ES2908376T3

ES2908376T3 - Anticuerpos que se unen específicamente a PD-1 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2908376T3
Application number: ES16862773T
Authority: ES
Inventors: Raluca Verona; Gordon Powers; Nina Chi Sabins; Nikki A Deangelis; Sandra Santulli-Marotto; Karla R Wiehagen; Sheng-Jiun Wu; Catherine Ferrante; Enrique-Zudaire Ubani
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2022-04-28
Anticipated expiration: 2036-11-01
Also published as: MA43186A; BR112018008891A8; PE20181326A1; HRP20220436T1; RS63125B1; SV2018005684A; BR112018008867A2; EP3370768A1; CL2018001177A1; EP3371226A4; KR102828417B1; UA126896C2; MX2018005550A; NI201800055A; TW201730213A; US20170121409A1; WO2017079116A2; JP2022031666A; JP2019500892A; AU2016348391A1

Abstract

Un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen específicamente a PD-1 y usos de los mismos

LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] Esta solicitud contiene un Listado de Secuencias presentado a través de la red EFS. El archivo de texto ASCII, creado el 28 de octubre de 2016, se denomina JBI507WOPCT_ST25.txt y tiene un tamaño de 418 kilobytes.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se relaciona con anticuerpos que se unen específicamente a PD-1, polinucleótidos que codifican los anticuerpos o fragmentos, y métodos para preparar y usar los anteriores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] El sistema inmunitario está estrechamente controlado por una red de ligandos y receptores coestimuladores y coinhibidores. Estas moléculas proporcionan señales secundarias para la activación de las células T y proporcionan una red equilibrada de señales positivas y negativas para maximizar las respuestas inmunitarias contra infecciones y tumores, al tiempo que limitan la inmunidad propia (Wang et al., (Epub 7 de marzo de 2011) J Exp Med 208(3):577-92, Lepenies et al., (2008) Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 8:279-288).

[0004] La terapia de punto de control inmunitario, dirigida a vías co-inhibitorias en células T para promover respuestas inmunitarias antitumorales, ha conducido a avances en la atención clínica de pacientes con cáncer.

[0005] PD-1 es una molécula de punto de control inmunitario negativo que suprime las funciones de las células T CD4+ y CD8+ en el microambiente tumoral (TME). El compromiso de PD-1 con sus ligandos (PD-L1 y PD-L2) impulsa la anergia y el agotamiento de las células T en los tumores mediante la inhibición de múltiples vías aguas abajo de la señalización del receptor de células T, lo que resulta en una disminución de la supervivencia, el crecimiento y la proliferación de las células T, y la función efectora comprometida y metabolismo alterado. Los estudios preclínicos han demostrado que el bloqueo de la vía PD-1 puede revertir el agotamiento de las células T y estimular la inmunidad antitumoral.

[0006] La ruta de PD-1 contribuye, por lo tanto, a la regulación negativa de las funciones de las células T en el (TME) y la evasión de tumores a través de la destrucción inmunitaria. En el TME, las células T agotadas, además de expresar altos niveles de PD-1, expresan otros receptores inhibidores, incluidos CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD244, TIGIT y CD160 (ver, por ejemplo, Pauken & Wherry; 2015, Trends in Immunology 36(4): 265-276).

[0007] TIM-3 es un receptor transmembrana que se expresa en células Th1 CD4+ (linfocito T 1) y células T CD8+ citotóxicas que secretan IFN-y. TIM-3 generalmente no se expresa en células T vírgenes, sino que se regula positivamente en células T efectoras activadas. TIM-3 tiene un papel en la regulación de la inmunidad y la tolerancia in vivo (ver Hastings et al., (2009) Eur J Immunol 39(9):2492-501).

[0008] Los anticuerpos PD-1 se han descrito, por ejemplo, en: Patentes de EE. UU. Nos 5.897.862 y 7.488.802, y en la Publicación de Patente Int. Nos WO2004/004771, WO2004/056875, WO2006/121168, WO2008/156712, WO2010/029435, WO2010/036959, WO2011/110604, WO2015/145493, WO2015/145493, WO2014/194302, WO2014/206107, WO2015/206107, WO2015/036394, WO2015/035606, WO2015/035606, WO2015/035606, WO2015/085847, WO2015/112900, WO2014/179664, WO2015/112800 y WO2015/112805.

[0009] Los anticuerpos TIM-3 se han descrito, por ejemplo, en: Monney et al., Nature (2002) 415(6871):536-41, y en Publicación de Patente Int. Nos WO2011/155607, WO2013/006490 y WO2015/117002.

[0010] Las combinaciones con el anticuerpo TIM-3 y un anticuerpo PD-L1 se han evaluado, por ejemplo, en Publicación de Patente Int. N° WO2011/159877.

[0011] Si bien los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 están demostrando respuestas clínicas alentadoras en pacientes con múltiples tumores sólidos, las tasas de respuesta aún son bastante bajas, alrededor del 15 % - 20 % en pacientes pretratados (Swaika et al., (2015) Mol Immunol. doi: 10.1016/j.molimm.2015.02.009). BORCH TH et al, "Reorienting the immune system in the treatment of cancer by using anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies", descubrimiento de fármacos hoy, septiembre de 2015, vol. 20, núm. 9, páginas 1127-1134 revisa el uso de anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 para tratar el cáncer, reorientando el sistema inmunológico. LOTE H et al, "PD-1 and PD-L1 blockade in gastrointestinal malignancies", Cancer Treatment Reviews, septiembre de 2015, vol. 41, núm. 10, ISSN 0305-7372, páginas 893-903 revisa el uso de anticuerpos anti-PD-1 en cánceres gastrointestinales. FAGHFURI E et al., "Nivolumab and pembrolizumab as immune-modulating monoclonal antibodies targeting the PD-1 receptor to treat melanoma", Expert Review of Anticancer Therapy, enero de 2015, vol. 15, núm. 9, ISSN 1744-8328, páginas 981-93, describe que nivolumab y pembrolizumab son dos anticuerpos anti-PD-1 aprobados por la FDA para tratar el melanoma maligno. MCDERMOTT J y JIMENO A " Pembrolizumab: PD-1 inhibition as a therapeutic strategy in cáncer ", Drugs of Today, enero de 2015, vol. 51, núm. 1, ISSN 1699-3993, página 7, revisa pembrolizumab (un anticuerpo anti-PD-1) y su uso en el tratamiento del cáncer. MOREIRA DA SILVA R, "Nivolumab: Anti-PD-1 monoclonal antibody cancer immunotherapy", Drugs of the Future, enero de 2014, vol. 39, núm. 1, ISSN 0377-8282, páginas 15-24, describe el anticuerpo antiPD-1 nivolumab y su uso en la terapia del cáncer. WANG C et al, "In vitro characterization of the anti-PD-1 antibody nivolumab, BMS-936558, and in vivo toxicology in non-human primates", Cancer Immunology Research, septiembre de 2014, vol. 2, núm. 9, páginas 846-856, caracteriza nivolumab.

[0012] Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas terapias que inhiban la actividad inmunosupresora de los inhibidores de puntos de control tales como PD-1 y TIM-3, para ser utilizados para la inmunoterapia contra el cáncer y el tratamiento de otras afecciones que se beneficiarían de la mejora de una respuesta inmunitaria, como las infecciones crónicas.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0013] La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

[0014] En particular, la invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56.

[0015] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o la porción de unión al antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptado.

[0016] La invención también proporciona un polinucleótido que codifica el anticuerpo VH, el anticuerpo VL o el anticuerpo VH y el anticuerpo VL de la invención.

[0017] La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido que codifica el anticuerpo VH, el anticuerpo VL o el anticuerpo VH y la VL de la invención.

[0018] La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector de la invención.

[0019] La invención también proporciona un método para producir el anticuerpo o la porción de unión al antígeno de la invención, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa el anticuerpo y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.

[0020] La invención también proporciona el anticuerpo o la porción de unión a antígeno de la invención para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto.

[0021] La invención también proporciona el anticuerpo o la porción de unión a antígeno de la invención para su uso en un método para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención al sujeto que lo necesita. durante un tiempo suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0022]

La Figura 1A muestra que la expresión superficial de TIM-3 está elevada en tumores después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1. Se trataron dos veces por semana ratones Balb/c con tumores de carcinoma de colon CT26 establecidos con anticuerpo anti-PD-1 o vehículo. Los tumores se recolectaron el día 22 y la expresión de TIM-3 se evaluó en células T infiltrantes de tumores usando citometría de flujo. MFI: intensidad fluorescente media. PBS: control

La Figura 1B muestra que la expresión superficial de TIM-3 está elevada en linfocitos infiltrados en tumores (LIT) después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1. Se trataron dos veces a la semana ratones Balb/c con tumores de carcinoma de colon MC38 establecidos con anticuerpo anti-PD-1 o vehículo. La intensidad fluorescente media geométrica (gMFI) de la expresión de TIM-3 en la población total de CD8 LIT se muestra en animales tratados con vehículo (PBS) o tratados con anticuerpo anti-PD-1 (PD-1). p = 0,003 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo antiPD-1.

La Figura 1C muestra la frecuencia relativa de células TIM-3+ CD8 de LIT CD8+ totales en tumores MC38 recolectados de ratones tratados con vehículo (PBS) o anticuerpo anti-PD-1 (PD-1). p=0,045 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1.

La Figura 2A muestra que la expresión superficial de CD137 (gMFI) está elevada en LIT en tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-PD-1 (grupo PD-1) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,005 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 2B muestra que la frecuencia relativa de células CD 137 CD8 de LIT CD8+ totales es elevada en tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-PD-1 (grupo PD-1) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0475 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 3A muestra que la expresión superficial de OX40 (gMFI) está elevada en LIT en tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-PD-1 (grupo PD-1) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0013 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 3B muestra que la frecuencia relativa de las células OX40 CD8 del total de CD8+ LIT está elevada en los tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-PD-1 (grupo PD-1) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,03 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 4A muestra que la expresión de superficie de GITR (gMFI) está elevada en LIT en tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-PD-1 (grupo PD-1) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0004 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 4B muestra que la frecuencia relativa de las células GITR CD8 del total de CD8+ LIT está elevada en los tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-PD-1 (grupo PD-1) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0015 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 5 muestra que el tratamiento con anticuerpos anti-TIM-3 después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 induce además una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Los anticuerpos se analizaron en el ensayo CMV utilizando PBMC de donantes positivos para CMV, en los que se indujeron respuestas inmunitarias específicas de antígeno con grupos de péptidos pp65. Las células se trataron durante 5 días con el anticuerpo anti-PD-1 PD1B244, se volvieron a estimular y se trataron durante 24 horas con el anticuerpo anti-TIM-3 TM3B105. La respuesta inmune se determinó midiendo los aumentos en la secreción de IFN-y . Control de isotipo IgG2s Iso: IgG2sigma. CMV: muestra tratada con péptidos p65 de citomegalovirus en ausencia de anticuerpos.

La Figura 6 muestra las secuencias de HCDR1 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la secuencia del género HCDR1.

La Figura 7 muestra las secuencias de HCDR2 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la secuencia del género HCDR2.

La Figura 8 muestra las secuencias de HCDR3 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la primera secuencia del género HCDR3.

La Figura 9 muestra las secuencias de HCDR3 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la segunda secuencia del género HCDR3.

La Figura 10 muestra las secuencias LCDR1 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la secuencia del género LCDR1.

La Figura 11 muestra las secuencias LCDR2 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la secuencia del género LCDR2.

La Figura 12 muestra las secuencias LCDR3 de anticuerpos anti-PD-1 seleccionados y la secuencia del género LCDR3.

La Figura 13 muestra las secuencias de HCDR1 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados y la secuencia del género HCDR1. La secuencia del género se determinó generando modelos moleculares para todos los Fv (pares VH/VL) en el MOE (CCG, Montreal) utilizando un protocolo predeterminado para el modelado de anticuerpos. Para las CDR que tienen diferentes longitudes, estos modelos estructurales se alinearon basándose en las regiones conservadas estructuralmente y se identificaron las posiciones de las CDR estructuralmente equivalentes.

La Figura 14 muestra las secuencias de HCDR2 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados y la secuencia del género HCDR2. La secuencia del género HCDR2 se generó como se describe en la Figura 10.

La Figura 15 muestra las secuencias HCDR3 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados y la primera secuencia del género HCDR3. La secuencia del género HCDR3 se generó como se describe en la Figura 10.

La Figura 16 muestra las secuencias LCDR1 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados y la secuencia del género LCDR1. La secuencia del género LCDR1 se generó como se describe en la Figura 10.

La Figura 17 muestra las secuencias LCDR2 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados y la secuencia del género LCDR2. La secuencia del género LCDR2 se generó como se describe en la Figura 10.

La Figura 18 muestra las secuencias LCDR3 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados y la secuencia del género LCDR3. La secuencia del género LCDR3 se generó como se describe en la Figura 10.

La Figura 19A muestra que la expresión de superficie de TIGIT (gMFI) está elevada en LIT en tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-TIM-3 (grupo TIM-3) en comparación con grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0181 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-TIM-3. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 19B muestra que la frecuencia relativa de células TIGIT+ CD8 de LIT CD8+ totales es elevada en tumores de carcinoma de colon MC38 en animales tratados con anticuerpos anti-TIM-3 (grupo TIM-3) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0475 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-TIM-3. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 20A muestra que la expresión superficial de TIGIT (gMFI) está elevada en LIT en tumores de carcinoma de colon CT26 en animales tratados con anticuerpos anti-TIM-3 (grupo TIM-3) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p<0,001 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-TIM-3. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 20B muestra que la frecuencia relativa de células TIGIT+ CD8 de LIT CD8+ totales es elevada en tumores de carcinoma de colon CT26 en animales tratados con anticuerpos anti-TIM-3 (grupo TIM-3) en comparación con el grupo tratado con vehículo (PBS). p=0,0105 vehículo frente a grupos tratados con anticuerpo anti-TIM-3. Cada punto representa un ratón. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La Figura 21 muestra la regulación al alza de la expresión de TIM-3 en células T periféricas en pacientes con melanoma PBMC de pacientes con melanoma sin tratamiento previo estimulados con grupos de péptidos de antígeno de melanoma (NY-ESO, gp100, MART-1) en presencia o ausencia de anti-PD-1 o anticuerpos bloqueantes de la función anti-TIM-3. La expresión de TIM-3 se determinó mediante citometría de flujo en células reestimuladas el día 6.

La Figura 22A muestra que el tratamiento con TM3B403 aumenta la frecuencia de células NK activadas en PBMC humanas estimuladas con IL-2. IgG2s: control de isotipo. La activación de células NK se evaluó como porcentaje (%) de células que expresan CD69 en las PBMC estimuladas.

La Figura 22B muestra que el tratamiento con TM3B403 aumenta la frecuencia de células NK activadas en PBMC humanas estimuladas con IL-2. IgG2s: control de isotipo. La activación de células NK se evaluó como porcentaje (%) de células que expresan CD25 en las PBMC estimuladas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0023] Debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir forma de realización particulares únicamente y no pretende ser limitativa. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece la invención.

[0024] Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede usarse en la práctica para probar la presente invención, aquí se describen materiales y métodos ejemplares. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.

[0025] Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "ella" incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células y similares.

[0026] "Unión específica" o "se une específicamente" o "se une" se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno o un epítopo dentro del antígeno con mayor afinidad que por otros antígenos. Normalmente, el anticuerpo se une al antígeno o al epítopo dentro del antígeno con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de alrededor de 1 X 10 8 M o menos, por ejemplo alrededor de 1 X 10'9 M o menos, alrededor de 1 X 10'10 M o menos, alrededor de 1 X 10'11 M o menos, o alrededor de 1 X 10'12 M o menos, normalmente con una K^dque es al menos cien veces menor que su K^dpara unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína). La constante de disociación se puede medir usando procedimientos estándar. Sin embargo, los anticuerpos que se unen específicamente al antígeno o al epítopo dentro del antígeno pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, con el mismo antígeno de otras especies (homólogos), como humanos o monos, por ejemplo Macaca fascicularis (cynomolgus, cyno), Pan troglodytes (chimpancé, chimp) o Callithrix jacchus (tití común, tití). Mientras que un anticuerpo monoespecífico se une específicamente a un antígeno o un epítopo, un anticuerpo biespecífico se une específicamente a dos antígenos distintos o dos epítopos distintos.

[0027] "Anticuerpos" se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina que incluyen anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales murinos, humanos, humanizados y quiméricos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, anticuerpos diméricos, tetrámeros o multiméricos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de unión a antígeno de la especificidad requerida. Los "anticuerpos de longitud completa" están compuestos por dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como sus multímeros (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (compuesta por los dominios CH1, bisagra CH2 y CH3). Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro segmentos FR, dispuestos desde el término amino hasta el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

[0028] Las "regiones determinantes de complementariedad (CDR)" son "sitios de unión a antígeno" en un anticuerpo. Las CDR se pueden definir utilizando varios términos: (i) Regiones determinantes de complementariedad (CDR), tres en VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en VL (LCd R1, LCDR2, LCDR3) se basan en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat, (1970) J Exp Med 132:211 - 50, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en VH (HI, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3) se refieren a las regiones de los dominios variables de un anticuerpo que tienen una estructura hipervariable según lo definido por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk, (1987) Mol Biol 196:901 -17). La base de datos de International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y una definición estandarizadas de los sitios de unión a antígenos. La correspondencia entre las delimitaciones de CDR, HV e IMGT se describe en Lefranc et al., (2003) Dev Comparat Immunol 27:55-77. El término "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" y "Lc Dr 3" como se usa en este documento incluye las CDR definidas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, Kabat, Chothia o IMGT, a menos que lo contrario se indica explícitamente en la especificación.

[0029] Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, a saber, kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0030] "Fragmentos de anticuerpo" o "porción de unión a antígeno" se refiere a una porción de una molécula de inmunoglobulina que retiene las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo original de longitud completa. Ejemplos de porciones de unión a antígeno son regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1,2 y 3, regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1,2 y 3, una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), fragmentos Fab, F(ab')2, Fd y Fv, así como anticuerpos de dominio (dAb) que consisten en un dominio VH o VL. Los dominios VH y VL se pueden unir entre sí a través de un conector sintético para formar varios tipos de diseños de anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios VH/VL se pueden emparejar de forma intramolecular o intermolecular en aquellos casos en los que los dominios VH y VL se expresan mediante construcciones de anticuerpos de cadena sencilla separadas., para formar un sitio de unión a antígeno monovalente, tal como Fv de cadena sencilla (scFv) o diacuerpo; descrito por ejemplo en Publicación de Patente Int. Nos WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 y WO1992/01047.

[0031] "Anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos con una composición de un solo aminoácido en cada cadena pesada y cada cadena ligera, excepto posibles alteraciones bien conocidas tales como la eliminación de la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales normalmente se unen a un epítopo antigénico, excepto que los anticuerpos monoclonales multiespecíficos se unen a dos o más antígenos o epítopos distintos. Los anticuerpos monoclonales biespecíficos se unen a dos epítopos antigénicos distintos. Los anticuerpos monoclonales pueden tener una glicosilación heterogénea dentro de la población de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos, o monovalentes, bivalentes o multivalentes. Un anticuerpo multiespecífico, como un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, se incluye en el término anticuerpo monoclonal.

[0032] "Anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-1 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PD-1). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIM-3 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de TIM-3. En el caso de anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3, el anticuerpo biespecífico se une específicamente tanto a PD-1 como a TIM-3, y está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PD-1 y TIM-3. "Anticuerpo aislado" abarca anticuerpos que se aíslan con una pureza superior, como anticuerpos que son 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % puro.

[0033] "Anticuerpos humanizados" se refiere a anticuerpos en los que al menos una CDR se deriva de especies no humanas y los marcos de la región variable se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir mutaciones introducidas intencionadamente en las regiones marco, de modo que el marco puede no ser una copia exacta de la inmunoglobulina humana expresada o de las secuencias genéticas de la línea germinal.

[0034] "Anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables de cadena pesada y ligera en las que tanto el marco como las 6 CDR se derivan de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante o una parte de la región constante, la región constante también deriva de secuencias de origen humano.

[0035] El anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena ligera o pesada que se "derivan de" secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados. Dichos sistemas ejemplares son bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana presentadas en fagos y animales transgénicos no humanos tales como ratones o ratas que portan loci de inmunoglobulina humana como se describe en el presente documento. El "anticuerpo humano" puede contener diferencias de aminoácidos cuando se compara con la inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas que ocurren naturalmente o a la introducción intencional de sustituciones en el marco o sitio de unión al antígeno, o ambos. Por lo general, el "anticuerpo humano" es al menos alrededor del 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados. En algunos casos, el "anticuerpo humano" puede contener secuencias marco consenso derivadas de análisis de secuencia marco humana, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86, o HCDR3 sintético incorporado en las bibliotecas de gen de la inmunoglobulina humana mostradas en fagos, por ejemplo como se describe en Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96, y en Publicación de Patente Int. N° WO2009/085462.

[0036] Los anticuerpos humanos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana pueden generarse utilizando sistemas como la presentación en fagos que incorporan CDR sintéticas y/o estructuras sintéticas, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades de los anticuerpos, lo que da como resultado anticuerpos que no son expresados por el repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

[0037] "Recombinante" se refiere a anticuerpos y otras proteínas que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes.

[0038] "Epítopo" se refiere a una parte de un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas (tales como polares, no polares o hidrofóbicas) de restos tales como cadenas laterales de aminoácidos o polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto de aminoácidos contiguos y/o no contiguos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo no contiguo, los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se acercan mucho en un espacio tridimensional a través del plegamiento de la molécula de proteína. El "epítopo" del anticuerpo depende de la metodología utilizada para identificar el epítopo.

[0039] "Multiespecífico" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a al menos dos antígenos distintos o dos epítopos distintos dentro de los antígenos, por ejemplo, tres, cuatro o cinco antígenos o epítopos distintos.

[0040] "Biespecífico" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a dos antígenos distintos o dos epítopos distintos dentro del mismo antígeno. El anticuerpo biespecífico puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, con el mismo antígeno de otras especies (homólogos), como humanos o monos, por ejemplo, Macaca fascicularis (cynomolgus, cyno), Pan troglodytes (chimpancé, chimp) o Callithrix jacchus (títí común, tití), o puede unirse a un epítopo que se comparte entre dos o más antígenos distintos.

[0041] "Variante" se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia en una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones.

[0042] "Vector" se refiere a un polinucleótido capaz de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector normalmente contienen elementos, tales como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de éstas.

[0043] "Vector de expresión" se refiere a un vector que se puede utilizar en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

[0044] "Polinucleótido" se refiere a una molécula sintética que comprende una cadena de nucleótidos unidos covalentemente por un esqueleto de azúcarfosfato u otra química covalente equivalente. El ADNc es un ejemplo típico de un polinucleótido.

[0045] "Polipéptido" o "proteína" se refiere a una molécula que comprende al menos dos residuos de aminoácidos unidos por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden denominarse "péptidos".

[0046] PD-1 se refiere a la proteína 1 de muerte celular programada humana, PD-1. PD-1 también se conoce como CD279 o PDCD1. La secuencia de aminoácidos del PD-1 humano maduro (sin secuencia señal) se muestra en SEQ ID NO: 1. El dominio extracelular abarca los residuos 1-150, el dominio transmembrana abarca los residuos 151-171 y el dominio citoplasmático abarca los residuos 172-268 de SEQ ID NO: 1. A lo largo de la especificación, "el dominio extracelular de PD-1 humano" huPD1-ECD " se refiere a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 1-149 de SEQ ID NO: 1, y se muestra en SEQ ID NO: 2. "PD-1" en la especificación se refiere a PD-1 humano maduro, a menos que se indique explícitamente el contrario.

[0047] TIM-3 se refiere al receptor celular 2 del virus de la hepatitis A humana, también llamado HAVCR2. La secuencia de aminoácidos del TIM-3 humano maduro (sin secuencia señal) se muestra en SEQ ID NO: 138. El dominio extracelular abarca los residuos 1-181, el dominio transmembrana abarca los residuos 182-202 y el dominio citoplasmático abarca los residuos 203-280 de SEQ ID NO: 138. A lo largo de la especificación, "el dominio extracelular de TIM-3 humano "huTIM-3-ECD" se refiere a proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 1-179 de SEQ ID NO: 138, y se muestra en SEQ ID NO: 89. T iM-3 en la especificación se refiere a TIM-3 humano maduro, a menos que se indique explícitamente lo contrario.

[0048] "En combinación con" significa que dos o más agentes terapéuticos se administran a un sujeto juntos en una mezcla, al mismo tiempo como agentes únicos o secuencialmente como agentes únicos en cualquier orden.

[0049] "Sobreexpresar", "sobreexpresado" y "sobreexpresan" se usan indistintamente y se refieren a una muestra como una célula cancerosa, una célula maligna o un tejido canceroso que tiene niveles medibles más altos de PD-1, TIM-3, PD-L1, PD-L2 o ligando TIM-3 en comparación con una muestra de referencia. La sobreexpresión puede estar causada por la amplificación de genes o por un aumento de la transcripción o traducción. La expresión y sobreexpresión de la proteína en la muestra puede medirse usando ensayos bien conocidos usando, por ejemplo, ELISA, inmunofluorescencia, citometría de flujo o radioinmunoensayo en células vivas o lisadas. La expresión y la sobreexpresión de un polinucleótido en la muestra pueden medirse, por ejemplo, utilizando técnicas de hibridación in situ fluorescente, transferencia Southern o PCR. Una proteína o un polinucleótido se sobreexpresa cuando el nivel de la proteína o el polinucleótido en la muestra es al menos 1,5 veces mayor o estadísticamente significativo en comparación con la muestra de referencia. Se conoce la selección de la muestra de referencia.

[0050] "Muestra" se refiere a una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Ejemplos de muestras son fluidos biológicos tales como sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, saliva, fluido quístico, lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosas de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos de ascitis tales como los asociados con tumores no sólidos, fluidos de las cavidades pleural, pericárdica, peritoneal, abdominal y otras cavidades corporales, fluidos recogidos por lavado bronquial, soluciones líquidas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos incluyendo células u órganos acondicionados medio, fluidos de lavado y similares, biopsias de tejido, aspiraciones con aguja fina o tejido tumoral extirpado quirúrgicamente.

[0051] Una "célula cancerosa" o una "célula tumoral" se refiere a una célula cancerosa, precancerosa o transformada, ya sea in vivo, ex vivo o en cultivo tisular, que tiene cambios fenotípicos espontáneos o inducidos. Estos cambios no implican necesariamente la incorporación de nuevo material genético. Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus transformante y la incorporación de un nuevo ácido nucleico genómico, la captación de ácido nucleico exógeno o también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno, mutando así un gen endógeno. La transformación/cáncer se ejemplifica mediante cambios morfológicos, inmortalización de células, control de crecimiento aberrante, formación de focos, proliferación, malignidad, modulación de niveles de marcadores específicos de tumores, invasividad, crecimiento tumoral en huéspedes animales adecuados tales como ratones desnudos y similares, in vitro, in vivo y ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3a ed. 1994)).

[0052] "Aproximadamente" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. A menos que se indique explícitamente lo contrario en los Ejemplos o en otra parte de la Especificación en el contexto de un ensayo, resultado o forma de realización en particular, "aproximadamente" significa dentro de una desviación estándar según la práctica en la técnica, o un rango de hasta el 5%, lo que sea más grande.

[0053] "Anticuerpo biespecífico PD-1/TIM-3", "anticuerpo PD-1/TIM-3", "anticuerpo biespecífico anti-PD-1/TIM-3" o "anticuerpo anti-PD-1/anticuerpo TIM-3" se refiere a una molécula que comprende al menos un dominio de unión que se une específicamente a PD-1 y al menos un dominio de unión que se une específicamente a TIM-3. Los dominios que se unen específicamente a PD-1 y TIM-3 suelen ser pares VH/VL. El anticuerpo anti-PD-1/TIM-3 biespecífico puede ser monovalente en cuanto a su unión a PD-1 o TIM-3.

[0054] "Valiente" se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión específicos para un antígeno en una molécula. Como tal, los términos "monovalente", "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" se refieren a la presencia de uno, dos, cuatro y seis sitios de unión, respectivamente, específicos para un antígeno en una molécula.

[0055] "Un linfocito T CD4+ o CD8+ específico de antígeno" se refiere a un linfocito T CD4+ o CD8+ activado por un antígeno específico, o un epítopo inmunoestimulador del mismo.

[0056] "CD137" (también llamado miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, TNFRSF9, 4-1BBL) se refiere a una molécula de CD137 humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 281.

SEQ ID NO: 281

MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPC'SNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSA

GGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQ

ELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPAD

LSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ1ISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYI

FKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0057] "TIGIT" (también llamado inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM) se refiere a una molécula TIGIT humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 301. SEQ ID NO: 301

MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHI

SPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEH

GARFQIPLLGAMAATLWICTAVIVVVALTRKKKALR1HSVEGDLRRKSAGQEEW

SPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG

[0058] "Agonist" se refiere a una molécula que, cuando se une a una proteína celular, induce al menos una reacción o actividad que es inducida por un ligando natural de la proteína. La molécula es un agonista cuando al menos una reacción o actividad es inducida por al menos un 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % mayor que al menos una reacción o actividad inducida en ausencia del agonista (p. ej., control negativo), o cuando la inducción es estadísticamente significativa en comparación con la inducción en ausencia del agonista. El agonista puede ser un anticuerpo, un ligando soluble o una molécula pequeña. Un agonista ejemplar es un anticuerpo agonista que se une específicamente a una molécula activadora de células T.

[0059] "Antagonista" se refiere a una molécula que, cuando se une a una proteína celular, suprime al menos una reacción o actividad que es inducida por un ligando natural de la proteína. Una molécula es un antagonista cuando al menos una reacción o actividad se suprime en al menos un 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más que al menos una reacción o actividad suprimida en ausencia del antagonista (p. ej., control negativo), o cuando la supresión es estadísticamente significativa en comparación con la supresión en ausencia del antagonista. El antagonista puede ser un anticuerpo, un ligando soluble, una molécula pequeña, un ADN o ARN tal como siARN. Ejemplos de antagonistas son un anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1, un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3, un anticuerpo biespecífico antagonista de PD-1/TIM-3 o un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una molécula inhibidora de células T. Una reacción o actividad típica inducida por la unión de PD-1 a su receptor PD-L1 o PD-L2 puede ser una reducción de la proliferación de células CD4+ o CD8+ específicas de antígeno o una reducción de la producción de interferón-y (IFN-Y) por parte de las células T, dando como resultado la supresión de las respuestas inmunitarias contra, por ejemplo, un tumor. Una reacción o actividad típica inducida por la unión de TIM-3 a su receptor, como la galectina-9, puede ser una reducción de la proliferación de células CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, una reducción de la producción de IFN-y por parte de las células T o una reducción de la expresión superficial de CD137. en las células c D4+ o CD8+, lo que da como resultado la supresión de las respuestas inmunitarias contra, por ejemplo, un tumor. De manera similar, una reacción o actividad típica que es inducida por una molécula inhibidora de células T es la inmunosupresión. Por lo tanto, un anticuerpo antagonista de PD-1 que se une específicamente a PD-1, un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3, un anticuerpo antagonista biespecífico de PD-1/TIM-3 o un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una molécula inhibidora de células T induce respuestas inmunitarias al inhibir las vías inhibidoras.

[0060] "Sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. "Animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" " se utilizan indistintamente.

[0061] La numeración de los residuos de aminoácidos en la región constante del anticuerpo a lo largo de la especificación está de acuerdo con el índice UE como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991), a menos que se indique explícitamente lo contrario.

[0062] Los códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras se usan aquí como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

Anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1

[0063] PD-1, al unirse al ligando, suprime las funciones de las células T a través de múltiples mecanismos (Pauken & Wherry (2015) Trends in Immunology 36(4): 265-276). El compromiso de PD-1 inhibe directamente la señalización del receptor de células T (TCR) a través de la colocalización con el TCR y la posterior inducción de la desfosforilación de las moléculas de señalización proximales de TCR, la inhibición de la vía Ras/MEK/ERK que conduce a la inhibición de la progresión del ciclo celular y de las células T. proliferación, inhibición del crecimiento y supervivencia celular y reprogramación del metabolismo de las células T a través de la supresión de la vía PI3K/AKT, lo que conduce a la regulación positiva del factor de transcripción BATF y la modulación del desarrollo, mantenimiento y función de las células T reguladoras. También se ha propuesto que PD-1 aumenta la motilidad de las células T y limita la duración de la interacción entre las células T y las células objetivo, reduciendo así el grado de activación de las células T (Honda et al., (2014) Immunity 40(2):235- 47).

[0064] Los tumores han cooptado la vía PD-1 para regular a la baja la función de las células T en el microentorno tumoral (TME) y para evadir la destrucción inmunitaria. En el TME, en condiciones de antígeno persistente e inflamación, las células T se agotan o son disfuncionales y pierden progresivamente su función efectora y su capacidad proliferativa. Las células T agotadas expresan altos niveles de PD-1, a menudo junto con otros receptores inhibitorios como TIM-3 o LAG-3 (Pauken & Wherry (2015) Trends in Immunology 36(4): 265-276). Uno de los ligandos de PD-1, PD-L1, también está regulado al alza en varios tumores. La expresión de PD-L1 se produce en las propias células cancerosas y/o en células inmunitarias infiltrantes, incluidos macrófagos, células dendríticas, fibroblastos y células T activadas asociadas a tumores (Chen et al., 2012 Clin Cancer Res 18(24):6580-7). En este entorno, se supone que el compromiso de PD-1 limita las respuestas de células T antitumorales y conduce a la evasión inmune. Estudios recientes han demostrado que se produce una mayor frecuencia y nivel de expresión de PD-1 en los linfocitos infiltrantes de tumores (LIT) en múltiples tumores sólidos. Es importante destacar que estos PD-1 LIT están funcionalmente deteriorados, como lo demuestra una menor proliferación y funciones efectoras (Pauken & Wherry; 2015, Trends in Immunology 36(4): 265-276) Estos datos apoyan la hipótesis que PD-1 media en la supresión inmune en el TME.

[0065] El agotamiento de las células T en los tumores es reversible, al menos parcialmente, mediante el bloqueo de la vía PD-1. Se ha demostrado que los anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 mejoran la función de las células T y conducen a una mejor inmunidad antitumoral en varios modelos de tumores preclínicos. Los anticuerpos PD-1/PD-L1 también han mostrado respuestas clínicas alentadoras en múltiples tumores sólidos, con una tasa de respuesta general (ORR) del 20 % al 40 % en melanoma, del 10 al 24 % en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), 12- 31 % en carcinoma de células renales (CCR), 24-52 % en cáncer de vejiga y 20 % en cáncer de cabeza y cuello (Swaika et al., (2015) Mol Immunol 67(2 Pt A):4-17).

[0066] La invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56.

[0067] SEQ ID NO: 82, 83, 84, 85, 86, 87 y 88 representan las secuencias de género HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de variantes maduradas por afinidad de anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 que tienen secuencias HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 similares, y dos grupos de secuencias HCDR3 similares. Los anticuerpos dentro del género se unen a PD-1 con una K^dde menos de aproximadamente 1 X 10^-7M, como menos de aproximadamente 1 X 10^-8M, por ejemplo, menos de aproximadamente 1 X 10^-9M, o por ejemplo menos de aproximadamente 1 X 10^-10M. Anticuerpos que tienen las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, como se describe en este documento.

SEQ ID NO: 82

X¹YX²IX³,

donde

X ^Ies S o D;

X²es V o A; y

X³es H o S.

SEQ ID NO: 83

GIIPIX⁴X⁵TANY AQKFQG,

donde

X⁴es Y o F; y

X⁵es G o D.

SEQ ID NO: 84

PGLAAAYDTGX⁶LDY,

donde

X⁶es N o S.

SEQ ID NO: 85

GX⁷X⁸X⁹X¹⁰TGX¹¹LDY,

donde

X⁷es T o Y;

X⁸es L o V;

X⁹es D o R;

X¹⁰es R o A; y

X ^{I I}es H o M.

SEQ ID NO: 86

RASQSVX¹²X¹³YLA,

donde

X¹²es S, R o D; y

X¹³es S o N.

SEQ ID NO: 87

DASX¹⁴RAT,

donde

X¹⁴es N, D, Y, S o T.

SEQ ID NO: 88

QQRX¹⁵X¹⁶WPL T,

donde

X¹⁵es S, N, G, E, D, W o A; y

X¹⁶es N, Y, E o A.

[0068] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo tiene una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes propiedades:

a) mejora la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno de una manera dependiente de la dosis, en el que la activación se mide usando un ensayo de recuerdo de antígeno de citomegalovirus (ensayo CMV) como se describe en el Ejemplo 1;

b) se une a PD-1 humana con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, en donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C;

c) se une a PD-1 humano con una K^dinferior a aproximadamente 1 nM, en el que la K^dse mide utilizando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C;

d) se une a cynomolgus PD-1 con una K^dinferior a aproximadamente 100 nM, donde la K^dse mide utilizando el sistema ProteOn XPR36 a 25 °C, o

e) se une a cynomolgus PD-1 con una K^dinferior a aproximadamente 1 nM, donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0069] Ejemplos de tales anticuerpos son los anticuerpos PD-1 PD1B196 y PD1B244 como se describe en este documento.

[0070] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno de una manera dependiente de la dosis, en donde la activación se mide usando un citomegalovirus ensayo de recuerdo de antígeno (ensayo CMV) como se describe en el Ejemplo 1, y se une a PD-1 humano con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, en el que K^dse mide utilizando el sistema ProteOn XPR36 a 25 °C.

[0071] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo mejora la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno de manera dependiente de la dosis, en donde la activación se mide usando un antígeno de citomegalovirus ensayo de recuperación (ensayo CMV) como se describe en el Ejemplo 1, y se une a PD-1 humana con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 10 nM, en el que la K^dse mide utilizando el sistema ProteOn XPR36 a 25 °C.

[0072] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo mejora la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno de manera dependiente de la dosis, en donde la activación se mide usando un antígeno de citomegalovirus ensayo de recuperación (ensayo CMV) como se describe en el Ejemplo 1, y se une a cynomolgus PD-1 con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, en el que la K^dse mide utilizando el sistema ProteOn XPR36 a 25 °C.

[0073] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo mejora la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno de manera dependiente de la dosis, en donde la activación se mide usando un antígeno de citomegalovirus ensayo de recuperación (ensayo CMV) como se describe en el Ejemplo 1, y se une a cynomolgus PD-1 con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 10 nM, en el que la K^dse mide utilizando el sistema ProteOn XPR36 a 25 °C.

[0074] La activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno puede evaluarse midiendo el aumento de la proliferación de células T en un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR), el aumento de la secreción de interferón-y (IFN-y) en el ensayo MLR, el aumento de TNF - secreción de a en el ensayo MLR, aumento de la secreción de IFN-y en un ensayo de antígeno de citomegalovirus (ensayo CMV) o aumento de la secreción de TNF- a en el ensayo CMV utilizando protocolos conocidos y los descritos en el Ejemplo 1. Los anticuerpos de la invención potencian la activación de CD4+ o CD8+ T específicos de antígeno cuando la funcionalidad de las células T medida aumenta mediante los anticuerpos de la invención de una manera dependiente de la dosis.

[0075] La afinidad de un anticuerpo por PD-1 humano o de Cynomolgus puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. Dichos métodos pueden utilizar instrumentación ProteOn XPR36, Biacore 3000 o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica. La afinidad medida de una interacción particular anticuerpo/PD-1 puede variar si se mide en diferentes condiciones (p. ej., osmolaridad, pH). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión (por ejemplo, K^d, Kon, Koff) se realizan normalmente con condiciones estandarizadas y un tampón estandarizado, como el tampón descrito en este documento. Los expertos en la técnica apreciarán que el error interno para las mediciones de afinidad, por ejemplo, usando Biacore 3000 o ProteOn (medido como desviación estándar, DE) puede estar típicamente dentro del 5-33 % para mediciones dentro de los límites típicos de detección. Por lo tanto, el término "aproximadamente" en el contexto de K^drefleja la desviación estándar típica en el ensayo. Por ejemplo, la DE típica para una K^dde 1 X 10' 9 M es de hasta ± 0,33 X 10' 9 M.

[0076] El anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 o la porción del mismo que se une a antígeno de la invención comprende el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 contenidos dentro de una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48, donde el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 están definidos por Chothia, Kabat o IMGT.

