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CN116171329A - 通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法 - Google Patents

通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法 Download PDF

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CN116171329A
CN116171329A CN202180056578.7A CN202180056578A CN116171329A CN 116171329 A CN116171329 A CN 116171329A CN 202180056578 A CN202180056578 A CN 202180056578A CN 116171329 A CN116171329 A CN 116171329A
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CN
China
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oligosaccharide
culture
oligosaccharides
ultrafiltration
less
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Application number
CN202180056578.7A
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乔瑞·博普雷兹
马丁·德尔福奇
加斯帕德·勒克斯
维姆·索塔特
托马斯·弗布鲁根
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Inbiose NV
Original Assignee
Inbiose NV
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Publication date
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Abstract

本发明属于寡糖生产的细胞培养或发酵的技术领域。本申请揭露了一种通过微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法。

Description

通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法
本发明属于寡糖生产的细胞培养或发酵的技术领域。本申请揭露了一种通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法。
背景技术
一般以结合蛋白质与脂质的糖结合形式存在的寡糖涉及许多生命现象，例如分化、发育与受精、胚胎形成、发炎、转移(metastasis)、宿主病原体附着等有关的生物识别过程。寡糖在体液与人乳中也可以未结合聚糖的形式存在，其中它们也调节了重要的发育与免疫过程(Bode,Early Hum.Dev.1-4(2015)；Reily et al.,Nat.Rev.Nephrol.15,346-366(2019)；Varki,Glycobiology 27,3-49(2017))。例如，几种寡糖已经证明可作为诱饵，通过与哺乳动物细胞的表面糖蛋白结合，以降低细菌和病毒病原体附着哺乳动物细胞的风险。如今，寡糖是通过化学、化学酶合成，或通过(代谢工程)细胞或微生物的培养或发酵以工业规模生产的。生产之后，较佳地将寡糖进行纯化以添加至个别的应用中。.
为了利用特定寡糖的正面效果，将单独的寡糖添加到营养组合物、化妆品、药物组合物和植物保护产品中。在某些情况下，以不同寡糖的组合进行补充更为方便，因为在寡糖混合物是哺乳类乳寡糖的混合物的情况下，这样的组合物，例如，则更接近于寡糖的天然来源。在其他情况下，通过在一次发酵中生产寡糖混合物，并将寡糖混合物从生物质、培养液组分和污染物中一起进行纯化，而不将不同的寡糖彼此分离，从而以更简单的方式更有效地生产特定寡糖的混合物。
因此，需要一种提供纯化寡糖溶液的方法，无论是仅包括一种待纯化的寡糖还是待纯化的不同寡糖的混合物，其中该方法适用于工业规模生产并提供简化的纯化过程。
上述目的已通过将由细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液进行纯化的方法实现。
发明概述
在第一方面，提供一种通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法。
在第二方面，提供一种通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法，其中该寡糖溶液灰分含量等于或低于10。
在第三方面，提供一种提供寡糖溶液糖浆的方法，其白利糖度在8-75％之间。
在第四方面，提供了一种干燥粉末，该干燥粉末基本上由一种寡糖或结构不同的寡糖混合物组成或含有该寡糖或结构不同的寡糖混合物，其较佳为用于生产营养组合物、膳食补充品、药物成分及/或化妆品成分。
在第五方面，提供一种包括干燥粉末的营养组合物，该干燥粉末基本上由一种寡糖或结构不同的寡糖混合物组成或含有该寡糖或结构不同的寡糖混合物。
定义
本说明书中描述本发明及其各种实施例的术语不可仅理解为其通常所定义的含意，且应通过本说明书中的特殊定义而包括通常所定义的含意范围以外的结构、材料或动作。因此，若要素在本说明书的背景下可被理解为包括一种以上的含意，则在申请专利范围中使用此要素需理解为说明书与该术语本身所支持的所有可能含意是通用的。
本文揭示的发明的各种实施例与实施例的方面不仅在本说明书具体描述的顺序与背景下进行解读，且应包括任何顺序及其任何组合。每当内容有需要，所有以单数形式的术语应视为包含复数，反之亦然。除非另有定义，本文使用的所有技术与科学术语一般具有本发明所属技术领域中具有通常知识者一般理解的相同含意。一般而言，本文使用的命名法及细胞培养、分子遗传学、有机化学与核酸化学的实验程序及本文所述的杂合(hybridization)步骤为本领域所周知且时常采用的。标准技术用于核酸与胜肽合成。一般而言，根据制造商说明书来进行纯化步骤。
本说明书中揭示了本发明的实施例，且虽然使用了特定术语，但术语仅是以描述性质而使用，并非用以作为限定，本发明的范围如下文权利要求书所述。应能理解的是，所述实施例仅是出于例示的目的而描述，不应将其视为限定本发明。对于本发明所属技术领域中具有通常知识者显而易见的是，其他实施例、改良、细节和用途与本揭露的文字及精神为一致的且在本揭露的范围以内，仅以权利要求书来限定本发明的范围，且以包括等同原则的专利法来进行解读。仅是为了便于描述起见，在下文权利要求书中，提供了仅为了说明方便用以表明权利要求书步骤的参考符号，而并非意图隐含进行这些步骤的特定顺序。
在此文件及其权利要求书中，动词「包括(comprise)」及其词型变化是以非限定的方式而使用，以意指在此术语之后所包含的项目，但不排除未特别提及的项目。在整个申请中，可利用「由…所组成」或「实质上由…所组成」取代动词「包括」，反之亦然。此外，可利用「实质上由…所组成」取代动词「由…所组成」，「实质上由…所组成」指的是本文所定义的组合物可包括所特别指明之外的额外成分，所述额外成分不会改变本发明的独特的特征。此外，以不定冠词「一(a或an)」提及成分不排除存在一个成分以上的可能性，除非内文明确指出仅有一个成分或其中一个成分。因此，不定冠词「一(a或an)」一般指的是「至少一个」。在整个申请中，除非另有明确说明，否则冠词「一(a或an)」较佳可利用「至少二」取代，更佳可利用「至少三」取代，更佳可利用「至少四」取代，更佳可利用「至少五」取代，更佳可利用「至少六」取代，最佳可利用「至少七」取代。
除非另有说明，本文所识别的每个实施例可以组合在一起。本说明书中提及的所有出版物、专利与专利申请案通过引用的方式并入本文，就如同明确且单独指明各个单独的出版物、专利或专利申请案通过引用的方式并入本文。优先权申请案EP20190210的全文亦通过引用的方式并入本文，就如同明确且单独指明所述优先权申请案通过引用的方式并入本文。
如本文提及细胞或宿主细胞而使用的「重组的(recombinant)」或「转基因的(transgenic)」或「经代谢改造的(metabolically engineered)」或「经基因改造的(genetically modified)」一词可交替使用，且指的是细胞复制异源核酸或表达异源核酸(亦即，对所述细胞而言是外来的序列，或对所述细胞中的所述位置或环境而言是外来的序列)编码的胜肽或蛋白质。这类细胞被描述为用至少被一种异源或外源基因进行转形，或描述为通过导入至少一种异源或外源基而进行转形。代谢改造或重组或转基因细胞可包含在细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因。重组细胞也可包含在细胞的天然形式中存在的基因，其中这些基因是经过修饰且利用人工方式重新导入至细胞。这些术语也包含含有对细胞而言为内源的核酸的细胞，所述核酸已经过修饰，或其表达或活性已在未从细胞移除核酸的情况下进行修饰，这些修饰包括通过基因取代、启动子(promoter)的取代、定点突变(site-specific mutation)及相关的技术。因此，「重组多肽」是由重组细胞所生产。如本文所使用的，「异源序列」或「异源核酸」是源自对特定细胞而言是外来的来源(例如，从不同的物种)，或者，若是源自相同来源，则是从其原始形式或基因体中的位置进行修饰。因此，与启动子可操作连接的异源核酸来自与衍生启动子的来源不同的来源，或者，若是自相同来源，则从其原始形式或基因体中的位置进行修饰。可稳定地导入异源序列，例如，通过转染、转化、接合或转导(transduction)，到宿主微生物细胞的基因体中，其中可以应用的技术取决于被导入的细胞和导入的序列。各种技术对于本发明所属技术领域具有通常知识者而言是习知的，且揭露于如Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中。本揭露内容中所使用的「突变」细胞或微生物指的是经基因改造的细胞或微生物。
在本揭露内容中的「内源的」一词是指任何多核苷酸、多肽或蛋白质序列，其是细胞的天然部分并且存在于其在细胞染色体中的自然位置。「外源的」一词是指任何多核苷酸、多肽或蛋白质序列，其源自于所研究的细胞外部，并且不是细胞的天然部分，或不存在于细胞染色体或质粒中的其自然位置。
「异源的」一词当用于提及多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶时，是指来自或衍生自宿主物种以外的来源的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相反地，本文使用的「同源」多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶来表示衍生自宿主生物体物种的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。当提及用于维持或操纵基因序列的基因调控序列或辅助核酸序列时(例如，启动子、5′未翻译区、3′未翻译区、poly A添加序列、内含子(intron)序列、剪接位点(splice site)、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因体同源区、重组位点等)，「异源的」是指调控序列或辅助序列与在构建体、基因体、染色体或附加体(episome)中与调控或辅助核酸序列并列的基因未有天然关联。因此，可操作地连接至在其天然状态下(亦即，在非基因改造生物体的基因体中)非可操作地连接至的基因的启动子在本文中被称为「异源启动子」，即使该启动子可衍生自与其所连接的基因相同的物种(或在某些情况下，相同的生物体)。
「野生型」一词是指自然界中常见的遗传或表型情况。
本文所使用的「单糖」一词指的是无法通过水解而分解成较简单糖类的糖，其被归类为醛糖(aldose)或酮糖(ketose)，且每个分子包含一或多个羟基。单糖为仅包含一个简单糖的糖类。单糖的范例包括己糖、D-葡萄吡喃糖(D-glucopyranose)、D-半乳呋喃糖(D-galactofuranose)、D-半乳吡喃糖、L-半乳吡喃糖、D-甘露吡喃糖、D-异吡喃糖(D-allopyranose)、L-阿卓吡喃糖(L-altropyranose)、D-古洛吡喃糖(D-gulopyranose)、L-艾杜吡喃糖(L-idopyranose)、D-塔罗吡喃糖(D-talopyranose)、D-核呋喃糖、D-核吡喃糖、D-阿拉伯呋喃糖、D-阿拉伯吡喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯吡喃糖、D-木吡喃糖(D-xylopyranose)、D-来苏吡喃糖(D-lyxopyranose)、D-赤藻呋喃糖(D-erythrofuranose)、D-苏呋喃糖(D-threofuranose)、庚糖、L-甘油-D-甘露吡喃庚糖(LDmanHep),D-甘油-D-甘露吡喃庚糖(DDmanHep)、6-脱氧-L-阿卓吡喃糖、6-脱氧-D-古洛吡喃糖、6-脱氧-D-塔罗吡喃糖、6-脱氧-D-半乳吡喃糖、6-脱氧-L-半乳吡喃糖、6-脱氧-D-甘露吡喃糖、6-脱氧-L-甘露吡喃糖、6-脱氧-D-古洛吡喃糖、2-脱氧-D-阿拉伯己糖、2-脱氧-D-赤藻戊糖、2,6-双脱氧-D-阿拉伯吡喃己糖、3,6-双脱氧-D-阿拉伯吡喃己糖、3,6-双脱氧-L-阿拉伯吡喃己糖、3,6-双脱氧-D-木吡喃己糖(3,6-dideoxy-D-xylopyranose)、3,6-双脱氧-D-核吡喃己糖、2,6-双脱氧-D-核吡喃己糖、3,6-双脱氧-L-木吡喃己糖、2-胺基-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-D-半乳吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-D-甘露吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-D-异吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-L-阿卓吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-D-古洛吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-L-艾杜吡喃糖、2-胺基-2-脱氧-D-塔罗吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-甘露吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-异吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-L-阿卓吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-古洛吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-L-艾杜吡喃糖、2-乙酰胺基-2-脱氧-D-塔罗吡喃糖、2-乙酰胺基-2,6-双脱氧-D-半乳吡喃糖、2-乙酰胺基-2,6-双脱氧-L-半乳吡喃糖、2-乙酰胺基-2,6-双脱氧-L-甘露吡喃糖、2-乙酰胺基-2,6-双脱氧-D-葡萄吡喃糖、2-乙酰胺基-2,6-双脱氧-L-阿卓吡喃糖、2-乙酰胺基-2,6-双脱氧-D-塔罗吡喃糖、D-葡萄吡喃糖醛酸(D-glucopyanuronic acid)、D-半乳呋喃糖醛酸、D-甘露吡喃糖醛酸、D-异吡喃糖醛酸、L-阿卓吡喃糖醛酸、D-古洛吡喃糖醛酸、L-古洛吡喃糖醛酸、L-艾杜吡喃糖醛酸、D-塔罗吡喃糖醛酸、唾液酸(sialic acid)、5-氨基-3,5-双脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-非-2-酮糖酸(5-Amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid)、5-乙酰胺基-3,5-双脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-非-2-酮糖酸、5-乙醇胺基-3,5-双脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-非-2-酮糖酸(5-Glycolylamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid)、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核-己-2-吡喃酮糖(D-ribo-Hex-2-ulopyranose)、D-阿拉伯-己-2-呋喃酮糖(D-果呋喃糖)、D-阿拉伯-己-2-吡喃酮糖、D-木-己-2-吡喃酮糖、L-来苏-己-2-吡喃酮糖、D-来苏-己-2-吡喃酮糖、D-苏-戊-2-吡喃酮糖(D-threo-pent-2-ulopyranose)、D-阿卓-庚-2吡喃酮糖、3-C-(羟甲基)-D-赤藻呋喃糖、2,4,6-三脱氧-2,4-二胺基-D-葡萄吡喃糖、6-脱氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖(3-O-mehtyl-rhamnose)、2,6-双脱氧-3甲基-D-核己糖、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖(2-Amino-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose)、2-乙酰胺基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖、2-乙醇胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖(2-Glycolylamido-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose)、3-脱氧-D-来苏-庚-2-吡喃酮糖酸(3-Deoxy-D-lyxo-hept-2-ulopyranosaric acid)、3-脱氧-D-甘露-辛-2-吡喃酮糖酸、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-非-2-吡喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-L-甘露-非-2-吡喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-L-阿卓-非-2-吡喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-非-2-吡喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-塔罗-非-2-吡喃酮糖酸、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神经胺酸、N-乙醇酰神经胺酸(N-glycolylneuraminic acid)、唾液酸、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸(glucuronic acid)、葡萄糖酸(gluconicacid)、果糖和多元醇(polyols)。
「多元醇」一词是指含有多个羟基的醇类。例如，甘油、山梨醇或甘露糖醇。
本文所使用的「双糖」一词是指由两个单糖单元组成的糖类。双糖的例子包括乳糖(Gal-b1,4-Glc)、乳糖-N-双糖(Gal-b1,3-GlcNAc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-b1,4-GlcNAc)、LacDiNAc(GalNAc-b1,4-GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺基葡萄糖(GalNAc-b1,4-Glc)、Neu5Ac-a2,3-Gal、Neu5Ac-a2,6-Gal和吡喃岩藻糖基-(1-4)-N-羟乙酰神经氨酸酰(fucopyranosyl-(1-4)-N-glycolylneuraminic acid)(Fuc-(1)-4)-Neu5Gc)。
「寡糖」是由三个或更多的单糖次单元组成的聚糖结构，这些次单元通过糖苷键以线性或支链结构相互连接。在此使用的「寡糖」一词是指含有少量，通常为三至二十个单糖，即单糖的糖聚合物。较佳地，如本文所述的寡糖包含选自由上文所用的列表的单糖。寡糖的实例包括但不限于路易斯抗原寡糖、唾液酸寡糖、岩藻糖基寡糖、几丁聚糖、几丁寡糖、硫酸化几丁聚糖、乙酰化几丁聚糖、肝素原(heparosan)、硫酸软骨素、糖胺聚糖寡糖(glycosaminoglycan oligosaccharide)、肝素(heparin)、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、玻尿酸或玻糖醛酸、硫酸角质素、哺乳类乳寡糖和人类乳寡糖。
本文所使用的「哺乳类乳寡糖」(mammalian milk oligosaccharide；MMO)是指寡糖，例如但不限于3-岩藻糖基乳糖、2'-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2',3-双岩藻糖基乳糖、2',2-双岩藻糖基乳糖、3、4-双岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、3'-唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳糖、6,6'-二唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳糖基-N-丁糖、乳糖基双岩藻丁糖、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖,乳糖基-N-岩藻戊糖II,乳糖基-N-岩藻戊糖I,乳糖基-N-岩藻戊糖III,乳糖基-N-岩藻戊糖V,乳糖基-N-岩藻戊糖VI,唾液酸乳糖基-N-新丁糖d,唾液酸乳糖基-N-新丁糖c,唾液酸乳糖基-N-丁糖b、唾液酸乳糖基-N-丁糖a、乳糖基-N-双岩藻糖己糖I、乳糖基-N-双岩藻糖己糖II、乳糖基-N-己糖、乳糖基-N-新己糖、对-乳糖基-N-己糖、单岩藻糖基单唾液酸乳糖-N-新丁糖c(monofucosylmonosialyllacto-N-neotetraose c)、单岩藻糖基对乳糖-N-己糖(monofucosyl para-lacto-N-hexaose)、单岩藻糖基乳糖-N-己糖III(monofucosyllacto-N-hexaose III)、异构岩藻糖基化乳糖-N-己糖III(isomeric fucosylated lacto-N-hexaose III)、异构岩藻糖基化乳糖-N-己糖I(isomeric fucosylated lacto-N-hexaose I)、唾液酸乳糖基-N-己糖、唾液酸乳糖基-N-新己糖II、双岩藻糖基-对-乳糖-N-己糖(difucosyl-para-lacto-N-hexaose)、双岩藻糖基乳糖-N-己糖(difucosyllacto-N-hexaose)、双岩藻糖基乳糖-N-己糖a(difucosyllacto-N-hexaose a)、双岩藻糖基乳糖-N-己糖c(difucosyllacto-N-hexaose c)、半乳糖基化几丁聚糖、岩藻糖基化寡糖、中性寡糖及/或唾液酸寡糖。哺乳类乳寡糖(MMO)包括于泌乳期间任何阶段的乳汁中存在的寡糖，包括来自人类的初乳(即人类乳寡糖或HMO)和哺乳动物，包括但不限于乳牛(Bos Taurus)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra aegagrus hircus)、双峰驼(Camelus bactrianus)、马(Equus ferus caballus)、猪(Sus scropha)、家犬(Canislupus familiaris)、虾夷棕熊(Ursus arctos yesoensis)、北极熊(Ursus maritimus)、日本黑熊(Ursus thibetanus japonicus)、条纹臭鼬(Mephitis mephitis)、连帽海豹(Cystophora cristata)、亚洲象(Elephas maximus)、非洲象(Loxodonta Africana)、巨型食蚁兽(Myrmecophaga tridactyla)、宽吻海豚(common brushtail possum)(Tursiopstruncates)、北小须鲸(Balaenoptera acutorostrata)、尤金袋鼠(Macropus eugenii)、红袋鼠(Macropus rufus)、刷尾负鼠(common brushtail possum)(TrichosurusVulpecula)、考拉(Phascolarctos cinereus)、东袋鼬(Eastern quolls)(Dasyurusviverrinus)、鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus)。人类乳寡糖(HMO)也称为类乳寡糖，其化学性质与人乳中发现的人类乳寡糖相同，但通过生物技术生产(使用无细胞系统或细胞和生物体，包括细菌、真菌、酵母、植物、动物或原生动物细胞，较佳为基因工程细胞和生物体)。人类相同的乳寡糖以HiMO的名称进行销售。
