ES2992413T3

ES2992413T3 - Haploidizacion en sorgo

Info

Publication number: ES2992413T3
Application number: ES18708396T
Authority: ES
Inventors: Monika Kloiber-Maitz; Silke Wieckhorst; Christof Bolduan; Milena Ouzunova
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2024-12-12
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CL2019002439A1; EP3589737B1; US20230279415A1; EA201991923A1; US11661607B2; CN110546266A; EP3589737A1; CA3054855A1; EP3366778A1; UA127680C2; PE20191361A1; BR112019017802A2; US20190390213A1; CL2020002415A1; AR111006A1; WO2018158301A1

Abstract

La invención se refiere a plantas de Sorghum bicolor que, gracias a modificaciones del genoma relacionadas con una expresión específica del polen de la fosfolipasa de patatina, son capaces de inducir la haploidía, produciendo así una progenie haploide, y en un corto período de tiempo se pueden producir líneas endogámicas, es decir, líneas parentales paternas y maternas homocigóticas mediante duplicación cromosómica para la cría híbrida. La invención también se refiere a métodos para producir inductores haploides de plantas transgénicas y no transgénicas y para mejorar el poder de inducción de las plantas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Haploidizacion en sorgo

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la simplificación de programas de cultivo intensivos en mano de obra utilizando procedimientos biológicos moleculares, tecnología de marcadores e ingeniería genética. En particular se proporcionan plantas de sorgo mijo que son capaces de inducir haploidía mediante modificaciones en el genoma que implican una fosfolipasa patatina expresada preferentemente de manera específica para el polen, por lo que se puede generar progenie haploide y líneas endogámicas para la cría híbrida en poco tiempo mediante la duplicación cromosómica. Especialmente se proporcionan plantas de sorgo mijo que tienen mutaciones en la fosfolipasa patatina, procedimientos para la generación e identificación de estas mutaciones o de la planta mutada y la correspondiente molécula de ácido nucleico que codifica la fosfolipasa patatina mutada, así como vectores y células huésped, en particular células vegetales que contienen la molécula de ácido nucleico, y plantas generadas a partir de dichas células vegetales que son capaces de generar haploidía, así como su progenie, productos de cruzamiento, líneas endocriadas y sus respectivas partes y productos vegetales.

Basándose en los hallazgos del sorgo, la presente invención proporciona procedimientos para generar e identificar inductores de haploides vegetales transgénicos y no transgénicos, así como las plantas correspondientes a las que se ha dotado de la propiedad de inducción de haploidía o cuya capacidad de inducción se ha mejorado. Además, la invención también incluye semillas o progenie, órganos, partes de plantas, tejidos o células de la planta según la invención y el uso de estos.

Antecedentes de la invención

El sorgo es un cultivo relativamente nuevo en Alemania, pero debido a su crecimiento masivo, tolerancia a la sequía y buena eficiencia hídrica y de nutrientes, se está convirtiendo en el centro de atención de la ciencia y la práctica en la búsqueda de otros cultivos de alto rendimiento para la generación de sustratos, en particular con respecto a su uso en la generación de biogás, pero también para su uso como pienso animal, alimento y para la generación de etanol. Los objetivos generales de cultivo del sorgo son la adaptación al clima de Europa Central, es decir, la mejora de la tolerancia al frío, la mejora del rendimiento, la estabilidad unida a un buen desarrollo juvenil y el desarrollo de la resistencia a enfermedades y plagas.

Al igual que un cultivo que se fecunda a sí mismo, el sorgo puede mejorarse por medio de cría. La mejora de la población puede lograrse mediante una cría por selección elaborada, seleccionando las mejores plantas para la generación de semillas para el siguiente año de cultivo. Además, la cría de híbridos ha creado nuevas posibilidades para mejorar las variedades. Sin embargo, el proceso de cría de híbridos se basa en la generación de líneas homocigóticas de padre y madre a lo largo de varias generaciones, lo que significa que el proceso de cría de híbridos también requiere mucho tiempo y dinero a pesar de los buenos resultados.

En el documento WO2016/177887A1 se describe un polipéptido aislado que es responsable de la inducción de haploide en plantas de maíz.

El documento WO2016/075255A1 se refiere al suministro de medios técnicos tales como ácidos nucleicos que, tras la transcripción o tras la expresión en una planta, son adecuados para impartir la propiedad de un inductor de haploide o para aumentar la capacidad de inducción de un inductor de haploide.

La publicación de Gilles et al (2014) describe que la pérdida de la fosfolipasa NOT LIKE DAD específica del polen desencadena la ginogénesis en el maíz.

En La publicación de Kelliher et al. (2017) se describe la inducción de haploides en maíz por la fosfolipasa MATRII,INEAL.

La publicación de Liu et al. (2017) se refiere a la inducción de haploides en maíz mediante una inserción de 4 pb en ZmPLA1 que codifica una fosfolipasa A putativa.

El objetivo de la presente invención era, por lo tanto, proporcionar un sistema eficiente para la cría de sorgo.

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con el campo de la simplificación de programas de cría intensivos en mano de obra, la tecnología de marcadores y la ingeniería genética. La invención proporciona plantas de sorgo mijo que son capaces de inducir haploidía mediante modificaciones en el genoma que implican una fosfolipasa patatina expresada específica del polen, por lo que se genera progenie haploide y líneas endogámicas, es decir, líneas homocigóticas de padre y madre, para la cría de híbridos en poco tiempo mediante la duplicación cromosómica. Además, los descubrimientos pueden utilizarse para generar inductores de haploides vegetales transgénicos y no transgénicos o para mejorar la capacidad de inducción de las plantas.

En primer lugar, a continuación se explican con más detalle algunos de los términos utilizados en la presente solicitud:

“ Impartir la propiedad de un inductor de haploide” o “ impartición de la propiedad de un inductor de haploide” o “ser capaz de inducir haploidía” o una expresión comparable significa que una planta, mediante el uso de un ácido nucleico según la invención o modificando el genoma, especialmente mutando una fosfolipasa patatina, es capaz de generar semillas fecundadas o embriones que tienen un único juego de cromosomas (haploide) a partir de un cruce con una planta del mismo género, preferentemente de la misma especie, que no tiene la propiedad de un inductor de haploide. La propiedad de un inductor de haploide, expresada como tasa absoluta de inducción de haploide, significa que al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,3%, el 0,4%, el 0,5%, el 0,6%, el 0,7%, el 0,8%, el 0,9% o el 1%, preferentemente al menos el 1,5%, el 2%, el 2,5%, el 3%, el 3,5%, el 4%, el 4,5% o el 5%, de modo particularmente preferible al menos el 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%, o más preferiblemente al menos el 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de las semillas fecundadas o embriones tienen un conjunto cromosómico haploide.

Por “fragmento funcional” de una secuencia de nucleótidos se entiende un segmento de una secuencia de nucleótidos que tiene una funcionalidad idéntica o comparable a la secuencia de nucleótidos total de la que procede el fragmento funcional. Como tal, el fragmento funcional puede tener una secuencia de nucleótidos que es idéntica u homóloga a la secuencia total de nucleótidos en una longitud de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% o 99%. Además, un “fragmento funcional” de una secuencia de nucleótidos también puede significar un segmento de una secuencia de nucleótidos que altera la funcionalidad de toda la secuencia de nucleótidos, por ejemplo en el curso del silenciamiento génico postranscripcional o transcripcional. Como tal, el fragmento funcional de una secuencia de nucleótidos puede comprender al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, preferiblemente al menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 o 140, de modo particularmente preferible al menos 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos total.

Una “parte funcional” de una proteína significa un segmento de una proteína o una sección de la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína, en cuyo caso el segmento puede realizar una funcionalidad idéntica o comparable a la proteína total en una célula vegetal. Una parte funcional de una proteína tiene, en una longitud de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94% 96%, 97%, 98% o 99%, una secuencia de aminoácidos idéntica o, teniendo en cuenta las sustituciones de aminoácidos conservativas y semiconservativas, similar a la proteína de la que se deriva la parte funcional.

“ Inductor de haploide” también significa un inductor de haploidein vivo.

El término “heterólogo” significa que el polinucleótido introducido procede, por ejemplo, de una célula o un organismo con un fondo genético diferente de la misma especie o de una especie diferente, o es homólogo a la célula huésped procariota o eucariota, pero se localiza en un entorno genético diferente y, por lo tanto, difiere de cualquier polinucleótido correspondiente presente de forma natural. Un polinucleótido heterólogo puede estar presente además de un gen endógeno correspondiente.

