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CN116685697A - 使用寡核苷酸微阵列进行空间核酸检测 - Google Patents

使用寡核苷酸微阵列进行空间核酸检测 Download PDF

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CN116685697A
CN116685697A CN202280009379.5A CN202280009379A CN116685697A CN 116685697 A CN116685697 A CN 116685697A CN 202280009379 A CN202280009379 A CN 202280009379A CN 116685697 A CN116685697 A CN 116685697A
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CN
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array
sequence
tissue
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Application number
CN202280009379.5A
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R·A·艾奇
N·M·桑帕斯
B·J·皮特
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Agilent Technologies Inc
Original Assignee
Agilent Technologies Inc
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Publication date
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Abstract

本公开文本总体上涉及检测核酸。具体地，本文公开了用于原位确定RNA和其他分子的序列(或身份)和位置的方法和组合物。本发明总体上涉及一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。

Description

使用寡核苷酸微阵列进行空间核酸检测
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月8日提交的美国临时申请号63/135,254的优先权，将所述临时申请的全部公开内容通过引用特此并入。
ASCII文本文件序列表的提交
本申请包含通过EFS-Web提交的序列表，将所述序列表通过引用以其整体特此并入。ASCII文本副本创建于，名为.txt并且大小是字节。
技术领域
本公开文本总体上涉及检测核酸。具体地，本公开文本涉及用于原位确定RNA和其他分子的序列(或身份)和位置的方法和组合物。例如，公开了一种用于检测核酸的方法，所述方法包括提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。
背景技术
目前大多数用于分析基因表达模式的技术要么一次仅提供一个或少量基因的空间转录信息，如RNA荧光原位杂交(RNA FISH)，要么以丢失位置信息为代价提供样品中的许多或所有基因的转录信息(如RNA测序或基因表达的阵列分析)。
空间RNA测序(也称为空间转录组学)是最近开发的技术，其用于在空间上解析RNA序列数据，从而从单独组织切片中的RNA获得局部基因表达数据。用于空间转录组学的方法最初由Stahl、Lundeberg及同事开发(Science 353,第6294期(2016):78-82和美国专利申请号2014/0066318A1)。空间RNA测序的其他变体已经描述于美国专利号9371598B2和美国专利申请号2018/0245142A1。此外，现在商业上提供了一种空间RNA测序形式(NatureProtocols 13,(2018):2501–2534)。在这种方法中，将空间条形码化逆转录寡核苷酸(dT)引物以有序的方式以其5’端附接至显微镜载玻片表面。然后将组织冷冻切片封固在该显微镜载玻片顶部，然后将组织透性化处理以引起RNA的释放，使得条形码化引物可以与来自组织的mRNA结合。然后条形码化引物用于启动所结合的mRNA的逆转录，所得的cDNA因而掺入了引物的空间条形码。然后从所得的cDNA制备测序文库，并通过DNA测序对其进行分析。存在于每个生成的序列中的空间条形码允许将每个单独的mRNA转录物的数据映射回其在阵列上的起点，从而映射在组织切片内。该技术和上述专利申请中描述的其他方法的主要缺点是，这些方法不能用于福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织，因为这些组织中的RNA与组织交联，因此不能通过透性化处理而释放。此外，FFPE组织切片通常已经封固在载玻片上，因此不能作为完整的组织切片封固至阵列载玻片上。
一般而言，大多数先前描述的方法具有共同的局限性：它们需要核酸从组织扩散至固体支持物，和/或它们需要在固体支持物上发生显著的生化步骤。这些策略的明显缺点是，核酸通过组织的扩散可能是不均匀的并且难以测量，使得组织的真实含量难以评估。另外，虽然清楚地知道生物化学过程(如引物延伸)可以在固体支持物上发生，但试剂的扩散和混合可能受到限制，从而导致较低的反应效率。此外，固体支持物结合的元件的浓度可能低于最佳值。最后，先前用于空间RNA测序的方法通常依赖于单个序列来启动cDNA合成，例如，依赖于寡核苷酸-dT引物启动多腺苷酸化RNA的cDNA合成。然而，这将可以测量的RNA限制为仅具有聚A尾的那些，这排除了许多类别的RNA和一些信使RNA，并且不能仅对目的RNA的子集进行特定测量。因此，仍然需要用于在组织切片中的空间信息的背景下分析基因表达信息的更好方法。
因此，需要允许确定样品中许多或所有基因的转录信息以及确定这些转录物的位置信息的组合物和方法。
发明内容
本发明总体上涉及一种用于检测核酸的方法，所述方法包括提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。
附图说明
当考虑以下的具体实施方式时，本公开文本将被更好地理解，并且除了上述那些之外的方面和优点将变得清楚。这样的具体实施方式参考了以下附图，其中：
图1A是示出在示例性方面中的第一步骤的示意图，其中多个寡核苷酸探针用可切割接头附接至阵列表面。图1B示出了相关方面，其中多个第一寡核苷酸与可被释放的多个寡核苷酸探针的位置条形码杂交。在这两种情况下，每个阵列特征(即，阵列上的“位置”或位于阵列上相同位置的寡核苷酸组)包含位置条形码(显示为有图案的区段)，其与阵列上其他位置处的位置条形码不同。
图2是示出检测组织样品中的核酸的方法的概述的示意图。所述方法可以包括：从阵列表面释放寡核苷酸探针，使得它们保持在各自的位置；施加组织载玻片，使得组织与阵列表面上释放的寡核苷酸探针接触；以及使释放的寡核苷酸探针扩散至组织中。所述方法包括在施加组织载玻片之前在组织切片中原位合成第一链cDNA。
图3是示出在示例性方面中的步骤的示意图，其中第一链cDNA是使用模板转换寡核苷酸(TSO)原位制备的，接着使用来自释放的寡核苷酸阵列的空间条形码化寡核苷酸引发第二链cDNA合成。
图4是示出根据本发明的另一个方面的含有寡核苷酸(dT)引物区的寡核苷酸探针的阵列的示意图。
图5是示出在示例性方面中的步骤的示意图，其中第一链cDNA由来自切割的寡核苷酸阵列的空间条形码化寡核苷酸(dT)引物引发。使用模板转换寡核苷酸(TSO)在第一链cDNA的3'端添加引物区，接着进行第二链合成和PCR。
图6是示出根据本发明的另一个方面的方法的示意图。通过与空间条形码进行碱基配对，位置条形码化寡核苷酸探针的阵列与寡核苷酸文库杂交。杂交的寡核苷酸的3'端含有寡核苷酸(dT)区。在释放杂交的探针后，可以使组织载玻片与阵列接触，使得释放的探针可以扩散至组织切片中，并且可以与组织切片中mRNA的聚(A)尾杂交。从这些探针合成cDNA可以生成包含空间条形码和来自组织的mRNA序列拷贝的核酸。
图7是示出第一链cDNA的示意图，所述第一链cDNA是使用如图6所示方法原位制备的，然后将其与含有引物结合序列的寡核苷酸连接，从而允许引物结合以及随后的第二链cDNA合成和PCR。
