KR20060052710A - 기능성 ｄｎａ 요소와 세포 단백질의 게놈 지도작성 - Google Patents
기능성 ｄｎａ 요소와 세포 단백질의 게놈 지도작성 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전체 게놈(가령, 하나이상의 크로모좀 또는 크로모좀 영역과 같은 전체 게놈 또는 일부 구역)에서 DNA에 대한 단백질의 결합을 검사하는 방법을 제시한다. 특히, 본 발명은 목적 단백질이 결합하는 게놈 DNA의 조절 영역(가령, 프로모터 또는 인헨서 영역)을 확인하는 방법을 제시한다. 한 측면에서, 본 발명은 조직 관련된 조절을 주시한다. 다른 측면에서, 본 발명은 발달 관련된 조절을 주시한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 질병 상태 또는 질환에서 발현의 조절을 주시한다.
게놈 지도작성
Description
관련 출원에 대한 교차 인용
본 출원은 35 U.S.C. §119하에, 2003년 7월 3일자로 제출된 가출원 60/485,052에 우선권을 주장한다.
연방 정부로부터 연구 지원을 받은 연구에 관한 진술
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 Grant No. 5R33CA88351에 의해 부분적인 연구 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 게놈에서 단백질과 DNA 요소의 지도작성(mapping)에 관한다.
전사 조절은 RNA 합성을 활성화시키거나 억제하는 일정한 프로모터에 특이적으로 조합된 다수의 단백질 또는 단백질 복합체를 수반한다. 특이적인 조직 또는 세포형에서, 프로모터는 일련의 특이적인 인식 현상으로 작동될 수 있다. 전사 인자는 시스-작용 조절 서열에 결합한다; 이들 DNA 결합 단백질은 이후, 보조-활성인자 복합체를 동원하고, 이들 전활성화 복합체는 코어 전사 기구를 동원한다. 이런 순차적인 동원 기전은 효모에서 세포 주기동안 HO 유전자 프로모터에서 확인되었다(Cosma et al., 1999). 유사하게, 유전자는 히스톤을 변형하는 크로마틴 리모델링 인자를 비롯한 억제동안 서열-특이적 DNA 결합 단백질을 통한 전사 보조-억제인자 복합체의 동원으로 중지될 수 있고, 장기 분자 기억은 DNA 메틸화를 통한 특이적인 크로마틴 영역의 후생적 변형으로 확립된다.
DNA 결합 단백질 지역의 이해는 크로마틴 면역침전(ChIP) 검사에 의해 더욱 진전되고 있다. 상기 기술은 생체내에서 특이적인 DNA 결합 단백질 및 이들의 연관된 단백질 복합체와의 상호작용에 관여하고 많은 개별 사례 연구에 적용되고 있는 기능적 DNA 단편의 지도작성을 가능하게 한다. 원칙적으로, 이런 방식은 초고속 검출 방법이며, 유전자 조절 네트워크에 대한 시스템-수준 접근을 새로운 기회를 제공한다.
연구자들은 유전자 발현, DNA 복제, 또는 세포에서 크로모좀 권역의 확립에 관여하는 여부에 상관없이, 인간 게놈에 포함된 다양한 기능적 DNA 요소를 확인하기 위하여 노력하고 있다. 이런 목적을 달성하는데 이상적으로 적합한 소위 ChIP-on-Chip 기술이라고 하는 상기 방법은 인간 프로모터의 마이크로어레이를 보유하는 칩에서 초고속 검출과 결합된 ChIP 검사법이다.
ChIP 검사법은 전사 인자의 생체내 결합 부위의 위치를 확인하는데 폭넓게 이용되고 있다. 도 1A에서 도시된 바와 같이, 배양된 세포는 생체내에서 DNA와 결합 단백질 사이의 가교결합을 유도하는 포름알데히드로 처리한다. 처리된 세포는 파괴하고, 핵단백질은 회수한다. 이후, 초음파처리를 이용하여 DNA를 ~0.5 kb 조각 으로 무작위 전단한다. 가교결합에 의해 유도된 공유 결합으로 인하여, 특이적인 단백질은 단편화된 DNA와 여전히 결합 상태로 유지된다. 표적 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 DNA-단백질 복합체를 면역침전시킨다. 염색되고 면역침전된 물질은 조사중인 일정한 DNA 영역에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR로 분석한다. 면역침전이 목적 DNA 단편의 현저한 농축을 결과하면, 특이적인 생체내 상호작용을 추론할 수 있다.
ChIP 검사법은 전사와 DNA 복제 인자, 크로마틴 리모델링 인자, 변형된 히스톤, 메틸화된 DNA 등에 특이적인 표적을 검출하는데 이용된다. 더 나아가, 상기 검사법은 전사 RNA에 의해 가교된 RNA 결합 단백질과 DNA 요소의 특이적인 연합을 검출하는 데에도 이용되는데, 그 이유는 전사와 절단접합(splicing)이 세포에서 공간적으로 일시적으로 결합되는 것으로 알려져 있기 때문이다.
ChIP-on-Chip 기술은 선택된 DNA 표적에서 상세한 기계학적 의문을 해결하는데 이용되고 있다. 하지만, 염색되고 면역침전된 물질은 한 번에 하나씩 PCR로 분석해야 하는데, 이는 가용한 기능 정보에 기초한 표적 세트의 선택을 요한다. 간단히 말하면, 서열분석되고 주석된 효모 게놈으로부터 얻은 정보를 이용하여, 개별 유전자내 서열은 PCR-증폭하고 유리에 스팟(spot)하여 프로모터 마이크로어레이를 형성한다. 면역침전된 DNA 단편은 양 단부에서 프라이머-착륙 부위와의 결찰에 의해 연결되어 PCR에 의한 신호 증폭(즉, 결찰-매개된 PCR 또는 LM-PCR)을 가능하게 한다. PCR 증폭되고 면역침전된 물질은 무작위 증폭에 의해 상이한 형광 염료로 최종적으로 표지한다. 이후, 집합된 PCR 산물은 프로모터 어레이에 혼성화시켜 어떤 프로모터가 크로마틴 면역침전에 의해 특이적으로 농축되는 지를 검출한다.
도 1B에 도시된 바와 같이, ChIP-on-Chip 기술은 각 실험에서 108개 세포를 요구하기 때문에, 출발 물질이 제한되는 발달, 종양형성, 줄기 세포의 분석이 불가능하다. 이에 더하여, 마이크로어레이-기초한 방식은 특이성 문제에 직면하게 된다. ChIP-on-Chip의 개략적 설명은 도 1A-1B 및 아래 표1의 요약 비교에서 제시한다.
요약
본 발명은 생물체의 게놈에서 폴리뉴클레오티드-폴리펩티드 상호작용 도메인을 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 폴리펩티드에 결합된 폴리뉴클레오티드를 면역침전시키고;
b) 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 분리시키고;
c) 프라이머 쌍이 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, 상기 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;
d) 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에, 제 1 혼성화 복합체를 리가아제와 접촉시키고;
e) 상기 결찰 프로브를 보편적 프라이머로 증폭하여 증폭된 표지 산물을 산 출하고;
f) 증폭된 표지 산물을 올리고뉴클레오티드 어레이와 접촉시키고;
g) 검사 복합체를 검출하고, 여기서 복합체의 존재는 면역침전된 폴리펩티드에 결합하는 DNA를 지시한다.
또한, 본 발명은 목적 폴리펩티드가 결합하는 생존 세포의 게놈 영역을 확인하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 생존 세포에서 DNA 결합 폴리펩티드를 생존 세포의 게놈 DNA에 가교결합시켜 게놈 DNA에 가교결합된 DNA 결합 폴리펩티드를 포함하는 단백질-DNA 복합체를 산출하고;
b) a)에서 단백질-DNA 복합체의 DNA 단편을 발생시켜 DNA 결합 단백질이 결합된 DNA 단편을 포함하는 혼합물을 산출하고;
c) 목적 폴리펩티드가 결합된 DNA 단편을 b)에서 산출된 혼합물로부터 떼어내고;
d) c)의 DNA 단편을 목적 폴리펩티드로부터 분리하고;
e) 프라이머 쌍이 DNA 단편에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, 상기 DNA 단편을 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 분절에 특이적으로 설계되고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;
f) 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에, 제 1 혼성화 복합체를 리가아제와 접촉시키고;
g) f)의 결찰 프로브를 증폭하고;
h) 증폭 산물 및 게놈 DNA에 상보적인 서열 영역 사이에 혼성화가 진행되어 제 2 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, g)의 증폭 산물을 세포의 게놈 DNA에 상보적인 서열을 포함하는 DNA와 결합시키고;
i) h)의 제 2 혼성화 복합체를 확인하고, 여기서 제 2 혼성화 복합체는 목적 폴리펩티드가 결합하는 세포에서 게놈 영역을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 목적 폴리펩티드가 결합하는 생존 세포의 게놈 영역을 확인하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 생존 세포에서 DNA 결합 폴리펩티드를 생존 세포의 게놈 DNA에 가교결합시켜 게놈 DNA에 가교결합된 DNA 결합 폴리펩티드를 포함하는 단백질-DNA 복합체를 산출하고;
b) 단백질-DNA 복합체의 DNA 단편을 발생시켜 DNA 결합 단백질이 결합된 DNA 단편을 산출하고;
c) 목적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 DNA 단편을 면역침전시키고;
d) c)에서 확인된 DNA 단편을 목적 폴리펩티드로부터 분리하고;
e) 프라이머 쌍이 DNA 단편에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, 상기 DNA 단편을 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 분절에 특이적으로 설계되고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;
f) 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에, 제 1 혼성화 복합체를 리가아제와 접촉시키고;
g) 검출가능 표지로 표지된 보편적 프라이머를 이용하여 f)의 결찰 프로브를 증폭하고;
h) 증폭 산물 및 게놈 DNA에 상보적인 서열 영역 사이에 혼성화가 진행되어 제 2 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, g)의 증폭 산물을 세포의 게놈 DNA에 상보적인 서열을 포함하는 DNA와 결합시키고;
i) 표지에 특이적인 방법을 이용하여 h)의 제 2 혼성화 복합체를 확인하고, 여기서 제 2 혼성화 복합체는 목적 폴리펩티드가 결합하는 세포에서 게놈 영역을 포함하고;
j) i)에서 측정된 표지 양/강도를 대조의 양/강도와 비교하고, 게놈 영역에서 대조 표지의 양/강도보다 높은 양/강도는 목적 폴리펩티드가 결합하는 세포에서 상기 게놈 영역을 지시한다.
한가지이상 구체예의 상세는 청부된 도면 및 아래의 상세한 설명에서 기술한다. 다른 특징, 목적, 이점은 상세한 설명, 도면, 특허청구범위로부터 명확하다.
도 1A-B에서는 ChIP-on-Chip 기술을 도시한다. (A)에서는 가교-결합, 단편화, 크로마틴 면역침전, 링커-결찰, 증폭, Chip 분석 과정을 도시한다; (B)에서는 공통 반복부위(common repeat)의 혼성화에 의한 가양성(false positive)과 공통 반복부위의 교차-혼성화에 의한 가음성(false negative)의 발생을 비롯한 ChIP-on-CHIP에서 발생하는 일부 어려움을 도시한다.