Por “hibridar” o “hibridación” se entiende un procedimiento en el que una molécula de ácido nucleico monocatenario se une a una cadena de ácido nucleico en gran medida complementaria, es decir, se empareja con ella a través de las bases. Los procedimientos estándar para la hibridación se describen, por ejemplo, en la publicación de Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Preferentemente se entiende que al menos el 80% u 85%, preferentemente al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95%, de modo particularmente preferible al menos el 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de la molécula de ácido nucleico forman un emparejamiento de bases con la cadena de ácido nucleico ampliamente complementaria. La posibilidad de dicho acoplamiento depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones de hibridación. Se habla de alta rigurosidad cuando el emparejamiento de bases es más difícil, y de baja rigurosidad cuando el emparejamiento de bases es más fácil. La rigurosidad de las condiciones de hibridación depende, por ejemplo, de la concentración de sal o de la fuerza iónica y de la temperatura. En general, la rigurosidad puede incrementarse aumentando la temperatura y/o disminuyendo el contenido de sal. El término “condiciones de hibridación rigurosas” se refiere a condiciones en las que la hibridación se genera predominantemente solo entre moléculas de ácido nucleico homólogas y los homólogos. El término “condiciones de hibridación” se refiere no solo a las condiciones que prevalecen durante la unión real de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones que prevalecen durante los pasos de lavado posteriores. Las condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo, condiciones en las que predominantemente solo hibridan aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de identidad de secuencia. Las condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo: hibridación en 4 * SSC a 65°C seguida de múltiples lavados en 0,1 * SSC a 65°C durante un total de aproximadamente 1 hora. El término “condiciones de hibridación rigurosas” utilizado aquí también puede significar: hibridación a 68°C en fosfato sódico de 0,25 M, pH 7,2, SDS al 7%, EDTA de 1 mM y BSA al 1% durante 16 horas, seguida de dos lavados con 2 * SSC y SDS al 0,1% a 68°C. La hibridación se realiza preferentemente en condiciones rigurosas.

“Aumentar la capacidad de inducción de un inductor de haploide” o “el aumento de la capacidad de inducción de un inductor de haploide” o expresiones comparables significan que se aumenta la tasa de inducción de haploide de una planta que tiene la propiedad de un inductor de haploide. Así, el número de semillas fecundadas que tienen un juego cromosómico haploide y que resultan de un cruce del inductor de haploide con una planta del mismo género, preferentemente de la misma especie, que no tiene la propiedad de un inductor de haploide, puede aumentarse al menos en un 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% o 1%, preferentemente al menos 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% o 5%, y de modo particularmente preferible al menos 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% o 50% superior al número de semillas haploides fecundadas que se logra sin la utilización del ácido nucleico o sin modificación del genoma, especialmente sin mutación de una fosfolipasa patatina en el sentido de la presente invención; es decir la tasa de inducción de haploide puede aumentarse al menos en un 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% o 1%, preferentemente al menos en un 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% o 5%, y de modo particularmente preferible al menos en un 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% o 50% en relación con la tasa de inducción de haploide alcanzada anteriormente.

Secuencia de nucleótidos “complementaria” significa, en relación con un ácido nucleico en forma de ADN bicatenario, que la segunda cadena de ADN complementaria de la primera cadena de ADN tiene, según las reglas de emparejamiento de bases, los nucleótidos correspondientes a las bases de la primera cadena según las reglas de Watson-Crick.

Un “marcador molecular” es un ácido nucleico que es polimórfico en una población vegetal y se utiliza como punto de referencia o de orientación. Un marcador para detectar un evento de recombinación debe ser adecuado para controlar diferencias o polimorfismos dentro de una población vegetal. Así, un marcador de este tipo es capaz de detectar y distinguir entre diferentes estados alélicos (alelos). El término “marcador molecular” también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias o al menos en gran medida complementarias u homólogas a secuencias genómicas, por ejemplo ácidos nucleicos, que se utilizan como sondas o cebadores. En el caso de los marcadores, estas diferencias se encuentran a nivel del ADN y son, por ejemplo, diferencias de secuencias polinucleotídicas como SSR (repeticiones de secuencias simples), RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción), FLP (polimorfismos de longitud de fragmentos) o SNP (polimorfismos de nucleótido único). Los marcadores pueden derivarse de ácidos nucleicos genómicos o expresados, como ARN empalmado, ADNc o EST, y también pueden referirse a ácidos nucleicos que se utilizan como sondas o pares de cebadores y, como tales, son adecuados para amplificar un fragmento de secuencia utilizando procedimientos basados en la PCR. Los marcadores que describen polimorfismos genéticos (entre partes de una población) pueden detectarse utilizando procedimientos bien establecidos en el estado de la técnica (An Introduction to Genetic Analysis. 7a edición, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Entre ellos se incluyen, por ejemplo, la secuenciación del ADN, la amplificación específica de secuencias basada en PCR, la detección de RFLP, la detección de polimorfismos polinucleotídicos mediante hibridación alelo-específica (ASH), la detección de secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, la detección de 3SR (replicación de secuencias autosostenida), la detección de SSR, SNP, RFLP o AFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados). También se conocen procedimientos para la detección de EST (etiquetas de secuencia expresada) y marcadores SSR derivados de secuencias e St y RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente). Dependiendo del contexto, el término marcador en la descripción también puede significar una posición cromosómica específica en el genoma de una especie donde se puede encontrar un marcador específico (por ejemplo, SNP).

“Enlazado operativamente” significa unido en una molécula de ácido nucleico común de tal manera que los elementos unidos están posicionados y orientados uno con respecto al otro de tal manera que puede tener lugar una transcripción de la molécula de ácido nucleico. Un ADN que está operativamente enlazado a un promotor está bajo el control transcripcional de este promotor

Una “planta” en el sentido de la invención puede ser de cualquier especie de las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, a menos que se especifique lo contrario. Se prefieren las plantas agrícolas u hortícolas o para la generación de bioenergía (bioetanol, biogás, etc.). Algunos ejemplos sonSolanum tuberosum, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum spelta, Helianthus annuus, Secale cereale, Hordeum vulgare, Hordeum bulbosum, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Glycine max, Gossypium sp, Sorghum bicolor, Sorghum sudanense, Sorghum bicolor * Sorghum sudanense, Triticale, Saccharum officinarium, Setaria italica, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Musa sp., Avena sp, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpaoBeta vulgaris.

Una planta de sorgo mijo según la invención es una planta del géneroSorghum,en particular de las especiesSorghum bicolor, Sorghum sudanense, Sorghum bicolor*Sorghum sudanense, Sorghum*almum (Sorghumbicolor*Sorghum halepense), Sorghum arundinaceum, Sorghum*drummondii, Sorghum halepensey/oSorghum propinquumo sus híbridos y todas las variedades derivadas de los mismos.

Por “órganos” vegetales se entienden, por ejemplo, las hojas, el eje del brote, el tallo, las raíces, las yemas vegetativas, los meristemos, los embriones, las anteras, los óvulos, las semillas o los frutos, en particular las semillas. El término “parte de la planta” o “partes de la planta” incluye, entre otros, el eje del brote o tallo, las hojas, las flores, las inflorescencias, las raíces, los frutos y las semillas, así como el polen. También se entiende por “partes” vegetales un conjunto de varios órganos, por ejemplo, una flor o una semilla, o una parte de un órgano, por ejemplo, una sección transversal del eje del brote. Los “tejidos” vegetales son, por ejemplo, el tejido calloso, el tejido de almacenamiento, el tejido meristemático, el tejido foliar, el tejido de brote, el tejido radicular, el tejido tumoral vegetal o el tejido reproductivo, así como el tejido de formación, el tejido de base (el denominado parénquima), el tejido de conducción, el tejido reafirmante y el tejido de recubrimiento (la denominada epidermis). Sin embargo, el tejido no está limitado por esta lista. Las “células” vegetales son, por ejemplo, células aisladas con pared celular o sus agregados o protoplastos.

Un “promotor” es un segmento de ADN no traducido, normalmente en dirección ascendente de una región codificante, que contiene el sitio de unión para la ARN polimerasa e inicia la transcripción del ADN. Un promotor también contiene otros elementos que actúan como reguladores de la expresión génica (por ejemplo, elementos cis-reguladores). Un “promotor de núcleo o mínimo” es un promotor que tiene al menos los elementos básicos necesarios para el inicio de la transcripción (por ejemplo, la caja TATA y/o el iniciador).

En el contexto de la presente invención, el término “modificaciones” se refiere a una secuencia de nucleótidos que influye en la especificidad y/o el nivel de expresión, por ejemplo por el hecho de que la secuencia reguladora imparte una determinada especificidad tisular. Dicha secuencia reguladora puede estar situada en dirección ascendente del punto de inicio de la transcripción de un promotor mínimo, pero también en dirección descendente del mismo, por ejemplo en una secuencia líder transcrita pero no traducida o dentro de un intrón.

