secuencias potenciadoras de sistemas de mamíferos, como el potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.
[0161] Los sistemas de vectores de expresión de mamíferos también incluyen típicamente un gen marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de la timidina quinasa (TK) o genes procarióticos que confieren resistencia a fármacos. Los dos primeros genes marcadores prefieren el uso de líneas celulares mutantes que carecen de la capacidad de crecer sin la adición de timidina al medio de crecimiento. Las células transformadas pueden identificarse entonces por su capacidad de crecer en medios no suplementados. Los ejemplos de genes procariotas de resistencia a fármacos útiles como marcadores incluyen los genes que confieren resistencia a G418, ácido micofenólico e higromicina.
[0162] Los vectores de expresión que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a células huésped mediante métodos bien conocidos, dependiendo del tipo de huésped de producción celular. Por ejemplo, para células huésped procariotas se utiliza comúnmente la transfección con cloruro de calcio, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, la lipofección o la electroporación pueden utilizarse para células huésped eucariotas. Otros métodos usados para transformar huéspedes mamíferos de producción celular incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección (véase, en general, Sambrook et al.,supra).
[0163] Una vez que el vector de expresión se ha introducido en un huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias polinucleotídicas mutantes introducidas para producir los polipéptidos mutantes. El vector de expresión es típicamente replicable en los organismos huéspedes, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de<a>D<n>deseadas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.704.362).
[0164] Por lo tanto, en otro aspecto de la divulgación, los polinucleótidos mutantes pueden generarse mediante el proceso de reordenación reductora. El método implica la generación de constructos que contienen secuencias consecutivas (secuencias codificantes parentales), su inserción en un vector apropiado y su posterior introducción en una célula huésped apropiada. El reordenamiento de las identidades moleculares individuales se produce mediante procesos combinatorios entre las secuencias consecutivas del constructo que poseen regiones de homología, o entre unidades cuasi repetidas. El proceso de reordenamiento recombina y/o reduce la complejidad y extensión de las secuencias repetidas, y da como resultado la producción de nuevas especies moleculares. Para aumentar la tasa de reordenación pueden aplicarse varios tratamientos. Estos podrían incluir el tratamiento con luz ultravioleta o productos químicos que dañan el ADN, y/o el uso de líneas celulares huésped que presentan niveles aumentados de "inestabilidad genética". Por tanto, el proceso de reordenación puede implicar la recombinación homóloga o la propiedad natural de las secuencias cuasi repetidas de dirigir su propia evolución.
[0165] A continuación, las células se propagan y se efectúa el "reordenamiento reductor". La tasa del proceso de reordenación reductora puede estimularse mediante la introducción de daños en el ADN si se desea, la reordenación in vivo se centra en procesos "intermoleculares" denominados colectivamente "recombinación" que, en bacterias, se considera generalmente un fenómeno "dependiente de RecA". La divulgación puede basarse en los procesos de recombinación de una célula huésped para recombinar y reordenar secuencias, o en la capacidad de las células para mediar en procesos reductores para disminuir la complejidad de secuencias cuasi repetidas en la célula por deleción. Este proceso de "reordenación reductora" se produce mediante un proceso "intramolecular", independiente de RecA. El resultado final es un reordenamiento de las moléculas en todas las combinaciones posibles.
[0166] En un aspecto, el organismo o célula huésped comprende una bacteria gramnegativa, una bacteria grampositiva o un organismo eucariota. En otro aspecto de la divulgación, la bacteria gramnegativa comprende Escherichia coli, o Pseudomonas fluorescens. En otro aspecto de la divulgación, la bacteria grampositiva comprende Streptomyces diversa, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, o Bacillus subtilis. En otro aspecto de la divulgación, el organismo eucariota comprende Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula plymorpha, o Aspergillus niger. Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, como levaduras; células de insectos, como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, como CHO, COS o Bowes melanoma; adenovirus; y células vegetales. La selección de un huésped apropiado se considera dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas de la presente.
[0167] Además de microorganismos eucariotas como la levadura, para expresar los polipéptidos mutantes de la presente invención también puede usarse el cultivo de células de tejido de mamífero (véase, Winnacker, "From Genes to Clones," VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)). Se prefieren las células eucariotas, porque en la técnica se han desarrollado una serie de líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen las líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células B o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev., vol. 89, página 49, 1986), y sitios de información de procesamiento necesarios, como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino y similares.
[0168] En una realización, las células huésped eucariotas se seleccionan entre líneas celulares CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MM1, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F, y SP2/0; y esplenocitos de ratón y PBMC de conejo. En un aspecto, la célula huésped de mamífero se selecciona de una línea celular CHO o HEK293. En un aspecto específico, la célula huésped de mamífero es una línea celular CHO-S. En otro aspecto específico, el sistema mamífero es una línea celular HEK293. En otra realización, el huésped eucariota es un sistema celular de levadura. En un aspecto, el huésped eucariota se selecciona entre células de levadura S. cerevisiae o células de levadura picchia.
[0169] En otra realización, las células huésped de mamífero pueden ser creadas comercialmente por una organización de investigación por contrato o de fabricación a medida. Por ejemplo, para anticuerpos recombinantes u otras proteínas, Lonza (Lonza Group Ltd, Basilea, Suiza) puede crear vectores para expresar estos productos usando la tecnología GS Gene Expression System™ con células huésped de producción CHOK1SV o NS0. Las células huésped que contienen los polinucleótidos de interés pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para los expertos en la materia.
METODOLOGÍAS DE CRIBADO Y DISPOSITIVOS DE MONITORIZACIÓN "EN LÍNEA"
[0170] En la puesta en práctica de los métodos de la divulgación, pueden usarse una variedad de aparatos y metodologías junto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, para cribar polipéptidos para actividad enzimática, para cribar compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores, de una actividad enzimática, para detectar anticuerpos que se unen a un polipéptido de la divulgación, para detectar ácidos nucleicos que hibridan con un ácido nucleico de la divulgación, para cribar células que expresan un polipéptido de la divulgación y similares. Matrices o "biochips"
[0171] Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la divulgación pueden inmovilizarse o aplicarse a una matriz. Las matrices pueden usarse para cribar o monitorizar bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su capacidad para unirse o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la divulgación. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, un parámetro monitorizado es la expresión del transcrito de un gen enzimático. Uno o más, o, todos los transcritos de una célula pueden medirse por hibridación de una muestra que comprende transcritos de la célula, o, ácidos nucleicos representativos o complementarios a transcritos de una célula, por hibridación a ácidos nucleicos inmovilizados en una matriz, o "biochip". Usando una "matriz" de ácidos nucleicos en un microchip, pueden cuantificarse simultáneamente algunos o todos los transcritos de una célula. Alternativamente, para determinar el genotipo de una cepa de nueva ingeniería hecha por los métodos de la divulgación también pueden usarse matrices que comprenden ácido nucleico genómico. Las "matrices de polipéptidos" también pueden usarse para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente divulgación puede ponerse en práctica con cualquier "matriz" conocida, también denominada "micromatriz" o "matriz de ácidos nucleicos" o "matriz de polipéptidos" o "matriz de anticuerpos" o "biochip", o variación de las mismas. Las matrices son genéricamente una pluralidad de "puntos" o "elementos diana", cada elemento diana comprendiendo una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, por ejemplo, oligonucleótidos, inmovilizados en un área definida de una superficie de sustrato para la unión específica a una molécula de muestra, por ejemplo, transcritos de ARNm.
[0172] En la puesta en práctica de los métodos de la divulgación, cualquier matriz conocida y/o método para elaborar y usar matrices en su totalidad o en parte, o variaciones de los mismos, se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6,277,628; 6,277,489; 6,261,776; 6,258,606; 6,054,270; 6,048,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,965,452; 5,959,098; 5,856,174; 5,830,645; 5,770,456; 5,632,957; 5,556,752; 5,143,854; 5,807,522; 5,800,992; 5,744,305; 5,700,637; 5,556,752; 5,434,049; véanse también, por ejemplo, los documentos WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; véase también, por ejemplo, Johnston (1998) "Gene chips: Array of hope for understanding gene regulation", Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) "Inexpensive Handheld Device for the Construction of High-Density Nucleic Acid Arrays", Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) "Direct hybridization of large-insert genomic clones on high-density gridded cDNA filter arrays", Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) "Matrix-Based Comparative Genomic Hybridization: Biochips to Screen for Genomic Imbalances", Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) "Options Available-From Start to Finish~for Obtaining Expression Data by Microarray", Nature Genetics Supp. 21:25-32. Véanse también las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas N° 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
MATRICES CAPILARES
[0173] En los métodos de la divulgación pueden usarse matrices capilares, como la GIGAMATRIX™ Diversa Corporation, San Diego, California. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de la divulgación pueden inmovilizarse o aplicarse a una matriz, incluyendo matrices capilares. Las matrices pueden usarse para cribar o monitorizar bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su capacidad para unirse o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la divulgación. Las matrices capilares proporcionan otro sistema para retener y cribar muestras. Por ejemplo, un aparato de cribado de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en una matriz de capilares adyacentes, en donde cada capilar comprende por lo menos una pared que define una luz para retener una muestra. El aparato puede incluir además material intersticial dispuesto entre capilares adyacentes en la matriz, y uno o más indicios de referencia formados dentro del material intersticial. Un capilar para el cribado de una muestra, en donde el capilar está adaptado para ser unido a una matriz de capilares, puede incluir una primera pared que define una luz para retener la muestra, y una segunda pared formada por un material filtrante, para filtrar la energía de excitación proporcionada a la luz para excitar la muestra. Puede introducirse un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo, un ligando, en un primer componente en por lo menos una porción de un capilar de una matriz capilar. Cada capilar de la matriz capilar puede comprender por lo menos una pared que define una luz para retener el primer componente. Puede introducirse una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Puede introducirse un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente está separado del primero por la burbuja de aire. Una muestra de interés puede introducirse como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de una matriz capilar, en donde cada capilar de la matriz capilar comprende por lo menos una pared que define una luz para retener el primer líquido y la partícula detectable, y en donde la por lo menos una pared está recubierta con un material de unión para unir la partícula detectable con la por lo menos una pared. El método puede incluir además retirar el primer líquido del tubo capilar, en donde la partícula detectable unida se mantiene dentro del capilar, e introducir un segundo líquido en el tubo capilar. La matriz capilar puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden por lo menos una pared exterior que define una luz. La pared exterior del capilar puede ser una o más paredes fusionadas entre sí. De manera similar, la pared puede definir una luz cilíndrica, cuadrada, hexagonal o de cualquier otra forma geométrica, siempre que las paredes formen una luz para la retención de un líquido o muestra. Los capilares de la matriz capilar pueden mantenerse juntos en estrecha proximidad para formar una estructura plana. Los capilares pueden estar unidos entre sí, por fusión (por ejemplo, cuando los capilares están hechos de vidrio), pegados, unidos o sujetados uno al lado del otro. La matriz capilar puede estar formada por cualquier cantidad de capilares individuales, por ejemplo, un intervalo de 100 a 4.000.000 de capilares. Una matriz capilar puede formar una microplaca de titulación que tenga aproximadamente 100.000 o más capilares individuales unidos entre sí.
