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WO2018186706A1 - Nk 세포 활성화 융합 단백질, nk 세포 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Nk 세포 활성화 융합 단백질, nk 세포 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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WO2018186706A1
WO2018186706A1 PCT/KR2018/004043 KR2018004043W WO2018186706A1 WO 2018186706 A1 WO2018186706 A1 WO 2018186706A1 KR 2018004043 W KR2018004043 W KR 2018004043W WO 2018186706 A1 WO2018186706 A1 WO 2018186706A1
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WO
WIPO (PCT)
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natural killer
cancer
fusion polypeptide
cxcl16
cell
Prior art date
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Application number
PCT/KR2018/004043
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English (en)
French (fr)
Inventor
김석호
이재민
조덕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to AU2018248672A priority patent/AU2018248672B2/en
Priority to CN201880025476.7A priority patent/CN110573529A/zh
Priority to EP18781754.9A priority patent/EP3594242A4/en
Priority to IL269801A priority patent/IL269801B2/en
Priority to RU2019135054A priority patent/RU2740438C1/ru
Priority to BR112019020909-3A priority patent/BR112019020909A2/pt
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Priority to MX2019011958A priority patent/MX2019011958A/es
Priority to US16/500,051 priority patent/US11655306B2/en
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    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
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    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Definitions

  • the present invention relates to a novel anti-cancer immune cell treatment using fusion proteins and natural killer cells for increasing cancer inflow of natural killer cells and maximizing antibody dependent cytotoxicity (ADCC).
  • ADCC antibody dependent cytotoxicity
  • the present invention also relates to methods of treating cancer with the fusion protein and various uses of the fusion protein.
  • Natural killer cells perform the function of removing host cells infected with tumor cells, bacteria, intracellular parasites or viruses without prior sensitization by antigen, rejecting inappropriate bone marrow transplantation, and T cells It acts on the first line of immune system defense mechanism in vivo, such as regulating immune response.
  • the immunological function of spontaneous killer cells is governed by the balance of the stimulatory signal that causes its killing function and the inhibitory signal that inhibits the killing function. Specifically, natural killer cells that receive strong activation signals attack and remove target cells, and natural killer cells that receive strong inactivation signals save target cells.
  • ADCC antibody-dependent cell cytoxicity
  • natural killing Natural Killing
  • Both ADCC and spontaneous killing require the activation of protein tyrosine kinase (PTK) and have in common that they are blocked by inactivation signals transmitted by inactivating receptors of spontaneous killer cells. Since the killing function of NK cells depends on the balance of activation and inactivation signals, natural killer cells can distinguish and remove normal host cells from infected or tumorized cells.
  • PTK protein tyrosine kinase
  • Natural killer cells can be classified according to the expression level of CD56, and CD56 dim natural killer cells are distributed over 90% in peripheral blood natural killer cells.
  • CD56 dim is known to have higher cytotoxicity than other CD56-expressing natural killer cells. It is known.
  • CD56 bright killer cells are known to have fewer numbers and lower cytotoxicity than CD56 dim killer cells.
  • CD56 bright natural killer cells have been reported not only to have high immunomodulatory function (IFN-gamma, TNF-alpha, etc.) but also to have high ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) function ( The Journal of Immunology, 2011, 186: 6753-6761). ).
  • CD56 bright natural killer cells are expected to have a synergistic effect in the combined treatment of antibodies and cancer.
  • tumors can express unique proteins associated with their malignant phenotype or overexpress certain proteins in greater numbers than normal cells.
  • Expression of unique proteins on the surface of tumor cells provides an opportunity to diagnose and characterize the disease by probing the phenotypic identity and biochemical composition and activity of the tumor or to target tumor-associated antigens and new treatments for the tumor. Have them develop a method.
  • Antibodies that exhibit an antigen-antibody response specific for the tumor-associated antigens induce cancer cells by inducing various biological immune responses (antibody-dependent cellular cytotoxic activity (ADCC), complement-dependent cytotoxic activity (CDC), etc.). Since it is known to induce cell death by attack, antibodies and the like which are useful for the treatment of tumors have been developed, but research and development for enhancing the therapeutic efficacy thereof are insufficient.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxic activity
  • CDC complement-dependent cytotoxic activity
  • the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds a tumor associated antigen
  • fusion polypeptides comprising natural killer cell inducing proteins of CXCL16.
  • the invention also provides a nucleic acid encoding the fusion polypeptide, a vector comprising the same or a host cell comprising the vector.
  • the invention also relates to an antibody or fragment thereof that binds to a tumor associated antigen
  • compositions for preventing or treating cancer including a fusion polypeptide comprising a natural killer cell-derived protein of CXCL16.
  • the invention also relates to an antibody or fragment thereof that binds to a tumor associated antigen
  • a fusion polypeptide comprising natural killer cell-derived protein of CXCL16, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including natural killer cells (Natural killer cells, NK cells).
  • the invention also provides a composition comprising said fusion polypeptide for use in the treatment of cancer.
  • the invention also provides the use of said fusion polypeptide in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the invention also provides the use of said fusion polypeptide for the treatment of cancer.
  • the invention also provides a method of treating cancer by administering to a patient a pharmaceutically effective amount of a composition comprising said fusion polypeptide.
  • CXCR3 and CXCR6 are present on the surface of natural killer cells among receptors of active inducers expressed on natural killer cells. Confirmed that the overexpression of CXCL16 among its ligands is effective for the migration of natural killer cells, and then fusion proteins of CXCL16 and tumor-associated antigen-specific antibodies prepared by natural killer cell-induced cells and administered to them.
  • the present invention was completed by remarkably enhancing the induction into cancer and having a remarkable effect on the treatment of cancer.
  • tumor-associated antigen refers to an antigen that is specifically expressed on tumor cells that are not expressed in normal cells or overexpressed only in tumor cells as compared to normal cells, preferably on the surface of tumor cells. Refers to antigenic substances produced in cells.
  • Tumor-associated antigens that are specifically expressed in tumors include, but are not limited to, for example, 4-1BB (CD137), 5T4, AGS-5, AGS-16, Angiopoietin 2, CD19 (Cluster of Differentiation 19), B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, Carcinoembryonic Antigen, CTLA4, Crypto, ED- B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, Fibronectin, Folic Acid Receptor, Ganglioside GM3, GD2, Glucocorticoid-induced Tumor Necrosis Factor Receptor (GITR) gplOO, gpA33, GPNMB, ICOS, IGFIR, integrin ⁇ , integrin ⁇ , KIR, LAG-3, Lewis
  • antibody includes whole antibodies, antibody fragments possessing antigen recognition and binding capacity, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and antibody analogs.
  • the antibody may be IgM, IgG (eg IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4), IgD, IgA, or IgE.
  • antibody fragment refers to a molecule comprising a portion of an intact antibody, generally the antigen binding or variable region of the intact antibody.
  • antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2, and Fv fragments; Single domain antibodies.
  • Said “antibody or fragment thereof” may specifically or preferably bind to tumor cells, preferably tumor associated antigens that are specifically expressed in tumors as compared to non-tumor cells or normal cells.
  • the binding between two binding partners eg, specifically binding
  • "preferably binds" eg, an antibody and an antigen that is a binding partner thereof
  • single-chain Fv or “single-chain variable fragment” refers to an antibody in which the variable domains of the heavy and light chains of a conventional two-chain antibody combine to form one chain.
  • linker peptides are inserted between the two chains to allow for the creation of suitable folding and active binding sites.
  • the term “antibody that binds an antigen” refers to an antibody useful as a therapeutic agent in which the antibody targets the antigen by binding to the antigen with sufficient affinity.
  • linker refers to a peptide that connects a first molecule (eg, an antibody or fragment thereof to a tumor-associated antigen) to a second molecule (a natural killer cell-derived protein of CXCL16) through chemical bonding or the like. it means.
  • cancer refers to a pathological condition in humans characterized by unregulated cell proliferation. But not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, and leukemia. More specific examples of cancers include, but are not limited to: lung cancer (small cell and non-small cell), breast cancer, prostate cancer, carcinoma, bladder cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer (hepatocellular), hepatoblastoma, colon cancer, squamous head squamous cancer Cell carcinoma, esophageal cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, mesothelioma, melanoma, sarcoma, osteosarcoma, liposarcoma, thyroid cancer, driftoma, acute myeloid leukemia (AML), and chronic myeloid leukemia ( CML).
  • lung cancer small cell and non-small cell
  • breast cancer breast cancer
  • prostate cancer carcinoma
  • bladder cancer gastric cancer
  • pancreatic cancer liver cancer (hepatocellular)
  • expression vector includes a nucleotide sequence encoding a molecule of interest that is operably linked to a promoter.
  • polypeptide As used herein, "polypeptide”, “peptide” and “protein” are used interchangeably and include references to polymers of amino acid residues. The terms apply to natural amino acid polymers as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues are artificial chemical analogs of the corresponding natural amino acid. The terms also apply to those polymers containing conservative amino acid substitutions so that the protein remains functional.
  • host cell means a cell capable of supporting the replication or expression of the expression vector.
  • the host cell can be a prokaryotic cell, for example Escherichia coli, or a eukaryotic cell, for example a yeast, insect, amphibian or mammalian cell.
  • inhibiting with respect to tumor or cancer growth or progression may be used to determine the growth, spread, or metastasis of a patient's tumor or cancer to an amount measurable using any method known in the art. Refers to inhibiting.
  • the growth, progression or spread of a tumor or cancer is about 10% relative to the tumor size prior to co-administration of the natural killer cells, eg, with fusion polypeptides of the invention and immune cell therapeutics, or prior to administration of the fusion polypeptide. If it decreases by more than 20%, 30%, 50%, 80% or 100%, it is suppressed, reduced or reduced.
  • the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds a tumor associated antigen; Linker; And it provides a fusion polypeptide comprising a natural killer cell-derived protein of CXCL16.
  • the fusion polypeptide according to the present invention may specifically bind to the cell surface of a tumor, including an antibody or a fragment thereof, which binds to a tumor-associated antigen, and binds CXCL16, a natural killer cell-derived protein that is cleaved and released after antigen-antibody binding. Through natural killer cells can be induced to the desired tumor cells.
  • Tumor target surface antigens include antibodies or fragments thereof that specifically bind to tumor associated antigens.
  • Tumor target surface antigens are well known in the art and include, for example, mesothelin, PD-L1, Her2, CD19, MUC1, EGFR, VEGFR, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, 4-1BB, 5T4 , AGS-5 or AGS-16, but is not limited thereto.
  • Antibodies or fragments thereof that specifically bind to the tumor associated antigen include single chain Fv (scFv), Fab, Fab ', F (ab') 2, disulfide stabilized antibodies, and the like, and specifically, single chain Fv ( scFv).
  • Preparation of the antibody or fragment thereof that specifically binds to the tumor associated antigen may be prepared according to known production methods in the art.
  • said antibody is a single chain Fv (scFv).
  • the V H and V L regions of the scFv antibody include single chains that are folded to produce antigen binding sites similar to those found in double chain antibodies. Once folded, non-covalent interactions stabilize the single chain antibody.
  • the scFv is produced by recombination.