图8A是示出根据本发明的另一个方面的方法的示意图，其中空间条形码化寡核苷酸探针可以用于检测寡核苷酸标记的抗体的存在，作为蛋白质表达的替代物。具体地，可以通过抗体的混合物来处理组织，其中可以用包含不同抗体索引序列的寡核苷酸标记不同的抗体。在洗去未结合的抗体后，可以使组织切片与可释放的空间条形码化寡核苷酸探针的阵列接触。在图8B中，释放的寡核苷酸探针可以扩散至含有寡核苷酸连接的抗体的组织中。杂交的寡核苷酸的3'端含有这样的区域(虚线)，其可以与连接至抗体的寡核苷酸的3'端的互补序列杂交，所述抗体与组织切片中的各种细胞靶标结合。在引物延伸后，寡核苷酸探针可以拷贝抗体上的寡核苷酸标签的序列，包括抗体索引序列和相邻的PCR引物。在用适当的PCR引物组扩增后，所得的序列文库可以用于对组织切片中的空间条形码化蛋白质表达进行谱分析。在一些方面，这种蛋白质表达谱分析的方法可以与如本文别处所述的RNA测量方法组合。
图9是示出根据本发明的另一个方面的方法的示意图，其中一组寡核苷酸探针可以与组织切片中的RNA在外显子间边界的两侧杂交。连接探针接着进行PCR，这允许检测特定的RNA种类。
图10是示出在图9中概述的示例性方面中的下一步骤的示意图，其中然后使FFPE组织与空间条形码化寡核苷酸探针的阵列接触。释放的寡核苷酸探针可以扩散至组织中并与DNA探针杂交，这些DNA探针首先与组织切片中的RNA杂交并连接在一起。
图11是示出图10所示的示例性方面中的步骤的示意图，其中用DNA聚合酶延伸空间条形码化寡核苷酸，以形成与组织RNA杂交的DNA探针的互补体。然后可以对这些延伸产物进行PCR以形成连接的RNA杂交探针的双链空间条形码化文库。
图12显示了通过如下方式合成的两个cDNA文库的Agilent Bioanalyzer迹线(DNA1000试剂盒)的两个例子：在FFPE组织切片上原位转录，接着在含有新合成的第一链cDNA的研磨FFPE组织上进行PCR。
图13显示了通过图2和图3中概述的方法构建的来自空间条形码化测序文库的cDNA插入片段的大小分布。通过插入片段的配对末端DNA测序确定大小。
图14显示了在图13中描述的cDNA文库中测序的RNA同源异构体(isoform)的丰度分布。鉴定出略超过30,00种不同的转录物同源异构体，其中当以每百万转录物(transcripts per million，TPM)表示时，其丰度范围很广。
图15是来自图13中描述的测序文库的244,000个不同空间条形码的丰度的图。将每个条形码的读段数量(x轴)对具有该读段计数的不同条形码的数量作图。244,000个可能的条形码中的约42,000个给出了每个条形码至少10个读段。
图16显示了来自图13-图15中描述的测序文库的条形码位置的空间图。文库中任何具有小于20个读段(instance)的条形码的位置绘制为白色，而具有20-60个读段的条形码的位置绘制为灰色渐变，并且任何具有超过60个读段的条形码的位置显示为深灰色点。在图中清楚地看到，大多数条形码位于这样的区域中，在所述区域中FFPE组织被固定至组织载玻片。
图17显示了在图16中测定的组织切片的同一放大区域中ErbB2和Mdm2 mRNA表达的空间图。可以清楚地看到，两个基因的空间表达模式是不同的。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。将所引用的参考文献通过引用以其整体或部分并入，其中并入了参考文献中与其引用目的有关的一部分。
当引入本公开文本的要素或其各种形式、其一个或多个方面或各个方面时，冠词“一个/一种”(“a”)、“一个/一种”(“an”)和“所述”旨在表示存在一个/一种或多个/多种要素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包容性的并且意指可能存在除所列要素之外的其他要素。
在实施方案中，公开了一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。
在一个实施方案中，公开了一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：提供组织样品；提供微阵列，其包含附接至微阵列表面的多个寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包含位置条形码、引物结合序列和引发序列；从所述微阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针，同时基本上维持它们在所述微阵列表面上的位置；使所述组织样品与所述寡核苷酸探针接触；允许所述寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中，并且将所述寡核苷酸探针和所述组织样品一起孵育足够的时间以允许所述多个寡核苷酸探针与所述组织样品内的靶核酸杂交；在所述寡核苷酸探针上延伸所述引发序列以产生包含所述位置条形码的引物延伸产物；扩增所述引物延伸产物以产生扩增的产物，以及对所扩增的产物进行测序。
在实施方案中，所述靶核酸包括mRNA，并且所述引发序列包括寡核苷酸(dT)。
在实施方案中，所述靶核酸包括各自包含至少第一链cDNA的cDNA。
在实施方案中，所述引发序列与所述第一链cDNA中的序列结合。
在实施方案中，其中所述靶核酸包括在存在模板转换寡核苷酸的情况下合成的cDNA，并且所述引发序列与通过所述模板转换寡核苷酸添加的序列结合。
在实施方案中，所述第一链cDNA包含连接到其3'端的衔接子，并且所述引发序列与所述衔接子结合。
在实施方案中，所述多个寡核苷酸探针通过杂交附接至所述微阵列表面。
在实施方案中，共享相同位置条形码的多个寡核苷酸探针由包含与该位置条形码互补的序列的微阵列特征结合。
在实施方案中，所述多个寡核苷酸探针共价附接至所述微阵列表面。
在实施方案中，所述多个探针通过用气态氨切割而从所述微阵列表面释放。
在实施方案中，所述多个探针通过光切割而从所述微阵列表面释放。
在实施方案中，所述多个探针通过限制酶而从所述微阵列表面释放。
在实施方案中，所述多个探针通过变性而从所述微阵列表面释放。
在实施方案中，在所述寡核苷酸探针从所述微阵列表面释放后，使所述组织样品与所述寡核苷酸探针接触。
在实施方案中，在所述寡核苷酸探针从所述微阵列表面释放之前，使所述组织样品与所述寡核苷酸探针接触。
在实施方案中，所述靶核酸包含指示特定抗体的核酸标签。
如本文所用，术语“基因组”是指存在于任何病毒、单细胞(原核生物或真核生物)或后生动物生物体中的每种细胞类型中的所有核酸序列(编码和非编码)和元件。术语基因组也适用于这些序列的任何天然存在或诱导的变异，所述变异可以存在于任何病毒、细胞或细胞类型的突变体或疾病变体中。基因组序列包括但不限于参与维持、复制、分离和生成更高阶结构(例如染色质和染色体中DNA的折叠和压实)或其他功能的那些，以及在给定生物体中产生和维持每种病毒、细胞或细胞类型所需的所有编码区及其相应的调节元件。
术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基，还含有已经被修饰的其他杂环碱基的部分。这些修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些含有半抗原或荧光标记的部分，并且不仅可以含有常规的核糖和脱氧核糖，还可以含有其他糖。经修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团替代，被官能化为醚、胺等。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以描述由核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度(例如，多于约2个碱基、多于约10个碱基、多于约100个碱基、多于约500个碱基、多于1000个碱基、多至约10,000个或更多个碱基)的聚合物，并且可以酶促或合成产生(例如，如美国专利号5,948,902和其中引用的参考文献中所述的PNA)，其能够与天然存在的核酸以类似于两个天然存在的核酸的杂交方式进行杂交，例如可以参与沃森-克里克碱基配对相互作用。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区、从连锁分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的具有任何序列的DNA、分离的具有任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物或异种核酸(XNA)。