ES2955617T3

ES2955617T3 - Organismos diseñados por ingeniería metabólica para la producción de bioproductos de valor añadido

Info

Publication number: ES2955617T3
Application number: ES17169628T
Authority: ES
Inventors: Jo Maertens; Joeri Beauprez; Mey Marjan De
Original assignee: Inbiose NV
Current assignee: Inbiose NV
Priority date: 2010-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2023-12-04
Anticipated expiration: 2031-07-12
Also published as: US20250051813A1; CN107603935A; MX2020011714A; JP6599498B2; JP5998130B2; MX2020011690A; MX386398B; CA2804713C; MX353506B; DE202011111144U1; NZ605093A; US20200140908A1; MX2020011713A; EP2593549A2; US11384374B2; US12098403B2; MX2013000460A; SG186836A1; EP4242320A3; US9701992B2

Abstract

La presente invención se refiere a organismos genéticamente modificados, especialmente microorganismos tales como bacterias y levaduras, para la producción de bioproductos de valor agregado tales como sacáridos especiales, sacáridos activados, nucleósidos, glucósidos, glicolípidos o glicoproteínas. Más específicamente, la presente invención se refiere a células huésped que están diseñadas metabólicamente para que puedan producir dichos valiosos productos especiales en grandes cantidades y a un ritmo elevado evitando los problemas técnicos clásicos que ocurren en los procesos de producción biocatalíticos o fermentativos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Organismos diseñados por ingeniería metabólica para la producción de bioproductos de valor añadido

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a E. coli y S. cerevisae diseñados por ingeniería genética para la producción de bioproductos de valor añadido, tales como sacáridos, glucolípidos y glucoproteínas especiales. Más específicamente, la presente invención se refiere a E. coli y S. cerevisae diseñados por ingeniería metabólica para poder producir dichos productos valiosos en grandes cantidades y en una tasa elevada, evitando los problemas técnicos clásicos que se producen en los procesos de producción biocatalítica o fermentativa.

Antecedentes de la técnica

El coste en aumento de los recursos petroleros contribuye a una conciencia creciente del potencial de los procesos de producción biológica. Esto ha intensificado los esfuerzos de investigación de las empresas y los centros de investigación hacia el desarrollo de tecnologías económicamente viables y benignas con el medio ambiente para la producción de un número creciente de bioproductos, por ejemplo, biocombustibles, productos bioquímicos y biopolímeros. Estos son fácilmente degradables y se producen con requisitos mínimos de energía y corrientes de desechos. A pesar del contexto favorable para los procesos de producción basados en biotecnología industrial, el desarrollo de alternativas a rutas de síntesis química bien establecidas requiere a menudo demasiado tiempo y es demasiado costoso para ser económicamente viable. En consecuencia, existe una clara demanda de un desarrollo más rápido y económico de nuevas cepas de producción.

Hoy en día, los oligosacáridos se sintetizan normalmente a través de procesos de bioconversión. Comúnmente se utilizan enzimas aisladas y purificadas (denominadas bioconversiones in vitro) y los biocatalizadores de células enteras. En esencia, estos convierten uno o más precursores en un bioproducto deseado.

Sin embargo, la aplicación de bioconversiones in vitro se ve a menudo obstaculizada ya que la síntesis del producto puede requerir múltiples pasos enzimáticos o se requieren cofactores adicionales (NADH, NADPH, UTP,...), que son costosos.

Otro inconveniente de la síntesis in vitro es el hecho de que la expresión y la purificación de muchas enzimas es laboriosa y su proceso de purificación puede resultar en una disminución de la actividad enzimática. Además, cada enzima en tal proceso de bioconversión multienzimática tiene sus propios parámetros de proceso óptimos, dando lugar a esquemas de optimización muy complicados. En tal proceso, los equilibrios de reacción desempeñan también un papel importante. Por ejemplo, cuando se utiliza una fosforilasa, se dispondrá de una relación sustrato/producto que limita el rendimiento del producto. Esto lleva a esquemas de procesamiento posteriores complicados para separar el producto del sustrato (33, 35).

La ingeniería metabólica es otro enfoque para optimizar la producción de bioproductos de valor añadido, tales como carbohidratos especiales. Comúnmente, las células enteras han sido diseñadas por ingeniería metabólica para producir bioproductos de valor añadido partiendo de un precursor suministrado. En este contexto, las células están diseñadas por ingeniería de tal manera que se eliminan todas las vías metabólicas implicadas en la degradación del (de los) precursor(es) (3, 45, 70, 77, 100). De este modo, el (los) precursor(es) se convierte(n) eficiente y directamente en el producto deseado.

Un inconveniente principal de este último enfoque es el hecho de que la síntesis de biomasa y la biosíntesis de bioproductos prevista requieren metabolitos de partida diferentes. Por ejemplo, E. coli fue diseñada por ingeniería metabólica para la producción eficiente de 2-desoxi-escilo-inonosa partiendo de glucosa. Esta estrategia hace que la E. coli diseñada por ingeniería metabólica no sea apta para crecer en glucosa, requiriéndose la adición de otros sustratos, por ejemplo glicerol, para permitir la síntesis de biomasa (45).

Un segundo inconveniente de los sistemas de producción de células enteras es que existe una necesidad de dos fases, una fase de crecimiento, en la que se forma biomasa (o síntesis de biomasa), seguida de una fase de producción del producto previsto. Esto significa que la fase de crecimiento y la fase de producción están separadas en el tiempo (fases consecutivas). Esto da como resultado tasas de producción general muy bajas del (de los) producto(s) deseado(s). Además, este tipo de proceso es difícil de optimizar. De hecho, los procesos de fermentación se han desarrollado haciendo uso de células diseñadas por ingeniería metabólica que sobreexpresan genes de vía de producción. Una gran cantidad de sustrato se convierte en biomasa, dando lugar únicamente a un flujo menor de sustrato hacia el producto (13).

Las desventajas descritas anteriormente son superadas por organismos diseñados por ingeniería metabólica como se describe en este documento o según la invención reivindicada, que son capaces de producir productos deseados con una productividad elevada y un rendimiento elevado garantizado (Figura 1). Esto se consigue dividiendo claramente el metabolismo del organismo en dos partes: 1) una llamada 'parte de producción' o 'vía de producción', y 2) una parte de 'suplemento de biomasa y cofactor' o 'vía de formación de biomasa y/o enzima biocatalítica'. Estas dos partes se crean dividiendo un azúcar en: a) un sacárido activado y b) un sacárido (no activado). Cada uno de estos sacáridos a) o b) son, o pueden ser, los primeros precursores de la vía de producción a) de biomasa y/o vías de formación de enzima biocatalítica b), permitiendo un mecanismo de arrastre/impulso en la célula.

De hecho, la síntesis de biomasa, que es el objetivo principal de la célula, convierte el sacárido activado o el sacárido en biomasa y desplaza el equilibrio de la reacción que divide el azúcar hacia el sacárido activado y el sacárido. De esta manera, el impulso de mantenimiento de vida de la célula actúa como un mecanismo de arrastre para la vía del producto. Este efecto de arrastre es creado por la síntesis de biomasa al asegurar la acumulación de la primera molécula de sustrato de la vía de producción, que también impulsa la vía de producción como tal y a su vez. Esta estrategia resuelve el problema de la tasa de producción que se produce en las estrategias de producción de dos fases como se describe en el estado de la técnica. Además, al catabolizar una parte de la fracción de azúcar, la célula siempre se suministra con los cofactores necesarios y los requisitos energéticos requeridos para la producción del bioproducto especial. Por lo tanto, la actual estrategia resuelve también el problema del suplemento de cofactor que se requiere en la producción biocatalítica como se describe en el estado de la técnica. Además, las enzimas necesarias en la vía de producción se sintetizan siempre de manera eficiente y se mantienen fácilmente a través de la estrategia de diseño por ingeniería de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: (A) Una reacción de equilibrio normal que se produce en las tecnologías de producción actuales (b) principio de arrastre/impulso: el equilibrio se desplaza hacia el sacárido y el sacárido activado. El principal objetivo de una célula es crecer, por lo tanto arrastra el sacárido (por ejemplo) para formar biomasa ("vía de formación de biomasa y/o enzima biocatalítica") y suplementa los cofactores necesarios para la vía de producción junto al mantenimiento de vida. Debido a este efecto de arrastre, el sacárido activado se acumulará en la célula e impulsará la vía de producción.

Figura 2: La tasa de crecimiento de transformantes de E. co lien un medio mínimo que lleva un plásmido que codifica una sacarosa fosforilasa. (Las abreviaturas se indican en la Tabla 2).

Figura 3: Flujo de carbono proyectado en la cepa de tipo salvaje. Flecha pequeña: indica reacciones en el metabolismo Flecha en negrita: indica reacciones introducidas mejoradas o novedosas Cruz: indica la inactivación de un gen o la reducción de su funcionalidad

Figura 4: Flujo de carbono proyectado en la cepa base 1. La reserva de aglucosa-1-fosfato (aG1P) en la cepa base 1 aumenta porque se eliminan las reacciones principales que convierten aG1 P en componentes celulares. Flecha pequeña: indica reacciones en el metabolismo Flecha en negrita: indica reacciones introducidas mejoradas o novedosas Cruz: indica la inactivación de un gen o la reducción de su funcionalidad

Figura 5: La reserva de aglucosa-1-fosfato en el tipo salvaje E. coli MG1655 (WT) cultivado en glucosa, E. coli MG1655 P22-BaSP cultivada en sacarosa y en la cepa de conector MG1655 AglgC Apgm AlacZ P22-BaSP cultivada en sacarosa: experimentos de matraz de agitación y experimentos por lotos de 1,5 L.

Figura 6: Evolución de la concentración de sacarosa, acetato y biomasa durante un cultivo de ApgmAlacZAglgC (3KO) P22-BaSP en medio LB tamponado.

Figura 7: Evolución de la concentración de aglucosa-1-fosfato, fructosa, glucosa y piruvato durante un cultivo de ApgmAlacZAglgC (3KO) P22-BaSP en medio LB tamponado.

Figura 8: Vista esquemática del productor de celobiosa ApgmAlacZAglgC (3KO) P22-BaSP-CuCP.

Figura 9: Producción y rendimiento de celobiosa de ApgmAlacZAglgCAagp (4KO) P22-BaSP-CuCP. Alto contenido en fosfato indica una concentración de fosfato de fosfato 0,2 M, bajo contenido en fosfato indica una concentración de fosfato 13 mM.

Figura 10: Partiendo de la ceba base 5, se pueden producir derivados de azúcar fucosilados y más específicamente de 1,2-fucosilactosa. La cepa se modifica para forzar la célula a producir fructosa-6-fosfato, que es un intermedio en la síntesis de GDP-fucosa. La glucosa o glucosa-1-fosfato (si la enzima de partida es una sacarasa o una sacarosa fosforilasa) se alimenta entonces al metabolismo de carbono central a través de la vía de pentosa fosfato. La Fig. 10 muestra la ruta hacia el producto y la biomasa y las inactivaciones necesarias para conseguir esto, la vía izquierda indica la ruta óptima con una sacarosa fosforilasa y la vía derecha indica la ruta óptima con una invertasa combinada con glucoquinasa.

Figura 11: Secuencia genómica parcial del cromosoma de tipo salvaje en la localicación del gen pgm. La secuencia del gen pgm está marcada en negrita/cursiva.

Figura 12: Secuencia genómica parcial de una cepa muíante en la que solo queda una cicatriz en la ubicación del gen pgm. La secuencia de la cicatriz está marcada en negrita/cursiva.

Figura 13: Secuencia genómica parcial de una cepa mutante de pgm en la que el gen pgm se reemplaza por una parte de una secuencia de proteína GFP. La secuencia recién introducida está marcada en negrita/cursiva.

Figura 14: Secuencia genómica parcial de una cepa mutante de pgm en la que el gen pgm se reemplaza por casete de kanamicina. La secuencia recién introducida está marcada en negrita/cursiva.

Figura 15: La cantidad de glucosa que se liberó tras la hidrólisis de polisacáridos para las cepas de tipo salvaje transformadas con una sacarosa fosforilasa heteróloga procedente de Bifidobacterium adolescentis y una cepa mutante ApgmAagpAglgCAacZAglkAptsG con una sacarosa fosforilasa heteróloga procedente de Bifidobacterium adolescentis y un gen heterólogo tts procedente de Streptococcus pneumoniae

Figura 16: Kojibiosa, maltosa y evolución de la densidad óptica en tiempo de una cepa productora de kojibiosa con el genotipo AlacZAglgCAagpAptsGAmalPQAycjU pCXp22MPp22KP.

Figura 17: Perfil de crecimiento y acumulación F6P de una cepa mutante ApgiApfkAApfkB en un medio basado en sacarosa.