  • Conservative variants of the antibodies of the invention can be prepared conventionally, and conservative variants used in scFv fragments will retain important amino acid residues necessary for accurate folding and stabilization between the V H and V L regions.
  • scFv has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as the scFV of mesothelin, specifically, may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • scFV is a scFV of PD-L1, the heavy chain (V H ) encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4; And a light chain (V L ) encoded by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, specifically, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, wherein the tumor-associated antigen PD-L1 is a base represented by SEQ ID NO: 7 It may be encoded by the sequence, but is not limited thereto.
  • scFV is a scFV of Her2 is a heavy chain encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, specifically the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9; It may include a light chain encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, wherein the tumor-associated antigen Her2 is to be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 May be, but is not limited thereto.
  • scFV is a scFV of CD19 heavy chain encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29; And a light chain encoded by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, specifically, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31, but is not limited thereto.
  • scFV is a scFV of MUC-1 is a heavy chain encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, specifically the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33; And a light chain encoded by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, specifically, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, but is not limited thereto.
  • scFV is a scFV of EGFR is a heavy chain encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 37; And a light chain encoded by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, specifically, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39, but is not limited thereto.
  • scFV is a scFV of VEGFR is a heavy chain encoded by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41; And a light chain encoded by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, specifically, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43, but is not limited thereto.
  • the scFv antibody may be directly bound to the peptide linker through the light chain and may be bound through the Fc region to which the scFv is bound.
  • the Fc may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, specifically, may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto.
  • the linker according to the present invention will not have any biological activity other than to bind the regions with a peptide linker or to preserve some minimum distance or other spatial relationship between them, but the constituent amino acids may not have any properties, e.g. It may be chosen to affect folding, net charge, or hydrophobicity.
  • the linker may comprise a cleavage sequence such that CXCL16 is isolated after the antibody binds to a tumor associated antigen.
  • Antibodies or fragments thereof that specifically bind to a tumor associated antigen may be up to 50 amino acids, typically up to 40 amino acids, preferably up to 30 amino acids, and more preferably up to 20 amino acids in length, even more preferred. May be linked via a peptide linker having 1 to 10 amino acids in length.
  • the peptide linker may comprise a sequence that is cleaved by any protease, and specifically, may be a peptide linker that includes consecutive amino acid residues of RVKR that are cleaved by purine, but is not limited thereto.
  • the fusion polypeptide according to the invention induces natural killer cells, including a purine cleavage site which is cleaved by the purine, ie, a purine cleavage site comprising a continuous amino acid residue which can be cleaved by the purine. Allow proteins to be released from cancer cells.
  • the purine cleavage site can be any polypeptide site cleavable by purine. As reported by Duckert et al. (Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection 17 (1): 107-112 (2004), the entire contents of which are incorporated herein by reference). Purine is an enzyme of the "evolutionary conserved dibasic- and monobasic-specific CA 2+ -dependent serine protease family" called substilisin / myxin-like proprotein convertase.
  • Purine cleavage site sequences known in the literature and the like are included herein, and specifically, may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, but is not limited thereto.
  • the antibody or fragment thereof that binds the tumor associated antigen may be bound to the purine cleavage sequence via a purine cleavage site amino terminus and may directly bind to the heavy, light, Fc (constant region) or framework regions of the antibody. have.
  • the fusion protein of the present invention may induce spontaneous killer cells into tumor cells having antibodies associated with tumor-associated antigens, including the killer cell-derived proteins of CXCL16.
  • Natural killer cell-derived protein refers to a protein that induces natural killer cell influx into tumor cells, that is, a protein that can migrate natural killer cells to cancer cells with chemokine (chemokine).
  • the CXCL16 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • CXCL16 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the natural killer cell-derived protein may be linked to an antibody or fragment thereof through a peptide linker.
  • the linker according to the present invention will not have any biological activity other than to bind the regions with a peptide linker or to preserve some minimum distance or other spatial relationship between them, but the constituent amino acids may not have any properties, e.g. It may be chosen to affect folding, net charge, or hydrophobicity.
  • the linker may also comprise a cleavage sequence by a cleavage sequence, such as any protease, such that CXCL16 is isolated after the antibody binds to a tumor associated antigen.
  • the peptide linker comprises a purine cleavage site which is cleaved by purine, ie a purine cleavage site comprising a contiguous amino acid residue which can be cleaved by purine.
  • Fusion polypeptides according to the present invention may be prepared via non-recombinant or recombinant methods known in the art, and preferably may be prepared via recombinant methods.
  • an antibody or fragment thereof that binds the tumor associated antigen; Linker; And expression vectors can be prepared by inserting into the vector a cDNA encoding the CNKCL16 natural killer cell-derived protein.
  • a base sequence comprising mesothelin scFv and Fc is inserted into a vector, specifically a pcDNA3.1 vector, and the base sequence encoding the purine cleavage site and natural killer cell-derived protein is immunoglobulin (
  • An expression vector is prepared by inserting it after the immunoglobulin sequence. Examples of the prepared expression vector is as described in Figure 2 below.
  • the prepared expression vector can be expressed in bacteria, plants, yeasts, insects and mammalian cells.
  • fusion polypeptides may be employed using a number of expression systems that can be used for protein expression, including Escherichia coli, other bacterial hosts, yeasts and various higher eukaryotic cells such as COS, CHO, HeLa and myeloma cell lines. It can manufacture.
  • the expression vector may be transfected into CHO cells from which purine has been removed to prepare a fusion polypeptide.
  • the fusion polypeptides prepared can be purified according to standard procedures in the art, including ammonium sulfate precipitation, affinity columns, column chromatography, and the like, to provide the desired fusion polypeptides.
  • the present invention provides nucleic acids encoding fusion polypeptides.
  • the present invention provides an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding the fusion polypeptide.
  • an expression vector having the structure shown in FIG. 2 may be provided, and may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
  • the present invention provides a host cell comprising the expression vector.
  • the cells may be any one selected from COS, CHO, HeLa, and myeloma cell lines, but are not limited thereto.
  • the present invention provides an antibody or fragment thereof that binds a tumor associated antigen
  • Linker provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a fusion polypeptide comprising a natural killer cell-derived protein of CXCL16.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention is an immune cell therapy, specifically, has a remarkable effect on cancer prevention or treatment through induction of natural killer cells into cancer.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention includes not only a direct therapeutic effect but also an action as an anticancer adjuvant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is effective for preventing or treating cancer.
  • the invention also relates to an antibody or fragment thereof that binds to a tumor associated antigen; Linker; And a fusion polypeptide comprising a natural killer cell inducing protein of CXCL16, and a natural killer cell.
  • the natural killer cell and the fusion polypeptide which are immune cell therapeutic agents, have a significant effect on preventing or treating cancer by greatly enhancing the influx of natural killer cells into cancer upon co-administration.
  • compositions for use in the present invention may be formulated by standard techniques using one or more physiologically acceptable carriers or excipients.
  • suitable pharmaceutical carriers are disclosed in the present invention and in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005).
  • the fusion polypeptides and / or killer cells of the invention may be formulated for administration by any suitable route, for example by inhalation, topically, nasal, oral, parenteral or rectal.
  • administration of the above-mentioned pharmaceutical compositions may be administered intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intranasal, by inhalation, in the cerebral, intratracheal, intraarterial, intraperitoneal, in the bladder, in the pleura, in the coronary artery, subcutaneously or By intratumoral injection, it can be done using a syringe or other device.
  • Transdermal administration is also contemplated as inhalation or aerosol administration. Tablets and capsules can be administered orally, rectally or vaginally.
  • the pharmaceutical composition will typically comprise a fusion polypeptide, or a fusion polypeptide and natural killer cells, dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. Fusion polypeptides and natural killer cells may be provided together or separately.
  • a pharmaceutically acceptable carrier preferably an aqueous carrier.
  • Fusion polypeptides and natural killer cells may be provided together or separately.
  • Various aqueous carriers can be used, such as buffered saline and the like. These solutions are bactericidal and are generally free of undesirable substances.
  • These compositions can be sterilized by conventional, well known sterilization techniques.
  • the compositions may be used as pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approach physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, toxicity modifiers and the like, for example sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate and the like. It may contain.
  • concentration of fusion polypeptides in these formulations can vary widely and will be selected based primarily on
  • compositions of the present invention are suitable for parenteral administration, including intravenous or intracavitary administration.
  • the fusion polypeptides and / or killer cells of the invention can be formulated for parenteral administration by injection, eg, by bolus injection or continuous infusion.
  • Injectable formulations may be present in unit dosage form, eg, in ampoules or in multiple-dose containers, with a preservative added.
  • Injectable compositions are preferably aqueous isotonic solutions or suspensions, and suppositories are preferably prepared from fatty emulsions or suspensions.
  • the composition may be sterilized and / or the composition may contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifiers, dissolution accelerators, osmotic pressure regulating salts and / or buffers.
  • the active ingredient may be present in powder form, which is constituted by water without a suitable vehicle, eg, sterile pyrogen, before use.
  • the active ingredient may also contain other therapeutically valuable substances.
  • the compositions are prepared according to each conventional mixing, granulation or coating method, which contains about 0.1 to 75%, preferably about 1 to 50% of the active ingredient.
  • the pharmaceutical compositions or medicaments may be in the form of tablets or capsules, eg prepared by conventional means, together with pharmaceutically acceptable excipients.
  • the active ingredient i.e. the composition of the present invention, may be prepared by (a) diluents or fillers, for example lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose (e.g.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and / or hydroxypropyl methylcellulose;
  • disintegrants for example starch (eg potato starch or sodium starch), glycolate, agar, alginic acid or its sodium salt, or effervescent mixtures; Preference is given to tablets and gelatin capsules comprising (e) wetting agents such as sodium lauryl sulfate and
  • the present invention administers a pharmaceutical composition to a patient in a therapeutically effective dose for preventing, treating or inhibiting a disease such as cancer or a malignant condition thereof.
  • the pharmaceutical composition is administered to the patient in an amount sufficient to elicit an effective therapeutic or diagnostic response in the patient.
  • An effective therapeutic or diagnostic response is one that at least partially arrests or slows down the symptoms or complications of the disease or malignant condition.
  • a suitable amount to accomplish this is defined as a "therapeutically effective amount.”
  • the dosage of the fusion polypeptide and / or natural killer cells to be administered depends on the species, weight, age, individual condition of the mammal, the surface area of the area to be treated and the dosage form.
  • the size of the dose will also be determined by the presence, nature and extent of any side effects that accompany the administration of the particular compound in the particular patient.
  • a unit dosage for administration to a mammal, preferably a human, of about 50 to 80 kg may contain an amount of about 1 mg / kg to 5 mg / kg for the fusion polypeptide and about 1 x for natural killer cells. It may contain an amount of 10 5 cells / kg to 2 x 10 7 cells / kg.
  • the dosage of the composition of the invention is a dosage sufficient to achieve the desired effect.
  • Optimal dosing schedules can be calculated from measurements of fusion polypeptides and / or killer cells, accumulation in the patient's body. It may be given more than once a day, week, month or yearly. Those skilled in the art can readily determine the optimum dosage, method of administration and repetition rate. Those skilled in the art will be able to determine optimal administration for administration of fusion polypeptides and / or killer cells to humans according to established protocols known in the art and disclosed herein.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age and gender, and therefore the dosage should be determined in some respects. It does not limit the scope of the present invention.