[0077] El anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo de la invención comprende el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 contenidos dentro de una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56, donde el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR están definidos por Chothia, Kabat o IMGT.

[0078] El anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 o la porción de unión a antígeno del mismo de la invención comprende el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 de SEQ ID NO: 10, 14 y 17, respectivamente.

[0079] El anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 o la porción del mismo que se une a antígeno de la invención comprende el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 de SEQ ID n O: 23, 26 y 32, respectivamente.

[0080] El anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 o una parte del mismo que se une a antígeno de la invención comprende el HCDR1, el HCDR2, el HCDR3, el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 de SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 y 32, respectivamente.

[0081] En algunas formas de realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une a PD-1 humano con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, opcionalmente menos de aproximadamente 10 nM, por ejemplo, menos de aproximadamente 1 nM tal como menos de aproximadamente 500 pM, en donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0082] En algunas formas de realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une a PD-1 cynomolgous con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, opcionalmente menos de aproximadamente 10 nM, por ejemplo, menos de aproximadamente 1 nM tal como menos de aproximadamente 500 pM, en donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0083] El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56.

[0084] En algunas formas de realización, la VH y la VL están codificados por secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 196 y 197, respectivamente.

[0085] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4, que comprende opcionalmente una sustitución S228P en comparación con el IgG4 de tipo salvaje.

[0086] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4/K, que comprende opcionalmente la sustitución S228P cuando se compara con la IgG4 de tipo salvaje.

[0087] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 y es un isotipo IgG4, que comprende opcionalmente la sustitución S228P cuando se compara con la IgG4 de tipo salvaje.

[0088] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 y es un isotipo IgG4/K que comprende la sustitución S228P cuando se compara con la IgG4 de tipo salvaje.

[0089] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada (HC) de SEQ ID NO: 72 y una cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 73.

[0090] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2, que comprende opcionalmente las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, a 330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.

[0091] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2/K, que comprende opcionalmente las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.

[0092] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 y es un isotipo IgG2/K, que comprende opcionalmente V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S sustituciones en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.

[0093] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 y es un isotipo IgG2/K que comprende las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S cuando en comparación con el tipo salvaje IgG2.

[0094] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG1.

[0095] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG3.

[0096] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico PD-1/TIM-3.

[0097] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer.

[0098] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un tumor sólido.

[0099] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un melanoma.

[0100] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de pulmón.

[0101] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

[0102] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un NSCLC escamoso.

[0103] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un NSCLC no escamoso.

[0104] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un adenocarcinoma de pulmón.

[0105] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un carcinoma de células renales (CCR).

[0106] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un mesotelioma.

[0107] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un carcinoma nasofaríngeo (CNF).

[0108] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer colorrectal.

[0109] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de próstata.

[0110] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de próstata resistente a la castración.

[0111] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de estómago.

[0112] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de ovario.

[0113] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer gástrico.

[0114] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de hígado.

[0115] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de páncreas.

[0116] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de tiroides.

[0117] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello.

[0118] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de carcinomas del esófago o del tracto gastrointestinal.

[0119] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de mama.

[0120] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer de trompa de Falopio.

[0121] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de cerebro.

[0122] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de uretra.

[0123] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de una endometriosis.

[0124] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de cuello uterino.

[0125] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de una lesión metastásica del cáncer.

[0126] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de una neoplasia maligna hematológica.

[0127] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un linfoma no Hodgkin.

[0128] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de una leucemia linfocítica crónica.

[0129] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer, en combinación con un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3.

[0130] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer, en combinación con un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3 que comprende la VH de SEQ ID NO: 146 y la VL de SEQ ID NO: 156.

[0131] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer, en combinación con un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3 que comprende la VH de SEQ ID NO: 145 y la VL de SEQ ID NO: 155.

[0132] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer, en combinación con un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3 que comprende la VH de SEQ ID NO: 172 y la VL de SEQ ID NO: 173.

[0133] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer, como un tumor sólido, en combinación con un inhibidor de FGFR.

[0134] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de cáncer, tal como un tumor sólido, en combinación con una vacuna.

[0135] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de cáncer, tal como un tumor sólido, en combinación con un anticuerpo agonista que se une específicamente a GITR (SEQ ID NO: 271).

[0136] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de cáncer, tal como un tumor sólido, en combinación con un anticuerpo agonista que se une específicamente a CD 137 (SEQ ID NO: 281).

[0137] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de cáncer, tal como un tumor sólido, en combinación con un anticuerpo agonista que se une específicamente a OX-40 (SEQ ID NO: 279).

[0138] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico PD-1/TIM-3.

[0139] Las secuencias VH, VL, HCDR y LCDR de anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 se muestran en la Tabla 2.

[0140] Aunque los anticuerpos ilustrados en los ejemplos comprenden pares de regiones variables, una de una cadena pesada y uno de una cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que las alternativas pueden comprender regiones variables únicas de cadena pesada o ligera. La región variable única puede usarse para rastrear dominios variables capaces de formar un fragmento de unión a antígeno específico de dos dominios capaz de, por ejemplo, unirse a PD-1 humano. La selección se puede lograr mediante métodos de selección de presentación de fagos usando, por ejemplo, un enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en Publicación de Patente Int. N° WO1992/01047. En este enfoque, se usa una colonia individual que contiene un clon de cadena VH o VL para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (VL o VH), y el dominio de unión a antígeno específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con las técnicas de visualización de fagos utilizando métodos conocidos y los descritos en este documento. Por lo tanto, las cadenas polipeptídicas VH y VL individuales son útiles para identificar anticuerpos adicionales que se unen específicamente a PD-1 humana usando los métodos descritos en Publicación de Patente Int. N° WO1992/01047.

[0141] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 es un anticuerpo multiespecífico.

[0142] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 es un anticuerpo biespecífico.

[0143] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a PD-1 se une a PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), LAG-3 (SEQ ID NO: 293), TIM-3 (SEQ ID NO: 138), CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), CEACAM- 5 (SEQ ID NO: 307), OX-40 (SEQ ID NO: 279), GITR (SEQ ID NO: 271)), CD27 (SEQ ID NO: 280), VISTA (SEQ ID NO: 286), CD137 (SEQ ID NO: 281), TIGIT (SEQ ID NO: 301) o CTLA-4 (SEQ ID NO: 292). Los anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos pueden generarse usando métodos descritos en este documento.

Tabla 2.

Anticuerpos con modificaciones conservativas

[0144] "Modificación conservativa" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene las secuencias de aminoácidos. Las modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Las sustituciones conservativas son aquellas en las que el aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares están bien definidas e incluyen aminoácidos con cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina, triptófano), cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, fenilalanina, triptófano, histidina, tirosina), cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), amida (por ejemplo, asparagina, glutamina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales que contienen azufre (cisteína, metionina). Además, cualquier resto nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina, como se ha descrito previamente para la mutagénesis de barrido de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys.

35:1-24, 1998). Las sustituciones de aminoácidos en los anticuerpos de la invención se pueden realizar mediante métodos bien conocidos, por ejemplo mediante mutagénesis por PCR (patente de EE. UU. N° 4.683.195). Alternativamente, las bibliotecas de variantes pueden generarse usando métodos conocidos, por ejemplo usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). Las variantes de anticuerpos resultantes pueden analizarse en cuanto a sus características utilizando los ensayos descritos en el presente documento.

Anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a TIM-3

[0145] El dominio de inmunoglobulina de células T y el dominio de mucina 3 (TIM-3, también conocido como receptor 2 celular del virus de la hepatitis A (HAVCR2)) es un receptor de punto de control inmunitario co-inhibidor que se ha propuesto para regulan negativamente tanto la respuesta inmunitaria adaptativa como la innata. TIM-3 se expresa en subconjuntos específicos de células T CD4+ y CD8+ y funciona para limitar la duración y la magnitud de las respuestas de las células T.

[0146] Múltiples líneas de evidencia respaldan el papel inhibidor de TIM-3 en la regulación de las respuestas de las células T. Los ratones deficientes en Tim-3 exhiben defectos en la inducción de la tolerancia específica al antígeno y al trasplante, lo que es consistente con la inhibición de las células T efectoras de TIM-3 durante las respuestas inmunitarias normales (Sabatos et al., (2003) Nat Immunol 4(11):1102 -1110, Sánchez-Fueyo et al., (2003) Nat Immunol 4(11):1093-1101). Los anticuerpos anti-TIM-3 exacerban la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en modelos animales (Monney et al., (2002) Nature 415(6871):536-541). Se ha demostrado que TIM-3 es un impulsor fundamental del estado disfuncional o agotado de las células T que se produce en la infección crónica y el cáncer (Sakuishi, K. y AC Anderson (2014). Tim-3 Regulation of Cancer Immunity. Tumor-Induced Immune Suppression D. I. Gabrilovich y A. A. Hurwitz, Springer New York: 239-261).

[0147] Se ha demostrado que el bloqueo de TIM-3 restaura la actividad en las células efectoras, como la secreción y proliferación de citoquinas. En poblaciones de células agotadas viralmente, por ejemplo, células infectadas con VHC, las células que expresan TIM-3 (células TIM-3+) expresan menos citocinas TNF-a e IFN-y que las células negativas para TIM-3 en ambas poblaciones de células efectoras, CD4+ y células T CD8+ (Golden-Mason et al., (2009) J Virol 83:9122). El bloqueo de TIM-3 restableció la proliferación en células T CD8+ de un paciente con VIH, o en células que recapitulan el agotamiento viral (Jones et al., (2008) J Exp Med 205:2763), o proliferación e IFN-y y/o Secreción de TNF-a en células T específicas de NY-ESO-1 de PBMC de pacientes metastásicos (Fourcade et al., (2010) J Exp Med 207:2175). Se ha descubierto que las células T TIM-3+ se concentran en los tumores y contribuyen al entorno tumoral inmunosupresor (Sakuishi et al., (2013) Oncoimmunology, 2:e23849).

[0148] El bloqueo de TIM-3 (parcialmente solo y de forma aditiva o sinérgica en combinación con el bloqueo de la vía PD-1) ha demostrado eficacia antitumoral en varios modelos de cáncer preclínicos, incluido el carcinoma de colon CT26 (Sakuishi et al., (2010) J Exp Med 207(10):2187-94), sarcoma WT3 y carcinoma de próstata TRAMP-C1 (Ngiow et al., (2011) Cancer Res 71(10):3540-3551).

[0149] Los mecanismos a través de los cuales TIM-3 inhibe las respuestas de células T no se comprenden completamente. La cola citoplásmica de TIM-3 contiene múltiples residuos de tirosina (Ferris et al., (2014) J Immunol 193(4): 1525-1530) pero carece de motivos de señalización inhibitorios como ITIM o ITSM que se encuentran en la cola PD-1 intracelular. Se ha demostrado que las tirosina quinasas Fyn y Lck de la familia Src se unen a TIM-3, aunque las consecuencias exactas de estas interacciones aún no se han confirmado in vivo. Se han propuesto dos modelos opuestos sobre cómo TIM-3 regula la señalización de células T. Por un lado, se ha postulado que TIM-3 regula negativamente la señalización de TCR mediante el reclutamiento de una fosfatasa en la sinapsis inmunológica y la desfosforilación de Lck (Clayton, et al., (2014) J Immunol 192(2):782-791). Por el contrario, también se ha propuesto que TIM-3 mejora la señalización de TCR y, paradójicamente, conduce a las células T hacia un estado más agotado, a través de una mayor activación de la actividad de NFAT y la señalización de NFkB.

[0150] Además de la expresión en células T efectoras, TIM-3 también se expresa en células T reguladoras (T-regs) y se ha demostrado que marca un subconjunto de T-reg supresor en tumores. Los análisis que utilizan células humanas primarias y modelos preclínicos de ratón han demostrado que TIM-3+ T-regs son más eficaces para inhibir las respuestas de células T de linfocitos T 1 (Th1) y linfocitos T 17 (Th17) que TIM-3' T-regs (Gautron et al., (2014) Eur J Immunol 44(9): 2703-2711, Sakuishi et al., (2013) Oncoimmunology, 2:e23849). Dado que TIM-3 se expresa en células Treg altamente supresoras, puede inhibir directamente las respuestas de células T CD4+ y CD8+. Además, TIM-3+ Tregs expresan altos niveles de IL-10, que se ha propuesto para impulsar el agotamiento de las células T efectoras en el TME como un mecanismo indirecto adicional para suprimir las respuestas inmunitarias antitumorales (Sakuishi et al., (2013)) Oncoimmunology, 2:e23849).

[0151] TIM-3 se expresa en varios tipos de células inmunitarias innatas, incluidos monocitos/macrófagos, células dendríticas y células NK. Los datos existentes son consistentes con un papel supresor de TIM-3 en estos diferentes tipos de células.

[0152] TIM-3 se expresa constitutivamente por monocitos CD14+ circulantes en donantes sanos, y su expresión en monocitos periféricos aumenta significativamente en pacientes con inflamación crónica y cáncer (Rong et al., (2014) Tissue Antigens 83(2):76-81). Los niveles de TIM-3 también aumentan en los macrófagos que se infiltran en los tumores de carcinoma hepatocelular (HCC), en comparación con los macrófagos de los tejidos adyacentes, y se propone que desempeñe un papel en la conducción de la polarización de los macrófagos a un fenotipo promotor de tumores M2.

[0153] Recientemente, se informó que TIM-3 se expresa en células dendríticas que se infiltran en tumores de ratón. En este contexto, se propuso la interacción de TIM-3 con HMBG1 para suprimir la inmunidad innata al interferir con el reconocimiento y la respuesta al ácido nucleico inmunoestimulador (Chiba et al., (2012) Immunol 13(9): 832-842). TIM-3 también se expresa constitutivamente en células NK en sangre periférica. Un estudio reciente mostró que las células NK de pacientes con melanoma avanzado expresan altos niveles de TIM-3 en las células NK periféricas. Es importante destacar que las células NK TIM-3+ se agotaron funcionalmente y el bloqueo anti-TIM-3 pudo revertir el agotamiento y mejorar la funcionalidad de las células NK (da Silva et al., (2014) Cancer Immunol Res 2(5): 410-422).

[0154] TIM-3 se une a los ligandos galectina-9 (Gal-9), fosfatidilserina (PtdSer), HMGB1 y CEACAM-1. La lectina tipo S galectina-9 puede inhibir la función efectora Th1 asociada a TIM-3 e inducir la apoptosis en las células T que expresan TIM-3 en modelos murinos. PtdSer generalmente reside en el lado intracelular de la membrana plasmática, pero se voltea hacia el lado extracelular durante la apoptosis. PtdSer se une a una hendidura conservada en los tres miembros de la familia TIM humanos (TIM-1, 3, 4). La inhibición de la unión de PtdSer a TIM-3 puede activar la respuesta de las células T. La galectina-9 es secretada por las células tumorales y puede contribuir a la evasión de la inmunidad antitumoral. La alarma de ADN HMGB1, para la cual TIM-3 puede actuar como un "sumidero", puede prevenir las interacciones HMGB 1/RAGE que estimulan la inmunidad innata. CEACAM-1 puede interactuar con TIM-3 tanto en cis como heterodímero en las células T como en trans como ligando. La interacción entre CEACAM-1 y TIM-3 puede ayudar a mediar el bloqueo de la señalización de la respuesta inmunitaria. El bloqueo conjunto de TIM-3 y CEACAM-1 en el carcinoma de colon CT26 mostró una eficacia similar a la observada para el bloqueo conjunto de PD-L1 y TIM-3.

[0155] La invención proporciona un anticuerpo biespecífico antagonista que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56, que se une específicamente a PD-1 y se une a TIM-3. Por lo tanto, el bloqueo de TIM-3 usando los anticuerpos biespecíficos de la invención descritos en este documento que inhiben la función de TIM-3 puede mejorar la respuesta inmunitaria contra la infección y la inmunidad antitumoral.

[0156] La inhibición de la unión de TIM-3 a galectina-9 por parte de los anticuerpos biespecíficos de la invención puede evaluarse mediante ELISA de competición. En un ensayo ejemplar, se une 1 pg/ml de Fc-TIM-3 humano recombinante en pocillos de placas de microtitulación, los pocillos se lavan y bloquean y se añaden 10 pg/ml del anticuerpo de prueba. Sin lavar, se añaden 7,5 pg/ml de galectina-9 a los pocillos y se incuban durante 30 minutos, después de lo cual se añaden 0,5 pg/ml de anticuerpo antigalectina-9-biotina y se incuban durante 30 minutos. Las placas se lavan y se añaden 0,5 pg/ml de anticuerpo policlonal conjugado de neutravidina-HRP y se incuban durante 30 minutos. Las placas se lavan y se añade sustrato de quimioluminiscencia POD inmediatamente antes de leer la señal de luminiscencia. Los anticuerpos biespecíficos de la invención inhiben la unión de TIM-3 a galectina-9 cuando la unión de galectina-9 se reduce en al menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % usando un ensayo descrito en el presente documento y en el Ejemplo 1. Ejemplos de anticuerpos, que no forman parte de la invención, que inhiben la unión de TIM-3 a galectina-9 son los anticuerpos TM3B103, TM3B105, TM3B107, TM3B108, TM3B109, TM3B113, TM3B189, TM3B190 y TM3B196.

[0157] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a TIM-3 potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno.

[0158] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a TIM-3 potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, en el que la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno se evalúa midiendo estadísticamente mejora significativa de la expresión superficial de CD 137 en células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno según los métodos descritos en el Ejemplo 14.

[0159] Uso de CD137 como marcador de células T CD8+ y CD4+ específicas de antígeno que se expanden en respuesta a CMV la estimulación antigénica permitió la detección de los efectos funcionales de los anticuerpos TIM-3 biespecíficos antagonistas de la invención.

[0160] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a TIM-3 se une a TIM-3 dentro de los residuos 32-47 de TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261).

[0161] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a TIM-3 se une a TIM-3 dentro de los residuos 32-47 de TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) y los residuos 50-56 (DERDVNY) (SEQ ID NO: 262). En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a TIM-3 se une a TIM-3 dentro de los residuos 90-102 de TIM-3 (RiQ iPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263).

[0163] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico antagonista que se une específicamente a TIM-3 se une a TIM-3 dentro de los residuos 90-102 de TIM-3 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263) y los residuos 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

[0164] "Dentro de" significa que el 80 % o más de los residuos del epítopo al que se une el anticuerpo biespecífico residen dentro de los tramos de aminoácidos citados, y que hasta el 20 % de los residuos del epítopo al que se une el anticuerpo biespecífico residen fuera del tramos de aminoácidos recitados.

[0165] El epítopo de Tim-3 al que se une el anticuerpo biespecífico puede resolverse, por ejemplo, usando intercambio de hidrógeno/deuterio (intercambio H/D) o analizando una estructura cristalina del anticuerpo en complejo con TIM-3. Los residuos del epítopo son aquellos que están protegidos por el anticuerpo con una diferencia de al menos un 5 % en los niveles de deuteración a través del intercambio H/D o aquellos residuos de aminoácidos expuestos en la superficie determinados para unirse al anticuerpo en una estructura cristalina de un complejo del anticuerpo biespecífico y TIM-3. En la estructura cristalina de un complejo del anticuerpo y TIM-3, los residuos del epítopo son aquellos residuos de TIM-3 que residen dentro de una distancia de 4 A o menos de cualquiera de los residuos de CDR del anticuerpo.

[0166] En un ensayo de intercambio H/D, la proteína TIM-3 se incuba en presencia o ausencia del anticuerpo en agua deuterada durante tiempos predeterminados, lo que da como resultado la incorporación de deuterio en los átomos de hidrógeno intercambiables que no están protegidos por el anticuerpo, seguido de la digestión con proteasa. de la proteína y análisis de los fragmentos peptídicos usando LCMS. En un ensayo ejemplar, se incuban 5 pL del anticuerpo de prueba (10 pg) o 5 pL del complejo de TIM-3 y el anticuerpo de prueba (10 y 7,35 pg, respectivamente) con 120 pL de marcaje con tampón de óxido de deuterio (fosfato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM a pH 7,4) durante 0 s, 60 s, 300 s, 1800 s, 7200 s y 14400 s. El intercambio de deuterio se detiene agregando 63 ml de clorhidrato de guanidina 5 M y el pH final es 2,5. La muestra apagada se somete a digestión con pepsina/proteasa tipo XIII en columna y análisis CL-EM. Para la digestión con pepsina/proteasa tipo XIII, se desnaturalizan 5 pg de las muestras en 125 pL de tampón de control (fosfato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM a pH 7,4) añadiendo 63 pL de clorhidrato de guanidina 5 M (el pH final es 2,5) y incubando la mezcla durante 3 min. Luego, la mezcla se somete a digestión en columna con pepsina/proteasa tipo XIII y los péptidos resultantes se analizan utilizando un sistema UPCL-EM compuesto por un Waters Acquity UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo). Los datos de Ms sin procesar se procesan utilizando HDX WorkBench, software para el análisis de datos de MS de intercambio H/D. Los niveles de deuterio se calculan usando la diferencia de masa promedio entre el péptido deuterado y su forma nativa (fe). La identificación de péptidos se realiza mediante la búsqueda de datos MS/MS contra la secuencia TIM-3 con Mascot. La tolerancia de masa para los iones precursores y productos es de 20 ppm y 0,05 Da, respectivamente.

[0167] Para cristalografía de rayos X, TIM-3 y el anticuerpo de prueba se expresan y purifican utilizando protocolos estándar. El complejo TIM-3/anticuerpo de prueba se incuba durante la noche a 4 °C, se concentra y se separa de las especies no complejadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El complejo se cristaliza mediante el método de difusión de vapor a partir de varias soluciones de prueba conocidas, por ejemplo, soluciones que contienen PEG3350, citrato de amonio y ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES).

[0168] Anticuerpos que se unen dentro de los residuos Tim-3 32-47 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261), 90-102 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263) y/o 50-56 (DERDVNY) (SEQ ID NO:: 262) puede generarse aislando anticuerpos que se unen a TIM-3 usando bibliotecas de presentación de fagos, seleccionando aquellos anticuerpos que compiten con el anticuerpo de referencia TM3B105 (VH de SEQ ID NO: 146 y VL de SEQ ID n O: 156) o TM3B291 (VH de Se Q ID NO: 172 y Vl de SEQ ID NO: 173) para unirse a TIM-3 en un 100 % y confirmar el epítopo de los anticuerpos generados resolviendo la estructura cristalina del complejo anticuerpo/TIM-3. Alternativamente, se pueden inmunizar ratones, ratas o conejos utilizando péptidos que abarcan los residuos 32-47, 90-102 y/o 50-56 de TIM-3 y se puede evaluar la unión de los anticuerpos generados dentro de la región citada.

[0169] Las SEQ ID NO: 164, 165, 166, 167, 168 y 169 representan las secuencias de género HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de antagonistas de TIM-3 derivados de bibliotecas de expresión en fagos. Las secuencias de género se generaron sobre la base de modelos estructurales que dieron como resultado los alineamientos de secuencias proporcionados en la Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17 y Figura 18 y resumidos en este documento.

SEQ ID NO: 164

X¹⁷YX¹⁸MX¹⁹,

donde

X¹⁷es N, S, G o D;

X¹⁸es W o A; y

X¹⁹es S o H.

SEQ ID NO: 165

X²⁰IX²¹X²²SGGSX²³YYADSKG,

donde

X²⁰es A o V;

X²¹es S o K;

X²²es G o Y; y

X²³es T o K.

SEQ ID NO: 166

X²⁴X²⁵X²⁶X²⁷X²⁸X²⁹X³⁰X³¹DY,

donde

X²⁴es D, S, N, G o E;

X²⁵es H, P, E, T o L;

X²⁶es W, E, N o suprimido;

X²⁷es D, P o suprimido;

X²⁸es P, Y, D o suprimido;

X²⁹es N, A, D, G o suprimido;

X³⁰es F, P, R, W o V; y

X³¹es L o F.

SEQ ID NO: 167

X32X33SQSVX34X35X36X37X38X39X40X41X42LA,

donde X³²es R o K;

X³³es A o S;

X³⁴es S, N o L;

X³⁵es S, A, N o suprimido;

X³⁶es S o se elimina;

X³⁷es S o se elimina;

X³⁸es N o está suprimido;

X³⁹es N o está eliminado;

X⁴⁰es K o se elimina;

X⁴¹es S, D o N; y

X⁴²es Y o T.

SEQ ID NO: 168

X⁴³ASX⁴⁴RX⁴⁵X⁴⁶,

donde X⁴³es G, D, W o T;

X⁴⁴es S, N o T;

X⁴⁵es A o E; y

X⁴⁶es T o S.

SEQ ID NO: 169

QQX47X48X49X50PX51T (SEQ ID NO: 169),

donde X⁴⁷es Y, G o S;

X⁴⁸es G o Y;

X⁴⁹es S, H o T;

X⁵⁰es S, A o T; y

X⁵¹es L, I o W.

SEQ ID NO: 78

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC'AASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQ

GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK.TVERKCC

VECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVD

GVEVHNAKTkPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT

i s k t k g q p r e p q v y t l p p s r e e m t k n q v s l t c l v k g f y p s d i a v e w e s n g q p e n n y

KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK.SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K

SEQ ID NO: 79

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDA

SNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAP1TFGQGTKVE1KR

TVAAPSVFIFPPSDEQLK.SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV

TEQDSKDSTYSLSSTETLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 240

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQ

GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPF.PVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDI-lKPSNTKVDKTVERK.ee

VECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS1EKT

ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

K.TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K SEQ ID NO: 80

EVQLVQSGAEVKKPGESLK1SCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYP

GDGDIRYTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQ

RNYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPA V LQSSGLY S LSS V VTV PSSN FGTQTYTCN VDHKPSNTKV

DKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLTPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDP

EVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNS'FFRWSVl TVLI1QDWI NGKl-'Y KCKVS

NKGLPSS1EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 81

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTFVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRY

TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTKLEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0170] Se muestran en la Tabla 3 las secuencias VH, VL, HCDR y LCDR de anticuerpos antagonistas ejemplares que se unen específicamente a TIM-3.

Tabla 3.

Anticuerpos anti-PD-1/TIM-3 biespecíficos

[0171] La invención también proporciona anticuerpos PD-1/TIM-3 biespecíficos antagonistas que comprenden una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56.

[0172] La invención también proporciona un anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56, y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3.

[0173] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno.

[0174] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, en el que la activación potenciada de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno es evaluado midiendo un aumento estadísticamente significativo de la expresión superficial de CD137 en células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno.

[0175] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención inhibe la unión de TIM-3 a galectina-9.

[0176] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención

se une a PD-1 humano con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, en donde la K^dse mide usando ProteOn sistema XPR36 a 25°C;

se une al PD-1 humano con una K^dinferior a aproximadamente 1 nM, en el que la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C;

se une a cynomolgus PD-1 con una K^dde menos de aproximadamente 100 nM, donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C; o

se une a cynomolgus PD-1 con la K^dde menos de aproximadamente 1 nM;

donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0177] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, en donde la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno se evalúa midiendo un aumento estadísticamente significativo de la expresión superficial de CD137 en células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno y se une a PD-1 humano con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, en donde la K^des medida usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0178] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención mejora la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, en donde la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno se evalúa midiendo un aumento estadísticamente significativo de la expresión superficial de CD137 en células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, y se une a PD-1 humana con una constante de disociación en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 1 nM, en donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0179] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, en donde la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno se evalúa midiendo un aumento estadísticamente significativo de la expresión de superficie de CD137 en células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno y se une a cynomolgus PD-1 con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 100 nM, donde K^des medido usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0180] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención potencia la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, en donde la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno se evalúa midiendo un aumento estadísticamente significativo de la expresión superficial de CD137 en células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, y se une a cynomolgus PD-1 con una constante de disociación de equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 1 nM, en donde la K^dse mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

[0181] Los anticuerpos antagonistas biespecíficos PD-1/TIM-3 de la invención descritos en el presente documento pueden evaluarse por su capacidad para potenciar la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno, para inhibir la unión de TIM-3 a galectina-9, y la cinética de unión a PD-1 o TIM-3 humana o de Cynomolgus puede evaluarse utilizando métodos descritos en el presente documento.

[0182] Por ejemplo, CD137 puede usarse como un marcador para la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno. La expresión superficial de CD137 se puede medir en células T cultivadas en presencia o en ausencia de un anticuerpo de prueba, como el anticuerpo biespecífico PD-1/TIM-3, utilizando un anticuerpo anti-CD 137 y un anticuerpo secundario conjugado, por ejemplo, con un tinte fluorescente. Se evalúa la diferencia estadísticamente significativa en la señal obtenida en células T cultivadas en presencia o ausencia del anticuerpo de prueba.

[0183] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención se une a TIM-3 dentro de los residuos 32-47 de TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261).

[0184] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención se une a TIM-3 dentro de los residuos 32-47 de TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) y los residuos 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

[0185] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención se une a TIM-3 dentro de los residuos TIM-390-102 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263).

[0186] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista de la invención se une a TIM-3 dentro de los residuos 90-102 de TIM-3 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263) y los residuos 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

[0187] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 164, 165 y 166, respectivamente.

[0188] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende las secuencias de aminoácidos LCDR1, Lc DR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 167, 168 y 169, respectivamente.

[0189] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 164, 165 y 166, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID N°: 167, 168 y 169 respectivamente.

[0190] El primer dominio comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 y 32, respectivamente.

[0191] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de

SEQ ID NO: 90, 99, 107, 117, 126 y 135, respectivamente;

SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 y 136, respectivamente;

SEQ ID NO: 91, 99, 109, 119, 128 y 137, respectivamente;

SEQ ID NO: 92, 100, 110, 117, 126 y 135, respectivamente;

SEQ ID NO: 93, 101, 111, 120, 129 y 139, respectivamente;

SEQ ID NO: 94, 102, 112, 121, 130 y 140, respectivamente;

SEQ ID NO: 95, 103, 113, 122, 131 y 141, respectivamente;

SEQ ID NO: 96, 104, 114, 123, 132 y 142, respectivamente;

SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 y 143, respectivamente; o

SEQ ID NO: 98, 106, 116, 125, 134 y 144, respectivamente.

[0192] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 o 172, teniendo la VH opcionalmente una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones conservativas de aminoácidos. Opcionalmente, cualquier sustitución no está dentro de los CDR.

[0193] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende la VL de SEQ IS NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 o 173, teniendo opcionalmente la VL una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones conservativas de aminoácidos. Opcionalmente, cualquier sustitución no está dentro de los CDR.

[0194] En algunas formas de realización, el segundo dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 o 172 y la VL de SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 o 173, teniendo opcionalmente la VH y la VL una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones conservativas de aminoácidos. Opcionalmente, cualquier sustitución no está dentro de los CDR.

[0195] El primer dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56.

[0196] La invención también proporciona un anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado que comprende un primer dominio que se une específicamente PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3, en el que el primer dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56, y el segundo dominio comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 de SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 y 136, respectivamente.

[0197] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista se une a TIM-3 dentro de los residuos 32-47 de TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261).

[0198] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista se une a TIM-3 dentro de los residuos 32-47 de TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) y los residuos 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

[0199] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista biespecífico de PD-1/TIM-3 inhibe la unión de TIM-3 a galectina-9.

[0200] En algunas formas de realización, el primer dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 y el segundo dominio comprende la Vh de SEQ ID NO: 146 y la VL de SEQ ID NO: 156

[0201] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG1.

[0202] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2.

[0203] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2 que comprende una sustitución F405L y/o K409R.

[0204] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2, que comprende opcionalmente las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, a 330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.

[0205] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG3.

[0206] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4, que comprende opcionalmente una sustitución S228P en comparación con el IgG4 de tipo salvaje.

[0207] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4 que comprende una sustitución F405L y K409R.

[0208] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4 que comprende una sustitución de cadena pesada S228P en comparación con la IgG4 de tipo salvaje.

[0209] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado comprende una primera cadena pesada (HC1), una primera cadena ligera (LC1), una segunda cadena pesada (HC2) y una segunda cadena ligera (LC2) de SEQ iD NO: 241, 188, 245 o 194, respectivamente.

[0210] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado comprende el HC1, el LC1, el HC2 y el LC2 de SEQ ID NO: 186, 188, 191 o 194, respectivamente.

[0211] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado comprende el HC1, el LC1, el HC2 y el LC2 de SEQ ID NO: 186, 188, 248 o 194, respectivamente.

[0212] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado comprende el HC1, el LC1, el HC2 y el LC2 de SEQ ID NO: 243, 188, 246 o 194, respectivamente.

[0213] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer.

[0214] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un tumor sólido.

[0215] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un melanoma.

[0216] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de pulmón.

[0217] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

[0218] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un NSCLC escamoso.

[0219] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un NSCLC no escamoso.

[0220] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un adenocarcinoma de pulmón.

[0221] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un carcinoma de células renales (CCR).

[0222] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un mesotelioma.

[0223] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un carcinoma nasofaríngeo (CNF).

[0224] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer colorrectal.

[0225] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de próstata.

[0226] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer de próstata resistente a la castración.

[0227] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de estómago.

[0228] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de ovario.

[0229] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer gástrico.

[0230] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de hígado.

[0231] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de páncreas.

[0232] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un cáncer de tiroides.

[0233] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello.

[0234] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de carcinomas del esófago o del tracto gastrointestinal.

[0235] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de mama.

[0236] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de trompa de Falopio.

[0237] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de cerebro.

[0238] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de uretra.

[0239] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de una endometriosis.

[0240] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de un cáncer de cuello uterino.

[0241] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de una lesión metastásica del cáncer.

[0242] El anticuerpo es adecuado para usar en terapia en un sujeto que está siendo tratado o que ha sido tratado con un anticuerpo antiPD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 230 y la VL de SEQ ID NO: 231. (por ejemplo, KEYTRUDA® (pembrolizumab)).

[0243] El anticuerpo es adecuado para usar en terapia en un sujeto que está siendo tratado o que ha sido tratado con un anticuerpo antiPD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 232 y la VL de SEQ ID NO: 233. (por ejemplo, OPDIVO® (nivolumab)).

[0244] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia en un sujeto que es refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 230 y la VL de SEQ ID NO: 231. (por ejemplo, KEYTRUDA® (pembrolizumab)).

[0245] El anticuerpo es adecuado para usar en terapia en un sujeto que es refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 232 y la VL de SEQ ID NO: 233. (por ejemplo, OPDIVO® (nivolumab)).

[0246] El anticuerpo es adecuado para usar en terapia en un sujeto que tiene un tumor recidivante después del tratamiento con el anticuerpo antiPD-1 que comprende la VH de SEQ iD NO: 230 y la VL de SEQ ID NO: 231. (por ejemplo, KEYTRUDA® (pembrolizumab).

[0247] El anticuerpo es adecuado para usar en terapia en un sujeto que tiene un tumor recidivante después del tratamiento con el anticuerpo antiPD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 232 y la VL de SEQ ID NO: 233. (p. ej., OPDIVO® (nivolumab)).

[0248] La invención también proporciona un anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista aislado que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3, en el que el primer el dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56, y el segundo dominio comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 y 143, respectivamente.

[0249] En algunas formas de realización, el primer dominio comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 y el segundo dominio comprende la Vh de SEQ ID NO: 153 y la VL de SEQ ID NO: 156.

[0250] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG1.

[0251] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2.

[0252] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2 que comprende una sustitución F405L y/o K409R.

[0253] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG2, que comprende opcionalmente las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, a 330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.

[0254] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG3.

[0255] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4, que comprende opcionalmente una sustitución S228P en comparación con el IgG4 de tipo salvaje.

[0256] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4 que comprende una sustitución F405L y K409R.

[0257] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un isotipo IgG4 que comprende una sustitución de cadena pesada S228P en comparación con el IgG4 de tipo salvaje.

[0258] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico aislado comprende e1HC1, el LC1, el HC2 y el LC2 de SEQ ID NO: 186, 188, 190 y 193, respectivamente.

[0259] Anticuerpos PD-1/TIM-3 antagonistas biespecíficos ejemplares de la invención que tienen ciertas secuencias Vh , VL, HCDR y LCDR como se muestra en la Tabla 4 y Tabla 5.

Tabla 4.

Tabla 5.

Anticuerpos manipulados y modificados

[0260] Los anticuerpos de la invención pueden manipularse adicionalmente para generar anticuerpos modificados con propiedades similares o alteradas en comparación con los anticuerpos parentales. La VH, la VL, la VH y la VL, las regiones constantes, el marco de VH, el marco de VL o cualquiera o todas las seis CDR pueden diseñarse en los anticuerpos de la invención.

[0261] "Los anticuerpos de la invención", como se usa en el presente documento, se refiere a los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 que comprenden una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56 y los anticuerpos antagonistas biespecíficos PD-1/TIM-3 que comprenden un primer dominio que se une específicamente a PD-1, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56, y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3 (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3) como se describe en el presente documento.

[0262] En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 de la invención comprenden el HDCR1 de SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 o 98, el HCDR2 de SEQ ID NO: 99, 100, 101, 102, 10, 104, 105 o 106, el HCDR3 de SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 o 116, y la VL que comprende el LCDR1 de SEQ ID NO: 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 125, el LCDR2 de SEQ ID NO: 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134, y/o el LCDR3 de SEQ ID NO: 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143 o 144, en el que el marco de VH se deriva de las secuencias del gen de la línea germinal de VH humana distintas de las de IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), IGHV1-02 (SEQ ID NO: 175), IGHV4-30-4 (SEQ ID NO: 176), IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), IGHV2-26 (SEQ ID NO: 178) o IGHV5-51 (SEQ ID NO: 179), y el marco VL se deriva de las secuencias del gen de la línea germinal humana VL distintas de las de IGKV3-20 (A27) (SEQ ID NO: 180), IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 171), IGKV4-1 (B3) (SEQ ID NO: 181), IGKV1-39 (O12) (SEQ ID NO: 182) o IGKV1-33 (O18) (SEQ ID NO: 183).

[0263] Las secuencias marco a usar pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, el ADN de la línea germinal y las secuencias de proteínas codificadas de los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en IMGT®, el sistema de información internacional ImMunoGeneTics® (http://_www-imgt_org). Las secuencias marco que se pueden usar para reemplazar las secuencias marco existentes en los anticuerpos de la invención pueden ser aquellas que muestren el porcentaje más alto de identidad con los marcos parentales sobre toda la longitud de VH o VL, o sobre la longitud de FR1, FR2, FR3 y FR4. Además, los marcos adecuados pueden seleccionarse adicionalmente en base a las longitudes de VH y VL CDR1 y CDR2 o la estructura canónica idéntica de LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 y HCDR2. Los marcos adecuados se pueden seleccionar utilizando métodos conocidos, como la adaptación del marco humano descrita en la patente de EE. UU. N° 8.748.356 o la sobrehumanización descrita en la patente de EE. UU. N° 7.709.226.

[0264] Las secuencias marco de los anticuerpos parentales y modificados pueden ser modificados posteriormente, por ejemplo, mediante retromutaciones para restaurar y/o mejorar la unión del anticuerpo generado al antígeno como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 6.180.370. Las secuencias flanqueantes de los anticuerpos parentales o manipulados pueden modificarse adicionalmente mediante la mutación de uno o más residuos dentro de la región flanqueante, o dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T y así reducir la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina "desinmunización" y se describe con mayor detalle en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20070014796.

[0265] Los residuos de CDR de los anticuerpos de la invención pueden mutarse para mejorar la afinidad de los anticuerpos por PD-1, TIM-3 o PD-1 y TIM-3.

[0266] Los residuos de CDR de los anticuerpos de la invención pueden mutarse, por ejemplo, para minimizar el riesgo de modificaciones postraduccionales. Los residuos de aminoácidos de motivos putativos para desaminación (NS), hidrólisis catalizada por ácido (DP), isomerización (DS) u oxidación (W) pueden sustituirse con cualquiera de los aminoácidos naturales para mutagenizar los motivos y los anticuerpos resultantes pueden probarse en cuanto a su funcionalidad y estabilidad usando los métodos descritos en este documento.

[0267] Se pueden realizar sustituciones de Fc en los anticuerpos de la invención para modular las funciones efectoras y las propiedades farmacocinéticas del anticuerpo. En la función inmunitaria tradicional, la interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con las células del sistema inmunitario da como resultado una amplia gama de respuestas, que van desde funciones efectoras como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de los mastocitos y la fagocitosis hasta señales inmunomoduladoras como la regulación de la proliferación de los linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician mediante la unión del dominio Fc de anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie celular especializados en células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por anticuerpos e inmunocomplejos resulta de la heterogeneidad estructural de los tres receptores Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) y FcyRIII (CD16) son "receptores Fcy activadores" (es decir, potenciadores del sistema inmunitario); FcyRIIB (CD32B) es un receptor Fcy inhibidor" (es decir, amortigua el sistema inmunitario). La unión al receptor FcRn modula la vida media del anticuerpo.

