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KR20060079180A - Ｎｋ 세포 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Ｎｋ 세포 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20060079180A
KR20060079180A KR1020067000025A KR20067000025A KR20060079180A KR 20060079180 A KR20060079180 A KR 20060079180A KR 1020067000025 A KR1020067000025 A KR 1020067000025A KR 20067000025 A KR20067000025 A KR 20067000025A KR 20060079180 A KR20060079180 A KR 20060079180A
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KR
South Korea
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antibody
antibodies
cells
kir2dl1
kir
Prior art date
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Application number
KR1020067000025A
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쇠렌 베르그 패드크재르
알레싼드로 모레타
마리엘라 델라 치에사
파스칼 안드레
로렌트 가우티에르
Original Assignee
노보 노르디스크 에이/에스
이나뜨 파르마
유니버시티 오브 제노아
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Filing date
Publication date
Application filed by 노보 노르디스크 에이/에스, 이나뜨 파르마, 유니버시티 오브 제노아 filed Critical 노보 노르디스크 에이/에스
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Abstract

본 발명은 대상에서 면역 반응을 조절하기 위한 신규 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 포유류 대상에서 NK 세포의 활성을 조절하고 NK 세포의 세포독성의 증강을 허용하는 특정 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 항체의 단편 및 유도체를 포함하는 약제학적 조성물과 특히 대상에서 NK세포 활성 또는 세포독성을 증가시키기 위한 치료법에서의 그들의 사용은 물론이고, 그러한 항체의 단편 및 유도체에 관한 것이다.
KIR2DL, 면역 반응, NK 세포, 세포독성, 리간드, 종양, 시토카인, DF-200, CDR, Pan2D, 항체, 사이노몰거스 원숭이.

Description

ＮＫ 세포 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR REGULATING NK CELL ACTIVITY}
본 발명은 NK 세포의 세포 표면에 존재하는 두개 이상의 저해 수용체와 교차반응하고 포유류 대상 또는 생물학적 샘플에서 NK 세포 세포독성을 증강하는 항체, 항체 단편, 및 그것의 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 항체, 단편, 변형체, 및 유도체; 그것을 포함한 제약학 조성물을 만드는 방법 및 특히 대상에서 NK 세포 활성 또는 세포독성을 증가시키기 위한 요법에서 그러한 분자 및 조성물의 사용에 관한 것이다.
자연 킬러(NK) 세포는 비-고식적 면역에 수반된 림프구의 하위-집단이다. NK 세포는 혈액 샘플, 세포성분채집술, 수집 등과 같은 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 얻어질 수 있다.
NK 세포의 특성 및 생물학적 성질은 CD16, CD56, 및/또는 CD57을 포함하는 표면항원의 발현; 세포 표면위의 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 착체의 부재 ; 특이적 세포용해 효소의 활성화에 의한 "자가" MHC/HLA 항원을 발현하는데 실패하는 세포에 결합하고 그것을 죽이는 능력 ; NK 활성화 수용체-리간드를 발현하는 종양 세포 또는 다른 질병의 세포를 죽이는 능력 ; 면역반응을 자극하거나 저해하는 시 토카인을 방출하는 능력; 및 세포 분할의 다중 순환을 겪고 모 세포와 유사한 생물학적 성질을 갖는 딸 세포를 생산하는 능력을 포함한다. 본 발명의 문맥에서 "활성" NK 세포는 생물학적으로 활성 NK 세포, 보다 구체적으로는 표적 세포를 용해하는 능력을 갖는 NK 세포를 명시한다. 예를 들어, "활성" NK 세포는 NK 활성화 수용체-리간드를 발현하고 "자가" MHC/HLA 항원 (KIR-부적합 세포)을 발현하지 못하는 세포를 죽일 수 있다.
그들의 생물학적 성질에 근거하여, NK 세포의 조정에 의존하는 다양한 치료 및 백신 전략이 당업계에 제안되었다. 그러나, NK 세포 활성은 자극 및 저해 신호 둘다를 수반하는 복합 메카니즘에 의해 조절된다. 따라서, 효과적인 NK 세포-매개된 요법은 이들 세포의 자극과 저해 신호의 중화 모두를 필요로 할 수 있다.
NK 세포는 주요 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I- 특이적 저해 수용체 (Karre 등, 1986; Sohlen 등, 1989)에 의해 네거티브하게 조절된다. 이들 특이적 수용체는 다른 세포에 존재하는 MHC 클래스 I 분자 또는 HLA의 다형 결정자에 결합하고 NK 세포 용해를 저해한다. 사람에서, 킬러 Ig-형 수용체 (KIR)라 불리는 수용체의 특정 수의 패밀리는 HLA 클래스 I 대립유전자의 그룹을 인지한다.
KIR는 NK 세포를 포함하는 림프구의 특정 서브셋에 존재하는, 수용체의 큰 패밀리이다. KIR 에 대한 명명법은 세포외 도메인 (KIR2D 또는 KIR3D)의 수와 세포질 꼬리가 길거나 (KIR2DL 또는 KIR3DL)혹은 짧은지 (KIR2DS 또는 KIR3DS)여부에 근거한다. 사람 내에서, 주어진 KIR의 존재 또는 부재는 단일 개개인에 존재하는 NK 집단 내에서 하나의 NK 세포로부터 다른것에 이르기까지 가변적이다. 사람 집 단 내에서 또한 비교적 높은 수준의 KIR 분자의 다형태가 존재하고, 특정 KIR 분자는 일부에 존재하지만 모든 개개인에 존재하지는 않는다. 특정 KIR 유전자 생성물은 적절한 리간드에 결합될 때, 림프구 활성의 자극을 유발한다. 확인된 자극 KIR 는 모두 면역자극 모티프 (ITAM)를 갖는 어댑터 분자와 연합되는 하전된 트랜스막 잔기를 갖는 짧은 세포질 꼬리를 가진다. 다른 KIR 유전자 생성물은 자연적으로 저해한다. 확인된 모든 저해 KIR는 긴 세포질 꼬리를 갖고 KIR 서브타입에 따라, HLA 항원의 다른 서브셋과 상호작용하는 것으로 보인다. 저해 KIR는 인산분해효소를 채용하는 그들의 세포질내 부분 하나 또는 몇개의 저해하는 모티프에 나타난다. 공지된 저해 KIR 수용체는 KIR2DL 및 KIR3DL 서브패밀리의 맴버를 포함한다. 두개의 Ig 도메인(KIR2D)을 갖는 KIR 수용체는 HLA-C 동종이형: KIR2DL2 (앞서 지정된 p58.2)을 확인하거나 또는 밀접히 관련된 유전자 생성물 KIR2DL3는 그룹 2 HLA-C 동종이형 (Cwl, 3,7, 및 8)에 의해 공유된 에피토프를 인식하는 반면, KIR2DL1 (p58. 1)는 상반 그룹 1 HLA-C 동종이형 (Cw2,4, 5, 및 6)에 의해 공유된 에피토프를 인식한다. KIR2DL1에 의한 인식은 HLA-C 대립유전자의 위치 80에서 Lys 잔기의 존재에 의해 지시된다.
KIR2DL2 및 KIR2DL3 인식은 위치 80에서 Asn 잔기의 존재에 의해 지칭된다. 중요하게는 큰 다수의 HLA-C 대립유전자가 위치 80에서 Asn 또는 Lys 잔기 중의 하나를 갖는다. 3개의 Ig 도메인, KIR3DL1 (p70)을 갖는 하나의 KIR는, HLA-Bw4 대립유전자에 의해 공유된 에피토프를 인식한다. 마지막으로, 3개의 Ig 도메인 KIR3DL2 (pu40)을 갖는 분자의 호모다이머는 HLA-A3 및 -A11을 인식한다.
저해 KIR 및 다른 클래스-I 저해 수용체 (Moretta 등, 1997; Valiante 등, 1997a; Lanier, 1998)가 NK 세포에 의해 공동-발현될 수 있지만, 어떠한 주어진 개인의 NK 레퍼토리에서 단일 KIR을 발현하는 세포가 존재하고, 따라서, 대응하는 NK 세포는 특이적 클래스 I 대립유전자 그룹을 발현하는 세포에 의해서만 차단된다.
KIR 부적당하게 짝지어진 NK 세포 집단 또는 클론, 즉, 숙주의 HLA 분자와 호환되지 않는 KIR를 발현하는 NK 세포의 집단은, 동종이계 이식술 (Ruggeri 등 , 2002)에서 나타난 이식 항-백혈병 효과의 가장 유사한 매개체로 나타났다. 주어진 개인에서 이 효과를 다시생산하는 한가지 방법은 KIR/HLA 상호작용을 차단하는 시약을 이용하는 것일 것이다.
KIR2DL1에 대해 특이적인 단일클론 항체는 KIR2DL1과 Cw4 (또는 유사한것) 대립유전자 (Moretta 등, 1993)과의 상호작용을 차단하는 것으로 나타났다. KIR2DL2/3에 대한 단일클론 항체는 또한 KIR2DL2/3의 HLACw3 (또는 유사한것) 대립유전자 (Moretta 등, 1993)와의 상호작용을 차단하는 것으로 기술되었다. 그러나, 임상 상황에서 그러한 시약의 사용은 어떠한 주어진 환자가 클래스 1 또는 클래스 2 HLA-C 대립유전자를 발현하고 있는가 여부에 상관없이, 모든 환자를 치료하기 위한 두가지 치료 mAbs의 개발을 필요로 할 것이다. 더욱이, 사람은 어떤 치료 항체를 사용할지 결정하기 전에, 각각의 환자가 어떤 HLA 타입이 발현할 것인지를 미리 결정해야 하기 때문에, 따라서 더 높은 치료 비용을 초래한다.
Watzl 등, 조직 항원, 56, p. 240 (2000)는 KIR의 다중 이소타입을 인지하는 교차-반응하는 항체를 제조하였지만, 그러한 항체는 NK 세포 활성의 증강작용을 나 타내지 않았다. G. M. Spaggiara 등, 혈액, 100, pp. 4098-4107 (2002)은 다양한 KIR에 대해서 수많은 단일클론 항체를 이용하는 실험을 수행하였다. 그러한 항체중 하나인, NKVSF1은, CD158a KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) 및 p50.3 (KIR2DS4)의 공통 에피토프를 인지하는 것으로 말해졌다. NKVSF1는 NK 세포 활성을 증강할 수 있다고 암시되지 않았으며 그것이 치료제로서 사용될 수 있다는 제안은 없다. 따라서, 지금까지 NK 세포 활성의 조정에서 실용적이고 효과적인 접근은 업계에서 이용가능하게 만들어지지 않았고 여전히 특이적 시약을 사용하는 HLA 대립유전자-특이적 중재를 필요로한다.
발명의 개요
본 발명은 이제 신규 항체, 조성물, 및 NK 세포 활성화에서 현재의 어려움을 극복하고 추가의 이로운 특징과 잇점들을 제공하는 방법을 제공한다. 한가지 예시적 관점에서, 본 발명은 사실상 모든 사람에서 사람 NK 세포의 활성화를 촉진하는 단일 항체를 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 다양한 저해 KIR 그룹과 교차-반응하고 그들의 저해 신호를 중화하고, 그 결과 그러한 저해 KIR 수용체를 발현하는 NK 세포에서 NK 세포 세포독성의 증강작용을 초래하는 신규한 특이적 항체를 제공한다. 다중 KIR 유전자 생성물과 교차-반응하는 이러한 능력은 본 발명의 항체가 대상의 HLA 타입을 미리결정하는 부담이나 비용없이, 대부분의 사람 대상에서 NK 세포 활성을 증가시키는데 효과적으로 사용되도록 허용한다.
첫번째 관점에서, 본 발명은 항체, 항체 단편, 및 그들의 유도체를 제공하고, 이때 상기 항체, 단편, 또는 유도체가 NK 세포의 표면에서, 적어도 두개의 저해 KIR 수용체와 교차 반응하고 NK 세포의 저해 신호를 중화하고, NK 세포의 활성을 증강시킨다. 보다 바람직하게는, 항체는 사람 KIR2DL 수용체의 공통 결정자에 결합한다. 더더욱 명확하게는, 본 발명의 항체는 적어도 KIR2DL1, KIR2DL2, 및KIR2DL3 수용체에 결합한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "KIR2DL2/3" KIR2DL2 및 KIR2DL3 수용체 중 하나 또는 둘다를 말한다. 이들 두개의 수용체는 매우 높은 상동성을 가지고, 아마도 동일한 유전자의 알렐릭(allelic) 형태로 추정되고, 당업계에서 상호교환가능한 것으로 간주된다. 따라서, KIR2DL2/3는 본 발명의 목적을 위한 단일 저해 KIR 분자 그리고 오로지 KIR2DL2 및 KIR2DL3 과 교차-반응하는 항체로 간주되고 어떤 다른 저해 KIR 수용체도 본 발명의 범위내에 있지 않다.
본 발명의 항체는 특이적으로 MHC 또는 HLA 분자의 적어도 두개의 저해 KIR 수용체로의 결합을 저해하고 NK 세포 활성을 촉진한다. 두가지 활성 모두는 본원에서 사용된 용어 "KIR의 저해하는 활성을 중화한다" 에 의해 추론된다. 본 발명의 문맥에서 본 발명의 항체의 "NK 세포 활성을 촉진하고,""NK 세포 세포독성을 촉진하고," "NK 세포를 촉진하고,""NK 세포 활성을 강력하게 하고,""NK 세포 세포독성을 강력하게 하고," 또는 "NK 세포를 강력하게 하는" 능력은 항체가 그들의 표면에서 저해 KIR 수용체를 발현하는 NK 세포가 그들의 표면에서 특정한 저해 KIR 수용체 (예를 들어, 특정한 HLA 항원)에 대한 대응하는 리간드를 발현하는 세포를 용해할 수 있도록 허용한다는 것을 의미한다. 특정한 관점에서, 본 발명은 특이적으로 HLA- C 분자의 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 수용체로의 결합을 저해하는 항체를 제공한다. 또다른 특정 관점에서, 본 발명은 생체내에서 NK 세포 활성을 촉진하는 항체를 제공한다.
적어도 하나의 KIR2DL1 또는 KID2DL2/3가 적어도 약 90% 의 사람 집단에 존재하기 때문에, 보다 바람직한 본 발명의 항체는 HLA-C 동종이형-관련된 세포의 대부분, 각각 그룹 1 HLA-C 동종이형 및 그룹 2 HLA-C 동종이형에 대해서, NK 세포 활성을 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 대부분의 사람 개개인에서 전형적으로 약 90% 또는 그 이상의 사람 개개인에서 효과적으로 NK 세포를 활성화하거나 강력하게 하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 단일 항체 조성물은 대부분의 사람 조성물을 치료하는데 사용될 수 있고, 알렐릭 그룹을 결정하거나 항체 칵테일을 사용하는데 좀처럼 필요하지 않다.
본 발명은 처음으로, 교차-반응성 및 중화 저해 KIR에 대한 항체가 발생될 수 있고, 그러한 항체는 넓은 범위의 사람 그룹에서 NK 세포의 효과적인 활성화를 허용한다는 것을 증명한다.
따라서 본 출원의 특정 목적은 항체에 존재하고, 이때 상기 항체는 특이적으로 KIR2DL1와 KIR2DL2/3 사람 수용체 둘다 결합하고 이들 KIR에 의해 매개된 NK 세포 세포독성의 저해를 역전시킨다. 하나의 구체예에서, 항체는 하이브리도마 DF200에 의해 제조된 단일클론 항체 DF200과 경쟁한다. 선택적으로 항체 DF200와 경쟁하는 상기 항체는 항체 DF200 그 자체가 아니다.
또다른 구체예에서, 항체는 단일클론 항체 NKVSF1와 경쟁하고, 선택적으로 항체 NKVSF1와 경쟁하는 항체는 항체 NKVSF1가 아니다.
또다른 구체예에서, 항체는 항체 1-7F9와 경쟁한다.
바람직하게 상기 항체는 키메릭 항체, 사람화 항체, 또는 사람 항체이다.
용어 "~와 경쟁한다"는 특정한 단일클론 항체 (예를 들어 DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183)를 말할때, 항체가 재조합 KIR 분자 또는 표면 발현된 KIR 분자 중의 하나를 사용하는 결합 분석법에서 단일클론 항체 (예를 들어 DF200, NKVSF1, 1-7F9, EB6, GL183)와 경쟁한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 만일 항체가 결합 분석법에서 KIR 분자에 대한 DF200의 결합을 감소시킨다면, 항체는 DF200와 "경쟁한다". DF200와 "경쟁"하는 항체는 KIR2DL1 사람 수용체, KIR2DL2/3 사람 수용체, 또는 KIR2DL1와 KIR2DL2/3 사람 수용체 둘다에 대한 결합을 위해 DF200와 경쟁할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1와 KIR2DL2/3 사람 수용체 둘다에 결합하고, 이들 KIR에 의해 매개된 NK 세포 세포독성의 저해를 역전시키고, DF200,1-7F9, 또는 KIR2DL1 사람 수용체, KIR2DL2/3 사람 수용체, 또는 KIR2DL1 와 KIR2DL2/3 사람 수용체 둘다에 결합하기 위해 NKVSF1와 경쟁하는 항체를 제공한다. 선택적으로, 상기 항체는 NKVSF1가 아니다. 선택적으로, 상기 항체는 키메릭, 사람, 또는 사람화 항체이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 사람 수용체 둘다에 결합하고, 이들 KIR에 의해 매개된 NK 세포 세포독성의 저해를 역전시키고, KIR2DL1 사람 수용체에 결합하기 위해 EB6과 경쟁하고, KIR2DL2/3 사람 수용체에 결합하기 위해 GL183과 경쟁하고, 또는 KIR2DL1 사람 수용체에 결합하기 위해 EB6과 KIR2DL2/3 사람 수용체에 결합하기 위해 GL183 과 둘다 경쟁하는 항체를 제공한다. 선택적으로, 상기 항체는 NKVSF1이 아니고 ; 선택적으로 상기 항체는 DF200이아니다. 선택적으로, 상기 항체는 키메릭, 사람, 또는 사람화 항체이다.
유리한 관점에서, 본 발명은 DF200과 경쟁하고 인식하고 결합하고, 또는 KIR 분자에서 단일클론 항체 DF200와 실질적으로 또는 본질적으로 동일하거나, 또는 동일한, 에피토프 또는 "애피토픽 부위"에 대해 면역특이성을 갖는 항체를 제공한다 . 바람직하게, 상기 KIR 분자는 KIR2DL1 사람 수용체 또는 KIR2DL2/3 사람 수용체이다.
본 발명의 특정한 목적은 항체에 있으며, 이때 상기 항체는 KIR2DL1와 KIR2DL2/3 사람 수용체 둘다에 존재하는 공통 결정자에 결합하고 이들 KIR에 의해 매개된 NK 세포 세포독성의 저해를 역전시킨다. 항체는 KIR에서 보다 특이적으로 하이브리도마 DF200에 의해 생산된 단일클론 항체 DF200 또는 하이브리도마 NKVSF1에 의해 생산된 항체 NKVSF1와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하고, 이때 항체는 NKVSF1이 아니다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 가장 바람직한 항체는 하이브리도마 DF200에 의해 제조된 단일클론 항체 DF200이다.
항체 DF200를 생산하는 하이브리도마는 Identification no. "DF200", 등록 번호. CNCM I-3224, 2004년 6월 10일 등록됨, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France으로서, CNCM 배양 수집에 기탁되었다. 항체 NKVSF1는 Serotec (Cergy Sainte-Christophe, France), Catalog ref no. MCA2243, CNCM 으로부터 이용가능하다. NKVSF1는 또한 본원에서 pan2D mAb 으로 불린다.