Una “planta transgénica” se refiere a una planta en cuyo genoma se integra al menos un polinucleótido, preferiblemente un polinucleótido heterólogo. Preferiblemente, el polinucleótido está integrado de forma estable, lo que significa que el polinucleótido integrado se mantiene de forma estable en la planta, se expresa y también puede ser heredado de forma estable por la progenie. La introducción estable de un polinucleótido en el genoma de una planta también incluye la integración en el genoma de una planta de la generación parental anterior, por lo que el polinucleótido puede transmitirse de forma estable. El término “heterólogo” significa que el polinucleótido introducido procede, por ejemplo, de una célula o un organismo con un fondo genético diferente de la misma especie o de una especie diferente, o es homólogo a la célula huésped procariota o eucariota, pero se localiza en un entorno genético diferente y, por tanto, difiere de cualquier polinucleótido correspondiente eventualmente presente de forma natural. Un polinucleótido heterólogo puede estar presente además de un gen endógeno correspondiente.

“Adecuado para su uso como inductor de haploide” o “capaz de inducir haploidía” significa que una planta es capaz de generar semillas fecundadas que tengan un único juego de cromosomas (haploide) a partir de un cruce con una planta del mismo género, preferiblemente de la misma especie, que no tenga la propiedad de inductor de haploide. El uso como inductor de haploide, expresado como tasa absoluta de inducción e dhaploide, significa que al menos el 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% o 1%, de modo preferible al menos el 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5% o 5%, 5% o 5%, de modo particularmente preferible al menos 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%, o más preferiblemente al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de las semillas fertilizadas tienen un conjunto cromosómico haploide.

Las configuraciones y formas de realización de la presente descripción se describen a modo de ejemplo con referencia a las figuras y secuencias adjuntas:

Figura 1: Alineación de secuencias (CLUSTAL O 1.2.4) de las secuencias de aminoácidos de la fosfolipasa patatina de tipo silvestre del sorgo mijo (Sorghum_PPL_AA, SEQ ID No.: 3), la fosfolipasa patatina del sorgo mijo con una sustitución del aminoácido arginina (R) por glutamina (Q) en la posición de aminoácido 59 (Sorghum_PPL_R59Q, SEQ ID No.: 6), la fosfolipasa patatina de sorgo mijo con una sustitución del aminoácido valina (V) por isoleucina (I) en la posición de aminoácido 162 (Sorghum_PPL_V162I, SEQ ID No.: 9), la fosfolipasa patatina de sorgo mijo con una sustitución del aminoácido serina (S) por leucina (L) en la posición de aminoácido 291 (Sorghum _PPL_S291L, SEQ ID No.: 12) y la fosfolipasa patatina de sorgo mijo con una sustitución del aminoácido glutamina (Q) por un codón de parada en la posición de aminoácido 372 (Sorgo _PPL_Q372Stopp, SEQ ID No.: 15). Las posiciones de aminoácidos 59, 162 y 291 están resaltadas en negro.

Figura 2: Alineación de secuencias (CLUSTAL O 1.2.4) de las secuencias de aminoácidos de la fosfolipasa patatina de tipo silvestre de sorgo mijo (Sorghum bicolor_PPL_AA, SEQ ID No.: 3), la fosfolipasa patatina de cebada (Hordeum vulgare_PPL_AA, SEQ ID No.: 21), la fosfolipasa patatina del girasol (Helianthus annuus_PPL_AA, SEQ ID No.: 18), la fosfolipasa patatina 1 de la remolacha azucarera (Beta vulgaris_PPL1_AA, SEQ ID No.: 24) y la fosfolipasa patatina 2 de la remolacha azucarera (Beta vulgaris _Phospholipase2_AA, SEQ ID No.: 27). Las posiciones de aminoácidos que representan el dominio funcional de la fosfolipasa están en negrita.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una planta del género sorgo, en lo sucesivo también denominada planta de sorgo mijo, que es capaz de inducir haploidía. Esta propiedad de inducción de haploide permite a la planta generar semillas fecundadas o embriones, que tienen un único juego de cromosomas (haploide), a partir de un cruce con una planta del mismo género, preferentemente de la misma especie, que no tiene la propiedad de inductor de haploide. Este sistema permitió a los inventores proporcionar un sistema eficaz para la cría de plantas de sorgo mijo, ya que la duplicación cromosómica en la progenie haploide puede generar líneas endocriadas, es decir, líneas homocigóticas de padre y madre para la cría de híbridos.

Las plantas de sorgo mijo según la invención se caracterizan porque tienen una o más modificaciones que afectan a la fosfolipasa patatina, por lo que se imparte la propiedad para la inducción de haploide o también se mejora una capacidad naturalmente presente para la inducción de haploide o se aumenta la capacidad de inducción. Así, la modificación relativa a la fosfolipasa patatina es causal de la idoneidad de la planta de sorgo mijo según la invención como inductor de haploide en programas de cría.

Las plantas se caracterizan por tener una tasa de inducción preferiblemente de al menos 0,5% y, por lo tanto, difieren de las plantas de tipo silvestre o de los inductores no haploides.

En los experimentos llevados a cabo en el contexto de la presente invención se estableció que la fosfolipasa patatina se expresa en el sorgo mijo de forma específica para el polen y, por lo tanto, presumiblemente influye en el crecimiento del tubo polínico o en la interacción entre gametofitos. Así pues, la planta de sorgo mijo se caracteriza preferentemente porque la fosfolipasa patatina se expresa de manera específica para el polen y/o tiene una influencia en el crecimiento del tubo polínico o la interacción entre los gametofitos.

La fosfolipasa patatina está codificada por la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No.: 1 o 2 o está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, aún más preferiblemente 95% y de modo más preferible 99% idéntica a SEQ ID No.: 1 o 2, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No.: 1 o 2 en condiciones rigurosas, en cuyo caso las condiciones rigurosas corresponden a hibridación en 4 * SSC a 65°C seguida de múltiples lavados en 0,1 * SSC a 65°C durante un total de aproximadamente 1 hora; o comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No.: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID No.: 3. Como se ha mencionado anteriormente, la planta de sorgo mijo en el sentido de la presente invención comprende plantas de cualquier especie del género Sorghum, en particular las especiesSorghum bicolor, Sorghum sudanenseySorghum bicolor*Sorghum sudanenseo sus híbridos y todas las variedades derivadas de las mismas. Por consiguiente, es razonable suponer que la secuencia de nucleótidos y, en consecuencia, la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa patatina han cambiado en el curso de la especiación y la cría de variedades. En este contexto, el término homólogo significa que los genes en cuestión (de dos especies o variedades de plantas diferentes) tienen esencialmente la misma función y un precursor común, y por lo tanto muestran típicamente una identidad significativa en su secuencia de ácido nucleico o de aminoácido codificado, que es preferiblemente al menos del 80%.

En el sentido de la descripción, por “homólogo” se entiende una proteína del mismo origen filogenético, por “análogo” se entiende una proteína que realiza la misma función pero tiene un origen filogenético diferente, por “ortólogo” se entiende una proteína de una especie diferente que realiza la misma función y por “parálogo” se entiende una proteína que ha surgido por duplicación dentro de una especie, en cuyo caso esta copia conserva la misma función proteica, cambia su patrón de expresión pero no cambia la función, su función proteica o divide la función del gen original entre las dos copias.

Una proteína codificada (o secuencia de aminoácidos) es en principio un homólogo en el sentido de la presente descripción si realiza la misma función, independientemente de si tiene el mismo o diferente origen filogenético o procede de la misma o diferente especie. Además, un homólogo puede complementar la propiedad de inducción de haploide, es decir, conferir la propiedad de un inductor de haploide o aumentar la capacidad de inducción de un inductor de haploide modificando el producto génico codificado por el homólogo de la planta de la que procede el gen. En consecuencia, el homólogo pertinente de la fosfolipasa patatina codificado por la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No.: 1 o 2 o que comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 3 puede caracterizarse preferentemente en que es capaz de complementar la propiedad de un inductor de haploide observada en la planta de sorgo mijo según la invención. Adicional o alternativamente, el homólogo de fosfolipasa patatina puede caracterizarse preferentemente en que la modificación del producto génico codificado por el homólogo confiere la propiedad de un inductor de haploide o aumenta el poder inductor de un inductor de haploide.

Las técnicas y procedimientos correspondientes para la genética de complementación en sorgo son conocidas por el experto en la materia por el estado de la técnica, por ejemplo, por la publicación de Li et al, J Genet. 94 (2015), 445-452, en la que el fenotipo de sorgo caracterizado por una nervadura central marrón y causado por una mutación puntual en el gen bmr-6 se complementó introduciendo el gen wildtpy-bmr-6.