도 2에서는 본 발명의 전반적인 과정을 도시한다. 가교-결합, 단편화, 면역침전, 비오틴화, 프라이머 어닐링, 고체상 선별, 결찰, 증폭, 칩 분석을 도시한다.
도 3A-B에서는 본 발명에 따른 방법의 특이성과 민감도를 입증하는 검사 결과를 도시한다.
도 4에서는 SAM 분석에 수반되는 LNCaP 세포에서 안드로겐 반응성 프로모터를 이용한 ChIP-DASL의 결과를 도시한다. 각 겔은 안드로겐의 존부하에 입력 DNA 쌍(IN+와 IN-) 및 안드로겐의 존부하에 농축된 입력 DNA 쌍(EN+와 EN-)을 포함한다.
도 5에서는 본 발명의 ChIP-DASL 검사를 이용한 2000개 인간 프로모터의 5배 스파이킹(spiking)으로부터 결과를 도시한다.
도 6에서는 본 발명의 방법을 이용한 에스트로겐 수용체 표적 유전자의 확인을 도시한다. 에스트로겐 항진제의 존부하에 과정을 도시한다. 또한, 칩 데이터의 SAM 분석 결과를 도시한다.
도 7에서는 베타-글로불린 좌우에서 타일링(tiling) 검사를 이용한 전사 단위의 지도를 도시한다.
도 8에서는 베타-글로불린 좌위에서 타일링(tiling)에 의한 전사 단위의 지도를 도시한다. ChIP-Chip에 비하여 ChIP-DASL 방법의 민감도를 도시한다.
도 9는 비교 게놈 혼성화(Comparative Genomic Hybridization, CGH), DNA 복제, DNase I 과민성에서 본 발명에 따른 방법의 활용을 도시하는 개요도이다.
본 명세서에서, 단수 형태는 달리 명시하지 않는 경우에 복수 대상을 포함한다. 따라서, 가령, “프로브”에 대한 언급은 이들 세포의 복수 대상을 포함하고, “프라이머”에 대한 언급은 하나이상의 형질전환 벡터 및 당분야에 공지된 이들의 등가물을 포함한다.
달리 정의하지 않는 경우에, 본 명세서에 이용된 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 인지되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 세포, 유전자가 본 발명의 방법과 조성물의 실시 또는 검사에 이용될 수 있긴 하지만, 전형적인 방법, 장치, 재료를 아래에 기술한다.
본원에 언급된 모든 간행물은 본 발명의 상세한 설명과 관련하여 이용될 수 있는 기존 문헌에 언급된 세포주, 벡터, 방법을 기술하고 개시하는 목적으로 본원에 통합된다. 상기한 간행물은 본원의 출원일에 앞서 이들의 공개를 위하여 제공된다. 본원에 언급된 어떤 간행물도 본 출원을 앞서는 것으로 간주되지 않는다.
DNA-결합 단백질이 전체적인 유전자 발현, 크로모좀 복제, 세포 증식을 어떻게 조절하는 지는 DNA 결합 단백질이 생체내에서 기능하는 크로모좀 위치의 확인에 의해 더욱 용이하게 이해된다. 본 발명은 조절된 DNA 요소와 단백질 조절인자의 전체 게놈에서 지도작성 방법에 관한다.
RASL(RNA 어닐링 선별과 결찰의 경우)로 지칭되는 절차는 마이크로어레이 방식과 일반적으로 관련된 특이성 문제를 해결하는데 이용되고 있다. 5' 교대성 절단접합에서, 예로써 공통 3' 절단접합 부위와 경쟁하는 2개의 5' 절단접합 부위가 존재한다. 3개의 올리고는 도표에 제시된 바와 같이, 각 절단접합 부위 접점에서 20개 뉴클레오티드 엑손 서열을 표적하는데 이용된다. 2개의 경쟁 3' 절단접합 부위를 구별하기 위하여, 각 5' 올리고에 특이적인 20개 뉴클레오티드 인덱스 서열(1 또는 2, 각각 적색과 녹색으로 표지됨)이 이용된다. RASL 검사는 아래의 과정을 수반한다: (1) 어닐링, (2) 고체상 선별, (3) 결찰, (4) PCR 증폭, (5) 보편적 인덱스 어레이에서 검출.
본 발명에서는 ChIP-on-Chip 기술과 조합으로 RNA 어닐링 선별과 결찰(RASL) 기술을 이용한다. 이런 조합은 “ChIP-DASL”이라 한다. ChIP-DASL 방법의 구체예는 도 2에서 제시한다.
본 발명은 전체 게놈(가령, 하나이상의 크로모좀 또는 크로모좀 영역과 같은 전체 게놈 또는 일부 구역)에서 DNA에 대한 단백질의 결합을 검사하는 방법을 제시한다. 한 측면에서, 본 발명은 목적 단백질이 결합하는 게놈 DNA의 조절 영역(가령, 프로모터 또는 인헨서 영역)을 확인하는 방법을 제시한다. 다른 측면에서, 본 발명은 조직 관련된 조절을 주시한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 발달 관련된 조절을 주시한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 질병 상태 또는 질환에서 발현의 조절을 주시한다.
본 발명의 방법은 결합 단백질이 전사 인자인지를 결정하는 능력을 또한 제공한다. 상기한 바와 같이, 결합 단백질이 상호작용하는 폴리뉴클레오티드(가령, DNA)는 게놈 단편(가령, 칩에서)에 혼성화된다. 결찰 프로브가 칩에서 게놈 단편에 결합하고 칩에서 게놈 단편이 생물체의 게놈에서 조절 영역인 것으로 알려져 있으면, 결찰 프로브에 상응하는 폴리뉴클레오티드는 조절 영역으로서 확인되고 목적 단백질은 전사 인자가 된다.
본 발명의 방법은 진핵 생물체의 전체 게놈에서 DNA 결합 단백질을 검사하거나 확인하는데 이용될 수 있다. DNA에 결합하는 다양한 DNA 결합 단백질을 분설할 수 있다. 가령, DNA 복제 또는 전사 조절에 관여하는 임의의 단백질이 본 발명의 방법으로 검사될 수 있다.
조절 영역의 확인과 분리를 위한 다른 방법에서, 조절 DNA의 농축은 활발하게 전사된 유전자의 크로마틴이 일반적으로 아세틸화된 히스톤을 포함하는 사실을 이용한다(참조: Wolffe et al., Cell 84:817-819, 1996). 특히, 아세틸화된 H3과 H4는 전사된 유전자의 크로마틴에서 농축되고, 조절 서열을 포함하는 크로마틴은 아세틸화된 H3과 선별적으로 연결된다. 따라서, 아세틸화된 히스톤, 특히, 아세틸화된 H3에 대한 항체를 이용한 크로마틴 면역침전은 조절 DNA에서 농축된 서열의 집합을 획득하는데 이용될 수 있다. 이런 항체의 실례에는 Upstate Biotechnology, Lake Placid, N.Y로부터 구입가능한 항-아세틸화된 히스톤 H3이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
이런 방법은 일반적으로, 크로마틴을 단편화시키고, 이후 아세틸화된 히스톤, 특히, H3을 특이적으로 인식하고 결합하는 항체와 이들 단편을 접촉시키는 단계를 수반한다. 면역침전물로부터 폴리뉴클레오티드는 면역침전물로부터 후속적으로 수집될 수 있다. 크로마틴을 단편화시키기에 앞서, 아세틸화된 히스톤을 인접한 DNA에 선택적으로 가교결합시킬 수 있다. 크로마틴 내에서 DNA에 히스톤의 가교결합은 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 한가지 방식은 크로마틴을 자외선 방사에 노출시키는 것이다(Gilmour et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:4275-4279, 1984). 다른 방식은 화학적 가교결합제를 이용한다. 적절한 화학적 가교결합제에는 포름알데히드와 프소렐란이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(Solomon et al., Proc. NatL. Acad. Sci. USA 82:6470-6474, 1985; Solomon et al., Cell 53:937-947, 1988).
세포 크로마틴에서 특정 정의된 전사 인자에 대한 결합 부위의 확인은 조절 서열의 존재를 지시한다. 이는 예로써, 크로마틴 면역침전 기술을 이용하여 달성할 수 있다. 이런 기술은 상응하는 항원(본 발명의 경우에, 목적 전사 인자)을 포함하는 크로마틴 복합체를 면역침전시키는 특정 항체의 이용 및 면역침전물에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 검사를 수반한다. 항체에 의한 항원에 결합된 특정 폴리뉴클레오티드의 면역침전은 항원과 폴리뉴클레오티드(가령, 조절 도메인)의 상호작용을 지시한다(O'Neill et al., in Methods in Enzymology, Vol. 274, Academic Press, San Diego, 1999, pp. 189-197; Kuo et al., Method 19:425-433, 1999; Current Protocols in Molecular Biology, F.: M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Chapter 21, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,(1998 Supplement)).
도 1에 도시된 바와 같이, 한 측면에서, 상기 방법은 변형된 크로마틴 면역침전(CHIP) 절차를 DNA 마이크로어레이 분석과 병합한다. 폴리뉴클레오티드(가령, DNA)와 단백질은 가교결합시키고(가령, 세포는 포름알데히드로 고정된다) 초음파처리로 수집하며, 결합 단백질 또는 목적 단백질에 가교결합된 폴리뉴클레오티드 단편은 예로써, 특정 항체를 이용한 면역침전으로 농축시킨다. 가교결합의 반전이후, 농축된 폴리뉴클레오티드는 프라이머 쌍이 폴리뉴클레오티드 단편에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역을 포함하고, 제 1 구역은 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 폴리뉴클레오티드 단편의 상류와 하류 분절에 특이적으로 설계되고, 프라이머 쌍에서 한 프라이머는 제 1 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 다른 프라이머는 제 2 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다. 제 2 혼성화 복합체는 폴리뉴클레오티드 단편에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에 리가아제와 접촉시킨다. 결찰 프로브는 보편적 프라이머로 증폭하여 증폭-표지된 산물을 발생시킨다. 가령, 증폭은 형광 염료와 결찰-매개된 PCR(LM-PCR)을 이용하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 예로써 면역침전으로 농축화되지 않은 폴리뉴클레오티드 역시 상이한 형광단의 존재하에 LM-PCR에 적용시키고, 표지된-산물의 농축된 풀(pool)과 농축되지 않은 풀 모두 DNA 마이크로어레이에 혼성화시킨다. 복수의 독립된 실험으로부터 획득된 형광 강도의 농축/비농축 비율은 어레이에서 대표되는 각 서열에 대한 결합 단백질(가령, 목적 폴리펩티드)의 상대적 결합을 산정하는 가중 평균 분석 방법과 병용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 폴리뉴클레오티드에 결합하는 단백질은 당분야에 공지된 가교결합 기술(가령, UV 광, 프소렐란 및/또는 포름알데히드)을 이용하여 가교결합시킨다. 생성 혼합물은 단백질 결합된 폴리뉴클레오티드 및 단백질에 의해 결합되지 않은 폴리뉴클레오티드를 모두 포함한다.