  • the invention also provides a composition comprising said fusion polypeptide for use in the treatment of cancer.
  • the invention also provides the use of said fusion polypeptide in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the invention also provides the use of said fusion polypeptide for the treatment of cancer.
  • the invention also provides a method of treating cancer by administering to a patient a pharmaceutically effective amount of a composition comprising said fusion polypeptide.
  • the method of treating cancer may be administered with natural killer cells, thereby exhibiting an elevated therapeutic effect.
  • Fusion proteins for preventing or treating cancer of the present invention include antibodies or fragments thereof that bind to tumor associated antigens; Linker; And a fusion polypeptide comprising a natural killer cell-derived protein of CXCL16, thereby significantly enhancing the influx of natural killer cells into cancers expressing specific antigens when co-administered with natural killer cells, which are immunocytotherapeutic agents. Significant effect on treatment.
  • Figure 1 shows the results confirmed the degree of migration of Expanded natural killer cells according to chemokine type.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of an expression vector for producing a fusion polypeptide according to the present invention.
  • Figure 3 shows the result of confirming that the fusion polypeptide prepared according to the invention recognizes and binds mesothelin present on the surface of the pancreatic cancer cell line by the mesothelin recognition site.
  • FIG. 4 shows the results of confirming that the fusion polypeptide prepared according to the present invention recognizes and binds PD-L1 present on the surface of the pancreatic cancer cell line by the PD-L1 recognition site.
  • FIG. 5 shows the results of confirming that the fusion polypeptide prepared according to the present invention recognizes and binds Her2 present on the surface of the pancreatic cancer cell line by Her2 recognition site.
  • Figure 6 is a diagram showing the results confirming that the fusion polypeptide prepared according to the present invention binds to the pancreatic cancer cell line to release CXCL16.
  • Figure 7 is a view showing the results confirmed that the mobility of natural killer cells increased according to the treatment of various cancer cell lines fusion polypeptide of the present invention comprising an antibody binding to mesothelin.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of confirming that the influx of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising the antibody binding to PD-L1 to the Panc-1 cell line.
  • FIG. 9 is a view showing the results of confirming that the influx of natural killer cells increased according to the treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising an antibody binding to PD-L1 to the HT-29 cell line.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of confirming that the influx of natural killer cells increased by treating the Panc-1 cell line with the fusion polypeptide of the present invention including the antibody binding to Her2.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of confirming that the influx of natural killer cells increased by treating the MCF7 cell line with the fusion polypeptide of the present invention including the antibody binding to Her2.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of confirming that the mobility of natural killer cells increased according to the treatment of various cancer cell lines with the fusion polypeptide of the present invention comprising an antibody binding to CD19.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of confirming that the mobility of natural killer cells increased according to the treatment of various cancer cell lines with the fusion polypeptide of the present invention including the antibody binding to MUC-1.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of confirming that the mobility of natural killer cells increased according to the treatment of various cancer cell lines with the fusion polypeptide of the present invention including the antibody binding to MUC-1.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results confirming that the mobility of natural killer cells increased according to treatment of various fusion polypeptides of the present invention comprising an antibody binding to EGFR in various cancer cell lines.
  • 15 is a diagram showing the results confirming that the mobility of natural killer cells increased according to treatment of various fusion polypeptides of the present invention including antibodies that bind VEGFR to various cancer cell lines.
  • Figure 16 shows the results confirming that the infiltration capacity of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising an antibody that binds mesothelin to various cancer cell lines.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of confirming that the invasive ability of natural killer cells was increased by treating the Panc-1 cell line with the fusion polypeptide of the present invention containing the antibody binding to PD-L1.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of confirming that the invasive ability of natural killer cells was increased by treating the Panc-1 cell line with the fusion polypeptide of the present invention containing the antibody binding to PD-L1.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of confirming that the invasiveness of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising the antibody binding to PD-L1 to the HT-29 cell line.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of confirming that the invasiveness of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising the antibody binding to PD-L1 to the HT-29 cell line.
  • FIG. 19 is a diagram showing the result of confirming that the invasive ability of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention containing the antibody binding to Her2 in Panc-1 cell line.
  • 20 is a diagram showing the results of confirming that the infiltration capacity of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising an antibody binding to Her2 to MCF7 cell line.
  • Figure 21 is a diagram showing the results confirmed that the infiltration capacity of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention containing an antibody that binds CD19 to various cancer cell lines.
  • Figure 22 shows the results confirming that the infiltration capacity of natural killer cells increased by treatment of various fusion polypeptides of the present invention comprising an antibody that binds to MUC-1 to various cancer cell lines.
  • Figure 23 is a view showing the results confirmed that the infiltration capacity of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention containing an antibody that binds to EGFR in various cancer cell lines.
  • Figure 24 shows the results confirming that the infiltration capacity of natural killer cells increased by treatment of the fusion polypeptide of the present invention comprising an antibody binding to VEGFR to various cancer cell lines.
  • 25 is a view showing the results confirmed that the infiltration capacity of natural killer cells increased by the fusion polypeptide (Her2 scFv NRP-body) prepared to recognize Her2 according to the present invention.
  • Figure 26 is a diagram showing the induction of natural killer cells to cancer tissues following administration of the fusion polypeptide and natural killer cells prepared according to the present invention.
  • Figure 27 is a diagram showing the result of confirming the therapeutic effect by administering the mesothelin scFv fusion polypeptide prepared according to the present invention with natural killer cells in a pancreatic cancer transplant animal model.
  • Figure 28 is a diagram showing the result of confirming the therapeutic effect by administering the PD-L1 scFv fusion polypeptide prepared according to the present invention with natural killer cells in a pancreatic cancer transplant animal model.
  • 29 is a diagram showing the result of confirming the therapeutic effect by administering the Her2 scFv fusion polypeptide prepared according to the present invention with natural killer cells in a pancreatic cancer transplant animal model.
  • FIG. 30 is a diagram showing the distribution of natural killer cells when CXCL16 and IL-2 are treated in natural killer cells for a short time.
  • FIG. 31 is a diagram showing the distribution of natural killer cells when CXCL16 and IL-2 are treated in natural killer cells for a long time.
  • FIG. 32 shows CD56 bright distributed in the treatment of fusion polypeptides prepared according to the present invention in NK cells.
  • Fig. 3 shows the results of confirming that cell death is enhanced by CD16 + natural killer cells.
  • expanded NK cells were recovered and centrifuged at 1,500 rpm. Then, the supernatant was removed and the cells were counted after washing with PBS. CXCL9, CXCL10, CXCL11, and CXCL16 were each dispensed with chemokine at the bottom layer of the boyden chamber plate, and 2 x 10 5 cells of Expanded NK cells were dispensed at the upper layer of the boyden chamber plate. Then, incubated for 2 hours in a CO 2 incubator at 37 °C, the bottom layer was recovered, centrifuged at 1,500 rpm.
  • CD56-PE staining was performed at 4 ° C. for 30 minutes and washed with PBS.
  • Count Bright Absolute Counting Beads (Invitrogen) were dispensed by 50 ul for FAC analysis and FACS analysis was performed.
  • CXCL16 showed a significant effect on the migration of Expanded natural killer cells in comparison with other chemokines.
  • a recombinant vector was prepared in which a scFv sequence that recognizes a cancer target antigen, a purine sequence that acts as a linker, and CXCL16 (NK cell Recruitment Protein; NRP), which induce the influx of natural killer cells with the highest efficiency, were prepared.
  • FIG. 2 The structure of a specific recombinant vector to which a scFv sequence that recognizes mesothelin as a target antigen is bound is shown in FIG. 2.
  • the pcDNA3.1 vector was digested with Sfi1 enzyme for 2 hours and purified to prepare a ligation vector.
  • amplification was carried out by PCR based on the primer sequences shown in Table 1 below to obtain the mesothelin scFv base sequence of SEQ ID NO: 2, and the mixture of the vector and the insert sample and the T4 ligase was mixed for 2 hours at 25 ° C. Ligation of the vector and the insert was performed by incubation. This was inserted into the Sfi1 enzyme site of the pcDNA3.1 vector.
  • amplification was carried out by PCR based on the primer sequences shown in Table 2 below to obtain a PD-L1 scFv base sequence comprising the heavy chain of SEQ ID NO: 4 and the light chain of SEQ ID NO: 6, wherein the mesothelin
  • the ligation of the vector and the insert was performed in the same manner as the method for preparing the scFv-coupled vector, which was inserted into the Sfi1 enzyme site of the pcDNA3.1 vector.
  • PD-L1 scFv Manufacturing primer order order PD-L1 scFv Forward primer 5'-GGCCCAGCCGGCCATGCAGGTCCAAC TTGTGCAGTC-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • Her2 scFv amplification was carried out by PCR based on the primer sequences shown in Table 3 below to obtain a Her2 scFv sequence including the heavy chain of SEQ ID NO: 9 and the light chain of SEQ ID NO: 11, wherein the mesothelin scFv was bound.
  • the ligation of the vector and the insert was performed in the same manner as the preparation method of the vector, and it was inserted into the Sfi1 enzyme site of the pcDNA3.1 vector.
  • the base sequence for the scFv (CD19 scFv comprising the heavy chain of SEQ ID NO: 29 and the light chain of SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33 based on the amino acid sequence of each scFv to prepare CD19, MUC-1, EFGR and VEGFR scFv) MUC-1 scFv comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 35 and a light chain of SEQ ID NO: 35; EGFR scFv comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 37 and a light chain of SEQ ID NO: 39; VEGFR scFv comprising a heavy chain of SEQ ID NO: 41 and a light chain of SEQ ID NO: 43)
  • the ligation of the vector and the insert was performed in the same manner as the method for preparing the mesothelin scFv-coupled vector, and inserted into the Sfi1 enzyme site of the pcDNA3.1 vector.
  • the CXCL16 and purine cleavage sites were amplified by PCR based on the primer sequences shown in Table 4 below to use immunoglobulins present in the vector and then the Not1 enzyme site.
  • the scFV-inserted vector that recognizes the target antigen was digested with Not1 enzyme for 2 hours and purified, and then the vector and the insert CXCL16 sample were mixed with ligase enzyme and incubated at 25 ° C for 2 hours to perform ligation of the vector and the insert. .
  • the produced expression vector was transformed into CHO (Chinese hamster ovary) cells from which purine was removed to mass produce fusion polypeptides (NRP-body).
  • CHO cells transfected with the expression vector were cultured in a 150 mm plate, and recovered by incubating for 72 hours in a roller bottle incubator. The recovered culture solution was centrifuged and only the supernatant was purified using a protein A-agarose column of the AKTA Protein Purification System (GE Healthcare Life Sciences) to produce a fusion polypeptide.