Figura 18: Árbol filogenético de fucosiltransferasas de las diferentes familias de glucosiltransferasa, el árbol fue construido con MCoffee (58)

Figura 19: Alineamiento de fucosiltransferasa de Dictyostelium discoideum y Helicobacter pylori, los aminoácidos marcados en color son motivos conservados hallados en las 2-fucosiltransferasas de la familia de GT 11. La negrita indica el motivo 1, subrayado el motivo 2, y la cursiva el motivo 3 (67).

Figura 20: Resultados LC-MS del ensayo de fucosiltransferasa con rojo de fenol. El cromatograma superior es el blanco sin GDP-glucosa, el inferior es una muestra del ensayo de D. discoideum fucosiltransferasa. En el cromatograma apareció un pico de 13,5 min de 2FL.

Figura 21: Análisis de 2-fucosilactosa LC MSMS de la enzima fucosiltransferasa. El cromatograma superior muestra un estándar de 100 mg/l de 2-fucosilactosa, el cromatograma inferior muestra el pico de 2-fucosilactosa del ensayo enzimático. En este análisis solo fue escaneada la masa de 2-fucosilactosa con el espectrómetro de masas.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona la materia como se establece en una y en todas las reivindicaciones adjuntas 1 a 10.

La presente invención divulga E. coli y S. cerevisae diseñadas por ingeniería metabóllica, que son capaces de producir bioproductos de valor añadido con una alta productividad y un rendimiento elevado garantizado. Los organismos de la presente invención están diseñados por ingeniería metabólica de modo que se construyen dos rutas diferentes que conducen al producto y al crecimiento/biomasa Esto se consigue mediante eliminación de la actividad de las reacciones catalizadoras de enzimas que convierten metabolitos de la 'biomasa y/o enzima biocatalítica y/o parte de suplemento de cofactor' en metabolitos de la parte de 'vía de producción’ y viceversa, mediante eliminación/inactivación de al menos uno, algunos o todos los genes que codifican enzimas que realizan reacciones que convierten los intermedios de la vía de producción en precursores de biomasa, y por ejemplo mediante reducción o eliminación/inactivación de al menos uno, algunos o todos los genes que codifican enzimas que realizan las reacciones que degradan los intermedios de la vía de producción. Además, estos cambios metabólicos/genéticos no perjudican el crecimiento de las células diseñadas por ingeniería. Una sacarosa fosforilasa se introduce en la célula. Esta última enzima convierte los sustratos que comprenden un sacárido, un oligosacárido, un polisacárido o una mezcla de los mismos en una fracción de azúcar y una fracción de azúcar activada (una fracción de sacárido fosforilada). El diseño por ingeniería metabólica adicional de la célula implica el bloqueo de la vía a partir de la fracción de azúcar hacia los constituyentes de la biomasa. De esta manera, la fracción de azúcar activada se utiliza como 'combustible' (o fuente de energía) y bloque de construcción para la síntesis de biomasa, de las numerosas enzimas biocatalíticas que realizarán la conversión de la fracción de azúcar (no activada) al producto deseado (= por ejemplo un carbohidrato especial) y a los cofactores necesarios (NADH, ATP, UTP ...). La fracción de azúcar activada se utiliza como 'combustible', mientras que la fracción de azúcar es activada por una quinasa de carbohidrato e 'impulsada' a la ruta de producción del producto especial deseado.

Utilizando los organismos diseñados por ingeniería de la presente invención, la formación del producto a través de la conversión del azúcar (no activado) puede vincularse al crecimiento que es alimentado por la otra fracción de azúcar activada. De esta manera, el impulso natural de la célula para la multiplicación se utiliza como una ventaja para impulsar la producción del bioproducto deseado. Esto significa que el antiguo inconveniente de tener que producir biomasa antes de que pueda iniciarse la producción real del bioproducto, ahora se convierte en un beneficio. Esta metodología da como resultado tasas de producción elevadas, con los problemas inherentes que se producen con sistemas multienzimáticos y sistemas de fermentación bifásicos. Además, los organismos de la presente invención pueden utilizar el (los) mismo(s) sustrato(s) que se indican anteriormente para crecimiento o producción de biomasa y producción del producto deseado en una tasa elevada, el principio general subyacente a esta estrategia de diseño por ingeniería metabólica es, por lo tanto, un principio de arrastre/impulso como se explicó también anteriormente. El metabolismo de carbono central que conduce a la biomasa arrastra una parte de la fracción de azúcar para el crecimiento, mientras que la otra parte se acumula en la célula, impulsando la vía de producción.

Este último enfoque no solo se puede utilizar para producir los carbohidratos especiales deseados o carbohidratos activados, sino que también se puede aplicar para la síntesis de una amplia variedad de compuestos glucosilados, por ejemplo sacáridos, nucleósidos, glicosilfosfatos, glucoproteínas y glucolípidos.

La presente invención se refiere a E. coli diseñada por ingeniería metabólica para la producción de al menos un producto especial elegido entre el grupo formado por un sacárido, un sacárido activado, un nucleósido, un glucósido, un glucolípido y una glucoproteína, caracterizado por que:

a) dicha E. coli está modificada genéticamente con la introducción de un gen que codifica una sacarosa fosforilasa, y

b) dicha E. coli está además modificada genéticamente mediante inactivación de los genes pgi, pfkA y pfkB.

La presente invención se refiere a S. cerevisae diseñada por ingeniería metabólica para la producción de al menos un producto especial elegido entre el grupo formado por un sacárido, un sacárido activado, un nucleósido, un glucósido, un glucolípido y una glucoproteína, caracterizado por que:

a) dicho S. cerevisae está modificada genéticamente con la introducción de un gen que codifica una sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis, y

b) dicho S. cerevisae está además modificado genéticamente mediante inactivación de los genes PGM1, PFK1 y PFK₂, y adicionalmente mediante inactivación de los genes SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C y YGR87c.

El término 'sacárido' se refiere a los monosacáridos tales como, entre otros, aldosas, cetosas, pentosas, metilpentosas, hexosas, polioles con o sin grupos carbonilo, carboxilo, amino o en los que un grupo hidroxilo es sustituido, entre otros, por un grupo hidrógeno, amino, tiol, fosfato y/o similar o un derivado de estos grupos. El término 'sacárido' se refiere también a di-, oligo- y polisacáridos que están formados por uno o más monosacáridos como se describen anteriormente, unidos entre sí por medio de un enlace glucosídico.

El término 'nucleósido' se refiere a cada monosacárido que se sustituye por un nucleótido que es, por ejemplo, entre otros, UDP, GDP, ADP, TDP, CMP, o dTDP.

El término 'glicósido' se refiere a un sacárido que forma un enlace glucosídico con otros compuestos químicos, tales como, entre otros, esteroles, fenoles, ácidos grasos, fosfatidilinositoles, vitamina C, cartenoides y artimisina.

El término 'glucolípido' se refiere a un sacárido que forma un enlace glucosídico con un ácido graso o un lípido.

El término 'glucoproteína' se refiere a un sacárido que forma un enlace glucosídico con una proteína.

El término 'glicosilfosfato' se refiere a un sacárido fosforilado.

La presente invención se refiere además a un organismo como se indica anteriormente, estando además este organismo modificado genéticamente con la introducción de al menos otro gen que convierte dicho sacárido en un producto especial o estando sobreexpresado al menos otro gen endógeno de dicho organismo que convierte dicho sacárido en un producto especial.

Además, la presente invención se refiere a un organismo como se indicó anteriormente, en el que dicho organismo es capaz de crecer en un disacárido, oligosacárido, polisacárido o una mezcla de los mismos como fuente principal de carbono. Con el término 'principal' se indica la fuente de carbono más importante para la formación de biomasa, es decir, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % de todo el carbono requerido se deriva de la fuente de carbono indicada anteriormente. En una realización de la invención, dicha fuente de carbono es la única fuente de carbono para dicho organismo, es decir, 100 % de todo el carbono requerido se deriva de la fuente de carbono indicada anteriormente.

El término 'ingeniería metabólica' se refiere a la práctica de la optimización de procesos genéticos y reguladores dentro de dicho organismo para aumentar la producción del organismo de una determinada sustancia o producto deseado. En el presente documento, este último producto se denomina 'producto especial’ y se refiere específicamente a un sacárido deseado (activado o no activado), un nucleósido, un glucósido, un glucolípido o una glucoproteína. Algunos ejemplos no limitantes de tales productos son derivados de azúcar como 1,2-fucosilactosa, 1,3-fucosilactosa, 1,4-fucosilactosa, 1,6-fucosilactosa, galactinol, estaquiosa, globotriosa, galactosa(beta1-4)ramnosa, soforosa, celobiosa, UDP-glucosa, soforolípidos, mio-inositol, L-arabinosa, escilo-inososa, glicosilfosfatidilinositol, lacto-N-biosa, lacto-N-tetraosa, lactosamina, galactosiloligosacáridos fucosilados, L-fucosa, N-Ac glucosamina, ácido siálico, sialilactosa, quitosano y quitina.

El término 'ingeniería' se refiere a cualquier técnica bien conocida que pueda utilizarse para modificar genéticamente un organismo como se describe por ejemplo en (9, 17, 19, 21,22, 42).

Los términos 'un organismo capaz de crecer en un disacárido, oligosacárido, polisacárido o una mezcla de los mismos como fuente principal de carbono' significa que los organismos de la presente invención pueden utilizar el mismo disacárido, oligosacárido, polisacárido o una mezcla de los mismos para el crecimiento (o producción de biomasa) y la producción del producto deseado, y pueden utilizar estos últimos sacáridos como la única fuente de carbono para multiplicarse y/o ser metabólicamente activos. En resumen, los organismos de la presente invención son capaces de multiplicarse y metabolizarse en o sobre un medio que comprende dichos sacáridos como la única fuente de carbono.

Con los términos 'división (o conversión) en un sacárido activado y un sacárido' se indica que estos últimos sacáridos que se utilizan como fuente de carbono serán divididos (o convertidos) por el organismo de la presente invención en una fracción de azúcar activada, restos de azúcares que portan un grupo fosfato, y una fracción de azúcar no activada que no porta o no está enlazada a un fosfato, un grupo UDP, GDP, ADP, TDP o dTDP.

El término 'enzimas biocatalíticas' se refiere a todas las enzimas requeridas para la producción del carbohidrato especial.

El término 'biomasa' se refiere a todos los componentes celulares (es decir, proteínas, ADN, ARN, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, cardiolipina, fosfatidilglicerol, putrescina, espermidina, peptidoglicano, glucógeno y/o liposacárido (63) que pueden sintetizarse en la cepa modificada de producción de carbohidratos especiales a partir de la fracción de azúcar que no se utiliza en la ruta de producción de carbohidratos especiales (y otros productos de valor añadido).

Los términos 'genes que se vuelven menos funcionales o no funcionales' se refieren a las tecnologías bien conocidas por una persona experta (tales como el uso de siRNA, RNAi, miRNA, asRNA, genes mutantes, genes de inactivación, mutagénesis de transposones, ...) que se utilizan para cambiar los genes de manera que sean menos capaces (es decir, estadísticamente 'menos capaces' de manera significativa en comparación con un gen funcional de tipo salvaje) o completamente incapaces (como los genes inactivados) de producir productos finales funcionales (2, 4, 5, 7, 8, 14, 19, 37, 40, 47, 73, 79, 80, 85, 93, 98).

El término '(gen) inactivado' se refiere de este modo a un gen que se vuelve no funcional.

El término 'polisacárido' se refiere a un sacárido que contiene 6 o más subunidades de monosacárido.

El término 'organismo' como se indica anteriormente se refiere a una bacteria perteneciente a la especie Escherichia co lio una levadura perteneciente a la especie Saccharomyces cereviseae.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un organismo diseñado por ingeniería metabólica como se indicó anteriormente, en el que dicho sacárido activado es alfa glucosa-1 -fosfato y en el que dicho sacárido es fructosa.