MANIPULACIÓN DE ANTICUERPOS CONDICIONALMENTE ACTIVOS
[0174] Los anticuerpos condicionalmente activos pueden manipularse para generar anticuerpos condicionalmente activos multiespecíficos. El anticuerpo multiespecífico puede ser un anticuerpo con especificidad poliepitópica, como se describe en el documento WO 2013/170168. Los anticuerpos multiespecíficos incluyen, entre otros, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (V<h>) y un dominio variable de cadena ligera (V<l>),, donde la unidad VHV i_tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios V i_y V<h>donde cada unidad V<h>V<l>se une a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables individuales en los que cada dominio variable individual se une a un epítopo diferente, y anticuerpos que comprenden uno o más fragmentos de anticuerpo, así como anticuerpos que comprenden fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalentemente o no covalentemente.
[0175] Para construir anticuerpos multiespecíficos, incluyendo anticuerpos biespecíficos, se obtienen fragmentos de anticuerpos que tienen por lo menos un grupo sulfhidrilo libre. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse a partir de anticuerpos condicionalmente activos de longitud completa. Los anticuerpos condicionalmente activos pueden digerirse enzimáticamente para producir fragmentos de anticuerpos. Los métodos de digestión enzimática ejemplares incluyen, entre otros, pepsina, papaína y Lys-C. Los fragmentos de anticuerpos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacuerpos (Db); diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (véase la Patente de Estados Unidos N° 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al, Protein Eng., vol. 8, páginas 1057-1062 (1995)); anticuerpos de un brazo, anticuerpos de dominio variable único, minicuerpos (Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel., vol.
17, páginas 315-323), moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), regiones determinantes complementarias (CDR) y fragmentos de unión a epítopos. Los fragmentos de anticuerpos también pueden producirse usando tecnología recombinante de ADN. El ADN que codifica los fragmentos de anticuerpo puede clonarse en vectores de expresión plasmídica o vectores fagémidos y expresarse directamente enE. Coli.Los métodos de digestión enzimática de anticuerpos, clonación de ADN y expresión de proteínas recombinantes son bien conocidos por los expertos en la materia.
[0176] Los fragmentos de anticuerpos pueden purificarse usando técnicas convencionales y pueden someterse a reducción para generar un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos que tienen un grupo tiol libre pueden hacerse reaccionar con un reticulante, por ejemplo, bis-maleimida. Tales fragmentos de anticuerpo reticulados se purifican y luego se hacen reaccionar con un segundo fragmento de anticuerpo que tenga un grupo tiol libre. Se purifica el producto final en el que estén reticulados dos fragmentos de anticuerpo. En ciertas realizaciones, cada fragmento de anticuerpo es un Fab y el producto final, en el que los dos Fab están enlazados a través de bis-maleimida, se denomina en la presente bismaleimido-(tio-Fab)2, o bis-Fab. Tales anticuerpos multiespecíficos y análogos de anticuerpos, incluyendo los bis-Fab, pueden aprovecharse para sintetizar rápidamente una gran cantidad de combinaciones de fragmentos de anticuerpos, o variantes estructurales de anticuerpos nativos o combinaciones particulares de anticuerpos/fragmentos.
[0177] Los anticuerpos multiespecíficos pueden sintetizarse con reticulantes modificados de tal manera que a los anticuerpos multiespecíficos puedan unirse fracciones funcionales adicionales. Los reticulantes modificados permiten la unión de cualquier fracción reactiva al sulfhidrilo. En una realización, el N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) se une a la bis-maleimida para formar bis-maleimido-acetiltioacetato (BMata). Después de la desprotección del grupo tiol enmascarado, a los anticuerpos multiespecíficos puede unirse cualquier grupo funcional que tenga una fracción reactiva al sulfhidrilo (o reactiva al tiol).
[0178] Los reactivos que reaccionan con tiol ejemplares incluyen un reactivo conector multifuncional, un reactivo marcador de captura, es decir, de afinidad (por ejemplo, un reactivo conector de biotina), un marcador de detección (por ejemplo, un reactivo fluoróforo), un reactivo de inmovilización en fase sólida (por ejemplo, SEPHAROSE™, poliestireno o vidrio), o un producto intermedio conector de fármaco. Un ejemplo de reactivo que reacciona con tiol es la N-etil maleimida (NEM). Tales anticuerpos multiespecíficos o análogos de anticuerpos con reticulantes modificados pueden reaccionar además con un reactivo de fracción de fármaco u otro marcador. La reacción de un anticuerpo multiespecífico o análogo de anticuerpo con un producto intermedio de conector de fármaco proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco multiespecífico o un conjugado análogo de anticuerpo-fármaco, respectivamente.
[0179] En la presente invención también pueden usarse otras técnicas para elaborar anticuerpos multiespecíficos. Las referencias que describen estas técnicas incluyen: (1) Milstein y Cuello, Nature, vol. 305, página 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J., vol. 10, página 3655 (1991) sobre coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades; (2) Patente de Estados Unidos N° 5,731,168 sobre la manipulación de "botón en el agujero"; (3) WO 2009/089004A1 sobre manipulación de los efectos de dirección electrostática para la elaboración de moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo; (4) Patente de Estados Unidos N° 4,676,980, y Brennan et al., Science, vol. 229, página 81 (1985) sobre la reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos; (5) Kostelny et al., J. Immunol., vol. 148, páginas 1547-1553 (1992) sobre el uso de cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos; (6) Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, páginas 6444-6448 (1993) sobre el uso de la tecnología "diacuerpo" para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos; (7) Gruber et al., J. Immunol., vol. 152, página 5368 (1994) sobre el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv); (8) Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) sobre la preparación de anticuerpos triespecíficos; y (9) US 2006/0025576A1 y Wu et al. Nature Biotechnology, vol. 25, páginas 1290-1297 (2007) sobre anticuerpos manipulados con tres o más sitios funcionales de unión a antígenos, incluyendo los "anticuerpos Octopus" o las "inmunoglobulinas de doble dominio variable" (DVD).
[0180] Los anticuerpos multiespecíficos de la presente invención también pueden generarse como se describe en el documento WO/2011/109726.
PROTEÍNAS BIOLÓGICAS CONDICIONALMENTE ACTIVAS PARA TUMORES
[0181] Las células cancerosas de un tumor sólido son capaces de formar un microambiente tumoral en sus alrededores para respaldar el crecimiento y la metástasis de las células cancerosas. Un microambiente tumoral es el entorno celular en el que existe el tumor, incluyendo los vasos sanguíneos circundantes, las células inmunitarias, los fibroblastos, otras células, factores solubles, moléculas de señalización, una matriz extracelular y señales mecánicas que pueden promover la transformación neoplásica, apoyar el crecimiento y la invasión tumoral, proteger al tumor de la inmunidad del huésped, fomentar la resistencia terapéutica y proporcionar nichos para que prosperen las metástasis latentes. El tumor y el microambiente que lo rodea están estrechamente relacionados e interactúan constantemente. Los tumores pueden influir en su microambiente liberando señales extracelulares, fomentando la angiogénesis tumoral e induciendo la tolerancia inmunitaria periférica, mientras que las células inmunitarias del microambiente pueden afectar al crecimiento y la evolución de las células cancerosas. Véase Swarts et al. "Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy", Cancer Res, vol., 72, páginas 2473-2480, 2012.
[0182] El microambiente tumoral a menudo es hipóxico. A medida que aumenta la masa tumoral, el interior del tumor crece más allá del suministro de sangre existente, lo que conlleva dificultades para suministrar completamente oxígeno al microambiente tumoral. La presión parcial de oxígeno en el entorno tumoral es inferior a 5 mm Hg en más del 50% de los tumores sólidos localmente avanzados, en comparación con una presión parcial de oxígeno de unos 40 mm Hg en el plasma sanguíneo. En cambio, otras partes del cuerpo no son hipóxicas. El entorno hipóxico lleva a la inestabilidad genética, que se asocia con la progresión del cáncer, a través de la regulación por disminución de la reparación por escisión de nucleótidos y las vías de reparación de malapareamientos. La hipoxia también provoca la regulación por incremento del factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF1-a), que induce la angiogénesis y se asocia a un peor pronóstico y a la activación de genes relacionados con la metástasis. Véase Weber et al., "The tumor microenvironment", Surgical Oncology, vol. 21, páginas 172-177, 2012 y Blagosklonny, "Antiangiogenic therapy and tumor progression", Cancer Cell, vol. 5, páginas 13-17, 2004.
[0183] Además, las células tumorales tienden a depender de la energía generada por la fermentación del ácido láctico, que no requiere oxígeno. Por tanto, es menos probable que las células tumorales usen la respiración aeróbica normal que sí requiere oxígeno. Una consecuencia del uso de la fermentación del ácido láctico es que el microambiente tumoral es ácido (pH 6,5-6,9), al contrario que otras partes del cuerpo que típicamente son neutras o ligeramente básicas. Por ejemplo, el plasma sanguíneo humano tiene un pH de aproximadamente 7,4. Véase Estrella et al., "Acidity Generated by the Tumor Microenvironment Drives Local Invasion", Cancer Research, vol. 73, páginas 1524-1535, 2013. La disponibilidad de nutrientes en el microambiente tumoral también es baja debido a la demanda relativamente alta de nutrientes de las células cancerosas en proliferación, en comparación con las células localizadas en otras partes del cuerpo.
[0184] Además, el microambiente tumoral también contiene muchos tipos celulares distintos que no se encuentran comúnmente en otras partes del cuerpo. Estos tipos celulares incluyen células endoteliales y sus precursores, pericitos, células musculares lisas, Wbroblastos, Wbroblastos asociados a carcinoma, mioWbroblastos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, linfocitos T y B, células asesinas naturales y células presentadoras de antígeno (APC) como macrófagos y células dendríticas (Lorusso et al., "The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis", Histochem Cell Biol, vol. 130, páginas 1091-1103, 2008).