혼합물은 이후, 혼합물에서 폴리뉴클레오티드가 분획되도록 처리한다. 분획 기술은 당분야에 공지되어 있는데, 여기에는 예로써 더욱 작은 게놈 단편을 발생시키는 전단 기술이 포함된다. 단편화는 크로마틴을 단편화시키는 확립된 방법, 예를 들면, 초음파처리, 전단 및/또는 제한 효소의 이용으로 달성할 수 있다. 생성 단편은 크기가 가변적이다. 한 측면에서, 초음파처리 기술을 이용하는 경우에, 대략 200-400개 뉴클레오티드 단편을 획득할 수 있다. 결과적으로, 결합 단백질에 가교결합된 폴리뉴클레오티드 단편(가령, 단백질-DNA 복합체)이 산출된다.
단백질-폴리뉴클레오티드 복합체/단편은 침전 기술로 혼합물로부터 떼어낼 수 있다. 이런 기술에는 예로써, 혼합물에서 단백질 표적에 대한 항체의 이용이 포함된다. 예를 들면, 목적 결합 단백질에 (특이적으로) 결합하는 항체(가령, 다클론, 단클론) 또는 이의 항원 결합 단편을 이용한 면역침전을 이용할 수 있다. 이에 더하여, 목적 단백질은 예로써 항체 에피토프(가령, 헤마글루티닌(HA))를 이용하여 표지하거나 표식할 수 있다. 생성된 실질적으로 정제된(즉, 농축된) 가교결합된 단백질-폴리뉴클레오티드 단편은 결합 단백질이 폴리뉴클레오티드로부터 분리되도록 처리한다. 이후, 폴리뉴클레오티드 단편은 폴리뉴클레오티드 단편과 올리고뉴클레오티드 프라이머 사이에 혼성화가 진행되는 조건하에, 폴리뉴클레오티드 단편에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브와 병합한다.
본 발명의 방법은 결합 단백질이 전사 인자인지를 결정하는 능력을 또한 제공한다. 상기한 바와 같이, 결합 단백질이 상호작용하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 단편(가령, 칩에서)에 혼성화된다. 폴리뉴클레오티드가 칩에서 DNA 단편에 결합하고 칩에서 DNA 단편이 생물체의 게놈에서 조절 영역인 것으로 알려져 있으면, 폴리뉴클레오티드는 조절 영역으로서 확인되고 목적 단백질은 전사 인자가 된다.
복수의 프로브(이후, “혼성화 프로브”)는 적어도 2개의 구역을 포함한다: 제 1 구역은 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 “보편적 프라이머 착륙 부위”를 포함한다. 2가지 상이한 혼성화 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 분절에 특이적으로 설계된다. 상류 혼성화 프로브는 제 1 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 하류 혼성화 프로브는 제 2 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함한다. 제 1과 제 2 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다. 보편적 프라이머 착륙 부위의 실례는 T7과 T3 보편적 프라이머 착륙 부위이다. 본 발명의 한 측면에서, 제 1 보편적 프라이머 착륙 부위는 T7 프라이머 착륙 부위이고, 제 2 보편적 프라이머 착륙 부위는 T3 프라이머 착륙 부위이다.
이들 혼성화 프로브는 사전 증폭없이 샘플로부터 ChIP으로 획득된 농축된 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성한다. 본 발명의 프로브와 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 프로브 또는 프라이머의 혼성화가 진행되도록 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 적어도 한 구역을 보유하도록 설계된다. 후술한 바와 같이, 이런 상보성(complementarity)은 완전한 필요는 없다; 표적 폴리뉴클레오티드와 본 발명의 단일 가닥 혼성화 프로브 사이의 혼성화를 간섭하는 임의의 염기쌍 부정합(mismatch)이 존재할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 “실질적으로 상보적인”은 프로브가 중간 내지 높은 엄밀도 조건하에 혼성화되는 표적 폴리뉴클레오티드에 충분히 상보적임을 의미한다.
따라서, 검사는 일반적으로, 엄밀도 조건하에 수행되는데, 이는 표적의 존재하에서만 제 1 혼성화 복합체의 형성을 허용한다. 엄밀도는 온도, 포름아마이드 농도, 염 농도, 무질서(chaotropic) 염 농도, pH, 유기 용제 농도, 이들의 조합을 비롯한 열역학 변수인 단계 모수(step parameter)를 변형함으로써 조절할 수 있다.
이들 모수는 U.S. Pat. No. 5,681,697에 개략적으로 기술된 바와 같이, 비-특이적 결합을 조절하는 데에도 이용될 수 있다. 따라서, 비-특이적 결합을 감소시키기 위하여 높은 엄밀도 조건에서 특정 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
높은, 중간, 낮은 엄밀도 조건을 비롯하여 다양한 혼성화 조건이 본 발명에 이용될 수 있다(참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1 989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.). 엄밀도 조건은 서열-의존하고 상황에 따라 달라진다. 긴 서열일수록 더욱 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 폭넓은 보도는 Tigesen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)에서 확인된다. 일반적으로, 엄밀도 조건은 정의된 이온 강도와 pH에서 특이적인 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 대략 5-10℃ 낮게 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태(Tm에서 표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%가 평형 상태에서 점유된다)에서 폴리아데닐화된 mRNA 표적 서열에 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도, pH, 핵산 농도에서)이다. 엄밀도 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 1.0M 이하 나트륨 이온, 전형적으로 대략 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(가령, 10 내지 50개 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 30℃, 긴 프로브(가령, 50개 초과 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 60℃인 조건이다. 엄밀도 조건은 포름아마이드와 같은 나선 불안정화제의 첨가로 달성될 수도 있다. 혼성화 조건은 당분야에 공지된 바와 같이, 비-이온성 골격, 즉, PNA가 이용되는 경우에도 변화된다. 이에 더하여, 표적 결합이후 혼성화 복합체의 두 가닥을 가교-결합, 즉, 공유 부착시키기 위하여 가교-결합제가 추가될 수 있다.
단백질이 결합하는(가령, 목적 단백질이 결합하는) 농축된 폴리뉴클레오티드 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드(가령, DNA)는 다양한 방법으로 혼성화될 수 있다. 예를 들면, 상보성 분자는 유리 슬라이드(가령, Corning Microarray Technology(CMTTM) GAPSTM)또는 마이크로칩에 고정될 수 있다. 전형적으로, 혼성화 조건은 예로써, 높은 엄밀도 조건 및/또는 중간 엄밀도 조건을 수반한다(참조: Current Protocols in Molecular Biology에서 2.10.1-2.10.16(특히, 2.10.8-11) 페이지와 6.3.1-6 페이지). 프로브 길이, 염기 조성, 혼성화 서열간 부정합 비율, 온도, 이온 강도와 같은 인자가 혼성화의 안전성에 영향을 준다. 따라서, 높은 또는 중간 엄밀도 조건은 경험적으로 결정될 수 있고, 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA) 및 혼성화가 분석되는 다른 핵산의 특성에 부분적으로 좌우된다. 일반적으로, 엄밀도 조건은 정의된 이온 강도와 pH에서 특이적인 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 대략 5-10℃ 낮게 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태(Tm에서 표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%가 평형 상태에서 점유된다)에서 표적 서열에 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도, pH, 핵산 농도에서)이다. 엄밀도 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 1.0M 이하 나트륨 이온, 전형적으로 대략 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(가령, 10 내지 50개 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 30℃, 긴 프로브(가령, 50개 초과 뉴클레오티드)에 대하여 적어도 60℃인 조건이다. 엄밀도 조건은 포름아마이드와 같은 나선 불안정화제의 첨가로 달성될 수도 있다. 선별적 또는 특이적 혼성화를 위하여, 양성 신호(가령, 핵산의 확인)는 대략 2배 배경 혼성화이다. 본 발명에서, 중간 엄밀도 혼성화 조건은 혼성화가 25 mM KPO4(pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhart's solution), 50 ㎍/㎖ 변성되고 초음파처리된 연어 정자 DNA, 50% 포름아마이드, 10% 덱스트란 설페이트, 1-15 ng/㎖ 프로브를 함유하는 혼성화 용액에서 대략 42℃에서 수행되고, 세척이 2X SSC와 0.1% 황산 도데실 나트륨을 함유하는 세척 용액으로 대략 50℃에서 수행된다는 것을 의미한다. 높은 엄밀도 혼성화 조건은 혼성화가 25 mM KPO4(pH 7.4), 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhart's solution), 50 ㎍/㎖ 변성되고 초음파처리된 연어 정자 DNA, 50% 포름아마이드, 10% 덱스트란 설페이트, 1-15 ng/㎖ 프로브를 함유하는 혼성화 용액에서 대략 42℃에서 수행되고, 세척이 0.2X SSC와 0.1% 황산 도데실 나트륨을 함유하는 세척 용액으로 대략 65℃에서 수행된다는 것을 의미한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 프라이머와 프로브의 크기는 변하는데, 프로브의 각 구역 및 프로브의 전체 길이는 일반적으로 5 내지 500개 뉴클레오티드이다. 각 구역은 용도와 증폭 기술에 따라, 전형적으로 10 내지 100개, 15 내지 50개, 10 내지 35개 뉴클레오티드를 보유한다. 예를 들면, 프로브의 각 보편적 증폭 부위는 대략 15-25개 뉴클레오티드 길이를 보유하며, 20개 뉴클레오티드 길이가 가장 빈번하게 이용된다. 프로브의 어댑터 서열은 5-25개 뉴클레오티드 길이를 보유하며, 10-20개 뉴클레오티드가 가장 일반적이다. 프로브의 표적 특이적인 구역은 전형적으로 15-50개 뉴클레오티드 길이를 보유하며, 20 내지 40개 가장 일반적이다.
따라서, 본 발명은 제 1 혼성화 프로브 세트를 제시한다. 본 발명에서 “프로브 세트”는 특정 다중 검사에 이용되는 복수의 혼성화 프로브를 의미한다. 본 명세서에서, 복수는 검사법, 샘플, 검사 목적에 따라 적어도 2개를 의미하지만, 10개 이상을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 보편적 증폭 부위를 포함하는 혼성화 프로브 세트를 제시한다. 본 명세서에서 “보편적 증폭 부위”는 증폭을 위하여 PCR 프라이머에 결합하는 프로브 서열을 의미한다. 각 프로브 세트는 상류 보편적 증폭 부위(UUP) 및 하류 보편적 증폭 부위(DUP)를 포함한다. 다시 말하면, “상류”와 “하류”는 특정 5-3' 방향을 의미하지 않고, 시스템의 방향에 좌우된다. 전형적으로, 단일 UUP 서열과 단일 DUP 서열이 프로브 세트에 이용되지만, 당업자가 인지하는 바와 같이 상이한 검사법 또는 상이한 다중 분석에 복수의 보편적 증폭 서열이 이용될 수 있다. 이에 더하여, 보편적 증폭 부위는 전형적으로, 혼성화 프로브 세트(또는 결찰 프로브)의 5'와 3' 말단에 위치하는데, 그 이유는 증폭 서열이 측면에 위치하는 접하는 서열만 증폭되기 때문이다.