본 발명은 또한 제한없이, Fab 단편, Fab'2 단편, 면역부착소, 다이아바디, CDR, 및 ScFv를 포함하여, 실질적으로 유사한 항원 특이성 및 활성 (예를 들어, 모 항체와 교차-반응할 수 있고 NK 세포 발현 저해 KIR 수용체의 세포독성 활성을 증강하는)을 갖는, 본원에서 기술된 항체의 작용 단편 및 유도체를 제공한다. 더나아가, 본 발명의 항체는 사람화, 사람, 또는 키메릭이 될 수 있다.
본 발명은 또한 독소, 방사선핵종, 검출가능한 부분 (예를 들어, 분비), 또는 고체 지지체에 접합 또는 공유 결합된 본 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체를 제공한다.
본 발명은 또한 위에서 개시된 항체, 그것의 단편, 또는 그것의 어느 하나의 유도체를 포함하는 제약학 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에서 개시된 바와 같이 약제의 제조를 위한 방법에 있어서 항체의 사용에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 약제 또는 제약학 조성물은 암 또는 다른 증식 장애, 감염의 치료를 위한, 또는 이식술에서 사용하기 위한 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물에 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 항체는 상기 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체중 적어도 하나를 발현하는 NK 세포에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있고, 이때 상기 항체는 리포솜 안으로 포함된다. 선택적으로 상기 조성물은 유전자 요법을 위한 유전자의 송달을 위한 핵산 분자; NK 세포에서 유전자를 저해하기 위한 안티센스 RNA, RNAi, 또는 siRNA의 송달을 위한 핵산 분자; 또는 상기 리포솜 안으로 추가로 혼입된 NK 세포의 표적화 죽임을 위한독소 또는 약물로부터 선택된 추가의 물질을 포함한다.
본 발명은 또한 사람 NK 세포를, 효과적인 양의 본 발명의 항체, 그러한 항체의 단편, 그것의 어느 하나의 유도체, 또는 그것의 어떤 것 중 적어도 하나를 포함하는 제약학 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 사람 NK 세포 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 본 발명의 효과적인 양의 제약학 조성물의 투여를 포함하고 본 발명은 가장 바람직하게는 암, 감염성 질환, 또는 면역질환을 갖는 대상에서, 생체외 또는 생체내에서, 사람 NK 세포의 세포독성 활성을 증가시키는 것을 지시한다.
더 나아간 관점에서, 본 발명은 : (b) 불사화 세포 (예를 들어, 골수종 세포)에 융합된, (a) 저해 KIR 폴리펩티드에 존재하는 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화된 포유류 숙주로부터 B 세포(전형적으로 사람이 아닌 포유동물 숙주)을 포함하는 하이브리도마를 제공하며, 여기서 상기 하이브리도마는 단일클론 항체 결합 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체를 생산하고 적어도 실질적으로, 상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체를 발현하는 NK 세포의 집단에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있다. 선택적으로, 상기 하이브리도마는 단일클론 항체 NKVSF1를 생산하지 않는다. 바람직하게 상기 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 수용체에 결합한다. 바람직하게 상기 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통 결정자에 결합한다. 바람직하게 상기 하이브리도마는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 HLA-c 대립유전자 분자의 사람 KIR2DL1 수용체에 대한 결합, 및 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는HLA-C 대립유전자 분자의 사람 KIR2DL2/3 수용체에 대한 결합을 저해하는 항체를 생산한다. 바람직하게 상기 하이브리도마는 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3중의 하나 또는 KIR2DL1 와 KIR2DL2/3 모두에서 하이브리도마 DF200에 의해 생산된 단일클론 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 생산한다. 그러한 하이브리도마의 예는 DF200이다.
본 발명은 또한 다중 KIR2DL 유전자 생성물과 교차-반응하고 그러한 KIR의 저해하는 활성을 중화하는, 항체의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(a)사람이 아닌 포유동물을 KIR2DL 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로 면역화하는 단계;
(b)상기 면역화 포유동물로부터, 상기 KIR2DL 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제조하는 단계,
(c) 적어도 두개의 다른 KIR2DL 유전자 생성물과 교차-반응하는 (b)의 항체를 선택하는 단계, 및
(d) NK 세포를 증강하는 (c)의 항체를 선택하는 단계. 한가지 구체예에서, 상기 사람이 아닌 포유동물은 사람 항체 레퍼토리를 발현하도록 엔지니어링된 유전자도입 동물이다 (예를 들어, XenomouseTM (Abgenix-Fremont, CA, USA와 같이,)와 같은 사람 면역글로불린 loci 및 천연 면역글로불린 유전자 결손을 포함하는 사람이 아닌 포유동물 또는 HuMab-마우스TM (Medarex-Princeton, NJ, USA))과 같이, 사람 Ig-인코딩 유전자의 미니로커스를 포함하는 사람이 아닌 포유동물). 선택적으로, 방법은 더 나아가 영장류, 바람직하게 사이노몰거스 원숭이 NK 세포 또는 KIR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 본 발명은 더 나아가 항체의 독성을 평가하는 방법을 포함한다, 이때 상기 방법에 의해 제조된 항체는 영장류, 바람직하게 사이노몰거스 원숭이에게 투여되고, 바람직하게 이때 원숭이는 항체의 독성의 표시의 존재 또는 부재에 대해 관찰된다.
본 발명자들은 또한 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물에 결합하는 항체의 제조 방법을 제공하며, 이때 상기 항체는 상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다 :
a) 저해 KIR 폴리펩티드를 포함하는, 사람이 아닌 포유동물을 면역원으로 면역화하는 단계;
b) 상기 면역화 동물로부터, 상기 KIR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제조하는 단계,
c)적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물과 교차-반응하는 (b)의 항체를 선택하는 단계 및
상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있는 (c)의 항체를 선택하는 단계, 이때 단계 (c) 및 (d)의 순서는 선택적으로 바뀔 수 있고 단계의 어떤 수는 선택적으로 1회 이상 반복된다. 바람직하게, 면역화에 사용된 저해 KIR 폴리펩티드는 KIR2DL 폴리펩티드이고 단계(c)에서 선택된 항체는 적어도 KIR2DL1와 KIR2DL2/3과 교차-반응한다. 바람직하게 상기 항체는 적어도 두개의 다른KIR 수용체 유전자 생성물에 존재하는 공통 결정자를 인식하고 ; 가장 바람직하게는 상기 KIR은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3이다. 선택적으로, 상기 방법은 영장류, 바람직하게 사이노몰거스 원숭이, NK 세포 또는 KIR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 선택하는 것을 더욱 포함한다. 선택적으로, 본 발명은 항체를 평가하는 방법을 더욱 포함하고, 이때 상기 방법에 따라 제조된 항체는 영장류, 바람직하게 사이노몰거스 원숭이에 투여되고, 바람직하게 이때 원숭이는 항체의 독성의 표시의 존재 또는 부재에 대해 관찰된다.
선택적으로, 위에서 기술한 방법에서, 단계 c) 또는 d) 에서 선택된 항체는 NKVSF1가 아니다. 바람직하게, 상기 방법에서 단계 (b)에서 제조된 항체는 단일클론 항체이다. 바람직하게 상기 방법에서 단계 (c)에서 선택된 항체는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 HLA-C 대립유전자 분자의 사람 KIR2DL1 수용체에 대한 결합 및 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 HLA-C 대립유전자 분자의 사람 KIR2DL2/3 수용체에 대한 결합을 저해한다. 바람직하게, 상기 방법에서 단계 (d)에서 선택된 항체는 NK 세포독성에서 증강작용, 예를 들어 NK 세포독성에서의 어떠한 상당한 증강작용, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30% 또는 더큰 증강작용, 예를 들어 표적 NK 세포독성의 적어도 약 50% 증강작용 (예를 들어, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% (이를테면, 예를 들어 약 65- 100%) NK 세포 세포독성의 증강작용)을 초래한다. 바람직하게, 항체는 KIR2DL1 및/또는 KIR2DL2/3에서 단일클론 항체 DF200와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 선택적으로 상기 방법은 또한 또는 대안으로서 선택된 단일클론 항체의 단편을 만드는 추가의 단계, 선택된 단일클론 항체의 유도체를 만드는 단계 (예를 들어, 방사선핵종, 세포독성제, 리포터 분자, 또는 유사한 것과 접합에 의해), 또는 그러한 단일클론 항체의 서열에 해당하는 서열로부터 제조된 또는 그 서열을 포함하는 항체 단편의 유도체를 만드는 단계를 포함한다.
본 발명은 더 나아가 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물에 결합하는, 항체의 제조 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는 상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있고, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다 :
(a) 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR2DL 수용체 유전자 생성물과 교차-반응하는 단일클론 항체 또는 항체 단편을, 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택하는 단계, 및
(b) 상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR2DL 수용체 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있는 (a)의 항체를 선택하는 단계. 바람직하게 항체는 KIR2DL1 및KIR2DL2/3에 존재하는 공통 결정자에 결합시킨다. 선택적으로, 단계 (b)에서 선택된 상기 항체는 NKVSF1이다. 바람직하게, 단계 (b)에서 선택된 항체는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 HLA-c 대립유전자 분자의 사람 KIR2DL1 수용체에 대한 결합 및 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 HLA-C 대립유전자 분자의 사람 KIR2DL2/3 수용체에 대한 결합을 저해한다. 바람직하게, 단계 (b)에서 선택된 항체는 NIC 세포독성에서의 증강작용, 예를 들어 NK 세포독성에서 어떠한 상당한 증강작용, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30% 또는 더 큰 증강작용, 예를 들어 적어도 표적 NK 세포독성의 약 50% 증강작용 (예를 들어, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% (이를테면, 예를 들어 약 65-100%) NK 세포 세포독성의 증강작용)을 유발한다. 바람직하게, 항체는 KIR2DL1 및/또는 KIR2DL2/3에서 단일클론 항체 DF200과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 선택적으로 방법은 선택된 단일클론 항체의 단편을 만드는 단계, 선택된 단일클론 항체의 유도체를 만드는 단계, 또는 선택된 단일클론 항체 단편의 유도체를 만드는 단계의 추가의 단계들을 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 결합시키는 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 이때 상기 항체는 NK 세포의 집단에서, 상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a) 상기 단일클론 항체의 생산을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
b) 상기 하이브리도마로부터 상기 단일클론 항체를 분리시키는 단계. 선택적으로 그 방법은 상기 단일클론 항체의 단편을 만드는 추가의 단계, 단일클론 항체의 유도체를 만드는 단계, 또는 그러한 단일클론 항체 단편의 유도체를 만드는 단계를 포함한다. 바람직하게 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통 결정자에 결합한다.
또한 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 결합시키는 항체의 제조 방법이 본 발명에 의해 제공되고, 이때 상기 항체는 상기 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있고, 상기 방법은 단계들을 포함하며 : a) 본 발명의 하이브리도마로부터 핵산 인코딩 상기 단일클론 항체를 분리시키는 단계;
b) 사람화 항체, 키메릭 항체, 단일 사슬 항체, 항체의 면역반응성 단편, 또는 그러한 면역반응성 단편을 포함하는 융합 단백질로부터 선택된, 단일클론 항체의 작용 서열에 해당하는 또는 실질적으로 거기에 유사한 (예를 들어, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% (이를테면 약 70-99%) 그러한 서열과 동일함) 아미노산 서열을 포함하는 변경된 또는 유도된 항체를 인코딩하는 서열을 포함하는 변경된 핵산을 얻기 위해 선택적으로 상기 핵산을 변경시키는 단계;
c)발현 벡터 안으로 상기 핵산 또는 변경된 핵산 (또는 동일한 아미노산 서열에 대한 관련된 핵산 코딩)을 삽입하는 단계, 이때 상기 인코딩된 항체 또는 항체 단편은 상기 발현 벡터가 적절한 조건 하에서 성장된 숙주 세포에 존재할때 발현될 수 있고 ;
d) 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 세포감염시키는 단계, 이때 상기 숙주 세포는 면역글로불린 단백질을 달리 제조하지 않고;
e) 상기 항체 또는 항체 단편의 발현을 초래하는 조건 하에서 상기 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 ; 및
f) 상기 트랜스펙션된 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 항체 단편을 분리하는 단계. 바람직하게 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통 결정자에 결합한다.
본 발명은 또한 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물에 결합하는 항체를 포함하는 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 제공하고, 이때 상기 항체는 적어도 하나의 상기 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체를 발현하는 NK 세포에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개된 저해를 중화할 수 있고, 상기 항체는 NK 세포를 포함하는 환자 또는 생물학적 샘플에서 검출가능하게 NK 세포 세포독성을 증강하는데 효과적인 양으로 존재한다는 것이 이해될 것이다. 바람직하게 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통 결정자에 결합시킨다. 상기 조성물은 선택적으로 예를 들어, 면역조절제, 호르몬제, 화학치료제, 항- 혈관형성제, 세포자멸제, 저해 KIR 수용체, 항-감염제, 표적화 약제, 또는 보조약 화합물에 결합되고 저해하는 제 2 항체로부터 선택된 제 2 치료제를 더욱 포함한다. 이로운 면역조절제는 IL-1 알파, IL-l베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 15, IL-21, TGF-베타, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-알파, TNF-베타, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-알파, IFN-베타, 또는 IFN- 감마로부터 선택될 수 있다. 상기 화학치료제의 예는 알킬화제, 대사길항물질, 세포독성 항생제, 아드리아마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 카르미노마이신, 다우노마이신, 독소루비신, 타목시펜, 탁솔, 탁소테레, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 에토포시드 (VP-16), 5-플루오로우라실 (5FU), 시토신 아라비노시드, 사이클로포스파미드, 티오테파, 메토트렉세이트, 캄프토테신, 엑티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴 (CDDP), 아미노프테린, 캄브레타스타틴(들), 다른 빈카 알킬로이드 및 그것의 유도체 또는 프로드러그를 포함한다. 호르몬제의 예는 류프로렐린, 고세렐린, 트리프토렐린, 부세렐린, 타목시펜, 토레미펜, 플루타미드, 닐루타미드, 사이프로테론 비칼루타미드 아나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸, 파드로졸 메드록시, 클로르마디논, 메게스트롤, 다른 LHRH 작용제, 다른 항-에스트로겐, 다른 항-안드로겐, 다른 아로마타제 저해제 및 다른 프로게스타겐을 포함한다. 바람직하게, 저해 KIR 수용체에 결합하고 그것을 저해하는 상기 두번째 항체는 적어도 두개의 다른 사람 저해 KIR 수용체 유전자 생성물에 존재하는 공통 결정자에 결합시키는 상기 항체에 의해 결합된 에피토프와 다른 저해 KIR 수용체의 에피토프에 결합하는 항체 또는 그것의 유도체 또는 단편이다.
본 발명은 상기 환자에게 본 발명에 따르는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로하는 환자에서, 더 나아가 검출가능하게 NK 세포 활성을 증강하는 방법을 제공한다. NK 세포 활성 증강작용을 필요로하는 환자는 그러한 증강작용이 치료 효과를 촉진하고, 강화하고 및/또는 유발하는 (또는 질환 또는 장애를 갖는 적어도 상당한 비율의 환자에서 그러한 효과를 촉진하고, 강화하고 및/또는 유발하고 환자와 실질적으로 유사한 특성 - 예를 들어, 임상 실험에 의해 결정될 있음) 질환 또는 장애를 갖는 어떠한 환자가 될 수 있다. 그러한 치료를 필요로하는 환자는 예를 들어, 암, 또다른 증식 장애, 감염성 질환 또는 면역장애로 고통받을 수 있다. 바람직하게 상기 방법은 상기 환자에게 면역조절제, 호르몬제, 화학치료제, 항-혈관형성제, 세포자멸제, 저해 KIR 수용체, 항-감염제, 표적화 약제 또는 보조약 화합물에 결합하고 그것을 저해하는 제 2 항체로부터 선택된 적절한 추가의 치료제를 투여하는 추가의 단계를 포함하고 이때 상기 추가의 치료제는 상기 항체와 함께 단일 용량 형태로서, 또는 개별적인 용량 형태로서 상기 환자에게 투여된다. 항체 (또는 항체 단편/유도체)의 용량 및 추가의 치료제의 용량은 총괄하여 NK 세포 활성의 증강작용을 포함하는 환자에서 치료 반응을 검출가능하게 유발하고, 촉진하고 및/또는 강화하기에 충분하다. 개별적으로 투여될 때, 항체, 단편, 또는 유도체 및 추가의 치료제는 바람직하게는 환자에 대한 검출가능한 조합된 치료 이점을 초래하는 조건 하에서 (예를 들어, 타이밍, 복용량의 수, 등에 대하여) 투여된다.
사람이 아닌 영장류, 바람직하게 원숭이, NK 세포 및/또는 원숭이 KIR 수용체를 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 항체가 본 발명에 의해 더욱 포함된다. 또한 후보 약제인 본 발명의 항체의 독성, 용량 및/또는 활성 또는 효능을 평가하기 위한 방법이 포함된다. 한가지 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 NK 세포를 갖는 사람이 아닌 영장류 수용자 동물에게 투여하고, 동물에 대한, 또는 바람직하게 표적 조직에 대한 어떠한 독성 또는 해로운 또는 부작용을 평가함으로써, 동물 또는 표적 조직에 독성인 항체의 복용량을 결정하는 방법을 포함한다. 또다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항체를, NK 세포를 갖는 사람이 아닌 영장류 수용자 동물에게 투여하고 동물에 대한, 또는 바람직하게 표적 조직에 대한 약제의 어떠한 독성 또는 해로운 또는 부작용을 평가함으로서 동물 또는 표적 조직에 독성인 항체를 확인하기 위한 방법이다. 또다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 감염, 질환 또는 암의 사람이 아닌 영장류 모델에 투여하고, 감염, 질환 또는 암, 또는 그것의 증상을 개선하는 항체를 확인함으로써 감염된, 질환 또는 종양의 치료에 효과적인 항체를 확인하는 방법이다. 바람직하게 본 발명의 상기 항체는 (a) 사람 NK 세포의 표면에서 적어도 두개의 저해하는 사람 KIR 수용체와 교차 반응하고, (b) 사람이 아닌 영장류의 NK 세포 또는 KIR 수용체와 교차 반응하는 항체이다.
더 나아가 생물학적 샘플 또는 살아있는 유기체에서 그들의 세포 표면에서 저해 KIR를 갖는 NK 세포의 존재를 검출하는 방법이 본 발명에 의해 포함되고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다 :
a) 상기 생물학적 샘플 또는 살아있는 유기체를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계, 이때 상기 항체는 검출가능한 부분과 접합되거나 공유결합되고; 및
b) 상기 생물학적 샘플 또는 살아있는 유기체에서 상기 항체의 존재를 검출하는 단계.
본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는, 그들의 세포 표면에서 저해 KIR를 갖는 샘플 NK 세포로부터 정제하는 방법을 제공하고 :
a) 그들의 세포 표면에서 저해 KIR를 갖는 상기 NK 세포를 상기 항체에 결합하도록 하는 조건 하에서 상기 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계, 이때 상기 항체는 고체 지지체(예를 들어, 비드, 매트릭스, 등)에 접합되거나 공유 결합되고 ; 및
b) 상기 결합된 NK 세포를 고체 지지체에 접합되거나 공유 결합된 상기 항체로부터 용출시키는 단계.