  • Example 2 Mesothlin scFV NRP-body (0.1-2 ⁇ g / ml) prepared in Example 2 was dispensed on 2 ⁇ 10 5 panc-1 cells, a pancreatic cancer cell line, and incubated at 4 ° C. for 20 minutes. . Cells were then recovered, washed with PBS, and FITC-bound FC antibody (1 ⁇ g / ml) was aliquoted and incubated at 4 ° C. for 20 minutes. Then, after collecting the cells again, the cells were washed with PBS and analyzed by FACS.
  • PD-L1 scFv NRP-body and Her2 scFv NRP-body recognize PD-L1 or Her2 present on the surface of pancreatic cancer cell line through antigen recognition sites, respectively. It was confirmed that the binding specifically, through this it was confirmed that the fusion polypeptide of the present invention can be applied to the antibody that specifically binds to the target antigen according to the target tumor-associated antigen.
  • CXCL16 ELISA was performed according to the method of Human CXCL16 ELISA kit (# DCX160) of the R & D system.
  • a mesothelin scFV fusion polypeptide (Mesothlin scFV NRP-body) was dispensed into a 96-well ELISA plate (R & D) at 0.5 ⁇ g / mL and 50 ⁇ l / Well, and allowed to stand at room temperature for 2 hours for adsorption. . After washing the plate, 200 ⁇ l / well of peroxidase label was added as a secondary antibody and left at room temperature for 2 hours. The plate was washed with Tween-PBS, then ABTS substrate solution was added and developed to measure absorbance at 415 nm using a plate reader.
  • fusion polypeptide (NRP-body) was bound to the mesothelin of the pancreatic cancer cell line Panc-1 and CXCL16 was released as the purine cleavage site of the fusion polypeptide was cleaved by the purine of the cancer cells.
  • Example 2 After the fusion polypeptide prepared in Example 2 recognizes and binds to a cancer expressing a target antigen, it was confirmed by using a Boyden cahamber system that natural killer cell influx was increased by releasing CXCL16, a natural killer cell induction-inducing protein.
  • Natural killer cells were labeled with CFSE (BioLegend, #RUO 423801), aliquoted at 2 ⁇ 10 5 in the upper layer, and incubated for 4 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. Then, bottom layer cells were recovered and the distribution of CFSE-labling natural killer cells was confirmed through FACS.
  • CFSE BioLegend, #RUO 423801
  • the PD-L1 scFv-fusion polypeptide and Her2 scFv-fusion polypeptide prepared in Example 2 were dispensed into a Panc-1, HT-29 or MCF7 cell line and subjected to Boyden cahamber under the same conditions as the mesothelin scFv-fusion polypeptide experiment.
  • the inflow of natural killer cells was confirmed through the system, and the results are shown in FIG. 8 (PD-L1 scFV NRP-body for Pan-1), FIG. 9 (PD-L1 NRP-body for HT-29), and FIG. 10 (Her2 NRP-body for Pan-1) and FIG. 11 (Her2 scFV NRP-body for MCF7).
  • the CD-19, MUC-1, EGFR and VEGFR scFv-fusion polypeptide prepared in Example 2 was HPDE, K562 (ATCC, Cat.CCL-243), HCT116 (ATCC, Cat.CCL-247), Panc
  • the cell lines were divided into -1 (ATCC, Cat.CRL-1469) or MCF7 (ATCC, Cat.HTB-22) cell lines to confirm the influx of natural killer cells through the Boyden cahamber system under the same conditions as the mesothelin scFv experiment.
  • the results are shown in FIG. 12 (CD19 scFV NRP-body), FIG. 13 (MUC-1 scFV NRP-body), FIG. 14 (EGFR scFV NRP-body), and FIG. 15 (VEGFR scFV NRP-body).
  • HPDE, Panc-1, HCT116, MCF7, HT-29 and K562 cell lines 2 ⁇ 10 5 to the bottom layer of the Boyden Chamber assay plate (Fisher Scientific, # 07-200-155) after 37 ° C, CO
  • the cells were incubated for 2 hours in two incubators, and 1 ⁇ g / ml of the fusion polypeptide prepared in Example 2 was dispensed into each cell line.
  • matrigel BD, # 354234
  • the natural killer cells were divided into 2 x 10 5 and incubated for 48 hours in 37 °C, CO 2 incubator. Thereafter, the upper layer was recovered, stained with crystal violet for 1 hour, and then randomly photographed three portions of the upper layer, and the invasive ability of natural killer cells was measured by image J program.
  • Results for each fusion polypeptide are shown in FIGS. 16-24, respectively.
  • ADCC Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
  • Panc-1 cell lines were dispensed into 96-well plates and incubated for 2 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • 1 ⁇ g / ml of mesothelin scFV-fusion polypeptide was treated in a target cell and then incubated at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 2 hours.
  • Natural killer cells were added as 2 x 10 5 so that the ratio of the target cell and the effector cell was 1: 1, and the cells were incubated for 4 hours at 37 °C, CO 2 incubator.
  • Cells were harvested, washed with PBS, stained with Annexin V (1 ⁇ g / ml) and PI (1 ⁇ g / ml) for 30 minutes and analyzed by FACS.
  • the fusion polypeptide prepared in Example 2 was injected into a cancer transplant animal model to confirm the effect in vivo.
  • mice Six-week-old female NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl / SzJ) mice were used for in vivo experiments. Mouse management was performed according to the Animal Care Committee of the Laboratory Animal Resource Center of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. Panc-1 was injected into the mouse pancreas to form tumors for 2 weeks, and mesothelin, PD-L1 or Her2 scFV fusion polypeptide (5 mg / kg) was injected intraperitoneally at 5 day intervals.
  • Natural killer cells were injected IV at 1 ⁇ 10 7 / mouse for tumor growth experiments. Tumor growth was observed using Panax-1 expressing luciferase using IVIS Living Image 3.0 program, and motility experiments of natural killer cells were performed using 1 ⁇ 10 7 / mouse of natural killer cells stained with DiR. Dosing was observed by IVIS flourescence Image program and FACS.
  • FIGS. 26 to 29 show the induction of natural killer cells to cancer tissues according to the administration of the fusion polypeptide and natural killer cells prepared in Example 2
  • Figure 27 is mesothelin scFV NRP-body
  • Figure 28 is PD-L1 scFV NRP -body
  • Figure 29 shows the result of confirming the therapeutic effect by administering Her2 scFV NRP-body with natural killer cells.
  • the fusion polypeptide of the present invention showed a significant effect on cancer treatment by enhancing the influx of natural killer cells, which are immune cell therapeutics.
  • IL-2 and CXCL16 which promote the growth of natural killer cells, are used together at concentrations of 200 U and 100 nM, respectively 0, 1, 2, 8 or 16 hours of processing and CD56 dim
  • concentrations of 200 U and 100 nM respectively 0, 1, 2, 8 or 16 hours of processing and CD56 dim
  • CD56 dim the distribution of CD56 bright was confirmed by FACS and the results are shown in Figure 30, the cells in the upper right corner represents the CD56 bright cells.
  • CXCL16 affects the characteristics of natural killer cells by changing CD56 dim to CD56 bright , which has a great effect of ADCC (Antibody dependent cellular cytotoxicity).
  • ADCC Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
  • Panc-1 cell lines were dispensed into 96-well plates and incubated for 2 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. Natural killer cells were added as 2 x 10 5 so that the ratio of the target cell and the effector cell was 1: 1, and the cells were incubated for 4 hours at 37 °C, CO 2 incubator. The cells were recovered, washed with PBS, stained with Annexin V (1 ⁇ g / ml) and PI (1 ⁇ g / ml) for 30 minutes, and analyzed by FACS.
  • CD56 bright increased by CXCL16 of the fusion polypeptide It was confirmed that cancer cell death was increased by CD16 + natural killer cells.

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Abstract

본 발명은 암 치료용 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 암 예방 또는 치료용 융합 단백질은 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 링커; 및 CXCL16의 자연 살해 세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하여 면역세포치료제인 자연 살해 세포와 공-투여시 특정 항원을 발현하는 암으로의 자연 살해 세포 유입을 크게 증강시킴으로써 암 예방 또는 치료에 현저한 효과를 보인다.

Description

NK 세포 활성화 융합 단백질, NK 세포 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물
본 발명은 자연살해세포의 암 유입 증대 및 항체의존적 세포독성(ADCC) 극대화를 위한 융합 단백질 및 자연살해세포를 이용한 신규 항암 면역세포 치료에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 융합 단백질을 이용한 암을 치료하는 방법 및 융합 단백질의 다양한 용도에 관한 것이다.
자연살해세포 (Natural killer cell; NK cell)는 항원에 의한 사전 감작 없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주 세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T 세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어기작의 제1선에서 작용하는 행동세포이다.
자연살해세포의 면역학적 기능은 그 살상 기능을 유발하는 활성화 신호 (stimulatory signal) 및 살상 기능을 억제하는 비활성화 신호 (inhibitory signal)의 균형에 의해 좌우된다. 구체적으로는 활성화 신호를 강하게 받은 자연살해세포는 표적 세포를 공격 및 제거하고, 비활성화 신호를 강하게 받은 자연살해세포는 표적세포를 살려두게 된다.
자연살해세포의 살상기능으로는 ADCC (antibody-dependent cell cytoxicity)와 자연살 (Natural Killing)을 들 수 있다. ADCC와 자연살은 모두 PTK (Protein Tyrosine Kinase)의 활성화를 필요로 하고, 자연살해세포의 비활성화 수용체에 의해 전달되는 비활성화 신호에 의해 차단된다는 공통점을 가진다. NK 세포의 살상 기능이 활성화 신호 및 비활성화 신호의 균형에 의해 좌우되기 때문에, 자연살해세포는 정상적인 숙주세포와 감염되거나 종양화된 세포를 구분하여 제거할 수 있게 된다.
자연살해세포는 CD56의 발현정도에 따라 분류할 수 있으며, CD56dim 자연살해세포는 말초혈액 (peripheral blood) 자연살해세포에 90% 이상 분포되어 있다. CD56dim은 다른 CD56 발현 자연살해세포 보다 세포독성 (cytotoxicity)이 높은 것으로 알려져 있으며, 자연살해세포의 활성화 수용체 (activating receptor)인 killer Ig-like receptors (KIR) 및 퍼포린 (perforin)의 발현이 높은 것으로 알려져 있다. CD56bright 자연살해세포는 CD56dim 자연살해세포보다 그 수가 적으며, 세포독성 능력도 낮은 것으로 알려져 있다. 하지만 CD56bright 자연살해세포는 면역조절기능 (IFN-gamma, TNF-alpha 등)이 높을 뿐만 아니라 ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) 기능이 높은 것으로 보고되었다(The Journal of Immunology, 2011, 186:6753-6761). 특히, CD56bright 자연살해세포는 항체와 암에 대한 병합치료 시 상승된 효과가 있을 것으로 기대된다.
한편, 종양은 그의 악성 표현형과 연관된 독특한 단백질을 발현할 수 있거나 특정 단백질을 정상 세포보다 더 많은 수로 과다 발현할 수 있음이 잘 알려져 있다. 종양 세포의 표면상에서의 특유한 단백질의 발현은 종양의 표현형적 아이덴티티 (identity) 및 생화학적 조성 및 활성을 프로빙함으로써 질환을 진단하고 특성화하는 기회를 제공하거나 종양 관련 항원을 타겟으로 하여 종양에 대한 새로운 치료 방법을 개발하게 한다.