En realizaciones, los siguientes genes en el paso b) pueden volverse además no funcionales: un gen que codifica una beta-galactosidasa y/o un gen que codifica una glucosa-1-fosfato adenililtransferasa y/o un gel que codifica una fosfatasa (por ejemplo glucosa-1 -fosfatasa) y/o un gen que codifica fosfogluconato dehidratasa y/o un gen que codifica 2-ceto-3-desoxigluconato-6-fosfato aldolasa y/o un gen que codifica una glucosa-1 -fosfato uridiltransferasa y/o un gen que codifica una UDP-glucosa-4-epimerasa y/o un gen que codifica una UDP-glucosa: galactosa-1-fosfato uridiltransferasa y/o un gen que codifica una UDP-galactopiranosa mutasa y/o un gen que codifica una UDP-galactosa; (glucosil)lipopolisacárido-1,6-galactosiltransferasa y/o un gen que codifica una UDP-galactosiltransferasa y/o un gen que codifica una UDP-glucosiltransferasa y/o un gen que codifica una UDP-glucuronato transferasa y/o un gen que codifica una UDP-glucosa transferasa portadora de lípidos y/o un gen que codifica GPD-manosa hidrolasa y/o un gen que codifica una UDP-azúcar hidrolasa y/o un gen que codifica una manosa-6-fosfato isomerasa y/o un gen que codifica una UDP-N-acetilglucosamina enoilpiruvoil transferasa y/o un gen que codifica una UDP-N acetilglucosamina acetiltransferasa y/o un gen que codifica una UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerasa y/o un gen que codifica una undecaprenil-fosfato-alfa-N-acetilglucosaminiltransferasa y/o glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa y/o un gen que codifica una L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa y/o un gen que codifica una manosa-6-fosfato isomerasa y/o un gen que codifica una sorbitol-6-fosfato deshidrogenasa y/o un gel que codifica una manitol-1 -fosfato-5-deshidrogenasa y/o un gen que codifica una alulosa-6-fosfato 3-epimerasa y/o un gen que codifica una invertasa y/o un gen que codifica una maltasa y/o un gen que codifica una trehalasa, y/o un gen que codifica una fosfotransferasa transportadora de azúcar y/o un gen que codifica una hexoquinasa.

Más específicamente, en realizaciones de la E. coli,

dichos genes adicionales en el paso b) pueden ser: el gen lacZ, el gen glgC, el gen agp, el gen waaB, el gen ushA, el gen eda, el gen edd, el gen wcaA, el gen wcaC, el gen wcaE, el gen wcal, el gen wcaL, el gen wcaJ, el gen wcaB, el gen wcaF, el gen wcaK, el gen wcaD, el gen galU, el gen galF,, el gen galE, el gen gmm, el gen galT,, el gen manA, el gen murA, el gen IpxA, el gen rffE y/o el gen rfe, el gen glmS, el gen srlD, el gen mtlD, el gen alsE y/o zwf (6, 20, 25, 28, 29, 32, 43, 44, 46, 49, 52-55, 62, 65, 75, 78, 82, 86, 87, 96, 97, 101).

En realizaciones de S. cerevisae, dichos genes adicionales en el paso b) pueden ser: el gen PGI1, el gen PFK₂6, el gen PFK₂6, el gen PFK₂7, el gen GND1, el gen GND2, el gen PMI40, el gen ZWF1, el gen GFA1, el gen GLG1, el gen GLG2, el gen INM1, el gen INM2, el gen GLK1, el gen HXK1, el gen HXK₂, el gen GAL10, el gen GAL7, el gen YHL012W, el gen UGP1, el gen GSY1, el gen GSY2, el gen DIE2, el gen ALG8, el gen ATG26, y/o FEN1 y/o FKS1 y/o GSC2 y/o TPS1 (12, 15, 16, 24, 26, 30, 31, 34, 36, 38, 39, 41,51,56, 57, 59-61,64, 66, 74, 76, 83, 84, 89, 90, 95, 99).

Los organismos diseñados por ingeniería según la invención reivindicada pueden utilizarse, por ejemplo, para producir derivados de azúcar fucosilados como la fucosilactosa, y más específicamente a-1,2-fucosilactosa, a-1,3-fucosilactosa, a-1,4-fucosilactosa, a-1,6-fucosilactosa como productos especiales con fucosiltransferasas específicas procedentes, por ejemplo, entre otros, de Helicobacter pylori, Bacteroides sp., Homo sapiens, Mus musculus, Bos taurus y Dictyostelium discoideum. Además, dicho organismo diseñado por ingeniería se puede utilizar para producir quitosanos por medio de una quitina sintasa y quitina deacetilasa o para producir mio-inositol mediante introducción de 1-fosfato de inositol sintasa en combinación con inositol monofosfatasa.

En realizaciones, dicho producto especial es un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un tetrasacárido, un pentasacárido, un oligosacárido, un polisacárido, un nucleósido, un O-glucósido, un S-glucósido, un N-glucósido, un C-glucósido, una glucoproteína, un glucolípido o un carbohidrato activado como, entre otros, mio-inositol, L-arabinosa, escilo-inososa, glicosilfosfatidilinositol, lacto-N-biosa, lacto-N-tetraosa, lactosamina, galactosiloligosacáridos fucosilados (GOS), L-fucosa, N-Ac glucosamina, ácido siálico, quitosano, quitina, 1,2-fucosilactosa, 1,3-fucosilactosa, 1,4-fucosilactosa, 1,6-fucosilactosa, galactinol, estaquiosa, globotriosa, galactosa(beta1-4)ramnosa, soforosa, celobiosa, UDP-glucosa y soforolípidos.

La presente invención se refiere además a un método para producir un derivado de azúcar fucosilado que comprende:

i) ingeniería metabólica de un microorganismo mediante la introducción de un gen que codifica una sacarosa fosforilasa mediante inactivación de los genes pgi, pfkA y pfkB, mediante la introducción de un gen que codifica a-1,2-fucosiltransferasa procedente de H. pylori, Bacteroides sp., H. sapiens, M. musculus, B. taurus o D. discoideum, mediante sobreexpresión de los genes manA, cpsG, cpsB, gmd and fcl, y mediante inactivación de los genes gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, wcal, wcaJ, wcaK, wcaL y wcaM, edd y eda, y

ii) cultivo de dicha E. coli diseñada por ingeniería metabólica, y

iii) extracción y purificación de dicho derivado de azúcar fucosilado.

Está claro que cualquier metodología conocida en la técnica para cultivar microorganismos y, para extraer y purificar productos especiales a partir de dicho cultivo, puede ser empleada en la presente invención.

Además, en el presente documento, aunque no según la invención reivindicada, se divulga el uso de una 2-fucosiltransferasa procedente de Dictyostelium discoideum y que tiene una secuencia de aminoácidos dada por SEQ ID N° 1, o un fragmento de la misma que tiene actividad de 2-fucosiltransferasa o una variante de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos 75 % y que tiene actividad de 2-fucosiltransferasa para producir 2-fucosilactosa (a1,2-fucosilactosa). Un fragmento específico que tiene actividad de 2-fucosiltransferasa como se indicó anteriormente viene dado por SEQ ID N° 4.

En el presente documento también se divulga, pero no según la invención reivindicada, el uso de un ácido nucleico que codifica una 2-fucosiltransferasa como se indicó anteriormente, y específicamente en el que dicho ácido nucleico viene dado por SEQ ID N° 2 o SEQ ID N° 3 (que codifican ambos para s Eq ID N° 1), para producir fucosilactosa. Los ácidos nucleicos que codifican SEQ ID N° 4 vienen dados por SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6 y también son parte de la presente invención.

El término 'fragmento' se refiere a una proteína (o péptido o poliproteína) que contiene menos aminoácidos que la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID N° 1 y que mantiene dicha actividad de 2-fucosiltransferasa. Tal fragmento puede ser, por ejemplo, una proteína con una deleción de 10 % o menos del número total de aminoácidos en el extremo C y/o N o puede corresponder a SEQ ID N° 4. El término "variante" se refiere a una proteína que tiene al menos 75 % de identidad de secuencia, preferiblemente que tiene al menos 76-85 % de identidad de secuencia, de modo más preferente que tiene al menos 86-90 % de identidad de secuencia y del modo más preferente que tiene al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con Se Q ID N° 1 o con un fragmento de la misma y que codifica una proteína que mantiene dicha actividad de 2-fucosiltransferasa.

Por lo tanto, los ortólogos o genes en otros géneros y especies (diferentes a Dictyostellium discoideum del cual se deriva SEQ ID N° 1) con al menos 75 % de identidad a nivel de aminoácidos, y que tienen la función descrita, se divulgan en el presente documento pero no según la invención reivindicada. El porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se determina mediante el alineamiento de dos secuencias y la identificación del número de posiciones con aminoácidos idénticos dividido por el número de aminoácidos en la más corta de las secuencias x 100. Esta última 'variante' puede diferir también de la proteína representada por SEQ ID N° 1 solo en sustituciones conservadoras y/o modificaciones, de modo que se mantiene la capacidad de la proteína para tener actividad de 2-fucosiltransferasa. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de química de proteínas esperaría que la naturaleza de la proteína se mantuviera sustancialmente inalterada. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Las variantes también pueden (o alternativamente) ser proteínas como se describe en el presente documento, modificadas, por ejemplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tienen una mínima influencia en la actividad de 2-fucosiltransferasa como se definición anteriormente, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática de la enzima.

Las siguientes secuencias específicas, como se indicó anteriormente, se divulgan pero no según la invención reivindicada:

SEQ ID N° 1: la secuencia completa de aminoácidos de la 2-fucosiltransferasa de Dictyostellium discoideum:

SEQ ID N°2: la secuencia de nucleótidos de codón optimizado que codifica SEQ ID N°1 para expresión en E. Coli:

SEQ ID N°3: la secuencia nativa de nucleótidos que codifica SEQ ID N°1: la 2-fucosiltransferasa de Dictyostelium discoideum:

SEQ ID N°4: la secuencia de aminoácidos de un fragmento de SEQ ID N° 1 que tiene actividad de fucosiltransferasa:

SEQ ID N° 5: la secuencia de ácidos nucleicos de codón optimizado que codifica SEQ ID N° 4 con un ATG añadido:

SEQ ID N°6: la secuencia nativa de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID N°4:

La presente invención se ilustra a continuación por medio de ejemplos de trabajo específicos 15, 28 y 31. Los ejemplos 1-14, 16-27, 29, 30 y 32-40 no son según la invención reivindicada y están presentes solo con fines ilustrativos. Ejemplos

Ejemplo 1. Materiales y métodos

medios

El medio del caldo Luria (LB) consistía en triptona peptona al 1 % (Difco, Erembodegem, Bélgica), extracto de levadura al 0,5 % (Difco) y cloruro sódico al 0,5 % (VWR, Lovaina, Bélgica). El medio para los experimentos con matraces de agitación contenía 2,00 g/l de NH4Cl, 5,00 g/l de (NH4)₂SO₄, , 2.993 g/l de KH₂PO₄, 7,315 g/l de K₂HPO₄, 8,372 g/l de MOPS, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de MgSO₄-7H₂O, 14,26 g/l de sacarosa u otra fuente de carbono cuando se especifique en los ejemplos, 1 ml/l de disolución de vitamina, 100 |jl/l de disolución de molibdato y 1 ml/l de disolución de selenio. El medio se ajustó a un pH de 7 con KOH 1M.

La disolución de vitaminas consistía en 3,6 g/l de FeCl2 ■ 4H₂O, 5 g/l de CaCl2 ■ 2H₂O, 1,3 g/l de MnCl2 ■ 2H₂O, 0,38 g/l de CuCl2 ■ 2H₂O, 0,5 g/l de CoCl2 ■ 6H₂O, 0,94 g/l de ZnCl2, 0,0311 g/l de H3BO₄, 0,4 g/l de Na₂EDTA- 2H₂O y 1,01 g/l de tiamina ■ HCl. La disolución de molibdato contenía 0,967 g/l de Na₂MoO₄■ 2H₂O. La disolución de selenio contenía 42 g/l de SeO₂.

El medio mínimo para fermentaciones contenía 6,75 g/l de NH4Cl, 1,25 g/l de (NH4)₂SO₄, 1,15 g/l de KH₂PO₄(medio con bajo contenido en fosfato) o 2,93 g/l de KH₂PO₄y 7,31 g/l de KH₂PO₄(medio con alto contenido en fosfato), 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de MgSO₄-7H₂O, 14,26 g/l de sacarosa, 1 ml/l de disolución de vitaminas, 100 gl/l de disolución de molibdato y 1 ml/l de disolución de selenio con la misma composición descrita anteriormente.

El medio complejo se esterilizó mediante empleo de autoclave (121 °C, 21') y el medio mínimo mediante filtración (Sartorius 0,22 gm). En caso necesario, el medio se hizo selectivo mediante la adición de un antibiótico (ampicilina, cloranfenicol, kanamicina).