本文所使用的「基于乳糖的哺乳类乳寡糖(MMO)」是指如本文所定义的MMO，其在其还原端含有乳糖。
本文所使用的「路易斯抗原」一词包括下列寡糖：H1抗原，其系Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc，或简称为2′FLNB；Lewisa，即三糖Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或简称4-FLNB；Lewisb，即丁糖Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或简称DiF-LNB；sialyl Lewisa即5-乙酰神经氨酰-(2-3)-半乳糖基-(1-3)-(吡喃岩藻糖基-(1-4))-N-乙酰葡糖胺(5-acetylneuraminyl-(2-3)-galactosyl-(1-3)-(fucopyranosyl-(1-4))-N-acetylglucosamine)，或简写为Neu5Acα2-3Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc；H2抗原，即Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，或2'岩藻糖基-N-乙酰-乳糖胺，简称2'FLacNAc；Lewisx，即三糖Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，或称为3-岩藻糖基-N-乙酰-乳糖胺(3-Fucosyl-N-acetyl-lactosamine)，简称3-FLacNAc；Lewisy，即丁糖Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，和唾液酸Lewisx即5-乙酰神经氨酰-(2-3)-半乳糖基-(1-4)-(吡喃岩藻糖基-(1-3))-N-乙酰葡糖胺(5-acetylneuraminyl-(2-3)-galactosyl-(1-4)-(fucopyranosyl-(1-3))-N-acetylglucosamine)，或简写为Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc。
如本文所用，「唾液酸化寡糖」应理解为含有带电的唾液酸的寡糖，即具有唾液酸残基的寡糖。它具有酸性。唾液酸化寡糖包含至少一个唾液酸单糖次单元，例如但不限于Neu5Ac和Neu5Gc。所述唾液酸化寡糖是包含至少三个通过糖苷键相互连接的单糖次单元的糖结构，其中该单糖次单元中的至少一个是唾液酸。所述唾液酸化寡糖可包含多于一个唾液酸残基，例如两个、三个或更多的唾液酸残基。所述唾液酸可通过包含α-2,3、α-2,6键的α-糖苷键连接至包含半乳糖、GlcNAc、唾液酸的其他单糖次单元。一些例子是3-SL(3'-唾液酸乳糖)、3'-唾液酸乳糖胺、6-SL(6′-唾液酸乳糖)、6′-唾液酸乳糖胺、包含6′-唾液酸乳糖、8,3-二唾液酸乳糖(Neu5Ac-a2,8-Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-Glc)、SGG己糖(Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNacβ-1,3Galα-1,4Galβ-1,4Gal)、唾液酸化丁糖(Neu5Acα-2,3Galβ-1,4GlcNacβ-14GlcNAc)、戊糖LSTD(Neu5Acα-2,3Galβ-1,4GlcNacβ-1,3Galβ-1,4Glc)、唾液酸化乳糖-N-丙糖、唾液酸化乳糖-N-丁糖、唾液酸乳糖基-N-新丁糖、单唾液酸乳糖基-N-己糖、二唾液酸乳糖基-N-己糖I、单唾液酸乳糖基-N-新己糖I、单唾液酸乳糖基-N-新己糖II、二唾液酸乳糖基-N-新己糖、二唾液酸乳糖基-N-丁糖、二唾液酸乳糖基-N-己糖II、唾液酸乳糖基-N-丁糖a、二唾液酸乳糖基-N-己糖I、唾液酸乳糖基-N-丁糖b、唾液酸乳糖基-N-新丁糖c、唾液酸乳糖基-N-新丁糖d、3'-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖、二唾液酸单岩藻糖基乳糖基-N-新己糖、单岩藻糖基单唾液酸乳糖基-N-八糖(sialyl Lea)、唾液酸乳糖基-N-岩藻糖己糖II、二唾液酸乳糖基-N-岩藻糖戊糖II、单岩藻糖基二唾液酸乳糖基-N-丁糖、和带有一个或多个唾液酸残基的寡糖，包括但不限于：选自GM3(3'唾液酸乳糖,Neu5Acα-2,3Galβ-4Glc)的神经节苷脂的寡糖部分和包含以下的寡糖：GM3基序、GD3Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,4Glc GT3(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,4Glc)；GM2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc,GM1 Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc,GD1a Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc,GT1a Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc,GD2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GT2 GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GD1b,Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GT1b Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GQ1b Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GT1c Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GQ1c Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GP1c Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,3Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,8Neu5Acα-2,8Neu5Acα2,3)Galβ-1,4Glc,GD1a Neu5Acα-2,3Galβ-1,3(Neu5Acα-2,6)GalNAcβ-1,4Galβ-1,4Glc,Fucosyl-GM1 Fucα-1,2Galβ-1,3GalNAcβ-1,4(Neu5Acα-2,3)Galβ-1,4Glc；所有这些都可以通过将上述寡糖部分与神经酰胺反应或在神经酰胺上合成上述寡糖而延伸到相应神经节苷脂的生产。
本发明中使用的术语「alpha-2,3-唾液酸转移酶」、「alpha 2,3唾液酸转移酶」、「3-唾液酸转移酶」、「α-2,3-唾液酸转移酶」、「α2,3唾液酸转移酶」、「3唾液酸转移酶」、「3-ST」或「3ST」可互换使用，并且指代催化唾液酸从供体CMP-Neu5Ac以α-2,3键结转移到的受体分子中的糖基转移酶。本发明中使用的术语「3′唾液酸乳糖」、「3'-唾液酸乳糖」、「alpha-2,3-唾液酸乳糖」、「alpha 2,3唾液酸乳糖」、「α-2,3-唾液酸乳糖」、「α2,3唾液酸乳糖」、「3SL」或「3′SL」可互换使用，并且指代通过α-2,3-岩藻糖基转移酶催化将唾液酸基团从CMP-Neu5Ac以α-2,3-键结转移到乳糖中获得的产物。本发明中使用的术语「alpha-2,6-唾液酸转移酶」、「alpha 2,6-唾液酸转移酶」、「6-唾液酸转移酶」、「α-2,6-唾液酸转移酶」、「α2,6-唾液酸转移酶」、「6-唾液酸转移酶」、「6-唾液酸转移酶」、「6-ST」或「6ST」可互换使用，并且指代催化唾液酸从供体CMP-Neu5Ac以α-2,6-键结转移到受体分子中的糖基转移酶。本发明中使用的术语「6'唾液酸乳糖」、「6'-唾液酸乳糖」、「alpha-2,6-唾液酸乳糖」、「alpha 2,6唾液酸乳糖」、「α-2,6-唾液酸乳糖」、「α2,6唾液酸乳糖」、「6SL」或「6′SL」可互换使用，是指通过α-2,6-岩藻糖基转移酶催化将唾液酸基团从CMP-Neu5Ac以alpha-2,6-连结转移到乳糖而获得的产物。本发明中使用的术语「alpha-2,8-唾液酸转移酶」、「alpha 2,8唾液酸转移酶」、「8-唾液酸转移酶」、「α-2,8-唾液酸转移酶」、「α2,8-唾液酸转移酶」、「8-唾液酸转移酶」、「8-唾液酸转移酶」「8-ST」或「8ST」可互换使用，是指催化唾液酸从供体CMP-Neu5Ac以α-2,8-键结转移到受体中的糖基转移酶。
如本文所用且如本领域中通常理解的，「岩藻糖基化寡糖」是携带岩藻糖残基的寡糖。此类岩藻糖基化寡糖是包含至少三个通过糖苷键彼此连接的单糖次单元的糖结构，其中该单糖次单元中的至少一个是岩藻糖。岩藻糖基化寡糖可含有多于一个岩藻糖残基，例如两个、三个或更多。岩藻糖基化寡糖可以是中性寡糖或带电寡糖，例如还包含唾液酸结构。岩藻糖可以通过包含alpha-1,2、alpha-1,3、alpha-1,4、alpha-1,6键的alpha-糖苷键连接到其他包括葡萄糖、半乳糖、GlcNAc的单糖次单元。
例示包括2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、双岩藻基乳糖(diFL)、乳糖双岩藻丁糖(lactodifucotetraose,LDFT)、乳糖基-N-岩藻糖戊糖I(LNFP I)、乳糖基-N-岩藻戊糖II(LNFP II)、乳糖基-N-岩藻戊糖III(LNFP III)、乳糖基-N-岩藻戊糖V(LNFP V)、乳糖基-N-岩藻戊糖VI(LNFP VI)、乳糖基-N-新岩藻糖戊糖I、乳糖基-N-双岩藻己糖I(LDFH I)、乳糖基-N-双岩藻己糖II(LDFH II)、单岩藻糖基乳糖-N-己糖III(Monofucosyllacto-N-hexaose III,MFLNH III)、双岩藻基乳糖基-N-己糖(DFLNHa)、双岩藻基-乳糖基-N-新己糖、3′-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖、二唾液酸单岩藻糖基乳糖基-N-新己糖、单岩藻糖基单唾液酸乳糖基-N-八糖(sialyl Lea)、唾液酸乳糖基-N-岩藻糖己糖II、二唾液酸乳糖基-N-岩藻糖戊糖II、单岩藻糖基二唾液酸乳糖基-N-丁糖。
本发明中使用的术语「alpha-1,2-岩藻糖基转移酶」、「alpha 1,2岩藻糖基转移酶」、「2-岩藻糖基转移酶」、「α-1,2-岩藻糖基转移酶」、「α1,2岩藻糖基转移酶」、「2岩藻糖基转移酶」、「2-FT」或「2FT」可互换使用，指代催化岩藻糖从供体GDP-L-岩藻糖以α-1,2-键结转移到受体分子中的糖基转移酶。本发明中使用的术语「2'岩藻糖基乳糖」、「2'-岩藻糖基乳糖」、「alpha-1,2-岩藻糖基乳糖」、「alpha 1,2岩藻糖基乳糖」、「α-1,2-岩藻糖基乳糖」、「α1,2岩藻糖基乳糖」、「Galβ-4(Fucα1-2)Glc」、「2FL」或「2'FL」可互换使用，是指通过alpha-1,2-岩藻糖基转移酶的催化，从GDP-L-岩藻糖中将岩藻糖残基以α-1,2-键结转移至乳糖获得的产物。本发明中使用的术语「双岩藻基乳糖」、「二-岩藻糖基乳糖」、「乳双岩藻丁糖」、「2′,3-双岩藻基乳糖」、「2′,3双岩藻基乳糖」、「α-2′,3-岩藻糖基乳糖」、「α2′,3岩藻糖基乳糖」、「Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)Glc」、「DFLac」、「2',3diFL」、「DFL」、「DiFL」或「diFL」可互换使用。
本发明中使用的术语「alpha-1,3-岩藻糖基转移酶」、「alpha 1,3岩藻糖基转移酶」、「3-岩藻糖基转移酶」、「α-1,3-岩藻糖基转移酶」、「α1,3岩藻糖基转移酶」、「3岩藻糖基转移酶」、「3-FT」或「3FT」可互换使用，是指催化岩藻糖从供体GDP-L-岩藻糖以α-1，3-键结转移到受体分子的糖基转移酶。本发明中使用的术语「3-岩藻糖基乳糖」、「alpha-1,3-岩藻糖基乳糖」、「alpha 1,3岩藻糖基乳糖」、「α-1,3-岩藻糖基乳糖」、「α1,3岩藻糖基乳糖」、「Galβ-4(Fucα1-3)Glc」、「3FL」或「3-FL」可互换使用，是指经alpha-1,3-岩藻糖基转移酶催化，将岩藻糖残基从GDP-L岩藻糖以α-1,3-键结转移至乳糖而获得的产物。
如本文所用且如本领域状态中通常理解的，「中性寡糖」是不具有源自羧酸基团的负电的寡糖。这种中性寡糖的例示是2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、2′,3-双岩藻基乳糖(diFL)、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖戊糖I、乳糖基-N-新岩藻糖戊糖I、乳糖基-N-岩藻糖戊糖II、乳糖基-N-岩藻糖戊糖III、乳糖基-N-岩藻糖戊糖V、乳糖基-N-岩藻糖戊糖VI、乳糖基-N-新岩藻糖戊糖V、乳糖基-N-双岩藻己糖I、乳糖基-N-双岩藻己糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖基-N-己糖、乳糖基-N-新己糖、对-乳糖基-N-己糖、对-乳糖基-N-新己糖、双岩藻糖基-乳糖基-N-己糖和双岩藻糖基-乳糖基-N-新己糖。
术语「LNB」和「乳糖基-N-双糖」可互换使用，且指代双糖Gal-b1,3-GlcNAc。
术语「LacNAc」和「N-乙酰乳糖胺」可互换使用，且指代双糖Gal-b1,4-GlcNAc。
本发明中使用的术语「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳糖基-N-丙糖II」、「乳糖基-N-丙糖II」、「乳糖基-N-丙糖」、「乳糖基-N-丙糖」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
本发明中使用的术语「LNT」、「乳糖基-N-丁糖」、「乳糖基-N-丁糖」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
本发明中使用的术语「LNnT」、「乳糖基-N-新丁糖」、「乳糖基-N-新丁糖」、「neo-LNT」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
本发明中使用的术语「LSTa」、「LS-丁糖a」、「唾液酸-乳糖基-N-丁糖a」、「唾液酸乳酸-N-丁糖a」或「Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互换使用。
本发明中使用的术语「LSTb」、「LS-丁糖b」、「唾液酸-乳糖基-N-丁糖b」、「唾液酸乳糖基-N-丁糖b」或「Gal-b1,3-(Neu5Ac-a2,6)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互换使用。
本发明中使用的术语「LSTc」、「LS-丁糖c」、「唾液酸-乳糖基-N-丁糖c」、「唾液酸乳糖-N-丁糖c」、「唾液酸乳糖基-N-新丁糖c」或「Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互换使用。
本发明中使用的术语「LSTd」、「LS-丁糖d」、「唾液酸-乳糖基-N-丁糖d」、「唾液酸乳糖基-N-丁糖d」、「唾液酸乳糖基-N-新丁糖d」或「Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc」可互换使用。
术语「DSLNnT」和「二唾液酸乳糖基-N-新丁糖」可互换使用，且指代Neu5Ac-a2,6-[Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc。
术语「DSLNT」和「二唾液酸乳糖基-N-丁糖」可互换使用，且指代Neu5Ac-a2,6-[Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc。术语「LNFP-I」、「乳糖基-N-岩藻糖戊糖I」、「LNFP I」、「LNF I OH I型决定子(LNF I OH type I determinant)」、「LNF I」、「LNF1」、「LNF 1」和「H血型抗原戊糖1型(Blood group H antigen pentaose type 1)」可互换使用，且指代Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
术语「GalNAc-LNFP-I」和「A血型抗原己糖I型」可互换使用，且指代GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
术语「LNFP-II」和「乳糖基-N-岩藻糖戊糖II」可互换使用，且指代Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
术语「LNFP-III」和「乳糖基-N-岩藻糖戊糖III」可互换使用，且指代Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
术语「LNFP-V」和「乳糖基-N-岩藻糖戊糖V」可互换使用，且指代Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
术语「LNFP-VI」、「LNnFP V」和「乳糖基-N-新岩藻戊糖V」可互换使用，且指代Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
术语「LNnFP I」和「乳糖基-N-新岩藻糖戊糖I」可互换使用，且指代Fuc-a1,2-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
术语「LNDFH I」、「乳糖基-N-双岩藻己糖I」、「LNDFH-I」、「LDFH I」、「Leb-乳糖」和「Lewis-b己糖」可互换使用，且指代Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。
术语「LNDFH II」、「乳糖基-N-双岩藻己糖II」、「Lewis a-Lewis x」和「LDFH II」可互换使用，且指代Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
术语「LNnDFH」、「乳糖基-N-新双岩藻己糖」和「Lewis x己糖」可互换使用，且指代Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。
术语「alpha-丁糖」和「A-丁糖」可互换使用，且指代GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,4-Glc。
带电寡糖」是包含一个或多个带负电的单糖次单元的寡糖结构，包括N-乙酰神经胺酸(Neu5Ac)，通常称为唾液酸、N-羟乙酰神经胺酸(Neu5Gc)、葡萄糖醛酸酯(glucuronate)和半乳糖醛酸酯(galacturonate)。带电寡糖也称为酸性寡糖(acidoligosaccharides or acidic oligosaccharides)。唾液酸属于神经胺酸(5-胺基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸)衍生物的家族。Neu5Gc是唾液酸的衍生物，由Neu5Ac的C5处的N-乙酰基羟基化形成。相反，中性寡糖是非唾液酸化寡糖，因此不包含酸性单糖次单元。中性寡糖包括在其聚糖结构中含有一个或多个岩藻糖次单元的不带电的岩藻糖基化寡糖，以及缺乏任何岩藻糖次单元的不带电的非岩藻糖基化寡糖。带电寡糖的其他例子是硫酸化壳聚糖和去乙酰壳聚糖。
如本文所用，人类ABO血型系统的抗原是寡糖。人类ABO血型系统的此类抗原不限于人类结构。所述结构涉及A决定子(determinant)GalNAc-alpha1,3(Fuc-alpha1,2)-Gal-、B决定子Gal-alpha1,3(Fuc-alpha1,2)-Gal-和H决定子Fuc-alpha1,2-Gal-，存在于包含Gal-beta1,3-GlcNAc、Gal-beta1,4-GlcNAc、Gal-beta1,3-GalNAc及Gal-beta1,4-Glc的双糖核心结构上。
如本文所用，「岩藻糖基化途径(fucosylation pathway)」是由酶及其各自的基因、甘露糖-6-磷酸糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶、GDP甘露糖4,6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成途径及/或再利用路径L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GDP-L-fucose synthase and/or the salvage pathway L-fucokinase/GDP-fucosepyrophosphorylase)，结合导致α1,2、α1,3、α1,4及/或α1,6岩藻糖基化寡糖的岩藻糖基转移酶。
「唾液酸化途径(sialylation pathway)」是由酶及其各自的基因组成的生化途径，L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡糖胺变位酶、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶、N-乙酰葡萄糖胺-6P 2-差向异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰甘露糖胺激酶，磷酸乙酰葡萄糖胺变位酶、N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase)、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶、唾液酸合酶、N-乙酰神经胺酸解离酶、N-酰基神经胺酸-9-磷酸合酶、N-酰基神经胺酸-9-磷酸磷酸酶、及/或CMP-唾液酸合酶，与导致2,3、α2,6及/或α2,8唾液酸化寡糖的唾液酸转移酶结合。
