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ES3000617T3 - Anti-tigit antibodies and methods of use - Google Patents

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ES3000617T3
ES3000617T3 ES16775058T ES16775058T ES3000617T3 ES 3000617 T3 ES3000617 T3 ES 3000617T3 ES 16775058 T ES16775058 T ES 16775058T ES 16775058 T ES16775058 T ES 16775058T ES 3000617 T3 ES3000617 T3 ES 3000617T3
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ES
Spain
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tigit
antibody
human
binding
antibodies
Prior art date
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Active
Application number
ES16775058T
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English (en)
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Jane Grogan
Robert Johnston
Yan Wu
Wei-Ching Liang
Patrick Lupardus
Mahesh Yadav
Dhaya Seshasayee
Meredith Hazen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-TIGIT (inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM) y métodos para utilizarlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-TIGIT y procedimientos de uso
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos antagonistas anti-TIGIT (inmunorreceptor de linfocitos T con dominios de Ig e ITIM) que son anticuerpos monoclonales de la subclase IgG1 humana y comprenden una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 35 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario (por ejemplo, el cáncer) son la manifestación o consecuencia de vías biológicas complejas que, en la fisiología normal, son fundamentales para responder a una agresión o lesión, iniciar la reparación de la agresión o lesión y desarrollar defensas innatas y adquiridas. La enfermedad o afección se produce cuando estas vías fisiológicas normales provocan una agresión o lesión adicional que está directamente relacionada con la intensidad de la respuesta (por ejemplo, como consecuencia de una regulación anómala o una estimulación excesiva) o como una reacción a sí mismo.
Aunque la génesis de estas enfermedades a menudo implica vías de múltiples etapas y, a menudo, múltiples sistemas/vías biológicas diferentes, la intervención en puntos fundamentales en una o más de estas vías puede tener un efecto de mejoría o terapéutico. La intervención terapéutica se puede producir por el antagonismo de un proceso/vía perjudicial o bien por la estimulación de un proceso/vía beneficioso.
Son conocidas muchas enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y se han estudiado ampliamente. Dichas enfermedades incluyen cáncer (neoplasia), enfermedades inflamatorias inmunomediadas, enfermedades inflamatorias no inmunomediadas, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencia.
Los linfocitos T (linfocitos T) son un componente importante de una respuesta inmunitaria de los mamíferos. Los linfocitos T reconocen antígenos que se asocian con una molécula propia codificada por genes dentro del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El antígeno se puede presentar conjuntamente con moléculas de MHC en la superficie de las células presentadoras de antígenos (CPA), células infectadas por virus, células cancerosas, injertos, etc. El sistema de linfocitos T elimina estas células alteradas, que representan una amenaza para la salud del mamífero huésped. Los linfocitos T incluyen linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T cooperadores proliferan ampliamente tras el reconocimiento de un complejo antígeno-MHC en una CPA. Los linfocitos T cooperadores también secretan una variedad de citocinas (es decir, linfocinas), que desempeñan un papel central en la activación de los linfocitos B, los linfocitos T citotóxicos y una variedad de otras células que participan en la respuesta inmunitaria.
Los linfocitos T reguladores (Treg) son un subconjunto de linfocitos T cooperadores que desempeñan un papel fundamental en la inhibición de las respuestas inmunitarias autorreactivas y a menudo se encuentran en sitios de inflamación crónica, tales como en el tejido tumoral. Los Treg se definen fenotípicamente por la alta expresión en la superficie celular de CD25, CLTA4, GITR y neuropilina-1 (NRP-1), y están bajo el control del factor de transcripción FOXP3. Los T reg realizan su función supresora en los linfocitos T activados a través de mecanismos dependientes del contacto y la producción de citocinas. Los Treg también modulan las respuestas inmunitarias por la interacción directa con ligandos en las células dendríticas (CD), tales como la fijación de CD40L y la interacción de CTLA4 con moléculas B7 en las CD que provoca la inducción de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO). Las CD son CPA profesionales que pueden inducir inmunidad o tolerancia contra antígenos propios o no propios. Los T reg expandidos con CD suprimen las respuestas de alorreactividadin vitroy, cuando se transfieren de forma adoptiva, los Treg apropiados inhiben la diabetes en ratones NODscid o el asma inducido experimentalmente. Las interacciones específicas de los ligandos en CD con Treg también pueden anular su función supresora, tal como la activación de GITR en ratones, lo que sugiere que las CD pueden tener un papel pluralista en la modulación de la función de Treg.
Las moléculas CTLA4 y GITR son representativas de ligandos definidos dentro de las superfamilias CD28-B7 y TNF de moléculas coestimuladoras/coinhibidoras, respectivamente. Estas moléculas se expresan en gran medida en los T reg, pero típicamente se regulan por incremento en linfocitos T activados. Más recientemente, se identificó una proteína denominada TIGIT (por inmunorreceptor de linfocitos T con dominios de Ig e ITIM) como una proteína unida a la superficie celular expresada específicamente en linfocitos T que poseen un dominio IgV, un dominio transmembranario y dos posibles motivos inhibidores basados en tirosina de inmunorreceptor (ITIM). Se demostró que TIGIT se expresa en particular en subconjuntos de Treg y linfocitos T de memoria, así como en linfocitos NK. Como existe una necesidad no cubierta de nuevos tratamientos y procedimientos de tratamiento de trastornos relacionados con el sistema inmunitario y, en particular, cánceres, se describen en el presente documento composiciones terapéuticas inesperadamente eficaces, tales como los anticuerpos anti-TIGIT y composiciones de los mismos, y procedimientos de tratamiento de trastornos relacionados con el sistema inmunitario y cánceres, que implican la modulación de la interacción de TIGIT con sus compañeros de unión.
El documento WO 2009/126688 A2 divulga anticuerpos anti-TIGIT para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, en particular un anticuerpo anti-TIGIT murino de hámster (10A7) que reacciona de forma cruzada con TIGIT humano y bloquea la interacción de TIGIT con PVR. Foksetal.,PLOS ONE 2013, 8(12), e83134, describen la inhibición de las respuestas de linfocitos T en ratones con insuficiencia en LDLr por un anticuerpo anti-TIGIT agonista y el efecto sobre la ateroesclerosis. Jolleret al.,J. Immunol. 2011, 186, 1338 1342, usaron un anticuerpo anti-TIGIT agonista para demostrar que TIGIT tiene funciones inhibidoras intrínsecas de linfocitos T.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos anti-TIGIT (inmunorreceptor de linfocitos T con dominios de Ig e ITIM) antagonistas que se unen específicamente a TIGIT humano, en los que los anticuerpos antagonistas son anticuerpos monoclonales de la subclase lgG1 humana y comprenden una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 35 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, con propiedades mejoradas, incluyendo, por ejemplo, afinidad de unión, reactividad cruzada, farmacocinética y/o expresión. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TIGIT antagonistas y variantes de los mismos que poseen, por ejemplo, alta afinidad de unión a TIGIT humano; reactividad cruzada entre TIGIT humano, TIGIT de macaco cangrejero (macaco) y TIGIT de conejo; propiedades de depuración deseables en macaco; y propiedades bioquímicas y biofísicas que confieren a los anticuerpos y variantes de los mismos alta estabilidad.
En un aspecto, la invención presenta un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIGIT humano, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de la subclase IgG1 humana y comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
En algunos modos de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento puede ser para su uso como medicamento. En algunos modos de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento puede ser para su uso como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo se administra en combinación con el anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A (atezolizumab) y/o un agente terapéutico adicional. En algunos modos de realización, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterápico.
En otro aspecto, la invención presenta un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido aislado) que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En otro aspecto, la invención presenta un vector (por ejemplo, un vector de expresión) que comprende el polinucleótido para expresar el anticuerpo. En otro aspecto, la invención presenta células huésped que comprenden los polinucleótidos y/o vectores precedentes. En algunos modos de realización, la célula huésped es procariota o eucariota (por ejemplo, una célula de mamífero). En algunos modos de realización, la célula eucariota es una célula 293, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de levadura o una célula vegetal.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento de producción de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores precedentes (por ejemplo, vectores de expresión) en un medio de cultivo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped o del medio de cultivo.
En otro aspecto, la invención presenta una composición que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento, que comprende además un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunos modos de realización, la composición es una composición farmacéutica. En algunos modos de realización, la composición comprende además el anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A (atezolizumab) o un agente terapéutico adicional. En algunos modos de realización, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterápico.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1A es un diagrama esquemático de un ensayo de unión de CHO-TIGIT.
La FIGURA 1B es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de unión de CHO-TIGIT representado en la figura 1A usando células CHO que expresan TIGIT humano y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 1C es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de unión de CHO-TIGIT representado en la figura 1A usando células CHO que expresan TIGIT de macaco cangrejero (macaco) y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 1D es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de unión de CHO-TIGIT representado en la figura 1A usando células CHO que expresan TIGIT humano y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de SD indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 1E es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de unión de CHO-TIGIT representado en la figura 1A usando células CHO que expresan TIGIT de macaco y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de SD indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 2A es un gráfico que muestra la unión de los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT indicados a linfocitos T CD4 humanos en función de la concentración de anticuerpo.
La FIGURA 2B es un gráfico que muestra la unión de los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT indicados a linfocitos T CD8 humanos en función de la concentración de anticuerpo.
La FIGURA 2C es un gráfico que muestra la unión de los anticuerpos anti-TIGIT derivados de SD indicados a linfocitos T CD4 humanos en función de la concentración de anticuerpo.
La FIGURA 2D es un gráfico que muestra la unión de los anticuerpos anti-TIGIT derivados de SD indicados a linfocitos T CD8 humanos en función de la concentración de anticuerpo.
La FIGURA 3A es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA de bloqueo usando placas recubiertas con proteína de fusión PVR-Fc humano, TIGIT humano y los anticuerpos anti-TIGIT indicados (10A7 y 4.1D3.Q1E en formato Fab o IgG) o control Fab anti-CSF1, en función de la concentración de anticuerpo/Fab.
La FIGURA 3B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA de bloqueo usando placas recubiertas con proteína de fusión PVR-Fc de macaco, TIGIT de macaco y los anticuerpos anti-TIGIT indicados (10A7 y 4.1D3.Q1E en formato Fab o IgG) o control Fab anti-CSF1, en función de la concentración de anticuerpo/Fab. La FIGURA 3C es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo ELISA de bloqueo usando placas recubiertas con proteína de fusión PVR-Fc murino, TIGIT murino y los anticuerpos anti-TIGIT indicados (10A7 y 4.1D3.Q1E en formato Fab o IgG) o control Fab anti-CSF1, en función de la concentración de anticuerpo/Fab.
La FIGURA 3D es una tabla que muestra los resultados de los ensayos ELISA de bloqueo descritos en las figuras 3A-3C.
La FIGURA 4A es un diagrama esquemático de un ensayo de bloqueo de PVR de CHO-TIGIT.
La FIGURA 4B es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de bloqueo de PVR de CHO-TIGIT representado en la figura 4A usando células CHO que expresan TIGIT humano y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 4C es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de bloqueo de PVR de CHO-TIGIT representado en la figura 4A usando células CHO que expresan TIGIT de macaco y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 4D es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de bloqueo de PVR de CHO-TIGIT representado en la figura 4A usando células CHO que expresan TIGIT humano y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de SD indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 4E es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de bloqueo de PVR de CHO-TIGIT representado en la figura 4A usando células CHO que expresan TIGIT de macaco y los anticuerpos anti-TIGIT derivados de SD indicados en concentraciones variables, como se analiza por FACS.
La FIGURA 5A es un gráfico que muestra la depuración farmacocinética de los anticuerpos anti-TIGIT indicados en macaco tras la administración intravenosa de 10 mg/kg en función de la concentración sérica (|ig/ml) a lo largo del tiempo (días).
La FIGURA 5B es una tabla que muestra los valores de depuración calculados para cada anticuerpo sometido a prueba en los experimentos de depuración farmacocinética de la figura 5A.
La FIGURA 5C es un gráfico que muestra la depuración farmacocinética de los anticuerpos anti-TIGIT h10A7.K4G3 y 4.1D3 en macaco tras la administración intravenosa de 10 mg/kg en función de la concentración sérica (|ig/ml) a lo largo del tiempo (días; d0-d7).
La FIGURA 5D es una tabla que muestra los valores de depuración calculados para los anticuerpos anti-TIGIT h10A7.K4G3 y 4.1D3 sometidos a prueba en los experimentos de depuración farmacocinética en la figura 5C.
La FIGURA 6A es una representación de la estructura cristalina del Fab de 4.1D3 unido a TIGIT humano, con las regiones de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de 4.1D3 indicadas y distinguidas por color.
La FIGURA 6B es una representación de la estructura cristalina del Fab de 4.1D3 unido a TIGIT humano, superpuesta con la estructura de PVR-TIGIT conocida (PDB 3UDW), que muestra que el anticuerpo 4.1D3 y PVR tienen sitios de unión superpuestos para TIGIT.
La FIGURA 6C es una representación de la estructura cristalina del Fab de 4.1D3 unido a TIGIT humano, con la localización relativa del sitio de unión de PVR indicado. También se indica la localización relativa del bucle 72-79 de TIGIT.
Las FIGURAS 6D y 6E son representaciones de la estructura cristalina del Fab de 4.1D3 unido a TIGIT humano desde diferentes vistas, que identifican determinados residuos de contacto claves de 4.1D3 (residuos de parátopo) y TIGIT (residuos de epítopo). Los residuos en recuadro indicados en la figura 6E se identificaron como residuos de epítopo funcionalmente importantes por mutagénesis de barrido de alanina.
La FIGURA 7A es un gráfico que muestra los valores de K<d>(nM) para cada uno de los anticuerpos anti-TIGIT identificados para el mutante de barrido de alanina de TIGIT humano indicado.
La FIGURA 7B es un gráfico que muestra los valores de K<d>(nM) para cada uno de los anticuerpos anti-TIGIT identificados para el mutante de barrido de alanina de TIGIT humano indicado, normalizado frente a la diana de TIGIT humano natural. Los mutantes de barrido de alanina de TIGIT que dieron como resultado un descenso de 1 a 10 veces o más de 10 veces en la afinidad de unión se indican por sombreado gris claro y gris oscuro, respectivamente.
La FIGURA 7C es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de 10A7 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 7D es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de h1A5 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 7E es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de 4.1D3 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 7F es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de 7.4A3 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 7G es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de 4.1A4 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 7H es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de h6B2 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 7I es una representación en cinta de la estructura de TIGIT humano con residuos identificados como importantes para el reconocimiento de h7E7 por mutagénesis de barrido de alanina indicados y representados como esferas.
La FIGURA 8 es una representación de la estructura cristalina del Fab de 1A5 unido a TIGIT humano, con las regiones de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) 1A5 indicadas y distinguidas por color.
La FIGURA 9 es una representación de las estructuras cristalinas de los complejos 4.1D3-TIGIT, 1A5-TIGIT y 10A7-TIGIT, superpuestos uno sobre otro con respecto a TIGIT, que muestra que los tres anticuerpos anti-TIGIT se unen a TIGIT humano en epítopos no idénticos.
La FIGURA 10A es una representación de la estructura cristalina del Fab de 10A7 unido a TIGIT humano, con las regiones de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de 10A7 indicadas y distinguidas por color.
La FIGURA 10B es una representación de la estructura cristalina del Fab de 10A7 unido a TIGIT humano, con la localización relativa del sitio de unión de PVR indicado. También se indica la localización relativa del bucle 72-79 de TIGIT.
La FIGURA 11 es una serie de representaciones de los anticuerpos 4.1D3 (arriba a la izquierda), 10A7 (centro medio) y 1A5 (abajo a la derecha) y la localización relativa de los residuos Ser78, Ser80 y Lys82 de TIGIT humano. Las estructuras indican que los residuos Ser78, Ser80 y Lys82 de TIGIT humano son residuos de epítopo claves para 4.1D3, pero no para 10A7 o 1A5, donde estos tres residuos se localizan a una distancia mayor del bolsillo de unión de anticuerpo.
La FIGURA 12 es una serie de gráficos que muestran la expresión de CD45, PD-1, TIGIT y CD226 en linfocitos T CD4+ y CD8+ aislados de la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (MM) (fila superior) y la expresión de PD-1, TIGIT y CD226 en linfocitos T CD4+ y CD8+ aislados de la sangre periférica de pacientes sanos (fila inferior), como se evalúa por citometría de flujo multicolor.
La FIGURA 13 es una serie de gráficos de citometría de flujo (izquierda) y gráficos adjuntos (derecha) que muestran que TIGIT y PD-1 se coexpresan en linfocitos T CD4+ y CD8+ en la médula ósea de pacientes con MM.
Descripción detallada de la invención
I. Técnicas generales
Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento, en general, se entienden bien y se emplean comúnmente usando una metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual3.a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Current Protocolsin MolecularBiology(F.M. Ausubel,et al.eds., (2003)); la serieMethodsin Enzymology(Academic Press, Inc.):PCR 2: A Practical Approach(M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988)Antibodies, A Laboratory Manual,yAnimal Cell Culture(R.l. Freshney, ed. (1987));Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;Animal Cell Culture(R.l. Freshney), ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mulliset al.,eds., 1994);Current Protocols in Immunology(J.E. Coliganet al.,eds., 1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999);Immunobiology(C.A. Janeway y P. Travers, 1997);Antibodies(P. Finch, 1997);Antibodies: A Practical Approach(D. Catty., ed., iRl Press, 1988-1989);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach(P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);Using Antibodies: A Laboratory Manual(E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies(M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); yCancer. Principles and Practice of Oncology(V.T. DeVitaet al.,eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
II. Definiciones
El término "TIGIT" o "inmunorreceptor de linfocitos T con dominios de Ig e ITIM" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier TIGIT natural de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. TIGIT también es conocido en la técnica como DKFZp667A205, FLJ39873, proteína 9 que contiene el dominio de inmunoglobulina y conjunto V, proteína 3 que contiene el dominio transmembranario y conjunto V, VSIG9, VSTM3 y WUCAM. El término engloba TIGIT "de longitud completa" sin procesar (por ejemplo, TIGIT humano de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 352), así como cualquier forma de TIGIT que resulta del procesamiento en la célula (por ejemplo, TIGIT humano procesado sin una secuencia señal, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 353). El término también engloba variantes naturales de TIGlT, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un TIGIT humano ejemplar se puede encontrar bajo el número de acceso UniProt Q495A1.
Los términos "anticuerpo anti-TIGIT" y "un anticuerpo que se une específicamente a TIGlT" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a TIGlT con afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección como diana de TIGIT. En un caso, el grado de unión de un anticuerpo anti-TIGIT a una proteína distinta de TIGlT no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a TIGlT como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados casos, un anticuerpo que se une a TIGlT tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |iM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M). En determinados casos, un anticuerpo anti-TIGIT se une a un epítopo del TIGlT que se conserva entre el TIGlT de diferentes especies o un epítopo en el TIGlT que permite la reactividad entre especies, tal como un epítopo que comprende los residuos aminoacídicos Ser78, Ser80 y Lys82.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas monocatenarias, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv). El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera intercambiable con "anticuerpo" en el presente documento.