[0268] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas de la invención comprenden al menos una sustitución en una Región Fc

[0269] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas de la invención comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o

[0270] Posiciones Fc que pueden sustituirse para modular la vida media del anticuerpo son los descritos, por ejemplo, en Dall'Acqua et al., (2006) J Biol Chem 281:23514-240, Zalevsky et al., (2010) Nat Biotechnol 28:157-159, Hinton et al., (2004) J Biol Chem 279(8):6213-6216, Hinton et al., (2006) J Immunol 176:346-356, Shields et al/.(2001) J Biol Chem 276:6591-6607, Petkova et al., (2006). Int Immunol 18:1759-1769, Datta-Mannan et al., (2007) Drug Metab Dispos, 35:86-94, 2007, Vaccaro et al., (2005) Nat Biotechnol 23:1283-1288, Yeung et al., (2010) Cancer Res, 70:3269-3277 y Kim et al., (1999) Eur J Immunol 29: 2819, e incluyen las posiciones 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 y 435. Sustituciones ejemplares que se pueden hacer individualmente o en combinación son sustituciones T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A y H435R. Ejemplos de sustituciones singulares o combinadas que se pueden realizar para aumentar la vida media del anticuerpo son las sustituciones M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A y T307A/E380A/N434A. Ejemplos de sustituciones individuales o combinadas que se pueden realizar para reducir la vida media del anticuerpo son las sustituciones H435A, P257I/N434h , D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A y H435R.

[0271] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc en la posición de aminoácido 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 o 435.

[0272] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc seleccionada del grupo que consiste en T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A y H435R.

[0273] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc seleccionada del grupo que consiste en M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A, T307A/E380A/N434A, H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A y H435R.

[0274] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc que reduce la unión del anticuerpo a un receptor Fcy activador (FcyR) y/o reduce las funciones efectoras de Fc tales como la unión a C1q, dependiente del complemento citotoxicidad (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o fagocitosis (ADCP).

[0275] Las posiciones Fc que pueden sustituirse para reducir la unión del anticuerpo al FcyR activador y posteriormente para reducir la función efectora son las descritas, por ejemplo, en Shields et al., (2001) J Biol Chem 276:6591-6604, Publicación de Patente Int.. N° WO2011/066501, Patentes de EE. UU. Nos 6.737.056 y 5.624.821, Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26, Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543, Bolt et al., (1993) Eur J Immunol 23:403-411, Cole et al., (1999) Transplantation, 68:563-571, Rother et al., (2007) Nat Biotechnol 25:1256-1264, Ghevaert et al., (2008) J Clin Invest 118:2929-2938, An et al., (2009) mAbs, 1:572-579) e incluyen las posiciones 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 y 365. Ejemplos de sustituciones que se pueden hacer individualmente o en combinación son las sustituciones K214T, E233P, L234V, L234A, eliminación de G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S y P331S en IgG1, IgG2, IgG4 o IgG4. Ejemplos de sustituciones combinadas que dan como resultado anticuerpos con ADCC reducida son las sustituciones L234A/L235A en IgG1, V234A,/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S en IgG2, F234A/L235A en IgG4, S228P/F234A/L235A en IgG4, N297A en todos los isotipos de Ig, V234A/G237A en IgG2, K214T/E233P/L234V/L235A/G236-deleted/A327G/P331A/D365E/L358M en IgG1, H268Q/V309L/A330S/P331S en IgG2, S267E, L3g4G1/L235E/D265A en IgG1, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S en IgG1, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S en IgG4 y S228P/F234A/L235A/G/38-S deleted en IgG4. También se pueden usar dominios híbridos IgG2/4 Fc, como Fc con los residuos 117-260 de IgG2 y los residuos 261 -447 de IgG4.

[0276] Se puede realizar la sustitución S228P bien conocida en anticuerpos IgG4 para mejorar la estabilidad de IgG4.

[0277] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución en al menos una posición de residuo 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 o 365, en donde la numeración de los residuos está de acuerdo con el índice de la UE.

[0278] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en K214T, E233P, L234V, L234A, deleción de G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S y P331S, en los que la numeración de residuos es según el índice de la UE.

[0279] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución en al menos una posición de residuo 228, 234, 235, 237, 238, 268, 330 o 331, en la que la numeración de residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0280] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución S228P, en la que la numeración de los residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0281] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución V234A, en la que la numeración de los residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0282] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución F234A, en la que la numeración de residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0283] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución G237A, en la que la numeración de residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0284] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución P238S, en la que la numeración de los residuos es según el índice EU.

[0285] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución H268A, en la que la numeración de los residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0286] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución Q268A, en la que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0287] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución A330S, en la que la numeración de residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0288] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden una sustitución de P331S, en la que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0289] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden sustituciones L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S y P331S, en las que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0290] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S, en las que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0291] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden sustituciones F234A, L235A, G237A, P238S y Q268A, en las que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0292] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden sustituciones L234A, L235A o L234A y L235A, en las que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0293] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden sustituciones F234A, L235A o F234A y L235A, en las que la numeración de residuos es según el índice EU.

[0294] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden sustituciones S228P, F234A y L235A, en las que la numeración de residuos está de acuerdo con el índice EU.

[0295] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en un anticuerpo Fc que mejora la unión del anticuerpo a un receptor Fcy (FcyR) y/o mejora las funciones efectoras de Fc tales como la unión a C1q, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o fagocitosis (ADCP).

[0296] Además de su actividad inmunomoduladora, los anticuerpos PD-1 o TIM-3 de la invención pueden matar células tumorales que expresan PD-1 y/o TIM-3 directamente a través de funciones efectoras mediadas por anticuerpos, por ejemplo, por ADCC, ADCP o CDC.

[0297] Las posiciones de Fc que pueden sustituirse para aumentar la unión del anticuerpo a la activación de Fcy y/o mejorar las funciones efectoras del anticuerpo son las descritas, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 6.737.056, Publicación de Patente de EE. UU. N° 2015/0259434, Shields et al., (2001) J Biol Chem 276:6591-6604, Lazar et al., (2006) Proc Natal Acad Sci, 103:4005-4010, Stavenhagen et al., (2007) Cancer Res 67:8882-8890, Richards y col., (2008) Mol Cancer Ther 7:2517-2527, Diebolder y col., Science; publicado en línea el 13 de marzo de 2014; doi:10.1126/science.1248943, e incluye las posiciones 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 o 430 (numeración de residuos según el índice de la UE). Ejemplos de sustituciones que se pueden realizar individualmente o en combinación son G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T y P396L. Ejemplos de sustituciones combinadas que dan como resultado anticuerpos con ADCC o ADCP aumentados son las sustituciones S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396A/y G²S239D/I332E en IgG1.

[0298] Las posiciones Fc que pueden sustituirse para potenciar la CDC del anticuerpo son las descritas, por ejemplo, en Solicitud de patente Int. WO2014/108198, Idusogie et al., (2001) J Immunol 166:2571-2575 y Moore et al., (2010) Mabs, 2:181-189, e incluyen las posiciones 267, 268, 324, 326, 333, 345 y 430. Ejemplos de sustituciones que se pueden realizar individualmente o en combinación son las sustituciones S267E, H268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F y E430T. Ejemplos de sustituciones de combinación que dan como resultado anticuerpos con CDC incrementado son las sustituciones K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T y S267E/H268F/S324T en IgG1.

[0299] "Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos", "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" es un mecanismo para inducir la muerte celular que depende de la interacción de células objetivo recubiertas de anticuerpos con células efectoras que poseen actividad lítica, tales como como células asesinas naturales, monocitos, macrófagos y neutrófilos a través de los receptores gamma Fc (FcyR) expresados en las células efectoras. Por ejemplo, las células NK expresan FcyRIIIa, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRIl y FcyRIIIa. La muerte de la célula objetivo recubierta de anticuerpos, como las células que expresan PD-1 o TIM-3, se produce como resultado de la actividad de las células efectoras a través de la secreción de proteínas y proteasas formadoras de poros de membrana. Para evaluar la actividad de ADCC del anticuerpo de la invención descrito en el presente documento, el anticuerpo puede agregarse a células que expresan TIM-3 o PD-1 en combinación con células efectoras inmunitarias, que pueden activarse por los complejos antígeno-anticuerpo dando como resultado la citólisis de la célula objetivo. La citólisis puede detectarse mediante la liberación de marca (p. ej., sustratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Ejemplos de células efectoras para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK. Las células objetivo ejemplares incluyen células que expresan TIM-3 o PD-1 de forma endógena o recombinante. En un ensayo ejemplar, las células objetivo se usan con una proporción de 1 célula objetivo por 50 células efectoras. Las células objetivo se marcan previamente con BATDA (PerkinElmer) durante 20 minutos a 37 °C, se lavan dos veces y se resuspenden en DMEM, FBS inactivado por calor al 10 %, L-glutamina 2 mM (todo de Invitrogen). Se combinan células objetivo (1 X 104 células) y efectoras (0,5 X 106 células) y se añaden 100 pl de células a los pocillos de placas con fondo en U de 96 pocillos. Se añaden 100 pl adicionales con o sin los anticuerpos de prueba. Las placas se centrifugan a 200 g durante 3 minutos, se incuban a 37 °C durante 2 horas y luego se centrifugan de nuevo a 200 g durante 3 minutos. Se elimina un total de 20 pl de sobrenadante por pocillo y se mide la lisis celular mediante la adición de 200 pl del reactivo a base de europio d El PHIA (PerkinElmer). Los datos se normalizan a la citotoxicidad máxima con Triton X-100 al 0,67 % (Sigma Aldrich) y el control mínimo se determina mediante la liberación espontánea de BATDA de las células objetivo en ausencia de cualquier anticuerpo. El anticuerpo de la invención puede inducir ADCC en aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.

[0300] "Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" ("ADCP") se refiere a un mecanismo de eliminación de células objetivo recubiertas de anticuerpos por internalización por células fagocíticas, tales como macrófagos o células dendríticas. La ADCP se puede evaluar mediante el uso de macrófagos derivados de monocitos como células efectoras y células Daudi (ATCC^®CCL-213™) o leucemia o linfoma de células B o células tumorales que expresan TIM-3 o PD-1 como células objetivo diseñadas para expresar GFP u otras molécula marcada. La proporción de células efectoras:objetivo puede ser, por ejemplo, de 4:1. Las células efectoras pueden incubarse con células objetivo durante 4 horas con o sin el anticuerpo de la invención. Después de la incubación, las células pueden separarse utilizando Accutase. Los macrófagos pueden identificarse con anticuerpos anti-CD 11b y anti-CD 14 acoplados a un marcador fluorescente, y el porcentaje de fagocitosis puede determinarse en función del % de fluorescencia de GFP en los macrófagos CD11⁺CD14⁺usando métodos estándar. El anticuerpo de la invención puede inducir ADCP en aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.

[0301] "Citotoxicidad dependiente del complemento", o "CDC", se refiere a un mecanismo para inducir la muerte celular en el que el dominio efector Fc de un anticuerpo unido a la objetivo se une y activa el componente C1q del complemento que, a su vez, activa la cascada del complemento que conduce a muerte de la célula objetivo. La activación del complemento también puede resultar en el depósito de componentes del complemento en la superficie de la célula objetivo que facilitan la ADCC al unirse a los receptores del complemento (p. ej., CR3) en los leucocitos. La CDC de las células que expresan TIM-3 o PD-1 se puede medir, por ejemplo, sembrando células Daudi a razón de 1 X 105 células/pocillo (50 pl/pocillo) en RPMI-B (RPMI suplementado con BSA al 1 %), añadiendo 50 pl de prueba de anticuerpos a los pocillos a una concentración final entre 0-100 pg/ml, incubando la reacción durante 15 min a temperatura ambiente, añadiendo 11 pl de suero humano combinado a los pocillos e incubar la reacción durante 45 min a 37 °C. El porcentaje (%) de células lisadas puede detectarse como % de células teñidas con yoduro de propidio en el ensayo FACS utilizando métodos estándar. Los anticuerpos de la invención pueden inducir Cd C en aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.

[0302] La capacidad de los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento para inducir ADCC puede mejorarse modificando su componente de oligosacárido. La IgG1 o IgG3 humana se N-glicosilan en Asn297 con la mayoría de los glucanos en las bien conocidas formas biantenarias G0, G0F, G¹, G1F, G²o G2F. Los anticuerpos producidos por células CHO no manipuladas normalmente tienen un contenido de glicano fucosa de aproximadamente al menos el 85 %. La eliminación de la fucosa central de los oligosacáridos de tipo complejo biantenario unidos a las regiones Fc mejora la ADCC de los anticuerpos a través de la unión mejorada de FcyRIIIa sin alterar la unión al antígeno o la actividad de CDC. Dichos mAbs se pueden lograr usando diferentes métodos que se ha informado que conducen a la expresión exitosa de anticuerpos relativamente defucosilados que llevan el tipo complejo biantenario de oligosacáridos Fc, como el control de la osmolalidad del cultivo (Konno et al., (2012) Cytotechnology 64: 249-65), aplicación de una variante de la línea CHO Lec13 como línea celular huésped (Shields et al., (2002) J Biol Chem 277:26733-26740), aplicación de una variante de la línea CHO EB66 como línea celular huésped (Olivier et al., MAbs;2(4), 2010; Epub antes de la impresión; PMID:20562582), aplicación de una línea celular de hibridoma de rata YB2/0 como línea celular huésped (Shinkawa et al., (2003) J Biol Chem 278:3466 -3473), la introducción de pequeños ARN de interferencia específicamente contra el gen de la a 1,6-fucosiltrasferasa (FUT8) (Mori et al., (2004) Biotechnol Bioeng 88:901-908), o la coexpresión de p-1,4-W-acetilglucosaminiltransferasa III y Golgi a-manosidasa II o un potente inhibidor de alfa-manosidasa I, kifunensina (Ferrara et al., (2006) J Biol Chem 281:50 32-5036, Ferrara et al., (2006) Biotechnol Bioeng 93:851-861; Xhou et al., (2008) Biotechnol Bioeng 99:652-65).

[0303] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc que potencia la función efectora del anticuerpo.

[0304] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc en la posición de aminoácido 236, 239, 243, 256, 267, 268, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 324, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 o 430.

[0305] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc seleccionada del grupo que consiste en G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T, P396L, S267E, H268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F y E430T.

[0306] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una sustitución en el anticuerpo Fc seleccionada del grupo que consiste en S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, G236A/S239D/I332E, K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T y S267E/H268F/S324T.

[0307] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención tienen una estructura de glicano biantenario con un contenido de fucosa de aproximadamente entre 0 % y aproximadamente 15 %, por ejemplo, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0 %.

[0308] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención tienen una estructura de glicano biantenario con un contenido de fucosa de aproximadamente 50 %, 40 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 % 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0 %.

[0309] Las sustituciones en la Fc y el contenido reducido de fucosa pueden potenciar la actividad ADCC de los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a TIM-3 o PD-1 de la invención. Los anticuerpos TIM-3 o PD-1 con actividad mejorada de ADCC, ADCP y/o CDC pueden ser útiles en el tratamiento de pacientes con tumores que expresan TIM-3 y/o PD-1, incluidos los hemo malignos.

[0310] "Contenido de fucosa" significa la cantidad del monosacárido de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa en relación con todas las glicoestructuras. Estos pueden caracterizarse y cuantificarse mediante múltiples métodos, por ejemplo: 1) usando MALDI-TOF de muestra tratada con N-glicosidasa F (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y oligo- y con alto contenido de mañosa) como se describe en Publicación de Patente Int. N° WO2008/077546; 2) por liberación enzimática de los glicanos Asn297 con posterior derivatización y detección/cuantificación por HPLC (UPLC) con detección por fluorescencia y/o HPCL-EM (UPCL-EM); 3) análisis de proteína intacta del mAb nativo o reducido, con o sin tratamiento de los glicanos Asn297 con Endo S u otra enzima que escinde entre el primer y el segundo monosacárido GlcNAc, dejando la fucosa unida al primer GlcNAc; 4) digestión del mAb a péptidos constituyentes por digestión enzimática (p. ej., tripsina o endopeptidasa Lys-C), y posterior separación, detección y cuantificación por HPCL-EM (UPCL-EM) o 5) separación de los oligosacáridos mAb del mAb proteína mediante desglicosilación enzimática específica con PNGasa F en Asn 297. Los oligosacáridos liberados pueden marcarse con un fluoróforo, separarse e identificarse mediante varias técnicas complementarias que permiten una caracterización fina de las estructuras de glucano mediante espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) mediante comparación de las masas experimentales con las masas teóricas, determinación del grado de sialilación por HPLC de intercambio iónico (GlycoSep C), separación y cuantificación de las formas de oligosacáridos según criterios de hidrofilia por HPLC en fase normal (GlycoSep N), y separación y cuantificación de los oligosacáridos por fluorescencia inducida por láser de electroforesis capilar de alto rendimiento (HPCE-LIF).

[0311] "Bajo contenido de fucosa" o "bajo contenido de fucosa" se refiere a anticuerpos con un contenido de fucosa de aproximadamente 0 % - 15 %.

[0312] "Fucosa normal" o "contenido de fucosa normal" se refiere a anticuerpos con un contenido de fucosa de aproximadamente más del 50 %, típicamente aproximadamente más del 60 %, 70 %, 80 % o más del 85 %.

[0313] Los anticuerpos de la invención pueden modificarse postraduccionalmente mediante procesos tales como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente no natural, como la adición de restos de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención descrita en el presente documento puede conjugarse con polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica sin interferir con función (Knigh et al., (2004) Platelets 15:409-18; Leong et al., (2001) Cytokine 16:106-19; Yang et al., (2003) Protein Eng 16:761-70).

[0314] Anticuerpos de la invención puede modificarse para mejorar la estabilidad, la selectividad, la reactividad cruzada, la afinidad, la inmunogenicidad u otras propiedades biológicas o biofísicas deseables que estén dentro del alcance de la invención. La estabilidad de un anticuerpo está influenciada por una serie de factores, que incluyen (1) el empaquetamiento del núcleo de los dominios individuales que afecta su estabilidad intrínseca, (2) las interacciones de la interfaz proteína/proteína que tienen un impacto en el emparejamiento HC y LC, (3) el entierro de residuos polares y cargados, (4) red de enlaces H para residuos polares y cargados; y (5) carga superficial y distribución de residuos polares entre otras fuerzas intramoleculares e intermoleculares (Worn et al., (2001) J Mol Biol 305:989-1010). Los posibles residuos desestabilizadores de la estructura pueden identificarse en función de la estructura cristalina del anticuerpo o mediante modelado molecular en ciertos casos, y el efecto de los residuos en la estabilidad del anticuerpo puede probarse generando y evaluando variantes que albergan mutaciones en los residuos identificados. Una de las formas de aumentar la estabilidad de los anticuerpos es elevar el punto medio de transición térmica (T^m) medido por calorimetría diferencial de barrido (DSC). En general, la proteína T m está correlacionada con su estabilidad e inversamente correlacionada con su susceptibilidad al desdoblamiento y desnaturalización en solución y los procesos de degradación que dependen de la tendencia de la proteína a desdoblarse (Remmele et al., (2000) Biopharm 13: 36 46). Varios estudios han encontrado una correlación entre la clasificación de la estabilidad física de las formulaciones medidas como estabilidad térmica por DSC y la estabilidad física medida por otros métodos (Gupta et al., (2003) AAPS PharmSci 5E8; Zhang et al., (2004) J Pharm Sci 93:3076-89; Maa et al., (1996) Int J Pharm 140:155-68; Bedu-Addo et al., (2004) Pharm Res 21:1353-61; Remmele et al., (1997) Pharm Res 15:200-8). Los estudios de formulación sugieren que un Fab T m tiene implicaciones para la estabilidad física a largo plazo de un mAb correspondiente.

[0315] La lisina C-terminal (CTL) puede eliminarse de los anticuerpos inyectados mediante carboxipeptidasas circulantes endógenas en el torrente sanguíneo (Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404-412). Durante la fabricación, la eliminación de CTL puede controlarse por debajo del nivel máximo mediante el control de la concentración de Zn²⁺extracelular, e DtA o EDTA - Fe³⁺como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20140273092. El contenido de CTL en anticuerpos se puede medir usando métodos conocidos.

[0316] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención tienen un contenido de lisina C-terminal de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 55 % a aproximadamente 70 % %, o alrededor del 60 %.

[0317] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención tienen un contenido de lisina C-terminal de aproximadamente 0 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %.

Métodos para generar anticuerpos homólogos, anticuerpos con modificaciones conservadoras y anticuerpos manipulados y modificados

[0318] Los anticuerpos de la invención que tienen secuencias de aminoácidos alteradas en comparación con los anticuerpos parentales pueden generarse usando tecnologías estándar de clonación y expresión. Por ejemplo, se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la(s) mutación(es) y el efecto sobre la unión del anticuerpo u otra propiedad de interés, se puede evaluar usando métodos bien conocidos y los métodos descritos aquí en los Ejemplos.

A lotipos de anticuerpos

[0319] El anticuerpo de la invención puede ser un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

[0320] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un isotipo IgG1.

[0321] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un isotipo IgG2.

[0322] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un isotipo IgG3.

[0323] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un isotipo IgG4.

[0324] La inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos está asociada con un mayor riesgo de reacciones a la infusión y una menor duración de la respuesta terapéutica (Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08). El grado en que los anticuerpos terapéuticos inducen una respuesta inmunitaria en el huésped puede determinarse en parte por el alotipo del anticuerpo (Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21). El alotipo del anticuerpo está relacionado con las variaciones de la secuencia de aminoácidos en ubicaciones específicas en las secuencias de la región constante del anticuerpo.

[0325] La Tabla ⁶muestra alotipos IgG1, IgG2 e IgG4 seleccionados.

[0326] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención son del alotipo G2m(n), G2m(n-), G2m(n)/(n-), nG4m(a), Glm(17) o Glm(17,1).

[0327] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a TIM-3 de la invención son del alotipo G2m(n), G2m(n-), G2m(n)/(n-), nG4m(a), Glm(17) o G1m(17,1).

[0328] En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 de la invención son del alotipo G2m(n), G2m(n-), G2m(n)/(n-), nG4m(a), Glm(17) o Glm(17,1).

Tabla 6.

Anticuerpos antiidiotípicos

[0329] Un anticuerpo antiidiotípico se une al anticuerpo de la invención.

[0330] Una forma de realización que no forma parte de la invención es un anticuerpo antiidiotípico que se une específicamente al anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56.

[0331] Un anticuerpo antiidiotípico puede utilizarse para detectar el nivel de los anticuerpos terapéuticos (p. ej., anti-PD-1 o los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 de la invención descritos en el presente documento) en una muestra.

[0332] Un anticuerpo antiidiotípico (Id) es un anticuerpo que reconoce los determinantes antigénicos (p. ej., el paratopo o las CDR) del anticuerpo. El anticuerpo Id puede bloquear o no bloquear el antígeno. El Id de bloqueo de antígeno puede usarse para detectar el anticuerpo libre en una muestra (p. ej., anti-PD-1 o el anticuerpo biespecífico PD-1/TIM 3 de la invención descrito en este documento). El Id sin bloqueo se puede utilizar para detectar el anticuerpo total (libre, parcialmente unido al antígeno o totalmente unido al antígeno) en una muestra. Se puede preparar un anticuerpo Id inmunizando a un animal con el anticuerpo para el que se está preparando un anti-Id.

[0333] También se puede usar un anticuerpo anti-Id como inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal más, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id. Un anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original, que indujo el anti-Id. Por lo tanto, mediante el uso de anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica. Los anticuerpos anti Id pueden variarse (produciendo así variantes de anticuerpos anti-Id) y/o derivatizarse mediante cualquier técnica adecuada, como las descritas en otra parte del presente documento con respecto a los anticuerpos que se unen específicamente a PD-1 o a los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3.

Inmunoconjugados

[0334] Un "inmunoconjugado" se refiere al anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas heterólogas.

[0335] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se conjuga con uno o más agentes citotóxicos o un agente de formación de imágenes.

[0336] Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (p. ej., toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) y radionúclidos.

[0337] El agente citotóxico puede ser uno o más fármacos, como un mayatansinoide (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 5.208.020, 5.416.06), una auristatina como las fracciones de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298), una dolastatina, una caliqueamicina o un derivado de la misma (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.5.877.296, Hinman y col., (1993) Cancer Res 53:3336-3342 y Lode y col., (1998) Cancer Res 58:2925-2928); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (ver, por ejemplo, Kratz et al., (2006) Current Med.Chem 13:477-523; Jeffrey et al., (2006) Bioorganic & Med Chem Letters 16:358-362; Torgov et al., (2005) Bioconj Chem 16:717-721, Nagy et al., (2000) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 97:829-834; Dubowchik y col., Bioorg. y Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King y col., (2002) J Med Chem 45:4336-4343; y Patente de EE. UU. N° 6.630.579), metotrexato, vindesina, un taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel.

[0338] El agente citotóxico también puede ser una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de la misma, como la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no vinculantes de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, diantinas, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

[0339] El agente citotóxico o un agente de formación de imágenes también puede ser un radionúclido. Los radionúclidos ejemplares incluyen Ac-225, At-211, 1-131,1-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32, Pb-212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc-99m o 1-123, o una marca de espín para imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imágenes de resonancia magnética, mri), como 1-123, 1-131, In-111, F-19, C-13, N-15 u O-17.

[0340] Los conjugados de los anticuerpos de la invención y la molécula heteróloga se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(Nmaleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HQ), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos de bisazido (como bis (p -azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como ²,⁶-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bisactivos (como 1,5-difluoro -2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., (1987) Science 238: 1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MXDTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase, por ejemplo, WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., (1992) Cancer Res 52: 127-131; Patente de EE. UU. N° 5.208.020).

[0341] Los conjugados de los anticuerpos de la invención y la molécula heteróloga se pueden preparar con reactivos de entrecruzamiento tales como BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

[0342] La invención también proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 de la invención unido a un agente terapéutico o un agente de formación de imágenes.

[0343] La invención también proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención unido a un agente terapéutico o un agente de formación de imágenes.

Generación de anticuerpos monoespecíficos de la invención

[0344] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención son humanos.

[0345] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención están humanizados.

[0346] Anticuerpos monoespecíficos de la invención descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a PD-1, que comprenden una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56) pueden generarse utilizando diversas tecnologías. Por ejemplo, puede usarse el método de hibridoma de Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975 para generar anticuerpos monoclonales. En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped, como un hámster, una rata o un mono, con PD-1 humano o cyno o fragmentos de PD-1, como el dominio extracelular de PD-1, seguido de fusión. de células de bazo de animales inmunizados con células de mieloma usando métodos estándar para formar células de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Las colonias que surgen de células de hibridoma individuales inmortalizadas se analizan para la producción de anticuerpos con las propiedades deseadas, tales como especificidad de unión, reactividad cruzada o ausencia de la misma y afinidad por el antígeno.

[0347] Se pueden usar diversos animales huéspedes para producir los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, se pueden usar ratones Balb/c para generar anticuerpos anti-PD-1 humanos de ratón. Los anticuerpos fabricados en ratones Balb/c y otros animales no humanos pueden humanizarse utilizando diversas tecnologías para generar secuencias más similares a las humanas.

[0348] Se conocen ejemplos de técnicas de humanización que incluyen la selección de estructuras aceptoras humanas e incluyen injerto de CDR (patente de EE. UU. N° 5.225.539), injerto de SDR (patente de EE. UU. N° 6.818.749), Rejuvenecimiento (Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499), Rejuvenecimiento de residuos determinantes de la especificidad (publicación de patente de EE. UU. N° 2010/0261620), adaptación del marco humano (patente de EE. u U. N° 8.748.356) o superhumanización (patente de EE. UU. N° 7.709.226). En estos métodos, las CDR de anticuerpos parentales se transfieren a marcos humanos que pueden seleccionarse en función de su homología general con los marcos parentales, en función de la similitud en la longitud de CDR o la identidad de estructura canónica o una combinación de los mismos.

[0349] Los anticuerpos humanizados pueden optimizarse aún más para mejorar su selectividad o afinidad por un antígeno deseado mediante la incorporación de residuos de soporte de estructura alterada para preservar la afinidad de unión (retromutaciones) mediante técnicas como las descritas en Publicación de Patente Int. Nos WO1090/007861 y WO1992/22653, o introduciendo una variación en cualquiera de las CDR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo.

[0350] Los animales transgénicos, como ratones o ratas que portan loci de inmunoglobulina humana (Ig) en su genoma, pueden usarse para generar anticuerpos humanos contra una proteína objetivo, y se describen, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 6.150.584, Publicación de Patente Int. N° WO99/45962, Publicación de Patente Int. Nos WO2002/066630, WO2002/43478, WO2002/043478 y WO1990/04036, Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9; Green y otros (1994) Nature Genet. 7:13-21; Green & Jakobovits (1998) Exp. Medicina. 188:483-95; Lonberg y Huszar (1995) Int Rev Immunol 13:65-93; Bruggemann y col., (1991) Eur J Immunol 21:1323-1326; Fishwild y col., (1996) Nat Biotechnol 14:845-851; Méndez et al., (1997) Nat Genet 15:146-156; Green (1999) J Immunol Methods 231:11-23; Yang y col., (1999) Cancer Res 59:1236-1243; Bruggemann y Taussig (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458. Los loci de inmunoglobulina endógenos en dicho animal pueden romperse o eliminarse, y al menos un locus de inmunoglobulina humana completo o parcial puede insertarse en el genoma del antimal usando recombinación homóloga o no homóloga, usando transcromosomas o usando minigenes. Empresas como Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbor Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) y Ablexis (http://_www_ablexis_com) pueden participar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnologías como las descritas anteriormente.

[0351] Los anticuerpos humanos se pueden seleccionar de una biblioteca de presentación de fagos, donde el fago se modifica para expresar inmunoglobulinas humanas o porciones de las mismas, como Fab, anticuerpos de cadena única (scFv) o regiones variables de anticuerpos emparejados o no emparejados (Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86, Krebs et al., (2001) J Immunol Meth 254:67-84, Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14:309-314, Sheets et al., (1998) PITAS (EE.UU.) 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter (1991) J Mol Biol 227:381, Marks et al., (1991) J Mol Biol 222:581). Los anticuerpos de la invención se pueden aislar, por ejemplo, de la biblioteca de presentación de fagos que expresan regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpo como proteínas de fusión con la proteína de cubierta pIX del bacteriófago como se describe en Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96, e Publicación de Patente Int. N° WO09/085462). Las bibliotecas pueden examinarse para la unión de fagos a PD-1 humano y/o cyno y los clones positivos obtenidos pueden caracterizarse adicionalmente, los Fab aislados de los clones lisados y expresados como IgG de longitud completa. Dichos métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos se describen, por ejemplo, en: Patentes de EE. UU. Nos 5.223.409, 5.403.484, 5.571.698, 5.427.908, 5.580.717, 5.969.108, 6.172.197, 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081.

[0352] La preparación de antígenos inmunogénicos y la producción de anticuerpos monoclonales se pueden realizar utilizando cualquier técnica adecuada, como la producción de proteínas recombinantes. Los antígenos inmunogénicos pueden administrarse a un animal en forma de proteína purificada, o mezclas de proteínas que incluyen células completas o extractos de células o tejidos, o el antígeno puede formarse de novo en el cuerpo del animal a partir de ácidos nucleicos que codifican dicho antígeno o una porción del mismo.

Generación de anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 de la invención

[0353] Los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 de la invención (p. ej., los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio que se une específicamente a PD-1, que comprende una variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de s Eq ID NO: 56, y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3) puede generarse combinando dominios VH/VL de unión a PD-1 con Dominios VH/VL de unión a TIM-3 aislados y caracterizados en este documento. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 pueden diseñarse usando dominios VH/VL de anticuerpos monoespecíficos anti-PD-1 y anti-TIM-3 disponibles públicamente y/o combinando los PD-1 o TIM-3 dominios VH/VL de unión identificados en el presente documento con dominios VH/Vl de unión PD-1 o TIM-3 disponibles públicamente.

[0354] Ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 que se pueden usar para diseñar moléculas biespecíficas de PD-1/TIM-3 son, por ejemplo, los descritos en las Patentes de EE. Publicación de Patente Nos WO2004/004771, WO2004/056875, WO2006/121168, WO2008/156712, WO2010/029435, WO2010/036959, WO2011/110604, WO2015/145493, WO2015/145493, WO2014/194302, WO2014/206107, WO2015/206107, WO2015/036394, WO2015/035606, WO2015/035606, WO2015/035606, WO2015/085847, WO2015/112900 y WO2015/112805. Por ejemplo, se pueden utilizar los dominios VH/VL de KEYTRUDA® (pembrolizumab) y OPDIVO® (nivolumab). Estos dominios VH/VL de PD-1 pueden incorporarse en anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios VH/VL de unión a TIM-3 descritos en el presente documento y en la Tabla 3. Por ejemplo, los dominios VH/VL de los anticuerpos TM3B103, TM3B105, TM3B107, TM3B107, TM3B108, TM3B109, TM3B113, TM3B189, TM3B190 y TM3B196 descritos en este documento pueden usarse para generar anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3.

[0355] De manera similar, ejemplos de anticuerpos anti-TIM-3 que pueden usarse para diseñar moléculas biespecíficas de PD-1ATIM-3 son, por ejemplo, los descritos en Publicación de Patente Int. Nos WO2011/155607, WO2013/006490 y WO2015/117002. Estos dominios VH/VL de TIM-3 pueden incorporarse en anticuerpos biespecíficos que comprenden los dominios VH/VL de unión a PD-1 descritos en el presente documento y en la Tabla 2. Por ejemplo, los dominios VH/VL de los anticuerpos PD-1 PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, PD1B185, PD1B187, PD1B192, PD1B71, PD1B177, PD1B70, PD1B175, PD1B194, PD1B195, PD1B196, PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200, PD1B201, PD1B131 y PD1B132 descritos aquí pueden usarse para generar anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3.

[0356] Los anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 generados pueden analizarse para determinar su unión a PD-1 y TIM-3, y sus características funcionales deseadas, como la mejora de la activación de células T CD4+ y CD4+ específicas de antígeno usando los métodos descritos en este documento.

[0357] Los anticuerpos biespecíficos de la invención comprenden anticuerpos que tienen una estructura de anticuerpo de longitud completa.

[0358] Los anticuerpos biespecíficos de longitud completa pueden generarse, por ejemplo, usando el intercambio de brazos Fab (p. ej., intercambio de media molécula, intercambio en el par de cadena pesada - cadena ligera) entre dos anticuerpos bivalentes monoespecíficos mediante la introducción de mutaciones en la interfaz CH3 de la cadena pesada en cada media molécula para favorecer la formación de heterodímeros de dos semimoléculas de anticuerpos que tienen una especificidad distinta, ya sea in vitro en un entorno libre de células o utilizando la coexpresión. La reacción de intercambio de brazos Fab es el resultado de una reacción de isomerización de enlaces disulfuro y disociación-asociación de dominios CH3. Los enlaces disulfuro de cadena pesada en las regiones bisagra de los anticuerpos monoespecíficos parentales se reducen. Las cisteínas libres resultantes de uno de los anticuerpos monoespecíficos parentales forman un enlace disulfuro entre cadenas pesadas con residuos de cisteína de una segunda molécula de anticuerpo monoespecífico parental y, simultáneamente, los dominios CH3 de los anticuerpos parentales se liberan y reforman por disociación-asociación. Los dominios CH3 de los brazos Fab pueden diseñarse para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización. El producto resultante es un anticuerpo biespecífico que tiene dos brazos Fab o medias moléculas, cada una de las cuales se une a un epítopo distinto. Las mutaciones F405L en una cadena pesada y K409R en la otra cadena pesada pueden usarse en el caso de anticuerpos IgG1. Para los anticuerpos IgG2, se pueden usar un anticuerpo IgG2 de tipo salvaje y un anticuerpo IgG2 con sustituciones F405L y R409K. Para generar anticuerpos biespecíficos, el primer anticuerpo bivalente monoespecífico y el segundo anticuerpo bivalente monoespecífico se modifican para que tengan una mutación F405L o K409R en la región Fc, los anticuerpos se incuban juntos en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas en la región bisagra sufran isomerización de enlaces disulfuro; generando así el anticuerpo biespecífico por intercambio de brazos Fab. Las condiciones de incubación pueden restaurarse óptimamente a no reductoras. Ejemplos de agentes reductores que pueden usarse son 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutatión, tris(2 carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína y beta-mercaptoetanol. Por ejemplo, la incubación durante al menos 90 min a una temperatura de al menos 20 °C en presencia de al menos 25 mM de 2-MEA o en presencia de al menos 0,5 mM de ditiotreitol a un pH de 5-8, por ejemplo se puede usar a pH de 7,0 o a pH de 7,4.

[0359] Los anticuerpos biespecíficos también se pueden generar usando diseños como Knob-in-Hole (Genentech), CrossMAbs (Roche) y emparejados electrostáticamente (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y (Genentech), el cuerpo de dominio de ingeniería Strand Exchange (SEEDbody) (EMD Serono) y el biclónico (Merus).

[0360] La estrategia de "perilla en el orificio" (ver, por ejemplo, Sol. Int. N° WO 2006/028936) puede usarse para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa de la invención. Brevemente, los aminoácidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios CH3 en la IgG humana pueden mutarse en posiciones que afectan las interacciones del dominio CH3 para promover la formación de heterodímeros. Un aminoácido con una cadena lateral pequeña (agujero) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y un aminoácido con una cadena lateral grande (botón) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. Después de la coexpresión de los dos anticuerpos, se forma un heterodímero como resultado de la interacción preferencial de la cadena pesada con un "agujero" con la cadena pesada con un "botón". Ejemplos de pares de sustitución de CH3 que forman una perilla y un orificio son (expresados como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S y T366W/T366S_L368A_Y407V.

[0361] La tecnología CrossMAb puede usarse para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa de la invención. Los CrossMAb, además de utilizar la estrategia de "perilla en el orificio" para promover el intercambio de brazos Fab, tienen en uno de los medios brazos los dominios CH1 y CL intercambiados para garantizar el emparejamiento correcto de la cadena ligera del anticuerpo biespecífico resultante (ver, por ejemplo, Patente de EE. UU. N° 8.242.247).

[0362] Se pueden usar otras estrategias cruzadas para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa de la invención mediante el intercambio de dominios variables o constantes, o ambos, entre la cadena pesada y la cadena ligera o dentro de la cadena pesada en los anticuerpos biespecíficos, ya sea en uno o ambos brazos. Estos intercambios incluyen, por ejemplo, VH-CH1 con VL-CL, VH con VL, CH3 con CL y CH3 con CH1 como se describe en Publicación de Patente Int. Nos WO2009/080254, WO2009/080251, WO2009/018386 y WO2009/080252.

[0363] Se pueden usar otras estrategias tales como promover la heterodimerización de la cadena pesada usando interacciones electrostáticas mediante la sustitución de residuos cargados positivamente en una superficie CH3 y residuos cargados negativamente en una segunda superficie CH3, como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US2010/0015133; Publicación de Patente de EE. UU. N° US2009/0182127; Publicación de Patente de EE. UU. N° US2010/028637 o Publicación de Patente de EE. UU. N° US2011/0123532. En otras estrategias, la heterodimerización puede promoverse mediante las siguientes sustituciones (expresadas como posiciones modificadas en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V,T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351 Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F. o T350V_L351Y_F405A _Y407V/T350V_T366L _K392L_T394W como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US2012/0149876 o Publicación de Patente de EE. UU. N° US2013/0195849.

[0364] La tecnología LUZ-Y se puede utilizar para generar anticuerpos biespecíficos de la invención. En esta tecnología, se agrega una cremallera de leucina en el extremo C de los dominios CH3 para impulsar el ensamblaje de heterodímeros de los mAbs parentales que se elimina después de la purificación como se describe en Wranik et al., (2012) J Biol Chem 287(52): 42221-9.

[0365] La tecnología SEEDbody se puede utilizar para generar anticuerpos biespecíficos de la invención. Los cuerpos SEED tienen, en sus dominios constantes, residuos de IgG seleccionados sustituidos con residuos de IgA para promover la heterodimerización como se describe en la Patente de EE. UU. N° US20070287170.