如果存在的话，则可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。可以在合成后进一步修饰多核苷酸，如通过与标记组分缀合。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键与骨架连接。锁核酸(LNA)，通常称为不可接近的RNA，是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。所述桥将核糖“锁定”在3'-内(北)构象中，这通常在A型双链体中发现。只要需要，LNA核苷酸就可以与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是含有非天然核苷酸的核酸，所述非天然核苷酸以降低的稳定性彼此结合。例如，非结构化核酸可含有G'残基和C'残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在形式，即类似物，它们以降低的稳定性彼此配对，但保留分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。非结构化核酸描述于美国专利申请20050233340中，将所述专利申请通过引用针对UNA的披露内容并入本文。
如本文所用，术语“寡核苷酸”表示长度为约2至500个核苷酸的核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的或可以酶促制备得到，并且在一些方面，其长度为30至150个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体，或核糖核苷酸单体和脱氧核糖核苷酸单体两者。例如，寡核苷酸的长度可以是10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。
如本文所用，“靶核酸”是指包含正在测定其数量或呈现程度(例如，拷贝数)或序列身份的序列的核酸。样品通常含有一种或多种靶核酸。靶核酸可以包含RNA、DNA或两者。所述RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶RNA、反义RNA或非编码RNA。具体地，所述靶核酸可以包括非聚腺苷酸化的RNA。另外，靶核酸可以包括在细胞中天然存在的核酸、被引入活细胞中的核酸(例如，通过用质粒转染、生物弹道引入或病毒感染)、或在固定后但在分析之前引入细胞或样品中的核酸。
术语“引物”是指当条件适合于引物延伸产物的合成时能够充当沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。对于DNA的合成条件包括存在至少一种脱氧核糖核苷酸三磷酸，并且通常存在四种不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸以及至少一种聚合诱导剂(如逆转录酶或DNA聚合酶)。这些存在于合适的缓冲液中，所述缓冲液可以包含作为辅因子或在各种合适的温度下影响条件(如pH等)的组分。引物优选地是单链序列，使得优化扩增效率，但也可以利用双链序列。
术语“探针”或“寡核苷酸探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸或寡核苷酸组。在一些方面，探针包含约八个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约25个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约70个核苷酸、约75个核苷酸、约80个核苷酸、约90个核苷酸、约100个核苷酸、约110个核苷酸、约115个核苷酸、约120个核苷酸、约130个核苷酸、约140个核苷酸、约150个核苷酸、约175个核苷酸、约187个核苷酸、约200个核苷酸、约225个核苷酸和约250个核苷酸。探针可以进一步包含可检测标记。可检测标记包括但不限于荧光团(例如，荧光素异硫氰酸酯等)、放射性标记、质量标签标记和半抗原(例如，生物素)。优选的可检测标记包括在样品的相关区域中通常不以高浓度存在的原子、分子或复合物。可检测标记可以被直接共价附接至探针寡核苷酸，例如位于探针的5'端或探针的3'端。包含荧光团的探针还可以进一步包含淬灭剂，例如Black Hole QuencherTM、Iowa BlackTM等。在一些方面，所述探针不含可检测标记。
本文公开了用于检测核酸及其位置的方法。在一些方面，含有引物和位置特异性条形码的寡核苷酸探针可以以位置特异性方式排列在阵列表面上，但不共价附接至阵列表面。可以允许寡核苷酸扩散至靶组织中，与用于引物延伸的靶核酸杂交，并且可以对延伸产物(或其扩增的产物)进行测序。延伸产物中的位置条形码可以指示靶核酸在组织中的位置。所述方法原位执行许多生化步骤，并且不需要将靶核酸扩散至阵列表面。另外，在阵列上使用预释放的寡核苷酸探针可以使位置编码的寡核苷酸探针扩散至组织中，从而直接与那里的靶核酸相互作用。在不同的方面，寡核苷酸探针可以包含另外的序列元件。例如，可含有位置条形码序列的寡核苷酸探针可以被切割并用作用于cDNA合成的引物，或用作模板转换寡核苷酸，或用作引物延伸寡核苷酸。所述方法有利地允许在无需从组织切片释放RNA或从组织样品纯化原位合成的cDNA的情况下进行cDNA合成和随后的扩增(例如，PCR)。所述方法还有利地允许确定RNA序列的链型(strandedness)。
可以在阵列(在本申请中也可互换地称为“微阵列”)的表面上生成多个非随机的、定义的寡核苷酸探针(在本文中也称为“第一链cDNA引物”、“寡核苷酸”和“探针”)。这些寡核苷酸探针可以共价或非共价附接至阵列表面，如通过杂交(图1B)。在一些方面，寡核苷酸探针可以包含至少两个不同的子序列，其中这两个不同的子序列中的每一个可以结合至存在于组织中的靶核酸中的不同位点。在一些方面，寡核苷酸探针可以包含已知且随机的、简并的或未知的序列。用于生成简并的或随机的序列的方法是本领域已知的。寡核苷酸探针可以具有以下序列(从5'至3’列出)：PCR引物序列、特征特异性条形码序列(在本文中也称为“位置条形码”，其告知寡核苷酸探针在阵列表面上的位置)、用于查询来自组织的序列的引物序列(例如，寡核苷酸-dT(图4)、第二链cDNA合成引物(图1A)或基因特异性序列)、以及任选地在3'端处的可切割接头。另外，所述寡核苷酸探针可以含有分子条形码、样品索引和/或其他序列。
如图1A所示，寡核苷酸探针的阵列可以用可切割接头附接至阵列表面。如图1B所示，寡核苷酸探针的阵列可以与第一寡核苷酸(在本文中也称为“阵列特征”)杂交，所述第一寡核苷酸包含与寡核苷酸探针互补的位置条形码。
如本文所用，“位置条形码序列”是指用于鉴定阵列表面上的寡核苷酸探针位置的已知核苷酸序列。阵列表面上的不同位置可以对应于组织的不同区域，并且可以通过它们的不同位置条形码序列来区分。
阵列中的每个单独位置可以包含多个寡核苷酸探针，如一个或多个寡核苷酸探针或两个或更多个寡核苷酸探针。如图1A所示，在单个位置中的多个寡核苷酸探针可以包含相同的特征特异性位置条形码。阵列的每个位置可以包含不同的特征特异性位置条形码。
如图1B所示，多于一种类型的寡核苷酸可以共享位置条形码，使得若干种类型的寡核苷酸探针可以存在于具有互补位置条形码的第一寡核苷酸上。例如，具有位置条形码的一个阵列特征可以捕获在3'端具有寡核苷酸(dT)序列的寡核苷酸探针，以及在3'端具有随机引发序列的寡核苷酸，以及在3'端具有特异性引发序列的寡核苷酸探针；只要这些类型的寡核苷酸探针中的每一种具有该阵列特征的互补位置条形码即可。
这些寡核苷酸探针中的每一种都可以与组织中的不同靶核酸结合，同时能够将相同的位置条形码转移至每种靶核酸。取决于位置条形码序列的所需长度和熔解温度，阵列探针可以被设计成包含与探针文库的其他区域(如与位置条形码相邻的引物位点)互补的序列。
以这种方式，存在包含存在于阵列的每个位置中的多个寡核苷酸探针的阵列，其中每个寡核苷酸探针包含所述位置独有的位置条形码。所述方法包括以使寡核苷酸探针能够保持在其独特位置的方式从阵列表面分离寡核苷酸探针。如果所述方法使用如图1A所示的寡核苷酸探针，则所述方法可以包括切割接头。如果所述方法使用如图1B所示的寡核苷酸探针，则所述方法可以包括分离杂交的序列。应当理解的是，将寡核苷酸探针附接至阵列表面并随后将寡核苷酸探针与阵列表面分离的特定方法可以变化，只要寡核苷酸探针保持在它们各自的位置，脱离所述阵列表面，并且能够扩散至组织中即可。
