ES2927019T3 - Combinaciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades hepáticas - Google Patents

Abstract

La presente descripción se refiere a un método para prevenir y/o tratar la enfermedad hepática que comprende administrar un inhibidor de ACC en combinación con un agonista de FXR a un paciente que lo necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Combinaciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades hepáticas

CAMPO

[0001] La presente divulgación se refiere a combinaciones para uso en métodos para prevenir y/o tratar enfermedades hepáticas.

LISTA DE SECUENCIAS

[0002] La Lista de Secuencias asociada con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y se incorpora aquí por referencia en la especificación.

ANTECEDENTES

[0003] La enfermedad hepática se clasifica generalmente como aguda o crónica basándose en la duración de la enfermedad. La enfermedad hepática puede ser causada por infección, lesión, exposición a drogas o compuestos tóxicos, alcohol, impurezas en los alimentos y la acumulación anormal de sustancias normales en la sangre, un proceso autoinmune, un defecto genético (como la hemocromatosis) o causas desconocidas.

[0004] La enfermedad hepática es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. En particular, se ha visto que una dieta rica en grasas daña el hígado de manera sorprendentemente similar a la hepatitis. La American Liver Foundation estima que más del 20 por ciento de la población tiene enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD). Se sugiere que la obesidad, las dietas poco saludables y los estilos de vida sedentarios pueden contribuir a la alta prevalencia de NAFLD. Cuando no se trata, NAFLD puede progresar a esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y causar efectos adversos graves. Una vez que se desarrolla NASH, hace que el hígado se inflame y cicatrice (es decir, cirrosis) con el tiempo.

[0005] El documento WO 2016/112305 describe en general el tratamiento de enfermedades hepáticas (p. ej., NALFD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática) utilizando un inhibidor de ACC. La publicación estadounidense n.° 2014/221659 describe el tratamiento de una enfermedad hepática utilizando un agonista de FXR.

[0006] Aunque los informes preliminares sugieren que los cambios positivos en el estilo de vida podrían prevenir o revertir el daño hepático, no existen tratamientos médicos efectivos para NAFLD o NASH. En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de proporcionar nuevos agentes farmacéuticos eficaces para tratar enfermedades hepáticas.

RESUMEN

[0007] La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas o medicamentos de la presente invención para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal.

[0008] En el presente documento se describen combinaciones para uso en métodos de tratamiento y/o prevención de enfermedades hepáticas en un paciente que lo necesite, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de acetil-CoA carboxilasa (ACC) de fórmula (I) o (II) como se define en las reivindicaciones en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista del receptor farmesoide X (FXR) de fórmula (III) o (IV) como se define en las reivindicaciones. La enfermedad hepática puede ser cualquier enfermedad hepática, incluidas las enfermedades hepáticas crónicas y/o metabólicas, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

[0009] En ciertas formas de realización, en el presente documento se proporciona una combinación para usar en un método para tratar y/o prevenir la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC de fórmula (I) o (II) en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR de fórmula (III) o (IV).

[0010] En una forma de realización, el inhibidor de ACC y el agonista de FXR pueden administrarse conjuntamente. En dicha realización, el inhibidor de ACC de fórmula (I) o (II) y el agonista de FXR de fórmula (III) o (IV) pueden administrarse juntos como una sola composición farmacéutica, o por separado en más de una composición farmacéutica. Por consiguiente, también se proporciona aquí una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC de fórmula (I) o (II) y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR de fórmula (III) o (IV).

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0011]

FIG. 1. Triglicéridos hepáticos en umol/g en el modelo FFD murino. (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001 significativamente diferente del vehículo por ANOVA). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 2. ALT IU/L en el modelo FFD murino. (*** p < 0,001; significativamente diferente del vehículo por ANOVA). El grafico muestra la media de ± SEM.

FIG. 3. Expresión hepática del gen de fibrosis hepática Col1a1 medida por RT-PCR cuantitativa en el modelo FFD murino. (** p < 0,01; **** p < 0,0001 significativamente diferente del vehículo por ANOVA; # significativamente diferente de cualquiera de los agentes individuales por prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 4. Expresión hepática del gen de fibrosis hepática Timp1 medida por RT-PCR cuantitativa en el modelo FFD murino. (* p < 0,05; **** p < 0,0001 significativamente diferente del vehículo por ANOVA; # significativamente diferente de cualquiera de los agentes individuales por prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 5. Porcentaje de área positiva de PSR mediante análisis de imagen cuantitativo en el modelo CDHFD de rata. (** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 significativamente diferente del vehículo mediante la prueba t; & p < 0,001 significativamente diferente del inicio del tratamiento mediante la prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 6. Porcentaje de área positiva de a-SMA mediante análisis de imagen cuantitativo en el modelo CDHFD de rata. (** p < 0,01 significativamente diferente del vehículo según la prueba t; & p < 0,001 significativamente diferente del comienzo del tratamiento según la prueba t; # p < 0,05 significativamente diferente de cualquiera de los agentes individuales según la prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 7. Proteína Timp1 medida en plasma por ELISA en el modelo CDHFD de rata. (* p < 0,05 significativamente diferente del vehículo por la prueba t; & p < 0,001 significativamente diferente del inicio del tratamiento por la prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 8. Ácido hialurónico (HA) medido en plasma por ELISA en el modelo CDHFD de rata. ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 significativamente diferente del vehículo por prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

FIG. 9. Propéptido N-terminal de Colágeno Tipo III (PIIINP) medido en plasma por ELISA en el modelo CDHFD de rata. (* p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,0001 significativamente diferente del vehículo por prueba t; & p < 0,001 significativamente diferente del inicio del tratamiento por prueba t; # p < 0,05 significativamente diferente de ya sea agente único por prueba t). El gráfico muestra la media ± SEM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones y parámetros generales

[0012] Tal como se usan en la presente memoria descriptiva, los siguientes términos y frases generalmente tienen los significados que se establecen a continuación, excepto en la medida en que el contexto en el que se usan indique lo contrario.

[0013] Como se usa aquí, el término "aproximadamente" usado en el contexto de mediciones cuantitativas significa la cantidad indicada ± 10 %, o alternativamente la cantidad indicada ± 5 % o ± 1 %.

[0014] El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de un compuesto descrito en el presente documento que conserva la eficacia biológica y las propiedades del compuesto subyacente, y que no es indeseable desde el punto de vista biológico o de otro tipo. Hay sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos.