[0366] Las mutaciones se realizan típicamente a nivel de ADN en una molécula tal como el dominio constante del anticuerpo usando métodos estándar.

[0367] Los anticuerpos de la invención pueden diseñarse en varios formatos de anticuerpos bien conocidos.

[0368] En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos incluyen moléculas de direccionamiento dual similares a IgG recombinantes, donde los dos lados de la molécula contienen cada uno el fragmento Fab o parte del fragmento Fab de al menos dos anticuerpos diferentes; moléculas de fusión de IgG, en las que los anticuerpos IgG de longitud completa se fusionan con un fragmento Fab adicional o partes del fragmento Fab; moléculas de fusión Fc, en las que moléculas Fv de cadena sencilla o diacuerpos estabilizados se fusionan con dominios constantes de cadena pesada, regiones Fc o partes de los mismos; moléculas de fusión Fab, en las que diferentes fragmentos Fab se fusionan entre sí; ScFvand anticuerpos basados en diacuerpos y de cadena pesada (p. ej., anticuerpos de dominio, nanocuerpos) en los que diferentes moléculas Fv de cadena sencilla o diferentes diacuerpos o diferentes anticuerpos de cadena pesada (p. ej., anticuerpos de dominio, nanocuerpos) se fusionan entre sí o con otra proteína o molécula transportadora.

Polinucleótidos, vectores y células huésped

[0369] La invención también proporciona un anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1, o PD-1 y TIM-3 que tiene una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera región variable (VL) de SEQ ID NO: 56, en la que el anticuerpo VH está codificado por un primer polinucleótido y el anticuerpo VL está codificado por un segundo polinucleótido. El polinucleótido puede ser un ácido desoxinucleico complementario (ADNc) y puede tener codones optimizados para la expresión en un huésped adecuado. La optimización de codones es una tecnología bien conocida.

[0370] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la VH del anticuerpo de la invención, la VL del anticuerpo de la invención, la cadena pesada del anticuerpo de la invención o la cadena ligera del anticuerpo de la invención.

[0371] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la VH, la VL o la VH y la VL del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 de la invención.

[0372] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la VH de SEQ ID NO: 48.

[0373] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la VL de SEQ ID NO: 56.

[0374] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 196 y 197.

[0375] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica e1HC1, el LC1, e1HC2 o el LC2 del anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención.

[0376] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica e1HC1 de SEQ ID NO: 186, 241 o 243.

[0377] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el LC1 de SEQ ID NO: 188.

[0378] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica e1HC2 de SEQ ID NO: 190, 191, 192, 244, 245, 246, 247 o 248.

[0379] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el LC2 de SEQ ID NO: 193, 194 o 195.

[0380] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 y 260.

SEQ ID NO: 196 (PD1H170)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCG

TGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTTAGCAGCTATGCGATTAG

CTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCATTATT

CCGATTTTTGACACCGCGAACTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCAT

TACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGC

AGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCCCTGGTCTCGCTGCGGCTTA

TGATACTGGTTCCTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCA

GC

S E Q ID NO: 197 (P D 1 L 148 )

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAAC

GCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTCGCTCCTACCTGGCGTGG

TATCAGCAGAAACCGGGCC'AGGCGCCGCGCCTGCTGATCTACGACGCGAGCA

ATCGTGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGAT

TTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGC

CAGCAACGTAATTATTGGCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAAT

TAAA

SEQ ID NO: 198 (PD1H129)

GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGC'GGATCTCT

GAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCGCCTTCAGCAGATACGACATGAGCT

GGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAAAGCGTGGCCTACATCTCTGG

CGGAGGCGCCAACACCTACTACCTGGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATC

AGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGG

CCGAGGACACCGC’CGTGTACTATTGCGCCTCCCCCTACCTGAGCTACTTCGAC

GTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCATCT

SEQ ID NO: 199 (PD1L62)

GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCAGGCGAAAG

AGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCCTGAGCGACTACCTGCACTGGT

ATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCAAGTCTGCCAGCCA

GTCCATCAGCGGCATCCCCGCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGAGT

TCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGAGCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGC

CAGAACGGCCACAGCTTCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAAT

CAAG SEQ ID NO: 200 (PD1H163) CAGGTGCAGC'TGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCG TGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAAGTCCTATGTGATTCAT TGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGTATTATCC CAATTTTTGGCACCGCCAATTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATT ACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCA GCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGTTATGTGCGGGCTACGGGC’ ATGTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 201 (PD1L185) GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAAC GCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTAGCAATTATCTGGCGTGG TATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCA ATCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGAT TTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGC CAGCAACGTGCATATTGGCCGCTGACC'TTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAAT TAAA SEQ ID NO: 202 (PD1H164) CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCG TGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAGCGATTATGTGATTTCC TGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGTATTATCC CGATTTACGGGACCGCTAACTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATT ACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCA GCGAAGATACCGC'GGTGTATTATTGCGCGCGCGGTACCCTCGACCGGACCGGG CATTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 203 (PD1L86) GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAAC GCGCGACCCTGAGCTGC'CGCGCGAGCCAGAGCGTCTCCTCCTACCTTGCGTGG TATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATCCACGACGCCTCTAC GCGTGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATT

TTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGC'GGTGTATTATTGC CAGCAACGTAATTATTGGCCGCTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAAT TAAA SEQ ID NO: 204 (TM3H24)

GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCC

TGCGCCTGAGCTGCGCGGCAAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGC

TGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCG

GC AGCGGCGGC AGC ACCTATT ATGC GG AT AGCGTGAA AGGCCGCTTTACC ATT

AGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGC'GCG

CGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAATCCCCGTACGCGCCCTTGGAC

TATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

S E Q ID NO: 205 (T M 3 L 33 )

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAAC

GCGCGACCCTTAGCTGCCGTGCAAGTCAGAGTGTGAACGACTACCTGGCGTGG TATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGC'AA CCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATT

TTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGC

CAGCAGGGTGGTCACGC'GCCGATCACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAA

TTAAA

SEQ ID NO: 206 (TM3H162)

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCC

TGAAGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTC'ACCAGCTACTGGATGCA

GTGGGTGCGCCAGATGCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCCATCTATC

CCGGCGACGGCGACATCAGATACACCCAGAACTTCAAGGGCCAAGTGACCAT

CAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGTCCAGCCTGAAG

GCCAGC'GACACCGCCATGTACTACTGTGCCAGATGGGAGAAGTCCACCACCGT GGTGCAGCGGAACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGT CTAGT SEQ ID NO: 207 (TM3L85)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACA

GAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGGCACCTTCGTGTCCTGG

TATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCA

ACAGATACACCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGA

CTTCACCCTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTG CGGCCAGAGCTACAGCTACCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCA AG

SEQ ID NO: 208 (TM3H21)

GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCC TGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAACTATTGGATGAGC TGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCG GCAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATT AGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCG CGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAAGATCATTGGGATCCCAATTTT TTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

S E Q ID NO: 209 (P H 9 L1 )

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAAC

GCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGC

GTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGGCGCGA

GCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCAC

CGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATT

ATTGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTG

GAAATTAAA

SEQ ID NO: 210 (TM3H65)

GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCC

TGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCGACTATTGGATGAGC

TGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGTGATCAAGT

ATAGCGGTGGCTCCAAATATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATT

AGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCG

CGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAAGAGCTGGAGGGGGTGTTCGA

CTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 211 (TM3L12)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAAC

GCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTAGCAATAGCACTCTGGC

GTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATACTGCGA

GCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCAC

CGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATT

ATTGCCAGCAGTCTTACACATCTCCGTGGACTTTTGGCCAGGGC'ACCAAAGTG

GAAATTAAA

[0381] Las secuencias de polinucleótidos que codifican la VH o la VL o un antígeno de unión fragmento del mismo de los anticuerpos de la invención, o la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos de la invención pueden estar unidos operativamente a uno o más elementos reguladores, como un promotor o potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en el célula huésped deseada. El polinucleótido puede ser un ADNc.

[0382] La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Dichos vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido sintético de la invención en un organismo dado o trasfondo genético por cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican regiones variables de cadena ligera y/o pesada de los anticuerpos de la invención, opcionalmente unidos a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligeras y/o pesadas pueden clonarse en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina pueden unirse operativamente a secuencias de control en el vector o vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Dichas secuencias de control incluyen secuencias señal, promotores (p. ej., promotores heterólogos o asociados de forma natural), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y se eligen para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar el anticuerpo. Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las proteínas codificadas por los polinucleótidos incorporados.

[0383] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 196 y 197.

[0384] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 204 y 205.

[0385] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 206 y 207.

[0386] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 208 y 209.

[0387] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: ²¹⁰y ²¹¹

[0388] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 253 y 254.

[0389] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 255 y 256

[0390] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 257 y 258.

[0391] En algunas formas de realización, el vector comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 259 y 260.

[0392] Los vectores de expresión adecuados son típicamente replicable en los organismos huéspedes, ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección tales como resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

[0393] Los elementos promotores y potenciadores adecuados son conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula eucariótica, los ejemplos de promotores incluyen elementos promotores y potenciadores del gen de la inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada; promotor temprano inmediato de citomegalovirus; promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple; promotores tempranos y tardíos de SV40; promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus; promotor de metalotioneína-I de ratón; y varios promotores específicos de tejidos conocidos. La selección del vector y el promotor apropiados se encuentra dentro del nivel de los expertos en la técnica.

[0394] Los vectores ejemplares que se pueden usar son Bacterial: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH⁸a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR¹, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) y pEE12.4 (Lonza).

[0395] La invención también proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. "Célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped se refiere no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie de tal célula, y también a una línea celular estable generada a partir de la célula objeto particular. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa aquí. Dichas células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células arqueales. Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas, son ejemplos de células huésped procarióticas. Otros microbios, como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichia son ejemplos de células huésped de levadura adecuadas. Ejemplos de células eucarióticas pueden ser de mamíferos, insectos, aves u otros orígenes animales. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como hibridomas o líneas celulares de mieloma tales como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHOK1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), Potelligent® CHOK2SV (Lonza), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.

[0396] La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa el anticuerpo y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos para producir anticuerpos y purificarlos son bien conocidos en la técnica. Una vez sintetizados (ya sea químicamente o de forma recombinante), los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y/o pesadas individuales u otros fragmentos de anticuerpos como VH y/o VL, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar, incluida la precipitación con sulfato de amonio, la afinidad columnas, cromatografía en columna, purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel y similares (ver generalmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, (1982)). Un anticuerpo sujeto puede ser sustancialmente puro, por ejemplo, al menos alrededor del 80 % al 85 % puro, al menos alrededor del 85 % al 90 % puro, al menos alrededor del 90 % al 95 % puro, o al menos alrededor del 98 % al 99 %, o más, puro, por ejemplo, libre de contaminantes tales como desechos celulares, macromoléculas, etc. distintos del anticuerpo en cuestión.

[0397] Las secuencias de polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en vectores utilizando métodos estándar de biología molecular. La transformación, el cultivo, la expresión de anticuerpos y la purificación de la célula huésped se llevan a cabo utilizando métodos bien conocidos. Otra forma de realización de la invención es un método para producir el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 de la invención, que comprende:

incorporar el primer polinucleótido que codifica la VH del anticuerpo y el segundo polinucleótido que codifica la VL del anticuerpo en un vector de expresión; transformar una célula huésped con el vector de expresión; cultivar la célula huésped en medio de cultivo en condiciones en las que VL y VH se expresan y forman el anticuerpo; y

recuperar el anticuerpo de la célula huésped o del medio de cultivo.

[0398] Los polinucleótidos que codifican ciertas secuencias VH o VL de la invención descritas en este documento, y en algunas formas de realización de todas y cada una de las formas de realización numeradas que se enumeran a continuación, pueden incorporarse en vectores utilizando métodos de biología molecular estándar. Se realiza la transformación, el cultivo, la expresión de anticuerpos y la purificación de la célula huésped utilizando métodos bien conocidos.

Composiciones farmacéuticas/Administración

[0399] La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para uso terapéutico, los anticuerpos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el anticuerpo de la invención. Dichos vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se pueden utilizar solución salina al 0,4 % y glicina al 0,3 %. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de partículas. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (p. ej., filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de los anticuerpos de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar, desde menos que aproximadamente 0,5 %, normalmente hasta al menos aproximadamente ¹% hasta 15 o ²⁰% en peso y puede seleccionarse principalmente en función de la dosis requerida, volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluidas otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, se describen, por ejemplo, en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Troy, DB ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, págs. 691-1092, Ver especialmente págs. 958-989.

[0400] El modo de administración para el uso terapéutico de los anticuerpos de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que suministre el anticuerpo al huésped, como la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar, transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, rectal), usando una formulación en tableta, cápsula, solución, polvo, gel, partícula; y contenido en una jeringa, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por el experto en la materia, como bien conocidos en la técnica. La administración en un lugar específico puede lograrse, por ejemplo, por vía intratumoral, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardíaca, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

[0401] Los anticuerpos de la invención se pueden administrar a un sujeto por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía parenteral mediante infusión intravenosa (i.v.) o inyección en bolo, por vía intramuscular o subcutánea o intraperitoneal. La infusión i.v. puede administrarse durante, por ejemplo, 15, 30, 60, 90, 120, 180 o 240 minutos, o entre 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11 o 12 horas.

[0402] La dosis administrada a un sujeto es suficiente para aliviar o al menos detener parcialmente la enfermedad que se está tratando ("cantidad terapéuticamente eficaz") y puede ser a veces de 0,005 mg a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 30 mg/kg o alrededor de 5 mg a alrededor de 25 mg/kg, o alrededor de 4 mg/kg, alrededor de ⁸mg/kg, alrededor de 16 mg/kg o alrededor de 24 mg/kg, o por ejemplo alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9 o 10 mg/kg, pero puede incluso más, por ejemplo alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg.

[0403] También se puede administrar una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área de superficie del paciente, por ejemplo, 500, 400, 300, 250, 200, o 100 mg/m2. Por lo general, se pueden administrar entre 1 y ⁸dosis (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, ⁶, 7 u ⁸) para tratar al paciente, pero se pueden administrar 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más dosis.

[0404] La administración de los anticuerpos de la invención puede repetirse después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles cursos repetidos de tratamiento, así como la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden administrar a ⁸mg/kg o a 16 mg/kg a intervalos semanales durante ⁸semanas, seguido de la administración a ⁸mg/kg o a 16 mg/kg cada dos semanas durante 16 semanas adicionales, seguido de la administración de ⁸mg/kg o de 16 mg/kg cada cuatro semanas mediante infusión intravenosa.

[0405] Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden proporcionar como una dosificación diaria en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, o alternativamente, al menos uno de la semana 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, utilizando dosis únicas o divididas cada 24, 12, ⁸, ⁶, 4 o 2 horas, o cualquier combinación de los mismos.

[0406] Los anticuerpos de la invención también pueden administrarse profilácticamente para reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar el inicio de la aparición de un evento en la progresión del cáncer y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión.

[0407] Los anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con preparaciones de proteínas convencionales y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución bien conocidas.

Métodos y usos

[0408] Los anticuerpos de la invención tienen utilidades diagnósticas in vitro e in vivo, así como terapéuticas y profilácticas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, para diagnosticar una variedad de trastornos, como cánceres y trastornos infecciosos.

[0409] La invención proporciona el anticuerpo de la invención para su uso en un método de modificación de una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo de la invención durante un tiempo suficiente para modificar la respuesta inmunitaria.

[0410] En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria se potencia, estimula o regula al alza.

[0411] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, el sujeto es un paciente humano.

[0412] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, el sujeto es un paciente humano que necesita potenciar la respuesta inmunitaria.

[0413] En algunas formas de realización, el sujeto está inmunocomprometido.

[0414] En algunas formas de realización, el sujeto corre el riesgo de estar inmunocomprometido. El sujeto inmunocomprometido puede estar recibiendo o ha recibido quimioterapia o radioterapia.

[0415] En alguna forma de realización, el sujeto está o está en riesgo de estar inmunocomprometido como resultado de una infección.

[0416] Los anticuerpos de la invención son adecuados para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno que puede tratarse aumentando las respuestas inmunitarias mediadas por células T.

[0417] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 para su uso según la invención es PD1B196 o PD1B244. Las secuencias de aminoácidos VH y VL de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 2.

[0418] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico PD-1ATIM-3 para uso según la invención es PTBB14, PTBB15, PTBB24, PTBB30, PTBB27, PTBB28, PTBB20 o PTBB21. Las secuencias de aminoácidos HC1, LC1, HC2 y LC2 de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 41 y la Tabla 42.

[0419] El anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 para su uso según la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56.

[0420] En algunas formas de realización, el anticuerpo antagonista biespecífico de PD-1/TIM-3 que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3 usado en los métodos de la invención comprenden la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 en el primer dominio, y la VH de SEQ ID NO: 153 y la VL de SEQ ID NO: 162 en el segundo dominio.

[0421] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3 usado en los métodos de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 en el primer dominio, y la VH de SEQ ID NO: 146 y la VL de SEQ ID NO: 156 en el segundo dominio.

[0422] En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1/TIM-3 biespecífico antagonista que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3 usado en los métodos de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 en el primer dominio, y la VH de SEQ ID NO: 172 y la VL de SEQ ID NO: 173 en el segundo dominio.

Cáncer

[0423] El bloqueo de PD-1 puede potenciar una respuesta inmune a las células cancerosas en un sujeto. El ligando para PD-1, PDL1, se expresa abundantemente en una variedad de cánceres humanos (Dong et al., (2002) Nat Med 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 puede resultar en una disminución de los linfocitos que se infiltran en el tumor, una disminución en la proliferación mediada por el receptor de células T y/o la evasión inmune por parte de las células cancerosas (Dong et al., (2003) J Mol Med 81:281-7, Blank y col., (2005) Cancer Immunol Immunother 54:307-314, Konishi y col., (2004) Clin Cancer Res 10:5094-100). La supresión inmunitaria puede revertirse al inhibir la interacción local de PD-1 con PD-L1; el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con el segundo ligando de PD-1, PD-L2 (Iwai et al., (2002) PorcNatl Acad Sci 99:12293-7; Brown et al., (2003) J Immunol 170:1257-66). Por lo tanto, la inhibición de PD-1 puede resultar en el aumento de una respuesta inmune.

[0424] TIM-3 es una proteína coinhibidora expresada en células T linfoides T activadas 1 (Thl) CD4+ y citotóxicas CD⁸+ que secretan IFN-y. TIM-3 se coexpresa en células T agotadas de PD-1+ como se muestra en modelos preclínicos de cáncer y agotamiento viral. El cobloqueo de estas vías puede restaurar la función de las células T efectoras (p. ej., secreción de IFN-y, proliferación) en varios modelos, así como en PBMC humanas derivadas de pacientes con melanoma metastásico y pacientes con VIH o VHC. TIM-3 también está enriquecido en células T reguladoras Foxp3+ y se ha demostrado que Tregs coexpresan TIM-3, LAG3 y CTLA4 para ser supresores altamente eficientes de células T efectoras (Teff) (Galuton et al., (2014) Eur J Immunol 44(9):2703-11). La expresión de TIM-3 se ha correlacionado con un peor pronóstico en NSClC (Zhuang et al., (2012) Am J Clin Pathol 137(6):978-85). Los linfocitos de tejidos tumorales de pacientes con carcinoma de ovario, colorrectal, cervical y hepatocelular exhiben una mayor proporción de células T TIM-3+ CD4, cuyas células tienen una capacidad reducida para producir ILF- y (Yan et al., (2013) PLoS One 8(3)):e58006).

[0425] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 de la invención durante un tiempo suficiente para inhibir el crecimiento de las células tumorales.

[0426] La invención también proporciona los anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención durante un tiempo suficiente para inhibir el crecimiento de las células tumorales.

[0427] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para su uso en un método de tratamiento de un cáncer mediante la administración al sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 de la invención durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.

[0428] La invención también proporciona los anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en un método de tratamiento de un cáncer mediante la administración al sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.

[0429] Ejemplos de anticuerpos que pueden usarse son anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 y anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 PD1B196, PTBB14, PTBB15, PTBB24, PTBB30, PTBB27, PTBB28, PTBB20 y PTBB21 que tienen la secuencia de aminoácidos de VH y VL y características como se describe en este documento.

[0430] El cáncer puede ser una condición o trastorno hiperproliferativo, un tumor sólido, una malignidad hematológica, un tumor de tejido blando o una lesión metastásica.

[0431] "Cáncer" pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados malignamente, independientemente del tipo de histopatología o etapa de invasividad. Los ejemplos de cánceres incluyen tumores sólidos, neoplasias malignas hematológicas, tumores de tejidos blandos y lesiones metastásicas. Tumores sólidos ejemplares incluyen neoplasias malignas, por ejemplo, sarcomas y carcinomas (incluidos adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas) de varios sistemas de órganos, como los que afectan al hígado, pulmón, mama, linfoide, tracto gastrointestinal (por ejemplo, colon), tracto genitourinario (por ejemplo, células renales, uroteliales), próstata y faringe. Los adenocarcinomas incluyen neoplasias malignas tales como la mayoría de los cánceres de colon, un cáncer de recto, un carcinoma de células renales, un cáncer de hígado, un carcinoma de células no pequeñas de pulmón, un cáncer de intestino delgado y un cáncer de esófago. Los carcinomas de células escamosas incluyen tumores malignos, por ejemplo, en el pulmón, esófago, piel, región de cabeza y cuello, cavidad oral, ano y cuello uterino.

[0432] En algunas formas de realización, el cáncer es un melanoma.

[0433] Las lesiones metastásicas de los cánceres antes mencionados también pueden tratarse o prevenirse usando los métodos y anticuerpos de la invención descritos en el presente documento.

[0434] Los cánceres ejemplares cuyo crecimiento pueden inhibirse o reducirse utilizando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres que pueden responder a la inmunoterapia. Ejemplos de tales cánceres incluyen un melanoma, un cáncer renal, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de colon, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de estómago, un cáncer de esófago, un cáncer de pulmón, un melanoma maligno metastásico, un carcinoma de células claras, un adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas, cáncer de pulmón de células no pequeñas o cáncer de cabeza y cuello. Las neoplasias malignas refractarias o recurrentes pueden tratarse usando los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento.

[0435] Ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención son un cáncer anal, un carcinoma de células basales, un cáncer del tracto biliar, un cáncer de vejiga, un cáncer de huesos, cánceres de cerebro y del SNC, un carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer astroesofágico, cáncer testicular, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de recto, cáncer de útero, linfoma primario del SNC; una neoplasia del sistema nervioso central (SNC), un cáncer de cuello uterino, un coriocarcinoma, un cáncer de recto, un cáncer de tejido conjuntivo, un cáncer del sistema digestivo, un cáncer de endometrio, un cáncer de ojo; una neoplasia intraepitelial, un cáncer de riñón, un cáncer de laringe, un cáncer de hígado; un cáncer de pulmón de células pequeñas, un neuroblastoma, un cáncer de cavidad oral (p. ej., labio, lengua, boca y faringe), un cáncer de nasofaringe, un retinoblastoma, un rabdomiosarcoma, un cáncer del sistema respiratorio, un sarcoma, un cáncer de tiroides, un cáncer del sistema urinario, un hepatocarcinoma, un cáncer de la región anal, un carcinoma de las trompas de Falopio, un carcinoma de la vagina, un carcinoma de la vulva, un cáncer del intestino delgado, un cáncer del sistema endocrino, un cáncer de la glándula paratiroides, un cáncer de la glándula suprarrenal, un sarcoma de tejido blando, un cáncer de uretra, un cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, una angiogénesis tumoral, un tumor del eje espinal, un glioma del tronco encefálico, un adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer de células de Merkel, un cáncer epidermoide, un cáncer de células escamosas, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por amianto, así como otros carcinomas y sarcomas, y combinaciones de dichos cánceres.

[0436] Las neoplasias malignas hematológicas ejemplares que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen leucemias, linfomas y mieloma, tales como una leucemia/linfoma linfoblástico de células B precursoras y un linfoma no Hodgkin de células B, una leucemia promielocítica aguda, una leucemia linfoblástica aguda (LLA), una leucemia linfocítica crónica (LLC)/linfoma linfocítico pequeño (LLP) de células B, una leucemia linfocítica aguda de células B, una leucemia prolinfocítica de células B, un linfoma linfoplasmocitario, un linfoma de células de manto (LCM), un linfoma folicular (LF), que incluye LF de bajo grado, grado intermedio y alto grado, un linfoma del centro del folículo cutáneo, un linfoma de células B de la zona marginal (tipo MALT, tipo nodal y esplénico), una leucemia de células pilosas, un linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), un linfoma de Burkitt (BL), un plasmacitoma, un mieloma múltiple (MM), una leucemia de células plasmáticas, un trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, trastornos de células plasmáticas, un linfoma anaplásico de células grandes (LACG), una leucemia linfocítica aguda de células T, una amiloidosis sistémica primaria (p. ej., amiloidosis de cadena ligera), una leucemia prolinfocítica/mielocítica, una leucemia mieloide aguda (LMA), una leucemia mieloide crónica (LMC), una leucemia de linfocitos granulares grandes (LGG), una leucemia de células NK y linfoma de Hodgkin.

[0437] "Trastorno de células plasmáticas" se refiere a trastornos caracterizados por células plasmáticas clonales, e incluye un mieloma múltiple, una amiloidosis de cadena ligera y macroglobulinemia de Waldenstrom. La amiloidosis de cadenas ligeras y la macroglobulinemia de Waldenstrom pueden surgir independientemente del mieloma múltiple. También pueden presentarse simultáneamente con mieloma múltiple y desarrollarse antes o después del desarrollo de mieloma múltiple.

[0438] Los linfomas no Hodgkin de células B ejemplares son una granulomatosis linfomatoide, un linfoma de efusión primaria, un linfoma de células B grandes intravascular, un linfoma de células B grandes mediastínico, enfermedades de cadena pesada (incluyendo y, m y una enfermedad), linfomas inducidos por terapia con agentes inmunosupresores, tales como linfoma inducido por ciclosporina y linfoma inducido por metotrexato.

[0439] Los pacientes que tienen cáncer, incluido el cáncer metastásico que expresa PD-L1, pueden tratarse con los anticuerpos de la invención. El cáncer puede ser un melanoma, un carcinoma de células renales, un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) escamoso, un NSCLC no escamoso, un cáncer colorrectal, un cáncer de próstata resistente a la castración, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un adenocarcinoma (ACA), un carcinoma de células escamosas (SCC), un carcinoma hepatocelular (HCC), un carcinoma pancreático, un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas de esófago, tracto gastrointestinal y mama.

[0440] Los pacientes que tienen cáncer que expresa TIM-3 pueden tratarse con los anticuerpos de la invención. Los cánceres que expresan TIM-3 incluyen cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, NSCLC, leucemia mieloide aguda (LMA), linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), melanoma, cáncer renal, carcinoma de células renales (CCR), un carcinoma de células claras de riñón, un carcinoma de células papilares de riñón, un carcinoma de células renales metastásico, un carcinoma de células escamosas, un carcinoma de células escamosas de esófago, un carcinoma nasofaríngeo, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama (por ejemplo, un cáncer de mama que no expresan uno, dos o todos los receptores de estrógeno, receptores de progesterona o Her2/neu, por ejemplo, un cáncer de mama triple negativo), un mesotelioma, un carcinoma hepatocelular y un cáncer de ovario. El cáncer que expresa TIM-3 puede ser un cáncer metastásico.

[0441] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un tumor sólido.

[0442] En algunas formas de realización, el sujeto tiene una malignidad hematológica.

[0443] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un melanoma.

[0444] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de pulmón.

[0445] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

[0446] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) escamoso.

[0447] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un NSCLC no escamoso.

[0448] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un adenocarcinoma de pulmón.

[0449] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un carcinoma de células renales (CCR).

[0450] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un mesotelioma.

[0451] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un carcinoma nasofaríngeo (CNF).

[0452] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer colorrectal.

[0453] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de próstata.

[0454] En algunas formas de realización, el tumor sólido es cáncer de próstata resistente a la castración.

[0455] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de estómago.

[0456] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de ovario.

[0457] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer gástrico.

[0458] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de hígado.

[0459] En algunas formas de realización, el tumor sólido es cáncer de páncreas.

[0460] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de tiroides.

[0461] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello.

[0462] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un carcinoma del esófago o del tracto gastrointestinal.

[0463] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de mama.

[0464] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de trompa de Falopio.

[0465] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer cerebral.

[0466] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer de uretra.

[0467] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer genitourinario.

[0468] En algunas formas de realización, el tumor sólido es una endometriosis.

[0469] En algunas formas de realización, el tumor sólido es un cáncer cervical.

[0470] En algunas formas de realización, el tumor sólido es una lesión metastásica del cáncer.

[0471] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es un linfoma, un mieloma o una leucemia.

[0472] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es un linfoma de células B.

[0473] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es el linfoma de Burkitt.

[0474] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es el linfoma de Hodgkin.

[0475] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es un linfoma no Hodgkin.

[0476] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es un síndrome mielodisplásico.

[0477] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es una leucemia mieloide aguda (LMA).

[0478] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es una leucemia mieloide crónica (LMC).

[0479] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es una leucemia mielomoncítica crónica (LMMC).

[0480] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es un mieloma múltiple (MM).

[0481] En algunas formas de realización, la malignidad hematológica es un plasmocitoma.

[0482] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un tumor que expresa PD-L1.

[0483] En algunas formas de realización, el sujeto tiene linfocitos T infiltrantes de tumores (LIT) en el tejido tumoral.

[0484] En algunas formas de realización, el sujeto tiene PD-1 TIM-3+ LIT en el tejido tumoral.

[0485] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un mayor número de linfocitos T infiltrantes de tumor (LIT) PD-1 TIM-3+ en el tejido tumoral.

[0486] "Número aumentado" se refiere a un aumento estadísticamente significativo en un sujeto en comparación con un control. "Número aumentado", por ejemplo, se refiere a un aumento estadísticamente significativo en el número de LIT en un sujeto (por ejemplo, un paciente) antes y después del tratamiento con un anticuerpo PD-1 u otro tratamiento terapéutico.

[0487] En algunas formas de realización, el sujeto tiene una mayor expresión o actividad de interferón-gamma (IFN-Y).

[0488] En algunas formas de realización, el sujeto ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-1.

[0489] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1.

[0490] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un tumor recurrente después del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1.

[0491] En algunas formas de realización, el sujeto ha sido tratado con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 230 y la VL de SEQ ID NO: 231 (por ejemplo, KEYTRUDA® (pembrolizumab)).

[0492] En algunas formas de realización, el sujeto ha sido tratado con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 232 y la VL de SEQ ID NO: 233 (por ejemplo, OPDIVO® (nivolumab)).

[0493] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 230 y la VL de SEQ ID NO: 231 (por ejemplo, KEYTRUDA® (pembrolizumab)).

[0494] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 232 y la VL de SEQ ID NO: 233 (por ejemplo, OPDIVO® (nivolumab)).

[0495] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un tumor recidivante después del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 230 y la VL de SEQ ID NO: 231 (por ejemplo, KEYTRUDA® (pembrolizumab).

[0496] En algunas formas de realización, el sujeto tiene una recidiva tumoral después del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 que comprende la VH de SEQ ID n O: 232 y la VL de SEQ ID NO: 233 (por ejemplo, OPDIVO® (nivolumab)).

SEQ ID NO: 230

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGG

INPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDM

GFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 231

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLAS

YLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTK.VEIK

SEQ ID NO: 232

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCK.ASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWY

DGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQG

TLVTVSS

SEQ ID NO: 233

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK

[0497] En algunas formas de realización, el sujeto ha sido tratado o está siendo tratado con un anticuerpo PD-L1.

[0498] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario al tratamiento con el anticuerpo PD-L1.

[0499] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un tumor recurrente después del tratamiento con el anticuerpo PD-L1.

[0500] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario o recayó después del tratamiento con el anticuerpo PD-L1 durvalumab (MEDI-4736). Durvalumab comprende la VH de SEQ ID NO: 234 y la VL de SEQ ID NO: 235.

SEQ ID NO: 234

EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAN

IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG

GWFGELAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 235

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIY

DASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFG

QGTKVEIK

[0501] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario o recayó después del tratamiento con el anticuerpo atezolizumab PD-L1. Atezolizumab comprende la VH de SEQ ID NO: 236 y la Vl de SEQ ID NO: 237.

SEQ ID NO: 236

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAW

ISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRH

WPGGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 237

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQK.PGKAPK.LLIYS

ASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQ

GTKVEIK

[0502] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario o recayó después del tratamiento con anticuerpo avelumab PD-L1. Avelumab comprende la VH de SEQ ID NO: 238 y la VL de SEQ ID NO: 239.

SEQ ID NO: 238

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSS

IY PSGGITF Y A DTVKG RFTIS R DNS K.NTLY LQMN SL RA EDT A VY Y C A RIK

LGTVTTVDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 239

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGK.APKLMI

YDVSNRPSGVSNRFSGSK.SGNTASLT1SGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRV

FGTGTKVTVL

[0503] En algunas formas de realización, el sujeto es refractario o recayó después del tratamiento con el anticuerpo PD-L1 MDX-1105.

[0504] En algunas formas de realización, el sujeto ha sido tratado o está siendo tratado con un anticuerpo PD-L2.

[0505] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, el sujeto es refractario al tratamiento con un anticuerpo PD-L2.

[0506] En algunas formas de realización, el sujeto tiene un tumor recurrente después del tratamiento con un anticuerpo PD-L2.

[0507] Se pueden usar varios métodos cualitativos y/o cuantitativos para determinar la recaída o la naturaleza refractaria de la enfermedad. Los síntomas que pueden estar asociados con la recaída o la resistencia son, por ejemplo, una disminución o estancamiento del bienestar del paciente o el restablecimiento o empeoramiento de varios síntomas asociados con tumores sólidos y/o la propagación de células cancerosas en el cuerpo desde un lugar a otros órganos, tejidos o células.

[0508] En el presente documento se encontró que la expresión de TIM-3 estaba elevada en células T CD⁸+ aisladas de tumores después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1. Por lo tanto, la administración terapéutica de anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a TIM-3 o anticuerpos antagónicos biespecíficos PD-1/TIM-3 descritos en el presente documento a un sujeto que ya ha recibido o está recibiendo terapia con anticuerpos anti-PD-1, es refractaria a la terapia anti-PD. -1 tratamiento con anticuerpos o ha recaído después o durante el tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 puede mejorar el resultado clínico de los pacientes.

[0509] La invención también proporciona los anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención, en el que el sujeto está siendo tratado o ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-1.

[0510] La invención también proporciona los anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención, en el que el sujeto está siendo tratado o ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-L1.

[0511] La invención también proporciona los anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 de la invención, en el que el sujeto está siendo tratado o ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-L2.

[0512] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56 durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.

[0513] Cualquiera de los anticuerpos PD-1 o PD-1/TIM-3 biespecíficos de la invención descritos en el presente documento puede usarse según la invención.

[0514] "Tratar" o "tratamiento" se refiere a un tratamiento terapéutico en el que el objetivo es ralentizar (disminuir) un cambio fisiológico o una enfermedad no deseados, como el desarrollo o la propagación de un tumor o células tumorales, o proporcionar un efecto beneficioso o resultado clínico deseado durante el tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen el alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, el estado de la enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento), el retraso o la desaceleración de la progresión de la enfermedad, la ausencia de metástasis, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si un sujeto no estuviera recibiendo tratamiento. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos sujetos que ya tienen el cambio fisiológico o la enfermedad no deseados, así como aquellos sujetos propensos a tener el cambio fisiológico o la enfermedad.

[0515] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de la invención para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los indicadores ejemplares de una terapia o combinación de terapias efectivas incluyen, por ejemplo, bienestar mejorado del paciente, reducción de la carga tumoral, crecimiento detenido o lento de un tumor y/o ausencia de metástasis de células cancerosas a otras ubicaciones en el cuerpo.

Terapias combinadas para el tratamiento del cáncer

[0516] Los anticuerpos de la invención pueden administrarse en combinación con un segundo agente terapéutico.

[0517] Los anticuerpos de la invención se pueden administrar en combinación con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes terapéuticos adicionales.

[0518] Cualquiera de los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención pueden usarse en combinación con un segundo agente terapéutico.

[0519] Cualquiera de los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención pueden usarse en combinación con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes terapéuticos adicionales.

[0520] "En combinación con" se refiere a la administración de los anticuerpos de la invención y al menos un segundo agente terapéutico simultáneamente como agentes únicos o secuencialmente como agentes únicos en cualquier orden. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un horario determinado para ese agente.

[0521] En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico modula la actividad de una molécula involucrada en el ciclo de inmunidad del cáncer, por ejemplo, una molécula involucrada en las vías de estimulación o inhibición que funcionan en la liberación de antígenos de células cancerosas, presentación de antígenos de cáncer, cebado y activación de células T, tráfico de células T a tumores, infiltración de células T en tumores, reconocimiento de células cancerosas por células T y destrucción de células cancerosas. El ciclo cáncer-inmunidad se describe en Chen y Mellman (2013) Immunity 39:1-10. En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico modula la actividad de una molécula implicada en la regulación de la actividad de las células T reguladoras (Treg), ligandos coestimuladores o coinhibidores expresados en tumores, receptores activadores o inhibidores en células asesinas naturales (NK), o inmunosupresores. factores en el microambiente tumoral. Las inmunoterapias combinadas contra el cáncer se describen en Manoney et al., (2015) Nature Reviews 14:561-584.

[0522] El segundo agente terapéutico potencia típicamente la actividad de las moléculas estimulantes y suprime la actividad de las moléculas inhibidoras, como es bien sabido. Por tanto, "modular" se refiere a la potenciación de la respuesta inmunitaria por el segundo agente terapéutico, aunque el propio agente sea agonista o antagonista de una molécula específica.

[0523] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de una molécula inhibidora de células T.

[0524] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de una molécula inhibidora de células T PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, HVEM, HHLA2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, CD160, CEACAM-1, LAIR1, TGFp, IL-10, proteína de la familia Siglec, KIR, CD96, TIGIT, NKG2A, CD112, CD47, SIRPA o CD244.

[0525] En algunas formas de realización, KIR es KIR2DL1, KIR2DL2 o KIR2DL3.

[0526] La inhibición de moléculas inhibidoras se puede realizar mediante inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína. En algunas formas de realización, se usa un ácido nucleico inhibidor (p. ej., un dsARN, siARN o shARN) para inhibir la expresión de la molécula inhibidora.

[0527] En algunas formas de realización, el inhibidor de la molécula inhibidora es un ligando soluble de la molécula inhibidora.

[0528] En algunas formas de realización, el inhibidor de la molécula inhibidora es un anticuerpo antagonista que se une específicamente a la molécula inhibidora.

[0529] En algunas formas de realización, el inhibidor de la molécula inhibidora es la proteína de fusión CTLA-4-Fc o TIM-3-Fc.

[0530] En algunas formas de realización, el inhibidor de la molécula inhibidora es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, HVEM, HHLA2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, CD160, CEACAM-1, LAIR1, TGFp, IL-10, proteína de la familia Siglec, KIR, CD96, TIGIT, NKG2A, CD112, CD47, SIRPA o CD244.

[0531] Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en el presente documento y en las Patentes de e E. UU. Nos 5.897.862 y 7.488.802, y en Publicación de Patente Int. Nos WO2004/004771, WO2004/056875, WO2006/121168, WO2008/156712, WO2010/029435, WO2010/036959, WO2011/110604, WO2015/145493, WO2015/145493, WO2014/194302, WO2014/206107, WO2015/206107, WO2015/036394, WO2015/035606, WO2015/035606, WO2015/035606, WO2015/085847, WO2015/112900 y WO2015/112805. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD1 incluyen KEYTRUDA® (pembrolizumab) y OPDIVO® (nivolumab).

[0532] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un ligando soluble de PD-1.

[0533] En algunas formas de realización, el ligando de PD-1 soluble es PD-L1 soluble o PD-L2 soluble fusionado con una Fc.

[0534] En algunas formas de realización, el ligando soluble de PD-1 es AMP-224.

[0535] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1, o fragmentos de unión a antígeno del mismo.