Condiciones de cultivo

Se incubó un precultivo de una sola colonia en una placa LB en 5 ml de medio LB durante 8 horas a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm. Desde este cultivo se transfirieron 2 ml a 100 ml de cultivo mínimo en un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 16 horas a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm. Se utilizó un inóculo al 4 % en un vaso de cultivo Biostat B Plus de 2 l con 1,5 l de volumen de trabajo (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania). Las condiciones de cultivo eran: 37 °C, agitación a 800 rpm y tasa de flujo de gas de 1,5 l/min. Se mantuvieron condiciones aeróbicas mediante inyección de aire. El pH se mantuvo en 7 con H²SO⁴0,5 M y KOH 4 M. El gas de escape se enfrió a 4 °C mediante un refrigerador de escape (Frigomix 1000, Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania). Se añadió una disolución al 10 % de agente antiespumante de silicona (BDH 331512K, VWR Int Ltd., Poole, Inglaterra) al ascender la espuma durante la fermentación (aproximadamente 10 gl). El gas de descarga se midió con un analizador de gas de descarga EL3020 (ABB Automation GmbH, 60488 Frankfurt am Main, Alemania). Todos los datos se registraron con el sistema Sartorius MFCS/win v3.0 (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania).

Todas las cepas se cultivaron al menos dos veces y las desviaciones estándar dadas sobre rendimientos y tasas se basan en al menos 10 puntos de datos tomados durante los experimentos repetidos.

Muestreo

El biorreactor contiene en su interior un tubo de recolección (aguja espinal BD. 1,2x152 mm (BDMedical Systems, Franklin Lakes, NJ - USA) conectado a un puerto del reactor, unido en el exterior a una tubería Mastertlex-14 (Cole-Parmer, Antwerpen, Bélgica), seguido de un puerto de recolección con un septum para el muestreo. El otro lado de este puerto de recolección está conectado de vuelta al vaso del reactor con un tubo Mastertlex-16. Este sistema se denomina circuito de muestreo rápido. Durante el muestreo, el caldo del reactor se bombea en el circuito de muestreo. Se ha calculado que, con una tasa de flujo de 150 ml/min, el caldo del reactor necesita 0,04 s para llegar al puerto de recolección y 3,2 s para volver a entrar en el reactor. A un nivel de pO₂de 50 %, hay alrededor de 3 mg/l de oxígeno en el líquido a 37 °C. El nivel de pO₂nunca debe ser inferior a 20 % para evitar condiciones microaeróbicas. Por lo tanto, durante el tránsito a través del circuito de muestreo pueden consumirse 1,8 mg/l de oxígeno. Suponiendo una tasa de absorción de oxígeno de 0,4 g de oxígeno/g de biomasa/h (la tasa máxima de absorción de oxígeno hallada en gmax), esto da para 5 g/l de biomasa una tasa de absorción de oxígeno de 2 g/l/h o 0,56 mg/l/s, que, multiplicada por 3,2 s (tiempo de residencia en el circuito) da 1,8 mg/I de consumo de oxígeno.

Para extinguir el metabolismo de células durante el muestreo se succionó el caldo del reactor a través del puerto de recolección en una jeringa llena con 62 de perlas de acero inoxidable enfriadas previamente a -20 °C, para enfriar 5 ml de caldo inmediatamente a 4 °C. El muestreo fue seguido inmediatamente de un centrifugado en frío (15000 g, 5 min, 4 °C). Durante los experimentos por lotes se tomaron muestras para OD⁶⁰⁰nm, CDW y metabolitos extracelulares cada hora utilizando el circuito de muestreo rápido y el método de muestreo con perlas inoxidables en frío. Al alcanzar crecimiento exponencial se aumentó la frecuencia de muestreo a cada 20 a 30 minutos.

Muestreo de caldo

Utilizando un muestreo rápido, que estaba acoplado al fermentador, se extrajeron muestras de 1 ml de caldo en 0,5 s. Las muestras se extrajeron directamente en tubos que contenían 5 ml de disolución de extinción enfriada previamente a -40 °C, que se mezclaron inmediatamente después del muestreo mediante agitación de vórtice. Los tamaños exactos de las muestras se cuantificaron mediante gravimetría pesando los tubos antes y después del muestreo.

Muestreo de filtrado

Las muestras de fluido de cultivo extracelular se obtuvieron mediante filtración con jeringa (tamaño de poro 0,45 gm, acetato de celulosa) a temperatura ambiente sin perlas, por filtración directa de la muestra de caldo después de eliminar las células, el filtrado o sobrenadante se mezcló inmediatamente con 5 ml de disolución de extinción para procesar estas muestras de la misma manera que las muestras de caldo. También en este caso, la cantidad exacta de muestra obtenida se cuantificó mediante gravimetría.

Procedimiento de extinción

La disolución de extinción utilizada era metanol acuoso al 60 % (v/v). Después de extinguir las muestras de caldo en la disolución de enfriamiento, enfriada previamente a -40 °C, la mezcla de muestra/disolución de extinción se centrifugó durante 5 min a 8000 g en una centrífuga enfriada (-20 °C) utilizando un rotor enfriado previamente a -40 °C. Tras la decantación, el sobrenadante (QS) se almacenó a -40 °C hasta la extracción. Posteriormente, los gránulos celulares se resuspendieron en 5 ml de disolución de extinción a -40 °C y se centrifugaron de nuevo. También este segundo sobrenadante (WS) se almacenó a -40 °C hasta la extracción. Para la medición de metabolitos en el caldo total, así como en el filtrado de cultivo, se aplicó el mismo procedimiento de extinción; sin embargo, las mezclas de caldo total extinguidas (B) o los filtrados de cultivo extinguidos (F) no se centrifugaron, sino que, tras agitación de vórtice, se extrajeron 500 gl de estas mezclas para la extracción de metabolitos.

Procedimiento de extracción de metabolitos

La extracción de metabolitos de los gránulos celulares, así como de las muestras de 500 gl del caldo total extinguido se realizó con el método de etanol caliente [34]. Los metabolitos se extrajeron en etanol en ebullición al 75 % (3 min, 90 °C). Tras el enfriamiento, los extractos obtenidos de este modo se evaporaron hasta sequedad en un RapidVap (Labconco Corporation, Kansas, Missouri, USA) durante 110 min bajo vacío. Tras resuspensión de cada residuo en 500 gL de H₂O se eliminaron desechos celulares mediante centrifugado durante 5 min a 5000 g. Tras la decantación se almacenaron los sobrenadantes a -80 °C hasta el posterior análisis.

Métodos analíticos

La densidad celular del cultivo se controló frecuentemente mediante medición de la densidad óptica a 600 nm (espectrofotómetro Uvikom 922, BRS, Bruselas, Bélgica). El peso celular en seco se obtuvo por centrifugado (15 min, 5000 g, rotor GSA, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Bélgica) de 20 g de caldo de reactor en halcones presecados y pesados. A continuación, los gránulos se lavaron una vez con 20 ml de disolución fisiológica (9 g/l NaCl) y se secaron a 70 °C hasta un peso constante. Para poder convertir las mediciones de OD⁶⁰⁰nm en concentraciones de biomasa, se realizó una curva de correlación de la OD⁶⁰⁰nm con la concentración de biomasa. Las concentraciones de glucosa y ácidos orgánicos se determinaron en un sistema Varian Prostar HPLC (Varian, Sint-Katelijne-Waver, Bélgica) utilizando una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Eke, Bélgica) calentada a 65 °C, equipada con una columna de 1 cm, utilizando H₂SO₄5 mM (0,6 ml/min) como fase móvil. Para la detección de picos se utilizó un detector UV-VIS de doble onda (210 nm y 265 nm) (Varian Prostar 325) y un detector de índice de refracción diferencial (Merck LaChrom L-7490, Merck, Lovaina, Bélgica). Los picos se pudieron identificar mediante división de las absorciones de los picos en 265 y 210 nm. La división da como resultado un valor constante, típico para un determinado compuesto (fórmula de Beer-Lambert).

Medidas de carbohidratos

Se midieron glucosa, fructosa, sacarosa y glucosa-1-fosfato por HPLC con una columna Hypercarb (100x4,6 mm; tamaño de partícula 5gm) y se detectaron con detector ELSD o espectrómetro de masas (Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006). Los LOQ de sacarosa y G1P eran 30 y 20 mg/l, respectivamente. Todas las muestras se diluyeron dentro del rango lineal del detector, que se encuentra entre el LOQ y aproximadamente 100 mg/l del metabolito. Cuando en el caldo estaban presentes múltiples azúcares fosforilados y nucleótidos se aplicó una adaptación del método de Bucholz et al (11). En este caso se utilizó un gradiente de agua milliQ (A) y acetato amónico 20mM (B). El gradiente comenzó a 100 % de A con un flujo de 1 ml/min y se cargó a 100 % de B a 1 ml/min durante 10 minutos. A continuación se mantuvo la composición de eluyentes de 100 % de B durante 4 minutos a 1 ml/min y después se cambió a 100 % de A a 1 ml/min durante 1 minuto, tras lo cual se aumentó el flujo a 1,2 ml/min y se mantuvo durante 3 minutos para reducir el tiempo de equilibrado de la columna. Después de estos tres minutos, el flujo se redujo de nuevo en 2 minutos a 1 ml/min. Todos los analitos se detectaron con un detector ELSD o un espectrómetro de masas.

Para el análisis de mono, di y oligosacáridos se utilizó una columna Prevail Carbohydrate ES (5g; 250 x 4,6 mm) con un gradiente de 100 % de acetona (A), 100 % de acetonitrilo (B) y 100 % de agua (C). El gradiente se inicia en 20 de % A, 60 % de B y 20 % de C. Esto se cambia durante 15 minutos a 15 % de A, 45 % de B y 40 % de C y después se cambia de nuevo a 20 % de A, 60 % de B y 20 % de C en 1 minuto. La columna se equilibra a continuación en sus condiciones iniciales durante 6 minutos. Todos los analitos se midieron con ELSD o espectrómetro de masas.

Medición del peso celular en seco

A partir de una muestra de caldo se transfirieron 4 x 10 g a tubos de centrífuga, se centrifugaron las células (5000g, 4 °C, 5 min), y se lavaron las células dos veces con disolución de NaCl al 0,9 %. Los tubos de centrífuga que contenían los gránulos celulares se secaron en un horno a 70 °C durante 48 h hasta peso constante. El peso celular en seco se obtuvo mediante gravimetría; los tubos se enfriaron en un desecador antes de la pesada.

Medición de polisacárido soforosa

Para determinar la cantidad de polisacárido soforosa producido por una cepa mutante en la que se expresaba el gen heterólogo tts (50) se centrifugó un cultivo de 100 ml de esta cepa mutante y de la cepa de tipo salvaje a aproximadamente OD 6 (5500 rpm, 4°C, 5 minutos, Heraus Biofuge stratos). Después se hidrolizaron 80 ml del sobrenadante con 2 volúmenes de etanol frío (100% a -20°C) y se almacenaron durante la noche a 6°C. El precipitado se separó del sobrenadante por centrifugado (5500 rpm, 4°C, 5 min, Hereaus Biofuge stratos) y se resuspendió en 25 ml de agua destilada (88). Después se hidrolizaron 2 ml de esta disolución de polisacáridos en tubos de borosilicato pyrex (26 x 100 mm) a 105°C con HCl 2,25 M (concentración final) durante 4h. Para neutralizar la disolución para la medición de glucosa se añadieron cantidades equimolares de NaOH a la disolución tras incubación y enfriamiento. La cantidad de glucosa en la disolución se determinó con un analizador bioquímico YSI (YSI (UK) Ltd.).

Cepas y plásmidos utilizados para la caracterización de a1.2-fucosiltransferasa de Dictyostellium discoideum

Se expresó heterólogamente una a1,2-fucosiltransferasa de codón optimizado procedente de Dictyostellium discoideum en E. co licon el genotipo AlacZAglgCAmanAACA en un plásmido que se construyó como se describe por Aerts etal. (1). CA indica todos los genes del grupo de genes que codifica la vía biosintética de ácido colánico descrita por Stevenson et al. (86).

Metodología de aislamiento enzimático

Las cepas se cultivaron en LB (10 g/l de triptona, 5g/l de extracto de levadura y 10 g/l de NaCL) en un cultivo durante la noche (100 ml en matraz de agitación de 500 ml) a 37°C y 200 rpm. Las células se cosecharon por centrifugado (15 minutos a 7500 rpm y 4°C). Este gránulo se resuspendió en 5 ml de tampón PBS y se sometió a ultrasonidos 3 veces durante 4 minutos en agua helada (ciclo 50 %, intensidad 3). Los desechos celulares se centrifugaron de nuevo 15 minutos a 7500 rpm y 4°C. El sobrenadante se utilizó como extracto celular crudo.

Determinación de proteínas

El contenido en proteínas del extracto enzimático se midió con el kit de ensayo Pierce BCA Protein (Thermo) como se especifica en el manual del producto.

Construcción de plásmidos para la expresión de genes heterólogos y homólogos

Plásmido que fue construido como se describe por Aerts et al. (1).