El término un "anticuerpo aislado", cuando se usa para describir los diversos anticuerpos divulgados en el presente documento, quiere decir un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del que se expresó. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían típicamente con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunos casos, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o un 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatmanet al. J. Chromatogr.B 848:79-87 (2007). En casos preferentes, el anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso de un secuenciador de vaso giratorio, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerposin situdentro de células recombinantes, debido a que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
La unidad de anticuerpo tetracatenaria básica es una glucoproteína heterotetrámera compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional llamado cadena J, y contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA comprenden de 2-5 de las unidades tetracatenarias básicas que se pueden polimerizar para formar ensamblajes polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad tetracatenaria es, en general, de aproximadamente 150.000 dáltones. Cada cadena L se enlaza a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se enlazan entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el extremo N un dominio variable (V<h>) seguido de tres dominios constantes (C<h>) para cada una de las cadenas a y<y>y cuatro dominios C<h>para los isotipos<h>y £. Cada cadena L tiene, en el extremo N, un dominio variable (V<l>) seguido de un dominio constante en su otro extremo. El V<l>se alinea con el V<h>y el C<l>se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (C<h>1). Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. El emparejamiento de un V<h>y un V<l>conjuntamente forma un único sitio de unión a antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo,Basic and Clinical Immunology,8.a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6. La cadena L de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente diferenciados, llamados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, 8, £,<y>, y H, respectivamente. Las clases y y a se dividen además en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y función de CH, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: lgG1, lgG2A, lgG2B, lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera se pueden denominar "VH" y "VL", respectivamente. Estos dominios son, en general, las partes más variables del anticuerpo (en relación con otros anticuerpos de la misma clase) y contienen los sitios de unión a antígeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en toda la extensión de los dominios variables. En cambio, se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR), en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las HVR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al., Sequences of Immunological Interest,quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Un "anticuerpo bloqueador" o un "anticuerpo antagonista" es uno que inhibe o reduce una actividad biológica del antígeno al que se une. En algunos casos, los anticuerpos bloqueadores o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Los anticuerpos anti-TIGIT de la invención pueden bloquear la señalización a través de PVR, PVRL2 y/o PVRL3 para restaurar una respuesta funcional por linfocitos T (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana) desde un estado disfuncional a la estimulación de antígeno.
Un "epítopo" es la porción del antígeno a la que el anticuerpo se une específicamente. Para un antígeno polipeptídico, el epítopo es, en general, una porción peptídica de aproximadamente 4-15 residuos aminoacídicos, que pueden ser contiguos o no contiguos.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.
Por "parátopo" se quiere decir la parte de un anticuerpo que se une selectivamente al epítopo de un antígeno. El parátopo incluye típicamente aminoácidos de las cadenas VH y VL del anticuerpo y, en particular, de la(s) región/regiones HVR del anticuerpo.
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones y/o modificaciones postraduccionales naturales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en tanto que se sintetizan por el cultivo de hibridomas, no estando contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el procedimiento de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein,Nature,256:495-97 (1975); Hongoet al., Hybridoma,14 (3): 253-260 (1995), Harlowet al., Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerlinget al.,en:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681 (Elsevier, NY, 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, Clacksonet al., Nature,352: 624-628 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Sidhuet al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Leeet al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Felouse,Proc. Natl. Acad. SciUSA 101(34): 12467-12472 (2004); y Leeet al., J. Immunol. Methods.284(1-2): 119-132 (2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen partes o todos los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovitset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 2551 (1993); Jakobovitset al., Nature362: 255-258 (1993); Bruggemannet al., Year in Immunol.7:33 (1993); patentes de EE. UU. n.os 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Markset al., Bio/Technology10: 779-783 (1992); Lonberget al., Nature368: 856-859 (1994); Morrison,Nature368: 812-813 (1994); Fishwildet al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnol.
14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar,Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).
La expresión "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto citotóxico o radiomarcador.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, a diferencia de un fragmento de anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas pesadas y ligeras que incluyen una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. En algunos casos, el anticuerpo intacto puede tener una o más funciones efectoras.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase la patente de EE. UU. n.° 5.641.870, ejemplo 2; Zapataet al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo monocatenario y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (V<h>) y el primer dominio constante de una cadena pesada (C<h>1 ). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo proporciona un único fragmento F(ab')2 grande que se corresponde aproximadamente con dos fragmentos Fab enlazados por disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno diferente y todavía puede reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en que tienen unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxílico del dominio C<h>1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
El fragmento Fc comprende las porciones carboxiterminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fc, la región que también se reconoce por los receptores de Fc (FcR) encontrados en determinados tipos de células.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a y de reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de la región variable de una cadena pesada y una ligera en estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos aminoacídicos para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
"Fv monocatenario", también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo V<h>y V<l>conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V<h>y V<l>que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Pluckthun enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Los "fragmentos funcionales" de los anticuerpos de la invención comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que en general incluye la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto o la región Fc de un anticuerpo que conserva o ha modificado su capacidad de unión a FcR. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen anticuerpo lineal; moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados construyendo fragmentos sFv (véase el párrafo precedente) con conectores cortos (de aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios V<h>y V<l>de modo que se logra el emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado de este modo un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv de "entrecruzamiento" en los que los dominios V<h>y V<l>de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen con mayor detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448 (1993).
Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en los que la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, por la inmunización de monos macacos con un antígeno de interés. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humanizado" se usa como un subconjunto de "anticuerpos quiméricos".
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En un caso, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una HVR (definida a continuación en el presente documento) del receptor se reemplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural ("FR") de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar además el rendimiento del anticuerpo, tal como la afinidad de unión. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos de los bucles hipervariables corresponden a los de una secuencia de inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas de las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de residuos de FR individuales que mejoran el rendimiento del anticuerpo, tal como la afinidad de unión, la isomerización, la inmunogenicidad, etc. El número de estas sustituciones aminoacídicas en la FR es típicamente de no más de 6 en la cadena H y, en la cadena L, de no más de 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse, por ejemplo, Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-329 (1988); y Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Véanse también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton,Ann. Allergy, Asthma & Immunol.1:105-115 (1998); Harris,Biochem. Soc. Transactions23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross,Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); y las pat. de EE. UU. n.os 6.982.321 y 7.087.409.
Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter,J. Mol. Biol.,227:381 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.,222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los procedimientos descritos en Coleet al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerneret al., J. Immunol.,147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol.,5:368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero con locus endógenos que se han desactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Liet al.,Proc. Natl Acad Sci. USA,103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.
El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular desempeña un papel único al conferir una especificidad precisa a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xuet al., Immunity13:37-45 (2000); Johnson y Wu, enMethods in Molecular Biology248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido naturales que consisten en una cadena pesada solo son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Véanse, por ejemplo,Hamers-Casterman et al., Nature363:446-448 (1993); Sheriffet al., Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).
Una serie de delimitaciones de HVR están en uso y se engloban en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas más comúnmente (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk,J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un término medio entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89 96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabatet al., supra,para cada una de estas definiciones.
La expresión "numeración de residuos de dominio variable según Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos según Kabat", y variaciones de la misma, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabatet al., supra.Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una inserción de un único aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "estándar".
Los residuos de la "región estructural" o "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de HVR, como se define en el presente documento.
Una "región estructural consenso humana" o "región estructural humana aceptora" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias estructurales de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo según Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los ejemplos incluyen para el VL, el subgrupo puede ser el subgrupo kappa I, kappa II, kappa III o kappa IV según Kabat.et al., supra.Adicionalmente, para el VH, el subgrupo puede ser el subgrupo I, subgrupo II o subgrupo III según Kabatet al., supra.De forma alternativa, una región estructural consenso humana se puede derivar de lo anterior, en la que se seleccionan residuos particulares, tal como cuando se selecciona un residuo de la región estructural humano en base a su homología con respecto a la región estructural donante alineando la secuencia estructural donante con una colección de diversas secuencias estructurales humanas. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos preexistentes. En algunos casos, el número de cambios de aminoácidos preexistentes es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos.
Una "región estructural consenso del subgrupo III de VH" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III pesado variable de Kabatet al., supra.En un caso, la secuencia de aminoácidos de la región estructural consenso del subgrupo III de VH comprende al menos una porción o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVCir,GGSLRLSCAA& (HC-FR1) (SEQ ID NO:
229);WVRQAPGKGLEWV(,HU(C~-FR2) (,eSiE=QnI,DnNMOr>:.230);RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(HC-FR3) (SEQ ID NO: 232); y W G Q G T L V T V S A (HC-FR4) (SEQ ID NO: 232).
Una "región estructural consenso de kappa I de VL" comprende la secuencia consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo kappa I ligero variable de Kabatet al., supra.En un caso, la secuencia de aminoácidos de la región estructural consenso del subgrupo I de VH comprende al menos una porción o la totalidad de cada una de las siguientes secuencias: DlQMTQSPESLSASVGDRVTITC (LC-FR1) (SEQ ID NO: 233);
WYQQKPGKAPKLLIY<(LQ_FR2) (SEQ ID NO: 234);>GVPSRFSGSGSGTDFTLTIS3LQPEDFATYYC<(LC-FR3)>
<(SEQ ID NO: 235); y>FGQGTKVEIKR (LC.FR4)<(SEQ !D NO: 236).>
Una "modificación aminoacídica" en una posición especificada, por ejemplo, de la región Fc, se refiere a la sustitución o deleción del residuo especificado, o la inserción de al menos un residuo aminoacídico adyacente al residuo especificado. La inserción "adyacente" a un residuo especificado quiere decir la inserción dentro de uno a dos residuos del mismo. La inserción puede ser N terminal o C terminal con respecto al residuo especificado. La modificación aminoacídica preferente en el presente documento es una sustitución.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno, por ejemplo, TIGIT). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. En lo que sigue se describen casos ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo "con afinidad madurada" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee esa(s) alteración/alteraciones. En un caso, un anticuerpo con afinidad madurada tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos con afinidad madurada se producen por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Markset al., Bio/Technology10:779-783 (1992) describe la maduración de la afinidad por reordenamiento de los dominios de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de residuos de la HVR y/o de la región estructural se describe, por ejemplo, en: Barbaset al. Proc Nat. Acad. Sci. USA91:3809-3813 (1994); Schieret al. Gene169:147-155 (1995); Yeltonet al. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jacksonet al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); y Hawkinset al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
Como se usa en el presente documento, el término "se une", "se une específicamente a" o "es específico para" se refiere a interacciones medibles y reproducibles, tales como la unión entre una diana y un anticuerpo, lo que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas, incluyendo moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo) es un anticuerpo que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o durante mayor duración que con la que se une a otras dianas. En un caso, el grado de unión de un anticuerpo a una diana no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a la diana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados casos, un anticuerpo que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |iM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En determinados casos, un anticuerpo se une específicamente a un epítopo en una proteína que se conserva entre la proteína de diferentes especies. En otro caso, la unión específica puede incluir, pero no requiere, la unión exclusiva. El término como se usa en el presente documento se puede presentar, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd por la diana de 10'4 M o menor, de forma alternativa 10'5 M o menor, de forma alternativa 10'6 M o menor, de forma alternativa 10'7 M o menor, de forma alternativa 10'8 M o menor, de forma alternativa 10'9 M o menor, de forma alternativa 10'10 M o menor, de forma alternativa 10'11 M o menor, de forma alternativa 10'12 M o menor o una Kd en el intervalo de 10'4 M a 10'6 M o de 10'6 M a 10'10 M o de 10'7 M a 10'9 M. Como se apreciará por el experto en la técnica, los valores de afinidad y Kd están inversamente relacionados. Una alta afinidad por un antígeno se mide por un bajo valor de Kd. En un caso, el término "unión específica" se refiere a la unión donde una molécula se une a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es típicamente una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. En un caso en particular preferente, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3 o las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina, véase también la patente de EE. UU. n.° 5.428.130 expedida el 27 de junio de 1995.
Una "proteína de fusión" y un "polipéptido de fusión" se refieren a un polipéptido que tiene dos porciones enlazadas de forma covalente, donde cada una de las porciones es un polipéptido que tiene una propiedad diferente. La propiedad puede ser una propiedad biológica, tal como actividadin vitrooin vivo.La propiedad también puede ser una propiedad química o física simple, tal como unión a una molécula diana, catálisis de una reacción, etc. Las dos porciones se pueden enlazar directamente por un enlace peptídico único o a través de un conector peptídico, pero están en marco de lectura entre sí.
El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente para que se extienda de un residuo aminoacídico en la posición Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la misma. La lisina C terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc se puede retirar, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o genomanipulando de forma recombinante el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. En consecuencia, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 retirados, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 retirados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
"Receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas de forma alternativa de estos receptores, los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y F<cy>RIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (véase M. Daeron,Annu. Rev. Immunol.15:203-234 (1997). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991); Capelet al., Immunomethods4: 25-34 (1994); y de Haaset al., J. Lab. Clin. Med.126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se vayan a identificar en el futuro, se engloban por el término "FcR" en el presente documento.
Las "células efectoras humanas" se refieren a leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En determinados casos, las células expresan al menos FcyRIII y realizan función/funciones efectora(s) de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente natural, por ejemplo, de sangre.
Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparativa) de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de significación estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores, por ejemplo, es mayor que aproximadamente un 10 %, mayor que aproximadamente un 20 %, mayor que aproximadamente un 30 %, mayor que aproximadamente un 40 % y/o mayor que aproximadamente un 50 % en función del valor para la molécula de referencia/comparativa.
La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparativo), de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna significación biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores, por ejemplo, es de menos de aproximadamente un 50 %, de menos de aproximadamente un 40 %, de menos de aproximadamente un 30 %, de menos de aproximadamente un 20 % y/o de menos de aproximadamente un 10 % en función del valor de referencia/comparativo.
El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido natural divulgado en el presente documento. De manera similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido natural divulgado en el presente documento. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas naturales, etc. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo antagonista" de una molécula diana se refiere a un anticuerpo que interfiere con el funcionamiento normal de la molécula diana, disminuyendo la transcripción o la traducción del ácido nucleico que codifica la molécula diana, o bien inhibiendo o bloqueando la actividad de la molécula diana, o ambos. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista de TIGIT se puede considerar un anticuerpo, o un fragmento de unión anti-TIGIT del mismo, que interfiere con el funcionamiento normal de TIGIT, disminuyendo la transcripción o la traducción del ácido nucleico que codifica TIGIT, o bien inhibiendo o bloqueando la actividad del polipéptido TIGIT, o ambos. Se entenderá por un experto en la técnica que, en algunos casos, un anticuerpo antagonista de TIGIT puede antagonizar una actividad de TIGIT sin afectar otra actividad de TIGIT. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista deseable de TIGIT para su uso en determinados procedimientos en el presente documento es un anticuerpo antagonista de TIGIT que antagoniza la actividad de TIGIT en respuesta a una de la interacción con PVR, la interacción con PVRL3 o la interacción con PVRL2, por ejemplo, sin afectar, o afectando mínimamente, ninguna de las otras interacciones con TIGIT.
Los términos "antagonista de TIGIT" y "antagonista de la actividad de TIGIT o expresión de TIGIT" se usan de manera intercambiable y se refieren a un compuesto que interfiere con el funcionamiento normal de TIGIT, disminuyendo la transcripción o la traducción del ácido nucleico que codifica TIGIT, o bien inhibiendo o bloqueando la actividad del polipéptido TIGIT, o ambos. Los ejemplos de antagonistas de TIGIT incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos antisentido, ARN interferentes, ARN catalíticos, quimeras ARN-ADN, aptámeros específicos de TIGIT, anticuerpos anti-TIGIT, fragmentos de unión a TIGIT de anticuerpos anti-TIGIT, moléculas pequeñas de unión a TIGIT, péptidos de unión a TIGIT y otros polipéptidos que se unen específicamente a TIGIT (incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos de unión a TIGIT de uno o más ligandos de TIGIT, opcionalmente fusionados a uno o más dominios adicionales), de modo que la interacción entre el antagonista de TIGIT y TIGIT da como resultado una reducción o cese de la actividad o expresión de TIGIT. Se entenderá por un experto en la técnica que, en algunos casos, un antagonista de TIGIT puede antagonizar una actividad de TIGIT sin afectar otra actividad de TIGIT. Por ejemplo, un antagonista de TIGIT deseable para su uso en determinados de los procedimientos en el presente documento es un antagonista de TIGIT que antagoniza la actividad de TIGIT en respuesta a una de la interacción con PVR, la interacción con PVRL3 o la interacción con PVRL2, por ejemplo, sin afectar, o afectando mínimamente, ninguna de las otras interacciones con TIGIT.
Los términos "antagonista de PVR" y "antagonista de la actividad de PVR o expresión de PVR" se usan de manera intercambiable y se refieren a un compuesto que interfiere con el funcionamiento normal de PVR, disminuyendo la transcripción o la traducción del ácido nucleico que codifica PVR, o bien inhibiendo o bloqueando la actividad del polipéptido PVR, o ambos. Los ejemplos de antagonistas de PVR incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos antisentido, ARN interferentes, a Rn catalíticos, quimeras ARN-ADN, aptámeros específicos de PVR, anticuerpos anti-PVR, fragmentos de unión a PVR de anticuerpos anti-PVR, moléculas pequeñas de unión a PVR, péptidos de unión a PVR y otros polipéptidos que se unen específicamente a PVR (incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos de unión a pVr de uno o más ligandos de PVR, opcionalmente fusionados a uno o más dominios adicionales), de modo que la interacción entre el antagonista de PVR y PVR da como resultado una reducción o cese de la actividad 0 expresión de PVR. Se entenderá por un experto en la técnica que, en algunos casos, un antagonista de PVR puede antagonizar una actividad de PVR sin afectar otra actividad de PVR. Por ejemplo, un antagonista de PVR deseable para su uso en determinados de los procedimientos en el presente documento es un antagonista de PVR que antagoniza la actividad de PVR en respuesta a la interacción con TIGIT sin afectar a las interacciones PVR-CD96 y/o PVR-CD226.
El término "antagonista de unión al eje PD-1" se refiere a una molécula que inhibe la interacción de un compañero de unión al eje PD-1 con uno o bien más de sus compañeros de unión, para retirar la disfunción de los linfocitos T resultante de la señalización en el eje de señalización de PD-1, siendo un resultado el restablecimiento o potenciación de la función de los linfocitos T (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana). Como se usa en el presente documento, un antagonista de unión al eje PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.
El término "antagonista de unión a PD-1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. En un caso, un antagonista de unión a PD-1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-1, para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras con respecto al reconocimiento de antígeno). En algunos casos, el antagonista de unión de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1. En un aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MDX-1106 (nivolumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MK-3475 (lambrolizumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es CT-011 (pidilizumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MEDI-0680 (AMP-514), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es PDR001 descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es REGN2810 descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es BGB-108 descrito en el presente documento.
El término "antagonista de unión a PD-L1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o bien más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En algunos casos, un antagonista de unión de PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 y/o B7-1. En algunos casos, los antagonistas de unión a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En un caso, un antagonista de unión a PD-L1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-L1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras con respecto al reconocimiento de antígeno). En algunos casos, un antagonista de unión de PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En un aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es YW243.55.S70, descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105, descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab) descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736 (druvalumab), descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es YW243.55.S70, descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PDL1 es MSB0010718C (avelumab), descrito en el presente documento.
El término "antagonista de unión a PD-L2" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o bien más de sus compañeros de unión, tales como PD-1. En algunos casos, un antagonista de unión a PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L2 inhibe la unión de PD-L2 a PD-1. En algunos casos, los antagonistas de PD-L2 incluyen anticuerpos anti-PD-L2, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o bien más de sus compañeros de unión, tales como PD-1. En un caso, un antagonista de unión a PD-L2 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-L2, para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras con respecto al reconocimiento de antígeno). En algunos casos, un antagonista de unión a PD-L2 es una inmunoadhesina.
El término "disfunción", en el contexto de la disfunción inmunitaria, se refiere a un estado de reactividad inmunitaria reducida a la estimulación antigénica.
El término "disfuncional", como se usa en el presente documento, también incluye resistente o insensible al reconocimiento de antígeno, específicamente, la capacidad alterada de traducir el reconocimiento de antígeno en funciones efectoras de linfocitos T en dirección 3', tales como proliferación, producción de citocinas (por ejemplo, interferón gamma) y/o destrucción de células diana.