[0185] Por consiguiente, el microambiente tumoral tiene por lo menos varias condiciones fisiológicas que son diferentes de las de otras partes del cuerpo, como las condiciones fisiológicas del plasma sanguíneo. El microambiente tumoral tiene un pH (ácido) que es menor que el de otras partes del cuerpo, especialmente el plasma sanguíneo (pH 7,4). El microambiente tumoral tiene una concentración más baja de oxígeno que otras partes del cuerpo, como el plasma sanguíneo. Además, el microambiente tumoral tiene una menor disponibilidad de nutrientes que otras partes del cuerpo, especialmente el plasma sanguíneo. El microambiente tumoral también tiene algunos tipos celulares distintos que no se encuentran típicamente en otras partes del cuerpo, especialmente en el plasma sanguíneo.
[0186] Algunos fármacos contra el cáncer incluyen anticuerpos que pueden penetrar en el microambiente tumoral y actuar sobre las células cancerosas en el mismo. La terapia contra el cáncer basada en anticuerpos está bien establecida y se ha convertido en una de las estrategias con más éxito e importantes para el tratamiento de pacientes con enfermedades malignas hematológicas y tumores sólidos. Hay una amplia gama de antígenos de la superficie celular que son expresados por las células cancerosas humanas que están sobreexpresados, mutados o expresados selectivamente en las células cancerosas en comparación con los tejidos normales. Estos antígenos de la superficie celular son dianas excelentes para la terapia contra el cáncer con anticuerpos.
[0187] Los antígenos de superficie de las células cancerosas a los que pueden dirigirse los anticuerpos se clasifican en varias categorías diferentes. Los antígenos de diferenciación hematopoyética son glicoproteínas que normalmente están asociadas con agrupaciones de cúmulos de diferenciación (CD) e incluyen CD20, CD30,<c>D33 y CD52. Los antígenos de diferenciación de la superficie celular son un grupo diverso de glicoproteínas y carbohidratos que se encuentran en la superficie tanto de las células normales como de las tumorales. Los antígenos que intervienen en la señalización del crecimiento y la diferenciación son a menudo factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento. Los factores de crecimiento que son diana de anticuerpos en pacientes con cáncer incluyen CEA2, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; también conocido como ERBB1)12, ERBB2 (también conocido como HER2)13, ERBB3 (REF. 18), MET (también conocido como HGFR)19, receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF1R)20, receptor A3 de la efrina (EPHA3)21, receptor 1 del ligando inductor de la apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAILR1; también conocido como TNFRSF10A), TRAILR2 (también conocido como TNFRSF10B) y ligando del activador del receptor del factor nuclear xB (RANKL; también conocido como TNFSF11)22. Los antígenos implicados en la angiogénesis son normalmente proteínas o factores de crecimiento que favorecen la formación de nueva microvasculatura, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (V<e>G<f>), el receptor del VEGF (VEGFR), la integrina aVp3 y la integrina a5p1 (REF. 10). El estroma tumoral y la matriz extracelular son estructuras de soporte indispensables para un tumor. Los antígenos del estroma y la matriz extracelular que son dianas terapéuticas incluyen la proteína de activación de fibroblastos (FAP) y la tenascina. Véase Scott et al., "Antibody therapy of cancer", Nature Reviews Cancer, vol. 12, páginas 278-287, 2012.
[0188] Las células madre cancerosas son células cancerosas que tienen la capacidad de dar lugar a todos los tipos celulares que se encuentran en una muestra de cáncer particular y, por lo tanto, son formadoras de tumores. Pueden generar tumores a través de los procesos de células madre de autorrenovación y diferenciación en múltiples tipos celulares. Se cree que las células madre cancerosas persisten en los tumores como una población diferenciada y provocan recaídas y metástasis al dar lugar a nuevos tumores. El desarrollo de terapias específicas dirigidas a las células madre cancerosas puede mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los enfermos de cáncer, especialmente de los que padecen enfermedad metastásica.
[0189] Estos fármacos para tratar tumores a menudo interfieren con las funciones fisiológicas normales en otras partes del cuerpo además de los tumores. Por ejemplo, las proteínas que inducen la apoptosis en los tumores también pueden inducir la apoptosis en otras partes del cuerpo, provocando así efectos secundarios. En las realizaciones en las que se usa un anticuerpo para tratar tumores, el antígeno del anticuerpo también puede expresarse en otras partes del cuerpo donde desempeñan funciones fisiológicas normales. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal bevacizumab (que se dirige al factor de crecimiento endotelial vascular) para detener el crecimiento de los vasos sanguíneos tumorales. Este anticuerpo también puede evitar el crecimiento o la reparación de vasos sanguíneos en otras partes del cuerpo, provocando así hemorragias, mala curación de heridas, coágulos sanguíneos y daños renales. El desarrollo de una proteína biológica condicionalmente activa que se concentre en dirigirse principalmente o únicamente a los tumores es muy deseable para lograr terapias tumorales más eficaces.
[0190] Las proteínas condicionalmente activas para el microambiente tumoral de la presente invención se generan mediante un método de evolución de un ADN que codifica una proteína biológica de tipo salvaje para crear una biblioteca de ADN mutante. A continuación, la biblioteca de ADN mutante se expresa para obtener proteínas mutantes. Las proteínas mutantes se criban en busca de una proteína biológica condicionalmente activa que tenga una actividad mayor que la proteína biológica parental bajo un pH fisiológico de un primer microambiente tumoral, y que tenga una actividad menor que la proteína biológica parental a un pH fisiológico en una segunda parte del cuerpo que sea diferente de la primera parte del cuerpo. La segunda parte del cuerpo puede ser el plasma sanguíneo. Tales proteínas biológicas mutantes seleccionadas son proteínas biológicas condicionalmente activas que tienen alta actividad en la primera parte del cuerpo pero baja actividad en las segundas partes del cuerpo.
[0191] Tales proteínas biológicas condicionalmente activas son ventajosas para reducir los efectos secundarios de la proteína de tipo salvaje, ya que la proteína biológica condicionalmente activa tiene menor actividad en las otras partes del cuerpo donde no se pretende que actúe la proteína biológica condicionalmente activa. Por ejemplo, si se pretende que la proteína biológica condicionalmente activa se introduzca en el microambiente tumoral, el hecho de que la proteína biológica condicionalmente activa tenga una actividad baja en partes del cuerpo distintas del microambiente tumoral significa que dicha proteína biológica condicionalmente activa tendrá menos probabilidades de interferir con las funciones fisiológicas normales en partes del cuerpo distintas del microambiente tumoral. Al mismo tiempo, la proteína biológica condicionalmente activa tiene una alta actividad en el microambiente tumoral, lo que confiere a la proteína biológica condicionalmente activa una mayor eficacia en el tratamiento de tumores.
[0192] Debido a la reducción de los efectos secundarios, la proteína biológica condicionalmente activa permitirá usar con seguridad una dosis significativamente mayor de la proteína, en comparación con la proteína biológica de tipo salvaje. Esto es especialmente beneficioso para un anticuerpo contra una citoquina o un factor de crecimiento, porque los anticuerpos contra la citoquina o el factor de crecimiento pueden interferir con las funciones fisiológicas normales de la citoquina o el factor de crecimiento en otras partes del cuerpo. Al usar una proteína biológica condicionalmente activa, con efectos secundarios reducidos, pueden usarse dosis más altas para lograr una mayor eficacia.
[0193] Las proteínas biológicas condicionalmente activas para actuar en un microambiente tumoral también pueden permitir el uso de nuevas dianas de fármacos. El uso de proteínas biológicas tradicionales como agentes terapéuticos puede provocar efectos secundarios inaceptables. Por ejemplo, la inhibición de un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) puede suprimir muy eficazmente el crecimiento tumoral. Sin embargo, un fármaco que inhibe el EGFR también suprimirá el crecimiento en la piel y el tracto gastrointestinal (GI). Estos efectos secundarios hacen que el EGFR no sea adecuado como diana farmacéutica tumoral. El uso de un anticuerpo condicionalmente activo que se una al EGFR con alta afinidad sólo en el microambiente tumoral, pero no o con muy baja afinidad en cualquier otra parte del cuerpo, reducirá significativamente los efectos secundarios y al mismo tiempo suprimirá el crecimiento tumoral. En este caso, el EGFR puede convertirse en una nueva diana farmacológica tumoral eficaz mediante el uso de anticuerpos condicionalmente activos.
[0194] En otro ejemplo, suprimir las citoquinas es a menudo beneficioso para reparar el daño articular. Sin embargo, la supresión de citoquinas en otras partes del cuerpo también puede suprimir la respuesta inmunitaria del cuerpo, provocando una deficiencia inmunitaria. Por tanto, las citoquinas del líquido sinovial no son dianas ideales para el desarrollo de fármacos tradicionales a base de anticuerpos para el tratamiento del daño articular. Sin embargo, mediante el uso de anticuerpos condicionalmente activos que se unen preferentemente a las citoquinas del líquido sinovial, mientras que no lo hacen o lo hacen débilmente a las mismas citoquinas en otras partes del cuerpo, puede reducirse drásticamente el efecto secundario de la inmunodeficiencia. Por lo tanto, las citoquinas del líquido sinovial pueden convertirse en dianas adecuadas para reparar el daño articular mediante el uso de anticuerpos condicionalmente activos.
PARTÍCULAS VÍRICAS CONDICIONALMENTE ACTIVAS
[0195] Las partículas víricas se han usado durante mucho tiempo como vehículos de administración para transportar proteínas, moléculas de ácido nucleico, compuestos químicos o isótopos radiactivos a una célula o tejido diana. Las partículas víricas que se usan comúnmente como vehículos de transporte incluyen retovirus, adenovirus, lentivirus, virus del herpes y virus adenoasociados. Las partículas víricas reconocen sus células diana a través de una proteína de superficie que sirve como proteína de reconocimiento para la unión específica a una proteína celular que sirve como proteína diana de las células diana, a menudo en un sistema de unión ligando-receptor (Lentz, "The reognition event between virus and host cell receptor: a target for antiviral agents," J. of Gen. Virol., vol. 71, páginas 751-765, 1990,). Por ejemplo, la proteína de reconocimiento vírico puede ser un ligando para un receptor de las células diana. La especificidad entre un ligando y un receptor permite a las partículas víricas reconocer específicamente y administrar su contenido a una célula diana.
[0196] Las técnicas para desarrollar partículas víricas artificiales a partir de virus de tipo salvaje son bien conocidas por los expertos en la materia. Las partículas víricas artificiales conocidas como vehículos de administración incluyen las basadas en retrovirus (véase, por ejemplo, los documentos WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; W<o>93/25234; la Patente de Estados Unidos N° 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218; Patente de Estados Unidos N° 4,777,127; Patente del Reino Unido N° 2,200,651; EP 0345242; y WO 91/02805), alfavirus (por ejemplo, vectores del virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus del río Ross (At CC VR-373; ATCC VR-1246), virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y virus adenoasociados (véase, por ejemplo, los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655).