더 나아간 관점에서, 본 발명은 도 12에서 도시한 바와 같이, 항체 DF200 또는 항체 Pan2D의 경쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함하는, 항체, 항체 단편, 또는 그것중 하나의 유도체를 제공한다. 여전히 또다른 관점에서, 본 발명은 모든 또는 본질적으로 모든 DF200 또는 Pan2D의 경쇄 가변 영역 서열 또는 이들 항체 둘다의 경쇄 가변 영역 CDR의 하나 이상과 매우 유사한 서열을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 그것의 어느 하나의 유도체를 제공한다.
더 나아간 관점에서, 본 발명은 도 13에서 도시한 바와 같이, 항체 DF200 의 중쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함하는, 항체, 항체 단편, 또는 그것의 어느 하나의 유도체를 제공한다. 여전히 또다른 관점에서, 본 발명은 DF200의 중쇄 가변 영역 서열의 모두 혹은 본질적으로 모두와 매우 유사한 서열을 포함하는, 항체, 항체 단편, 또는 그것의 어느 하나의 유도체를 제공한다.
본 발명의 이들 및 추가의 이로운 관점 및 특징은 본원의 다른 곳에서 더욱 기술될 수 있다.
도 1은 다양한 사람 KIR2DL 수용체 공통 결정자에 대한 단일클론 항체 DF200 결합을 도시한다.
도 2는 Cw4 포지티브 표적 세포에서 KIR2DL1 포지티브 NK 세포 세포독성의 KIR2DL-매개된 저해를 중화하는 단일클론 항체 DF200을 도시한다.
도 3은 Cw4 포지티브 표적 세포에 대한 KIR2DL1 포지티브 NK 세포 세포독성의 KIR2DL-매개된 저해 및 Cw3 포지티브 표적 세포에서 KIR2DL2/3 포지티브 NK 세포 세포독성의 KIR2DL-매개된 저해를 중화하는, DF200 및 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3 특이적 종래의 항체의 단일클론 항체 DF200, Fab 단편을 도시한다.
도 4는 DF200 및 EB6 항체의 F (ab') 2 단편의 존재하에서 HLA Cw4 포지티브 표적 세포의 NK 클론에 의한 세포 용해의 재구성을 도시한다.
도 5 및 6는 단일클론 항체 DF200, NKVSF1 (pan2D), 사람 항체 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 및 1-6F1, 및 Cw4 포지티브 표적 세포에서 KIR2DL1 포지티브 NK 세포 세포독성의 KIR2DL-매개된 저해를 중화하는 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3 특이적 종래의 항체를 도시한다(도 6에서 도 5에서 Cw4 트랜스펙션된 세포 및 EBV 세포).
도 7은 KIR2DL1에 대한 항-KIR 항체로 표면플라스몬 공명 (BIAcore®) 분석에 의해 얻어진 경쟁적인 결합 실험의 결과를 나타내는 에피토프 맵을 도시하고, 이때 오버랩하는 원은 KIR2DL1에 대한 결합에서 오버랩을 나타낸다. 결과는 1-7F9이 EB6 및 1-4F1과 경쟁적이지만, KIR 2DL1에서,NKVSF1 및 DF200과는 아니라는 것 을 나타낸다. 항체 1-4 F1는 반대로 EB6, DF200, NKVSF1, 및 1-7 F9과 경쟁적이다. 항체 NKVSF1는 DF200, 1-4F1, 및 EB6과 경쟁하지만, KIR2DL1에서 1-7F9과는 하지 않는다. DF200는 NKVSF1, 1-4F1, 및 EB6과 경쟁하지만, KIR2DL1에서 1-7F9과는 하지 않는다.
도 8은 BIAcore® 분석에 의해 얻어진 항-KIR 항체로 KIR2DL3에 대한 경쟁적인 결합 실험의 결과를 나타내는 에피토프 맵을 도시하고, 이때 오버랩하는 원은 KIR2DL3에 대한 결합에서의 오버랩을 나타낸다. 결과는 1-4F1는 KIR2DL3에서 NKVSF1, DF200, gll83, 및 1-7F9과 경쟁적이라는 것을 나타낸다. 1-7F9은 DF200, GL1 83, 및 1-4F1과 경쟁적이지만, KIR2DL3에서 NKVSF1와는 아니다. NKVSF1는 DF200, 1-4F1, 및 GL183과 경쟁적이지만, KIR2DL3에서 1-7F9와는 아니다. DF200은 NKVSF1, 1-4F1, 및 1-7F9과 경쟁하지만, KIR2DL3에 대해서 GL183와는 아니다.
도 9는 항-KIR 항체으로 BIAcore® 분석에 의해 얻어진, KIR2DS1에 대한 경쟁적인 결합 실험의 결과를 보여주는 에피토프 맵을 나타내고, 이때 오버랩하는 원은 KIR2DS 1에 대한 결합에서 오버랩을 지정한다. 결과는 항체 1-4F1 가 KIR2DS1에서 NKVSF1, DF200, 및 1-7F9와 경쟁적이라는 것을 보여준다. 항체 1-7F9는 1-4F1과 경쟁적이지만, KIR2DS1에서 DF200 및 NKVSF1와는 경쟁적이지 않다. NKVSF1는 DF200 및 1-4F1과 경쟁하지만, KIR2DS1에서, 1-7F9과는 아니다. DF200는 NKVSF1 및 1-4F1과 경쟁하지만, KIR2DS1에서 1-7F9와는 아니다.
도 10은 사이노몰거스 NK 세포에 대한 mAb의 결합을 증명하는 NKVSF1 (pan2D) mAb 적정을 도시한다. 사이노몰거스 NK 세포 (NK 벌크 16일)는 다른 양의 Pan2D mAb으로 배양하고 이어서 PE-접합된 염소 F (ab') 2 단편 항-마우스 IgG (H+L) 항체로 배양한다. 포지티브 세포의 퍼센트는 이소타입 대조군 (정제된 마우스 IgGl)으로 결정되었다. 샘플을 복제로 하였다. 평균 형광 강도 = MFI.
도 12는 항체 DF200 및 Pan2D mAb의 경쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 CDR의 아미노산 서열의 비교 정열을 제공한다.
도 13은 항체 DF200의 중쇄 가변 영역을 제공한다.
발명의 상세한 설명
항체
본 발명은 사람 저해 KIR 수용체의 공통 결정자, 바람직하게는 적어도 두개의 다른KIR2DL 유전자 생성물에 존재하는 결정자에 결합하고, 적어도 하나의 그러한 KIR 수용체를 발현하는 NK 세포의 증강작용을 초래하는, 신규한 항체 및 단편 또는 그것의 유도체를 제공한다. 본 발명은 처음으로, 그러한 교차-반응하고 중화하는 항체가 생산될 수 있다는 것을 개시하고, 이것은 특히 사람 대상에서 예상치못한 결과를 나타내고 새롭고 효과적인 NK-기반 치료법에 대한 수단을 개시한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 단일클론 항체 NKVSF1가 아니다.
본 발명의 문맥에서 "공통 결정자"는 사람 저해 KIR 수용체의 몇개의 유전자 생성물에 의해 공유되는 결정자 또는 에피토프를 지칭한다. 바람직하게, 공통 결정자는 KIR2DL 수용체 그룹의 적어도 두개의 구성원에 의해 공유된다. 더 바람직하게는, 결정자는 적어도 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 의해 공유된다. 본 발명의 특정 항체는 KIR2DL의 다중 유전자 생성물을 인식하는데 더하여, 또한 KIR3DL 수용체 그 룹의 유전자 생성물과 같은, 다른 저해 KIRs에 존재하는 결정자를 인식한다. 결정자 또는 에피토프는 상기 멤버에 의해 공유된 펩티드 단편 또는 형태 에피토프를 나타낼 수 있다. 더 구체적인 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체 DF200에 의해 인지된 실질적으로 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 결정자는 KIR2DL1 와 KIR2DL2/3 둘다에 존재한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 공통 결정자에 "결합하는" 항체는 특이성 및/또는 친화력을 갖는 상기 결정자에 결합하는 항체를 지정한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "항체"는 문맥에 의해 달리 언급되거나 또는 명확하게 모순되지 않으면, 상기 다클론성 및 단일클론 항체의 단편 및 유도체는 물론이고, 다클론성 및 단일클론 항체를 말한다. 중쇄에서 불변영역의 타입에 따라, 전장 항체는 전형적으로 5가지 주요 클래스 중 하나로 할당된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들중 몇개는 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, 등과 같은, 하위클래스 또는 이소타입으로 더욱 나뉜다. 면역글로불린의 차이 클래스에 해당하는 중쇄 불변영역은 각각 "알파,""델타,""엡실론,""감마" 및 "뮤"라고 부른다. 면역글로불린의 다른 클래스의 서브유닛 구조 및 3-차원 입체구조는 잘 알려져 있다. IgG 및/또는 IgM 은 그들은 생리적인 상황에서 가장 일반적인 항체이며 그들은 가장 실험실 세팅에서 가장 쉽게 만들어지기 때문에, 본 발명에서 채택된 항체의 바람직한 클래스이다. 바람직하게 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 목표 중 하나가 NK 세포를 고갈시키지 않고, 저해 KIR의 상호작용과 생체 내에서 그것의 대응하는 HLA 리간드를 차단하는 것이기 때문에, IgG4와 같이, 낮은 효과기 작용을 매개 하는 Fc 수용체와 대응하는 이소타입은 전형적으로 바람직하다.
본 발명의 항체는 당업계에서 잘 알려진 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 그들은 저해 KIR 폴리펩티드, 바람직하게 KIR2DL 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 사람 KIR2DL 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로, 사람이 아닌 동물, 바람직하게 마우스의 면역화에 의해 제조된다.
저해 KIR 폴리펩티드는 사람 저해 KIR 폴리펩티드의 전장 서열, 또는 그것의 단편 또는 유도체, 전형적으로 면역원 단편, 즉, 저해 KIR 수용체를 발현하는 세포의 표면에서 노출된 에피토프를 포함하는 폴리펩티드의 부분을 포함할 수 있다. 그러한 단편은 전형적으로 성숙한 폴리펩티드 서열의 적어도 약 7 개의 연속적인 아미노산을 함유하고, 더 바람직하게는 적어도 약 10 개의 연속적인 그것의 아미노산을 함유한다. 단편은 전형적으로 본질적으로 수용체의 세포외 도메인으로부터 유도된다. 훨씬 더 바람직한 것은 전장 KIRDL 폴리펩티드의 세포외 Ig 도메인의 적어도 하나, 보다 바람직하게는 둘 다를 포함하는 사람 KIR2DL 폴리펩티드이고, KIR2DL 수용체에 존재하는 적어도 하나의 입체적 에피토프를 모방할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 KIR2DL1 폴리펩티드의 아미노산 위치 1-224의 세포외 Ig 도메인의 적어도 약 8 개의 연속적인 아미노산을 포함한다(KIR 유전자 패밀리를 기술하는 PROW 웹 사이트에 따르는 아미노산 넘버링, http://www. ncbi. nhn. nih. gov/prow/guide/1326018082. htm).
가장 바람직한 구체예에서, 면역원은 지질막에서, 전형적으로 세포의 표면에서 야생형 사람 KIR2DL 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 면역원은 선택 적으로 처리되거나 용해된, 완전한 NK 세포, 특히 완전한 사람 NK 세포를 포함한다.
사람 아닌 포유동물을 항원으로 면역화하는 단계는 마우스에서 항체의 제조를 자극하기 위해 당업계에서 잘 알려진 어떠한 방식으로 수행될 수 있다(참조, 예를 들어, E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). 면역원은 그후 선택적으로 완전한 Freund's 애주번트와 같은 애주번트와 함께, 완충제에 현탁되거나, 용해된다. 면역원의 양, 완충제의 타입 및 애주번트의 양을 측정하는 방법은 당업자에게 주지이고 본 발명에 대하여 어떠한 방법에 한정되지 않는다. 이들 매개변수는 다른 면역원에 대하여 다를 수 있지만 용이하게 밝혀지지는 않는다.
유사하게, 항체의 생산을 자극하기에 충분한 면역화의 위치나 빈도 또한 당업계 주지이다. 전형적 면역화 방법에서, 사람 아닌 동물에 복강 내로 항원을 제1일에 주사하고 약 1 주일 이후에 다시 주사한다. 그 후, 항원을 약 제20일에, 선택적으로 불완전 Freund's 애주번트 같은 애주번트와 함께, 재주사한다. 재주사는 정맥 내 주사로 행하고 연속된 며칠간 반복할 수 있다. 그 후, 제40일에 후속 주사를 정맥 내 또는 복강 내로, 전형적으로는 애주번트 없이 주사한다. 이 방법으로 약 40일 만에 항원 특이적 항체 생산 B 세포의 생산을 결과한다. 면역화에 사용되는 항원에 대한 항체를 발현하는 B 세포를 생산하는 결과를 가져오는 한 어떤 다른 방법 또한 사용될 수 있다.
다클론 항체의 제조를 위하여, 혈청은 면역화된 사람 아닌 동물로부터 얻어 지고 그 안에 존재하는 항체는 주지의 기술에 의하여 얻는다. 혈청은, 저해 KIR 리셉터에 반응하는 항체를 얻도록 고체 지지체에 결합된 전술된 어떤 면역원을 사용하여 친화성 정제될 수 있다.
대안의 구체예에서, 면역화되지 않은 사람 아닌 포유동물로부터의 림포구를 분리하고 시험관 내에서 성장시킨 후, 세포 배양물 내의 면역원에 노출시켰다. 그 후, 림프구를 회수하고 아래 기술된 융합 단계를 수행하였다.
단일클론 항체를 위하여, 다음 단계는 면역화된 사람 아닌 포유동물로부터의 비장 세포의 분리 및 그 직후 그 비장 세포를 항체 생산 하이브리도마를 형성시키기 위하여 불사화 세포와 융합시키는 것이다. 사람 아닌 포유동물로부터 비장 세포를 분리하는 것은 당업계 주지이고 전형적으로 마취된 인간 아닌 포유동물로부터 비장을 제거하여, 작은 조각으로 자르고 비장 피막으로부터 비장 세포를 짜낸 후, 단일 세포 현탁을 제조하도록 적당한 완충액 내로 나일론 그물을 통하여 세포 여과기를 통과시키는 단계들을 포함한다. 세포를 세척하고 원심분리하여 적혈구를 용혈시키는 완충액에서 재현탁한다. 용액을 다시 원심분리시켜 펠릿에 유지된 림프구를 최종적으로 신선한 완충액에 재현탁시킨다.
일단 분리되고 단일 세포 현탁액으로 존재하면, 림프구는 불사화 세포주에 융합될 수 있다. 이것은 전형적으로 마우스 골수종 세포주이지만, 하이브리도마를 생산하기에 유용한 다른 많은 불사화 세포주가 당업계 주지이다. 바람직한 마우스 골수종 세포주는 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U. S. A.로부터 구입 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U. S. A.로부터 구입 가능한 X63 Ag8653 및 SP-2 세포로부터 유래한 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 융합은 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 실행된다. 그 후, 결과의 하이브리도마는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장과 생존을 저해하는 물질 하나 이상을 함유하는 선택배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포는 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)를 결여하는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것인데 (HAT 배지), 이 물질들은 HGPRT 결실 세포의 성장을 방해한다.
하이브리도마는 전형적으로 마크로파지의 피더층 상에서 성장한다. 마크로파지는 바람직하게는 비장 세포를 분리하기 위하여 사용되는 사람 아닌 포유동물의한배 새끼들로부터 유래하고 전형적으로 하이브리도마를 플레이팅하기 수일 전에 불완전 Freund's 애주번트 등으로 초회 감작된다. 융합 방법은 Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)에 기재되고, 여기에 참고문헌으로써 개시된다.
세포는 충분한 시간 동안 콜로니 형성과 항원 생산을 위하여 선택 배지에서 성장하도록 한다. 이는 통상 약 7 내지 약 14일 동안이다. 하이브리도마 콜로닌는 그 후 다중 저해 KIR 리셉터 유전자 생성물과 교차반응하는 항원의 생산 여부에 대하여 측정된다. 측정은 전형적으로 측색 ELISA 타입 측정이지만 하이브리도마가 성장하는 웨에 적용될 수 있는 어떤 측정법도 사용될 수 있다. 다른 측정법은 면역침강 및 방사성 면역측정을 포함한다. 소망의 항체 생산에 대하여 포지티브인 웰을 시험하여 하나 이상의 구별되는 콜로니가 존재하는지 여부를 조사한다. 만약 하나 초과의 콜로니가 존재하면 세포를 다시 클로닝하여 오직 하나의 세포만이 소망의 항체를 생산하는 콜로니를 생성하도록 확실하게 한다. 단일의 명백한 콜로니를 갖는 포지티브 웰은 전형적으로 단지 하나의 단일클론 항체가 검출되고 생산되는 것을 확실하게 하기 위하여 다시 클로닝하고 다시 측정한다.
항체는 또한, 예를 들어 Ward et al. , Nature, 341 (1989) p. 544에 기재된 바와 같이 면역 글로불린 조합 라이브러리의 선택에 의하여 생산될 수 있다.
이 발명의 항체는 또한 NK 세포 세포독성의 KIR-매개 저해; 특히 KIR2DL 리셉터에 의하여 매개되는 저해 및 더 구체적으로는 적어도 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 저해 둘 다에 의하여 매개되는 저해를 중화할 수 있다. 그러므로, 이들 항체는 그것들이 MHC 클래스 I 분자와 상호작용할 때 적어도 부분적으로 및 검출 가능하게 KIR 리셉터에 의하여 매개되는 저해 신호전달 경로를 차단한다는 의미에서 "중화" 또는 "저해" 항체이다. 더 중요하게는, 이 저해 활성은 몇몇 타입의 KIR 리셉터, 바람직하게는 KIR2DL 리셉터 유전자 생성물, 더 바람직하게는 적어도 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 둘 다에 관하여 작용되어 이들 항체는 다양한 대상물에 대하여 높은 효능으로 사용될 수 있다. KIR-매개 NK 세포 세포독성 저해는 결합 또는 세포적 측정법 같은 다양한 측정법이나 테스트에 의하여 평가될 수 있다.
다중 저해자 KIR 리셉터와 교차반응하는 항체가 일단 동정되면, 완전한 NK 세포 안에서 그들 KIR 리셉터의 저해 효과를 중화시키는 그것의 능력에 대하여 시험할 수 있다. 구체적 변형에서, 중화 활성은 상기 항체가 HLA-C 포지티브 표적의 KIR2DL-포지티브 NK 클론에 의한 용혈을 재구성하는 능력에 의하여 설명될 수 있다. 다른 구체적 구체예에서, 항체의 중화 활성은 항체가 HLA-C 분자와 KIR2DL1 및 KIR2DL3 리셉터(또는 긴밀하게 연관된 KIR2DL2)의 결합을 저해하는 능력, 더 바람직하게는 항체가:
- Cwl, Cw3, Cw7 및 Cw8으로부터 선택되는 HLA-C 분자 (또는 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 HLA-C 분자)와 KIR2DL2/3의 결합 ; 및
- Cw2, Cw4, Cw5 및 Cw6으로부터 선택되는 HLA-C 분자 (또는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 HLA-C 분자)와 KIR2DL1 사이의 결합을 변화시키는 능력에 의하여 정의된다.
다른 변형에서, 본 발명의 항체의 저해활성은 실시예에서 여기에서 개시한 바와 같이 세포 기초 세포독성 측정에서 평가될 수 있다.