상기 종양 관련 항원에 대하여 특이적인 항원-항체 반응을 나타내는 항체는, 여러 가지 생체 면역 반응 (항체 의존성 세포성 세포 독성 활성 (ADCC), 보체 의존성 세포 독성 활성 (CDC) 등)을 유도하여 암 세포를 공격해 세포사를 유도하는 것이 알려져 있기 때문에, 종양의 치료에 유용한 항체 등이 개발되고 있으나 이의 치료 효능을 증진시키기 위한 연구 개발이 미비한 실정이다.
이러한 배경 하에, 암 세포 표면에 특이적으로 발현되는 암 항원 및 자연살해세포를 이용하여 효과적으로 암을 치료할 수 있는 방법에 관한 연구개발이 수행될 필요성이 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 공개특허 제10-2006-0079180호
대한민국 공개특허 제10-2015-0063145호
본 발명은 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편;
링커; 및
CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 이를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편;
링커; 및
CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편;
링커; 및
CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 자연살해세포 (Natural killer 세포, NK 세포)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한 상기 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료를 위한 상기 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 면역세포치료제인 자연살해세포를 암 조직 내로 효과적으로 유입시키기 위한 방법에 관해 연구 개발을 수행한 결과, 자연살해세포 표면에 발현되는 활성유도물질의 리셉터 중 자연살해세포의 표면에 CXCR3과 CXCR6가 과발현됨을 확인하고 이의 리간드 중 CXCL16이 자연살해세포의 migration에 효과적인 것을 확인한 후, 자연살해세포 유도 특성을 지닌 CXCL16과 종양 관련 항원에 특이적인 항체의 융합 단백질을 제조하여 이를 투여함으로써, 자연살해세포의 암으로 유도를 현저히 증강시키고 암의 치료에 현저한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서 용어, "종양 관련 항원"이란 정상 세포에서 발현되지 않거나 정상 세포와 대비하여 종양 세포에만 과다발현되는 종양 세포 상에, 바람직하게 종양 세포 표면상에 특이적으로 발현되는 항원으로, 종양 세포들에서 생성된 항원성 물질을 말한다.
이에 제한되지 않지만, 종양에서 특이적으로 발현되는 종양 관련 항원은 예를 들어, 4-1BB (CD137), 5T4, AGS-5, AGS-16, 앙기오포이에틴 (Angiopoietin) 2, CD19 (Cluster of Differentiation 19), B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, 암태아성 (Carcinoembryonic) 항원, CTLA4, 크립토 (Cripto), ED-B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, 피브로넥틴, 엽산 수용체, 갱글리오사이드 (Ganglioside) GM3, GD2, 글루코코르티코이드-유도의 종양 괴사 인자 수용체 (GITR), gplOO, gpA33, GPNMB, ICOS, IGFIR, 인테그린 αυ, 인테그린 αυβ, KIR, LAG-3, 루이스 (Lewis) Y, 메소텔린 (Mesothelin), c-MET, Her2 (human EGFR-related 2), MN 탄산무수화효소 IX, MUC1, MUC16, 넥틴(Nectin)-4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 (Programmed death-ligand 1), PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, 신데칸(Syndecan)-1, TACI, TAG-72, 테나신 (Tenascin), TIM3, TRAILR1, TRAILR2, EGFR, VEGFR-1, VEGFR-2 또는 VEGFR-3 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 메소텔린, PD-L1, Her2, CD19, MUC1, EGFR 및 VEGFR에 대하여 본 발명의 융합 폴리펩티드의 효과를 확인하였다.
본 발명에 있어서 용어, "항체"란 전체항체, 항원 인식 및 결합 능력을 보유하는 항체 단편, 단클론 항체, 다클론 항체, 및 항체 유사물질을 포함한다. 상기 항체는 IgM, IgG(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgD, IgA, 또는 IgE 일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어, "항체 단편"이란 완전한 항체의 일부, 일반적으로 상기 완전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일 도메인 항체를 포함한다.
상기 “항체 또는 이의 단편”은 비-종양 세포 또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포, 바람직하게 종양에서 특이적으로 발현하는 종양 관련 항원과 특이적으로 또는 바람직하게 결합할 수 있다. 여기에서 "특이적으로 결합하다" 또는 "바람직하게 결합하다"는 두 결합 파트너들 사이(예로, 항체 및 그의 결합 파트너인 항원)의 결합은 상기 두개의 결합 파트너들에 선택적이며, 원하지 않거나 비-특이적인 상호작용들과 구분될 수 있음을 의미한다.
본 발명에 있어서 용어, "단일쇄 Fv" 또는 "scFv (single-chain variable fragment)"란 전통적인 2쇄 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들이 결합하여 하나의 쇄를 형성하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 링커 펩타이드가 상기 두 쇄 사이에 삽입되어 적합한 폴딩 및 활성 결합 부위의 생성을 허용한다.
본 발명에 있어서, "항원에 결합하는 항체"라는 용어는 충분한 친화성으로 항원과 결합함으로써 상기 항체가 항원을 표적화하는 치료성 제제로서 유용한 항체를 지칭한다.
본 발명에 있어서 용어, “링커”는 제1 분자(예컨대, 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편)를 제2 분자(CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질)에 화학 결합 등을 통해 연결하는 펩타이드를 의미한다.
본 발명에 있어서 용어, “암” 또는 “종양”이란 비조절의 세포 증식에 의하여 특성화되는 인간들에서의 병리학적 상태를 의미한다. 이에 제한되지 않지만, 암종, 림프종, 아세포종, 및 백혈병을 포함한다. 암들의 더욱 특정한 예시들은 비제한적으로: 폐암 (소세포 및 비-소세포), 유방암, 전립선암, 암양종, 방광암, 위암, 췌장암, 간암 (간세포성), 간아종, 결장암, 두경부 편평암 (squamous) 세포 암종, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 중피종, 흑색종, 육종, 골육종, 지방육종, 갑상선암, 유건종, 급성 (acute) 골수성 백혈병 (AML), 및 만성 (chronic) 골수성 백혈병 (CML)을 포함한다.
본 발명에 있어서, "발현 벡터"란 용어는 프로모터에 작동적으로 결합되는 관심 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어들을 천연 아미노산 중합체들뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체들에 적용한다. 상기 용어들을 또한 단백질이 작용성으로 남아있도록 보존적인 아미노산 치환을 함유하는 상기 중합체들에 적용한다.
본 발명에 있어서, "숙주 세포"는 상기 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 효모, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포일 수 있다.
종양 또는 암 성장 또는 진행에 관하여 "억제하는", "감소시키는", "줄이는"이란 용어들은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정 가능한 양까지 환자의 종양 또는 암의 성장, 확산, 전이를 억제시킴을 지칭한다. 종양 또는 암의 성장, 진행 또는 확산은, 상기 종양 크기가 예를 들어 본 발명의 융합 폴리펩티드와 면역 세포 치료체인 자연살해세포의 공-투여 전, 또는 융합 폴리펩티드 투여 전 종양 크기에 비해 약 10%, 20%, 30%, 50%, 80% 또는 100% 이상 감소하는 경우 억제되거나, 감소되거나 줄어든다.
본 발명은 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 링커; 및 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하여 종양의 세포 표면에 특이적으로 결합할 수 있으며, 항원-항체 결합 후 절단되어 방출되는 자연살해세포 유도 단백질인 CXCL16을 통해 자연살해세포를 목적하는 종양 세포로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하여 종양 표적 표면 항원에 결합한다. 종양 표적 표면 항원은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 메소텔린, PD-L1, Her2, CD19, MUC1, EGFR, VEGFR, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, 4-1BB, 5T4, AGS-5 또는 AGS-16 일 수 있으며, 이에 제한되지 아니한다.
상기 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 단일쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', F(ab')2, 다이설파이드 안정화된 항체 등을 포함하며, 구체적으로 단일쇄 Fv (scFv)일 수 있다.
상기 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조는 당업계에 알려진 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 실시양태에 있어서, 상기 항체는 단일쇄 Fv (scFv)이다. scFv 항체의 VH 및 VL 영역은, 폴딩되어 2쇄 항체 중에서 발견되는 것과 유사한 항원 결합 부위를 생성시키는 단일쇄를 포함한다. 일단 폴딩되면, 비공유 상호작용이 상기 단일쇄 항체를 안정화시킨다. 보다 구체적인 실시태양에서, 상기 scFv를 재조합에 의해 생성시킨다. 본 발명의 항체의 보존적인 변체는 통상적으로 제조될 수 있으며, scFv 단편에 사용되는 보존적인 변체는 상기 VH 및 VL 영역들 간의 정확한 폴딩 및 안정화에 필요한 중요한 아미노산 잔기를 유지할 것이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, scFv는 메소텔린의 scFV로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 구체적으로 서열번호 2로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 따르면, scFV는 PD-L1의 scFV로 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 중쇄 (VH); 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 6으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 경쇄 (VL)를 포함할 수 있으며, 상기 종양 관련 항원인 PD-L1은 서열번호 7로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, scFV는 Her2의 scFV로 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 중쇄; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 11로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있으며, 상기 종양 관련 항원인 Her2는 서열번호 12로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, scFV는 CD19의 scFV로 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 29로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 31로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, scFV는 MUC-1의 scFV로 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 33으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 35로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, scFV는 EGFR의 scFV로 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 37로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 39로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, scFV는 VEGFR의 scFV로 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 41로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 중쇄; 및 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 43으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 경쇄를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 scFv 항체를 경쇄를 통해 펩타이드 링커에 직접 결합시킬 수 있으며 scFv가 결합된 Fc 영역을 통해 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, Fc(불변 영역)은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 구체적으로 서열번호 14로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 링커는 펩타이드 링커로써 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이나, 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 또한, 링커는 종양 관련 항원에 항체가 결합한 후 CXCL16이 분리되도록 절단 서열을 포함할 수 있다. 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은, 50개 이하 아미노산, 일반적으로 40개 이하 아미노산, 바람직하게는 30개 이하 아미노산, 및 보다 바람직하게는 20개 이하 아미노산의 길이, 보다 더 바람직하게 1 내지 10개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
예컨대, 상기 펩타이드 링커는 임의의 프로테아제에 의해 절단되는 서열을 포함할 수 있고, 구체적으로 퓨린에 의해 절단되는 RVKR의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 퓨린에 의해 절단되는 퓨린 절단부위, 즉 퓨린에 의해 절단될 수 있는 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 퓨린 절단부위를 포함하여 자연살해세포 유도 단백질이 암 세포에서 방출될 수 있게 한다.
퓨린 절단 부위는 퓨린에 의해 절단 가능한 임의의 폴리펩타이드 부위일 수 있다. 듀커트(Duckert) 등(문헌 [Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection 17(1):107-112 (2004)], 본 문헌에서 그 내용 전체가 참조로 포함됨)에 의해 보고되는 바와 같이, 퓨린은 "서브스틸리신/켁신-유사 프로단백질 전환효소라 지칭되는 진화상 보존된 이염기- 및 일염기-특이적 CA2+-의존성 세린 프로테아제 계열"의 효소이다.