[0015] Los ácidos y las bases útiles para la reacción con un compuesto subyacente para formar sales farmacéuticamente aceptables (sales de adición de ácido o de adición de base, respectivamente) son conocidos por los expertos en la técnica. De manera similar, los métodos para preparar sales farmacéuticamente aceptables a partir de un compuesto subyacente (después de la divulgación) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Berge, et al. Journal of Pharmaceutical Science, enero de 1977 vol. 66, N° 1, y otras fuentes.

[0016] Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye excipientes o agentes tales como solventes, diluyentes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que no son perjudiciales para el compuesto divulgado o el uso del mismo. El uso de dichos vehículos y agentes para preparar composiciones de sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Filadelfia, PA 17th Ed. (1985); y Modern Pharmaceutics, Marcel Dekker, Inc. 3a Ed. (GS Banker & TC Rhodes, Eds.).

[0017] Los términos "cantidad terapéuticamente efectiva" y "cantidad efectiva" se usan indistintamente y se refieren a una cantidad de un compuesto que es suficiente para efectuar el tratamiento como definido a continuación, cuando se administra a un paciente (p. ej., un ser humano) que necesita dicho tratamiento en una o más dosis. La cantidad terapéuticamente eficaz variará según el paciente, la enfermedad que se esté tratando, el peso y/o la edad del paciente, la gravedad de la enfermedad o la forma de administración según lo determinado por un prescriptor o cuidador calificado.

[0018] El término "tratamiento" o "tratar" significa administrar un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con el propósito de: (i) retraso en g la aparición de una enfermedad, es decir, hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen o retrasar su desarrollo; (ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo de síntomas clínicos; y/o (iii) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de los síntomas clínicos o la gravedad de los mismos.

Enfermedades del hígado

[0019] Las enfermedades del hígado son daños agudos o crónicos del hígado en función de la duración de la enfermedad. El daño hepático puede ser causado por infección, lesión, exposición a drogas o compuestos tóxicos como el alcohol o impurezas en los alimentos, una acumulación anormal de sustancias normales en la sangre, un proceso autoinmune, un defecto genético (como la hemocromatosis), u otras causas desconocidas. Ejemplos de enfermedades hepáticas incluyen, pero no se limitan a, cirrosis, fibrosis hepática, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatohepatitis alcohólica (ASH), lesión por reperfusión de isquemia hepática, cirrosis biliar primaria (PBC), colangitis esclerosante primaria (PSC), y hepatitis, incluyendo tanto la hepatitis viral como la alcohólica.

[0020] La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la acumulación de grasa adicional en las células hepáticas que no está causada por el alcohol. NAFLD puede hacer que el hígado se inflame (es decir, esteatohepatitis), lo que a su vez puede causar cicatrización (es decir, cirrosis) con el tiempo y puede provocar cáncer de hígado o insuficiencia hepática. NAFLD se caracteriza por la acumulación de grasa en los hepatocitos y, a menudo, se asocia con algunos aspectos del síndrome metabólico (p. ej., diabetes mellitus tipo 2, resistencia a la insulina, hiperlipidemia, hipertensión). La frecuencia de esta enfermedad se ha vuelto cada vez más común debido al consumo de dietas ricas en carbohidratos y grasas. Un subconjunto (~20 %) de los pacientes con NAFLD desarrollan esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

[0021] NASH, un subtipo de enfermedad del hígado graso, es la forma más grave de NAFLD. Se caracteriza por esteatosis macrovesicular, degeneración en globo de los hepatocitos y/o inflamación que finalmente conduce a la cicatrización hepática (es decir, fibrosis). Los pacientes diagnosticados con NASH progresan a fibrosis hepática en etapa avanzada y, finalmente, a cirrosis. El tratamiento actual para pacientes con NASH cirróticos con enfermedad en etapa terminal es el trasplante de hígado.

[0022] Otra enfermedad hepática común es la colangitis esclerosante primaria (PSC). Es una enfermedad hepática crónica o de larga duración que daña lentamente los conductos biliares dentro y fuera del hígado. En pacientes con colangitis esclerosante primaria, la bilis se acumula en el hígado debido a la obstrucción de los conductos biliares, donde gradualmente daña las células hepáticas y causa cirrosis o cicatrización del hígado. Actualmente, no existe un tratamiento eficaz para curar la colangitis esclerosante primaria. Muchos pacientes que tienen colangitis esclerosante primaria finalmente necesitan un trasplante de hígado debido a la insuficiencia hepática, generalmente alrededor de 10 años después de haber sido diagnosticados con la enfermedad. La colangitis esclerosante primaria también puede provocar cáncer de las vías biliares.

[0023] La fibrosis hepática es la acumulación excesiva de proteínas de la matriz extracelular, incluido el colágeno, que se produce en la mayoría de los tipos de enfermedades hepáticas crónicas. La fibrosis hepática avanzada da como resultado cirrosis, insuficiencia hepática e hipertensión portal y, a menudo, requiere un trasplante de hígado.

Métodos

[0024] En el presente documento se describe un método para tratar y/o prevenir la enfermedad hepática en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR. La presencia de enfermedad hepática activa puede detectarse por la existencia de niveles elevados de enzimas en la sangre. Específicamente, se sabe que los niveles en sangre de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) por encima de los rangos normales clínicamente aceptados son indicativos de daño hepático continuo. El control de rutina de los pacientes con enfermedad hepática para determinar los niveles sanguíneos de ALT y AST se usa clínicamente para medir el progreso de la enfermedad hepática durante el tratamiento médico. La reducción de ALT y AST elevados dentro del rango normal aceptado se toma como evidencia clínica que refleja una reducción en la gravedad del daño hepático en curso del paciente.

[0025] En ciertas descripciones, la enfermedad hepática es una enfermedad hepática crónica. Las enfermedades hepáticas crónicas implican la destrucción y regeneración progresiva del parénquima hepático, lo que lleva a fibrosis y cirrosis. En general, las enfermedades hepáticas crónicas pueden ser causadas por virus (como el de la hepatitis B, la hepatitis C, el citomegalovirus (CMV) o el virus de Epstein Barr (EBV)), agentes tóxicos o fármacos (como el alcohol, el metotrexato o la nitrofurantoína), un enfermedad metabólica (como la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), la hemocromatosis o la enfermedad de Wilson), una enfermedad autoinmune (como la hepatitis crónica autoinmune, la colangitis biliar primaria (anteriormente conocida como cirrosis biliar primaria), o colangitis esclerosante primaria, u otras causas (tales como insuficiencia cardiaca derecha).