Como se muestra en el Ejemplo 2, una sustitución de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa patatina de sorgo mijo (SEQ ID No.: 3) en el sorgo mijo conduce a una tasa de inducción de haploide de más del 1,5% en algunos casos. Cabe suponer que otras sustituciones de aminoácidos, que conduzcan a una modificación adicional de la secuencia codificante de la fosfolipasa patatina, pueden dar lugar a un aumento adicional de la tasa de inducción. Por lo tanto, las plantas de sorgo mijo que tienen una o más modificaciones o mutaciones que afectan a la fosfolipasa patatina están incluidas en la presente invención.

Las modificaciones mencionadas que afectan a la fosfolipasa patatina se caracterizan en el sentido de la presente invención en que son mutaciones que, en el gen endógeno que codifica la fosfolipasa patatina, conducen a una o más sustituciones de aminoácidos en la región de las posiciones de aminoácidos 55-75, 157 167 o 285-298 según SEQ ID No.: 3.

Una mutación significa una modificación a nivel del ADN, es decir, un cambio en la genética y/o epigenética. Por ejemplo, un cambio en la genética puede ser la sustitución de al menos una nucleobase en la secuencia de<a>D<n>endógena o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógena. Si dicha sustitución de nucleobase tiene lugar, por ejemplo en un promotor, esto puede conducir a una actividad alterada del promotor, ya que, por ejemplo, los elementos cis-reguladores se modifican de tal manera que la afinidad de un factor de transcripción por el elemento cis-regulador mutado se altera en comparación con el promotor de tipo silvestre, de modo que la actividad del promotor con el elemento cis-regulador mutado aumenta o disminuye, dependiendo de si el factor de transcripción es represor o inductor o de si la afinidad del factor de transcripción por el elemento cis-regulador mutado se refuerza o se debilita. Si tal sustitución de nucleobases tiene lugar, por ejemplo, en una región codificante de la secuencia de ADN endógena, esto puede conducir a una sustitución de aminoácidos en la proteína codificada, lo que puede provocar un cambio en la actividad o estabilidad de la proteína en comparación con la proteína de tipo silvestre. Otro ejemplo de cambio en la genética es la deleción de nucleótidos en la secuencia reguladora y/o en la secuencia de ADN endógena, así como la adición de nucleótidos en la secuencia reguladora y/o en la secuencia de ADN endógena. Un cambio en la epigenética puede ocurrir, por ejemplo, a través de un patrón de metilación alterado del ADN.

Los procedimientos para mutagenizar secuencias de ADN se describen con más detalle en relación con el procedimiento para obtener un inductor de haploide vegetal.

Dado que las mutaciones descritas conducen a un cambio o acortamiento de la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa patatina, puede suponerse que las mutaciones cambian, es decir, aumentan o reducen, la actividad o estabilidad de la fosfolipasa patatina codificada por la secuencia de ADN endógena en la planta de sorgo mijo en comparación con una planta de tipo silvestre.

En el caso de las mutaciones, la actividad de la proteína puede incrementarse, por ejemplo optimizando la secuencia, o puede igualmente inhibirse o perderse. Las mutaciones en la región promotora también pueden provocar un cambio en la expresión del gen.

Con referencia a la presente invención, la actividad biológica de la fosfolipasa patatina puede modificarse en consecuencia mediante la mutación descrita, con el efecto de que su función original en el polen ya no se realice en la misma medida que en la planta de sorgo de tipo silvestre.

Esto puede suceder por sobreexpresión del gen unida a una mayor actividad y cantidad de la proteína, por ejemplo mediante mutaciones en la región promotora, mediante el aumento de la estabilidad de la proteína, o mediante la formación de una forma más activa de la fosfolipasa patatina, por ejemplo mediante sustituciones de aminoácidos en el dominio funcional, lo que podría conducir, por ejemplo, a un crecimiento más rápido del tubo polínico, a un desacoplamiento del transporte de las células generativas en el tubo polínico con su crecimiento o a una interacción perturbada de los gametofitos seguida de una fecundación incompleta con la consiguiente eliminación de cromosomas. Por otra parte, la sobreexpresión del gen también podría inhibir, impedir o reducir la correcta formación, el plegamiento y/o la estabilidad de la fosfolipasa patatina. Sin embargo, la formación reducida o la no formación de una fosfolipasa patatina funcional, por ejemplo debido a mutaciones en la región promotora, también podría conducir a la formación de una forma menos activa, inactiva o inestable de fosfolipasa patatina, por ejemplo debido a sustituciones de aminoácidos en el dominio funcional, lo que a su vez también podría conducir a una fecundación defectuosa. La localización de la fosfolipasa patatina también podría verse alterada por las mutaciones descritas, de modo que ya no se exprese de forma específica para el polen, por ejemplo.

En consecuencia, la presente invención también incluye plantas de sorgo mijo que tienen una o más inserciones de un casete de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica la fosfolipasa patatina caracterizada por la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No. 1o 2 o por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% y lo más preferiblemente un 99% idéntica a SEQ ID No.: 1o 2, o que comprende una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No.: 1 o 2 en condiciones rigurosas, en cuyo caso las condiciones rigurosas corresponden a hibridación en 4 * SSC a 65°C y lavados múltiples posteriores en 0,1 * SSC a 65°C durante un total de aproximadamente 1 hora, o que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la fosfolipasa patatina con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 3, o una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID No.: 3 en al menos 80%, en cuyo caso la fosfolipasa patatina codificada o parte funcional de la misma tiene una o más mutaciones que dan lugar a una o más sustituciones de aminoácidos y por lo tanto proporcionan una sobreexpresión del gen que codifica la fosfolipasa patatina en una planta o parte de la misma en comparación con una planta de tipo silvestre o parte correspondiente de la misma.

Como se muestra en el Ejemplo 2, la sustitución del aminoácido arginina por glutamina en la posición de aminoácido 59 según la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa patatina mostrada en SEQ ID No.: 6 o la sustitución del aminoácido valina por isoleucina en la posición de aminoácido 162 según la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa patatina mostrada en SEQ ID No.: 9 en plantas de sorgo mijo da como resultado una tasa de inducción de haploide superior al 0,5%. Puede observarse en la Fig. 2 que estas posiciones de aminoácidos se localizan en el dominio funcional de la fosfolipasa patatina, que corresponde al intervalo de posiciones de aminoácidos 37 a 240.

Así, la presente invención proporciona plantas de sorgo mijo que tienen una o más mutaciones que dan lugar a una sustitución de aminoácidos en la región de las posiciones de aminoácidos 55-75 o 157-167 según SEQ ID No.:3.

Además, una sustitución del aminoácido serina por leucina en la posición de aminoácido 291 según la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa patatina mostrada en SEQ ID No.: 12 en plantas de sorgo mijo conduce a una tasa de inducción de haploide de más del 1,5%.

Mediante la Fig. 2 puede reconocerse que esta posición está fuera del dominio funcional de la fosfolipasa patatina.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona plantas de sorgo mijo que tienen una o más mutaciones que conducen a una sustitución de aminoácidos en la región de las posiciones de aminoácidos 285-298 según SEQ ID No.: 3, que preferiblemente corresponde a una región fuera del dominio funcional de la fosfolipasa patatina.

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, la planta según la invención se caracteriza en que la una o más mutaciones conducen a una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácidos 59, 162 y/o 291 según SEQ ID No.: 3.

En este contexto, en una forma de realización de la presente invención, la fosfolipasa patatina modificada comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SEQ ID No.: 3, en la que está presente al menos una sustitución de aminoácidos, en cuyo caso en la posición 59 arginina (R), en la posición 162 valina (V), y/o en la posición 291 serina (S) se intercambia por otro aminoácido, preferentemente por glutamina (Q) en la posición 59, isoleucina (I) en la posición 162 y/o leucina (L) en la posición 291; o se codifica por una secuencia de nucleótidos según SEQ ID No. 1 que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN según SEQ ID No.: 1 o una secuencia de ADN que es al menos 80% idéntica a SEQ ID No.: 1, en la que está presente al menos una sustitución de nucleótidos, dando lugar a una sustitución de aminoácidos, en el que en las posiciones 421-423, 815-817, 1420-1422 y/o 1663-1665 según SEQ ID No.: 1 (correspondientes a las posiciones nucleotídicas 175-177, 484 486, 871-873 y/o 1114-1116 de SEQ ID No.: 2) se intercambian uno o más nucleótidos; o una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 6, 9 o 12; o se codifica por una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN según SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 10 o SEQ ID No.: 13.

Como eucariotas, las plantas tienen dos o más copias de su información genética por célula. Cada gen suele estar representado por dos alelos, que pueden ser idénticos en el estado homocigótico o diferentes en el estado heterocigótico. El fenotipo de la planta según la invención está causado por una o más mutaciones en la fosfolipasa patatina, en cuyo caso la planta es homocigota o heterocigota, preferiblemente homocigota para la fosfolipasa patatina mutada.

