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ES3008686T3 - Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample - Google Patents

Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample Download PDF

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ES3008686T3
ES3008686T3 ES22715466T ES22715466T ES3008686T3 ES 3008686 T3 ES3008686 T3 ES 3008686T3 ES 22715466 T ES22715466 T ES 22715466T ES 22715466 T ES22715466 T ES 22715466T ES 3008686 T3 ES3008686 T3 ES 3008686T3
Authority
ES
Spain
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capture
analyte
probes
biological sample
spatial
Prior art date
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Active
Application number
ES22715466T
Other languages
English (en)
Inventor
Jennifer Chew
Joseph Francis Shuga
Patrick Roelli
Denise Cheung
Alexander Hermes
Yifeng Yin
Naishitha Anaparthy
Ryo Hatori
Marlon Stoeckius
Rapolas Spalinskas
Anna-Maria Katsori
Cedric Uytingco
Mesruh Turkekul
David Sukovich
Christina Galonska
Aleksandra Jurek
Octavian Marian Bloju
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
10X Genomics Inc
Original Assignee
10X Genomics Inc
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Publication date
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos, composiciones y kits para preparar muestras biológicas para la expresión espacial múltiple de genes y el análisis proteómico, como la determinación de una ubicación de un analito de ácido nucleico y un analito de proteína en una muestra biológica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Captura en formato múltiple de la expresión génica y proteica de una muestra biológica
Campo de la invención
En la presente descripción se proporcionan métodos, composiciones y kits para preparar muestras biológicas para el análisis proteómico y de expresión génica espacial en formato múltiple, tal como determinar una localización de un analito de ácido nucleico y un analito de proteína en una muestra biológica.
Antecedentes
Las células dentro de un tejido de un sujeto tienen diferencias en la morfología y/o función celular debido a niveles variados de analito (por ejemplo, expresión génica y/o de proteínas) dentro de las diferentes células. La posición específica de una célula dentro de un tejido (por ejemplo, la posición de la célula con relación a las células vecinas o la posición de la célula con relación al microentorno del tejido) puede afectar, por ejemplo, la morfología, la diferenciación, el destino, la viabilidad, la proliferación, el comportamiento, y la señalización y el intercambio de la célula con otras células en el tejido.
La heterogeneidad espacial se ha estudiado previamente mediante el uso de técnicas que solo proporcionan datos para un pequeño puñado de analitos en el contexto de un tejido intacto o una porción de un tejido, o proporcionan datos sustanciales del analito para el tejido disociado (es decir, células individuales), pero no logran proporcionar información sobre la posición de la célula individual en una muestra biológica madre (por ejemplo, muestra de tejido).
Además, la detección en formato múltiple de diferentes analitos (por ejemplo, ácido nucleico, proteína, etc.) en la misma muestra biológica, mientras se conserva la información espacial sigue siendo un desafío en el campo. Los métodos actuales incluyen la detección espacial amplia del transcriptoma o varios métodos de detección de proteínas, sin embargo, aún se necesitan métodos que logren ambos dentro del contexto espacial de una muestra biológica.
Resumen
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
La detección en formato múltiple de diferentes analitos (por ejemplo, ácido nucleico, proteína, etc.) en la misma muestra biológica, mientras se conserva la información espacial, sigue siendo un desafío en el campo. Como se describió anteriormente, los métodos actuales incluyen la detección espacial amplia del transcriptoma o varios métodos de detección de proteínas, incluida la inmunofluorescencia, sin embargo, aún se necesitan métodos que detecten tanto la expresión génica espacial como la expresión proteica espaciales dentro del contexto espacial de una muestra biológica simultáneamente.
En la presente descripción se proporcionan métodos para determinar la localización espacial de un ácido nucleico y una proteína a partir de una muestra biológica que incluye: a) proporcionar una matriz espacial que incluye una primera y segunda pluralidad de sondas de captura donde cada pluralidad incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, b) poner en contacto la matriz espacial con una muestra biológica, c) poner en contacto la muestra biológica con (i) una pluralidad de agentes de captura de analito, donde un agente de captura de analito incluye un resto de unión al analito y un oligonucleótido que incluye un código de barras de un resto de unión al analito y una secuencia de captura de analito, donde la secuencia de captura de analito incluye una secuencia complementaria a una segunda pluralidad de dominios de captura, y (ii) una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla, donde una de las sondas de ligazón con plantilla incluye una secuencia complementaria a una primera pluralidad de dominios de captura, d) unir el resto de unión al analito del agente de captura de analito a una proteína objetivo, e) hibridar las sondas de ligazón con plantilla a un ácido nucleico objetivo y ligar las sondas para producir productos de ligazón, f) hibridar los productos de ligazón a la primera pluralidad de dominios de captura y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos a la segunda pluralidad de dominios de captura en la matriz espacial, y g) determinar la secuencia o una porción de esta de un producto de ligazón capturado, o un complemento de esta, y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el producto de ligazón, y la secuencia del resto de unión al analito de la sonda de captura unida, o un complemento de esta, del agente de captura de analito unido, para determinar de esta manera la localización espacial de un ácido nucleico y la proteína de la muestra biológica.
En algunas modalidades, los dominios de captura de la primera pluralidad de sondas de captura se definen como secuencias de captura no homopoliméricas o secuencias homopoliméricas. En algunas modalidades, los dominios de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura se definen como secuencias no homopoliméricas o secuencias de captura homopoliméricas. En algunas modalidades, los dominios de captura de la primera pluralidad de sondas de captura son diferentes de los dominios de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura. En algunas modalidades, la secuencia homopolimérica incluye una secuencia de poliT y la secuencia no homopolimérica incluye una secuencia fija o una secuencia redundante. En algunas modalidades, la secuencia fija incluye al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11.
En algunas modalidades, el ácido nucleico es un ARN o ADN. En algunas modalidades, el ARN es un ARNm.
En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de tejido. En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de tejido recién congelada o una muestra de tejido fijada, donde la muestra de tejido fija es una muestra de tejido fijada con formaldehído, una muestra de tejido fijada con acetona, una muestra de tejido con paraformaldehído o una muestra de tejido fijada con metanol. En algunas modalidades, la muestra biológica es una sección de tejido, donde la sección de tejido es una sección de tejido recién congelada o una sección fijada, y opcionalmente, donde la sección de tejido fijada es una sección de tejido embebida en parafina fijada con formalina, una sección de tejido fijada con acetona, una sección de tejido con paraformaldehído o una sección de tejido fijada con metanol. En algunas modalidades, la muestra de tejido se deriva de una muestra de biopsia o un embrión de roedor completo.
En algunas modalidades, antes de la etapa (b) la muestra biológica se desparafina y desreticula. En algunas modalidades, la desreticulación incluye el uso de un tampón. En algunas modalidades, el tampón incluye tampón Tris-EDTA a un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 y una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 80 °C. En algunas modalidades, el tampón incluye tampón citrato a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 y una temperatura de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 100 °C.
En algunas modalidades, la hibridación de los productos de ligazón con plantilla y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos incluye la permeabilización de la muestra biológica.
En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito del oligonucleótido se bloquea antes de unirse a la proteína objetivo. En algunas modalidades, el oligonucleótido del agente de captura de analito se bloquea mediante una sonda de bloqueo. En algunas modalidades, la sonda de bloqueo se elimina antes de hibridar la secuencia de captura de analito del oligonucleótido de la secuencia de captura de analito con el dominio de captura de la sonda de captura.
En algunas modalidades, la determinación en la etapa (g) incluye: a) extender los productos de ligazón capturados y los oligonucleótidos capturados de los agentes de captura de analito, donde los productos de extensión incluyen el código de barras espacial o un complemento de este, b) liberar los productos de extensión, o los complementos de estos, de la matriz espacial, c) producir una biblioteca a partir de los productos de extensión liberados o los complementos de estos, y d) secuenciar la biblioteca.
En algunas modalidades, antes de la etapa (c) el método incluye preamplificar los productos de extensión, o complementos de estos.
En algunas modalidades, el complemento del oligonucleótido del agente de captura de analito incluye un código de barras del resto de unión al analito específico para la porción de unión al analito del agente de captura de analito.
En algunas modalidades, la primera y segunda pluralidad de sondas de captura incluyen un dominio de escisión, uno o más dominios funcionales, un identificador molecular único y sus combinaciones.
En algunas modalidades, el método incluye la obtención de imágenes de la muestra biológica. En algunas modalidades, la obtención de imágenes incluye una o más de microscopía de expansión, microscopía de campo claro, microscopía de campo oscuro, microscopía de contraste de fases, microscopía electrónica, microscopía de fluorescencia, microscopía de reflexión, microscopía de interferencia y microscopía confocal.
En algunas modalidades, el método incluye teñir la muestra biológica. En algunas modalidades, la tinción incluye hematoxilina y eosina. En algunas modalidades, la tinción incluye el uso de una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente o una de sus combinaciones.
En algunas modalidades, la matriz espacial incluye una o más series de dilución de proteínas.
En la presente descripción se proporcionan además matrices espaciales que incluyen: a) una pluralidad de sondas de captura que incluyen códigos de barras espaciales y una primera pluralidad de dominios de captura hibridados con una pluralidad de productos de ligazón con plantilla, y b) una pluralidad de sondas de captura que incluyen códigos de barras espaciales y una segunda pluralidad de dominios de captura hibridados con una pluralidad de oligonucleótidos de los agentes de captura de analitos, donde los oligonucleótidos incluyen una secuencia de captura de analito y un código de barras de la fracción de unión al analito.
En algunas modalidades, las sondas de captura incluyen dominios de escisión, identificadores moleculares únicos, una o más secuencias funcionales, o una de sus combinaciones.
En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura son secuencias homopoliméricas o secuencias no homopoliméricas definidas. En algunas modalidades, la segunda pluralidad de dominios de captura son secuencias homopoliméricas o secuencias no homopoliméricas definidas. En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura son secuencias de poli(T). En algunas modalidades, la matriz espacial incluye una o más series de dilución de proteínas.
En la presente descripción se proporcionan además kits que incluyen: a) una matriz espacial que incluye una pluralidad de sondas de captura, donde las sondas de captura incluyen códigos de barras espaciales y donde la pluralidad de sondas de captura incluye una primera pluralidad de primeros dominios de captura y una segunda pluralidad de segundos dominios de captura, b) uno o más agentes de captura de analito, c) uno o más pares de sondas de ligazón con plantilla con ácido nucleico, y d) una o más enzimas y tampones para la práctica de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para determinar la localización espacial de un ácido nucleico y una proteína en una muestra biológica de enfermedad que incluye: a) proporcionar una matriz espacial que incluye una primera y una segunda pluralidad de sondas de captura donde cada pluralidad incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, b) poner en contacto la muestra biológica de enfermedad con la matriz espacial, c) poner en contacto la muestra biológica de enfermedad con: (i) una pluralidad de agentes de captura de analito, donde un agente de captura de analito incluye un resto de unión al analito y un oligonucleótido que incluye un código de barras de un resto de unión al analito y una secuencia de captura de analito, donde la secuencia de captura de analito incluye una secuencia complementaria a una segunda pluralidad de dominios de captura, y (ii) una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla, donde una de las sondas de ligazón con plantilla incluye una secuencia complementaria a una primera pluralidad de dominios de captura, d) unir el resto de unión al analito del agente de captura de analito a una proteína objetivo, e) hibridar las sondas de ligazón con plantilla a un ARN objetivo y ligar las sondas para producir productos de ligazón con plantilla, f) hibridar los productos de ligazón con plantilla a la primera pluralidad de dominios de captura y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos a la segunda pluralidad de dominios de captura en la matriz espacial, y g) determinar la secuencia o una porción de esta de un producto de ligazón capturado, o un complemento, y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el producto de ligazón, y la secuencia del resto de unión al analito de la sonda de captura, o un complemento de esta, del agente de captura de analito unido, para determinar de esta manera la localización espacial de un ácido nucleico y la proteína en la muestra biológica de enfermedad.
En algunas modalidades, la muestra biológica de enfermedad es una muestra biológica cancerosa. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es una muestra biológica de cáncer de ovario, una muestra biológica de cáncer de mama, una muestra biológica de cáncer de pulmón o un melanoma. En algunas modalidades, la muestra de cáncer de mama es cáncer de mama triple positivo o una muestra de carcinoma ductal invasivo.
Cuando los valores se describen en términos de intervalos, debe entenderse que la descripción incluye la descripción de todos los posibles subintervalos dentro de tales intervalos, así como también valores numéricos específicos que caen dentro de tales intervalos independientemente de si se indica expresamente un valor numérico específico o un subintervalo específico.
El término “cada uno”, cuando se usa en referencia a una recopilación de artículos, pretende identificar un artículo individual en la recopilación, pero no necesariamente se refiere a cada artículo en la recopilación, a menos que se indique expresamente de cualquier otra manera, o a menos que el contexto del uso indique claramente de cualquier otra manera.