상기 문헌 등에서 알려진 퓨린 절단 부위 서열은 본 명세서에 포함되며, 구체적으로 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 16으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 퓨린 절단 부위 아미노 말단을 통해 퓨린 절단 서열에 결합될 수 있고, 상기 항체의 중쇄, 경쇄, Fc(불변 영역) 또는 프레임워크 영역들에 직접 결합시킬 수도 있다.
본 발명의 융합단백질은 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하여 종양 관련 항원과 결합된 항체를 가진 종양 세포로 자연살해세포를 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 “자연살해세포 유도 단백질”이란 종양 세포로 자연살해세포의 유입을 유도하는 단백질, 즉 케모카인 (chemokine)으로 자연살해세포를 암 세포로 migration 시킬 수 있는 단백질인 CXCL16을 의미한다.
구체적으로, 상기 CXCL16은 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다. CXCL16은 서열번호 18의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 자연살해세포 유도 단백질은 펩타이드 링커를 통해 항체 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 본 발명에 따른 링커는 펩타이드 링커로써 상기 영역들을 결합시키거나 또는 이들 간의 일부 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 보존하는 것 이외에 특정한 생물 활성을 갖지 않을 것이나, 구성 아미노산들은 상기 분자의 일부 성질, 예를 들어 폴딩, 순 전하, 또는 소수성에 영향을 미치도록 선택될 수 있다. 또한, 링커는 종양 관련 항원에 항체가 결합한 후 CXCL16이 분리되도록 절단 서열, 예컨대 임의의 프로테아제에 의해 절단 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 펩타이드 링커는 퓨린에 의해 절단되는 퓨린 절단부위 즉, 퓨린에 의해 절단될 수 있는 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 퓨린 절단 부위를 포함한다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 당업계에 알려진 비-재조합 방법 또는 재조합 방법을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게 재조합 방법을 통해 제조될 수 있다.
즉, 상기 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 링커; 및 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 암호화하는 cDNA를 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 메소텔린 scFv 및 Fc를 포함하는 염기 서열을 벡터, 구체적으로 pcDNA3.1 벡터에 삽입하고, 퓨린 절단 부위 및 자연살해세포 유도 단백질을 암호화하는 염기 서열을 면역글로블린 (immunoglobulin) 서열 뒤에 삽입하여 발현벡터를 제조한다. 제조된 발현벡터의 예는 하기 도 2에 기재된 바와 같다.
제조된 발현벡터는 세균, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다. 당업자들은 에스케리키아 콜라이, 다른 세균 숙주, 효모 및 다양한 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 포함하여 단백질 발현에 이용될 수 있는 다수의 발현 시스템들을 이용하여 융합 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 발현 벡터를 퓨린이 제거된 CHO 세포에 형질주입하여, 융합 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
제조된 융합 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피 등을 포함한 당해 분야의 표준 과정에 따라 정제되어 목적하는 융합 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
본 발명은 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 상기 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 도 2에 표시된 구조를 가진 발현 벡터를 제공할 수 있으며, 서열번호 19의 염기 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 구체적으로, COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주로부터 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편;
링커; 및 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 면역세포치료제로서, 구체적으로 자연살해세포의 암으로의 유도를 통해 암 예방 또는 치료에 현저한 효과를 가진다. 본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 직접적 치료 효과뿐만 아니라 항암 보조제로써의 작용을 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드의 CXCL16에 의해 자연살해세포의 CD56dim에서 CD56bright로 세포의 분포가 변화되는 것이 확인되었으며, CD56dim에 비해 ADCC 효과가 큰 CD56bright로 분화시킴으로써, 본 발명의 약학 조성물은 암 예방 또는 치료에 효과적임을 확인하였다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 링커; 및 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 자연살해세포(Natural killer cell)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 면역세포치료제인 자연살해세포와 융합 폴리펩티드를 공-투여시 암으로의 자연살해세포 유입을 크게 증강시킴으로써 암 예방 또는 치료에 현저한 효과를 가진다.
본 발명에 사용하기 위한 상기 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 표준 기법에 의해 제형화할 수 있다. 적합한 약학 담체는 본 발명 및 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005))에 개시된다.
본 발명의 융합 폴리펩티드 및/또는 자연살해세포를 임의의 적합한 경로, 예를 들어 흡입을 통해, 국소, 코, 경구, 비경구 또는 직장에 의해 투여하기 위해서 제형화할 수 있다. 따라서, 상기 언급된 약학 조성물의 투여를 피내, 피하, 정맥 내, 근육 내, 비내, 흡입에 의해, 대뇌 내, 기관 내, 동맥 내, 복강 내, 방광 내, 흉막 내, 관상동맥 내, 피하 또는 종양 내 주사에 의해, 주사기 또는 다른 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여가 또한, 흡입 또는 에어로졸 투여와 같이 고려된다. 정제 및 캡슐을 경구, 직장 또는 질내 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 융합 폴리펩티드, 또는 융합 폴리펩티드 및 자연살해세포를 포함할 것이다. 융합 폴리펩티드 및 자연살해세포는 함께 또는 별개로 제공될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충된 염수 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 살균성이며 바람직하지 못한 물질이 일반적으로 없다. 이들 조성물을 통상적인, 널리 공지된 살균 기법에 의해 살균시킬 수 있다. 상기 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수도 있다. 이들 제형 중 융합 폴리펩티드의 농도는 광범위하게 다양할 수 있으며, 선택된 특정한 투여 모드 및 환자의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등을 근거로 선택될 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 정맥 내 투여 또는 체강 내 투여를 포함하여 비경구 투여에 적합하다.
본 발명의 융합 폴리펩티드 및/또는 자연살해세포를 주사, 예를 들어 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형, 예를 들어 앰풀 또는 수회-용량 용기 중에, 첨가된 보존제와 함께 존재할 수 있다. 주사 가능한 조성물은 바람직하게는 수성 등장성 용액 또는 현탁액이며, 좌약을 바람직하게는 지방 유화액 또는 현탁액으로부터 제조한다. 상기 조성물을 살균하고/하거나 상기 조성물이 보조제, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 활성 성분은 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 멸균성의 발열원이 없는 물에 의해 조성되는 분말 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 활성 성분은 다른 치료학적으로 귀중한 물질을 함유할 수도 있다. 상기 조성물들을 통상적인 각각의 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조하며, 이들은 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
경구 투여의 경우, 약학 조성물 또는 약제는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께, 예를 들어 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 활성 성분, 즉 본 발명의 조성물을 (a) 희석제 또는 충전제, 예를 들어 락토오스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스(예를 들어 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스), 글리신, 펙틴, 폴리아크릴레이트 및/또는 칼슘 수소 포스페이트, 칼슘 설페이트, (b) 윤활제, 예를 들어 실리카, 탤컴, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염, 금속성 스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및/또는 폴리에틸렌글리콜과 함께; 정제의 경우 또한 (c) 결합제, 예를 들어 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 경우에 따라 (d) 붕해제, 예를 들어 전분(예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분), 글리콜레이트, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; (e) 습윤제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 및/또는 (f) 흡수제, 착색제, 풍미제 및 감미제와 함께 포함하는 정제 및 젤라틴 캡슐이 바람직하다.
본 발명은 약학 조성물을 암과 같은 질병 또는 이의 악성 상태를 예방하거나, 치료하거나 또는 억제하기 위한 치료 유효 용량으로 환자에게 투여한다. 상기 약학 조성물을 환자에게서 유효한 치료 또는 진단 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여한다. 유효한 치료 또는 진단 반응은 상기 병 또는 악성 상태의 증상 또는 합병증을 적어도 부분적으로 저지하거나 늦추는 반응이다. 이를 수행하기에 적합한 양을 "치료학적으로 유효한 양"으로서 정의한다.
투여되는 융합 폴리펩티드 및/또는 자연살해세포의 투여량은 포유동물의 종, 체중, 연령, 개별적인 조건, 치료하려는 영역의 표면적 및 투여 형태에 따라 다르다. 상기 용량의 크기는 또한 특정 환자에게서 특정 화합물의 투여에 동반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다.
약 50 내지 80 ㎏의 포유동물, 바람직하게 인간에게 투여하기 위한 단위 투여량은 융합 폴리펩티드에 대하여 약 1 mg/kg 내지 5 mg/kg의 양을 함유할 수 있으며, 자연살해세포에 대하여 약 1 x 105 cells/kg 내지 2 x 107 cells/kg의 양을 함유할 수 있다.
전형적으로, 본 발명 조성물의 투여량은 목적하는 효과를 성취하기에 충분한 투여량이다. 최적의 투여 스케줄을 융합 폴리펩티드 및/또는 자연살해세포의 측정, 환자의 신체 중의 누적으로부터 계산할 수 있다. 하루에, 일주일에, 한 달에 또는 1년에 1 회 이상 제공될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 최적 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 쉽게 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 확립된 프로토콜에 따라 인간에게 융합 폴리펩티드 및/또는 자연살해세포의 투여를 위한 최적 투여를 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한 상기 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료를 위한 상기 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 암의 치료방법은 자연살해세포를 함께 투여할 수 있으며, 이에 따라 상승된 치료효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 융합 단백질은 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 링커; 및 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하여 면역세포치료제인 자연살해세포와 공-투여시 특정 항원을 발현하는 암으로의 자연살해세포 유입을 크게 증강시킴으로써 특이적으로 암 예방 또는 치료에 현저한 효과를 보인다.
도 1은 케모카인 종류에 따른 Expanded 자연살해세포의 migration 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드를 제조하기 위한 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드가 메소텔린 인식 부위에 의해 췌장암 세포주 표면에 존재하는 메소텔린을 인식하여 결합함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드가 PD-L1 인식 부위에 의해 췌장암 세포주 표면에 존재하는 PD-L1을 인식하여 결합함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드가 Her2 인식 부위에 의해 췌장암 세포주 표면에 존재하는 Her2를 인식하여 결합함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드가 췌장암 세포주에 결합하여 CXCL16을 방출하는 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 메소텔린에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주 처리함에 따른 자연살해세포의 이동능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 Panc-1 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 유입이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 HT-29 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 유입이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 Her2에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 Panc-1 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 유입이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 Her2에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 MCF7 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 유입이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 12는 CD19에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 이동능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 MUC-1에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 이동능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 EGFR에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 이동능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 VEGFR에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 이동능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 메소텔린에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 17은 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 Panc-1 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 18은 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 HT-29 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 19는 Her2에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 Panc-1 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 20은 Her2에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 MCF7 세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 21은 CD19에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 22는 MUC-1에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 23은 EGFR에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 24는 VEGFR에 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 다양한 암세포주에 처리함에 따른 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 25는 본 발명에 따라 Her2을 인식 할 수 있게 제조된 융합 폴리펩티드(Her2 scFv NRP-body)에 의해 자연살해세포의 침윤능이 증가한 것을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 26은 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드 및 자연살해세포의 투여에 따른 암 조직으로 자연살해세포 유도를 나타내는 도이다.