"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que las inmunoglobulinas secretadas unidas sobre receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo linfocitos NK, neutrófilos y macrófagos) posibilitan que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan F<cy>RI, F<cy>R<i>I y F<cy>RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCCin vitro,tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337 o la patente de EE. Uu . n.° 6.737.056 (Presta). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen PBMC y linfocitos NK. De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interésin vivo,por ejemplo, en un modelo animal, tal como el divulgado en Clyneset al. PNAS (USA)95:652-656 (1998). Se proporciona un ensayo ejemplar para evaluar la actividad de ADCC en los ejemplos en el presente documento.
El término "anergia" se refiere al estado de insensibilidad a la estimulación antigénica resultante de señales incompletas o insuficientes emitidas a través del receptor de linfocitos T (por ejemplo, incremento del Ca2+ intracelular en ausencia de activación de Ras). La anergia de linfocitos T también puede ser el resultado de la estimulación con antígeno en ausencia de coestimulación, lo que da como resultado que la célula se vuelva resistente a la activación posterior por el antígeno, incluso en el contexto de coestimulación. El estado insensible a menudo se puede invalidar por la presencia de interleucina 2 (IL-2). Los linfocitos T anérgicos no experimentan expansión clónica y/o adquieren funciones efectoras.
"Potenciar la función de los linfocitos T" quiere decir inducir, provocar o estimular un linfocito T efector o de memoria para que tenga una función biológica renovada, mantenida o amplificada. Los ejemplos de potenciación de la función de los linfocitos T incluyen: secreción incrementada de interferón y de los linfocitos T efectores CD8+, secreción incrementada de interferón<y>de los linfocitos T de memoria y/o efectores CD4+, proliferación incrementada de linfocitos T efectores y/o de memoria CD4+, proliferación incrementada de linfocitos T efectores CD8+, reactividad a antígeno incrementada (por ejemplo, depuración), en relación con dichos niveles antes de la intervención. En un caso, el nivel de potenciación es al menos de un 50 %, de forma alternativa de un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %. La manera de medir esta potenciación es conocida por un experto en la técnica.
El término "agotamiento" se refiere al agotamiento de linfocitos T como un estado de disfunción de los linfocitos T que surge de la señalización de TCR mantenida que se produce durante muchas infecciones crónicas y cáncer. Se distingue de la anergia por que surge no a través de señalización incompleta o insuficiente, sino de señalización mantenida. Se define por una mala función efectora, expresión mantenida de receptores inhibidores y un estado transcripcional distinto del de los linfocitos T de memoria o efectores funcionales. El agotamiento evita el control óptimo de infecciones y tumores. El agotamiento puede resultar tanto de las vías reguladoras negativas extrínsecas (por ejemplo, citocinas inmunorreguladoras) así como de las vías reguladoras (coestimuladoras) negativas intrínsecas celulares (PD-1, B7-H3, B7-H4, etc.).
"Potenciar la función de los linfocitos T" quiere decir inducir, provocar o estimular que un linfocito T tenga una función biológica mantenida o amplificada, o renovar o reactivar linfocitos T agotados o inactivos. Los ejemplos de potenciación de la función de linfocitos T incluyen: secreción incrementada de interferón y de los linfocitos T CD8+, proliferación incrementada, reactividad a antígeno incrementada (por ejemplo, depuración vírica, patógena o tumoral) en relación con dichos niveles antes de la intervención. En un caso, el nivel de potenciación es como mínimo de un 50 %, de forma alternativa de un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %. La manera de medir esta potenciación es conocida por un experto en la técnica.
Un "trastorno disfuncional de linfocitos T" es un trastorno o estado de los linfocitos T caracterizado por una reactividad disminuida a la estimulación antigénica. En otro caso, un trastorno disfuncional de linfocitos T es uno en el que los linfocitos T son anérgicos o tienen una capacidad disminuida de secretar citocinas, proliferar o ejecutar la actividad citolítica. En un aspecto específico, la reactividad disminuida da como resultado un control ineficaz de un patógeno o tumor que expresa un inmunógeno. Los ejemplos de trastornos disfuncionales de linfocitos T caracterizados por la disfunción de linfocitos T incluyen infección aguda, infección crónica e inmunidad tumoral sin resolver.
La "inmunidad tumoral" se refiere al proceso en el que los tumores evaden el reconocimiento y la depuración inmunitarios. Por tanto, como concepto terapéutico, la inmunidad tumoral se "trata" cuando dicha evasión se atenúa y los tumores se reconocen y atacan por el sistema inmunitario. Los ejemplos de reconocimiento tumoral incluyen unión tumoral, reducción del volumen tumoral y eliminación tumoral.
"Inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de una sustancia particular de provocar una respuesta inmunitaria. Los tumores son inmunógenos y la potenciación de la inmunogenicidad tumoral ayuda en la eliminación de las células tumorales por la respuesta inmunitaria.
"Respuesta mantenida" se refiere al efecto mantenido en la reducción del crecimiento tumoral después del cese de un tratamiento. Por ejemplo, el tamaño del tumor puede permanecer igual o más pequeño en comparación con el tamaño al comienzo de la fase de administración. En algunos casos, la respuesta mantenida tiene una duración al menos igual a la duración del tratamiento, al menos 1,5X, 2,0X, 2,5X o 3,0X de duración de la duración del tratamiento.
Los "vehículos", como se usan en el presente documento, incluyen vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que está expuesto a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alditoles, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
Un "prospecto del envase" se refiere a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de medicamentos que contienen información sobre las indicaciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de medicamentos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros medicamentos que se van a combinar con el producto envasado, y/o advertencias en relación con el uso de dichos medicamentos, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a la intervención clínica diseñada para alterar la evolución natural del individuo o la célula que se trata durante la evolución de la afección clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen disminuir la tasa de progresión de enfermedad, mejorar o atenuar el grado de actividad y la remisión o pronóstico mejorado. Por ejemplo, se "trata" a un individuo satisfactoriamente si uno o más síntomas asociados con el cáncer se mitigan o eliminan, lo que incluye, pero no se limita a, reducir la proliferación de (o destruir) las células cancerosas, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, incrementar la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos.
Como se usa en el presente documento, "retrasar la progresión de una enfermedad" quiere decir diferir, dificultar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer la aparición de la enfermedad (tal como el cáncer). Este retraso puede tener duraciones de tiempo variables dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que se trata. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede englobar, en efecto, la prevención, ya que el individuo no padece la enfermedad. Por ejemplo, se puede retrasar un cáncer en estadio terminal, tal como la aparición de metástasis.
Como se usa en el presente documento, el término "reducir o inhibir la recidiva del cáncer' quiere decir reducir o inhibir la recidiva del tumor o del cáncer o la progresión del tumor o del cáncer.
Como se usan en el presente documento, "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. En esta definición se incluyen las neoplasias benignas y malignas, así como los tumores latentes o micrometástasis. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, mieloma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen mieloma múltiple (MM), cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón de células escamosas), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo el linfoma no hodgkiniano (LNH) folicular/de escasa malignidad; LNH linfocítico pequeño (LP); LNH folicular/de malignidad intermedia; LNH difuso de malignidad intermedia; LNH inmunoblástico de gran malignidad; LNH linfoblástico de gran malignidad; LNH de células pequeñas no hendidas de gran malignidad; LNH con gran masa tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el sida; y macroglobulinemia de Waldenstrom), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), tricoleucemia, leucemia mieloblástica crónica y trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT), así como proliferación vascular anómala asociada con las facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs.
El término "tumor" se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se hace referencia en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "metástasis" quiere decir la propagación del cáncer desde su sitio primario a otros lugares del cuerpo. Las células cancerosas se pueden separar de un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través de la circulación sanguínea y crecer en un foco a distancia (metastatizar) en los tejidos normales en cualquier parte del cuerpo. Las metástasis pueden ser locales o a distancia. La metástasis es un proceso secuencial, dependiente de que las células tumorales se separen del tumor primario, se desplacen a través de la circulación sanguínea y se detengan en un sitio a distancia. En el nuevo sitio, las células establecen un riego sanguíneo y pueden crecer para formar una masa potencialmente mortal. Tanto las vías moleculares estimuladoras como inhibidoras dentro de la célula tumoral regulan este comportamiento, y las interacciones entre la célula tumoral y las células huésped en el sitio a distancia también son significativas.
Una "cantidad eficaz" es al menos la concentración mínima necesaria para conseguir una mejora o prevención medible de un trastorno particular. Una cantidad eficaz en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como el grado de actividad, edad, sexo y peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del tratamiento se compensa con los efectos terapéuticamente beneficiosos. Para su uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante la aparición de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como disminuir uno o más síntomas que resultan de la enfermedad, incrementar la calidad de vida de los que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, potenciar el efecto de otro medicamento tal como por medio de selección, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia. En el caso de cáncer o tumor, una cantidad eficaz del fármaco puede tener el efecto de reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida o, deseablemente, detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y, deseablemente, detener) la metástasis tumoral; inhibir en cierta medida el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico directa o bien indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica se puede lograr o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una "cantidad eficaz" se puede considerar en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y un único agente se puede considerar que se da en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede lograr o se logra un resultado deseable.
Como se usa en el presente documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.
Como se usa en el presente documento, "sujeto" o "individuo" quiere decir un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferentemente, el sujeto es un ser humano. Los pacientes también son sujetos en el presente documento.
El "agente quimioterápico" incluye compuestos químicos útiles en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), disulfiram, galato de epigalocatequina, salinosporamida A, carfilzomib, 17-AAG (geldanamicina), radicicol, lactato deshidrogenasa A (LDH-A), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), sunitib (SUTENT®, Pfizer/Sugen), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), finasunato (VATALANIB®, Novartis), oxaliplatino (ELOXATIN®, Sanofi), 5-FU (5-fluorouracilo), ácido folínico, rapamicina (sirólimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (NEXAVAR®, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquisulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aciridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo topotecán e irinotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); adrenocorticoesteroides (incluyendo prednisona y prednisolona); acetato de ciproterona; 5a-reductasas incluyendo finasteride y dutasteride); vorinostat, romidepsina, panobinostat, ácido valproico, mocetinostat dolastatina; aldesleucina, talco duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uramustina; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina y1I y calicheamicina w1l (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 33:183-186); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y los cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® (doxorubicina), morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico, tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diacicuona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamnol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo polisacarídico PSK® (j Hs Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triacicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® (sin cremofor), formulaciones de nanopartículas de paclitaxel genomanipuladas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III.) y TAXOTERE® (docetaxel, doxetaxel; Sanofi-Aventis); cloranmbucilo; GEMZAR® (gemcitabina); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® (vinorelbina); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®); ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
El agente quimioterápico también incluye (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor estrogénico (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROmAs IN® (exemestano; Pfizer), formestano, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) y ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprorrelina y goserelina; buserelina, tripterelina, acetato de medroxiprogesterona, dietilestilbestrol, premarina, fluoximesterona, tretinoína, fenretinida, así como troxacitabina (un análogo 1,3-dioxolano de nucleósido citosina); (iv) inhibidores de proteína cinasa; (v) inhibidores de lípido cinasa; (vi) oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación de células anómalas, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; (vii) ribocimas, tales como inhibidores de la expresión de VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME®) e inhibidores de la expresión de HER2; (viii) vacunas, tales como vacunas para el tratamiento génico, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® y VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; un inhibidor de topoisomerasa 1, tal como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y (ix) sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
El agente quimioterápico también incluye anticuerpos, tales como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECT<i>B<i>X®, Amgen), rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (O<m>NITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia) y el conjugado anticuerpo-fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth). Los anticuerpos monoclonales humanizados adicionales con potencial terapéutico como agentes en combinación con los compuestos de la invención incluyen: apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tucotuzumab celmoleucina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, ustekinumab, visilizumab y antiinterleucina 12 (ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories), que es un anticuerpo IgG1 A de longitud completa de secuencia exclusivamente humana recombinante genéticamente modificado para reconocer la proteína p40 de interleucina 12.
El agente quimioterápico también incluye "inhibidores de EGFR", que se refiere a compuestos que se unen a o de otro modo interactúan directamente con EGFR y evitan o reducen su actividad de señalización, y se denomina de forma alternativa "antagonista de EGFR". Los ejemplos de dichos agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase la patente de EE. UU. n.° 4.943.533, Mendelsohnet al.)y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o cetuximab; ERBUTIX®) y 225 humano (H225) remodelado (véase, el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, un anticuerpo dirigido a EGFR completamente humano (Imclone); anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (patente de EE. UU. n.° 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, tales como ABX-EGF o panitumumab (véase el documento WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliottoet al.Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab), un anticuerpo para EGFR humanizado dirigido frente a EGFR que compite tanto con EGF como con TGF-alfa por la unión a EGFR (EMD/Merck); anticuerpo para EGFR humano, HuMax-EGFR (GenMab); anticuerpos completamente humanos conocidos como E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 y e 7.6. 3 y descritos en el documento US 6.235.883; MDX-447 (Medarex Inc); y mAb 806 o mAb humanizado 806 (Johnset al.,J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). El anticuerpo anti-EGFR se puede conjugar con un agente citotóxico, generando, por tanto, un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, el documento EP659.439A2, Merck Patent GmbH). Los antagonistas de EGFR incluyen moléculas pequeñas, tales como los compuestos descritos en las patentes de EE. UU. n.os 5.616.582, 5.457.105, 5.475.001, 5.654.307, 5.679.683, 6.084.095, 6.265.410, 6.455.534, 6.521.620, 6.596.726, 6.713.484, 5.770.599, 6.140.332, 5.866.572, 6.399.602, 6.344.459, 6.602.863, 6.391.874, 6.344.455, 5.760.041, 6.002.008 y 5.747.498, así como las siguientes publicaciones PCT: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 y WO99/24037. Los antagonistas de EGFR de molécula pequeña particulares incluyen OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (Cl 1033, 2-propenamida, N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propoxi]-6-quinazolinil]-, diclorhidrato, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) (4-(3'-cloro-4'-fluoroanilino)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolina, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-quinazolina, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4-d]pirimidin-2,8-diamina, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroxifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina); CL-387785 (N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida); EKB-569 (N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-3-ciano-7-etoxi-6-quinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamida) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); inhibidores dobles de tirosina cinasas para EGFR/HER2, tales como lapatinib (TYKERB®, GSK572016 o N-[3-cloro-4-[(3-fluorofenil)metoxi]fenil]-6[5[[[(2-metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-quinazolinamina).
Los agentes quimioterápicos también incluyen "inhibidores de tirosina cinasas", incluyendo los fármacos dirigidos a EGFR indicados en el párrafo precedente; inhibidor de tirosina cinasa para HER2 de molécula pequeña, tal como TAK165, disponible de Takeda; CP-724.714, un inhibidor selectivo oral de tirosina cinasa receptora ErbB2 (Pfizer y OSI); inhibidores dobles de HER, tales como EKB-569 (disponible de Wyeth), que se une preferentemente a EGFR, pero inhibe las células que sobreexpresan tanto HER2 como EGFR; lapatinib (GSK572016; disponible de Glaxo-SmithKline), un inhibidor de tirosina cinasa oral para HER2 y EGFR; PKI-166 (disponible de Novartis); inhibidores de pan-HER, tales como canertinib (CI-1033; Pharmacia); inhibidores de Raf-1, tales como el agente antisentido ISIS-5132, disponible de ISIS Pharmaceuticals, que inhiben la señalización de Raf-1; inhibidores de TK no dirigidos a HER, tales como mesilato de imatinib (GLEEVEC®, disponible de Glaxo SmithKline); inhibidores de tirosina cinasas con múltiples dianas, tales como sunitinib (SUTENT®, disponible de Pfizer); inhibidores de tirosina cinasas receptoras de VEGF, tales como vatalanib (PTK787/ZK222584, disponible de Novartis/Schering AG); inhibidor de cinasas I reguladas extracelularmente para MAPK CI-1040 (disponible de Pharmacia); quinazolinas, tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina (diferuloilmetano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contienen restos nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antisentido (por ejemplo, las que se unen a ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (patente de EE. UU. n.° 5.804.396); trifostinas (patente de EE. UU. n.° 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inhibidores de pan-HER, tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaxinib (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), rapamicina (sirólimus, RAPAMUNE®); o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: patente de EE. UU. n.° 5.804.396; documentos WO1999/09016 (American Cyanamid); w O 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) y WO 1996/33980 (Zeneca).
Los agentes quimioterápicos también incluyen dexametasona, interferones, colquicina, metoprina, ciclosporina, anfotericina, metronidazol, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, amifostina, trióxido de arsénico, asparaginasa, BCG viva, bevacuzimab, bexaroteno, cladribina, clofarabina, darbepoetina alfa, denileucina, dexrazoxano, epoetina alfa, elotinib, filgrastim, acetato de histrelina, ibritumomab, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, lenalidomida, levamisol, mesna, metoxaleno, nandrolona, nelarabina, nofetumomab, oprelvecina, palifermina, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pemetrexed disódico, plicamicina, porfímero de sodio, mepacrina, rasburicasa, sargramostim, temozolomida, VM-26, 6-TG, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrrubicina, zoledronato y ácido zoledrónico, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Los agentes quimioterápicos también incluyen hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, acetato de cortisona, pivalato de tixocortol, acetónido de triamcinolona, alcohol de triamcinolona, mometasona, amcinónida, budesónida, desónida, fluocinónida, acetónido de fluocinolona, betametasona, fosfato sódico de betametasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, fluocortolona, 17-butirato de hidrocortisona, 17-valerato de hidrocortisona, dipropionato de aclometasona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, prednicarbato, 17-butirato de clobetasona, 17-propionato de clobetasol, caproato de fluocortolona, pivalato de fluocortolona y acetato de fluprednideno; péptidos antinflamatorios selectivos inmunitarios (ImSAID), tales como fenilalanina-glutaminaglicina (FEG) y su forma D-isómera (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); fármacos antirreumáticos, tales como azatioprina, ciclosporina (ciclosporina A), D-penicilamina, sales de oro, hidroxicloroquina, leflunomideminociclina, sulfasalazina, bloqueantes del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), tales como etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade), adalimumab (Humira), certolizumab pegol (Cimzia), golimumab (Simponi), bloqueantes de interleucina 1 (IL-1), tales como anakinra (Kineret), bloqueantes de la coestimulación de linfocitos T, tales como abatacept (Orencia), bloqueantes de interleucina 6 (IL-6), tales como tocilizumab (ACTEMERA®); bloqueantes de interleucina 13 (IL-13), tales como lebrikizumab; bloqueantes de interferón (IFN) alfa, tales como rontalizumab; bloqueantes de integrina beta-7, tales como rhuMAb Beta7; bloqueantes de la vía de IgE, tales como anti-M1 prime; bloqueantes de heterotrímero LTa1/p2 unido a membrana y LTa3 homotrimérica secretadas, tales como anti-linfotoxina alfa (LTa); isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); diversos agentes en fase de investigación, tales como tioplatino, PS-341, fenilbutirato, ET-18-OCH3 o inhibidores de farnesiltransferasa (L-739749, L-744832); polifenoles, tales como quercetina, resveratrol, piceatanol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavanoles, procianidinas, ácido betulínico y derivados de los mismos; inhibidores de autofagia, tales como cloroquina; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas, ácido betulínico; acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); podofilotoxina; tegafur (UFTORAL®); bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROc Al®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas, tales como la vacuna THERATOPE®; perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2, tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de farnesiltransferasa, tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASARTM); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, abreviatura para un tratamiento combinado de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATINTM) combinado con 5-FU y ácido folínico.