이에 더하여, 보편적 증폭 서열은 검사의 특이성을 담보하기 위하여 특정 검사법과 숙주 게놈에 가능한 특이적으로 선택된다. 일반적으로, 보편적 증폭 서열은 대략 5 내지 35개 염기쌍 크기이며, 대략 15 내지 20개가 전형적이다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 2가지 증폭 부위의 방향은 상이하다. 다시 말하면, 한 PCR 프라이머는 제 1 보편적 증폭 부위에 직접적으로 혼성화되고, 다른 PCR 프라이머는 제 2 보편적 증폭 부위의 보체에 혼성화된다. 달리 말하면, 제 1 보편적 증폭 부위는 센스 방향이고, 제 2 보편적 증폭 부위는 안티센스 방향이다.
보편적 증폭 부위 이외에, 프로브 세트의 각 혼성화 프로브는 적어도 제 1 표적-특이적 서열을 포함한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 표적-특이적 서열은 프로브의 용도에 따라, 다양한 형식을 취한다. 예를 들면, 프라이머 선별 프로그램을 통하여, 특이적인 40-mer 올리고뉴클레오티드는 인간 게놈에서 일정한 영역(가령, 프로모터)을 대표하도록 선별된다. 이런 과정은 인간 게놈 데이터베이스에 대한 BLAST 검색이후 게놈의 관련 서열에서 적어도 4개의 균일하게 분포된 부정합을 허용함으로써 이의 특이성을 검증한다. 선별된 서열은 작은 반복부위를 히피하고 정의된 범위(가령, 대략 55 내지 65℃)에서 Tm을 보유하며 최소화된 이차 구조(△G로 산정됨)를 보유한다. 병렬적으로, 아미노-유래된 올리고는 합성되고 기질(가령, Motorola 3D 코드링크 슬라이드)에 스팟되어 올리고-기초한 어레이(가령, 프로모터 어레이)를 형성한다. 올리고머는 본질적으로 2개로 분할되고(가령, 올리고머가 40-mer인 경우, 2개의 20-mer로 분할된다), 보편적 프라이머와 병합되어 상류와 하류 혼성화 프로브가 되는 표적 특이적 서열을 제공한다.
2개의 혼성화 프로브는 OLA 검사 시스템에 이용될 수 있다. 기본적 OLA 방법은 적어도 2가지 상이한 방식으로 수행될 수 있다; 제 1 구체예에서, 한 가닥의 표적 서열만 결찰을 위한 주형으로 이용된다; 대안으로, 양 가닥이 이용될 수 있다; 후자는 일반적으로, 결찰 연쇄 반응 또는 LCR이라 한다(참조: U.S. Pat. No. 5,185,243, 5,573,907; EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439 182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; WO 89/09835). 하기에서는 OLA에 중심하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, LCR에도 용이하게 적용될 수 있다.
이런 구체예에서, 혼성화 프로브는 적어도 제 1 혼성화 프로브 및 제 2 혼성화 프로브를 포함한다. 상기 방법은 2개의 프로브가 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되고 두 프로브 사이의 접점에 완전한 상보성 존재한다면 서로 결찰된다는 사실에 기초하긴 하지만, 이는 양 프로브의 전장에서 완전한 상보성이 존재해야 한다는 것을 의미하지는 않는다.
한 구체예에서, 2개의 혼성화 프로브는 각각 표적 특이적 구역을 보유하도록 설계된다. 제 1 혼성화 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드(가령, 폴리뉴클레오티드 단편)의 제 1 표적 도메인에 실질적으로 상보적으로 설계되고, 제 2 혼성화 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드(가령, 폴리뉴클레오티드 단편)의 제 2 표적 도메인에 실질적으로 상보적으로 설계된다. 일반적으로, 혼성화 프로브의 각 표적 특이적 서열은 적어도 5개 뉴클레오티드 길이를 보유하며, 전형적으로 대략 15 내지 30개, 특히 20개이다. 한 구체예에서, 제 1과 제 2 표적 도메인은 직접적으로 인접한다, 예를 들면, 이들은 개입 뉴클레오티드(intervening nucleotide)를 보유하지 않는다. 이런 구체예에서, 적어도 제 1 혼성화 프로브는 제 1 표적 도메인에 혼성화되고, 제 2 혼성화 프로브는 제 2 표적 도메인에 혼성화된다. 접점에서 완전한 상보성이 존재하는 경우에, 이들 두 프로브가 서로 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 결찰 구조가 형성된다. 이런 상보성이 존재하지 않는 경우에, 결찰 구조는 형성되지 않고, 프로브는 상당한 수준까지 서로 결찰되지 않는다. 추가적인 반응을 위한 주형으로서 기능할 수 있도록 결찰 프로브를 표적 폴리뉴클레오티드로부터 변성시키는 작업은 열 사이클링을 이용하여 수행한다. 상기 방법은 dNTP와 중합효소가 추가되는 경우에, 3개의 혼성화 프로브 또는 하나이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되는 혼성화 프로브를 이용하여 수행할 수도 있다(이는 “Genetic Bit” 분석이라 한다).
이런 구체예에서, 2개의 혼성화 프로브는 직접적으로 인접하지 않는다. 상기 구체예에서, 이들은 하나이상의 염기에 의해 분리된다. dNTP와 중합효소의 추가는 결찰 반응이후 간격을 “메우는데” 이용된다. 이는 결찰 프로브의 형성을 가능하게 한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 핵산 동족체는 본 발명에서 프라이머와 프로브로서 이용된다. 이에 더하여, 자연 발생 핵산과 동족체의 혼합물을 제조될 수 있다. 대안으로, 서로 다른 핵산 동족체의 혼합물 및 자연 발생 핵산과 동족체의 혼합물이 제조될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 핵산 동족체를 보유하는 펩티드 핵산(PNA)이 이용될 수 있다. 이들 골격은 자연 발생 핵산의 극도로 하전된 포스포디에스테르 골격에 대조적으로, 중성 환경에서 실질적으로 비-이온성이다. 이는 2가지 이점을 결과한다. 첫째, PNA 골격은 향상된 혼성화 동역학을 보인다. PNA는 부정합 염기쌍 vs. 완전한 정합 염기쌍에 대한 용융 온도(Tm)에서 더욱 많은 변화를 보인다. DNA와 RNA는 전형적으로, 내부 부정합에 대하여 Tm에서 2-4℃ 감소를 보인다. 비-이온성 PNA 골격의 경우, 감소는 7-9℃에 근접한다. 유사하게, 이들의 비-이온성 특성으로 인하여, 이들 골격에 부착된 염기의 혼성화는 염 농도에 상대적으로 무감하다.
혼성화 프로브 또는 프라이머는 디옥시리보-와 리보-뉴클레오티드의 조합 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 히폭사타닌, 이소시토신, 이소구아닌 등을 비롯한 염기의 임의 조합을 보유한다. 한 구체예에서, 이소시토신과 이소구아닌이 프라이머와 프로브에 이용되는데, 그 이유는 이들이 비-특이적 혼성화를 감소시키기 때문이다((U.S. Pat. No. 5,681,702). 본 명세서에서, “뉴클레오시드”는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 뉴클레오티드 동족체, 변형된 뉴클레오시드(가령, 아미노 변형된 뉴클레오시드)를 포괄한다. 이에 더하여, “뉴클레오시드”는 비-자연 발생 동족체 구조를 포괄한다. 따라서, 각각 하나의 염기를 보유하는 펩티드 핵산의 개별 단위를 뉴클레오시드라고 한다.
결찰이후, 비-혼성화된 DNA와 혼성화 프로브는 제거한다. 한 측면에서, 이는 하이브리드 복합체를 비롯한 모든 비오틴화된 DNA를 특이적으로 유지할 수 있는 스트렙타비딘 서포트를 이용하여 달성된다. 예를 들면, 한 측면에서, 샘플의 폴리뉴클레오티드는 혼성화 프로브와의 접촉에 앞서 비오틴화된다. 따라서, 혼성화 프로브와의 접촉 이전에, 접촉 동안 또는 접촉 이후에, 비오틴화된 폴리뉴클레오티드는 비오틴화된 폴리뉴클레오티드를 스트렙타비딘 기질과 접촉시킴으로써 고체상 선별된다.
예를 들면, ChIP 이전에 또는 이후에, 폴리뉴클레오티드는 비오틴화된다. 폴리뉴클레오티드-폴리펩티드 복합체가 폴리펩티드를 보유하지 않는 폴리뉴클레오티드로부터 분리되면, 비오틴화된 폴리뉴클레오티드는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통하여 고체상에 결합된다.
한 측면에서, 비-혼성화 프로브가 제거되면, 하이브리드는 결찰을 수행한다. 결찰 프로브는 상류와 하류 보편적 증폭 서열에 혼성화되는 보편적 프라이머를 이용하여 동시에 증폭될 수 있다. 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있는 생성 앰플리콘(amplicon)은 어레이에서 검출될 수 있다. 이는 표적 폴리뉴클레오티드의 검출과 정량을 가능하게 한다.
가령, 비-혼성화 프로브(목적하지 않는 샘플로부터 부가적인 다른 핵산 분자)가 제거되면, 결찰 프로브는 변성하고 증폭하여 앰플리콘을 형성하는데, 이는 후속으로 검출된다. 이런 과정은 PCR 증폭과 롤링 서클 증폭을 비롯한 여러 방식으로 수행될 수 있다. 이에 더하여, 아래에 개략적으로 기술한 바와 같이, 표지는 여러 방식으로 앰플리콘에 함입될 수 있다.
본 발명의 방법에서 폴리뉴클레오티드는 예로써, 결찰-매개된 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 증폭할 수 있다(가령, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al., eds. 199l).
면역침전물로부터 분리된 폴리뉴클레오티드는 클론하여 라이브러리를 산출하거나 서열분석할 수 있고, 생성 서열은 데이터베이스를 조밀하게 하는데 이용할 수 있다. 상기 방법으로 검출된 것들에 인접하는 폴리뉴클레오티드 역시 조절 영역일 가능성이 높다. 이들은 크로마틴 샘플이 수득된 생물체로에 대한 게놈에서, 분리된 폴리뉴클레오티드의 지도를 작성함으로써 확인하고, 한가지이상의 데이터베이스에 입력할 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 거의 모든 생물체의 체액(가령, 혈액, 소변, 혈청, 림프, 타액, 항문과 질 분비액, 땀, 정액)을 비롯한 샘플로부터 수득될 수 있으며, 포유동물 샘플, 특히, 인간 샘플이 본 발명의 방법에 전형적이다. 샘플은 일차 세포(박테리아 포함) 및 모든 유형의 종양 세포(특히, 흑색종, 골수성 백혈병, 폐, 유방, 난소, 결장, 신장, 전립선, 췌장, 고환의 암종); 심근세포; 내피 세포; 상피 세포; 림프구(T-세포와 B 세포); 비만 세포; 호산구; 혈관 내벽 세포; 간세포; 단핵 백혈구를 비롯한 백혈구; 조혈, 신경, 피부, 폐, 신장, 간, 심근 줄기 세포와 같은 줄기 세포; 파골세포; 연골세포와 다른 연결 조직 세포; 각화세포; 멜라닌세포; 간 세포; 신장 세포; 지방 세포를 비롯한 세포주를 보유한다. 적절한 세포에는 Jurkat T 세포, NIH3T3 세포, CHO, Cos, 923, HeLa, WI-38, Weri-l, MG-63 등을 비롯한 공지된 연군 세포가 포함된다(ATCC 세포주 목록 참조).