[0536] Los anticuerpos PD-L1 ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención son los anticuerpos MDPL3280A (Genentech/Roche) y otros anticuerpos monoclonales humanos descritos en la Patente de EE. UU. N° 20120039906. Otros agentes de unión anti-PD-L1 incluyen YW243.55.S70 (las regiones variables de cadena pesada y ligera se muestran en SEQ ID NO 20 y 21 en WO2010/077634) y MDX-1105 (también denominado BMS-936559 y, por ejemplo, agentes de unión anti-PD-L1 descritos en el documento WO2007/005874). Las secuencias VH y VL de los anticuerpos anti-PD-L1 durvalumab, atezolimumab y avelumab que pueden usarse se describen en el presente documento.

[0537] Anticuerpos PD-L2 ejemplares que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en las Patentes de EE. UU. N° 20110271358 e Publicación de Patente Int. N° WO2012145493.

[0538] Ejemplos de anticuerpos B7-H4 que se pueden usar en los métodos de la invención son los descritos en las Patentes de EE. UU. Nos 7.888.477, 8.609.816, 7.931.896, Patente N° 1817055, Publicación de Patente de EE. UU. N° US20140037551 y US2014029486, y Publicación de Patente Int. Nos WO2014/100483 y WO2014/159835.

[0539] Los ejemplos de anticuerpos anti-CTLA-4 que pueden usarse en los métodos de la invención son ipilimumab (MDX-010, CAS N° 477202-00-9) y tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible de Pfizer, anteriormente conocido como ticilimumab, CP-675.206).

[0540] Los ejemplos de anticuerpos anti-LAG-3 que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos, por ejemplo, en Publicación de Patente Int. Nos WO2008/132601 y WO2010/019570.

[0541] Los ejemplos de anticuerpos anti-CEACAM-1 que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en la Patente de EE. UU. N° 8.598.322 y en la Publicación de Patente de EE. UU. Nos US2004/0047858, US20140271618 y US20120100158. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, CEACAM-1 se ha descrito como un ligando y socio de TIM-3 (ver, por ejemplo, Publicación de Patente Int. Int. N° WO2014/022332). El efecto sinérgico in vivo de la combinación de anticuerpos anti-TIM-3 y antiCEACAM-1 se ha detectado en modelos de cáncer de xenoinjerto (ver, por ejemplo, Publicación de Patente Int. Int. N° WO2014/022332). Los tumores pueden usar CEACAM-1 para inhibir el sistema inmunológico. Por lo tanto, los anticuerpos anti-CEACAM-1 pueden usarse en combinación con los anticuerpos de la invención descritos en este documento.

[0542] Los ejemplos de anticuerpos anti-LAIR1 que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en la Patente de EE. UU. N° 6.479.638 y Publicación de Patente Int. N° WO2010/078580.

[0543] Los ejemplos de anticuerpos anti-CD96 que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en Publicación de Patente Int. N° WO2015/024060.

[0544] Los ejemplos de anticuerpos anti-TIM-3 que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en este documento y en Publicación de Patente Int. Nos WO2011/155607, WO2013/006490 y WO2015/117002.

[0545] Anticuerpos anti-TIGIT ejemplares que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en la Publicación de Patente de EE. Uu . Nos US20140056890 y US20150216970. Un ejemplo de anticuerpo anti-TIGIT es RG-6058 (MTIG-7192A).

[0546] En este documento se encontró que la expresión de TIGIT estaba elevada en células T CD⁸+ aisladas de tumores después del tratamiento con anticuerpos anti-TIM-3 en modelos animales de cáncer. Por lo tanto, la administración terapéutica de anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a TIGIT a un sujeto que ya recibió o está recibiendo terapia con anticuerpos anti-TIM-3, es refractario al tratamiento con anticuerpos anti-TIM-3 o ha recaído después o durante el tratamiento con anticuerpos anti-TIM-3 puede mejorar el resultado clínico de los pacientes.

[0547] Los ejemplos de anticuerpos anti-BTLA que se pueden usar en los métodos de la invención son los descritos en las Patentes de EE. Publicación de Patente N° WO2014184360.

[0548] Los ejemplos de anticuerpos anti-MEVH que pueden usarse en los métodos de la invención son los descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20110280866.

[0549] Los anticuerpos CD47 ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención son los descritos en la Patente de EE. UU. N° 8.101.719.

[0550] Los ejemplos de anticuerpos contra CD244 que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen los descritos en la Patente de EE. UU. N° 5.688.690.

[0551] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-TIM-3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0552] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-PD-L¹o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0553] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-PD-L²o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0554] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-VISTA o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0555] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-BTNL²o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0556] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-B7-H3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0557] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-B7-H4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0558] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas Los anticuerpos biespecíficos PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-MEVH o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0559] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-HLA²o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0560] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CTLA-4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0561] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-LAG-3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0562] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-TIM-3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0563] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-BTLA o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0564] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD 160 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0565] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CEACAM-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0566] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-LAIR1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0567] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-TGFp o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0568] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-IL-10 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0569] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-TIGIT o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0570] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-KIR o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0571] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-NKG²A o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0572] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD ¹¹²o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0573] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD47 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0574] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-SIRPA o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0575] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD244 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0576] Las moléculas inhibidoras inmunitarias pueden regular o regular sinérgicamente las funciones de las células T para promover el escape inmunitario tumoral. Por lo tanto, las terapias de combinación con dos o más inhibidores de las moléculas inhibidoras pueden proporcionar una terapia mejorada para un paciente en comparación con la monoterapia sola.

[0577] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un activador de una molécula activadora.

[0578] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un activador de una molécula activadora CD⁸⁶, CD80, c D28, ICOS, ligando de ICOS, TMIGD2, CD40, ligando GITR, ligando 4-1BB, ligando OX40, CD70, CD40L, TNFRSF25, LIGHT, GITR, OX-40, CD27, CD137, NKG2D, CD48, CD226 o MICA.

[0579] La activación de moléculas activadoras se puede realizar utilizando, por ejemplo, ligandos solubles o derivados de ligandos de las moléculas activadoras, péptidos o anticuerpos agonistas.

[0580] En algunas formas de realización, el activador de la molécula activadora es un ligando soluble de la molécula activadora de células T.

[0581] En algunas formas de realización, el activador de la molécula activadora es un anticuerpo agonista que se une específicamente a la molécula activadora.

[0582] Los ejemplos de anticuerpos anti-CD40 que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen CP-870,893 y S2C6 humanizado descritos en la Patente de EE. UU. N° 7.288.251 (anticuerpo 21.4.1) y la Patente de EE. UU. N° 8.303.955, respectivamente, y los anticuerpos CD40 descritos en Publicación de Patente Int. Nos WO2001/056603, WO2001/083755, WO2013/034904 y WO2014/070934.

[0583] Los agonistas de GITR ejemplares incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de GITR y anticuerpos anti-GITR (por ejemplo, anticuerpos anti-GITR bivalentes), tales como una proteína de fusión de GITR descrita en la patente de EE. UU. Patente N° 8.586.023, Publicación de Patente Int. Nos WO2010/003118 y WO2011/090754, o un anticuerpo anti-GITR descrito en la Publicación de Patentes de EE. UU. Nos WO2011/028683, WO2013/039954, W02005/007190, WO2007/133822, WO2005/055808, WO1999/40196, WO2001/03720, WO1999/20758, WO2006/083289, WO2005/15151751 y WO2005/151542.

[0584] En este documento se encontró que la expresión de GITR estaba elevada en células T CD⁸+ aisladas de tumores después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 en modelos animales de cáncer. La restauración de la expresión de GITR en LIT mediante el tratamiento anti-PD-1 respalda que la terapia combinada con anticuerpos anti-GITR y anti-PD-1 puede mejorar el resultado clínico de los pacientes.

[0585] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 y un agonista anticuerpo que se une específicamente a GITR durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.

[0586] En algunas formas de realización, el anticuerpo agonista que se une específicamente a GITR se administra después de la administración del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1.

[0587] En algunas formas de realización, el anticuerpo agonista que se une específicamente a GITR y el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 se administran simultáneamente como agentes únicos o secuencialmente como agentes únicos en cualquier orden.

[0588] Los ejemplos de anticuerpos OX40 que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen los descritos en las Patentes de EE. UU. N° 20130280275 e Publicación de Patente Int. N° WO2013028231 y WO2014148895.

[0589] Un ejemplo de anticuerpo OX40 que se puede usar en los métodos de la invención es un anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 309 y la VL de SEQ ID NO: 310.

[0590] Otro ejemplo de anticuerpo OX40 que se puede usar en los métodos de la invención es un anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 311 y la VL de SEQ ID NO: 312.

[0591] En este documento se encontró que la expresión de OX40 estaba elevada en células T CD⁸+ aisladas de tumores después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 en modelos animales de cáncer. La restauración de la expresión de OX40 en los LIT mediante el tratamiento anti-PD-1 respalda que la terapia combinada con anticuerpos anti-OX40 y anti-PD-1 puede mejorar el resultado clínico de los pacientes.

[0592] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 y un agonista anticuerpo que se une específicamente a OX40 durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.

[0593] En algunas formas de realización, el anticuerpo agonista que se une específicamente a OX40 se administra después de la administración del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1.

[0594] En algunas formas de realización, el anticuerpo agonista que se une específicamente a OX40 y el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 se administran simultáneamente como agentes únicos o secuencialmente como agentes únicos en cualquier orden.

[0595] Los anticuerpos CD70 ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen los descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20130336976.

[0596] Los anticuerpos TNFRSF25 ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen los descritos en la Patente de EE. UU. N° 7.708.996.

[0597] Los anticuerpos CD27 ejemplares que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen los descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20130336976.

[0598] Los anticuerpos CD137 ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen los descritos en las Patentes de EE. UU. Nos 6.974.863, 6.303.121, 7.138.500, 7.288.638, 8.716.452, 8.821.867 y la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20130149301.

[0599] En este documento se encontró que la expresión de CD137 estaba elevada en células T CD⁸+ aisladas de tumores después del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 en modelos animales de cáncer. La restauración de la expresión de CD137 en los LIT mediante el tratamiento anti-PD-1 respalda que la terapia combinada con anticuerpos anti-CD 137 y anti-PD-1 puede mejorar el resultado clínico de los pacientes.

[0600] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 y un anticuerpo agonista que se une específicamente a CD137 durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.

[0601] En algunas formas de realización, el anticuerpo agonista que se une específicamente a CD137 se administra después de la administración del anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1.

[0602] En algunas formas de realización, el anticuerpo agonista que se une específicamente a CD137 y el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 se administran simultáneamente como agentes únicos o secuencialmente como agentes únicos en cualquier orden.

[0603] Los anticuerpos NKG2D ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen los descritos en la Publicación de Patente de EE. UU. N° US20110150870.

[0604] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD⁸⁶o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0605] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD80 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0606] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0607] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-ICOS o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0608] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-ligando de ICOS o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0609] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-TMIGD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0610] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0611] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-ligando GITR o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0612] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-ligando 4-1BB o un fragmento de unión a antígenos del mismo.

[0613] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-ligando OX40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0614] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD70 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0615] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD40L o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0616] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-TNFRSF25 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0617] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-LIGHT o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0618] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-GITR o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0619] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-OX40 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0620] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD27 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0621] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD137 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0622] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-NKG²D o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0623] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD48 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0624] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD226 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0625] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-MICA o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0626] La combinación de anticuerpos citados en el presente documento puede administrarse por separado, por ejemplo, como anticuerpos separados, o unidos, por ejemplo, como una molécula de anticuerpo biespecífica o triespecífica.

[0627] La eficacia de las combinaciones descritas en el presente documento puede probarse en modelos animales conocidos en la técnica.

[0628] Los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con una vacuna.

[0629] Los ejemplos de vacunas son agentes inmunogénicos, como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas recombinantes, epítopos antigénicos, péptidos y moléculas de carbohidratos), antígenos tumorales administrados a un paciente a través de terapia génica, células y células transfectadas con genes que codifican inmunidad citocinas estimulantes. Los ejemplos de vacunas que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina GM-CSF, vacunas basadas en ADN, vacunas basadas en ARN, transducción viral, y vacunas basadas en péptidos o antígenos de próstata o péptidos de antígenos de cáncer de pulmón. La vacuna contra el cáncer puede ser profiláctica o terapéutica.

[0630] Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (ver Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300- 302, Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428, Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738, véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, páginas 3023 -3043 en DeVita, V. y otros (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Quinta edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna utilizando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al., (1993) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 90: 3539-43).

[0631] Los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con una o una colección de proteínas y/o péptidos recombinantes expresados en o sobre un tumor para generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas normalmente son vistas por el sistema inmunitario como autoantígenos y, por lo tanto, son tolerantes a ellas. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de los telómeros de los cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y solo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al., (1994)) Ciencia 266: 2011-2013). Los antígenos tumorales también pueden ser "neoantígenos" expresados en o sobre células cancerosas como resultado de mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (p. ej., bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de B tumores de células. Los antígenos tumorales pueden ser epítopos antigénicos del antígeno prostático específico (PSA), mesotelina, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), sarcoma sinovial X2 (SSX2), NKX3.1, fosfatasa ácida prostática (PAP) o receptores del factor de crecimiento epidérmico, o péptidos específicos para variantes de EGFR como el conocido EGFRvIII sobreexpresado en células tumorales.

[0632] Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de virus implicadas en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (VPH), virus de la hepatitis (HBV y HCV) y virus del sarcoma del herpes de Kaposi (KHSV) y virus de EpsteinBarr (EBV). Otra forma de antígenos específicos de tumores que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento son las proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del propio tejido tumoral. Las HSP contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y son muy eficaces en el suministro a las células presentadoras de antígenos para provocar la inmunidad tumoral (Suot y Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al., (1997) Science 278:117- 120).

[0633] Las células dendríticas (CD) son potentes células presentadoras de antígenos que pueden usarse para cebar respuestas específicas de antígeno. Las CD pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos proteicos y peptídicos así como con extractos de células tumorales (Nestle et al., (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD también pueden transducirse por medios genéticos para expresar estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente con células tumorales con fines de inmunización (Kugler et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización con CD puede combinarse eficazmente con los anticuerpos de la invención descritos en este documento para activar respuestas antitumorales más potentes.

[0634] En algunas formas de realización, la vacuna es un polipéptido o un fragmento del mismo, o un ADN o un ARN que codifica el polipéptido o un fragmento del mismo expresado en células tumorales.

[0635] En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento del mismo expresado en células tumorales es PSMA.

[0636] En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento del mismo expresado en células tumorales es mesotelina.

[0637] En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento del mismo expresado en células tumorales es EGFR o una variante de EGFR tal como EGFRv iIi.

[0638] En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento del mismo expresado en células tumorales es PAP.

[0639] En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento del mismo expresado en células tumorales es sarcoma sinovial X2 (SSX2).

[0640] En algunas formas de realización, el polipéptido o fragmento del mismo expresado en células tumorales es NKX3.1.

[0641] En algunas formas de realización, las células tumorales son melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas escamosas (NSCLC), NSCLC no escamoso, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas del esófago o del tracto gastrointestinal o células de cáncer de mama.

[0642] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con una vacuna de carcinoma renal (CCR).

[0643] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con una vacuna contra el cáncer de pulmón.

[0644] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con una vacuna contra el cáncer de próstata.

[0645] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con una vacuna contra el cáncer de pulmón.

[0646] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1/TIM-3 de la invención se administran en combinación con una vacuna tumoral que comprende un fragmento peptídico de EGFR o EGFRvIII, o un vector que codifica el fragmento peptídico de EGFR o EGFRvIII.

[0647] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con una vacuna tumoral que comprende un fragmento peptídico de mesotelina, o un vector que codifica el fragmento peptídico de la mesotelina.

[0648] En algunas formas de realización, los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a PD-1 de la invención o los anticuerpos antagonistas biespecíficos de PD-1ATIM-3 de la invención se administran en combinación con una vacuna tumoral que comprende un fragmento peptídico del antígeno prostático específico, o un vector que codifica el fragmento peptídico del antígeno prostático específico.

[0649] Los vectores adecuados que se pueden usar en los métodos de la invención son bien conocidos e incluyen vectores lentivirales, vectores adenovirales, vector de ácido nucleico mínimo (MNAV), virus vaccinia, virus de la viruela, VRP derivado del virus Alfa, Saccharomyces cerevisiae, MVA, Listeria moonocytogenes, plásmido basado en pVAX, véase, por ejemplo, Pol et al., (2014) Oncoimmunology 1(3):e28185.

[0650] Los anticuerpos de la invención se pueden administrar en combinación con un tratamiento de cáncer de atención estándar.

[0651] Los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con regímenes quimioterapéuticos contra el cáncer estándar de atención. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr et al., (1998) Cancer Research 58: 5301 -5304).

[0652] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención pueden administrarse en combinación con una o más de otras moléculas de anticuerpo, quimioterapia, otra terapia anticancerígena (p. ej., terapias anticancerígenas dirigidas o fármacos oncolíticos), agentes citotóxicos, citoquinas, procedimientos quirúrgicos y/o de radiación.

[0653] Los ejemplos de agentes citotóxicos que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos de la invención incluyen agentes antimicrotúbulos, inhibidores de topoisomerasa, antimetabolitos, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antraciclinas, alcaloides de la vinca, agentes intercalantes, agentes capaces de interferir con una ruta de transducción de señales, agentes que promueven la apoptosis, inhibidores del proteosoma y radiación (p. ej., irradiación local o de todo el cuerpo).

[0654] Los tratamientos estándar de atención incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfano (Myleran®), inyección de busulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, citosina arabinósido (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección de liposomas de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran®), ⁶-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), paclitaxel (Taxol®), phoenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposida (Vumon®), ⁶-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), clorhidrato de topotecán para inyección (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), vinorelbina (Navelbine®), ibrutinib, idelalisib y brentuximab vedotin.

[0655] Ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos: mostaza de uracilo (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil Nitrogen Mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™), ifosfamida (Mitoxana®), melfalán (Alkeran®), clorambucilo (Leukeran®), pipobroman (Amedel®, Vercyte®), trietilenmelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilentiofosforamina, temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), busulfán (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®) y estreptozocina (Zanosar®). Ejemplos de agentes alquilantes adicionales incluyen, oxaliplatino (Eloxatin®), temozolomida (Temodar® y Temodal®), dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen®), altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®), bendamustina (Treanda®), carboplatino (Paraplatin®), lomustina (también conocido como CCNU, CeeNU®), cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol® y Platinol® -AQ), clorambucilo (Leukeran®), prednumustina, procarbazina (Matulane®) y tiotepa (también conocida como tiofosfoamida, TESPA y TSPA, Thioplex®).

[0656] Las antraciclinas ejemplares incluyen, por ejemplo, doxorrubicina (Adriamycin® y Rubex®); bleomicina (Lenoxane®), daunorrubicina (clorhidrato de dauorrubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine®), daunorrubicina liposomal (liposoma de citrato de daunorrubicina, DaunoXome®), mitoxantrona (DHAD, Novantrone®), epirrubicina (Ellence™), idarrubicina (Idamycin®, Idamycin PFS®), mitomicina C (Mutamycin®), geldanamicina, herbimicina, ravidomicina y desacetilravidomicina.

[0657] Ejemplos de alcaloides de la vinca que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención incluyen tartrato de vinorelbina (Navelbine®), vincristina (Oncovin®) y vindesina (Eldisine®), vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina y VLB, Alkaban-AQ® y Velban®) y vinorelbina (Navelbine®).

[0658] Los ejemplos de inhibidores de proteosomas que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención son bortezomib (Velcade®); carfilzomib (Kyprolis®), ixazomib (Ninlaro®), marizomib (NPI-0052) y delanzomib (CEP-18770).

[0659] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de tirosina quinasa (p. ej., un inhibidor de receptor de tirosina quinasa (RTK)). Los ejemplos de inhibidores de tirosina quinasa incluyen un inhibidor de la ruta del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (p. ej., un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)), un inhibidor de la ruta del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (p. ej., un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) (p. ej., un inhibidor de VEGFR-1, un inhibidor de VEGFR-2, un inhibidor de VEGFR-3), un inhibidor de la vía del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (p. ej., un inhibidor del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) (p. ej., un inhibidor de PDGFR- p), un inhibidor de RAF-1, un inhibidor de KIT y un inhibidor de RET. En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico es axitinib (AG013736), bosutinib (SKI-606), cediranib (RECENTIN™, AZD2171), dasatinib (SPRYCEL®, BMS-354825), erlotinib (TARCEVA®), gefitinib (IRESSA®), imatinib (Gleevec®, CGP57148B, STI-571), lapatinib (TYKERB®, TYVERB®), lestaurtinib (CEP-701), neratinib (HKI-272), nilotinib (TASIGNA®), semaxanib (semaxinib, SU5416), sunitinib (SUTENT®, SU11248), toceranib (PALLADIA®), vandetanib (ZACTIMA®, ZD6474), vatalanib (PTK787, PTK/ZK), trastuzumab (HERCEPTIN®), bevacizumab (AVASTIN®), rituximab (RITUXAN®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®), ranibizumab (Lucentis®), nilotinib (TASIGNA®), sorafenib (NEXAVAR®), alemtuzumab (CAMPATH®), gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, lactato de dovitinib (TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOK™), SGX523, PF-04217903, PF- 02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, B MS-690154, CEP-11981, tivozanib (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, XL228, AEE788, AG-490, AST-⁶, BMS-599626, CUDC-101, PD153035, pelitinib (EKB-569), vandetanib (zactima), WZ3146, WZ4002, WZ8040, ABT-869 (linifanib), AEE788, AP24534 (ponatinib), AV-951 (tivozanib), axitinib, BAY 73-4506 (regorafenib), alaninato de brivanib (BMS-582664), brivanib (BMS-540215), cediranib (AZD2171), CHIR-258 (dovitinib), CP 673451, CYC116, E7080, Ki8751, masitinib (AB1010), MGCD-265, difosfato de motesanib (AMG-706), MP-470, OSI-930, clorhidrato de pazopanib, PD173074, tosilato de sorafenib (Bahía 43-9006), SU 5402, TSU^{- 68}(SU^{6 668}), vatalanib, XL880 (GSK1363089, EXEL-2880). Los inhibidores de la tirosina quinasa seleccionados se eligen entre sunitinib, erlotinib, gefitinib o sorafenib. En algunas formas de realización, el inhibidor de EGFR es un anticuerpo EGFRc-Met biespecífico (EM-1 mAb) que comprende las cadenas pesada y ligera de SEQ ID NO: 249, 250, 251 y 252 (US2014/0141000).

[0660] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con inhibidores del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que incluyen bevacizumab (Avastin®), axitinib (Inlyta®), alaninato de brivanib (BMS-582664, (S)-((R)-1-(4-(4-fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-5-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6- iloxi)propan-2-il)2-aminopropanoato), sorafenib (Nexavar®); Pazopanib (Votrient®), malato de sunitinib (Sutent®), cediranib (AZD2171, CAS 288383-20-1), vargatef (BIBF1120, CAS 928326-83-4), foretinib (GSK1363089), telatinib (BAY57-9352, CAS 332012)-40-5), apatinib (YN968D1, CAS 811803-05-1), imatinib (Gleevec®), ponatinib (AP24534, CAS 943319-70-8), tivozanib (AV951, CAS 475108-18-0), regorafenib (BAY73-4506, CAS 755037-03-7), diclorhidrato de vatalanib (PTK787, CAS 212141-51-0), brivanib (BMS-540215, CAS 649735-46 ⁶), vandetanib (Caprelsa® o AZD6474), motesanib difosfato (AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-dihidro-3,3-di metil-1H-indol-6-il)-2-[(4-piridinilmetil)amino]-3-piridincarboxamida, descrito en la publicación PCT N° WO 02/066470), ácido diláctico dovitinib (TKI258, CAS 852433-84-2), linfanib (ABT869, CAS 796967- 16-3); cabozantinib (XL184, CAS 849217-68-1), lestaurtinib (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-Dimetiletil)-2-oxazolil]metil]tio]-2-tiazolil]-4-piperidinacarboxamida (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-Amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)metil)piperidin-3-ol (BMS690514); N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[(3aa,5p,6aa)-octahidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8); 4-metil-3-[[1-metil-6-(3-piridinil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]amino]-N-[3-(trifluorometil)fenil]-benzamida (BHG712, CAS 940310-85-0); y aflibercept (Eylea®).

[0661] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de PI3K. En una forma de realización, el inhibidor de PI3K es un inhibidor de las isoformas delta y gamma de PI3K. Los inhibidores de PI3K ejemplares que se pueden usar se describen, por ejemplo, en WO 2010/036380, WO 2010/006086, WO 09/114870, WO 05/113556, GSK 2126458, GDC-0980, GDC-0941, Sanofi XL147, XL756, XL147, PF-46915032, BKM 120, CAL-101, CAL 263, SF1126, PX^{- 886}y un inhibidor dual de PI3K (p. ej., Novartis BEZ235).

[0662] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, uno o más inhibidores de mTOR elegidos entre uno o más de rapamicina, temsirolimus (TORISEL®), AZD8055, BEZ235, BGT226, XL765, PF-4691502, GDC0980, SF1126, OSI-027, GSK1059615, KU-0063794, WYE-354, Palomid 529 (P529), PF-04691502 o PKI-587. ridaforolimus (formalmente conocido como deferolimus, (1R,2R,4s )-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R, 19R,21 R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexildimetilfosfinato, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en la publicación Pc T N° WO 03/064383); everolimus (Afinitor® o RAD001); rapamicina (AY22989, Sirolimus®); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-uno (PF04691502, CAS 1013101-36-4); y N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartilL-serina-(SEQ ID NO: 237), sal interna (SF1126, CAS 936487-67-1) y XL765.

[0663] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de BRAF, por ejemplo, GSK2118436, RG7204, PLX4032, GDC-0879, PLX4720 y tosilato de sorafenib (Bay 43-9006).

[0664] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de MEK.

[0665] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de JAK2, por ejemplo, CEP-701, INCB18424, Cp -690550 (tasocitinib).

[0666] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con paclitaxel o un agente de paclitaxel, por ejemplo, TAXOL®, paclitaxel unido a proteínas (por ejemplo, ABRAXANE®). Los ejemplos de agentes de paclitaxel incluyen paclitaxel unido a nanopartículas de albúmina (ABRAXANE, comercializado por Abraxis Bioscience), paclitaxel unido a ácido docosahexaenoico (DHA-paclitaxel, Taxoprexin, comercializado por Protarga), paclitaxel unido a poliglutamato (PG-paclitaxel, paclitaxel poliglumex, CT-2103, XYOTAX, comercializado por Cell Therapeutic), el profármaco activado por tumor (TAP), ANG105 (Angiopep-2 unido a tres moléculas de paclitaxel, comercializado por ImmunoGen), paclitaxel-EC-1 (paclitaxel unido al péptido EC-1 de reconocimiento de erbB2; véase Li et al., Biopolymers (2007) 87:225-230), y paclitaxel conjugado con glucosa (p. ej., 2'-paclitaxel metil 2-glucopiranosil succinato, véase Liu et al., (2007) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 17:617-620).

[0667] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con una inmunoterapia celular (por ejemplo, Provenge (por ejemplo, Sipuleucel)), y opcionalmente en combinación con ciclofosfamida.

[0668] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento del cáncer de páncreas incluyen un agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel o un agente de paclitaxel (por ejemplo, una formulación de paclitaxel como TAXOL, una nanopartícula estabilizada con albúmina formulación de paclitaxel (p. ej., ABRAXANE) o una formulación de paclitaxel liposomal); gemcitabina (p. ej., gemcitabina sola o en combinación con AXP107-11); otros agentes quimioterapéuticos como oxaliplatino, 5-fluorouracilo, capecitabina, rubitecán, clorhidrato de epirrubicina, NC-6004, cisplatino, docetaxel (p. ej., TAXOTERE), mitomicina C, ifosfamida; interferón; inhibidor de tirosina quinasa (p. ej., inhibidor de EGFR (p. ej., erlotinib, panitumumab, cetuximab, nimotuzumab); inhibidor del receptor HER2/neu (p. ej., trastuzumab); inhibidor dual de quinasa (p. ej., bosutinib, saracatinib, lapatinib, vandetanib); inhibidor multiquinasa (p. ej.,, sorafenib, sunitinib, XL184, pazopanib); inhibidor de VEGF (p. ej., bevacizumab, AV-951, brivanib); radioinmunoterapia (p. ej., XR303); vacuna contra el cáncer (p. ej., GVAX, péptido de survivina); inhibidor de la COX-2 (p. ej., celecoxib); inhibidor del receptor de IGF-1 (p. ej., AMG 479, MK-0646); inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus, temsirolimus), inhibidor de IL^{- 6}(p. ej., CNTO 328); inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (p. ej., P276-00, UCN-01); compuesto dirigido por el metabolismo energético alterado (AEMD) (p. ej., CPI-613); inhibidor de HDAC (p. ej., vorinostat); agonista del receptor TRAIL 2 (TR-2) (p. ej., conatumumab); inhibidor de MEK (p. ej.,, AS703026, selumetinib, GSK1120212); inhibidor dual de cinasa Raf/MEK (p. ej., RO5126766), inhibidor de señalización de Notch (p. ej., MK0752), anticuerpo monoclonal-proteína de fusión de anticuerpo (p. ej., L19IL2), curcumina; HSP90 inhibidor (p. ej., tanespimicina, STA-9090), rIL-2; denileucina diftitox; inhibidor de topoisomerasa 1 (p. ej., irinotecán, PEP02); estatina (p. ej., simvastatina), inhibidor del factor VI I a (p. ej., PCI-27483), inhibidor de AKT (p. ej., RX-0201), profármaco activado por hipoxia (p. ej., TH-302), clorhidrato de metformina, inhibidor de gamma-secretasa (p. ej., R04929097), inhibidor de reductasa ribonucleótido (p. ej., 3-AP), inmunotoxina (p. ej., HuC242-DM4), inhibidor de PARP (p. ej., KU-0059436, veliparib), CTLA -4 inhibidor (p. ej., CP-675,206, ipilimumab), terapia con AdV-tk, inhibidor del proteosoma (p. ej., bortezomib (Velcade), NPI-0052), tiazolidinediona (p. ej., pioglitazona), CNF-1C; Inhibidor de aurora cinasa (p. ej., R763/AS703569), inhibidor de CTGF (p. ej., FG-3019), siG12D LODER y radioterapia (p. ej., tomoterapia, radiación estereotáctica, terapia de protones), cirugía y una combinación de los mismos. En ciertas formas de realización, se puede usar una combinación de paclitaxel o un agente de paclitaxel y gemcitabina con los anticuerpos de la invención.

[0669] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) incluyen fármacos aprobados para el tratamiento de SCLC tales como metotrexato (Folex®, Mexate®), everolimus (Afinitor®), clorhidrato de doxorrubicina, fosfato de etopósido (Etopophos®), clorhidrato de topotecán (Hycamtin®), clorhidrato de mecloretamina (Mustargen®), clorhidrato de topotecán. Otros agentes terapéuticos que se pueden utilizar son carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, irinotecán, gemcitabina, liposomal SN-38, bendamustina, temozolomida, belotecán, NK012, FR901228, flavopiridol), inhibidor de la tirosina cinasa (p. ej., inhibidor de EGFR (p. ej., erlotinib, gefitinib, cetuximab, panitumumab), inhibidor de multicinasa (p. ej., sorafenib, sunitinib), inhibidor de VEGf (p. ej., bevacizumab, vandetanib), vacuna contra el cáncer (p. ej., GVAX); inhibidor de Bcl^{- 2}(p. ej., oblimersen sódico, a BT-263), proteasoma inhibidor (p. ej., bortezomib (Velcade), NPI-0052), paclitaxel o un agente de paclitaxel; docetaxel, inhibidor del receptor de IGF-1 (p. ej., AMG 479), inhibidor de HGF/s F (p. ej., AMG 102, MK-^{0 646}), cloroquina, inhibidor de la quinasa Aurora (p. ej., MLN8237), radioinmunoterapia (p. ej., TF2), inhibidor de HSP90 (p. ej., tanespimicina, STA-9090), inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus), anticuerpo biespecífico Ep-CAM/CD3 (p. ej., MT110), inhibidor de CK-2 (p. ej., CX-4945), inhibidor de HDAC (p. ej., belinostat), antagonista de SMO (p. ej., b Ms 833923), vacuna peptídica contra el cáncer y radioterapia (por ejemplo, radioterapia de intensidad modulada (IMRT), radioterapia hipofraccionada, radioterapia guiada por hipoxia), cirugía y combinaciones de las mismas.

[0670] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas incluyen fármacos aprobados para el tratamiento de NSCLC que incluyen metotrexato (Folex®, Mexate®), paclitaxel (Abraxane®), afatinib (Gilotrif®), everolimus (Afinitor®), alectinib (Alecensa®), pemetrexed disódico (Alimta®), bevacizumab (Avastin®), carboplatino, ceritinib (Zykadia®), crizotinib (Xalkori®), ramucirumab (Cyramza®), docetaxel, everolimus (Afinitor®),gefitinib (Iressa®), dimaleato de afatinib (Gilotrif®), clorhidrato de gemcitabina (Gmezar®), pembrolizumab (Keytruda®), clorhidrato de mecloretamina (Mustargen®), tartrato de vinorelbina (Navelbine®), necitumumab (Portrazza®), nivolumab (Opdivo®), osimertinib, paclitaxel (Taxol®), carboplatino, pemetrexed disódico, ramucirumab (Cyramza®), osimertinib (Tagrisso®). Otros agentes terapéuticos que se pueden utilizar son vinorelbina, cisplatino, docetaxel, pemetrexed disódico, etopósido, gemcitabina, carboplatino, liposomal SN-38, TLK286, temozolomida, topotecan, pemetrexed disódico, azacitidina, irinotecan, tegafur-gimeracil-oteracil potásico, sapacitabine), inhibidor de la tirosina cinasa (p. ej., inhibidor de EGFR (p. ej., erlotinib, gefitinib, cetuximab, panitumumab, necitumumab, PF-00299804, nimotuzumab, RO5083945), inhibidor de MET (p. ej., PF-02341066, ARQ 197), inhibidor de la cinasa PI3K (p. ej., XL147, GDC-0941), inhibidor dual de quinasa Raf/MEK (p. ej., RO5126766), inhibidor dual de quinasa PI3K/mTOR (p. ej., XL765), inhibidor SRC (p. ej., dasatinib), inhibidor dual (p. ej., BIBW 2992, GSK1363089, ZD6474, AZD0530, AG-013736, lapatinib, MEHD7945A, linifanib), inhibidor de multicinasa (p. ej., sorafenib, sunitinib, pazopanib, AMG 706, XL184, MGCD265, BMS-690514, R935788), inhibidor de VEGF (p. ej., endostar, endostatina, bevacizumab, cediranib, BIBF 1120, axitinib, tivozanib, AZD2171), vacuna contra el cáncer (p. ej., liposoma BLP25 vacuna, GVAX, ADN recombinante y adenovirus que expresa la proteína L523S), inhibidor de Bcl-2 (p. ej., oblimersen sódico), inhibidor del proteasoma (p. ej., bortezomib, carfilzomib, NPI-0052, MLN9708), paclitaxel o un agente de paclitaxel, docetaxel, inhibidor del receptor IGF-1 (p. ej., cixutumumab, MK-0646, OSI 906, Cp -751,871, BIIB022), hidroxicloroquina, inhibidor de HSP90 (p. ej., tanespimicina, STA-9090, AUY922, XL888), inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus, temsirolimus, ridaforolimus), anticuerpo biespecífico Ep-CAM/CD3 (p. ej., MT110), inhibidor de CK-2 (p. ej., CX-4945), inhibidor de HDAC (p. ej., MS 275, LBH589, vorinostat, ácido valproico, FR901228), inhibidor de d Hf R (p. ej.,, pralatrexato), retinoide (p. ej., bexaroteno, tretinoína), conjugado de anticuerpo y fármaco (p. ej., SGN-15), bisfosfonato (p. ej., ácido zoledrónico), vacuna contra el cáncer (p. ej., belagenpumatucel-L), heparina de bajo peso molecular (h Bp M) (p. ej., tinzaparina, enoxaparina), GSK1572932A, melatonina, talactoferrina, dimesna, inhibidor de la topoisomerasa (p. ej., amrubicina, etopósido, karenitecina), nelfinavir, cilengitida, inhibidor de ErbB3 (p. ej., MM-121, U3-1287), inhibidor de survivina (p. ej., YM155, LY2181308), mesilato de eribulina, inhibidor de la COX-2 (p. ej., celecoxib), pegfilgrastim, inhibidor de la cinasa tipo 1 tipo Polo (p. ej., BI 6727), agonista del receptor TRAIL 2 (TR-2) (p. ej., CS-1008), péptido CNGRC (SEQ ID NO: 225)-conjugado de TNF alfa, dicloroacetato (DCA), inhibidor de HGF (p. ej., SCH 900105), SAR240550, agonista PPAR-gamma (p. ej., CS-7017), inhibidor de gamma-secretasa (p. ej., RO4929097), terapia epigenética (p. ej., 5-azacitidina), nitroglicerina, inhibidor de MEK (p. ej., AZD6244), inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (p. ej., UCN -01), colesterol-Fusl, agente antitubulina (p. ej., E7389), inhibidor de farnesil-OH-transferasa (p. ej., lonafarnib), inmunotoxina (p. ej., BB-10901, SS1 (dsFv) PE38), fondaparinux, disruptor vascular (p. ej., AVE8062), inhibidor de PD-L1 (p. ej., MDX-1105, MDX-1106), beta-glucano, NGR-hTNF, EMD 521873, inhibidor de MEK (p. ej., GSK1120212), análogo de epotilona (p. ej., ixabepilona), inhibidor de kinesinhuso (p. ej., 4SC-205), agente dirigido a los telómeros (p. ej., KML-001), P70 pat inhibidor de hway (p. ej., LY2584702), inhibidor de AKT (p. ej., MK-2206), inhibidor de la angiogénesis (p. ej., lenalidomida), inhibidor de la señalización de Notch (p. ej., OMP-21M18), anticuerpo biespecífico EGFR/c-Met EM-1 como se describe en US2014/0141000A1, radioterapia, cirugía y combinaciones de los mismos.

[0671] Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento del cáncer de ovario incluyen medicamentos aprobados para el tratamiento del cáncer de ovario, como melfalán (Alkeran®), bevacizumab (Avastin®), carboplatino, ciclofosfamida (Clafen®, Cytoxan®), clisplatino, clorhidrato de doxorrubicina, clorhidrato de gemcitabina (Gemzar®), clorhidrato de topotecán (Hycamtin®), Olaparib (Lynparza®), carboplatino, cisplatino, paclitaxel (Taxol®), tiotepa y clorhidrato de topotecán. Otros agentes terapéuticos que se pueden utilizar son ifosfamida, olaparib, oxaliplatino, pemetrexed disódico, SJG-136, etopósido, decitabina; inmunoterapia (p. ej., APC8024, oregovomab, OPT-821), inhibidor de tirosina quinasa (p. ej., inhibidor de EGFR (p. ej., erlotinib), inhibidor dual (p. ej., E7080), inhibidor multiquinasa (p. ej., AZD0530, JI-101, sorafenib, sunitinib, pazopanib), inhibidor de VEg F (p. ej., bevacizumab, BIBF 1120, cediranib, AZD2171), inhibidor de PDGFR (p. ej., IMC-3G3), paclitaxel, inhibidor de topoisomerasa (p. ej., karenitecina, irinotecán), inhibidor de HDAC (p. ej., valproato, vorinostat), inhibidor del receptor de folato (p. ej., farletuzumab), inhibidor de la angiopoyetina (p. ej., AMG 386), análogo de la epotilona (p. ej., ixabepilona), inhibidor del proteosoma (p. ej., carfilzomib), inhibidor del receptor de IGF-1 (p. ej., OSI 906, AMG 479), PAr P (p. ej., veliparib, a G014699, iniparib, MK-4827), inhibidor de la quinasa Aurora (p. ej., MLN8237, ENMD-2076), inhibidor de la angiogénesis (p. ej., lenalidomida), inhibidor de DHFR (p. ej., pralatrexato), agente radioinmunoterapéutico (p. ej., Hu3S193), estatina (p. ej., lovastatina), inhibidor de la topoisomerasa 1 (p. ej., NKTR-102), vacuna contra el cáncer (p. ej., vacuna de péptidos largos sintéticos p53, autol vacuna OC-CD angosta), inhibidor de mTOR (p. ej., temsirolimus, everolimus), inhibidor de BCR/ABL (p. ej., imatinib), antagonista del receptor ET-A (p. ej., ZD4054), agonista del receptor TRAIL 2 (TR-2) (p. ej., CS-1008), inhibidor de HGF/SF (p. ej., AMG 102), Eg En -001, inhibidor de la quinasa 1 similar a Polo (p. ej., B i 6727), inhibidor de gammasecretasa (p. ej., RO4929097), inhibidor de Wee-1 (p. ej., MK-1775), agente antitubulina (p. ej., vinorelbina, E7389), inmunotoxina (p. ej., denileucina diftitox), SB-485232, agente disruptor vascular (p. ej., AVE8062), inhibidor de integrina (p. ej., EMD 525797), inhibidor del huso de la cinesina (p. ej., 4SC-205), revlimid, inhibidor de HER2 (p. ej., MGAH22), inhibidor de ErrB3 (p. ej., MM-121), radioterapia y combinaciones de los mismos.