다른 변형에서, 이 발명의 항체의 저해 활성은 시토카인-방출 측정법으로 평가될 수 있는데, 이 측정법에서는 NK 세포를 시험 항체와 인큐베이션 시키고 한 HLA-C 대립유전자를 발현하는 표적 세포주를 NK 집단의 KIR 분자에 의하여 인식시켜 NK 세포 시토카인 생산 (예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 생산)을 촉진시킨다. 전형적인 방법에서, PBMC로부터의 IFN-γ 생산은 배양 약 4일 후에 세포표면 및 세포질 내 염색 및 유동세포계측에 의한 분석에 의하여 평가한다. 요약하면, Brefeldin A (Sigma Aldrich) 를 최종농도 약 5 ㎍/ml로 적어도 배양 약 4 시간 동안 첨가될 수 있다. 세포를 그 후 투과화 (IntraPrepTM ; Beckman Coulter) 전에 항-CD3 및 항-CD56 mAb로 인큐베이션시키고 PE-항-IFN-γ 또는 PE-IgG1 (Pharmingen)로 염색할 수 있다. 다클론 활성화 NK 세포로부터의 GM-CSF 및 IFN-γ 생산은 ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R & D Systems, Minneapolis, MN;IFN-γ: OptElA set, Pharmingen)를 사용하여 상청액에서 측정될 수 있다.
본 발명의 항체는 NK 세포 세포독성의 KIR-매개 저해를 부분적으로 또는 완전히 중화할 수 있다. 용어 "NK 세포 세포독성의 KIR-매개 저해를 중화하는"은, 여기에서 사용될 때, 세포독성의 전통적 크롬 방출 테스트에 의하여 측정될 때, 주어진 KIR을 발현하는 NK 세포 집단이 (NK 세포 상에 발현되는 KIR에 의하여 인식되는) 동류의 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉할 때 항체 없이 얻어지는 용균비의 수준과 비교한, 그것의 KIR에 의하여 차단되지 않은 NK 세포 또는 NK 세포주와 동일한 비율에서 얻은 용균비의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 이상 (예를 들어 25-100%)으로 증가시키는 능력을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 항체는 매치하는 또는 HLA가 일치하는 또는 자기유래의 표적 세포 집단, 즉 상기 항체 부재시에 NK 세포에 의하여 효과적으로 용균되지 않는 세포 집단의 용균을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또한 NK 세포 생체 내 활성을 촉진하는 것으로 정의될 수 있다.
대안으로, 용어 "KIR 매개되는 저해를 중화하는"은 하나 또는 수 개의 저해 KIR을 발현하는 NK 세포 클론 또는 트랜스펙턴트 및 NK 세포 상의 KIR의 하나에 의하여 인지되는 오직 하나의 HLA 대립유전자를 발현하는 표적 세포를 사용하는 크롬 분석법에서, 항체로 획득되는 세포독성의 수준은, W6/32 항 MHC 클래스 I 항체 같이, 공지의 차단 항 MHC 클래스 I 분자로 얻어지는 세포독성의 적어도 20%, 바람직 하게는 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50% 이상 (예를 들어 25-100%) 또는 그 이상이어야 한다.
구체적 구체예에서, 항체는 (하이브리도마 DF200에 의하여 생산되는) 단일클론 항체 DF200와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 이 같은 항체는 "DF200 유사 항체"로 지칭된다. 더 바람직한 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 더 바람직한 본원발명의 "DF200 유사 항체"는 단일클론 항체 NKVSF1 이외의 항체이다. 가장 바람직한 것은 (하이브리도마 DF200에 의하여 생산되는) 단일클론 항체 DF200이다.
용어, 관심의 항체와 "실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는"은 상기 관심의 항체와 "경쟁하는" 항체를 의미한다. 용어, 단일클론 항체 DF200와 "실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는"은 DF200와 "경쟁하는" 항체를 의미한다. 일반적으로, 관심의 단일클론 항체 (예를 들어, DF200, NKVSF1, 17F9)와 "실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는" 항체는 그 항체가 어떤 KIR 분자, 바람직하게는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3으로 구성된 군으로부터 선택되는 KIR 분자에 대하여 상기 관심의 항체와 "경쟁함"을 의미한다. 다른 실시예에서, 관심의 항체와 실질적으로 동일한 KIR2DL1 분자 상의 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체는 KIR2DL1 분자에 대한 결합에서 관심의 항체와 "경쟁한다". 관심의 항체와 실질적으로 동일한 KIR2DL2/3 분자 상의 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체는 KIR2DL2/3 분자에 대한 결합에서 관심의 항체와 "경쟁한다".
용어, 관심의 항체와 "실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는" 은 항체가 상기 관심의 항체가 특이적으로 결합하는 어떤 및 모든 KIR 분자에 대하여 상기 관심의 항체와 "경쟁한다"는 의미이다. 용어, 단일클론 항체 DF200과 "실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는"은 항체가 DF200가 특이적으로 결합하는 어떤 및 모든 KIR 분자에 대하여 DF200와 "경쟁한다"는 의미이다. 예를 들어, 단일클론 항체 DF200 또는 NKVSF1와 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체는 각각 DF200 또는 NKVSF1와 KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 및 KIR2DS2에 대한 결합에 대하여 "경쟁한다".
여기에 기재된 단일클론 항체와 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체의 동정은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 다양한 면역학적 스크리닝 분석법 중 어느 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 다수의 그 같은 분석법이 일상적으로 수행되고 당업계 주지이다 (예를 들어, 여기에 참고문헌으로 수록된, 1997년 8월 26일 특허된 미국 특허 제 5,660,827 호 참고). 여기에서 기재된 항체에 결합하는 에피토프를 실제로 결정하는 것은 여기에 기재하는 단일클론 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프를 동정하는 것이 전혀 필요하지 않다.
예를 들어, 시험될 테스트 항체가 상이한 기원의 동물로부터 얻어지거나 심지어 상이한 Ig 이소타입의 것으로부터 얻어지는 경우, 단순한 경쟁 분석법이 사용될 수 있는데, 여기에서 대조표준 (예를 들어, DF200) 및 시험 항체를 혼합한 후 (또는 사전-흡수한 후), 각각 DF200에 결합하는 것으로 알려진 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 둘 다를 함유하는 샘플에 적용한다. ELISA, 방사성면역측정법, 웨스턴 블롯 및 BIACORE 분석에 기초한 방법 (예를 들어 실시예 부분에 기재된 방법)은 이 같은 단순 경쟁 연구에 사용하기에 적당하다.
특정 구체예에서, 저해 KIR 항원 샘플에 적용하기 전에 일정기간 동안 대조표준 항체 (예를 들어, DF200) 를 다양한 양의 (예를 들어, 약 1:10 또는 약 1:100으로) 시험 항체에 사전 혼합할 것이다. 다른 구체예에서, 대조표준과 다양한 양의 시험 항체가 KIR 항체 샘플에 노출되는 동안 단순히 혼합될 수 있다. (예를 들어, 비결합 항체를 배제하기 위하여 분리 또는 세척 기술을 사용함으로써) 자유 항체로부터 결합항체를 및 (예를 들어, 종 특이적 도는 이소타입 특이적 이차 항체를 사용함으로써 또는 검출 가능한 표지로 DF200을 특이적으로 표지함으로써) 시험 항체로부터 DF200을 구별할 수 있다면, 시험항체가 DF200과 실질적으로 동일한 에피토프를 인지한다는 것을 가리키는, 항체가 두 가지 상이한 KIR2DL 항원에 대한 DF200의 결합을 감소시키는지 여부를 측정할 수 있을 것이다. 완전히 부적당한 항체의 부재시의 (표지된) 대조표준 항체의 결합은 대조표준 높은 값의 역할을 할 수 있다. 대조표준 낮은 값은 표지된 (DF200) 항체를 완전히 동일한 타입의 표지되지 않은 항체와 인큐베이션시킴으로써 얻을 수 있는데, 여기서 경쟁이 일어날 것이고 표지된 항체의 결합이 감소될 것이다. 테스트 분석법에서, 테스트 항체의 존재시에 표지된 항체 반응성의 유의한 감소는 시험 항체가 실질적으로 동일한 에피토프를 인지한다는 것, 즉 표지된 (DF200) 항체와 "교차반응"한다는 것을 나타내는 것이다. 약 1:10 내지 약 1:100 사이의 어떤 DF200:시험항체 비율에서 적어도 약 60%, 또는 더 바람직하게는 적어도 약 70% (예를 들어, 약 65-100%) 같은, 적어도 약 50%로 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 항체 각각에 대한 DF200의 결합을 감소시키는 어떠한 항체도 DF200와 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체로 간주된다. 바람직하게는, 이 같은 시험 항체는 KIR2DL 항원 각각에 대한 DF200의 결합을 적어도 약 90% (예를 들어, 약 95%) 감소시킬 것이다.
경쟁은, 예를 들어, 유동 세포계측 시험에 의하여 평가될 수 있다. 이 같은 테스트에서, 주어진 KIR을 함유하는 세포는, 예를 들어, 우선 DF200로 인큐베이션 시킨 후, 플루오로크롬 또는 비오틴으로 표지된 시험항체로 인큐베이션 시킨다. 항체는 만약 포화량의 DF200으로 사전 인큐베이션 후 얻어진 결합이, DF200로 사전인큐베이션하지 않은 항체에 의하여 얻어지는 (형광에 의하여 측정될 때) 결합의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 또는 그 미만 (예를 들어, 약 30%)인 경우, DF200와 경쟁한다고 말한다. 대안으로, 만약 포화량의 시험 항체로 사전 인큐베이션된 세포 상의 표지된 DF200로부터 얻어진 결합이 그 항체로 사전 인큐베이션함 없이 얻어진 결합의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 또는 그 미만 (예를 들어, 약 30%)인 경우, 항체는 DF200와 경쟁한다고 말한다.
시험 항체가 포화 농도로 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 둘 다가 고정화된 표면에 사전 흡수된 및 적용된 단순 경쟁 측정법 또한 유리하게 사용될 수 있다. 단순 경쟁 측정법에서의 표면은 바람직하게는 BIACORE 칩 (또는 표면 플라즈몬 공명 분석에 적당한 다른 매체)이다. 대조표준 항체 (예를 들어, DF200)를 그 후 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3-포화 농도로 표면에 접촉시키고 대조표분 항체의 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 표면 결합을 측정한다. 대조표준 항체의 이 결합을 시험 항체 부재시의 대조표준 항체의 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3-함유 표면에 대한 결합과 비교한다. 시험 측정법에서, 시험 항체 부재시에 대조표준 항체에 의하여 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3-함유 표면의 결합이 현저하게 감소하면 시험 항체가 대조표준 항체와 실질적으로 동일한 에피토프를 인지한다는 것을 의미하는 것이고, 시험 항체는 대조표준 항체와 "교차반응"하는 것이다. KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 항원 각각에 대한 (DF200 같은) 대조표준 항체의 결합을 적어도 30% 또는 더 바람직하게는 약 40% 감소시키는 어떤 시험 항체도 대조표준 (예를 들어, DF200)과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하는 항체로 생각될 수 있다. 바람직하게는, 이 같은 시험 항체는 대조표준 항체 (예를 들어, DF200)의 KIR2DL 항원에 대한 결합을 적어도 약 50% (예를 들어, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 또는 그 이상) 감소시킬 것이다. 대조표준과 시험 항체의 순서는 반대로 될 수 있다는 것이 이해될 것이다: 즉, 경쟁 측정법에서 대조표준 항체가 표면에 먼저 결합되고 시험 항체가 표면에 그 후에 접촉될 수 있다는 것이다. 바람직하게는, (항체들이 교차반응한다는 가정 하에서는) 제 2 항체에 대한 결합의 감소가 더 큰 폭이 될 것으로 기대될 것이므로 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 항원에 대한 더 높은 친화도를 갖는 항체가 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3-함유 표면에 우선적으로 결합된다. 이 같은 측정법의 더 나아간 예는 실시예에 제공되고, 예를 들어, 여기에 참고문헌으로써 수록된 Saunal 및 Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41에 제공된다.
예시의 목적으로 DF200의 문맥으로 기재되었으나, 상기-기재된 면역학적 스크리닝 분석은 NKVSF1,1-7F9, EB6, GL183 및 본 발명에 따르는 다른 항체와 경쟁하 는 항체를 동정하는데 또한 사용될 수 있다.
척추동물 또는 세포에서의 항체의 고정화와 생산 후, 특정 선택 단계가 수행되어 청구항에 기재된 바와 같이 항체를 분리할 수 있다. 이와 관련하여, 구체적 구체예에서, 본 발명은 또한 이 같은 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 다음:
(a) 사람 아닌 포유동물을 저해 KIR 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로 면역화하는 단계;
(b) 상기 면역화된 동물로부터 상기 KIR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제조하는 단계;
(c) 적어도 두 가지의 상이한 저해 KIR 유전자 생성물과 교차반응하는 (b)의 항체를 선택하는 단계; 및
(d) 상기 적어도 두 가지의 상이한 저해 KIR 리셉터 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단 상의 NK 세포 세포독성의 KIR-매개 저해를 중화하는 능력이 있는 (c)의 항체를 선택하는 단계를 포함한다.
적어도 두 가지의 상이한 저해 KIR 유전자 생성물과 교차반응하는 항체의 선택은 항체를, 예를 들어 상기된 바와 같은, 두 가지 이상의 상이한 저해 KIR 항원에 대한 항체를 스크리닝함으로써 달성될 수 있다.
더 바람직한 구체예에서, 단계 (b)에서 제조된 항체는 단일클론 항체이다. 그러므로, 용어 "상기 면역화된 동물로부터 항체를 제조하는"은 여기에서 사용될 때, 면역화된 동물로부터 B-세포를 얻는 것 및 그 B 세포를 사용하여 하이브리도마 를 생산하는 것 및 면역화된 동물의 혈청으로부터 항체를 직접 얻는 것을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 단계 (c)에서 선택된 항체는 적어도 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과 교차반응한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 단계 (d)에서 선택된 항체는, KIR에 의하여 차단되지 않은 NK 세포와 동일한 작용인자/표적 비율로 얻어지는 용균 또는 세포독성과 비교할 때, 동류 HLA 클래스 I 분자를 발현하는 표적 세포에 대하여 표준 크롬 방출 측정법에서 측정하여, 항체에 의하여 인지되는 적어도 하나의 KIR에 의하여 나타나는 NK 세포에 의하여 매개되는, 적어도 약 10% 용균비, 및 바람직하게는 적어도 약 40% 용균비, 적어도 약 50% 용균비, 또는 더 바람직하게는 적어도 약 70% 용균비 (예를 들어, 약 60%-100% 용균비)를 발생시킨다. 대안으로, 단계 (d)에서 선택된 항체는, 하나 또는 수 개의 저해 KIR를 발현하는 NK 세포 및 NK 클론 상의 한 KIR에 의하여 인지되는 단지 한 종류의 HLA 대립유전자를 발현하는 표적 세포를 사용하는 크롬 측정법에서 사용될 때, 항체로 인하여 얻어지는 세포독성 수준이, W6/32 항 MHC 클래스 I 항체 같은 항 MHC 클래스 I mAb를 차단하여 얻어지는 세포독성의 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 또는 그 이상이 되어야 한다.
바로 위에 기재된 단계 (c)와 (d)의 순서는 바꾸어질 수 있다. 선택적으로, 그 방법은 또한 대안으로, 여기 다른 부분에서 기재된 바와 같이, 단일클론 항체 또는 단일클론 항체의 유도체 또는 그것의 단편을 제조하는 추가의 단계 더 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 활용 가능한 방법에 따르는 항체를 제조하는데 사용되는 사람 아닌 동물은 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 등), 소, 돼지, 말, 토끼, 염소, 양 등 같은 포유동물이다. 또한, 사람 아닌 포유동물은 유전적으로 수정되거나 조작되어 XenomouseTM (Abgenix) 또는 HuMAb-MouseTM(Medarex) 같은 "사람" 항체를 제조한다.
다른 변형에서, 본 발명은:
(a) 라이브러리나 레퍼토리로부터 적어도 두 가지의 상이한 사람 저해 KIR2DL 리셉터 유전자 생성물과 교차반응하는 단일클론 항체, 단일클론 항체의 단편, 또는 둘 중 어느 것의 유도체를 선택하는 단계, 및
(b) 상기 적어도 두 가지의 상이한 사람 저해 KIR2DL 리셉터 유전자 생성물을 발현하는 NK 세포의 집단 상의 NK 세포 세포독성의 KIR-매개 저해를 중화할 수 있는, (a)의 항체, 단편 또는 유도체를 선택하는 단계를 포함하는, 항체를 얻는 방법을 제공한다.
레퍼토리는 항체 또는 그것의 단편의, 선택적으로는 어떤 적당한 구조 (예를 들어, 파지, 박테리아, 합성 복합물 등)에 의하여 디스플레이되는, 어떤 (재조합) 레퍼토리일 수 있다. 저해 항체의 선택은 상기된 바와 같이 수행될 수 있고 실시예에 더 설명하고 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 사람 아닌 숙주로부터의 B 세포를 포함하는 하이브리도마를 제공하는데, 여기서 상기 B 세포는 적어도 두 가지의 상이한 사람 저 해 KIR2DL 리셉터 유전자 생성물 상에 존재하는 결정자에 결합하는 항체를 생산하고 상기 항체는 상기 리셉터의 저해 활성을 중화하는 능력이 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 이 양태의 하이브리도마는 단일클론 항체 NKVSF1을 생산하는 하이브리도마가 아니다. 본 발명의 이 양태의 하이브리도마는 면역화된 사람 아닌 포유동물로부터의 비장 세포와 불사화 세포주의 융합에 의하여 상기한 바와 같이 생산될 수 있다. 이 융합에 의하여 제조되는 하이브리도마는 여기 다른 부분에서 기재하는 바와 같은 이 같은 교차반응하는 항체의 존재 여부에 대하여 스크리닝될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마는 적어도 두 가지의 상이한 KIR2DL 유전자 생성물 상에 존재하는 결정자를 인지하는 항체를 생산하고, 그들 KIR 리셉터의 적어도 하나를 발현하는 NK 세포의 증강을 야기한다. 더욱 바람직하게는, 하이브리도마는 DF200과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자에 결합하고 NK 세포 활성을 증강시키는 항체를 생산한다. 가장 바람직하게는, 하이브리도마는 단일클론 항체 DF200를 생산하는 하이브리도마 DF200이다.
본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 것으로 확인되는 하이브리도마는 DMEM 또는 RPMI- 1640 같은 적당한 배지에서 다량으로 성장시킬 수 있다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 동물 내에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
소망의 단일클론 항체를 생산하기 위한 충분한 성장 후에, 단일클론 항체 함유 성장 배지 (또는 복수)를 세포로부터 분리하고, 그 안에 존재하는 단일클론 항체를 정제한다. 정제는 전형적으로 (모두, 예를 들어, 여기에 참고문헌으로써 수록된 Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC에 기재된) 겔 전기영동, 투석, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 사용하는 크로마토그래피, 또는 아가로스나 세파로스 비드 같은 고체 지지체에 결합된 항-마우스 Ig에 의하여 달성된다. 결합된 항체는 전형적으로 단백질 A/단백질 G 컬럼으로부터 낮은 pH 완충액 (pH 3.0 또는 그 이하의 글리신 또는 아세테이트 완충액)을 사용하여 용출한 직후 즉시 항체-함유 분획을 중화시킨다. 이들 분획은 합하여, 투석한 후 필요한 농도로 농축한다.