En la presente descripción se describen diversas modalidades de las características de esta descripción. Sin embargo, debe entenderse que tales modalidades se proporcionan meramente a manera de ejemplo, y pueden ocurrir numerosas variaciones, cambios, y sustituciones para los expertos en la técnica.
Descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos ilustran ciertas modalidades de las características y ventajas de esta descripción. Estas modalidades no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera. Los símbolos de referencia similares en los dibujos indican elementos similares.
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de una sonda de captura con código de barras, como se describe en la presente descripción.
La Figura 2 es un diagrama esquemático de un agente de captura de analito ilustrativo.
La Figura 3 es un diagrama esquemático que representa una interacción ilustrativa entre una sonda de captura inmovilizada en la característica 324 y un agente de captura de analito 326.
La Figuras 4A-B muestra datos de agrupamiento ilustrativos para secciones de ganglios linfáticos humanos FFPE mediante el uso de un panel de prueba de conjugado anticuerpo-oligonucleótido en formato de ocho. La Figura 4A (ARN) muestra el agrupamiento con respecto a la expresión génica del panel de prueba y la Figura 4B (proteína) muestra el agrupamiento con respecto a la expresión proteica del panel de prueba.
La Figura 5 muestra datos de agolpamiento ilustrativos de genes espaciales (superior central) y expresión proteica (superior derecha) en secciones de tejido de amígdala FFPE superpuestas sobre la imagen de H&E (superior izquierda). Las figuras inferiores muestran la visualización de los marcadores de proteínas PD-1, Ki67 y CD8A que etiquetan las células T foliculares, los folículos individuales y las células T supresoras/citotóxicas, respectivamente. La Figura 6 muestra una sección de tejido de amígdala FFPE teñida con H&E ilustrativa (parte superior izquierda), datos de expresión génica espacial (parte superior central) y datos de expresión proteica espaciales (parte superior izquierda). La Figura 6 también muestra una vista ampliada de una sección del tejido de las amígdalas FFPE teñido con H&E (parte inferior izquierda) y el agrupamiento de la expresión génica y la expresión proteica de CD8a (parte inferior del medio) y CD4 (parte inferior derecha) superpuestos en la sección de la sección de tejido de las amígdalas FFPE de H&E.
La Figura 7 muestra la expresión espacial ilustrativa de genes y proteínas a partir de un subconjunto de datos de expresión de genes y proteínas de tejido de amígdala. Se muestra un subconjunto de dieciocho mapas de calor de expresión génica y proteica objetivos diferentes.
La Figura 8 muestra vistas ampliadas de datos de mapas de calor ilustrativos para la sección de tejido de amígdala humana FFPE mediante el uso de un panel de prueba de conjugado anticuerpo-oligonucleótido en formato de 12 de varios genes que se muestran en la Figura 7.
Las Figuras 9A-C muestran la expresión espacial ilustrativa de genes y proteínas en secciones de tejido de cáncer de mama triple positivo FFPE. La Figura 9A muestra una sección de tejido de cáncer de mama triple positivo FFPE teñida con H&E. La Figura 9B muestra los grupos representativos de expresión génica y la Figura 9C muestra los grupos representativos de expresión proteica. Los insertos mostrados en las Figuras 9B y 9C muestran gráficos tSNE representativos.
La Figura 10 muestra una vista ampliada de la expresión de ARN y proteína de Her2 y Vimentina en secciones de tejido de carcinoma ductal invasivo FFPE. Las secciones adyacentes se tiñeron por inmunofluorescencia para Her2 (arriba) y Vimentina (abajo) demostrando una señal fuerte dentro de la región del cuadro discontinuo de la muestra de biopsia.
Las Figuras 11A-C muestran la expresión espacial ilustrativa de genes y proteínas en secciones de tejido de carcinoma ductal invasivo FFPE. La Figura 11B muestra los grupos representativos de expresión génica y Figura 11C muestra los grupos representativos de expresión proteica superpuestos en la tinción H&E (Figura 11A) secciones de tejido de carcinoma ductal invasivo.
La Figura 12 muestra la expresión espacial ilustrativa de genes y proteínas a partir de un subconjunto de los datos de expresión génica y proteica de las Figuras 11B-C. Los biomarcadores se usaron para identificar dos regiones de interés en la muestra de tejido de carcinoma ductal invasivo.
La Figuras 13 muestra la expresión espacial ilustrativa de genes y proteínas en la sección de tejido de carcinoma ductal invasivo en FFPE superpuesta a la imagen de H&E del gen ACTA2 y Epcam y sus proteínas correspondientes. La Figura 14A muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica del ARN del receptor de la proteína tirosina fosfatasa de tipo C (Ptprc) mediante el uso de sondas ligadas en tejido de bazo de ratón FFPE bajo condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 14B muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica del ARN de Ptprc mediante el uso de sondas ligadas en tejido de bazo FFPE bajo condiciones de control de configuración sin intercalamiento
La Figura 14C muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de CD45R mediante el uso de agentes de captura de analitos en tejido de bazo de ratón FFPE bajo condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 14D muestra una imagen ilustrativa de información resuelta espacialmente de la expresión proteica de CD45R mediante el uso de agentes de captura de analitos en tejido de bazo de ratón FFPE bajo condiciones de control de configuración sin intercalamiento.
La Figura 15A muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica del ARN de tirosina hidroxilasa (Th) mediante el uso de sondas ligadas en tejido cerebral de ratón FFPE bajo condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 15B muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica de Th ARN mediante el uso de sondas ligadas en tejido cerebral de ratón FFPE bajo condiciones de control de configuración sin intercalamiento.
La Figura 15C muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de la proteína tirosina hidroxilasa (TH) mediante el uso de agentes de captura de analitos en tejido cerebral de ratón FFPE bajo condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 15D muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de TH mediante el uso de agentes de captura de analitos en tejido cerebral de ratón FFPE bajo condiciones de control de configuración sin intercalamiento.
La Figura 16A muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Ter119 mediante el uso de sondas ligadas en tejido de torso de embrión de ratón FFPE en condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 16B muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Ter119 mediante el uso de sondas ligadas en tejido de torso de embrión de ratón FFPE en condiciones de configuración sin intercalamiento.
La Figura 16C muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de Ter119 mediante el uso de un agente de captura de analito en tejido de torso de embriones de ratón FFPE en condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 16D muestra una imagen ilustrativa de información resuelta espacialmente de la expresión proteica de Ter119 mediante el uso de agentes de captura de analitos en tejido de torso de embriones de ratón FFPE bajo condiciones de configuración sin intercalamiento.
La Figura 17A muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Ter119 mediante el uso de sondas ligadas en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 17B muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Ter119 mediante el uso de sondas ligadas en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración sin intercalamiento.
La Figura 17C muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de Ter119 mediante el uso de agentes de captura de analitos en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración de intercalamiento.
La Figura 17D muestra una imagen ilustrativa de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de Ter119 mediante el uso de un agente de captura de analito en la cabeza del embrión de ratón FFPE y el tejido del torso superior mediante el uso de condiciones de configuración sin intercalamiento.
Las Figuras 18A, 19A, 20A, 21A, y 22A muestran imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Mpped1 (Figura 18A), Tnnc1 (Figura 19A), Fgf15 (Figura 20A), Epyc (Figura 21A), y Serpina1e (Figura 22A) mediante el uso de sondas ligadas en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración de intercalamiento.
Las Figuras 18B, 19B, 20B, 21B, y 22B muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Mpped1 (Figura 18B), Tnnc1 (Figura 19B), Fgf15 (Figura 20B), Epyc (Figura 21B), y Serpina1e (Figura 22B) mediante el uso de sondas ligadas en tejido de torso de embrión de ratón FFPE bajo condiciones de configuración de intercalamiento.
Las Figuras 18C, 19C, 20C, 21C, y 22C muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Mpped1 (Figura 18C), Tnnc1 (Figura 19C), Fgf15 (Figura 20C), Epyc (Figura 21C), y Serpina1e (Figura 22C) mediante el uso de sondas ligadas en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración sin intercalamiento.
Las Figuras 18D, 19D, 20D, 21D, y 22D muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Mpped1 (Figura 18D), Tnnc1 (Figura 19D), Fgf15 (Figura 20D), Epyc (Figura 21D), y Serpina1e (Figura 22D) mediante el uso de sondas ligadas en tejido de torso de embrión de ratón FFPE bajo condiciones de configuración sin intercalamiento.
Las Figuras 18E, 19E, 20E, 21E, y 22E muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de Mpped1 (Figura 18E), Tnnc1 (Figura 19E), Fgf15 (Figura 20E), Epyc (Figura 21E), y Serpina1e (Figura 22E) mediante el uso de agentes de captura de analito en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración de intercalamiento.
Las Figuras 18F, 19F, 20F, 21F, y 22F muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de Mpped1 (Figura 18F), Tnnc1 (Figura 19F), Fgf15 (Figura 20F), Epyc (Figura 21F), y Serpina1e (Figura 22F) mediante el uso de agentes de captura de analitos en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración sin intercalamiento.
Las Figuras 18G, 19G, 20G, 21G, y 22G muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión proteica de Mpped1 (Figura 18G), Tnnc1 (Figura 19G), Fgf15 (Figura 20G), Epyc (Figura 21G), y Serpina1e (Figura 22G) mediante el uso de agentes de captura de analito en tejido de torso de embriones de ratón FFPE bajo condiciones de configuración sin intercalamiento.
Las Figuras 18H, 19H, 20H, 21H, y 22H muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Mpped1 (Figura 18H), Tnnc1 (Figura 19H), Fgf15 (Figura 20H), Epyc (Figura 21H), y Serpina1e (Figura 22H) mediante el uso de sondas ligadas en la cabeza de embriones de ratón FFPE y el tejido del torso superior en condiciones de configuración sin intercalamiento en el que solo se detectó ARN.
Las Figuras 18I, 19I, 20I, 21I, y 22I muestra imágenes ilustrativas de información espacialmente resuelta de la expresión génica de ARN de Mpped1 (Figura 18I), Tnnc1 (Figura 19I), Fgf15 (Figura 20I), Epyc (Figura 21I), y Serpina1e (Figura 22I) mediante el uso de sondas ligadas en tejido de torso de embrión de ratón FFPE bajo condiciones de configuración sin intercalamiento en el que solo se detectó ARN.
Las Figuras 23A-E muestran la infiltración espacial de células inmunitarias en una sección de tejido de cáncer de mama se correlaciona con las anotaciones del patólogo. La Figura 23A muestra una sección de tejido de cáncer de mama humano FFPE teñida con H&E. La Figura 23B muestra las anotaciones del patólogo. La Figura 23C muestra la expresión proteica espaciales de CD3 (por ejemplo, un marcador para los linfocitos T); Figura 23D muestra la expresión proteica espacial de CD8A (por ejemplo, un marcador para linfocitos T citotóxicos); y la Figura 23E muestra la expresión proteica espacial para HLA-DR (por ejemplo, un marcador para la activación de linfocitos T).
Las Figuras 24A-D muestran la infiltración espacial de células inmunitarias en una sección de tejido FFPE de cáncer de ovario se correlaciona con las anotaciones del patólogo. La Figura 24A muestra una anotación del patólogo para el carcinoma invasivo y las células inmunitarias. La Figura 24B muestra la expresión proteica espacial de CD20 (por ejemplo, un marcador para las células B); la Figura 24C muestra la expresión proteica espacial de CD68 (por ejemplo, un marcador para monocitos); y la Figura 24D muestra la expresión proteica espacial de CD8A (por ejemplo, un marcador para linfocitos T citotóxicos).
Las Figuras 25A-D muestran la infiltración diferencial de linfocitos T citotóxicos espaciales dentro de diferentes regiones de una sección de tejido de FFPE de cáncer de ovario. La Figura 25A muestra la expresión proteica espacial de CD8A (por ejemplo, un marcador para linfocitos T citotóxicos). La Figura 25B muestra áreas altamente infiltradas (“calientes”, CD3) y no filtradas (“frías”, CD8) de expresión proteica en la sección de tejido FFPE mostrada en la Figura 25A. La Figura 25C muestra la expresión proteica espaciales de HLA-G y Figura 25D muestra la expresión espacial de proteínas de IMPG2.
La Figura 26 muestra una matriz espacial ilustrativa con múltiples series de dilución de proteínas que se ubican en la matriz espacial.
Las Figuras 27A-D muestra un gen espacial ilustrativo (Figura 27B) y la expresión proteica (Figura 27C) en la expresión en el tejido FFPE de cáncer de pulmón. La Figura 27A muestra un tejido de cáncer de pulmón FFPE teñido con H&E y la Figura 27D muestra un gráfico de UMI espacial de proteínas HLA-DR.