폴리뉴클레오티드는 공지된 기술을 이용하여 샘플로부터 제조된다. 가령, 샘플은 용해 완충액, 초음파처리 기술, 전기천공 등을 이용하여, 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 용해되도록 처리한다.
표적 폴리뉴클레오티드에는 적어도 20개 염기 길이 뉴클레오티드의 다형성 형태가 포함된다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 유래 생물체의 자연 발생 게놈에서 즉시 연속하는 코딩 서열(5' 말단에서 하나와 3' 말단에서 하나) 중에서 하나와 즉시 연속하지 않는 폴리뉴클레오티드이다. 이런 이유로, 여기에는 예로써, 용액이나 마이크로어레이 칩에 존재하는 게놈 단편뿐만 아니라 벡터에; 자동으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스에; 또는 다른 서열과 독립적으로 별개 분자(가령, cDNA)로서 존재하는 원핵생물이나 진핵생물의 게놈 DNA에 통합된 재조합 DNA가 포함된다. 본 발명의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 또는 양 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 여기에는 단일과 이중 가닥 형태의 DNA가 포함된다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 폴리뉴클레오티드는 특히, 단일-과 이중-가닥 DNA; 단일-과 이중-가닥 영역의 혼합체인 DNA; 단일-과 이중-가닥 RNA; 단일-과 이중-가닥 영역의 혼합체, DNA 및 단일-가닥 또는 더욱 전형적으로 이중-가닥인 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 또는 단일-과 이중-가닥의 혼합체인 RNA를 의미한다.
이에 더하여, 폴리뉴클레오티드에는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역이 포함된다. 이런 영역에서 가닥은 동일 분자 또는 상이한 분자로부터 유래될 수 있다. 이들 영역은 한가지이상 분자의 전체를 보유할 수 있긴 하지만, 더욱 전형적으로 상기 분자 중에서 일부의 영역만을 수반한다. 삼중-나선 영역의 분자 중에서 하나는 올리고뉴클레오티드이다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드(가령, 프로브, 프라이머 또는 프라이머 쌍)에는 하나이상의 변형된 염기를 보유하는 상기한 DNA 또는 RNA가 포함된다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 변형된 골격을 보유하는 DNA 또는 RNA는 핵산 분자이다. 게다가, 2가지 실례로서 특이한 염기, 예를 들면, 이노신, 또는 변형된 염기, 예를 들면, 트리틸화된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 본 명세서에서 동일한 의미의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다.
당업자에게 공지된 다양한 목적으로 기능하는 DNA와 RNA에 다양한 변형이 가능하다. 폴리뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드에는 특히, 단순 세포와 복합 세포를 비롯한 바이러스와 세포의 특징적인 DNA와 RNA의 화학적 형태뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드의 이와 같은 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태가 포함된다.
표적 폴리뉴클레오티드는 인접(즉, 연속)하거나 분리된 서로 다른 표적 도메인으로 구성될 수도 있다. 가령, OLA 기술에서, 제 1 혼성화 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드에서 제 1 표적 도메인에 혼성화되고, 제 2 혼성화 프로브는 제 2 표적 도메인에 혼성화된다. 이들 도메인은 즉시 인접하거나, 또는 하나이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. “제 1”과 “제 2”는 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-3' 방향으로의 서열 방향을 의미하지 않는다. 가령, 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-3' 방향을 가정한다면, 제 1 표적 도메인은 제 2 도메인의 5', 또는 제 2 도메인의 3'에 위치할 수 있다. 이에 더하여, 당업자가 인지하는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 어레이의 표면에서 프로브는 자유 3' 말단 또는 자유 5' 말단을 보유하도록 한쪽 방향으로 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로브는 하나이상의 내부 위치, 또는 양 말단 모두에 부착될 수 있다.
반응물의 구성요소는 동시에, 또는 임의의 순서로 순차적으로 추가될 수 있는데, 전형적인 구체예는 아래에 개략적으로 기술한다. 이에 더하여, 반응물은 검사에 포함되는 다양한 다른 시제를 함유할 수 있다. 이런 다른 시제에는 염, 완충액, 중성 단백질, 예를 들면, 알부민, 세정제 등이 포함되는데, 이들은 최적 혼성화와 검출을 조정하거나, 또는 비-특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키는데 이용된다. 샘플 제조 방법과 폴리뉴클레오티드의 순도에 따라, 검사의 효율을 개선하는 시제, 예를 들면, 프로테아제 저해물질, 뉴클레아제 저해물질, 항생제 역시 사용될 수 있다.
이에 더하여, 대부분의 구체예에서, 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드는 프라이머와 다른 프로브의 혼성화가 가능해지도록 단일 가닥으로 변성된다. 전형적인 구체예는 일반적으로, 반응물의 온도를 대략 95℃로 상승시키는 열 단계를 이용하지만, pH 변화와 다른 기술 역시 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 증폭 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. PCR은 폭넓게 이용되는데, 표적 서열을 증폭하는 열 사이클링과 함께 프라이머 신장을 수반한다(참조: U.S. Pat. No. 4,683,195와 4, 683,2 02; PCR Essential Data, J. W. Wiley & sons, Ed. C. R. Newton, 1995).
일반적으로, PCR은 아래와 같이 간략하게 기술될 수 있다. 이중 가닥 혼성화 복합체는 일반적으로, 온도를 상승시킴으로써 변성되고, 이후 과량의 PCR 프라이머의 존재하에 냉각되며, 상기 프라이머는 보편적 증폭 부위(가령, T7 또는 T3 증폭 부위)에 혼성화된다. 이후, DNA 중합효소가 작용하여 dNTP로 프라이머를 신장시킴으로써, 혼성화 복합체를 형성하는 새로운 가닥을 합성한다. 그 다음, 샘플은 다시 가열하여 혼성화 복합체를 분리시키고, 상기 과정은 반복한다. 제 2 보편적 증폭 부위에 혼성화되는 상보성 표적 가닥에 제 2 PCR 프라이머를 이용함으로써, 신속하고 기하급수적인 증폭이 진행된다. 따라서, PCR 단계는 변성, 어닐링, 신장이다. PCR의 상세는 널리 알려져 있으며, 열안정성 중합효소, 예를 들면, Taq I 중합효소와 열 사이클링의 이용을 수반한다. 적절한 DNA 중합효소에는 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, SEQUENASE 1.0과 SEQUENASE 2.0(U.S. Biochemical), T5 DNA 중합효소, Phi29 DNA 중합효소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 중합효소는 임의의 중합효소일 수 있지만, 전형적으로 3' 엑소뉴클레아제 활성이 부재한다. 적절한 중합효소의 실례에는 엑소뉴클레아제 마이너스 DNA 중합효소 I 대형(Klenow) 단편, Phi29 DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 일부 구체예에서, 단일-가닥 DNA를 복제하는(즉, 이중 가닥 부분을 형성하는 프라이머가 없는) 중합효소가 이용될 수 있다.
반응은 보편적 프라이머, 중합효소, 뉴클레오티드를 함유하는 용액에 결찰 프로브를 도입함으로써 개시된다. 뉴클레오티드는 디옥시뉴클레오시드-트리포스페이트(또는 디옥시뉴클레오티드 또는 dNTP, 예를 들면, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)이다. 일부 구체예에서, 아래에 개략적으로 기술된 바와 같이, 하나이상의 뉴클레오티드는 일차 또는 이차 표지인 검출가능 표지를 보유한다. 이에 더하여, 뉴클레오티드는 시스템의 구성에 따라, 뉴클레오티드 동족체일 수도 있다. 유사하게, 프라이머는 일차 또는 이차 라벨을 보유할 수 있다.
따라서, PCR 반응은 적어도 1개, 전형적으로 2개의 프라이머, 중합효소, 일단의 dNTP를 필요로 한다. 본 발명에서, 프라이머가 표지를 보유하거나, 또는 하나이상의 dNTP가 표지를 보유할 수 있다.
이들 구체예는 결찰되지 않은 프로브를 제거할 필요가 없는 이점이 있는데, 그 이유는 표적의 부재시에 현저한 증폭이 진행되지 않기 때문이다. 이들 이점은 프로브의 설계에 의해 극대활 할 수 있다; 예를 들면, 첫 번째 구체예에서, 단일 혼성화 프로브가 존재하는 경우에, 프로브가 결찰 반응물의 부재시에 짧고 절두된 조각을 발생시키는 역할만을 하기 때문에 프로브의 5' 말단에 가깝게 보편적 증폭 부위를 위치시킨다.
앰플리콘의 표지화는 다양한 방법으로 달성할 수 있다; 예를 들면, 중합효소가 표지된 뉴클레오티드(dNTP)를 통합하거나, 또는 대안으로 보편적 프라이머 자체가 표지를 보유한다.
“표지” 또는 “검출가능 표지”는 검출을 가능하게 하는 부분을 의미한다. 이는 일차 표지 또는 이차 표지이다. 따라서, 검출 표지는 일차 표지(즉. 직접적으로 검출가능) 또는 이차 표지(간접적으로 검출가능)이다.