대안의 구체예에 따르면, 적어도 두 가지의 상이한 사람 저해 KIR 리셉터 유전자 생성물에 존재하는 결정자에 결합하는 항체를 코딩하는 DNA를 본 발명의 하이브리도마로부터 분리하여 적당한 숙주 내로 트랜스펙션시키기 위하여 적당한 발현 벡터에 위치시킨다. 그 후, 숙주는 항체, 또는 단일클론 항체의 사람화 버젼, 그 항체의 활성화 단편, 또는 그 항체의 항원인지 부위를 포함하는 키메라 항체 같은 그것의 변이체의 재조합 생산에 사용된다. 바람직하게는, 이 구체예에 사용되는 DNA는 적어도 두 가지의 상이한 KIR2DL 유전자 생성물 상에 존재하는 결정자를 인지하는 항체를 코딩하고, 그들 KIR 리셉터 중 적어도 하나를 발현하는 NK 세포의 증강을 야기한다. 더욱 바람직하게는, DNA는 DF200과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정자와 결합하고 NK 세포 활성을 증강시키는 항체를 코딩한다. 가장 바람직하게는, DNA는 단일클론 항체 DF200를 코딩한다.
본 발명의 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 전통적 방법을 사용하여 (예를 들어, 마우스 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 분리되고 서열결정된다. 일단 분리되면, DNA는 발현벡터에 위치시켜 그 후, 트랜스펙션되지 않았을 때는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는, E. coli, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포내에서 단일 클론 항체의 합성을 얻는다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내에서의 재조합 발현은 당업계 주지이다 (예를 들어, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993) ; 및 Pluckthun, Immunol.Revs., 130, pp. 151 (1992) 참조).
단일클론 항체의 단편 및 유도체
본 발명의 단일클론 항체의 단편 및 유도체 (문맥에 의하여 다르게 기재하거나 분명하게 그에 반한 기재가 없는 경우, 용어 "항체" 또는 "항체들"은 본원에서 사용될 때 이를 포괄한다), 바람직하게는 DF200-유사 항체는 당업계 공지의 기술에 의하여 제조될 수 있다. "면역활성 단편"은 완전한 항체의 일부, 일반적으로는 항체 결합 부위 또는 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디; (1) 단일사슬 Fv (ScFv) 분자, (2) 단지 하나의 경쇄 가변 영역을 함유하는 단일사슬 폴리펩티드 또는 중쇄 부분과 결합되지 않은 경쇄 가변 영역의 세 개의 CDR을 함유하는 그것의 단편 및 (3) 단지 하나의 중쇄 가변부를 함유하는 단일사슬 폴리펩티드 또는 경쇄 부분과 결합되지 않은 중쇄 가변 영역의 세 개의 CDR을 함유하는 그것의 단편을 제한 없이 포함하는, 연속된 아미노산 잔기의 방해되지 않은 서열로 구성된 일차 구조를 갖는 폴리펩티드인 어떤 항체 단편 (이하에서는 "단일사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩티드"라고 한다); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, Fab 또는 (Fab')2 단편은, 전통적 기술에 따라, 분리된 항체의 프로테이제 가수분해에 의하여 생산될 수 있다. 면역활성 단편은 공지 방법을 사용하여 변형되어 생체 내 클리어런스를 감소시키고 더 바람직한 약물동역학 프로파일을 얻기 위하여 변형될 수 있고, 단편은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 변형될 수 있다는 것이 이해될 것이다. PEG를 Fab' 단편에 커플링 및 부위 특이적 접합하기 위한 방법은, 예를 들어, 여기에 참고문헌으로써 수록된 Leong 등, Cvtokine 16 (3): 106-119 (2001) 및 Delgado 등, Br. J. Cancer 73 (2): 175- 182 (1996)에 기재된다.
특정 양태에서, 본 발명은 도 12에 기재된 바와 같은 DF-200의 경쇄 가변부 서열을 포함하는 항체, 항체 단편 및 항체 유도체를 제공한다. 다른 특정 양태에서, 본 발명은 도 12에 기재된 바와 같은 Pan2D의 경쇄 가변부 서열을 포함하는 항체, 항체 단편 및 항체 유도체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 도 12에 기재된 바와 같은 DF-200의 경쇄 가변부 CDR의 하나 이상을 포함하는 항체, 항체 단편 및 항체 유도체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 도 12에 기재된 바와 같은 Pan2D의 경쇄 가변부 CDR의 하나 이상을 포함하는 항체, 항체 단편 및 항체 유도체를 제공한다. 이 같은 서열의 기능적 변형체/유사체는, 서열의 대비의 도움을 받아 표준 기술을 사용하여 이들 개시된 아미노산 서열에 적당한 치환, 삽입 및/또는 결실을 행함으로써 제조될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, Pan2D와 DF-200 사이에 보존된 CDR 잔기는, (비록 Pan2D와 DF-200는 경쟁하기는 하지만) 이 같은 잔기가 여기 개시된 다른 항체에 관하여 이들 항체가 갖는 경쟁에서 상이한 프로파일에 기여하지 않을 수 있고, 따라서 그들의 특정의 각각의 에피토프에 대한 이들 항체의 특이성에 기여하지 않을 수 있는 한 변형의 적당한 표적이 될 수 있다. 다른 양태에서, 이들 항체의 하나의, 하지만 다른 서열에는 아닌, 서열에 잔기가 존재하는 위치는 결실, 치환 및/또는 삽입에 적당할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 도 13에 기재된 바와 같은 DF-200의 중쇄 가변부 서열을 포함하는 항체, 항체 단편 및 항체 유도체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 도 13에 기재된 바와 같은 DF-200의 중쇄 가변부 CDR의 하나 이상을 포함하는 항체, 항체 단편 및 항체 유도체를 제공한다. 이 같은 서열의 기능적 변형체/유사체는, 서열의 대비의 도움을 받아 표준 기술을 사용하여 이들 개시된 아미노산 서열에 적당한 치환, 삽입 및/또는 결실을 행함으로써 제조될 수 있다. 다른 양태에서, 이들 항체의 하나의, 하지만 다른 서열에는 아닌, 서열에 잔기가 존재하는 위치는 결실, 치환 및/또는 삽입에 적당할 수 있다.
대안으로, 본 발명의 항체를, 바람직하게는 DF-200 유사 항체를, 생산하는 하이브리도마의 DNA는 본 발명의 단편을 코딩하도록 변형될 수 있다. 그 후, 변형된 DNA를 발현 벡터 내로 삽입시켜 적당한 세포에 형질전환 또는 트랜스펙션시키는데 사용한 후, 소망의 단편을 발현시킨다.
대안의 구체예에서, 본 발명의 항체를, 바람직하게는 DF-200 유사 항체를, 생산하는 하이브리도마의 DNA는 발현 벡터에 삽입시키기 전에, 예를 들어, 동형 사람 아닌 서열 대신 사람 중쇄 및 경쇄 불변영역에 대한 코딩서열로 치환함으로써 ( 예를 들어, Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 81, pp. 6851(1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그 방법에서, 원래 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다. 전형적으로, 이 같은 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 영역으로 치환된다.
그러므로, 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 항체, 바람직하게는 DF-200 유사 항체는 인간화된다. 본 발명에 따른 항체의 "인간화" 형태는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 마우스 면역글로불린으로부터 유래한 최소한의 서열을 함유하는 (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원결합 하위서열 같은) 그것의 단편이다. 대부분, 인간화된 항체는 수용자의 보체결정부 (CDR)로부터의 잔기가 원래 항체 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의하여 교체되었지만 원래 항체의 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 유지한 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 예에서, 사람 면역글로불린의 Fv 골격 잔기가, 대응하는 사람 아닌 잔기에 의하여 교체될 수 있다. 더욱이, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 이입된 CDR 또는 골격 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 순화하고 최적화하기 위하여 행하여질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 두 개의 가변 영역의 실질적으로 전체를 포함할 것인데, 여기에서 원래 항체의 그것에 대응하는 CDR 영역의 전체 또는 실질적으로 전체와 FR 영역의 전체 또는 실질적으로 전체는 사람 면역글로불린 공통 서열의 그것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변부 (Fc), 전형적으로 사람의 면역글로불린의 불변부의 적어도 일부분을 선택적으로 포함할 것이다. 더 상세한 내용은 Jones 등, Nature, 321, pp. 522 (1986);Reichmann 등, Nature, 332, pp. 323(1988) ; 및 Presta, Curr.Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992) 참조.
본 발명의 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계 주지이다. 일반적으로, 본 발명에 따르는 인간화 항체는 원래 항체로부터 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 마우스 또는 다른 사람 아닌 동물의 아미노산 잔기는 "유입" 잔기라고 종종 지칭되는데, 이것은 전형적으로 "유입" 가변 영역으로부터 취하여진다. 인간화는 Winter와 공동 연구자들 (Jones 등 , Nature, 321, pp. 522 (1986); Riechmann 등, Nature, 332, pp. 323(1988) ; Verhoeyen 등, Science, 239, pp. 1534 (1988))의 방법을 따라 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 이 같은 "인간화된" 항체는 키메라 항체 (Cabilly et al.,U. S. Pat. No. 4,816, 567)이고, 여기에서 완전한 사람 가변 영역보다 실질적으로 적은 부분이 원래 항체로부터의 대응서열로 교체되었다. 실제로, 본 발명에 따르는 인간화 항체는 전형적으로 CDR 잔기와 아마도 몇몇의 FR 잔기가 원래 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 교체된 사람 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될 사람의, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적" 방법에 따르면, 본 원발명의 항체의 가변 영역의 서열은 사람 가변영역 서열의 전체 라이브러리로부터 스크리닝된다. 그 후, 마우스의 것에 가장 가까운 사람 서열을 인간화 항체를 위한 사람 골격 (FR)으로 받아들인다 (Sims 등, J. Immunol.,151, pp. 2296 (1993); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp. 901 (1987)). 다른 방법은 특정 서브그룹의 경쇄 또는 중쇄의 모든 사람 항체의 공통 서열로부터의 특정 골격을 사용한다. 동일한 골격이 몇몇 상이한 인간화 항체에 대하여 사용될 수 있다 (Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89,pp. 4285 (1992); Presta 등, J. Immunol., 51, pp. 1993)).
항체가 다중 저해 KIR 리셉터에 대한 고 친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질을 유지하면서 인간화되는 것 또한 중요하다. 이 목적을 성취하기 위하여, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체가 모 서열 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 사용하여 모 서열의 분석의 방법 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의하여 제조된다. 삼차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 사용 가능하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 삼차원 입체구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 구입가능하다. 이들 디스플레이의 관찰은 후보 면역글로불린의 작용시 잔기의 가능한 역할의 분석을, 즉 후보 면역글로불린이 그것의 항원에 결합되는 능력에 대한 잔기의 영향의 분석을 가능케 한다. 이 방법에서, 표적 항원에 대한 친화도가 증가하는 것 같은 바람직한 항체 특성이 달성되도록 FR 잔기가 공통 서열 및 유입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항체 결합데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
"인간화" 단일클론 항체를 제조하는 다른 방법은, 면역화에 마우스가 사용된 경우에는 XenoMouse
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(Abgenix, Fremont, CA)를 사용하는 것이다. XenoMouse는 면역글로불린 유전자가 작용하는 사람 면역글로불린 유전자로 교체된 본 발명에 따르는 마우스 숙주이다. 그러므로, 이 마우스에 의하여 또는 이 마우스의 B 세포로부터 만들어지는 하이브리도마에서 생산되는 항체는 이미 인간화된 것이다. XenoMouse는 여기에 참고문헌으로써 전문이 수록된 미국 특허 제 6,162,963호에 기재된다. 유사한 방법이 HuMAb-MouseTM(Medarex)을 사용하여 달성될 수 있다.
사람 항체는 또한 면역화를 위하여 사람 항체 레퍼토리를 발현하도록 조작된 다른 트랜스제닉 동물을 사용하거나 (Jakobovitz 등, Nature 362 (1993) 255), 또는 파지 디스플레이 방법을 사용하는 항체 레퍼토리의 선택에 의하는 것과 같은 다양한 다른 기술에 따라 제조될 수 있다. 이 같은 기술은 당업자에게 공지이고 본원에 기재된 것과 같은 단일클론 항체로부터 시작하여 수행될 수 있다.
본 발명의 항체, 바람직하게는 DF-200 유사 항체는, 바람직한 생물학적 활성을 갖는 한, 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 원래 항체의 대응 서열과 동일하거나 동형이면서 쇄의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래한 항체의 대응서열과 동일하거나 동형이거나 다른 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 "키메라" 항체 (면역글로불린) 및 그 같은 항체의 단편으로 파생될 수 있다 (Cabilly 등, supra; Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A., 81, pp. 6851 (1984)).
본 발명의 범위에 속하는 다른 유도체는 기능화된 항체, 즉 리신,디프테리아 톡신, 아브린 및 Pseudomonas 외독소에; 형광 부분, 방사성 동위원소 나 영상화제 같은 검출 가능한 부분에; 또는 아가로스 비드 등의 고체 지지체에 접합되거나 공유결합된 항체를 포함한다. 이들 다른 약제를 항체에 접합시키거나 공유결합시키는 방법은 당업계 주지이다.
독소와의 결합은 그것의 세포 표면상에 교차 반응 KIR 수용체 중 하나를 전개하는 NK 세포의 표적화된 사멸에 유용하다. 일단 본 발명의 항체가 이들 세포의 세포 표면에 결합하면, 항체는 내재화되고 독소가 세포 내부로 방출되어서 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 이러한 용례는 본원발명의 다른 구체예에 해당한다.
검출가능한 부분과의 결합은 본원발명의 항체가 진단 목적으로 사용되는 경우에 유용하다. 이러한 목적은 이에 제한되는 것은 아니지만, 그들의 세포 표면상에 교차 반응 KIR을 포함하는 NK 세포의 존재에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것 및 생체 기관 중에서 교차 반응 KIR 을 포함하는 NK 세포의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 분석 및 검출 방법이 또한 본원발명의 또 다른 구체예이다.
본원발명의 항체와 고체 지지체와의 결합은 생물학적 유체와 같은 공급원으로부터 그들의 세포 표면상에 교차 반응 KIR을 포함하는 NK 세포의 친화성 정제를 위한 툴로서 사용된다. NK 세포의 결과적인 정제 집단과 마찬가지로, 정제 방법은 본원발명의 다른 대안적인 구체예이다.
다른 구체예에서, 적어도 2개의 상이한 사람 저해성 KIR 수용체 유전자 생산물에 존재하는 공통 결정인자에 결합하는 항체는(항체는 본 발명의 상기 2개의 상이한 사람 저해성 KIR 수용체(NKVSF1을 포함한다)의 적어도 하나를 발현하는 NK 세 포상에서 NK 세포 세포독성의 KIR-매개 저해를 중화할 수 있다.) 동물로의 표적화된 송달을 위해 단독으로 또는 다른 물질과 조합하여 리포솜("면역리포솜")내에 통합될 수 있다. 이러한 다른 물질은 유전자 요법에 있어서 유전자 송달을 위한 핵산 또는 NK 세포에서 유전자를 억제하기 위한 안티센스 RNA, RNAi, 또는 siRNA 의 송달을 위한 핵산, 또는 NK 세포의 표적 사멸을 위한 독소 또는 약제를 포함한다.
공개된 결정 구조에 기초한 KIR2DL1, -2 및 -3(KIR2DL-3)의 세포외 도메인의 컴퓨터 모델링으로(Maenaka 등.,(1999), Fan 등., (2001), Boyington 등(2000)), KIR2DL1 과 KIR2DL1-3-교차 반응 마우스 단일 클론 항체들 DF200 및 NKVSF1 사이의 상호작용에 있어서 어떤 영역 또는 KIR2DL1, -2 및 -3이 관여한다는 것을 예측하였다. 따라서, 한 구체예에서, 본원발명은 아미노산 잔기(105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192)로 규정된 영역내의 KIR2DL1에 배타적으로 결합하는 항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 본원발명은 잔기(105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192)에 의해서 규정된 영역 외부의 아미노산 잔기와 상호작용하지 않으면서 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과 결합하는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DL1에는 결합하고 KIR2DL1의 돌연변이체(R131은 Ala이다)에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DL1에는 결합하고 KIR2DL1의 돌연변이체 (R157은 Ala이다)에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DL1에는 결합하고 KIR2DL1의 돌연변이체(R158은 Ala이다)에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DL1 잔기(131, 157, 158)에는 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DS3(R131W)에는 결합하지만, 야생형 KIR2DS3에는 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 뿐만 아니라 KIR2DS4와 결합하는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본원발명은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과는 결합하지만, KIR2DS4와는 결합하지 않는 항체를 제공한다.
항체가 상기에 규정된 에피토프 영역 중 어디에 결합하는지를 결정하는 것은 당업자에게 알려진 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 맵핑/특성결정 방법의 한 예로서, 항-KIR 항체에 대한 에피토프 영역은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 단백질내의 노출된 아민/카르복실의 화학적 변형을 사용하여 에피토프 "풋-프린팅"에 의해서 결정될 수 있다. 이러한 풋-프린팅 기술의 구체예는 HXMS(질량 분광계에 의해서 검출된 수소-중수소 교환)을 사용하는 것이고, HXMS에 있어서 수용체와 리간드 단백질 아미드 프로톤의 수소/중수소 교환, 결합, 및 후방 교환이 발생하고, 단백질 결합에 관여하는 백본 아미드기는 후방 교환으로부터 보호되어서 중수소화된 채로 남아 있게된다. 이 부위에서의 펩티드 단백질 분해, 신속한 마이크로보어 고성능 액체 크로마토그래피 분리, 및/또는 일렉트로스프레이 이온화 질량 분광계에 의해서 관련 영역이 확인될 수 있다. 예를 들어, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol.267(2)pp.252-259(1999) 및/또는 Engen, J.r. 및 Smith, D.L(2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A 참조. 적당한 에피토프 동정 기술의 다른 예는 핵자기 공명 에피토프 맵핑(NMR)이고, 전형적으로 유리 항원의 2차원 NMR 스펙트럼 중의 신호 위치와 항원 결합 펩티드(예를 들어, 항체)와 복합체를 형성한 항원이 비교된다. 항원은 전형적으로 15N으로 선택적으로 동위원소 표지화되어서 NMR-스펙트럼에 있어서 항원에 해당하는 신호만이 관찰되고 항원 결합 펩티드로부터 유래된 신호는 관찰되지 않는다. 항원 결합 펩티드와의 상호작용에 포함된 아미노산으로부터 유래하는 항원 신호는 유리 황원의 스펙트럼에 비교하여 복합체 스펙트럼의 위치를 변화시키고, 결합에 관여한 아미노산이 이러한 방식으로 확인될 수 있다. Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44):149-67; Huang 등, Journal of Molecular Biology, Vol. 281(1)pp. 61-67(1998); 및 Saito 및 Patterson, Methods. 1996 Jun;9(3):516-24 참조.
에피토프 맵핑/특성결정은 또한 질량 분광계 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35(4):493-503 및 Kiselar 및 Downard, Anal Chem. 1999 May 1;71(9):1792-801.
프로테아제 분해 기술이 또한 에피토프 맵핑 및 확인에 있어서 유용할 수 있다. 항원 결정인자-관련 영역/서열은 예를 들어, 37℃, pH 7-8에서 약 1:50의 비율 로 분해중인 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3에 트립신을 사용하는 것에 의한 프로테아제 분해에 의해서 결정될 수 있고 그 다음, 질량 분광계(MS) 분석에 의해서 펩티드를 확인할 수 있다. 항-KIR 바인더에 의해 트립신 절단으로부터 보호된 펩티드는 트립신 분해를 거친 샘플과 항체와 함께 인큐베이션된 다음 예를 들어, 트립신에 의해서 분해과정을 거친 샘플을 비교함으로써 연속적으로 확인될 수 있다. 키모트립신, 펩신 등과 같은 다른 효소가 유사한 에피토프 특성결정 방법에 함께 또는 선택적으로 사용될 수 있다. 더욱이, 효소 분해는, 표면 노출되어 있지 않아서 면역원성/항원성의 관점에서 관련성이 없을 것으로 여겨지는 항-KIR 폴리펩티드의 문맥에서, 강력한 항원성 결정인자 서열이 KIR2DL1의 영역내에 있는지 여부를 분석하는 신속한 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, Manca, Ann Ist Super Santia. 1991; 27(1):15-9에 유사한 기술이 기재되어 있다.