Las Figuras 28A-D muestra la expresión espacial ilustrativa de genes (Figura 28B) y proteínas (Figura 28C) en tejido FFPE de melanoma. La Figura 28A muestra un tejido canceroso de melanoma teñido con H&E y la Figura 28D muestra un gráfico de UMI espacial de proteínas HLA-DR.
Las Figuras 29A-C muestran la tinción por inmunofluorescencia de anticuerpos contra vimentina ilustrativa y tinción con DAPI (Figura 29A), la expresión espacial de proteínas ilustrativa (Figura 29B), y la expresión proteica espacial ilustrativa de Vimentina (Figura 29C) en una sección de tejido de cáncer de mama ductal invasivo FFPE de grado II.
Descripción detallada
La presente descripción presenta métodos, composiciones y kits para el análisis espacial de muestras biológicas. Más específicamente, la presente descripción presenta métodos, composiciones y kits tanto para la expresión génica espacial como para la expresión proteica espacial en una muestra biológica.
Las metodologías y composiciones de análisis espacial descritas en la presente descripción pueden proporcionar una gran cantidad de analito y/o datos de expresión para una variedad de analitos dentro de una muestra biológica con alta resolución espacial, mientras se retiene el contexto espacial nativo. Los métodos y composiciones de análisis espacial pueden incluir, por ejemplo, usar una sonda de captura que incluye un código de barras espacial (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la localización o posición de un analito dentro de una célula o una muestra de tejido (por ejemplo, una célula de mamífero o una muestra de tejido de mamífero) y un dominio de captura que es capaz de unirse a un analito (por ejemplo, una proteína y/o un ácido nucleico) producido por y/o presente en una célula. Los métodos y composiciones de análisis espacial también pueden incluir usar una sonda de captura que tiene un dominio de captura que captura un agente intermedio para la detección indirecta de un analito. Por ejemplo, el agente intermedio puede incluir una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un código de barras) asociada con el agente intermedio. Por lo tanto, la detección del agente intermedio es indicativa del analito en la muestra de células o tejido.
Los aspectos no limitativos de las metodologías y composiciones de análisis espacial se describen en las Patentes de Estados Unidos núms. 10,774,374, 10,724,078, 10,480,022, 10,059,990, 10,041,949, 10,002,316, 9,879,313, 9,783,841, 9,727,810, 9,593,365, 8,951,726, 8,604,182, 7,709,198, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos núms. 2020/239946, 2020/080136, 2020/0277663, 2020/024641, 2019/330617, 2019/264268, 2020/256867, 2020/224244, 2019/194709, 2019/161796, 2019/085383, 2019/055594, 2018/216161, 2018/051322, 2018/0245142, 2017/241911,2017/089811, 2017/067096, 2017/029875, 2017/0016053, 2016/108458, 2015/000854, 2013/171621, WO 2018/091676, WO 2020/176788, Rodriques y otros, Science 363(6434):1463-1467, 2019; Lee y otros, Nat. Protoc. 10(3):442-458, 2015; Trejo y otros, PLoS ONE 14(2):e0212031, 2019; Chen y otros, Science 348(6233):aaa6090, 2015; Gao y otros, BMC Biol. 15:50, 2017; y Gupta y otros, Nature Biotechnol. 36:1197-1202, 2018; la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión génica espacial de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de junio de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de julio de 2020), ambas disponibles en el sitio web de documentación 10x Genomics Support y puede usarse en la presente descripción en cualquier combinación. Vickovic y otros (bioRxiv, DOI 10.1101/2020.10.14.338418, 2020), describe una plataforma de alto rendimiento completamente automatizada para la transcriptómica combinada y la proteómica basada en anticuerpos resuelta espacialmente. En la presente descripción se describen aspectos adicionales no limitantes de las metodologías y composiciones de análisis espacial.
Alguna terminología general que puede usarse en esta descripción puede encontrarse en la Sección (I)(b) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Típicamente, un “código de barras” es una etiqueta o identificador que transmite o es capaz de transmitir información (por ejemplo, información sobre un analito en una muestra, una perla y/o una sonda de captura). Un código de barras puede ser parte de un analito o independiente de un analito. Un código de barras puede unirse a un analito. Un código de barras particular puede ser único con relación a otros códigos de barras. A los efectos de esta descripción, un “analito” puede incluir cualquier sustancia, estructura, resto o componente biológico a analizar. El término “diana” puede referirse de manera similar a un analito de interés.
Los analitos pueden clasificarse en términos generales en uno de dos grupos: analitos de ácidos nucleicos y analitos no ácidos nucleicos. Los ejemplos de analitos no ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitarse a, lípidos, carbohidratos, péptidos, proteínas, glicoproteínas (unidas a N o unidas a O), lipoproteínas, fosfoproteínas, variantes específicas de proteínas fosforadas o acetiladas, variantes de amidación de proteínas, variantes de hidroxilación de proteínas, variantes de mutilación de proteínas, variantes de ubiquitinación de proteínas, variantes de sulfatación de proteínas, proteínas virales (por ejemplo, cápside viral, envoltura viral, cubierta viral, accesorio viral, glicoproteínas virales, pico viral, etc.), proteínas extracelulares e intracelulares, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) localizarse en localización(ones) subcelular(es), incluidas, por ejemplo, orgánulos, por ejemplo, mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, cloroplastos, vesículas endocíticas, vesículas exocíticas, vacuolas, lisosomas, etc. En algunas modalidades, el(los) analito(s) puede(n) ser péptidos o proteínas, incluidos sin limitación, anticuerpos y enzimas. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de analitos en la Sección (I)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm.
2020/0277663. En algunas modalidades, un analito puede detectarse indirectamente, tal como mediante la detección de un agente intermedio, por ejemplo, un producto de ligazón o un agente de captura de analito (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con oligonucleótido), tales como los descritos en la presente descripción.
Una “muestra biológica” se obtiene típicamente del sujeto para su análisis mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, biopsia, cirugía y microscopía de captura láser (LCM), y generalmente incluye células y/u otro material biológico del sujeto. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una sección de tejido. En algunas modalidades, una muestra biológica puede ser una muestra biológica fijada y/o teñida (por ejemplo, una sección de tejido fijada y/o teñida). Los ejemplos no limitantes de tinciones incluyen tinciones histológicas (por ejemplo, hematoxilina y/o eosina) y tinciones inmunológicas (por ejemplo, tinciones fluorescentes). En algunas modalidades, pueden obtenerse imágenes de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra biológica fijada y/o teñida). Las muestras biológicas también se describen en la Sección (I)(d) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
En algunas modalidades, una muestra biológica se permeabiliza con uno o más reactivos de permeabilización. Por ejemplo, la permeabilización de una muestra biológica puede facilitar la captura del analito. Las condiciones y agentes de permeabilización ilustrativos se describen en la Sección (I)(d)(ii)(13) o la Sección de modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
Los métodos de análisis espaciales basados en matrices implican la transferencia de uno o más analitos de una muestra biológica a una matriz de elementos en un sustrato, donde cada elemento está asociado con una localización espacial única en la matriz. El análisis subsecuente de los analitos transferidos incluye determinar la identidad de los analitos y la localización espacial de los analitos dentro de la muestra biológica. La localización espacial de un analito dentro de la muestra biológica se determina basándose en el elemento al que está unido el analito (por ejemplo, directa o indirectamente) en la matriz, y la localización espacial relativa del elemento dentro de la matriz.
Una “sonda de captura” se refiere a cualquier molécula capaz de capturar (directa o indirectamente) y/o etiquetar un analito (por ejemplo, un analito de interés) en una muestra biológica. En algunas modalidades, la sonda de captura es un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas modalidades, la sonda de captura incluye un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial y/o un identificador molecular único (UMI)) y un dominio de captura). En algunas modalidades, una sonda de captura puede incluir un dominio de escisión y/o un dominio funcional (por ejemplo, un sitio de unión a cebador, tal como para secuenciación de próxima generación (NGS)). Ver, por ejemplo, la Sección (II)(b) (por ejemplo, las subsecciones (i)-(vi)) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. La generación de sondas de captura puede lograrse mediante cualquier método apropiado, incluidos los descritos en la Sección (II)(d)(ii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra una sonda de captura ilustrativa, como se describe en la presente descripción. Como se muestra, la sonda de captura 102 está opcionalmente acoplada a un elemento 101 por un dominio de escisión 103, tal como un enlazador disulfuro. La sonda de captura puede incluir una secuencia funcional 104 que sea útil para su procesamiento subsecuente. La secuencia funcional 104 puede incluir toda o una parte de la secuencia de unión de células de flujo específica del secuenciador (por ejemplo, una secuencia P5 o P7), toda o una parte de una secuencia de cebador de secuenciación (por ejemplo, un sitio de unión al cebador R1, un sitio de unión al cebador R2), o sus combinaciones. La sonda de captura también puede incluir un código de barras espacial 105. La sonda de captura también puede incluir una secuencia de identificador molecular único (UMI) 106. Mientras que la Figura 1 muestra el código de barras espacial 105 como ubicado aguas arriba (5') de la secuencia UMI 106, debe entenderse que las sondas de captura en donde la secuencia UMI 106 está ubicada aguas arriba (5') del código de barras espacial 105 también son adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 107 para facilitar la captura de un analito objetivo. En algunas modalidades, la sonda de captura comprende una o más secuencias funcionales adicionales que se pueden ubicar, por ejemplo, entre el código de barras espacial 105 y la secuencia de UMI 106, entre la secuencia de UMI 106 y el dominio de captura 107, o siguiendo el dominio de captura 107. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de un analito de ácido nucleico. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una sonda conectada descrita en la presente descripción. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de control de captura presente en un agente de captura de analito. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a un oligonucleótido de férula. Tal oligonucleótido de férula, además de tener una secuencia complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura, puede tener una secuencia de un analito de ácido nucleico, una secuencia complementaria a una porción de una sonda conectada descrita y/o una secuencia de control de captura descrita en la presente descripción.
Las secuencias funcionales generalmente pueden seleccionarse para compatibilidad con cualquiera de una variedad de sistemas de secuenciación diferentes, por ejemplo, Ion Torrent Proton o PGM, instrumentos de secuenciación Illumina, PacBio, Oxford Nanopore, etc., y los requisitos de los mismos. En algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para compatibilidad con sistemas de secuenciación no comercializados. Ejemplos de tales sistemas y técnicas de secuenciación, para los cuales pueden usarse secuencias funcionales adecuadas, incluyen (pero no se limitan a) secuenciación Ion Torrent Proton o PGM, secuenciación Illumina, secuenciación PacBio SMRT y secuenciación Oxford Nanopore. Además, en algunas modalidades, las secuencias funcionales pueden seleccionarse para que sean compatibles con otros sistemas de secuenciación, incluidos sistemas de secuenciación no comercializados.
En algunas modalidades, el código de barras espacial 105 y secuencias funcionales 104 es común a todas las sondas unidas a un elemento determinado. En algunas modalidades, la secuencia UMI 106 de una sonda de captura unida a un elemento dado es diferente de la secuencia UMI de una sonda de captura diferente unida al elemento dado.
En algunas modalidades, puede detectarse más de un tipo de analito (por ejemplo, ácidos nucleicos y proteínas) de una muestra biológica (por ejemplo, simultánea o secuencialmente) mediante el uso de cualquier técnica en formato múltiple apropiada, tales como las descritas en la Sección (IV) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
En algunas modalidades, la detección de uno o más analitos (por ejemplo, analitos proteicos) puede realizarse mediante el uso de uno o más agentes de captura de analito. Como se usa en la presente, un “agente de captura de analito” se refiere a un agente que interactúa con un analito (por ejemplo, un analito en una muestra biológica) y con una sonda de captura (por ejemplo, una sonda de captura unida a un sustrato o una característica) para identificar el analito. En algunas modalidades, el agente de captura de analito incluye: (i) un resto de unión al analito (por ejemplo, que se une a un analito), por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; (ii) código de barras del resto de unión al analito; y (iii) una secuencia de captura de analito. En algunas modalidades, el agente de captura de analito incluye un dominio de código de barras del agente de captura que se conjuga o se une de cualquier otra manera a la porción de unión al analito. En algunas modalidades, el dominio de código de barras del agente de captura se une covalentemente a la porción de unión al analito. En algunas modalidades, un dominio de código de barras del agente de captura es una secuencia de ácido nucleico. En algunas modalidades, un dominio de código de barras del agente de captura incluye un código de barras del resto de unión al analito y una secuencia de captura de analito.
