ES2926055T3

ES2926055T3 - Generación de plantas haploides

Info

Publication number: ES2926055T3
Application number: ES15766043T
Authority: ES
Inventors: Andreas Houben; Raheleh Karimi-Ashiyani; Takayoshi Ishii; Nils Stein; Jochen Kumlehm; Christof Bolduan; Frank Breuer; Monika Kloiber-Maitz; Markus Niessen; Milena Ouzunova; Britta Schulz; Silke Wieckhorst
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2035-08-28
Also published as: CN106998665A; WO2016030019A1; AU2015309289B2; MX378674B; CA2959566A1; US20210259178A1; UA124293C2; HUE059854T2; CL2017000465A1; US11895960B2; MX2017002519A; BR112017003555A2; PL3186381T3; EA037899B1; DK3186381T3; CN106998665B; EP3186381A1; US20170280646A1; EP3186381B1; CL2023000238A1

Abstract

La presente invención se refiere a plantas no transgénicas y transgénicas, preferiblemente plantas de cultivo, que comprenden una mutación que provoca una alteración de la secuencia de aminoácidos en el dominio CATD de la histona centrómero H3 (CENH3), preferiblemente dentro del loopl o la hélice α2 de el dominio CATD, que tienen la actividad biológica de un inductor haploide. Además, la presente invención proporciona métodos para generar las plantas de la presente invención y plantas haploides y doble haploides que pueden obtenerse cruzando las plantas de la presente invención con plantas de tipo salvaje, así como métodos para facilitar el intercambio de citoplasma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Generación de plantas haploides

La presente invención se refiere a plantas no transgénicas y transgénicas, preferiblemente plantas de cultivo, que comprenden al menos una mutación que provoca una alteración de un aminoácido dentro del bucle1 o la hélice a2 del dominio CATD del centrómero de histona H3 (CENH3), que tienen la actividad biológica de un inductor haploide. Además, la presente invención proporciona métodos para generar las plantas de la presente invención.

La generación y uso de haploides es uno de los medios biotecnológicos más poderosos para mejorar las plantas cultivadas. La ventaja de los haploides para los cultivadores es que la homocigosidad puede lograrse ya en la primera generación después de la dihaploidización, creando plantas doblemente haploides, sin necesidad de varias generaciones de retrocruzamiento requeridas para obtener un alto grado de homocigosidad. Además, el valor de los haploides en la investigación y la reproducción de plantas radica en el hecho de que las células fundadoras de los haploides dobles son productos de la meiosis, de modo que las poblaciones resultantes constituyen grupos de diversos individuos recombinantes y al mismo tiempo fijados genéticamente. Por lo tanto, la generación de haploides duplicados proporciona no solo una variabilidad genética perfectamente útil para seleccionar con respecto a la mejora de cultivos, sino que también es un medio valioso para producir poblaciones de mapeo, endogamia recombinante, así como mutantes homocigóticos instantáneos y líneas transgénicas.

Lermontova and Schubert (Primera edición. Editado por Jiming Jiang and James A. Birchler. 2013 John Wiley & Sons, Inc. Publicado en 2013 por John Wiley & Sons, Inc.) discuten la regulación de la aparición, la conservación funcional, las interacciones y la aplicación potencial de la variante centromérica histona H3 y sus peculiaridades en las plantas.

Los haploides se pueden obtener mediante enfoques in vitro o in vivo. Sin embargo, muchas especies y genotipos son recalcitrantes a estos procesos. Alternativamente, los cambios sustanciales de la variante de histona H3 específica del centrómero (CENH3, también llamada CENP-A), al intercambiar sus regiones N-terminales y fusionarlas con GFP ("GFP-tailswap" CENH3), crean líneas inductoras haploides en la planta modelo Arabidopsis thaliana (Ravi and Chan, Nature, 464 (2010), 615-618; Comai, L, "Genome elimination: translating basic research into a future tool for plant breeding.", PLoS biology, 12.6 (2014)). Las proteínas CENH3 son variantes de las proteínas histonas H3 que son miembros del complejo cinetocoro de centrómeros activos. Con estas líneas inductoras de haploides "GFP-tailswap", la haploidización se produjo en la progenie cuando se cruzó una planta inductora de haploides con una planta de tipo salvaje. Curiosamente, la línea inductora haploide se mantuvo estable tras la autofecundación, lo que sugiere que una competencia entre el centrómero modificado y el tipo salvaje en el embrión híbrido en desarrollo da como resultado la inactivación del centrómero del progenitor inductor y, en consecuencia, la eliminación del cromosoma uniparental.

Como resultado, los cromosomas que contienen la proteína CENH3 alterada se pierden durante el desarrollo embrionario temprano, lo que produce una progenie haploide que contiene solo los cromosomas del progenitor de tipo salvaje.

Por lo tanto, pueden obtenerse plantas haploides cruzando plantas transgénicas "GFP-tailswap" como inductoras de haploides con plantas de tipo salvaje. Sin embargo, como se describió anteriormente, esta técnica requiere cambios sustanciales de la proteína CENH3 y las plantas comprenden un transgén heterólogo, que es económicamente problemático debido a la creciente renuencia del público hacia los cultivos modificados genéticamente.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es superar los problemas antes mencionados y, en particular, proporcionar plantas inductoras de haploides alternativas que no comprendan modificaciones sustanciales de su proteína CENH3 y/o que no estén modificadas genéticamente.

Este problema se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes. La presente invención es por lo tanto como se define en el conjunto de reivindicaciones. Lo mismo es cierto en consecuencia para las secuencias de acuerdo con la lista de secuencias que forma parte de la solicitud tal como se presentó. El dominio CATD de la proteína CENH3 corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 113 hasta la posición 155 como se establece en SEQ ID No. 38 derivada de Arabidopsis thaliana y/o el dominio CATD de la proteína CENH3 está codificado por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos de la posición 337 a la posición 465 como se establece en SEQ ID No. 37 derivada de Arabidopsis thaliana. Las secuencias de A. thaliana sirven solo como referencias y no limitan la invención a las secuencias particulares de A. thaliana. Debido al alto nivel de conservación, un experto en la materia puede encontrar la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondientes a las secuencias de A. thaliana en cualquier otro material de planta o especie de planta. En el contexto de la presente invención, el término "alteración" significa cualquier modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína CENH3 (incluidas las modificaciones múltiples) que es causada por al menos una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína centrómero de histona H3 (CENH3). La secuencia de nucleótidos puede ser un ADN genómico o el ADNc del gen CENH3. Una alteración puede ser una sustitución de uno o más aminoácidos, una inserción de uno o más aminoácidos o una deleción de uno o más aminoácidos. Las mutaciones a nivel de ADN que pueden alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína CENH3 pueden ser mutaciones puntuales que conducen a una sustitución de un aminoácido o un codón de terminación, inserciones o deleciones que desplazan el marco de lectura del gen CENH3, o mutaciones en los sitios de empalme.

En una realización, la mutación que provoca la sustitución de un aminoácido se encuentra dentro del buclel del dominio CATD. El bucle1 corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 114 hasta la posición 126 como se establece en SEQ ID No. 38 derivada de Arabidopsis thaliana y/o el bucle1 está codificado por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos desde la posición 340 hasta la posición 378 como se establece en SEQ ID No. 37 derivada de Arabidopsis thaliana. Las secuencias de A. thaliana sirven solo como referencias y no limitan la invención a las secuencias particulares de A. thaliana. Debido al alto nivel de conservación, los expertos en la materia pueden encontrar la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondientes a las secuencias de A. thaliana en cualquier otro material de planta o especie de planta.

En otra realización, la al menos una mutación que causa una sustitución de aminoácido está ubicada dentro de la hélice a2 del dominio CATD. La hélice a2 corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 127 hasta la posición 155 como se establece en SEQ ID No. 38 derivada de Arabidopsis thaliana y/o la hélice a2 está codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos de la posición 379 a la posición 465 como se establece en SEQ ID No. 37 derivada de Arabidopsis thaliana. Las secuencias de A. thaliana sirven solo como referencias y no limitan la invención a las secuencias particulares de A. thaliana. Debido al alto nivel de conservación, los expertos en la materia pueden encontrar la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondientes a las secuencias de A. thaliana en cualquier otro material de planta o especie de planta.

Las proteínas CENH3 son variantes de las proteínas histonas H3 que son miembros del complejo cinetocoro de centrómeros activos, es decir, la estructura de la proteína en los cromosomas donde se unen las fibras del huso durante la división celular. Básicamente, las proteínas CENH3 se caracterizan por un dominio de cola variable, que no forma una estructura secundaria rígida, y un dominio de pliegue de histona conservado que consiste en tres regiones a-helicoidales, denominadas a1 a a3, que están conectadas por dos secciones de bucle. Dentro del dominio de plegamiento de histonas se encuentra el dominio CATD altamente conservado (dominio de direccionamiento CENP-A), que está formado por partes de la hélice a1, la hélice a2 completa y el bucle1 de conexión. El dominio CATD conservado es necesario para que las chaperonas carguen CENH3 y, por lo tanto, es vital para la localización del cinetocoro y la función del centrómero.

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que se puede obtener una planta que posea la capacidad de producir progenie haploide, es decir, un inductor haploide, sustituyendo un solo aminoácido dentro del dominio CATD conservado en el bucle1 o la hélice a2 de la proteína CENH3. Ventajosamente, esto puede lograrse mediante métodos transgénicos así como no transgénicos. Se prefieren los métodos no transgénicos debido a los enormes costes de la desregulación de los organismos genéticamente modificados (GMO), así como al creciente rechazo público de los organismos genéticamente modificados (GMO) o las plantas generadas por medio de GMO, en particular los cultivos para consumo humano, y los amplios procesos de autorización de comercialización que incluyen evaluaciones de seguridad rigurosas de tales GMO.