如本文所用，「半乳糖基化途径(galactosylation pathway)」是由酶及其各自的基因组成的生化途径，半乳糖-1-差向异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、UDP-葡萄糖4-差向异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶及/或葡糖磷酸变位酶，与导致寡糖的2、3、4及/或6羟基上形成alpha或bata结合的半乳糖的半乳糖基转移酶结合。
如本文所用，「N-乙酰葡萄糖胺碳水化合物途径(N-acetylglucosaminecarbohydrate pathway)」是由酶及其各自的基因组成的生化途径，L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶、N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶及/或葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶，与导致寡糖的3、4及/或6羟基上形成alpha或beta结合的N-乙酰葡萄糖胺的糖基转移酶结合。
如本文所用，「N-乙酰半乳糖胺化(N-acetylgalactosaminylation)途径」是包含选自包括L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺4-差向异构酶、UDP-葡萄糖4-差向异构酶、N-乙酰半乳糖胺激酶及/或UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶的列表中的至少一种酶及其各自基因的生化途径，且与导致GalNAc修饰化合物的糖基转移酶结合，其中GalNAc修饰化合物包含在所述单糖、双糖或寡糖上具有alpha或beta结合的N-乙酰半乳糖胺的单糖、双糖或寡糖。
如本文所用，「甘露糖基化(mannosylation)途径」是包含甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶及/或甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶的列表中的至少一种酶及其各自基因的生化途径，且与导致甘露糖基化化合物的糖基转移酶组合，所述甘露糖基化化合物包括在所述单糖、双糖或寡糖上具有alpha或beta结合甘露糖的单糖、双糖或寡糖。
如本文所用，「N-乙酰甘露糖胺化(N-acetylmannosaminylation)途径」是包含选自包括L-麸酰胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基转移酶、葡糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰转移酶、N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶、UDP-GlcNAc 2-差向异构酶及/或ManNAc激酶的列表中的至少一种酶及其各自基因的生化途径，且与导致ManNAc修饰的化合物的糖基转移酶结合，该化合物包含在所述单糖、双糖或寡糖上具有alpha或beta结合的N-乙酰甘露糖胺的单糖、双糖或寡糖。
如本文所用和本领域所使用的术语「基本上由……组成」是指由在所述术语之后指定的化合物和-可视需要地-不可避免的副产物组成的组合物。所述不可避免的副产物包括——例如——在用于生产仅包含一种寡糖或寡糖混合物的寡糖溶液的细胞培养或微生物发酵过程中生产的化合物以及从回收寡糖溶液引入到程序流中但不能被移除的化合物。
关于喷雾干燥粉末的术语「基本上由……组成」包括具有相对于喷雾干燥粉末的干燥物质至少80％-wt.、至少85％-wt、至少90％-wt.、至少93％-wt.、至少95％-wt.或至少98％-wt寡糖混合物的喷雾干燥粉末。术语「基本上由……组成」同样用于喷雾干燥的粉末、程序流和含有寡糖混合物的溶液。
此外，在本文中，术语「污染物」和「杂质」较佳意指可存在于来自发酵方法的水培养基(aqueous medium)中的微粒、细胞、细胞组分、代谢物、细胞碎片、蛋白质、胜肽、胺基酸、核酸、糖脂和内毒素。
本文使用的「澄清」一词是指处理水培养基或发酵液以从发酵方法中去除悬浮颗粒和污染物，特别是细胞、细胞成分、不溶性代谢物和碎片，这些可能干扰寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物的最终纯化。此类处理可以通过离心、絮凝、可视需要有超声波处理的絮凝、重力过滤、微滤、泡沫分离或真空过滤(例如，通过可包括CeliteTM助滤剂的陶瓷过滤器)以常规方式进行。
如本文所用，术语「不含蛋白质的寡糖溶液」是指来自水培养基或发酵方法的培养液(broth)的寡糖溶液，该培养基已被处理以从过程中基本上去除可能会在过程中干扰最终纯化寡糖溶液的所有蛋白质以及任何相关杂质，例如胺基酸、胜肽、内毒素、糖脂、RNA和DNA。可以通过离子交换层析、亲和层析、超滤和粒径筛析层析以常规方式完成蛋白质，较佳为基本上所有蛋白质的这种去除。较佳地，不含蛋白质的寡糖溶液是澄清的寡糖溶液或澄清的发酵液(fermentation broth)
根据本发明，术语「从培养或发酵液中纯化寡糖溶液」是指从细胞及/或其生长培养基中收获、收集或回收(retrieving)寡糖溶液(oligosaccharide solution)。术语「培养物(cultivation)」是指其中栽培(cultivated)或培养(cultured)或发酵(fermented)细胞的培养基、细胞本身以及由细胞在全培养液中，即细胞的内部(细胞内)和细胞的外部(细胞外)生产的寡糖。
如果寡糖溶液仍然存在或部分存在于生产寡糖溶液的细胞中，可以使用常规方式从细胞中释放或提取寡糖溶液，例如使用高pH值破坏细胞、热休克、音波处理、法式压碎(French press)、均质、酶水解、化学水解、溶剂水解、界面活性剂、水解……。接着可以一起及/或单独地将培养培养基及/或细胞提取物进一步用于从发酵液中纯化寡糖溶液。
术语「纯化的」是指基本上或实质上不含干扰生物分子活性的成分的材料。对于细胞、糖类、核酸和多肽，术语「纯化的」是指基本上或实质上不含在天然状态下发现的通常伴随材料的组分的材料。通常，本发明的纯化的糖类、寡糖、蛋白质或核酸通过银染凝胶(silver stained gel)上的条带强度或其他确定纯度的方法测量的纯度至少约为50.0％、55.0％、60.0％、65.0％、70.0％、75.0％、80.0％或85.0％，通常至少约为90％、91.0％、92.0％、93.0％、94.0％、95.0％、96.0％、97.0％、98.0％或99.0％。纯度或均质性(homogeneity)可以通过本领域习知的多种方式来指示，例如蛋白质或核酸样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并接续染色后可视化。出于某些目的，需要高分辨率并使用HPLC或类似的纯化方法。对于寡糖，纯度可以使用例如但不限于薄层层析、气相层析、NMR、HPLC、毛细管电泳或质谱的方法来确定。
「纯化的寡糖溶液」包括在水培养基中溶解的一寡糖或寡糖混合物。水培养基是包含水的溶剂。在一些实施例中，水培养基是纯水。在其他实施例中，培养基包括水和痕量的一种或多种有机溶剂。在一些这样的实施例中，培养基包含小于1％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，培养基包含小于0.1％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，培养基包含小于0.01％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，培养基包含小于0.001％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，培养基包含小于0.0001％-wt的有机溶剂。
在一些实施例中，寡糖溶液包含痕量的一种或多种有机溶剂。在一些这样的实施例中，纯化的寡糖溶液包含小于1％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，纯化的寡糖溶液包含小于0.1％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，纯化的寡糖溶液包含小于0.01％-wt(重量百分比)的有机溶剂。在一些实施例中，纯化的寡糖溶液包含小于0.001％-wt的有机溶剂。在一些实施例中，纯化的寡糖溶液包含小于0.0001％-wt的有机溶剂。
如本文所用，「白利糖度值(Brix value)」表示水溶液的糖含量。白利糖度值可以表示为百分比(白利糖百分比percent Brix)或「白利糖度」(degrees Brix)。严格地说，白利糖度值是纯水溶液中蔗糖的重量百分比，因此不适用于包含其他溶质及/或溶剂的溶液。然而，白利糖度值易于测量，因此在本领域中通常用作除纯蔗糖溶液之外的糖溶液的总糖含量的近似值。如本文所用，当纯化的寡糖溶液包含两种或更多种不同的寡糖时，「白利糖度值」表示水溶液的总糖含量。
测量白利糖度值的技术是本领域习知的。糖在水溶液中的溶解会改变溶液的折射率。因此，可以使用适当校正的折射计来测量溶液的白利糖度值。
或者，可以测量溶液的密度并将其转换为白利糖度值。电子式密度计可以自动进行这种测量和转换，或者可以使用比重计或比重瓶。
如本文所用，术语「体积密度(bulk density)」是给定体积中颗粒固体(例如粉末)的颗粒的重量，并以克/升(g/L)表示。颗粒固体的颗粒占据的总体积取决于颗粒本身的尺寸和颗粒之间空间的体积。颗粒之间和内部的夹带空气也会影响体积密度。因此，由具有大颗粒间空间的多孔大颗粒组成的颗粒固体将具有比由紧密压实在一起的无孔小颗粒组成的颗粒固体更低的体积密度。体积密度可以用两种形式表示：「松散体积密度(loose bulkdensity)」和「振实体积密度(Tapped bulk density)」。松散体积密度(在本领域中也称为「自由沉降(freely settled)」或「倾倒(poured)」体积密度)是颗粒固体的重量除以其体积，其中使得颗粒固体自行沉降到该体积(例如倒入容器的粉末)。
可以通过振实容器来更紧密地压实容器内的固体颗粒，让颗粒更紧密地聚集在一起，从而在重量保持不变的情况下减小体积。因此振实增加了体积密度。振实体积密度(在本领域中也称为「装填(tamped)」体积密度)是颗粒固体的重量除以它的体积，其中将颗粒固体轻敲并使其沉淀到体积中精确的次数。颗粒固体被振实的次数在陈述振实体积密度时是惯有的。例如，「100x振实体积密度」是指颗粒固体在振实100次后的体积密度。
测量体积密度的技术是本领域习知的。松散体积密度可用量筒和秤测量：将固体颗粒倒入量筒中，测量固体颗粒的重量和体积；重量除以体积得出松散体积密度。振实体积密度可以使用相同的技术进行测量，并在测量重量和体积之前额外振实量筒一定的次数。振实的自动化可确保各个振实的数量、时间和压力准确且一致。自动振实装置很容易获得，一个例子是J.Englesmann AG的Jolting Stampfvolumeter(STAV 203)。
如本文所用，术语「不同的寡糖」是指结构不同的寡糖。
如本文所用，术语「干燥固体」和「干燥物质」可互换使用并在示例1中进一步描述。
在整个申请中，除非另有明确说明，「基因改造微生物」或「代谢工程微生物」或「基因改造细胞」或「代谢工程细胞」分别较佳地是指分别经过基因改造的或代谢工程的微生物或细胞，用于生产包含根据本发明的不同寡糖的所述混合物。在本发明的上下文中，本文公开的所述混合物的不同寡糖较佳分别不存在于所述代谢工程微生物或细胞的野生型祖先(wild type progenitor)中。
在整个申请中，除非另有明确说明，否则部件的「合成(synthesize)」、「合成的(synthesized)」和「合成(synthesis)」分别与部件的「生产(produce)」、「生产的(produced)」和「生产(production)」可互换使用。
发明详述
根据第一方面，本案提供了一种以批次方式或连续方式从细胞培养或微生物发酵获得的培养液或发酵液中纯化寡糖溶液之方法。该培养或发酵液还包括生物量、培养基成分及污染物。该培养或发酵液中的寡糖溶液的纯度最佳地占总干燥固体的<80％。该培养或发酵液应用于以下纯化步骤：i)澄清该培养或发酵液。ii)从该澄清的培养或发酵液中去除盐及/或培养基成分，以及iii)较佳地浓缩该寡糖溶液，从而获得占总干燥固体≥80％的纯度的纯化寡糖溶液。上述方法的特征在于，从该澄清的培养液或发酵液中去除盐分及/或培养基成分的步骤ii)包括离子交换处理，其包含用于去除正电材料的阳离子交换处理，并且不包含用于去除负电材料的阴离子交换处理。
纯化步骤包括培养或发酵液的澄清与从澄清的培养或发酵液中去除盐类及/或培养基成分，及最佳地将所述寡糖溶液进行浓缩的结合。在一实施例中，澄清与盐类及/或培养基成分的去除相结合。在一实施例中，澄清与在澄清的培养或发酵液中将寡糖溶液进行浓缩的步骤相结合，并且接着进行步骤ii)。在一实施例中，澄清与盐类及/或培养基成分的去除相结合，并且进一步与由盐类及/或培养基成分的去除步骤生产的寡糖溶液的浓缩步骤相结合。在一实施例中，澄清与寡糖溶液的浓缩步骤相结合，并且进一步与由浓缩步骤生产的寡糖溶液的盐类及/或培养基成分的去除相结合，并且进一步与步骤ii)之后的浓缩步骤相结合。
本发明的方法允许以高纯度将大量的寡糖溶液进行有效纯化，该寡糖溶液仅包含一种寡糖或寡糖混合物。
与目前用于细胞培养或发酵生产寡糖的纯化相反，该纯化提供使用阴离子和阳离子交换的离子交换处理将寡糖从培养或发酵液中分离，通过省略使用阴离子交换处理，本方法允许提供简化的寡糖溶液纯化。可以通过干燥、喷雾干燥、冻干或浓缩成至少40％为干燥物质的糖浆，以获得固体形式的纯化寡糖溶液。所提供的(多种)寡糖不含源自所用重组细胞或微生物菌株的蛋白质和重组材料，因此非常适用于食品、医疗食品和饲料(例如宠物食品)的应用。
在一实施例中，纯化包括澄清含有寡糖溶液的培养或发酵液以去除悬浮颗粒和污染物，特别是通过培养基因改造细胞生产的细胞、细胞成分、不溶性代谢物和碎片。在此步骤中，可以以常规方式澄清含有所生产的寡糖溶液的培养或发酵液。较佳地，通过离心、絮凝(flocculation)、倾析(decantation)、超滤及/或过滤来澄清培养或发酵液。从培养或发酵液中纯化寡糖溶液的第二步骤包括待其澄清后，从含有寡糖溶液的培养或发酵液中去除盐及/或培养基成分，包括蛋白质以及胜肽、胺基酸、RNA和DNA以及可能影响纯度的任何内毒素和糖脂。该步骤包括由用于去除正电材料的阳离子交换处理组成的离子交换处理，并且所述离子交换处理不包括用于去除负电材料的阴离子交换处理。在此步骤中，通过超滤、纳米过滤、逆渗透、微滤、活性碳或碳处理、切向流高性能过滤、切向流超滤、亲和层析、进一步的阳离子交换、疏水性相互作用层析及/或凝胶过滤(即粒径筛析层析)，特别是通过层析，更特别是通过离子交换层析或疏水性相互作用层析或配体交换层析从含有寡糖混合体的混合物中去除蛋白质、盐类、副产物、颜色和其他相关杂质。除了粒径筛析层析，蛋白质和相关杂质被层析基质(chromatography medium)或选定的选透膜保留，而寡糖溶液保留在澄清的、可能是浓缩的培养液或发酵液中。从培养或发酵液中纯化寡糖混合物的第三步骤较佳为包括浓缩培养或发酵液。在一实施例中，第三步骤在第二步骤之前。在一实施例中，浓缩步骤在第二步骤之前并且在如上所述的第二步骤之后再次进行。
在一实施例中，纯化的寡糖溶液的灰分含量占总干燥固体≤10％，较佳为占总干燥固体≤9％，更佳为占总干燥固体≤8％，更佳为占总干燥固体≤7％，甚至更佳为占总干燥固体的≤6％，甚至更佳为占总干燥固体的≤5％，甚至更佳为占总干燥固体的≤4％，甚至更佳为占总干燥固体的≤3％，甚至更佳为≤2占总干燥固体的％，甚至更佳为占总干燥固体的≤1％，最佳为占总干燥固体的≤0.5％。
在一实施例中，寡糖溶液分别从通过使用至少一种细胞的细胞培养液或使用至少一种微生物的微生物发酵获得的培养或发酵液进行纯化。细胞可以是真菌、酵母、细菌、昆虫、动物、植物和原生动物细胞。较佳地，所使用的细胞是微生物的细胞。微生物较佳为细菌或酵母。
在一实施例中，细胞是在化学限定培养基中生长的重组细胞，其中在步骤i)中分离的生物量可视需要地再循环到细胞培养中。
在一实施例中，细胞培养使用重组细胞并且包括至少一种已经基因改造以产生寡糖的细胞，较佳地，该至少一种细胞已经基因改造以产生至少两种不同的寡糖。
在一实施例中，培养液中的寡糖溶液是通过使用至少一种能够产生所述寡糖溶液的基因改造细胞的细胞培养获得的，较佳为来自内化的碳水化合物前体。
在一实施例中，微生物是在化学限定培养基中生长的重组微生物，其中在步骤i)中分离的生物量可视需要地再循环至微生物发酵。
在一实施例中，微生物发酵使用重组微生物并且包含至少一种已经基因改造以产生寡糖的微生物，较佳地，该至少一种微生物已经基因改造以产生至少两种不同的寡糖。
在一实施例中，发酵液中的寡糖溶液是通过微生物发酵获得的，上述微生物发酵使用至少一种能够产生所述寡糖溶液的基因改造微生物，较佳为来自内化的碳水化合物前体。
根据本发明的一实施例，细胞培养或微生物发酵在具有碳源的基础盐培养基中培养，该至少一种细胞或微生物分别在上述碳源上生长。较佳地，基础盐培养基含有硫酸盐、磷酸盐、氯化物、铵、钙离子、镁离子、钠离子、钾离子、铁离子、铜离子、锌离子、锰离子、钴离子及/或硒离子。
本文所用的该至少一种细胞或微生物，在以单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、复合培养基或其混合物为主要碳源上生长。主要碳源是指感兴趣之生物产品、生物量形成、二氧化碳及/或副产品形成(例如酸及/或醇，例如乙酸盐、乳酸盐及/或乙醇)的最重要的碳源，即20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的所有所需碳来自上述碳源。在本发明的一实施例中，所述碳源是所述生物体的唯一碳源，即所有所需碳的100％源自上述碳源。常见的主要碳源包括但不限于葡萄糖、甘油、果糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽寡糖(malto-oligosaccharides)、麦芽三糖、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖(trehalose)、淀粉、纤维素、半纤维素、玉米浸液(corn-steep liquor)、高果糖糖浆、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和丙酮酸盐。术语复合培养基是指其确切构成未确定的培养基。例如糖蜜、玉米浸液、蛋白胨(peptone)、胰胨(tryptone)或酵母提取物。
替代地或较佳地，碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、玉米浸液、乳糖、半乳糖、高果糖糖浆、淀粉、纤维素、半纤维素、麦芽寡糖、海藻糖、甘油、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和丙酮酸盐之一或多种。
在一实施例中，在培养或发酵液中的寡糖溶液的纯度在纯化前以总干燥固体计为<70％、<60％、<50％、<40％、<30％、<20％、<10％，及/或纯化的寡糖溶液的纯度在纯化后以总干燥固体计为>80％，较佳为>85％，更加为>90％，再更加为>95％，最佳为>97％。
在一实施例中，寡糖溶液的纯化产率为>60％，较佳为>65％，更佳为>70％，最佳为>75％。根据最终糖浆或粉末中寡糖的总质量除以澄清后培养液中寡糖的总质量以百分比计算产率。
在一个实施例中，寡糖溶液仅包括一种待纯化的寡糖。
在一个实施例中，寡糖溶液包括至少2种不同的寡糖，较佳为至少3种不同的寡糖，更佳为至少4种不同的寡糖，甚至更佳为至少5种不同的寡糖，最佳为至少6种不同的寡糖。
这种包括不同寡糖的寡糖溶液可例如包含5种不同结构的寡糖，例如2'-FL、3-FL、LNT、3'-SL和6'-SL；另一例包括7种不同结构的寡糖，例如2'-FL、3-FL、LNT、LNnT、LNFPI、3'-SL和6'-SL。
在另一较佳的实施例中，寡糖溶液包括至少2种不同的寡糖，这些寡糖的聚合度(degree of polymerization；DP)不同，较佳地所述寡糖溶液包含至少3种不同的寡糖，其聚合度不同，更佳地所述寡糖溶液包含至少4种不同的寡糖，其聚合度不同。寡糖的聚合度是指寡糖结构中存在的单糖单元的数量。如本文所用，寡糖的聚合度为3(DP3)或更高，后者包括4(DP4)、5(DP5)、6(DP6)或更多中的任何一个。如本文所述的寡糖溶液较佳为包含至少三种不同的寡糖，其中溶液中存在的所有寡糖彼此之间的聚合度不同。例如，所述寡糖溶液可以包含三种寡糖，其中第一寡糖是聚合度为3(DP3)的三糖，第二寡糖是聚合度为4(DP4)的丁糖，第三寡糖为聚合度为5(DP5)的戊糖。
在一实施例中，由两种不同聚合度的寡糖组成的寡糖溶液是2′FL和LNT的混合物；2′FL和DiFL的混合物或2′FL和LNFPI的混合物。在一实施例中，包括三种与DP不同之不同寡糖的寡糖混合物是2′FL、DiFL和LNFPI的混合物。
在一实施例中，至少一种细胞产生的寡糖溶液包括四种不同的寡糖或四种以上的寡糖。这种溶液可以包括至少四种不同的寡糖，其中三种寡糖具有不同的聚合度。或者，如本文所述，溶液中所有的所述寡糖可以具有不同的聚合度。
替代地另外，或较佳地，寡糖溶液包括至少一种中性寡糖和至少一种带电寡糖。
根据本发明的一个方面，澄清培养液或发酵液的步骤i)包括澄清、清除、过滤、微滤、离心、倾析和超滤中的一种或多种，较佳地，所述步骤i)还包括使用助滤剂及/或絮凝剂。可替代地，或较佳地，步骤i)包括使用不同的膜将培养液或发酵液进行两次膜过滤步骤。进一步可替代地或较佳地，澄清培养液或发酵液的步骤i)还包括使用过滤剂，较佳为吸附剂，更佳为活性碳。
在本发明的一个方面中，从该澄清的培养或发酵液中去除盐类及/或培养基成分的步骤ii)包括离子交换处理，该离子交换器处理包括用于去除正电材料的阳离子交换处理，所述离子交换处理不包括用于去除负电材料的阴离子离子交换处理。步骤ii)较佳地还包括纳米过滤、透析、电渗析、活性碳或碳的使用、溶剂的使用、醇的使用以及含水酒精混合物的使用、木炭的使用、切向流高效过滤、切向流超滤、亲和层析、阳离子交换、模拟移动床层析(simulated moving bed chromatography)、疏水性相互作用层析、凝胶过滤、配体交换层析、管柱层析、阳离子交换吸附树脂以及阳离子交换树脂的使用中的至少一者或多者。
在另一方面中，浓缩的步骤iii)包括纳米过滤、渗滤(diafiltration)、逆渗透、蒸发、刮膜蒸发(wiped film evaporation)和降膜蒸发(falling film evaporation)中的一者或多者。
在一实施例中，寡糖溶液包括岩藻糖基化寡糖、唾液酸化寡糖、刘易斯型抗原、含有N-乙酰葡萄糖胺的中性寡糖、含有N-乙酰基乳糖胺的寡糖、含有乳糖-N-双糖的寡糖、非岩藻糖基化中性寡糖、壳聚糖、壳聚糖寡糖、肝素原、硫酸软骨素、糖胺聚糖寡糖、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、玻尿酸或透明质酸及/或硫酸角质素中的至少一种者。替代或较佳地，寡糖溶液包含哺乳类乳寡糖，较佳为人类乳寡糖(HMO)。
在一实施例中，该寡糖溶液包括本文定义的中性HMO，较佳为选自包括2′-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、2',3-双岩藻基乳糖、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖基戊糖I、乳糖基-N-新岩藻基戊糖、乳糖基-N-岩藻基戊糖II、乳糖基-N-岩藻基戊糖III、乳糖基-N-岩藻基戊糖V、乳糖基-N-新岩藻基戊糖V、乳糖-N-双岩藻基己糖I、乳糖-N-双岩藻基己糖II、6′-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖，乳糖基-N-己糖及乳糖基-N-新己糖。