En algunas modalidades, los agentes de captura de analito son capaces de unirse a analitos presentes dentro de una célula. En algunas modalidades, los agentes de captura de analito son capaces de unirse a analitos de la superficie celular que pueden incluir, sin limitación, un receptor, un antígeno, una proteína de superficie, una proteína transmembrana, un conglomerado de proteínas de diferenciación, una proteína canal, una proteína bomba, una proteína portadora, un fosfolípido, una glucoproteína, un glucolípido, un complejo de proteína de interacción célulacélula, un complejo presentador de antígenos, un complejo mayor de histocompatibilidad, un receptor de linfocitos T manipulado genéticamente, un receptor de linfocitos T, un receptor de linfocitos B, un receptor de antígeno quimérico, una proteína de la matriz extracelular, una modificación postraduccional (por ejemplo, fosforilación, glucosilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación o lipidación) del estado de una proteína de la superficie celular, una unión en hendidura, y una unión adherente. En algunas modalidades, los agentes de captura de analito son capaces de unirse a analitos de la superficie celular que se modifican postraduccionalmente. En tales modalidades, los agentes de captura de analito pueden ser específicos para los analitos de la superficie celular en base a un estado dado de modificación postraduccional (por ejemplo, fosforilación, glucosilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación o lipidación), de manera que un perfil del analito de la superficie celular puede incluir información de modificación postraduccional de uno o más analitos.
Como se usa en la presente, la expresión “resto de unión al analito” se refiere a una molécula o resto capaz de unirse a un constituyente macromolecular (por ejemplo, un analito, por ejemplo, un analito biológico). En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de perfilamiento espacial descritos en la presente descripción, el resto de unión al analito del agente de captura de analito que se une a un analito biológico puede incluir, pero no se limita a, un anticuerpo, o un fragmento de unión al epítopo del mismo, una molécula de unión al receptor de superficie celular, un ligando del receptor, una molécula pequeña, un anticuerpo biespecífico, un activador de linfocitos T biespecífico, un activador de receptores de células T, un activador de receptores de células B, un procuerpo, un aptámero, un monocuerpo, un afímero, una darpina, y un andamio de proteínas, o cualquiera de sus combinaciones. La porción de unión al analito puede unirse al constituyente macromolecular (por ejemplo, analito) con alta afinidad y/o con alta especificidad. La porción de unión al analito puede incluir una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un oligonucleótido), que puede corresponder a al menos una porción o a la totalidad del resto de unión al analito. La porción de unión al analito puede incluir un polipéptido y/o un aptámero (por ejemplo, un polipéptido y/o un aptámero que se une a una molécula objetivo específica, por ejemplo, un analito). La porción de unión al analito puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno) que se une a un analito específico (por ejemplo, un polipéptido).
En algunas modalidades, una porción de unión al analito de un agente de captura de un analito incluye uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de estos. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que incluyen la porción de unión al analito pueden unirse específicamente a un analito objetivo. En algunas modalidades, el analito es una proteína (por ejemplo, una proteína sobre una superficie de la muestra biológica (por ejemplo, una célula) o una proteína intracelular). En algunas modalidades, una pluralidad de agentes de captura de analito que comprenden una pluralidad de porciones de unión al analito se une a una pluralidad de analitos presentes en una muestra biológica. En algunas modalidades, la pluralidad de analitos incluye una única especie del analito (por ejemplo, una única especie de polipéptido). En algunas modalidades en las que la pluralidad de analitos incluye una única especie del analito, las porciones de unión al analito de la pluralidad de agentes de captura de analito son los mismos. En algunas modalidades en las que la pluralidad de analitos incluye una única especie del analito, las porciones de unión al analito de la pluralidad de agentes de captura de analito son diferentes (por ejemplo, los miembros de la pluralidad de agentes de captura de analito pueden tener dos o más especies de porciones de unión al analito, en donde cada una de las dos o más especies de porciones de unión al analito se unen a una única especie del analito, por ejemplo, en sitios de unión diferentes). En algunas modalidades, la pluralidad de analitos incluye múltiples especies diferentes de analitos (por ejemplo, múltiples especies diferentes de polipéptidos).
Como se usa en la presente, el término “código de barras del resto de unión al analito” se refiere a un código de barras que se asocia con, o de cualquier otra manera, identifica la porción de unión al analito. En algunos casos, un código de barras del resto de unión al analito (o una porción del mismo) puede eliminarse (por ejemplo, escindirse) del agente de captura de analito. En algunas modalidades, al identificar un resto de unión al analito y su código de barras de resto de unión al analito asociado, también se puede identificar el analito al que se une el resto de unión al analito. Un código de barras del resto de unión al analito puede ser una secuencia de ácido nucleico de una longitud y/o secuencia dadas que se asocia con la porción de unión al analito. Un código de barras del resto de unión al analito puede incluir generalmente cualquiera de la variedad de aspectos de códigos de barras descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un agente de captura de analito que es específico para un tipo de analito puede tener acoplado a este un primer dominio de código de barras del agente de captura (por ejemplo, que incluye un primer código de barras del resto de unión al analito), mientras que un agente de captura de analito que es específico para un analito diferente puede tener un dominio de código de barras del agente de captura diferente (por ejemplo, que incluye un segundo código de barras del resto de unión al analito) que se acopla a este. En algunos aspectos, tal dominio de código de barras del agente de captura puede incluir un código de barras del resto de unión al analito que permite la identificación del resto de unión al analito al que se acopla el dominio de código de barras del agente de captura. La selección del dominio de código de barras del agente de captura puede permitir una diversidad significativa en términos de secuencia, mientras que también se puede unir fácilmente a la mayoría de los restos de unión al analito (por ejemplo, anticuerpos o aptámeros) así como también detectarse fácilmente, (por ejemplo, mediante el uso de tecnologías de secuenciación o de matriz). Puede encontrarse una descripción adicional de los agentes de captura de analito en la Sección (II)(b)(ix) del documento WO 2020/176788 y/o en la Sección (N)(b)(viii) de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
En algunas modalidades, el dominio de código de barras del agente de captura de un agente de captura de analito incluye una secuencia de captura de analito. Como se usa en la presente, el término “secuencia de captura de analito” se refiere a una región o resto configurado para hibridarse, unirse, acoplarse o interactuar de cualquier otra manera con un dominio de captura de una sonda de captura. En algunas modalidades, una secuencia de captura de analito incluye una secuencia de ácido nucleico que es complementaria o sustancialmente complementaria al dominio de captura de una sonda de captura de manera que la secuencia de captura de analito se hibrida con el dominio de captura de la sonda de captura. En algunas modalidades, una secuencia de captura de analito comprende una secuencia de ácido nucleico poli(A) que se hibrida con un dominio de captura que comprende una secuencia de ácido nucleico poli(T). En algunas modalidades, una secuencia de captura de analito comprende una secuencia de ácido nucleico poli(T) que se hibrida con un dominio de captura que comprende una secuencia de ácido nucleico poli(A). En algunas modalidades, una secuencia de captura de analito comprende una secuencia de ácido nucleico que no es homopolimérica que se hibrida con un dominio de captura que comprende una secuencia de ácido nucleico que no es homopolimérica que es complementaria (o sustancialmente complementaria) a la secuencia de ácido nucleico que no es homopolimérica de la región de captura del analito.
Figura 2 es un diagrama esquemático de un agente de captura de analito ilustrativo 202 que comprende una fracción de unión al analito 204 y un dominio de código de barras del agente de captura 208. Un resto de unión al analito 204 es una molécula capaz de unirse a un analito 206 e interactuar con una sonda de captura con código de barras espacial. El resto de unión al analito puede unirse al analito 206 con alta afinidad y/o con alta especificidad. El agente de captura de analito puede incluir un dominio de código de barras del agente de captura 208, una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un oligonucleótido), que puede hibridarse con al menos una porción o la totalidad de un dominio de captura de una sonda de captura. El resto de unión al analito 204 puede incluir un polipéptido y/o un aptámero (por ejemplo, una molécula de oligonucleótido o péptido que se une a un analito objetivo específico). El resto de unión al analito 204 puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de unión al antígeno).
La Figura 3 es un diagrama esquemático que representa una interacción ilustrativa entre una sonda de captura inmovilizada en la característica 324 y un agente de captura de analito 326. La sonda de captura inmovilizada en características 324 puede incluir un código de barras espacial 308 así como también una o más secuencias funcionales 306 y 310, como se describe en otra parte en la presente descripción. La sonda de captura también puede incluir un dominio de captura 312 que es capaz de unirse a un agente de captura de analito 326. El agente de captura de analito 326 puede incluir una secuencia funcional 318, dominio de código de barras del agente de captura 316, y una secuencia de captura de analito 314 que es capaz de unirse al dominio de captura 312 de la sonda de captura 324. El agente de captura de analito también puede incluir un enlazador 320 que permite el dominio de código de barras del agente de captura 316 para acoplarse a la porción de unión al analito 322.
Existen al menos dos métodos para asociar un código de barras espacial con una o más células vecinas, de manera que el código de barras espacial identifique la una o más células, y/o el contenido de la una o más células, como asociado con una localización espacial particular. Un método es promover analitos o sustitutos de analitos (por ejemplo, agentes intermedios) fuera de una célula y hacia una matriz con código de barras espacial (por ejemplo, incluidas sondas de captura con código de barras espaciales). Otro método consiste en escindir sondas de captura con códigos de barras espaciales de una matriz y promover las sondas de captura con códigos de barras espaciales hacia y/o dentro o sobre la muestra biológica.
En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para cebar, replicar y, en consecuencia, producir productos de extensión opcionalmente con códigos de barra a partir de una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio (por ejemplo, un producto de ligazón o un agente de captura de analito), o una porción del mismo), o derivados de los mismos (ver, por ejemplo, la Sección (II)(b)(vii) del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663 con respecto a sondas de captura extendidas). En algunos casos, las sondas de captura pueden configurarse para formar productos de ligazón con una plantilla (por ejemplo, una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio, o una porción del mismo), para crear de esta manera productos de ligazón que sirven como sustitutos de una plantilla.
Como se usa en la presente, una “sonda de captura extendida” se refiere a una sonda de captura que tiene nucleótidos adicionales añadidos al extremo (por ejemplo, extremo 3' o 5') de la sonda de captura, para extender de esta manera la longitud total de la sonda de captura. Por ejemplo, un “extremo 3' extendido” indica que se añadieron nucleótidos adicionales al nucleótido más cerca de 3' de la sonda de captura para extender la longitud de la sonda de captura, por ejemplo, mediante reacciones de polimerización usadas para extender moléculas de ácido nucleico, incluida la polimerización con plantilla catalizada por una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa o una transcriptasa inversa). En algunas modalidades, extender la sonda de captura incluye añadir a un extremo 3' de una sonda de captura una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de un analito o agente intermedio unido específicamente al dominio de captura de la sonda de captura. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de transcripción inversa. En algunas modalidades, la sonda de captura se extiende mediante el uso de una o más ADN polimerasas. Las sondas de captura extendidas incluyen la secuencia de la sonda de captura y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura.
En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas se amplifican (por ejemplo, en solución a granel o en la matriz) para producir cantidades que son suficientes para el análisis aguas abajo, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. En algunas modalidades, las sondas de captura extendidas (por ejemplo, moléculas de ADN) actúan como plantillas para una reacción de amplificación (por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa).
Variantes adicionales de métodos de análisis espacial, que incluyen, en algunas modalidades, una etapa de obtención de imágenes, se describen en la Sección (II)(a) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Análisis de analitos capturados (y/o agentes intermedios o porciones de los mismos), por ejemplo, incluyendo extracción de muestras, extensión de sondas de captura, secuenciación (por ejemplo, de una sonda de captura extendida escindida y/o una molécula de ADNc complementaria a una sonda de captura extendida), la secuenciación en la matriz (por ejemplo, mediante el uso de, por ejemplo, enfoques de hibridación in situ o ligazón in situ), análisis temporal y/o captura de proximidad, se describe en la Sección (II)(g) del documento WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Algunas mediciones de control de calidad se describen en la Sección (II)(h) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica y/o médica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: la identificación de uno o más biomarcadores (por ejemplo, de diagnóstico, pronóstico y/o para la determinación de la eficacia de un tratamiento) de una enfermedad o trastorno; identificación de un candidato a objetivo farmacológica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno; identificación (por ejemplo, diagnóstico) de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno; identificación de la etapa y/o pronóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de un sujeto que tiene una mayor posibilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno; seguimiento de la progresión de una enfermedad o trastorno en un sujeto; determinación de la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto; identificación de una subpoblación de pacientes para la cual un tratamiento es efectivo para una enfermedad o trastorno; modificación de un tratamiento de un sujeto con una enfermedad o trastorno; selección de un sujeto para la participación en un ensayo clínico; y/o selección de un tratamiento para un sujeto con una enfermedad o trastorno. Los métodos ilustrativos para identificar información espacial de importancia biológica y/o médica se pueden encontrar en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2021/0140982A1, la solicitud de patente de Estados Unidos núm.
2021/0198741A1 y/o la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2021/0199660.