En una forma de realización adicional de la presente invención, se reivindica una molécula de ácido nucleico que comprende las mutaciones específicas definidas anteriormente que conducen a las sustituciones de aminoácidos R59Q, V162I, y/o S291L basadas en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 3. En este caso, la molécula de ácido nucleico según la invención se caracteriza porque la presencia de la molécula de ácido nucleico según la invención en ausencia de una fosfolipasa patatina de tipo silvestre en una planta da como resultado que la planta sea capaz de inducir haploidía o de mejorar la capacidad de inducción de una planta que ya es capaz de inducir haploidía.

En una configuración preferida de la presente descripción, el ácido nucleico según la invención o un ARN codificado por el ácido nucleico o una proteína o polipéptido codificado por el ácido nucleico influye en el crecimiento del tubo polínico en una planta, en la interacción entre los gametofitos o en la fertilización como tal.

Las sondas de hibridación de ADN derivadas de la secuencia modificada de la fosfolipasa patatina, es decir, que comprenden una de las mutaciones descritas anteriormente, pueden utilizarse para identificar plantas según la invención, es decir, utilizarse para detectar las mutaciones en el gen de la fosfolipasa patatina. Para conseguir una hibridación específica, dichas sondas deben ser específicas y tener una longitud de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente de al menos 20 nucleótidos. Puede encontrarse una guía detallada de la hibridación de ácidos nucleicos en la publicación de Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, Nueva York (1993); y en Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al, eds, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1995). Las sondas también pueden usarse para amplificar una región de la secuencia de fosfolipasa patatina modificada que recibe al menos una de las mutaciones descritas previamente mediante el procedimiento conocido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20, preferiblemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, más preferiblemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y de modo principalmente preferible al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 nucleótidos de longitud es un objeto de la presente invención, en cuyo caso dicha molécula de ácido nucleico hibrida específicamente a una secuencia de nucleótidos previamente descrita, que comprende el gen de la fosfolipasa patatina modificada, y que comprende una de dichas mutaciones, o tiene un par de moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para amplificar una región que contiene al menos una de dichas mutaciones en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente en forma de un oligonucleótido, preferiblemente con una longitud máxima de 50 nucleótidos, preferiblemente una de las siguientes secuencias de nucleótidos según SEQ ID Nos. 28-30, 32-34, 36-38 o 40-42.

Otro objeto de la invención son los vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico según la invención. Un vector según la invención puede comprender el gen mutado de la fosfolipasa patatina con las propiedades de secuencia de nucleótidos mencionadas anteriormente que está enlazado operativamente a un promotor heterólogo, o puede comprender el gen mutado de la fosfolipasa patatina junto con su promotor natural.

Otro vector puede comprender el gen de la fosfolipasa patatina de tipo silvestre que está enlazado operativamente a un promotor heterólogo. Además, un vector puede comprender una molécula de ADN recombinante que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de doble cadena y, por lo tanto, conduce a la inhibición de la expresión del gen de la fosfolipasa patatina tras expresarse en una célula vegetal.

Además, un vector puede contener la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos mutada de la fosfolipasa patatina.

El vector descrito puede ser un plásmido, un cósmido, un fago o un vector de expresión, un vector de transformación, un vector lanzadera o un vector de clonación, puede ser de cadena doble o simple, lineal o circular o puede transformar un hospedador procariota o eucariota ya sea por integración en su genoma o de modo extracromosómico. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico según la invención está enlazada de forma operativa en un vector de expresión a una o más secuencias reguladoras que permiten la transcripción y opcionalmente la expresión en una célula huésped procariota o eucariota; véase, por ejemplo, la publicación de Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 y la solicitud internacional WO 00/75359 en la página 21, línea 20 a la página 22, línea 32. Una secuencia reguladora, preferentemente ADN, puede ser homóloga o heteróloga al ácido nucleico según la invención. Preferentemente, estas secuencias reguladoras son promotores o terminadores, en particular un sitio de partida para transcripción-iniciación, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de transcripción-terminación y/o una señal de poliadenilación. Los vectores suelen contener además genes indicadores/reporteros o genes de resistencia para detectar la transferencia del vector o molécula de ADN/molécula de ácido nucleico deseado y para seleccionar los individuos que los contienen, ya que la detección directa mediante la expresión del gen suele ser bastante difícil. En una forma de realización preferida, el vector es un vector vegetal.

Además de los vectores descritos anteriormente, se describe un procedimiento que comprende la introducción de un vector descrito en una célula huésped. El vector puede introducirse, por ejemplo, por conjugación, movilización, transformación biolística, transformación mediada por agrobacterias, transfección, transducción, infiltración al vacío o electroporación. Tales procedimientos, así como los procedimientos para la preparación de los vectores descritos, son familiares para el experto (Sambrook et al. 2001).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a células huésped que contienen los vectores o moléculas de ácido nucleico descritos. Una célula huésped en el sentido de la invención puede ser una célula procariota (por ejemplo, bacteriana) o eucariota (por ejemplo, una célula vegetal o una célula de levadura). Preferentemente, la célula huésped es una agrobacteria comoAgrobacterium tumefaciensoAgrobacterium rhizogeneso una célula vegetal que comprende el ácido nucleico o vector según la invención. El experto conoce numerosos procedimientos, como la conjugación o la electroporación, mediante los cuales puede introducir el ácido nucleico o el vector de la presente invención según la invención en un Agrobacterium, así como procedimientos como diversos procedimientos de transformación (transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium) mediante los cuales puede introducir el ácido nucleico o el vector de la presente invención según la invención en una célula vegetal (Sambrook et al. 2001).

Además preferiblemente, la presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico según la invención como un transgén o el vector de la presente invención y una planta transgénica o una parte de esta que comprende la célula vegetal transgénica. Dicha célula vegetal o planta transgénica es, por ejemplo, una célula vegetal o planta que se transforma preferentemente de forma estable con la molécula de ácido nucleico según la invención o con el vector de la presente invención. Una planta transgénica de la presente invención es adecuada para su uso como inductor de haploide. En una forma de realización preferida de la célula vegetal transgénica, la molécula de ácido nucleico está operativamente enlazada a una o más secuencias reguladoras que permiten la transcripción y opcionalmente la expresión en la célula vegetal. Una secuencia reguladora, preferentemente ADN, puede ser homóloga o heteróloga al ácido nucleico según la invención. La construcción total de la molécula de ácido nucleico según la invención y la(s) secuencia(s) reguladora(s) representa entonces el transgén. Una parte de una planta puede ser una semilla fecundada o no fecundada, un embrión, un polen, un tejido, un órgano o una célula vegetal, en cuyo caso la semilla fecundada o no fecundada, el embrión o el polen se generan en la planta transgénica y el ácido nucleico según la invención se integra en su genoma como transgén o el vector. Del mismo modo, la presente invención también incluye una progenie de la planta transgénica en cuyo genoma se integra el ácido nucleico según la invención como transgén o el vector y que es adecuada para su uso como inductor de haploide.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una planta capaz de inducir haploidía o con una tasa de inducción aumentada en comparación con el tipo silvestre. El procedimiento comprende los siguientes pasos:

(a)

(i) mutagenizar células vegetales y posteriormente regenerar plantas a partir de las células vegetales mutagenizadas o de las plantas mutagenizadas; y

(ii) identificar una planta de i) que tenga una o más mutaciones en una secuencia endógena de ADN que codifique la fosfolipasa patatina descrita anteriormente que den lugar a una o más sustituciones de aminoácidos, una o más de las sustituciones de aminoácidos descritas S291L, R59Q y V1621 según la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 o que dan lugar a uno o más sustituciones de aminoácidos en secuencias de fosfolipasas patatina vegetal correspondientes a los sustituciones de aminoácidos S291L, R59Q y V1621 según la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 y/o que dan lugar a que el ácido aspártico (D) en la posición 75, la glicina (G) en la posición 79, y/o la prolina (P) en la posición 203 de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID No. 3 se sustituye por otro aminoácido, preferentemente por asparagina (N) en la posición 75, arginina (R) en la posición 79 y/o leucina (L) en la posición 203 o que correspondan a las mismas, y que sea capaz de inducir la obtención de progenie haploide con una tasa mayor en comparación con una planta no mutagenizada. En tal caso, al menos una mutación hace que la planta identificada imparta la propiedad de un inductor de haploide o aumente la eficacia de inducción de un inductor de haploide, o bien

(b)

(i) introducir la molécula de ácido nucleico que tiene una o más mutaciones correspondientes a la una o más mutaciones caracterizadas en la reivindicación 1 y/o que dan lugar a que el ácido aspártico (D) en la posición 75, la glicina (G) en la posición 79, y/o la prolina (P) en la posición 203 de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID No. 3 se sustituye por otro aminoácido, preferentemente por asparagina (N) en la posición 75, arginina (R) en la posición 79 y/o leucina (L) en la posición 203 o que correspondan a las mismas, en una célula vegetal, y

(ii) regenerar una planta a partir de la célula vegetal de (i).