[0026] En una divulgación, se proporciona en el presente documento un método para reducir el nivel de cirrosis. En una divulgación, la cirrosis se caracteriza patológicamente por la pérdida de la arquitectura lobular microscópica normal, con fibrosis y regeneración nodular.Los métodos para medir la extensión de la cirrosis son bien conocidos en la técnica. En una descripción, el nivel de cirrosis se reduce en aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 %. En una forma de realización, el nivel de cirrosis se reduce en al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, o al menos alrededor del 95 % en el sujeto.

[0027] En cierta divulgación, la enfermedad hepática es una enfermedad metabólica del hígado. En una descripción, la enfermedad del hígado es la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD). La NAFLD está asociada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico (obesidad, hiperlipidemia combinada, diabetes mellitus (tipo II) e hipertensión arterial). Se considera que NAFLD cubre un espectro de actividad de la enfermedad y comienza como una acumulación de grasa en el hígado (esteatosis hepática).

[0028] Se ha demostrado que tanto la obesidad como la resistencia a la insulina probablemente juegan un papel importante en el proceso de la enfermedad de NAFLD. Además de una dieta deficiente, NAFLD tiene otras causas conocidas. Por ejemplo, NAFLD puede ser causado por ciertos medicamentos, como amiodarona, medicamentos antivirales (p. ej., análogos de nucleósidos), aspirina (raramente como parte del síndrome de Reye en niños), corticosteroides, metotrexato, tamoxifeno o tetraciclina. NAFLD también se ha relacionado con el consumo de refrescos a través de la presencia de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa que puede provocar un aumento de la deposición de grasa en el abdomen, aunque el consumo de sacarosa muestra un efecto similar (probablemente debido a su descomposición en fructosa). También se sabe que la genética desempeña un papel, ya que se han identificado dos mutaciones genéticas para esta susceptibilidad.

[0029] Si no se trata, NAFLD puede convertirse en esteatohepatitis no alcohólica (NASH), que es la forma más extrema de NAFLD, un estado en el que la esteatosis se combina con inflamación y fibrosis. NASH se considera una de las principales causas de cirrosis hepática. En consecuencia, aquí se divulga un método para tratar y/o prevenir la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de ACC en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de FXR.

[0030] También se describe aquí un método para tratar y/o prevenir la fibrosis hepática en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR. La fibrosis hepática es la acumulación excesiva de proteínas de la matriz extracelular, incluido el colágeno, que se produce en la mayoría de los tipos de enfermedades hepáticas crónicas. En ciertas divulgaciones, la fibrosis hepática avanzada da como resultado cirrosis e insuficiencia hepática. Los métodos para medir las histologías hepáticas, tales como los cambios en la extensión de la fibrosis, la hepatitis lobulillar y la necrosis en puente periportal, son bien conocidos en la técnica.

[0031] En una divulgación, el nivel de fibrosis hepática, que es la formación de tejido fibroso, fibroma o degeneración fibrosa, se reduce en más del 90 %. En una descripción, el nivel de fibrosis, que es la formación de tejido fibroso, fibroma o degeneración fibrosa, se reduce en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, en al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 5 % o al menos alrededor del 2 %.

[0032] En una descripción, los compuestos proporcionados en el presente documento reducen el nivel de fibrogénesis en el hígado. La fibrogénesis hepática es el proceso que conduce a la deposición de un exceso de componentes de la matriz extracelular en el hígado conocido como fibrosis. Se observa en una serie de condiciones tales como hepatitis viral crónica B y C, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática inducida por drogas, hemocromatosis, hepatitis autoinmune, enfermedad de Wilson, colangitis biliar primaria (anteriormente conocida como cirrosis biliar primaria), enfermedad esclerosante colangitis, esquistosomiasis hepática y otras. En una divulgación, el nivel de fibrogénesis se reduce en más de un 90 %. En una divulgación, el nivel de fibrogénesis se reduce en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 40 %, al menos un 30 % %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 5 % o al menos el 2 %.

[0033] En aún otra descripción, se proporciona en el presente documento un método para tratar y/o prevenir la colangitis esclerosante primaria (PSC) en un paciente que lo necesite, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC en combinación con un inhibidor terapéuticamente cantidad efectiva de un agonista de FXR.

[0034] Se ha observado que los pacientes que tienen NASH son, en promedio, aproximadamente 2,8 años mayores que los pacientes sanos en las pruebas epigenéticas. Por lo tanto, en una divulgación, los compuestos útiles para el tratamiento de NASH serían útiles para retrasar, mejorar o revertir la edad epigenética o los efectos del envejecimiento debido a NASH. En otra divulgación, las terapias de combinación para el tratamiento de NASH como, por ejemplo, la combinación de un inhibidor de ACC con un agonista de FXR como se describe en el presente documento pueden ser útiles para mejorar o revertir los efectos del envejecimiento debido a NASH.

[0035] En una descripción, el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se pueden administrar juntos en una formulación combinada o en composiciones farmacéuticas separadas, donde cada inhibidor se puede formular en cualquier forma de dosificación adecuada. En ciertas descripciones, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden administrar por separado una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ACC y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y una composición farmacéutica que comprende un agonista de FXR y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones de combinación según la presente descripción comprenden un inhibidor de ACC y un agonista de FXR junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Las formulaciones de combinación que contienen el ingrediente activo pueden estar en cualquier forma adecuada para el método de administración pretendido.

Inhibidores de ACC

[0036] En ciertas descripciones de los métodos y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, el inhibidor de ACC es un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (I):

, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0037] En ciertas descripciones de los métodos y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, el inhibidor de ACC es un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (II):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0038] Los compuestos de fórmula (I) y fórmula (II) se pueden sintetizar y caracterizar utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, como los descritos en la publicación de solicitud internacional PCT n° WO 2013/071169. En una forma de realización, el inhibidor de ACC es el compuesto de Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una forma de realización, el inhibidor de ACC es el compuesto de Fórmula (II) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Agonista de FXR

[0039] En ciertas descripciones de los métodos y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, el agonista de FXR es un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0040] En ciertas descripciones de los métodos y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, el agonista de FXR es un compuesto que tiene la estructura de fórmula (IV):

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

[0041] Los compuestos de fórmula (III) y fórmula (IV) se pueden sintetizar y caracterizar utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, como los descritos en la publicación de EE. UU. n.° 2014/0221659.

Dosificación y administración

[0042] Aunque es posible que un ingrediente activo se administre solo, puede ser preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas o composiciones farmacéuticas como se describe a continuación. Las formulaciones, tanto para uso veterinario como humano, de la descripción comprenden al menos uno de los ingredientes activos, junto con uno o más vehículos aceptables para los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El o los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y fisiológicamente inocuos para el receptor de la misma.