La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden permitir: identificación de perfiles de expresión del transcriptoma y/o proteoma (por ejemplo, en tejido sano y/o enfermo); identificación de múltiples tipos de analitos muy cercanos (por ejemplo, análisis del vecino más cercano); determinación de genes y/o proteínas regulados positivamente y/o negativamente en tejido enfermo; caracterización de microambientes tumorales; caracterización de respuestas inmunitarias tumorales; caracterización de tipos celulares y su colocalización en tejido; e identificación de variantes genéticas dentro de los tejidos (por ejemplo, basadas en los perfiles de expresión de genes y/o proteínas asociados con biomarcadores de enfermedades o trastornos específicos).
Típicamente, para los métodos basados en matrices espaciales, un sustrato funciona como un soporte para la unión directa o indirecta de sondas de captura a elementos de la matriz. Un “elemento” es una entidad que actúa como soporte o repositorio para varias entidades moleculares usadas en el análisis espacial. En algunas modalidades, algunos o todos los elementos de una matriz están funcionalizadas para la captura del analito. Se describen sustratos ilustrativos en la Sección (II)(c) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Pueden encontrarse características y atributos geométricos ilustrativos de una matriz en las Secciones (II)(d)(i), (N)(d)(iii) y (II)(d)(iv) del documento WO 2020/176788 y/ o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
Generalmente, los analitos y/o agentes intermedios (o porciones de los mismos) pueden capturarse cuando se pone en contacto una muestra biológica con un sustrato que incluye sondas de captura (por ejemplo, un sustrato con sondas de captura incrustadas, manchadas, impresas, fabricadas sobre el sustrato, o un sustrato con elementos (por ejemplo, perlas, pocillos) que comprende sondas de captura). Como se usa en la presente descripción, “contactar”, “contactado” y/o “que entra en contacto”, una muestra biológica con un sustrato se refiere a cualquier contacto (por ejemplo, directo o indirecto) de manera que las sondas de captura pueden interactuar (por ejemplo, unirse covalente o no covalentemente (por ejemplo, hibridar)) con analitos de la muestra biológica. La captura puede lograrse activamente (por ejemplo, mediante el uso de electroforesis) o pasivamente (por ejemplo, mediante el uso de difusión). La captura de analitos se describe con más detalle en la Sección (M)(e) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm 2020/0277663.
En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la unión y/o introducción de una molécula (por ejemplo, un péptido, un lípido o una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (por ejemplo, un código de barras espacial) a una muestra biológica (por ejemplo, a una célula en una muestra biológica). En algunas modalidades, una pluralidad de moléculas (por ejemplo, una pluralidad de moléculas de ácido nucleico) que tienen una pluralidad de códigos de barras (por ejemplo, una pluralidad de códigos de barras espaciales) se introducen en una muestra biológica (por ejemplo, en una pluralidad de células en una muestra biológica) para usar en análisis espacial. En algunas modalidades, después de unir y/o introducir una molécula que tiene un código de barras a una muestra biológica, la muestra biológica puede separarse físicamente (por ejemplo, disociarse) en células individuales o grupos de células para su análisis. Algunos de estos métodos de análisis espacial se describen en la Sección (III) del documento WO 2020/176788 y/o en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663.
En algunos casos, el análisis espacial puede realizarse mediante la detección de múltiples oligonucleótidos que se hibridan con un analito. En algunos casos, por ejemplo, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de ligazón con plantilla de ARN (RTL). Los métodos de RTL se han descrito anteriormente. Ver, por ejemplo, Credle y otros, Nucleic Acids Res. 21 de agosto de 2017; 45(14):e128. Típicamente, RTL incluye la hibridación de dos oligonucleótidos con secuencias adyacentes en un analito (por ejemplo, una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm). En algunos casos, los oligonucleótidos son moléculas de ADN. En algunos casos, uno de los oligonucleótidos incluye al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3' y/o el otro oligonucleótido incluye un nucleótido fosforilado en el extremo 5'. En algunos casos, uno de los dos oligonucleótidos incluye un dominio de captura (por ejemplo, una secuencia poli(A), una secuencia no homopolimérica). Después de la hibridación con el analito, una ligasa (por ejemplo, la ligasa SplintR) liga los dos oligonucleótidos juntos, creando un producto de ligazón. En algunos casos, los dos oligonucleótidos se hibridan con secuencias que no son adyacentes entre sí. Por ejemplo, la hibridación de los dos oligonucleótidos crea un espacio entre los oligonucleótidos hibridados. En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, una ADN polimerasa) puede extender uno de los oligonucleótidos antes de la ligazón. Después de la ligazón, el producto de ligazón se libera del analito. En algunos casos, el producto de ligazón se libera mediante el uso de una endonucleasa (por ejemplo, ARNasa H). El producto de ligazón liberado puede capturarse a continuación mediante sondas de captura (por ejemplo, en lugar de la captura directa de un analito) en una matriz, opcionalmente amplificarse y secuenciarse, para determinar de este modo la localización y opcionalmente la abundancia del analito en la muestra biológica.
Durante el análisis de información espacial, se obtiene información de secuencia para un código de barras espacial asociado con un analito, y la información de secuencia puede usarse para proporcionar información sobre la distribución espacial del analito en la muestra biológica. Pueden usarse varios métodos para obtener la información espacial. En algunas modalidades, sondas de captura específicas y los analitos que capturan están asociados con ubicaciones específicas en una matriz de elementos en un sustrato. Por ejemplo, pueden asociarse códigos de barras espaciales específicos con ubicaciones de matriz específicas antes de la fabricación de la matriz, y las secuencias de los códigos de barras espaciales pueden almacenarse (por ejemplo, en una base de datos) junto con información de localización de matriz específica, de modo que cada código de barras espacial se asigne de forma única a una localización particular de la matriz.
Alternativamente, pueden depositarse códigos de barras espaciales específicos en ubicaciones predeterminadas en una matriz de elementos durante la fabricación, de manera que en cada localización, solo esté presente un tipo de código de barras espacial, de modo que los códigos de barras espaciales estén asociados de forma única con un único elemento de la matriz. Cuando sea necesario, las matrices pueden decodificarse mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción de modo que los códigos de barras espaciales se asocien de forma única con las ubicaciones de los elementos de la matriz, y este mapeo puede almacenarse como se describió anteriormente.
Cuando se obtiene información de secuencia para sondas y/o analitos de captura durante el análisis de la información espacial, las ubicaciones de las sondas de captura y/o analitos pueden determinarse al hacer referencia a la información almacenada que asocia de forma única cada código de barras espacial con una localización de elementos de la matriz. De esta manera, las sondas de captura específicas y los analitos capturados se asocian con ubicaciones específicas en la matriz de elementos. Cada localización de elemento de matriz representa una posición con relación a un punto de referencia de coordenadas (por ejemplo, una localización de matriz, un marcador fiducial) para la matriz. En consecuencia, cada localización de elemento tiene una “dirección” o localización en el espacio de coordenadas de la matriz.
Algunos flujos de trabajo ilustrativos de análisis espacial se describen en la sección modalidades ilustrativas del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Ver, por ejemplo, la modalidad ilustrativa que comienza con “En algunos ejemplos no limitantes de los flujos de trabajo descritos en la presente descripción, la muestra puede sumergirse...” del documento WO 2020/176788 y/o la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663. Ver también, por ejemplo, la Guía del usuario de los kits de reactivos de expresión genética espacial de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de junio de 2020) y/o la Guía del usuario de los kits de reactivos de optimización de tejidos espaciales de Visium (por ejemplo, Rev C, con fecha de julio de 2020).
En algunas modalidades, el análisis espacial puede realizarse mediante el uso de hardware y/o software dedicado, tal como cualquiera de los sistemas descritos en las Secciones (M)(e)(ii) y/o (V) de los documentos WO 2020/176788 y/o publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2020/0277663, o cualquiera de uno o más de los dispositivos o métodos descritos en las secciones Control Slide for Imaging, Methods of Using Control Slides and Substrates for Systems of Using Control Slides and Substrates for Imaging, y/o Sample and Array Alignment Devices and Methods, Informational labels del documento WO 2020/123320.
Los sistemas adecuados para realizar análisis espacial pueden incluir componentes tales como una cámara (por ejemplo, una celda de flujo o una cámara que pueda sellarse, hermética) para contener una muestra biológica. La muestra biológica puede montarse, por ejemplo, en un soporte para muestras biológicas. Pueden conectarse una o más cámaras de fluido a la cámara y/o al soporte para muestras a través de conductos de fluido, y los fluidos pueden suministrarse a la cámara y/o al soporte para muestras a través de bombas fluídicas, fuentes de vacío u otros dispositivos acoplados a los conductos de fluido que crean un gradiente de presión para impulsar el flujo de fluido. También puede conectarse una o más válvulas a conductos de fluido para regular el flujo de reactivos desde los depósitos hasta la cámara y/o el soporte para muestras.
Los sistemas pueden incluir opcionalmente una unidad de control que incluye uno o más procesadores electrónicos, una interfaz de entrada, una interfaz de salida (tal como una pantalla) y una unidad de almacenamiento (por ejemplo, un medio de almacenamiento de estado sólido tal como, pero sin limitarse a, un medio de almacenamiento magnético, óptico u otro de estado sólido, persistente, grabable y/o regrabable). Opcionalmente, la unidad de control puede conectarse a uno o más dispositivos remotos a través de una red. La unidad de control (y componentes de la misma) generalmente puede realizar cualquiera de las etapas y funciones descritas en la presente descripción. Cuando el sistema está conectado a un dispositivo remoto, el dispositivo (o dispositivos) remotos puede realizar cualquiera de las etapas o características descritas en la presente descripción. Los sistemas pueden incluir opcionalmente uno o más detectores (por ejemplo, CCD, CMOS) usados para capturar imágenes. Los sistemas también pueden incluir opcionalmente una o más fuentes de luz (por ejemplo, basadas en LED, basadas en diodos, láseres) para iluminar una muestra, un sustrato con elementos, analitos de una muestra biológica capturada en un sustrato y diversos medios de control y calibración.
Los sistemas pueden incluir opcionalmente instrucciones de software codificadas y/o implementadas en uno o más medios de almacenamiento tangibles y componentes de hardware tales como circuitos integrados de aplicaciones específicas. Las instrucciones de software, cuando son ejecutadas por una unidad de control (y en particular, un procesador electrónico) o un circuito integrado, pueden hacer que la unidad de control, circuito integrado u otro componente que ejecuta las instrucciones de software realice cualquiera de las etapas o funciones del método descritos en la presente descripción.
En algunos casos, los sistemas descritos en la presente descripción pueden detectar (por ejemplo, registrar una imagen) la muestra biológica en la matriz. Los métodos ilustrativos para detectar la muestra biológica en una matriz se describen en el documento WO 2021/102003 y/o la solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2021/0150707 A1.
Antes de transferir analitos desde la muestra biológica hasta la matriz de elementos en el sustrato, la muestra biológica puede alinearse con la matriz. La alineación de una muestra biológica y una matriz de elementos que incluyen sondas de captura pueden facilitar el análisis espacial, que puede usarse para detectar diferencias en la presencia y/o nivel de analito dentro de diferentes posiciones en la muestra biológica, por ejemplo, para generar un mapa tridimensional de la presencia y/o nivel del analito. Los métodos ilustrativos para generar un mapa bidimensional y/o tridimensional de la presencia y/o nivel del analito se describen en la solicitud PCT núm. 2020/053655 y los métodos de análisis espacial se describen generalmente en el documento WO 2021/102039 y/o la solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2021/0155982 A1.
En algunos casos, un mapa de presencia y/o nivel de analito puede alinearse con una imagen de una muestra biológica mediante el uso de uno o más marcadores de referencia, por ejemplo, objetos colocados en el campo de visión de un sistema de procesamiento de imágenes que aparecen en la imagen producida, como se describe en el Atributos del sustrato Sección, Control Slide for Imaging Sección del documento W<o>2020/123320, WO 2021/102005 y/o solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2021/0158522 A1. Los marcadores fiduciales pueden usarse como punto de referencia o escala de medición para la alineación (por ejemplo, para alinear una muestra y una matriz, para alinear dos sustratos, para determinar la localización de una muestra o matriz en un sustrato con relación a un marcador fiducial) y/o para mediciones cuantitativas de tamaños y/o distancias.
Análisis en formato múltiple de la expresión génica y proteica
La comprensión tanto de la expresión génica como proteica en sistemas biológicos puede ser útil para obtener información sobre los tejidos normales, en desarrollo y enfermos. Mientras que la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) hace posible obtener mediciones de expresión génica de alta resolución, la técnica requiere que las células se disocien, lo que hace que se pierda información anatómica y organizativa. De manera similar, se conocen numerosas técnicas de detección de proteínas y pueden proporcionar información espacial de proteínas en una muestra biológica, sin embargo, aún se necesitan métodos para detectar simultáneamente los niveles de expresión génica (por ejemplo, ARNm) de la proteína, o incluso todo el transcriptoma.