参见图1A，寡核苷酸探针可以包含至少一个、两个、三个、四个或更多个切割位点。寡核苷酸可以通过光、热、化学物质或酶(如RNA酶或限制酶)在特异性切割位点从阵列表面切割。可以将切割化学物质以液体或气体形式施加于阵列。这种切割可以产生不同长度的寡核苷酸，包括但不限于15至250个碱基对(bp)、18bp、25bp、30bp、35bp、40bp、50bp、60bp、70bp、75bp、80bp、90bp、100bp、110bp、115bp、120bp、125bp、130bp、140bp、150bp、175bp、200bp、225bp、和/或250bp。
在阵列与寡核苷酸探针之间不存在共价连接的情况下，寡核苷酸探针可以在阵列表面上切割并留在适当的位置，从而保持空间定位。气相脱保护试剂(例如气态氨或甲胺)可以用于从阵列表面切割寡核苷酸探针。例如，酯接头可以由气相胺切割，但缺乏水性溶剂可以阻止寡核苷酸探针迁移离开它们在阵列表面上的空间定位。作为切割的例子，我们先前已经发现(描述于美国专利号9834814和其中的参考文献中)，可以使用气态氨进行切割，使得只要载玻片保持干燥，则阵列探针寡核苷酸一旦切割就保持在阵列载玻片上的相同位置中。可以通过用溶剂或溶剂混合物洗涤阵列去除脱保护副产物，其中所述寡核苷酸探针在所述溶剂或溶剂混合物中不是明显可溶性的。此类溶剂的非限制性例子包括乙腈和甲苯。以这种方式，寡核苷酸探针可以保持其空间定位。
在一些方面，可以使用多于一种可切割接头或附接模式来最初将寡核苷酸探针附接至阵列。例如，在阵列上合成的寡核苷酸探针可以含有2、3、4或更多个可切割接头，使得所述寡核苷酸探针可以通过切割处理被切割成3、4、5或更多个更短的寡核苷酸。这个方面使得在一个阵列特征中合成的寡核苷酸能够参与组织中多于一种特异性靶核酸的扩增或引物延伸测定。例如，可以将一个100聚体寡核苷酸探针切割成四个25聚体引物，它们是可用于通过PCR扩增两个特异性靶标的两对引物。此外，可以使用多于一种类型的可切割接头或附接方式。以这种方式，可以在不同的时间释放不同的寡核苷酸探针组。例如，用气态氨处理可以切割一种类型的接头，而第二种类型的接头可以是可光切割的。
参见图1B，可以通过与包含与位置条形码互补的序列的阵列特征和探针的其他部分(如果需要的话)杂交，在阵列上捕获寡核苷酸探针。图1B的寡核苷酸探针可以没有可切割接头，并且可以以3'端远离阵列表面的方式取向。具体地，第一寡核苷酸附接至阵列表面，并且可以在其5'端包含与寡核苷酸探针的特征特异性位置条形码互补的序列。寡核苷酸探针可以与第一寡核苷酸的5'端杂交，有效地将寡核苷酸探针附接至阵列表面，但寡核苷酸探针的3’端面向远离阵列表面的方向。
第一寡核苷酸的长度可以变化，只要其5'端附近的部分可以与寡核苷酸探针的特征特异性位置条形码杂交即可。第一寡核苷酸的使用允许寡核苷酸探针附接至阵列表面，但不将寡核苷酸探针直接附接至所述阵列表面，和/或寡核苷酸探针的3'端面向“向上”或远离所述阵列表面的方向。
在一些方面，在寡核苷酸探针是杂交至而不是共价连接至阵列表面的情况下，探针被募集或“分选”至阵列表面上的所需位置。因此，溶液中的寡核苷酸探针的混合物可以与具有共价结合的第一寡核苷酸(“索引寡核苷酸”)的阵列杂交，所述第一寡核苷酸在每个位置中是独特的并且至少部分地与混合物中的一些探针互补。在一些方面，可溶性寡核苷酸探针可以包含位置条形码，并且可以与第一寡核苷酸杂交，所述第一寡核苷酸可以包含与所述寡核苷酸探针的位置条形码互补的序列。
可以通过变性条件(如高pH，添加甲酰胺或高于双链体Tm的温度)去除这些杂交的寡核苷酸。在一些方面，杂交的寡核苷酸可以含有可切割位点(如限制酶识别位点)、脱氧尿苷残基或一个或多个RNA核苷酸，使得这些寡核苷酸可以被酶(如限制酶)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII的混合物、或RNA酶(如RNA酶H)切割。在一些方面，所述阵列寡核苷酸可以包含识别位点，使得它们被切口核酸内切酶切割，从而将杂交的寡核苷酸探针序列释放至组织中。可替代地，可以在杂交的寡核苷酸解离之前或之后通过切割条件去除共价结合的寡核苷酸探针。
从阵列表面释放寡核苷酸探针，同时基本上保持它们在阵列表面上的位置，这可以以本领域已知的任何方式进行。通过对寡核苷酸、接头和条件的仔细设计，将有可能允许在不同条件下从阵列表面去除各种大小的寡核苷酸探针。所述方法包括使分离的寡核苷酸探针扩散至组织中。通过“扩散至组织中”可以理解，与保留在组织的表面上或与组织的界面上相对，包含特征特异性位置条形码的寡核苷酸探针可以自由移动、扩散和/或进入组织的团块中。[请确认这一定义。]所述方法可以在固体组织样品(例如，来自福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织的组织切片)上进行。实体组织可以是活检(例如，肿瘤活检)的产物。可替代地，所述方法可以用新鲜或新鲜冷冻的组织切片进行。
如本文所用，术语“样品”是指含有核酸分子的物体。样品的一致性通常以这样的方式，即目的核酸分子具有不均匀或不平均的分布。优选地，所述核酸不应在溶液中。优选的样品是非流体的、凝胶状的、固定的或固体的。合适样品的例子是组织切片，组织块，凝胶层，细胞，细胞层，组织阵列，培养板、膜、纸或织物上的酵母或细菌，或具有分离或合成的核酸分子的斑点的载体。一般而言，所述样品可以包含由玻璃、塑料、纸、膜(例如硝化纤维)或织物制成的载体。例如，组织切片通常施加于载玻片或盖玻片上。细胞层也可以提供于载玻片或塑料盘上。单细胞生物体可以提供于培养板、滤纸或织物上。核酸分子可以在样品内，例如固定细胞内、凝胶内或组织内。可替代地，所述核酸分子可以提供于样品的表面上，如阵列(固体基底上的2D阵列；通常是载玻片或硅薄膜细胞)，例如也通常称为DNA芯片或生物芯片的DNA阵列。
在一个方面，所述样品是组织切片。组织切片和其他样品(例如细胞或单细胞生物体)可以是冷冻的(新鲜冷冻或固定冷冻的)、固定的(甲醛固定的、福尔马林固定的、甲醇固定的、乙醇固定的、丙酮固定的或戊二醛固定的)和/或包埋的(使用石蜡、Epon或其他塑料树脂)。此类组织切片可以用如常规用于电子显微镜切片的标准钢切片机刀片或玻璃和金刚石刀制备。此外，可以将小块组织(小于15mm厚)处理为整装物。如果核酸分子在样品的表面上，则样品的厚度实际上并不重要，因此可以使用任何厚度。如果核酸分子位于样品(如组织载玻片)内，则厚度应在这样的范围内使得核酸分子可以从样品移出至目标表面。这种样品的厚度可以是例如1微米至1mm，并且例如2微米至10微米。
本文尤其公开了用于执行空间RNA测序的方法，这意味着使用释放的寡核苷酸探针的阵列确定组织切片中RNA的序列和位置。尽管不同方面的细节有所不同，但这些方面通常描述了如下方法，其合并从阵列特征所赋予的位置特异性条形码信息以将位置特异性条形码信息和扩增序列增补至来自组织样品的序列信息。
图2示出了检测核酸的方法的概述。寡核苷酸探针可以提供于阵列表面上，如上文关于图1A至图1B所讨论的。寡核苷酸探针可以在适当的位置释放，例如如图2所示切割的。值得注意的是，尽管图2示出了图1A的寡核苷酸探针，但图2所示的方法的步骤同样适用于图1B或图4的寡核苷酸探针。可以使包含释放的寡核苷酸探针的阵列与含有组织的组织载玻片接触以形成“夹心式结构(sandwich)”。当在水性条件下在组织与阵列之间制成夹心式结构时，可以允许包含位置条形码的释放的寡核苷酸探针扩散至存在于组织载玻片上的组织中。寡核苷酸探针可以与组织中的靶核酸杂交，并且可以促进引物延伸和/或靶核酸的扩增，其中位置条形码被掺入延伸/扩增产物中。在对此类延伸/扩增产物进行测序时，可以分别基于序列和位置条形码来确定靶核酸的身份和位置。在一些方面，所述阵列或所述组织可以被嵌入凝胶状基质中，而不是仅仅嵌入缓冲液中。
上面已经讨论了包含释放的寡核苷酸的阵列。关于组织载玻片，合适的组织样品可以包括FFPE组织切片和新鲜或冷冻组织切片。如果使用FFPE组织切片，则可以使用二甲苯或其他标准处理将切片脱蜡。如果需要的话，也可以在使用前进行胃蛋白酶处理FFPE组织，这在一些情况下可以增加接近RNA或其他靶分子的机会。在一些方面，组织中的RNA可以通过超声处理或酶或化学处理而部分地片段化，以使RNA更容易被酶或引物接近。可替代地或者并行地，如果想要保留组织的蛋白质结构，则可以在抗原修复或类似缓冲液中进行处理。在所述方法的某个时间点，可以对组织进行染色并捕获显微图像。可替代地，可以通过FFPE组织的一个切片获得空间RNA序列信息，而可以在相邻切片上进行成像、FISH或免疫组织化学，并且可以合并来自相邻切片的所得数据。最终，可以通过合并若干种数据类型获得更深入的生物学见解，所述数据类型包括图像数据、序列数据(来自RNA或来自代表其他生物学标记物的替代序列)、蛋白质或抗体结合数据等。