[0672] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de un mieloma incluyen uno o más agentes de quimioterapia u otros anticancerosos (por ejemplo, análogos de talidomida, por ejemplo, lenalidomida), HSCT (Cook, (2008) J Manag Care Pharm. 14(7 Suppl): 19-25), un anticuerpo anti-TIM-3 (Hallett et al, (2011) J of American Society for Blood and Marrow Transplantation 17(8): 1133 145), células dendríticas pulsadas con antígeno tumoral, fusiones (p. ej., electrofusiones) de células tumorales y células dendríticas, o vacunación con inmunoglobulina idiotípica producida por células plasmáticas malignas (revisado en Yi (2009) Cancer J 15(6):502-10).

[0673] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de un cáncer renal, por ejemplo, un carcinoma de células renales (CCR) o CCR metastásico incluyen fármacos aprobados para el tratamiento de CCR, incluido everolimus (Afinitor®), aldesleucina, bevacizumab (Avastin®), axitinib (Inlyta®), cabozantinib-S-malato (Cabometyx®), aldesleucina (Proleukin®), mesilato de lenvatinib (Lenvima®), tosilato de sorafenib (Nexavar®), nivolumab (Opdivo®), clorhidrato de pazopanib, tosilato de sorafenib, sunitinib (Sutent®), temsirolimus (Torisel®) y clorhidrato de pazopanib (Votrient®). Otros agentes terapéuticos que pueden usarse son un agente dirigido (por ejemplo, un inhibidor de VEGF como un anticuerpo monoclonal contra VEGF, por ejemplo, bevacizumab, un inhibidor de tirosina quinasa de VEGF como sorafenib, axitinib y pazopanib.

[0674] Agentes terapéuticos ejemplares que pueden ser utilizados en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de una leucemia mielógena crónica (LMA) incluyen un quimioterapéutico (p. ej., citarabina, hidroxiurea, clofarabina, melfalán, tiotepa, fludarabina, busulfán, etopósido, cordicepina, pentostatina, capecitabina, azacitidina, ciclofosfamida, cladribina, topotecan), inhibidor de la tirosina quinasa (p. ej., inhibidor de BCR/ABL (p. ej., imatinib, nilotinib), inhibidor dual (p. ej., dasatinib, bosutinib), inhibidor multiquinasa (p. ej., DCC-2036, ponatinib, sorafenib, sunitinib, RGB-286638), interferón alfa, esteroides, agente apoptótico (p. ej., omacetaxina mepesuccinato), inmunoterapia (p. ej., células T similares a Th1 de memoria CD4+ alogénicas/anti-CD3/anti-CD28 unido a micropartículas, asesino autólogo inducido por citoquinas (CIK), AHN-12), agente dirigido a CD52 (p. ej., alemtuzumab), inhibidor de HSP90 (p. ej., tanespimicina, STA-9090, AUY922, XL888), inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus), antagonista de SMO (p. ej., BMS 833923), inhibidor de ribonucleótido reductasa (p. ej., 3-AP), inhibidor de JAK-2 (p. ej., INCB018424), hidroxicloroquina, retinoide (p. ej., fenretinida), inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (p. ej., UCN-01), inhibidor de HDAC (p. ej., belinostat, vorinostat, JNJ-26481585), inhibidor de PARP (p. ej., veliparib), antagonista de MDM2 (p. ej., RO5045337), inhibidor de la quinasa Aurora B (p. ej., TAK-901), radioinmunoterapia (p. ej., anticuerpo anti-CD33 marcado con actinio-225 HuM 195), inhibidor de Hedgehog (p. ej., PF-04449913), inhibidor de STAT3 (p. ej., OPB-31121), KB004, vacuna contra el cáncer (p. ej., AG858), trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, radioterapia y combinaciones de los mismos.

[0675] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de una leucemia linfocítica crónica (LLC) incluyen un agente quimioterapéutico (p. ej., fludarabina, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, clorambucilo, bendamustina, clorambucilo, busulfano, gemcitabina, melfalán, pentostatina, mitoxantrona, 5-azacitidina, pemetrexed disódico), inhibidor de tirosina cinasa (p. ej., inhibidor de EGFR (p. ej., erlotinib), inhibidor de BTK (p. ej., PCI-32765 (ibrutinib), inhibidor de multicinasa (p. ej., MGCD265, RGB-286638), agente dirigido a CD-20 (p. ej., rituximab, ofatumumab, RO5072759, LFB-R603), agente dirigido a CD52 (p. ej., alemtuzumab), prednisolona, darbepoetina alfa, lenalidomida, inhibidor de Bcl-2 (p. ej., ABT-263), inmunoterapia (p. ej., células T alogénicas CD4+ de memoria similares a Th1/anti-CD3/anti-CD28 unido a micropartículas, células asesinas inducidas por citoquinas (CIK) autólogas, inhibidor de HDAC (p. ej., vorinostat, ácido valproico, LBH589, JNJ-26481585, AR-42), inhibidor de X iAP (p. ej., AEG35156), agente dirigido a CD-74 (p. ej., milatuzumab), inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus), AT-101, inmunotoxina (p. ej., CAT-8015, anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2)), agente dirigido a CD37 (p. ej., TRU-016), radioinmunoterapia (p. ej., 131-tositumomab), hidroxicloroquina, perifosina, inhibidor de SRC (p. ej., dasatinib), talidomida, inhibidor delta de PI3K (p. ej., CAL-101), retinoide (p. ej., fenretinida), antagonista de MDM2 (p. ej., RO5045337), plerixafor, Inhibidor de la quinasa Aurora (p. ej., MLN8237, TAK-901), inhibidor del proteasoma (p. ej., bortezomib), agente dirigido a CD-19 (p. ej., MEDI-551, m Or 208), inhibidor de MEK (p. ej., ABT-348), inhibidor de JAK-2 (p. ej., INCB018424), profármaco activado por hipoxia (p. ej., TH-302), paclitaxel o un agente de paclitaxel, inhibidor de h Sp 90, inhibidor de AKT (p. ej., MK2206), inhibidor de h Mg -CoA (p. ej., simvastatina), GNKG186, radioterapia, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre y una combinación de los mismos.

[0676] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de una leucemia linfocítica aguda (LLA) incluyen un agente quimioterapéutico (p. ej., prednisolona, dexametasona, vincristina, asparaginasa, daunorrubicina, ciclofosfamida, citarabina, etopósido, tioguanina, mercaptopurina, clofarabina, anamicina liposomal, busulfán, etopósido, capecitabina, decitabina, azacitidina, topotecán, temozolomida), inhibidor de tirosina quinasa (p. ej., inhibidor de BCR/ABL (p. ej., imatinib, nilotinib), ON 01910.Na, inhibidor de multiquinasa (p. ej., sorafenib), agente dirigido a CD-20 (p. ej., rituximab), agente dirigido a CD52 (p. ej., alemtuzumab), inhibidor de HSP90 (p. ej., STA-9090), inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus, rapamicina), inhibidor de JAK-2 (p. ej., INCB018424), inhibidor del receptor HER2/neu (p. ej., trastuzumab), inhibidor del proteasoma (p. ej., bortezomib), metotrexato, asparaginasa, agente dirigido a CD-22 (p. ej., epratuzumab, inotuzumab), inmunoterapia (p. ej., asesino autólogo inducido por citoquinas células (CIK), AHN-12), blinatumomab, inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (p. ej., UCN-01), agente dirigido a CD45 (p. ej., BC8), antagonista de MDM2 (p. ej., RO5045337), inmunotoxina (p. ej., CAT-8015, DT2219ARL), inhibidor de HDAC (p. ej., JNJ-26481585), JVRS-100, paclitaxel o un agente de paclitaxel, inhibidor de STAT3 (p. ej., OPB-31121), inhibidor de PARP (p. ej., veliparib), EZN-2285, radioterapia, esteroide, hueso trasplante de médula, trasplante de células madre o una combinación de los mismos.

[0677] Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden usarse en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de una leucemia mieloide aguda (LMA) incluyen un agente quimioterapéutico (p. ej., citarabina, daunorrubicina, idarrubicina, clofarabina, decitabina, vosaroxina, azacitidina, clofarabina, ribavirina, CPX-351, treosulfán, elacitarabina, azacitidina), inhibidor de tirosina cinasa (p. ej., inhibidor de BCR/ABL (p. ej., imatinib, nilotinib), ON 01910.Na, inhibidor de multicinasa (p. ej., midostaurina, SU 11248, quizartinib, sorafinib), inmunotoxina (p. ej., gemtuzumab ozogamicina), proteína de fusión DT388IL3, inhibidor de HDAC (p. ej., vorinostat, LBH589), plerixafor, inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus), inhibidor de SRC (p. ej., dasatinib), inhibidor de HSP90 (p. ej., STA-9090), retinoide (p. ej., bexaroteno, inhibidor de la cinasa Aurora (p. ej., BI 811283), inhibidor de JAK-2 (p. ej., INCB018424), inhibidor de la cinasa similar a Polo (p. ej., BI 6727), cenersen, agente dirigido a CD45 (p. ej., BC8), inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (p. ej., UCN-01), antagonista de MDM2 (p. ej., RO5045337), inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus), LY573636-sodio, ZRx-101, MLN4924, lenalidomida, inmunoterapia (p. ej., AHN-12), diclorhidrato de histamina, radioterapia, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre y una combinación de los mismos.

[0678] Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de un mieloma múltiple (MM) incluyen un agente quimioterapéutico (p. ej., melfalán, amifostina, ciclofosfamida, doxorrubicina, clofarabina, bendamustina, fludarabina, adriamicina, SyB L-0501), talidomida, lenalidomida, dexametasona, prednisona, pomalidomida, inhibidor del proteasoma (p. ej., bortezomib, carfilzomib, MLN9708), vacuna contra el cáncer (p. ej., GVAX), agente de direccionamiento CD-40 (p. ej., SGN-40, CHIR- 12.12), perifosina, ácido zoledrónico, inmunoterapia (p. ej., MAGE-A3, NYESO-1, HuMax-CD38), inhibidor de HDAC (p. ej., vorinostat, LBH589, AR-42), aplidina, inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (p. ej., PD -0332991, dinaciclib), trióxido de arsénico, CB3304, inhibidor de HSP90 (p. ej., KW-2478), inhibidor de tirosina quinasa (p. ej., inhibidor de EGFR (p. ej., cetuximab), inhibidor multiquinasa (p. ej., AT9283), inhibidor de VEGF (p. ej., bevacizumab), plerixafor, inhibidor de MEK (p. ej., AZD6244), IPH2101, atorvastatina, inmunotoxina (p. ej., BB-10901), NPI-0052, radioinmunoterapéutico (p. ej., itrio Y 90 ibritumomab tiuxetan), inhibidor de STAT3 (p. ej., OPB-31121), MLN4924, inhibidor de la quinasa Aurora (p. ej., ENMD-2076), IMGN901, ACE-041, inhibidor de Ck -2 (p. ej., CX-4945), un anticuerpo anti-CD38 (p. ej., DARZALEX® (daratumumab), radioterapia, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre y una combinación de los mismos.

[0679] Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden usarse en combinación con los anticuerpos de la invención para el tratamiento de un cáncer de próstata son fármacos aprobados para el tratamiento del cáncer de próstata, tales como acetato de abiraterona (Zytiga®), bicalutamida (Casodex®), cabazitaxel (Jevtana®), estrógenos conjugados (Premarin®), estradiol (Estrace®), valerato de estradiol (Delestrogen®), estrógenos esterificados (Menest®), degarelix (Firmagon®), docetaxel (Taxotere®), enzalutamida (Xtandi®), flutamida, acetato de goserelina (Zoladex®), cabazitaxel (Jevtana®), acetato de leuprolida (Lupron®), clorhidrato de mitoxantrona, nilutamida (Nilandron®), sipuleucel-T (Provenge®) y dicloruro de radio 223 (Xofigo®). Otros medicamentos que se pueden usar incluyen un agente quimioterapéutico (p. ej., carboplatino, fludarabina), terapia hormonal (p. ej., acetato de ciproterona, ketoconazol, aminoglutetimida, abarelix, degarelix, leuprolida, triptorelina, buserelina), inhibidor de la tirosina cinasa (p. ej., inhibidor dual de la cinasa (p. ej., lapatanib), inhibidor multicinasa (p. ej., sorafenib, sunitinib), inhibidor de VEGF (p. ej., bevacizumab), TAK-700, vacuna contra el cáncer (p. ej., BPX-101, PEP223), lenalidomida, TOK-001, receptor de IGF-1 (p. ej., cixutumumab), TRC105, inhibidor de la cinasa Aurora A (p. ej., MLN8237), inhibidor del proteasoma (p. ej., bortezomib), OGX-011, radioinmunoterapia (p. ej., HuJ591-GS), inhibidor de HDAC (p. ej., ácido valproico, SB939, LBH589), hidroxicloroquina, inhibidor de mTOR (p. ej., everolimus), lactato de dovitinib, diindolilmetano, efavirenz, OGX-427, genisteína, IMC-3G3, bafetinib, CP-675.206, radioterapia, cirugía o una combinación de los mismos.

[0680] Agentes terapéuticos que pueden usarse en combinación con los anticuerpos de la invención para tratar tratamiento de un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) incluyen metotrexato (Folex®, Mexate®), bleomicina (Blenoxane®), docetaxel (Taxotere®), erbitux (Cetuximab®), hidroxiurea (Hydrea®) o pembrolizumab (Keytruda®),

[0681] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un agonista de TLR.

[0682] En algunas formas de realización, el agonista de TLR3 es un agonista de TLR4.

[0683] En algunas formas de realización, el agonista de TLR3 es un agonista de TLR7/8.

[0684] Los agonistas de TLR ejemplares son Pam3Cys, un agonista de TLR-1/2; CFA, un agonista de TLR-2; MALP2, un agonista de TLR-2; Pam2Cys, un agonista de TLR-2; FSL-1, un agonista de TLR-2; Hib-OMPC, un agonista de TLR-2; ácido polirribosínico:polirribocítido (Poly I:C), un agonista de TLR-3; ácido poliadenosina-poliuridílico (poli AU), un agonista de TLR-3; ácido poliinosínico-policitidílico estabilizado con poli-L-lisina y carboximetilcelulosa (Hiltonol®), un agonista de TLR-3; monofosforil lípido A (MPL), un agonista de TLR-4; LPS, un agonista de TLR-4; flagelina bacteriana, un agonista de TLR-5; sialil-Tn (STn), un carbohidrato asociado con la mucina MUCI en varias células cancerosas humanas y un agonista de TLR-4; imiquimod, un agonista de TLR-7; resiquimod, un agonista de TLR-7/8; loxoribina, un agonista de TLR-7/8; y dinucleótido CpG no metilado (CpG-ODN), un agonista de TLR-9.

[0685] Los agonistas de TLR4 ejemplares son anticuerpos agonistas que se unen específicamente a TLR4.

[0686] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un anticuerpo que se une a CSF-1R.

[0687] Los ejemplos de anticuerpos que se unen a CSF-1R son los descritos en Publicación de Patente Int. N° WO2013132044.

[0688] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con el agonista de LXRp.

[0689] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un agonista de DR4.

[0690] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un agonista de DR5.

[0691] Los agonistas de DR4 y DR5 adecuados se describen, por ejemplo, en Publicación de Patente Int. N° WO2014159562.

[0692] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-galectina 1.

[0693] Los ejemplos de anticuerpos anti-galectina 1 que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención son los descritos en Publicación de Patente Int. N° WO2015013389.

[0694] En alguna forma de realización descrita en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un inhibidor de BTK.

[0695] En algunas formas de realización, el inhibidor de BTK es IMBRUVICA® (ibrutinib).

[0696] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-HER2.

[0697] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un anticuerpo anti-CD20.

[0698] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después de) el trasplante de médula ósea, terapia de ablación de células T usando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida y/o anticuerpos como OKT3 o CAMPATh . En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención pueden administrarse después de una terapia de eliminación de células B, como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una forma de realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con quimioterapia de dosis alta seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas formas de realización, tras el trasplante, los sujetos reciben los anticuerpos de la invención.

[0699] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran antes o después de la cirugía.

[0700] En algunas formas de realización descritas en el presente documento, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con radioterapia.

[0701] La radioterapia se puede administrar usando varios métodos, que incluyen terapia de haz externo, radioterapia interna, radiación de implante, radiocirugía estereotáctica, radioterapia sistémica, radioterapia y braquiterapia intersticial permanente o temporal. La terapia de haz externo implica radioterapia conformada tridimensional en la que se diseña el campo de radiación, radiación local (p. ej., radiación dirigida a un objetivo u órgano preseleccionado) o radiación enfocada. La radiación enfocada puede seleccionarse entre radiocirugía estereotáctica, radiocirugía estereotáctica fraccionada o radioterapia de intensidad modulada. La radiación enfocada puede tener un haz de partículas (protones), un acelerador lineal (rayos X) de cobalto-60 (fotones) como fuente de radiación (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/177624). "Braquiterapia" se refiere a la radioterapia administrada por un material radiactivo espacialmente confinado insertado en el cuerpo en o cerca de un tumor u otro sitio de enfermedad proliferativa del tejido, e incluye la exposición a isótopos radiactivos (p. ej., At-211, 1-131, 1- 125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 e isótopos radiactivos de Lu). Las fuentes de radiación adecuadas para usar como acondicionador celular incluyen tanto sólidos como líquidos. La fuente de radiación puede ser un radionúclido, como 1-125, 1-131, Yb-169, Ir-192 como fuente sólida, 1-125 como fuente sólida u otros radionúclidos que emiten fotones, partículas beta, radiación gamma, u otros rayos terapéuticos. El material radiactivo también puede ser un fluido elaborado a partir de cualquier solución de radionúclido(s), por ejemplo, una solución de I-125 o 1-131, o se puede producir un fluido radiactivo usando una suspensión de un fluido adecuado que contenga pequeñas partículas de radionúclidos sólidos, tales como Au-198, Y-90. El o los radionúclidos pueden estar incorporados en un gel o en microesferas radiactivas.

[0702] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Sin estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que el uso combinado de bloqueo de PD-1 y/o TIM-3 y quimioterapia se ve facilitado por la muerte celular que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, que puede resultar en niveles incrementados de antígeno tumoral en la vía de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden resultar en sinergia con el bloqueo de PD-1 y/o TIM-3 a través de la muerte celular son la radiación, la cirugía y la privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con el bloqueo de PD-1 y/o TIM-3. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de las células tumorales, lo que puede alimentar el antígeno tumoral en las vías de presentación del antígeno del huésped.

[0703] Los anticuerpos PD-1 monoespecíficos de la invención también pueden usarse en combinación con anticuerpos biespecíficos. Se pueden usar anticuerpos biespecíficos para atacar dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado anticuerpos biespecíficos anti-receptor Fc/anti-antígeno tumoral (p. ej., Her-2/neu) para dirigir los macrófagos a los sitios del tumor. El direccionamiento biespecífico puede activar de manera más eficaz las respuestas específicas del tumor. El brazo de células T de estas respuestas se aumentaría mediante el uso del bloqueo de PD-1 y/o TIM-3. Alternativamente, el antígeno puede administrarse directamente a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

[0704] Los anticuerpos de la invención se pueden usar en formas no conjugadas o conjugadas con un segundo agente, por ejemplo, un fármaco citotóxico, un radioisótopo o una proteína, por ejemplo, una toxina proteica o una proteína viral. Las moléculas de anticuerpo se pueden usar para administrar una variedad de agentes terapéuticos, por ejemplo, un resto citotóxico, por ejemplo, un fármaco terapéutico, un radioisótopo, moléculas de origen vegetal, fúngico o bacteriano, o proteínas biológicas (por ejemplo, toxinas de proteínas) o partículas (p. ej., partículas virales recombinantes, p. ej., a través de una proteína de cubierta viral), o mezclas de los mismos.

Enfermedades infecciosas

[0705] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método de tratamiento de un sujeto que ha estado expuesto a toxinas o patógenos particulares con los anticuerpos de la invención durante un tiempo suficiente para tratar al sujeto.

[0706] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad infecciosa, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención al sujeto que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar la enfermedad infecciosa.

[0707] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar a un sujeto que tiene una infección viral, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención al sujeto que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar la infección vírica.

[0708] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar a un sujeto que tiene una infección bacteriana, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención al sujeto que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar la infección bacteriana.

[0709] La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para usar en un método para tratar a un sujeto que tiene una infección fúngica, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención al sujeto que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar la infección por hongos.

[0710] En el tratamiento de la infección (p. ej., aguda y/o crónica), la administración de los anticuerpos de la invención puede combinarse con tratamientos convencionales además de o en lugar de estimular las defensas inmunitarias naturales del huésped frente a la infección. Las defensas inmunitarias naturales del huésped contra la infección incluyen inflamación, fiebre, defensa del huésped mediada por anticuerpos, defensas del huésped mediadas por linfocitos T, incluida la secreción de linfocinas y células T citotóxicas (especialmente durante la infección viral), lisis y opsonización mediadas por el complemento (fagocitosis facilitada) y fagocitosis. La capacidad de los anticuerpos de la invención para reactivar las células T disfuncionales sería útil para tratar infecciones crónicas, en particular aquellas en las que la inmunidad mediada por células es importante para una recuperación completa.

[0711] De manera similar a su aplicación a tumores como se discutió anteriormente, los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o como un adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmune a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser útil incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz, o patógenos para los que las vacunas convencionales no son completamente eficaces. Estos incluyen VIH, Hepatitis (A, B y C), Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus y Pseudomonas Aeruginosa. El bloqueo de PD-1 y/o TIM-3 puede ser útil contra infecciones establecidas por agentes como el VIH que presentan antígenos alterados en el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de los anticuerpos de la invención, provocando así una fuerte respuesta de células T que no se ve amortiguada por señales negativas a través de PD-1 o TIM-3.

Virus

[0712] Para infecciones resultantes de causas virales, los anticuerpos de la invención pueden combinarse con terapias estándar para tratar infecciones virales. Estas terapias estándar varían según el tipo de virus, aunque en casi todos los casos, la administración de suero humano que contiene anticuerpos (por ejemplo, IgA, IgG) específicos para el virus puede ser eficaz.

[0713] Los ejemplos de virus patógenos que causan infecciones que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen VIH, hepatitis (A, B o c ), virus del herpes (p. ej., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, virus de la poliomielitis, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

[0714] En algunas formas de realización, la infección por el virus es una infección por el virus de la influenza. La infección por influenza puede provocar fiebre, tos, mialgia, dolor de cabeza y malestar, que a menudo ocurren en epidemias estacionales. La influenza también se asocia con varios trastornos posinfecciosos, como encefalitis, miopericarditis, síndrome de Goodpasture y síndrome de Reye. La infección por influenza también suprime las defensas antibacterianas pulmonares normales, de modo que los pacientes que se recuperan de la influenza tienen un mayor riesgo de desarrollar neumonía bacteriana. Las proteínas de la superficie del virus de la influenza muestran una marcada variación antigénica, como resultado de la mutación y la recombinación. Por tanto, los linfocitos T citolíticos son el principal vehículo del huésped para la eliminación del virus después de la infección. La influenza se clasifica en tres tipos principales: A, B y C. La influenza A es única porque infecta tanto a humanos como a muchos otros animales (p. ej., cerdos, caballos, pájaros y focas) y es la causa principal de la influenza pandémica. Una célula puede ser infectada por dos cepas de influenza A diferentes, los genomas de ARN segmentados de dos tipos de virus parentales se mezclan durante la replicación para crear un replicante híbrido, lo que da como resultado nuevas cepas epidémicas. La influenza B no se replica en animales y, por lo tanto, tiene menos variación genética y la influenza C tiene un solo serotipo.

[0715] La mayoría de las terapias convencionales son paliativas de los síntomas resultantes de la infección, mientras que la respuesta inmune del huésped realmente elimina la enfermedad. Sin embargo, ciertas cepas (p. ej., influenza A) pueden causar enfermedades más graves y la muerte. La gripe A puede tratarse tanto clínica como profilácticamente mediante la administración de los inhibidores de aminas cíclicas amantadina y rimantadina, que inhiben la replicación viral. Sin embargo, la utilidad clínica de estos medicamentos es limitada debido a la incidencia relativamente alta de reacciones adversas, su espectro antiviral estrecho (solo influenza A) y la propensión del virus a volverse resistente. La administración de anticuerpos IgG séricos contra las principales proteínas de superficie de la influenza, hemaglutinina y neuraminidasa, puede prevenir la infección pulmonar, mientras que se requiere IgA mucosal para prevenir la infección del tracto respiratorio superior y la tráquea. El tratamiento actual más eficaz para la gripe es la vacunación con la administración de virus inactivados con formalina o p-propiolactona.

[0716] En algunas formas de realización, la infección es una infección por hepatitis, por ejemplo, una infección por hepatitis B o C.

[0717] El virus de la hepatitis B (HB-V) es el patógeno transmitido por la sangre más infeccioso conocido. Es una de las principales causas de hepatitis aguda y crónica y de carcinoma hepático, así como de infección crónica de por vida. Después de la infección, el virus se replica en los hepatocitos, que también eliminan el antígeno de superficie HBsAg. La detección de niveles excesivos de HBsAg en suero se utiliza como método estándar para diagnosticar una infección por hepatitis B. Una infección aguda puede resolverse o puede convertirse en una infección persistente crónica. Los tratamientos actuales para el VHB crónico incluyen el interferón a, que aumenta la expresión del antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I en la superficie de los hepatocitos, lo que facilita su reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos. Además, los análogos de nucleósidos ganciclovir, famciclovir y lamivudina también han demostrado cierta eficacia en el tratamiento de la infección por VHB en ensayos clínicos. Los tratamientos adicionales para el VHB incluyen interferón a pegilado, adenfovir, entecavir y telbivudina. Si bien se puede conferir inmunidad pasiva a través de la administración parental de anticuerpos séricos antiHBsAg, la vacunación con HBsAg inactivado o recombinante también confiere resistencia a la infección. Los anticuerpos de la invención pueden combinarse con tratamientos convencionales para infecciones de hepatitis B para obtener ventajas terapéuticas.

[0718] La infección por el virus de la hepatitis C (HC-V) puede conducir a una forma crónica de hepatitis, dando como resultado cirrosis. Mientras que los síntomas son similares a las infecciones resultantes de la hepatitis B, en claro contraste con la HB-V, los huéspedes infectados pueden permanecer asintomáticos durante 10 a 20 años. Los anticuerpos de la invención se pueden administrar como monoterapia o combinados con el tratamiento estándar para la infección por hepatitis C. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden administrar con uno o más de Sovaldi (sofosbuvir) Olysio (simeprevir), más ribavirina o interferón pegilado. Aunque los regímenes que incluyen Incivek (telaprevir) o Victrelis (boceprevir) más ribavirina e interferón pegilado también están aprobados, están asociados con un aumento de los efectos secundarios y una mayor duración del tratamiento.

[0719] El tratamiento convencional para la infección por HC-V incluye la administración de una combinación de ainterferón y ribavirina. Una terapia potencial prometedora para la infección por HC-V es el inhibidor de la proteasa telaprevir (VX-960). Los tratamientos adicionales incluyen bavituximab (un anticuerpo que se une a la fosfatidilserina de fosfolípidos aniónicos de una manera dependiente de la glicoproteína B2 I, Peregrine Pharmaceuticals), anticuerpo(s) anti-VPH de la proteína de cubierta viral E2 (p. ej., ATL 6865-Ab68+Ab65, XTL Farmacéutica) y Civacir® (inmunoglobulina humana policlonal anti-VHC). Los anticuerpos de la invención se pueden combinar con uno o más de estos tratamientos para las infecciones por hepatitis C para una ventaja terapéutica. Los inhibidores de proteasa, polimerasa y NS5A que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención para tratar específicamente la infección por hepatitis C incluyen los descritos en el documento US 2013/0045202.

[0720] En otra forma de realización, la infección es un virus del sarampión. Después de una incubación de 9 a 11 días, los huéspedes infectados con el virus del sarampión desarrollan fiebre, tos, coriza y conjuntivitis. Dentro de 1-2 días, se desarrolla una erupción maculopapular eritematosa, que se extiende rápidamente por todo el cuerpo. Debido a que la infección también suprime la inmunidad celular, el huésped tiene un mayor riesgo de desarrollar superinfecciones bacterianas, como otitis media, neumonía y encefalomielitis posinfecciosa. La infección aguda se asocia con morbilidad y mortalidad significativas, especialmente en adolescentes desnutridos.

[0721] El tratamiento para el sarampión incluye la administración pasiva de IgG humana agrupada, que puede prevenir la infección en sujetos no inmunes, incluso si se administra hasta una semana después de la exposición. Sin embargo, la inmunización previa con virus vivo atenuado es el tratamiento más efectivo y previene la enfermedad en más del 95 % de los inmunizados. Como hay un serotipo de este virus, una sola inmunización o infección generalmente da como resultado una protección de por vida contra una infección posterior.

[0722] En una pequeña proporción de huéspedes infectados, el sarampión puede convertirse en SSPE, que es un trastorno neurológico progresivo crónico que resulta de una infección persistente del sistema nervioso central. La SSPE es causada por variantes clonales del virus del sarampión con defectos que interfieren con el ensamblaje y la gemación del virión. Para estos pacientes, sería deseable la reactivación de las células T con los anticuerpos de la invención para facilitar la eliminación viral.

[0723] En otra forma de realización, la infección es VIH. El VIH ataca las células CD4+, incluidos los linfocitos T, los monocitos y los macrófagos, las células dendríticas foliculares y las células de Langerhans, y las células auxiliares/inductoras CD4+ se agotan. Como resultado, el huésped adquiere un defecto grave en la inmunidad mediada por células. La infección por el VIH produce SIDA en al menos el 50 % de las personas y se transmite por contacto sexual, administración de sangre o productos sanguíneos infectados, inseminación artificial con semen infectado, exposición a agujas o jeringas que contienen sangre y transmisión de una madre infectada a bebé durante el parto.

[0724] Un huésped infectado con VIH puede ser asintomático o puede desarrollar una enfermedad aguda que se asemeja a la mononucleosis: fiebre, dolor de cabeza, dolor de garganta, malestar y erupción cutánea. Los síntomas pueden progresar a una disfunción inmunológica progresiva, que incluye fiebre persistente, sudores nocturnos, pérdida de peso, diarrea inexplicable, eczema, psoriasis, dermatitis seborreica, herpes zoster, candidiasis oral y leucoplasia vellosa oral. Las infecciones oportunistas por una gran cantidad de parásitos son comunes en pacientes cuyas infecciones se convierten en SIDA.

[0725] Los tratamientos para el VIH incluyen terapias antivirales que incluyen análogos de nucleósidos, zidovudina (AST) solos o en combinación con didanosina o zalcitabina, dideoxiinosina, didesoxicitidina, lamidvudina, estavudina; inhibidores de la transcripción inversa como delavirdina, nevirapina, lovirida e inhibidores de proteinasa como saquinavir, ritonavir, indinavir y nelfinavir. Los tratamientos para el VIH incluyen EDURANT® (rilpivirina). Los anticuerpos de la invención pueden combinarse con tratamientos convencionales para infecciones por VIH para obtener ventajas terapéuticas.

[0726] En otra forma de realización, la infección es una infección por citomegalovirus (CMV). La infección por CMV a menudo se asocia con una infección persistente, latente y recurrente. El CMV infecta y permanece latente en monocitos y células progenitoras de granulocitos-monocitos. Los síntomas clínicos del CMV incluyen síntomas similares a los de la mononucleosis (es decir, fiebre, glándulas inflamadas, malestar) y una tendencia a desarrollar erupciones cutáneas alérgicas a los antibióticos. El virus se transmite por contacto directo. El virus se elimina en la orina, la saliva, el semen y, en menor medida, en otros fluidos corporales. La transmisión también puede ocurrir de una madre infectada a su feto o recién nacido y por transfusión de sangre y trasplantes de órganos. La infección por CMV da como resultado un deterioro general de la inmunidad celular, caracterizado por respuestas blastogénicas alteradas a mitógenos no específicos y antígenos de CMV específicos y capacidad citotóxica disminuida.

[0727] Los tratamientos de la infección por CMV incluyen los antivirales ganciclovir, foscarnet y cidovir, pero estos fármacos normalmente solo se prescriben en pacientes inmunocomprometidos. Los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento pueden combinarse con tratamientos convencionales para infecciones por citomegalovirus para una ventaja terapéutica.

[0728] En otra forma de realización, la infección es una infección por el virus de Epstein-Barr (EBV). El EBV puede establecer infecciones persistentes y latentes y ataca principalmente a las células B. La infección por EBV da como resultado la condición clínica de mononucleosis infecciosa, que incluye fiebre, dolor de garganta, a menudo con exudado, linfadenopatía generalizada y esplenomegalia. También hay hepatitis, que puede convertirse en ictericia.

[0729] Mientras que los tratamientos típicos para las infecciones por EBV son paliativos de los síntomas, el EBV está asociado con el desarrollo de ciertos cánceres tales como el linfoma de Burkitt y el cáncer nasofaríngeo. Por lo tanto, la eliminación de la infección viral antes de que se desarrollen las complicaciones sería de gran beneficio. Los anticuerpos de la invención se pueden combinar con tratamientos convencionales para las infecciones por el virus de Epstein-Barr para una ventaja terapéutica.

[0730] En otra forma de realización, la infección es una infección por el virus Herpes simplex (HSV). El VHS se transmite por contacto directo con un huésped infectado. Una infección directa puede ser asintomática, pero generalmente produce ampollas que contienen partículas infecciosas. La enfermedad se manifiesta como ciclos de periodos activos de enfermedad, en los que aparecen y desaparecen lesiones a medida que el virus infecta de forma latente el ganglio nervioso para brotes posteriores. Las lesiones pueden estar en la cara, los genitales, los ojos y/o las manos. En algunos casos, una infección también puede causar encefalitis.

[0731] Los tratamientos para las infecciones por herpes están dirigidos principalmente a resolver los brotes sintomáticos e incluyen medicamentos antivirales sistémicos como: aciclovir (p. ej., Zovirax®), valaciclovir, famciclovir, penciclovir y medicamentos tópicos como docosanol (Abreva®), tromantadina y zilactina. La eliminación de infecciones latentes de herpes sería de gran beneficio clínico. Los anticuerpos de la invención pueden combinarse con tratamientos convencionales para infecciones por virus del herpes para obtener ventajas terapéuticas.

[0732] En otra forma de realización, la infección es el virus linfotrófico T humano (HTLV-1, HTLV-2). E1HTLV se transmite a través del contacto sexual, la lactancia materna o la exposición a sangre contaminada. El virus activa las células Th1, lo que resulta en su sobreproliferación y sobreproducción de citocinas relacionadas con Th1 (p. ej., IFN-Y y TNF-a). Esto, a su vez, da como resultado una supresión de los linfocitos Th2 y una reducción de la producción de citocinas Th2 (p. ej., IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13), lo que provoca una reducción en la capacidad de un huésped infectado para montar una respuesta inmune adecuada a los organismos invasores que requieren una respuesta dependiente de Th2 para su eliminación (por ejemplo, infecciones parasitarias, producción de mucosa y anticuerpos humorales).

[0733] Las infecciones por HTLV conducen a infecciones oportunistas que dan como resultado bronquiectasias, dermatitis y superinfecciones con Staphylococcus spp. y Strongyloides spp. resultando en muerte por sepsis polimicrobiana. La infección por HTLV también puede conducir directamente a la leucemia/linfoma de células T del adulto y a la enfermedad progresiva desmielinizante de la neurona motora superior conocida como HAM/TSP. La eliminación de infecciones latentes por HTLV sería de gran beneficio clínico. Los anticuerpos de la invención pueden combinarse con tratamientos convencionales para infecciones por HTLV para obtener ventajas terapéuticas.

[0734] En otra forma de realización, la infección es el virus del papiloma humano (VPH). El VPH afecta principalmente a los queratinocitos y se presenta en dos formas: cutánea y genital. Se cree que la transmisión ocurre por contacto directo y/o actividad sexual. Tanto la infección cutánea como la genital por VPH pueden provocar verrugas e infecciones latentes y, a veces, infecciones recurrentes, que están controladas por la inmunidad del huésped que controla los síntomas y bloquea la aparición de verrugas, pero deja al huésped capaz de transmitir la infección a otros.

[0735] La infección con VPH también puede conducir a ciertos cánceres, tales como cáncer de cuello uterino, anal, vulvar, de pene y orofaríngeo. No existen curas conocidas para la infección por VPH, pero el tratamiento actual es la aplicación tópica de Imiquimod, que estimula el sistema inmunológico para atacar el área afectada. La eliminación de las infecciones latentes por VPH sería de gran beneficio clínico. Los anticuerpos de la invención pueden combinarse con tratamientos convencionales para infecciones por VPH para obtener ventajas terapéuticas.

Infecciones bacterianas

[0736] Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen sífilis, clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lymes. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con modalidades de tratamiento existentes para las infecciones antes mencionadas. Por ejemplo, los tratamientos para la sífilis incluyen penicilina (p. ej., penicilina G.), tetraciclina, doxiciclina, ceftriaxona y azitromicina.

[0737] La enfermedad de Lyme, causada por Borrelia burgdorferi, se transmite a los seres humanos a través de las picaduras de garrapatas. La enfermedad se manifiesta inicialmente como una erupción cutánea localizada, seguida de síntomas similares a los de la gripe que incluyen malestar general, fiebre, dolor de cabeza, rigidez en el cuello y artralgias. Las manifestaciones posteriores pueden incluir artritis migratoria y poliarticular, compromiso neurológico y cardíaco con parálisis de nervios craneales y radiculopatía, miocarditis y arritmias. Algunos casos de la enfermedad de Lyme se vuelven persistentes y provocan daños irreversibles análogos a la sífilis terciaria. La terapia actual para la enfermedad de Lyme incluye principalmente la administración de antibióticos. Las cepas resistentes a los antibióticos pueden tratarse con hidroxicloroquina o metotrexato. Los pacientes refractarios a los antibióticos con dolor neuropático pueden tratarse con gabapentina. La minociclina puede ser útil en la enfermedad de Lyme tardía/crónica con manifestaciones neurológicas u otras manifestaciones inflamatorias.

[0738] Otras formas de borreliois, como las resultantes de B. recurentis, B. hermsii, B. turicatae, B. parikeri, B. hispanica, B. duttonii y B. persica, así como leptospirosis (p. ej., L. interrogans), por lo general se resuelven espontáneamente a menos que los títulos sanguíneos alcancen concentraciones que provoquen obstrucción intrahepática.

Hongos y parásitos

[0739] Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Género Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

[0740] Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables con los anticuerpos de la invención descritos en este documento incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi y Nippostrongylus brasiliensis.

Kits y usos de diagnóstico

Kits

[0741] La invención también proporciona un kit que comprende el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 de la invención.

[0742] La invención también proporciona un kit que comprende el anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3 de la invención.

[0743] El kit se puede usar para usos terapéuticos y como kits de diagnóstico.

[0744] El kit puede usarse para detectar la presencia de PD-1, TIM-3 o PD-1 y TIM-3 en una muestra biológica.

[0745] En algunas formas de realización, el kit comprende el anticuerpo de la invención descrito en este documento y reactivos para detectar el anticuerpo. El kit puede incluir uno o más elementos que incluyen: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, un marcador, un agente terapéutico o un agente útil para quelar, o acoplar de otro modo, un anticuerpo a un marcador o agente terapéutico, o una composición radioprotectora; dispositivos u otros materiales para preparar el anticuerpo para su administración; vehículos farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto.

[0746] En algunas formas de realización, el kit comprende el anticuerpo de la invención en un recipiente e instrucciones para el uso del kit.