Por tanto, en la presente descripción se describen enfoques de "multiómicas" que pueden proporcionar un complemento poderoso a las metodologías tradicionales, lo que permite una mayor comprensión de la heterogeneidad y organización celular dentro de las muestras biológicas. La combinación de detección de proteínas mediante el uso de agentes de captura de analitos en una matriz espacial permite el examen simultáneo de proteínas y expresión génica a partir de la misma muestra biológica (por ejemplo, sección de tejido). Por ejemplo, una matriz que comprende las sondas de captura (por ejemplo, cualquiera de las sondas de captura descritas en la presente descripción) se puede poner en contacto con una muestra biológica, una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla y una pluralidad de agentes de captura de analitos que dan como resultado un análisis simultáneo de expresión génica y proteica.
En algunas modalidades, la pluralidad de sondas de ligazón con plantilla incluye un par de sondas para un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ADN, ARN). Las sondas son complementarias a porciones del ácido nucleico objetivo, sin embargo, cuando ambas sondas se hibridan con el ácido nucleico objetivo, existe un espacio entre las dos sondas. En algunas modalidades, el espacio se liga, generando de esta manera un producto de ligazón con plantilla (por ejemplo, un producto de ligazón con plantilla de ADN o ARN). En algunas modalidades, una de las parejas de sondas incluye una secuencia de flanqueo complementaria a un dominio de captura de la matriz. En algunas modalidades, la secuencia complementaria al dominio de captura del producto de ligazón con plantilla se hibrida con el dominio de captura de la sonda de captura.
En algunas modalidades, los agentes de captura de analito, como se describe en la presente descripción, también pueden ponerse en contacto con la muestra biológica. En algunas modalidades, los agentes de captura de analito se ponen en contacto con la muestra biológica antes de que la muestra biológica se ponga en contacto con una matriz. En algunas modalidades, los agentes de captura de analito se ponen en contacto con la muestra biológica después de que la muestra biológica se pone en contacto con la matriz. En algunas modalidades, el resto de unión al analito del agente de captura de analito interactúa (por ejemplo, se une) con un analito (por ejemplo, proteína) en una muestra biológica. En algunas modalidades, el resto de unión al analito es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno.
Los agentes de captura de analitos también pueden incluir un oligonucleótido conjugado que puede comprender uno o más dominios. Por ejemplo, el oligonucleótido conjugado puede incluir un código de barras de la fracción de unión al analito y una secuencia de captura de analito. En algunas modalidades, el código de barras del resto de unión al analito, o un complemento de esta, se refiere a (por ejemplo, identifica) un código de barras que se asocia con o de cualquier otra manera identifica la porción de unión al analito. En algunas modalidades, el oligonucleótido conjugado puede incluir una secuencia de captura de analito. En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito es capaz de interactuar con (por ejemplo, hibridarse) con un dominio de captura de una sonda de captura en un sustrato.
En algunas modalidades, se permite que las sondas de ligazón con plantilla se unan al ácido nucleico objetivo antes de que los agentes de captura de analito se suministren a la muestra biológica. En algunas modalidades, las sondas de ligazón con plantilla se pueden ligar juntas antes, simultáneamente o después de que se suministren los agentes de captura de analito a la muestra biológica. En algunas modalidades, los agentes de captura de analito se suministran a la muestra biológica y se permite que el resto de unión al analito se una al analito objetivo (por ejemplo, proteína) antes de que se suministren las sondas de ligazón con plantilla. En algunas modalidades, los agentes de captura de analitos se suministran a la muestra biológica y la secuencia de captura de analitos se bloquea (por ejemplo, bloqueada por cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción). En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito de los agentes de captura de analito no se bloquea (por ejemplo, no se bloquea por ninguno de los métodos descritos en la presente descripción) antes, simultáneamente, o después de que las sondas de ligazón con plantilla (por ejemplo, las sondas de ligazón con plantilla de ARN) se suministren y/o antes, simultáneamente, o después de que las sondas de ligazón con plantilla se liguen entre sí.
Por lo tanto, en la presente descripción se proporcionan métodos para determinar la localización espacial de un ácido nucleico y una proteína a partir de una muestra biológica que incluye: a) proporcionar una matriz espacial que incluye una primera y segunda pluralidad de sondas de captura donde cada pluralidad incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, b) poner en contacto la matriz espacial con una muestra biológica, c) poner en contacto la muestra biológica con (i) una pluralidad de agentes de captura de analito, donde un agente de captura de analito incluye un resto de unión al analito y un oligonucleótido que incluye un código de barras de un resto de unión al analito y una secuencia de captura de analito, donde la secuencia de captura de analito incluye una secuencia complementaria a una segunda pluralidad de dominios de captura, y (ii) una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla, donde una de las sondas de ligazón con plantilla incluye una secuencia complementaria a una primera pluralidad de dominios de captura, d) unir el resto de unión al analito del agente de captura de analito a una proteína objetivo, e) hibridar las sondas de ligazón con plantilla a un ácido nucleico objetivo y ligar las sondas para producir productos de ligazón, f) hibridar los productos de ligazón a la primera pluralidad de dominios de captura y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos a la segunda pluralidad de dominios de captura en la matriz espacial, y g) determinar la secuencia o una porción de esta de un producto de ligazón capturado, o un complemento de esta, y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el producto de ligazón, y la secuencia del resto de unión al analito de la sonda de captura, o un complemento de esta, del agente de captura de analito unido, para determinar de esta manera la localización espacial de un ácido nucleico y la proteína de la muestra biológica.
También se proporcionan en la presente descripción métodos para determinar la localización espacial de un ácido nucleico y una proteína en una muestra biológica de enfermedad que incluye: a) proporcionar una matriz espacial que incluye una primera y una segunda pluralidad de sondas de captura donde cada pluralidad incluye un código de barras espacial y un dominio de captura, b) poner en contacto la muestra biológica de enfermedad con la matriz espacial, c) poner en contacto la muestra biológica de enfermedad con: (i) una pluralidad de agentes de captura de analito, donde un agente de captura de analito incluye un resto de unión al analito y un oligonucleótido que incluye un código de barras de un resto de unión al analito y una secuencia de captura de analito, donde la secuencia de captura de analito incluye una secuencia complementaria a una segunda pluralidad de dominios de captura, y (ii) una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla, donde una de las sondas de ligazón con plantilla incluye una secuencia complementaria a una primera pluralidad de dominios de captura, d) unir el resto de unión al analito del agente de captura de analito a una proteína objetivo, e) hibridar las sondas de ligazón con plantilla a un ARN objetivo y ligar las sondas para producir productos de ligazón con plantilla, f) hibridar los productos de ligazón con plantilla a la primera pluralidad de dominios de captura y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos a la segunda pluralidad de dominios de captura en la matriz espacial, y g) determinar la secuencia o una porción de esta de un producto de ligazón capturado, o un complemento, y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el producto de ligazón, y la secuencia del resto de unión al analito de la sonda de captura, o un complemento de esta, del agente de captura de analito unido, para determinar de esta manera la localización espacial de un ácido nucleico y la proteína en la muestra biológica de enfermedad.
En algunas modalidades, el ácido nucleico es ARN. En algunas modalidades, el ARN es ARNm. En algunas modalidades, el ácido nucleico es ADN.
En algunas modalidades, la muestra biológica de enfermedad es una muestra biológica cancerosa. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es una muestra biológica de cáncer de ovario o una muestra biológica de cáncer de mama. En algunas modalidades, la muestra de cáncer de mama es cáncer de mama triple positivo. En algunas modalidades, el cáncer de mama es cáncer de mama de células ductales invasivas. En algunas modalidades, el carcinoma ductal invasivo es un carcinoma ductal invasivo de grado II. En algunas modalidades, el carcinoma ductal invasivo es un carcinoma ductal invasivo de grado III. En algunas modalidades, el cáncer de mama es un carcinoma lobular invasivo. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es melanoma. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es cáncer de colon. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es glioblastoma. En algunas modalidades, la muestra biológica cancerosa es cáncer de próstata.
En algunas modalidades, las sondas de captura incluyen identificadores moleculares únicos, secuencias funcionales o sus combinaciones.
En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura son secuencias homopoliméricas. En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura comprende secuencias de poli(T). En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura se definen como secuencias no homopoliméricas. En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura incluye una secuencia redundante. En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura incluye una secuencia fija. Por ejemplo, la primera pluralidad de dominios de captura puede comprender una de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO: 11.
En algunas modalidades, la segunda pluralidad de dominios de captura son secuencias homopoliméricas. En algunas modalidades, la segunda pluralidad de dominios de captura se definen como secuencias no homopoliméricas. En algunas modalidades, la segunda pluralidad de dominios de captura comprende secuencias de poli(T). En algunas modalidades, la segunda pluralidad de dominios de captura incluye una secuencia redundante. En algunas modalidades, la segunda pluralidad de dominios de captura incluye una secuencia fija. Por ejemplo, la segunda pluralidad de dominios de captura puede comprender una de las s Eq ID NO: 1, SEQ iD NO: 2, Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o SEQ ID NO: 11.
En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura y la segunda pluralidad de dominios de captura incluyen la misma secuencia. En algunas modalidades, la primera pluralidad de dominios de captura y la segunda pluralidad de dominios de captura incluyen diferentes secuencias.
Generalmente, los métodos de la presente descripción pueden usarse con cualquier muestra biológica (por ejemplo, cualquier muestra biológica descrita en la presente descripción). En algunas modalidades, la muestra biológica es una sección de tejido. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de tejido. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra biológica recién congelada. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra biológica fijada (por ejemplo, embebida en parafina fijada con formalina (FFPE), paraformaldehído, acetona o metanol). En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra FFPE. En algunas modalidades, la muestra biológica es una sección de tejido FFPE. En algunas modalidades, la muestra de tejido es una muestra de tumor. En alguna modalidad, la sección de tejido es una sección de tejido tumoral. En algunas modalidades, la sección de tejido tumoral es una sección de tejido tumoral fija (por ejemplo, una sección de tejido tumoral fijada en parafina fijada con formalina). En algunas modalidades, la muestra de tumor comprende uno o más tumores cancerosos. Se conocen numerosos tipos de cáncer en la técnica. En algunas modalidades, la muestra de tejido se deriva de una muestra de biopsia. En algunas modalidades, la muestra de tejido se deriva de un embrión de roedor completo. En algunas modalidades, el tejido se selecciona de, pero no se limita a, tejido cerebral, tejido de mama, tejido de colon, tejido de corazón, tejido pulmonar, tejido de bazo, tejido de testículos, tejido de amígdala inflamada, tejido de cuello uterino y tejido de ganglios linfáticos.
En algunas modalidades, una muestra FFPE se desparafina y desreticular antes de suministrar una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla (por ejemplo, sondas de ligazón con plantilla de ARN) y agentes de captura de analitos. En algunas modalidades, una muestra biológica FFPE se desparafina y descruza antes de la etapa (b). Por ejemplo, el material de incrustación en parafina se puede eliminar (por ejemplo, desparafinado) de la muestra biológica (por ejemplo, sección de tejido) al incubar la muestra biológica en un solvente apropiado (por ejemplo, xileno), seguido de una serie de enjuagues (por ejemplo, etanol de diversas concentraciones) y rehidratación en agua. En algunas modalidades, la muestra biológica se puede secar después de la desparafinización. En algunas modalidades, después de la etapa de secar la muestra biológica, la muestra biológica se puede teñir (por ejemplo, tinción H&E, cualquiera de la variedad de tinciones descritas en la presente descripción).
En algunas modalidades, el método incluye teñir la muestra biológica. En algunas modalidades, la tinción incluye el uso de hematoxilina y eosina. En algunas modalidades, una muestra biológica se puede teñir mediante el uso de cualquier número de colorantes biológicos, que incluyen, entre otros, naranja de acridina, marrón de Bismarck, carmín, azul coomassie, violeta de cresilo, DAPI, eosina, etidio bromuro, ácido fucsina, hematoxilina, tinciones de Hoechst, yodo, verde de metilo, azul de metileno, rojo neutro, azul de Nilo, rojo de Nilo, tetróxido de osmio, yoduro de propidio, rodamina o safranina.
La muestra biológica se puede teñir mediante el uso de técnicas de tinción conocidas, que incluyen Can-Grunwald, Giemsa, hematoxilina y eosina (H&E), Jenner, Leishman, tricrómico de Masson, Papanicolaou, Romanowsky, plata, Sudán, Wright y/o técnicas de tinción de ácido periódico de Schiff (PAS). La tinción con PAS se realiza típicamente después de la fijación en formalina o acetona.
En algunas modalidades, la tinción incluye el uso de una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente o una de sus combinaciones.