한 구체예에서, 검출 표지는 일차 표지이다. 일차 표지는 직접적으로 검출될 수 있는 표지, 예를 들면, 형광단이다. 일반적으로, 표지는 3가지 종류로 구분된다: a) 방사성 동위원소 또는 중동위원소(heavy isotope)인 동위원소 표지; b) 자기적, 전기적 또는 열적 표지; c) 형광이나 발광 표지. 표지에는 효소 표지(가령, 양고추냉이 과산화효소 등)와 자기적 입자 역시 포함될 수 있다. 통상적인 표지에는 형광단 또는 인광체가 포함되지만 전형적으로 형광 염료이다. 본 발명에 적합한 염료에는 형광 란타니드 복합체, 유로퓸(europium), 테르븀(terbium), 플루레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 에오신(eosin), 에리트로신(erythrosin), 코우마린(coumarin), 메틸-코우마린(methyl-coumarin), 양자점(quantum dot)(“나노결정”), 피렌(pyrene), 말라카이트 그린(malachite green), 스틸벤(stilbene), Lucifer Yellow, Cascade BlueTM, Texas Red, Cy 염료(Cy3, Cy5 등), 알렉사 염료(alexa dye), 피코에리틴(phycoerythin), 보디피(bodipy) 및 Molecular Probess Handbook(Richard P. Haugland)의 6판에 기술된 염료가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이차 표지는 간접적으로 검출되는 표지이다; 가령, 이차 표지는 검출을 위한 일차 표지에 결합 또는 반응하거나, 추가 산물에 작용하여 일차 표지(가령, 효소)를 발생시키거나, 또는 표지되지 않은 물질로부터 이차 표지를 보유하는 화합물의 분리를 가능하게 한다. 이차 표지에는 결합 상대 쌍, 예를 들면, 비오틴/스트렙타비딘 중에서 하나; 화학적으로 변형가능 부분; 뉴클레아제 저해물질; 양고추냉이 과산화효소와 같은 효소; 알칼리성 포스파타아제; 루시페라아제 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이차 표지는 전형적으로, 결합 상대 쌍이다. 예를 들면, 표지는 결합 상대에 결합하는 합텐 또는 항원이다. 예를 들면, 적절한 결합 상대 쌍에는 항원(가령, 단백질(펩티드 포함))과 항체(이의 단편(FAb 등) 포함); 비오틴/스트렙타비딘을 비롯한 단백질과 소형 분자‘ 효소와 기질 또는 저해물질; 다른 단백질-단백질 상호작용 쌍; 수용체-리간드; 탄수화물과 이의 결합 상대가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 핵산-핵산 결합 단백질 쌍 역시 유용하다. 일반적으로, 쌍에서 작은 상대가 프라이머로의 통합을 위한 뉴클레오티드에 부착된다. 전형적인 결합 상대 쌍에는 비오틴(또는 이미노-비오틴)과 스트렙타비딘, 디게옥시닌(digeoxinin)과 Ab, ProlixTM 시제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예를 들면, 결합 상대 쌍은 비오틴 또는 이미노-비오틴 및 형광 표지된 스트렙타비딘으로 구성될 수 있다. 이미노-비오틴은 pH 4.0 완충액에서 스트렙타비딘으로부터 분리되는 반면, 비오틴은 강한 변성제(가령, 95℃에서 6 M 구아니디늄 HCl, pH 1.5 또는 90% 포름아마이드)를 필요로 한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 표지화는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 표지화는 2가지 방법 중에서 한 방법으로 수행될 수 있다: 표지를 프라이머에 통합하여, 증폭 반응에서 표지를 보유하는 앰플리콘을 결과한다; 또는 표지를 dNTP에 부착하여, 중합효소에 의해 앰플리콘에 통합되도록 한다.
증폭된 DNA는 LM-PCR 반응에서 형광-표식된 뉴클레오티드를 포함시키거나, 또는 보편적 프라이머를 형광 표지함으로써 형광 표지될 수 있다.
표지된 앰플리콘 DNA는 게놈 전체 또는 일부분(가령, 크로모좀)을 대표하는 반점을 보유하는 DNA 마이크로어레이에 혼성화된다. 비-면역침전된 대조에 비하여, 마이크로어레이에서 각 반점의 형광 강도는 DNA 결합 단백질(가령, 목적 단백질)이 특정 반점에 위치된 DNA 영역에 결합되는 지를 확증한다. 따라서, 본 발명의 방법은 전체 게놈에서 단백질-DNA 상호작용의 검출이 가능하다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 폴리펩티드 분자와 상호작용하는 폴리뉴클레오티드의 검출에 유용한 방법과 조성물을 제시한다. 이런 과정은 농축된 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위하여 폴리펩티드에 가교결합된 폴리뉴클레오티드를 면역침전시키고; 폴리펩티드를 폴리뉴클레오티드로부터 분리하고; 각각 예로써 20-mer 표적 서열을 포함하는 한 쌍의 프로브와 보편적 프라이머를 농축된 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키고; 상기 프로브를 결찰하여 결찰 프로브를 형성하고; 표지를 보유하는 보편적 프라이머를 이용하여 상기 결찰 프로브를 증폭하고; 마이크로어레이(가령, DNA 마이크로어레이)를 증폭된-표지 산물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 증폭 산물은 증폭된 표지 산물의 서열에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 어레이 부위에 상호작용한다(혼성화를 통하여).
어레이 조성은 개별 부위를 보유하는 표면을 갖는 적어도 제 2 기질을 포함한다. 본 명세서에서 “어레이” 또는 “바이오칩”은 어레이 형식으로 복수의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 어레이 크기는 어레이의 조성과 최종 용도에 좌우된다. 핵산 어레이는 당분야에 공지되어 있고 다양한 방식으로 분류될 수 있는데, 여기에는 정렬된 어레이(가령, 개별 부위에서 화학적 작용을 분석하는 능력) 및 무작위 어레이가 포함된다. 정렬된 어레이에는 광식각 기술(Affymetrix GeneChipTM), 스팟팅(spotting) 기술(Synteni 등), 프린팅 기술(Hewlett Packard와 Rosetta), 3차원 “겔 패드(gel pad)” 어레이 및 당분야에 공지된 다른 기술이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 액체 어레이가 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
일반적으로, 어레이는 기질 크기 및 어레이의 최종 용도에 따라, 2개 내지 수십억개 이상의 서로 다른 서열을 포함한다. 따라서, 매우 높은 밀도, 높은 밀도, 중간 밀도, 낮은 밀도, 매우 낮은 밀도 어레이가 이용될 수 있다. 가령, 매우 높은 밀도 어레이는 대략 10,000,000 내지 대략 2,000,000,000개의 핵산 분자를 포함하며, 대략 100,000,000 내지 대략 1,000,000,000개가 전형적이다(모든 수치는 cm2). 높은 밀도는 대략 100,000 내지 대략 10,000,000개의 핵산 분자를 포함하며, 대략 1,000,000 내지 대략 5,000,000개가 전형적이다. 중간 밀도 어레이는 대략 1O,000 내지 대략 100,000개의 핵산 분자를 포함하며, 대략 20,000 내지 대략 50,000개가 전형적이다. 낮은 밀도 어레이는 일반적으로, 10,000개 이하의 핵산 분자를 포함하며, 대략 1,000 내지 대략 5,000개가 전형적이다. 매우 낮은 밀도 어레이는 1,000개 이하의 핵산 분자를 포함하며, 대략 10 내지 100개가 전형적이고, 대략 100개 내지 대략 500개가 가장 일반적이다.
“기질” 또는 “고체 서포트”는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 다른 유기 중합체의 부착 또는 결합에 적합한 분리된 개별 부위를 보유하도록 변형될 수 있고 적어도 한가지 검출 방법에 종속될 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 가능 기질에는 유리 및 변형되거나 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴계 재료(acrylics), 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 테플론 등), 폴리사카라이드, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 수지, 실리카 또는 실리콘과 변형된 실리콘을 비롯한 실리카-기초한 재료, 탄소, 금속, 무기질 유리, 광학 섬유 번들, 다양한 다른 중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일반적으로, 기질은 광학적 검출이 가능하고, 자체로써 광학 검출을 거의 간섭하지 않는다(가령, 자체적으로 형광을 발하지 않는다).
일반적으로, 기질은 편평(평면)하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 다른 형태의 기질 역시 이용될 수 있다. 예를 들면, 비드에 샘플 접근을 가능하게 하는 다공성 플라스틱 블록에 비드를 삽입시키고 검출용 공초점 현미경을 이용함으로써 3차원 형태를 이용할 수 있다. 유사하게, 비드는 샘플 용적을 최소화시키기 위하여 유동(flow-through) 샘플 분석용 튜브의 내부면에 위치될 수 있다.
일반적으로, 어레이 조성은 다양한 방법으로 배열될 수 있다. 가령, 복수의 검사 위치(“검사 웰(assay well)”)를 보유하는 제 1 기질, 예를 들면, 마이크로역가 평판은 각 검사 위치가 개별 어레이를 보유하도록 배열된다. 다시 말하면, 검사 위치와 어레이 위치는 동일하다. 예를 들면, 마이크로역가 평판의 플라스틱 재료는 각 검사 웰의 바닥에 복수의 “웰”을 보유하도록 형성될 수 있다.
다른 측면에서, 개별 어레이의 총수는 이용된 마이크로역가 평판의 크기로 정해진다. 따라서, 96 웰, 384 웰, 1536 웰 마이크로역가 평판은 96개, 384개, 1536개의 개별 어레이를 포함하는 복합 어레이를 이용하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 모든 마이크로역가 웰이 개별 어레이를 보유할 필요는 없다. 복합 어레이는 동일한, 유사한 또는 상이한 개별 어레이를 포함할 수 있다. 다시 말하면, 일부 구체예에서, 96개의 서로 다른 샘플에서 2,000번의 동일한 검사를 수행하는 것이 바람직하다. 대안으로, 동일한 샘플(즉, 96개의 웰 각각에서 동일한 샘플)에서 192,000번의 실험을 수행하는 것이 바람직하다. 대안으로, 복합 어레이의 각 열 또는 칼럼이 존재비/품질 조절을 위하여 동일할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 시스템을 배열하는 다양한 방법이 존재한다. 이에 더하여, 어레이의 무작위 성질은 동일한 비드 집단이 2가지 상이한 표면에 부가되어 실질적으로 유사하긴 하지만 동일하지 않은 어레이를 산출한다는 것을 의미한다.
실용되는 증폭된-표지 산물(가령, 표지된 앰플리콘)은 혼성화 프로브에서처럼 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드를 포함하는 어레이에 노출된다. 증폭된-표지 산물(가령, 표지된 앰플리콘) 및 마이크로어레이에서 폴리뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드는 혼성화되어(직접적 또는 간접적으로) 특정 마이크로어레이 위치의 광학 신호에서 변화를 유도할 수 있다.
아래의 특정 구체예는 본 발명을 더욱 예시하기 위하여 제공된다. 아래의 특정 구체예는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
아래의 절차는 본 발명의 방법을 구현하기 위하여 수행되었다.
가교결합. 단백질은 1%의 최종 농도로 배양 배지에 포름알데히드를 직접 첨가함으로써 DNA에 가교결합시키고 37℃에서 10분간 배양하였다(가령, 평판에서 270 ㎕의 37% 포름알데히드를 10 ㎖의 성장 배지에 첨가한다). 이후, 배지는 흡기하고 가능한 많은 배지를 제거한다. 세포는 프로테아제 저해물질(1 mM 페닐메틸설포닐 플루오르화물(PMSF), 1 ㎍/㎖ 아프로티닌, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A)을 함유하는 차가운 PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 이들 세포는 원뿔형 튜브에 긁어 넣고 4℃에서 2000 rpm으로 4분간 펠렛하였다. 용해 완충액은 프로테아제 저해물질(저해물질: 1 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 아프로티닌, 1 ㎍/㎖ 펩스타틴 A)과 함께, 침전된 SDS에 첨가하였다. 세포 펠렛은 200 ㎕의 SDS 용해 완충액에 재부유시키고 얼음 위에서 10분간 배양하였다. 주의: 200 ㎕의 SDS 용해 완충액은 1 x 106 세포에 의한다; 더욱 많은 세포가 이용되면, 재부유된 세포 펠렛은 200 ㎕ 분량으로 분할하여 각 200 ㎕ 분량이 ~1 x 106 세포를 보유하도록 한다.