[0197] Generalmente, las partículas víricas artificiales se construyen insertando una proteína de reconocimiento extraña en una partícula vírica, a menudo sustituyendo la proteína de reconocimiento nativa por tecnología recombinante. La proteína de reconocimiento extraña puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un receptor, un ligando o un dominio de unión a colágeno. La presente invención proporciona una proteína de reconocimiento condicionalmente activa que es inactiva o menos activa para unirse a una célula en una condición fisiológica normal, y que es activa o más activa para unirse a una célula en una condición aberrante. De este modo, la proteína de reconocimiento condicionalmente activa puede unirse preferentemente a las células diana del tejido enfermo y/o en un sitio de la enfermedad basándose en la presencia de una condición anormal en ese sitio y evitar o unirse sólo mínimamente a las células del tejido normal donde existe una condición fisiológica normal. La proteína de reconocimiento condicionalmente activa puede expresarse y mostrarse en la superficie de una partícula vírica.
[0198] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método de evolución de una proteína de reconocimiento de tipo salvaje y cribado para una proteína de reconocimiento condicionalmente activa. La proteína de reconocimiento condicionalmente activa es menos activa en la unión a una célula que la proteína de reconocimiento de tipo salvaje en condiciones fisiológicas normales, y más activa en la unión a una célula que la proteína de reconocimiento de tipo salvaje en condiciones aberrantes. Dicha proteína de reconocimiento condicionalmente activa puede insertarse en una partícula vírica mediante tecnología recombinante bien conocida para generar una partícula vírica condicionalmente activa.
[0199] En otra realización, la presente invención proporciona una partícula vírica condicionalmente activa que comprende una proteína de reconocimiento condicionalmente activa, que permite que la partícula vírica condicionalmente activa reconozca y se una a las células diana del tejido enfermo o en un sitio de enfermedad, pero no a las células del tejido normal. Dicha partícula vírica condicionalmente activa puede administrar preferentemente los agentes terapéuticos dentro de la partícula vírica al tejido enfermo o al sitio de la enfermedad, mientras que la partícula vírica condicionalmente activa administra menos o no suministra los agentes terapéuticos a las células del tejido normal.
[0200] En algunas realizaciones, las células diana en un sitio de enfermedad están dentro de una zona o microambiente con un pH anormal (por ejemplo, pH 6,5) o una temperatura anormal, en comparación con el pH o la temperatura en otras partes del cuerpo que están sanas o que no sufren la enfermedad particular o el estado de enfermedad. En esta realización, la proteína de reconocimiento condicionalmente activa es menos activa que una proteína de reconocimiento de tipo salvaje en la unión con una proteína diana de una célula diana a un pH o temperatura fisiológicos normales, y más activa que una proteína de reconocimiento de tipo salvaje en la unión con la proteína diana de una célula diana a un pH o temperatura anormales. De esta manera, la proteína de reconocimiento se unirá preferentemente a un sitio en el que se encuentre un pH o temperatura anormales, administrando de este modo un tratamiento en el sitio de una enfermedad.
[0201] En una realización, la partícula vírica puede comprender un anticuerpo condicionalmente activo de la presente invención, y especialmente la región variable de un anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', Fv). Dicho anticuerpo condicionalmente activo puede unirse a la proteína diana (como antígeno) de una célula diana con menor afinidad que un anticuerpo de tipo salvaje en condiciones fisiológicas normales que pueden encontrarse en una localización con tejido normal, y con mayor afinidad que el anticuerpo de tipo salvaje en condiciones aberrantes que pueden encontrarse en un sitio de enfermedad o tejido enfermo. El anticuerpo condicionalmente activo puede derivarse del anticuerpo de tipo salvaje de acuerdo con el método de la presente invención.
[0202] En una realización, la proteína diana en la célula diana incluye receptores de factor de crecimiento de tirosina quinasa que están sobreexpresados en las superficies celulares en, por ejemplo, muchos tumores. Los factores de crecimiento de tirosina quinasa ejemplares son receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de PDGF, receptores de IGF, receptores de EGF, receptores de TGF-alfa, receptores de TGF-beta, receptores de HB-EGF, receptores de ErbB2, receptores de ErbB3 y de receptores ErbB4.
[0203] Los anticuerpos multiespecíficos tienen una alta selectividad para dirigirse preferentemente a tejidos que contienen todas o la mayoría de las dianas (antígenos) a las que puede unirse un anticuerpo multiespecífico. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico proporciona selectividad para las células diana mostrando mayor preferencia por las células diana que expresan ambos antígenos reconocidos por el anticuerpo biespecífico, en comparación con las células no diana que pueden expresar sólo uno de los antígenos. Por lo tanto, debido al dinamismo del sistema, en equilibrio hay más anticuerpos biespecíficos unidos a las células diana que a las células no diana.
[0204] Los anticuerpos multiespecíficos manipulados en la presente, o sus fragmentos de reconocimiento de antígeno, pueden usarse como ASTR en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención.
MANIPULACIÓN DE CÉLULAS CITOTÓXICAS
[0205] Una vez se ha identificado una ASTR condicionalmente activa mediante el paso de cribado, el receptor de antígeno quimérico puede ensamblarse ligando las secuencias polinucleotídicas que codifican los dominios individuales para formar una única secuencia polinucleotídica (el gen CAR, que codifica el CAR condicionalmente activo). Los dominios individuales incluyen una ASTR condicionalmente activa, un TM y un ISD. En algunas realizaciones, también pueden introducirse otros dominios en los CAR, incluyendo un ab ESD y un CSD (Figura 1). Si el CAR condicionalmente activo es un CAR biespecífico, el gen del CAR puede tener, por ejemplo, la siguiente configuración en la dirección N-terminal a C-terminal: Secuencia señal N-terminal - ASTR 1 - conector - ASTR 2 -dominio espaciador extracelular - dominio transmembrana - dominio coestimulador - dominio de señalización intracelular. En una realización, dicho gen del CAR puede comprender dos o más dominios coestimuladores.
[0206] Alternativamente, la secuencia polinucleotídica que codifica el CAR condicionalmente activo puede tener la siguiente configuración en la dirección N-terminal a C-terminal: Secuencia señal N-terminal - ASTR 1 - conector -ASTR 2 - dominio transmembrana - dominio coestimulador - dominio de señalización intracelular. En una realización, dicho CAR puede comprender dos o más dominios coestimuladores. Si un CAR comprende más de dos ASTR, la secuencia polinucleotídica que codifica el CAR puede tener la siguiente configuración en la dirección N-terminal a C-terminal: Secuencia señal N-terminal - ASTR 1 - conector - ASTR 2 - conector - (región de direccionamiento específica de antígeno)n- dominio transmembrana - dominio coestimulador - dominio de señalización intracelular. Dicho CAR puede comprender además un dominio espaciador extracelular. Cada ASTR puede estar separada por un conector. En una realización, dicho CAR puede comprender dos o más dominios coestimuladores.
[0207] El CAR condicionalmente activo se introduce en las células citotóxicas mediante un vector de expresión. También se proporcionan en la presente vectores de expresión que comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica un CAR condicionalmente activo de la invención. Los vectores de expresión adecuados incluyen vectores de lentivirus, vectores de retrovirus gamma, vectores de virus espumosos, vectores de virus adenoasociados (AAV), vectores de adenovirus, virus híbridos manipulados, ADN desnudo, incluyendo pero no limitados a vectores mediados por transposones, como Sleeping Beauty, Piggybak, e Integrasas como Phi31. Algunos otros vectores de expresión adecuados incluyen el virus del herpes simple (VHS) y los vectores de expresión de retrovirus.
[0208] Los vectores de expresión de adenovirus se basan en adenovirus, que tienen una baja capacidad para la integración en el ADN genómico pero una alta eficiencia para transfectar células huésped. Los vectores de expresión de adenovirus contienen secuencias de adenovirus suficientes para: (a) soportar el empaquetamiento del vector de expresión y (b) expresar en última instancia el gen del CAR en la célula huésped. El genoma del adenovirus es un<a>D<n>lineal de cadena doble de 36 kb, en el que puede insertarse una secuencia de ADN extraña (como los genes de CAR) para sustituir grandes trozos de ADN adenoviral con el fin de elaborar el vector de expresión de la presente invención (Grunhaus y Horwitz, "Adenoviruses as cloning vectors," Seminars Virol., vol. 3, páginas 237-252, 1992).
[0209] Otro vector de expresión se basa en un virus adenoasociado, que aprovecha los sistemas acoplados de adenovirus. Este vector de expresión AAV tiene una alta frecuencia de integración en el genoma huésped. Puede incluso infectar células que no se dividen, lo que lo hace útil para la administración de genes en células de mamíferos, por ejemplo, en cultivos de tejidos oin vivo.El vector AAV tiene un amplio intervalo de infectividad. Los detalles relativos a la generación y el uso de vectores AAV se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.139.941 y 4.797.368.
[0210] Los vectores de expresión de retrovirus son capaces de integrarse en el genoma huésped, administra una gran cantidad de material genético extraño, infectar un amplio espectro de especies y tipos celulares y empaquetarse en líneas celulares especiales. El vector retroviral se construye insertando un ácido nucleico (por ejemplo, uno que codifica el CAR) en el genoma viral en ciertas localizaciones para producir un virus que es defectuoso en la replicación. Aunque los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos celulares, la integración y expresión estable del gen CAR requiere la división de las células huésped.
[0211] Los vectores de lentivirus se derivan de los lentivirus, que son retrovirus complejos que, además de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural (Patentes de Estados Unidos N° 6.013.516 y 5.994.136). Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1, VIH-2) y el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS). Los vectores lentivirus se han generado mediante la atenuación múltiple de los genes de virulencia del VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se eliminan haciendo que el vector sea biológicamente seguro. Los vectores de lentivirus son capaces de infectar células que no se dividen y pueden usarse tanto para la transferencia de genesin vivocomoex vivoy para la expresión del gen del CAR (Patente de Estados Unidos N° 5,994,136).
[0212] Los vectores de expresión que comprenden el gen de CAR condicionalmente activo pueden introducirse en una célula huésped mediante cualquier medio conocido por un experto en la materia. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias virales para transfección, si se desea. Alternativamente, los vectores de expresión pueden introducirse mediante fusión, electroporación, biolística, transfección, lipofección o similares. La célula huésped puede crecer y expandirse en cultivo antes de la introducción de los vectores de expresión, seguido del tratamiento adecuado para la introducción e integración de los vectores. A continuación, las células huésped se expanden y se examinan en virtud de un marcador presente en los vectores. Varios marcadores que pueden usarse incluyen hprt, resistencia a la neomicina, timidina quinasa, resistencia a la higromicina, etc. Como se usa en la presente, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden usarse indistintamente. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula T, una célula NKy una célula NKT.