La secuencia de ADN endógena del paso (a) (ii) del procedimiento anterior puede codificar en principio cualquier fosfolipasa patatina vegetal. Preferentemente, la secuencia de ADN endógena codifica una fosfolipasa patatina de sorgo mijo (SEQ ID No.: 3), girasol (SEQ ID No.: 18), cebada (SEQ ID No.: 21), o remolacha azucarera, en cuyo caso la remolacha azucarera tiene dos fosfolipasas patatina putativas (SEQ ID No.: 24 y 27). Las fosfolipasas patatina vegetales mencionadas en el paso (ii) son preferiblemente las de girasol (SEQ ID No.: 18), cebada (SEQ ID No.: 21) o remolacha azucarera; la remolacha azucarera tiene dos fosfolipasas patatina putativas (SEQ ID No.: 24 y 27).

Es conocido por el experto cómo puede lograrse una mutación según la invención mediante el procedimiento de mutagenización en el paso (a) (i) del procedimiento para generar una planta adecuada para su uso como inductor de haploide. La mutagenización incluye aquí tanto la mutagénesis convencional como la mutagénesis de sitio específico o “edición del genoma”. En la mutagénesis convencional, la modificación a nivel del ADN no se induce específicamente. La célula vegetal o la planta se expone a condiciones mutagénicas como el TILLING mediante irradiación de luz UV o el uso de sustancias químicas (Till et al., BMC Plant Biology 4 (2004), 12). Otro procedimiento de mutagénesis aleatoria es la mutagénesis mediante un transposón. La mutagénesis específica para el sitio permite introducir modificaciones a nivel del ADN de forma selectiva en sitios predefinidos del ADN. Para este fin pueden usarse, por ejemplo, TALENS (WO 2010/079430, WO 2011/072246), meganucleasas (Silva et al., Current Gene Therapy 11 (2011), 11), endonucleasas homing (Chevalier, Molecular Cell 10 (2002), 895-905), nucleasas dedos de zinc (Lloyd et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (2005), 2232-237 o un sistema CRISPR/Cas (Gaj et al., Trends in Biotechnology 31 (2013), 397-405).

La identificación de una planta en el paso (a) (ii) puede realizarse, por ejemplo, utilizando marcadores moleculares o sondas. Las sondas de ADN son, por ejemplo, cebadores o pares de cebadores que pueden utilizarse en una reacción de PCR. Por ejemplo, los mutantes Tilling pueden detectarse o identificarse mediante la secuenciación del gen diana en una población Tilling u otros procedimientos que detectan emparejamientos fallidos en el ADN como, por ejemplo, los análisis del punto de fusión o el uso de nucleasas específicas de emparejamientos fallidos. La presente invención también incluye cebadores/ pares de cebadores que pueden usarse para este fin, tales como cebadores para fosfolipasa patatina.

Además, los mutantes generados por transposones pueden detectarse utilizando cebadores específicos para transposones y cebadores específicos para genes diana en PCR sobre toda la población y la posterior secuenciación de los productos de PCR. Tales cebadores también están cubiertos por la presente invención. El experto en la materia conoce otros medios y procedimientos del estado de la técnica que pueden utilizarse para identificar una planta en el paso (b). La presente descripción también se refiere a marcadores moleculares que detectan la presencia o ausencia de una mutación en la secuencia de ADN endógena o en una secuencia reguladora de la secuencia de ADN endógena. Tales marcadores se basan, por ejemplo, en un SNP y son específicos para la mutación (ejemplos: marcador KASPar o TaqMan).

La identificación de una planta en el paso (a) (ii) también puede realizarse probando la capacidad de inducción como se describe en el ejemplo 1 adjunto. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar una planta según la invención detectando la mutación en el gen de la fosfolipasa patatina o detectando un alelo marcador acoplado a la mutación, preferiblemente usando marcadores moleculares descritos anteriormente.

Un ejemplo de una planta generada e identificada por dicho procedimiento es la planta de sorgo mijo según la invención.

La presente invención también se refiere a una planta que es generable o generada por el procedimiento anterior, o una parte de dicha planta, donde una parte de una planta puede ser una semilla fertilizada o no fertilizada, embrión, polen, tejido, órgano o célula vegetal, donde la semilla fertilizada o no fertilizada, embrión o polen se genera en la planta transgénica y la al menos una mutación está presente en el genoma de esta. Asimismo, la presente invención también incluye una progenie de la planta que tiene la al menos una mutación y es adecuada para su uso como inductor de haploide. En principio, el procedimiento puede aplicarse a cualquier planta que contenga una fosfolipasa patatina y así impartirle la propiedad de inducción de haploide. Preferentemente, esta planta es sorgo mijo, girasol, cebada, remolacha azucarera, centeno, trigo o patata.

El procedimiento de generación de una planta transgénica adecuada para su uso como inductor de haploide también incluye proporcionar dos o más de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, opcionalmente también diferentes realizaciones del ácido nucleico según la invención y opcionalmente en uno o más vectores, y transformar células vegetales introduciendo los dos o más ácidos nucleicos. Alternativa o adicionalmente, además del ácido nucleico según la invención, uno o más ácidos nucleicos adicionales que se sabe que son utilizables para generar un inductor de haploide (por ejemplo, gen cenh3 manipulado (publicación de Ravi y Chan, Nature 464 (2010), 615-618; publicaciones EP 2989889 A1; EP 3037 540 A1; WO 2016/138021 A1) pueden proporcionarse y transformarse o introducirse mediante cría.

La molécula de ácido nucleico o el vector de (b) se introduce mediante transformación, preferiblemente mediante transformación estable de células vegetales. El vector puede introducirse, por ejemplo, por conjugación, movilización, transformación biolística, transformación mediada por agrobacterias, transfección, transducción, infiltración al vacío o electroporación. Tales procedimientos son familiares para el experto (Sambrook et al. 2001). Una molécula de ácido nucleico también puede introducirse en el genoma de la planta mediante recombinación homóloga, por ejemplo mediante CRISPR/Cas o CRISPR/Cpfl y plantilla de reparación.

La presente invención también se refiere a una planta transgénica que puede generarse o se genera usando este procedimiento, o una parte de esta planta, donde una parte de una planta puede ser una semilla fertilizada o no fertilizada, un embrión, un polen, un tejido, un órgano o una célula vegetal, donde la semilla fertilizada o no fertilizada, el embrión o el polen se generan en la planta transgénica y el ácido nucleico introducido se integra en su genoma como un transgén o el vector. Asimismo, la presente invención también incluye una progenie de la planta transgénica que tiene el ácido nucleico introducido como transgén y es adecuada para su uso como inductor de haploide. En principio, el procedimiento puede aplicarse a cualquier planta que contenga una fosfolipasa patatina y así impartirle la propiedad de inducción de haploide. Preferentemente, esta planta es sorgo mijo, girasol, cebada, remolacha azucarera, centeno, trigo o patata.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un procedimiento para generar una planta haploide que comprende los pasos de:

(a) cruzar una planta inductora no transgénica o transgénica de la presente descripción, que es adecuada para su uso como inductor de haploide, con una planta del mismo género, preferiblemente de la misma especie,

(b) seleccionar una semilla o embrión haploide fecundado, y

(c) generar una planta haploide a partir de la semilla o embrión de (b).

Preferiblemente, la planta adecuada para su uso como inductor de haploide se utiliza como progenitor de polen y se cruza con un progenitor de semilla del mismo género, preferiblemente de la misma especie. La planta adecuada para su uso como inductor de haploide también puede utilizarse como progenitor de semillas y cruzarse con un progenitor de polen del mismo género, preferiblemente de la misma especie. Ambas parejas de cruzamiento en el paso (a), es decir, el progenitor de semilla y el progenitor de polen, también pueden ser el mismo individuo. En este caso, el paso de cruce es una autofecundación.

La selección de la semilla fertilizada haploide o embrión puede comprender un paso de detección de haploidía y separación de la semilla fertilizada haploide o embrión de la semilla fertilizada poliploide o embriones. La detección de la haploidía de un semilla fecundada o embrión puede ser fenotípica o genotípica, por ejemplo proporcionando al inductor un marcador dominante específico del embrión que sea visible en toda la progenie diploide pero no en la progenie haploide inducida. Además, el estado de ploidía puede determinarse mediante citometría de flujo. Además, un patrón completamente homocigótico de marcadores moleculares proporciona una indicación de plantas haploides. La separación puede automatizarse, por ejemplo a partir de los datos de la detección de haploidía.

La presente descripción también se refiere a una semilla fertilizada haploide o embrión resultante del cruce en el paso (a) del procedimiento para generar una planta haploide y una planta haploide generable o generada por este procedimiento, o una parte de esta planta; una parte de una planta puede ser una semilla, un embrión, un tejido, un órgano o una célula vegetal. Asimismo, la presente descripción también incluye una progenie de la planta.