도 27은 본 발명에 따라 제조된 메소텔린 scFv 융합 폴리펩티드를 췌장암 이식 동물 모델에서 자연살해세포와 함께 투여하여 치료효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 28은 본 발명에 따라 제조된 PD-L1 scFv 융합 폴리펩티드를 췌장암 이식 동물 모델에서 자연살해세포와 함께 투여하여 치료효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 29는 본 발명에 따라 제조된 Her2 scFv 융합 폴리펩티드를 췌장암 이식 동물 모델에서 자연살해세포와 함께 투여하여 치료효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 30은 자연살해세포에 CXCL16 및 IL-2를 단기간으로 처리시 자연살해세포의 분포 변화를 나타내는 도이다.
도 31은 자연살해세포에 CXCL16 및 IL-2를 장기간으로 처리시 자연살해세포의 분포 변화를 나타내는 도이다.
도 32는 본 발명에 따라 제조된 융합 폴리펩티드를 NK 세포에 처리시 분포되는 CD56bright CD16+ 자연살해세포에 의한 세포 사멸 증진을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 케모카인에 의한 Expanded 자연살해세포 migration 확인
케모카인 종류에 따라 Expanded 자연살해세포의 migration 정도를 확인하기 위하여, Expanded NK cell을 회수 후 1,500 rpm으로 원심 분리하였다. 그리고 나서, 상층액을 제거하고 PBS로 워싱 후 세포 수를 세었다. Boyden chamber plate의 bottom layer에 케모카인으로 CXCL9, CXCL10, CXCL11 및 CXCL16을 10 nM 씩 분주하고, Boyden chamber plate의 upper layer에 Expanded NK cell 2 x 105 cells를 분주하였다. 그 후, 37℃의 CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하고, Bottom layer를 회수하여, 1,500 rpm으로 원심 분리하였다. 그리고 나서, PBS 워싱을 수행한 후, CD56-PE 염색을 4℃ 에서 30분 동안 수행하고, PBS로 워싱하였다. FAC 분석을 위해 Count Bright Absolute Counting Beads (Invitrogen)을 50 ul 씩 분주하고, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, 다른 케모카인과 대비하여 CXCL16가 Expanded 자연살해세포의 migration에 현저한 효과를 보임이 확인되었다.
< 실시예 2> 융합 폴리펩티드 [ NK cell recruitment protein( NRP )-body]의 제조 및 정제
암 표적 항원을 인식하는 scFv 서열, 링커역할을 하는 퓨린 서열, 및 가장 높은 효율로 자연살해세포의 유입을 유도하는 CXCL16 (NK cell Recruitment Protein; NRP)이 결합된 재조합 벡터를 제조하였다.
표적 항원으로서 메소텔린(mesothelin)을 인식하는 scFv 서열이 결합된 구체적인 재조합 벡터의 구조를 도 2에 나타내었다.
pcDNA3.1 벡터를 Sfi1 효소로 2시간 분해시키고, 정제하여 결찰용 벡터를 제조했다. 메소텔린 scFv를 제조하기 위해 하기 표 1의 프라이머 서열을 기초로 PCR을 통해 증폭하여, 서열번호 2의 메소텔린 scFv 염기서열을 얻었으며 벡터 및 삽입물 샘플과 T4 리가아제를 혼합하여 25℃에서 2시간 배양하여 벡터와 삽입물의 결찰을 수행했다. 이를 pcDNA3.1 벡터의 Sfi1 enzyme site에 삽입하였다.
메소텔린 scFv 제조용 프라이머 서열
서열
Mesothelin scFv Forward primer 5’-GGCCCAGCCGGCCATGCAGGTACAACTGCAGCAG-3’(서열번호 20)
Mesothelin scFv Reverse primer 5’-GGCCCTTGGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’(서열번호 21)
PD-L1 scFv를 제조하기 위해 하기 표 2의 프라이머 서열을 기초로 PCR을 통해 증폭하여, 서열번호 4의 중쇄 및 서열번호 6의 경쇄를 포함하는 PD-L1 scFv 염기서열을 얻었으며, 상기 메소텔린 scFv이 결합된 벡터의 제조방법과 동일한 방법으로 벡터와 삽입물의 결찰을 수행하여, 이를 pcDNA3.1 벡터의 Sfi1 enzyme site에 삽입하였다.
PD-L1 scFv 제조용 프라이머 서열
서열
PD-L1 scFv Forward primer 5’-GGCCCAGCCGGCCATGCAGGTCCAAC TTGTGCAGTC-3’(서열번호 22)
PD-L1 scFv Reverse primer 5’-GGCCCTTGGTGGACCAAGCTGGAGATCAAA-3’(서열번호 23)
Her2 scFv를 제조하기 위해 하기 표 3의 프라이머 서열을 기초로 PCR을 통해 증폭하여, 서열번호 9의 중쇄 및 서열번호 11의 경쇄를 포함하는 Her2 scFv 염기서열을 얻었으며, 상기 메소텔린 scFv이 결합된 벡터의 제조방법과 동일한 방법으로 벡터와 삽입물의 결찰을 수행하여, 이를 pcDNA3.1 벡터의 Sfi1 enzyme site에 삽입하였다.
Her2 scFv 제조용 프라이머 서열
서열
Her2 scFv Forward primer 5’-GGCCCAGCCGGCCATGGAGGTTC AGCTGGTGGA-3’(서열번호 24)
Her2 scFv Reverse primer 5’-GGCCCTTGGTACCAAGGTGGAGATCAAA-3’(서열번호 25)
또한, CD19, MUC-1, EFGR 및 VEGFR scFv를 제조하기 위해 각 scFv의 아미노산 서열을 기초로 scFv에 대한 염기서열(서열번호 29의 중쇄 및 서열번호 31의 경쇄를 포함하는 CD19 scFv; 서열번호 33의 중쇄 및 서열번호 35의 경쇄를 포함하는 MUC-1 scFv; 서열번호 37의 중쇄 및 서열번호 39의 경쇄를 포함하는 EGFR scFv; 서열번호 41의 중쇄 및 서열번호 43의 경쇄를 포함하는 VEGFR scFv)을 합성하였으며, 상기 메소텔린 scFv이 결합된 벡터의 제조방법과 동일한 방법으로 벡터와 삽입물의 결찰을 수행하여, 이를 pcDNA3.1 벡터의 Sfi1 enzyme site에 삽입하였다.
CXCL16 및 퓨린 절단 부위는 하기 표 4의 프라이머 서열을 기초로 PCR로 증폭하여 벡터에 존재하는 면역글로불린 뒤 Not1 enzyme site를 이용하였다. 표적 항원을 인식하는 scFV가 삽입된 벡터에 Not1 효소로 2시간 분해시키고 정제를 한 후 벡터와 삽입물인 CXCL16 샘플을 리가아제 효소를 혼합하여 25℃에서 2시간 배양하여 벡터와 삽입물의 결찰을 수행했다.
CXCL16 및 퓨린 절단 부위 제조용 프라이머 서열
서열
CXCL16 , Furin cleavage site Forward primer 5’-CACACTGGCGGCCGCACGGGTGAAGCGGAACGAGGGCAG-3’(서열번호 26)
CXCL16 , Furin cleavage site Reverse primer 5’-AATCTCGAGCGGCCGCCTAAGGAAGTAAATGCTTCTGGTG-3’(서열번호 27)
제조된 발현벡터로 퓨린이 제거된 CHO (Chinese hamster ovary) 세포에 형질 전환시켜 융합 폴리펩티드 (NRP-body)를 대량 생산하였다. 상기 발현 벡터가 트랜스펙션된 CHO 세포를 150 mm 플레이트에서 배양하고, 회전병 (roller bottle) 배양기에서 72시간 배양하여 회수하였다. 회수한 배양액은 원심 분리 후 상층액만을 AKTA 단백질 정제 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)의 단백질 A-아가로오스 컬럼을 이용하여, 정제를 수행함으로써 융합 폴리펩티드를 생산하였다.
< 실시예 3> 융합 폴리펩티드의 항원에 대한 결합확인
췌장암 세포주인 Panc-1 세포 2 x 105 개에 상기 실시예 2에서 제조된 메소텔린 인식 융합 폴리펩티드 (Mesothlin scFV NRP-body) (0.1 - 2 ㎍/ml)을 분주하여 4℃에서 20분간 배양하였다. 그 후 세포를 회수하고 PBS로 세정한 뒤 FITC가 결합된 FC 항체 (1 ㎍/ml)를 분주하고 4℃에서 20분간 배양하였다. 그 후, 다시 세포를 회수한 후에, PBS로 세정하여 FACS로 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드 의 메소텔린 인식 부위를 통해, 췌장암 세포주 표면에 존재하는 메소텔린이 인식되어 세포 표면에 융합 폴리펩티드가 결합되는 것이 확인되었다.
또한, 항원인식부위가 상이하더라도 본원발명의 융합 폴리펩티드가 표적 세포주 표면에 결합되는 것을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제조된 PD-L1 scFv 융합 폴리펩티드 및 Her2 scFv 융합 폴리펩티드에 대해서도 상기 메소텔린 scFV 융합 폴리펩티드의 항원결합 실험과 동일한 조건으로 FACS 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 4(PD-L1 scFv NRP-body) 및 도 5(Her2 scFv NRP-body)에 나타내었다.
도 4 및 5에서 확인되는 바와 같이, PD-L1 scFv NRP-body 및 Her2 scFv NRP-body은 항원 인식 부위를 통해 각각 췌장암 세포주 표면에 존재하는 PD-L1 또는 Her2를 인식하여 세포 표면에 융합 폴리펩티드가 특이적으로 결합되는 것이 확인되었으며, 이를 통해 본 발명의 융합 폴리펩티드는 표적으로 하는 종양 관련 항원에 따라 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 달리 적용할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 4> CXCL16 방출 특성 확인
상기 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드 (NRP-body)의 퓨린 절단 부위가 암 세포주의 퓨린에 의해 절단되고, CXCL16가 방출되는지를 인간 CXCL16 ELISA를 통해 확인하였다.
CXCL16 ELISA는 R&D system의 Human CXCL16 ELISA 키트 (#DCX160)의 방법에 따라서 수행하였다. ELISA 분석에는 메소텔린 scFV 융합 폴리펩티드 (Mesothlin scFV NRP-body)를 96-웰 ELISA용 플레이트 (R&D)에 0.5 ㎍/mL, 50 ㎕/Well로 분주하여, 실온에서 2시간 방치하여 흡착시킨 것을 이용하였다. 상기 플레이트를 세정한 후, 2차 항체로서 퍼옥시다제 표지를 200 ㎕/well로 가하여 실온에서 2시간 방치하였다. 상기 플레이트를 Tween-PBS로 세정한 후, ABTS 기질액을 첨가하고, 발색시켜 OD 415 nm의 흡광도를 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 융합 폴리펩티드 (NRP-body)가 췌장암 세포주 Panc-1의 메소텔린에 결합되고 융합 폴리펩티드의 퓨린 절단 부위가 암 세포의 퓨린에 의해 절단되면서 CXCL16이 방출되는 것이 확인되었다.
< 실시예 5> 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의한 자연 살해 세포 이동능 (유입) 증진 확인
상기 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드가 타겟 항원을 발현하는 암을 인식해서 결합한 후 자연살해세포 유입 유도 단백질인 CXCL16이 방출되어 자연살해세포 유입이 증가되는지를 Boyden cahamber system을 이용하여 확인하였다.