Métodos genéticos

Los plásmidos se mantuvieron en el huésped E. coli DH5a (F-, $80d/acZAM15, A(lacZYA-argF)U169, deoR, recAI, endAl, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, A-, thi-1, gyrA96, relA1).

Plásmidos. Los plásmidos pKD46 (plásmido Red helper, resistencia a ampicilina), pKD3 (contiene un gen de resistencia a cloranfenicol flanqueado por FRT (cat)), pKD4 (contiene un gen de resistencia a kanamicina (kan)), y pCP20 (expresa actividad de FLP recombinasa) se obtuvieron del Prof. Dr. J-P Hernalsteens (Universidad Libre de Bruselas, Bélgica). El plásmido pBluescript (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) se utilizó para construir los derivados de pKD3 y pKD4 con una biblioteca de promotores, o con alelos portadores de una mutación puntual.

Mutaciones Las mutaciones consistían en la disrupción del gen (inactivado, KO), la sustitución de un promotor endógeno por un promotor artificial (activado, KI), respectivamente. Se introdujeron utilizando el concepto de Datsenko y Wanner (19).

Los transformantes portadores de un plásmido Red helper se cultivaron en 10 ml de medio LB con ampicilina (100 mg/l) y L-arabinosa (10 mM) a 30 °C hasta una OD⁶⁰⁰nm de 0,6. Las células se hicieron electrocompetentes mediante lavado con 50 ml de agua helada una primera vez y con 1 ml de agua helada una segunda vez. Después se resuspendieron las células en 50 gl de agua helada. La electroporación se realizó con 50 gl de células y 10-100 ng de producto de ADN lineal de cadena doble utilizando un Gene Pulser™ (BioRad) (600 Q, 25 gFD y 250 voltios).

T ras la electroporación, las células se añadieron a 1 ml de medio LB incubado 1 h a 37 °C, y finalmente se extendieron sobre LB-agar que contenía 25 mg/l de cloranfenicol o 50 mg/l de canamicina para seleccionar transformantes resistentes a antibiótico. Los mutantes seleccionados se verificaron mediante PCR con cebadores aguas arriba y aguas abajo de la región modificada y se cultivaron en LB-agar a 42 °C para la pérdida del plásmido ayudante. Se comprobó la sensibilidad a ampicilina de los mutantes.

Eliminación de genes de resistencia a antibiótico

Los mutantes seleccionados (resistentes a cloranfenicol o kanamicina) se transformaron con el plásmido pCP20, que es un plásmido resistente a ampicilina y cloranfenicol que muestra replicación sensible a la temperatura e inducción térmica de la síntesis de FLP. Los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30 °C, tras lo cual se purificaron algunas colonias en LB a 42 °C y después se comprobó la pérdida de todas las resistencias a antibiótico y del plásmido FLP helper. Los genes inactivados y activados se comprobaron con cebadores de control y se secuenciaron.

Los cebadores utilizados para construir los diversos mutantes desactivados y activados se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1: Cebadores utilizados para la construcción de los genes inactivados

Ejemplo 2. Ingeniería y uso de la cepa base 1 (fuente de carbono : sacarosa : convertida en glucosa-1-fosfato y fructosa por sacarosa fosforilasa) - Cribado de diferentes sacarosa fosforilasas

Un requisito importante para el éxito de la 'cepa base 1’ es la existencia de una potente sacarosa fosforilasa. Sin embargo, aunque E. coli tiene una sacarosa fosforilasa putativa (SP), no crece en un medio mínimo con sacarosa como única fuente de carbono. Por lo tanto, se cribaron 6 sacarosa fosforilasas de una variedad de fuentes microbianas (Tabla 2).

Para este fin se construyeron 6 transformantes de E. coli de tipo salvaje, cada una de ellas portadora de un plásmido [pCX-promotor-SP] que codifica una de las sacarosa fosforilasas (Sp) enumeradas en la Tabla 2. Se evaluó el rendimiento de estas cepas en medio mínimo utilizando sacarosa como única fuente de carbono. La cepa de tipo salvaje (WT) se incorporó al diseño experimental como un control (pwt = 0).

Tabla 2: Sacarosa fosforilasas cribadas

En este experimento de cribado se controló la tasa de crecimiento de los diversos transformantes y se relacionó con el rendimiento de las sacarosa fosforilasas. Según este razonamiento, la cepa de mejor crecimiento posee la sacarosa fosforilasa de mejor rendimiento.

La tasa de crecimiento de los diversos transformantes se representa en la Figura 2, el principio aplicado para la producción de un carbohidrato especial se representa en la Figura 1: (a) una reacción de equilibrio normal que se produce en las tecnologías de producción actuales (b) principio de arrastre/impulso: el equilibrio se desplaza hacia el sacárido y el sacárido activado. El principal objetivo de la célula es crecer, por lo tanto arrastra, en esta figura, en el sacárido para formar biomasa. Debido a este efecto de arrastre, el sacárido activado se acumulará en la célula e impulsará la vía de producción.

Ejemplo 3. Caracterización de sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis

Se han insertado varios promotores constitutivos artificiales para evaluar la influencia de la fuerza del promotor en la tasa de crecimiento. Para este fin se introdujeron un promotor débil, uno de fuerza media y uno fuerte de una biblioteca de promotores disponible en el Centro de Experiencia - Biotecnología Industrial y Biocatálisis (Universidad de Gante). Finalmente se mantuvo el promotor de fuerza media, que produjo la tasa de rendimiento más alta.

Se determinaron la constante de afinidad y la tasa de crecimiento máximo de la cepa de E. coli portadora de un plásmido que codifica la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis. Para este fin se realizaron experimentos por lotes y en quimiostato. También se comprobó la influencia de la concentración de fosfato en estos parámetros (Tabla 3).

La Tabla 3 muestra las propiedades cinéticas de la cepa diseñada por ingeniería. Es evidente que las propiedades cinéticas de la cepa diseñada por ingeniería son adecuadas para futuras aplicaciones industriales.

Tabla 3: Características de crecimiento de una E. coli portadora de la sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis. Alto contenido en PO⁴3- = 64 mM; bajo contenido en PO⁴3- = 8,5 mM.

Ejemplo 4. Estrategia de ingeniería para un suplemento incrementado de a glucosa-1-fosfato

Para validar la racionalidad de la estrategia de ingeniería es importante demostrar una reserva incrementada de a glucosa-1 -fosfato en la cepa mutante (Figura 3) en comparación con la reserva de aglucosa-1 -fosfato en el tipo salvaje (Figura 4). El metabolismo microbiano en la 'cepa base 1' se divide en dos partes desconectadas porque se eliminaron las principales reacciones capaces de convertir a glucosa-1-fosfato en producción de biomasa. Una parte del metabolismo convierte la fracción de fructosa en biomasa y numerosas enzimas biocatalíticas (metabolismo central clásico). La otra parte convierte la fracción de aglucosa-1 -fosfato de sacarosa.

La concentración de a glucosa-1-fosfato se determinó tanto para el tipo salvaje como también para algunas cepas diseñadas por ingeniería. Para este fin, se realizaron experimentos utilizando sacarosa como única fuente de carbono.

La reserva de a glucosa-1-fosfato: comparación del tipo salvaje y la cepa de conector

Para evaluar el potencial de la estrategia de ingeniería metabólica prevista se determinó la reserva de aglucosa-1-fosfato en:

• E. coli MG1655 de tipo salvaje cultivada en glucosa,

• E. coli MG1655 p22BaSP cultivada en sacarosa,

• E. coli MG1655 AglgC Apgm AlacZp22BaSP cultivada en sacarosa.

El tamaño de esta reserva es de importancia esencial ya que todas las vías diseñadas por ingeniería metabólica de los diversos carbohidratos especiales a producir utilizan aglucosa-1-fosfato como precursor principal. Por lo tanto, cuanto mayor es la reserva de aglucosa-1-fosfato, más precursores están disponibles para la producción de los diversos carbohidratos especiales.

En la Figura 5 se representan los resultados obtenidos en los matraces de agitación. La concentración intracelular de glucosa-1-fosfato es 4,03 10-3 mmol/gcDW, 0,26 mmol/gcDW y 1,27 mmol/gcDW, respectivamente. De este modo se ha conseguido ya un aumento de A > 20000 % en la reserva de G1P. Esta reserva incrementada permite la producción eficiente de una variedad de carbohidratos especiales.

En la cepa E. coli MG1655 de tipo salvaje, la glucosa-1 -fosfato es un precursor de componentes relacionados con la pared celular, glucógeno, etc. Un flujo limitado de carbono, procedente normalmente de aglucosa-6-fosfato, basta para suministrar a la célula aglucosa-1 -fosfato suficiente para producir estas fracciones menores de biomasa. Por lo tanto, la reserva de aglucosa-1-fosfato es de tamaño limitado (4,03 10-3 mmol/gcDW).

Esto contrasta con la estrategia propuesta de utilizar sacarosa como fuente de carbono. En comparación con la cepa de E. coli MG1655 de tipo salvaje se ha mostrado una reserva incrementada de glucosa-1-fosfato en las cepas mutantes que contienen una potente sacarosa fosforilasa que divide eficientemente el azúcar económico sacarosa, no costoso, en fructosa y aglucosa-1 -fosfato.

Los resultados obtenidos en un reactor por lotes de 1,5 L se representan en la Figura 6. La concentración intracelular de aglucosa-1-fosfato es 4,03 10-3 mmol/gcDW, 0,65 mmol/gcDW y 0,89 mmol/gcDW, respectivamente.

Producción de aglucosa-1-fosfato por ApgmAlacZbalaC (3KO) P22-BaSP en medio LB tamponado a escala de reactor

Se verificó la capacidad de úpgmúlacZúglgC P22-BaSP para producir aglucosa-1 -fosfato. Para este fin, se realizó un cultivo con medio LB tamponado con unos 15 g/L de sacarosa. Aproximadamente a las 15 h se añadió una disolución de sacarosa concentrada que contenía fosfato. En la Figura 7 y la Figura 6 se representa la concentración de los (sub)productos más importantes. La tasa de crecimiento máxima durante la fase por lotes es aproximadamente 0,552 h-1.

Durante la fase por lotes, por cada mol de sacarosa degradada se generan 0,74 moles de glucosa-1-fosfato. Idealmente se puede generar 1 mol de aglucosa-1-fosfato. Sin embargo, la 3KO estudiada contiene todavía genes cuyos productos son capaces de convertir aglucosa-1-fosfato, por ejemplo agp.

A partir del momento en el que se consume toda la sacarosa, la concentración de glucosa-1-fosfato disminuye y la concentración de glucosa aumenta, lo que se debe a la actividad de Agp.

Posteriormente, aproximadamente a las 15 h se añade sacarosa adicional, que se convierte de nuevo en glucosa-1-fosfato y se acumula en el medio. La fructuosa se acumula asimismo en el medio, lo que indica que la célula tiene medios limitados para metabolizar adicionalmente este compuesto (0,64 moles de fructosa por mol de sacarosa). En un experimento posterior se añadieron sacarosa y fosfato a intervalos de tiempo regulares durante el curso de la fermentación. Se alcanzó una concentración máxima de aglucosa-1-fosfato de aproximadamente 57 g/L.

Ejemplo 5. Inactivación del gen que codifica fosfoglucomutasa

Para dividir el metabolismo según el ejemplo 1-4, el gen que codifica fosfoglucomutasa tiene que estar inactivado. A través de la metodología clásica descrita por Datsenko y Wanner (19), una inactivación da como resultado una cicatriz cromosómica de aproximadamente 84 pares de bases. Las cepas en las que se eliminó este gen de esta manera parecen crecer en un medio complejo pero, para nuestra sorpresa, no crecieron en un medio mínimo cono se describió en la sección de materiales y métodos. Sin embargo, la cepa creció en un medio mínimo cuando se excluyó el casete de kanamicina Aparentemente, la eliminación de la secuencia original en esta localización cromosómica parecía interferir con el crecimiento de un medio mínimo, pero la sustitución de esta secuencia específica (gen pgm), que codifica fosfoglucomutasa, por una secuencia con una longitud similar no lo hizo. Este hecho se validó mediante sustitución del gen pgm con una parte del gen GFP que tenía exactamente el mismo tamaño que el gen pgm. Esto dio lugar también a una cepa mutante que podía crecer en un medio mínimo. Las secuencias de estas cepas en la localización cromosómica de pgm se muestran en la Figura 11, la Figura 12, la Figura 13 y la Figura 14.

Ejemplo 6. Producción de celobiosa en E. coli

Las cepas productoras de celobiosa se han construido partiendo de la 'cepa base 1' (Figura 8). Para este fin, se ha insertado un plásmido que contiene sacarosa fosforilasa (Bifidobacterium adolescentis) y celobiosa fosforilasa (Cellulomonas uda) en el tipo salvaje, en E. coli MG1655 A AglgC Apgm A lacZ (3KO), y en E. coli MG1655 Aagp AglgC úpgm A lacZ (4KO) (Tabla 4). Los genes adicionales que deben inactivarse son g lk y ptsG, ya que ambos convierten glucosa en glucosa-6-fosfato.