所述靶核酸可以是例如用于标记特定抗体的mRNA、cDNA或核酸标签。组织中的靶核酸可以是例如mRNA、cDNA或其他寡核苷酸，如附接至特定蛋白质或抗体的条形码寡核苷酸。在一些方面，所述靶标是cDNA，其可以在将组织暴露于排列的寡核苷酸之前在(整个)组织中合成。因此，在将阵列载玻片和组织载玻片放置在一起以形成“夹心式结构”之前，将组织切片中的RNA逆转录以形成第一链cDNA(例如，参见图3)。
在图3中，示出了检测核酸的方法的进一步详细过程。第一行示出了组织载玻片上的组织，其中所述组织包含mRNA形式的靶核酸。可以将溶液添加至组织切片中。所述可以含有寡核苷酸(dT)引物、逆转录酶及其缓冲液、dNTP和模板转换寡核苷酸(TSO)(BioTechniques 30,第4期(2001):892–897)。寡核苷酸(dT)引物可以在其5'端具有PCR引物结合位点，并且在其3'端具有寡核苷酸(dT)区。如果需要的话，如上所述的分子条形码序列可以插入例如在这两个区域之间(图3，第2行)。可以将所述溶液轻轻散布在组织切片上，并且可以在低温条件下孵育组织载玻片，从而使寡核苷酸(dT)引物与组织切片中mRNA上的聚(A)尾杂交。然后可以升高温度以允许逆转录酶从寡核苷酸探针序列的寡核苷酸-dT尾延伸。当逆转录酶到达mRNA片段的末端时，它倾向于在第一链cDNA的3'端添加3个未模板化的C残基(图3，第3行)。
这三个C可以在TSO的3'端与三个核糖-G残基杂交(图3，第4行)。TSO在3'端包含三个核糖-G残基以及在上游包含第二链cDNA引发区。当TSO与第一链cDNA末端的未模板化C杂交时，它可以充当模板进一步延伸cDNA的第一链。术语“模板转换寡核苷酸”或“TSO”是指能够与由逆转录酶产生的新生第一链cDNA链的末端杂交的寡核苷酸，从而能够继续cDNA合成。在一些方面，新生链在3’端具有3个或更多个胞嘧啶残基。在这些方面，TSO在3’端在引物或衔接子序列下游的包含3个核糖鸟苷残基。在一些方面，除了引物或衔接子序列之外，所述TSO还可以包含空间条形码、样品索引或分子条形码序列(例如，寡核苷酸文库)。
如本文所用，“分子条形码序列”是指可用于区分由不同模板分子产生的核酸的核苷酸序列。分子条形码序列可以用于鉴定由相同模板产生的重复分子，和/或可以用于校正在PCR扩增或测序期间产生的错误。在一些方面，分子条形码序列可以由随机核苷酸构成，或者由随机核苷酸和已知核苷酸的混合物构成。分子条形码序列可以在寡核苷酸的5'端、3'端或中间。
条形码序列(如位置条形码序列和分子条形码序列)在大小和组成方面可能有很大差异；以下参考文献为选择适用于特定方面的条形码序列组提供指导：Brenner,美国专利号5,635,400；Brenner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Shoemaker等人,Nature Genetics,14:450-456(1996)；Morris等人,European patentpublication0799897A1；Wallace,美国专利号5,981,179；等。在特定方面，条形码序列的长度可以在4至36个核苷酸或6至30个核苷酸或8至20个核苷酸的范围内。通常，所述条形码序列的范围可以在约5个核苷酸至约20个核苷酸的范围内。
在第一链cDNA合成结束时(图3，第5行)，组织载玻片包含具有第一链cDNA的组织，使其与DNA聚合酶、缓冲液、dNTP和释放的寡核苷酸探针的阵列接触以形成夹心式结构(图3，第6行)。将夹心式结构在允许DNA聚合酶使用释放的位置条形码化寡核苷酸作为引物合成第二链cDNA的条件下孵育(图3，第7行)。所述第一链被延伸以在其3'端包含位置条形码和PCR引物区，并在其5'端保留分子条形码和PCR引物区。互补第二链还在其3'端包含PCR引物区和分子条形码以及在其3'端包含位置条形码和PCR引物区。
之后，可以从释放的寡核苷酸阵列载玻片取出组织载玻片，可以将组织和溶液刮入试管中，并且可以使用与cDNA的5'和3'端的引发序列互补的PCR引物进行PCR，其通过寡核苷酸(dT)引物和TSO放置在适当位置。然后可以对cDNA PCR产物的文库进行测序。
然后可以通过检查位置条形码将第一链cDNA引物阵列上的位置解卷积。随后，可以将由位置条形码确定的mRNA序列的位置与在原位RNA测序之前获得的组织切片的图像进行比对。在一些方面，所述组织切片可以具有特征形状、大小或尺寸，这有助于确定信号是否为噪声，因为在所述切片之外的信号应该为噪声。以这种方式，可以将组织切片的图像与从原位RNA测序获得的mRNA序列进行比对。与阵列中未与组织切片接触的区域相对应的位置条形码将不会在RNA测序文库中表示。
本发明的另一个方面是一种利用图4的寡核苷酸探针的方法。如图4所示，所述寡核苷酸探针可以在其5'端包含PCR引物序列、位置条形码、寡核苷酸(dT)cDNA合成引物序列以及任选地在其3'端的可切割接头。图1B的寡核苷酸探针可以在完成第一链cDNA合成后用于方法中，如图3所示。图4的寡核苷酸探针可以在完成第一链cDNA合成之前用于方法中，如图5所示。
可以使包含靶核酸的组织载玻片与逆转录酶及其缓冲液、dNTP和TSO接触(图5，第1行)。可以将包含位置条形码和来自图4的寡核苷酸(dT)cDNA合成引物序列的所释放的寡核苷酸探针施加于组织玻片以形成夹心式结构。然后，释放的寡核苷酸探针可以扩散至组织中，从而允许寡核苷酸探针的3'端的寡核苷酸-dT与组织切片中发现的mRNA的聚(A)尾杂交(图5，第2行)。这可以通过将夹心式结构在低温下短暂放置以促进退火来辅助。然后可以升高温度以允许逆转录酶从寡核苷酸探针的寡核苷酸-dT尾延伸(图5，第3行)。当逆转录酶到达mRNA片段的末端时，TSO与未模板化的C残基杂交，从而允许其通过逆转录酶拷贝(图5，第4行)。在这个方面，TSO包含三个区域(从5'至3'列出)：PCR引物序列、分子条形码序列(范围从约5至20个核苷酸-未显示)和三个核糖-G残基。在第一链cDNA合成后，所述第一链包含5'端附近的位置条形码和3'端附近的分子条形码(未显示)(图5，第5行)。可以从阵列载玻片取出组织载玻片，并且使用与第一链cDNA的5'和3'端的PCR引发序列互补的PCR引物进行PCR(图5，第6行)。然后可以对cDNA PCR产物的文库进行测序。可替代地，代替使用TSO，可以将第一链cDNA的3'端连接至含有分子条形码(如果需要的话)和PCR引物序列的单链衔接子序列。如果需要的话，这可以在从组织切片分离出第一链cDNA之后进行。在连接后，可以进行PCR以扩增cDNA，并通过DNA测序分析产物。
在使用释放的寡核苷酸阵列的另一个示例性方面中，具有位置条形码的TSO被印在阵列表面上。这允许用户在制作阵列载玻片与组织样品载玻片之间的“夹心式结构”之前，在组织中使用非排列的寡核苷酸(dT)引物进行大部分第一链cDNA合成。制作夹心式结构允许TSO从阵列的表面扩散至组织中，以与组织中第一链cDNA的3'非模板化CCC残基杂交。当逆转录反应继续时，第一链cDNA的延伸将包括TSO序列，从而将位置条形码序列附加至靶序列。在这个方面，如果使用分子条形码序列，则分子条形码可以在第一链寡核苷酸(dT)cDNA引物上。在这种方法中，cDNA合成完全直接在组织切片中进行，而不是与附接至阵列的引物结合进行，这可以使引物更好地渗透至组织切片中。在一些方面，分子和位置条形码都在相同的引物序列上。
鉴于上述情况，可以看出，本发明实现了若干个优点并获得了其他有利的结果。本发明可以用于检测除mRNA或cDNA以外的核酸。在某些方面，原位RNA测序方法可以与组织分析的其他方法组合。例如，原位RNA测序方法可以与用DNA适配体或寡核苷酸标记的抗体标记生物分子的方法组合，如美国专利号9834814中所述。在一些方面，附接至抗体的寡核苷酸的序列可以与通过所述方法获得的mRNA序列一起检索。例如，组织切片可以用具有附接的RNA寡核苷酸的抗体染色，其中寡核苷酸具有条形码序列和3'聚A尾。所述条形码序列将鉴定所述抗体，并且所述抗体的位置将由从阵列释放的寡核苷酸提供。以这种方式，可以从同一组织切片以空间分辨率一起获得有关基因表达(来自mRNA序列)和蛋白质表达(来自寡核苷酸连接的抗体)的信息。在一些方面，所述抗体也可以进行荧光或染色体标记，使得IHC信息可以与原位RNA序列信息组合。在一些方面，原位RNA测序方法可以与用于获取DNA序列的方法组合。例如，来自阵列的位置条形码可以附接至原位生成的PCR扩增子，使得可以以空间分辨率获得关于基因组突变的信息。将来自RNA测序的信息与来自DNA测序的信息进行比较可以深入了解诸如RNA编辑或等位基因特异性基因表达的过程。