[0213] En otro aspecto, la presente invención también proporciona células citotóxicas manipuladas genéticamente que comprenden y expresan de manera estable el CAR condicionalmente activo de la invención. En una realización, las células manipuladas genéticamente incluyen linfocitos T (células T), células T vírgenes (T<n>), células T de memoria (por ejemplo, células T de memoria central (t C<m>), células de memoria efectora (T<em>)), células asesinas naturales y macrófagos capaces de dar lugar a progenie terapéuticamente relevante. En otra realización, las células manipuladas genéticamente son células autólogas. Ejemplos de células T adecuadas son las células T CD4+/CD8' , CD4VCD8+, CD4VCD8' o CD4+/CD8+. Las células T pueden ser una población mixta de células CD4+/CD8' y CD4VCD8+ o una población de un solo clon. Las células T CD4+ de la invención también pueden producir IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa y otras citoquinas efectoras de células T cuando se cocultivanin vitrocon células que expresan los antígenos diana (por ejemplo células tumorales CD20+ y/o CD 19+). Las células T CD8+ de la invención pueden lisar células que expresan el antígeno diana. En algunas realizaciones, las células T pueden ser una o más de las células vírgenes CD45RA+ CD62L+, células de memoria central CD45RO CD62I7, células de memoria efectoras CD62L'' o una combinación de las mismas (Berger et al., "Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity," Curr. Opin. Immunol., vol. 21, páginas 224-232, 2009).
[0214] Las células citotóxicas manipuladas genéticamente pueden producirse transfectando de manera estable células con un vector de expresión que comprende el gen de CAR de la invención. Los métodos adicionales para manipular genéticamente células usando el vector de expresión incluyen métodos de transformación química (por ejemplo, usando fosfato de calcio, dendrímeros, liposomas y/o polímeros catiónicos), métodos de transformación no química (por ejemplo, electroporación, transformación óptica, electrotransferencia de genes y/o administración hidrodinámica) y/o métodos basados en partículas (por ejemplo, impalefección, usando una pistola de genes y/o magnetofección). Las células transfectadas que demuestren la presencia de un único vector integrado no reordenado y que expresen el CAR condicionalmente activo pueden expandirseex vivo.
[0215] Los métodos físicos para introducir un vector de expresión en una célula huésped incluyen la precipitación con fosfato de calcio, la lipofección, el bombardeo de partículas, la microinyección, la electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Los métodos químicos para introducir un vector de expresión en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas.
[0216] Ya sea antes o después de la modificación genética de las células citotóxicas para expresar un CAR condicionalmente activo deseable, las células pueden activarse y expandirse en número usando métodos como los descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y US 20060121005. Por ejemplo, las células T de la invención pueden expandirse por contacto con una superficie que tenga unido a la misma un agente que estimule una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimule una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de la proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, las células T pueden ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besangon, Francia) y éstos pueden usarse en la invención, al igual que otros métodos conocidos comúnmente en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland etal., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
[0217] Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del CAR condicionalmente activo de la invención. El CAR condicionalmente activo en la composición puede ser uno o más de un polinucleótido que codifica el CAR, una proteína que comprende el CAR o células modificadas genéticamente que expresan la proteína de CAR. La proteína de CAR puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables se refieren a sales que pueden usarse como sales de una proteína terapéutica en la industria farmacéutica incluyendo, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio y similares, y sales de amina de procaína, dibencilamina, etilendiamina, etanolamina, metilglucamina, taurina y similares, así como sales de adición de ácidos, como clorhidratos, y aminoácidos básicos y similares.
[0218] El excipiente farmacéuticamente aceptable puede incluir cualquier excipiente que sea útil para preparar una composición farmacéutica que sea generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que sean aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico humano. Tales excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición en aerosol, gaseosos. Un tipo de excipiente incluye portadores farmacéuticamente aceptables, que pueden añadirse para mejorar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición. Los portadores líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, glicerina, solución salina, alcoholes y agua. Los portadores sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio, dihidrato, terra alba, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar y gelatina. El portador también puede incluir un material de liberación sostenida como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera.
[0219] Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se esté administrando, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas. Pueden usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materias indeseables. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste del pH y agentes tampón, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración de CAR en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente sobre la base de los volúmenes de fluidos, las viscosidades y el peso corporal, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente.
[0220] Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para su administración a través de cualquier vía de administración adecuada. "Vía de administración" puede referirse a cualquier vía de administración conocida en la técnica incluyendo, entre otras, aerosol, nasal, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inhalación, transmucosal, transdérmica, parenteral, bomba implantable, infusión continua, aplicación tópica, cápsulas y/o inyecciones.
[0221] Las composiciones farmacéuticas pueden encapsularse, formarse en comprimidos o prepararse en una emulsión o jarabe para administración oral. Las composiciones farmacéuticas se elaboran siguiendo las técnicas convencionales de farmacia que implican molienda, mezclado, granulación y compresión, cuando sea necesario, para formas de comprimidos; o molienda, mezclado y llenado para formas de cápsulas de gelatina dura. Cuando se usa un portador líquido, la preparación puede presentarse en forma de jarabe, elixir, emulsión o suspensión acuosa o no acuosa. Dicha formulación líquida puede administrarse directamente p.o. o llenarse en una cápsula de gelatina blanda.
[0222] Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como: (a) soluciones líquidas, como una cantidad eficaz del ácido nucleico empaquetado suspendido en diluyentes, como agua, solución salina o PEG 400; (b) cápsulas, sobres o comprimidos, cada uno de los cuales conteniendo una cantidad predeterminada del principio activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. En particular, las formas de dosificación adecuadas incluyen, entre otras, comprimidos, píldoras, polvos, grageas, cápsulas, líquidos, pastillas para chupar, geles, jarabes, lechadas, suspensiones, etc.
[0223] Las formulaciones sólidas comprenden excipientes sólidos adecuados, como carbohidratos o cargas proteicas que incluyen, por ejemplo, azúcares como lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa como metilcelulosa, hidroxipropietilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica; y gomas incluyendo la arábiga y el tragacanto; y proteínas, por ejemplo, gelatina y colágeno. Pueden añadirse agentes disgregadores o solubilizantes, como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal del mismo, como alginato sódico. Las formas de comprimidos pueden incluir una o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de patata, tragacanto, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, cargas, aglutinantes, diluyentes, agentes tampón, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes, agentes disgregantes y portadores farmacéuticamente aceptables.
[0224] Las suspensiones líquidas comprenden un CAR condicionalmente activo, en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen un agente de suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia, y agentes dispersantes o humectantes como un fosfátido de origen natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetileno oxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol), o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán). La suspensión líquida también puede contener uno o más conservantes, como phidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, como sacarosa, aspartamo o sacarina. Las formulaciones pueden ajustarse para la osmolalidad.
[0225] Las formas de pastillas para chupar pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, como gelatina y glicerina o emulsiones de sacarosa y acacia, geles y similares que contienen, además del ingrediente activo, portadores conocidos en la técnica. Se reconoce que el CAR condicionalmente activo, cuándo se administra por vía oral, tiene que protegerse de la digestión. Esto se consigue normalmente mediante la formación de complejos del CAR condicionalmente activo con una composición que lo haga resistente a la hidrólisis ácida y enzimática o empaquetando el CAR condicionalmente activo en un portador adecuadamente resistente, como un liposoma. En la técnica se conocen bien los medios para proteger las proteínas de la digestión. Las composiciones farmacéuticas pueden encapsularse, por ejemplo, en liposomas, o en una formulación que proporcione una liberación lenta del principio activo.
[0226] La composición farmacéutica puede formularse como formulaciones en aerosol (por ejemplo, pueden ser "nebulizadas") para ser administradas por inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en propelentes presurizados aceptables, como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Las formulaciones adecuadas para administración rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en el ácido nucleico empaquetado con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina, además, también es posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación del ácido nucleico empaquetado con una base, incluyendo, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles e hidrocarburos de parafina.
[0227] La composición farmacéutica puede formularse para administración parenteral, como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyendo soluciones acuosas y no acuosas, isotónicas estériles para inyección, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes, en la puesta en práctica de esta invención, las composiciones pueden administrarse, por ejemplo, por infusión intravenosa, oral, tópica, intraperitoneal, intravesical o intratecal. En un aspecto, los modos de administración parenteral son métodos de administración preferidos para composiciones que comprenden la proteína del CAR o células citotóxicas manipuladas genéticamente. Las composiciones pueden administrarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton Pa., 18a Ed., 1990. Las formulaciones para administración intravenosa pueden contener un portador farmacéuticamente aceptable como agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares.
[0228] La composición farmacéutica puede administrarse por al menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácioa, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico. Opcionalmente, el método puede comprender además la administración, antes, concurrentemente o después del CAR condicionalmente activo, de por lo menos una composición que comprende una cantidad eficaz de por lo menos un compuesto o proteína seleccionado entre por lo menos uno de una marcador o informador detectable, un antagonista del TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabolizante, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o un análogo de la misma, un agente citotóxico u otro agente anticancerígeno, un antimetabolito como el metotrexato, o un agente antiproliferativo.
[0229] Los tipos de cánceres a tratar con las células citotóxicas manipuladas genéticamente o las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o enfermedades malignas linfoides, tumores benignos y malignos, y enfermedades malignas, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. Los cánceres pueden ser tumores no sólidos (como los tumores hematológicos) o tumores sólidos. También se incluyen los tumores/cánceres adultos y los tumores/cánceres pediátricos.
[0230] Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
[0231] Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que generalmente no contienen quistes ni zonas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los distintos tipos de tumores sólidos se denominan por el tipo de células que los forman (como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, enfermedad maligna linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (como un glioma (como un glioma de tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).
[0232] Un dispositivo médico puede comprender por lo menos una proteína de CAR, una secuencia polinucleotídica que codifica un CAR o una célula huésped que expresa un CAR, en donde el dispositivo es adecuado para administrar el por lo menos un CAR condicionalmente activo mediante por lo menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracelebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraspinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.
[0233] Un kit puede comprender por lo menos una proteína de CAR, una secuencia polinucleotídica que codifica una CAR, o una célula huésped que expresa una CAR, en forma liofilizada en un primer recipiente, y un segundo recipiente opcional que comprende agua estéril, agua estéril tamponada, o por lo menos un conservante seleccionado del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio, alquilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. En un aspecto, en el kit, la concentración del CAR condicionalmente activo o una porción o variante especificada en el primer recipiente se reconstituye a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml con el contenido del segundo recipiente, en otro aspecto, el segundo recipiente comprende además un agente isotónico. En otro aspecto, el segundo recipiente comprende además un tampón fisiológicamente aceptable. En un aspecto, el método para tratar por lo menos una afección mediada por proteínas de tipo salvaje, comprende administrar a un paciente que lo necesite una formulación proporcionada en un kit y reconstituida antes de la administración.