La presente invención proporciona una planta como se define en las reivindicaciones 1 a 4.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a una planta que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína centrómero de histona H3 (CENH3) que comprende un dominio CATD, en donde la parte de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio CATD comprende una mutación y en donde la mutación provoca una alteración de la secuencia de aminoácidos en el dominio CATD de la proteína CENH3 en el bucle1 que a) está codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos desde la posición 340 hasta la posición 378 como se establece en SEQ ID No. 37 derivada de Arabidopsis thaliana, que corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 114 hasta la posición 126 como se establece en SEQ ID No. 38 derivada de arabidopsis thaliana, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 271 a la posición 306 como se establece en SEQ ID No. 60 derivada de Beta vulgar, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 91 hasta la posición 102 como se establece en SEQ ID No. 61 derivada de Beta vulgar, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 346 a la posición 384 como se establece en SEQ ID No. 51 derivada de Brassica napus, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde las posiciones 116 a la posición 128 como se establece en SEQ ID No. 52 derivada de Brassica napus, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 280 a la posición 318 como se establece en SEQ ID No. 57 derivada de Zeamays, corresponde a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 94 a la posición 106 como se establece en SEQ ID No. 58 derivada de Zea mays, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 280 a la posición 318 como se establece en SEQ ID No. 54 derivada de Sorghum bicolor, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde las posiciones 94 a la posición 106 como se establece en SEQ ID No. 55 derivada de Sorghum bicolor, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 208 a la posición 264 como se establece en SEQ ID No. 33 derivada de Hordeum vulgare (pCENH3), corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 70 a la posición 88 como se establece en SEQ ID No. 34 derivada de Hordeum vulgare (pCENH3), o que tiene la secuencia consenso de SEQ ID No. 49, y b) que está posicionada dentro del dominio CATD de la proteína CENH3 como se definió anteriormente, o la mutación provoca una alteración de la secuencia de aminoácidos en el dominio CATD de la Proteína CENH3 en la hélice a2 que a) está codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos desde la posición 379 hasta la posición 465 como se establece en SEQ ID No. 37 derivada de Arabidopsis thaliana, que corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 127 hasta la posición 155 como se establece en SEQ ID No. 38 derivada de arabidopsis thaliana, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 307 a la posición 393 como se establece en SEQ ID No. 60 derivada de Beta vulgar, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 103 hasta la posición 131 como se establece en SEQ ID No. 61 derivada de Beta vulgar, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 385 a la posición 471 como se establece en SEQ ID No.

51 derivada de Brassica napus, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde las posiciones 129 a la posición 157 como se establece en SEQ ID No. 52 derivada de Brassica napus, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 319 a la posición 405 como se establece en SEQ ID No.

57 derivada de Zea mays, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 107 hasta la posición 135 como se establece en SEQ ID No. 58 derivada de Zea mays, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 319 a la posición 405 como se establece en SEQ ID No. 54 derivada de Sorghum bicolor, corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 107 hasta la posición 135 como se establece en SEQ ID No, 55 derivada de Sorghum bicolor, o está codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de la posición 265 a la posición 351 como se establece en SEQ ID No. 33 derivada de Hordeum vulgare (pCENH3), corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la posición 89 a la posición 117 como se establece en ^sE^qID No. 34 derivada de Hordeum vulgare (pCENH3), o que tiene la secuencia consenso de SEQ ID No. 1, y b) que está ubicado en el buclel o la hélice a2 del dominio CATD. El bucle 1 no mutado del dominio CATD está muy conservado entre las especies de plantas y tiene 13 aminoácidos de longitud, comenzando en la posición 1 y terminando en la posición 13. En la presente invención, cualquier posición de aminoácido dada con respecto al bucle 1 o a la secuencia consenso descrita a continuación de SEQ ID No. 49 se refiere a este sistema de numeración. Preferiblemente, el buclel no mutado presenta la secuencia de aminoácidos que se indica en la Tabla 1.

Tabla 1: Aminoácidos especificados en el bucle1 de la proteína CENH3

Más preferiblemente, el bucle1 tiene la secuencia consenso de SEQ ID No. 49, que es

TNFLA PXEVT RWT,

S 1 0 1 .3

Como se indicó anteriormente, el bucle1 comprende aminoácidos no especificados [marcados como X] y aminoácidos especificados [marcados como código de una letra].

La hélice a2 no mutada del dominio CATD está altamente conservada entre las especies de plantas y tiene una longitud de 29 aminoácidos que comienza en la posición 1 y termina en la posición 29. En la presente invención, cualquier posición de aminoácido dada con respecto a la hélice a2 o la secuencia consenso descrita a continuación de SEQ ID No. 1 se refiere a este sistema de numeración. Preferiblemente, la hélice a2 no mutada presenta la secuencia de aminoácidos que se indica en la Tabla 2.

Tabla 2: Aminoácidos especificados en la hélice a2 del dominio CATD

Más preferiblemente, la hélice a2 tiene la secuencia consenso de SEQ ID No. 1, que es

AKATiTi AT.QEA AEDFL VHT.FK DAMLC A 1H A ,

5 1 0 1 5 2 0 2 5 2 9

Como se indicó anteriormente, la hélice a2 comprende aminoácidos específicos [marcados como un código de una letra].

Un aminoácido no especificado como se indica en la Tabla 1 o en SEQ ID No. 49 es un aminoácido que, aunque se especifica en un grupo de especies de plantas en particular, en un género de plantas en particular o en una especie de plantas en particular, no se conserva en un rango mayor de especies de plantas. Por lo tanto, un aminoácido no especificado de SEQ ID No. 49 o como se proporciona en la Tabla 1 está en un grupo de especies de plantas particulares, en un género de plantas particular o en una especie de planta particular un aminoácido específico bien definido que, sin embargo, posiblemente no se encuentra en el mismo lugar en otra especie de planta. Por lo tanto, una sustitución de aminoácido de un aminoácido no especificado de SEQ ID No. 49 o como se indica en la Tabla 1 significa que en una planta, es decir, en una especie de planta específica, el aminoácido específico pero no conservado se sustituye por otro aminoácido que es de origen natural en ese lugar en este grupo de especies de plantas particulares, en este género de plantas en particular o en esta especie de plantas en particular en la proteína CENH3 nativa codificada endógenamente de dicha especie de planta. Además, un aminoácido no especificado así como un aminoácido especificado pueden ser esencial con respecto a los procesos de plegamiento de proteínas o estabilidad de proteínas. La alteración de dicho aminoácido puede conducir a que un CENH3 mutante tenga una estabilidad deteriorada o un plegamiento incorrecto.

Los aminoácidos especificados proporcionados en la Tabla 1 y en la Tabla 2 y en particular los aminoácidos especificados de SEQ ID Nos. 49 y 1 son aquellos que se encuentran en un amplio rango de especies de plantas, preferiblemente como las enumeradas a continuación, y que por lo tanto están bien conservadas.

En una realización preferida, la secuencia consenso de SEQ ID No. 49 o 1 se ha compilado a partir de las secuencias de buclel y a2-helix derivadas de especies seleccionadas del grupo que consiste en Hordeum vulgare, Hordeum bulbusom, Sorghum bicolor, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italica, Oryza minuta, Oryza sativa, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Secale cereale, Malus domestica, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum,Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Beta vulgaris, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana tabacum, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Erythrante guttata, Genlisea aurea, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis arenosa, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsute, Brassica napus, Brassica oeleracia, Brassica rapa, Raphanus sativus, Brassica juncea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subsp. sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpa, Medicago truncatula, Cicer yamashitae, Cicer bijugum, Cicer arietinum, Cicer reticulatum, Cicer judaicum, Cajanus cajanifolius, Cajanus scarabaeoides, Phaseolus vulgaris, Glycine max, Astragalus sinicus , Lotus japonicus Torenia fournieri, Allium cepa, Allium fistulosum, Allium sativum, y Allium tuberosum.

La sustitución de un aminoácido especificado como se define en la Tabla 1 significará la sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en:

a) histidina, glutamina, asparagina, alanina, tirosina, fenilalanina, glicina, ácido aspártico o ácido glutámico en la posición 2,

b) triptófano o tirosina en la posición 12.

La sustitución de un aminoácido especificado como se define en la Tabla 2 significará la sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en:

a) leucina o valina en la posición 4,

b) isoleucina o leucina en la posición 7,

c) glutamina en la posición 8,

e) cisteína o leucina en la posición 25,

f) alanina o treonina en la posición 26.

En una realización particularmente preferida, la mutación provoca una sustitución de un aminoácido específico de SEQ ID No. 49. Por tanto, la planta según la presente invención comprende una sustitución de los aminoácidos especificados de SEQ ID No. 49, es decir, aquellos aminoácidos que están altamente conservados y nombrados en la secuencia consenso de SEQ ID No. 49. La sustitución de un aminoácido especificado de SEQ ID No. 49 significará la sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en:

a) asparagina en la posición 2,

b) triptófano en la posición 12.

En una realización particularmente preferida, la mutación provoca una sustitución de un aminoácido específico de SEQ ID No. 1. Así, la planta según la presente invención comprende al menos una sustitución de los aminoácidos especificados de SEQ ID No. 1, es decir, aquellos aminoácidos que están altamente conservados y nombrados en la secuencia consenso de SEQ ID No. 1. La sustitución de un aminoácido especificado de SEQ ID No. 1 significará la sustitución de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en:

a) leucina en la posición 4,

b) leucina en la posición 7,

c) glutamina en la posición 8,

d) alanina en la posición 10,

e) cisteína en la posición 25,

f) alanina en la posición 26,

En otra realización especialmente preferida, la mutación provoca una sustitución de un aminoácido específico en el buclel, en el que el aminoácido asparagina en la posición 2 de SEQ ID No. 49 se sustituye, preferiblemente por valina, o el aminoácido alanina en la posición 95 de SEQ ID No. 55 se sustituye, preferiblemente por valina, o el aminoácido prolina en la posición 121 de SEQ ID No. 52 se sustituye, preferiblemente por serina, o se sustituye el aminoácido triptófano en la posición 12 de SEQ ID No. 49, preferiblemente por una señal de parada, o se sustituye el aminoácido triptófano en la posición 127 de SEQ ID No. 52, preferiblemente por un señal de parada. En otra realización particularmente preferida, la mutación provoca una sustitución de un aminoácido específico en la hélice a2, en la que el aminoácido leucina en la posición 4 de SEQ ID No. 1 se sustituye, preferiblemente por fenilalanina, isoleucina o glutamina, o el el aminoácido leucina en la posición 132 de SEQ ID No. 52 o la posición 92 de SEQ ID No. 34 o la posición 130 de SEQ ID No. 38 o la posición 106 de SEQ ID No. 61 se sustituye, preferiblemente por fenilalanina, isoleucina o glutamina, o se sustituye la amino leucina en la posición 7 de SEQ ID No. 1, preferiblemente por prolina, o se sustituye el aminoácido leucina en la posición 109 de SEQ ID No. 61, preferiblemente por prolina, o el aminoácido glutamina en la posición 8 de SEQ ID No. 1 se sustituye, preferiblemente por una señal de parada o leucina, o se sustituye el aminoácido glutamina en la posición 114 de SEQ ID No. 58 o la posición 110 de SEQ ID No. 61, preferiblemente por una señal de parada o leucina, o el aminoácido alanina en la posición 10 de SEQ ID No. 1 se sustituye, preferiblemente por treonina, o se sustituye el aminoácido alanina en la posición 138 de SEQ ID No. 52, preferiblemente por treonina, o se sustituye el aminoácido cisteína en la posición 25 de SEQ ID No. 1, preferiblemente por tirosina, o el aminoácido cisteína en la posición 153 de SEQ ID No. 52 se sustituye, preferiblemente por tirosina, o el aminoácido alanina en la posición 26 de SEQ ID No. 1 se sustituye, preferiblemente por valina, o el aminoácido alanina en la posición 154 de SEQ ID No. 52 se sustituye, preferiblemente por valina.