Los agentes quimioterápicos también incluyen antinflamatorios no esteroideos con efectos analgésicos, antitérmicos y antinflamatorios. Los AINE incluyen inhibidores no selectivos de la enzima cicloxigenasa. Los ejemplos específicos de AINE incluyen aspirina, derivados de ácido propiónico, tales como ibuprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina y naproxeno, derivados de ácido acético, tales como indometacina, sulindaco, etodolaco, diclofenaco, derivados de ácido enólico, tales como piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lornoxicam e isoxicam, derivados de ácido fenámico, tales como ácido mefenámico, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, ácido tolfenámico e inhibidores de COX-2, tales como celecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, parecoxib, rofecoxib, rofecoxib y valdecoxib. Los AINE pueden estar indicados para el alivio sintomático de afecciones, tales como artritis reumatoide, artrosis, artropatías inflamatorias, espondiloartritis anquilosante, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, gota aguda, dismenorrea, dolor óseo metastásico, cefalea y jaqueca, dolor posoperatorio, dolor de leve a moderado debido a inflamación y lesión tisular, fiebre, íleo y cólico renal.
Como se usa en el presente documento, el término "citocina" se refiere genéricamente a proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares o tienen un efecto autocrino sobre las células que producen las proteínas. Los ejemplos de dichas citocinas incluyen linfocinas, monocinas; interleucinas ("IL"), tales como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, de IL-18 a IL-29 (tal como IL-23), IL-31, incluyendo PROLEUKIN® rIL-2; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-a o TNF-p, TGF-p1-3; y otros factores polipeptídicos que incluyen factor inhibidor de leucemia ("LIF"), factor neurotrófico ciliar ("CNTF"), citocina similar a CNTF ("CLC"), cardiotrofina ("CT") y el ligando kit ("KL").
Como se usa en el presente documento, el término "quimiocina" se refiere a factores solubles (por ejemplo, citocinas) que tienen la capacidad de inducir selectivamente la quimiotaxia y la activación de leucocitos. También desencadenan procesos de angiogénesis, inflamación, cicatrización y oncogénesis. Los ejemplos de quimiocinas incluyen IL-8, un homólogo humano de factor quimiotáctico de queratinocitos (KC) murino.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo de inmediato precedente usando el programa informático ALIGN-2.
La frase "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser química y/o toxicológicamente compatible con los demás ingredientes que comprende una formulación y/o con el mamífero que se trata con la misma.
Como se usa en el presente documento, "administrar" quiere decir un procedimiento de dar una dosificación de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-TIGIT de la invención o un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-TIGIT de la invención) o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención) a un sujeto. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento se pueden administrar, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intravítrea (por ejemplo, por inyección intravítrea), por colirio, por vía intradérmica, percutánea, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, intraorbitaria, oral, tópica, transdérmica, por inhalación, por inyección, por implantación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada bañando directamente las células diana, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento también se pueden administrar por vía sistémica o local. El procedimiento de administración puede variar dependiendo de diversos factores (por ejemplo, el compuesto o composición que se administra y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno que se trata).
El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico a la que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. Determinados vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de los genes a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes" o "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están, a menudo, en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera intercambiable.
El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error habitual para el respectivo valor fácilmente conocido para el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que están dirigidos a ese valor o parámetroper se.
III. Anticuerpos anti-TIGIT ejemplares
En el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-TIGIT útiles para tratar o retrasar la progresión del cáncer o una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario (por ejemplo, un trastorno disfuncional de linfocitos T) en un sujeto (por ejemplo, un ser humano).
En un ejemplo, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye uno o más residuos aminoacídicos (por ejemplo, 1, 2 o 3 residuos aminoacídicos) seleccionados del grupo que consiste en Ser78, Ser80 y Lys82 del TIGIT humano. Por ejemplo, en algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Ser80 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Ser78 y Ser80. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Ser78 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Ser78, Ser80 y Lys82.
En otro ejemplo, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye uno o más residuos aminoacídicos (por ejemplo, 1, 2 o 3 residuos aminoacídicos) seleccionados del grupo que consiste en Thr55, Ser80 y Lys82 del TIGIT humano. Por ejemplo, en algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye el residuo aminoacídico Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Ser80 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Thr55 y Ser80. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Thr55 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Thr55, Ser80 y Lys82.
En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye, además de Thr55, Ser80 y/o Lys82, el residuo Gln56 del TIGIT humano. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el T<i>GIT humano que incluye Thr55 y Gln56; Ser80 y Gln56; Lys82 y Gln56; Thr55, Ser80 y Gln56; Thr55, Lys82 y Gln56; Ser80, Lys82 y Gln56; o Thr55, Ser80, Lys82 y Gln56.
En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye, además de Thr55, Ser80 y/o Lys82, uno o más residuos aminoacídicos adicionales (por ejemplo, 1, 2 o 3 residuos aminoacídicos) seleccionados del grupo que consiste en Asn58, Glu60, Ile77 y Pro79 del TIGIT humano. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55 y Asn58; Thr55 y Glu60; Ser80 y Asn58; Ser80 y Glu60; Lys82 y Asn58; Lys82 y Glu60; Thr55 e Ile77; Ser80 e Ile77; Lys82 e Ile77; Thr55 y Pro79; Ser80 y Pro79; Lys82 y Pro79. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55, Ser80 y Asn58; Thr55, Ser80 y Glu60; Thr55, Ser80 e IIe77; Thr55, Ser80 y Pro79; Ser80, Lys82 y Asn58; Ser80, Lys82 y Glu60; Ser80, Lys82 e Ile77; Ser80, Lys82 y Pro79; Thr55, Lys82 y Asn58; Thr55, Lys82 y Glu60; Thr55, Lys82 e IIe77; Thr55, Lys82 y Pro79. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55, Ser80, Lys82 y Asn58; Thr55, Ser80, Lys82 y Glu60; Thr55, Ser80, Lys82 e IIe77; Thr55, Ser80, Lys82 y Pro79. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Asn58, Ile77 y Thr55; Glu60, IIe77 y Thr55; Asn58, IIe77 y Ser80; Glu60, Ile77 y Ser80; Asn58, Ile77 y Lys82; Glu60, Ile77 y Lys82; Ile77, Pro79 y Thr55; Ile77, Pro79 y Ser80; Ile77, Pro79 y Lys82; Glu60, Pro79 y Thr55; Asn58, Pro79 y Ser80; Glu60, Pro79 y Ser80; Asn58, Pro79 y Lys82; Glu60, Pro79 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Asn58, IIe77, Pro79 y Thr55; Glu60, Ile77, Pro79 y Thr55; Asn58, Ile77, Pro79 y Ser80; Glu60, Ile77, Pro79 y Ser80; Asn58, Ile77, Pro79 y Lys82; Glu60, IIe77, Pro79 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Asn58, IIe77, Thr55 y Ser80; Glu60, IIe77, Thr55 y Ser80; Asn58, IIe77, Thr55 y Lys82; Glu60, Ile77, Thr55 y Lys82; Asn58, IIe77, Ser80 y Lys82; Glu60, Ile77, Ser80 y Lys82; Ile77, Pro79, Thr55 y Ser80; Ile77, Pro79, Thr55 y Lys82; Ile77, Pro79, Ser80 y Lys82; IIe77, Asn58, Thr55 y Ser80; IIe77, Glu60, Thr55 y Ser80; IIe77, Asn58, Thr55 y Lys82; Ile77, Asn58, Thr55 y Lys82; Ile77, Glu60, Thr55 y Lys82; Ile77, Asn58, Ser80 y Lys82; IIe77, Glu60, Ser80 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Asn58, IIe77, Thr55, Ser80 y Lys82; Glu60, Ile77, Thr55, Ser80 y Lys82; Ile77, Pro79, Thr55, Ser80 y Lys82; Asn58, Ile77, Thr55, Ser80 y Lys82; Glu60, Ile77, Thr55, Ser80 y Lys82. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55, Ser80, Asn58, IIe77 y Pro79; Thr55, Ser80, Glu60, IIe77 y Pro79; Thr55, Lys82, Asn58, Ile77 y Pro79; Thr55, Lys82, Glu60, Ile77 y Pro79; Ser80, Lys82, Asn58, IIe77 y Pro79; y Ser80, Lys82, Glu60, IIe77 y Pro79. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55, Ser80, Lys82, Glu60, Ile77 y Pro79. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55, Ser80, Lys82, Asn58, Ile77 y Pro79. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye Thr55, Asn58, Glu60, I Ie77, Pro79, Ser80 y Lys82.
En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye, además de Thr55, Ser80 y Lys82, uno o más residuos aminoacídicos adicionales (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos aminoacídicos) seleccionados del grupo que consiste en Leu65, IIe68, Leu73, His76, Ser78 e His111 del TIGIT humano.
En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que incluye los residuos aminoacídicos Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, IIe68, Leu73, His76, IIe77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 e His111 del TIGIT humano. En algunos casos, los anticuerpos anti-TIGIT se unen a un epítopo en el TIGIT humano que consiste en los residuos aminoacídicos Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 e His111 del TIGIT humano.
En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT establece contactos únicos con aminoácidos de TIGIT humano a una distancia de 4,5 Angstroms, 3,7 Angstroms, 3,5 Angstroms, 3,25 Angstroms, 3,00 Angstroms, 2,75 Angstroms o menos. En determinados casos, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo que consiste en uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de TIGIT humano a una distancia de 4,5 Angstroms, 3,7 Angstroms, 3,5 Angstroms, 3,25 Angstroms, 3,00 Angstroms, 2,75 Angstroms o menos. En un caso, el anticuerpo anti-TIGIT de la invención establece contactos únicos con aminoácidos del TIGIT humano a una distancia de 3,7 Angstroms o menos. En determinados casos, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo que consiste en uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos del TIGIT humano a una distancia de 3,7 Angstroms o menos.
Los anticuerpos anti-TIGIT anteriores incluyen seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la
secuencia de aminoácidos de S N S A A W N (g^Q |q f\jQ: 1); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de KTYYRFKWYSDYAVSVKG (SEQ |D NO: 2); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de
aminoácidos de ESTTYDLLAGPFDY (SEQ ID NO: 3); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de KSSQTVLYSSNNKKYLA (SEQ ID NO: 4); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WASTRES (gEQ<iq n o>: 5); y/o (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQYYSTPFT (SEQ ID NO: 6), tal como la poseída por el anticuerpo anti-TIGIT 4.1D3 y derivados del mismo (por ejemplo, 4.1D3.Q1E). En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT puede tener un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 35 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT puede tener un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. En un caso particular, el anticuerpo anti-TIGIT puede ser 4.1D3.Q1E, o un derivado o pariente clonal del mismo. En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT puede tener un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. En un caso particular, el anticuerpo anti-TIGIT puede ser 4.1D3, o un derivado o pariente clonal del mismo.
En algunos casos, el anticuerpo comprende además al menos una, dos, tres o cuatro de las siguientes regiones estructurales (FR) de región variable de la cadena ligera: una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIVMTQSPDSUWSLGERATINC (SEQ ID NO: 7); una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de<W>vv<YQQKPGQP>r<PfrILU Y>r (SEQ ID NO: 8); una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPtRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYVC (SEQ ID NO: 9); y/o una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de rGFGTKVEIK (SEQ ID NO: 10), o una combinación de una o más de las FR anteriores. En algunos casos, por ejemplo, el anticuerpo comprende además una FR-L1 que comprende la secuencia de<aminoácidos de>DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC<(SEQ ID NO: 7); una FR-L2 que comprende la secuencia>de aminoácidos deWYQQKPGQPPNLLIY’ (gEQ ID NO: 8); una FR-L3 que comprende la secuencia deaminoácidos de GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ |D NO: 9); y una FR-L4 que
comprende la secuencia de aminoácidos de FGPGTKVEIK(SEQ ID NO: 10), tales como las poseídas por losanticuerpos anti-TIGIT 4.1D3.Q1E y 4.1 D3.
En algunos casos, el anticuerpo comprende además al menos una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de XiVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ<id>NO: en la que X1 es Q o E; una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WIRQSPSRGLEWLG (<s e q>ID NO: 12); una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RITINPDTEKNQF5LCLN5VTPEDTAVFVCTR (s e q ID NO: 13); y/o una FR-H4 que
comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (<s e q id>NO: 14), o una combinación de una o más de las FR anteriores. El anticuerpo anti-TIGIT puede incluir además, por ejemplo, al menos una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVQLQQSGPGLVKPSQTL5LTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 15); una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WIRQSPSRGLEWLG (<s e q id>NO: 12); una FR-H3 que comprende la secuencia<de aminoácidos de>RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR(SEQ ID NO: 13); y/o una FR-H4
que comprende la secuencia de aminoácidos deWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 14), o una combinación deuna o más de las FR anteriores. En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT incluye una FR-H1 que comprende la
secuencia de aminoácidos deEVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 15); una FR-
WIRQSPSRGLEWLG
H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de (SEQ ID NO: 12); una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQIDNO: 13);
y<una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de>^VGQGTLVTVSS<( g E Q i q n o : 14), tales como>las poseídas por el anticuerpo 4.1D3.Q1E. En otro caso, por ejemplo, el anticuerpo anti-TIGIT puede incluir además al menos una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR de región variable de la cadena pesada: una FR-H1 que
comprende la secuencia de aminoácidos deQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS(SEQ ID
<NO: 16); una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de>WIRQSPSRGLEWLG<(SEQ ID NO:>12); una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de<RI TI NF DTS K N Q F SLQ LN5VTF EDTAVF YCTR>(SEQ ID NO: 13); y/o una FR-H4 que comprende la secuencia
de aminoácidos de. WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 14), o una combinación de una o más de las FR anteriores.En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT incluye una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ |D NQ: 16); una FR. H2 que comprende la secuencia de
aminoácidos de WIRQSPSRGLEWLG(SEQ ID NO: 12); una FR-H3 que comprende la secuencia deaminoácidos de<RI TI NPDTSKN Q F SLQ LN S VTP EDTAVF YCTR>(SEQ ID NO: 13); y una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de<WGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 14), tales como las poseídas por el anticuerpo 4.1D3.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-TIGIT, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de los casos proporcionados anteriormente, y un VL como en cualquiera de los casos proporcionados anteriormente, en el que una o ambas de las secuencias de dominio variable incluyen modificaciones postraduccionales.
En algunos casos, uno cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT descritos anteriormente se puede unir al TIGIT de conejo, además del TIGIT humano. En algunos casos, uno cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT descritos anteriormente se puede unir tanto al TIGIT humano como al TIGIT de macaco cangrejero (macaco). En algunos casos, uno cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT descritos anteriormente se puede unir al TIGIT humano, TIGIT de macaco y TIGIT de conejo. En algunos casos, uno cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT descritos anteriormente (por ejemplo, 4.1D3 o un derivado del mismo) se puede unir al TIGIT humano, TIGIT de macaco y TIGIT de conejo, pero no al TIGIT murino.
En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT se une al TIGIT humano con una Kd de aproximadamente 10 nM o menor y al TIGIT de macaco con una Kd de aproximadamente 10 nM o menor (por ejemplo, se une al TIGIT humano con una Kd de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 1 nM y al TIGIT de macaco con una Kd de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 nM, por ejemplo, se une al TIGIT humano con una Kd de aproximadamente 0,1 nM o menor y al TIGIT de macaco con una Kd de aproximadamente 0,5 nM o menor).
En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT es un anticuerpo antagonista. El anticuerpo antagonista se puede unir específicamente al TIGIT e inhibir o bloquear la interacción del TIGIT con el receptor del virus de la poliomielitis (PVR) (por ejemplo, el anticuerpo antagonista inhibe la señalización intracelular mediada por la unión del TIGIT al PVR). En algunos casos, el anticuerpo antagonista inhibe o bloquea la unión del TIGIT humano al PVR humano con un valor de CI50 de 10 nM o menor (por ejemplo, de 1 nM a aproximadamente 10 nM). En algunos casos, el anticuerpo antagonista inhibe o bloquea la unión del TIGIT de macaco al PVR de macaco con un valor de CI50 de 50 nM o menor (por ejemplo, de 1 nM a aproximadamente 50 nM, por ejemplo, de 1 nM a aproximadamente 5 nM).
Un anticuerpo anti-TIGIT de acuerdo con cualquiera de los casos anteriores es un anticuerpo monoclonal, que comprende un anticuerpo humano. En un caso, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto (por ejemplo, un anticuerpo lgG1 intacto) u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-TIGIT de acuerdo con cualquiera de los casos anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1 7 a continuación.
1. Afinidad de anticuerpo
Un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-TIGIT) proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1<j>M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10 8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).
En un caso, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En un caso, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chenet al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones sucesivas de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Prestaet al., Cáncer Res.57:4593-4599 (1997)). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TO<p>C<o>UNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otro caso, se mide Kd usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un caso, se activan los chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de su inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones sucesivas 1:2 de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y las velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chenet al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación excede 106 M-1 s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, a continuación, se puede determinar la velocidad de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Anticuerpos humanos
En determinados casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos en general en van Dijk y van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) y Lonberg,Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).
Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos se han inactivado, en general, los locus de inmunoglobulina endógena. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg,Nat. Biotech.
23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, KozborJ. Immunol.,133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerneret al., J. Immunol.,147:86 (1991)). Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Liet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91 (2005).
También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.
3. Anticuerpos derivados de colecciones
Se pueden aislar anticuerpos cribando colecciones combinatorias para determinar los anticuerpos con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, son conocidos en la técnica una variedad de procedimientos para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para detectar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisa, por ejemplo, en Hoogenboomet al.enMethods in Molecular Biology178:1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCaffertyet al., Nature348:552-554; Clacksonet al., Nature352: 624-628 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, enMethods in Molecular Biology248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhuet al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Leeet al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA101(34): 12467-12472 (2004); y Leeet al., J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132(2004).
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winteret al., Ann. Rev. Immunol.,12: 433-455 (1994). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffithset al., EMBO J,12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamientoin vitro,como se describe por Hoogenboom y Winter,J. Mol. Biol.,227:381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
4. Anticuerpos multiespecíficos
En cualquiera de los aspectos anteriores, los anticuerpos anti-TIGIT (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) proporcionados en el presente documento pueden ser anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados casos, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes en el TIGIT. En determinados casos, una de las especificidades de unión es por TIGIT y la otra es por cualquier otro antígeno (por ejemplo, una segunda molécula biológica, por ejemplo, un antígeno de superficie celular, por ejemplo, un antígeno tumoral). En consecuencia, un anticuerpo anti-TIGIT biespecífico puede tener especificidades de unión por TIGIT y una segunda molécula biológica, tal como PD-1, PD-L1, PD-L2, OX40, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 o CD96. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
En otros casos, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes del TIGIT, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2. En determinados casos, una de las especificidades de unión es por TIGIT y la otra es por cualquier otro antígeno (por ejemplo, una segunda molécula biológica, tal como OX40). En otros casos, el anticuerpo biespecífico puede tener especificidad de unión por TIGIT y PD-L1; TIGIT y PD-L2; TIGIT y PD-1; TIGIT y CTLA-4; TIGIT y LAG3; TIGIT y TIM3; TIGIT y BTLA; TIGIT y VISTA; TIGIT y B7H4; o TIGIT y CD96, en el que el anticuerpo biespecífico es preferentemente un anticuerpo antagonista para el TIGIT y un anticuerpo antagonista para su segunda diana. En otros casos, el anticuerpo biespecífico puede tener especificidad de unión por TIGIT y CD226; TIGIT y CD28; TIGIT y CD27; TIGIT y CD137; TIGIT y HVEM; TIGIT y GITR; TIGIT y MICA; TIGIT e ICOS; TIGIT y NKG2D; o TIGIT y 2B4, en el que el anticuerpo biespecífico es preferentemente un anticuerpo antagonista para el TIGIT y para su segunda diana.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véanse Milstein y Cuello,Nature305:537 (1983)), documento WO 93/08829 y Trauneckeret al., EMBO J.10:3655 (1991)) y genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). La genomanipulación de "botón en ojal" de anticuerpos multiespecíficos se puede utilizar para generar un primer brazo que contiene un botón y un segundo brazo que contiene el ojal al que se puede unir el botón del primer brazo. El botón de los anticuerpos multiespecíficos de la invención puede ser un brazo anti-TIGIT en un caso. De forma alternativa, el botón de los anticuerpos multiespecíficos de la invención puede ser un brazo anti-TIGIT en un caso. Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden genomanipular usando tecnología de cruce de inmunoglobulina (también conocida como intercambio de dominio Fab o formato CrossMab) (véase, por ejemplo, el documento WO2009/080253; Schaeferet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,108:11187-11192 (2011)). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas con Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennanet al., Science,229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelnyet al., J. Immunol.,148(5): 1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenario (sFv) (véase, por ejemplo, Gruberet al., J. Immunol.,152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tuttet al. J. Immunol.