Además, la presente descripción también abarca una planta doblemente haploide (diploide) o una parte de esta; la planta doblemente haploide (diploide) o la parte de esta se generó por duplicación cromosómica de la planta haploide o la parte de esta. Estas plantas doblemente haploides (diploides) pueden generarse por el procedimiento siguiente

(a) generar una planta haploide por el procedimiento descrito;

(b) duplicar el conjunto de cromosomas haploides en al menos una célula de la planta haploide, y

(c) regenerar la planta diploide a partir de la célula de (b).

En el procedimiento descrito para generar plantas doblemente haploides, las plantas haploides de (a) se tratan con el inhibidor de la división celular colchicina. Esto conduce a una duplicación de los cromosomas. Este procedimiento es conocido por el experto y se describe, por ejemplo, en la publicación de Seguí-Simarro y Nuez, Cytogenetic and Genome Research 120 (2008), 358-369.

Los procedimientos generales para la generación de plantas haploides y doblemente haploides son conocidos por el experto, por ejemplo en la publicación de Dwivedi et al, Biotechnol. Adv. 33 (2015), 812-29 y de Murovec y Bohanec, Biochemistry, Genetics and Molecular Biology “Plant Breeding” (2012), eds. Abdurakhmonov, Capítulo 5 y puede aplicarse a la presente descripción.

Otra forma de realización de la presente descripción comprende un procedimiento para generar plantas híbridas que comprende los siguientes pasos:

(a) cruzar la planta doblemente haploide (diploide) descrita con una segunda planta del mismo género, preferiblemente de la misma especie,

(b) seleccionar las plantas híbridas con respecto al rasgo deseado.

Las plantas doblemente haploides son homocigóticas y al cruzar dos plantas homocigóticas se genera el conocido efecto de heterosis, que conduce a un rendimiento particularmente pronunciado de las plantas híbridas. Por consiguiente, las plantas híbridas obtenidas mediante dicho procedimiento también son objeto de la presente descripción.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso del ácido nucleico o vector según la invención en una planta para impartir la propiedad de un inductor de haploide o para aumentar la capacidad de inducción de un inductor de haploide o el uso del ácido nucleico o vector según la invención para generar una planta o planta transgénica adecuada para su uso como inductor de haploide.

En experimentos con plantas de sorgo mijo se encontró un gen, en particular el gen fosfolipasa patatina con una o más mutaciones que eran adecuadas para impartir la propiedad de un inductor de haploidía a la planta y una capacidad de inducción de al menos 0,4% a 1,5% o más, de modo que por primera vez se pudo proporcionar un sistema eficiente y por lo tanto económicamente aplicable para generar plantas haploides y doblemente haploides de sorgo mijo para la cría híbrida. El procedimiento para generar tales inductores haploides y la identificación de fosfolipasas patatina en otras plantas cultivadas significa que este sistema también puede transferirse a ellas.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin, no obstante, limitar el objeto de la invención. A menos que se indique lo contrario, se han utilizado procedimientos estándar de biología molecular, véase por ejemplo (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), Fritsch et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al, Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, eds, Academic Press, London, 1987) y Weir et al, Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell, eds, 1986).

Ejemplos

1. Identificación de la fosfolipasa patatina como diana para impartir la propiedad de inducción de haploide en sorgo mijo

En una población de TILLING se encontró que una planta de sorgo era capaz de inducir haploidía con una eficiencia de alrededor del 1%. En la búsqueda de la base genética que imparte esta propiedad en la planta de sorgo identificada, el foco se centra en diferentes genes como objetivos potenciales. La selección de los genes se basó en el hecho de que se expresan preferentemente en los órganos reproductivos de la planta y desempeñan un papel en la fertilización de alguna manera, porque una fertilización defectuosa o incompleta, por ejemplo debido a una falta o transporte defectuoso de las células generativas a los óvulos femeninos o por efecto sobre el metabolismo energético del polen, puede conducir a la eliminación de cromosomas, lo que resulta en un conjunto cromosómico haploide.

Tras las investigaciones preliminares iniciales en el contexto de la presente invención, se encontró entonces un gen mutado, que se analizó utilizando los procedimientos bioinformáticos BLASTP y el estudio Syntenie (Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25 (1997), 3389-3402) como una fosfolipasa patatina en sorgo, cuyas secuencias de nucleótidos y aminoácidos se muestran en SEQ ID No.: 1 y SEQ ID No.: 3, respectivamente, y se identificó como una fosfolipasa patatina expresada específica de polen basada en la secuenciación de ARN (ARNSeq). El gen mutado tenía una mutación puntual en la secuencia de nucleótidos de la fosfolipasa patatina (véase SEQ ID No.: 10), que causó una sustitución de aminoácidos de serina a leucina en la posición 291 (véase SEQ ID No.: 12). La mutación puntual en la secuencia de nucleótidos de la fosfolipasa patatina se identificó utilizando el procedimiento PCR con los cebadores según SEQ ID No.: 44 y 45.

Para verificar el gen mutado como la causa de la inducción de haploide observada, el locus que contiene el gen se introdujo en el fondo genético de un no inductor mediante procedimientos de cría y biotecnológicos. Esto permitió introducir la propiedad de un inductor de haploide en el no inductor con una eficacia media del 1,5% cuando la mutación era homocigota y del 1,2% cuando la mutación era heterocigota. Durante la verificación, el gen mutado pudo rastrearse mediante PCR con los cebadores según SEQ ID No.: 36 a 38. La capacidad de inducción de un inductor potencial se llevó a cabo mediante polinización de plantas de sorgo mijo con las plantas de sorgo mijo mutantes (que contenían el gen mutante). Las plantas de sorgo de tipo silvestre utilizadas se diferenciaban genéticamente de la línea de inductor potencial por varios marcadores. Estos marcadores se utilizaron para identificar plantas homocigóticas, cuya haploidía se comprobó posteriormente mediante citometría de flujo.

2. Generación de otros inductores haploidesin vivode sorgo mijo

Después de que mediante el experimento descrito anteriormente se verificara que la fosfolipasa patatina en el sorgo mijo es una diana adecuada para impartir la propiedad de inducción de haploide en el sorgo mijo, se introdujeron mutaciones adicionales en el gen endógeno de tipo silvestre. Se introdujo una mutación que dio lugar a una sustitución del aminoácido glutamina (Q) por un codón de parada en la posición 372. Esto condujo a un acortamiento de la proteína fosfolipasa patatina y dio a la planta de sorgo que contenía esta mutación la propiedad de inducir haploides con una eficiencia media de entre el 1% y el 3%. Como se muestra en la Fig. 2, las mutaciones previamente descritas S291L y Q372Stopp están fuera del dominio funcional de la fosfolipasa patatina. Por lo tanto, en el siguiente experimento, se introdujeron mutaciones en el gen de la fosfolipasa patatina que inducían una sustitución de aminoácidos R59Q y V162I. Estas dos mutaciones se encuentran dentro del dominio funcional y hacen que la planta de sorgo adquiera una propiedad inductora haploide; los experimentos iniciales muestran que la tasa de inducción es superior al 0,5% aproximadamente. En la Fig. 1 se muestra una alineación de secuencias de los cuatro mutantes junto con la proteína de tipo silvestre.

Se puede suponer que mutaciones adicionales u otras o la combinación de varias mutaciones en la fosfolipasa patatina conducen a una tasa de inducción aumentada o más aumentada, de modo que se pueden llevar a cabo experimentos adicionales para cribar poblaciones TILLING con el fin de identificar una planta con una capacidad de inducción aumentada.

Además, las mutaciones no solo podrían introducirse en la fosfolipasa patatina en las diversas especies de sorgo y variedades derivadas mediante TILLING u otros procedimientos de mutagénesis, sino que también podrían generarse otros inductores haploides mediante la expresión transgénica de la fosfolipasa patatina, por ejemplo. Para ello, los genes correspondientes, incluidos sus promotores, de las líneas inductoras de sorgo mijo con las mutaciones S291L, R59Q, V162I y/o Q372Stopp en la fosfolipasa patatina deben clonarse de acuerdo con SEQ ID No.: 3. Estos genes pueden clonarse en un vector de transformación adecuado y transformarse en la planta deseada.

La propiedad de inducción de las plantas de sorgo mijo descrita anteriormente puede remontarse a las mutaciones en la fosfolipasa patatina mostradas, lo que generalmente conduce a un cambio en su actividad biológica. Sin embargo, la actividad biológica puede cambiarse no solo introduciendo las mutaciones descritas, sino también mediante otros numerosos procedimientos de ingeniería genética.