[0043] Cada uno de los ingredientes activos se puede formular con vehículos y excipientes convencionales, que se seleccionarán de acuerdo con la práctica habitual. Las tabletas pueden contener excipientes, deslizantes, rellenos, aglutinantes y similares. Las formulaciones acuosas se preparan en forma estéril, y cuando están destinadas a una administración distinta a la oral, generalmente serán isotónicas. Todas las formulaciones contendrán opcionalmente excipientes como los establecidos en el Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986). Los excipientes incluyen ácido ascórbico y otros antioxidantes, agentes quelantes como EDTA, carbohidratos como dextrina, hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilmetilcelulosa, ácido esteárico y similares. El pH de las formulaciones varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 11, pero normalmente es de aproximadamente 7 a 10.

[0044] Un médico experto puede determinar fácilmente la cantidad terapéuticamente eficaz de ingrediente activo utilizando estudios de aumento de dosis convencionales. Normalmente, cada ingrediente activo se administrará en una dosis de 0,01 miligramos a 1 gramo. En una forma de realización, la dosificación será de aproximadamente 10 miligramos a 450 miligramos. En otra forma de realización, la dosificación será de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 miligramos. En otra forma de realización, la dosificación será de aproximadamente 50 o 100 miligramos. En una forma de realización, la dosificación será de aproximadamente 100 miligramos. En una forma de realización, se administran 20 mg de un inhibidor de ACC. En una forma de realización específica, se administran 20 mg de un compuesto de Fórmula (II). En una forma de realización, se administran 30 mg de un agonista de FXR. En una forma de realización específica, se administran 30 mg de un compuesto de Fórmula (III). Se contempla que los ingredientes activos puedan administrarse una, dos o tres veces al día. Además, los ingredientes activos pueden administrarse una o dos veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas o una vez cada seis semanas.

[0045] La composición farmacéutica del ingrediente activo puede incluir aquellas adecuadas para las vías de administración anteriores. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Las técnicas y formulaciones generalmente se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Dichos métodos incluyen el paso de asociar el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.

[0046] Las formulaciones adecuadas para la administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo también se puede administrar como bolo, electuario o pasta. En ciertas formas de realización, el ingrediente activo puede administrarse como una inyección subcutánea.

[0047] Una tableta se puede hacer por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en forma de flujo libre, como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante o agente tensioactivo. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del ingrediente activo en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o ranurar opcionalmente y se formulan opcionalmente para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo de los mismos.

[0048] El ingrediente activo se puede administrar por cualquier ruta apropiada para la condición. Las rutas adecuadas incluyen oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural) y similares. Se apreciará que la ruta preferida puede variar con, por ejemplo, la condición del destinatario. En ciertas formas de realización, los ingredientes activos están biodisponibles por vía oral y, por lo tanto, se pueden dosificar por vía oral. En una forma de realización, el paciente es un ser humano.

[0049] Cuando se usan en combinación en los métodos descritos en el presente documento, el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se pueden administrar juntos en una sola composición farmacéutica, por ejemplo, una combinación de dosis fija, o por separado (ya sea concurrente o secuencialmente) en más de una composición farmacéutica. En ciertas formas de realización, el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se administran juntos. En otras realizaciones, el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se administran por separado. En algunos aspectos, el inhibidor de ACC se administra antes que el agonista de FXR. En algunos aspectos, el agonista de FXR se administra antes que el inhibidor de ACC. Cuando se administran por separado, el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se pueden administrar al paciente por la misma vía de administración o por vías diferentes.

Composiciones farmacéuticas

[0050] Las composiciones farmacéuticas de la divulgación comprenden una cantidad eficaz de un inhibidor de ACC seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de Fórmula (I) y un compuesto de Fórmula (II), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un cantidad efectiva de un agonista de FXR seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de Fórmula (III) y un compuesto de Fórmula (IV), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0051] Cuando se usa para uso oral, por ejemplo, se pueden preparar comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes o elixires. Las composiciones destinadas al uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes que incluyen agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, con el fin de proporcionar un sabor agradable al paladar. preparación. Son aceptables los comprimidos que contienen el ingrediente activo mezclado con un excipiente no tóxico farmacéuticamente aceptable que es adecuado para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como, por ejemplo, carbonato cálcico o sódico, lactosa, lactosa monohidrato, croscarmelosa sódica, povidona, fosfato cálcico o sódico; agentes de granulación y disgregación, tales como, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; aglutinantes como, por ejemplo, celulosa, celulosa microcristalina, almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes como, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas que incluyen la microencapsulación para retrasar la desintegración y la adsorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo de tiempo tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera.

[0052] Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un aceite. medio, como por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

[0053] Las suspensiones acuosas de la divulgación contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen un agente de suspensión, como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga, y agentes dispersantes o humectantes como, por ejemplo, un fosfátido natural (p. ej., lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (p. ej., estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (p. ej., heptadecaetilenoxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (p. ej., monooleato de sorbitán polioxietilenado). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservantes como, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más colorantes, uno o más aromatizantes y uno o más edulcorantes, como por ejemplo sacarosa. o sacarina.

[0054] Las suspensiones de aceite pueden formularse suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, como por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral como, por ejemplo, parafina líquida. Las suspensiones orales pueden contener un agente espesante como, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, tales como, por ejemplo, los expuestos anteriormente, y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral apetecible. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante como, por ejemplo, ácido ascórbico.

[0055] Los polvos y gránulos dispersables de la descripción adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ejemplifican mediante los descritos anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

[0056] Las composiciones farmacéuticas de la divulgación también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, como por ejemplo el aceite de oliva o el aceite de cacahuete, un aceite mineral, como por ejemplo la parafina líquida, o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas de origen natural, como, por ejemplo, goma arábiga y goma de tragacanto, fosfátidos de origen natural, como, por ejemplo, lecitina de soja, ésteres o ésteres derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, como, por ejemplo, monooleato de sorbitán, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, como, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y aromatizantes. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes como, por ejemplo, glicerol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante, un aromatizante o un agente colorante.

[0057] Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, tal como, por ejemplo, una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, como, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol o preparada como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se pueden emplear convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como, por ejemplo, el ácido oleico también pueden utilizarse en la preparación de inyectables.