147: 60 (1991).
En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, también pueden incluir un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une al TIGIT así como a otro antígeno diferente (por ejemplo, una segunda molécula biológica) (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).
7. Variantes de anticuerpo
En determinados casos, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-TIGIT descritos en el presente documento. Como se describe en detalle en el presente documento, los anticuerpos anti-TIGIT se pueden optimizar en base a las propiedades estructurales y funcionales deseadas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
I. Variantes de sustitución, inserción y deleción
En determinados casos, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.
Tabla 1. Sustituciones aminoacídicas ejemplares y preferentes
Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lIe;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para otro estudio tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo con afinidad madurada, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para detectar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury,Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), y/o residuos que se ponen en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para detectar la afinidad de unión. La maduración de la afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboomet al.enMethods in Molecular Biology178:1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos casos de maduración de la afinidad se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido de alanina o modelado. A menudo se seleccionan como diana, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.
En determinados casos se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden preparar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) en las HVR que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos que se ponen en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados casos de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989)Science,244:1081-1085. En este procedimiento, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos con carga, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar como diana o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.
II. Variantes de glucosilación
En determinados casos, los anticuerpos anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) se pueden alterar para incrementar o disminuir el grado en el que se glucosila el anticuerpo. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo anti-TIGIT de la invención se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o retire uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wrightet al. TIBTECH15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos casos se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.
En un caso, se proporcionan variantes de anticuerpo anti-TIGIT que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras fijadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos hacia 5' o hacia 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función de ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "carentes de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazakiet al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiet al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripkaet al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); la sol. de pat. de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adamset al.,especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen alfa-1,6-fucosiltransferasa,FUT8,células CHO con genes inactivados (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnukiet al.Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Y.et al., Biotechnol. Bioeng.,94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).
Se proporcionan además variantes de anticuerpos anti-TIGIT con oligosacáridos bisegmentados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo está bisegmentado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o una función de ADCC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairetet al.);la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umanaet al.);y el documento US 2005/0123546 (Umanaet al.).También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función de CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patelet al.);WO 1998/58964 (Raju, S.); y W o 1999/22764 (Raju, S.).
111. Variantes de la región Fc
En determinados casos, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), generando, de este modo, una variante de la región Fc (véase, por ejemplo, el documento US 2012/0251531). La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc de lgG1 humana que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En determinados casos, la invención contempla una variante de anticuerpo anti-TIGIT que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) sean innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/disminución de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carezca de unión a F<cy>R (de ahí que probablemente carezca de actividad de ADCC), pero conserve su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Los ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom, I.et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, Iet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985); documento 5.821.337 (véase Bruggemann, M.et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluarin vivo,la actividad de ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clyneset al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y, de ahí, que carezca de actividad de CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoroet al., J. Immunol. Methods202:163 (1996); Cragg, M.S.et al., Blood.101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. GlennieBlood.103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de la unión a FcRn y de la depuración/semividain vivousando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B.et al., Int'. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patentes de EE. UU. n.os 6.737.056 y 8.219.149). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc denominado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 a alanina (patentes de EE. UU. n.os 7.332.581 y 8.219.149).
En determinados casos, la prolina en la posición 329 de una región Fc humana natural en el anticuerpo se sustituye con glicina o arginina o un residuo aminoacídico lo suficientemente grande como para destruir el sándwich de prolina dentro de la interfase del receptor gamma de Fc/Fc que se forma entre la prolina 329 del Fc y los residuos de triptófano Trp 87 y Trp 110 de FcgRIII (Sondermannet al.:Nature 406, 267-273 (20 de julio de 2000)). En determinados casos, el anticuerpo comprende al menos otra sustitución aminoacídica. En un caso, la otra sustitución aminoacídica es S228p , E233p , L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S y, todavía en otro caso, la al menos otra sustitución aminoacídica es L234A y L235A de la región Fc de lgG1 humana (véase, por ejemplo, el documento US 2012/0251531) y, todavía en otro caso, la al menos otra sustitución aminoacídica es L234A, L235A y P329G de la región Fc de IgG1 humana.
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión a los FcR mejorada o disminuida. (Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312; y Shieldset al. J. Biol. Chem.9(2 ): 6591-6604 (2001)).
En determinados casos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).
En algunos aspectos, las alteraciones se realizan en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o bien reducidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogieet al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al., J. Immunol.117:587 (1976) y Kimet al., J. Immunol.24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hintonet al.).Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc al FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).
Véanse también Duncan y Winter,Nature322:738-40 (1988); patente de EE. UU. n.° 5.648.260; patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, 4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) comprende una región Fc que comprende una mutación N297G.
En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, 4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) comprende uno o más dominios constantes de la cadena pesada, en el que los uno o más dominios constantes de la cadena pesada se seleccionan de un primer dominio CH1 (CH11),un primer dominio CH2 (CH21), un primer dominio CH3 (CH31), un segundo dominio CH1 (CH12), segundo dominio CH2 (CH22) y un segundo dominio CH3 (CH32). En algunos casos, al menos uno de los uno o más dominios constantes de la cadena pesada se empareja con otro dominio constante de la cadena pesada. En algunos casos, los dominios CH31y CH32comprenden cada uno una protuberancia o cavidad, y en los que la protuberancia o cavidad en el dominio CH31 se puede situar en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH32. En algunos casos, los dominios CH31 y CH32 se encuentran en una interfase entre dichas protuberancia y cavidad. En algunos casos, los dominios CH21 y CH22 comprenden cada uno una protuberancia o cavidad, y en los que la protuberancia o cavidad en el dominio CH21 se puede situar en la cavidad o protuberancia, respectivamente, en el dominio CH22. En otros casos, los dominios CH21 y CH22 se encuentran en una interfase entre dichas protuberancia y cavidad. En algunos casos, el anticuerpo anti-TIGIT es un anticuerpo lgG1.
IV. Variantes de anticuerpo genomanipulados con cisteína
En determinados casos, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En casos particulares, se producen los residuos sustituidos en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados casos, se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
V. Derivados de anticuerpo
En determinados casos, un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) proporcionado en el presente documento se puede modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas o moléculas diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otro caso, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar de forma selectiva por exposición a radiación. En un caso, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kamet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células proximales al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
IV. Procedimientos y composiciones recombinantes
Los anticuerpos anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1 D3.Q1 E) se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En un caso, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En otro caso, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro caso, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En uno de dichos casos, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un caso, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfática (por ejemplo, célula Y0,<n>S0, Sp20). En un caso, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-TIGIT, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-TIGIT, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas, que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton,Methods in Molecular Biology, vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli).Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross,Nat. Biotech.
22:1409-1414 (2004) y Liet al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adapten para su cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293, como se describe, por ejemplo, en Grahamet al., J. Gen Virol.36:59 (1977), células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather,Biol. Reprod.23:243-251 (1980), células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TR1, como se describe, por ejemplo, en Matheret al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR- (Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980)); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu,Methods in Molecular Biology, vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.
255-268 (2003).
V. Procedimientos y composiciones para pruebas diagnósticas y detección
En determinados casos, cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) es útil para detectar la presencia de TIGIT en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados casos, una muestra biológica comprende una célula o tejido.
En un caso, se proporciona un anticuerpo anti-TIGIT para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de TIGIT en una muestra biológica. En determinados casos, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-TIGIT como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-TIGIT a TIGIT, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-TIGIT y TIGIT. Dicho procedimiento puede ser un procedimientoin vitrooin vivo.
En determinados casos, se proporcionan anticuerpos anti-TIGIT marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacinodionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
VI. Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1 D3.Q1 E) se preparan mezclando un anticuerpo de este tipo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales(Remington's Pharmaceutical Sciences16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de composiciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; glúcidos, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.
En algunos casos, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-TIGIT proporcionado en el presente documento puede incluir además un antagonista de unión al eje PD-1, tal como un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.
En algunos casos, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-TIGIT proporcionado en el presente documento puede incluir además un agonista de unión a OX40, tal como un anticuerpo agonista para OX40, un fragmento agonista para OX40L, un receptor oligomérico para OX40 y una inmunoadhesina para OX40.
En algunos casos, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-TIGIT proporcionado en el presente documento puede incluir además un agente terapéutico adicional, tal como un agente quimioterápico o un agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 y/o CD96).
En otros casos, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-TIGIT puede incluir además (a) un antagonista de unión al eje PD-1 y un agonista de unión a OX40; (b) un antagonista de unión al eje PD-1 y un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico); (c) un antagonista de unión al eje PD-1 y un agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 y/o CD96); (d) un agonista de unión a OX40 y un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico); (e) un agonista de unión a OX40 y un agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 y/o CD96); (f) un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico) y un agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 y/o CD96); o (g) un antagonista de unión al eje<p>D-1, un agonista de unión a OX40 y un agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, LAG3, T iM3, BTLA, VISTA, B7H4 y/o CD96). Opcionalmente, la composición farmacéutica incluirá uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones de anticuerpos liofilizados ejemplares se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las composiciones de anticuerpos acuosos incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas composiciones un tampón de acetato de histidina.
La composición en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico, un agente citotóxico, un agente inhibidor del crecimiento y/o un agente antihormonal, tales como los enumerados en el presente documento anteriormente). Dichos ingredientes activos están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan enRemington's Pharmaceutical Sciences16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las composiciones que se van a usar para su administraciónin vivoson, en general, estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
VII. Procedimientos terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) se puede usar en procedimientos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-TIGIT para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario en un sujeto. En determinados casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-TIGIT para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario que está asociada con un trastorno disfuncional de linfocitos T. En otros casos, la enfermedad relacionada con el sistema inmunitario es una infección vírica. En determinados casos, la infección vírica es una infección vírica crónica. En algunos casos, el trastorno disfuncional de linfocitos T se caracteriza por una reactividad disminuida a la estimulación antigénica. En algunos casos, el trastorno disfuncional de linfocitos T se caracteriza por anergia de linfocitos T o una capacidad disminuida para secretar citocinas, proliferar o ejecutar actividad citolítica. En algunos casos, el trastorno disfuncional de linfocitos T se caracteriza por el agotamiento de linfocitos T. En algunos casos, los linfocitos T son linfocitos T CD4+ y CD8+. En algunos casos, el trastorno disfuncional de linfocitos T incluye infección aguda, infección crónica e inmunidad tumoral sin resolver.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1 D3.Q1 E) para tratar o retrasar la progresión de un cáncer en un sujeto. En determinados casos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un carcinoma de pulmón no microcítico, un carcinoma de pulmón microcítico, un cáncer de células renales, un cáncer colorrectal, un cáncer de ovario, un cáncer de mama, un cáncer de páncreas, un carcinoma gástrico, un cáncer de vejiga, un cáncer esofágico, un mesotelioma, un melanoma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de tiroides, un sarcoma, un cáncer de próstata, un glioblastoma, un cáncer de cuello uterino, un carcinoma tímico, una leucemia, un linfoma, un mieloma (por ejemplo, mieloma múltiple (MM)), micosis fungoide, un cáncer de células de Merkel y una neoplasia hemática. Por tanto, se puede tratar una variedad de cánceres o se puede retrasar su progresión. En algunos casos, el individuo puede tener cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo). En otros casos, el individuo puede tener cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático (ACDP)). En algunos casos, el individuo tiene carcinoma de pulmón no microcítico. El carcinoma de pulmón no microcítico puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene carcinoma de pulmón microcítico. El cáncer de pulmón microcítico puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de células renales. El cáncer de células renales puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer colorrectal. El cáncer colorrectal puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de ovario. El cáncer de ovario puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de mama. El cáncer de mama puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de páncreas. El cáncer de páncreas puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene carcinoma gástrico. El carcinoma gástrico puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de vejiga. El cáncer de vejiga puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer esofágico. El cáncer esofágico puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene mesotelioma. El mesotelioma puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene melanoma. El melanoma puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de cabeza y cuello. El cáncer de cabeza y cuello puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de tiroides. El cáncer de tiroides puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene sarcoma. El sarcoma puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de próstata. El cáncer de próstata puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene glioblastoma. El glioblastoma puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de cuello uterino. El cáncer de cuello uterino puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene carcinoma tímico. El carcinoma tímico puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene leucemia. La leucemia puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene linfomas. El linfoma puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene un mieloma (por ejemplo, MM). El mieloma (por ejemplo, MM) puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene micosis fungoide. La micosis fungoide puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene cáncer de células de Merkel. El cáncer de células de Merkel puede estar en fase precoz o en estadio terminal. En algunos casos, el individuo tiene neoplasias hemáticas. Las neoplasias hemáticas puede estar en fase precoz o en estadio terminal.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) para su uso en el incremento, potenciación o estimulación de una respuesta o función inmunitaria en un sujeto que lo necesita. En algunos casos, la respuesta o función inmunitaria se incrementa, potencia y/o estimula activando células efectoras (por ejemplo, linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o<c>D4+), expandiendo (incrementando) una población de células efectoras y/o destruyendo células diana (por ejemplo, células tumorales diana) en el sujeto. En algunos casos, los linfocitos T CD4 y/o CD8 en el individuo tienen preparación, activación, proliferación, liberación de citocinas y/o actividad citolítica incrementada o potenciada en relación con antes de la administración de la combinación. En algunos casos, el número de linfocitos T CD4 y/o CD8 se eleva en relación con antes de la administración de la combinación. En algunos casos, el número de linfocitos T CD4 y/o CD8 activados se eleva en relación con antes de la administración de la combinación. En algunos casos, los linfocitos T CD4 y/o CD8 activados se caracterizan por linfocitos T CD4 y/o CD8 que producen y-IFN+ y/o actividad citolítica potenciada en relación con antes de la administración de la combinación. En algunos casos, los linfocitos T CD4 y/o CD8 presentan una liberación incrementada de citocinas seleccionadas del grupo que consiste en IFN-y, TNF-a e interleucinas. En algunos casos, el linfocito T CD4 y/o CD8 es un linfocito T de memoria efector. En algunos casos, el linfocito T de memoria efector CD4 y/o CD8 se caracteriza por linfocitos T CD4 y/o CD8 que producen y-IFN+ y/o actividad citolítica potenciada. En algunos casos, el linfocito T de memoria efector CD4 y/o CD8 se caracteriza por tener la expresión de CD44alta CD62Lbaja. En algunos casos, el cáncer tiene niveles elevados de infiltración de linfocitos T.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el anticuerpo anti-TIGIT puede ser para su uso en combinación con un antagonista de TIGIT diferente, un antagonista de unión al eje PD-1, un agonista de unión a OX40, un agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales y/o un agente terapéutico adicional, tal como un agente quimioterápico, como se describe en detalle en el presente documento.
En algunos casos, el (segundo) antagonista de TIGIT diferente puede ser un antagonista de la expresión y/o actividad de TIGIT, tal como un inhibidor de molécula pequeña, un anticuerpo inhibidor o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un aptámero, un ácido nucleico inhibidor y un polipéptido inhibidor. En algunos casos, el antagonista de TIGIT es un anticuerpo anti-TIGIT diferente o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, uno que se une a un epítopo diferente en TIGIT que no se superpone o bien solo se superpone parcialmente con el epítopo reconocido por el anticuerpo anti-TIGIT de la invención que se usa). En algunos casos, el antagonista de TIGIT es un ácido nucleico inhibidor seleccionado entre un polinucleótido antisentido, un ARN interferente, un ARN catalítico y una quimera ARN-ADN.
En algunos casos, el antagonista de TIGIT puede ser un agente que modula la expresión y/o actividad de CD226. Por ejemplo, un agente que modula la expresión y/o actividad de CD226 que puede incrementar y/o estimular la expresión y/o actividad de CD226; incrementar y/o estimular la interacción de CD226 con PVR, PVRL2 y/o PVRL3; e incrementar y/o estimular la señalización intracelular mediada por la unión de CD226 a PVR, PVRL2 y/o PVRL3. Como se usa en el presente documento, un agente que puede incrementar y/o estimular la expresión y/o actividad de CD226 incluye, sin limitación, agentes que incrementan y/o estimulan la expresión y/o actividad de CD226. Como se usa en el presente documento, un agente que puede incrementar y/o estimular la interacción de CD226 con PVR, PVRL2 y/o PVRL3 incluye, sin limitación, agentes que incrementan y/o estimulan la interacción de CD226 con PVR, PVRL2 y/o PVRL3. Como se usa en el presente documento, un agente que puede incrementar y/o estimular la señalización intracelular mediada por la unión de CD226 a PVR, PVRL2 y/o PVRL3 incluye, sin limitación, agentes que incrementan y/o estimulan la señalización intracelular mediada por la unión de CD226 a PVR, PVRL2 y/o PVRL3.
En algunos casos, el agente que modula la expresión y/o actividad de CD226 se selecciona de un agente que inhibe y/o bloquea la interacción de CD226 con TIGIT, un antagonista de la expresión y/o actividad de PVR, un agente que inhibe y/o bloquea la interacción de TIGIT con PVR, un agente que inhibe y/o bloquea la interacción de TIGIT con PVRL2, un agente que inhibe y/o bloquea la interacción de TIGIT con PVRL3, un agente que inhibe y/o bloquea la señalización intracelular mediada por la unión de TIGIT a PVR, un agente que inhibe y/o bloquea la señalización intracelular mediada por la unión de TIGIT a PVRL2, un agente que inhibe y/o bloquea la señalización intracelular mediada por la unión de TIGIT a PVRL3, y combinaciones de los mismos.
En algunos casos, los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen la administración de una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1, antes de, posteriormente a, o simultáneamente con un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (y, opcionalmente, uno o más agentes adicionales, tales como un segundo antagonista de TIGIT diferente, un agonista de unión a OX40, un agente quimioterápico, etc.). El antagonista de unión al eje PD-1 se puede seleccionar del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2.
En algunos casos, el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-1. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión ligandos. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L2. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 tanto a PD-L1 como a PD-L2. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo. En algunos casos, el antagonista de la unión a PD-1 se selecciona del grupo que consiste en MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 y BGB-108.
En otros casos, el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L1. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 tanto a PD-1 como a B7-1. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: MPDL3280A (atezolizumab), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab).
En otros casos, el antagonista de unión al eje PD-1 es un antagonista de unión a PD-L2. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L2 es un anticuerpo. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L2 es una inmunoadhesina.