Por ejemplo, el gen de tipo silvestre de la fosfolipasa patatina puede clonarse en un vector de transformación junto con un promotor adecuado y transformarse en la planta deseada de modo que se produzca una sobreexpresión de la fosfolipasa patatina. Además, la actividad de la fosfolipasa patatina podría reducirse mediante ARNi. Por ejemplo, pueden generarse construcciones de horquilla para este fin, que luego se clonan en un vector de transformación adecuado, incluyendo un promotor y un terminador adecuados que permitan la transcripción de la construcción de horquilla antes o en el momento de la formación del polen, y se transforman en la planta deseada. Alternativamente, podrían buscarse mutantes knockout que reduzcan aún más la actividad.

3. Generación de nuevos inductores haploidesin vivo

Las investigaciones iniciales en el contexto de la presente invención dan razones justificadas para estipular que en algunas otras plantas cultivadas la propiedad de inducción de haploide o una mejora de esta propiedad puede ser impartida vía modificaciones de la fosfolipasa patatina, en particular vía mutaciones correspondientes descritas anteriormente para la planta de sorgo mijo o según los procedimientos de la invención descritos anteriormente. Se trata de genes diana que codifican fosfolipasas patatina putativas con una de las siguientes secuencias de aminoácidos en girasol (SEQ ID No.: 18), cebada (SEQ ID No.: 21) y en remolacha azucarera, en cuyo caso la remolacha azucarera tiene dos fosfolipasas potenciales (SEQ ID No.: 24 y 27). En la Fig. 2 se muestra una alineación de secuencias de las proteínas de sorgo, girasol, cebada y remolacha azucarera, en la que el dominio funcional putativo también está marcado (en negrita). La expresión de estos genes en el polen puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante ARNSeq del polen.

Según el procedimiento de la invención descrito anteriormente, ahora se pueden introducir modificaciones dirigidas relacionadas con la fosfolipasa patatina en girasol, cebada (y otros cereales como trigo, centeno y avena) y remolacha azucarera. Por ejemplo, la alineación de secuencias de la Fig. 2 puede utilizarse para identificar los aminoácidos que corresponden a los de las posiciones 291, 59, 162 y 372 según SEQ ID No.: 3 e intercambiarlos. Por consiguiente, también son objeto de la presente invención plantas de girasol, cebada o cereales y remolacha azucarera que son capaces de inducir haploidía y se caracterizan porque tienen una o más modificaciones que se relacionan con una fosfolipasa patatina endógena, preferiblemente expresada específicamente en polen, de manera correspondiente a una de las formas de realización caracterizadas en los puntos [] anteriores o reivindicaciones, en particular para plantas de sorgo mijo, y/u obtenibles por medio del procedimiento según la invención como se ha descrito anteriormente o caracterizado en las reivindicaciones. Ya existen los primeros indicios de que también las sustituciones de aminoácidos en la posición 75 (el ácido aspártico (D) se reemplaza por asparagina (N) (D75N)), en la posición 79 (la glicina (G) se reemplaza por arginina (R) (G79R)) y/o en la posición 203 (la prolina (P) se reemplaza por leucina (L) (P203L)) de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID No. 3 pueden impartir una inducción de haploides en sorgo, así como en otras especies cultivadas,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Planta de sorgo mijo que es capaz de inducir haploidía, caracterizada porque la planta tiene una o más modificaciones que se refieren a un gen endógeno que codifica una fosfolipasa patatina, en cuyo caso la fosfolipasa patatina se caracteriza por la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No.: 1 o 2 o por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID No.: 1 o 2, o por una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEQ ID No.: 1 o 2 en condiciones rigurosas, o que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID No.: 3, caracterizada porque la una o más modificaciones son una o más mutaciones en el gen endógeno que codifica la fosfolipasa patatina que conducen a uno o más sustituciones de aminoácidos, donde la una o más mutaciones conducen a un sustitución de aminoácidos en la región de las posiciones de aminoácidos 55-75, 157-167 o 285-298 según SEQ ID No.: 3, donde las condiciones rigurosas corresponden a hibridación en 4 * SSC a 65°C y lavados múltiples posteriores en 0,1 * SSC a 65°C durante un total de aproximadamente 1 hora.

2. Planta según la reivindicación 1, caracterizada porque la una o más mutaciones conducen a una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácidos 59, 162 y/o 291 según SEQ ID No.: 3.

3. Planta según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la fosfolipasa patatina modificada

(i) comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a SEQ ID No.: 3, en la que está presente al menos una sustitución de aminoácidos; en la posición 59 arginina (R), en la posición 162 valina (V), y/o en la posición 291 serina (S) se intercambian por otro aminoácido, preferentemente por glutamina (Q) en la posición 59, isoleucina (I) en la posición 162 y/o leucina (L) en la posición 291;

(ii) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN según la SEQ ID No.: 1 o una secuencia de ADN que es idéntica al menos en un 80% a la SEQ ID No.: 1, en la que está presente al menos una sustitución de nucleótidos que conduce a una sustitución de aminoácidos, en cuyo caso uno o más nucleótidos se intercambian en las posiciones 421-423, 815-817, 1420 1422 y/o 1663-1665 según la SEQ ID No.: 1;

(iii) comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID No.: 6, 9 o 12; o

(iv) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN según SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 10 o SEQ ID No.: 13.

4. Molécula de ácido nucleico que codifica la fosfolipasa patatina mutante caracterizada en la reivindicación 1, que en una planta en ausencia de una fosfolipasa patatina de tipo silvestre da como resultado que la planta sea capaz de inducir haploidía.

5. Molécula de ácido nucleico de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20, preferiblemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, más preferiblemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y de modo principalmente preferible al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 nucleótidos de longitud, que se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos como se define en las reivindicaciones 2 y 3 y que comprende una de las mutaciones, o un par de moléculas de ácido nucleico idóneas para amplificar una región que contiene al menos una de las mutaciones en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente en forma de un oligonucleótido, preferiblemente con una longitud máxima de 50 nucleótidos, que comprende preferiblemente una de las siguientes secuencias de nucleótidos según SEQ ID Nos. 28-30, 32-34, 36-38 o 40-42.

6. Célula huésped, preferentemente una célula vegetal que contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5, un vector, preferentemente un vector vegetal, que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5 o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5 como transgén, opcionalmente bajo el control de un promotor heterólogo.

7. Procedimiento para obtener una planta capaz de inducir haploidía o

con una tasa de inducción aumentada con respecto al tipo silvestre, que comprende los pasos siguientes

(a)

(i) mutagenizar células vegetales y posteriormente regenerar plantas a partir de las células vegetales mutagenizadas o mutagenizar plantas;

(ii) identificar una planta de (i) que tenga una o más mutaciones en una secuencia de ADN endógena correspondiente a una o más mutaciones caracterizadas en la reivindicación 1 y/o que den lugar a que el ácido aspártico (D) en la posición 75, la glicina (G) en la posición 79, y/o la prolina (P) en la posición 203 de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID No. 3 se sustituyan por otro aminoácido, preferentemente asparagina (N) en la posición 75, arginina (R) en la posición 79 y/o leucina (L) en la posición 203, o que correspondan a las mismas, y sea capaz de inducir la obtención de progenie haploide con una tasa elevada en comparación con una planta no mutagenizada; o

(b)

(i) introducir la molécula de ácido nucleico que tiene una o más mutaciones correspondientes a una o más mutaciones caracterizadas en la reivindicación 1 y/o que dan lugar a que el ácido aspártico (D) en la posición 75, la glicina (G) en la posición 79, y/o la prolina (P) en la posición 203 de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID No. 3 se sustituye por otro aminoácido, preferentemente por asparagina (N) en la posición 75, arginina (R) en la posición 79 y/o leucina (L) en la posición 203 o que correspondan a estas, en una célula vegetal, y

(ii) regenerar una planta a partir de la célula vegetal de i),

preferentemente en cuyo caso la secuencia de ADN endógeno o la molécula de ácido nucleico es una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No.: 3 para sorgo mijo(Sorghum bicolor),<s>E<q>ID No.: 18 para girasol(Helianthus annuus),SEQ ID No.: 21 para cebada(Hordeum vulgare)o en SEQ ID No.: 24 o 27 paraBeta vulgaris(por ejemplo, remolacha azucarera).

8. Planta que comprende la célula vegetal según la reivindicación 6 y/u que es obtenible por medio de un procedimiento según la reivindicación 7; preferentemente la planta es sorgo mijo, girasol, centeno, trigo, patata, cebada o remolacha azucarera.

9. Órgano, parte de la planta, tejido o célula de la planta según una de las reivindicaciones 1 a 3 u 8 o semilla o progenie de la planta según una de las reivindicaciones 1 a 3 u 8, en cuyo caso la semilla o progenie presenta la mutación definida en una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5 o un vector, preferentemente vector vegetal, que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 o 5.