在本发明的另一组方面中，具有固定的、不可切割的序列(“索引寡核苷酸”)的阵列用作杂交底物以“分选”寡核苷酸的文库，使得探针与阵列上的预定位置杂交(图1B)。在这些方面，每个阵列特征可以含有不同的位置条形码序列，并且可溶性寡核苷酸探针可以经由位置条形码与阵列特征杂交。这些方面的主要优点是，只要序列共享位置条形码，就可以在一个阵列特征中捕获多个不同的序列。例如，可以在阵列上捕获一组寡核苷酸-dT探针，其中每个寡核苷酸-dT探针还含有独特的分子条形码。作为另一个例子，可以在阵列上捕获寡核苷酸-dT探针和基因特异性cDNA引物的混合物，以探测通常除了聚腺苷酸化序列之外的特异性序列。在另一个例子中，包括正向和反向引物的PCR引物可以被捕获在阵列上。这些或其他序列的组合可以与所述阵列杂交，使得每个阵列特征可以捕获具有不同序列或功能的多个探针寡核苷酸，前提是它们共享相同的位置条形码，使得所述多个探针寡核苷酸能够与所述特异性阵列特征杂交。以这种方式，可以使用一个阵列特征将多个不同的探针寡核苷酸递送至组织内的每个位置。
在这个方面，打印阵列，其中每个特征都含有充当位置条形码的独特核苷酸序列(图6)。该阵列中的寡核苷酸附接至表面(如通过其3'端)，并且排列的寡核苷酸不需要与可切割接头连接。产生相应的寡核苷酸文库，其中寡核苷酸含有PCR引物序列(例如在5'端)以及与阵列上的位置条形码互补的序列。在探针文库中的寡核苷酸中还包含另一种PCR引物序列，其包括在3'端的寡核苷酸(dT)序列。如果需要的话，寡核苷酸探针文库可以在与阵列杂交之前通过PCR扩增；寡核苷酸文库的PCR扩增可以产生一组产物，其具有在5'端的PCR引物序列、在中间的与阵列上那些互补的位置条形码、以及在3'端延续的寡核苷酸(dT)。
然后将寡核苷酸探针文库与阵列杂交，使得每个阵列特征捕获含有相同位置条形码的文库的子集。随后，将待测定的组织切片置于阵列表面上方以形成“夹心式结构”，其中与所述阵列杂交的寡核苷酸探针的寡核苷酸(dT)延续段(run)然后可用于与组织切片中的mRNA的聚(A)尾杂交(图6)。在杂交后，用逆转录酶进行引物延伸将产生由寡核苷酸探针文库引发的cDNA。尽管由于组织切片中RNA的交联或降解，cDNA可能不会延伸得很远，但不需要全长cDNA来鉴定正在延伸的mRNA。在cDNA合成后，分离由寡核苷酸探针文库引发的cDNA，并将新的PCR引物序列连接至3'端(图7)。该引物还可以含有随机核苷酸的分子条形码(在图7中显示为N)。使用该引物序列加上原始的5'端PCR引物序列进行PCR产生在相同分子上含有位置条形码和mRNA(cDNA)序列的cDNA文库。然后使用典型的下一代测序(NGS)方法对该文库进行测序。
然后使用空间条形码将测序结果映射回阵列，以确定每个cDNA序列在阵列上的位置。可以将组织切片的显微图像与测序结果叠加，并且可以在组织的显微图像上可视化每个测序的RNA的位置。由于没有从与组织切片接触的阵列上的特征产生cDNA，因此将组织切片图像与阵列图像进行比对应该是简单直接的。以这种方式，产生了RNA转录组的空间可视化。如果使用寡核苷酸(dT)引物序列，则所述方法不应挑选rRNA或任何其他缺乏聚(A)尾的RNA。可替代地，可以使用一组随机引发序列代替寡核苷酸(dT)引物来测定整个RNA转录组，或者可以使用随机引发和寡核苷酸(dT)引物的组合。
如果要寻找特异性mRNA(或cDNA)，则可以修改刚才描述的方法以使用序列特异性引物代替寡核苷酸文库上的寡核苷酸(dT)引发区。这可以以多路化方式完成，使得可以同时测定一组定义的mRNA。在这种情况下，每个位置条形码将具有一组这样的引物，所述引物具有与其缔合的不同3'端，所述引物全部都与相同特征杂交。可替代地，可以使用寡核苷酸(dT)引物和特异性引物的混合物。
该方法的另一种变体也可以用于定位组织切片中的蛋白质(图8)。在该方法中，使用具有针对不同蛋白质的许多抗体的免疫组织化学对组织切片进行探测，其中每种抗体具有指示抗体性质的附接的独特寡核苷酸标签。这些寡核苷酸标签含有与寡核苷酸阵列上的PCR引物(例如3'引物)序列互补的PCR引物区(在这种方法中，寡核苷酸上没有寡核苷酸(dT)尾)；这些区域在制成“夹心式结构”后与探针杂交，并且使用DNA聚合酶进行的引物延伸贯穿附接至抗体的DNA的其余部分而延伸，所述其余部分包含抗体特异性条形码和3'PCR序列(图8)。在引物延伸后，分离延伸的寡核苷酸探针文库，使用外部PCR引物序列进行PCR扩增，并进行测序。
可替代地，可以设计附接至抗体的寡核苷酸标签，使得它们在3'端具有聚(A)或聚(dA)序列，从而能够通过寡核苷酸(dT)引物引发这些标签序列。在这种变化中，对于抗体的寡核苷酸标签序列应被设计成使得标签序列与样品中的靶序列不同，因为寡核苷酸(dT)引物也应捕获样品中的一些mRNA序列。然而，该方法可以能够同时测量同一组织中的mRNA和蛋白质表达。同样，阵列特征特异性序列可以用于鉴定阵列表面上的每个抗体的位置，并且这可以被映射至组织切片的显微图像上，因为没有从组织不接触阵列的区域产生DNA。
用于执行空间分析的另一个方面涉及用可连接在一起的序列特异性探针对探测组织中的序列。在这个方面，合成了单链DNA寡核苷酸的集合，所述集合将与要研究的一组RNA转录物杂交。成对设计寡核苷酸，使得每个寡核苷酸对将在RNA转录物上彼此相邻杂交，使得两个寡核苷酸所在的位置在成熟mRNA中的外显子间连接处是末端对末端的，并且其5'端在该连接处的探针将在5’端被磷酸化(图9)。在探针与组织切片中的RNA转录物杂交后，添加了DNA连接酶(如SplintR DNA连接酶(New England Biolabs))，所述连接酶连接DNA寡核苷酸，所述DNA寡核苷酸彼此相邻地杂交至RNA模板。SplintR连接酶的使用需要将探针与RNA杂交以及使探针在外显子间连接处排列，这确保探针仅在与成熟的mRNA转录物杂交时才能连接，而不是在与基因组DNA杂交时连接。这种探针连接方法的优点在于，可以使用杂交探针序列接近在组织中部分降解或交联的核酸，因为组织中的核酸充当用于杂交的模板，而不是充当用于聚合的模板或引物序列。
除了与RNA互补的区域之外，探针对中的每个DNA探针还具有不与组织切片中的任何东西杂交的区域(图9)。一个探针具有将用作PCR引物的结合位点的5'区，而另一个探针具有与另一个探针组中与DNA阵列杂交的区域互补的3'区(图10)。使具有与目的特异性RNA杂交的探针对的组织切片与DNA阵列接触，其中阵列上的每个特征含有该特征所特有的位置条形码，并且每个特征将通过该独特的条形码与寡核苷酸探针杂交。与阵列杂交的这些条形码化探针中的每一个还将含有3'区，其在所有杂交的寡核苷酸上是相同的(图10中的虚线)，并且与组织切片中的RNA杂交的寡核苷酸的3'区互补。因此，两个探针可以杂交(图10)，并且可以进行引物延伸以延伸与阵列杂交的寡核苷酸从而拷贝所连接的RNA检测寡核苷酸。然后可以将该引物延伸产物从阵列和组织切片中熔解掉(可能在RNA酶的帮助下降解组织RNA)，然后将使用在两条链末端的引物位点进行PCR以扩增连接的探针产物(图11)。然后，将使用对产物的测序来计数不同的产物以确定丰度，并且对所附接的空间条形码的测序将鉴定它们在组织中的位置。此方法使用与组织中RNA杂交的DNA探针上的引物延伸，而不是在RNA本身上的引物延伸，因此可以更耐受FFPE组织中常见的降解和断裂的RNA。
在上述方法的另一个方面中，杂交的探针在外显子间边界处不相遇，因为SplintR连接酶应仅连接与RNA杂交的探针。探针可以设计成在单核苷酸多态性(SNP)的位点相遇，这将能够原位检测RNA SNP或等位基因特异性基因表达。
在与样品中的RNA杂交的同时将两个DNA探针连接在一起的方法已描述于文献中(Nucleic Acids Research 45,e128(2017))。然而，所报道的方法并未使用SplintR连接酶来区分与RNA杂交的寡核苷酸和与DNA杂交的寡核苷酸。它也没有教导使探针在剪接连接处相遇以区分DNA与RNA杂交，并且它没有提及使用阵列或任何其他方法来确定连接产物的空间位置。