[0058] La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con el material de vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración, tal como administración oral o inyección subcutánea. Por ejemplo, una formulación de liberación prolongada destinada a la administración oral a seres humanos puede contener aproximadamente de 1 a 1000 mg de material activo combinado con una cantidad apropiada y conveniente de material portador que puede variar de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 95 % de las composiciones totales (peso:peso).). La composición farmacéutica se puede preparar para proporcionar cantidades fácilmente medibles para la administración. Por ejemplo, una solución acuosa prevista para infusión intravenosa puede contener de aproximadamente 3 a 500 gg del ingrediente activo por mililitro de solución para que pueda ocurrir la infusión de un volumen adecuado a una velocidad de aproximadamente 30 mL/h. Cuando se formula para administración subcutánea, la formulación se administra normalmente aproximadamente dos veces al mes durante un período de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro meses.

[0059] Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.

[0060] Las formulaciones se pueden presentar en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en una condición liofilizada (liofilizada) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se preparan a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, como se indica anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Eficacia en un modelo de ratón de NASH

[0061] El siguiente estudio se realizó para evaluar la eficacia de la combinación de un inhibidor de ACC y un agonista de FXR en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica (NASH), en relación con la eficacia de los agentes individuales solos en el modelo. Se indujo NASH en ratones macho C57BL/6 mediante la administración crónica de una dieta de "comida rápida" (FFD) alta en grasas saturadas, colesterol y azúcares durante un total de 6 meses, mientras que los animales de control delgados se mantuvieron con una dieta de comida normal. Se estableció un fenotipo NASH en ratones FFD en comparación con ratones de control después de 6 meses, y se caracterizó por esteatosis macrovesicular, ALT y AST elevados y niveles elevados de transcritos asociados con la activación de células estrelladas hepáticas. Véase Charlton M, et al. Fast food diet mouse: novel small animal model of NASH with ballooning, progressive fibrosis, and high physiological fidelity to the human condition. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology 2011; 301 (5):G825-34.

[0062] Después de 5 meses, los ratones FFD se trataron posteriormente con placebo (vehículo), un inhibidor de ACC (Fórmula (I)), un agonista de FXR (Fórmula (III)), o con la combinación de Fórmula (I) y Fórmula (III) durante 1 mes. Los ratones de control permanecieron con una dieta de comida normal durante todo el período de estudio de 6 meses. Los análisis de punto final incluyeron la cuantificación bioquímica de los triglicéridos hepáticos, la ALT plasmática y la medición de las transcripciones profibróticas Timp1 y Col1A1 en el hígado.

Métodos

Animales

[0063] En este estudio se usaron ratones C57CL/6 macho (de 12 semanas de edad al inicio del estudio).

[0064] Todos los procedimientos utilizados para estudiar a los animales cumplieron con la Ley de Bienestar Animal del Departamento de Agricultura (9 CFR Partes 1,2 y 3); la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación de Animales de Laboratorio, The National Academies Press, Washington, DC); y los Institutos Nacionales de Salud, Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio.

Protocolo experimental en vivo para el modelo de ratón FFD

[0065] El diseño experimental se muestra en la Tabla 1. A los animales del estudio se les administró una dieta de comida estándar (Harlan Teklad Global Diets 2014, TD2014) o una dieta alta en grasas y colesterol disponible comercialmente. (Research Diets Inc, DB12079B) (el FFD). A los animales que recibieron FFD se les administró fructosa/glucosa en agua de bebida formulada de la siguiente manera: se mezclaron 23,1 g de fructosa (Sigma, F2543) y 17,2 g de glucosa (Sigma, 49158) en 1000 ml de agua de bebida.

[0066] El compuesto de Fórmula (I) o el compuesto de Fórmula (III) solo, o la combinación de los compuestos de Fórmula (I) y Fórmula (III), se administraron durante el último mes del estudio (mes 5 - mes 6). El compuesto de fórmula (I) y el compuesto de fórmula (III) se formularon en carboximetilcelulosa sódica al 0,5 % (viscosidad media), etanol al 1 % p/p, tampón Tris 50 mM al 98,5 % p/p, pH 8 en agua de ósmosis inversa. El compuesto de Fórmula (I) se formuló a 0,1 o 0,2 mg/mL y se administró en la dosis proporcionada en la Tabla 1, y el compuesto de Fórmula (III) se formuló a 2 mg/mL y se administró en la dosis proporcionada en la Tabla 1.

[0067] Comenzando siete días antes de la dosificación PO, los animales en los grupos 1 - 6 recibieron una dosificación simulada con vehículo BID. La dosificación simulada se diseñó para aclimatar a los animales a la administración de dosis por sonda oral. A partir del día 1 del estudio, los animales de todos los grupos de dosis recibieron dosis tres veces al día; dos veces secuencialmente por la mañana (7:00 /- 1 hora), y una vez por la noche (19:00 /- 1 hora), con el mismo volumen de formulación que no contiene compuesto (grupo 1, vehículo) o los compuestos apropiados como se describe a continuación (Tabla 1) durante 28 días (hasta el Día 29 de dosificación). Cada grupo se dividió en dos y la mitad se sacrificó 2 horas después de la dosis, y la mitad se sacrificó 8 horas después de la dosis el día 29.

Tabla 1. Diseño experimental y grupos de dosis

Conce N2 de ncia de

Grupo ^{Artículo de} Dosis Dosis

_prueba Vol ntración anima­ dosifi­ la Ruta (mg/kg)

(mL/kg) (pg/ml) les cación dosifi­

cación (x/día)

días

Cuantificación de tríglicéridos de hígado murino

[0068] Extracción de tejido: Muestras de tejido de hígado de ratón (25 ± 10 mg, con precisión pesados en estado congelado) fueron homogeneizados y extraídos con una mezcla de solventes orgánicos inmiscibles en agua que extrae la fracción de triacilglicéridos así como las fracciones de colesterol libre y esterificado en la fase orgánica. Después de la centrifugación, una parte alícuota de la capa superior orgánica, que contenía los triacilglicéridos, el colesterol y los ésteres de colesterol, se diluyó 10 veces o 25 veces con etanol. Se tomaron dos alícuotas separadas de esta dilución. Se analizó una alícuota para los triacilglicéridos, la segunda alícuota se utilizó para la determinación del colesterol total.

[0069] Determinación de triacilglicéridos: Para la determinación de triacilglicéridos, se evaporó una alícuota de la dilución de 25 veces (o ninguna dilución en el caso de muestras que tienen un bajo contenido de triacilglicéridos) bajo una corriente de nitrógeno. El extracto seco se reconstituyó paso a paso con una solución de dodecilsulfato de sodio al 0,1 % en PBS bajo ultrasonicación y luego se mezcló con el reactivo de determinación de triacilglicéridos (reactivo líquido estable de triglicéridos Infinity™, Thermo Scientific, hoja de datos del producto, reactivo estable líquido de triglicéridos Infinity™).