Tabla 4 Cepa productora de celobiosa

Comparación de tipo salvaje y cepa de conector

Para evaluar el potencial de la estrategia de ingeniería metabólica prevista para producir carbohidratos especiales se investigó la producción de celobiosa en diversas cepas diseñadas por ingeniería.

• E. coli MG1655 (WT) P22-BaSP P22-CuCP

• E. coli MG1655 AglgC úpgm AlacZ (3KO) P2- BaSP P22-CuCP

• E. coli MG1655 AglgC úpgm AlacZ Aagp (4KO) P22-BaSP P22-CuCP

Para este fin, se realizaron experimentos en matraces de agitación. El medio contenía medio LB tamponado y se añadieron sacarosa y glucosa en cantidades iguales a los matraces de agitación, de modo que se alcanzó una concentración final de 1,978 g de celobiosa/L en el matraz de agitación (Tabla 5). En la Figura 5 se representan los resultados obtenidos en los matraces de agitación. La concentración (extracelular) del producto deseado celobiosa aumenta con el número de mutaciones que se ha introducido.

Tabla 5 Producción de celobiosa de diversas cepas diseñadas por ingeniería

Producción de celobiosa por Aoam&lacZ&alaCAaao (4KO) P22-BaSP P22-CuCP en medio LB tamponado a escala de reactor

La capacidad de úpgmúlacZúglgCúagp P22-BaSP P22-CuCP para producir celobiosa se verificó a escala de reactor en un experimento preliminar. Para este fin, se realizó un cultivo con medio LB tamponado. Aproximadamente a las 9 h y en momentos específicos se añadió al cultivo una disolución que contenía 500 g/L de sacarosa y 250 g/L de glucosa.

Se alcanzó una eficiencia de conversión de alrededor de 30 % (mol de celobiosa producido/mol de sacarosa consumido) y alrededor de 40 % de la fracción de glucosa de la sacarosa terminó en celobiosa o en glucosa-1 -fosfato. Al final del cultivo se alcanzó un título de alrededor de 15 g/L de celobiosa.

En segundo lugar se verificó la producción de celobiosa en un cultivo por lotes partiendo de 70 g/l de sacarosa con una alta concentración de fosfato y una baja concentración de fosfato. Alto contenido en fosfato indica una concentración de fosfato de fosfato 0,2 M, bajo contenido en fosfato indica una concentración de fosfato 13 mM. Esto afectó significativamente a la producción. La alta concentración de fosfato dio como resultado un título final de aproximadamente 20 g/l y un rendimiento de 0,33 g/g, mientras que una baja concentración de fosfato dio como resultado un título final de 42 g/l y un rendimiento de sacarosa consumida de 0,84 g/g (Figura 9).

Ejemplo 7. Ingeniería de la cepa base 2 (sacarosa-sacarosa sintasa) y sus usos

Mediante ingeniería metabólica de E. coli se construye una cepa base que es un productor eficiente de carbohidratos especiales y sus derivados cuya vía parte de UDP-glucosa.

Mediante introducción de sacarosa sintasa (por ejemplo procedente de Solanum tuberosum), la sacarosa se divide en fructosa y UDP-glucosa. Mediante inactivación adicional de los genes que codifican UDP-glucosa 4 epimerasa (galE), UDP-glucosa galactosa-1-P uridililtransferasa (galT), glucosa-1-P uridililtransferasa (galU, galF), 5'-nucleotidasa / UDP-azúcar hidrolasa (ushA), UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (ugd), pertenecientes al operón de ácido colánico (ca), se construye un mutante que acumula UDP-glucosa (Tabla 6).

Tabla 6 Cepa base UDP-glucosa

Ejemplo 8. Expresión de sacarosa sintasa en E. coli

La actividad de sacarosa se determinó mediante un ensayo in vitro. Se expresó heterólogamente una sacarosa sintasa de Solanum tuberosum en E. coli BL21. A partir de este cultivo se preparó un extracto enzimático que se incubó con sacarosa 500mM y UDP 2mM. La evolución de la cantidad de UDP-glucosa producida se da en la Tabla 7.

Tabla 7 Ensayo enzimático de sacarosa sintasa que demuestra la actividad de la reacción de escisión de sacarosa sintasa (mezcla que contenía sacarosa 500 mM y UDP 2 mM).

Ejemplo 9. Producción de soforosa

Partiendo de la cepa base 2 (UDP-glucosa) se construye una cepa que produce grandes cantidades de soforosa como un polímero de unidades de soforosa. Esto se consigue introduciendo adicionalmente el gen tts de Streptococcus pneumoniae (50). Las unidades de soforosa pueden generarse a partir del polímero de soforosa de dos maneras, es decir, a través de hidrólisis ácida o a través de conversión enzimática. Tal enzima también puede estar (sobre)expresada en la cepa productora.

Para evaluar el potencial de la estrategia de ingeniería metabólica, se determinó el polímero de soforosa para E. coli MG1655 P22-BaSP P22-tts, y una cepa de 6KO P22-BaSP P22-tts (E. coli MG1655 AglgC Apgm AlacZ Aagp AptsG Aglk) mediante cultivo de estas cepas en un medio mínimo que contenía lactosa como única fuente de carbono. En la Figura 15 se representan los resultados. Estos resultados indican que las cepas mutantes producen significativamente más polímero de soforosa en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Ejemplo 10. Ingeniería de la cepa base 3 (lactosa-lactosa fosforilasa) y sus usos

Mediante introducción de lactosa fosforilasa (20), la lactosa se divide en glucosa y galactosa-1-P. Mediante inactivación adicional de genes que codifican agp, galE, galT, lacZ, el metabolismo se divide en dos partes desconectadas. Sin embargo, todas las combinaciones posibles de estos genes dan como resultado una acumulación incrementada de galactosa-1-fosfato. En lugar de inactivar estos genes, este objetivo se puede conseguir también haciéndolos defectuosos o mediante reducción de su expresión (Tabla 8).

Tabla 8 Cepa base 3 Galactosa-1-fosfato (lactosa-lactosa fosforilasa)

Ejemplo 11. Producción de galactosa(B1-4)L-ramnosa:

Partiendo de la cepa base 3 se construye un productor de Gal(p1-4)L-Rha mediante introducción adicional de un gen que codifica una (Ga)lacto-N-biosa D-galactosil-(p1-4)-L-ramnosa fosforilasa, que convierte galactosa-1-fosfato y ramnosa en Gal(p1 -4)L-Rha y fosfato.

Se realiza una fermentación utilizando lactosa como principal fuente de carbono que produce cantidades de Gal(p1 -4)L-Rha. Se añade L-ramnosa al medio. La degradación no deseada de ramnosa se evita mediante inactivación de genes implicados en la degradación de ramnosa (rhaA, rhaB, rhaC, rhaD).

Ejemplo 12. Ingeniería de la cepa base 4 (lactosa - lactosa sintasa) y sus usos

Mediante introducción de lactosa sintasa (71, 72), la lactosa se divide en glucosa y UDP-galactosa. Mediante inactivación adicional de los genes que codifican beta-galactosidasa (lacZ), UDP-glucosa, galactosa-1-P uridililtransferasa (galT) UDP-glucosa 4 epimerasa (galE), 5'-nucleotidasa / UDP-azúcar hidrolasa (ushA), UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (ugd), pertenecientes al operón de ácido colánico (ca), se construye un mutante que acumula UDP-galactosa (Tabla 9).

Tabla 9: Cepa base 4 UDP-galactosa (lactosa sintasa)

Ejemplo 13. Producción de galactinol:

Partiendo de la cepa base 4 se construye un productor de galactinol mediante introducción adicional de un gen que codifica una inositol 3-alfa-galactosiltransferasa que cataliza la conversión:

UDP-galactosa mio-inositol = UDP O-a-D-galactosil-(1 —>3)-1 D-mio-inositol

Se realiza una fermentación utilizando lactosa como principal fuente de carbono que produce cantidades de galactinol en las que se añade mio-inositol al medio.

Ejemplo 14. Producción de globotriosa:

Partiendo de la cepa base 4 se construye un productor de galactinol mediante introducción adicional del gen IgtC de Neisseria meningitidis (3) que codifica para una a-1,4-Gal transferasa, que cataliza la conversión UDP-Gal Lactosa — UDP Globotriosa. Se realiza una fermentación utilizando lactosa como principal fuente de carbono que produce cantidades de globotriosa.

Ejemplo 15. Ingeniería de la cepa base 5 y producción de azúcares fucosilados

Partiendo de la ceba base 5, que acumula fructosa-6-fosfato (descrita en el Ejemplo 20 y en el Ejemplo 28), se pueden producir derivados de azúcar fucosilados tales como fucosilactosa y más específicamente 1,2-fucosilactosa. Para este fin, se modifica la cepa de modo que la célula se vea forzada a producir fructosa-6-fosfato, que es un precursor de GDP-glucosa. La glucosa o glucosa-1 -fosfato (si la enzima de partida es una sacarasa o una sacarosa fosforilasa) se alimenta entonces al metabolismo de carbono central a través de la vía de pentosa fosfato. La Figura 10 muestra la ruta hacia el producto y la biomasa y las inactivaciones necesarias para ello. Para evitar la pérdida de fructosasfosfato a través de la glucólisis se inactivan pfkA, pfkB and pgi. Para evitar la acumulación de piruvato se inactiva la ruta de Entner Douderoff (edd y eda).

Dado que la GDP-glucosa es un intermedio de la vía de biosíntesis de ácido colánico, esta vía debe modificarse. Se inactivan los genes del operón de ácido colánico que pueden reducir el rendimiento del producto. Estos genes son gmm, wcaA, wcaBi, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, wcal, wcaJ, wcaK, wcaL y/o wcaM. Los genes manA, cpsG, cpsB, gmd y fcl (que codifican manosa-6-fosfato isomerasa, fosfomanomutasa, manosa-1-fosfato guanililtransferasa, GDP-manosa 4,6-deshidratasa y GDP-fucosa sintasa, respectivamente), se potencian en su expresión para aumentar el flujo hacia GDP-fucosa. O bien el operón de ácido colánico se inactiva completamente, con la reintroducción de los genes necesarios que se sobrexpresan con un promotor artificial de una biblioteca de promotores, o bien el operón se modifica de tal manera que los genes descritos anteriormente se inactivan uno por uno y los genes remanentes en el operón se potencian en su expresión mediante cambio del promotor del operón por un operón constitutivo artificial (23). Finalmente, GDP-fucosa se une a la lactosa para dar a-1,2-fucosilactosa por medio de una a-1,2-fucosiltransferasa. Las fucosiltransferasas analizadas proceden de Helicobacterpylori, Bacteroides sp., Homo sapiens, Mus musculus, Bos taurus y Dictyostelium discoideum.

Ejemplo 16. Ingeniería de la cepa base 3 de E. coli (galactosa-1-P) y sus usos

Mediante inactivación de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), UDP-glucosa, galactosa-1-P uridililtransferasa (galT), UDP-glucosa-4-epimerasa (galE), se construye un mutante que acumula galactosa-1-P. Mediante sobreexpresión adicional de genes que codifican galactoquinasa (galK) y/o galactosa-1 -epirmerasa (galM) se potencia la formación de galactosa-1-P (Tabla 10).

Tabla 10 Cepa base Galactosa-1-fosfato

Ejemplo 17. Ingeniería de la cepa base 3 (galactosa- 1P) y sus usos

Mediante inactivación de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), UDP-glucosa, galactosa-1-P uridililtransferasa (.galT), UDP-glucosa-4-epimerasa (galE) y mediante sobreexpresión adicional de genes que codifican galactoquinasa (galK) se construye un mutante que acumula galactosa-1-P (Tabla 11).

Tabla 11 Cepa base de E. coli galactosa-1 -fosfato

Para evaluar el potencial de la estrategia de ingeniería metabólica, se determinó la concentración de galactosa-1-fosfato para el tipo salvaje, E. coli MG1655 AgalET P22 galK, E. coli MG1655 AgalETKM Aagp P22 galK, E. coli MG1655 AgalET P22 galK y E. coli MG1655 AgalETKM Aagp P22 galK orotato (2 g/L) mediante cultivo de estas cepas en un medio mínimo que contenía lactosa (15 g/L) como principal fuente de carbono. En la Figura 12 se representan los resultados.