사이노몰거스 원숭이와의 교차반응성
항체 NKVSF1이 또한 사이노몰거스 원숭이(실시예7)로부터의 NK 세포에 결합한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본원발명은 항체, 및 그것의 단편 및 유도체를 제공하고, 상기 항체, 단편, 또는 유도체는 사람 NK 세포의 표면에서 적어도 2개의 저해성 사람 KIR 수용체와 교차 반응하고, 이들은 더욱이 사이노몰거스 원숭이로부터의 NK 세포에 결합한다. 한 구체예에서, 항체는 항체 NKVSF1 이 아니다. 발명은 또한 항체, 단편 및 유도체의 독성을 시험하는 방법을 제공하며, 상기 항체, 단편, 또는 유도체는 사람 NK 세포의 표면에서 적어도 2개의 저해성 사람 KIR 수용체와 교차반응하고, 이 방법은 사이노몰거스 원숭이에서 항체를 시험하는 단계를 포함한 다.
조성물 및 투여
본원발명은 또한 항체 및 그것의 단편 및 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 항체, 단편 또는 유도체는 NK 세포의 표면에서 적어도 2개의 저해성 KIR 수용체와 교차 반응하고, 그들의 저해성 신호를 중화하고 환자 또는 NK 세포를 포함하는 생물학적 샘플에 있어서 NK 세포 세포독성을 검출가능하도록 강화시키기에 유효한 양으로 적당한 비히클을 사용하여 이들 세포의 활성을 강화시킨다. 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 또한 "본원발명의 항체 조성물"로서 언급된다. 한 구체예에서, 본원발명의 항체 조성물은 상기의 항체 구체예에서 기재된 항체를 포함한다. 항체 NKVSF1은 본원발명의 항체 조성물내에 존재할 수 있는 항체의 범위에 포함된다.
본원에 사용될 때, 용어 "생물학적 샘플"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 생물학적 체액(예를 들어, 혈청, 림프, 혈액), 세포 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 골수)을 포함한다.
이들 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민), 인산염과 같은 완충액 물질, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 글리세리드 혼합물 일부, 물, 염 또는 전해질(프로타민 술페이트, 디소디움 히드로겐 포스페이트, 포타슘 히드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연염), 콜로라이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케 이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함한다.
본원발명의 조성물은 환자 또는 생물학적 샘플에서 NK 세포의 활성을 증강시키는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 상기 조성물을 상기 환자 또는 생물학적 샘플과 접촉시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 진단 및 치료 목적 모두에 유용하다.
생물학적 샘플과 조합한 사용에 있어서, 항체 조성물은 샘플의 성질(액체 또는 고체)에 따라서 샘플과 단순히 혼합하거나 또는 샘플에 직접 적용시키는 것에 의해서 투여될 수 있다. 생물학적 샘플은 어떤 적당한 장치 (플레이트, 파우치, 플라스크 등) 내의 항체와 직접 접촉될 수 있다. 환자와 조합한 사용에 있어서, 조성물은 환자에 투여되도록 조제되어야만 한다.
본원발명의 조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국부, 직장, 비강, 구강, 질내 또는 임플란트 공급원에 의해서 투여될 수 있다. 본원에 사용될 때 용어 "비경구"는 피하내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 포막내, 간장내, 손상부위내 및 두개골내 주사 또는 주입을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 경구, 비경구 또는 정맥내 투여된다.
본원발명 조성물의 주입가능한 무균 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적당한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라서 조제될 수 있다. 주입가능한 무균 제제는 비독성의 경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 주입가능한 무균 용액 또는 현탁액일 수 있으며, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액이다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 더욱이, 무균, 고정된 오일은 종래에는 용매 또는 현탁배지로서 사용되었다. 이러한 목적을 위해서, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 어떤 블랜드 고정 오일이 사용될 수 있다. 올리브 오일 또는 카스토르 오일, 특히 그들의 폴리옥시에틸화 버젼과 같은 천연의 약학적으로 허용가능한 오일과 마찬가지로, 올레산과 그것의 글리세리드 유도체와 같은 지방산이 주입가능한 제제에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 긴사슬 알코올 희석제 또는 카르복시메틸 셀룰로스와 같은 분산제 또는 에멀젼 및 현탁액을 포함하는 약학적으로 허용가능한 제형의 제조에 있어 일반적으로 사용되는 유사한 분산제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 고체, 액체, 또는 다른 제형의 제조에 일반적으로 사용되어지는, 트윈, 스판과 같은 다른 일반적으로 사용된 계면활성제 및 다른 유화제 또는 생체이용가능한 인핸서가 또한 조제 목적에 사용될 수 있다.
본원발명의 조성물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 경구 허용가능한 제형으로 경구적으로 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 일반적으로 사용된 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여에 있어서, 유용한 희석제는 락토스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구 사용에 필요한 경우에는, 활성제를 유화제 및 현탁제와 결합시킨다. 원한다면, 어떤 감미료, 조미료 또는 착색제가 첨가될 수 있다.
또는, 본원발명의 조성물은 직장 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 실온에서는 고형이지만 직장 온도에서 액체로 되어 직장내에서 약제를 방출하도록 용해될 수 있는 적당한 비자극성 부형제와 약제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본원발명의 조성물은 국부적으로 투여될 수 있으며, 특히 치료 표적(눈병, 피부병, 또는 하부 창자관병을 포함한다)은 국부 적용에 의해서 용이하게 접근가능한 영역 또는 기관을 포함한다. 적당한 국부용 제제가 이들 영역 또는 기관 각각에 대해서 용이하게 제조될 수 있다.
하부 창자관에 대한 국부 적용은 직장 좌약 제제(상기 참조) 또는 적당한 관장제로 효과를 나타낼 수 있다. 국부적-경피 패취가 또한 사용될 수 있다.
국부 적용의 경우에, 조성물은 하나 이상의 담체 중에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적당한 연고로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국부 적용을 위한 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 미네랄 오일, 액상 바셀린, 흰 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화용 왁스 및 물을 포함한다. 또는, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적당한 로션 또는 크림의 형태로 조제될 수 있다. 적당한 담체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테 아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물을 포함한다.
안과 적용의 경우에, 조성물은 벤질알코니움 클로라이드와 같은 보존제와 함께 또는 보존제 없이, 등장성, pH 조정된 무균 식염수 중의 미세화된 현탁액으로, 또는 바람직하게는 등장성, pH 조정된 무균 식염수 중의 용액으로 조제될 수 있다. 또는, 안과 적용의 경우에, 조성물은 바셀린과 같은 연고로 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물 코 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 조성물은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 방부제, 생물학적 이용가능성을 강화하기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본, 및/또는 다른 종래의 가용화제 또는 분산제를 채택하여, 약학 조제의 업계에서 잘 알려진 기술에 따라 제조되고 식염수 중의 용액으로 제조될 수 있다.
Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) 또는 Xolair (Omalizumab)과 같은 몇몇 단일클론 항체는 임상 상황에서 효과적인 것으로 나타났고, 유사한 투여 요법 (즉, 제제 및/또는 복용량 및/또는 투여 프로토콜)이 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 제약학 조성물에서 항체의 투여를 위한 스케줄과 용량은 이들 제품에 대해 공지된 방법에 따라 예를 들어 제조업자의 지시를 사용하여, 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약학 조성물에 존재하는 항체는 100 mg (10 mL) 또는 500 mg (50 mL) 단일-사용 약병 중의 하나에 10 mg/mL의 농도에서 공급될 수 있다. 제품은 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 나트륨 시트레이트 디하이드레이트, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 주사용 Sterile Water에서 IV 투여 를 위해 조제된다. pH는 6.5로 조절된다. 본 발명의 제약학 조성물중의 항체에 대한 적합한 용량 범위의 예는 약 10 mg/m2 및 500 mg/m2 사이일 수 있다. 그러나, 이들 스케줄은 예시이며, 임상 실험에서 결정되어야 하는 제약학 조성물중의 특정한 항체의 친화력과 허용능력을 고려하여, 최적의 스케줄 및 요법이 채택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 24 시간, 48 시간 72 시간 또는 1주 또는 한달 동안 NK 세포를 포화시키는 본 발명의 제약학 조성물에서 항체의 주사의 양과 스케줄은 항체의 친화력 및 그것의 약동학 요인들을 고려하여, 결정될 것이다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명의 항체 조성물은 그것을 위해 항체가 투여되는 특정한 치료 목적을 위해 통상적으로 이용되는 약제를 포함하여, 또다른 치료제를 포함할 수 있다. 추가의 치료제는 통상적으로 치료될 특정한 질환 또는 상태를 위한 단일요법에서 그 약제를 위해 전형적으로 사용되는 양으로 조성물에 존재할 것이다. 그러한 치료제는 이것으로 한정되지는 않지만, 암의 치료에 사용되는 치료제, 감염성 질환을 치료하는데 사용되는 치료제, 다른 면역치료법에 사용된 치료제, 시토카인 (이를테면 IL-2 또는 IL-15), 다른 항체 및 다른 항체의 단편을 포함한다.
예를 들어, 많은 치료제는 암의 치료에 이용가능하다. 본 발명의 항체 조성물 및 방법은 특정한 질환, 특정하게는 종양, 암 질환, 또는 환자가 나타내는 다른 질환 또는 장애의 치료에 일반적으로 채택되는 어떠한 다른 방법과 조합될 수 있다. 특정한 치료 접근법이 환자의 상태에 해로운 것으로 알려지지 않고, 본 발명 의 제약학 조성물에서 항체의 활성을 상당히 방해하지 않는 한, 본 발명과의 그것의 조합을 계획한다.
고체 종양 치료와 조합하여, 본 발명의 제약학 조성물은 외과수술, 방사선요법, 화학요법, 등과 같은 전통적 접근법과 조합될 수 있다. 본 발명은 따라서 본 발명의 제약학 조성물이 외과수술 또는 방사선 치료와 동시에, 그 전에, 또는 그 후에 사용되는 ; 또는 종래의 화학치료, 방사선치료 또는 항- 혈관형성 제, 또는 표적화 면역독소 또는 코아규리간드와 함께, 그 전에 또는 그 후에 환자에 투여되는, 조합된 치료법을 제공한다.
하나 이상의 약제가 치료 요법에서 본 발명의 항체-함유 조성물과 조합하여 사용될 때, 각각의 치료가 개별적으로 수행될 때 관찰된 조합된 결과에 대한 요구조건은 없다. 적어도 추가 효과가 일반적으로 바람직하지만, 단일 치료법 중 하나 이상으로 어떠한 증가된 항암 효과가 유익할 것이다. 또한, 이것이 특정하게 가능하고 이롭지만, 시너지 효과를 나타내는 조합 치료에 대한 특정한 요구조건은 없다.
조합된 항암 요법을 실행하기 위해서, 본 발명의 항체 조성물을 동물내에서 그들의 조합된 항암 작용을 초래하기에 효과적인 방식으로 또다른 함암제와 조합하여, 동물에게 간단히 투여할 것이다. 약제는 따라서 종양 맥관계 내에서 그들의 조합된 존재 및 종양 환경에서 그들의 조합된 작용을 초래하는데 효과적인 양으로 효과적인 시간 기간동안 제공될 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 항체 조성물과 함암제는 다른 투여 경로를 사용하여 단일 조합된 조성물로, 또 는 두개의 별개의 조성물로서 동시에 동물에게 투여될 수 있다.
대안으로서, 본 발명의 항체 조성물의 투여는 예를 들어, 분 내지 주 및 달에 이르는 간격에 의해 함암제 치료보다 앞서거나 그 후에 일어날 수 있다. 함암제와 본 발명의 항체 조성물에서의 항체가 암에 대해서 이롭게 조합된 효과를 발휘한다는 것을 보장할 것이다.
대부분의 함암제는 항-혈관형성 요법에서 본 발명의 저해 KIR 항체 조성물보다 앞서 주어질 것이다. 그러나, 항체의 면역접합체가 본 발명의 항체 조성물에 사용될때, 다양한 항암제가 동시에 또는 이어서 투여될 수 있다.
어떤 상황에서는, 상당히 치료를 위한 기간을 연장하는 것이 바람직할 수도 있고, 이때 함암제의 각각의 투여 또는 항암 치료와 본 발명의 항체 조성물의 투여 사이에 몇일 (2,3, 4,5, 6 또는 7), 몇주 (1,2, 3,4, 5,6, 7 또는 8) 또는 심지어 몇개월 (1,2, 3,4, 5,6, 7 또는 8)이 경과한다. 이는 외과수술 또는 화학요법과 같이, 항암 치료가 실질적으로 종양을 파괴하려는 목적인 상황에서 이로울 것이고, 본 발명의 항체 조성물의 투여는 미세전이 또는 종양 재-성장을 방지하려는 목적이었다.
또한 본 발명의 저해 KIR 항체-기반 조성물 또는 함암제 중 하나의 1회 이상의 투여가 이용될 것으로 계획된다.
이들 약제는 격일 또는 격주로 또는 저해 KIR 본 발명의 항체 조성물로의 치료의 싸이클로, 이어서 함암제 요법의 싸이클로 상호교환하여 투여될 수 있다. 어떠한 경우에는, 조합된 요법을 사용하여 종양 퇴행을 달성하기 위해, 필요한 모든 것은 두 약제 모두를 투여를 위한 시간에 관계없이 항-종양 효과를 발휘하는데 효과적인 조합된 양으로 송달하는 것이다.
외과수술의 관점에서, 어떠한 외과용 중재가 본 발명과 조합하여 실행될 수 있다. 방사선요법과 연결하여, 감마-조사, X-선, UV-조사, 마이크로파 및 심지어 전자 방출 등과 같이, 암 세포 내에 국소적으로 DNA 손상을 유발하기 위한 어떠한 메카니즘이 계획된다. 방사선 동위원소의 암 세포로의 직접적인 송달은 또한 계획되고, 이는 표적화 항체 또는 다른 표적화 수단과 연결되어 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 면역조절 화합물 또는 요법은 본 발명의 항체 조성물과 조합하여 또는 그것의 일부로서 투여될 수 있다. 면역조절 화합물의 바람직한 예는 시토카인을 포함한다. 다양한 시토카인은 그렇게 조합된 접근법에 채택될 수 있다. 본 발명에 의해 계획된 조합에 유용한 시토카인의 예는 IL-l알파 IL-l베타, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF- 베타, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-알파, TNF-베타, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마를 포함한다. 조합 치료 또는 본 발명의 조성물에 사용된 시토카인은 환자의 상태 및 시토카인의 상대적인 독성과 같은 임상 징조와 일치하게, 표준 요법에 따라 투여된다.
특정 구체예에서, 교차-반응하는 저해 KIR 항체-포함 본 발명의 치료 조성물은 조합하여 투여되거나 또는 화학치료 또는 호르몬 요법제를 더욱 포함할 수 있다. 다양한 호르몬 요법 및 화학치료제는 본원에 개시된 조합된 치료 방법에서 사용될 수 있다. 예로서 계획된 화학치료제는 이것으로 한정되지는 않지만, 알킬화 제, 대사길항물질, 세포독성 항생제, 빈카 알칼로이드, 예를 들어 아드리아마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 카르미노마이신, 다우노마이신, 독소루비신, 타목시펜, 탁솔, 탁소테레, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 에토포시드 (VP-16), 5-플루오로우라실 (5FU), 시토신 아라비노시드, 사이클로포스파미드, 티오테파, 메토트렉세이트, 캄프토테신, 엑티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴 (CDDP), 아미노프테린, 캄브레타스타틴(들) 및 그것의 유도체 및 프로드러그를 포함한다.
호르몬제는 이것으로 제한되지는 않지만, 예를 들어 류프로렐린, 고세렐린, 트리프토렐린, 및 부세렐린과 같은 LHRH 작용제; 타목시펜 및 토레미펜과 같은 항-에스트로겐; 플루타미드, 닐루타미드, 사이프로테론 및 비칼루타미드와 같은 항-안드로겐; 아나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸 및 파드로졸과 같은 아로마타제 저해제; 및 메드록시, 클로르마디논 및 메게스트롤과 같은 프로게스타겐을 포함한다.
당업자들에 의해 이해될 것처럼, 적절한 복용량의 화학치료제는 화학치료가 단독으로 또는 다른 화학치료와 조합하여 투여되는 임상 치료법에 이미 채택된 것들과 비슷할 것이다. 오직 예로서, 시스플라틴, 및 다른 DNA 알킬화와 같은 약제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 매 3주 총 3 과정동안 5일동안 20 mg/m2의 임상 응용에 사용된 효능있는 복용량으로, 암을 치료하는데 널리 사용되었다. 시스플라틴 은 경구로 흡수되지 않고 따라서 정맥내, 피하로, 종양내로 또는 복막내 주사를 통해 송달되어야 한다.
더 나아가 유용한 화학치료제는 DNA 복제, 유사 분열 및 염색체 분비와 상충 하는 화합물, 및 폴리뉴클레오티드 전구물질의 합성 및 적합도를 붕괴시키는 약제를 포함한다. 조합된 요법을 위한 화학치료제의 많은 예는 미국 특허 No. 6,524, 583의 표 C에 열거되어 있고, 그것의 약제 및 징후의 개시는 특이적으로 참고문헌에 의해 본원에 포함된다. 열거된 약제의 각각은 예이고 제한하는 것이 아니다. 당업자들은 "Remington's Pharmaceutical Sciences"15th Edition, 제 33장, 구체적인 페이지 624-652에 지시된다. 용량의 변화는 치료될 상태에 따라 일어날 것이다. 치료를 관리하는 의사는 개별적인 대상을 위한 적절한 복용량을 결정할 수 있다.
본 발명의 교차-반응하는 저해 KIR 항체 조성물은 어떠한 하나 이상의 다른 항-혈관형성 치료법과 조합될 수 있고 또는 항-혈관형성제를 더 포함할 수 있다. 그러한 약제의 예는 중화 항체, 안티센스 RNA, siRNA, RNAi, RNA aptamers 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대해 각각 지시된 리보자임(미국 특허 No. 6,524, 583, 이것의 개시는 참고문헌에 의해 본원에 포함된다)를 포함한다. 대항 성질을 갖는 VEGF의 변형체는 또한 특이적으로 참고문헌에 의해 본원에 포함되는, WO 98/16551에 기술된 바와 같이, 채택될 수 있다. 조합된 요법과 연결하여 유용한 더 나아간 항-혈관형성제의 예는 미국 특허 No. 6,524, 583의 표 D에 열거되어 있고, 그것의 약제 및 징후의 개시는 특이적으로 참고문헌에 의해 본원에 포함된다.