[0234] Un artículo de fabricación para uso farmacéutico o diagnóstico humano puede comprender un material de envasado y un recipiente que comprenda una solución o una forma liofilizada de por lo menos una proteína de CAR, una secuencia polinucleotídica que codifique un CAR o una expresión celular huésped de un CAR. El artículo de fabricación puede comprender opcionalmente tener el recipiente como un componente de un sistema parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracelebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraspinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.
[0235] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método que comprende recuperar células citotóxicas de un sujeto, manipular genéticamente las células citotóxicas introduciendo un gen de CAR de la presente invención en las células citotóxicas, y administrar las células citotóxicas manipuladas genéticamente al sujeto. En algunas realizaciones, las células citotóxicas se seleccionan entre células T, células T vírgenes, células T de memoria, células T efectoras, células asesinas naturales y macrófagos. En una realización, las células citotóxicas son células T.
[0236] En una realización, las células T se obtienen de un sujeto. Las células T pueden obtenerse de una variedad de fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas realizaciones de la presente invención, puede usarse cualquier número de líneas de células T disponibles en la técnica. En ciertas realizaciones de la presente invención, las células T pueden obtenerse a partir de sangre recogida de un sujeto usando cualquier cantidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, como la separación de Ficoll™.
[0237] En una realización preferida, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En una realización de la invención, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización alternativa, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no todos, los cationes divalentes. De nuevo, sorprendentemente, los pasos iniciales de activación en ausencia de calcio llevan a una activación magnificada. Como apreciarán fácilmente los expertos en la materia, el paso de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos en la materia, como por ejemplo usando una centrifugadora semiautomática de flujo continuo (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células pueden volver a suspenderse en varios tampones biocompatibles, como, por ejemplo, PBS sin Ca2+, PBS sin Mg2+, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Alternativamente, pueden eliminarse los componentes indeseables de la muestra de aféresis y volver a suspender las células directamente en medios de cultivo.
[0238] En otra realización, las células T se aíslan de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™ o por elutriación centrífuga a contracorriente. Una subpoblación específica de células T, como las células T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y CD45RO+, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típciamente anticuerpos contra CD 14, CD20, CD11b, CD 16, HLA-DR y CD8. En ciertas realizaciones, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente células T reguladoras que típicamente expresan CD4+, CD25+, CD62LhiGITR+, y FoxP3+.
[0239] Por ejemplo, en una realización, las células T se aíslan por incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3*28), como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En una realización, el periodo de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una realización adicional, el periodo de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros intermedios. En una realización adicional, el periodo de tiempo es de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otra realización preferida más, el periodo de tiempo es de 10 a 24 horas. En una realización preferida, el periodo de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de células T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Pueden usarse tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocas células T en comparación con otros tipos celulares, como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de tejido tumoral o de individuos inmunodeprimidos. Además, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficacia de la captura de linfocitos T CD8+. Así, simplemente acortando o alargando el tiempo durante el que se permite que las células T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la proporción de perlas con respecto a las células T (como se describe más adelante), pueden seleccionarse preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Además, al aumentar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, pueden seleccionarse preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos deseados. El experto en la materia reconocerá que en el contexto de esta invención también pueden usarse múltiples rondas de selección. En ciertas realizaciones, puede ser deseable llevar a cabo el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a rondas de selección adicionales.
[0240] A continuación, las células citotóxicas obtenidas se manipulan genéticamente como se describe en la presente. Un polinucleótido que codifica el CAR, localizado típicamente en un vector de expresión, se introduce en las células citotóxicas de tal manera que las células citotóxicas expresen, preferiblemente de manera estable, el CAR. El polinucleótido que codifica el CAR se integra típicamente en el genoma huésped de la célula citotóxica. En algunas realizaciones, no es necesario que la introducción del polinucleótido dé como resultado la integración, sino que puede bastar con el mantenimiento transitorio del polinucleótido introducido. De esta manera, se podría tener un efecto a corto plazo, donde las células citotóxicas podrían introducirse en el huésped y luego activarse después de un tiempo predeterminado, por ejemplo, después de que las células hayan podido migrar a un sitio particular para el tratamiento.
[0241] Dependiendo de la naturaleza de las células citotóxicas y las enfermedades a tratar, pueden introducirse en el sujeto las células citotóxicas manipuladas genéticamente, por ejemplo un mamífero, en una amplia variedad de formas. Las células citotóxicas manipuladas genéticamente pueden introducirse en el sitio del tumor. En una realización, las células citotóxicas manipuladas genéticamente se dirigen al cáncer o están modificadas para que se dirijan al cáncer. La cantidad de células citotóxicas manipuladas genéticamente que se empleen dependerá de una serie de factores, como las circunstancias, el propósito de la introducción, la vida útil de las células y el protocolo que se vaya a usar. Por ejemplo, la cantidad de administraciones, la capacidad de las células para multiplicarse y la estabilidad de la construcción recombinante. Las células citotóxicas manipuladas genéticamente pueden aplicarse como una dispersión, generalmente inyectada en o cerca del sitio de interés. Las células pueden estar en un medio fisiológicamente aceptable.
[0242] Debe apreciarse que el método de tratamiento está sujeto a muchas variables, como la respuesta celular al CAR, la eficiencia de expresión del CAR por las células citotóxicas y, según proceda, el nivel de secreción, la actividad del CAR expresado, la necesidad particular del sujeto, que puede variar con el tiempo y las circunstancias, la tasa de pérdida de la actividad celular como resultado de la pérdida de células citotóxicas manipuladas genéticamente o la actividad de expresión de células individuales, y similares. Por lo tanto, se espera que para cada paciente individual, incluso si hubiera células universales que pudieran administrarse a la población en general, cada paciente sería monitorizado para la dosificación adecuada para el individuo, y tales prácticas de monitorización de un paciente son rutinarias en la técnica.
[0243] Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitativos, de los métodos de la presente divulgación. Otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de la variedad de condiciones y parámetros que normalmente se encuentran en el campo, y que son obvias para los expertos en la materia, están dentro del alcance de la presente divulgación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Descripción general de un ensayo de múltiples pocilios (por ejemplo, ensayo de 96 pocilios) para mutantes de temperatura:
[0244] Se añade sustrato fluorescente a cada pocillo de una placa de múltiples pocillos, tanto a la temperatura de reacción de tipo salvaje como a la nueva temperatura de reacción más baja (por ejemplo, 37°C o 25°C como se ha mencionado con anterioridad) durante un período de tiempo apropiado. La fluorescencia se detecta midiéndola en un lector de placas fluorescentes con los espectros de excitación y emisión adecuados (por ejemplo, 320 nm de excitación/405 nm de emisión). Se determinan las unidades de fluorescencia relativas (RFU). El sobrenadante de la molécula de tipo salvaje y de las células transformadas con plásmido/vector se usan como controles positivo y negativo. Se realizan reacciones por duplicado para cada muestra, temperatura de reacción y control positivo y negativo.
[0245] Los mutantes que son activos a la temperatura más baja (por ejemplo, los mutantes activos a 25°C) y que tienen una disminución en la actividad a la temperatura del tipo salvaje (por ejemplo, una disminución del 10%, 20%, 30%, 40% o más en la actividad a 37°C), y que tienen por tanto una relación de actividades mayor que o igual a aproximadamente 1.1o más (por ejemplo, la relación de las actividades a 25°C o 37°C (25°C/37°C) es mayor que o igual a 1.1 o más), pueden considerarse como supuestos resultados positivos primarios sensibles a la temperatura. Estos supuestos resultados positivos primarios sensibles a la temperatura pueden volver a cribarse, usando el mismo ensayo, para confirmar cualquier resultado positivo primario.
Ejemplo 2: Descripción general de un formato de ensayo diferente para la confirmación de la actividad (por ejemplo, un ensayo de 14 ml) para mutantes de temperatura:
[0246] Los mutantes que se identifican como resultados positivos primarios sensibles a la temperatura se expresan en tubos de cultivo de 14 ml y su actividad enzimática se mide a la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, 37°C) y a la temperatura más baja (por ejemplo, 25°C). La proteína se expresa y se purifica como se ha descrito con anterioridad para el formato de múltiples pocillos, con la excepción de que la expresión se realiza en un formato diferente (tubos de 14 ml) en lugar del formato de múltiples pocillos (placa de 96 pocillos).
[0247] Cada sobrenadante mutante se transfiere a una placa de múltiples pocillos, por ejemplo una microplaca de 96 pocillos. A cada tubo se le añade sustrato fluorescente a las temperaturas de reacción indicadas (tipo salvaje, temperatura más baja) durante un periodo de tiempo requerido. Las moléculas de tipo salvaje se usan como control positivo y el sobrenadante de las células transformadas sólo con el vector se usa como control negativo. La fluorescencia se detecta midiendo la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes en los espectros de emisión adecuados (por ejemplo, 320 nm de excitación/405 ran de emisión). Se determinan las unidades de fluorescencia relativa (RFU). Pueden realizarse reacciones duplicadas para cada muestra, temperatura de reacción y control positivo y negativo.
[0248] Los mutantes que son activos a las temperaturas más bajas (por ejemplo, 25°C) pero que demuestran por lo menos un 30% o más de disminución de la actividad a la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, 37°C), tienen por tanto una relación de actividad a la temperatura más baja (por ejemplo, 25°C) a la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, 37°C) igual o mayor que 1,5, se identifican como resultados positivos sensibles a la temperatura.
[0249] Las actividades de los mutantes a la temperatura más baja (por ejemplo 25°C) se comparan con la actividad de la molécula de tipo salvaje a la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo 37°C). Si las moléculas son más activas que las moléculas de tipo salvaje a la temperatura más baja (por ejemplo 25°C), como indica una actividad residual de >1, preferiblemente 2 o mayor de 2, y si los mutantes demuestran una disminución global de la actividad en comparación con la molécula de tipo salvaje a la temperatura de tipo salvaje (37°C), puede confirmarse el fenotipo de los mutantes como mutantes sensibles a la temperatura.
Ejemplo 3: Descripción general de la evolución posterior de los resultados positivos descubiertos:
[0250] Si se desea, se genera una nueva biblioteca combinatoria de variantes a partir de todos los mutantes o de los mutantes seleccionados previamente identificados. La nueva biblioteca puede diseñarse para que contenga todas las combinaciones posibles de variantes de aminoácidos para cada uno de los mutantes seleccionados, y volver a cribarse como se ha descrito para los nuevos resultados.