재부유된/용해된 세포 펠렛은 초음파처리하여 DNA를 200 내지 1000 염기쌍 길이로 전단하고, 샘플은 냉각 상태로 유지시켰다. 65℃에서 4시간동안 8 ㎕ 5M NaCl을 첨가하여 역 가교결합시켰다. DNA는 페놀/클로로포름 추출로 회수하였다.
인산화. 6 ㎕의 비-인산화된 올리고 풀(pool)은 1/10 볼륨의 5M NaCl 및 2.5 볼륨의 차가운 에탄올과 혼합하였다. 혼합물은 -20℃에서 30분간 배양하였다. 침전된 올리고는 30분간 원심분리로 펠렛하였다. 펠렛은 70-75% 에탄올로 세척하고 5분간 원심분리하였다. 펠렛은 건조시키고 적량의 TF(10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA, pH 8.0) 또는 H2O에 용해시켰다.
역-가교결합된 DNA의 비오틴화. 페놀-클로로포름 추출된 DNA는 세척하고 TE(pH 8.0)에 용해시켰다. 10 ㎕ DNA에, H2O에 담긴 100 ng의 파지 1 DNA와 1 ㎕(1 ㎍/㎕)의 PHOTOPROBE® Biotin(Vector Laboratories)을 20 ㎕의 최종 부피로 첨가하였다. 혼합물은 광유로 위를 깔고 95℃에서 10분간 가열하였다. 침전물에 0.1M Tris(pH 9.5)를 80 ㎕의 최종 부피로 첨가하였다. 혼합물은 160 ㎕의 2-부탄올을 첨가하고 활발하게 교반하며 원심분리하여 상을 분리하였다. 위쪽 부탄올 상을 제거하고 부탄올 추출을 반복하였다. 비오틴화된 DNA는 아래의 성분을 첨가하고 혼합하여 침전시켰다: 10 ㎕의 10M NH4Ac, 2 ㎕의 1M MgCl2, 1 ㎕ 글리코겐, 150 ㎕의 -20℃ 에탄올. -20℃ 에탄올에서 배양한다. 혼합물은 -20℃에서 15분간 배양하였다. 30분간 원심분리로 펠렛하고 70% 에탄올로 세척하며 5분간 원심분리하였다. 펠렛은 건조시키고 TE에 재부유시켰다.
어닐링. 아래의 성분을 PCR 튜브에서 혼합하였다: 40 ㎕의 전체 부피에서, 각 올리고의 최종 농도가 200 fmol/반응이 되도록 하는 적량의 올리고 풀, 비오틴화된 샘플 DNA, 20 ㎕ 2x 결합 완충액(40 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1M NaCl, 2 mM EDA, 0.1% Tween-80). 혼합물은 95℃에서 10분간 가열하고, 이후 45℃로 냉각하였다. 샘플은 10분동안 유지시키고, 이후 5 ㎕의 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(Seradyne)를 첨가하였다. 그 다음, 샘플은 45℃에서 2시간동안 배양하였다.
선별. 비드는 150 ㎕의 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.1M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween-80)으로 2회 세척하였다. 비드는 1 x NEB Taq DNA 리가아제 완충액으로 세척하였다.
결찰. 39 ㎕의 1x NEB Taq 리가아제 완충액과 1 ㎕(40 U) NEB Taq 리가아제를 첨가하고 45℃에서 1시간동안 배양하였다. 비드는 세척 완충액으로 2회 세척하고, 결찰 올리고뉴클레오티드 쌍은 95℃에서 5분간 가열함으로써 40 ㎕ H2O로 용출하였다.
증폭. 각 반응물: 2.5 ㎕의 1Ox AmpliTaq 완충액, 1.5 ㎕의 25 mM MgCl2, 0.5 ㎕ dNTP, 15 pmole의 각 PCR 프라이머, 2-4 ㎕의 샘플, 0.4 ㎕ AmpliTaq Gold(5U/㎕)은 25 ㎕의 전체 부피로 혼합하였다. 아래의 PCR 사이클 조건: 94℃에서 10분; 94℃에서 30초의 30회 사이클; 54℃에서 2분; 72℃에서 2분을 수행하였다.
본 발명에 따른 방법의 특이성을 검증하기 위하여, 아래의 실험을 수행하였다:
플라스미드 스파이킹(spiking). 가교결합 선별과 역 가교결합은 당분야에 공지되고 상기한 바와 같이 수행하였다. 올리고는 상기한 바와 같이 인산화시켰다.
올리고뉴클레오티드: 게놈 DNA 검출을 위한 20개의 상이한
올리고뉴클레오티드 쌍
스파이킹 플라스미드 DNA 검출을 위한 16개의 상이한
올리고뉴클레오티드 쌍
비오틴화: (i) 파지 람다 DNA 없음, (ii) 10 ㎕ PHOTOPROBE® Biotin, (iii) 30분간 가열을 제외하고 상기한 바와 동일함.
293T 세포로부터 게놈 DNA 및 4가지 상이한 플라스미드 DNA 혼합물은 개별적으로 비오틴화시켰다.
어닐링: (i) 각 올리고의 최종 농도 400 fmol/반응과 (ii) 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(Seradyne) 대신에 스트렙타비딘-코팅된 튜브(Boeringer-Manhein) 를 제외하고 상기한 바와 동일함.
아래의 반응을 수행하였다:
| 반응# | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 게놈 DNA(분자) | 0 | 105 | 105 | 105 | 105 | 105 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 개별 플라스미드 DNA(분자) | 0 | 0 | 102 | 103 | 104 | 105 | 105 | 0 | 105 | 105 |
| 게놈 DNA용 올리고(fmol) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 400 | 400 | 400 |
| 플라스미드용 올리고(fmol) | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 0 | 0 | 0 |
선별: 상기한 바와 동일함.
결찰: 1시간 어닐링과 2시간 결찰을 제외하고 상기한 바와 동일함.
증폭: 상기한 바와 동일함.
제조물은 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 데이터는 도 3A에 제시한다.
상이한 배수 스파이킹으로 PCR-단편 스파이킹 실험. 올리고 인산화는 상기한 바와 같이 수행하였다. 올리고뉴클레오티드: 스파이킹되지 않은 게놈 DNA 검출을 위한 15개 상이한 올리고뉴클레오티드 쌍 및 스파이킹과 게놈 DNA 검출을 위한 7개 상이한 올리고뉴클레오티드 쌍.
비오틴화. (i) 파지 람다 DNA 없음, (ii) 10 ㎕ PHOTOPROBE® Biotin, (iii) 30분간 가열을 제외하고 상기한 바와 동일함.
아래의 반응을 수행하였다. 293T 세포로부터 게놈 DNA 및 7개의 상이한 PCR DNA 단편 혼합물은 함께 비오틴화시켰다.
| 반응 # | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 게놈 DNA(분자) | 104 | 104 | 104 | 104 |
| 각 스파이킹 DNA(분자) | 3x104 | 5x104 | 105 | 2x105 |
어닐링: (i) 각 올리고의 최종 농도 400 fmol/반응과 (ii) 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(Seradyne) 대신에 스트렙타비딘-코팅된 튜브(Boeringer-Manhein)를 제외하고 상기한 바와 동일함.
선별: 상기한 바와 동일함.
결찰: 1시간 어닐링과 2시간 결찰을 제외하고 상기한 바와 동일함.
증폭: 상기한 바와 동일함.
데이터는 도 3B에 제시한다.
본 발명의 방법은 안드로겐 수용체(AR) 반응성 프로모터 및 대조에서 수행하였다. 표 A에서는 실험에 이용된 프로모터와 대조를 도시한다.
| ChIP로 확인된 AR 반응성 프로모터 | 기능 검사에 의한 AR 반응성 프로모터 | 대조 프로모터 | 플라스미드 대조 |
| KLK2 KLK3 | CDK2 P21 PSP94 SC FGF8 TMPRSS2 LCP1 NKX3A F9 | GADPH AARS ASNS CYP4B1 GFI1 HOXB3 MAP4K1 RAB23 CCL7 | pUC-GFP pUC-GST pUC-CAT pUC-Neo |
인간 전립선암 세포주인 LNCaP 세포는 안드로겐 항진제 디하이드로테스토스테론(DHT)으로 먼저 처리하였다. 가성-처리된 세포와 DHT-처리된 세포는 표준 ChIP에 종속시켜 항-안드로겐 수용체(AR)-농축된 DNA를 획득하였다. ChIP DNA는 개별적으로 비오틴화시키고, 이후 DASL 분석을 수행하여다. 가성-처리된 세포로부터 면역침전된 DNA는 T3과 알렉사-표지된 T7로 증폭하고, DHT-처리된 세포로부터 면역침전된 DNA는 T3과 Cy3-표지된 T7로 증폭하였다. 이후, 산물은 집합시키고 개별 프로모터로부터 표적 서열에 상보적인 프로브를 보유하는 올리고뉴클레오티드 어레이에 혼성화시켰다. 비-안드로겐 반응성 프로모터는 항-AR 항체에 의해 면역침전되지 않기 때문에, 신호가 가성-처리된 세포와 DHT-처리된 세포 모두에서 낮으며, 이들 세포는 Cy3/알렉사 비율을 산정하는데 이용될 수 없다. 더욱 높은 Cy3/알렉사 비율은 DHT 처리에 의해 유도된 안드로겐 수용체와 프로모터 I LNCaP 세포 사이의 양성 상호작용을 지시한다. 흥미롭게도, 기존 문헌에서 5가지 프로모터(SC, FGF8, LCP1, NKX3A, F9)는 다른 세포형에서 안드로겐 반응성으로 보고되었지만, 도 4와 6에 제시된 데이터에서 이들은 LNCaP 세포에서 안드로겐 반응성이 아닌 것으로 나타났다.
도 4에서는 SAM 분석 결과와 함께, LNCaP 세포에서 안드로겐 반응성 프로모터를 이용한 본 발명에 따른 방법의 결과를 도시한다. 각 겔은 안드로겐의 존부하에 입력 DNA 쌍(IN+와 IN-) 및 안드로겐의 존부하에 농축된 입력 DNA 쌍(EN+와 EN-)을 포함한다.
도 6에서는 본 발명의 방법을 이용한 에스트로겐 수용체 표적 유전자의 확인을 도시한다. 에스트로겐 항진제의 존부하에 과정을 도시한다. 또한, 칩 데이터의 SAM 분석 결과를 도시한다.
통상적인 게놈 타일링은 연속 중복 게놈 서열을 칩에 배치하는 단계를 수반한다. 이런 전략은 게놈에서 RNA 전사체의 편견없는 위치확인을 가능하게 한다. 실제로, 이런 타일링 어레이에 전체 세포질 폴리(A) RNA를 혼성화시킴으로써, 전체 RNA가 크로모좀 21과 22에서 다수 영역에 혼성화되는 것으로 확인되었는데, 이들 영역의 대부분은 공지된 전사 단위에 해당하지 않는다.