En particular, la presente invención se refiere a mutaciones que provocan o conducen a una sustitución de aminoácidos dentro de la proteína CENH3, en particular el dominio CATD de la misma. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, una mutación es preferiblemente una mutación o sustitución puntual no sinónima en la secuencia de ADN que codifica la proteína CENH3 que da como resultado un cambio en el aminoácido. Esto también se llama una mutación de sentido contrario. Además, el cambio de aminoácido o la sustitución de aminoácido puede ser conservador, es decir, un cambio a un aminoácido con propiedades fisicoquímicas similares, semiconservador, por ejemplo negativo a un aminoácido cargado positivamente, o radical, es decir, un cambio a un aminoácido muy diferente.

En una realización preferida de la presente invención, la presente planta que tiene actividad biológica de un inductor haploide es homocigota con respecto a la mutación o al menos una mutación. En otra realización de la presente invención, la presente planta que tiene actividad biológica de un inductor haploide es heterocigota con respecto a la mutación o al menos una mutación.

La planta según la presente invención tiene la actividad biológica de un inductor de haploides. Esto significa que el cruce entre la planta según la presente invención y una planta de tipo salvaje o una planta que expresa la proteína CENH3 de tipo salvaje produce al menos 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, preferiblemente al menos 1 %, preferiblemente al menos 2 %, preferiblemente al menos 3 %, preferiblemente al menos 4 %, preferiblemente al menos 5 %, preferiblemente al menos 6 %, preferiblemente al menos 7 %, preferiblemente al menos 8 % , preferiblemente al menos el 9 %, lo más preferiblemente al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 % o más progenie haploide. Por lo tanto, una planta de tipo salvaje es preferiblemente una planta de la misma especie que no comprende la mutación de la planta según la presente invención dentro del gen CENH3 endógeno correspondiente, es decir, la planta es capaz de expresar la proteína CENH3 nativa, y una planta que expresa CENH3 de tipo salvaje es preferiblemente una planta de la misma especie que comprende i) una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CENH3 sin la mutación de la planta según la presente invención y es capaz de expresar dicha proteína CENH3 nativa o ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CENH3 de otra especie de planta que muestra una funcionalidad comparable a la CENH3 nativa, por ejemplo, tal proteína CENH3 derivada de otra especie de planta puede introducirse como un transgén.

Por lo tanto, la presente invención proporciona de forma más ventajosa medios y métodos para generar líneas inductoras de haploides en un amplio rango de especies de eudicotiledóneas, dicotiledóneas y monocotiledóneas. La presente invención también permite el intercambio de citoplasma materno y crear, por ejemplo, plantas de esterilidad masculina citoplasmática con un genotipo deseado en un solo paso de proceso. La presente invención es ventajosa en la medida en que se puede generar una mutación de un solo aminoácido mediante mutagénesis o cualquier otro enfoque no basado en GMO.

Así, todo el proceso de haploidización mediante la aplicación de una línea inductora de haploides caracterizada por un gen CENH3 endógeno con mutación puntual que codifica una proteína CENH3 con alteración en al menos una de las posiciones proporcionadas por la presente invención es no transgénica en una realización preferida.

En el contexto de la presente invención, un gen, alelo o proteína "endógenos" se refiere a una secuencia no recombinante de una planta tal como la secuencia se presenta en la planta respectiva, en particular en la planta de tipo salvaje. El término "mutado" se refiere a una secuencia alterada por humanos. Los ejemplos de mutaciones no transgénicas inducidas por humanos incluyen la exposición de una planta a una dosis alta de mutágeno químico, radiológico u otro con el fin de seleccionar mutantes. Alternativamente, mutaciones transgénicas inducidas por humanos, es decir, alteraciones recombinantes o ingeniería genómica, por ejemplo, por medio de nucleasas TALE, nucleasas con dedos de zinc o un sistema CRISPR/Cas, incluyen fusiones, inserciones, deleciones y/o cambios en la secuencia de ADN o de aminoácidos.

Una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos es "heteróloga o exógena a" un organismo si se origina a partir de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica a partir de su forma original. "Recombinante" se refiere a una secuencia polinucleotídica o polipeptídica alterada por humanos, es decir, transgénica. Un "transgén" se usa como se entiende el término en la técnica y se refiere a un ácido nucleico, preferiblemente heterólogo, introducido en una célula mediante manipulación molecular humana del genoma de la célula, por ejemplo por transformación molecular. Así, una "planta transgénica" es una planta que comprende un transgén, es decir, es una planta modificada genéticamente. La planta transgénica puede ser la planta inicial en la que se introdujo el transgén, así como su progenie cuyo genoma también contiene el transgén.

El término "codificación de secuencia de nucleótidos" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína específica, en particular la proteína CENH3 o partes de la misma. Las secuencias de nucleótidos incluyen tanto la secuencia de la cadena de ADN que se transcribe en ARN como la secuencia de ARN que se traduce en la proteína. Las secuencias de nucleótidos incluyen tanto las secuencias de ácido nucleico de longitud completa como las secuencias de longitud no completa derivadas de las secuencias de longitud completa.

El término "gen" se refiere a una secuencia de nucleótidos codificante y secuencias de nucleótidos reguladoras asociadas, intrones, 5' UTR y/o 3' UTR.

El término 'elemento regulador' se refiere a una secuencia, preferiblemente una secuencia de nucleótidos, ubicada corriente arriba (5'), dentro y/o corriente abajo (3') de una secuencia de nucleótidos, preferiblemente una secuencia codificante, cuya transcripción y expresión están controladas por el elemento regulador, potencialmente en conjunción con el aparato biosintético de proteínas de la célula. 'Regulación' o 'regular' se refieren a la modulación de la expresión génica inducida por elementos de la secuencia de ADN ubicados principalmente, pero no exclusivamente, corriente arriba (5') desde el inicio de la transcripción del gen de interés. La regulación puede resultar en una respuesta de todo o nada a una estimulación, o puede resultar en variaciones en el nivel de expresión génica.

Se dice que un elemento regulador, en particular una secuencia de ADN, como un promotor, está "operablemente enlazado a" o "asociado con" una secuencia de ADN que codifica un ARN o una proteína, si las dos secuencias están situadas y orientadas de manera que la secuencia de ADN reguladora afecta la expresión de la secuencia de ADN codificante,

Un 'promotor' es una secuencia de ADN que inicia la transcripción de una secuencia de ADN asociada, en particular que se ubica corriente arriba (5') desde el comienzo de la transcripción y que está involucrada en el reconocimiento y que es de la ARN-polimerasa. Dependiendo de la región promotora específica, también puede incluir elementos que actúan como reguladores de la expresión génica, como activadores, potenciadores y/o represores.

Un elemento regulador '3' (o extremo '3') se refiere a la porción de un gen que comprende un segmento de ADN, excluyendo la secuencia 5' que impulsa el inicio de la transcripción y la porción estructural del gen, que determina el sitio correcto de terminación y contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARN mensajero (ARNm) o la expresión génica. La señal de poliadenilación generalmente se caracteriza por efectuar la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación a menudo se reconocen por la presencia de homología con la forma canónica 5'-AATAAA-3'.

El término "secuencia codificante" se refiere a la parte de un gen que codifica una proteína, un polipéptido o una parte del mismo, y excluye las secuencias reguladoras que impulsan el inicio o la terminación de la transcripción.

El gen, la secuencia de codificación o el elemento regulador puede ser uno que normalmente se encuentra en la célula, en cuyo caso se denomina 'autólogo' o 'endógeno', o puede ser uno que normalmente no se encuentra en una ubicación celular, en cuyo caso es denominado 'heterólogo', 'transgénico' o 'transgén',

Un gen, una secuencia de codificación o un elemento regulador 'heterólogos' también pueden ser autólogos de la célula pero, sin embargo, están dispuestos en un orden y/u orientación o en una posición o entorno genómico que normalmente no se encuentra o no ocurre en la célula en la que se transfiere.

El término "vector" hace referencia a un constructo de ADN recombinante que puede ser un plásmido, un virus, una secuencia de replicación autónoma, un cromosoma artificial, tal como el cromosoma artificial bacteriano BAC, un fago u otra secuencia de nucleótidos, en la que al menos dos secuencias de nucleótidos, al menos al menos uno de los cuales es una molécula de ácido nucleico de la presente invención, se han unido o recombinado. Un vector puede ser lineal o circular. Un vector puede estar compuesto por un ADN o ARN monocatenario o bicatenario.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un transgén en plantas.