Ejemplo 4: Descripción general de la reversibilidad de la actividad enzimática después de la disminución de la temperatura:
[0251] Los mutantes evolucionados sensibles a la temperatura pueden analizarse adicionalmente para determinar si la actividad enzimática a temperaturas más bajas (por ejemplo, 25°C) es reversible o irreversible exponiendo los mutantes a temperaturas elevadas seguido de un retorno a la temperatura más baja (por ejemplo, 25°C). Los mutantes sensibles a la temperatura se expresan en cualquier formato deseado, por ejemplo en tubos de cultivo de 14 ml, como se ha descrito brevemente. Se comprueba la actividad de los mutantes en varias condiciones, incluyendo la temperatura de tipo salvaje (por ejemplo, 37°C), así como otras temperaturas, y posteriormente se vuelven a exponer a la temperatura más baja requerida (25°C, por ejemplo). Los mutantes que son activos a temperaturas más bajas, muestran una disminución de la actividad cuando se eleva a temperaturas más altas o de tipo salvaje (es decir, la relación entre las actividades a temperaturas más bajas y más altas es igual o mayor que 1, 1,5 o 2 o más), y muestran una actividad de referencia cuando se vuelve a bajar a la temperatura más baja y se puntúan como "Resultados positivos reversibles". Los mutantes que son activos a la temperatura más baja, muestran una actividad disminuida cuando se elevan a temperaturas más altas o del tipo salvaje (es decir, la relación entre las actividades a las temperaturas más bajas y más altas es igual o mayor que 1, 1,5 o 2 o más), y muestran por lo menos la misma cantidad de actividad disminuida cuando se vuelven a bajar a la temperatura más baja y se puntúan como "Resultados positivos irreversibles".
[0252]Ejemplo 5: Materiales y métodos para cribar variantes de angiostatina condicionalmente activas.Los materiales y métodos para el cribado de variantes de angiostatina condicionalmente activas pueden adaptarse de Chi y Pizzo, "Angiosatin is directly cytotoxic to tumor cells at low extracellular pH: a mechanism dependent on cell surfaceassociated ATP synthase", Cancer Res. 2006; 66(2):875-882.
Materiales
[0253] Los kringles 1 a 3 de angiostatina de tipo salvaje, derivados del plasminógeno humano, pueden obtenerse de Calbiochem (Darmstadt, Alemania) y reconstituirse en PBS estéril. Pueden generarse anticuerpos policlonales dirigidos contra la subunidad beta catalítica de la ATP sintasa y la subunidad de la ATP sintasa Fl bovina puede purificarse como se ha descrito con anterioridad (Moser et al., "Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells", Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:2811-6; Moser et al. "Endothelial cell surface Fl-FO ATP synthase is active in ATP synthesis and is inhibited by angiostatin", Proc Natl Acad Sci U S A;2001;98:6656-ól). La cariporida puede solubilizarse en agua estéril y filtrarse estérilmente.
Cultivo celular
[0254] La A549 (línea celular epitelial humana derivada de un tejido de carcinoma de pulmón), o una línea celular de cáncer alternativa (células DU145, LNCaP o PC-3) puede obtenerse, por ejemplo, de la ATCC. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) pueden aislarse de venas umbilicales humanas como se ha descrito. (Grant et al., "Matrigel induces thymosin h 4 gene in differentiating endothelial cells", J Cell Sci 1995; 108:3685-94.). Las células HUVEC pueden usarse como control positivo como línea celular que expresa ATP sintasa en la superficie celular. Las células pueden cultivarse en DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) con un 1% de penicilina estreptomicina y un 10% de medio de sustitución de suero 3 (Sigma, St. Louis, MO) para minimizar la presencia de plasminógeno. El medio de pH bajo (6,7) puede prepararse reduciendo el bicarbonato a 10 mmol/l a un 5% de CO<2>y suplementando con 34 mmol/l de NaCl para mantener la osmolalidad o incubando el medio con 22 mmol/l de bicarbonato a condiciones de un 17% de CO<2>. El método de disminución del pH usado puede variarse por limitaciones experimentales y el ensayo.
Citometría de flujo
[0255] Para asegurar que la ATP sintasa es funcional en la superficie celular de la línea celular tumoral, pueden realizarse experimentos de citometría de flujo. Por ejemplo, las líneas celulares A549 pueden cultivarse en un medio de pH variable (10, 22 y 44 mmol/l de bicarbonato Dm Em ), bajo hipoxia (0,5% 02, 5% de CO<2>, equilibrado con N<2>) frente a normoxia (21% de O<2>, 5% de CO<2>) durante 0, 12, 24, 48 y 72 horas. Las células vivas pueden bloquearse, incubarse con un anticuerpo anti-subunidad p, lavarse, bloquearse, incubarse con un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo-FITC (Southern Biotech, Birmingham, AL), y lavarse de nuevo, con todos los pasos realizados a 4 grados C. El yoduro de propidio (BD Biosciences, San Jose, CA) puede incluirse con todas las muestras para discriminar las células con membranas comprometidas. La intensidad fluorescente media de FITC en 10.000 células puede cuantificarse mediante el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y pueden excluirse las células con captación de yoduro de propidio para eliminar la detección de ATP sintasa mitocondrial en el software CELLQuest (BD Biosciences).
Ensayo de generación de ATP en la superficie celular
[0256] Las células A549 o 1-LN (60,000 por pocillo) en placas de 96 pocillos pueden refrescarse con medio y tratarse con angiostatina, variante de angiostatina, anticuerpo anti- subunidad beta, IgG de conejo elevado a albúmina de suero bovino (Organon Teknika, West Chester, PA), piceatannol (un inhibidor conocido de ATP sintasa F1 usado como control positivo, Sigma), o medio solo durante 30 minutos a 37 grados C, 5% de CO<2>. A continuación, las células pueden incubarse con 0,05 mmol/l de ADP durante 20 segundos. Los sobrenadantes pueden extraerse y analizarse para determinar la producción de ATP mediante el ensayo de luminiscencia CellTiterGlo (Promega, Madison, WI), como se ha descrito (23). Los lisados celulares pueden analizarse de manera similar para confirmar que las reservas intracelulares de ATP no variaron en ninguna condición. Las grabaciones pueden realizarse en el Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia). Los datos se expresan en moles de ATP por célula sobre la base de patrones determinados para cada experimento independiente.
Ensayo de proliferación celular
[0257] El efecto de la angiostatina en las líneas celulares cancerosas puede evaluarse con un ensayo de proliferación de la sal interna (MTS) 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio en medio libre de suero. Las cantidades de células relativas en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos después de la incubación durante 20 horas, 37 grados C y 5% de CO<2>en presencia o ausencia de angiostatina puede determinarse usando el ensayo de proliferación celular AQueous One (Promega) según el protocolo del fabricante. El pH del medio puede regularse al 5% de CO<2>mediante la concentración de bicarbonato.
Evaluación de la citotoxicidad celular
[0258] Para cuantificar la muerte celular y la lisis celular, puede medirse la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol al sobrenadante con el kit de detección de citotoxicidad (Roche, Indianapolis, IN). Las células cancerosas (por ejemplo, células A549) (5.000 por pocillo) tratadas con angiostatina, variante de angiostatina, anticuerpo anti-subunidad beta, IgG de conejo, cariporida y Tritón X (un detergente usado para permeabilizar las células como un control positivo) pueden incubarse a 37 grados C y un 5% de CO<2>o 17% de CO<2>durante 15 horas en condiciones de pH neutro y bajo, respectivamente. Un índice de citotoxicidad puede calcularse dividiendo la absorbancia media de las muestras tratadas por cuadruplicado por la absorbancia media de las muestras no tratadas por cuadruplicado correspondientes al mismo medio de pH. Evaluación de la necrosis celular y la apoptosis. Para determinar el modo de muerte celular inducida por la angiostatina puede realizarse un ELISA de histona-ADN. Los efectos de la angiostatina, las variantes de la angiostatina, el anticuerpo anti-subunidad beta, IgG de conejo y la cariporida sobre las células A549 (5.000 por pocillo) pueden determinarse mediante un ensayo ELISA de apoptosis y necrosis (Roche) que depende de la detección de fragmentos extranucleares de histona-ADN. La apoptosis o la necrosis pueden determinarse, respectivamente, a partir de los lisados o sobrenadantes celulares de muestras por cuadruplicado después de 15 horas de incubación a 37 grados C, en presencia o ausencia de agentes. Los índices apoptóticos o necróticos pueden calcularse dividiendo la absorbancia media de las muestras tratadas por cuadruplicado por la absorbancia media de las muestras no tratadas por cuadruplicado correspondientes al mismo pH del medio. El pH del medio puede regularse incubando a un 5% de CO<2>o un 17% de CO<2>.
Medición del pH intracelular (pHi)
[0259] El pHi puede medirse por fluorescencia en células colocadas en placas de micropocillos de 35 mm con cubreobjetos de vidrio (MatTek, Ashland, MA). Las células pueden colocarse sobre Matrigel (BD Biosciences) libre de rojo fenol y con factor de crecimiento reducido. Después de una noche de crecimiento, puede cambiarse el medio y cargar las células con el colorante fluorescente sensible al pH cSNARF (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 15 minutos, seguidos de 20 minutos de recuperación en medio fresco. A continuación, las células pueden montarse en una platina de microscopio a 37 grados C, 5% de CO<2>para recoger durante 1 hora los espectros de emisión a partir de los cuales puede calcularse el pHi, como se ha descrito, de campos que contengan entre 7 y 15 células cada uno (Wahl ML, Grant DS. "Effects of microenvironmental extracellular pH and extracellular matrix proteins on angiostatin's activity and on intracellular pH", Gen Pharmacol 2002;35:277-85). Al inicio de la recogida de espectros, puede retirarse el medio de la placa y las células pueden exponerse a 1 ml de medio fresco en presencia o ausencia de inhibidores del pH angiostatina, anti-subunidad beta, IgG de conejo, o cariporida, un inhibidor del intercambio sodio-protón. El pH del medio puede regularse mediante la concentración de bicarbonato, como se ha descrito anteriormente, con un % fijo de CO<2>.
Ejemplo 6: Generación de anticuerpos scFv condicionalmente activos
[0260] Dos anticuerpos condicionalmente activos (CAB-scFv-63.9-4 y CAB-scFv-63.9-6) para una diana farmacéutica X se expresaron como homodímeros con Fc de IgG1 humana de tipo salvaje (dando como resultado los anticuerpos bivalentes CAB-scFv-63.9-4-01 y CAB-scFv-63.9-6-01 en FIGS. 2-3), así como heterodímeros en el sistema de botón en el agujero resultando en un scFv monovalente (resultando en scFv de anticuerpos monovalentes CAB-scFv-63.9-4-02 y CAB-scFv-63.9-6-02 en las FIGS. 2-3).