En algunas modalidades, se obtienen imágenes de la muestra biológica después de teñir la muestra biológica. En algunas modalidades, se obtienen imágenes de la muestra biológica antes de teñir la muestra biológica. En algunas modalidades, la muestra biológica se visualiza o se obtienen imágenes de esta mediante el uso de microscopía de campo claro. En algunas modalidades, la muestra biológica se visualiza o se obtienen imágenes de esta mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Se conocen en la técnica métodos adicionales de visualización y obtención de imágenes. Los ejemplos no limitativos de visualización y obtención de imágenes incluyen microscopía de expansión, microscopía de campo claro, microscopía de campo oscuro, microscopía de contraste de fases, microscopía electrónica, microscopía de fluorescencia, microscopía de reflexión, microscopía de interferencia y microscopía confocal. En algunas modalidades, la muestra se tiñe y se obtienen imágenes de esta antes de añadir el primer y/o segundo cebador a la muestra biológica en la matriz.
Después de que una muestra biológica fijada (por ejemplo, FFPE, PFA, acetona, metanol) se haya desparafinado, la muestra biológica fijada (por ejemplo, FFPE, PFA) se puede procesar adicionalmente. Por ejemplo, las muestras biológicas fijadas (por ejemplo, FFPE, PFA) se pueden tratar para eliminar las reticulaciones (por ejemplo, las reticulaciones inducidas por formaldehído (por ejemplo, la desreticulación)). En algunas modalidades, la desreticulación de las reticulaciones (por ejemplo, reticulaciones inducidas por formaldehído) en la muestra biológica fijada (por ejemplo, FFPE, PFA) puede incluir tratar la muestra con calor. En algunas modalidades, la desreticulación de las reticulaciones inducidas por formaldehído puede incluir realizar una reacción química. En algunas modalidades, la desreticulación de las reticulaciones inducidas por formaldehído, puede incluir tratar la muestra con un reactivo de permeabilización. En algunas modalidades, la desreticulación de las reticulaciones inducidas por formaldehído puede incluir calor, una reacción química y/o reactivos de permeabilización.
En algunas modalidades, la desreticulación de las reticulaciones (por ejemplo, reticulaciones inducidas por formaldehído) se pueden realizar en presencia de un tampón. En algunas modalidades, el tampón es tampón Tris-EDTA (TE) (por ejemplo, tampón TE para muestras biológicas FFPE). En algunas modalidades, el tampón es tampón de citrato (por ejemplo, tampón de citrato para muestras biológicas FFPE). En algunas modalidades, el tampón es tampón Tris-HCl (por ejemplo, tampón Tris-HCl para muestras biológicas fijadas con PFA). En algunas modalidades, el tampón (por ejemplo, tampón TE, tampón Tris-HCl) tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0 y una temperatura de entre aproximadamente 60 °C a aproximadamente 100 °C.
En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza (por ejemplo, se permeabiliza por cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción). En algunas modalidades, la permeabilización es una permeabilización enzimática. En algunas modalidades, la permeabilización es una permeabilización química. En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza antes de suministrar las sondas de ligazón con plantilla de ARN y los agentes de captura de analitos a la muestra biológica. En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza al mismo tiempo que las sondas de ligazón con plantilla de ARN y los agentes de captura de analitos se suministran a la muestra biológica. En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza después de que las sondas de ligazón con plantilla de ARN y los agentes de captura de analitos se suministran a la muestra biológica. En algunas modalidades, la hibridación de los productos de ligazón con plantilla por ARN a los segundos dominios de captura y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos a los primeros dominios de captura comprende además la permeabilización de la muestra biológica.
En algunas modalidades, la muestra biológica se permeabiliza de aproximadamente 30 a aproximadamente 120 minutos, de aproximadamente 40 a aproximadamente 110 minutos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 minutos, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 minutos, o de aproximadamente 70 a 80 minutos. En algunas modalidades, las muestras biológicas se permeabilizan durante aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, o aproximadamente 130 minutos.
En algunas modalidades, el tampón de permeabilización comprende urea. En algunas modalidades, la urea está en una concentración de aproximadamente 0,5 M a 3,0 M. En algunas modalidades, la concentración de la urea es aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, o aproximadamente 3,0 M. En algunas modalidades, el tampón de permeabilización incluye un detergente. En algunas modalidades, el detergente es sarcosilo. En algunas modalidades, el sarcosilo está presente en aproximadamente 2 % a aproximadamente 10 % (v/v). En algunas modalidades, el sarcosilo está presente en aproximadamente 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 % o 9 % (v/v). En algunas modalidades, el tampón de permeabilización comprende polietilenglicol (PEG). En algunas modalidades, el PEG es de aproximadamente PEG 2K a aproximadamente PEG 16K. En algunas modalidades, el PEG es PEG 2K, 3K, 4K, 5K, 6K, 7K, 8K, 9K, 10K, 11K, 12K, 13K, 14K, 15K o 16K. En algunas modalidades, el PEG está presente en una concentración de aproximadamente 2 % a 25 %, de aproximadamente 4 % a aproximadamente 23 %, de aproximadamente 6 % a aproximadamente 21 %, o de aproximadamente 8 % a aproximadamente 20 % (v/v).
En algunas modalidades, el método incluye una etapa de permeabilizar la muestra biológica (por ejemplo, una sección de tejido). Por ejemplo, la muestra biológica puede permeabilizarse para facilitar la transferencia de los productos extendidos a las sondas de captura en la matriz. En algunas modalidades, la permeabilización incluye el uso de un solvente orgánico (por ejemplo, acetona, etanol y metanol), un detergente (por ejemplo, saponina, Triton X-100™, Tween-20™ o dodecil sulfato de sodio (SDS)) y una enzima (una endopeptidasa, una exopeptidasa, una proteasa) o sus combinaciones. En algunas modalidades, la permeabilización incluye el uso de un endopeptidasa, una proteasa, SDS, éter de polietilenglicol terc-octilfenilo, polisorbato 80 y polisorbato 20, solución de sal de N-lauroilsarcosina de sodio, saponina, Tritón X-100™, Tween-20™, o sus combinaciones. En algunas modalidades, la endopeptidasa es pepsina. En algunas modalidades, la endopeptidasa es la proteinasa K. Se describen métodos adicionales para la permeabilización de muestras, por ejemplo, en Jamur y otros, Method Mol. Biol. 588:63-66, 2010.
Los métodos proporcionados en la presente descripción también pueden incluir la tinción de anticuerpos. En alguna modalidad, la tinción de anticuerpos incluye el uso de un tampón de tinción de anticuerpos. En algunas modalidades, el tampón de tinción de anticuerpos (por ejemplo, un tampón a base de PBS) incluye un detergente (por ejemplo, Tween-20, SDS, sarcosilo). En algunas modalidades, el tampón de tinción de anticuerpos incluye un suero, tal como por ejemplo, un suero de cabra. En algunas modalidades, el suero de cabra es de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % (v/v), de aproximadamente 2 % a aproximadamente 9 % (v/v), de aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 % (v/v), o de aproximadamente 4 % a aproximadamente 7 % (v/v). En algunas modalidades, el tampón de tinción de anticuerpos incluye sulfato de dextrano. En algunas modalidades, el sulfato de dextrano está a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, o de aproximadamente 8 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml.
Los métodos proporcionados en la presente descripción también pueden utilizar sondas de bloqueo para bloquear la unión no específica (por ejemplo, hibridación) de la secuencia de captura de analito y el dominio de captura de una sonda de captura en una matriz. En algunas modalidades, después del contacto entre la muestra biológica y la matriz, la muestra biológica entra en contacto con una pluralidad de agentes de captura de analitos, donde un agente de captura de analito incluye una secuencia de captura de analito que se bloquea de manera reversible con una sonda de bloqueo. En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito se bloquea de manera reversible con más de una sonda de bloqueo (por ejemplo, 2, 3, 4 o más sondas de bloqueo). En algunas modalidades, el agente de captura de analito se bloquea antes de que se una el analito objetivo (por ejemplo, una proteína objetivo).
En algunas modalidades, el oligonucleótido del agente de captura de analito (por ejemplo, la secuencia de captura de analito) se bloquea mediante una sonda de bloqueo. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se hibridan con la secuencia de captura de analito de los agentes de captura de analito antes de introducir los agentes de captura de analito en una muestra biológica. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se hibridan a la secuencia de captura de analito de los agentes de captura de analito después de introducir los agentes de captura de analito en la muestra biológica. En tales modalidades, el dominio de captura también puede bloquearse para evitar la unión no específica y/o para controlar el tiempo de unión, entre la secuencia de captura de analito y el dominio de captura. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se pueden introducir de forma alternativa o adicional durante la tinción de la muestra biológica. En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito se bloquea antes de unirse al dominio de captura, donde la sonda de bloqueo incluye una secuencia complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia de captura de analito.
En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito se bloquea con una sonda de bloqueo. En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito se bloquea con dos sondas de bloqueo. En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito se bloquea con más de dos sondas de bloqueo (por ejemplo, 3, 4, 5 o más sondas de bloqueo). En algunas modalidades, se usa una sonda de bloqueo para bloquear el extremo 3' libre de la secuencia de captura de analito. En algunas modalidades, se usa una sonda de bloqueo para bloquear el extremo 5' de la secuencia de captura de analito. En algunas modalidades, se usan dos sondas de bloqueo para bloquear ambos extremos 5' y 3' de la secuencia de captura de analito. En algunas modalidades, tanto la secuencia de captura de analito como el dominio de la sonda de captura se bloquean.
En algunas modalidades, las sondas de bloqueo pueden diferir en longitud y/o complejidad. En algunas modalidades, la sonda de bloqueo puede incluir una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 nucleótidos de longitud (por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 22, de aproximadamente 8 a aproximadamente 20, de aproximadamente 8 a aproximadamente 18, de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 24, de aproximadamente 10 a aproximadamente 22, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20, de aproximadamente 10 a aproximadamente 18, de aproximadamente 10 a aproximadamente 16, de aproximadamente 10 a aproximadamente 14, de aproximadamente 10 a aproximadamente 12, de aproximadamente 12 a aproximadamente 24, de aproximadamente 12 a aproximadamente 22, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20, de aproximadamente 12 a aproximadamente 18, de aproximadamente 12 a aproximadamente 16, de aproximadamente 12 a aproximadamente 14, de aproximadamente 14 a aproximadamente 24, de aproximadamente 14 a aproximadamente 22, de aproximadamente 14 a aproximadamente 20, de aproximadamente 14 a aproximadamente 18, de aproximadamente 14 a aproximadamente 16, de aproximadamente 16 a aproximadamente 24, de aproximadamente 16 a aproximadamente 22, de aproximadamente 16 a aproximadamente 20, de aproximadamente 16 a aproximadamente 18, de aproximadamente 18 a aproximadamente 24, de aproximadamente 18 a aproximadamente 22, de aproximadamente 18 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 24, de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 o de aproximadamente 22 a aproximadamente 24 nucleótidos de longitud).
En algunas modalidades, la sonda de bloqueo se elimina antes de hibridar la secuencia de captura de analito del oligonucleótido de la secuencia de captura de analito con el primer dominio de captura. Por ejemplo, una vez que la sonda de bloqueo se libera de la secuencia de captura de analito, la secuencia de captura de analito puede unirse al primer dominio de captura en la matriz. En algunas modalidades, la secuencia de captura de analito de bloqueo reduce la tinción de fondo no específica. En algunas modalidades, bloquear la secuencia de captura de analito permite controlar cuándo permitir la unión de la secuencia de captura de analito al dominio de captura de una sonda de captura durante un flujo de trabajo espacial, controlando así el tiempo de captura de la secuencia de captura de analito en la matriz. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se unen de manera reversible, de manera que las sondas de bloqueo se pueden eliminar de la secuencia de captura de analito durante o después del tiempo en que los agentes de captura de analito están en contacto con la muestra biológica. En algunas modalidades, la sonda de bloqueo se puede eliminar con el tratamiento con ARNasa (por ejemplo, el tratamiento con ARNasa H). En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se eliminan al aumentar la temperatura (por ejemplo, calentando) la muestra biológica. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se eliminan enzimáticamente (por ejemplo, escindidas). En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se eliminan por una enzima USUARIO. En algunas modalidades, las sondas de bloqueo se eliminan por una endonucleasa. En algunas modalidades, la endonucleasa es endonucleasa IV. En algunas modalidades, la endonucleasa es endonucleasa V.
En algunas modalidades, la determinación en la etapa (g) incluye a) extender los productos de ligazón capturados y los oligonucleótidos capturados de los agentes de captura de analito, en donde los productos de extensión comprenden el código de barras espacial o un complemento de este, b) liberar los productos de extensión, o los complementos de estos, de la matriz espacial, c) producir una biblioteca a partir de los productos de extensión liberados o los complementos de estos, y d) secuenciar la biblioteca. En algunas modalidades, la extensión (por ejemplo, la extensión de los productos de ligazón de ácido nucleico que se capturan y los oligonucleótidos que se capturan de los agentes de captura de analito y/o la extensión de la pluralidad de sondas de captura) se realiza con una polimerasa (por ejemplo, cualquier polimerasa adecuada, por ejemplo, la polimerasa T4).