'Transformación', 'que transforman' y 'que transfieren' se refieren a métodos para transferir moléculas de ácido nucleico, en particular ADN, a las células, incluidos, pero no limitados a, enfoques biolísticos tales como el bombardeo de partículas, la microinyección, la permeabilización de la membrana celular con diversos tratamientos físicos, por ejemplo electroporación, o tratamientos químicos, por ejemplo tratamientos con polietilenglicol o PEG; la fusión de protoplastos o Agrobacterium tumefaciens o transformación mediada por rizogenes. Para la inyección y electroporación de ADN en células vegetales no existen requisitos específicos para los plásmidos utilizados. Pueden usarse plásmidos tales como derivados de pUC. Si se van a regenerar plantas completas a partir de tales células transformadas, se prefiere el uso de un marcador seleccionable. Dependiendo del método para la introducción de los genes deseados en la célula vegetal, pueden ser necesarias más secuencias de ADN; si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usa para la transformación de la célula vegetal, al menos el borde derecho, a menudo, sin embargo, los bordes derecho e izquierdo del plásmido Ti y Ri T-ADN tienen que estar unidos como región flanqueante a los genes a introducir. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico transferidas se integran de forma estable en el genoma o plastoma de la planta receptora.

En el contexto de la presente invención, el término "actividad biológica de un inductor de haploides" o "inductor de haploides" o "línea de inductores de haploides" se refiere a una planta o línea de plantas que tiene la capacidad de producir progenie o genotipia haploide en al menos un 0.1 %. al menos 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 %, 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, preferiblemente al menos 1 %, preferiblemente al menos 2 %, preferiblemente al menos 3 %, preferiblemente al menos 4 %, preferiblemente al menos el 5 %, preferiblemente al menos el 6 %, preferiblemente al menos el 7 %, preferiblemente al menos el 8 %, preferiblemente al menos el 9 %, lo más preferiblemente al menos el 10 %, lo más preferiblemente al menos el 15 %, lo más preferiblemente al menos el 20 % de casos cuando se cruza con una planta de tipo salvaje o una planta que expresa al menos la proteína CENH3 de tipo salvaje. Dado que los cromosomas del inductor haploide se eliminan durante la meiosis, la progenie haploide resultante solo comprende los cromosomas del progenitor de tipo salvaje. Sin embargo, en caso de que el inductor haploide fuera el progenitor del óvulo del cruce, la progenie haploide posee el citoplasma del inductor y los cromosomas del progenitor de tipo salvaje.

El término "planta" según la presente invención incluye plantas enteras o partes de tal planta entera.

Las plantas enteras son preferiblemente plantas con semillas o un cultivo. Las partes de una planta son, por ejemplo órganos/estructuras vegetativas de brotes, por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos; raíces, flores y órganos/estructuras florales, por ejemplo brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos; semilla, incluidos el embrión, el endospermo y la cubierta de la semilla; fruto y el ovario maduro; tejido vegetal, por ejemplo tejido vascular, tejido triturado y similares; y células, por ejemplo células protectoras, células fecundables, tricomas y similares; y progenie de la misma.

En cualquier caso, la planta de la presente invención comprende al menos una célula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína centrómero de histona H3 que comprende un dominio CATD, en donde la secuencia de nucleótidos comprende una mutación que provoca en el dominio CATD una alteración de la secuencia de aminoácidos de la proteína CENH3 y dicha alteración pueden conferir a la planta la actividad biológica de un inductor de haploides, preferiblemente como se especifica aquí con más detalle. Lo más preferiblemente, la mayoría o en particular todas las células de la planta de la presente invención comprenden la mutación como se describe en el presente documento.

Las especies de plantas que se pueden usar en el método de la invención son preferiblemente plantas eudicotiledóneas, dicotiledóneas y monocotiledóneas.

El término "planta" en una realización preferida se refiere únicamente a una planta completa, es decir, una planta que exhibe el fenotipo completo de una planta desarrollada y capaz de reproducirse, una etapa anterior de desarrollo de la misma, por ejemplo, un embrión de planta, o ambos.

En una realización de la presente invención, el término "planta" se refiere a una parte de una planta completa, en particular material de la planta, células vegetales o cultivos de células vegetales.

El término "célula vegetal" describe la unidad estructural y fisiológica de la planta y comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una sola célula aislada, como células protectoras estomáticas o células cultivadas, o como parte de una unidad organizada superior como, por ejemplo, un tejido vegetal o un órgano vegetal.

El término "material vegetal" incluye partes de plantas, en particular células vegetales, tejidos vegetales, en particular material de propagación vegetal, preferiblemente hojas, tallos, raíces, radículas emergidas, flores o partes de flores, pétalos, frutos, polen, tubos polínicos, filamentos de anteras, óvulos, sacos embrionarios, células fecundables, ovarios, cigotos, embriones, embriones cigóticos per se, embriones somáticos, secciones de hipocótilo, meristemas apicales, haces vasculares, periciclos, semillas, raíces, esquejes, cultivos de células o tejidos, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Por tanto, la presente invención también proporciona material de propagación vegetal de las plantas de la presente invención. Por dicho “material de propagación vegetal” se entiende cualquier material vegetal susceptible de ser reproducido sexual o asexualmente in vivo o in vitro. Particularmente preferidos dentro del alcance de la presente invención son protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, polen, células fecundables, cigotos, junto con cualquier otro material de propagación obtenido de plantas transgénicas. Partes de plantas, tales como por ejemplo flores, tallos, frutos, hojas, raíces que se originan en plantas mutadas o su progenie previamente mutada, preferiblemente transformadas, mediante los métodos de la presente invención y que por lo tanto consisten al menos en parte en células mutadas, son también objeto de la presente invención.

Preferiblemente, la planta según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en cebada (Hordeum vulgare), sorgo (Sorghum bicolor), centeno (Secede cereale), triticale, caña de azúcar (Saccharum officinarium), maíz (Zea mays), mijo cola de zorra (Setaria italic), arroz (Oriza sativa), Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, trigo (Triticum aestivum), Triticum durum, Hordeum bulbosum, falso bromo púrpura (Brachypodium distachyon), cebada marina (Hordeum marinum), hierba de cabra (Aegilops tauschii), manzana (Malus domestica), Beta vulgaris, girasol (Helianthus annuus), zanahoria australiana (Daucus glochidiatus), zanahoria silvestre americana (Daucus pusillus), Daucus muricatus, zanahoria (Daucus carota), eucalipto (Eucalyptus grandis), Elythranthe guttata, Genlisea aurea, tabaco del bosque (Nicotiana Sylvestris), tabaco (Nicotiana tabacum), Nicotiana tomentosiformis, tomate (Solanum lycopersicum), patatas (Solanum tuberosum), café (Coffea canephora), vid de uva (Vitis vinifera), pepino (Cucumis sativus), morera (Morus notabilis), berro de thale (Arabidopsis thaliana), Arabidopsis lyrata, berro de arena (Arabidopsis arenosa), Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, berro amargo ondulado (Cardamine flexuosa), hierba de pimienta (Lepidium virginicum), bolsa de pastor (Capsella bursa-pastoris), Olmarabidopsis pumila, berro peludo (Arabis hirsuta), colza (Brassica napus), brócoli (Brassica oleracea), Brassica rapa, Brassica juncacea, mostaza negra (Brassica nigra), rábano (Raphanus sativus), Eruca vesicaria sativa, naranja (cítricos sinensis), Jatropha curcas, Glycine max, y álamo negro (Populus trichocarpa).

Particularmente preferida es la planta seleccionada del grupo que consiste en cebada (Hordeum vulgare), sorgo (Sorghum bicolor), centeno (Secale cereale), Triticale, caña de azúcar (Saccharum officinarium), maíz (Zea Mays), arroz (Oriza sativa), trigo (Triticum aestivum), Triticum durum, Avena sativa, Hordeum bulbosum, Beta vulgaris, girasol (Helianthus annuus), zanahoria (Daucus carota), tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Solanum lycopersicum), patatas (Solanum tuberosum), café (Coffea canephora), vid de uva (Vitis vinifera), pepino (Cucumis sativus), berro de thale (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica napus), brócoli (Brassica oleracea), Brassica rapa, Brassica juncacea, mostaza negra (Brassica nigra), rábano (Raphanus sativus), y Glycine max.

La planta de acuerdo con la presente invención contiene en una realización preferida la secuencia de nucleótidos que codifica el CENH3 ya sea como un gen endógeno o como un transgén.

La invención se refiere en una realización preferida a una planta según la presente enseñanza, en la que la alteración se introduce en la secuencia de nucleótidos que codifica CENH3 de forma no transgénica o transgénica.

Así, preferiblemente en una realización, en la que la mutación se efectúa en el gen CENH3 endógeno, la planta obtenida no es transgénica. Preferiblemente, la mutación se efectúa mediante mutagénesis no transgénica, en particular mutagénesis química, preferiblemente mediante TILLING inducido por EMS (etilmetanosulfonato) o edición genómica direccionada.

Así, la presente invención se refiere a una planta, en la que la introducción no transgénica de la mutación que provoca en el dominio CATD una alteración de la secuencia de aminoácidos de la proteína CENH3, preferiblemente una sustitución o deleción de aminoácidos, y dicha alteración que confiere la actividad biológica de un inductor haploide se efectúa mediante mutagénesis química, en particular mediante TILLING.

En otra realización preferida, la mutación se introduce en la planta en forma de transgén. Preferiblemente, esto se hace transformando un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos el dominio CATD de CENH3 que comprende una alteración, preferiblemente tal como se describe en este documento. Los métodos para la transformación de una planta y la introducción de un transgén en el genoma de una planta son bien conocidos en la técnica anterior.

Por lo tanto, en una realización preferida se proporciona una planta en la que la introducción transgénica de la sustitución dentro de la proteína CENH3 se efectúa mediante la transformación de un vector como se define en la reivindicación 6.

Preferiblemente, para la transformación se utilizan la transformación mediada por Agrobacterium, el método de inmersión floral o el bombardeo de partículas.

En la realización preferida, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CENH3 mutada según la presente invención se transforma en la planta en forma de un transgén y uno o dos alelos del gen CENH3 endógeno se inactivan o anulan preferiblemente. Otra realización preferida, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CENH3 mutada según la presente invención se transforma en la planta en forma de un transgén y el transgén se sobreexpresa para que sea más competitivo como proteína CENH3 endógena y se prefiera durante la generación de un complejo cinetocoro.

La presente invención también proporciona una planta obtenible, en particular obtenida, mediante un método según la presente invención y que se caracteriza por tener la actividad biológica de un inductor de haploides.

En una realización preferida de la presente invención, el método para producir la planta que tiene actividad biológica de un inductor de haploides según la presente invención no es un método esencialmente biológico.