在一些实施例中，步骤i)包括经由微滤之澄清的第一步骤。或者，i)包括经由离心之澄清的第一步骤、经由絮凝之澄清的第一步骤或经由超滤之澄清的第一步骤。
在一些实施例中，步骤i)包括超滤。
较佳地，步骤i)中的超滤具有等于或大于1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kda、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa的截留分子量(molecularweight cut off)。可替代或较佳地，步骤i)包括连续的两次超滤，且其中第一次超滤的滤膜截留分子量大于第二次超滤的滤膜截留分子量。
在一较佳的实施例中，步骤步骤ii)包括纳米过滤及/或电渗析。较佳地，所述纳米过滤及/或电渗析进行两次。更佳地，所述纳米过滤及/或电渗析的步骤连续进行。
在一些实施例中，步骤i)中的超滤渗透物在步骤ii)中纳米过滤及/或电渗析。
在一些实施例中，步骤i)为超滤，并且步骤ii)为纳米过滤及/或电渗析的处理结合阳离子交换处理。
在一实施例中，步骤i)为超滤，所述步骤ii)为纳米过滤及/或电渗析的处理结合使用阳离子交换处理，其中在阳离子交换处理之前，先进行超滤，接着进行纳米过滤及/或电渗析。
在一些步骤i)中使用超滤且步骤ii)中使用纳米过滤的实施例中，较佳纳米过滤膜的截留分子量低于步骤i)中超滤膜的截留分子量。
如本文所用，步骤ii)中纳米过滤膜的截留分子量较佳为等于或高于200Da。例如200Da、300Da、400Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da或1000Da。较佳在300与500Da之间及/或600与800之间。
在一实施例中，阳离子交换处理是强酸性阳离子交换处理，较佳为H+形式、K+或Na+形式的强阳离子交换树脂处理。
在一实施例中，将阳离子交换处理的洗脱液的pH值控制在4和7之间，较佳为通过磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸。
在一些实施例中，该过程不包括电渗析。
在一些实施例中，该过程包括电渗析。
在本发明的一个具体实施例中，步骤i)至iii)中的至少一个重复至少一次。
在一实施例中，阳离子交换处理是阳离子交换树脂，较佳为通过一中性固相。
在一实施例中，在至少一个纯化步骤i)或ii)之后；将该寡糖溶液进行渗滤及/或浓缩，较佳为通过纳米过滤膜，更佳为通过尺寸筛除限制小于或等于20A的纳米过滤膜，其中最佳为将该溶液进行渗滤，直至导电率小于或等于15mS/cm、较佳为小于或等于10mS/cm、更佳为小于或等于5mS/cm。
本发明的方法优选提供一种包含所述纯化寡糖溶液具有约8至约75％的白利糖度值(Brix value)，较佳为该纯化寡糖溶液具有约30至约65％的白利糖度值。
在一实施例中，纯化的寡糖溶液含有至少20.0％(w/v)、30.0％(w/v)、35.0％(w/v)、及至多45.0％(w/v)、50.0％(w/v)、60.0％(w/v)的糖量。
在一实施例中，纯化寡糖溶液经过无菌过滤及/或进行内毒素去除，最佳为通过3kDa的过滤器将纯化寡糖溶液进行过滤。
进一步根据本发明的一较佳实施例，步骤i)之前为酶处理。较佳地酶处理包括使用一种或多种的酶温育(incubation)培养或发酵液，所述酶选自包括以下的群组：糖苷酶、乳糖酶、b-半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、麦芽糖酶、淀粉酶、己糖胺酶(hexaminidase)、葡糖醛酸酶、海藻糖酶和转化酶。在一实施例中，酶处理将乳糖及/或蔗糖转化为单糖。
根据一较佳实施例，方法还包括脱色。
在一实施例中，纯化的寡糖溶液具有(以总干燥固体计)小于10％的灰分含量，小于0.1mg/kg、较佳为小于0.05mg/kg、又更佳为低于0.02mg/kg干燥固体的铅含量；小于0.2mg/kg、较佳为小于0.1mg/kg、又更佳为低于0.05mg/kg干燥固体的砷含量；小于0.1mg/kg、较佳为小于0.05mg/kg、又更佳为低于0.02mg/kg干燥固体的镉含量；及/或小于0.5mg/kg、较佳为小于0.2mg/kg、又更佳为低于0.1mg/kg干燥固体的汞含量。
在一实施例中，纯化的寡糖混合物溶液具有小于100mg/kg干燥固体的蛋白质含量、小于10ng/g干燥固体的DNA含量及/或小于10000EU/g干燥固体的内毒素含量。小于100mg/kg干燥固体的蛋白质含量较佳为小于100mg、小于90mg、小于80mg、小于70mg、小于60mg、小于50mg、小于40mg、小于30mg、小于20mg、小于10mg、小于5mg每kg干燥固体。小于10ng/g干燥固体的DNA含量为较佳小于10ng、小于9ng、小于8ng、小于7ng、小于6ng、小于5ng、小于4ng、小于3ng、小于2ng、小于1ng每g干燥固体。小于10000EU/g干燥固体的内毒素含量为较佳为小于7500EU、小于5000EU、小于2500EU、小于1000EU、小于750EU、小于500EU、小于250EU、小于100EU、小于50EU每g干燥固体。
在一实施例中，纯化的寡糖溶液不含DNA、蛋白质及/或重组遗传物质。
本发明的另一方面提供一种方法，其中至少一种细胞是真菌、酵母、细菌、昆虫、动物、植物及原生动物细胞。较佳地，所使用的细胞是微生物的细胞。本发明的另一方面提供一种方法，其中该至少一种微生物是本文所述的真菌、酵母或细菌细胞。至少一种微生物选自包括细菌、酵母或真菌的列表。后一种细菌较佳属于变形菌门(Proteobacteria)或厚壁菌门(Firmicutes)或蓝藻门(Cyanobacteria)或奇异球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)。属于变形菌门的后一种细菌较佳属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，较佳属于大肠杆菌种(Escherichia coli)。后一种细菌较佳涉及属于大肠杆菌种的任何菌株，例如但不限于大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌W、大肠杆菌K12、大肠杆菌Nissle。更具体地说，后一个术语涉及培养的大肠杆菌菌株──命名为大肠杆菌K12菌株，它们非常适应实验室环境，并且与野生型菌株不同，它们已经失去了在肠道中茁壮成长的能力。大肠杆菌K12菌株的众所周知的例子是K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111和AA200。因此，本发明具体涉及如上所述的突变及/或转化的大肠杆菌细胞或菌株，其中该大肠杆菌菌株是K12菌株。更佳地，大肠杆菌K12菌株是大肠杆菌MG1655。
后一种属于厚壁菌门的细菌较佳属于芽孢杆菌(Bacilli)，较佳为乳杆菌目(Lactobacilliales)，其成员例如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)或芽孢杆菌目(Bacillales)，其成员例如来自芽孢杆菌属(genus Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或液化淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。后一种细菌属于放线菌门(Actinobacteria)，较佳属于棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)，其成员例如麸胺酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或非发酵棒杆菌(C.afermentans)，或属于链丝菌科(Streptomycetaceae)，其成员例如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或弗氏链霉菌(S.fradiae)。
后一种酵母较佳属于子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)或半知菌门(Deuteromycota)或接合菌门(Zygomycetes)。后一种酵母较佳属于酵母属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊氏酵母菌属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母菌属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、耶氏酵母属(Yarrowia)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)；较佳地选自包含：酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母菌(Pichia methanolica)、树干毕赤酵母菌(Pichia stipites)、博伊丁假丝酵母菌(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)的群组。
后一种真菌较佳属于根霉菌属(Rhizopus)、网柱黏菌属(Dictyostelium)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)。
在一实施例中，该至少一种微生物是乳糖渗透酶阳性表型(lactose permeasepositive)的大肠杆菌或酵母，其中该乳糖渗透酶分别由基因LacY或LAC12编码。
在一实施例中，将纯化的寡糖溶液进一步浓缩为至少40％为干燥物质的糖浆，将所述纯化的寡糖溶液结晶或将所述纯化的寡糖溶液干燥为粉末。
在一实施例中，步骤iii)包括使用真空蒸发或逆渗透或纳米过滤a)使寡糖浓度>100克/升，较佳为>200克/升，更佳为>300克/升，更佳为>400克/升，更佳为>500克/升，更佳为>600克/升，最佳为在300克/升至650克/升；及/或b)在真空蒸发或逆渗通过程中，温度为<60℃，较佳为<50℃，更佳为20℃至50℃，甚至更佳为30℃至45℃；及/或c)温度为<80℃，较佳为<50℃，更佳为20℃至50℃。
在一实施例中，纯化的寡糖溶液包括一种寡糖，并浓缩至浓度>1.5M，冷却至温度<25℃，更佳为<8℃，以获得寡糖的结晶材料。
在一实施例中，将纯化的寡糖溶液进行干燥。
在一实施例中，干燥步骤包括喷雾干燥、冻干、蒸发、沉淀、喷雾冷冻干燥(sprayfreeze drying)、带式干燥(band drying或belt drying)、真空带式干燥(vacuum banddrying或vacuum belt drying)、滚筒式干燥(drum drying或roller drying)或真空滚筒式干燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)和其他类型的干燥中的任何一种或多种。
在一实施例中，将纯化的寡糖溶液进行喷雾干燥。
在一实施例中，干燥为将所述纯化的寡糖溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥，较佳在溶液的pH值低于5.0的情况下。
在一实施例中，对纯化的溶液进行喷雾干燥，特别是在寡糖溶液浓度为20-60(w/v)，较佳为30-50(w/v)，更佳为35-45(w/v)，喷嘴温度为110-150℃，较佳为120-140℃，更佳为125-135℃及/或出口温度为60-80℃，较佳为65-70℃时进行喷雾干燥。
在一些实施例中，纯化的寡糖溶液在干燥前，例如喷雾干燥或冷冻干燥前具有约8至约75的白利糖百分比(percent Brix)的白利糖度值。在一些实施例中，寡糖混合物的溶液在干燥前具有约30至约65的白利糖百分比的白利糖度值。在一些实施例中，纯化的寡糖溶液在干燥前，较佳为在喷雾干燥前，具50至60的白利糖百分比的白利糖度值。在一些实施例中，寡糖混合物的溶液在干燥前具有约50的白利糖百分比的白利糖度值。
在一些实施例中，对纯化的溶液进行喷雾干燥。在一些实施例中，进料到喷雾干燥器中的纯化的寡糖溶液具有为约8至约75的白利糖度百分比的白利糖度值。在一些实施例中，进料到喷雾干燥器中的纯化的寡糖溶液具有约30至约65的白利糖度百分比的白利糖度值。在一些实施例中，进料到喷雾干燥器中的纯化的寡糖溶液具有约50至约60的白利糖度百分比的白利糖度值。
在一些实施例中，进入喷雾干燥器的进料在喷雾干燥器中被分散成液滴之前的温度约为2至70摄氏度。在一些实施例中，进料至喷雾干燥器的原料在喷雾干燥器中被分散成液滴之前的温度约为30至60摄氏度。在一些实施例中，进料至喷雾干燥器的原料在喷雾干燥器中被分散成液滴之前的温度约为2至30摄氏度的温度。在一些实施例中，喷雾干燥使用进气温度为120至280摄氏度的空气。在一些实施例中，进气温度为120至210摄氏度。在一些实施例中，进气温度约为130至190摄氏度。在一些实施例中，进气温度约为135至160摄氏度。在一些实施例中，喷雾干燥使用进气温度约为80至110摄氏度的空气。在一些实施例中，进气温度约为100至110摄氏度。在一些实施例中，喷雾干燥在约20至约90摄氏度的温度下进行。在一些实施例中，喷雾干燥器是并流喷雾干燥器(co-current spray dryer)。在一些实施例中，喷雾干燥器附接到外部流体床(fluid bed)。在一些实施例中，喷雾干燥器包括转盘、高压喷嘴或双流体喷嘴(two-fluid nozzle)。在一些实施例中，喷雾干燥器包括雾化轮(atomizer wheel)。在一些实施例中，喷雾干燥是纯化的寡糖溶液的最终纯化步骤。
在一实施例中，纯化后的寡糖溶液的最终纯化步骤是冻干。
在一实施例中，纯化的寡糖溶液的最终纯化步骤是浓缩成糖浆。
另一个方面提供了根据本文所述方法得到的纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物。
一实施例提供了用本文所述方法生产的寡糖，其中寡糖溶液最好是喷雾干燥、冻干或结晶的。
一实施例提供了一种可通过本文所述方法生产的寡糖混合物，其中寡糖溶液较佳为经喷雾干燥、冻干或浓缩成至少40％为干燥物质的糖浆。
一实施例提供了一种通过培养或发酵产生的寡糖溶液，其中该寡糖溶液不由阴离子交换来进行纯化，且所述寡糖溶液的灰分含量小于10％。
一实施例提供了一种通过培养或发酵产生的喷雾干燥的寡糖或寡糖混合物，其中该寡糖或寡糖混合物不由阴离子交换来进行纯化，并且所述喷雾干燥的寡糖或寡糖混合物含有低于10％的灰分含量。
在一实施例中，干燥的粉末含水量低。
测量材料含水量的技术为本领域所习知的。例子包括费歇尔滴定法(Karl-Fischer titration)，其中由样品吸收的卡耳费雪溶液的量指示出样品中的水量，以及重量法，其中将样品进行干燥并每隔一段时间测量由溶剂蒸发所造成的重量损失。
一实施例提供了根据实施例56至60的任何一个方法得到的干燥的粉末，其中干燥粉末具有≤15％-wt.的水，较佳为≤10％-wt.的水，更佳为≤7％-wt.的水，最佳为≤5％-wt.的水。在另外及/或替代的实施例中，干燥粉末不具有基因改造微生物且不具有源自基因改造微生物的核酸分子。
在一特定的实施例中，本发明提供一种喷雾干燥至粉末的生产的纯化寡糖溶液，其中喷雾干燥的粉末具有≤15％-wt.的水，较佳为≤10％-wt.的水，更佳为≤7％-wt.的水，最佳为≤5％-wt.的水。在一些实施例中，操作喷雾干燥器以达到约3.0至5.0％-wt.的水的含水量。在一些实施例中，纯化寡糖溶液的粉末具有低于5.0％-wt.的水的含水量。在一些实施例中，纯化寡糖溶液的粉末具有低于(以重量计)2.3％的水的含水量。
本说明书提供了可根据本文所述过程获得的喷雾干燥粉末，其中粉末通过激光衍射测定具有50至250μm的平均粒径，较佳粉末过激光衍射测定具有95至120μm的平均粒径，更佳粉末具有110至120μm的平均粒径。此类粒径取决于干燥机的规格、配置、性能和设计。可用的商用干燥机包括Büchi迷你喷雾干燥机、Procept喷雾干燥机、Gea喷雾干燥机，可选配旋转雾化器、双流体喷嘴、压力喷嘴、组合喷嘴，可选开放式设计、多级干燥设计，闭合循环设计。使用Buchi喷雾干燥器(Buchi Mini Spray Dryer B-290)(Büchi，Essen，Germany)，应用以下参数获得上述粒径：入口温度：130℃，出口温度67℃-71℃，气流670L/h，抽气器(aspirator)100％。
本说明书提供了可根据本文所述过程获得的喷雾干燥粉末，其中干燥粉末具有约500至700g/L的松散体积密度，约600至约850g/L的100x振实体积密度，约600至约900g/L的625x振实体积密度，及/或约650至约900g/L的1250x振实体积密度。
在一些实施例中，干燥粉末具有约600至700g/L的松散体积密度。在一些实施例中，干燥粉末具有约500至600g/L的松散体积密度。
在一些实施例中，干燥粉末具有约750至约850g/L的100x振实体积密度。在一些实施例中，干燥粉末具有约600至约700g/L的100x振实体积密度。
在一些实施例中，干燥粉具有约750至约900g/L的625x振实体积密度。在一些实施例中，干燥粉具有约700至约800g/L的625x振实体积密度。
在一些实施例中，干燥粉具有约850至约900g/L的1250x振实体积密度。在一些实施例中，干燥粉具有约750至约800g/L的1250x振实体积密度。
在一些实施例中，干燥粉具有约600至700g/L的松散体积密度，约750至约850g/L的100x振实体积密度，约750至约850g/L的625x振实体积密度，及/或约850至约900g/L的1250x振实体积密度。在一些实施例中，干燥粉具有约500至600g/L的松散体积密度，约600至约700g/L的100x振实体积密度，约700至约800g/L的625x振实体积密度，及/或约750至约800g/L的1250x振实体积密度。
在一实施例中，当干燥的寡糖溶液以10％的浓度(质量/体积)重新溶于水中时，提供的溶液的pH值在4至7之间，较佳为pH值在4至6之间。
一实施例提供了如本文所述和如本文生产的寡糖，其中该寡糖是哺乳类乳寡糖，较佳为人类乳寡糖(HMO)。一实施例提供了如本文所述的寡糖混合物，其中该混合物包括哺乳类乳寡糖，较佳为人类乳寡糖(HMO)。
一个实施方案提供了如本文所述的和如本文生产的母乳寡糖(HMO)，其中HMO是一种中性HMO，选自包括2′-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2′,3-双岩藻糖基乳糖、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖戊糖I、乳糖基-N-新岩藻糖戊糖、乳糖基-N-岩藻糖戊糖II、乳糖基-N-岩藻糖戊糖III、乳糖基-N-岩藻糖戊糖V、乳糖基-N-新岩藻糖戊糖V、乳糖基-N-二岩藻己糖I、乳糖基-N-二岩藻己糖II、6'-半乳糖、3'-半乳糖、乳糖基-N-己糖和乳糖基-N-新己糖。
一实施例提供了如本文所述的寡糖或寡糖混合物，其中该寡糖或寡糖混合物a)在300克/升的溶液中具有小于1mS/cm的导电率；b)不含重组DNA材料，可视需要地不含任何DNA；及/或c)不含来自重组微生物的蛋白质，可视需要地不含任何蛋白质。
一实施例提供了本文所述的寡糖或寡糖混合物用于医学，较佳为用于预防或治疗胃肠道疾病。
寡糖混合体的组合物
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL及LDFT，其中2'FL对2'FL、3FL和LDFT质量总和的相对百分比介于65％和79％之间，3FL对2′FL、3FL和LDFT质量总和的相对百分比介于17％和21％，LDFT对2′FL、3FL和LDFT质量总和的相对百分比介于9％和10％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL及LDFT，其中2'FL对2'FL、3FL和LDFT质量总和的相对百分比介于10％和12％之间，3FL对2'FL、3FL和LDFT质量总和的相对百分比介于79％和96％，LDFT对2′FL、3FL和LDFT质量总和的相对百分比介于1％和2％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL、LDFT、3’SL及6’SL，其中2'FL对2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL的质量总和的相对百分比介于53％到64％之间，3FL对2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6'SL的质量总和的相对百分比介于14％和17％之间，LDFT对2'FL、3FL、LDFT、3'SL和6′SL质量总和的相对百分比为介于7％和8％之间，3′SL对2′FL、3FL、LDFT、3′SL和6′SL的质量总和的相对百分比介于5％和6％之间，并且6′SL对2′FL、3FL、LDFT、3′SL和6′SL的质量总和的相对百分比介于12％和15％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含LNT、LNnT、3’SL及6’SL，其中LNT对LNT、LNnT、3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于48％到59％之间，LNnT对LNT、LNnT、3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于13％和16％之间，3’SL对LNT、LNnT、3’SL及6’SL质量总和的相对百分比为介于8％和10％之间，且6’SL对LNT、LNnT、3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于20％和25％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含3’SL及6’SL，其中3’SL对3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于26％到32％之间，6’SL对3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于64％和78％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含3’SL及6’SL，其中6’SL对3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于26％到32％之间，3’SL对3’SL及6’SL的质量总和的相对百分比介于64％和78％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V，其中2’FL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于38％到46％之间，3FL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于10％和12％之间，LDFT对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于5％和6％之间，LNFP I对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于21％和25％之间，LNFPII对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于10％和13％之间，LNFP III对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于5％和6％之间，且LNFP V对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFPIII及LNFP V的质量总和的相对百分比介于1％和2％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V，其中2’FL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于6％到8％之间，3FL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于51％和63％之间，LDFT对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于0.5％到2％之间，LNFP