尽管出于清楚理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但根据本发明的传授内容，本领域普通技术人员容易清楚的是，可以在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。包含在上述描述中以及显示在附图中的所有内容应旨在被解释为说明性的而不是限制性的。
实施例
有利地，对于一些方面，我们已经发现，可以在不首先从组织样品纯化cDNA的情况下进行第一链或第二链cDNA合成后的PCR。相反，可以将含有新合成的cDNA的FFPE组织从载玻片上刮下，并直接放入PCR管中以进行扩增。图12显示了通过如下方式合成的两个cDNA文库的Agilent Bioanalyzer迹线(DNA 1000试剂盒)的两个例子：在FFPE组织切片上原位逆转录，接着在含有新合成的第一链cDNA的研磨FFPE组织上进行PCR。两个文库清楚地产生了约200-400个碱基的PCR产物。对来自图12的两个文库进行测序，并显示出这两个文库含有一部分人mRNA的cDNA拷贝。在各个方面，这些cDNA拷贝可以用从阵列特征提供的空间条形码编码。
使用空间条形码化释放的寡核苷酸阵列，我们证明了它们在FFPE组织切片中引发第二链cDNA合成的能力，如图3所概述。将显微镜载玻片上的人乳腺肿瘤FFPE组织切片脱蜡，用胃蛋白酶处理，并用酒精脱水。使用具有序列GCAATCGTCGATAGCGTTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN(SEQ ID NO.1)的第一链cDNA寡核苷酸(dT)引物、模板转换寡核苷酸(CGGCTCATCAGATTGAACACrGrGrG)(SEQ ID NO.2)、缓冲液、dNTP和逆转录酶，通过在42℃下孵育90分钟接着在85℃下孵育5分钟原位合成第一链cDNA。在冷却至室温并短暂洗涤载玻片后，将Herculase II DNA聚合酶(Agilent)、聚合酶缓冲液和dNTP添加至组织的顶部，然后用释放的空间条形码化寡核苷酸阵列制成“夹心式结构”(图2)。将其在72℃下孵育2分钟，在57℃下孵育2分钟，以及在72℃下孵育10分钟。然后将夹心式结构拆开，并且将组织和溶液刮入微量离心管中，紧接着使用Herculase II进行22个PCR循环。PCR引物是TAGCTTGGCTATCGACACCATAAG(SEQ.ID.NO 3)和GCAATCGTCGATAGCGTTG(SEQ.ID.NO 4)。珠粒纯化后，再次扩增PCR产物以将其置于衔接子序列上以进行测序，并使用标准方案在MiSeq(Illumina)上对产物进行测序。
对由此获得的文库的分析表明，获得了宽范围的插入片段大小，其中最丰富的是长度在50-100个碱基之间，并且几乎全部小于250个碱基(图13)。鉴定出略超过30,00种不同的转录物同源异构体，其中当以每百万转录物(TPM)表示时，其丰度范围很广(图14)。当检查附接至每个cDNA序列的空间条形码时，244,000个可能的条形码中有约42,000个条形码给出每个条形码至少10个读段(图15)。当根据阵列载玻片上的位置绘制空间条形码的位置且每个条形码的丰度由斑点的暗度表示时，清楚地看到大多数条形码位于这样的区域中，在所述区域中FFPE组织的载玻片被固定至载玻片(图16)。实际上，当在制备两个载玻片的夹心式结构时在组织顶部形成小气泡的情况下，气泡的位置可以很容易地看作是从该区域获得的条形码数量的减少(图16)。在图17中，来自该实验的两个代表性基因ErbB2和Mdm2的表达模式显示在FFPE组织切片的相同放大区域中。两种mRNA的表达模式明显不同，这表明检测到差异空间基因表达。

Claims (15)

1.一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：
提供组织样品；
提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，
其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；
从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；
使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及
允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
将所述寡核苷酸探针和所述组织样品一起孵育足够的时间以允许所述多个寡核苷酸探针与所述组织样品内的靶核酸杂交；
在所述寡核苷酸探针上延伸所述引发序列以产生包含所述位置条形码的引物延伸产物；
扩增所述引物延伸产物以产生扩增的产物，以及
对所扩增的产物进行测序。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括mRNA，并且所述引发序列包括寡核苷酸(dT)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品包含cDNA，每个cDNA至少包含第一链cDNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述引发序列与所述第一链cDNA中的序列结合。
6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中所述组织样品包含在存在模板转换寡核苷酸的情况下合成的cDNA，并且所述引发序列与通过所述模板转换寡核苷酸添加的序列结合。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述第一链cDNA包含连接至其3'端的衔接子，并且所述引发序列与所述衔接子结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过杂交或共价附接至所述阵列表面。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针共享相同的位置条形码，并且由包含与该位置条形码互补的序列的阵列特征结合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过用气态氨切割而从所述阵列表面释放。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过光切割而从所述阵列表面释放。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过限制酶或变性而从所述阵列表面释放。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述寡核苷酸探针从所述阵列表面释放之前或之后，使所述组织样品与所述寡核苷酸探针接触。
14.根据权利要求1和8-13中任一项所述的方法，其中所述组织样品包含指示特定抗体的核酸标签。
15.一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：
提供组织样品；
提供微阵列，其包含附接至微阵列表面的多个寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包含位置条形码、引物结合序列和引发序列；
从所述微阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针，同时基本上保持其在所述微阵列表面上的位置；
使所述组织样品与所述寡核苷酸探针接触；
允许所述寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中，并且将所述寡核苷酸探针和所述组织样品一起孵育足够的时间以允许所述多个寡核苷酸探针与所述组织样品内的靶核酸杂交；
在所述寡核苷酸探针上延伸所述引发序列以产生包含所述位置条形码的引物延伸产物；
扩增所述引物延伸产物以产生扩增的产物，以及
对所扩增的产物进行测序。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025129663A1 (zh) * 2023-12-22 2025-06-26 深圳华大生命科学研究院 Rna-蛋白质互作的检测方法