Además, la presente invención también proporciona un método para generar la planta que tiene actividad biológica de un inductor de haploides según la presente invención, que comprende los pasos de:

i) someter las semillas de una planta a una cantidad suficiente del mutágeno etilmetano sulfonato (EMS) para obtener plantas M1,

ii) permitir una producción suficiente de plantas M2 fértiles,

iii) aislar ADN genómico de plantas M2 y

iv) seleccionar individuos que posean una mutación que provoque una alteración de la secuencia de aminoácidos en el dominio CATD de CENH3 como se define en la reivindicación 1.

La presente invención se relaciona además en una realización preferida con un método para generar una planta que tiene actividad biológica de un inductor de haploides de acuerdo con la presente invención, que comprende los pasos de:

i) proporcionar un vector como se define en la reivindicación 6,

ii) transformar una célula vegetal con el vector, en el que preferiblemente la célula vegetal comprende uno o dos alelos endógenos de un gen CENH3 inactivado o anulado, y

iii) regenerar una planta que tiene la actividad biológica de un inductor haploide a partir de la célula vegetal.

a) transformar una célula vegetal con una secuencia de nucleótidos como se define en la reivindicación 5 o un vector como se define en la reivindicación 6, y

b) regenerar una planta que tiene la actividad biológica de un inductor haploide a partir de la célula vegetal.

Sin estar ligado a la teoría, en la figura se proporciona un modelo posible de cómo funciona la eliminación cromosómica uniparental en el inductor CENH3 x embriones híbridos interespecíficos CENH3 de tipo salvaje. (A) Las células fecundables probablemente derivados del inductor haploide contienen menos CENH3 o, en comparación con el tipo salvaje, una "firma requerida de transgeneración de CENH3" desconocida y reducida. Una cantidad reducida de CENH3 materno es menos probable según los estudios realizados con un reportero CENH3-GFP en los núcleos de espermas de plantas A. thaliana, pero no en las células fecundables, están marcados por CENH3. Sin embargo, todavía es posible que los CENH3 maternos residuales, que generan una "impresión centromérica", se transmitan a la progenie. (B) Dentro de unas pocas horas después de la fertilización, también el CENH3 de tipo salvaje paterno se elimina activamente del núcleo del cigoto, y (C) la recarga centromérica de CENH3-GFP en el cigoto ocurre en la etapa de 16 núcleos del desarrollo del endospermo en A. thaliana. (D) En los embriones que experimentan haploidización, la recarga centromérica de los cromosomas maternos está alterada o retrasada, lo que causa retrasos en los cromosomas debido a la inactividad del centrómero durante la anafase. Posteriormente, los cromosomas inductores de haploides micronucleados se degradarán y (E) se desarrollará un embrión haploide. Los embriones haploides contienen cromosomas derivados del padre en el fondo del citoplasma derivado de la madre.

La presente invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5.

La presente invención también se refiere a un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica al menos el dominio CATD de una proteína CENH3 comprende preferiblemente al menos la región codificante completa de CENH3, en particular el gen de CENH3.

En una realización más preferida de la presente invención, la secuencia codificante de CENH3 puede asociarse con elementos reguladores, tales como elementos reguladores 5' y/o 3', más preferiblemente con un promotor, preferiblemente un promotor constitutivo o inducible.

Además, la presente invención proporciona una célula vegetal que comprende dicha secuencia de nucleótidos o un vector que la comprende como un transgén.

En el contexto de la presente invención, el término "que comprende" como se usa aquí tiene el significado de "que incluye" o "que contiene", lo que significa que, además del elemento mencionado explícitamente, posiblemente estén presentes otros elementos.

En una realización preferida de la presente invención, el término 'que comprende' como se usa aquí también se entiende que significa 'que consiste en' excluyendo así la presencia de otros elementos además del elemento mencionado explícitamente.

En una realización preferida adicional, el término "que comprende", tal como se usa en el presente documento, también se entiende que significa "que consiste esencialmente en excluir de ese modo la presencia de otros elementos que proporcionen una contribución significativa a la enseñanza divulgada además del elemento mencionado explícitamente".

Otras realizaciones preferidas de la presente invención son el asunto objeto de las subreivindicaciones.

La invención se describirá ahora con algo más de detalle por medio de ejemplos no limitativos y dos figuras.

El protocolo de secuencia muestra:

SEQ ID No.1: la secuencia de consenso de aminoácidos de la hélice a2 de CENH3,

SEQ ID Nos. 2 a 32: secuencias de nucleótidos de cebadores utilizados en la presente enseñanza,

SEQ ID No. 33: la secuencia de nucleótidos de ADNc de la proteína p-CENH3 de tipo salvaje de Hordeum vulgare, SEQ ID No. 34: la secuencia de aminoácidos de p-CENH3 de Hordeum vulgare,

SEQ ID No. 35: la secuencia de ADNc del p-CENH3 de Hordeum vulgare (mutante de la línea 4528 de TILLING), SEQ ID No. 36: la secuencia de aminoácidos de p-CENH3 de Hordeum vulgare (mutante de la línea 4528 de TILLING), SEQ ID No. 37: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de tipo salvaje (ADNc) de A. thaliana CENH3,

SEQ ID No. 38: la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje A. thaliana CENH3,

SEQ ID No. 39: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la A. thaliana CENH3 mutada (mutante L a I),

SEQ ID No. 40: la secuencia de aminoácidos del A. thaliana CENH3 mutado (mutante L a I),

SEQ ID No. 41: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la A. thaliana CENH3 mutada (mutante L a F),

SEQ ID No. 42: la secuencia de aminoácidos del A. thaliana CENH3 mutado (mutante L a F),

SEQ ID No. 43: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de tipo salvaje (ADNc) de Beta vulgaris CENH3,

SEQ ID No. 44: la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje Beta vulgaris CENH3,

SEQ ID No. 45: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de Beta vulgaris CENH3 (mutante L a F),

SEQ ID No. 46: la secuencia de aminoácidos de Beta vulgaris CENH3 mutado (mutante L a F),

SEQ ID No. 47: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de Beta vulgaris CENH3 (mutante L a I),

SEQ ID No. 48: la secuencia de aminoácidos de Beta vulgaris CENH3 mutado (mutante L a I),

SEQ ID No. 49: la secuencia consenso de aminoácidos del bucle1 de CENH3,

SEQ ID No. 50: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica de tipo salvaje (ADN genómico) de B. napus CENH3,

SEQ ID No. 51: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de tipo salvaje (ADNc) de B. napus CENH3,

SEQ ID No. 52: la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje B. napus CENH3,

SEQ ID No. 53: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica de tipo salvaje (ADN genómico) de S. bicolor CENH3,

SEQ ID No. 54: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de tipo salvaje (ADNc) de S. bicolor CENH3,

SEQ ID No. 55: la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje S. bicolor CENH3,

SEQ ID No. 56: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica de tipo salvaje (ADN genómico) de Z. mays CENH3,

SEQ ID No. 57: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de tipo salvaje (ADNc) de Z. mays CENH3, SEQ ID No. 58: la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje Z. mays CENH3,

SEQ ID No. 59: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica de tipo salvaje (ADN genómico) de B. vulgaris CENH3,

SEQ ID No. 60: la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de tipo salvaje (ADNc) de B. vulgaris CENH3,

SEQ ID No. 61: la secuencia de aminoácidos del tipo salvaje B. vulgaris CENH3,

SEQ ID No. 62: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de B. napus mutada (mutante P121S),

SEQ ID No. 63: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de CENH3 de B. napus mutada (mutante P121S),

SEQ ID No. 64: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. napus mutada (mutante P121S),

SEQ ID No. 65: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de B. napus mutada (parada W127 mutante),

SEQ ID No. 66: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. napus mutada (parada W127 mutante),

SEQ ID No. 67: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. napus mutada (parada W127 mutante),

SEQ ID No. 68: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de B. napus mutada (mutante L132F),

SEQ ID No. 69: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. napus mutada (mutante L132F),

SEQ ID No. 70: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. napus mutada (mutante L132F),

SEQ ID No. 71: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de B. napus mutada (mutante A138T),

SEQ ID No. 72: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. napus mutada (mutante A138T),

SEQ ID No. 73: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. napus mutada (mutante A138T),

SEQ ID No. 74: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de B. napus mutada (mutante C153Y),

SEQ ID No. 75: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. napus mutada (mutante C153Y),

SEQ ID No. 76: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. napus mutada (mutante C153Y),

SEQ ID No. 77: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de B. napus mutada (mutante A154V),

SEQ ID No. 78: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. napus mutada (mutante A154V),

SEQ ID No. 79: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. napus mutada (mutante A154V),

SEQ ID No. 80: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de Z. mays mutada (mutante A107T),

SEQ ID No. 81: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de Z. mays mutada (mutante A107T),

SEQ ID No. 82: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de Z. mays mutada (mutante A107T),

SEQ ID No. 83: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de CENH3 de Z. mays mutada (mutante Q114stop),

SEQ ID No. 84: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de Z. mays mutada (mutante Q114stop),

SEQ ID No. 85: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de Z. mays mutada (mutante Q114stop),

SEQ ID No. 86: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de la CENH3 de S. bicolor mutada (mutante A95V),

SEQ ID No. 87: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de S. bicolor mutada (mutante A95V),

SEQ ID No. 88: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de S. bicolor mutada (mutante A95V),

SEQ ID No. 89: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante L106Q),

SEQ ID No. 90: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante L106Q),

SEQ ID No. 91: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante L106Q),

SEQ ID No. 92: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante L109P),

SEQ ID No. 93: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante L109P),

SEQ ID No. 94: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante L109P),

SEQ ID No. 95: la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica (ADN genómico) de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante Q110L),

SEQ ID No. 96: la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante (ADNc) de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante Q110L), y

SEQ ID No. 97: la secuencia de aminoácidos de la CENH3 de B. vulgaris mutada (mutante Q110L).

La Figura 1 muestra esquemáticamente un modelo mecánico de inducción haploide.