[0070] Esta solución de reactivo contenía varias enzimas, cofactores y el reactivo cromogénico 4-aminoantipirina. La determinación de triacilglicéridos (TAG) con este reactivo se basó en el método de Wako, Product Data Sheet, Triacylglyceride - G Code No. 997-69801, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Dallas, TX, y las modificaciones por McGowan et al, (McGowan, MW, et al., Clin. Chem 1983:29:538) y Fossati et al (Fosseti, P. Prenciple L. Clin Chem.

1892:28:2077-80) como sigue:

1. Los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por la lipasa a ácidos grasos libres y glicerol.

2. El glicerol es fosforilado por el trifosfato de adenosina (ATP) con la quinasa de glicerol (GK) para producir 3-fosfato de glicerol y difosfato de adenosina.

3. El glicerol-3-fosfato es oxidado por el fosfato de dihidroxiacetona (DAP) por la glicerol fosfato oxidasa que produce peróxido de hidrógeno (H²O²).

4. En una reacción de color tipo T rinder 5 catalizada por peroxidasa, el H²O² reacciona con 4-aminoantipirina (4-AAP) y sulfonato de 3,5-dicloro-2-hidroxibenceno (DHBS) para producir un tinte de color rojo. La absorbancia de este colorante es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra.

[0071] Después de la incubación con el reactivo de determinación de triacilglicéridos durante 30 min a 37 °C, las muestras se transfirieron a una placa de microtitulación y se midió la absorbancia a 540 nm en un lector de microplacas (SpectraMax M2, Molecular Devices). La cuantificación se realizó utilizando un análisis de regresión de mínimos cuadrados lineales generado a partir de patrones de calibración reforzados utilizando trioleato de glicerilo (trioleína) como patrón de referencia de triacilglicéridos. Las muestras estándar de calibración se tomaron mediante los mismos pasos de extracción e incubación que las muestras de tejido. Las correcciones de peso y los cálculos de concentración se realizaron con Microsoft Excel 2013. Los contenidos finales de tejido se dieron en pmol de triacilglicéridos (TAG)/g de tejido hepático.

ALT

[0072] Se recogió suero de todos los ratones en la necroscopia terminal. La ALT sérica se midió mediante piruvato con piridoxal-5'-fosfato y se analizó en el sistema químico Cobas Hitachi 6000, Roche Diagnostics.

Expresión génica

[0073] Se envió un fragmento de aproximadamente 100 mg de lóbulo lateral izquierdo congelado a DC3 Therapeutics, LLC para su lisis y extracción de ARN. Los ensayos de NanoString se llevaron a cabo con todos los reactivos y consumibles contenidos en un kit maestro nCounter (NanoString) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para medir las transcripciones de ARN. Brevemente, la sonda indicadora codificada por colores que se dirige a 110 genes relacionados con la fibrosis hepática y 6 genes de mantenimiento de control (Tabla 2) se hibridó durante la noche en un termociclador precalentado a 65 °C durante 16 a 22 horas con muestras de ARN de 100 ng en una reacción que incluye un tampón de hibridación y una sonda de captura. Después de la incubación, las muestras se colocaron en una estación de preparación donde se eliminó el exceso de sonda y los complejos de transcripción de sonda se inmovilizaron en un cartucho recubierto de estreptavidina. Finalmente, se tomaron imágenes de los cartuchos en el analizador digital nCounter (NanoString Technologies, Seattle, WA). Todas las transcripciones se normalizaron a la media geométrica de 6 genes domésticos (B2m, Hprt, Pgk1, Rpl13a, Rpn1 y Sfrs4) con el software nSover 3.0.

Tabla 2: Sondas de nanocadenas

Símbolo genético N° de acceso

Secuencia objetivo

Resultados

[0074] El Ejemplo 1 demuestra que un tratamiento combinado con un inhibidor de ACC y un agonista de FXR da como resultado una mayor eficacia que cualquier agente administrado solo en el modelo de NASH en ratones. En particular, la FIG. 1 muestra una reducción significativa de los triglicéridos hepáticos con la combinación del compuesto de Fórmula (I) y el compuesto de Fórmula (III) en relación con los agentes individuales. La FIG. 2 muestra una reducción significativa en la ALT sérica con la combinación del compuesto de Fórmula (I) y el compuesto de Fórmula (III) en relación con los agentes individuales, y la FIG. 3 y la FIG. 4 muestran una reducción significativa en la expresión hepática de Col1 a1 y Timp1 con la combinación del compuesto de fórmula (I) y el compuesto de fórmula (III) en relación con los agentes individuales, respectivamente.

Ejemplo 2. Eficacia en un modelo de rata de NASH

[0075] El siguiente estudio se realizó para evaluar la eficacia de la combinación de un inhibidor de ACC y un agonista de FXR en un modelo de roedor de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) con fibrosis en relación con el eficacia de los agentes individuales solos en el modelo. En este modelo, se indujo NASH con fibrosis en ratas macho Wistar mediante la administración de una dieta rica en grasas y deficiente en colina (CDHFD).

Animales

[0076] Se adquirieron ratas macho Wistar (Crl:Wi(Han)) (de 8-9 semanas de edad a la llegada) de Charles River, Raleigh, NC, y se usaron en los estudios actuales. Este estudio cumplió con todas las secciones aplicables de las Normas finales de los reglamentos de la Ley de Bienestar Animal (Código de Reglamentos Federales, Título 9), la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio de la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio, y el Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigaciones.

Preparación del vehículo

[0077] El vehículo, tampón tris 50 mM p/v, pH 8 en agua desionizada, se preparó antes de su uso y se almacenó en un refrigerador ajustado para mantener 2-8°C. Para preparar 1 L, se agregaron 800 mL de agua caliente (~80 °C) a un recipiente apropiado y se agitó vigorosamente hasta que se formó un vórtice escarpado. Se añadieron lentamente 5,0 gramos de metilcelulosa sódica a la carboximetilcelulosa sódica al vórtice. Se continuó agitando hasta que se disolvió toda la carboximetilcelulosa y la solución se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron al recipiente 5,12 g de Tris HCl. Se añadieron al recipiente 2,12 g de Tris base. Se añadieron 10 g de etanol al recipiente. Los componentes se agitaron durante aproximadamente 15 minutos, asegurándose de que todos los sólidos se hubieran disuelto. Se añadió agua QS a 1 L con mezcla suave.