크로모좀 11p15에서 베타-글로불린 영역을 이용하여 타일링과 본 발명에 따른 방법의 조합을 검사하였다. 프라이머 선별 프로그램 1000을 이용하여, 베타 글로빈 좌위에서 전체 1 Mb 영역을 커버하는 40-mer을 설계하였다. 합성된 올리고뉴클레오티드는 Motorola 3D CodeLink 슬라이드에 스팟하여 마이크로어레이를 형성하였다. 각 표적에 상응하는 올리고뉴클레오티드 쌍을 제조하고 집합시켰다. 상기 실험의 데이터는 도 7과 8에 도시한다.
상기한 설명에 기초하여, 본 발명에 따른 방법의 명백한 이점은 아래의 표 1에 제시한다.
| ChIP-Chip | ChIP-DASL | |
| 민감도 | 108 세포 | 106 세포 |
| 검출가능한 변화(배수) | ? | 3-5X |
| 특이성 | ? | 높음 |
| 반복부위와의 관계 | 예 | 아니오 |
| 실험 단계 | 다수 | 소수 |
| 탈-가교결합 | 필요 | 생략 |
| 어레이 형식 | PCR 산물 또는 올리고 | 올리고 |
| 올리고 풀 | N/A | 필요* |
| 검사당 비용 (어레이 배제) | ~$200 | ~$10 |
| 가장 유용한 용도 | 프로모터 & 타일링 어레이 | 프로모터 & Locus-sp. 타일링 어레이 |
* 검사당 비용은 어레이 밀도 및 수행되는 검사에 좌우된다:
30K 프로모터 어레이의 경우: $240,000
1000번 검사를 수행하는 10회 실험의 경우: $24
전체 게놈 스캔의 경우: $10 million
1000번 검사를 수행하는 10회 실험의 경우: $1,000
다수의 구체예를 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하다. 따라서, 다른 구체예는 아래의 특허청구범위의 범위에 속한다.
Claims (37)
- 생물체의 게놈에서 폴리뉴클레오티드-폴리펩티드 상호작용 도메인을 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 폴리펩티드에 결합된 폴리뉴클레오티드를 면역침전시켜 농축된 폴리뉴클레오티드 제조물을 수득하고;b) 농축된 제조물에서 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 분리시키고;c) 프라이머 쌍이 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, 상기 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 농축된 제조물에서 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 분절에 특이적이고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;d) 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에, 제 1 혼성화 복합체를 리가아제와 접촉시키고;e) 상기 결찰 프로브를 보편적 프라이머로 증폭하여 증폭된 표지 산물을 산출하고;f) 결찰 프로브가 어레이상의 상보성 올리고뉴클레오티드에 혼성화되어 검사 복합체를 형성하는 조건하에, 증폭된 표지 산물을 올리고뉴클레오티드 어레이와 접 촉시키고;g) 검사 복합체를 검출하고, 여기서 복합체의 존재는 면역침전된 폴리펩티드에 결합하는 DNA를 지시한다.
- 제 1항에 있어서, 폴리펩티드와 결합된 폴리뉴클레오티드는 가교결합된 폴리뉴클레오티드-폴리펩티드 복합체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 가교결합은 UV 광, 포름알데히드, 프소렐란(psorelan), 또는 이들의 임의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 보편적 착륙 부위는 T3과 T7 증폭 부위(priming site)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 보편적 프라이머는 검출가능 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 검출가능 표지는 동위원소 표지; 자기적, 전기적 또는 열적 표지; 효소 표지; 형광이나 발광 표지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 동위원소 표지는 방사성 동위원소 또는 중동위원소(heavy isotope)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 형광이나 발광 표지는 형광 란타니드 복합체, 유로퓸(europium), 테르븀(terbium), 플루레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 에오신(eosin), 에리트로신(erythrosin), 코우마린(coumarin), 메틸-코우마린(methyl-coumarin), 양자점(quantum dot), 피렌(pyrene), 말라카이트 그린(malachite green), 스틸벤(stilbene), Lucifer Yellow, Cascade BlueTM, Texas Red, Cy 염료, 알렉사 염료(alexa dye), 피코에리틴(phycoerythin), 보디피(bodipy)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 생물체의 게놈에서 폴리뉴클레오티드-폴리펩티드 상호작용 도메인을 검출하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) DNA 결합 단백질을 생물체의 게놈 DNA로 교차결합시켜, DNA-단백질 복합체를 산출하고;b) DNA-단백질 복합체를 단편화시켜 DNA 단편-단백질 복합체를 포함하는 혼합물을 산출하고;c) b)에서 산출된 혼합물로부터 DNA 단편-단백질 복합체를 떼어내고;d) c)에서 수득된 DNA 단편을 DNA 결합 단백질로부터 분리하고;e) 프라이머 쌍이 DNA 단편에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, 상기 DNA를 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 DNA 단편에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 DNA 단편의 상류와 하류 분절에 특이적으로 설계되고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;f) DNA 단편에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에, 제 1 혼성화 복합체를 리가아제와 접촉시키고;g) 상기 결찰 프로브를 보편적 프라이머와 접촉시키고;h) g)의 결찰 프로브를 증폭하여 증폭 산물을 수득하고;i) 증폭 산물과 상보성 폴리뉴클레오티드 영역 사이에 혼성화가 진행되어 제 2 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, h)의 증폭 산물을 생물체로부터 유래된 상보성 폴리뉴클레오티드와 결합시키고;j) i)의 제 2 혼성화 복합체를 확인하고, 여기서 제 2 혼성화 복합체는 DNA 결합 단백질 상호작용하는 게놈 영역을 포함한다.
- 제 9항에 있어서, 생물체는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 생물체는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, DNA 결합 단백질은 전사 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 세포의 DNA 결합 단백질은 포름알데히드, 프소렐란 또는 UV 광을 이용하여 생물체의 게놈 DNA에 가교결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, DNA는 제한 효소 또는 초음파처리에 의해 단편화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, DNA 단편-단백질 복합체는 단백질에 결합하는 항체를 이용하여 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, h)의 결찰 프로브는 결찰-매개된 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 제 2 혼성화 복합체는 DNA 마이크로어레이에 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 보편적 프라이머 착륙 부위는 T3과 T7 증폭 부위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 보편적 프라이머는 검출가능 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 검출가능 표지는 동위원소 표지; 자기적, 전기적 또는 열적 표지; 효소 표지; 형광이나 발광 표지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 동위원소 표지는 방사성 동위원소 또는 중동위원소(heavy isotope)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 형광이나 발광 표지는 형광 란타니드 복합체, 유로퓸(europium), 테르븀(terbium), 플루레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 에오신(eosin), 에리트로신(erythrosin), 코우마린(coumarin), 메틸-코우마린(methyl-coumarin), 양자점(quantum dot), 피렌(pyrene), 말라카이트 그린(malachite green), 스틸벤(stilbene), Lucifer Yellow, Cascade BlueTM, Texas Red, Cy 염료, 알렉사 염료(alexa dye), 피코에리틴(phycoerythin), 보디피(bodipy)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 목적 폴리펩티드가 결합하는 생존 세포의 게놈 영역을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 생존 세포에서 DNA 결합 폴리펩티드를 생존 세포의 게놈 DNA에 가교결합시켜 게놈 DNA에 가교결합된 DNA 결합 폴리펩티드를 산출하고;b) DNA 결합 폴리펩티드에 가교결합된 게놈 DNA의 DNA 단편을 발생시켜 DNA 결합 폴리펩티드가 결합된 DNA 단편을 산출하고;c) 목적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 DNA 단편을 면역침전시키고;d) c)에서 수득된 DNA 단편을 목적 폴리펩티드로부터 분리하고;e) 프라이머 쌍이 DNA 단편에 혼성화되어 제 1 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, 상기 DNA 단편을 프라이머 쌍과 접촉시키고, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 DNA 단편에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 DNA 단편의 상류와 하류 분절에 특이적으로 설계되고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;f) DNA 단편에 혼성화된 프라이머 쌍이 결찰되어 결찰 프로브를 형성하는 조건하에, 제 1 혼성화 복합체를 리가아제와 접촉시키고;g) 검출가능 표지로 표지된 보편적 프라이머를 이용하여 f)의 결찰 프로브를 증폭하여 증폭 산물을 수득하고;h) 증폭 산물과 상보성 폴리뉴클레오티드 영역 사이에 혼성화가 진행되어 제 2 혼성화 복합체를 형성하는 조건하에, g)의 증폭 산물을 세포로부터 유래된 상보성 폴리뉴클레오티드와 결합시키고;i) 표지에 특이적인 방법을 이용하여 h)의 제 2 혼성화 복합체를 확인하고, 여기서 제 2 혼성화 복합체는 목적 폴리펩티드가 결합하는 세포에서 게놈 영역을 포함한다.
- 제 23항에 있어서, i)에서 측정된 표지 양/강도를 대조의 양/강도와 비교하는 단계가 추가로 포함되고, 게놈 영역에서 대조 표지의 양/강도보다 높은 양/강도는 목적 폴리펩티드가 결합하는 세포에서 상기 게놈 영역을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 세포는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, DNA 결합 폴리펩티드는 전사 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, DNA 결합 폴리펩티드는 포름알데히드, 프소렐란 또는 UV 광을 이용하여 세포의 게놈 DNA에 가교결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, DNA는 제한 효소 또는 초음파처리에 의해 단편화되는 것 을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, f)의 결찰 프로브는 결찰-매개된 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 제 2 혼성화 복합체는 DNA 마이크로어레이에 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 보편적 프라이머 착륙 부위는 T3과 T7 증폭 부위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 보편적 프라이머는 검출가능 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33항에 있어서, 검출가능 표지는 동위원소 표지; 자기적, 전기적 또는 열적 표지; 효소 표지; 형광이나 발광 표지에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항에 있어서, 동위원소 표지는 방사성 동위원소 또는 중동위원소(heavy isotope)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33항에 있어서, 형광이나 발광 표지는 형광 란타니드 복합체, 유로퓸(europium), 테르븀(terbium), 플루레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 에오신(eosin), 에리트로신(erythrosin), 코우마린(coumarin), 메틸-코우마린(methyl-coumarin), 양자점(quantum dot), 피렌(pyrene), 말라카이트 그린(malachite green), 스틸벤(stilbene), Lucifer Yellow, Cascade BlueTM, Texas Red, Cy 염료, 알렉사 염료(alexa dye), 피코에리틴(phycoerythin), 보디피(bodipy)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 아래의 구성요소를 포함하는 키트:폴리펩티드에 결합된 폴리뉴클레오티드를 면역침전시켜 농축된 폴리뉴클레오티드 제조물을 수득하는 수단;프라이머 쌍, 각 프라이머는 적어도 2개의 구역으로 구성되고, 제 1 구역은 농축된 제조물에서 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 구역은 보편적 프라이머 착륙 부위를 포함하고, 이들 두 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 분절에 특이적이고, 여기서 보편적 착륙 부위는 동일하지 않다;리가아제;보편적 프라이머;올리고뉴클레오티드 어레이.
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