La Figura 2 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de Arabidopsis thaliana (primera fila), Beta vulgaris (segunda fila), Brassica napus (tercera fila), Zea mays (cuarta fila), Sorghum bicolor (quinta fila), así como un diagrama que muestra el nivel de conservación de estas cinco especies de plantas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Mutagénesis de la cebada a y BCENH3 al direccionar lesiones locales EN genomas (TILLING) Para identificar si una mutación de un solo punto de CENH3 endógeno podría dar como resultado en un inductor haploide una población de TILLING inducida por EMS de cebada diploide (Hordeum vulgare) (Gottwald et al., 2 (2009), BMC Res Notes, 258), se cribó una especie que codifica dos variantes funcionales de CENH3 (a y pCENH3) (Sanei et al., 108 (2011), Proc Natl Acad Sci USA, E498-505). Suponiendo que la complementación de cualquiera de las variantes de CENH3, una mutación funcional de aCENH3 o pCENH3 aún permitiría la generación de descendencia. Para ello, se cribó una población de TILLING de 10.279 EMS trató plantas de cebada diploide (Hordeum vulgare) del cv. Barke para identificar los alelos mutantes de a y pCENH3. Se utilizaron combinaciones de cuatro y tres cebadores Hv_aCENH3_EX1+2+3_F: AGGCAGGGTCTCAATTCCTT (SEQ ID No. 2), Hv_aCENH3_EX1+2+3_R: GTCCCATCATCCATCGTCTT (SEQ ID No. 3), Hv_aCENH3_EX4+5_F: CCCACTTCCTTGTTGTGGAC (SEQ ID No.

4), Hv_aCENH3_EX4+5_R: GGCGATAAATGTATCTTGCATTC (SEQ ID No. 5), Hv_aCENH3_EX6_F: TGGTAGCAACCAGAGCTACG (SEQ ID No. 6), Hv_aCENH3_EX6_R: ACTGGCATGTTTCCTTCTGC (SEQ ID No.

7), Hv_aCENH3_EX7_F: CGGACGGAGGGAGTATTTCT (SEQ ID No. 8), Hv_aCENH3_EX7_R: GGACATGCCCAAAGAAAGTG (SEQ ID No. 9), Hv_bCENH3_EX1+2_F: GCCAGCGAGTACTCCTACAAG (SEQ ID No. 10), Hv_bCENH3_EX1_R: TTGAGTTACCAGCCACCACTC (SEQ ID No. 11), Hv_bCENH3_EX3_F: GTCATGCACTGTGTCTTGCA (SEQ ID No. 12), Hv_bCENH3_EX3_R: TGCTAAGATCGGATAACTGTGG (SEQ ID No. 13), Hv_bCENH3_EX4_F: TGCTCCTGAACAAACTGAACC (SEQ ID No. 14), Hv_bCENH3_EX4_R: GTGGCCGTCAGTACAATCG (SEQ ID No. 15)

para amplificar todos los exones de las variantes de CENH3 a y p y partes de los intrones correspondientes, respectivamente, mediante el uso de PCR con un paso heterodúplex como se describió anteriormente (Gottwald et al., (2009), BMC Res Notes, 258). Los productos de PCR se digirieron con Kit de escisión de ADNbc y se analizaron con el Kit Mutation Discovery y Gel - kit de reactivos ADNbc en el sistema AdvanCETM FS96 de acuerdo con las pautas del fabricante (Advanced Analytical, IA, EE. UU.).

Extracción de ARN, PCR y RT-PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se aisló de raíces, hojas usando el método Trizol (Chomczynski and Sacchi, 162 (1987), Anal Biochem, 156-159) de anteras (microscópicamente escalonada entre la meiosis y el desarrollo del polen maduro), carpelo, endospermo y embrión mediante el kit de aislamiento de ARN Picopure (Arcturus) según el fabricante. La ausencia de contaminación por ADN genómico se confirmó mediante PCR utilizando cebadores GAPDH (véase la Tabla 3). 10 pl de mezcla de PCR contenían 1 pl de molde de ADNc, 5 pl de 2x Power SYBR Green p Cr Master Mix (Applied Biosystems), 0.33 mM de los cebadores directo e inverso para cada gen (véase la Tabla 3). Las reacciones se realizaron en un sistema Fast Real-Time PCR de Applied Biosystems 7900HT. La PCR se realizó utilizando las siguientes condiciones: 95°C por 10 min, seguido de 40 ciclos a 95°C por 15 s, a la temperatura de hibridación de 60°C por 60 s. Se realizaron tres réplicas técnicas para cada muestra de ADNc. El sistema Fast Real-Time PCR y los datos se analizaron con el software SDS v 2.2.2. Los niveles de transcripción de cada gen se normalizaron a GAPDH mediante la siguiente fórmula: R = 2 A(-(aG°i-aH)),ioo, donde R = cambios relativos, GOI = gen de interés y H = cuidador (GAPDH). La especificidad y la eficacia de ambos cebadores se determinaron mediante qRT-PCR utilizando una serie de diluciones de plásmidos de genes a y pCENH3 de cebada de longitud completa clonados. Un valor Ct (el ciclo de PCR en el que la señal fluorescente del colorante informador supera el nivel de fondo) para la misma cantidad de plásmido indica que ambos cebadores pueden amplificar transcritos específicos con la misma eficacia.

Tabla 3

Solo se identificaron mutaciones puntuales de sentido contrario para ambas variantes de CENH3 de cebada.

La falta de funcionalidad de las CENH3 mutadas de mutantes M2 homocigóticos se analizó mediante inmunotinción de los centrómeros con anticuerpos específicos de la variante CENH3. Cromosomas mitóticos y meióticos de H. vulgare de tipo salvaje y línea homocigótica TILLING 4528 (planta según la presente invención) se sometieron a inmunotinción con anticuerpos específicos para aCENH3 y pCENH3. Las señales de aCENH3 y pCENH3 en los centrómeros se revelaron en todos los mutantes, mientras que solo la línea homocigota TILLING 4528 que contiene una sustitución de leucina por fenilalanina en el aminoácido 92 (SEQ ID No. 36), es decir, el aminoácido en la posición 4 de la secuencia consenso SEQ ID No 1, no mostró señales centroméricas de pCENH3 en células mitóticas, meióticas y en interfase. La sustitución de leucina por fenilalanina en el aminoácido 92 de SEQ ID No. 36 de la secuencia de p-CENH3 de H. vulgare corresponde a una sustitución de un solo nucleótido de C a T en la posición 274 de la secuencia de ADNc de p-CENH3 de H. vulgare (SEQ ID No. 35).

En esta línea, solo se encontraron señales débiles de pCENH3 dispersas fuera de los centrómeros. Se han medido los niveles de transcripción de a y pCENH3 en tipo salvaje (cv Barke) (SEQ ID no. 33 y 34) y la línea TILLING 4528 con pCENH3 mutado. El nivel de expresión relativo de a y pCENH3 se midió en diferentes tejidos usando cebadores específicos (Tabla 3). Se preparó ADNc a partir de ARN total y los niveles de expresión génica se normalizaron al nivel de expresión de gliceril fosfato deshidrogenasa (GRPTA). Obviamente, la carga centromérica de la variante pCENH3 mutada parece estar alterada, mientras que no se encontró un nivel de transcripción diferente entre el tipo salvaje y el PCENH3 mutado. Por lo tanto, los centrómeros compuestos exclusivamente de aCENH3 son suficientes para la función del centrómero mitótico en la cebada, ya que no se encontraron defectos obvios de segregación cromosómica, tal como puentes de anafase, así como cambios de ploidía o valores de ciclo. Además, no se observaron cambios evidentes en el habitus de la planta en las plantas mutantes. En particular, no se pudieron detectar diferencias significativas en el fenotipo, los niveles de ploidía, los valores del ciclo y el fenotipo de crecimiento entre las plantas homocigotas de la línea TlLLING 4528 y la cebada de tipo salvaje.

Se abordó el problema de si la falta de pCENH3 se compensa con aCENH3 adicional para mantener la función del centrómero en el mutante. Por lo tanto, las señales de inmunotinción de aCENH3 de tipo salvaje (126 centrómeros medidos) y de la línea 4528 (56 centrómeros medidos) se cuantificaron comparativamente mediante mediciones de intensidad de píxeles. Un aumento del 19.8 % de aCENH3 en el mutante indica que el pCENH3 faltante se compensa parcialmente con aCENH3 incorporado adicionalmente. La mutación pCENH3 está ubicada en un dominio de direccionamiento evolutivamente altamente conservado (CATD) definido por partes de la hélice a1, el bucle 1 y la hélice a2 del pliegue de la histona. Este dominio es necesario para la carga del centrómero de CENH3 por chaperones.

Inmunotinción indirecta

La inmunotinción indirecta de núcleos y cromosomas se llevó a cabo como se describió anteriormente (Sanei et al., 108 (2011), Proc Nati Acad Sci USA, E498-505). Se detectó CENH3 de cebada con anticuerpos anti-aCENH3 específicos de cobaya y anticuerpos específicos de conejo anti-pCENH3. Se usó un anticuerpo específico de HTR12 de conejo (abcam, ab72001) para la detección de A. thaliana CENH3 (AtCENH3). Las señales de epifluorescencia se registraron con una cámara CCD enfriada (ORCA-ER, Hamamatsu). La obtención de imágenes se realizó utilizando un microscopio Olympus BX61 y una cámara CCD ORCA-ER (Hamamatsu). Para analizar las estructuras de las inmunoseñales y la cromatina a una resolución óptica de ~100 nm (superresolución) se aplicó Microscopía de Iluminación Estructurada (SIM) usando un objetivo C-Apo 63*/1.2W Korr de un sistema de microscopio Elyra y el software ZEN (Zeiss, Alemania). Las imágenes se capturaron por separado para cada fluorocromo usando filtros de excitación y emisión apropiados. Las imágenes se fusionaron utilizando el software Adobe Photoshop 6.0. Para determinar la cantidad de a y pCENH3 en los núcleos, se midieron las intensidades de fluorescencia utilizando el software TINA 2.0 en proyecciones de máxima intensidad generadas a partir de apilamientos de secciones SIM ópticas a través de las muestras mediante el software ZEN. Se estableció un umbral de intensidad para restar computacionalmente los píxeles de fondo de la imagen. La suma corregida de los valores grises de todas las señales dentro del núcleo se utilizó para determinar el contenido de CENH3. La representación 3D basada en apilamientos de imágenes SIM se realizó utilizando el software ZEN.