HPDE, Panc-1(ATCC, Cat.CRL-1469), HCT116(ATCC, Cat.CCL-247), MCF7(ATCC, Cat.HTB-22) 및 HT-29(ATCC, Cat.HTB-38) 세포주를 2 x 105 개로 Boyden Chamber assay plate (Fisher Scientific, #07-200-155)의 bottom layer에 분주 후 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. 메소텔린 scFv-융합 폴리펩티드 1 ㎍/ml를 상기 각 세포주에 분주하고 37℃, CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 자연살해세포는 CFSE (BioLegend, #RUO 423801)로 라벨링하고, upper layer에 2 x 105 개로 분주하고 37℃, CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 그 후, Bottom layer 세포를 회수하고, FACS를 통해 CFSE-labling 자연살해세포의 분포를 확인하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, human expanded NK cell의 이동능이 메소텔린 scFV 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의해 증가됨이 확인되었으며, 나아가 암세포주의 종류에 따라 자연살해세포의 유입 증가정도가 상이함을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 2에서 제조된 PD-L1 scFv-융합 폴리펩티드 및 Her2 scFv-융합 폴리펩티드를 Panc-1, HT-29 또는 MCF7 세포주에 분주하여 상기 메소텔린 scFv-융합 폴리펩티드 실험과 동일한 조건으로 Boyden cahamber system를 통해 자연살해세포의 유입 증가를 확인하였으며, 그 결과를 도 8(Panc-1에 대한 PD-L1 scFV NRP-body), 도 9(HT-29에 대한 PD-L1 NRP-body), 도 10(Panc-1에 대한 Her2 NRP-body) 및 도 11(MCF7에 대한 Her2 scFV NRP-body)에 나타내었다.
도 8 내지 11에서 확인되는 바와 같이, 메소텔린 scFV-융합 폴리펩티드와 마찬가지로 human expanded NK cell의 이동능이 각 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의해 증가됨이 확인되었다.
또한, 상기 실시예 2에서 제조된 CD-19, MUC-1, EGFR 및 VEGFR scFv-융합 폴리펩티드를 HPDE, K562(ATCC, Cat.CCL-243), HCT116(ATCC, Cat.CCL-247), Panc-1(ATCC, Cat.CRL-1469) 또는 MCF7(ATCC, Cat.HTB-22) 세포주에 분주하여 상기 메소텔린 scFv 실험과 동일한 조건으로 Boyden cahamber system를 통해 자연살해세포의 유입 증가 여부를 확인하였으며, 그 결과를 각각 도 12(CD19 scFV NRP-body), 도 13(MUC-1 scFV NRP-body), 도 14(EGFR scFV NRP-body) 및 도 15(VEGFR scFV NRP-body)에 나타내었다.
도 12 내지 15에서 확인되는 바와 같이, human expanded NK cell의 이동능이 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의해 증가됨이 확인되었으며, 나아가 암세포주의 종류에 따라 자연살해세포 유입의 증가정도가 상이함을 확인하였다.
< 실시예 6> 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의한 자연살해세포의 침윤능 확인
상기 실시예 2에서 제조된 각 융합 폴리펩티드가 암세포에서 발현되는 타겟 항원을 인식해서 결합한 후 자연살해세포 유입 유도 단백질인 CXCL16이 방출되어 암세포에 대한 자연살해세포의 침윤능이 증가되는지를 침윤 분석(invasion assay)를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, HPDE, Panc-1, HCT116, MCF7, HT-29 및 K562 세포주를 2 x 105 개로 Boyden Chamber assay plate (Fisher Scientific, #07-200-155)의 bottom layer에 분주 후 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하고, 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드 1 ㎍/ml를 상기 각 세포주에 분주하였다. Upper layer에 matrigel (BD, #354234)을 처리 한 후, 자연살해세포 2 x 105 개로 분주하고 37℃, CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 그 후, Upper layer를 회수하고, 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)에 1시간 염색 후, upper layer를 임의적으로 3부분 촬영하여 image J program으로 자연살해세포의 침윤능을 측정하였다.
각 융합 폴리펩티드에 대한 결과를 각각 도 16 내지 24에 나타내었다.
도 16 내지 24에서 확인되는 바와 같이, human expanded NK cell의 침윤성이 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의해 증가됨이 확인되었으며, 나아가 암세포주의 종류에 따라 자연살해세포의 침윤능 증가정도가 상이함을 확인하였다.
< 실시예 7> 유입이 증가된 자연살해세포에 의한 암 세포주의 사멸 유도 확인
상기 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드에서 CXCL16이 방출된 후 유입이 증가된 자연살해세포에 의해 암 세포주의 사멸을 유도하는 ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) 효능을 확인하였다.
Panc-1 세포주 2 x 105 개를 96-웰 플레이트에 분주 후 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. 메소텔린 scFV-융합 폴리펩티드 1 ㎍/ml을 target cell에 처리 후 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. Target cell과 Effector cell의 비율이 1:1이 되도록 자연살해세포를 2 x 105 개로 첨가하고 37℃, CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 세포를 회수하고, PBS로 세정 후, Annexin V (1 ㎍/ml)와 PI (1 ㎍/ml)로 30분간 염색하고 FACS로 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에서 확인되는 바와 같이, CXCL16이 방출된 후 유입이 증가된 자연살해세포에 의해 암 세포의 사멸이 현저히 증가하였음이 확인되었다.
< 실시예 8> 암 이식 동물모델에서 융합 폴리펩티드의 치료 효능 확인
실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드를 암 이식 동물 모델에 주입하여 in vivo에서 효과를 확인하였다.
In vivo 실험을 위해 6주령 암컷 NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) 마우스를 사용하였다. 마우스 관리는 한국생명공학연구원의 실험동물자원센터의 Animal Care Committee에 의거하여 수행하였다. Panc-1을 마우스 췌장에 주입하여 2주간 종양을 형성하고, 메소텔린, PD-L1 또는 Her2 scFV 융합 폴리펩티드 (5 mg/kg)을 5일 간격으로 복강에 주입하였다.
종양 성장 (Tumor growth) 실험을 위해 자연살해세포를 1 x 107/마우스로 I.V 주입하였다. 종양성장 관찰은 IVIS Living Image 3.0 program을 이용하여 루시페라아제 (luciferase)를 발현하는 Panc-1의 성장을 관찰하였고, 자연살해세포의 이동능 실험은 DiR로 염색한 자연살해세포를 1x107/마우스로 정맥 투여하여 IVIS flourescence Image program 및 FACS로 관찰하였다.
그 결과를 도 26 내지 29에 나타내었다. 도 26은 상기 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드 및 자연살해세포의 투여에 따른 암 조직으로의 자연살해세포 유도를 나타낸 것이며, 도 27은 메소텔린 scFV NRP-body, 도 28은 PD-L1 scFV NRP-body 및 도 29는 Her2 scFV NRP-body를 자연살해세포와 함께 투여하여 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 26의 A에서 확인되는 바와 같이, NRP-body에 의해 자연살해세포의 암 조직으로의 유입이 크게 증가하였으며, 도 26의 B에서와 같이 이러한 작용 효과는 NRP-body의 첨가에 의해서만 일어났다.
또한, 도 27 내지 29에서 확인되는 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 융합 폴리펩티드를 자연살해세포와 함께 투여하는 경우, 종양 성장이 현저히 억제되었으며, 종양 조직 내로 자연살해세포의 이동이 크게 증가하였다.
상기 결과로부터 본 발명의 융합 폴리펩티드가 면역 세포 치료제인 자연살해세포의 유입을 증강시킴으로써 암 치료에 현저한 효과를 보임을 확인하였다.
< 실시예 9> CXCL16 처리에 따른 자연살해세포의 특성 변화 확인
자연살해세포가 융합 폴리펩티드에서 방출되는 CXCL16에 의해 변화되는 특성을 확인하기 위하여, 자연살해세포의 성장을 촉진하는 IL-2와 CXCL16을 함께 각각 200 U 및 100 nM의 농도로 0, 1, 2, 8 또는 16시간 처리하고, CD56dim 및 CD56bright의 분포를 FACS를 통해 확인하여 그 결과를 도 30에 나타내었으며, 오른쪽 상단의 사각형 내 세포들은 CD56bright 세포를 나타낸다.
도 30에서 확인되는 바와 같이, CXCL16 처리에 따른 시간 경과에 따라 CD56dim에서 CD56bright로 세포의 분포가 변화하는 것이 확인되었다.
또한, 위 실험 방법과 유사하게 장기간 (14일간) IL-2와 CXCL16을 동시에 처리 한 후 CD56의 발현 변화를 확인하여 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에서 확인되는 바와 같이, IL2 및 CXCL16을 같이 투여한 실험군(도 31 A의 IL-2+CXCL16, 도 31 B의 CXCL16)에서 CD56bright 세포로 변화가 확인되었다.
위 결과를 통해, CXCL16가 CD56dim를 ADCC (Antibody dependent cellular cytotoxicity) 효과가 큰 CD56bright로 변화시킴으로써 자연살해세포의 특성에 영향을 미치는 것이 확인되었다.
< 실시예 10> 융합 폴리펩티드( NRP -body)처리에 따른 자연살해세포의 특성 변화
CXCL16에 의해 변화된 자연살해세포의 분포에 따라 암세포의 사멸을 유도하는 ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) 효능 변화를 확인하였다.
Panc-1 세포주 2 x 105 개를 96-웰 플레이트에 분주 후 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. Target cell과 Effector cell의 비율이 1:1이 되도록 자연살해세포를 2 x 105 개로 첨가하고 37℃, CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 세포를 회수한 후, PBS로 세정 후 Annexin V (1 ㎍/ml)와 PI (1㎍/ml)로 30분간 염색하고 FACS로 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 32에 나타내었다.
도 32에서 확인되는 바와 같이, 융합폴리펩티드의 CXCL16에 의해 증가된 CD56bright CD16+ 자연살해세포에 의해 암세포의 사멸이 증가하였음이 확인되었다.

Claims (16)

  1. 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    링커; 및
    CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 메소텔린 (Mesothelin), PD-L1 (Programmed death-ligand 1), Her2 (human EGFR-related 2), CD19, MUC1, EGFR, VEGFR, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, 4-1BB, 5T4, AGS-5 또는 AGS-16으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 융합 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)인 융합 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 링커는 퓨린 절단 부위를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 퓨린 절단 부위는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 CXCL16은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  8. 제7항에 따른 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  9. 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주로부터 선택되는 어느 하나인, 숙주 세포.
  11. 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    링커; 및
    CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항원은 메소텔린, PD-L1, Her2, CD19, MUC1, EGFR, VEGFR, B7H1, B7H2, B7H3, BT-062, BTLA, CAIX, 4-1BB, 5T4, AGS-5 또는 AGS-16으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 유방암, 전립선암, 위암, 간암 또는 폐암으로부터 선택되는 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 링커는 퓨린 절단 부위를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 CXCL16은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 종양 관련 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 링커; 및 CXCL16의 자연살해세포 유도 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드; 및
    자연살해세포 (Natural killer cell)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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