[0747] En algunas formas de realización, el anticuerpo en el kit está marcado.

[0748] En algunas formas de realización, el kit comprende el anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 que comprende la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56.

[0749] En algunas formas de realización, el kit comprende el anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 que comprende HC1, LC1, HC2 y LC2 de

SEQ ID NO: 186, 188, 190 y 193, respectivamente;

SEQ ID NO: 186, 188, 191 y 194, respectivamente;

SEQ ID NO: 186, 188, 192 y 195, respectivamente;

SEQ ID NO: 186, 188, 248 y 194, respectivamente;

SEQ ID NO: 241, 188, 244, 195, respectivamente;

SEQ ID NO: 241, 188, 245, 194, respectivamente;

SEQ ID NO: 243, 188, 246, 194, respectivamente; o

SEQ ID NO: 243, 188, 247, 195, respectivamente.

Métodos para detectar PD-1, TIM-3 o PD-1 y TIM-3

[0750] La invención también proporciona un método para detectar PD-1 en una muestra, que comprende obtener la muestra, ponerla en contacto con el anticuerpo antagonista que se une específicamente PD-1 de la invención, y detectar el anticuerpo unido a PD-1 en la muestra.

[0751] La invención también proporciona un método para detectar PD-1 y TIM-3 en una muestra, que comprende obtener la muestra, ponerla en contacto con el anticuerpo antagonista biespecífico PD-1/TIM-3 que comprende un primer dominio que se une específicamente a PD-1 y un segundo dominio que se une específicamente a TIM-3 de la invención, y detecta el anticuerpo unido a PD-1 y TIM-3 en la muestra.

[0752] En algunas formas de realización, la muestra puede derivarse de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas a tejido (es decir, células libres), tejidos (p. ej. tejido tumoral resecado, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares.

[0753] Los anticuerpos de la invención unidos a PD-1, TIM-3 o PD-1 y TIM-3 pueden detectarse utilizando métodos conocidos. Ejemplos de métodos incluyen el marcaje directo de los anticuerpos utilizando marcadores fluorescentes 0 quimioluminiscentes, o radiomarcadores, o unir a los anticuerpos de la invención un resto que es fácilmente detectable, como biotina, enzimas o etiquetas epitópicas. Ejemplos de etiquetas y restos son rutenio, 111In-DOTA, ácido 111In-dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y betagalactosidasa, polihistidina (etiqueta HIS), colorantes de acridina, colorantes de cianina, colorantes de fluorona, colorantes de oxazina, colorantes de fenantridina, colorantes de rodamina y colorantes Alexafluor®.

[0754] Los anticuerpos de la invención pueden usarse en una variedad de ensayos para detectar PD-1, TIM-3 o PD-1 y TIM-3 en la muestra. Ejemplos de ensayos son análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, resonancia de plasmón superficial, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.

[0755] La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos no limitantes.

Ejemplo 1. Métodos generales

Reacción de linfocitos mixtos humanos purificados (MLR)

[0756] Se usó una reacción de linfocitos mixtos humanos purificados (ensayo MLR) para medir los cambios en la producción de citoquinas inducidos por la adición de anticuerpos de prueba a cocultivos de células T CD4+ y células dendríticas.

[0757] Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un leucopak (Biological Specialty Corporation) usando un gradiente de Ficoll. A continuación, las células T CD4+ se aislaron recientemente mediante selección negativa de PBMC utilizando Miltenyi AutoMACS y perlas de aislamiento de células T CD4+ según las instrucciones del fabricante o se compraron comercialmente como células T CD4+ congeladas (Hemacare Corporation). Se utilizó un donante de células dendríticas (Hemacare Corporation). Después del aislamiento o descongelación, las células T CD4+ y las células dendríticas se lavaron y resuspendieron en medios de ensayo (medios RMPI1640 suplementados con 10 % de suero fetal bovino, 1 % de penicilina/estreptomicina, IX aminoácidos no esenciales y IX piruvato de sodio Invitrogen). Los linfocitos T CD4+ humanos purificados se diluyeron a 1 X 106 células/mL y se sembraron a 100.000 células/100 pL/pocillo. Las células dendríticas se diluyeron a 0,1 X 106 células/mL y se sembraron a 5000 células/50 pL/pocillo en placas con fondo en U. Los anticuerpos de prueba o los anticuerpos de control se prepararon a una concentración de 4X en medios de ensayo que produjeron IX cuando se añadieron 50 pL de anticuerpo a 150 pL de células.

[0758] Se añadieron diluciones en serie de 10 puntos de anticuerpos de prueba o de control a los pocillos a una concentración final de: 30, 10, 3,33, 1,11, 0,37, 0,12, 0,04, 0,01, 0,0046 y 00015 nM. Se incluyeron células T CD4⁺más células dendríticas y células dendríticas solas como controles para medir la secreción basal de citoquinas. Las células se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO²durante 5 días. El día 5, se retiraron 100 ml de sobrenadante de cultivo de tejidos de las placas de cultivo y se transfirieron a placas con fondo en V. El sobrenadante se congeló al menos durante la noche a -80 °C. La producción acumulada de citoquinas se midió en el sobrenadante de cultivo de tejidos utilizando placas de 10 plex de citoquinas humanas Th1/Th2 de Meso Scale Discovery (MSD) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las placas MSD se bloquearon con bloqueador B al 1 % durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se eliminó el bloqueador y las placas se lavaron utilizando el lavador de placas Biotek 406. Se preparó una curva estándar de 8 puntos y se añadió por duplicado a las placas. Se añadió sobrenadante de cultivo de tejido descongelado a 25 pL/pocillo. las placas se sellaron y se agitaron vigorosamente durante 1,5 horas. Sin eliminar los estándares ni el sobrenadante, se agregaron 25 pL de anticuerpo de detección a cada pocillo. Las placas se sellaron y se agitaron vigorosamente durante 1,5 horas. Las placas se lavaron, se añadió tampón de lectura y las placas se leyeron utilizando el lector de placas de Meso Scale Discovery.

[0759] Las concentraciones de citocinas se calcularon mediante el software MSD. La concentración de citoquinas en muestras desconocidas se calcula comparando la señal de salida desconocida con la señal de salida y las concentraciones de citoquinas conocidas en la curva estándar. Las concentraciones calculadas se cargaron en el software Spotfire TIBCO para su visualización. Después de una inspección visual de los datos, se utilizó el procedimiento de valores atípicos de mediana MAD con un umbral de 3,5 para identificar y excluir los valores atípicos en los datos transformados logarítmicamente. Se llevó a cabo un análisis robusto de la mitad de la concentración efectiva máxima (CE50 robusta) en cada citoquina para cada anticuerpo.

Ensayo de CMV

[0760] Se usó un ensayo de recuerdo de antígeno de citomegalovirus (ensayo de CMV) para medir los cambios en la producción de citoquinas inducidos por la adición de anticuerpos de prueba a cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con antígeno completo de CMV (para anticuerpos PD-1) o con un grupo de 138 péptidos de 15 mer que se superponen a través de la fosfoproteína de 65 Kd (pp65) (para mAbs TIM-3 y mAb biespecíficos PD1/TIM-3).

[0761] Después de la descongelación, las PBMC (Astarte Biologics y Hemcare Corporation) se lavaron y resuspendieron en medios de ensayo (medios RMPI1640 suplementados con 10 % de suero bovino fetal, 1 % de penicilina/estreptomicina, IX aminoácidos no esenciales y IX piruvato de sodio-Invitrogen). Las PBMC se diluyeron a 1,5 X 106 células/mL y se sembraron a 150000 células/100 pL/pocillo. El antígeno CMV (Astarte Biologics) se preparó a una concentración 4x de 0,4 pg/mL en medios de ensayo que produjeron 0,1 pg/mL cuando se agregaron 50 pL de antígeno a 100 pL de células y 50 pL de anticuerpo. Los anticuerpos se prepararon a una concentración de 4x en medios de ensayo que produjeron IX cuando se añadieron 50 pL de anticuerpo a las células y el péptido.

[0762] Se añadieron diluciones en serie de anticuerpos de prueba a los pocillos a una concentración final entre 150 y 0,001 nM. Se incluyeron células más antígeno CMV o conjunto de pp65, células solas y control de isotipo preparado a una concentración final de 50 o 30 nM como controles para medir la secreción basal de citoquinas. Las células se mantuvieron a 37 °C, 5 % CO²durante 6 días. Para el análisis de MSD, el día 6, se retiraron 100 pL de sobrenadante de cultivo de tejidos de las placas de cultivo y se transfirieron a placas de fondo V. El sobrenadante se congeló al menos durante la noche a -80°C. La producción acumulada de citoquinas se midió en el sobrenadante de cultivo de tejidos utilizando placas de 10 plex de citoquinas humanas Th1/Th2 de Meso Scale Discovery (MSD) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las placas MSD se bloquearon con bloqueador B al 1 % durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se eliminó el bloqueador y las placas se lavaron utilizando el lavador de placas Biotek 406. Se preparó una curva estándar de 8 puntos y se añadió por duplicado a las placas. Se añadió sobrenadante de cultivo de tejidos descongelado a razón de 25 pL/pocillo, las placas se sellaron y se agitaron vigorosamente durante 1,5 horas. Sin eliminar los estándares ni el sobrenadante, se agregaron 25 ml de anticuerpo de detección a cada pocillo. Las placas se sellaron y se agitaron vigorosamente durante 1,5 horas. Las placas se lavaron, se añadió tampón de lectura y las placas se leyeron utilizando el lector de placas de Meso Scale Discovery.

[0763] Las concentraciones de citocinas se calcularon mediante el software MSD. La concentración de citoquinas en muestras desconocidas se calcula comparando la señal de salida desconocida con la señal de salida y las concentraciones de citoquinas conocidas en la curva estándar. Las concentraciones calculadas se cargaron en el software Spotfire TIBCO para su visualización. Después de una inspección visual de los datos, se utilizó el procedimiento de valores atípicos de mediana MAD con un umbral de 3,5 para identificar y excluir los valores atípicos en los datos transformados logarítmicamente. Se llevó a cabo un análisis robusto de la mitad de la concentración efectiva máxima (CE50 robusta) en cada citoquina para cada anticuerpo.

[0764] Para los anticuerpos TIM-3 y los anticuerpos biespecíficos PD 1/TIM-3, en el día 6, después de recolectar el sobrenadante para el análisis de MSD, las células se lavaron una vez con PBS y posteriormente se tiñeron para la discriminación Vivo/Muerto y los siguientes marcadores de superficie celular: CD3, CD4, CD8, CD137, PD-1 y TIM-3. La citometría de flujo se realizó en un LSR Fortessa (BD). Los datos se analizaron usando el software Flow Jo. Las células CD137+ se identificaron según el método Fluorescence Minus One (FMO) en células CD8+ y CD4+ tratadas con CMV viables.

[0765] Para los experimentos de tratamiento secuencial, los ensayos de recuperación de CMV se llevaron a cabo como anteriormente con estimulación del conjunto de péptidos pp65 durante seis días. En el sexto día, se eliminó el sobrenadante y las células se volvieron a estimular con un conjunto de pp65 en presencia de anticuerpos anti-TIM-3. Veinticuatro horas más tarde, se eliminó el sobrenadante y se midieron los niveles de IFN-y mediante MSD, como se describe anteriormente.

Ensayo de inhibición del ligando de PD-1

[0766] El diseño del ensayo de inhibición del ligando se basó en MSD (Mescoscale Discovery). Una placa de MSD se revistió directamente con ligando (cynoPDL1-ECD, huPDL1-ECD o huPDL2-ECD) y se incubó durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se eliminó la solución de recubrimiento y se bloqueó la placa. Se preincubó una concentración fija de PD-1 biotinilado (huPD1-ECD) con anticuerpos o con un anticuerpo de control de isotipo como control negativo. Dependiendo del panel de anticuerpos a probar, los anticuerpos se probaron como titulaciones o en una concentración fija. La placa de MSD se lavó y la mezcla de PD-1/anticuerpo biotinilado se añadió a la placa de MSD recubierta con ligando. La placa se lavó y el PD-1 biotinilado unido al ligando se detectó mediante estreptavidina rutenilada. La inhibición de la unión de PD-1 por un anticuerpo resultó en una disminución de la señal en el ensayo MSD. Se determinó la unión máxima de PD-1 biotinilado en ausencia de inhibidor y, a veces, se usó para normalizar los datos a un porcentaje de la señal máxima de PD-1 biotinilado. Los mAbs que fueron positivos para la inhibición de la unión del ligando a una concentración también se probaron en las respuestas de dosis para la inhibición de varios ligandos de PD-1.

Unión de células Jurkat

[0767] Las células Jurkat se estimularon durante la noche con 20 ng/ml de PHA, se recogieron, lavaron y comprobaron su viabilidad. A continuación, las células se incubaron a 6-10 °C durante 45-60 minutos con diversas concentraciones de anticuerpos de ensayo, se lavaron e incubaron a 6-10 °C durante 45-60 minutos con IgG antihumana de cabra marcada con FITC. Las células se lavaron y fijaron con BD Cytofix, se refrigeraron durante la noche y se analizaron en un citómetro de flujo MACSQuant. El porcentaje de células positivas para PD-1 en cada concentración de anticuerpo se representó frente al logaritmo de la concentración de anticuerpo y los valores de CE⁵⁰se generaron en Prism.

Mediciones de afinidad

PD-1 mAbs

[0768] Se ensayaron mAbs anti-PD-1 para determinar la afinidad de unión a huPD1-ECD y cynoPD-1-ECD. Las mediciones de afinidad usando resonancia de plasmón superficial (SPR) se realizaron usando un sistema ProteOn XPR36. Se preparó una superficie de biosensor acoplando una mezcla de superficie de capa de polímero de alginato modificado con anti-IgG Fc de un chip GLC utilizando las instrucciones del fabricante para la química de acoplamiento de amina. Se capturaron los mAb de prueba y se controlaron sus interacciones con los analitos (huPD1-ECD o cynoPD1-ECD) en tampón basado en PBS a 25 °C. Los datos recopilados se procesaron y ajustaron a un modelo de enlace Langmuir 1:1. El resultado de cada mAb se informó en el formato de K^on(velocidad de activación), K^off(velocidad de desactivación) y Kd (constante de disociación de equilibrio).

Ensayo de inhibición del ligando de TIM-3

[0769] Se realizaron ELISA de competencia de TIM-3/galectina-9 uniendo 1 pg/ml de quimera Fc-TIM-3 humana recombinante (R&D Systems-cat#: 2365-TM-05) en PBS por pocillo de una placa White Maxisorp de 96 pocillos (Nunc). Las placas se lavaron y bloquearon con StartingBlock T20 (Pierce) y se añadió inhibidor a una concentración de 10 pg/ml a los pocillos. Sin lavar, se añadieron a los pocillos 7,5 pg/ml de galectina-9 at y se incubaron durante 30 min. A continuación, se añadió anticuerpo policlonal anti-galectina-9-biotina (R&D Systems) a 0,5 mg/ml y se incubó durante 30 minutos. Las placas se lavaron y se añadió neutravidina-HRP conjugado (Pierce) y las placas se incubaron durante 45 minutos adicionales. Las placas se lavaron y se añadió sustrato de quimioluminiscencia POD (Roche) inmediatamente antes de leer las placas y se leyó la luminiscencia en un luminómetro.

Generación de antígenos usados en el estudio

[0770] La clonación, expresión y purificación de los antígenos se realizó usando métodos estándar. Varios fragmentos de proteínas se expresaron como etiquetas de hexahistidina o proteínas de fusión Fc. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas usadas sin las secuencias de etiqueta se muestran en SEQ ID NO: 1-9, 138 y 89.

PD1 humana de longitud completa (huPDI); SEQ ID NO: 1

PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQT

DKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPK

AQ1KESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVW

VLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCV

PEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPE DGHCSWPL

Dominio extracelular de PD1 humano (huPD1-ECD); SEQ ID NO: 2

PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQT

DKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPK

AQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTL

Macaca fascicularis (cynomolgous, aquí denominada cyno) PD1 (cPD1); SEQ ID NO: 3)

PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQ

TDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAP

KAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLV

WVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAP

CVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL

Dominio extracelular de cyno PD1 (cPD1-ECD); SEQ ID NO: 4

PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQ

TDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGA1SLAP

KAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQAL

PD-L1 humana de longitud completa (huPD-L1); SEQ ID NO: 5

FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEED

LKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQ1TDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKR1T

VKVNAPYNK1NQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTT

NSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER

Dominio extracelular de PD-L1 humana (huPDL1-ECD) SEQ ID NO: 6

FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEED LKVQHSSYRQRARLLK.DQLSLGNAALQ1TDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRIT VKVNAPYNK1NQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTT

NSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERT Dominio extracelular de cynomolgus PD-L1 (cynoPDLI-ECD) SEQ ID NO: 7

A F T V T V P K D L Y V V E Y G S N M T IE C K F P V E K Q L D L T S L IV Y W E M E D K N IIQ F V H G E E

D LK .V Q H S N Y R Q R A Q LLK .D Q LS LG N A A LR FrD V K LQ D A G V Y R C M IS Y G G A D Y K .R I

T V K V N A P Y N K IN Q R ILV V D P V T S E H E LT C Q A E G Y P K A E V IW T S S D H Q V LS G K T T T

TN SKR E E K LLN V TS TLR IN TTA N E IFY C 1FR R LD P E E N H TA E LV IP E LP LA LP P N E R T

Dominio extracelular de PD-L2 humano (huPDL2-ECD) SEQ ID NO: 8

LFT V TV P K E LY IIE H G S N V T LE C N F D T G S H V N LG A IT A S LQ K V E N D T S P H R E R A T LL E E Q L P LG K A S F H IP Q V Q V R D E G Q Y Q C IIIY G V A W D Y K Y LT L K V K A S Y R K IN T H ILK VP ETD EV ELTC Q ATG YPLAEVSW PN VSVPAN TSH SR TPEG LYQ VTSVLR LKPPPG R N FS C VFW N TH VR ELTLAS ID LQ SQ M EP R TH PT

Dominio extracelular de ratón PD1 (musPD1-ECD) SEQ ID NO: 9

LEVP N G PW R S LTFYP AW LTVS EG A N ATFTC S LS N W SE D LM LN W N R LS PSN Q TE K

Q A A F C N G LS Q P V Q D A R F Q IIQ LP N R H D F H M N ILD T R R N D S G IY LC G A IS LH P K A K IE

ESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQ

TIM-3 humano de longitud completa, SEQ ID NO: 138

S E V E Y R A E V G Q N A Y LP C FY TP A A P G N LV P V C W G K G A C P V FE C G N V V LR TD E R D V

N Y W T S R Y W LN G D F R K G D V S LT IE N V T LA D S G IY C C R IQ IP G IM N D E K F N LK LV IK P

A K VTPA PTR Q R D FTA AFPR M LTTR G H G PA ETQ TLG SLPD IN LTQ ISTLA N ELR D SR

L A N D L R D S G A T IR IG IY IG A G IC A G L A L A L IF G A L IF K W Y S H S K E K IQ N L S L IS L A N L

PPSG LAN AVAEG IR SEEN IYTIEEN VYEVEEPN EYYCYVSSR Q Q PSQ PLG C R FAM P

Dominio extracelular de TIM-3 humano (huTIM-3-ECD) SEQ ID NO: 89

AK VTPA PTR Q R D FTA A FP R M LTTR G H G P A E TQ TLG S LP D IN LTQ IS TLA N E LR D S R

LA N D LR D S G A TIR

Ejemplo 2. Selección de anticuerpos humanos anti-PD-1 de bibliotecas de presentación de fagos

[0771] Fab de unión a PD-1 se seleccionaron de bibliotecas de presentación de fagos pIX de novo como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397: 385-96, 2010, Publicación de Patente Int. N° WO2009/085462 y Publicación de Patente de EE. UU. N° US2010/0021477. Brevemente, las bibliotecas se generaron diversificando andamios humanos donde los genes VH de la línea germinal IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01 se recombinaron con el minigen IGHJ-4 humano a través del bucle H3 y la VL de la línea germinal humana. Los genes kappa 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11 *01), A27 (IGKV3-20*01) y b 3 (IGKV4-1 *01) se recombinaron con el minigen iGkJ-1 para ensamblar VH completo y dominios VL. Las posiciones en las regiones variables de cadena pesada y ligera alrededor de los bucles HI, H2, L1, L2 y L3 correspondientes a posiciones identificadas para estar frecuentemente en contacto con proteínas y antígenos peptídicos se eligieron para diversificación. La diversidad de secuencias en las posiciones seleccionadas se limitó a los residuos que se encontraban en cada posición en las familias de genes de línea germinal IGHV o IGLV de los respectivos genes IGHV o IGLV. La diversidad en el bucle H3 se generó utilizando bucles sintéticos de tamaño corto a mediano de longitudes de 7-14 aminoácidos. La distribución de aminoácidos en H3 fue diseñado para imitar la variación observada de aminoácidos en anticuerpos humanos. El diseño de la biblioteca se detalla en Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96. Los andamios utilizados para generar bibliotecas se nombraron de acuerdo con su origen génico de la línea germinal humana VH y VL. Las tres bibliotecas de cadenas pesadas se combinaron con las cuatro cadenas ligeras de la línea germinal o se combinaron con las bibliotecas de cadenas ligeras diversificadas para generar 12 combinaciones únicas de VH:VL. Posteriormente, estas bibliotecas se combinaron aún más en función de las versiones de la biblioteca para generar bibliotecas adicionales para analizar experimentos contra PD-1.

[0772] Las bibliotecas se seleccionaron frente a huPD1-ECD, cynoPD1-ECD, musPD1-ECD, huPD1-Fc y/o musPD1-Fc. Las proteínas recombinantes se biotinilaron (bt) y se capturaron en perlas magnéticas de estreptavidina (Dynal), luego se expusieron a las bibliotecas pIX Fab de novo a una concentración final de 100 nM o 10 nM. Los fagos no específicos se eliminaron por lavado en PBS-Tween y los fagos unidos se recuperaron mediante infección de células MC1061F' de E. coli. Los fagos se amplificaron a partir de estas células durante la noche y se repitió la selección durante un total de tres o cuatro rondas. Después de la ronda final de bioselección, se evaluó la unión de Fab monoclonal a huPD1-ECD, huPD1-Fc, musPD1-Fc y/o cynoPD1-Fc en dos formatos ELISA. En el formato 1, se capturó Fab en una placa ELISA mediante anticuerpo anti-Fd y se añadieron las diversas formas de btPD1 al Fab capturado, seguido de la detección de bt-PD1 con estreptavidina:HRP. En el formato 2, las diversas formas de btPD1 se capturaron en placas ELISA mediante estreptavidina y se añadió Fab secretado al antígeno capturado, seguido de detección de Fab con AntiFab'2HRP de cabra. Los clones que demostraron unirse a las proteínas se secuenciaron en las regiones variables de cadena pesada y ligera.

[0773] A continuación, se analizó la reactividad cruzada de los Fab de las selecciones de PD-1 humano o PD-1 de ratón con cynoPD1-Fc secretado en el sobrenadante de células de mamífero. El Fab se capturó en una placa ELISA mediante anticuerpo anti-Fd y el sobrenadante de cynoPD1-Fc se añadió al Fab capturado, seguido de la detección de cynoPD1-Fc con Anti-Humano Fc:HRP de cabra. En función de las características de unión a cynoPD1-Fc, se eligieron anticuerpos seleccionados para una caracterización adicional.

[0774] Se eligieron Fab seleccionados para una caracterización adicional y se clonaron como IgG2sigma/k. IgG2sigma tiene funciones efectoras abolidas y tiene sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje. IgG2sigma se describe en la Patente de EE. UU. N° 8.961.967. Se evaluó la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de PD-1 humano a PD-L1 de Cynomolgus, su afinidad con las proteínas PD-1 humanas y de Cynomolgus y su capacidad para unirse a células que expresan endógenamente PD-1 humano (células Jurkat). Posteriormente se evaluó la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de PD-L1 humana y PD-L2 humana a huPD1.

[0775] Basándose en los resultados, se eligieron varios anticuerpos para la maduración de la afinidad. Las características de los anticuerpos seleccionados elegidos para la maduración por afinidad se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7.

Ejemplo 3. Maduración por afinidad de anticuerpos humanos anti-PD-1

[0776] Los anticuerpos PD1B70, PD1B71 y PD1B114 (homólogo cercano a PD1B11) se maduraron por afinidad en formato Fab utilizando bibliotecas de presentación de fagos con diversidad en posiciones VL seleccionadas y en HCDR1 y HCDR2. El diseño de las bibliotecas de maduración por afinidad para cada Fab se muestra en la Tabla 8.

La numeración de los residuos se realiza de acuerdo con PD1B114 VH SEQ ID NO: 41 en la Tabla 8.

Tabla 8.

[0777] Se construyeron las bibliotecas y se generó el fago. Las bibliotecas de fagos VH y VL se usaron luego para la selección de fagos contra proteínas recombinantes biotiniladas huPD 1-ECD y cynoPD1-ECD. Después de la selección de fagos, se examinaron los Fab solubles para determinar la unión a PD-1 humano y cyno. Se clonaron Fab seleccionados como isotipo IgG2sigma y se caracterizaron por su unión a células Jurkat y la inhibición del ligando PD-L1 de Cynomolgus a concentraciones de 1 pg/ml y 10 pg/ml.

[0778] La Tabla 9 muestra los resultados de la caracterización de los anticuerpos parentales y madurados por afinidad.

Tabla 9.

[0779] Los anticuerpos madurados por afinidad se evaluaron en experimentos de afinidad como se describe anteriormente usando análisis ProteOn SPR para unión a huPD1-ECD y cynoPD 1-ECD. Las características de unión de los mAbs a cyno PD-1 se muestran en la Tabla 10 y a PD-1 humana en la Tabla 11. DESVEST se calculó para 3 o más réplicas generadas para proteínas humanas y cyno. Si se calculaban menos de 3 repeticiones, se indicaba RANGO. RANGO se define como los valores alto y bajo para las réplicas probadas. Para las muestras en la Tabla 10 o Tabla 11 sin valor indicado en RANGO o DESVEST, solo se realizó un experimento. Las variantes maduradas con mejor afinidad tenían afinidades por PD-1 humano y cyno en el rango de nM de un solo dígito después de ganancias de ~4-20 veces en afinidad en comparación con sus mAb originales.

Tabla 10.

Tabla 11.

Ejemplo 4. Variante combinatoria de producción de mAb PD-1

[0780] Después del análisis de los resultados de afinidad, se consideraron las secuencias combinatorias.

[0781] PD1B11 y PD1B114 tienen secuencias muy similares. Debido a que PD1B11 tenía una afinidad aproximadamente 3 veces mayor por PD-1 humano y una afinidad 2 veces mayor por cyno PD-1 en comparación con PD1B114, se produjeron anticuerpos que tenían combinaciones de sus diversas CDR. E1HCDR3 de PD1B11 se colocó en PD1B164 y PD1B162 (variantes maduradas por afinidad de PD1B114), usando mutagénesis dirigida al sitio, mientras que el HCDR2 de PD1B164 (variante madurada por afinidad de PD1B114) se colocó en PD1B187 (variante madurada por afinidad de PD1B11). Las cadenas pesadas resultantes se emparejaron con las cadenas ligeras parentales dando como resultado nuevos anticuerpos PD1B194, PD1B195 y PD1B196, respectivamente.

[0782] PD1B175 y PD1B177 contenían la cadena ligera original aunque los anticuerpos se generaron utilizando bibliotecas VL diversificadas durante la maduración por afinidad. En un intento por aumentar las afinidades de los anticuerpos, la cadena pesada de PD1B175 se emparejó con cadenas ligeras maduradas por afinidad de PD1L185 o PD1L187, y la cadena pesada de PD1B177 se emparejó con cadenas ligeras maduradas por afinidad de PD1L86, PD1L168 o PD1L190, lo que dio como resultado anticuerpos PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200 PD1B201. El emparejamiento VH y VL de los anticuerpos se muestra en la Tabla 20 en el Ejemplo 5.

[0783] Las secuencias HCDR, LCDR, VH y VL de estos anticuerpos se muestran en las Tablas 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 y 22 en el Ejemplo 5. Los anticuerpos se clonaron como mAbs IgG2sigma/k y se expresaron transitoriamente en células HEK293 expi para mediciones de afinidad.

[0784] Las afinidades de los anticuerpos resultantes se determinaron como se describe anteriormente. La Tabla 12 muestra las afinidades medidas de las variantes de mAb combinatorias por cyno PD-1 y la Tabla 13 muestra las afinidades por PD-1 humana. DESVEST se calculó para 3 o más réplicas generadas para proteínas humanas y cyno. Si se calcularon menos de 3 repeticiones, se indica RANGO. RANGO se define como los valores alto y bajo para las réplicas probadas. Para muestras sin RANGO o DESVEST, solo se realizó un experimento.

Tabla 12.

Tabla 13.

Ejemplo 5. Caracterización estructural de anticuerpos anti-PDl derivados de bibliotecas de expresión en fagos

[0785] Las secuencias de ADNc y las traducciones de aminoácidos de los anticuerpos se obtuvieron usando técnicas estándar a lo largo de la generación de los anticuerpos usando varias campañas. Después de la determinación de la secuencia polipeptídica, se optimizaron los codones de algunos ADNc de anticuerpos que codifican las regiones variables o los anticuerpos de longitud completa utilizando métodos estándar para aumentar la expresión.

La Tabla 14 muestra las secuencias de HCDR1 de anticuerpos PD-1 seleccionados.

La Tabla 15 muestra las secuencias de HCDR2 de anticuerpos PD-1 seleccionados.

La Tabla 16 muestra las secuencias de HCDR3 de anticuerpos PD-1 seleccionados.

La Tabla 17 muestra las secuencias LCDR1 de anticuerpos PD-1 seleccionados. La Tabla 18 muestra las secuencias LCDR2 de anticuerpos PD-1 seleccionados. La Tabla 19 muestra las secuencias LCDR3 de anticuerpos PD-1 seleccionados. La Tabla 20 muestra el emparejamiento VH y VL de anticuerpos PD-1 seleccionados.

La Tabla 21 muestra las secuencias VH de anticuerpos PD-1 seleccionados.

La Tabla 22 muestra las secuencias VL de anticuerpos PD-1 seleccionados.

Tabla 14.

Tabla 15.

Tabla 16.

Tabla 17.

Tabla 18.

Tabla 19.

Tabla 20.

Tabla 21.

Tabla 22.

(Continuación)

[0786] Se identificó que todos los anticuerpos anti-PD-1 tenían los marcos VH1-69 (SEQ ID NO: 170) e IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 171).

SEQ ID NO: 170

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG

GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

SEQ ID NO: 171

e iv l t q s p a t l s l s p g e r a t l s c r a s q s v s s y l a w y q q k p g q a p r l l iy d a s n r a t

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP

Ejemplo 6 Generación y caracterización de anticuerpos PD-1 en ratones

[0787] Se inmunizaron BALB/c por vía intraperitoneal con huPD1-ECD y se evaluaron los títulos de IgG específicos. Una vez que se obtuvieran suficiente títulos, se aislaron esplenocitos y se fusionaron con células FO. Los hibridomas resultantes se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 10 días. Los clones específicos de antígeno se identificaron mediante ELISA de captura estándar para la unión a huPD1-ECD. Los hibridomas específicos de PD-1 humano se analizaron adicionalmente para determinar su afinidad con el PD-1 humano y cyno, la unión a las células Jurkat y la inhibición de cyno PD-L1. En base a los resultados, se seleccionó el clon PD1B28 para su humanización mediante la adaptación del marco.

[0788] El proceso de adaptación del marco se realizó como se describe esencialmente en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 2009/0118127 y Fransson et al., (2010) J Mol Biol 398:214-231. Brevemente, las secuencias de cadena pesada y ligera se compararon con las secuencias de la línea germinal humana (solo los alelos "01" a partir del 1 de octubre de 2007) utilizando la búsqueda BLAST en la base de datos IMGT (Kaas, et al., (2004) Nucl Acids Res 32, D208-D210; Lefranc et al., (2005) Nucl Acid Res 33, D593-D597). De este conjunto de genes de la línea germinal humana, se eliminaron los genes redundantes (100 % idénticos a nivel de aminoácidos) y aquellos con residuos de cisteína desapareados. Los genes restantes de la línea germinal humana más cercanos tanto en el marco como en las regiones CDR se eligieron como los marcos humanos aceptores. Se seleccionaron varios marcos humanos de línea germinal VL y VH en base a la homología de secuencia general y las longitudes de CDR, así como la similitud de CDR. FR-4 se seleccionó en base a la similitud de secuencia de los genes de la línea germinal IGHJ/IGJK. Luego, las CDR de PD1B28 se transfirieron a los marcos humanos aceptores seleccionados para generar las variantes de HFA, excepto en la región correspondiente al HCDR1 de Vh. Para esta región, se transfirió una combinación de CDR y HV, o un HCDR2 más corto (denominado Kabat-7, véase la Publicación de Patente de EE. UU. 2009/0118127) se transfirieron desde el anticuerpo no humano en FR humano porque los residuos HCDR2 restantes no se han encontrado en contacto en complejos antígeno-anticuerpo de estructuras conocidas (Almagro, (2004) J Mol Recognit.

17:132). Se introdujeron mutaciones inversas en ciertas posiciones de residuos en los anticuerpos humanizados. Retromutaciones PD1B131: VH: V37I_Q39L_W47S_R98S, VL: Y49K. PD1B132: VHW47S_R98S, VL: Y49K (numeración de residuos según Chothia). Los anticuerpos seleccionados se expresaron como IgG2sigma/K. Los anticuerpos resultantes se caracterizaron por su unión a PD-1 recombinante y PD-1 expresado en células (células Jurkat), y su inhibición de ligando (cyno PD-L1 y PDL1 humano). Las características de anticuerpos humanizados seleccionados se muestran en la Tabla 23. Las secuencias VH y Vl de los anticuerpos generados se muestran en la Tabla 24 y la Tabla 25, respectivamente.

Tabla 23.

Tabla 24.

Tabla 25.

[0789] Las secuencias CDR de PD1B131 y PD1B132 se muestran a continuación:

HCDR1 (SEQ ID NO: 66)

RYDMS HCDR2 (SEQ ID NO: 67)

YISGGGANTYYLDNVKG HCDR3 (SEQ ID NO: 68)

PYLSYFDV LCDR1 (SEQ ID NO: 69)

RASQSLSDYLH LCDR2 (SEQ ID NO: 70)

SASQSIS LCDR3 (SEQ ID NO: 71)

QNGHSFPYT

Ejemplo 7. Efecto del cambio de isotipo en las propiedades del anticuerpo anti-PD-1

[0790] Las regiones variables de los anticuerpos PD1B196 y PD1B199 (de isotipo IgG2sigma/K) se clonaron como isotipos IgG4 S228P y las regiones variables del anticuerpo PD1B132 (de IgG2) en el isotipo IgG2sigma para evaluar posibles diferencias en funcionalidad y capacidad de desarrollo.

[0791] Los anticuerpos se denominaron PD1B244 (PD1B196 VH/VL en IgG4 S228P) PD1B245 (PD1B199 VH/VL en IgG4 S228P) Y PD1B243 (PD1B132 VH/VL en IgG2sigma).

[0792] El cambio de isotipo no tuvo un efecto consistente sobre las propiedades del anticuerpo; sin embargo, para algunos de los anticuerpos, se observaron algunos cambios en los valores de CE⁵⁰en el ensayo de CMV.

[0793] A continuación se ejemplifican secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de varios anticuerpos. La Tabla 26 muestra el resumen de VH, VL, SEQ ID NO de cadena pesada y de cadena ligera: para anticuerpos seleccionados.

Tabla 26.

SEQ ID NO: 72 LC de PD1B244 QVQLVQSGAEVkkPGSSVkVSCkASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF DTANYAQkFQGRVTlTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVFITFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTkTYTCNVDHkPSNTkVDkR VESkYGPPC'PPCPAPEFLGGPSVFLFPPkPkDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAkTkPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGkEYkCkVSNkG LPSSIEkTISkAkGQPREPQVYTLPPSQEEMTkNQVSLTCLVkGFYPSDIAVEWESN GQPENNYkTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDkSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ kSLSLSLGk

SEQ ID NO: 73 LC de PD1B244

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLkSGTASVVCLLNNFYPREAkVQWkVDNALQSGNSQESVTEQD SkDSTYSLSSTLTLSkADYEkHkVYACEVTHQGLSSPVTkSFNRGEC

SEQ ID NO: 74 LC de PD1B243 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC'AASGFAFSRYDMSWVRQAPGkGLESVAYISGG GANTYYLDNVkGRFTISRDNAkNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWG QGTLVTVSSASTkGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVkDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTkTYTCNVDHkPSNTkVDkRVESkY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPkPkDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAkTkPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGkEYkCkVSNkGLPSSI EkTISkAkGQPREPQVYTLPPSQEEMTkNQVSLTCLVkGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYkTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDkSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQkSLSL SLGk

SEQ ID NO: 75 LC de PD1B243

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASQSISG

1PARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKLE1KRTVAAPS

VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 76 HC de PD1B245

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYVISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIY

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTLDRTGHLDY

WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG

ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES

KYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP

SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSLGK

SEQ ID NO: 77 LC de PD1B245

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLL1HDASTRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVE1KRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDMALOSGNSQESVTEOD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 212 HC de PD1B114

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGN

LDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW

NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTVTCNVDHKPSNTKVDK

TVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEV

q f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q fn s t f r v v s v l t v l h o d w l n g k e y k c k v sn k

GLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 213 LC de PD1B114

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLT1SSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTK.VEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO 214 HC de PD1B149

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGN

LDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW

NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK

TVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEV

QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK

GLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALFINHYT QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 215 LC de PD1B149

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLL1HDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVE1KRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 216 HC de PD1B160

QVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGOGLEWMGGIIPIF

DTANYAQKFQGRVT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAY DTGN

LDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW

NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTOTYTCNVDHKPSNTKVDK

TVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEV

QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK

GLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

NGOPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK.LTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 217 LC de PD1B160

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIKDASDRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRGNWPLTFGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 218 HC de PD1B162

QVQLVQSGAEVkkPGSSVkVSCkASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF

DTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGN

LDYWGQGTLVTVSSASTkGPSVFPLAPC’SRSTSESTAALGCLVkDYFPEPVTVSW

NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK

TVERkCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPkPkDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEV

QFNWYVDGVEVFTNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK

GLPSSlEkTISkTkGQPREPQVYTLPPSREEMTkNQVSLTCLVkGFYPSDlAVEWES

NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QkSLSLSPGk

SEQ ID NO: 219 LC de PD1B162

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQREYWPLTFGQGTkVElkRTVAAP SVFIFPPSDEQLkSGTASVVCLLNNFYPREAkVQWkVDNALQSGNSQESVTEQDS kDSTYSLSSTLTLSkADYEkHkVYACEVTHQGLSSPVTkSFNRGEC

SEQ ID NO: 220 HC de PD1B164

QVQLVQSGAEVkkPGSSVkVSCkASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF DTANYAQkFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGN LDYWGQGTLVTVSSASTkGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC'LVkDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHkPSNTkVDk TVERkCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPkPkDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEV OFNWYVDGVEVHNAkTkPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGkEYkCkVSNk GLPSSIEkTISkTkGOPREPQVYTLPPSREEMTkNQVSLTCLVkGFYPSDIAVEWES NGQPENNYkTTPPMLDSDGSFFLYSkLTVDkSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QkSLSLSPGK

SEQ ID NO: 221 LC de PD1B164

ElVLTQSPATLSLSPGERATLSC’RASQSVRSYLAWYQQkPGQAPRLLlYDASYRAT GlPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDYWPLTFGQGTkVEIkRTVAA PSVFIFPPSDEQLkSGTASVVCLLNNFYPREAkVQWkVDNALQSGNSQESVTEQD SRDSTYSLSSTLTLSRADYERHRVYACEVTHQGLSSPVTkSFNRGEC

SEQ ID NO: 222 HC de PD1B183

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGI1PIF

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT

VERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQ

FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 223 LC de PD1B183

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIKDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC'QQRGYWPLTFGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTL.TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 224 HC de PD1B184

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC'ARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT

VERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPK.PK.DTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQ

FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKT1SKTKGQPREP0VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 225 LC de PD1B184

E1VLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLL1HDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVE1KRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 226 HC de PD1B185

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGI1PIF

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT

VERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQ

FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 227 LC de PD1B185

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC'RASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRWNWPLTFGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 228 HC de PD1B192

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG1IPIF

GTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT

VERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC'VVVDVSAEDPEVQ

FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLFIQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 229 LC o PD1B192

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLL1HDASNRAT

GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Ejemplo 8. Caracterización de anticuerpos PD-1 en ensayos basados en células

[0794] Se caracterizaron anticuerpos seleccionados en MLR y CMV Los valores de CE⁵⁰para la inducción de IFN-y de los ensayos MLR y CMV se muestran en la Tabla 27. En la mayoría de los casos, los anticuerpos anti-PD-1 mostraron un aumento dependiente de la dosis en los niveles de IFN-y en ensayos MLR y CMV.