I对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于3％和5％之间，LNFP II对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于17％和21％之间，LNFP III对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于8％和10％之间，且LNFP V对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III及LNFP V的质量总和的相对百分比介于2％和3％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含LSTa、LSTb及LSTc，其中LSTa对LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于15％到18％之间，LSTb对LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于13％到16％之间，且LSTc对LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于62％到75％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc，其中3’SL对3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于14％到17％之间，6’SL对3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于35％到43％之间，LSTa对3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于7％到9％之间，LSTb对3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于6％到8％之间，且LSTc对3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于28％到34％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFPV、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc，其中2’FL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于20％到30％之间，3FL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于5％到10％之间，LDFT对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFPIII、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于3％到6％之间，3’SL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于2％到4％之间，6’SL对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFPIII、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于5％到10％之间，LNT对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于11％到20％之间，LNnT对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于2％到4％之间，LNFP I对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于12％到20％之间，LNFP II对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于5％到10％之间，LNFP III对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于3％到6％之间，LNFP V对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于0.5％到2％之间，LSTa对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于0.5％到2％之间，LSTb对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP V、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于0.5％到2％之间，LSTc对2’FL、3FL、LDFT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFPV、3’SL、6’SL、LSTa、LSTb及LSTc的质量总和的相对百分比介于4％到8％之间，
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT，其中2’FL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于37％到46％之间，3FL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于10％到12％之间，LDFT对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于4％到8％之间，3’SL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于2％到5％之间，6’SL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于8％到10％之间，LNT对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于20％到25％之间，且LNnT对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于5％到10％之间。
在一实施例中，寡糖混合物包含2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT，其中2’FL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于3％到6％之间，3FL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于35％到46％之间，LDFT对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于0.5％到2％之间，3’SL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于2％到5％之间，6’SL对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于8％到15％之间，LNT对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于25％到31％之间，且LNnT对2’FL、3FL、LDFT、3’SL、6’SL、LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于5％到10％之间。
寡糖混合物包含LNT及LNnT，其中LNT对LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于70％到90％之间，且LNnT对LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于10％到30％之间。
寡糖混合物包含LNT及LNnT，其中LNT对LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于10％到30％之间，且LNnT对LNT及LNnT的质量总和的相对百分比介于70％到90％之间
包括寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物的产品
在一些实施例中，通过本说明书的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物被掺入营养配方(如食品、饮料或饲料)、食品补充剂、膳食补充剂、消化健康功能食品或其他消费品(consumable products)中，供婴儿、儿童、成人或老年人使用。其他应用包括通过本说明书的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物并入药物成分、化妆品成分或药物中。在一些实施例中，寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物与一种或多种适用于食品、饲料、膳食补充剂、药物成分、化妆品成分或药物的成分混合。
在一些实施例中，膳食补充剂包含至少一种益生元(prebiotic)成分及/或至少一种益生菌(probiotic)成分。
「益生元(prebiotic)」是一种促进有益于宿主的微生物生长，特别是胃肠道微生物生长的物质。在一些实施例中，膳食补充剂提供多种益生元，包括通过本说明书中公开的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物，以促进一种或多种有益微生物的生长。用于膳食补充剂的益生元成分的例子包括其他益生元分子(如HMOs)和植物多糖(如菊糖、果胶、b-葡聚糖和木质寡糖)。「益生菌」产品通常含有活的微生物，它们替代或添加到胃肠道微生物群中，以造福接受者。此类微生物的实例包括乳杆菌种(Lactobacillus species)(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus))、双歧杆菌种(Bifidobacterium species)(例如动物双歧杆菌(B.animalis)(例如BB12)、长双歧杆菌(B.longum)和婴儿双歧杆菌(B.infantis)(例如Bi-26、Bi-07、Bb-02、EVC001-ActiBif))、链球菌(Streptococcis species)(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(例如TH-4)和布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii))。在一些实施例中，通过本说明书的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物与此类微生物组合口服施用。
膳食补充剂的其他成分的例子包括双糖(如乳糖)、单糖(如葡萄糖和半乳糖)、增稠剂(如阿拉伯胶)、酸度调节剂(如柠檬酸三钠、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸(tartric acid)、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸或其盐)、水、脱脂牛奶和调味剂。
在一些实施例中，将寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物掺入人类婴儿食品(例如婴儿配方(infant formula))中。婴儿配方通常是一种用于喂养婴儿的人造食品，作为人类母乳的完全或部分替代品。在一些实施例中，婴儿配方以粉末出售并通过与水混合制备用于给婴儿用奶瓶或杯子喂养。婴儿配方的组成通常是模仿人类母乳所设计。在一些实施例中，通过本说明书中的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物被包含在婴儿配方中以提供与人类母乳中的寡糖相似的营养价值。在一些实施例中，寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物与婴儿配方的一种或多种成分混合。婴儿配方成分的示例包括脱脂牛奶、碳水化合物来源(例如乳糖)、蛋白质来源(例如乳清蛋白浓缩物和酪蛋白)、脂肪来源(例如植物油──例如棕榈油、高油酸红花籽油、菜籽油、椰子油及/或葵花籽油；和鱼油)、维生素(例如维生素A、Bb、Bi2、C和D)、矿物质(例如柠檬酸钾、柠檬酸钙、氯化镁、氯化钠、柠檬酸钠和磷酸钙)和可能HMOs。此类HMOs可包括，例如，DiFL、乳糖基-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳糖基-N-岩藻戊糖I、乳糖基-N-新岩藻戊糖、乳糖基-N-岩藻戊糖II、乳糖基-N-岩藻戊糖III、乳糖基-N-岩藻戊糖V、乳糖基-N-新岩藻戊糖V、乳糖基-N-二岩藻糖己糖I、乳糖基-N-二岩藻糖己糖II、6′-半乳糖基乳糖、3′-半乳糖基乳糖、乳糖基-N-己糖和乳糖基-N-新己糖。
在一些实施例中，一种或多种婴儿配方成分包括脱脂牛奶、碳水化合物来源、蛋白质来源、脂肪来源及/或维生素和矿物质。
在一些实施例中，一种或多种婴儿配方成分包含乳糖、乳清蛋白浓缩物及/或高油酸红花籽油。
在一些实施例中，婴儿配方中寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物的浓度与人类母乳中通常存在的寡糖的浓度大致相同。在一些实施例中，婴儿配方的寡糖混合物中的每种单一寡糖的浓度与通常存在于人类母乳中的此寡糖的浓度大致相同。
在一些实施例中，将寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物掺入饲料调制中，其中该饲料选自包括宠物食品、动物代乳品、兽医产品、断奶后饲料(post weaning feed)或教槽饲料(creep feed)的列表。
通过本说明书的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物可以加入药学上可接受的载体，例如常规的添加剂、佐剂、赋形剂和稀释剂(水、明胶、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物胶、植物油、聚亚烷基二醇(polyalkylene glycols)、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、填充剂、润湿剂等)。合适的载体在Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本中有所描述，这是该领域的标准参考文本。当将通过本说明书方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物加入药学上可接受的载体中时，剂型可以制成例如但不限于片剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、浸剂(infusions)、胶囊剂、注射剂、液体剂、酏剂(elixirs)、提取物和酊剂(tincture)。对于上述配方，如果需要，也可以进一步添加益生菌，例如乳酸菌(lacto bacteria)、双歧杆菌种、益生元例如果寡糖和半乳寡糖、来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂牛奶的蛋白质、碳水化合物如乳糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉或其混合物、脂类(如软质棕榈油(palm olein)、葵花籽油、红花籽油)以及日常饮食中必不可少的维生素和矿物质。
包含通过本说明书的方法纯化的寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物的药物组合物可以通过本领域已知的任何常用方式制造，例如Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本中对此进行了描述，其为该领域的标准参考文本。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与所属技术领域具有通常知识者普遍理解的相同含义。一般来说，本文使用的术语以及上文和下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学及杂交的实验室程序是本领域众所周知和普遍采用的。标准技术用于核酸和肽的合成。一般来说，纯化步骤是根据制造商的规格进行的。
进一步的优势来自于具体的实施例。毫无疑问地，上述特征和仍将在下文中解释的特征不仅可以在分别指定的组合中使用，而且可以在其他组合中使用、或单独使用，而不偏离本发明的范围。
本发明涉及以下具体实施例：
1.一种以批次方式或连续方式从细胞培养或微生物发酵获得的培养或发酵液中纯化寡糖溶液之方法，该培养或发酵液还包括生物量、培养基成分及污染物，其中该培养或发酵液中的寡糖溶液的纯度较佳地占总干燥固体的<80％，并且该培养或发酵液应用于以下纯化步骤：
i)澄清该培养或发酵液。
ii)从该澄清的培养或发酵液中去除盐及/或培养基成分，以及
iii)较佳为浓缩该寡糖溶液，
其中，提供占总干燥固体≥80％的纯度的纯化寡糖溶液，
其特征在于，从该澄清的培养液或发酵液中去除盐分及/或培养基成分的步骤ii)包括由用于去除正电材料的阳离子交换处理所组成之一离子交换处理，并且不包括用于去除负电材料的阴离子交换处理。
2.如实施例1所述的方法，其中步骤iii)在步骤ii)之前进行。
3.如实施例1或2中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液具有占总干燥固体≤10％的灰分含量，较佳为占总干燥固体的≤9％、更佳为占总干燥固体的≤8％、更佳为占总干燥固体的≤7％、更佳为占总干燥固体的≤6％、更佳为占总干燥固体的≤5％、更佳为占总干燥固体的≤4％、更佳为占总干燥固体的≤3％、更佳为占总干燥固体的≤2％、更佳为占总干燥固体的≤1％、更佳为占总干燥固体的≤0.5％。
4.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液从由细胞培养获得的培养或发酵液中纯化，该细胞培养使用至少一种细胞，较佳为在化学限定培养基中生长的重组细胞，其中在步骤i)中分离的生物量可视需要地回收至该培养中。
5.如实施例1至4中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液从由微生物发酵获得的发酵液中纯化，该微生物发酵使用至少一种微生物，较佳为细菌或酵母，更佳为在化学限定培养基中生长的重组微生物，其中在步骤i)中分离的生物量可视需要地回收至该微生物发酵中。
6.如实施例1至5中任一项所述的方法，其中该细胞培养使用重组细胞，并包括至少一种细胞，其经基因改造以产生寡糖，较佳为该至少一种细胞已被基因改造以产生至少两种不同寡糖。
7.如实施例1至6中任一项所述的方法，其中该细胞培养为使用重组微生物的微生物发酵，并包括至少一种微生物，其经基因改造以产生寡糖，较佳为该至少一种微生物已被经基因改造以产生至少两种不同寡糖。
8.如实施例1至7中任一项所述的方法，其中该培养或发酵液中的该寡糖溶液是由使用至少一种基因改造细胞之细胞培养或微生物发酵获得的，该至少一种基因改造细胞能够产生该寡糖溶液，较佳为从内化的碳水化合物前体。
9.如实施例1至8所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵在具有碳源的基础盐培养基中培养，该至少一种细胞或微生物在其上生长。
10.如实施例9所述的方法，其中该基础盐培养基含有硫酸盐、磷酸盐、氯化物、铵、钙离子、镁离子、钠、钾离子、铁离子、铜离子、锌离子、锰离子、钴离子及/或硒离子。
11.如实施例9或10中任一项所述的方法，其中该碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、玉米浸液、乳糖、半乳糖、高果糖浆、淀粉、纤维素、半纤维素、麦芽寡糖、海藻糖、甘油、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和丙酮酸盐中的一种或多种。
12.如实施例1至11中任一项所述的方法，其中纯化前在该培养或发酵液中的该寡糖溶液的纯度为占总干燥固体的<70％、<60％、<50％、<40％、<30％、<20％、<10％，及/或纯化后的该寡糖溶液的纯度为占总干燥固体的>80％、较佳为>85％、更佳为>90％、更佳为>95％、最佳为>97％。
13.如实施例1至12中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液的纯化产率为＞60％，较佳为＞65％，更佳为＞70％，最佳为＞75％。
14.如实施例1至13中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少2种不同的寡糖，较佳为至少3种不同的寡糖，更佳为至少4种不同的寡糖，甚至更佳为至少5种不同的寡糖，最佳为至少6种不同的寡糖。
15.如实施例14所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少2种聚合度不同的不同寡糖，较佳为该寡糖溶液包括至少3种聚合度不同的不同寡糖，更佳为该寡糖溶液包括至少4种聚合度不同的不同寡糖。
16.如实施例14或15中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少一种中性寡糖和至少一种带电寡糖。
17.如实施例1至16中任一项所述的方法，其中澄清该培养或发酵液的该步骤i)包含澄清、清除、过滤、微滤、离心、倾析和超滤中的一种或多种，较佳地，该步骤i)还包含使用助滤剂及/或絮凝剂；较佳地，该助滤剂是吸附剂，更佳为活性碳。
18.如实施例1至17中任一项所述的方法，其中该步骤ii)从澄清的培养或发酵液中去除盐及/或培养基成分，还包含纳米过滤、透析、电渗析、使用活性碳或碳、使用溶剂、使用醇类和水醇混合物、使用木碳、切向流高效能过滤(tangential flow high-performancefiltration)、切向流超滤(tangential flow ultrafiltration)、亲和性层析、阳离子交换、模拟移动床层析(simulated moving bed chromatography)、疏水性相互作用层析、凝胶过滤、配体交换层析、管柱层析、阳离子交换吸附树脂，以及使用阳离子交换树脂。
19.如实施例1至18中任一项所述的方法，其中该步骤iii)浓缩包括纳米过滤、渗滤、逆渗透、蒸发、刮膜膜蒸发(wiped film evaporation)和降膜蒸发(falling filmevaporation)中的一种或多种。
20.如实施例1至19中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少一种寡糖，该寡糖选自包括岩藻糖基化寡糖、唾液酸化寡糖、路易斯抗原、含N-乙酰葡萄糖胺的中性寡糖、含N-乙酰乳糖胺的寡糖、含乳糖基-N-双糖的寡糖、非岩藻糖基化中性寡糖、几丁聚糖、几丁寡糖、肝素原(heparosan)、硫酸软骨素、糖胺聚糖寡糖、肝素(heparin)、硫酸肝素、硫酸皮肤素、玻尿酸或玻糖醛酸及/或硫酸角质素的列表。
21.如实施例1至20中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括哺乳类乳寡糖(mammalian milk oligosaccharide；MMO)，最佳为人类乳寡糖(human milkoligosaccharide；HMO)。