Como propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1) que se puede administrar a un ser humano estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal de paciente, ya sea por una o más administraciones. En algunos casos, por ejemplo, el antagonista (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) se administra en una dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg administrados diariamente, por ejemplo. En algunos casos, el antagonista (por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-L1) se administra a 15 mg/kg. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. En un caso, se administra un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) a un ser humano en una dosis de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg, aproximadamente 1400 mg o aproximadamente 1500 mg. En algunos casos, se administra un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) en una dosis de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 850 mg cada dos semanas. En algunos casos, se administra un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) en una dosis de aproximadamente 840 mg cada dos semanas. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. La dosis del anticuerpo administrado en un tratamiento de combinación se puede reducir en comparación con un tratamiento único. En algunos casos, por ejemplo, el procedimiento para tratar o retrasar la progresión del cáncer de mama localmente avanzado o metastásico en un individuo comprende una pauta posológica que comprende ciclos de tratamiento, en el que se administra al individuo, los días 1 y 15 de cada ciclo, un antagonista de unión al eje PD-1 humano (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) en una dosis de aproximadamente 840 mg, en el que cada ciclo es de 28 días (es decir, cada ciclo se repite cada 28 días). El curso de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas convencionales.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada, con lo que el anticuerpo anti-TIGIT y los uno o más agentes (por ejemplo, antagonista de unión al eje PD-1, agonista de unión a OX40, agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales y/o agente terapéutico adicional) se incluyen en la misma formulación o en formulaciones separadas, y la administración separada, con lo que la administración del anticuerpo anti-TIGIT de la invención se puede producir antes de, simultáneamente con y/o tras la administración de los uno o más agentes (por ejemplo, antagonista de unión al eje PD-1, agonista de unión a OX40, agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales y/o agente terapéutico adicional). En un caso, la administración del anticuerpo anti-TIGIT y la administración de uno o más de los agentes se producen dentro de aproximadamente un mes, o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. Los anticuerpos anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) también se pueden usar en combinación con radioterapia.
Un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (y/o cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunos casos, el anticuerpo se administra por administración subcutánea. En algunos casos, un anticuerpo anti-TIGIT administrado por inyección subcutánea presenta una respuesta menos tóxica en un paciente que el mismo anticuerpo anti-TIGIT administrado por inyección intravenosa. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o prolongada. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos puntos temporales, administración por inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.
Los anticuerpos anti-TIGIT de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de un modo consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular al que se trata, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. No es necesario, pero el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que es apropiada.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes adicionales (por ejemplo, antagonista de unión al eje PD-1, agonista de unión a OX40, agente que disminuye o inhibe uno o más receptores de coinhibición inmunitarios adicionales y/o agente terapéutico adicional), dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo usado, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, el tratamiento previo, la anamnesis del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos.
Como una propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-TIGIT administrada a un ser humano estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de paciente, ya sea por una o más administraciones. En algunos casos, el anticuerpo usado es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg administrados diariamente, por ejemplo. En caso, un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento se administra a un ser humano en una dosis de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg o aproximadamente 1400 mg el día 1 de ciclos de 21 días. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantendría, en general, hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo anti-TIGIT). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. El progreso de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
En algunos casos, los procedimientos pueden comprender además un tratamiento adicional. El tratamiento adicional puede ser radioterapia, cirugía, quimioterapia, tratamiento génico, tratamiento con ADN, tratamiento vírico, tratamiento con ARN, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, tratamiento con anticuerpos monoclonales o una combinación de los anteriores. El tratamiento adicional puede ser en forma de tratamiento adyuvante o neoadyuvante. En algunos casos, el tratamiento adicional es la administración de un inhibidor enzimático de molécula pequeña o un agente antimetastásico. En algunos casos, el tratamiento adicional es la administración de agentes limitantes de efectos secundarios (por ejemplo, agentes destinados a disminuir la aparición y/o la gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales como agentes antieméticos, etc.). En algunos casos, el tratamiento adicional es radioterapia. En algunos casos, el tratamiento adicional es cirugía. En algunos casos, el tratamiento adicional es una combinación de radioterapia y cirugía. En algunos casos, el tratamiento adicional es irradiación gamma. En algunos casos, el tratamiento adicional puede ser una administración separada de uno o más de los agentes terapéuticos descritos anteriormente.
VIII. Artículos de fabricación
En otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación o un kit que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí misma o combinada con otra composición, es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-TIGIT de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
En un caso, se proporciona un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-TIGIT para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un sujeto o para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario en un sujeto. En un caso relacionado, se presenta un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-TIGIT para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un sujeto o para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario en un sujeto. En un caso relacionado, se presenta un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), un agonista de unión a OX40 (por ejemplo, un anticuerpo agonista para OX40, un fragmento agonista para OX40L, un receptor oligomérico para OX40 y una inmunoadhesina para OX40) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-TIGIT para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un sujeto o para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario en un sujeto. En un caso relacionado, se presenta un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2), un agonista de unión a OX40 (por ejemplo, un anticuerpo agonista para OX40, un fragmento agonista para OX40L, un receptor oligomérico para OX40 y una inmunoadhesina para OX40) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-TIGIT para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un sujeto o para tratar o retrasar la progresión de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario en un sujeto. En cualquiera de los casos anteriores, el sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano. Se contempla específicamente que cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT, agonistas de unión a OX40 y antagonistas de unión al eje PD-1 descritos en el presente documento se pueden incluir en el kit.
Aún en otro caso, se proporciona un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para incrementar, potenciar o estimular una respuesta o función inmunitaria en un sujeto. En un caso relacionado, se presenta un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para incrementar, potenciar o estimular una respuesta o función inmunitaria en un sujeto. En un caso relacionado, se presenta un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), un agonista de unión a OX40 (por ejemplo, un anticuerpo agonista para OX40, un fragmento agonista para OX40L, un receptor oligomérico para OX40 y una inmunoadhesina para OX40) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-TIGIT para incrementar, potenciar o estimular una respuesta o función inmunitaria en un sujeto. En un caso relacionado, se presenta un kit que incluye un anticuerpo anti-TIGIT de la invención (4.1D3 o una variante del mismo, por ejemplo, 4.1D3.Q1E), un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2), un agonista de unión a OX40 (por ejemplo, un anticuerpo agonista para OX40, un fragmento agonista para OX40L, un receptor oligomérico para OX40 y una inmunoadhesina para OX40) y un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-TIGIT para incrementar, potenciar o estimular una respuesta o función inmunitaria en un sujeto. En cualquiera de los casos anteriores, el sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano. Se contempla específicamente que cualquiera de los anticuerpos anti-TIGIT, agonistas de unión a OX40 y antagonistas de unión al eje PD-1 descritos en el presente documento se pueden incluir en el kit.
Ejemplos
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti-TIGIT
Se coinmunizaron ratas Sprague Dawley o ratas transgénicas OMT (Open Monoclonal Technology, Palo Alto, CA) con una dosis inicial por vía subcutánea de 50 |jg de proteína TIGIT humana (Genentech, Inc.) y 50 |jg de proteína TIGIT de macaco cangrejero (macaco) (Genentech, Inc.) mezcladas con adyuvante completo de Freund (BD, Franklin Lakes, NJ), seguido de 25 jg de proteína TIGIT humana y 25 jg de proteína TIGIT de macaco diluidas en PBS en múltiples sitios por vía subcutánea e intraperitoneal cada dos semanas.
Se extrajeron múltiples ganglios linfáticos tres días después de la última inmunización. Se enriquecieron los linfocitos B de estas ratas usando selección negativa con anticuerpos biotinilados dirigidos a células distintas de linfocitos B de rata (BD; eBioscience, San Diego, CA) y microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Miltenyi, San Diego, CA). Se fusionó la población de linfocitos B resultante con células de mieloma de ratón P3X63-Ag8U.1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) por medio de electrofusión (Harvard Apparatus, Holliston, MA). Se incubaron las células fusionadas a 37 °C, CO2 al 7 %, durante la noche en medio C (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá), antes de volver a suspenderse en medio D semisólido (StemCell Technologies) con anti-IgG de rata-FITC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y sembrándose en bandejas Omniwell (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY). Siete días después de la siembra, se seleccionaron colonias fluorescentes y se transfirieron a placas de cultivo de 96 pocillos (BD) que contenían medio E (StemCell Technologies) usando un Clonepix FL (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se cribaron los sobrenadantes por ELISA frente a la proteína TIGIT humana siete días después de la recogida de la colonia. Se recubrieron placas de 384 pocillos (Greiner MicroIon, Greiner Bio-One, Monroe, NC) con 1 jg/m l de proteína diluida en tampón de carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6, y se incubó durante la noche a 4 °C. A continuación, se bloquearon los pocillos con 100 j l de PBS que contenía BSA al 0,5 % y Tween-20 al 0,5 % durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron sobrenadantes y/o sueros a 50 j l y se agitaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para la detección de anticuerpos específicos, se diluyeron los anticuerpos anti-IgG de rata conjugados con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a una concentración optimizada en PBS que contenía BSA al 0,5 % y Tween-20 al 0,5 % y se añadieron a 50 j l por pocillo después del lavado, y se agitaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con 100 j l de PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se añadieron 50 j l de sustrato TMB (BioFX, Owings Mills, MD) y se incubaron las placas durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 50 j l de solución de parada (BioFX), a continuación se leyeron a 630 nM. Se expandieron las líneas celulares de hibridoma que se unen a TIGIT humano y se cultivaron durante de dos a cuatro días, a continuación se cribaron por ELISA frente a las proteínas TIGIT humana, TIGIT de macaco y TIGIT de ratón (Genentech, Inc.). Se recolectó el sobrenadante de las líneas celulares reactivas cruzadas humanas y de macaco y se purificó con proteína G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Se cribaron aproximadamente 500 clones. A partir del cribado, se identificaron los clones 4.1D3, 7.4A3 y 4.1A4 a partir de la inmunización de ratas OMT, y se identificaron los clones 1.6B2, 1.10A5, 1.7E7 y 1.15C8 a partir de la inmunización de ratas Sprague Dawley.
Ejemplo 2. Optimización de anticuerpos anti-TIGIT
A. Pulido de anticuerpo monoclonal humano anti-TIGIT derivado de ratas OMT
Para evitar la formación no deseada de piroglutamato para los clones 4.1A4, 4.1D3 y 7.4A3 (también denominados 1A4, 1D3 y 4A3, respectivamente) y para resolver el problema de los residuos de cisteína no emparejados para los clones 4.1A4 y 7.4A3, se generaron las siguientes variantes optimizadas de anticuerpo anti-TIGIT: 4.1A4.C96S.Q1E, 4.1A4.C96Y.Q1E, 4.1D3.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E y 7.4A3.C96Y.Q1E (también denominados 1A4.C96S.Q1E, 1A4.C96Y.Q1E, 1D3.Q1E, 4A3.C96S.Q1E y 4A3.C96Y.Q1E, respectivamente). Como se describe a continuación en la tabla 2, las afinidades de estas cinco variantes optimizadas para TIGIT humano y de macaco cangrejero (macaco) se determinaron a continuación por resonancia de plasmón superficial (RPS) (análisis BIACORE™) y se compararon con las de sus respectivos clones originales.
En resumen, se activó un chip biosensor CM5 de la serie S con reactivos de clorhidrato de W-etil-W'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ) y se aplicó un kit de captura de anticuerpos humanos para acoplar las IgG anti-Fc humano de cabra para lograr aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (UR) en cada cubeta de lectura, seguido de un bloqueo de los grupos sin reaccionar con etanolamina 1 M.
Para las mediciones cinéticas, se capturó cada clon para lograr aproximadamente 250 UR y se inyectaron diluciones sucesivas 1:5 del antígeno para TIGIT (de 1,23 nM a 300 nM) en tampón HBS-P (H<e>P<e>S 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005 %) a 25 °C (caudal: 30 jl/m in) sin regeneración entre inyecciones. Se registraron los sensogramas y se evaluaron por el programa informático de evaluación BIAcore™ T200 (versión 2.0) después de restar la señal de la cubeta de referencia. Se calcularon las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión de Langmuir uno a uno. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (K<d>) como la proporción kdis/kas.
Tabla 2. Mediciones de afinidad por BIACORE™ para variantes de anticuerpo 1A4, 1D3 y 4A3 derivados de ratas OMT contra TIGIT humano y de macaco
Los clones 4.1A4.C96S.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E y 4.1D3.Q1E se consideraron moléculas finales con una afinidad de unión similar y aceptable tanto para TIGIT humano como de macaco en comparación con los clones originales. Los análisis de BIACORE™ adicionales revelaron que el clon 4.1 D3.Q1 E, en particular, pudo reaccionar de forma cruzada y unirse al TIGIT de conejo con baja afinidad nanomolar (tabla 3).
Tabla 3. 4.1D3.Q1E puede reaccionar de forma cruzada con TIGIT humano, de macaco y de conejo
B. Humanización de anticuerpos monoclonales anti-TIGIT derivados de ratas SD
Los anticuerpos monoclonales 1.6B2, 1.10A5, 1.7E7 y 1.15C8 (denominados en el presente documento 6B2, 10A5, 7E7 y 15C8, respectivamente) se humanizaron como se describe a continuación. Los números de residuos son de acuerdo con Kabatet al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest.5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Para la humanización del anticuerpo 6B2, se diseñaron regiones hipervariables del anticuerpo 6B2 de rata (rat6B2) en sus regiones estructurales aceptoras humanas más cercanas para generar 6B2 humanizado (h6B2.L1H1). Específicamente, del dominio VL de rat6B2, se injertaron las posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la línea germinal humana IGKV1-33*01. Del dominio VH de rat6B2, se injertaron las posiciones 26-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la línea germinal humana IGHV2-5*08. Además, se conservaron la posición 43 en la región estructural II de VL y las posiciones 69, 73, 78 en la región estructural III de VH de la secuencia de rata en h6B2.L1H1. Se descubrió que esos residuos eran parte de los residuos de región estructural que actúan como zona "Vernier", que puede ajustar la estructura de CDR/HVR y afinar el ajuste del antígeno. Véase, por ejemplo, Foote y Winter,J. Mol. Biol.224: 487-499 (1992). Estas definiciones de CDR/HVR incluyen las posiciones definidas por su hipervariabilidad de secuencia (Wu, T. T. y Kabat, E. A. (1970)), su localización estructural (Chothia, C. y Lesk, A. M. (1987)) y su participación en los contactos antígeno-anticuerpo (MacCallumet al. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)).
Se generaron variantes de 6B2 humanizadas adicionales genomanipulando cada residuo de rata de h6B2.L1H1 en la zona Vernier hasta convertirlo en un residuo de línea germinal humana y estas variantes son h6B2.L2H1 (VL: S43A), h6B2.L1H2 (VH: V69I), h6B2.L1H3 (VH: A73T), h6B2.L1H4 (VH: A78V), h6B2.L1H5 (VH: V69I, A73T, A78v ) y h6B2.L2H5 (VL: S43A, VH: V69I, A73T, A78V; una versión completamente humanizada).
Para la humanización del anticuerpo 10A5, se diseñaron regiones hipervariables del anticuerpo 10A5 de rata (rat10A5) en sus regiones estructurales aceptoras humanas más cercanas para generar 10A5 humanizado (H10A5.L1H1). Específicamente, del dominio V<l>de rat10A5, se injertaron las posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la línea germinal humana IGKV3-15*01. Del dominio VH de 10A5 de rata, se injertaron las posiciones 26-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la línea germinal humana IGHV2-5*08. Además, se conservaron la posición 43 en la región estructural II y la posición 58 en la región estructural III de VL y las posiciones 69 y 78 en la región estructural III de VH de la secuencia de rata en h10A5.L1H1. Se descubrió que esos residuos eran parte de los residuos de región estructural que actúan como zona "Vernier" como se describe anteriormente.
Se generaron variantes de 10A5 humanizadas adicionales genomanipulando cada residuo de rata de h10A5.L1H1 en la zona Vernier hasta convertirlo en un residuo de línea germinal humana y estas variantes son h10A5.L2H1 (VL: S43A), h10A5.L3H1 (VL: V58I), h10A5.L4H1 (VL: S43A, V58I), h10A5.L1H2 (VH: V69I), h10A5.L1H3 (VH: A78V), h10A5.L1 H4 (VH: V69I, A78V) y h10A5.L4H4 (VL: S43A, V58I, VH: V69I, A78V; una versión completamente humanizada).
Para la humanización del anticuerpo 7E7, se diseñaron regiones hipervariables del anticuerpo 7E7 de rata (rat7E7) en sus regiones estructurales aceptoras humanas más cercanas para generar 7E7 humanizado (h7E7.L1H1). Específicamente, del dominio VL de rat7E7, se injertaron las posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la línea germinal humana IGKV1-9*01. Del dominio Vh de rat7E7, se injertaron las posiciones 26-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la línea germinal humana IGHV1-3*01. Además, se conservaron las posiciones 58, 71 y 87 en la región estructural III de VL, las posiciones 47, 48 en la región estructural II de VH y las posiciones 67, 69, 71, 91 y 93 en la región estructural III de VH de la secuencia de rata en h7E7.L1H1. Se descubrió que esos residuos eran parte de los residuos de región estructural que actúan como zona "Vernier" como se describe anteriormente.
Se generaron variantes de 7E7 humanizadas adicionales genomanipulando cada residuo de rata de h7E7.L1H1 en la zona Vernier hasta convertirlo en un residuo de línea germinal humana y estas variantes son h7E7.L2H1 (VL: I58V), h7E7.L3H1 (VL: Y71F), h7E7.L4H1 (VL: F87Y), h7E7.L5H1 (VL: I58V, Y71F, F87Y), h7E7.L1H2 (VH: I47W), h7E7.L1H3 (VH: I48M), h7E7.L1H4 (VH: A67V), h7E7.L1H5 (VH: L69I), h7E7.L1H6 (VH: A71R), h7E7.L1H7 (VH: F91Y), h7E7.L1H8 (VH: T93A), h7E7.L1H9 (VH: I47W, I48M, A67V, L69I, A71R, F91Y, T93A) y h7E7.L5H9 (VL: I58V, Y71F, F87Y, VH: I47W, I48M, A67V, L69I, A71R, F91Y, T93A; una versión completamente humanizada).
Para la humanización del anticuerpo 15C8, se diseñaron regiones hipervariables del anticuerpo 15C8 de rata (rat15C8) en sus regiones estructurales aceptoras humanas más cercanas para generar 15C8 humanizado (h15C8.L1H1). Específicamente, del dominio VL de rat15C8, se injertaron las posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la línea germinal humana IGKV1-9*01. Del dominio VH de rat15C8, se injertaron las posiciones 26 35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la línea germinal humana IGHV1-3*01. Además, se conservaron las posiciones 58, 71 y 87 en la región estructural III de VL, las posiciones 37, 47 y 48 en la región estructural II de VH y las posiciones 67, 69, 71 y 91 en la región estructural III de VH de la secuencia de rata en h15C8.L1H1. Se descubrió que esos residuos eran parte de los residuos de región estructural que actúan como zona "Vernier" como se describe anteriormente.
Se generaron variantes de 15C8 humanizadas adicionales genomanipulando cada residuo de rata de h15C8.L1H1 en la zona Vernier hasta convertirlo en un residuo de línea germinal humana y estas variantes son h15C8.L2H1 (VL: I58V), h15C8.L3H1 (VL: Y71F), h15C8.L4H1 (VL: F87Y), h15C8.L5H1 (VL: I58V, Y71F, F87Y), h15C8.L1H2 (VH: L37V), h15C8.L1H3 (VH: I47W), h15C8.L1H4 (VH: I48M), h15C8.L1H5 (VH: A67V), h15C8.L1H6 (VH: L69I), h15C8.L1H7 (VH: T71R), h15C8.L1H8 (VH: F91Y), h15C8.L1H9 (VH: L37V, I47W, I48M, A67V, L69I, T71R, F91Y) y h7E7.L5H9 (VL: I58V, Y71F, F87Y, VH: L37V, I47W, I48M, A67V, L69I, T71R, F91Y; una versión completamente humanizada).