WO2025162175A1 (zh) * 2024-02-01 2025-08-07 深圳赛陆医疗科技有限公司 超高密度探针捕获的空间转录组芯片及其制备方法和应用

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020123320A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN115038794A (zh) 2019-12-23 2022-09-09 10X基因组学有限公司 在基于分区的测定中使用固定生物样品的组合物和方法
US12365942B2 (en) 2020-01-13 2025-07-22 10X Genomics, Inc. Methods of decreasing background on a spatial array
US12405264B2 (en) 2020-01-17 2025-09-02 10X Genomics, Inc. Electrophoretic system and method for analyte capture
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021158925A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US12281357B1 (en) 2020-02-14 2025-04-22 10X Genomics, Inc. In situ spatial barcoding
US12399123B1 (en) 2020-02-14 2025-08-26 10X Genomics, Inc. Spatial targeting of analytes
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
WO2021236625A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Electrophoresis cassettes and instrumentation
US12265079B1 (en) 2020-06-02 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for detecting analytes from captured single biological particles
EP4600376A3 (en) 2020-06-02 2025-10-22 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US12435363B1 (en) 2020-06-10 2025-10-07 10X Genomics, Inc. Materials and methods for spatial transcriptomics
AU2021294334A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of DNA methylation
US12209280B1 (en) 2020-07-06 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis
EP4491742A3 (en) 2020-09-18 2025-05-21 10x Genomics, Inc. Sample handling apparatus and image registration methods
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4294571B8 (en) 2021-02-19 2024-07-10 10X Genomics, Inc. Method of using a modular assay support device
EP4301870B1 (en) * 2021-03-18 2025-01-15 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4305196B1 (en) 2021-04-14 2025-04-02 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
EP4441711A1 (en) 2021-12-20 2024-10-09 10X Genomics, Inc. Self-test for pathology/histology slide imaging device
CN117512070B (zh) * 2022-10-14 2024-08-16 深圳赛陆医疗科技有限公司 在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法
EP4482979B1 (en) * 2022-11-09 2025-10-01 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of multiple analytes in a biological sample
CN120266214A (zh) * 2022-11-29 2025-07-04 深圳华大智造科技股份有限公司 原位测序及对原位测序结果进行区域划分的方法
CN120693411A (zh) * 2023-03-09 2025-09-23 疫苗基因技术株式会社 扩增互补dna链的方法
CN117385477B (zh) * 2023-03-10 2024-09-20 深圳赛陆医疗科技有限公司 用于空间转录组学测序的芯片及其制备方法、空间转录组学测序方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004537257A (ja) * 2000-10-06 2004-12-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 核酸配列の検出および／または定量のための、方法およびプローブ
EP4592400A3 (en) * 2012-10-17 2025-10-29 10x Genomics Sweden AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
US9834814B2 (en) * 2013-11-22 2017-12-05 Agilent Technologies, Inc. Spatial molecular barcoding of in situ nucleic acids
CN108138225B (zh) * 2015-07-27 2022-10-14 亿明达股份有限公司 核酸序列信息的空间定位
US20170130258A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-11 Agilent Technologies, Inc. Multiplex on-array droplet pcr and quantitative pcr
US20220106623A1 (en) * 2018-11-21 2022-04-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Spatial mapping of cells and cell types in complex tissues
WO2020123320A2 (en) * 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
US11501440B2 (en) * 2019-11-22 2022-11-15 10X Genomics, Inc. Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025129663A1 (zh) * 2023-12-22 2025-06-26 深圳华大生命科学研究院 Rna-蛋白质互作的检测方法
WO2025162175A1 (zh) * 2024-02-01 2025-08-07 深圳赛陆医疗科技有限公司 超高密度探针捕获的空间转录组芯片及其制备方法和应用

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