22.如实施例1至21中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括中性HMO，较佳为选自由2'-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、2′,3-双岩藻基乳糖、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖基戊糖I、乳糖基-N-新岩藻基戊糖、乳糖基-N-岩藻基戊糖II、乳糖基-N-岩藻基戊糖III、乳糖基-N-岩藻基戊糖V、乳糖基-N-新岩藻基戊糖V、乳糖-N-双岩藻基己糖I、乳糖-N-双岩藻基己糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖，乳糖基-N-己糖及乳糖基-N-新己糖所组成之群组。
23.如实施例1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含由微滤进行澄清的第一步骤。
24.如实施例1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含由离心进行澄清的第一步骤。
25.如实施例1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含由絮凝进行澄清的第一步骤。
26.如实施例1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含由超滤进行澄清的第一步骤。
27.如实施例1至26中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含超滤。
28.如实施例26或27中任一项所述的方法，其中在该步骤i)中，该超滤的截留分子量等于或高于1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kda、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa。
29.如实施例1至28中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含两次连续的超滤，且其中第一次超滤膜的截留分子量高于第二次超滤膜的截留分子量。
30.如实施例1至29中任一项所述的方法，其中该步骤ii)包含纳米过滤及/或电渗析。
31.如实施例30所述的方法，其中纳米过滤及/或电渗析进行两次。
32.如实施例31所述的方法，其中纳米过滤及/或电渗析步骤连续进行。
33.如实施例26至32中任一项所述的方法，其中该步骤i)的超滤渗透物在该步骤ii)中进行纳米过滤及/或电渗析。
34.如实施例1至22、26至33中任一项所述的方法，其中该步骤i)为超滤，该步骤ii)为纳米过滤及/或电渗析处理与阳离子交换处理相结合。
35.如实施例34所述的方法，其中阳离子交换处理之前为超滤，之后为纳米过滤及/或电渗析。
36.如实施例30至35中任一项所述的方法，其中该步骤ii)中该纳米过滤膜的截留分子量低于该步骤i)中该超滤纳米过滤膜的截留分子量。
37.如实施例1至36中任一项所述的方法，其中阳离子交换处理是强酸性阳离子交换处理，较佳为H+形式、K+或Na+形式的强阳离子交换树脂处理。
38.如实施例1至37中任一项所述的方法，其中将阳离子交换处理的洗脱液的pH值控制在4和7之间，较佳为通过磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸之方式。
39.如实施例1至38中任一项所述的方法，不包括电渗析。
40.如实施例1至38中任一项所述的方法，其中该步骤ii)包含电渗析。
41.如实施例1至40中任一项所述的方法，其中该纯化步骤i)至iii)中的至少一个在该方法期间重复至少一次。
42.如请求项1至41中任一项所述的方法，其中在至少一个纯化步骤i)或ii)之后；将该寡糖溶液进行渗滤及/或浓缩，较佳为通过纳米过滤膜，更佳为通过尺寸筛除限制小于或等于20A的纳米过滤膜，其中最佳为将该溶液进行渗滤，直至达成导电率小于或等于15mS/cm、较佳为小于或等于10mS/cm、更佳为小于或等于5mS/cm。
43.如实施例1至42中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液具有约8至约75％的白利糖度值(Brix value)，较佳为该纯化寡糖溶液具有约30至约65％的白利糖度值。
44.如实施例1至43中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液经过无菌过滤及/或进行内毒素去除，最佳为通过3kDa的过滤器将纯化寡糖溶液进行过滤。
45.如实施例1至44中任一项所述的方法，其中步骤i)之前进行酶处理。
46.如实施例45所述的方法，其中该酶处理包括通过一或多种选自由糖苷酶、乳糖酶、b-半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、麦芽糖酶、淀粉酶、己糖胺酶、葡萄糖醛酸酶、海藻糖酶和转化酶所组成之群组的酶将培养液进行培养。
47.如实施例45或46中任一项所述的方法，其中该酶处理将乳糖及/或蔗糖转化为单糖。
48.如实施例1至47中任一项所述的方法，其中该方法还包括脱色。
49.如实施例1至48中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液的灰分含量低于10％(以总干燥固体计)，较佳为铅含量低于0.1mg/kg的干燥固体，砷含量低于0.2mg/kg的干燥固体，镉含量低于0.1mg/kg的干燥固体及/或汞含量低于0.5mg/kg的干燥固体。
50.如实施例1至49中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液具有低于100mg/kg干燥固体的蛋白质含量、低于10ng/g干燥固体的DNA含量及/或低于10000EU/g干燥固体的内毒素含量，较佳地，纯化寡糖溶液不含DNA、蛋白质及/或重组遗传物质。
51.如请求项1至50中任一项所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵包括至少一种细胞，其中该至少一种细胞是细菌、真菌、酵母、植物、动物或原生动物细胞的细胞，该细胞较佳为微生物的细胞，其中该微生物是细菌，较佳为大肠杆菌菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳地该大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655。
52.如实施例1至50中任一项所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵包括至少一种细胞，其中该至少一种细胞是酵母细胞。
53.如实施例52所述的方法，其中该酵母选自由酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊氏酵母菌属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母菌属(Pichia)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、许旺氏酵母菌属(Schwanniomyces)、有圆孢酵母菌属(Torulaspora)、耶氏酵母菌属(Yarrowia)和接合酵母菌属(Zygosaccharomyces)所组成的群组；较佳为选自由酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊氏酵母菌(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母菌(Pichia methanolica)、树干毕赤酵母菌(Pichia stipites)、博氏念珠菌(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)、戴尔孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)及拜耳接合酵母菌(Zygosaccharomyces bailii)所组成的群组。
54.如实施例1至53中任一项所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵包括至少一种细胞，其中该至少一种细胞是微生物的该细胞，其中该微生物是乳糖渗透酶阳性表型的大肠杆菌或酵母，其中该乳糖渗透酶分别由基因LacY或LAC12编码。
55.如实施例1至54中任一项所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进一步浓缩成至少40％为干燥物质的糖浆，将该纯化寡糖溶液结晶或将该纯化寡糖溶液进行干燥成粉末。
56.如实施例1至55中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括使用真空蒸发或逆渗透或纳米过滤a)使寡糖浓度>100g/L，较佳为>200g/L，更佳为>300g/L，更佳为>400g/L，更佳为>500g/L，更佳为>600g/L，最佳为300g/L至650g/L之间；及/或b)在真空蒸发或逆渗透的过程中，温度为<60℃，较佳为<50℃，更佳为20℃至50℃之间，甚至更佳为30℃至45℃之间；及/或c)温度为<80℃，较佳为<50℃，更佳为20℃至50℃之间。
57.如实施例1至55中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液包括一种寡糖并浓缩至>1.5M的浓度且冷却至<25℃，更佳为<8℃的温度，以获得该寡糖的结晶材料。
58.如实施例1至55中任一项所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进行干燥。
59.如实施例58所述的方法，其中该干燥步骤包括喷雾干燥、冷冻干燥(lyophilization)、蒸发、沉淀、喷雾冷冻干燥(spray freeze drying)、冷冻喷雾干燥、带式干燥(band drying或belt drying)、真空带式干燥(vacuum band drying或vacuum beltdrying)、滚筒式干燥(drum drying或roller drying)、真空滚筒式干燥(vacuum drumdrying或vacuum roller drying)及其他干燥方式中的一或多种。
60.如实施例59所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进行喷雾干燥。
61.如实施例59所述的方法，其中该干燥步骤为将该纯化寡糖溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥并且较佳地其中溶液的pH为低于5.0。
62.如实施例58-61中任一项所述的方法，其特征在于将该纯化溶液喷雾干燥，特别是在20-60(w/v)、较佳为30-50(w/v)、更佳为35-45(w/v)的寡糖溶液浓度下，以及在110-150℃、较佳为120-140℃、更佳为125-135℃的喷嘴温度及/或60-80℃、较佳为65-70℃的出口温度进行喷雾干燥。
63.如实施例1至62中任一项所述的方法获得的纯化寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物。
64.通过如实施例1至62中任一项所述的方法所生产的寡糖，其中将该寡糖溶液较佳为进行喷雾干燥、冻干或结晶。
65.通过如实施例1至62中任一项所述的方法所生产的寡糖混合物，其中将该寡糖溶液较佳为进行喷雾干燥、冻干或浓缩成至少40％为干燥物质的糖浆。
66.一种寡糖溶液，其系通过培养或发酵所产生的，其中将该寡糖溶液在没有阴离子交换的情况下进行纯化，并且其中该寡糖溶液含有少于10％的灰分。
67.一种喷雾干燥的寡糖或寡糖混合物，其是通过培养或发酵所产生的，其中将该寡糖或寡糖混合物在没有阴离子交换的情况下进行纯化，并且其中该喷雾干燥的寡糖或寡糖混合物含有少于10％的灰分。
68.一种干燥粉末，其是利用如实施例58至62中任一项所述的方法获得，其中该干燥粉末含有≤15重量％的水、较佳为≤10重量％的水、更佳为≤7重量％的水、最佳为≤5重量％的水。
69.如实施例58-62中任一项所述的方法获得的一种喷雾干燥粉末，其中该喷雾干燥粉末的平均粒径为50-250μm，由激光衍射测定；较佳为粉末具有95至120μm的平均粒径，更佳为粉末具有110至120μm的平均粒径。
70.如实施例58至62中任一项所述的方法获得的干燥粉末，其中该干燥粉末展现出：
约500至700g/L的松散体积密度(loose bulk density)，
约600至约850g/L的100倍振实体积密度(tapped bulk density)，
约600至约900g/L的一625x振实体积密度，及/或
约650至约900g/L的1250x振实体积密度。
71.如实施例70中所述的方法获得的干燥粉末，其中该干燥粉末展现出：
约600至700g/L的松散体积密度，
约750至约850g/L的100倍振实体积密度
约750至约850g/L的625x振实体积密度，及/或
约850至约900g/L的1250x振实体积密度。
72.如实施例70中所述的方法获得的干燥粉末，其中该干燥粉末展现出：
约500至600g/L的松散体积密度，
约600至约700g/L的100倍振实体积密度
约700至约800g/L的625x振实体积密度，及/或
约750至约800g/L的1250x振实体积密度。
73.如实施例64、65、67至72中任一项所述的干燥粉末，其中当该干燥粉末以10％(体积质量)的浓度重新溶解在水中时提供具有4至7之间的pH值、较佳为具有4至6之间的pH值的溶液。
74.如实施例63、64或67至73中任一项所述的寡糖，其中该寡糖是哺乳类乳寡糖，较佳为乳寡糖(human milk oligosaccharide；HMO)。
75.如实施例64、65或67至73中任一项所述的寡糖混合物，其中该寡糖混合物包含哺乳类乳寡糖，较佳为人类乳寡糖(human milk oligosaccharide；HMO)。
76.如实施例74或75中任一项所述的HMO，其中该乳寡糖为中性HMO，较佳为选自由2′-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、2′,3-双岩藻基乳糖、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖基戊糖I、乳糖基-N-新岩藻基戊糖、乳糖基-N-岩藻基戊糖II、乳糖基-N-岩藻基戊糖III、乳糖基-N-岩藻基戊糖V、乳糖基-N-新岩藻基戊糖V、乳糖-N-双岩藻基己糖I、乳糖-N-双岩藻基己糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖，乳糖基-N-己糖及乳糖基-N-新己糖所组成之群组。
77.如实施例63至70中任一项所述的寡糖或寡糖混合物，其中该寡糖或寡糖混合物a)在300g/l溶液中具有小于1mS/cm的导电率；b)不含重组DNA材料，可视需要不含任何DNA；及/或c)不含源自重组微生物的蛋白质，可视需要不含任何蛋白质。
78.如实施例63至77中任一项所述的寡糖或寡糖混合物在医药的用途，最佳为用于预防或治疗胃肠道疾病。
79.如实施例1至62中任一项所述的方法获得的纯化寡糖在食品或饲料制备、膳食补充品、化妆品成分或药物成分中的用途。
80.如实施例63至77中任一项所述的纯化寡糖溶液在食品或饲料制备、膳食补充品、化妆品成分或药物成分中的用途。
81.如实施例79或80中任一项所述的用途，其中该食品是人类食品，较佳为婴儿食品及/或婴儿配方或婴儿补充品。
82.如实施例74至76中任一项所述的HMO作为食品添加剂的用途，较佳为作为人类食品及/或宠物食品的添加剂，更佳为作为人类婴儿食品的添加剂。
83.如实施例79或80中任一项所述的用途，其中该饲料是宠物食品、动物代乳品、兽医用产品、断奶后饲料或教槽饲料。
将在实施例中更详细地描述本发明
实施例
实施例1.材料与方法
培养基与培养
Luria Broth(LB)培养基由1％胰蛋白胨(tryptone peptone)(Difco,Erembodegem,Belgium)、0.5％酵母萃取物(Difco)和0.5％氯化钠(VWR.Leuven,Belgium)组成。用于96孔板或摇瓶的培养实验的基本培养基含有2.00g/L NH4Cl、5.00g/L(NH4)2SO4、2.993g/L KH2PO4、7.315g/L K2HPO4、8.372g/L MOPS、0.5g/L NaCl、0.5g/LMgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1ml/L维生素溶液、100μl/L钼酸盐溶液以及1mL/L硒溶液。如相应例示中所述，将0.30g/L唾液酸、20g/L乳糖、20g/L LacNAc、20g/L LNnT、20g/LLNT及/或20g/L LNB作为前体额外添加到培养基中。使用1M KOH将基本培养基的pH值设置为7。维生素溶液由3.6g/L FeCl2.4H2O、5g/L CaCl2.2H2O、1.3g/L MnCl2.2H2O、0.38g/LCuCl2.2H2O、0.5g/L CoCl2.6H2O、0.94g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/LNa2EDTA.2H2O以及1.01g/L盐酸硫胺明(Thiamine HCl)组成。钼酸盐溶液包含0.967g/LNaMoO4.2H2O。硒溶液包含42g/L SeO2。
发酵用的基本培养基包含6.75g/L NH4Cl、1.25g/L(NH4)2SO4、2.93g/L KH2PO4及7.31g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1mL/L维生素溶液、100μL/L钼酸盐溶及具有与上述相同的组成的1mL/L硒溶液。如相应例示中所述，将0.30g/L唾液酸、20g/L乳糖、20g/L LacNAc、20g/L LNnT、20g/L LNT及/或20g/L LNB作为前体额外添加到培养基中。
复合培养基通过高压灭菌(121℃，21分钟)且基本培养基通过过滤(0.22μmSartorius)进行灭菌。
生物反应器的预培养从特定菌株的整个1mL冷冻管开始，接种在1L或2.5L摇瓶中的250mL或500mL基本培养基中，并在37℃下在回转式振荡机(orbital shaker)上以200转/分的速度温育(incubate)24h。然后将5L或30L的生物反应器进行接种(inoculated)(250mL接种物(inoculum)在2L批次培养基(batch medium)中或1L在17L批次培养基中)；该过程由MFCS控制软件(Sartorius Stedim Biotech,Melsungen,Germany)控制。培养条件设为37℃，最大搅拌；压力气体流速(pressure gas flow rates)取决于菌株和生物反应器。使用0.5M H2SO4和20％ NH4OH将pH控制在6.8。冷却废气。发酵过程中起泡时加入10％硅消泡剂溶液。
菌株和突变
大肠杆菌K12 MG1655[λ-,F-,rph-1]在2007年3月从Coli Genetic Stock Center(US)获得，CGSC Strain#:7740。使用Datsenko和Wanner发表的技术(PNAS 97(2000),6640-6645)进行基因中断(Gene disruptions)、基因导入和基因置换。该技术基于lambda Red重组酶进行同源重组后的抗生素选择。翻转酶重组酶(flippase recombinase)的后续催化确保去除最终生产菌株中的抗生素选择盒。携带Red辅助质粒pKD46的转化子(transformants)在含氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/L)和L-阿拉伯糖(10mM)的10mL LB培养基中于30℃下生长至OD600nm为0.6。通过第一次用50mL冰冷水(ice-cold water)洗涤细胞，第二次用1mL冰冷水洗涤，使细胞电转感受态(electrocompetent)。然后，将细胞重新悬浮在50μL冰冷的水中。使用Gene PulserTM(BioRad)(600Ω、25μFD和250伏)对50μL细胞和10-100ng线性双链DNA产物进行电穿孔。电穿孔后，将细胞加入1mL LB培养基中，在37℃温育1h，最后铺在含有25mg/L氯霉素(chloramphenicol)或50mg/L卡那霉素(kanamycin)的LB琼脂上，以筛选抗生素抗药性转化子。用修饰区上游和下游的引物进行PCR验证所选择的突变体，并在LB琼脂中在42℃下生长以失去辅助质粒。对这些突变体进行氨苄青霉素敏感性测试。线性ds-DNA扩增子是用pKD3、pKD4和它们的衍生物作为模板而通过PCR获得的。使用的引物有一部分序列与模板互补，另一部分与染色体DNA上必须发生重组的一侧互补。对于基因体敲除(genomic knock-out)，同源区被设计在目的基因(gene of interest)的起始和终止密码子的上游50nt和下游50nt。对于基因体敲入(genomic knock-in)，必须顾及转录起始点(+1)。PCR产物经PCR纯化，用Dpnl消化，从琼脂糖凝胶中重新纯化，并悬浮在洗脱缓冲液(5mM Tris，pH 8.0)中。选定的突变体用pCP20质粒进行转化，此质粒是一种抗氨苄青霉素和氯霉素的质粒，显示出对温度敏感的复制和热诱导FLP合成。在30℃下筛选抗氨苄青霉素的转化子，之后在42℃的LB中对少数转化子进行菌落纯化(colony purified)，然后检测所有抗生素抗药性和FLP辅助质粒的损失。用对照引物检查基因体敲除和敲入的情况。
在一个用于生产GDP-岩藻糖和岩藻糖化寡糖的例示中，突变株来自大肠杆菌K12MG1655，包括大肠杆菌中wcaJ及thyA基因的敲除和组成型表达构建体(constitutiveexpression constructs)的基因体敲入，所述组成型表达构建体含有蔗糖转运子例如源自大肠杆菌W(UniProt ID E0IXR1)的CscB、果糖激酶例如源自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的frk(ZmFrk)(UniProt ID Q03417)，蔗糖磷酸化酶例如源自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的BaSP(UniProt ID A0ZZH6)，另外还包括表达质粒，所述表达体包含alpha-1,2-岩藻糖基转移酶例如来自幽门螺旋杆菌(H.pylori)的HpFutC(GenBank No.AAD29863.1)及/或alpha-1,3-岩藻糖基转移酶例如源自幽门螺杆菌的HpFucT(UniProt ID O30511)的组成型表达构建体，以及大肠杆菌thyA的组成型表达构建体(UniProt ID P0A884)作为选择性标记。岩藻糖转移酶基因的组成型表达构建体也可以通过基因体敲入的方式出现在突变的大肠杆菌菌株中。GDP-岩藻糖的生产可以在突变的大肠杆菌菌株中通过基因体敲除包括glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、pgi和lon的大肠杆菌基因而进一步优化，如WO2016075243和WO2012007481中所述。GDP-岩藻糖的生产可以通过甘露糖-6-磷酸异构酶例如源自大肠杆菌的manA(UniProt ID P00946)、磷酸甘露糖变位酶例如源自大肠杆菌的manB(UniProt ID P24175)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶例如源自大肠杆菌的manC(UniProt ID P24174)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶例如来自大肠杆菌的gmd(UniProt ID P0AC88)、以及GDP-L-岩藻糖合成酶例如源自大肠杆菌的fcl(UniProt IDP32055)的组成型表达构建体的基因体敲入而进一步优化。GDP-岩藻糖的生产也可通过基因体敲除大肠杆菌fucK及fucI基因并同时基因体敲入包含岩藻糖通透酶，例如来自大肠杆菌的fucp(UniProt ID P11551)及具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶活性的双功能酶，例如来自脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)的fkp(UniProt ID SUV40286.1)的组成型表达构建体而达成。如果生产GDP-岩藻糖的突变菌株旨在制造岩藻糖基化乳糖结构，则该菌株还需要通过大肠杆菌LacZ、LacY及LacA基因的基因体敲除以及乳糖通透酶的基因体敲入，例如大肠杆菌LacY(UniProt ID P02920)的组成型表达构建体进行修饰。