Diseño del estudio

[0078] La alimentación fue pro libitum y todos los animales del estudio recibieron una dieta alta en colesterol, rica en grasas y deficiente en colina (CDHFD; Research Diets, A16092003) el día 1 del estudio, excepto el grupo 1, el grupo de control de comida, que recibieron dieta estándar (5CR4), como se describe en la Tabla 3. El día del sacrificio, se recogió el hígado y se incrustó en parafina, y se recogió y congeló el plasma. Los animales no fueron dosificados el día del sacrificio.

Tabla 3 de Histo-tec. Diseño experimental y grupos de dosis

[0079] Los tejidos fueron recolectados por Charles River en Reno, Nevada, procesados e incluidos en parafina en Histotec en Hayward, CA y luego fueron enviados a Gilead Sciences en Foster City. Las muestras se seccionaron a 5 pm y las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio para su posterior tinción.

[0080] Tinción con rojo de Picrosirius: las secciones se pretrataron en ácido fosfomolíbdico al 0,2 % (EMS, Cat N° 26357­ 01) y luego se incubaron posteriormente en rojo Sirius 88-89-1 al 0,1 % (p/v) en solución saturada de ácido pícrico (EMS, Cat#26357-02) durante 1 hora a temperatura ambiente. A esto le siguió la diferenciación en HCl 0,01 N (EMS, Cat#26357) y la deshidratación en alcoholes graduados.

[0081] Se capturaron imágenes de portaobjetos completos de portaobjetos teñidos con Picrosirius Red (PSR) utilizando un escáner Leica AT2 con un aumento de 40X. Se verificó la calidad de escaneado de las imágenes de diapositivas digitales, se anotaron y exportaron a las carpetas de red apropiadas dentro del archivo de Leica Digital Image Hub. El análisis cuantitativo de imágenes se realizó en todas las imágenes del portaobjetos utilizando el software de análisis de imágenes Visiopharm (Visiopharm, Hoersholm, Dinamarca) para determinar el alcance y la intensidad de la PSR. Se midió el área total teñida con PSR y se expresó como un porcentaje del área total del hígado teñida. Los resultados se muestran en la FIG. 7.

[0082] a-SMA: Las secciones se desparafinizaron en 3 cambios de xileno durante 5 minutos cada uno, y posteriormente se rehidrataron en 3 cambios de EtoH al 100 %, 1 cambio de EtOH al 95 %, 1 cambio de EtOH al 80 % durante 3 minutos cada uno; seguido de 2 enjuagues sucesivos en agua destilada. Luego, las secciones se incubaron en bloqueador de peroxidasa endógeno Peroxidazed 1 (Biocare Medical, Cat N° PX968) durante 5 minutos y se enjuagaron con agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación del epítopo inducida por calor usando Reveal Decloaker (Biocare Medical, Cat N° RV1000M) a 95 °C durante 40 minutos con una Decloaking Chamber NxGen (Biocare Medical, Cat N° DC2012), seguida de un enfriamiento gradual con reemplazo del tampón de recuperación con agua destilada y se colocó en solución salina tamponada con Tris (TBS). La inmunohistoquímica se realizó en portaobjetos preparados utilizando un autoteñidor Intellipath (Biocare Medical, Cat N° IPS0001) siguiendo los siguientes pasos:

1. Aplicar 300 ul de Background Punisher (Biocare Medical, Cat N° IP974G20) a los portaobjetos e incubar durante 10 minutos; seguido de lavado con TBS.

2. Aplique 300 ul de anticuerpo primario de SMA monoclonal de ratón, clon 1A4, (Biocare Medical, Cat N° CM001) diluido 1:50 en diluyente Da Vinci Green (Biocare Medical, Cat N° PD900L). Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente; seguido de lavado con TBS.

3. Aplicar 300 ul de ratón sobre rata HRP Polymer (Biocare Medical, Cat N° MRT621H) e incubar durante 30 minutos; seguido de lavado con TBS.

4. Prepare DSB: 1 gota de DSB Chromogen/ 1 ml Substrate Buffer (Biocare Medical, Cat N° BRI 4014C / BRI 4013 respectivamente). Aplique 300 uL de cromógeno Deep Space Black (DSB) durante 5 minutos; seguido de lavado con agua destilada.

5. Contraste con Nuclear Fast Red (Biocare Medical, Cat N° STNFRLT) durante 1 minuto; seguido de lavado con agua destilada.

[0083] Los portaobjetos se retiraron del instrumento y se deshidrataron a través de una serie de alcoholes de grado histológico graduados hasta xileno y se cubrieron con cubreobjetos.

[0084] Se capturaron imágenes de portaobjetos completos de portaobjetos teñidos con a-SMA utilizando un escáner Leica AT2 con un aumento de 40X. Se verificó la calidad de escaneado de las imágenes de diapositivas digitales, se anotaron y exportaron a las carpetas de red apropiadas dentro del archivo de Leica Digital Image Hub. El análisis cuantitativo de imágenes se realizó en todas las imágenes del portaobjetos utilizando el software de análisis de imágenes Visiopharm (Visiopharm, Hoersholm, Dinamarca) para determinar la extensión y la intensidad de a-SMA. El área total teñida con a­ SMA se midió y expresó como un porcentaje del área total del hígado teñida.

[0085] ELISA de TIMP-1 en plasma: Las concentraciones de TIMP-1 en plasma se determinaron por duplicado utilizando un kit de ELISA específico de TIMP-1 para rata disponible comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat N° RTM100). TIMP-1 se analizó en plasma de acuerdo con las especificaciones del fabricante con modificaciones menores. Se añadió tampón RD1-21 (50 pl) a los pocillos de la placa ELISA recubiertos previamente con anti-TIMP-1 de ratón. Antes de ELISA, se generó una curva estándar de siete puntos de TIMP-1 de rata (TIMP-1 recombinante expresado en NS0: 2400-37,5 pg/mL) y las muestras de plasma se diluyeron 1:20 en tampón RD5-17. Las muestras y los estándares (50 pl cada uno) se añadieron por duplicado a pocillos que contenían RD1-21 y se incubaron (temperatura ambiente) durante 2 horas en un agitador de placas orbital (300 rpm). Después de la captura del antígeno, las placas se lavaron 5 veces (350 pl/pocillo/lavado) con tampón de lavado utilizando un lavador de placas automático. Después del lavado, se añadió conjugado TIMP-1 de rata (100 pl) a cada pocillo y las placas se incubaron (temperatura ambiente) durante 2 horas en un agitador de placas orbital (300 rpm). A continuación, las placas se lavaron 5 veces y se añadió solución de sustrato (100 pl) a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos protegidas de la luz. Finalmente, se añadió solución de parada (100 pl) a cada pocillo. La absorbancia de densidad óptica (DO) se determinó inmediatamente a 450 nm en un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale CA). Las DO relativas para cada estándar y muest ra se corrigieron en segundo plano frente a las muestras en blanco, y se generaron curvas estándar para la conversión de las DO a la concentración de TIMP-1 utilizando un método de ajuste de curva de 4 parámetros. Se determinaron concentraciones de TIMP-1 de muestras desconocidas usando el software SoftMax Pro5 usando un factor de dilución de 20. Los resultados se muestran en la FIG. 7.