Tabla 12 Concentración de galactosa-1-P de diversos mutantes de E. coli

Ejemplo 18. Producción de glucosa-6-fosfato utilizando sacarosa fosforilasa en E. coli

Mediante la introducción de sacarosa fosforilasa, la sacarosa se divide en glucosa-1-P y fructosa. Mediante la inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (zwf), fosfoglucosa isomerasa (pgi), glucosa-1-fosfato adenililtransferasa (glgC) se construye un mutante que acumula glucosa-6-P.

Los mutantes KO se eligen de tal manera que el metabolismo se divide en dos partes desconectadas. Sin embargo, todas las combinaciones posibles de estos genes dan como resultado un suministro incrementado. En lugar de inactivar estos genes, este objetivo se puede conseguir también haciéndolos defectuosos o mediante reducción de su expresión.

Mediante ingeniería metabólica de E. coli se construye una cepa base que es un productor eficiente de carbohidratos especiales y sus derivados cuya vía parte de glucosa-6-P (Tabla 13).

Tabla 13 Cepa base glucosa-6-fosfato utilizando una sacarosa fosforilasa

Ejemplo 19. Producción de glucosa-6-fosfato utilizando invertasa en E. coli

Mediante la introducción de sacarosa hidrolasa/invertasa, la sacarosa se divide en glucosa y fructosa. Mediante la inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (zwf), fosfoglucosa isomerasa (μgi), glucosa-1-fosfato adenililtransferasa (glgC), fosfoglucomutasa (pgm) se construye un mutante que acumula glucosa-6-P (Tabla 14).

Tabla 14: Cepa base glucosa-6-fosfato utilizando invertasa en E. coli

Ejemplo 20. Producción de fructosa-6-fosfato utilizando invertasa en E. coli

Mediante la introducción de sacarosa hidrolasa/invertasa, la sacarosa se divide en glucosa y fructosa. Mediante la inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), fosfofructoquinasa (pfkA y pfkB), fosfoglucosa isomerasa (pgi), glucosa-1-fosfato adenililtransferasa (glgC), fosfoglucomutasa (pgm) se construye un mutante que acumula fructosa-6-fosfato (Tabla 15).

Tabla 15 Cepa base fructosa-6-fosfato

Ejemplo 21. Producción de B-glucosa-1-fosfato utilizando maltosa fosforilasa en E. coli

Mediante la introducción de maltosa fosforilasa, la maltosa se divide en p-D-glucosa 1-fosfato y glucosa. Mediante inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp, yfbT), fosfoglucomutasa (ycjU), maltosa hidrolasa (malPQ), se construye un mutante que acumula p-glucosa-1-P. Los mutantes KO se eligen de tal manera que el metabolismo se divide en dos partes desconectadas. Sin embargo, todas las combinaciones posibles de estos genes dan como resultado un suministro incrementado. En lugar de inactivar estos genes, este objetivo se puede conseguir también haciéndolos defectuosos o mediante reducción de su expresión (Tabla 16).

Tabla 16: Cepa base p-D-glucosa-1-fosfato utilizando maltosa fosforilasa en E. coli

Ejemplo 22. Producción de B-alucosa-1-fosfato utilizando trehalosa fosforilasa en E. coli

Mediante la introducción de trehalosa fosforilasa, la trehalosa se divide en p-D-glucosa 1 -fosfato y glucosa. Mediante inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp, yfbT), fosfoglucomutasa (ycjü), enzimas nativas no deseadas que degradan trehalosa (treABC, treC, treE, treF), se construye un mutante que acumula p-glucosa-1-fosfato (Tabla 17).

Los mutantes KO se eligen de tal manera que el metabolismo se divide en dos partes desconectadas. Sin embargo, todas las combinaciones posibles de estos genes dan como resultado una productividad incrementada. En lugar de inactivar estos genes, este objetivo se puede conseguir también haciéndolos defectuosos o mediante reducción de su expresión.

Tabla 17 Cepa base p-D-glucosa-1-fosfato utilizando trehalosa fosforilasa en E. coli

Ejemplo 23. Producción de kojibiosa

Mediante introducción adicional de kojibiosa fosforilasa en una cepa que acumula p-D-glucosa 1 -fosfato y inactivación adicional de genes que codifican glucoquinasa (glk) y el sistema de fosfotransferasa (ptsG), se construye un mutante que produce kojibiosa.

Se realiza una fermentación con una cepa mutante de E. coli (AlacZAglgCAagpAptsGAmalPQAycjü pCXp22MPp22KP) utilizando maltosa y glucosa como principales fuentes de carbono para producir kojibiosa. (Figura 16).

Ejemplo 24. Producción de UDP-glucosa a partir de sacarosa a través de una sacarosa fosforilasa Mediante introducción de sacarosa fosforilasa (por ejemplo procedente de Bifidobacterium adolescentis), la sacarosa se divide en fructosa y glucosa-1-P. Partiendo de una cepa que acumula glucosa-1-fosfato (véase los ejemplos anteriores) y mediante inactivación adicional de genes que codifican UDP-glucosa 4 epimerasa (galE), UDP-glucosa galactosa-1-P uridililtransferasa (galT), 5'-nucleotidasa / UDP-azúcar hidrolasa (ushA), UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (ugd) se construye un mutante que acumula UDP-glucosa mediante sobreexpresión adicional de genes que codifican UDP-glucosa pirofosforilasa (por ejemplo procedentes de Bifidobacterium bifidum) (Tabla 18).

Tabla 18 Cepa base UDP-glucosa de sacarosa a través de una sacarosa fosforilasa en E. coli

Ejemplo 25. Producción de UDP-glucosa en E. coli con una sacarosa-6-fosfato sintasa combinada con sacarosa PTS

Mediante introducción de sacarosa PTS (94) sacarosa-6-fosfato sintasa (69), la sacarosa se convierte en fructosasfosfato y UDP-glucosa. Partiendo de la cepa descrita en el Ejemplo 4, sin sacarosa fosforilasa, y mediante inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), UDP-glucosa 4 epimerasa (galE), UDP-glucosa galactosa-1-P uridililtransferasa (galT), 5'-nucleotidasa / UDP-azúcar hidrolasa (ushA), UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (ugd) se construye un mutante que acumula UDP glucosa mediante sobreexpresión adicional de genes que codifican UDP-glucosa pirofosforilasa (Bifidobacterium bifidum) (Tabla 19).

Tabla 19 Cepa base UDP-glucosa con sacarosa-6-fosfato sintasa combinada con sacarosa PTS

Ejemplo 26. Producción de UDP galactosa a través de galactoquinasa

Mediante sobreexpresión de genes que codifican galactoquinasa (galK) y galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (por ejemplo procedentes de Bifidobacterium bifidum) se potencia la formación de UDP-galactosa mediante inactivación adicional de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), UDP-glucosa, galactosa-1-P uridililtransferasa (galT), UDP-glucosa-4-epimerasa (galE) se construye un mutante que acumula galactosa-1-P (Tabla 20).

Tabla 20 Cepa base UDP-galactosa a través de galactoquinasa

Ejemplo 27. Producción de UDP galactosa a través de lactosa fosforilasa

Mediante introducción de lactosa fosforilasa (20), la lactosa se divide en glucosa y galactosa-1-P. Mediante inactivación de genes que codifican (a) fosfatasa(s) (agp), UDP-glucosa, galactosa-1-P uridililtransferasa (galT), UDP-glucosa-4-epimerasa (galE), se construye un mutante que acumula galactosa-1 -P. Mediante sobreexpresión adicional de genes que codifican galactosa-1 -fosfato uridililtransferasa (por ejemplo procedentes de Bifidobacterium bifidum) se potencia la formación de UDP-galactosa (Tabla 21).

Tabla 21 Cepa base UDP-galactosa a través de lactosa fosforilasa

Ejemplo 28. Acumulación de fructosa-6-fosfato en E. coli

El metabolismo se divide para acumular fructosa-6-fosfato Esto se consigue mediante inactivación de los genes que codifican la actividad fosfoglucosa isomerasa y fosfofructoquinasa. Estas actividades en E. coli están codificadas por los genes pgi, pfkA y pfkB. La tasa de crecimiento de cepas carentes de estas actividades se describe en la Tabla 22 para el crecimiento de glucosa y sacarosa. La tasa de crecimiento de la cepa de tipo salvaje se ve afectada de algún modo cuando se cultiva en sacarosa tras la introducción de una sacarosa fosforilasa en comparación con el cultivo en glucosa, aunque la introducción de inactivaciones de pgi y mutaciones dobles de pfkA y pfkB conducen a una reducción significativa de la tasa de crecimiento, siendo esta última extremadamente baja (0,02 h-1) en glucosa. Sorprendentemente, la cepa mutante ApgiApfkAApfkB tiene una tasa de crecimiento similar a la del mutante sencillo Apgi.

Tabla 22: Tasas de crecimiento específicas de las cepas de inactivación de glicólisis en un medio mínimo con glucosa y sacarosa. En las cepas cultivadas con sacarosa se introdujo un plásmido que codifica sacarosa fosforilasa.

Solo la cepa mutante ApgiApfkAApfkB acumuló fructosa-6-fosfato en el medio al cultivarse en sacarosa, las otras cepas no indicaban una acumulación de F6P. El perfil de crecimiento y la acumulación de F6P por esta cepa se muestra en la Figura 17.

Ejemplo 29. Acumulación de aglucosa-1-fosfato en Saccharomyces cereviseae

Dado que Saccharomyces cereviseae divide la sacarosa por naturaleza, se inactivan todas las reacciones alternativas de degradación de sacarosa (invertasas), que están codificadas por los genes SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c. Para evitar la asimilación de a-glucosa-1-fosfato, las enzimas que convierten este carbohidrato activado se vuelven menos funcionales o no funcionales. Estas enzimas son fosfoglucomutasa, codificada por PGM1 y PGM2, y glucosa-1-fosfatasa, codificada por INM1 y INM2. Mediante introducción de una sacarosa fosforilasa (por ejemplo procedente de Bifidobacterium adolescentis), similar al metabolismo de división de E. coli (véase el ejemplo anterior). El metabolismo de Saccharomyces cereviseae se divide en dos partes dando lugar a la acumulación de aglucosa-1-fosfato.

Ejemplo 30. Producción de celobiosa con Saccharomyces cereviseae

Dado que Saccharomyces cereviseae divide la sacarosa por naturaleza, se inactivan todas las reacciones alternativas de degradación de sacarosa (invertasas), que están codificadas por los genes SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c. Para evitar la asimilación de a-glucosa-1-fosfato, las enzimas que convierten este carbohidrato activado se vuelven menos funcionales o no funcionales. Estas enzimas son fosfoglucomutasa, codificada por PGM1 y PGM2, y glucosa-1-fosfatasa, codificada por INM1 y INM2. Mediante introducción de una sacarosa fosforilasa (por ejemplo procedente de Bifidobacterium adolescentis), similar al metabolismo de división de E. coli (véase el ejemplo anterior). El metabolismo de Saccharomyces cereviseae se divide en dos partes dando lugar a la acumulación de aglucosa-1-fosfato. Mediante introducción de un gen de celobiosa fosforilasa procedente de Cellulomonas uda, Saccharomyces cereviseae es capaz de producir celobiosa.

Para evitar la degradación de glucosa, también se inactiva la actividad de glucoquinasa, codificada por GLK1. Dado que las hexoquinasas en Saccharomyces cereviseae no son específicas, estas se sustituyen por una hexoquinasa heteróloga específica de sustrato. Las fructoquinasas procedentes de E. coli o Bifidobacterium adolescentis muestran menor actividad para glucosa y pueden sustituir a los genes que codifican las hexoquinasas nativas codificadas por HXK1 y HXK₂.

Ejemplo 31. Acumulación de fructosa-6-fosfato en Saccharomyces cereviseae mediante introducción de una sacarosa fosforilasa

Dado que Saccharomyces cereviseae divide la sacarosa por naturaleza, se inactivan todas las reacciones alternativas de degradación de sacarosa (invertasas), que están codificadas por los genes SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c. Mediante introducción de sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis, la sacarosa se divide en fructosa y glucosa-1-fosfato. Para evitar la conversión de fructosa-6-fosfato en biomasa, la actividad de las enzimas fosfoglucosa isomerasa y fosfofructoquinasa se reduce o se elimina haciendo que los genes PGM1, PFK1 y PFK₂sean menos funcionales o no funcionales, respectivamente.