[0261] Las afinidades de unión de estos anticuerpos a la diana farmacéutica X a pH 6,0 y pH 7,4 se midieron mediante el ensayo ELISA. Como se muestra en la FIG. 2, los anticuerpos scFv mostraron afinidades a la diana farmacéutica X tanto a pH 6,0 como a pH 7,4, que fueron comparables a los anticuerpos bivalentes completos. Además, la selectividad de estos anticuerpos scFv a pH 6,0 sobre pH 7,4 como se muestra en la FIG. 3 también fue comparable a los anticuerpos bivalentes completos. Este ejemplo demostró que los anticuerpos condicionalmente activos de la presente invención tienen afinidad y selectividad comparables como anticuerpos scFv o anticuerpos bivalentes completos. Por tanto, los anticuerpos condicionalmente activos de la presente invención pueden insertarse como una cadena de ADN individual en una molécula de ADN que codifica CAR en la plataforma de CAR-T de la presente invención.
Ejemplo 7: Células CAR-T
[0262] De acuerdo con una realización de la presente invención, se generaron anticuerpos condicionalmente activos para la diana farmacéutica X mediante el cribado simultáneo de selectividad y afinidad, así como del nivel de expresión tanto a pH 6,0 como a pH 7,4. El cribado se realizó en suero usando una etiqueta FLAG porque había anticuerpos humanos en el suero que podrían provocar falsos positivos en el cribado. El tampón de cribado fue un tampón carbonatado (tampón Krebs con Ringer - tampón estándar pero diferente de PBS). Se observó que los anticuerpos condicionalmente activos generados tenían una mayor afinidad por la diana farmacéutica X a pH 6,0, pero una menor afinidad por la misma diana farmacéutica X a pH 7,4, ambos en comparación con el anticuerpo de tipo salvaje. Además, todos estos anticuerpos condicionalmente activos tienen altos niveles de expresión, como se muestra en la Tabla 1 a continuación, donde la columna "Clon" que muestra los anticuerpos y el nivel de expresión "mg/ml" se muestra en la segunda columna.
[0263] Los clones de estos anticuerpos se enviaron a un proveedor de servicios con un nivel de expresión solicitado ("cantidad pedida", niveles de expresión esperados). Sin embargo, los niveles de expresión reales de estos anticuerpos ("cantidad administrada") fueron muy altos y superaron los niveles de expresión esperados.
Tabla 1. Anticuer os condicionalmente activos con altos niveles de ex resión
[0264] Los anticuerpos condicionalmente activos no mostraron agregación en un tampón como se demuestra en la FIG. 4, usando el anticuerpo BAP063.9-13-1 como ejemplo. El anticuerpo BAP063.9-13-1 se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En la FIG. 4, sólo se detectó un pico, demostrando poca o ninguna agregación del anticuerpo.
[0265] Los anticuerpos condicionalmente activos también se analizaron usando resonancia de plasmón superficial (SPR) para medir sus constantes de asociación y disociación de la diana farmacéutica X. Se sabe que el ensayo SPR mide las constantes de asociación y disociación de los anticuerpos condicionalmente activos. El ensayo SPR se realizó en presencia de bicarbonato. La constante de asociación y disociaciónin vivo(en animales y humanos) de los anticuerpos condicionalmente activos es una característica muy importante de los anticuerpos condicionalmente activos.
[0266] Se observó que los anticuerpos condicionalmente activos tienen constantes de asociación rápidas a pH 6.0 y constantes de asociación más lentas a pH 7.4, en comparación con el control negativo (BAP063 10F10 que tiene constantes de asociación similares tanto a pH 6.0 como a pH 7.4) (FIG. 5). Además, el aumento de la temperatura desde la temperatura ambiente a 60°C no altera significativamente los resultados del ensayo SPR (FIG. 5). El ensayo SPR también mostró que estos anticuerpos condicionalmente activos eran altamente selectivos a pH 6,0 en comparación con pH 7,4 (las FIGS. 6A-6B muestran un anticuerpo como ejemplo).
[0267] Los anticuerpos biológicos condicionalmente activos se resumen en la Tabla 2. Dos de los anticuerpos se expresaron como scFv (BAP063.9-13.3 y BAP063.9-48.3), que estaban listos para ser insertados en un CAR en la plataforma CAR-T. La incubación de los anticuerpos a 60°C durante una hora no modificó las afinidades de la mayoría de los anticuerpos ("Termoestabilidad"). En las dos columnas que informan de los datos usando SPR para medir la actividad de unión a pH 6,0 y pH 7,4 (las dos últimas columnas de la Tabla 2), se realizó una comparación con "BAP063.6-hum10F10-FLAG" (un control negativo, segunda fila de la Tabla 2). La selectividad de estos anticuerpos puede determinarse por las diferencias entre los datos de las dos últimas columnas. Los dos anticuerpos scFv tenían una selectividad muy alta (75% y 50% a pH 6 sobre 0% a pH 7,4).
[0268] Debe entenderse, sin embargo, que aunque en la descripción anterior se han expuesto numerosas características y ventajas de la presente invención, junto con detalles de la estructura y función de la invención, la divulgación es solamente ilustrativa, y pueden hacerse cambios en el detalle, especialmente en cuestiones de forma, tamaño y disposición de partes dentro de los principios de la invención en toda la extensión indicada por los amplios significados generales de los términos en los que se expresan las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un receptor quimérico de antígeno que comprende por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, dicho método comprendiendo los pasos de
generar la por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno que se une a un antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas a partir de una proteína parental o un dominio de la misma que se une específicamente con el antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas:
i. haciendo evolucionar el ADN que codifica la proteína original o un dominio de la misma usando una o más técnicas evolutivas para crear ADN mutantes;
ii. expresando los ADN mutantes para obtener polipéptidos mutantes;
iii. sometiendo los polipéptidos mutantes a un ensayo a un pH fisiológico normal y a un ensayo a un pH aberrante; iv. seleccionando una región de direccionamiento específica de antígeno condicionalmente activa a partir de los polipéptidos mutantes expresados en el paso (iii) que presente una disminución de la actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo al pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo al pH aberrante, y
v. enlazando la por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular para producir el receptor de antígeno quimérico; y
en donde el antígeno diana es un receptor del factor de crecimiento tirosina quinasa que está sobreexpresado en la superficie de las células cancerosas.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la región de direccionamiento específica de antígeno también tiene una disminución en la afinidad de unión al antígeno diana en el ensayo al pH fisiológico normal en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o un dominio de la misma.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la región de direccionamiento específica de antígeno tiene un aumento de la actividad en el ensayo al pH aberrante en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o un dominio de la misma.
4. El método de las reivindicaciones 1-3, en donde la región de direccionamiento específica de antígeno tiene un aumento de selectividad en el ensayo al pH aberrante en comparación con la región de direccionamiento específica de antígeno de la proteína parental o un dominio de la misma.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el pH fisiológico normal es 7,4 y el pH aberrante es un pH de un microambiente tumoral.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína biológica condicionalmente activa es sustancialmente inactiva al pH fisiológico normal y es activa a un pH aberrante menor que el pH fisiológico normal.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el paso de evolución comprende una técnica seleccionada entre PCR, PCR propensa a errores, barajado, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis sexual por PCR, mutagénesisin vivo,mutagénesis en casete, mutagénesis en conjunto recursiva, mutagénesis en conjunto exponencial, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje de genes, mutagénesis saturada de sitio génico, mutagénesisin vitro,reacción en cadena de la ligasa, síntesis de oligonucleótidos y combinaciones de las mismas.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además un paso vi. de configurar dicho receptor de antígeno quimérico de tal manera que una proteína que contenga el receptor de antígeno quimérico tiene un aumento en el nivel de expresión en comparación con la proteína parental o un dominio de la misma.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el paso iv. selecciona la región de direccionamiento específica de antígeno condicionalmente activa que presenta la mayor actividad diferencial entre la actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo al pH fisiológico normal y la misma actividad de unión al antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas en el ensayo al pH aberrante.
10. Una célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del cáncer en un sujeto, en donde la célula citotóxica manipulada genéticamente se produce introduciendo un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un receptor de antígeno quimérico para unirse a un antígeno diana localizado en una superficie de células cancerosas, en una célula citotóxica obtenida del sujeto, en donde el receptor de antígeno quimérico comprende
i. por lo menos una región de direccionamiento específica de antígeno que se une al antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas, dicha región de direccionamiento específica de antígeno haciéndose evolucionar a partir de una proteína parental o de un dominio de la misma que se une al antígeno diana localizado en la superficie de las células cancerosas y que tiene una disminución de la actividad de unión al antígeno diana en un ensayo a un pH fisiológico normal en comparación con la misma actividad de unión al antígeno diana en un ensayo a un pH aberrante;
ii. un dominio transmembrana; y
iii. un dominio de señalización intracelular; y
en donde el antígeno diana es un receptor del factor de crecimiento tirosina quinasa que está sobreexpresado en la superficie de las células cancerosas.
11. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la región de direccionamiento específica de antígeno tiene una relación de afinidad de unión con el antígeno diana al pH aberrante con respecto a la actividad de unión con el antígeno diana al pH fisiológico normal de por lo menos 1,6, o por lo menos 1,8, o por lo menos 2, o por lo menos 2,5, o por lo menos 3, o por lo menos 5, o por lo menos 7, o por lo menos 8, o por lo menos 9, o por lo menos 10, o por lo menos 15, o por lo menos 20.
12. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el vector de expresión se selecciona entre vectores de lentivirus, vectores de retrovirus gamma, vectores de virus espumosos, vectores de virus adenoasociados, vectores de adenovirus, vectores de virus pox, vectores de virus herpes, virus híbridos manipulados y vectores mediados por transposones.
13. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 12, en donde la célula citotóxica es una célula T, preferiblemente una célula T seleccionada entre una célula T virgen, una célula T de memoria central y una célula T de memoria efectora.
14. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 12, en donde la célula citotóxica se selecciona entre una célula asesina natural, una célula NK activada, un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo, una célula B, un macrófago y una célula asesina activada por linfoquinas.
15. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 14, en donde la secuencia polinucleotídica se integra en el genoma de la célula citotóxica y la célula citotóxica produce el receptor de antígeno quimérico en una cantidad suficiente para uso terapéutico.
16. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde el cáncer es un tumor sólido seleccionado entre fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, enfermedad maligna linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma, glioma, glioblastoma, astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales, o en donde el cáncer es un tumor hematológico seleccionado entre leucemias, policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.
17. La célula citotóxica manipulada genéticamente para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 16, en donde el receptor de antígeno quimérico está configurado de tal manera que una proteína que contiene el receptor de antígeno quimérico tiene un aumento en el nivel de expresión en comparación con la proteína parental o un dominio de la misma.
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