Ejemplo 2: Arabidopsis thaliana

Para probar si la mutación en el dominio CATD causó la carga alterada del centrómero observada, eYFP se fusionó en el extremo N con la secuencia de codificación (CDS) de CENH3 de A. thaliana (SEQ ID No. 37, proteína: SEQ ID No. 38) con un L/I (leucina/isoleucina) (CDS: SEQ ID No. 39, proteína SEQ ID No. 40) o L/F (leucina/fenilalanina) (CDS: SEQ ID No. 41, proteína SEQ ID No. 42) intercambio de las posiciones correspondientes (L130I o L130F, correspondiente a la posición de aminoácido 92 en pCENH3 de cebada, es decir, la posición de aminoácido 4 de la secuencia consenso SEQ ID No. 1) en CENH3 de A. thaliana. La sustitución de leucina por isoleucina en la posición 130 de A. thaliana corresponde a una única sustitución de nucleótido de C a A en la posición 388 de SEQ ID no. 37.

La sustitución de aminoácidos de leucina a fenilalanina en la posición 130 es causada por dos sustituciones de nucleótidos, a saber, TC a AT en las posiciones 387 y 388 de SEQ ID No. 37.

Doble marcaje de transgénicos A. thaliana con el CENH3 de tipo anti-salvaje correspondiente y el anti-GFP revelaron una focalización significativamente reducida en el centrómero de los CENH3 mutados.

A continuación, para probar la capacidad inductora de haploides se utilizaron constructos genómicos de CENH3 de A. thaliana con un intercambio L130I o L130F para transformar plantas heterocigotas de A. thaliana con inactivación de CENH3 Ravi and Chan, Nature, 464 (2010), 615-618). El genotipificado identificó mutantes nulos homocigóticos de CENH3 que se complementaron con constructos genómicos de CENH3 de tipo salvaje, L1301 o L130F. Como se obtuvieron plantas diploides viables que contenían cualquiera de los constructos, es probable que esta mutación no perjudique la función del centrómero en plantas homocigotas de A.thaliana. Cuando los mutantes nulos de CENH3 que expresan una proteína L130F CENH3 con mutación puntual se cruzaron con el tipo salvaje, los cromosomas del mutante se eliminaron, produciendo una progenie haploide. El análisis de citometría de flujo reveló que el 10.7% de las plantas F1 eran haploides.

Clonación y generación de transgenes CENH3

Para generar fragmentos genómicos de CENH3 portadores de mutaciones, lo que da como resultado fenilalanina 130 (F130) e isoleucina 130 (I130) en lugar de leucina 130 de tipo salvaje (L130), un fragmento genómico de CENH3 en el vector pCAMBIA1300 utilizado para complementar cenh3-1/cenh3-1 (cenh3 mutante nulo) (Ravi and Chan, Nature, 464 (2010), 615-618; Ravi et al., Genetics, 186 (2010), 461-471) fue subclonado a través de los sitios únicos HindIII y BamHI en pBlueScript II KS (Strategene, www.stratagene.com). Las mutaciones de CENH3, L130I o L130F se generaron en pBlueScript II KS usando un Kit Phusion® de mutagénesis dirigida al sitio (Finnzymes, www.fmnzymes.com) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con cambios menores como se describe. Se utilizaron los siguientes cebadores fosforilados en 5' para la mutagénesis: CH3A+L130_F_for, CENH3L130_I_for y CENH3L130_F+I_rev. Los fragmentos genómicos de CENH3 mutados se subclonaron a través de los sitios únicos HindIII y BamHI en el pCAMBIA1300 inicial que contenía un marcador de resistencia a la higromicina. Todas las construcciones fueron verificadas por secuenciacion. Para los cebadores, véase la Tabla 3, anterior.

Para generar los constructos de fusión p35S::eYFP-CENH3 que contienen mutaciones dentro de la CENH3 CDS, dando como resultado L130I o L130F, se utilizó como plantilla un plásmido (p35S-BM; Schmidt, www.dna-cloning.com) que contenía una expresión p35S::eYFP-CENH3 (Lermontova, 18 (2006), Plant Cell, 615-618) para el Kit Phusion® de mutagénesis dirigida al sitio (Finnzymes, www.finnzymes.com). Los cebadores y las estrategias para introducir las mutaciones deseadas fueron los mismos que los anteriores. Los casetes de expresión resultantes (35Spro, eYFP-(mutado)CENH3 y terminador NOS) se subclonaron a través de sitios de restricción SfiI únicos en el vector pLH7000 que contenía un marcador de resistencia a la fosfinotricina (Schmidt, www.dna-cloning.com) y verificado por secuenciación.

Transformación de plantas, condiciones de cultivo y polinización cruzada.

Plantas heterocigotas A. thaliana de tipo salvaje (SEQ ID No. 37 y 38) y cenh3-1/CENH3 (ambas de la accesión Columbia-0) fueron transformadas por el método de inmersión floral (Clough and Bent, 16 (1998), Plant J, 735-743). Las progenies transgénicas se seleccionaron en medio sólido de Murashige y Skoog que contenía el antibiótico correspondiente. Las plantas se germinaron en placas de Petri en condiciones de día largo (20 °C 16 h de luz/18 °C 8 h de oscuridad), se cultivaron durante 4 semanas en condiciones de día corto (20 °C 8 h de luz/18 °C 16 h de oscuridad) y luego se cambiaron a condiciones de día largo de nuevo. Para el crucce, los brotes cerrados de mutantes cenh3 A. thaliana fueron emasculadas extrayendo las anteras inmaduras con la ayuda de fórceps. Los estigmas de las yemas emasculadas se fertilizaron con el polen amarillento de las anteras maduras de flores de tipo salvaje de A. thaliana recién abiertas.

Extracción de ADN y genotipificado de A. thaliana

Las preparaciones de ADN genómico y el genotipificado basado en PCR se realizaron utilizando métodos estándar, el ^aDⁿse extrajo de acuerdo con Edwards et al. (1991), Nucleic Acids Res 19, 1349,

Las plantas fueron genotipificadas para cenh3-1 en una reacción de genotipificado dCAPS. Los cebadores dCAPS, cenh3-1mut_for y cenh3-1_mut_rev, se usaron para amplificar CENH3. Los amplicones se digirieron con EcoRV y se resolvieron en un gel. El alelo mutante cenh3-1 no se corta (215 pb) mientras que el el alelo WT CENH3 se corta (191 y 24 pb). Para los cebadores, véase la Tabla 3. Para genotipificar el locus CENH3 endógeno para cenh3-1 en la descendencia de plantas cenh3-1/CENH3 transformadas con el locus CENH3 genómico (transgén CENH3 no marcado con L130, L130I o L130F), se realizó una reacción de PCR inicial con un cebador fuera del locus CENH3 del transgén, lo que permitió la amplificación específica del locus CENH3 endógeno y no transgénico. Los cebadores usados fueron cenh3-1_mut_for y cenh3-1_mut2320r/cenh3-1_mut2429r. Los amplicones se purificaron y usaron como plantilla para una segunda reacción de genotipificado de PCR con dCAPS como se describió anteriormente para plantas cenh3-1. Para los cebadores, véase la Tabla 3. La presencia de transgén se verificó por PCR.

Análisis de citometría de flujo de plantas y semillas.

Para los análisis de ploidía de citometría de flujo de plantas, se cortaron simultáneamente cantidades iguales de material foliar de 5 a 10 individuos en tampón de aislamiento de núcleos (Galbraith et al. (1983), Science 220, 1049 1051) complementado con RNasa libre de DNas (50 pg/ml) y yoduro de propidio (50 pg/ml) con una hoja de afeitar afilada. Las suspensiones de núcleos se filtraron a través de un filtro de células de 35 pm en tubos de poliestireno de 5 ml (BD Biosciences) y se midieron en un clasificador de células FACStarPLUS (BD Biosciences) equipado con un láser de iones de argón INNOVA 90C (Coherent). Se midieron y analizaron aproximadamente 10,000 núcleos usando el software CELL Quest ver. 3.3 (BD Biosciences), los histogramas resultantes se compararon con un histograma de referencia que representaba una planta diploide de tipo salvaje. En los casos en los que se detectó un pico adicional en la posición haploide, las plantas se midieron individualmente de nuevo para identificar a los individuos haploides.

El aislamiento de núcleos de las semillas se realizó como se describe anteriormente utilizando el tampón de aislamiento de núcleos MA VI (100 mM Tris-HCl, 5.3 mM MgCh, NaCl 86 mM, citrato de sodio 30.6 mM, Triton X-100 1.45 mM, pH 7.0; complementado con 50 pg/ml de RNasa libre de DNas y 50 pg/ml de yoduro de propidio). Las suspensiones de núcleos se midieron en un clasificador de células FACSAria (BD Biosciences) y se analizaron usando el software FACS Diva ver. 6.1.3 (BD Biociencias). De manera similar a lo anterior, las primeras 10 a 20 semillas se agruparon para identificar líneas con embriones haploides y, en un segundo paso, semillas individuales se cortaron junto con material foliar de Raphanus sativus (Genebank Gatersleben, número de acceso: RA 34) como referencia interna para confirmar la ocurrencia de semillas haploides.

Ejemplo 3: Beta vulgaris

Además, la importancia funcional de la mutación identificada también se analizó en la remolacha azucarera. Beta vulgaris. Se generaron constructos de indicadores RFP que contienen el ADNc de Beta vulgaris CENH3 (SEQ ID No.

43, proteína SEQ ID No. 44) con un intercambio L106F (S^eQ ID No. 45, proteína SEQ ID No. 46) o L106I (SEQ ID No.

47, proteína SEQ ID No. 48) (correspondiente a la posición de aminoácido 92 de la cebada, la posición de aminoácido 4 de la secuencia consenso SEQ ID No. 1) y se usaron para la transformación estable de la remolacha azucarera y se detectó un direccionamiento reducido en el centrómero de las CENH3 mutadas.

La sustitución de aminoácidos de leucina a fenilalanina en la posición 106 es causada por dos sustituciones de nucleótidos, a saber, C a T en la posición 316 y G a T en la posición 318 de SEQ ID no. 43.