[0086] PIIINP en plasma: Las concentraciones de PIIINP en plasma se determinaron por duplicado utilizando un kit ELISA de propéptido N-terminal de Procolágeno III (PIIINP) de rata comercialmente disponible (Biomatik, Wilmington, DE, Cat N° EKU06788). El PIIINP se analizó en plasma diluido 50 veces en PBS de acuerdo con las especificaciones del fabricante con modificaciones menores. Se prepararon 7 estándares (2000 pg/mL, 1000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,2 pg/mL) a partir de stock estándar que se reconstituyó en Diluyente estándar. Se agregaron 100 pL de cada estándar, blanco y muestras en los pocillos apropiados. La placa se cubrió con el sellador de placas y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de retirar el líquido de cada pocillo, se añadieron 100 pL de solución de trabajo del reactivo de detección A a cada pocillo y se cubrieron con el sellador de placas y luego se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Los pocillos se lavaron con 350 pL de 1 x Lavar y dejar reposar durante 1~2 minutos 3 veces. Después del último lavado, se eliminó cualquier tampón de lavado remanente por decantación y secado contra papel absorbente. Luego se agregaron 100 pL de la solución de trabajo del reactivo de detección B a cada pocillo, la placa se cubrió con el sellador de placas y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. El proceso de aspiración/lavado se repitió un total de 5 veces. Se agregaron 90 pL de solución de sustrato a cada pocillo, la placa se cubrió con un nuevo sellador de placas y se incubó durante 10 - 20 minutos a 37°C protegiéndola de la luz. El líquido se volvió azul por la adición de la solución de sustrato. Finalmente se agregaron 50 pL de Solución de Parada a cada pocillo. El líquido luego se volvió amarillo. Mezcle el líquido golpeando suavemente el lado de la placa. La absorbancia de densidad óptica (DO) se determinó inmediatamente a 450 nm en un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale CA). Las DO relativas para cada estándar y muestra se corrigieron de fondo frente a muestras en blanco, y se generaron curvas estándar para la conversión de DO a concentración de PIIINP utilizando un método de ajuste de curva de 4 parámetros. Las concentraciones de PIIINP de muestras desconocidas se determinaron usando el software SoftMax Pro5 usando un factor de dilución de 50. Los resultados se muestran en la FIG. 9.

[0087] Ensayo de ácido hialurónico (HA) en plasma: Las concentraciones de HA en plasma se determinaron por duplicado usando un kit de prueba de HA comercialmente disponible (Corgenix, Inc., Broomfield, CO, Cat N° 029-001). La HA se analizó en plasma de acuerdo con las especificaciones del fabricante con modificaciones menores. Antes del ensayo, se generó una curva estándar de siete puntos de la solución de referencia de HA (800-12,5 ng/mL) y cada muestra de referencia y muestra de plasma se diluyó de 1 parte a 10 partes de tampón de reacción (30 pl de referencia/muestra a 300 pl de tampón de reacción). Las muestras y los estándares (100 pl) se agregaron por duplicado a los pocillos de la microplaca recubiertos previamente con proteína de unión a HA (HABP) y se incubaron (temperatura ambiente) durante 60 minutos en un agitador de placas orbital (300 rpm). Después de la captura del antígeno, las placas se lavaron 4 veces (350 pl/pocillo/lavado) con PBS utilizando un lavador de placas automático. Después del lavado, se añadió HABP conjugado con HRP (100 pl) a cada pocillo y las placas se incubaron (temperatura ambiente) durante 30 minutos en un agitador de placas orbital (300 rpm). A continuación, las placas se lavaron 4 veces y se añadió a cada pocillo la solución de sustrato de un componente (100 pl). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos protegidas de la luz. Finalmente, se añadió solución de parada (100 pl) a cada pocillo. La absorbancia de densidad óptica (DO) se determinó inmediatamente a 450 nm en un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale CA). Las DO relativas para cada estándar y muestra se corrigieron de fondo frente a las muestras en blanco, y se generaron curvas estándar para la conversión de las DO en concentración de HA utilizando un método de ajuste de curva de 4 parámetros. Las concentraciones de HA de muestras desconocidas sin diluir se determinaron utilizando el software SoftMax Pro5. Los resultados se muestran en la FIG. 8.

Resultados

[0088] El ejemplo 2 demuestra que un tratamiento combinado con un inhibidor de ACC y un agonista de FXR da como

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de ACC para usar en combinación con un agonista de FXR para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en la que el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un inhibidor de ACC para usar en combinación con un agonista de FXR para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el inhibidor de ACC es un compuesto de Fórmula (I):

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (IV):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. Un inhibidor de ACC para usar en combinación con un agonista de FXR para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el inhibidor de ACC es un compuesto de Fórmula (II):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4. Un inhibidor de ACC para usar en combinación con un agonista de FXR para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (II):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (IV):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. Un agonista de FXR para usar en combinación con un inhibidor de ACC para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el inhibidor de ACC es un compuesto de Fórmula (I):

6. Un agonista de FXR para usar en combinación con un inhibidor de ACC para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (II):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. Un agonista de FXR para usar en combinación con un inhibidor de ACC para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (IV):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. Un agonista de FXR para usar en combinación con un inhibidor de ACC para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, en el que el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (IV):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (II):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9. El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se administran juntos.

10. El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el inhibidor de ACC y el agonista de FXR se administran por separado.

11. El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la enfermedad hepática es esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (III):

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (I):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (IV):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (II):

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; y el agonista de FXR es un compuesto de Fórmula (III):

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ACC, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de FXR y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde el inhibidor de ACC es un compuesto de fórmula (II):