En algunas modalidades, los productos de extensión liberados se pueden preparar para aplicaciones posteriores, tales como la generación de una biblioteca de secuenciación y la secuenciación de próxima generación. La producción de bibliotecas de secuenciación se conoce en la técnica. Por ejemplo, los productos de extensión liberados se pueden purificar y recolectar para las etapas de amplificación corriente abajo. Los productos de extensión liberados pueden amplificarse mediante el uso de PCR, donde los sitios de unión de cebadores flanquean el código de barras espacial y el producto de ligazón o el código de barras de la fracción de unión al analito, o los complementos de estos, generando una biblioteca asociada con un código de barras espacial particular. En algunas modalidades, la preparación de la biblioteca puede cuantificarse y/o controlarse con calidad para verificar el éxito de las etapas de preparación de la biblioteca. Los amplicones de la biblioteca se secuencian y analizan para decodificar la información espacial y el código de barras del producto de ligazón o del resto de la fracción de unión al analito, o complementos de estos.
Alternativa o adicionalmente, los amplicones pueden fragmentarse enzimáticamente y/o seleccionarse por tamaño para proporcionar el tamaño de amplicón deseado. En algunas modalidades, cuando se utiliza una metodología de preparación de la biblioteca de Illumina®, por ejemplo, P5 y P7, se pueden agregar secuencias a los amplicones lo que permite de esta manera la captura de la preparación de la biblioteca en una célula de flujo de secuenciación (por ejemplo, en instrumentos de secuenciación de Illumina). Adicionalmente, se pueden agregar secuencias de i7 e i5 como índices de muestra si se van a agrupar y secuenciar juntas varias bibliotecas. Además, las secuencias de lectura 1 y lectura 2 se pueden añadir a la preparación de la biblioteca para propósitos de secuenciación. Las secuencias antes mencionadas pueden añadirse a una muestra de preparación de la biblioteca, por ejemplo, a través de reparación de extremos, adición de cola de poliA, ligazón de adaptador y/o PCR. Los fragmentos de ADNc pueden entonces secuenciarse mediante el uso, por ejemplo, de la secuenciación de extremos emparejados mediante el uso de TruSeq Lectura 1 y TruSeq Lectura 2 como sitios de cebador de secuenciación, aunque se conocen otros métodos en la técnica.
En algunas modalidades, la determinación en la etapa (g) puede incluir una etapa de preamplificación. Por ejemplo, una hebra complementaria a los productos de ligazón de ARN extendido y/o el producto de extensión de los oligonucleótidos capturados de los agentes de captura de analito la etapa puede generarse y además incluir una etapa de preamplificación de los productos de extensión o complementos de estos (por ejemplo, productos extendidos) antes de la producción de la biblioteca (por ejemplo, producción de la biblioteca r TL; oligonucleótido capturado de la producción del agente de captura de analito).
Composiciones

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i .Un método para determinar la localización espacial de un ácido nucleico y una proteína en una muestra biológica que comprende:
    a) proporcionar una matriz espacial que comprende una primera y segunda pluralidad de sondas de captura, en donde cada una de la primera y segunda pluralidad de sondas de captura comprende un código de barras espacial y un dominio de captura,
    b) poner en contacto la matriz espacial con la muestra biológica,
    c) poner en contacto la muestra biológica con
    (i) una pluralidad de agentes de captura de analito, en donde un agente de captura de analito de la pluralidad de agentes de captura de analito comprende un resto de unión a proteína y un oligonucleótido que comprende un código de barras de resto de unión a proteína y una secuencia de captura de analito, en donde la secuencia de captura de analito comprende una secuencia complementaria al dominio de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura, y
    (ii) una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla, en donde una de las sondas de ligazón con plantilla comprende una secuencia complementaria al dominio de captura de la primera pluralidad de sondas de captura,
    d) unir el resto de unión a proteína del agente de captura de analito a una proteína objetivo,
    e) hibridar la pluralidad de sondas de ligazón con plantilla a un ácido nucleico objetivo y ligar las sondas de ligazón con plantilla hibridadas para producir un producto de ligazón con plantilla,
    f) hibridar: (i) el producto de ligazón con plantilla al dominio de captura de la primera pluralidad de sondas de captura y (ii) la secuencia de captura de analito del agente de captura de analito unido al dominio de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura en la matriz espacial, y
    g) determinar: (i) la secuencia o una porción de esta del producto de ligazón con plantilla capturado, o un complemento de esta, y la secuencia del código de barras espacial de la primera pluralidad de sondas de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el producto de ligazón con plantilla, y (ii) la secuencia del código de barras del resto de unión a proteína, o un complemento de esta, del agente de captura de analito unido, y la secuencia del código de barras espacial de la segunda pluralidad de sondas de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el agente de captura de analito, para determinar de esta manera la localización espacial del ácido nucleico y la proteína en la muestra biológica.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde los dominios de captura de la primera pluralidad de sondas de captura son secuencias de captura no homopoliméricas o secuencias homopoliméricas definidas, opcionalmente en donde los dominios de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura son secuencias de captura homopoliméricas o secuencias no homopoliméricas definidas, en donde opcionalmente los dominios de captura de la primera pluralidad de sondas de captura son diferentes de los dominios de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura.
  3. 3. El método de la reivindicación 2, en donde las secuencias homopoliméricas comprenden secuencias de poliT y las secuencias no homopoliméricas comprenden secuencias fijas o secuencias redundantes, preferentemente en donde las secuencias fijas comprenden al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11.
  4. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el ácido nucleico es un ARN o ADN, preferentemente en donde el ARN es un ARNm.
  5. 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la muestra biológica es una muestra de tejido, preferentemente en donde la muestra de tejido es una muestra de tejido recién congelada o una muestra de tejido fijada, en donde la muestra de tejido fijada es una muestra de tejido fijada con formaldehído, una muestra de tejido fijada con acetona, una muestra de tejido con paraformaldehído o una muestra de tejido fijada con metanol.
  6. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la muestra biológica es una sección de tejido, en donde la sección de tejido es una sección de tejido recién congelada o una sección de tejido fijada, y opcionalmente, en donde la sección de tejido fijada es una sección de tejido embebida en parafina fijada con formalina, una sección de tejido fijada con acetona, una sección de tejido con paraformaldehído o una sección de tejido fijada con metanol.
  7. 7. El método de la reivindicación 5, en donde la muestra de tejido se deriva de una muestra de biopsia o un embrión de roedor completo.
  8. 8.El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde antes de (b) la muestra biológica se desparafina y desreticula, preferentemente en donde la desreticulación comprende el uso de un tampón, opcionalmente en donde:
    (i) el tampón comprende tampón Tris-EDTA a un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 y una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 80 °C; o
    (ii) el tampón comprende tampón de citrato a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 y una temperatura de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 100 °C.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde la hibridación del producto de ligazón con plantilla y las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos en (f) comprende permeabilizar la muestra biológica.
  10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de captura de analito del oligonucleótido se bloquea antes de la unión a la proteína objetivo, preferentemente en donde la secuencia de captura de analito se bloquea mediante una sonda de bloqueo, preferentemente en donde la sonda de bloqueo se elimina antes de hibridar la secuencia de captura de analito del agente de captura de analito unido al dominio de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura en (f).
  11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación en (g) comprende además:
    a) extender el producto de ligazón con plantilla capturado y el oligonucleótido capturado de los agentes de captura de analito, en donde los productos de extensión comprenden el código de barras espacial de la primera y segunda pluralidad de sondas de captura o un complemento de estas, respectivamente,
    b) liberar los productos de extensión, o complementos de estos, de la matriz espacial,
    c) producir una biblioteca a partir de los productos de extensión liberados o complementos de estos, y d) secuenciar la biblioteca,
    opcionalmente en donde:
    (i) antes de (c) el método comprende además preamplificar los productos de extensión, o complementos de estos; o
    (ii) el complemento del oligonucleótido capturado del agente de captura de analito comprende el código de barras del resto de unión a proteína específico para el resto de unión a proteína del agente de captura de analito.
  12. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde cada una de la primera y segunda pluralidad de sondas de captura comprende además un dominio de escisión, uno o más dominios funcionales, un identificador molecular único y una de sus combinaciones.
  13. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el método comprende además la obtención de imágenes de la muestra biológica, preferentemente en donde la obtención de imágenes comprende uno o más de microscopía de expansión, microscopía de campo claro, microscopía de campo oscuro, microscopía de contraste de fases, microscopía electrónica, microscopía de fluorescencia, microscopía de reflexión, microscopía de interferencia y microscopía confocal.
  14. 14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el método comprende además teñir la muestra biológica, preferentemente en donde:
    (i) la tinción comprende hematoxilina y eosina; o
    (ii) la tinción comprende el uso de un radioisótopo, un fluoróforo, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente o una de sus combinaciones.
  15. 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la matriz espacial comprende una o más series de dilución de proteínas.
  16. 16. Una matriz espacial que comprende:
    a) una pluralidad de sondas de captura que comprenden códigos de barras espaciales y una primera pluralidad de dominios de captura hibridados con una pluralidad de productos de ligazón con plantilla producidos por la ligazón de sondas de ligazón con plantilla, y
    b) una pluralidad de sondas de captura que comprenden códigos de barras espaciales y una segunda pluralidad de dominios de captura hibridados con una pluralidad de oligonucleótidos de los agentes de captura de analito, en donde la pluralidad de oligonucleótidos comprende una secuencia de captura de analito y un código de barras del resto de unión a proteína,
    opcionalmente en donde:
    i) las sondas de captura comprenden además dominios de escisión, identificadores moleculares únicos, una o más secuencias funcionales, o una de sus combinaciones;
    ii) la primera pluralidad de dominios de captura son secuencias homopoliméricas o secuencias no homopoliméricas definidas;
    iii) la segunda pluralidad de dominios de captura son secuencias homopoliméricas o secuencias no homopoliméricas definidas; o
    iv) la primera pluralidad de dominios de captura son secuencias de poli(T);
    opcionalmente en donde la matriz espacial comprende una o más series de dilución de proteínas.
  17. 17. Un método para determinar la localización espacial de un ácido nucleico y una proteína en una muestra biológica de enfermedad que comprende:
    a) proporcionar una matriz espacial que comprende una primera y una segunda pluralidad de sondas de captura en donde cada una de la primera y segunda pluralidad de sondas de captura comprende un código de barras espacial y un dominio de captura,
    b) poner en contacto la muestra biológica de enfermedad con la matriz espacial,
    c) poner en contacto la muestra biológica de enfermedad con:
    (i) una pluralidad de agentes de captura de analito, en donde un agente de captura de analito de la pluralidad de agentes de captura de analito comprende un resto de unión a proteína y un oligonucleótido que comprende un código de barras de resto de unión a proteína y una secuencia de captura de analito, en donde la secuencia de captura de analito comprende una secuencia complementaria al dominio de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura, y
    (ii) una pluralidad de sondas de ligazón con plantilla, en donde una de las sondas de ligazón con plantilla comprende una secuencia complementaria al dominio de captura de la primera pluralidad de sondas de captura,
    d) unir el resto de unión a proteína del agente de captura de analito a una proteína objetivo,
    e) hibridar la pluralidad de sondas de ligazón con plantilla a un ácido nucleico objetivo y ligar las sondas de ligazón con plantilla hibridadas para producir un producto de ligazón con plantilla,
    f) hibridar: (i) el producto de ligazón con plantilla al dominio de captura de la primera pluralidad de sondas de captura y (ii) las secuencias de captura de analito de los agentes de captura de analito unidos al dominio de captura de la segunda pluralidad de sondas de captura en la matriz espacial, y
    g) determinar: (i) la secuencia o una porción de esta del producto de ligazón con plantilla capturado, o un complemento de esta, y la secuencia del código de barras espacial de la primera pluralidad de sondas de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el producto de ligazón con plantilla, y (ii) la secuencia del código de barras del resto de unión a proteína, o un complemento de esta, del agente de captura de analito unido, y la secuencia del código de barras espacial de la segunda pluralidad de las sondas de captura, o un complemento de esta, que se asocia con el agente de captura de analito unido, para determinar de esta manera la localización espacial del ácido nucleico y la proteína en la muestra biológica de enfermedad,
    opcionalmente en donde la muestra biológica de enfermedad es una muestra biológica cancerosa, preferentemente en donde la muestra biológica cancerosa es una muestra biológica de cáncer de ovario, una muestra biológica de cáncer de mama, una muestra biológica de cáncer de pulmón o un melanoma, preferentemente en donde la muestra biológica de cáncer de mama es una muestra de cáncer de mama triple positivo o un carcinoma ductal invasivo.
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