본 발명의 저해 KIR 항체 조성물은 또한 세포자멸사를 유도하는 방법과 조합하여 이롭게 사용될 수 있거나 또는 세포자멸제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 많은 종양원은 세포자멸사, 또는 프로그래밍된 세포 사멸을 저해하는 것으로 확인되 었다. 이러한 카테고리에서 종양원의 예는 이것으로 한정되지는 않지만, bcr-abl, bcl-2 (bcl-1, cyclin D1으로부터 별개; GenBank 승인 번호 M14745, X06487; 미국 특허 Nos. 5,650, 491; 및 5,539, 094; 각각은 본원에 참고문헌에 의해 포함됨) 및 Bcl-xl, Mcl-1, Bak, Al, 및 A20을 포함하는 패밀리 맴버를 포함한다. bcl-2의 과도발현은 먼저 T 세포 임파종에서 발견되었다. 종양유전자 bcl-2은, 세포고사 경로에서 단백질인 Bax에 결합하고 비활성화함으로써 작용한다. bcl-2 작용의 저해는 Bax의 비활성화를 방지하고, 세포고사 경로가 진행되는 것을 허용한다. 이 클래스의 종양원의 저해는, 예를 들어, 안티센스 뉴클레오티드서열, RNAi, siRNA 또는 소분자 화학 화합물을 사용하여, 세포자멸사의 강화를 제공하기 위한 본 발명의 사용을 위해 계획된다(미국 특허 Nos. 5,650, 491; 5,539, 094; 및 5,583, 034; 각각은 참고문헌에 의해 본원에 포함된다).
본 발명의 저해 KIR 항체 조성물은 또한 표적화 부분, 예를 들어, 표적 세포 ("표적화 약제")의 특이적 마커, 예를 들어 표적 종양 세포에 지시된, 항체, 리간드, 또는 그것의 접합체를 포함하는 분자를 포함하거나 그것과 조합하여 사용될 수 있다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 이들 추가의 관점에서 사용하기 위한 표적화 약제는 바람직하게, 우선적으로, 또는 특이적으로, 종양 부위에 발현되는 접근가능한 종양 항원을 인식한다. 표적화 약제는 일반적으로 종양 세포의 표면-발현된, 표면-접근가능한 또는 표면-집중된 성분에 결합할 것이다. 표적화 약제는 또한 바람직하게 높은 친화력의 성질을 나타낼 것이고; 심장, 신장, 뇌, 간, 골수, 결장, 유방, 전립샘, 티로이드, 쓸개, 폐, 부신, 근육, 신경 섬유, 췌장, 피부, 또는 사람 몸에서 다른 수명-유지 기관 또는 조직으로부터 선택된 하나 이상의 조직과 같은 수명-유지 통상의 조직에 대해, 생체내에서 유의한 부작용을 발휘하지 않을 것이다. 용어 "유의한 부작용을 발휘하지 않는다 "는 본원에서 사용된 바와 같이, 생체내에서 투여될 때, 표적화 약제가, 화학요법 동안에 통상 부딪치게 되는 것들과 같은 무시해도 좋은 또는 임상적으로 제어하기 쉬운 부작용 만을 생산할 것이라는 사실을 말한다.
종양의 치료에 있어서, 본 발명의 항체 조성물은 추가적으로 보조약 화합물을 포함하거나 보조약 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 보조약 화합물은 예로서, 세로토닌 대항제과 같은 항-구토제 및 페노티아진, 치환 벤자미드, 항히스타민, 부티로페논, 코르티코스테로이드, 벤조디아제핀 및 칸나비노이드와 같은 치료법 ; 졸레드론산 및 파미드론산과 같은 비스포스포네이트; 및 에리트로포이에틴 및 G-CSF과 같은 조혈 성장 인자, 예를 들어 필그라스팀, 레노그라스팀 및 다베포이에틴을 포함한다.
또다른 구체예에서, NKVSF1을 포함하여, 다른 교차-반응성을 갖는, 본 발명의 두개 이상의 항체는 가능한 많은 저해 KIR 유전자 제품의 저해 효과를 중화하기 위해, 단일 조성물에서 조합될 수 있다. 본 발명의 교차-반응성 저해 KIR 항체의 조합을 포함하는 조성물, 또는 단편 또는 그것의 유도체는, 단일 교차-반응하는 항체에 의해 인식된 저해 KIR 유전자 생성물의 각각을 결여할 수 있는 사람 집단의 작은 백분율을 나타낼 것이기 때문에, 더 넓은 효용을 허용할 것이다. 유사하게, 본 발명의 항체 조성물은 단일 저해 KIR 서브타입을 인식하는 하나 이상의 항체를 더욱 포함할 수 있다. 그러한 조합은 치료 세팅에서의 더 넓은 효용을 다시 제공할 것이다.
본 발명은 또한 그것을 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따라 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 NK 세포 활성을 증강하는 방법을 제공한다. 방법은 NK 세포에 의해 용해에 민감한 세포를 수반하고, 그것에 영향을 주고 또는 그것에 의해 유발되는, 또는 암, 또다른 증식 장애, 감염성 질환 또는 면역장애와 같이, 불충분한 NK 세포 활성에 의해 유발되거나 그것을 특징으로 하는, 증가된 NK 세포 활성이 유익한 질환을 갖는 환자에서 NK 세포 활성을 증가시키는데 있어서 특이적으로 지시된다. 좀더 명확하게는, 본 발명의 방법은 이것으로 제한되지는 않지만, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립샘, 췌장, 위, 자궁경부, 티로이드 및 비늘 세포 암종을 포함하는 피부 암종을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 임파종, T-세포 임파종, Hodgkins 임파종, 비-Hodgkins 임파종, 털 세포 임파종 및 Burketts 임파종을 포함하는 림프모양 계통의 조혈 종양 ; 급성 및 만성 골수 백혈병 및 잔골수구 백혈병을 포함하는, 골수 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 멜라닌종, 고환종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종을 포함하는 다른 종양; 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 평활근 조직 악성 종양, 및 뼈육종을 포함하는, 중간엽 기원의 종양; 및 멜라닌종, 피부건조증 건피증, 각질가시세포종, 고환종, 티로이드 소포 암 및 기형암종을 포함하는 다른 종양을 포함하는, 다양한 암 및 다른 증식 질환의 치료에 이용된다.
본 발명에 따라서 처리될 수 있는 바람직한 장애는 이것으로 제한되지는 않지만 T-프로림프구 백혈병 (T-PLL)과 같은 T-세포 장애를 포함하는, 작은 세포 및 대뇌모양 세포 타입; 큰 과립 림프구 백혈병 (LGL) 바람직하게 T-세포 타입; Sezary 증후군 (SS); 성인 T-세포 백혈병 임파종 (ATLL); a/d T-NHL 간비장임파종; 말초/포스트-가슴샘 T 세포 임파종 (다형태 및 면역모세포 서브타입); 혈관 면역모세포 T-세포 임파종; 혈관중심성 (코) T-세포 임파종; 아나플라스틱 (Ki 1+) 큰 세포 임파종; 창자 T-세포 임파종; T-림프모구; 및 임파종/백혈병 (T-Lbly/T-ALL)을 포함하는, 림프모양 계통의 조혈- 종양, 예를 들어 T-세포 및 B-세포 종양을 포함한다.
예를 들어 비후, 섬유증 (특히 폐는 물론이고, 신장 섬유증과 같은 다른 타입의 섬유증도 또한), 혈관형성, 건선, 죽상경화증 및 혈관에서 평활근 증식, 이를테면 협착증 또는 혈관성형술 후의 재협착증을 포함하여, 다른 증식 장애는 또한 본 발명에 따라 치료될 수 있다. 본 발명의 교차-반응하는 저해 KIR 항체는 바람직하게 바이러스, 박테리아, 원생동물, 곰팡이 또는 균류에 의해 유발된 어떠한 감염을 포함하는, 감염성 질환을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 그러한 바이러스 감염성 유기체는 이것으로 한정되지는 않지만, 간염 A형, 간염 B형, 간염 C형, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순헤르페스 I형 (HSV-1), 단순헤르페스 2형 (HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡 융합체 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에키노바이러스, 아르보바이러스, 훈타바이러스, 콕사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 폴리오 바이러스 및 사람 면역결핍 바이러스 I형 또는 2형 (HIV-1, HIV-2)을 포함한다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 세균 감염은 이것으로 한정되지는 않지만, 다음에 의해 유발된 감염들을 포함한다: Staphylococcus; S. pyogenes을 포함하는 Streptococcus; Enterococcl ; Bacillus anthracis, 및 Lactobacillus을 포함하는 Bacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; G. vaginalis을 포함하는 Gardnerella ; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna ; Raeruginosa을 포함하는 Camplyobacter, Pseudomonas ; Legionella ; N. gonorrhoeae 및 N. meningitides을 포함하는 Neisseria ; F. meningosepticum 및 F. odoraturn을 포함하는 Flavobacterium ; Brucella; B. pertussis 및 B. bronchiseptica을 포함하는 Bordetella ; E. coli, Klebsiella을 포함하는 Escherichia ; S. marcescens 및 S. liquefaciens을 포함하는 Enterobacter, Serratia ; Edwardsiella ; P. mirabilis 및 P. vulgaris을 포함하는 Proteus ; Streptobacillus; R. fickettsfi를 포함하는 Rickettsiaceae, C. psittaci 및 C. trachomatis을 포함하는 Chlamydia ; M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare, 및 M. lepraemurium을 포함하는 Mycobacterium; 및 Nocardia.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 원생동물 감염은, 이것으로 한정되지는 않지만, 리슈만편모충, 코크지디오아, 및 파동편모충에 의해 유발된 감염을 포함한다. 감염성 질환의 전체 리스트는 Center for Disease Control (CDC)에서 감염성 질환 (NCID)에 대한 National Center의 웹사이트에서 찾아볼 수 있다(http://www. cdc. gov/ncidod/diseases/), 이 리스트는 참고문헌에 의해 본원에 포함된다.
모든 상기 질환은 본 발명의 교차-반응하는 저해 KIR 항체를 사용하여 치료를 위한 후보자이다.
다양한 감염성 질환을 치료하는 그러한 방법은 단독으로 또는 다른 치료 및/또는 치료제와 조합하여, 항-바이러스제, 항-진균제, 항세균제, 항생제, 항-기생충 약제 및 항- 원생동물 약제를 포함하여, 그러한 질환을 치료하는 것으로 알려진 본 발명의 항체 조성물을 채택할 수 있다. 이들 방법들은 추가의 치료제로 추가의 치료를 수반할 때, 그러한 약제는 단일 용량 형태 또는 분리된, 다중 용량 형태로, 본 발명의 항체와 함께 투여될 수 있다. 분리된 용량 형태로서 투여될 때, 추가의 약제는 본 발명의 항체의 투여 전에, 동시에, 그 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 더 나아간 관점 및 잇점들은 하기의 실험 섹션에서 개시될 것이며, 이것은 예시로서 간주되어야 하며 본 출원의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
PBL의 정제 및 다클론성 또는 클론 NK 세포주의 발생.
PBL은 Ficoll Hypaque 구배 및 플라스틱 부착성 세포의 고갈에 의해 건강한 제공자로부터 유도되었다. 풍부한 NK 세포를 얻기 위해, PBL를 항 CD3, 항 CD4 및 항 HLA-DR mAbs (4°C에서 30 분)으로 배양하고, 이어서 당업계에 공지된 방법에 의해 염소 항 마우스 자성 비드 (Dynal) (4°C에서 30 분) 및 면역자성 선택 (Pende 등, 1999)을 하였다. 방사선조사된 피더 세포 및 100 U/ml 인터류킨 2 (Proleukin, Chiron Corporation) 및 1.5 ng/ml Phytohemagglutinin A (Gibco BRL)에서 CD3-, CD4-, DR-세포를 배양하여 다클론성 NK 세포 집단을 얻었다. NK 세포를 제한하는 희석에 의해 클로닝하였고 NK 세포의 클론은 세포 표면 수용체의 발현에 대한 흐름세포측정에 의해 특징지어졌다.
사용된 mAbs은 JT3A (IgG2a, 항 CD3), EB6 및 GL183 (각각 IgG1 항 KIR2DL1 및 KIR2DL3), XA-141 IgM (EB6과 동일한 특이성을 갖는 항 KIR2DL1), 항 CD4 (HP2.6), 및 항 DR (D1.12, IgG2a)이었다. JT3A 대신에, 출원인에 의해 제조된 HP2.6, 및 DR1.12은, 동일한 특이성의 상업적으로 입수가능한 mAbs이 사용될 수 있다(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). EB6와 GL183는 시중에서 입수가능하다 (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. XA-141는 시중에서 입수불가능하지만, EB6 (Moretta 등, 1993)에서 기술된 바와 같이 용해의 제어 재구성을 위해 사용될 수 있다.
세포를 적절한 항체 (4°C에서 30mns)로 염색하고 이어서 PE 또는 FITC 접합된 다클론성 항 마우스 항체 (Southern Biotechnology Associates Inc)로 염색하였다. 샘플은 FACSAN 장비(Becton Dickinson, Mountain View, CA)에서 사이토플루오로메트릭 분석에 의해 분석하였다.
다음의 클론을 연구에 사용하였다. CP1 1, CN5 및 CN505은 KIR2DL1 포지티 브 클론이고 EB6 ((IgGl 항 KIR2DL1) 또는 XA-141 (EB6 항체와 비교할때 동일한 특이성을 갖는 IgM 항 KIR2DL1)에 의해 염색한다. CN12와 CP502는 KIR2DL3 포지티브 클론이고 GL183 항체 (IgGl 항 KIR2DL3)에 의해 염색된다.
NK 클론의 세포용해 활성은 이펙터 NK 세포를 NK 세포 용해에 대한 그들의 민감도에 대해 잘 알려진 Cw3 또는 Cw4 포지티브 세포주에서 실험된, 표준 4 시간 51Cr 방출 분석법에 의해 평가되었다. 모든 표적은 마이크로적정 플레이트에서 웰 당 5000 세포에서 사용되었고 이펙터: 표적 비는 도면에 표시되어 있다 (표적 세포당 보통 4 이펙터). 세포용해 분석법을 1/2 희석에서 표시된 단일클론 항체의 성청액과 함께 또는 그것없이 수행하였다. 과정은 (Moretta 등, 1993)에서 기술된 바와 같이 본질적으로 동일하였다.
실시예 2
새로운 mAbs 의 발생
mAbs는 5 주령 Balb C 마우스를 (Moretta 등, 1990)에서 기술된 바와 같이 활성화 다클론성 또는 단일클론 NK 세포주로 면역화함으로써 발생되었다. 다른 세포 융합 후에, mAbs를 EB6 및 GL183 포지티브 NK 세포주 및 클론으로 교차-반응하는 그들의 능력에 대해 먼저 선택되었다. 포지티브 단일클론 항체를 각각 Cw4 또는 Cw3 포지티브 표적의 EB6 포지티브 또는 GL183 포지티브 NK 클론에 의해 용해를 재구성하는 그들의 능력에 대해 더욱 스크리닝하였다.
세포 염색법을 다음과 같이 수행하였다. 세포를 항체의 패널 (1μg/ml 또는 50111 상청액, 4°C에서 30mns)로 염색하였고 이어서 PE-접합된 염소 F (ab') 2 단편 항-마우스 IgG (H+L) 또는 PE-접합된 염소 F (ab') 2 단편 항-사람 IgG (Fc 감마) 항체 (Beckman Coulter)으로 염색하였다. 사이토플루오로메트릭 분석을 Epics XL. MCL 장비 (Beckman Coulter)에서 수행하였다.
단일클론 항체 중의 하나인, DF200 mAb는, KIR2DL1, KIR2DL2/3을 포함하는 KIR 패밀리의 다양한 멤버들과 반응하는 것으로 나타났다. KIR2DL1+와 KIR2DL2/3+ NK 세포 둘다를 DF200mAb (도 1)으로 밝게 염색하였다.
이들 HLA 클래스 I-특이적 저해 수용체의 하나 또는 또다른 (또는 둘다조차)것을 발현하는 NK 클론은 하나 이상의 HLA-C 대립유전자를 발현하는 표적 세포에 대해서 이펙터 세포로서 사용되었다. 세포독성 분석법을 다음과 같이 수행하였다. YTS-KIR2DL1 또는 YTS-Eco 세포주의 세포용해 활성을 표준 4 시간 51Cr 방출 분석법에 의해 평가하였다. 이펙터 세포를 HLA-Cw4 포지티브 또는 네거티브 EBV 세포주 및 HLA-Cw4 트랜스펙션된 721.221 세포에서 실험하였다. 모든 표적을 마이크로적정 플레이트에서 웰당 3000 세포에서 사용하였다. 이펙터/표적 비는 도면에 표시된다.
단일클론 마우스 또는 사람 항체의 표시된 전장 또는 F (ab') 2 단편으로 또는 그것없이 세포용해 분석법을 수행하였다. 예상한 바와 같이, HLA-Cw4 및 KIR2DL3+ NK 클론을 발현하는 표적 세포에 대해서 어떠한 세포용해 활성도 Cw3 포지티브 표적에 대해 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다면, KIR2DL1+ NK 클론 은 거의 나타나지 않았다. 그러나, DF200mAb (그들의 KIR2DL 수용체를 마스크 하기 위해 사용됨)의 존재하에서 NK 클론은 그들의 HLA-C 리간드를 인지할 수 없게 되었고 Cw3 또는 Cw4 표적에 대해 강한 세포용해 활성을 나타냈다.
예를 들어, C1R 세포주 (CW4+ EBV 세포주, ATCC n°CRL 1993)는 KIR2DL1+ NK 클론 (CN5/CN505)에 의해 죽지 않았지만, 저해는 DF200 또는 종래의 항 KIR2DL1 mAb 중 어느 하나를 사용함으로써 효과적으로 역전될 수 있었다. 다른 한편으로는 KIR2DL2/3+ KIR2DL1-표현형 (CN12)을 발현하는 NK 클론은 효과적으로 C1R 세포를 죽였고 이러한 사멸은 DF200mAb (도 2)에 의해 영향받지 않았다. Cw3 포지티브 표적에 대해서 KIR2DL2- 또는 KIR2DL3-포지티브 NK 클론으로 유사한 결과가 얻어진다.
유사하게, Cw4+ 221 EBV 세포주는 KIR2DL1+트랜스펙션된 NK 세포에 의해 죽은건 아니었지만, 저해는 DF200, DF200 Fab 단편, 또는 종래의 항 KIR2DL1 mAb EB6 또는 XA141 중의 하나를 사용함으로써 효과적으로 역전될 수 있었다. 또한, Cw3+ 221 EBV 세포주는 KIR2DL2+ NK 세포에 의해 죽지는 않았지만, 이러한 저해는 DF200 또는 DF200 Fab 단편 중의 하나를 사용함으로써 역전될 수 있었다. 마지막으로, 후자의 Cw3+ 221 EBV 세포주는 KIR2DL3+ NK 세포에 의해 죽지 않았지만, 이러한 저해는 DF200 Fab 단편 또는 종래의 항 KIR2DL3 mAb GL183 또는 Y249 중 하나를 사용함으로써 역전될 수 있었다. 결과는 도 3에 나타낸다.
F (ab') 2 단편은 또한 Cw4 포지티브 표적의 용해를 재구성하는 그들의 능력 에 대해 실험하였다. DF200 및 EB6 Abs의 F (ab') 2 단편은 둘다 Cw4 트랜스펙션된 221 세포주 및 Cw4+ TUBO EBV 세포주의 KIR2DL1-트랜스펙션된 NK 세포에 의해 용해의 저해를 역전할 수 있었다. 결과는 도 4에 나타낸다.
실시예 4
새로운 사람 mAbs 의 발생
사람 단일클론 항-KIR Abs는 재조합 KIR 단백질로 사람 항체 레퍼토리를 발현하도록 엔지니어링된 유전자도입 마우스를 면역화함으로써 발생되었다. 다른 세포 융합 후에, mAbs는 먼저 고정화 KIR2DL1 및 KIR2DL2 단백질과 교차-반응하는 그들의 능력에 대해 선택되었다. 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 및 1-6F1을 포함하는 몇개의 단일클론 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과 반응하는 것으로 밝혀졌다.