在生产乳糖-N-丙糖(LN3、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的一个例示中，突变株来源于大肠杆菌K12 MG1655，并通过基因体敲除大肠杆菌lacZ、lacY、lacA及nagB基因，以及基因体敲入乳糖通透酶，例如大肠杆菌LacY(UniProt ID P02920)以及半乳糖苷beta-1,3-N-乙酰葡萄糖胺转移酶，例如来自脑膜炎双球菌(N.meningitidis)的lgtA(UniProt IDQ9JXQ6)的组成型转录单位。
在生产源自例如乳糖基-N-丁糖(LNT、Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的LN3衍生寡糖的例示中，突变的生产LN3的菌株将N-乙酰葡萄糖胺beta-1,3-半乳糖基转移酶(例如，来自大肠杆菌O55:H7的wbgO)的组成型转录单位通过基因体敲入或从表达质粒递送至菌株来进一步修饰。
在生产源自例如乳糖-N-新四糖(LNnT、Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的LN3衍生寡糖的例示中，突变的生产LN3的菌株将N-乙酰葡萄糖胺beta-1,4-半乳糖基转移酶，例如，来自脑膜炎双球菌的lgtB的组成型转录单位通过基因体敲入或从表达质粒递送至菌株来进一步修饰。
光学密度(optical density)
培养的细胞密度常通过测量600nm处的光学密度来监测(Implen NanophotometerNP80,Westburg,Belgium，或使用Spark 10M微盘分析仪，Tecan,Switzerland)。
分析
标准品如但不限于蔗糖、乳糖、N-乙酰乳糖胺(LacNAc、Gal-b1,4-GlcNAc),、乳糖基-N-双糖(LNB、Gal-b1,3-GlcNAc)、岩藻糖化LacNAc(2’FLacNAc、3-FLacNAc)、唾液酸化LacNAc(3’SLacNAc、6’SLacNAc)。岩藻糖基化LNB(2'FLNB、4'FLNB)、乳糖基-N-丙糖II(LN3)，乳糖基-N-丁糖(LNT)、乳糖基-N-新丁糖(LNnT)、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LNFP-VI、LSTa、LSTc和LSTd均购自Carbosynth(英国)、Elicityl(法国)和IsoSep(瑞典)。其他化合物以内部制作的标准品进行分析。
中性寡糖在Waters Acquity H-class UPLC上使用蒸发光散射侦测器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)或折射率(Refractive Index,RI)侦测器分析。将体积为0.7μL的样品注入Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1x 100mm；
Figure BDA0004113359340000511
1.7μm)和Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱，
Figure BDA0004113359340000512
2.1x 5mm。管柱温度为50℃。流动相由1/4水和3/4乙腈溶液组成，其中添加了0.2％三乙胺。此方法是等度的，流速为0.130mL/min。ELS侦测器的漂移管温度为50℃，N2气压为50psi，增益为200，数据速率为10pps。RI侦测器的温度设置为35℃。
在Waters Acquity H-class UPLC上分析唾液酸化寡糖，并使用了折射率(RI)侦测器。将0.5μL样品注入Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1x 100mm；
Figure BDA0004113359340000521
1.7μm)。管柱温度为50℃。流动相由70％乙腈、26％醋酸铵缓冲液(150mM)和4％甲醇的混合物组成，其中加入了0.05％吡咯啶。该方法是等度的，流速为0.150mL/min。RI侦测器的温度设置为35℃。
中性糖和唾液酸化糖均在Waters Acquity H-class UPLC上使用折射率(RI)侦测器进行分析。将0.5μL样品注入Waters Acquity UPLC BEH酰胺管柱(2.1x 100mm；
Figure BDA0004113359340000522
1.7μm)。管柱温度为50℃。流动相由72％乙腈和28％醋酸铵缓冲液(100mM)的混合物组成，其中加入了0.1％三乙胺。该方法是等度的，流速为0.260mL/min。RI侦测器的温度设置为35℃。
对于在质谱仪(mass spectrometer,MS)上的分析，使用带有电子喷雾电离(Electron Spray Ionisation,ESI)的Waters Xevo TQ-MS，去溶剂化温度为450℃，去溶剂化氮气流量为650L/h，锥电压(cone voltage)为20V。MS在选择离子监测(selected ionmonitoring,SIM)下对所有寡糖进行负模式操作。在配备Thermo Hypercarb管柱(2.1x100mm；3μm)的Waters Acquity UPLC上在35℃下进行分离。使用梯度，其中洗脱液A是含0.1％甲酸的超纯水，其中洗脱液B是含0.1％甲酸的乙腈。使用以下梯度在55分钟内分离寡糖：在21分钟内初始从2％的洗脱液B增加到12％，在11分钟内第二次从12％增加到40％的洗脱液B，在5分钟内第三次从40％增加到100％洗脱液B。作为洗涤步骤，在5分钟使用100％的洗脱液B。对于管柱平衡，2％的洗脱液B的初始条件在1分钟内恢复并维持12分钟。
为了鉴定本文所述的生产的寡糖混合物中的单一寡糖，可以通过本领域已知的标准方法鉴定单体组合单元(monomeric building blocks)(例如单糖或聚糖单元组成)、侧链的异构构型、取代基的存在和位置、聚合度/分子量和连接模式，例如甲基化分析、还原裂解、水解、气相层析-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、介质辅助激光解吸/电离-质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization-massspectrometry,MALDI-MS)、电喷雾离子化-质谱(Electrospray ionization-massspectrometry,ESI-MS)。带紫外线或折射率检测的高性能液相层析(High-PerformanceLiquid chromatography with ultraviolet or refractive index detection,HPLC)、带脉冲安培检测的高性能阴离子交换层析(High-Performance Anion-Exchangechromatography with Pulsed Amperometric Detection,HPAEC-PAD)、毛细管电泳(CE,capillary electrophoresis)、红外/拉曼光谱(IR(infrared)/Raman spectroscopy)和核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)光谱技术。晶体结构可以用例如固态核磁共振、傅里叶变换红外光谱(Nuclear magnetic resonance,FT-IR)和广角X射线散射(wide-angle X-ray scattering,WAXS)来解决。聚合度(degree of polymerization,DP)、DP分布和多分散性可以通过例如黏度测定法和高效粒径筛析层析(high performance size-exclusion chromatography,SEC-HPLC)来确定。为了确定糖类的单体组分，可以使用诸如酸催化水解、高效液相层析法(high performance liquid chromatography,HPLC)或(在转化为糖醇乙酸酯(alditol acetates)后)气液层析法(gas-liquid chromatography,GLC)等方法。为了确定糖苷连接，在DMSO中用碘化甲烷和强碱使糖类甲基化，进行水解，还原为部分甲基化的醛糖醇(alditols)，进行乙酰化处理，使之成为甲基化的醛糖醇醋酸(methylated alditol acetates)，并通过气液层析与质谱联用仪(gas-liquidchromatography coupled with mass spectrometry,GLC/MS)进行分析。为了确定寡糖序列，使用酸或酶进行部分解聚以确定结构。为了确定变旋异构体结构(anomericconfiguration)，对寡糖进行酶分析法，例如与对特定类型的连接有特异性的酶接触，如beta-半乳糖苷酶，或alpha-葡萄糖苷酶等，并可使用核磁共振分析其产物。
灰分含量
灰分含量是衡量食物或成分(例如寡糖)中矿物质总量的量度，而矿物质含量则是衡量食物中存在的特定无机成分的量的指标，例如Ca、Na、K、Mg、磷酸盐、硫酸盐和Cl。确定食品或寡糖的灰分和矿物质含量十分重要，是出于多种原因：营养标示。通常规定存在的矿物质的浓度和类型必须在食品或成分例如寡糖的标示上。许多食物的质量取决于它们所含矿物质的浓度和类型，包括它们的味道、外观、质地和稳定性。微生物稳定性。有时高矿物质含量被用于推迟特定微生物的生长。营养。有些矿物质对健康饮食至关重要(例如钙、磷、钾和钠)，而其他矿物质可能有毒(例如铅、汞、镉和铝)。加工。在加工过程中了解食品/产品的矿物质含量通常很重要，因为这会影响食品或成分例如寡糖的物化特性。
灰分是在氧化剂存在的情况下通过加热去除水和有机物后剩余的无机残留物，它提供了食物中矿物质总量的量度。提供矿物质总含量信息的分析技术基于矿物质(分析物)可以某种可测量的方式与食物或成分中的所有其他成分(基质)区分开来。最广泛使用的方法是基于矿物质不会被加热而破坏，并且与其他食物成分相比，它们的挥发性较低。用于确定食品灰分含量的三种主要分析方法均基于此原理：干灰化、湿灰化和低温电浆干灰化。为特定分析选择的方法取决于进行分析的原因、所分析的食品或成分的类型以及可用的设备。灰化也可作为准备样品的第一步，通过原子光谱或下述各种传统方法对特定矿物进行分析。
对于样品制备，选择组成代表成分的样品，以确保其组成在分析前不会发生显著变化。例如，干燥的寡糖样品通常是吸湿的，所选样品应保持在干燥条件下，避免吸水。通常，1-10g的样品用于分析灰分含量。固体成分经过精细研磨，然后仔细混合，以方便选择具有代表性的样品。在进行灰分分析之前，通常对水分含量高或溶液中的样品进行干燥，以防止灰化过程中的飞溅。其他可能的问题包括在分析过程中与样品接触的研磨机、玻璃器皿或坩埚中的矿物质污染样品。出于同样的原因，制备样品时使用去离子水，空白样品中也使用去离子水。
干灰化程序使用能够将温度保持在500至600℃之间的高温蒙孚炉(mufflefurnace)。水和其他挥发性物质被蒸发，有机物质在空气中的氧气存在下燃烧成CO2、H2O和N2。大多数矿物质会转化为氧化物、硫酸盐、磷酸盐、氯化物或硅酸盐。尽管大多数矿物质在这些高温下具有相当低的挥发性，但有些是挥发性的并且可能会部分丢失，例如铁、铅和汞，对于这些矿物质，产品的ICP-MS分析更适合于定量。
食品样品在灰化前后称重以确定存在的灰分浓度。灰分含量可以干基表示，其计算方法是将灰化的材料、成分或食物的质量除以灰化前干燥的材料、成分或食物的质量，并乘以100，即可得出材料、成分或食物中灰分的百分比。以类似的方式，可以确定液体产品的湿灰分百分比，其中使用灰化前后的液体质量而不是干燥的材料、成分或食物的质量。
重金属测定
将一种基于电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-massspectrometry,ICP-MS)的稳健通用方法用于检测和定量以下每种元素：砷(As)、硒(Se)、镉(Cd)、锡(Sn)、铅(Pb)、银(Ag)、钯(Pd)、铂(Pt)、汞(Hg)、钼(Mo)、钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锌(Zn)、锰(Mn)、磷(P)、硒(Se)。
硝酸(≥65％，Sigma-Aldrich)用于微波消化和标准品/样品制备。所有的稀释都使用18.2MΩ-cm(Millipore,Bedford,MA,USA)的去离子水(de-ionized water,DIW)。使用微波消化(CEM，Mars 6)程序，在100W和50℃下，15分钟(min)的升温时间和15分钟的持住时间，然后在1800W和210℃下，15分钟的升温时间和20分钟的持住时间，将0.2g之每个寡糖、成分、样品在5mL的HNO3中进行消化。样品消化后冷却30分钟。然后以去离子水将完全消化的样品稀释到50毫升。
分析是使用标准的Agilent 7800ICP-MS进行的，其中包括第四代ORS池系统，以使用氦碰撞模式(He模式)有效控制多原子干扰。ORS利用氦气控制多原子干扰，以减少所有常见的基于基质的多原子干扰的传播。利用动能分辨(kinetic energy discrimination,KED)将较小、较快的分析物离子与较大、较慢的干扰离子分开。除Se外，所有元素都在流速为5mL/min的He模式下测量。Se是在高能氦(High Energy He,HEHe)模式下测量的，池气体流速为10mL/min。7800ICP-MS配置了标准的样品引入系统，包括MicroMist玻璃同心雾化器、石英喷雾室、具有2.5mm内径进样器的石英焰炬(torch)和镍界面锥体。ICP-MS的操作条件是：1550W RF功率，8毫米采样深度，1.16l/min雾化气体，自动调谐的透镜调谐(autotuned lens tuning)，5或10ml/min氦气流量，5V KED。
干燥物质/干燥固体和水分含量定量
Sartorius MA150红外水分分析仪用于测定寡糖的干燥物质含量。在分析天平上称取0.5g寡糖，在红外水分仪中干燥至样品重量稳定。干燥样品的质量除以干燥前样品的质量给出寡糖或包括寡糖的样品的干燥物质含量(以百分比计)。以类似的方式称量液体样品，然而，称量的液体量适应液体中干燥物质的预期量，因此干燥物质的质量可以在分析天平上适当地测量。
水分分析仪测量干燥物质，但不测量水含量。卡尔·费歇尔滴定法(Karl Fishertitration)用于确定粉末、食品成分中的水量。卡尔·费歇尔滴定法是用Mettler Toledo的卡尔·费歇尔滴定仪DL31进行的，采用双组分技术(two-component technique)，使用Hydra-Point溶剂G和Hydra-Point滴定剂(5mg H2O/ml)，两者都购自J.T.Baker(Deventer,Holland)。双指示电极电位终点(bipotentiometric end-poin)测定的极化电流为20微安，停止电压为100mV。终点标准为漂移稳定(15微克H2O min-1)或最大滴定时间(10分钟)。
样品的含水量(moisture content,MC)使用以下公式计算：
MC＝V_KF W_eq 100/W_样品；其中V_KF为滴定剂的消耗量，单位为mL，W_eq为滴定剂的滴定量(titer)，单位为mg H2O/mL，W_样品为样品的重量，单位为mg。
干燥生物量含量(细胞干燥质量)
通过在预干燥(70℃过夜)和称重的离心管(falcons)中离心(15分钟，5000g)20g培养液获得细胞干重。随后用20ml生理食盐水(9g/l NaCl)将片状沉淀物(pellets)洗涤一次，并在70℃下干燥至恒重。最终重量根据添加到样品中的氯化钠进行校正。
蛋白质定量
对于蛋白质定量，使用与还原剂(例如还原糖或具有还原末端的寡糖)兼容的方法。为此，使用了Bradford分析(Thermo Scientific，Pierce)，其线性范围在1到1500μg/ml之间。此测定用BSA的标准曲线校正。干燥的寡糖产品的蛋白质含量通过将预先称重的定量物溶解在18.2MΩ·cm(Millipore，Bedford，MA，USA)去离子水(DIW)中进行定量，直至达到50％(m/v)的量。在595nm处测量蛋白质的量，并使用基于BSA的校正曲线转换为浓度。
DNA定量
生产宿主的特定DNA残基(residue)通过RT-qPCR定量，为此设计了宿主上的特定引物，以便扩增生产宿主的残留DNA。RT-qPCR根据从Sigma获得的试剂盒的标准方案进行，并基于SYBR Green检测。
总DNA是通过Threshold分析(Molecular Devices)测量的，基于免疫分析，使得测量溶液样品中低至2pg的DNA。双链DNA通过
Figure BDA0004113359340000561
QuantTMAccuBlueTMPico dsDNA检测试剂盒(Molecular Devices)测量，线性范围介于5pg和3ng的dsDNA之间。
内毒素测定
液体中的内毒素通过LAL测试进行测量。
激光衍射
粉末粒度可以通过激光衍射进行评估。该系统通过同心排列的传感器组件数组检测散射光和衍射光。然后，软件算法通过计算到达不同传感器组件的光强度值的z值来近似粒子计数。可以使用SALD-7500Aggregate Sizer(Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan)定量激光衍射系统(qLD)进行分析。
每个样品的少量(刮刀尖端)可以分散在2ml异辛烷中，并通过超声波处理均质5分钟。然后将分散体转移到装有异辛烷的分批池(batch cell)中，并以手动模式进行分析。
数据采集设置可以如下：每次测量的讯号平均计数：128，讯号累积计数：3，间隔：2秒。
在测量之前，系统可以用异辛烷进行清空(blanked)。每个样品分散体将测量3次，并报告平均值和标准偏差。可以使用软件WING SALD II version V3.1评估数据。当样品的折射率为未知时，糖(双糖)颗粒的折射率(1.530)可用于确定尺寸分布曲线。报告平均直径和中位数直径的尺寸值。由于使用的喷雾干燥器设置，所有样品的平均粒径非常相似。此外，粒度分布将显示所有样品都存在一个主要尺寸群体(main size population)。
实施例2.利用修饰的大肠杆菌宿主在补料分批发酵(fed-batch fermentations)中生产包含2′FL、3-FL及DiFL的寡糖混合物
用表达幽门螺杆菌alpha-1,2-岩藻糖转移酶组成性转录单元的第一质粒和表达幽门螺杆菌alpha-1,3-岩藻糖转移酶组成型转录单元的第二兼容质粒依次转化本领域所述或实施例1所述的用于生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌K12菌株。这种改良的突变株在批次和补料分批发酵方法中进行评估。如实施例1所述，在生物反应器规模(5和30L)下进行补料分批发酵。在这些实施例中，蔗糖用作碳源，乳糖作为前体添加到批次培养基中。如实施例1所述，定期采集培养液样品，并利用UPLC测量2'FL、3-FL和DiFL的生产。实验表明，批次阶段结束时的培养液样品包含2′FL和3-FL以及未改性的乳糖的寡糖混合物，而在补料分批阶段结束时的培养液样品包含2′FL、3-FL和DiFL的寡糖混合物。由于乳糖、2′FL、3-FL和DiFL的比例在补料分批过程中随时间变化，它们可以在发酵方法中通过在补料分批阶段的所需时间停止发酵方法来进行操控。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例3.在以甘油作为碳源、唾液酸和乳糖作为前体的补料分批发酵方法中评估突变大肠杆菌菌株发酵液中包含LN3、唾液酸化LN3、LNT、LSTa和3′SL的寡糖混合物的生产
如本领域所述或如实施例1所述，经修饰以生产LNT的大肠杆菌菌株进一步通过基因体敲除大肠杆菌lacZ基因进行修饰，并用表达质粒进行转化，所述表达质粒含有来自败血性巴斯德拉菌(P.multocida)且编码N-酰基神经胺酸胞苷酸转移酶(N-acylneuraminatecytidylyltransferase)的NeuA基因，以及来自败血性巴斯德拉菌的α-2,3-唾液酸转移酶基因的组成型表达盒。此菌株生产包含LN3、3'-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、3′SL和LSTa(Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物，并在5L和30L生物反应器中批次和补料分批发酵方法中生长。生物反应器规模的补料分批发酵如实施例1中所述般进行。在这些实施例中，使用甘油作为碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。在补料分批期间，还通过额外的进料添加唾液酸。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在批次阶段后的选定菌株的发酵液含有乳糖、LN3和LNT，而在补料分批阶段后提取的选定菌株的发酵液包含具有LN3、3'-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、LSTa和3'SL的寡糖混合物。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例4.在使用甘油、乳糖的补料分批发酵方法中评估突变大肠杆菌菌株发酵液中包含LN3、唾液酸化LN3、LNT、LSTa和3′SL的寡糖混合物的生产
如WO2018122225所述的经修饰以生产唾液酸的大肠杆菌菌株，进一步通过基因体敲入来自脑膜炎双球菌(N.meningitidis)的半乳糖苷beta-1,3-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶基因(LgtA)和来自大肠杆菌O55的N-乙酰葡萄糖胺beta-1,3-半乳糖基转移酶基因(WbgO)的组成型转录单位，以允许生产LNT。在下一步骤中，此新菌株进一步通过基因体敲除大肠杆菌lacZ基因并通过表达质粒转化，所述表达质粒含有源自败血性巴斯德拉菌(P.multocida)且编码N-酰基神经胺酸胞苷酸转移酶的NeuA基因，以及源自败血性巴斯德拉菌的α-2,3-唾液酸转移酶基因的组成型转录单位。当根据实施例1中提供的培养条件在生长实验中进行评估时，其中培养培养基含有蔗糖作为碳源和乳糖作为前体，新菌株生产包含LN3、3’-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、3’SL以及LSTa的寡糖混合物。
选择此突变体以在5L及30L的生物反应器的补料分批发酵方法中进行进一步的评估。生物反应器规模的补料分批发酵如实施例1中所述进行。在这些实施例中，蔗糖用作碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在批次阶段后的选定菌株的培养液含有乳糖、3’SL和LNT，而在补料分批阶段后提取的选定菌株的发酵液包含具有LN3、3′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)、LNT、LSTa和3'SL的寡糖混合物。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例5.在使用甘油、唾液酸、乳糖的补料分批发酵方法中评估突变大肠杆菌菌株发酵液中包含LN3、唾液酸化LN3、LNnT、对乳糖基N-新己糖、二唾液酸化LNnT、LSTc和6′SL的寡糖混合物的生产