Tabla 27.

[0795] Además de IFN-y, los niveles secretados de citocinas adicionales también se vieron afectados por el bloqueo de PD-1 en los dos ensayos. Tras la estimulación con CMV, los anticuerpos anti-PD-1 condujeron a una inducción dependiente de la dosis de TNF-a e IL-4, mientras que en el ensayo MLR aumentaron los niveles de TNF-a e IL-2.

Ejemplo 9. Generación de anticuerpos anti-TIM-3 humanos utilizando bibliotecas de presentación de fagos

[0796] Las bibliotecas pIX Fab de novo descritas en el Ejemplo 2 se analizaron contra el dominio extracelular de la proteína de fusión TIM-3-Fc humana recombinante (R&D Systems, # 2365-TM, residuos Ser22-Arg200 de TIM-3 de longitud completa) (huTIM-3-Fc).

[0797] La proteína recombinante se biotiniló (bt) y se capturó en perlas magnéticas de estreptavidina (Dynal), luego se expuso a las bibliotecas pIX Fab de novo a una concentración final de 100 nM. Los fagos no específicos se eliminaron por lavado en PBS-Tween y los fagos unidos se recuperaron mediante infección de células MC1061F' de E. coli. Los fagos se amplificaron a partir de estas células durante la noche y se repitió la selección durante un total de tres rondas. Después de la ronda final de bioselección, se evaluó Fab monoclonal para la unión de Fab con TIM-3-Fc humana biotinilada capturada en placas ELISA por estreptavidina y se agregó Fab secretado al antígeno capturado, seguido de la detección del Fab con Cabra Anti humano kappa:HRP. Los anticuerpos seleccionados se expresaron y clonaron en varios isotipos de IgG como se indica a continuación y se caracterizaron adicionalmente.

Ejemplo 10. Generación de anticuerpos anti-TIM-3 en ratones

[0798] Se inmunizaron ratones Balb/c con proteína de fusión TIM-3-Fc humana recombinante (R&D Systems, N° de catálogo 2365-TM) en el transcurso de 18 días. Se recogieron los bazos y se fusionó una población enriquecida de células B con células de mieloma de ratón FO para generar hibridomas secretores de mAb. Los sobrenadantes de hibridoma se seleccionaron para determinar la unión mediante ELISA a la proteína TIM-3-Fc ya una lgG1 Fc humana irrelevante. A continuación, se analizó la capacidad de los sobrenadantes específicos de TlM-3 para unirse a las células THP-1 que expresan TlM-3.

[0799] Se clonaron genes v de mAb HC y LC seleccionados de los hibridomas positivos para TlM-3 utilizando técnicas de biología molecular estándar (RT-PCR seguido de ligación de fragmentos de PCR en vectores de expresión de plásmidos). Los mAb se expresaron de forma recombinante y se repitió el ELISA para confirmar la unión específica de TlM-3. Se construyeron modelos moleculares para secuencias de anticuerpos murinos para ser adaptados al marco humano usando m Oe (CCG, Montreal) y se inspeccionaron visualmente. Se identificaron posibles posiciones problemáticas que podrían influir en la unión al antígeno, el empaquetamiento de VL/VH y/o los residuos del núcleo que podrían afectar la estabilidad de los dominios. Tanto para VL como para VH, se propusieron marcos humanos múltiples con o sin retromutaciones en secuencias marco de ratón si se identificaban posiciones problemáticas. Las secuencias diseñadas se clonaron en plásmidos de cadena ligera y pesada y se expresaron en células Expi293F. Se cuantificó el anticuerpo expresado en los sobrenadantes del cultivo y se evaluó la unión a células HEK293 transfectadas con TlM-3 humana recombinante.

Ejemplo 11. Isotipos de anticuerpos anti-TIM-3

[0800] La VH y VL de anticuerpos anti-TlM-3 aislados se clonaron en varios isotipos de cadenas pesadas, opcionalmente con varias sustituciones de Fc, y alotipos con cadenas ligeras k durante el curso de caracterización de anticuerpos para evaluar el efecto, si lo hay, del cambio de isotipo sobre la funcionalidad o capacidad de desarrollo de los anticuerpos. Los diversos isotipos utilizados se muestran en la Tabla 28.

Tabla 28.

[0801] Los diversos alotipos usados en los anticuerpos generados se muestran en la Tabla 29. Algunos de los anticuerpos tenían alotipos quiméricos. Los anticuerpos TM3B105 y TM3B403, por ejemplo, difieren en una sustitución de aminoácido en una región constante en la posición 189. Cadenas ligeras y pesadas de TM3B105 SEQ ID NO: 240 y 79, respectivamente; Cadenas pesada y ligera de TM3B403 SEQ ID NO: 78 y 79, respectivamente. Se espera que los dos anticuerpos tengan las mismas características.

Tabla 29.

[0802] En general, los anticuerpos anti-TIM-3 con IgG2sigma Fc tuvieron mayor actividad en el ensayo de CMV que los anticuerpos anti-TIM-3 con huIgG4 Fc. Además, los anticuerpos con huIgG2 Fc demostraron una funcionalidad intermedia entre IgG2sigma e IgG4. El alotipo no tuvo ningún efecto sobre la actividad de los anticuerpos.

Ejemplo 12. Caracterización estructural de anticuerpos anti-TIM-3

[0803] Las secuencias de ADNc y las traducciones de aminoácidos de los anticuerpos se obtuvieron utilizando técnicas estándar a lo largo de la generación de anticuerpos utilizando varias campañas. Después de la determinación de la secuencia polipeptídica, se optimizaron los codones de algunos ADNc de anticuerpos que codifican las regiones variables o los anticuerpos de longitud completa utilizando métodos estándar para aumentar la expresión. Los anticuerpos TM3B103, TM3B105, M3B108, TM3B109 y TM3B113 se aislaron de bibliotecas de presentación de fagos. Los anticuerpos TM3B189, TM3B190, TM3B193, TM3B195 y TM3B196 se generaron inmunizando ratones.

La Tabla 30 muestra las secuencias de HCDR1 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 31 muestra las secuencias de HCDR2 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 32 muestra las secuencias de HCDR3 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 33 muestra las secuencias LCDR1 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 34 muestra las secuencias LCDR2 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 35 muestra las secuencias LCDR3 de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 36 muestra las secuencias de VH de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 37 muestra las secuencias VL de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

La Tabla 38 muestra los marcos de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados.

Tabla 30.

Tabla 31.

Tabla 32.

Tabla 33.

Tabla 34.

Tabla 35.

Tabla 36.

(Continuación)

(Continuación)

Tabla 37.

(Continuación)

Tabla 38.

IGHV3-23 SEQ ID NO: 174

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS

AISGSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

IGHV1-02 SEQ ID NO: 175

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMH WVRQAPGQGLEWMG

RINPNSGGTNYAQKFQG RVTSTRDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAR

IGHV4-30 SEQ ID NO: 176

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYS

GSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR

IGHV1-03 SEQ ID NO: 177 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMG

WINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

IGHV2-26 SEQ ID NO: 178

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNARMGVSWIRQPPGKALEWLA

HIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI

IGHV5-51 SEQ ID NO: 179

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPG

DSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR

IGKV3 -20 SEQ ID NO: 180

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP

IGKV3-11 SEQ ID NO: 171

IGKV4-1SEQ ID NO: 181

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP

IGKV1-39 SEQ ID NO: 182

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPI

GKV1-33 SEQ ID NO: 183

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

d a s n l e t g v p s r f s g s g s g t d f t f t is s l q p e d ia t y y c q q y d n l p

Ejemplo 13. Caracterización de anticuerpos anti-TIM-3

[0804] Los anticuerpos seleccionados se caracterizaron por su unión a células humanas o cyno, y su capacidad para bloquear la unión del ligando galectina 9. La Tabla 39 muestra las características de anticuerpos seleccionados en estos ensayos. Los datos de enlace de célula representan los valores CE⁵⁰calculados de los anticuerpos que se unen a células transfectadas con la proteína recombinante TIM-3 indicada expresada en unidades pg/ml. La inhibición de galectina-9 representa el nivel máximo de inhibición de la unión de galectina-9 a TIM-3 humano observado con los anticuerpos indicados. Los anticuerpos analizados se analizaron como isotipos IgG2sigma.

[0805] Los ensayos de mapeo de epítopos se realizaron recubriendo la proteína huTIM-3-Fc recombinante en placas MSD. Las placas se bloquearon y lavaron, seguido de la adición de la mezcla de mAbs anti-TIM-3 marcados con etiqueta m Sd incubados con concentraciones crecientes de mAbs anti-TIM-3 no marcados. Después de la incubación con agitación suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron y analizaron con un SECTOR Imager 6000. Se consideró que los anticuerpos que competían entre sí para unirse a TIM-3 humano se unían a epítopos similares. Se observó una inhibición positiva si se inhibió >75 % de la unión. La inhibición parcial fue una inhibición del 40-75 %. < 40 % de inhibición se denotó como negativo.

Tabla 39.

Ejemplo 14. Desarrollo de un ensayo funcional in vitro para caracterizar los anticuerpos anti-TIM-3

[0806] La evaluación funcional de los receptores inhibidores como PD-1 se puede realizar utilizando células T de un donante normal que son estimuladas por células dendríticas alogénicas o antígenos específicos, como el toxoide tetánico o el CMV. En este entorno, los cambios en la función de las células T con el tratamiento con anticuerpos pueden detectarse midiendo los niveles de citoquinas sobrenadantes o los marcadores de activación de las células T. Los efectos de los anticuerpos anti-TIM-3 pueden ser muy variables en este tipo de ensayos, con pocos cambios generales en el estado de activación o funcionalidad de las células T en masa (no específicas de antígeno). Por otro lado, el uso de enfoques tetrámeros para seguir subpoblaciones/clones de células T individuales en estos ensayos no proporciona la resolución necesaria para detectar los efectos funcionales de los anticuerpos anti-TIM-3, debido a la baja frecuencia y al perfil funcional heterogéneo de estos. clones de células T. Además, este enfoque requiere la identificación previa de los epítopos reconocidos por las células T específicas de CMV en cada donante.

[0807] CD137 se describió recientemente como un marcador sustituto para células T específicas de antígeno activadas (Wolf et al., (2007) Blood 110(1 ):201 -210; Klinger et al., (2013) PLoS One 8(9): e74231). En nuestros ensayos, el uso de CD137 permitió la identificación de células T CD8+ y CD4+ específicas de antígeno que se expanden en respuesta a la estimulación del antígeno CMV y permitió la detección de los efectos funcionales de los anticuerpos anti-TIM-3. Además de la expresión de CD137, en estos ensayos también se evaluó la secreción de citoquinas por MSD.

[0808] Se probó la actividad de anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados en PBMC estimuladas con CMV pp65. En estos ensayos, los anticuerpos anti-TIM-3 aumentaron la activación de las células T, como lo demuestra el aumento de la expresión de CD137 en las células T CD8+ y CD4+. Además, los anticuerpos anti-TIM-3 seleccionados también mejoraron la secreción de IFN-y y TNF-a en este ensayo.

[0809] La Tabla 40 muestra los resultados del ensayo de CMV en el que se evaluó la expresión superficial mejorada de CD137 en células CD8+ o CD4+ para anticuerpos TIM-3 seleccionados. La tabla muestra los valores de p generados utilizando la prueba T de dos colas (varianza desigual).

Tabla 40.

Ejemplo 15. Generación de anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3

[0810] Se expresaron anticuerpos monoespecíficos PD-1 y TIM-3 seleccionados como IgG1/K, IgG2/K o IgG4/K. Se realizaron sustituciones en las posiciones 405 y 409 (numeración UE) en los anticuerpos monoespecíficos para promover el intercambio de brazos in vitro posterior y la formación de los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos IgG1 e IgG2 anti-PD-1 y anti-TIM-3 se diseñaron para tener una sustitución F405L y K409r , respectivamente, para promover el intercambio de brazos y la generación de anticuerpos biespecíficos. En IgG4, la posición 409 WT es R, por lo que el anticuerpo IgG4 anti-PD-1 no se diseñó y el anticuerpo IgG4 anti-TIM-3 se diseñó para tener sustituciones F405L y R409K. Además de las sustituciones de las posiciones 405 y 409, los mAbs IgG4 se diseñaron para tener la sustitución S228P y los anticuerpos IgG2 se diseñaron opcionalmente para incluir la sustitución IgG2sigma (V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S).

[0811] Los anticuerpos monoespecíficos se expresaron y purificaron usando métodos estándar usando una columna de Proteína A (columna HiTrap MabSelect SuRe). Después de la elución, los grupos se dializaron en D-PBS, pH 7,2.

[0812] Se generaron anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3 combinando un mAb monoespecífico de PD-1 y un mAb monoespecífico de TIM-3 en un intercambio de brazo Fab in vitro como descrito en Publicación de Patente Int. N° WO2011/131746. Brevemente, a aproximadamente 1-20 mg/ml en una relación molar de 1:1 de cada anticuerpo en PBS, pH 7-7,4 y 2-mercaptoetanolamina (2-MEA) 75 mM se mezcló y se incubó a 25-37 °C. durante 2 a 6 h, seguido de la eliminación del 2-MEA mediante diálisis, diafiltración, filtración de flujo tangencial y/o filtración de células rotatorias usando métodos estándar.

[0813] Los anticuerpos biespecíficos se purificaron adicionalmente después del intercambio de brazo Fab in vitro usando cromatografía de interacción hidrofóbica para minimizar los anticuerpos PD-1 y TIM-3 parentales residuales usando métodos estándar.

[0814] Se combinaron anticuerpos anti-PD-1 monoespecíficos seleccionados y anticuerpos anti-TIM-3 en matriz en intercambio de brazo Fab in vitro para generar anticuerpos biespecíficos. La Tabla 41, la Tabla 42 y la Tabla 43 muestran las secuencias VH, VL, HC y LC de los anticuerpos biespecíficos generados y sus isotipos. Los alotipos de anticuerpos G2 fueron G2m(n)/(n-) o G2m(n-).

[0815] En algunos experimentos, se usaron anticuerpos de control que eran monovalentes para PD-1 o TIM-3 con el segundo brazo unido inerte a gp120. El brazo de unión a gp120 tenía una VH de SEQ ID NO: 184 y la VL de SEQ ID NO: 185. La Tabla 44 muestra los anticuerpos de control generados.

SEQ ID NO: 184 ^{V H de m A b de un ión a gp120}

QVQLVQSGAEVK.KPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINP

YNGNKEFSAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDS PQDNYYMDVWGKGTTVIVSS

SEQ ID NO: 185 VL de mAb de unión a gp120 EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRAS

GISDRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERK

Tabla 41.

Tabla 42.

Tabla 43.

S E Q ID NO: 186

QVQLVQSGAEVKKPGSSVK.VSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIP1F

DTANYAQK.FQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKT

VERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQ

f n w y v d g v e v h n a k .t r p r e e q f n s t f r v v s v l t v l h o d w l n g k e y k c k v s n k :g LPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYK.TTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDK.SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 187 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSRYDMSWVRQAPGKGLESVAYISGG GANTYYLDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPAAASSVFLFPPK.PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK.NQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPEN NYKTTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK

SEQ ID NO: 188

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQK.PGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTK.VE1KJITVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTI.TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 189 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASQS1SG IPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKLEIRRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

S E Q ID NO: 190

EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEW1GAIYPG

DGDIRYTQNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARWEKSTTVVQR

NYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK.DYFPEPVTVS

WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVD

K.TVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPK.DTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN

KGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE

SNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY

TQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 191

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQ

GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC

VECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K

SEQ ID NO: 192

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYP

GDGDIRYTQNFKGQVTISADKS1STAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQ

RNYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

NKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 193

DVQMIQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTFVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNR

YTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPTFGSGTKLEMKRTV

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

S E Q ID NO: 194

ElVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWYQQkPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAPITFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLkSGTASVVCLLNNFYPREAkVQWkVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 195 DlQMTQSPSSLSASVGDRVTITCkASENVGTFVSWYQQkPGkAPkLLIYGASNRY TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTkLEIkRTVAAP SVFIFPPSDEQLkSGTASVVCLLNNFYPREAkVQWkVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 241 QVQLVQSGAEVkkPGSSVkVSCkASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIlPIF DTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSL DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDkT VERkCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPkPkDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAkTkPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGkEYkCkVSNkG LPAPIEkTISkTkGQPREPQVYTLPPSREEMTkNQVSLTCLVkGFYPSDIAVEWESN GQPENNYkTTPPMLDSDGSFLLYSkLTVDkSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ kSLSLSPGk

SEQ ID NO: 242

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSRYDMSWVRQAPGkGLESVAYISGG GANTYYLDNVKGRFTISRDNAkNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWG QGTLVTVSSASTkGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVkDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTkTYTCNVDHkPSNTkVDkRVESkY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPkPkDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAkTkPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGkEYkCkVSNkGLPSSI

EkTISkAkGQPREPQVYTLPPSQEEMTkNQVSLTCLVkGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDkSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLGK

S E Q ID NO: 243

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF

DTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC'ARPGLAAAYDTGSL

DYWGQGTLVTVSSASTK.GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKR

VESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPK.PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ

FNWYVDGVEVFINAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSLGK

SEQ ID NO: 244

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYP

GDGDIRYTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQ

RNYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV

DKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP

EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHODWLNGKEYKCKVS

NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 245 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQ

GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP1EK

T1SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

y k t t p p m l d s d g s f f l y s r l t v d k s r w q o g n v f s c s v m h e a l h n h y t q k s l s l s p GK

S E Q ID NO: 246

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQ

GTLVTVSSASTK.GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG

PPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

NNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSLGK

SEQ ID NO: 247

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGK.GLEWMGAIYP

GDGDIRYTQNFKGQVTISADKS1STAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQ

RNYFDYWGQGTTVTVrSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHRPSNTKV

DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP

EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS

NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDK.SRWQEGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 248

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQ

GTLVTVSSASTK.GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK.DYFPEPVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC

VECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT

ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK.SLSLSPG

K

Tabla 44.

Ejemplo 16. Caracterización de anticuerpos biespecíficos PD-1/TIM-3

[0816] Los anticuerpos biespecíficos antagonistas generados se analizaron en el ensayo CMV por su capacidad para mejorar las respuestas de células T específicas de antígeno. La funcionalidad se midió evaluando la expresión de CD137 en células T CD4+ y CD+ y mediante los niveles de IFN-y y TNF-a en los sobrenadantes del cultivo como se describe en el Ejemplo 14. La Tabla 45 y la Tabla 46 resumen la actividad de PD-1/biespecífico. Anticuerpos TIM-3 en este ensayo para las diferentes lecturas. Como se muestra en esta tabla, las moléculas biespecíficas seleccionadas condujeron a aumentos significativos en la expresión de CD137 en las células T CD4+ y CD8+ y en los niveles de IFN-Y y TNF-a secretados. En general, los biespecíficos de PD-1/TIM-3 con huIgG2sigma Fc tuvieron la actividad más robusta, seguidos de aquellas moléculas con huIgG2 y luego huIgG4.

Tabla 45.

Tabla 46.

Ejemplo 17. Los anticuerpos anti-PD1 aumentan la expresión de TIM-3 en tumores

[0817] Efecto del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 en la expresión de TIM-3 en los tumores se evaluaron en el modelo de ratón de carcinoma de colon CT26 o MC38.

[0818] Se implantaron subcutáneamente ratones Balb/c con 1 X 106 tumores de carcinoma de colon CT26. Siete días después del implante de células tumorales, se midieron los tumores y los ratones se aleatorizaron según el tamaño del tumor. El tratamiento con PBS o 10 mg/kg de anticuerpos anti-PD-1 de ratón (clon RMP1-14, BioXCell) comenzó el día 7 después del implante de células tumorales y continuó cada dos semanas durante el resto del estudio. Para analizar la expresión de células T de TIM-3, los tumores se recolectaron el día 22 y se disociaron usando GentleMACS (Miltenyi). La tinción para citometría de flujo se realizó con Live/Dead y marcadores para CD3, CD4, CD8 y TIM-3. La citometría de flujo se realizó en un LSR Fortessa (BD). Los datos se analizaron usando el software Flow Jo.

[0819] Se implantaron subcutáneamente ratones hembra C57B1/6 de tipo salvaje con 5 X 105 células de carcinoma de colon MC-38 suspendidas en PBS. Se midieron los tumores y los ratones se aleatorizaron según el tamaño del tumor (50-100 mm3). El tratamiento con PBS o 10 mg/kg de PD-1 anti-ratón (clon RMP1-14, BioXCell) comenzó después de la aleatorización y continuó cada dos semanas durante el resto del estudio. Para perfilar las células T que se infiltran en el tumor, los tumores se recolectaron y disociaron usando GentleMACS (Miltenyi) 12, 15, 19 o 22 días después del implante.

[0820] La tinción para citometría de flujo se llevó a cabo con Vivo/Muerto y marcadores para CD45, Thy1, CD3, CD4, Cd 8, TIM-3, CD137, OX40, GITR, TIGIT. Los datos de citometría de flujo se recogieron en un LSR Fortessa (BD). Los datos se analizaron con el software FlowJo (v9.9.4) y se visualizaron con GraphPad Prism. Las estadísticas fueron generadas por GraphPad Prism.

[0821] El análisis de la expresión de TIM-3 en células T CD8+ aisladas de tumores CT26 en el día 22 reveló un aumento de la expresión de TIM-3 en las muestras tratadas con PD-1, en comparación con el control de PBS. La Figura 1A muestra la intensidad fluorescente media de la expresión de TIM-3 en los dos grupos de tratamiento.

[0822] La expresión de TIM-3 también aumentó en tumores MC-38 en las muestras tratadas con mAb anti-PD-1 en comparación con el control de PBS. La Figura 1B muestra la intensidad fluorescente media geométrica de la expresión de TIM-3 en la población de LIT CD8+. La Figura 1C muestra el porcentaje (%) de frecuencia relativa de las células TIM-3+ CD8+ del total de CD8+ LIT.

[0823] Estos datos muestran que TIM-3 se regula positivamente en respuesta al tratamiento con anti-PD-1, lo que apoya la racionalidad para dirigirse a TIM-3 en sujetos tratados con PD-1.

[0824] La expresión de CD137, OX40 y GITR también se analizó en células T CD8+ infiltrantes en tumores MC38 aislados de ratones tratados con anticuerpos anti-PD-1 de ratón. Estos resultados mostraron que tanto la frecuencia como el nivel (gMFI) de la expresión de los receptores coestimuladores CD137, OX40 y GITR de la familia TNF aumentaron después del bloqueo de PD-1. La Figura 2A y la Figura 2B muestran la gMFI y la frecuencia relativa de expresión de CD137 en CD8 LIT, respectivamente. La Figura 3A y la Figura 3B muestran la gMFI y la frecuencia relativa de la expresión de OX40 en CD8 LIT, respectivamente, y la Figura 4A y la Figura 4B muestran la gMFI y la expresión relativa de GITR en CD8 LIT, respectivamente.

[0825] Estos datos respaldan la racionalidad para dirigirse a CD137, OX40 y/o GITR en sujetos tratados con PD-1.

Ejemplo 18. Actividad de los anticuerpos anti-TIM-3 tras el bloqueo de PD-1

[0826] La actividad de los anticuerpos anti-TIM-3 también se analizó tras el bloqueo de anticuerpos anti-PD-1 en el ensayo CMV. En estos experimentos, se incubaron PBMC de un donante normal (CMV-suero positivo) con grupos de péptidos pp65 y anticuerpos anti-PD-1 durante 5 días. El día 5, se recogieron los sobrenadantes y las células se reestimularon con un conjunto de péptidos pp65 en presencia de anticuerpos anti-TIM-3 o anti-PD-1. Los niveles de IFN-y en el sobrenadante se midieron 24 horas más tarde. El tratamiento con anticuerpos anti-TIM-3 después de 5 días de bloqueo anti-PD-1 resultó en un aumento significativo de los niveles de IFN-y. Este efecto fue significativo (p=0,0183) en comparación con el tratamiento continuo con anti-PD-1. En el experimento se utilizaron el anticuerpo anti-TIM-3 TM3B403 y el anticuerpo anti-PD-1 PD1B244. La Figura 5 muestra los niveles aumentados de IFN-y en el ensayo de CMV, en el que se trataron las PBMC con el anticuerpo anti-TIM-3 TM3B105 después de 5 días de tratamiento con anti-PD-1 PD1B244. Los valores representan el promedio de seis réplicas biológicas utilizadas para cada condición.

Ejemplo 19. Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TIM-3

[0827] Se realizó espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio en solución (HDX-MS) para identificar los epítopos de unión de TMB403 y TMB291. Para los experimentos, la VH y la VL de TM3B403 y Tm 3b291 se clonaron como IgG1 Fab con una etiqueta de hexahistidina en el extremo C-terminal. Los Fab se generaron a partir de transfecciones transitorias de células HEK293 Expi en matraces de agitación en suspensión. Se usó la quimera TIM-3 IgG1 Fc, Ser22-Arg200 (número de acceso Q8TDQ0), producida en la línea celular de mieloma de ratón (derivada de NS0) de R&D Systems (número de catálogo 2365-Tm ).

[0828] Para el intercambio H/D, los procedimientos usados para analizar la perturbación Fab fueron similares a los descritos previamente (Hamuro et al., Biomolecular Techniques 14: 171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45: 8488 8498)., 2006) con algunas modificaciones. Brevemente, la proteína de fusión TIM-3/Fc humana desglicosilada o la mezcla de TIM-3-Fc humana más Fab desglicosilada se incubó con tampón marcador de óxido de deuterio a 0°C durante varios tiempos hasta 2 horas. El intercambio de deuterio se inactivó agregando clorhidrato de guanidina y la muestra inactivada se sometió a digestión con pepsina en columna y análisis CL-EM. Los espectros de masas se registraron en modo solo MS. Para el cálculo de la incorporación de deuterio, los espectros de masas para un péptido dado se combinaron a través del pico del cromatograma de iones extraído y se calculó el promedio ponderado m/z. El aumento de masa desde la masa del péptido nativo (0 min) hasta la masa promedio ponderada corresponde al nivel de incorporación de deuterio. Aproximadamente el 98,4 % de la proteína se podría asignar a péptidos específicos.

[0829] Los niveles de deuterio en los péptidos identificados se controlaron a partir del cambio de masa en CL-EM. Se trazaron las curvas de acumulación de deuterio seleccionadas, que muestran una diferencia significativa en los niveles y/o pendientes de deuterio, a lo largo del tiempo de intercambio para los péptidos. La proteína de fusión Tim-3/Fc humana desglicosilada mostró una reducción significativa en las captaciones de deuterio al unirse a TM3B403 en las secuencias ³²WGKGACPVFECGNVVL⁴⁷(SEQ ID NO: 261) y al unirse a TM3B291 en las secuencias ⁹⁰RIQIPGIMNDEKF¹⁰²(SEQ ID NO: 262). Estas regiones con una reducción significativa de las captaciones de deuterio tras la unión a Fab pueden considerarse, por tanto, como epítopos principales de los mAb.

[0830] Un segmento, ⁵⁰DERDVNY⁵⁶, (SEQ ID NO: 263) demostró una modesta reducción en el intercambio de deuterio al unirse a TM3B403 o TM3B291. Esta región también puede considerarse como un epítopo potencial para ambos anticuerpos.

[0831] Los principales epítopos de unión para TM3B403 o TM3B291 son diferentes. Sin embargo, pueden compartir la región de protección modesta similar, ⁵⁰DERDVNY⁵⁶, (SEQ ID NO: 263) en base a los resultados del mapeo HDX. Para ayudar a evaluar si esta región contribuye a la región del epítopo de unión común para ambas moléculas Fab, se realizó un ELISA de competición. La proteína Tim-3/Fc humana recombinante se revistió directamente sobre placas que luego se bloquearon y lavaron. Una mezcla de TM3B291 Fab marcado con rutenio (Ru) que se incubó previamente con diferentes concentraciones de TM3B105 o TM3B291 sin marcar. Las placas se incubaron, lavaron y se dispensó el tampón de lectura T de MSD en cada pocillo seguido de lectura con un SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

[0832] El análisis de competencia demostró que TM3B403 compitió por unirse a TIM-3 con TM3B291. Este resultado podría indicar que la región modestamente protegida, DERDVNY (SEQ ID NO: 263) es parte del epítopo para ambos anticuerpos o que los anticuerpos pueden bloquear estéricamente la unión entre sí debido a la proximidad de sus epítopos.

Ejemplo 20. El bloqueo de TIM-3 aumenta la expresión de TIGIT en LIT CD8⁺

[0833] Se evaluó el efecto del tratamiento con anticuerpos anti-TIM-3 sobre la expresión de TIGIT en tumores en modelos de ratón de carcinoma de colon CT26 y MC38. Los estudios se realizaron como se describe en el Ejemplo 17 excepto que se usaron 10 mg/ml de anticuerpo anti-TIM-3 RMT3-23 (Bioxcell).

[0834] La expresión de TIGIT en CD8+ LIT (Figura 19A, Figura 20A) y la frecuencia relativa de TIGIT+ LIT (Figura 19B, Figura 20B) estaban elevadas en modelos tumorales tanto de CT26 (Figura 19A, Figura 19B) como MC38 (Figura 20A, Figura 20B) después del bloqueo de TIM-3.

Ejemplo 21. La expresión de TIM-3 aumenta después del bloqueo de PD-1 ex vivo en PBMC de pacientes con melanoma

[0835] Las PBMC de pacientes con melanoma sin tratamiento previo se estimularon con grupos de péptidos de antígenos de melanoma (NYESO, gp100, MART-1) en presencia de anticuerpos bloqueantes de la función anti-PD-1 o anti-TIM-3. La expresión de TIM-3 se evaluó en células reestimuladas con péptido el día 6. Los resultados mostraron aumentos significativos en la frecuencia de linfocitos T CD8+ TIM-3+ en las muestras tratadas con anti-PD-1 en comparación con los controles o las PBMC tratadas con TIM-3 (Figura 21).

[0836] El día 0, las PBMC congeladas de pacientes con melanoma sin tratamiento previo se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Las células se descongelaron, lavaron y contaron en medios RPMI completos (RPMI FBS al 10 % piruvato de sodio al 1 % NEAA al 1 % pen/estrep al 1 %). Las células se colocaron en placas a razón de 200.000 células por pocillo en una placa con fondo en U de 96 pocillos en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores de la función anti-PD-1 o anti-TIM-3 (PD1B244 y TM3B403, respectivamente) y 1 pg/ml de grupos de péptidos de antígenos de melanoma (NY-ESO, gp100, MART-1) durante 6 días a 37°C. Las células se volvieron a estimular con el grupo de péptidos el día 6 y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión de PD-1 y TIM-3, así como los marcadores de activación y proliferación de células T.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente a PD-1 o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 56.

2. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una cadena pesada (HC) de SEQ ID NO: 72 y una cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 73.

3. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene una, dos o tres de las siguientes propiedades:

a) mejora la activación de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno de una manera dependiente de la dosis, en la que la activación se mide usando un ensayo de recuperación de antígeno de citomegalovirus (ensayo CMV) como se describe en el Ejemplo 1;

b) se une a PD-1 humano con una Kd de menos de 1 nM, donde la Kd se mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C;

c) se une a cynomolgus PD-1 de SEQ ID NO: 3 con la Kd de menos de 1 nM, donde la Kd se mide usando el sistema ProteOn XPR36 a 25°C.

4. El anticuerpo o la parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo es humano.

5. El anticuerpo o la parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo es:

a) un isotipo IgG4;

b) un isotipo IgG1;

c) un isotipo IgG2;

d) un isotipo IgG3;

e) un isotipo IgG4 que comprende una sustitución S228P;

f) un isotipo IgG1 que comprende las sustituciones L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S y P331S; g) un isotipo IgG2 que comprende las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S; h) un isotipo IgG4 que comprende las sustituciones F234A, L235A, G237A, P238S y Q268A;

i) un isotipo IgG1 que comprende las sustituciones L234A, L235A o L234A y L235A;

j) un isotipo IgG4 que comprende sustituciones F234A, L235A o F234A y l235A;

k) un isotipo IgG2 que comprende una sustitución V234A; o

l) un isotipo IgG4 que comprende las sustituciones S228P, F234A y L235A, en el que la numeración de los residuos está de acuerdo con el índice EU.

6. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, que opcionalmente se une a PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), LAG-3 (SEQ ID NO: 293), TIM-3 (SEQ ID NO: 138), CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), CEACAM-5 (SEQ ID NO: 307), OX-40 (SEQ ID NO: 279), GITR (SEQ ID NO: 271), CD27 (SEQ ID NO: 280), VISTA (SEQ ID NO: 286), CD137 (SEQ ID NO: 281), TIGIT (SEQ ID NO: 301) o CTLA-4 (SEQ ID NO: 292).

7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o la porción del mismo que se une al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptado.

8. Un polinucleótido que:

a) codifica la VH de SEQ ID NO: 48 y la VL de SEQ ID NO: 56;

b) codifica la HC de SEQ ID NO: 72 y la LC de SEQ ID NO: 73; o

c) comprende las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 196 y 197.

9. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

10. Una célula huésped que comprende:

a) el vector de la reivindicación 9; o

b) un polinucleótido que codifica la VH de SEQ ID NO: 48 o la HC de SEQ ID NO: 72, o que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 196; y

c) un polinucleótido que codifica la VL de SEQ ID NO: 56 o la LC de SEQ ID NO: 73, o que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 197.

11. Un método para producir un anticuerpo antagonista que se une específicamente a PD-1 o una parte del mismo que se une al an tígeno , que c o m p re n d e cu ltiva r la cé lu la hu ésp ed de la re iv ind ica c ión 10 en co n d ic io n e s en las que se exp resa el an ticu e rp o o la pa rte de l m ism o que se une al an tígeno , y re cu p e ra r el an ticu e rp o o la po rc ión del m ism o que se une al a n tíg eno p ro du c ido po r la cé lu la huésped .

12. El anticuerpo aislado o la porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para usar en un método para tratar un cáncer en un sujeto.

13. El anticuerpo aislado o la porción del mismo que se une al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para uso de acuerdo con la reivindicación 12, donde el cáncer es

(a) un tumor sólido, por ejemplo un melanoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas escamosas (CPCNP), un cáncer de pulmón no microcítico no escamoso, un cáncer colorrectal, un cáncer de próstata, un cáncer de próstata resistente a la castración, un cáncer de estómago, un cáncer de ovario, un cáncer gástrico, un cáncer de hígado cáncer, un cáncer de páncreas, un cáncer de tiroides, un carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, carcinomas del esófago o del tracto gastrointestinal, un cáncer de mama, un cáncer de las trompas de Falopio, un cáncer de cerebro, un cáncer de uretra, un cáncer genitourinario, un endometriosis, un cáncer de cuello uterino o una lesión metastásica del cáncer; o (b) una malignidad hematológica, por ejemplo, un linfoma, un mieloma o una leucemia.

14. El anticuerpo o la porción del mismo que se une al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una composición farmacéutica de la reivindicación 7 para usar en un método para mejorar una respuesta inmune en un sujeto que lo necesita durante un tiempo suficiente para mejorar la respuesta inmune, opcionalmente en el que el sujeto tiene un cáncer o una infección viral.

15. El anticuerpo o la porción del mismo que se une al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o una composición farmacéutica de la reivindicación 7, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 14, en donde el anticuerpo, la porción del mismo que se une al antígeno, o la composición farmacéutica se administra en combinación con un segundo agente terapéutico, opcionalmente en donde:

(A) el anticuerpo o su porción de unión a antígeno y el segundo agente terapéutico se administran simultáneamente, secuencialmente o por separado, y/o

(B) el segundo agente terapéutico es:

a) un fármaco de referencia para el tratamiento del tumor sólido o la malignidad hematológica, en el que el fármaco de referencia es anastrozol, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfán, inyección de busulfán, capecitabina, N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, arabinósido de citosina, inyección de liposomas de citarabina, dacarbazina, dactinomicina, clorhidrato de daunorrubicina, inyección de liposomas de citrato de daunorrubicina, dexametasona, docetaxel, clorhidrato de doxorrubicina, etopósido, fosfato de fludarabina, 5-fluorouracilo, flutamida, tezacitibina, gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecán, L-asparaginasa, leucovorina cálcica, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, paclitaxel, fénix, pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina, citrato de tamoxifeno, teniposida, 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina, clorhidrato de topotecán para inyección, vinblastina, vincristina, vinorelbina, ibrutinib, idelalisib o brentuximab vedotina;

b) un agonista de CD86 (SEQ ID NO: 264), CD80 (SEQ ID NO: 265), CD28 (SEQ ID NO: 266), ICOS (SEQ ID NO: 267), ligando de ICOS (SEQ ID NO: 268), TMIGD2 (SEQ ID NO: 269), CD40 (SEQ ID NO: 270), GITR (SEQ ID NO: 271), ligando 4-1BB (SEQ ID NO: 271), ligando OX40 (SEQ ID NO: 272), CD70 (SEQ ID NO: 274), CD40L (SEQ ID NO: 275), TNFRSF25 (SEQ ID NO: 264), LIGHT (SEQ ID NO: 277), ligando GITR (SEQ ID NO: 278), OX-40 (SEQ ID NO: 279), CD27 (SEQ ID NO: 280), CD137 (SEQ ID NO: 281), NKG2D (SEQ ID NO: 282), CD48 (SEQ ID NO: 283), CD226 (SEQ ID NO: 284), o MICA (SEQ ID NO: 285);

c) un inhibidor de PD-1 (SEQ ID NO: 1), PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), VISTA (SEQ ID NO: 286), BTNL2 (SEQ ID NO: 287), B7-H3 (SEQ ID NO: 288), B7-H4 (SEQ ID NO: 289), HVEM (SEQ ID NO: 290), HHLA2 (SEQ ID NO: 291), CTLA-4 (SEQ ID NO: 292), LAG-3 (SEQ ID NO: 293), TIM-3 (SEQ ID NO: 138), BTLA (SEQ ID NO: 294), CD160 (SEQ ID NO: 295), CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), LAIR1 (SEQ ID NO: 297), TGFp (SEQ ID NO: 298), IL-10 (SEQ ID NO: 299), CD96 (SEQ ID NO: 300), TIGIT (SEQ ID NO: 301), NKG2A (SEQ ID NO: 302), CD112 (SEQ ID NO: 303), CD47 (SEQ ID NO: 304), SIRPA (SEQ ID NO: 305) o CD244 (SEQ ID NO: 306);

d) un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3;

e) un anticuerpo antagonista que se une específicamente a TIM-3 que comprende la VH y la VL de

i) SEQ ID NO: 145 y 155, respectivamente;

ii) SEQ ID NO: 146 y 156, respectivamente;

iii) SEQ ID NO: 148 y 157, respectivamente;

iv) SEQ ID NO: 147 y 155, respectivamente;

v) SEQ ID NO: 149 y 158, respectivamente;

vi) SEQ ID NO: 150 y 159, respectivamente;

vii) SEQ ID NO: 151 y 160, respectivamente;

viii) SEQ ID NO: 152 y 161, respectivamente;

ix) SEQ ID NO: 153 y 162, respectivamente;

x) SEQ ID NO: 154 y 163, respectivamente; o

xi) SEQ ID NO: 172 y 173, respectivamente;

f) un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR);

g) una vacuna;

h) un anticuerpo agonista que se une específicamente a GITR;

i) un anticuerpo agonista que se une específicamente a OX40;

j) un anticuerpo agonista que se une específicamente a OX40, que comprende la VH y la VL de SEQ ID NO: 309 y 310, respectivamente;

k) un anticuerpo agonista que se une específicamente a OX40, que comprende la VH y la VL de SEQ ID NO: 311 y 312, respectivamente;

l) un anticuerpo agonista que se une específicamente a CD137;

m) radioterapia; o

n) cirugía.