포지티브 단일클론 항체는 Cw4-포지티브 표적 세포의 KIR2DL1를 발현하는 EB6 포지티브 NK 트랜스텍턴트에 의한 용해를 재구성하는 그들의 능력에 대해 더욱 스크리닝되었다. HLA 클래스 I-특이적 저해 수용체를 발현하는 NK 세포는 하나 이상의 HLA-C 대립유전자 (도 5 및 6)를 발현하는 표적 세포에 대해서 이펙터 세포로서 사용되었다. 세포독성 분석법은 상기와 같이 수행되었다. 이펙터/표적 비는 도면에 나타나있고, 항체는 lOug/ml 또는 30 ug/ml에서 사용되었다.
예상한 바와 같이, 만일 어떠한 HLA-Cw4를 발현하는 표적 세포에 대해서 어떠한 세포용해 활성이 있다면 KIR2DL1+ NK 세포는 거의 나타나지 않는다. 그러나, 1-7F9 mAb의 존재하에서, NK 세포는 그들의 HLA-C 리간드를 인식할 수 없게 되었고 Cw4 표적에서 강한 세포용해 활성을 나타냈다. 예를 들어, 시험된 두개의 세포주(HLA-Cw4 트랜스펙션된 721.221 및 CW4+ EBV 세포주)는 KIR2DL1+ NK 세포에 의해 죽지는 않았지만, 저해는 Mab 1-7F9 또는 종래의 항 KIR2DL1 mAb EB6 중의 하나의 사용에 의해 효과적으로 역전될 수 있었다. Abs DF200 및 panKIR (또한 NKVSF1이라고 부름)은 1-7F9와 비교되었다. 항체 1-4F1, 1-6F5 및 1-6F1은 다른 한편으로 Cw4 포지티브 표적에서 NK 세포에 의한 세포 용해를 재구성할 수 없었다.
실시예 5
DF200 mAb / KIR2DLl 및 DF200 mAb / KIR2DL3 상호작용의 Biacore 분석
재조합 단백질의 생산 및 정제
KIR2DL1 및 KIR2DL3 재조합 단백질은 E. coli에서 생산되었다. KIR2DL1 및 KIR2DL3의 전체 세포외 도메인을 인코딩하는 cDNA 인코딩은 하기 프라이머를 사용하여, 각각 pCDM8 클론 47.11 벡터 (Biassoni 등, 1993) 및 RSVS (gpt) 183 클론 6 벡터 (Wagtman 등, 1995)로부터의 PCR에 의해 증폭되었다:
센스: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3'
안티-센스: 5'-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3'
그들은 바이오티닐화 신호를 인코딩하는 서열을 갖는 프레임에서 pMLl 발현 벡터안으로 클로닝된다 (Saulquin 등, 2003).
BL21 (DE3) 균주 (Invitrogen)에서 단백질 발현을 수행하였다. 트랜스펙션 된 박테리아는 암피실린 (100 μg/ml)으로 보충된 배지에서 37°C에서 OD600=0. 6으로 성장하였고 발현은 1 mM IPTG으로 유도되었다.
단백질은 변성 조건 (8 M 유리아) 하에서 포함체로부터 회수되었다. 실온에서, 6 단계 투석 (각각, 4,3, 2,1 0.5 및 0 M 유리아)에서 유리아 농도를 감소시킴으로써, L-아르기닌 (400 mM, Sigma) 및 p-메르캅토에탄올 (1 mM)을 함유하는, 20 mM Tris, pH 7.8, NaCl 150 mM 완충제중에서 재조합 단백질의 리폴딩(Re폴딩)을 수행하였다. 0.5 및 0 M 유리아 투석 단계 동안에 환원되고 산화된 글루타티온 (각각, 5 mM 및 0.5 mM, Sigma)을 첨가하였다. 마지막으로, 단백질은 10 mM Tris, pH 7.5, NaCl 150 mM 완충제에 대해서 광범위하게 투석되었다. 가용성, 리폴딩 단백질은 농축되었고 그후 Superdex 200 사이즈- 배제 칼럼 (Pharmacia ; AKTA 시스템)에서 정제되었다.
Biacore 장비 (Biacore)에서 표면플라스몬 공명 측정을 수행하였다. 모든 Biacore 실험에서 0.05% 계면활성제 P20로 보충된 HBS 완충제는 작동 완충제 역할을 하였다.
단백질 부동화.
상기한 바와 같이 제조된 재조합 KIR2DL1 및 KIR2DL3 단백질은 센서 칩 CM5 (Biacore)에서 덱스트란 층에서 공유적으로 카르복실 기에 고정화되었다. 센서 칩 표면은 EDC/NHS (N-ethyl-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미데하이드로클로라이드 및 N-히드록시숙시니미드, Biacore)으로 활성화되었다.
커플링 완충제 (10 mM 아세테이트, pH 4.5) 중의 단백질이 주입되었다. 100 mM 에탄올아민 pH 8 (Biacore)을 사용하여 남아있는 활성화 기의 탈활성화를 수행하였다.
친화력 측정.
역학 측정을 위해서, 다양한 농도의 가용성 항체 (1 x 10-7 내지 4 x 10-10 M)를 고정화 샘플 위에 도포하였다. 20 μl/min 연속 유속에서 측정을 수행하였다. 각각의 싸이클에 대해서, 센서 칩의 표면은 10 mM NaOH pH 11의 5 μl 주사에 의해 재발생되었다. BIAlogue Kinetics Evaluation 프로그램(BIAevaluation 3.1, Biacore)를 데이타 분석에 사용하였다. 가용성 분석체 (다양한 농도에서 40μl)는 500 또는 540 반사도 유닛 (RU) 및, 각각 1000 또는 700 RU 의 KIR2DL1 및 KIR2DL3을 함유하는 덱스트란 층에서, HBS 완충제중의 20μl/min의 유속에서 주사되었다. 데이타는 6개 독립적 실험의 대표이다. 결과는 하기 표 1에 나와있다.
Figure 112006000071918-PCT00002
KD : 해리 상수.
실시예 6
생쥐 및 사람 항- KIR 항체의 Biacore 경쟁적인 결합분석
이전에 기술된 바와 같은 마우스 항-KIR 2D 항체 DF200, Pan2D, gll 83 및 EB6, 및 사람 항-KIR 2D 항체 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 및 1- 7F9를 가지고 고정화 KIR 2DL1 (900 RU), KIR 2DL3 (2000 RU) 및 KIR 2DS1 (1000 RU)에서 에피토프 맵핑 분석을 수행하였다 (Gauthier 등 1999, Saunal 및 van Regenmortel 1995).
모든 실험을 15 μg/ml에서 다른항체의 2분 주사와 함께 HBS 완충제 중에서 5 μl/min 의 유속에서 수행하였다. 항체의 각각의 커플에 대해서 두개의 단계로 경쟁적인 결합분석을 수행하였다. 제 1 단계에서 제 1 단일클론 항체 (mAb)는 KIR 2D 표적 단백질에서 주사되고 이어서 제 2 mAb (제 1 mAb을 제거하지 않고) 및 제 2 mAb RU 값 (RU2)을 모니터링하였다. 제 2 단계에서 누드 KIR 2D 단백질에서 직접, 제 2 mAb를 먼저 주사하고, mAb RU 값 (RU1)을 모니터하였다. 제 1 mab에 의해 KIR 2D 단백질에 대한 제 2 mAb 결합의 퍼센트 저해는 : 100* (1-RU2/RU1)에 의해 계산되었다.
결과는 표 2,3 및 4에 나타내고, 이때 '첫번째 항체'라고 표시된 항체가 수직 열에 열거되고 '두번째 항체'가 수평 열에 열거된다. 시험된 각각의 항체 조합에 대해서, 칩에 대해 항체의 직접적인 결합수준 (RU)에 대한 값은 표에 열거되고, 여기서 KIR2D 칩에 대한 두번째 항체의 직접적인 결합은 필드의 상위 부분에 열거되고 첫번째 항체가 존재할때 KIR2D 칩에 대한 두번째 항체의 결합에 대한 값 은 필드의 하부에 열거된다. 두번째 항체 결합의 백분율 저해가 각각의 필드의 오른쪽에 열거된다. 표 2는 KIR2DL1 칩에서 결합을 나타내고, 표 3은 KIR2DL3 칩에 대한 항체의 결합을 나타내고, 표 4는 KIR2DSl 칩에 대한 항체의 결합을 나타낸다.
고정화 KIR2DL1, KIR2DL2/3 및 KIR2DS1에 대한 생쥐 항체 DF200, NKVSF1 및 EB6 및 사람 항체 1-4F1, 1-7F9 및 1-6F1의 경쟁적인 결합을 평가하였다. KIR2DL1 에 대한 항-KIR 항체'의 결합으로 실험으로부터 에피토프 맵핑(도 7)는 (a) 항체 1-7F9은 EB6 및 1-4F1과 경쟁적이지만, NKVSF1 및 DF200와는 아니다; (b) 항체 1-4 Fl 는 반대로 EB6, DF200, NKVSF1 및 1-7 F9과 경쟁적이고 ; (c) NKVSF1는 DF200, 1-4F1 및 EB6과 경쟁하지만, 1-7F9과는 아니고; (d) DF200는 NKVSF1, 1-4F1 및 EB6과 경쟁하지만, 1-7F9과는 아니다는 것을 보여주었다. KIR2DL3에 대한 항-KIR 항체'결합으로의 실험으로부터 에피토프 맵핑(도 8)은 (a) 1-4F1 은 NKVSF1, DF200, gll83 및 1-7F9과 경쟁적이고 ; (b) 1-7F9는 DF200, gll83 및 1-4F1과 경쟁적이지만, NKVSF1과는 아니고 ; (c) NKVSF1는 DF200 , 1-4F1 및 GL183과 경쟁하지만, 1-7F9과는 아니고; (d) DF200는 NKVSF1, 1-4F1 및 1-7F9과 경쟁하지만, GL183과는 아니다라는 것을 보여주었다. KIR2DS1에 대한 항-KIR 항체'결합로의 실험으로부터 에피토프 맵핑(도 9)은 (a) 1-4F1이 NKVSF1, DF200 및 1-7F9과 경쟁적이고; (b) 1-7F9은 1-4F1 과 경쟁적이지만 DF200 및 NKVSF1과는 경쟁적이지 않고 ; (c) NKVSF1 DF200 및1-4F1과 경쟁하지만, 1-7F9과는 아니고; (d) DF200 는 NKVSF1 및 1-4F1과 경쟁하지만, 1-7F9과는 아니다.
실시예 7
사이노몰거스 NK 세포로 항- KIR mAb 적정
항-KIR 항체 NKVSF1는 사이노몰거스 원숭이로부터 NK 세포에 결합하는 그것의 능력에 대해 시험하였다. 원숭이 NK 세포에 대한 항체의 결합은 도 10에 나타낸다.
원숭이 PBMC 의 정제 및 다클론 NK 세포 벌크의 발생.
사이노몰거스 Macaque PBMC를 나트륨 시트레이트 CPT 튜브(Becton Dickinson)로부터 제조하였다. NK 세포 정제를 네거티브 고갈 (Macaque NK 세포 풍부 키트, Stem 세포 Technology)에 의해 수행하였다. 방사선조사된 사람 피더 세포, 300 U/ml 인터류킨 2 (Proleukin, Chiron Corporation) 및 lng/ml Phytohemagglutinin A (Invitrogen, Gibco)에서 NK 세포를 배양하여, 다클론성 NK 세포 집단을 얻었다.
사이노몰거스 NK 세포로 Pan2D mAb 적정.
사이노몰거스 NK 세포 (NK 벌크 16일)를 다른 양의 Pan2D mAb으로 배양하고 이어서 PE-접합된 염소 F (ab') 2 단편 항-마우스 IgG (H+L) 항체로 배양하였다. 포지티브 세포의 백분율은 이소타입 대조군 (정제된 마우스 IgGl)으로 결정하였다. 샘플을 복제하여 수행하였다. 평균 형광 강도 = MFI.
Figure 112006000071918-PCT00003
Figure 112006000071918-PCT00004
Figure 112006000071918-PCT00005
실시예 8
KIR2DL1 에 대한 DF200 -및 Pan2D-결합의 에피토프 -맵핑
KIR2DL1,-2 및 -3 (KIR2DL1-3)의 세포외 도메인의 컴퓨터 모델링은, 그들의 공개된 결정-구조 (Maenaka 등 (1999), Fan 등 (2001), Boyington 등 (2000))에 근거하여, KIR2DL1 과 KIR2DLl-3-교차-반응성 마우스 단일클론 항체 (mAb's) DF200 및 pan2D 사이의 상호작용에서 아미노산 R1311의 수반을 예측하였다. 이것을 입증하기 위해, KIR2DL1 (아미노산 H1-H224)의 완전한 세포외 도메인, 사람 Fc (hFc)에 융합된, 야생형 또는 포인트-돌연변이된 (예를 들어 R131W2)중의 하나로 구성되는, 융합-단백질을 제조하였다. 다양한 KIR2DL1-hFc 융합-단백질을 생산하고 평가하기 위해 사용된 재료와 방법은 기술되었다(Winter 및 Long (2000)). CL42-Ig의 PCR-기반 돌연변이유발 (Quickchange II, Promega), 요컨대, 야생형 KIR2DLl-hFc의 제조를 위한 공개된 cDNA-벡터 (Wagtmann 등 (1995))에 의해, KIR2DLl (R131W)-hFc 인코딩 cDNA-벡터가 발생되었다. KIR2DLl-hFc 및 KIR2DLl (R131W)-hFc은 본질적으로 기술된 바와 같이(Wagtmann 등 (1995)), COS7 세포에서 제조되었고 조직-배양 배지로부터 분리되었다. 그들의 정확한 폴딩을 테스트하기 위해, KIR2DLl-hFc 및 KIR2DLl (R131W)-hFc을 LCL721으로 배양하였다. HLA- Cw3 (KIR2DL1 리간드 없음) 또는 HLA-Cw4 (KIR2DL1 리간드) 중의 하나를 발현하는221 세포 및 KIR-Fc 융합 단백질과 세포 사이의 상호작용은 FACS, 세포-표면에서 단백질-상호작용의 연구를 위한 표준 기술에 의해 분석되었다. 독립적 실험의 예는 도 11, 판넬 A에 주어진다. 문헌에서 예측된 바와 같이, KIR2DLl-hFc 융합 단백질 결합된 HLA-Cw3의 어떤 것도 LCL721.221 세포를 발현하지 않는다. 대조적으로, KIR2DLl-hFc와 KIR2DLl (R131W)-hFc 둘다 LCL721.221 세포를 발현하는 HLA-Cw4에 결합하고, 그로인해 그들의 정확한 폴딩을 확인한다.
KIR2DLl (R131W)-hFc와 KIR2DLl-hFc의 KIR-특이적 mAb's (DF200, pan2D, EB6 및 GL183)에 대한 결합은 ELISA, 단백질-상호작용을 연구하기 위한 표준 기술을 사용하여 연구되었다. 요컨대, KIR2DLl (R131W)-hFc 및 KIR2DLl-hFc은 염소 항-사람 항체를 통해, 96-웰 플레이트에 연결되었고, 그후에 KIR-특이적 mAb's을 다양한 농도 (PBS중의 0-1μg/ml)로 첨가하였다. KIR2DLl-hFc 변형체와 mAb's 사이의 상호작용은 마우스 항체에 대해 특이적인 퍼옥시다아제-커플링된 두번째 항체를 사용하여, 분광광도법 (450nm)에 의해 시각화되어, TMB 기질을 변환하였다. 독립적 실험의 예는 도 11, 판넬 B에 주어진다. 반면에 KIR2DL2-3-특이적 mAb GL183는 KIR2DLl-hFc 융합 단백질중 어떤것에도 결합할 수 없었고, 복용량-의존성 형태로 KIR2DL1-특이적 mAb EB6, DF200 및 pan2D는 KIR2DLl-hFc 변형체에 결합하였다. 단일점-돌연변이 (R131W)는 가장높은 농도의 mAb (1μg/ml)에서 ~10%의 야생형과 비교할때 결합의 감소를 갖는 DF200와 pan2D의 결합에 영향을 주었고, R131가 KIR2DL1의 세포외 도메인 2에서 DF200와 pan2D 의 결합-부위의 일부분이라는 것을 확증한다.
주석: 1 한글자 아미노산 코드
2 KIR2DL1에서 아미노산 위치 131(N-종말)에서 W 대신 R로 치환
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본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용된 최대 범위까지 본원에 제시된 관점 또는 청구항에서 인용된 주제 물질의 모든 변형 및 등가물을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR REGULATING NK CELL ACTIVITY <130> 6803.204-WO <140> PCT/DK2004/000470 <141> 2004-07-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30 Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys Arg 130 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 8 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 140 <212> PRT <213> mus musculus <400> 9 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Thr Pro Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asn Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Arg Pro Gly Asn Tyr Pro Tyr Gly Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 10 Gly Phe Ser Phe Thr Pro Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> mus musculus <400> 11 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> mus musculus <400> 12 Asn Pro Arg Pro Gly Asn Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10

Claims (19)

  1. 다중 KIR2DL 유전자 생성물과 교차-반응하고 그러한 KIR의 저해 활성을 중화하는 항체의 제조 방법으로서,
    (a)사람이 아닌 포유동물을 KIR2DL 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로 면역화하는 단계;
    (b)상기 면역화 포유동물로부터, 상기 KIR2DL 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제조하는 단계,
    (c) 적어도 두개의 다른 KIR2DL 유전자 생성물과 교차-반응하는 (b)의 항체를 선택하는 단계,
    (d) NK 세포를 증강하는 (c)의 항체를 선택하는 단계
    (e) 영장류 NK 세포 또는 KIR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (e)에서의 영장류는 사이노몰거스 원숭이인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 방법에 따라 제조된 항체를 영장류에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 항체의 독성의 평가 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 영장류는 사이노몰거스 원숭이인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 도 12에 설명된 바와 같은 DF-200의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.
  6. 도 12에 설명된 바와 같은 Pan2D의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.
  7. 도 12에 설명된 바와 같은 DF-200의 경쇄 가변 영역 CDR중 하나 이상을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.
  8. 도 12에 설명된 바와 같은 Pan2D의 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.
  9. 도 13에 설명된 바와 같은 DF-200의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.
  10. 도 13에 설명된 바와 같은 DF-200의 중쇄 가변 영역 CDR중 하나 이상을 포함하는 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체.
  11. 아미노산 잔기 (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192)에 의해 한정된 영역 내에서 KIR2DL1에 배타적으로 결합하는 항체.
  12. 잔기 (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, 192)에 의해 한정된 영역 바깥에서 아미노산 잔기와 상호작용하지 않고 KIR2DL1 및 KIR 2DL2/3에 결합하는 항체.
  13. KIR2DL1에 결합하고 R131가 Ala인 KIR2DL1의 돌연변이체에는 결합하지 않는 항체.
  14. KIR2DL1에 결합하고 R157이 Ala인 KIR2DL1의 돌연변이체에는 결합하지 않는 항체.
  15. KIR2DL1에 결합하고 R158이 Ala인 KIR2DL1의 돌연변이체에는 결합하지 않는 항체.
  16. KIR2DL1 잔기 (131,157, 158)에 결합하는 항체.
  17. KIR2DS3 (R131W)에는 결합하지만, 야생형 KIR2DS3에는 결합하지 않는 항체.
  18. KIR2DS4는 물론이고, KIR2DL1와 KIR2DL2/3 둘다에 결합하는 항체.
  19. KIR2DL1와 KIR2DL2/3 둘다에는 결합하지만, KIR2DS4에는 결합하지 않는 항체.
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