La sustitución de aminoácidos de leucina a isoleucina en la posición 106 es causada por dos sustituciones de nucleótidos, a saber, C por A en la posición 316 y G por T en la posición 318 de SEQ ID no. 43.

Transformación de plantas y condiciones de cultivo

Se transformaron hojas de tipo salvaje de Beta vulgaris de plantas de 6 a 8 semanas de edad (cultivadas en condiciones de invernadero semicontroladas) transientemente mediante bombardeo con partículas (300 |jg de oro recubierto con 0.5 jg de ADN plasmídico). Las hojas bombardeadas se incubaron durante 48 - 72 h (25 °C, 16 h de luz (350 jm o lm 'V ) / 8h oscuridad) antes del análisis microscópico. La transformación estable de callo de B. vulgaris se realizó como se describe en Lindsey & Gallois, 1990 (Journal of experimental botany, 41(5), 529-536) (selección vía kanamicina). Después de aprox. 2 meses (24°C 16 h luz (55 jm o lirr2s'1)/8 h de oscuridad) se analizaron microscópicamente las células del callo.

Clonación y generación de transgenes de CENH3

Para generar el constructo de fusión 35S::RFP-CENH3, CENH3 se amplificó a partir de ADNc de remolacha azucarera con los siguientes cebadores:

BvCENH3-cds1: GGATCCATGAGAGTTAAACACACTGC (SEQ ID No. 16), BvCENH3-cds2: GGATCCTGTTCAGTTACCATCCCCTC (SEQ ID No. 17),

clonado en un vector que contiene un casete de expresión 35Pro, RFP y 35S-terminador Para constructos que contienen mutaciones dentro de la secuencia de codificación CENH3, lo que resulta en F106 e I106 en lugar de L106, el plásmido mencionado anteriormente que contiene el casete de expresión 35S::RFP-CENH3 se usó como plantilla para la mutagénesis basada en cebadores. El sitio PstI cercano a la posición de la mutación deseada se usó para dividir CENH3 en dos partes. A través de mutaciones en los cebadores se integraron las mutaciones deseadas: BvCENH3 mut Fw: ATGGATCCATGAGAGTTAAACACACTGC (SEQ ID No. 18), BvCENH3_L->F_Rv: CTCTGCAGCCTCTTGAAGGGCCATAAAAGC (SEQ ID No. 19), BvCENH3_L->I_Rv: CTCTGCAGCCTCTTGAAGGGCCATAATAGC (SEQ ID No. 20).

Casetes de expresión resultantes (35Spro, RFP-(mutado)CENH3 y 35S-terminador) fueron verificados por secuenciación.

Análisis de unión a CENH3 en B. vulgaris

Para analizar la unión de CENH3 y CENH3 mutado, se analizó material de hoja o callo utilizando un objetivo Korr C Apo 63x/1.2W de un sistema de microscopio Axio Imager M2 y el software ZEN (Zeiss, Alemania).

Ejemplo 4: Identificación y prueba de otros mutantes de CENH3

Para la identificación de otras mutaciones de un solo punto dentro del gen endógeno de CENH3 que provocan una sustitución de aminoácidos o una deleción de uno o más aminoácidos de la secuencia del CENH3 traducido. Incluso si Ravi und Chan 2010 destacaron solo la importancia particular del dominio N terminal, los estudios descritos anteriormente sobre mutantes en otra parte de CENH3 como a2-helix (Ejemplo 1 a 3) dieron indicaciones de que la modificación del dominio CATD de CENH3 puede resultar en una desestabilización de las capacidades de unión a CENH3 al ADN. Por lo tanto, la atención se centró en la identificación de otras mutaciones dentro de CATD, en particular en bucle1 y la hélice a2. Adicionalmente, debe demostrarse que debido al alto nivel de conservación del dominio CATD entre las especies, una mutación identificada tiene el potencial de conferir la actividad biológica de un inductor haploide a diferentes especies de plantas.

Para ello, se han generado poblaciones de TILLING que tienen altas tasas de mutación para otras dos plantas monocotiledóneas, a saber, para el maíz (Zea mays) y sorgo (Sorghum bicolor), y para dos plantas dicotiledóneas, a saber, semillas de colza (Brassica napus) y remolacha azucarera (Beta vulgaris). Con el fin de detectar mutaciones en el gen CENH3 endógeno que dan como resultado al menos una sustitución de un aminoácido o una deleción de al menos un aminoácido en el dominio CATD de la proteína CENH3 traducida, los amplicones que cubren todos los exones de los genes CENH3, así como partes de los intrones correspondientes, respectivamente, se han desarrollado como el ejemplo descrito anteriormente para la cebada (Ejemplo 1) y se han analizado entre 1000 y 10000 individuos por especie de planta mediante el método de secuenciación de Sanger. Además, las plantas de remolacha azucarera M2 han sido analizadas para detectar mutaciones utilizando PCR específico.

Además, el efecto de la mutación identificada dentro del gen CENH3 sobre la estructura primaria y secundaria de la proteína codificada se ha evaluado utilizando, entre otros, el software Prof (Rost, B. and Sander, C. (1994a). Combinando información evolutiva y redes neuronales para predecir la estructura secundaria de proteínas. Proteins, 19(1), 55-72. Rost, B. and Sander, C. (1994b). Conservación y predicción de la accesibilidad de disolventes en familias de proteínas. Proteins, 20(3), 216-26. Rost, B., Casadio, R., Fariselli, P., and Sander, C. (1995). Hélices transmembrana predichas con un 95 % de precisión. Protein Sci, 4(3), 521-33.).

La falta de funcionalidad de los CENH3 mutados de mutantes homocigóticos se ha probado, por ejemplo, mediante inmunotinción de centrómeros con anticuerpos específicos de CENH3 como se ha descrito anteriormente (Ejemplos 1 y 2). Las líneas TILLING identificadas mostraron una carga centromérica significativamente reducida o deteriorada por el CENH3 mutado. Las plantas que tenían un genoma que era heterocigoto para tales mutaciones eran viables y no se observaron cambios obvios en el hábito de la planta, es decir, el fenotipo, los niveles de ploidía, los valores del ciclo y el crecimiento fueron comparables a las correspondientes plantas de tipo salvaje con respecto a la precisión estadística.

La actividad biológica de un inductor haploide en los mutantes identificados se evaluó cruzando las plantas mutantes con una planta de prueba de la misma especie: La planta de prueba lleva la forma de tipo salvaje de CENH3. Se ha probado el rendimiento tanto materno como paterno de la inducción haploide. Para ello, las plantas mutantes se han utilizado como progenitores de óvulos o como progenitores de polen en el cruce con la planta de ensayo. La supuesta progenie haploide de este cruce se puede determinar rápidamente si las líneas de prueba usadas portan una mutación recesiva no CENH3. Entonces, las plantas haploides muestran el fenotipo recesivo. Por ejemplo, en el maíz se puede usar la manifestación de la mutación glossy (Mutants of maize, Neuffer, MG et al. 1997.Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). La progenie haploide de estos cruces se puede determinar rápidamente si las líneas de prueba usadas portan una mutación recesiva no CENH3. Entonces, las plantas haploides muestran el fenotipo recesivo. Por ejemplo, en el maíz se puede usar la manifestación de la mutación glossy (Mutants of maize, Neuffer, MG et al. 1997.Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York).

Además, los análisis citogenéticos de mitosis y meiosis con los inductores indican también la idoneidad de los mutantes como inductores haploides y se ha determinado la homocigosidad mediante el uso de marcadores moleculares, polimórficos para el probador y el inductor potencial. La haploidía como tal podría probarse citogenéticamente.

Las siguientes tablas muestran las mutaciones de sentido contrario y deleción que confieren la actividad biológica de un inductor haploide a las especies de plantas investigadas:

Tabla 4: mutación del CENH3 derivada de Brassica napus (aa: aminoácido; nd: no determinado, y: sí, n: no). La sustitución de aminoácidos se da como X#Y, es decir, el aminoácido X (código de una letra) se sustituye por el aminoácido Y en la posición #.

Tabla 5: mutación del CENH3 derivada de Zeamays (aa: aminoácido; nd: no determinado, y: sí, n: no). La sustitución de aminoácidos se da como X#Y, es decir, el aminoácido X (código de una letra) se sustituye por el aminoácido Y en la posición #.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Planta que tiene actividad biológica de un inductor haploide y que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína centrómero de histona H3 (CENH3) que comprende un dominio CATD, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una mutación que causa en el dominio CATD una alteración de la secuencia de aminoácidos de la proteína CENH3 y dicha alteración le confiere la actividad biológica de un inductor haploide en la que la mutación causa una sustitución de un aminoácido en la posición 2 o 12 de la secuencia endógena correspondiente a la secuencia consenso representada por SEQ ID NO: 49; o

en la que la mutación causa una sustitución de un aminoácido en la posición 4, 7, 8, 10, 25 o 26 de la secuencia endógena correspondiente a la secuencia consenso representada por SEQ ID NO: 1.

2. Planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el cruce entre la planta y una planta de tipo salvaje o una planta que expresa la proteína CENH3 de tipo salvaje produce al menos 0.1% de progenie haploide.

3. Planta de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la secuencia de nucleótidos que comprende la mutación es un gen endógeno o un transgén.

4. Planta de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la secuencia de nucleótidos que comprende la mutación es un transgén y al menos un gen endógeno que codifica una proteína CENH3 está inactivado o anulado.

5. Secuencia de nucleótidos que codifica una proteína centrómero de histona H3 (CENH3) que comprende un dominio CATD, que comprende una mutación que causa en el dominio CATD una alteración de la secuencia de aminoácidos de la proteína CENH3 y dicha alteración confiere la actividad biológica de un inductor haploide,

en la que la mutación causa una sustitución de un aminoácido en la posición 2 o 12 de una secuencia endógena correspondiente a la secuencia consenso representada por SEQ ID NO: 49; o

en la que la mutación causa una sustitución de un aminoácido en la posición 4, 7, 8, 10, 25 o 26 de una secuencia endógena de CENH3 correspondiente a la secuencia consenso representada por SEQ ID NO: 1.

6. Vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 5.

7. Célula vegetal o célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 6 como un transgén.

8. Un método de generación de una planta de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, que comprende los pasos de: a) transformar una célula vegetal con la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 6, y