Las primeras versiones humanizadas, h6B2, L1H1, h10A5.L1H1, h7E7, L1H1 y h15C8.L1H1, que contienen tanto las CDR de rata como residuos de región estructural en posiciones de Vernier, y las versiones completamente humanizadas, h6B2.L2H5, h10A5.L4H4, h7E7.L5H9 y h15C8.L5H9, que contienen solo las CDR de rata, se sometieron a medición de afinidad por BIAcore por comparación con los anticuerpos de rata originales, rat6B2, rat10A5, rat7E7 y rat15C8. Para las determinaciones de afinidad de unión de los anticuerpos para TIGIT contra TIGIT humano, TIGIT de macaco cangrejero y mutantes de TIGIT barridos con alanina humana por cinética de ciclo único, se usó la medición de resonancia de plasmón superficial (RPS) con un instrumento BIACORE™-T200, como se describe anteriormente. Los resultados de BIACORe ™ en la tabla 4, a continuación, indican que todas las variantes humanizadas presentan un descenso en la afinidad de unión (es decir, un incremento en K<d>) de aproximadamente 5 a 10 veces contra TIGIT tanto humano como de macaco. Las versiones completamente humanizadas de h6B2.L2H5 y h10A5.L4H4 sorprendentemente muestran una afinidad de unión similar a las primeras versiones humanizadas de h6B2.L1H1 y h10A5.L1H1, lo que sugiere que los residuos de región estructural de rat6B2 y rat10A5 en las posiciones de Vernier no contribuyen a la unión de TIGIT humano y de macaco. Por lo tanto, tanto h6B2.L2H5 como h10A5.L4H4 representan la versión humanizada final para rat6B2 y rat10A5, respectivamente. Por el contrario, las versiones completamente humanizadas de h7E7.L5H9 y h15C8.L5H9 perdieron la capacidad de unirse a TIGIT humano y de macaco.
Para dilucidar además qué residuos de región estructural de rata en las posiciones de Vernier para los primeros anticuerpos humanizados h7E7, L1H1 y h15C8.L1H1 son cruciales para la unión, todas las variantes de pulido de región estructural se sometieron a medición de afinidad por BIAcore. Para el pulido de región estructural de 7E7, las variantes de h7E7.L1H2, h7E7.L1H9 y h7E7.L5H9 que contienen la sustitución en VH: I47W muestran un descenso de afinidad de unión de TIGIT humano y de macaco de más de 100 veces, y las variantes de h7E7.L3H1 y h7E7.L5H1, que contienen la sustitución en VL: Y71F, muestran un descenso de afinidad de unión de TIGIT de macaco de aproximadamente 2-3 veces. Por lo tanto, ambos residuos de región estructural de rata en VH: I47 y VL: Y71 se mantuvieron en la versión humanizada de 7E7 final, llamada h7E7.L5aH9a, para conservar la unión de TIGIT humano y de macaco. Para el pulido de región estructural de 15C8, las variantes de h15C8.L1H3, h15C8.L1H9 y h15C8.L5H9 que contienen la sustitución en VH: I47W muestran un descenso de afinidad de unión de TIGIT humano y de macaco de más de 100 veces, y variantes de h15C8.L3H1 y h15C8.L5H1 que contienen la sustitución en VL: Y71F muestran un descenso de afinidad de unión de TIGIT humano y de macaco de aproximadamente 2-3 veces. Otras variantes, h15C8.L1 H2, h15C8.L1H5 y h15C8.L1H7, que contienen la sustitución en VH: L37V, A67V y T71R, respectivamente, también muestran un descenso de afinidad de unión de TIGIT humano de aproximadamente 2-3 veces. Por lo tanto, los cinco residuos de región estructural de rata de VH: I47, L37, A67, T71 y VL: Y71 se mantuvieron en la versión humanizada de 15C8 final, llamada h15C8.L5aH9a, para conservar la unión de TIGIT humano y de macaco.
Tabla 4. Resumen de mediciones de afinidad por BIACORE™ para las variantes humanizadas de anticuerpos 6B2, 10A5, 7E7 y 15C8 derivados de rata SD contra TIGIT humano y de macaco
Ejemplo 3. Estudios de unión y bloqueo in vitro de anticuerpos anti-TIGIT
A. Caracterización de la unión in vitro de anticuerpos anti-TIGIT
Se caracterizaron los anticuerpos anti-TIGIT derivados de OMT y SDin vitro paradeterminar su capacidad de unirse a TIGIT y de bloquear la unión del receptor del virus de la poliomielitis (PVR) a TIGIT. Se sometió a prueba la unión a TIGIT humano y de macaco por análisis BIACORE™, como se describe anteriormente, en el contexto de afinidad tanto monovalente como bivalente, y se comparó con un anticuerpo anti-TIGIT derivado de ratón (1A5) y un anticuerpo anti-TIGIT derivado de hámster quimérico (10A7; véase, por ejemplo, la pub. de EE. UU. n.° 2009/0258013). Los resultados del análisis BIACORE™, representados en la tabla 5, indican que numerosas variantes de clones anti-TIGIT derivados de OMT, tales como 4.1D3.Q1E y 7.4A3.C96S.Q1E, y variantes de clones anti-TIGIT derivados de SD se pudieron unir a TIGIT tanto humano como de macaco, cada una con una afinidad alta y similar. Dichas propiedades son deseables para los anticuerpos anti-TIGIT terapéuticos, ya que permiten realizar pruebas de toxicidad simples usando macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)como una especie para toxicología no clínica. La reactividad cruzada adicional del clon 4.1D3.Q1E con conejo puede proporcionar una especie para toxicología adicional.
Tabla 5. Análisis BIACORE™ de clones anti-TIGIT derivados de OMT y SD optimizados
Se llevaron a cabo estudios de uniónin vitroadicionales de los clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de OMT y SD. Se sometieron a prueba los clones anti-TIGIT derivados de OMT y SD para determinar su unión a TIGIT humano y de macaco expresado en la superficie de células CHO por análisis FACS. Se transfectaron células CHO con TIGIT humano de longitud completa (CHO-hTIGIT) o TIGIT de macaco (CHO-cyTIGIT). Se incubaron las células CHO que expresan TIGIT con cada anticuerpo anti-TIGIT en las concentraciones indicadas y, a continuación, se detectaron por medio de un anticuerpo anti-hlgG marcado con FITC (véase la figura 1A) usando procedimientos estándar. Los resultados, mostrados en la tabla 6 y las figuras 1B-1E, corroboran los resultados del análisis BIACORE™, descrito anteriormente.
También se sometieron a prueba los clones anti-TIGIT derivados de OMT y SD para determinar su unión a linfocitos T primarios humanos por análisis FACS. Se activaron los PBMC humanos con anti-CD3 unido a placa (5 pg/ml) y anti-CD28 soluble (2 pg/ml) durante 2 días como se describe en Yuet al. Nature Immunology.10: 48-57, 2009. A continuación, se lavaron las células y se incubaron con cada anticuerpo anti-TIGIT en las concentraciones indicadas y, a continuación, se detectaron por medio de un anticuerpo anti-hlgG marcado con FITC. También se tiñeron las células con anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD25(BD bioscience).Se evaluaron los linfocitos T CD4+ (CD25+CD4+) humanos y CD8+ (CD25+CD8+) humanos para determinar su unión por los clones anti-TIGIT por FACS. Se adquirieron todas las muestras en instrumentos LSR-II o LSR-Fortessa (BD Biosciences) y se analizaron usando el programa informático FlowJo (Treestar). Como se describe en la tabla 6 y las figuras 2A-2D, los clones presentaron una unión aproximadamente equivalente a su TIGIT diana.
Tabla 6. Resumen de la unión a CHO-TIGIT y a linfocitos T humanos de clones anti-TIGIT derivados de OMT y SD optimizados
B. Caracterización del bloqueo in vitro de anticuerpos anti-TIGIT
También se sometieron a prueba los clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de OMT y SD para determinar su capacidad para bloquear las interacciones TIGIT-PVR y TIGIT-CD226.
Para someter a prueba la capacidad de los clones para bloquear la interacción TIGIT-PVR, se usó un ensayo ELISA de bloqueo. En resumen, se recubrió la proteína de fusión PVR-Fc humano recombinante, la proteína de fusión PVR-Fc de macaco cangrejero o la proteína de fusión PVR-Fc de ratón a 4 pg/ml a 25 pl/pocillo en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0) en placas de microvaloración Maxisorp de 384 pocillos (NUNC, Dinamarca) y se incubó durante la noche a 4 °C. A continuación, se descartó la solución de recubrimiento y se bloqueó la placa usando seroalbúmina bovina (BSA) al 0,5 % en PBS a 80 pl/pocillo y se incubó con agitación suave durante 1 hora. Se diluyeron las curvas de valoración de los anticuerpos de control de isotipo anti-TIGIT y Fab en tampón de ensayo (PBS, BSA al 0,5 %, Tween 20 al 0,05 %) usando 12 diluciones sucesivas de 2,5 veces (40000-1,7 ng/ml). Se añadieron volúmenes iguales de TIGIT humano-AviFlag-biotina (1 pg/ml), TIGIT de macaco-AviFlag-biotina (150 ng/ml) o bien TIGIT de ratón-His (1 pg/ml) a estas curvas de valoración y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. Se lavó la placa bloqueada 3x con tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,05 %, pH 7,4) usando un lavador de pocillos de microvaloración automatizado ELx405 (BioTek Instruments, Vermont) y se añadió la mezcla de anticuerpo/ligando-biotina o ligando-His a 25 pl/pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se lavó la placa 6x con tampón de lavado y se detectó TIGIT humano-AviFlag-biotina, TIGIT de macaco-AviFlag-biotina o TIGIT de ratón-His unido añadiendo 25 pl/pocillo de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:10000, Amersham, Reino Unido) o anti-His de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:2500, Qiagen, Alemania) diluidos en tampón de ensayo. Después de una incubación de 30 minutos o 1 hora, se lavó la placa 6x con tampón de lavado y se añadieron 100 pl/pocillo de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD, EE. UU.) para permitir que apareciera el color. Se desactivó la reacción por adición de ácido fosfórico 1 M. Se leyó la absorbancia a 450 nM en un lector de pocillos de microvaloración MULTISKAN ASCENT® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia). Se trazaron curvas de ajuste a partir de los valores de densidad óptica resultantes de las placas de ELISA y se calcularon las CI50 usando el programa informático Genedata Screener (Genedata, Suiza). Como se muestra a continuación en las figuras 3A-3D, estos ensayos demostraron la reactividad cruzada y la capacidad de bloqueo de 4.1D3.Q1E para TIGIT humano y TIGIT de macaco, lo que distingue a 4.1D3.Q1E del anticuerpo anti-TIGIT derivado de hámster, 10A7, que reacciona de forma cruzada con TIGIT de ratón, pero no con TIGIT de macaco. Los datos indican que 4.1 D3.Q1 E bloquea fuertemente la unión de TIGIT de macaco a PVR de macaco. Los datos también indican que 4.1D3.Q1E es un bloqueador más fuerte de TIGIT humano a PVR humano que el clon de anticuerpo anti-TIGIT derivado de hámster 10A7.
Estos estudios se validaron además en experimentos de bloqueo de PVR CHO-TIGIT en los que se incubaron las células CHO que expresaban TIGIT con proteína de fusión PVR-Fc marcada en presencia de un anticuerpo anti-TIGIT o un control de IgG1 humana (figura 4A). Como se muestra en la tabla 7 y las figuras 4B-4E, la incubación con 10 pg/ml de anticuerpo anti-TIGIT derivado de OMT (figuras 4B y 4C) o anticuerpo anti-TIGIT derivado de SD (figuras 4D y 4E) dio como resultado el bloqueo de la unión de TIGIT-PVR tanto para huTIGIT-huPVR como para cyTIGIT-cyPVR, con valores de CI50 en el intervalo nanomolar y subnanomolar.
Para someter a prueba la capacidad de los clones para bloquear la interacción TIGIT-CD226, se usó TR-FRET (Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo). En primer lugar, se expresó y marcó CD226 marcado con SNAP (ST) humano con fluoróforos donantes y aceptores no permanentes usando células CHO. El ST-CD226 humano se coexpresó con TIGIT marcado con HA, en presencia o ausencia de los clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de OMT y SD. La adición de cada uno de los clones sometidos a prueba a los cultivos celulares redujo significativamente la capacidad de TIGIT y CD226 para asociarse (tabla 7). Estos datos sugirieron que el tratamiento anti-TIGIT con los anticuerpos anti-TIGIT identificados puede limitar la interacción de TIGIT con CD226, lo que indica que estos anticuerpos pueden ser tratamientos favorables basados en su capacidad para activar la actividad de linfocitos T al liberar la supresión mediada por TIGIT de la actividad de CD226 y evitar el posterior agotamiento de linfocitos T CD8+.
Tabla 7. Resumen del bloqueo de TIGIT-PVR y del bloqueo de TIGIT-CD226 de clones anti-TIGIT derivados de OMT y SD optimizados
Ejemplo 4. Caracterización farmacocinética de los anticuerpos anti-TIGIT
Seguidamente, se sometieron a prueba las propiedades farmacocinéticas (FC) de los clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de OMT y SD en macacos cangrejeros en comparación con el anticuerpo anti-TIGIT derivado de ratón que porta una mutación de aglucosilación N297G (1A5 N297G) y un anticuerpo de control anti-gD. En estos experimentos, se midió la concentración sérica de los anticuerpos durante un período de 28 días tras administraciones intravenosas de 10 mg/kg en macacos cangrejeros. Los estudios FC revelaron que la variante h1.6B2 derivada de SD presentó la depuración más rápida, aproximadamente 20 ml/día/kg (figuras 5A y 5B). La variante 1A5 sometida a prueba también presentó una depuración rápida, de aproximadamente 15 ml/día/kg (figuras 5A y 5B). A diferencia de estas variantes anti-TIGIT, las variantes de OMT sometidas a prueba (4.1D3.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E y 4.1A4.C96S.Q1E) presentaron un depuración de aproximadamente 8-10 ml/día/kg (figuras 5A y 5B), que está en el extremo superior del intervalo de macaco históricamente aceptado de aproximadamente 4 8 ml/día/kg. Los perfiles FC de las variantes de OMT fueron similares a los del anticuerpo anti-gD de control hasta el d10, momento en el que los efectos de disposición del fármaco mediada por la diana (DFMD) y/o de anticuerpo antiterapéutico (ATA) alteran las estimaciones.
El anticuerpo anti-TIGIT derivado de OMT 4.1D3, que presentó propiedades FC favorables, también se comparó con el 10A7 humanizado (h10A7.K4G3) en un estudio FC de 7 días. En este experimento, se dividieron ocho macacos cangrejeros hembras en dos grupos de cuatro monos, recibiendo el primer grupo h10A7.K4G3 y recibiendo el segundo grupo 4.1D3. Ambos anticuerpos anti-TIGIT se administraron a una dosis de 10 mg/kg (volumen de dosis de 5 ml/kg; concentración de dosis de 2 mg/ml) por inyección intravenosa en bolo lento. Se recogieron muestras de sangre (0,5 ml) a las 0 horas (antes de la dosis), 0,25 horas, 2 horas, 8 horas, 1 día, 3 días y 7 días después de la dosis de acuerdo con los siguientes márgenes de recogida:
Punto temporal después
de la dosisMargen de recogida
De 0 a 15 minutos /- 1 minuto
De 16 a 30 minutos /- 2 minutos
De 31 a 45 minutos /- 3 minutos
De 46 a 60 minutos /- 4 minutos
De 61 minutos a 2 horas /- 5 minutos
De >2 a 8 horas /-10 minutos
De >8 a 24 horas /- 20 minutos
usando tubos separadores de suero en gel. La sangre se mantuvo a temperatura ambiente y se dejó coagular durante al menos 20 minutos antes de la centrifugación. Se centrifugaron las muestras (aproximadamente de 10 a 15 minutos a aproximadamente de 1500 a 2000 x g [fuerza], de 2 °C a 8 °C) dentro de 1 hora de su recogida. Se recolectó el suero dentro de los 30 minutos posteriores al inicio de la centrifugación y se transfirió a tubos con tapa de rosca con código de barras 2D de 0,5 ml (catálogo de Thermofisher Scientific n.° 3744 o equivalente). Se marcó la muestra de suero con el número de animal, la especie, el grupo de dosis, el día de recogida, el tipo de muestra (es decir, suero FC) y los números de estudio. A continuación, se analizaron las muestras de suero para determinar las concentraciones de h10A7.K4G3 o 4.1D3. Como se muestra en las figuras 5C y 5D, este estudio FC reveló que h10A7.K4G3 presentó una depuración más rápida (ABC más baja) que 4.1D3, y que la depuración de h10A7.K4G3 (> 9 ml/día/kg) es más rápida que la recomendada para la selección de anticuerpos monoclonales en macacos cangrejeros. La depuración estimada se basó en datos del día 0 al día 7 y se calculó por Winnonlin usando NCA.
Ejemplo 5. Análisis molecular de anticuerpos anti-TIGIT
También se sometieron a prueba los clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de OMT (4.1D3, 7.4A3.C96S y 4.1A4.C96S) y derivados de SD (h1.6B2.L1H1, h1.10A5.L1H1, h1.7E7.L1H1 y h1.15C8.L1H1) en un análisis de evaluación molecular (MA) para determinar propiedades de línea celular estable. En resumen, se sometieron a prueba los anticuerpos anti-TIGIT (1 mg/ml) en cuanto a la agresión en condiciones químicas con AAPH (diclorhidrato de 2,2-azobis(2-amidinopropano)), una pequeña molécula conocida por generar radicales libres, así como en condiciones térmicas a pH variable (una prueba de agresión térmica de dos semanas a 40 °C, a pH 5,5 o bien pH 7,4). Como se muestra en las tablas 8 y 9, a continuación, se determinó que 4.1A4.C96S era inestable, mostrando una pérdida de pico principal inaceptable y una desamidación incrementada en los estudios de MA. De forma similar, h1.7E7.L1H1 y h1.15C8.L1H1 mostraron una desamidación inicial alta (>30 %). Por otra parte, se descubrió que los anticuerpos anti-TIGIT 4.1D3, 7.4A3.C96S, h1.6B2.L1H1 y h1.10A5.L1H1 poseían propiedades de estabilidad aceptables en los estudios de MA.
Tabla 8. Resumen de estabilidad de MA para clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de OMT
Tabla 9-1. Resumen de estabilidad de MA para clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de SD
Tabla 9-2. Resumen de estabilidad de MA para clones de anticuerpo anti-TIGIT derivados de SD
Ejemplo 6. Cartografía de epítopos de TIGIT estructural y funcional
Para entender mejor cómo el anticuerpo anti-TIGIT 4.1D3 y sus variantes optimizadas (por ejemplo, 4.1D3.Q1E), en particular, pueden presentar una reactividad cruzada ejemplar (por ejemplo, reactividad cruzada entre TIGIT humano, de macaco y de conejo), una alta afinidad por TIGIT y un bloqueo sólido de la interacción/función de TIGIT-PVR y TIGIT-CD226 mientras presentan propiedades farmacocinéticas y de evaluación molecular, se determinó la estructura cristalina de 4.1D3 en complejo con TIGIT y se comparó con las estructuras cristalinas del anticuerpo anti-TIGIT derivado de ratón 1A5 unido a TIGIT y un anticuerpo anti-TIGIT derivado de hámster 10A7 unido a TIGIT, como se describe en detalle a continuación. También se realizaron experimentos de mutagénesis por barrido de alanina de la interfase de TIGIT para identificar residuos epitópicos funcionales.