Ejemplo 32. Acumulación de galactosa-1-fosfato en Saccharomyces cereviseae

La galactosa-1-fosfato se deriva del disacárido lactosa. Dado que Saccharomyces cereviseae no divide lactosa por naturaleza, se introduce una p-galactosidasa heteróloga (por ejemplo de E. coli). Esto conduce a la degradación de lactosa a galactosa y glucosa. El objetivo es aumentar el suministro de galactosa-1-fosfato a una vía biosintética de un carbohidrato especial. Por lo tanto, la galactosa-1 -fosfato puede no convertirse ya en biomasa, lo que es catalizado por UDP-glucosa-hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, la aldosa reductasa. Esto se consigue mediante inactivación de los genes que codifican UDP-glucosa-hexosa-1-fosfato uridililtransferasa y aldosa reductasa, GAL7 y GRE3 respectivamente. Para evitar la degradación de dicha galactosa-1-fosfato, se inactivan los genes que codifican galactosa-1-fosfatasa. Estos son INM1 y INM2. Se sobreexpresa una galactoquinasa para potenciar la formación de galactosa-1 -fosfato a partir de galactosa.

Ejemplo 33. Acumulación de glucosa-6-fosfato en Saccharomyces cereviseae a través de su invertasa nativa

Para dividir el metabolismo de Saccharomyces cereviseae en dos partes (para potenciar el suministro de glucosasfosfato de modo que pueda utilizarse como un componente de un carbohidrato especial), se inactivan la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la fosfoglucomutasa y la fosfoglucosa isomerasa, que están codificadas por los genes ZWF1, PGM1 y PGM2, y PGI1, respectivamente. En tal cepa, la sacarosa se divide en fructosa y glucosa por las invertasas nativas y se fosforila para dar fructosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato por las hexoquinasas nativas. A continuación se suministra glucosa-6-fosfato a la vía de biosíntesis de carbohidratos especiales y la fructosa-6-fosfato se convierte en biomasa.

Ejemplo 34. Acumulación de glucosa-6-fosfato en Saccharomyces cereviseae a través de sacarosa fosforilasa

Saccharomyces cereviseae se modifica para producir glucosa-6-fosfato a partir de sacarosa con una sacarosa fosforilasa procedente de Bifidobacterium adolescentis. Dado que la sacarosa fosforilasa compite por la sacarosa con la invertasa, se inactivan los genes que codifican la actividad de invertasa. Estos genes son SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C y YGR287c. Después se convierte adicionalmente glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato con una fosfoglucomutasa codificada por PGM1 y PGM2. Para evitar la degradación de glucosa-1-fosfato en glucosa, se inactivan los genes que codifican glucosa-1-fosfatasa, codificada por INM1 y INM2. La asimilación de este sacárido activado se reduce adicionalmente mediante eliminación de la actividad de UTP glucosa-1-fosfato uridililtransferasa en la célula, haciendo que los genes YHL012W y UGP1 sean menos funcionales o no funcionales. La fracción de fructosa es fosforilada por las hexoquinasas nativas codificadas por HXK1 y HXK₂y convertida en biomasa.

Ejemplo 35. Formación de UDP-glucosa potenciada en Saccharomyces cereviseae a través de sacarosa sintasa

Dado que Saccharomyces cereviseae divide la sacarosa por naturaleza, se inactivan todas las reacciones alternativas de degradación de sacarosa (invertasas), que están codificadas por los genes SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c. Se introduce una sacarosa sintasa, por ejemplo procedente de Solanum tuberosum, de modo que la sacarosa se divide en UDP-glucosa y fructosa. Para evitar la conversión de UDP-glucosa en biomasa, la actividad de las enzimas UDP-glucosa difosforilasa, UDP-glucosa 4-epimerasa, UDP-glucosa-hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, UDP-glucosa-glucógeno glucosiltransferasa, UDP-glucosa-1,3-beta-D-glucano glucosiltransferasa, UDP-glucosaglucosafosfato glucosiltransferasa se hacen menos funcionales o no funcionales, estas enzimas están codificadas por los genes UGP1 y YHL012W, GAL10, GAL7, GSY1 y GSY2, FEN1 y FKS1 y GSC2 y TPS1, respectivamente. La fracción de fructosa es fosforilada por las hexoquinasas nativas codificadas por HXK1 y HXK₂y convertida en biomasa.

Ejemplo 36. Formación de UDP-glucosa potenciada en Saccharomyces cereviseae a través de sacarosa sacarosa fosforilasa

Para potenciar el suministro de UDP-glucosa en Saccharomyces cereviseae, una cepa como se describe en el Ejemplo 29 se modifica adicionalmente mediante sobreexpresión del gen GAL7 que codifica una UTP-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, que cataliza la conversión de a-glucosa-1-fosfato en UDP-glucosa.

Ejemplo 37. Formación de UDP-galactosa potenciada en Saccharomyces cereviseae a través de B-galactosidasa

Para potenciar el suministro de UDP-glucosa en Saccharomyces cereviseae, una cepa como se describe en el Ejemplo 32 se modifica adicionalmente mediante sobreexpresión del gen que codifica una UTP-galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (por ejemplo procedente de Bifidobacterium bifidum), que cataliza la conversión de a-galactosa-1-fosfato en UDP-galactosa.

Ejemplo 38. Actividad de a1.2-fucosiltransferasa de Dictyostellium discoideum

Introducción

La a1,2-fucosyltransferasa (FT) de Dictyostelium discoideum es parte de una clase de glucosiltransferasas bastante nueva. Todas las FT conocidas pertenecen a la clase GT11, mientras que FT de D. discoideum pertenece a la clase GT74. Hasta el momento solo se ha encontrado una FT de este tipo en otros dos organismos llamados Desulfococcus oleovorans y Desulfotomaculum reducens. La tercera clase es GT37, que contiene solo FT de plantas (Figura 18). Un alineamiento clustalW y Tcoffee indica que la identidad con H. pylori es solo 9,7% y 15,5%, respectivamente. Los motivos conservados de GT11 se muestran en la Figura 19 y no se producen en absoluto en la proteína de Dictyostelium (67). Estos dominios se diferencian para la actividad de fucosilación de las transferasas. Los dos primeros motivos son los mismos para a-1,2-fucosiltransferasa y a-6-fucosiltransferasa, mientras que el tercero diferencia las enzimas entre sí. La a-1,3-fucosiltransferasa contiene dos motivos conservados completamente diferentes.

Sin embargo, se ha descrito que la FT de Dictyostelium discoideum solo era activa en lacto-n-biosa y no en galactosa fenil-p-galactosida, Galp1-6-GlcNac, lactosa, Galp1-6Gal, Xyl, Glc, GIcNAc y GalNac (92).

En la Figura 20 se muestra un análisis LC MSMS del ensayo de fucosiltransferasa de Dictyostellium discoideum. Este ensayo mostró sorprendentemente que esta fucosiltransferasa expresada heterólogamente es activa con lactosa como aceptor y GDP-fucosa como donador de fucosa. La actividad de esta enzima era 0,19 ± 0,01 U/mg de proteína y se determinó siguiendo el método de Persson y Palcic (68).

Dado que solo la mitad de la enzima de Dictyostelium discoideum es responsable de su actividad de a1,2-fucosiltransferasa, esta parte se clonó de manera similar a la enzima completa, aunque con un codón de inicio adicional (codificado por ATG) en presencia de una secuencia de nucleótidos. Esta nueva enzima se produjo en una cepa mutante AlacZAglgCAmanAACA y se analizó la actividad de a1,2-fucosiltransferasa con un LC MSMS. La Figura 21 muestra claramente que esta enzima parcial sigue siendo capaz de formar 2-fucosilactosa a partir de GDP-fucosa y lactosa.

Ejemplo 39. Producción de mio-inositol en E. coli

Partiendo de una cepa base que acumula glucosa-6-fosfato, se construye un productor de mio-inositol mediante introducción adicional de un gen que codifica mio-inositol-1-fosfato sintasa (INO1, procedente de Saccharomyces cerevisiae) y mio-inositol-1(o 4)-monofosfatasa (INM1 y INM2, procedente de Saccharomyces cerevisiae).

Ejemplo 40. Producción de lacto-N-biosa en E. coli

Partiendo de una cepa base que acumula galactosa-1-fosfato, se construye un productor de lacto-N-biosa mediante introducción adicional de un gen que codifica lacto-N-biosa fosforilasa (Inbp, Bifidobacterium longum). Se realiza una fermentación utilizando lactosa y N-acetilglucoamina como fuentes de carbono. La degradación de N-acetilglucosamina se inhibe en la cepa productora mediante inactivación de toda actividad de N-acetil-D-glucosamina quinasa (nagK) y actividad de N-acetilglucosamina PTS (nagE, ptsH, ptsl, manXYZ).

Lista de abreviaturas utilizadas en el texto

3KO Una cepa mutante en la se inactivan los genes pgm, lacZy glgC

4KO Una cepa mutante en la se inactivan los genes pgm, lacZ, glgC y agp

6PG 6-fosfogluconato

BA Bifidobacterium adolescentis

BaSP Una sacarosa fosforilasa procedente de Bifidobacterium adolescentis

CA Operón de ácido colánico definido por Stevenson et al. (86)

CDW Peso celular en seco

CuCP Celobiosa fosforilasa de Cellulomonas uda

F6P Fructosa-6-fosfato

FBP Fructosa-1,6-bifosfato

Fru Fructosa

FT a1,2-fucosiltransferasa

G1P Glucosa-1 -fosfato

Gal1 P Galactosa-1 -fosfato

Glc Glucosa

Glu Glucosa

KI Activado

KO Inactivado

KP Kojibiosa fosforilasa

LA Lactobacillus acidophilus

LB Caldo Luria Bertani

LM Leuconostoc mesenteroides

MP Maltosa fosforilasa

P22 Promotor 22 de la librería de promotores de De Mey et al (2007)

pCXp22 Un plásmido que contiene el promotor P22 según Aerts et al (1)

PEP Fosfoenolpiruvato

Pi Fosfato inorgánico

PPi Pirofosfato

Pyr Piruvato

Rμm Revoluciones por minuto

SM Streptococcus mutans

SP Sacarosa fosforilasa

Suc Sacarosa

UDP-gal UDP-galactosa

UDP-glc UDP-glucosa

WT Cepa de tipo salvaje

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una Escherichia coli diseñada por ingeniería metabólica para la producción de al menos un producto especial elegido entre el grupo formado por un sacárido, un sacárido activado, un nucleósido, un glucósido, un glucolípido y una glucoproteína, caracterizada por que:

a) dicha E. coli está modificada genéticamente con la introducción de un gen que codifica una sacarosa fosforilasa, y b) dicha E. coli está además modificada genéticamente mediante inactivación de los genes pgi, pfkA y pfke.

2. Una S. cerevisae diseñada por ingeniería metabólica para la producción de al menos un producto especial elegido entre el grupo formado por un sacárido, un sacárido activado, un nucleósido, un glucósido, un glucolípido y una glucoproteína, caracterizada por que:

a) dicha S. cerevisae está modificada genéticamente con la introducción de un gen que codifica una sacarosa fosforilasa de Bifidobacterium adolescentis, y b) dicha S. cerevisae está además modificada genéticamente mediante inactivación de los genes PGM1, PFK1 y PFK₂, y además mediante inactivación de los genes SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C y YGR87c.

3. La E. coli o S. cerevisae diseñada por ingeniería metabólica según la reivindicación 1 o 2, donde dicho producto especial es fructosa-6-fosfato.

4. La E. coli diseñada por ingeniería metabólica de la reivindicación 1, donde dicho producto especial es un derivado de azúcar fucosilado y donde dicha E. coli está además modificada genéticamente con la introducción de un gen que codifica a-1,2-fucosiltransferasa procedente de H. pylori, Bacteroides sp., H. sapiens, M. musculus, 8. taurus o D. discoideum, donde los genes manA, cpsG, cpsB, gmd y fcl se sobreexpresan, y donde dicha bacteria está además modificada genéticamente mediante inactivación de los gmm, wcaA, wcaB, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, wcal, wcaJ, weaK, wcaL and wcaM, edd y eda.

5. La E. coli diseñada por ingeniería metabólica según la reivindicación 4, donde dicho producto especial es una fucosilactosa.

6. La E. coli diseñada por ingeniería metabólica según la reivindicación 4 o 5, donde dicho producto especial es a-1,2-fucosilactosa.

7. La E. coli o S. cerevisae diseñada por ingeniería metabólica según alguna de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha E. coli o S. cerevisae es capaz de crecer en glucosa como la principal fuente de carbono.

8. Un método para producir un derivado de azúcar fucosilado que comprende:

i) E. coli diseñada por ingeniería metabólica según alguna de las reivindicaciones 4 a 7, y

ii) cultivo de dicha E. coli diseñada por ingeniería metabólica, y

iii) extracción y purificación de dicho derivado de azúcar fucosilado.

9. El método según la reivindicación 8, en el que dicho derivado de azúcar fucosilado es fucosilactosa.

10. El método según la reivindicación 8 o 9, en el que dicho derivado de azúcar fucosilado es a-1,2-fucosilactosa.