A. Expresión, purificación y cristalización de TIGIT y Fab
Se expresaron los residuos 23-128 de TIGIT humano y se purificaron como se describe (véase, por ejemplo, Stengelet al. PNAS.109(14): 5399-5404, 2012). Se expresaron los fragmentos Fab que incluyen las cadenas pesadas y ligeras y se purificaron como se describe (véase, por ejemplo, Carteret al. Nat. Biotech.1992).Se mezcló TIGIT purificado con un exceso de fragmento Fab purificado para generar el complejo TIGIT/Fab. A continuación, se purificó además el complejo en una columna de exclusión por tamaño equilibrada en solución salina tamponada con HEPES (HEPES 10 mM, pH 7,5 y NaCl 100 mM) para generar una muestra que contenía solo complejos 1:1 de TIGIT y Fab. A continuación, se concentró cada uno de los complejos TIGIT/Fab para su cristalización y se sometió a técnicas estándar de cribado de cristalización por difusión con vapor de alto rendimiento. Para el complejo TIGIT/10A7, se concentró la muestra a aproximadamente 25 mg/ml y se encontró que cristalizaba en HEPES 0,1 M, pH 7,5, PEG 4000 al 20 % e isopropanol al 10 %. Para el complejo TIGIT/1A5, se concentró la muestra a aproximadamente 25 mg/ml y se encontró que cristalizaba en HEPES 0,05 M, pH 7,0, PEG3350 al 12 % y triptona al 1 %. Para el complejo TIGIT/4.1D3, se concentró la muestra a aproximadamente 25 mg/ml y se encontró que cristalizaba en HEPES 0,1 M, pH 7,5, PEG 6000 al 10 % y M<p>D al 5 %. Se crioprotegieron los cristales con glicerol y se ultracongelaron rápidamente en nitrógeno líquido de acuerdo con técnicas estándar para la recopilación de datos.
B. Recopilación de datos y solución de estructura
Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en condiciones de enfriamiento criogénico a 100 Kelvin usando diversas radiaciones de rayos X de sincrotrón en fuente de luz avanzada (Berkeley, CA) o fuente de fotones avanzada (Argonne, IL) de acuerdo con procedimientos estándar. Se procesaron las imágenes de difracción y se redujeron usando el programa informático de procesamiento de datos XDS (Kabsch W.Acta Cryst. D. Biol. Crystl.
66: 125-132, 2010). Se generaron modelos usando la técnica de reemplazo molecular con el programa PHASER. La estructura de TIGIT humano (Stengelet al.PNAS 2012) y el modelo de anticuerpo de Fab (Nakamuraet al.Cell Host Microbe 2013) se usaron como modelos de búsqueda. Se sometieron las estructuras a rondas iterativas de ajuste del modelo usando el programa COOT y refinamiento usando los programas Phenix.refine o BUSTER. Se refinaron los modelos a valores de R y R libre aceptables y estadísticas de Ramachandran (calculadas por Molprobity). Las estadísticas de procesamiento y refinamiento de datos se pueden encontrar en la tabla 10.
Tabla 10. Estadísticas de recopilación y refinamiento de datos
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C. La estructura de 4.1D3 unido a TIGIT humano
El Fab de 4.1D3 en complejo con TIGIT cristalizó en el grupo espacial I4, con dos complejos en la unidad asimétrica, y difractó a 1,91 A. La superposición de los dos complejos individuales en la unidad asimétrica muestra solo cambios menores en el posicionamiento de la cadena principal entre las copias individuales. La estructura de 4.1D3 unido a TIGIT humano (figura 6A) muestra que 4.1D3 interfiere estéricamente con la unión de PVR (figuras 6B y 6C). El área de superficie oculta entre 4.1D3 y TIGIT es de aproximadamente 1630 A2. Las interacciones de la cadena ligera de 4.1D3 se agrupan alrededor de los residuos 77-82 de TIGIT, con Tyr27d de CDR L1 y Tyr92, Ser93, Thr94 y Phe96 de CDR L3 en contacto con los residuos de TIGIT IIe77, Pro79, Ser80 y Lys82. CDR L2 no entra en contacto con TIGIT. Las interacciones de la cadena pesada de 4.1D3 están mediadas principalmente por CDR H2 y H3 y entran en contacto más extenso con TIGIT. Asn32 de CDR H1 de 4.1D3 se pone en contacto con Leu73 de TIGIT. Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56 y Asp58 de CDR H2 de 4.1D3 se ponen en contacto con los residuos Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, IIe68, Asn70, Ser80 e His111 de TIGIT. Los residuos Tyr99, Asp100, Leu100a Leu100b y Ala100c de CDR H3 de 4.1D3 se ponen en contacto con los residuos Leu65, Ala67, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79 y Lys82 de TIGIT. 4.1D3 interactúa con TIGIT usando una combinación de interacciones polares y no polares. El residuo Thr94 de CDR L3 de la cadena ligera forma contactos polares con Pro79 y Ser80 de TIGIT. Los residuos Arg52b y Tyr56 de CDR H2 de la cadena pesada forman enlaces de hidrógeno con los residuos Asn58 y Glu60 de TIGIT. El residuo Leu100a de CDR H3 de la cadena pesada forma un enlace de hidrógeno con His76 de TIGIT. El residuo Lys54 de CDR H2 y el residuo Asp100 de CDR H3 de la cadena pesada forman puentes salinos con los residuos Glu60 y Lys82 de TIGIT, respectivamente. Véanse también las figuras 6D y 6E.
En base a la estructura cristalina del complejo 4.1D3/TIGIT, se determinaron los residuos de TIGIT que se ponen en contacto con 4.1D3 (es decir, los residuos epitópicos de TIGIT unido por 4.1D3) y los residuos de 4.1D3 que se ponen en contacto con TIGIT (es decir, los residuos paratópicos de 4.1D3 que se ponen en contacto con TIGIT). Las tablas 11 y 12, a continuación, muestran los residuos de TIGIT y los residuos de la cadena ligera o pesada de 4.1D3 con los que se ponen en contacto, como se evalúa usando una restricción de distancia de contacto de 3,7 A, un punto en el que las fuerzas de interacción de van der Waals (no polares) son las más altas.
Tabla 11. Residuos epitópicos de TIGIT y sus correspondientes residuos paratópicos en la cadena ligera de 4.1D3
Tabla 12. Residuos epitópicos de TIGIT y sus correspondientes residuos paratópicos en la cadena pesada de 4.1D3
También se realizó un barrido de alanina de la interfase de TIGIT humano, con mutaciones de alanina de los residuos de TIGIT realizadas para Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 y Thr117. Se sometieron a prueba estos mutantes, junto con el natural, para determinar su unión al fragmento Fab de 4.1D3. En este experimento, la mutación de los residuos Glu60, Leu65 e Ile68 de TIGIT redujo la unión de 4.1D3 más de 10 veces (figuras 7A, 7B y 7E). La mutación de los residuos Gln56, Asn70, Leu73, His111 y Tyr113 de TIGIT redujo la unión de 4.1D3 entre 1 y 10 veces (figuras 7A, 7B y 7E). La mutación de Gln53, His76 y Thr117 de TIGIT no afectó la unión de 4.1D3 (figuras 7A, 7B y 7E). Este análisis coincidió con el análisis de estructura cristalina, y se encontró que los residuos de TIGIT que más afectaron la unión de 4.1D3 interactuaban con 4.1D3 en la estructura.
D. La estructura de 1A5 unido a TIGIT humano
El complejo Fab de 1A5 con TIGIT cristalizó en el grupo espacial P1, con cuatro complejos en la unidad asimétrica, y difractó a 2,77 A. La superposición de los cuatro complejos individuales en la unidad asimétrica muestra solo cambios menores en el posicionamiento de la cadena principal entre las copias individuales. La estructura de 1A5 unido a TIGIT humano (figura 8) muestra que 1A5 interfiere estéricamente con la unión de PVR, pero el epítopo en TIGIT humano al que se une 1A5 no es idéntico al de 4.1D3 (figura 9). El área de superficie oculta entre 1A5 y TIGIT es de aproximadamente 1715 A2. Las interacciones de la cadena ligera de lA5 con TIGIT se agrupan principalmente entre los residuos 109 y 119, con un contacto periférico con Glu60. CDR L1 de la cadena ligera de 1A5 tiene un único residuo de contacto, Trp32, que se pone en contacto con los residuos Ile109, Thr117 y Thr119 de TIGIT. El residuo Lys50 de CDR L2 de 1A5 se pone en contacto con Glu60 de TIGIT. Los residuos Gly91, Gln92, Ser93 y Tyr94 de CDR L3 de 1A5 se ponen en contacto con los residuos Thr112, Tyr113, Pro114, Asp115, Gly116 y Thr117 de TIGIT. Para la cadena pesada de 10A7, los residuos Thr30 y Asp31 de CDR H1 entran en contacto con el residuo Leu73 de TIGIT. Los residuos Tyr52, Val53, Ser54, Tyr58 y Tyr59 de CDR H2 de 10A7 entran en contacto con los residuos Gln53, Thr55, Asp72, Leu73 y Tyr113 de TIGIT. Los residuos Phe97, Arg98, Pro100 y Trp100a de CDR H3 de 10A7 entran en contacto con los residuos Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ile68, Leu73, His76 e His111 de TIGIT. Los contactos entre 1A5 y TIGIT son principalmente de naturaleza no polar, siendo dos excepciones un enlace de hidrógeno entre el residuo Ser54 de CDR H2 de 1A5 y el residuo Asp72 de TIGIT, y un puente salino entre el residuo Arg98 de CDR H3 de 1A5 y el residuo Glu60 de TIGIT.
En base a la estructura cristalina del complejo 1A5/TIGIT, se determinaron los residuos de TIGIT que se ponen en contacto con 1A5 (es decir, los residuos epitópicos de TIGIT unido por 1A5) y los residuos de 1A5 que se ponen en contacto con TIGIT (es decir, los residuos paratópicos de 1A5 que se ponen en contacto con TIGIT). Las tablas 13 y 14, a continuación, muestran los residuos de TIGIT y los residuos de la cadena ligera o pesada de 1A5 con los que se ponen en contacto, como se evalúa usando una restricción de distancia de contacto de 3,7 A, un punto en el que las fuerzas de interacción de van der Waals (no polares) son las más altas.
Tabla 13. Residuos epitópicos de TIGIT y sus correspondientes residuos paratópicos en la cadena ligera de 1A5
Tabla 14. Residuos epitópicos de TIGIT y sus correspondientes residuos paratópicos en la cadena pesada de 1A5
También se realizó un barrido de alanina de la interfase de TIGIT, con mutaciones de alanina de los residuos de TIGIT realizadas para Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 y Thr117. Se sometieron a prueba estos mutantes, junto con el natural, para determinar su unión al fragmento Fab de 1A5. En este experimento, la mutación de los residuos Gln56, Glu60, Leu65, Ile68 y Tyr113 de TIGIT redujo la unión de 1A5 más de 10 veces (figuras 7A, 7B y 7D). La mutación de los residuos Leu73, His76, Asn70, His111 y Thr117 de TIGIT redujo la unión de 1A5 entre 1 y 10 veces (figuras 7A, 7B y 7D). Solo la mutación de TIGIT Gln53 no afectó la unión de 1A5 (figuras 7A, 7B y 7d ). Este análisis coincidió con el análisis de estructura cristalina, y se encontró que muchos de los residuos de TIGIT que más afectaron la unión de 1A5 interactuaban con 1A5 en la estructura.
E. La estructura de 10A7 unido a TIGIT humano
El complejo Fab de 10A7/TIGIT cristalizó en el grupo espacial P21, con dos complejos 10A7/TIGIT en la unidad asimétrica, y difractó a 1,85 A. La superposición de los dos complejos muestra solo diferencias menores en el posicionamiento de la cadena principal tanto para TIGIT como para 10A7. La estructura de 10A7 unido a TIGIT humano (figura 10A) muestra que 10A7 interfiere estéricamente con la unión de PVR (figura 10B), pero el epítopo en TIGIT humano al que se une 10A7 no es idéntico al de 4.1D3 o 1A5 (figura 9). El área de superficie oculta entre 10A7 y TIGIT es de aproximadamente 1420 A2. Los residuos de contacto de TIGIT se agrupan entre Leu65 e Ile77, con dos contactos de CDR de 10A7 periféricos con Gln56 y Pro87 de TIGIT. CDR L1 de la cadena ligera tiene una inserción de seis aminoácidos y utiliza los residuos Tyr27d, Gly27f, Val28, Lys29 y Leu32 para realizar contactos con los residuos Gln56, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, Ser78, Ile77 y Pro79 de TIG<i>T. CDR L2 solo realiza dos contactos por medio de Tyr50 e IIe53 con His76, Ile77 y Pro79 de TIGIT. Gly91, Ile92, Asn93 y Asn94 de CDR L3 se ponen en contacto con los residuos Asp72, Leu73 e His76 de TIGIT. Para las CDR de la cadena pesada, ningún residuo de H1 se pone en contacto con TIGIT. Para CDR H2, Phe50 y Arg52, se ponen en contacto con Asn70, Ala71, Asp72, Leu73 y Gly74. Para CDR H3, los residuos Arg95, Leu97, Gly98, His99 y Asn100 se ponen en contacto con los residuos Leu73, Gly74, Trp75, His76, Ile77 y Pro87 de TIGIT. En general, las interacciones entre la cadena ligera de 10A7 y TIGIT fueron principalmente de naturaleza hidrófoba, con un contacto de enlace de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de Tyr50 de CDR L2 y el carbonilo de la cadena principal de Ile77. Para la cadena pesada de 10A7, se encuentran contactos polares entre Arg52 y los grupos carbonilo de la cadena principal de TIGIT Ala71 y Asp72, así como entre Arg95 y los grupos carbonilo de la cadena principal de Gly74 y Trp75.
En base a la estructura cristalina del complejo 10A7/TIGIT, se determinaron los residuos de TIGIT que se ponen en contacto con 10A7 (es decir, los residuos epitópicos de TIGIT unido por 10A7) y los residuos de 10A7 que se ponen en contacto con TIGIT (es decir, los residuos paratópicos de 10A7 que se ponen en contacto con TIGIT). Las tablas 15 y 16, a continuación, muestran los residuos de TIGIT y los residuos de la cadena ligera o pesada de 10A7 con los que se ponen en contacto, como se evalúa usando una restricción de distancia de contacto de 3,7 A, un punto en el que las fuerzas de interacción de van der Waals (no polares) son las más altas.
Tabla 15. Residuos epitópicos de TIGIT y sus correspondientes residuos paratópicos en la cadena ligera de 10A7
Tabla 16. Residuos epitópicos de TIGIT y sus correspondientes residuos paratópicos en la cadena pesada de 10A7
También se realizó un barrido de alanina de la interfase de TIGIT, con mutaciones de alanina de los residuos de TIGIT realizadas para Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 y Thr117. Se sometieron a prueba estos mutantes, junto con el natural, para determinar su unión al fragmento Fab de 10A7. En este experimento, solo las mutaciones Leu73Ala e His76Ala afectaron la unión de 10A7 más de 10 veces (figuras 7A-7C). La mutación de los otros residuos enumerados no afectó significativamente la unión de 10A7 (figuras 7A-7C). Esto coincidió estrechamente con la estructura cristalina de 10A7 unido a TIGIT, en la que Leu73 y His76 se encontraron directamente en el epítopo unido por 10A7.
F. Los anticuerpos anti-TIGIT 4.1D3, 1A5 y 10A7 reconocen TIGIT en epítopos únicos
Los estudios estructurales descritos anteriormente demuestran que los tres anticuerpos anti-TIGIT, 4.1D3, 1A5 y 10A7, reconocen TIGIT en epítopos únicos, lo que puede explicar sus distintas propiedades y características funcionales. Como se muestra a continuación en la tabla 17, por ejemplo, 4.1D3 se une a TIGIT en los residuos Ser78, Ser80 y Lys82, que no están unidos por los anticuerpos 1A5 o bien por el 10A7. La figura 11 es una representación estructural que muestra que los residuos Ser78, Ser80 y Lys82 de TIGIT se ponen en contacto estrecho con 4.1D3, pero no con 1A5 o 10A7.
Tabla 17. Residuos epitópicos de TIGIT dentro de 3,7 A para los anticuerpos anti-TIGIT 4.1D3, 1A5 y 10A7
Ejemplo 7. Caracterización de la expresión de TIGIT, PD-1 y CD226 en células inmunitarias
Seguidamente, se caracterizó la expresión de TIGIT, PD-1 y CD226 en linfocitos T CD4+ y CD8+ de muestras de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (MM) usando citometría de flujo multicolor. Se aislaron células de médula ósea congelada obtenida de pacientes con MM (n=10). Se recogieron muestras de dos de los pacientes con MM sometidos a prueba en el momento del diagnóstico y nuevamente tras la remisión. Se usó médula ósea congelada de donantes sanos como control (n=8). En estos experimentos, se tiñeron las muestras de médula ósea con los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con fluorescencia: BV605 (PD-1), Alexa Fluor 488 (FoxP3), PE-DNAM-1 (CD226), PE-Cy7 (CD45), BUV737 (CD8), PerCP-eF710 (CD4), CPA (TIGIT), violeta brillante 421 (NKp46), violeta brillante 421 (CD56), violeta brillante 510 (CD3) violeta brillante 510 (CD38), PE-Cy7 (CD319), PE (CD19) y tinción de células muertas con infrarrojo cercano fijable LIVE/DEAD (Life Technologies, ThermoFisher).
Se demostró que TIGIT, PD-1 y CD226 se expresaban en gran medida en linfocitos T CD4+ y CD8+ obtenidos de la médula ósea de pacientes con MM en comparación con linfocitos T CD4+ y CD8+ obtenidos de la sangre periférica de pacientes sanos (figura 12). También se determinó que los linfocitos T CD4+ y CD8+ obtenidos de la médula ósea de pacientes con MM coexpresaban tanto TIGIT como PD-1 (figura 13). Dado este patrón de expresión, los anticuerpos anti-TIGIT de la invención son útiles para tratar a pacientes que tienen una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario o cáncer (por ejemplo, un mieloma, por ejemplo, MM), como monoterapia o bien en combinación con un agente terapéutico adicional, tal como un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un antagonista de unión a PD-L1, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A (atezolizumab)).

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIGIT humano, en el que el anticuerpo antagonista es un anticuerpo monoclonal de la subclase IgG 1 humana y comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 35 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
2. El anticuerpo antagonista de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo antagonista comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
3. El anticuerpo antagonista de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo antagonista comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
4. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.
6. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5, en la que la célula huésped es procariota o eucariota.
7. La célula huésped de la reivindicación 6, en la que la célula huésped es una célula 293, una célula CHO, una célula de levadura o una célula vegetal.
8. Un procedimiento de producción del anticuerpo antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo el procedimiento cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en un medio de cultivo, en el que el procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped o del medio de cultivo.
9. Una composición que comprende el anticuerpo antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. La composición de la reivindicación 9, en la que la composición es una composición farmacéutica.
11. La composición de la reivindicación 10, en la que la composición farmacéutica comprende además el anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A (atezolizumab).
12. La composición de las reivindicaciones 10 u 11, en la que la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional.
13. La composición de la reivindicación 12, en la que el agente terapéutico adicional es un agente quimioterápico.
14. El anticuerpo antagonista de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como medicamento.
15. El anticuerpo antagonista para su uso de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo antagonista se administra en combinación con el anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A (atezolizumab) y/o un agente terapéutico adicional.
16. El anticuerpo antagonista para su uso de la reivindicación 15, en el que el agente terapéutico adicional es un agente quimioterápico.
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