如本领域所述或如实施例1所述，经修饰以生产LNnT的大肠杆菌菌株进一步通过基因体敲除大肠杆菌lacZ基因进行修饰，并以表达质粒进行转化，所述表达质粒包含源自败血性巴氏杆菌且编码N-酰基神经胺酸胞苷酸转移酶的NeuA基因，以及选自发光杆菌(P.damselae)的特定α-2,6-唾液酸转移酶基因的组成型表达盒(constitutiveexpression cassette)。此菌株生产包含6’SL、LN3、6’-唾液酸LN3(Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc)、LNnT以及LSTc(Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物。
此突变菌株在5L及30L的生物反应器的批次与补料分批发酵方法中培养。生物反应器规模的补料分批发酵如实施例1中所述进行。在这些实施例中，甘油用作碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。在补料分批的过程中，还通过额外的进料添加唾液酸。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在批次阶段后的选定菌株的发酵液含有乳糖、LN3和LNnT，而在补料分批阶段后提取的选定菌株的发酵液包含具有LN3、6′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc)、LNnT、LSTc和6'SL的寡糖混合物。在补料分批结束时，混合物还包含对-乳糖基-N-新己糖(para-lacto-N-neohexaose,pLNnH)和二唾液酸化LNnT，这两种结构由于检测水平有限及总体生产水平较低，而未在生长实验测定中检测到。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例6.在使用蔗糖、乳糖的补料分批发酵方法中评估突变大肠杆菌菌株发酵液中包含LN3、唾液酸化LN3、LNnT、对乳糖基N-新己糖、二唾液酸化LNnT、LSTc和6'SL的寡糖混合物的生产
如WO2018122225所述的经修饰以生产唾液酸的大肠杆菌菌株，进一步通过基因体敲入来自脑膜炎双球菌(N.meningitidis)的LgtA基因和来自脑膜炎双球菌的LgtB基因(WbgO)的组成型转录单位，以允许生产LNnT。在下一步骤中，此新菌株进一步通过基因体敲除大肠杆菌lacZ基因修饰，并通过表达质粒转化，所述表达质粒含有源自败血性巴斯德拉菌(P.multocida)且编码N-酰基神经胺酸胞苷酸转移酶的NeuA基因，以及源自发光杆菌(Photobacterium)sp.JT-ISH-224的α-2,6-唾液酸转移酶基因的组成型转录单位。此菌株生产包含LN3、6’-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2,6-(GlcNAc-b1,3)-Gal-b1,4-Glc)、6’SL、LNnT以及LSTc的寡糖混合物。
此菌株在5L及30L的生物反应器中的批次与补料分批发酵方法中生长。生物反应器规模的补料分批发酵如实施例1中所述进行。在这些实施例中，蔗糖用作碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在批次阶段后的选定菌株的发酵液含有乳糖、LN3、6’SL和LNnT，而在补料分批阶段后提取的选定菌株的发酵液包含具有LN3、6'-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a-2,6-(GlcNAc-b-1,3)-Gal-b-1,4-Glc)、LNnT、LSTc和6'SL的寡糖混合物。在补料分批结束时，混合物还包含对-乳糖基N-新己糖和二唾液酸化LNnT，这两种结构由于检测水平有限和总体生产水平较低而未在生长实验测定中检测到。
按照例如实施例14，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例7.在补料分批发酵中评估在经修饰的大肠杆菌宿主生产的包含LNT、LNnT和聚半乳糖基化结构的寡糖混合物
如本领域所述或如实施例1所述，经修饰以生产LNnT的菌株通过来自脑膜炎双球菌的N-乙酰葡萄糖胺beta-1,4-半乳糖基转移酶基因(LgtB)的一个或多个拷贝的组成型转录单元修饰。为了增加UDP-半乳糖的生产，基因体敲除ushA以及galT基因。突变的大肠杆菌菌株通过基因体敲入源自大肠杆菌的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因(galE)、源自大肠杆菌的磷酸葡萄糖胺变位酶基因(glmM)、以及源自大肠杆菌的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase/glucosamine-1-phosphate acetyltransferase)基因(glmU)的组成型转录单位而进一步修饰。此突变菌株通过基因体敲入包含源自大肠杆菌W的蔗糖转运蛋白基因(CscB)、源自青春双歧杆菌(B.adolescentis)的果糖激酶基因(Frk)以及蔗糖磷酸化酶组成型转录单位，进一步突变以在蔗糖上生长。此菌株更进一步通过基因体敲入来自大肠杆菌O55:H7的WbgO基因的组成型转录单位修饰。
最终突变菌株生产乳糖基N-丙糖II(LN3)、乳糖基N-新四糖(LNnT)、乳糖基N-四糖(LNT)、对-乳糖基N-新五糖、对-乳糖基N-戊糖、对-乳糖基N-新己糖、对-乳糖基N-己糖、beta-(1,3)半乳糖基-对-乳糖基N-新戊糖和beta-(1,4)半乳糖基-对-乳糖基N-戊糖的混合物。
如实施例1中所述，此突变菌株在5L及30L的生物反应器中的批次和补料分批发酵方法中评估。在此实施例中，蔗糖用作碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在补料分批阶段定期采集的所选菌株的发酵液具有含有乳糖基N-丙糖II(LN3)、乳糖基N-新四糖(LNnT)、乳糖基N-四糖(LNT)、对-乳糖基N-新五糖、对-乳糖基N-五糖、对-乳糖基N-新己糖、对-乳糖基N-己糖、beta-(1,3)半乳糖基-对-乳糖基N-新五糖和beta-(1,4)半乳糖基-对-乳糖基N-五糖的寡糖混合物。
按照例如实施例14，将所得培养液所述进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例8.利用修饰的大肠杆菌宿主生产包含2′FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT和LNFP-I的寡糖混合物
如以上实施例所描述的针对GDP-岩藻糖进行修饰的大肠杆菌菌株，更进一步修饰以表达源自大肠杆菌的glmS*54基因、源自脑膜炎双球菌的LgtA基因、源自大肠杆菌O55:H7的WbgO基因、源自幽门螺旋杆菌的a-1,2-岩藻糖基转移酶基因、以及a-1,3-岩藻糖基转移酶基因(HpFucT)。在按照实施例1提供的培养条件进行的生长实验中，其中培养培养基中含有蔗糖为碳源，乳糖为前体，此新菌株生产包括2’FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT以及LNFP-I(Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物。如实施例1所述，此菌株在5L及30L的生物反应器中的批次和补料分批发酵方法中评估。在此实施例中，蔗糖用作碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在补料分批阶段定期采集的选定菌株的发酵液具有含有2’FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT以及LNFP-I(Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)的寡糖混合物。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例9.利用修饰的大肠杆菌宿主生产包含岩藻糖基化和唾液酸化寡糖结构的寡糖混合物
WO2018122225中描述的适于唾液酸生产的大肠杆菌菌株，通过基因体敲除大肠杆菌wcaJ基因以增加GDP-岩藻糖的细胞内池(intracellular pool)，以及基因及应敲入源自脑膜炎双球菌的LgtA基因和源自大肠杆菌O55:H7的WbgO基因的组成型表达盒，而进一步修饰。在接下来的步骤中，新菌株通过两个兼容的表达质粒而转化，其中第一个质粒pMF_2包括两种岩藻糖基转移酶基因(幽门螺杆菌alpha-1,2-岩藻糖基转移酶基因(HpFutC)和幽门螺杆菌alpha-1,3-岩藻糖基转移酶基因(HpFucT))的(一个或多个)组成型表达单元。而第二个质粒pMS_2包括两种唾液酸转移酶基因(来自败血性巴氏杆菌的alpha-2,3-唾液酸转移酶，和来美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的alpha-2,6-唾液酸转移酶(PdST6))以及来自多败血性巴氏杆菌且编码N-酰基神经胺酸胞苷酸转移酶的NeuA基因的组成型表达单元。此菌株在全培养液样品中生产包含岩藻糖基化和唾液酸化的乳糖、LNB、岩藻糖基化和唾液酸化的LNB、LN3、唾液酸化LN3、LNT和岩藻糖基化和唾液酸化的LNT结构的寡糖混合物。根据实施例1中提供的培养条件在实验中培养菌株，其中培养中含有蔗糖作为碳源和乳糖作为前体。
如实施例1所述，此突变菌株在5L及30L的生物反应器中的批次和补料分批发酵方法中评估。在此实施例中，蔗糖用作碳源并且将乳糖作为前体添加到批次培养基中。定期采集培养液样品，并如实施例1所述测量生产的糖。UPLC分析表明，在补料分批阶段定期采集的所选菌株的发酵液具有含有2’FL、3-FL、DiFL、3’SL、6’SL、di-SL、3’S-2’FL、3’S-3-FL、6’S-2’FL、6’S-3-FL、LNB、2’FLNB、4-FLNB、Di-FLNB、3’SLNB、6’SLNB、LN3、3’S-LN3、6’S-LN3、LNT、LNFP-I、LSTa的寡糖混合物。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例10.2'-岩藻糖基乳糖(2'fucosyllactose)在补料分批发酵中的生产
将如WO2013087884A1所述产生2′-岩藻糖基乳糖的并如WO21122708所述进一步修改的大肠杆菌菌株用于如实施例1所述的补料分批发酵中。发酵培养基在分批培养基中含有120克/升的乳糖与100克/升的蔗糖，且提供60％的蔗糖溶液至生物反应器，直到上清液中的乳糖浓度低于5克/升。
对实施例1所述的培养基组成进行调整，其中没有向培养基中添加氯化铵或硫酸铵，钠以硫酸钠的形式添加，因此减少了培养基中的盐量。
发酵过程中达到的最终滴定量为150克/升。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例11.6′唾液乳糖(6′sialyllactose)及3′唾液乳糖(3′sialyllactose)在补料分批发酵中的生产
将如WO2018122225所述的产生6'唾液乳糖或3'唾液乳糖的大肠杆菌菌株用于如实施例1所述的补料分批发酵中。发酵培养基含有100克/升的乳糖和60克/升的蔗糖，并对其提供60％的蔗糖溶液，直到上清液中的乳糖浓度低于5克/升。发酵过程中达到的最终滴定量是100克/升的6'SL或3'SL。
如实施例14所述，将所得培养液进行澄清。在单独的实施例中，如实施例13所述，裂解细胞以增加寡糖的释放，并如实施例14所述进行进一步的澄清。
实施例12.培养或发酵液(cultivation or fermentation broth)的组成测定
对于在实施例2-9中获得的培养或发酵液，根据表1中描述的方法，其组成通过测量培养液(broth)的细胞干燥质量、上清液和培养液的灰分含量、上清液和培养液的寡糖含量以及培养液中的总干燥固体来确定。对于所有样品，总寡糖含量低于总干燥固体的80％。培养液中寡糖混合物的纯度在30％到77％之间。
实施例13.细胞裂解
在许多如上述的突变菌株中，产物很容易从细胞中排出。然而，较大的分子往往在培养或发酵方法中更难释放。因此，可视需要地引入附加步骤以从细胞中释放产物。来自实施例2-8的发酵方法的培养液用于细胞裂解实验。
通过加热培养液1小时，使其温度在60℃至80℃之间，以建立产品的软释放(softrelease)。温度越高，获得的释放越多，但颜色形成增加。产物释放在pH低于6.5和高于3的情况下最佳。在pH值高于3.9的情况下，单糖的形成最少。产物的释放通过测量处理前后的培养液中的总寡糖池(实施例1中的cfr方法)来定量。当观察到寡糖浓度增加时，产物从细胞中释放出来。
为了更加破坏细胞完整性，其他方法也常使用，例如冷冻解冻及/或通过超声处理、混合、均质机及/或法式压碎机的剪切应力的方法。
实施例14.培养液澄清(broth clarification)
源自培养(cultivation)或发酵(fermentation)，以及视情况而定，实施例2-13中描述的裂解步骤的培养液通过微滤而进一步澄清。对于过滤，几种类型的孔径在0.1至10μm之间的微滤膜(陶瓷、PES、PVDF膜)已用于澄清的培养或发酵液(cultivation orfermentation broth)。滤膜型首先用作终端过滤(dead-end filtration)，并在扫流过滤(cross flow filtration)中进行进一步优化。在此纯化步骤后，在扫流过滤之后进行渗滤(diafiltration)以增加产物收率。滤膜能够分离大的悬浮固体，如胶体、颗粒、脂肪、细菌、酵母、真菌、细胞，同时允许糖、蛋白质、盐类和低分子量分子通过滤膜。
滤液中的颗粒浓度用分光亮度计(spectrophotometer)在600nm处通过光的吸附进行测量。该方法允许验证颗粒的去除和过滤的优化。
使用超滤膜替代微滤膜。测试截留值(cut-off)介于1000Da和10kDa之间的超滤膜(microdyne Nadir(3kDa PES)、Synder(3kDa，PES)、Synder Filtration MT(5kDa，PES)和Synder Filtration ST(10kDa，PES))。具有较大截留值的替代膜也可用于培养液澄清。滤膜以扫流模式(cross flow mode)使用，并应用类似于上述微滤操作的渗滤以增加产物收率。基于滤液的颗粒浓度评估过滤效率。除细胞和细胞碎片外，低于10kDa的滤膜可有效去除DNA、蛋白质和内毒素，这些是使用实施例1中描述的方法进行测量。10到500kDa之间的较高截留值的滤膜可有效去除细胞块(cell mass)，但不会有效保留较小分子量的产物，因此需要额外的截留分子量低于10kDa的超滤步骤。通过超滤的培养液澄清的最终回收率达到95％以上。
为了通过离心提升培养液澄清，`使用了絮凝剂/凝结剂。通常，石膏、明矾、氢氧化钙、聚合氯化铝(polyaluminium chloride)、氯化羟铝(Aluminium chlorohydrate)用作良好的絮凝剂。这些絮凝剂在pH>7和4℃至20℃之间，更较佳4℃至10℃之间的温度下使用。pH<7释放的有毒阳离子，进一步通过阳离子交换去除。测试的替代絮凝剂基于聚丙烯酰胺或生物聚合物(壳聚糖)、Floquant(SNF inc)、Superfloc(Kemira)或hyperfloc(Hycheminc)、Tramfloc。这些絮凝剂以不同的浓度使用：在用RO水1:1稀释培养液后0.05、0.1和0.2v/v％，将它们直接添加到培养液中，并在室温下轻轻混合10分钟。pH值保持在中性条件，即6和7之间。在较高的pH值下，絮凝剂会发生一些降解，导致通过离子交换的方式被去除的化合物。
为了测试絮凝效率，在4000g下进行离心，并在不同离心时间后评估片状沉淀物强度(pellet strength)和上清液浊度。通过测量寡糖上清液浓度和总上清液体积来测量寡糖产率。将片状沉淀物洗涤数次以增加寡糖的释放。得到90％至98％的最终寡糖回收率。
实施例15.超滤
在由运行Convergence Inspector软件的PC控制的Colossus装置(ConvergenceIndustry,The Netherlands)上进行超滤。在线(inline)测量渗余物和滤液两者的温度、压力和导电率，使用经校正的pH探针(Hanna Instruments)脱机(offline)测量pH。用于进一步去除DNA、蛋白质和内毒素的滤膜是基于PES的10kDa滤膜(Synder)，用于扫流。过滤后，测定滤液中的DNA、蛋白质和内毒素含量。蛋白质含量低于100mg/kg干燥固体，DNA含量低于10ng/g干燥固体，内毒素低于10000EU/g干燥固体。在滤液中没有检测到来自生产宿主的DNA。
虽然在此实施例中使用基于聚砜(polysulfon)的滤膜，但其他滤膜材料将具有相同的表现，这些滤膜材料可以由陶瓷或合成或天然的聚合物制成，例如来自Synder、Tami、TriSep、Microdyn Nadir、GE等供货商的聚丙烯、醋酸纤维素或聚乳酸。
实施例16.通过纳米过滤去除离子、单及双糖
在由运行Convergence Inspector软件的PC控制的Colossus装置(ConvergenceIndustry,The Netherlands)上进行切向流纳米过滤。在线测量渗余物和滤液两者的温度、压力和导电率，使用经校准的pH探针(Hanna Instruments)脱机测量pH。实施例15的超滤处理的澄清液体进一步经过纳米过滤和连续的渗滤。为此，在40℃下使用截留值在300到500Da之间的聚酰胺基膜(polyamide base membrane)(TriSep XN-45(TriSepCorporation，USA))。使用去离子水进行渗滤，去离子水的总体积为寡糖浓缩物的5倍。该步骤将干燥固体中的双糖分数降低到5％以下，并且将液体的总灰分含量降低了50％。寡糖的浓度增加到约200g/l。
实施例17.通过电渗析去除离子
使用的电渗析(electrodialysis,ED)设备是PCCell ED 64004实验室规模的ED迭层(stack)，装有5对PC SA和PC SK标准离子交换膜。初始稀释液和浓缩物均由实施例14和15中澄清和超滤后所获得的1.5L进料流(feed stream)组成。这些实施例中获得的液体含有寡糖和阳离子和阴离子，其灰分含量高于干燥固体的10％。脱盐(desalination)是针对浓度梯度进行的。当施加7.5V的恒定电压时，将两种流(stream)都进行再循环，并监测电流和导电率。在开始和结束时以及在实验期间定期取样。通过在实验结束时测量所有流的体积来监测跨膜的水传输。为确保电流有效转移到迭层，60g/L NaNO3的电解质溶液在电极处循环。
维持ED实验，直到观察到电流和导电率的稳定。这指明脱盐变得缓慢且效率低下的点。导电率从进料(feed)中的3.79mS/cm降低到实验结束时的0.88mS/cm，表明总体脱盐率为77％。多价阴离子的去除高达90％。最终寡糖回收率在90％和99％之间。电渗析后干燥固体的灰分含量约为干燥固体的3％。
实施例18.阳离子交换
为了去除不需要的离子，进行了阳离子交换。在质子形式下其大幅地酸化液体，在钠、钾、钙、镁或其他碱金属形式下其生成碱性溶液。一般来说，寡糖在这样的溶液中被视为是不稳定的，但是我们发现在进行单一的阳离子或连续的阳离子交换步骤时，我们的方法有良好的产量和稳定性。
源自实施例2至12的澄清培养液在如实施例15所述的超滤后，都在10℃的温度下进入含有质子形式的强酸阳离子交换树脂柱(1L的Amberlite IR120)。该阳离子交换步骤的洗脱液的pH值通过氢氧化钠或氢氧化钾来控制，使pH值保持在4和7之间。寡糖的回收率在95-98％之间，几乎没有形成单糖，铅的含量低于0.1毫克/公斤干燥固体，砷低于0.2毫克/公斤干燥固体，镉低于0.1毫克/公斤干燥固体，汞低于0.5毫克/公斤干燥固体。
源自实施例3、4、5、6、9和11的澄清培养液在如实施例15所述的超滤后，在10℃的温度下进入含有质子形式的强酸阳离子交换树脂管柱(1L Amberlite FPC 22H)，然后进入含有钠形式的强阳离子交换树脂管柱(1L Amberlite IR120)。该阳离子交换步骤的洗脱液的pH值通过磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、柠檬酸来控制，使pH值保持在4到7之间。寡糖的回收率在95-98％之间，几乎没有形成单糖，铅的含量通常低于0.1毫克/千克干燥固体，更典型的是低于0.05毫克/千克，甚至更典型的是低于0.02毫克/千克，砷的含量通常低于0.2毫克/千克干燥固体，更典型的是低于0.1毫克/千克，甚至更典型地低于0.05毫克/千克；镉含量通常低于0.1毫克/千克干燥固体，更典型地低于0.05毫克/千克，甚至更典型地低于0.02毫克/千克；汞通常低于0.5毫克/千克干燥固体，更典型地低于0.2毫克/千克，更典型地低于0.1毫克/千克。
实施例19.通过纳米过滤浓缩
纳米过滤利用截留值为200Da的NF-2540膜(DOW)进行，以将离子交换、电渗析或纳米过滤后的去离子溶液浓缩至25白利糖度(Brix)。在过滤过程中，使用了20-25bar范围内的跨膜压力和45℃的方法温度。溶液在膜上连续再循环以进行浓缩，使浓缩物的干燥物质含量高达25％白利糖度。
为了去除阳离子交换步骤中形成的一些单糖，通常使用300至500Da的纳米过滤步骤，膜压力为20至25bar，温度高于30℃。该膜允许将寡糖溶液浓缩到约15至20％的白利糖度。
实施例20.颜色去除
为实现脱色，在整个过程中，几个样品都经过Norit SX PLUS活性碳(0.5％m/v)进行活性碳处理。用分光亮度计在420nm处测量颜色去除程度。在所有样品中，420nm处的颜色强度降低了50到100倍。
实施例21.寡糖混合物的喷雾干燥
用实验性(pilot)喷雾干燥设备喷雾干燥不同浓度的寡糖混合物。该设备的蒸发量为25kg/h。
为了喷雾干燥，将液体加热至50至100oC之间的温度，以降低黏度。液体的pH值设定为4至6。再更佳地将pH值设定为4至5并且温度保持在50至70oC之间。
进料(feed)中的寡糖浓度在20％到80％白利糖度之间。这些浓度是通过旋转蒸发或刮膜蒸发获得的。浓缩的液体以50％至90％的速率送入喷雾干燥器。白利糖度百分比越高，进料速度越快
使用的入口温度范围在120到280℃之间。出口温度介于100℃和180℃之间。雾化轮转速设置在10000到28000rpm之间。在一项特定测试中，入口温度设置为184℃，出口温度设置为110℃，雾化器速度设置为21500rpm。
所得粉末呈白色至米白色(off white)，以10％浓度再次溶解于水中后，其pH值在4-6之间。寡糖混合物的纯度以干燥固体计，寡糖含量高于80％。喷雾干燥的寡糖混合物具有约3％至10％的水分，蛋白质含量低于100mg/kg干燥固体，DNA含量低于10ng/g干燥固体并且内毒素低于10000EU/g干燥固体。在滤液中没有检测到来自生产宿主的DNA。处理后灰分低于5％(以总干燥固体计)，铅含量典型地低于0.1mg/kg干燥固体。更典型地低于0.05mg/kg干燥固体，且更典型地低于0.02mg/kg干燥固体、砷含量典型地低于0.2mg/kg干燥固体，更典型地低于0.1mg/kg干燥固体，且更典型地低于0.05mg/kg干燥固体、镉含量典型地低于0.1mg/kg干燥固体，更典型地低于0.05mg/kg干燥固体，且更典型地低于0.02mg/kg干燥固体，以及汞含量典型地低于0.5mg/kg干燥固体，更典型地低于0.2mg/kg干燥固体，且更典型地低于0.1mg/kg干燥固体。
实施例22.逐步纯化岩藻糖化的寡糖混合物
实施例8的培养液通过首先使用0.45μm孔径的滤膜进行微滤来澄清，在60℃和4至5的pH值下去除生物量。微滤步骤的滤液在第二步骤中使用10kD的PES膜进行超滤，去除蛋白质、内毒素和DNA。得到的滤液通过纳米过滤进一步浓缩，在40℃下用300至500Da的聚酰胺膜从液体中部分地去除盐和双糖。在纳米过滤步骤中，寡糖混合物被浓缩到大约200g/l或20白利糖度的浓度。所得浓缩物通过活性碳进一步脱色，并通过阳离子交换步骤去除阳离子，使灰分含量低于干燥质量的5％。该液体的pH值在5和7之间，并通过蒸发浓缩到约50白利糖度。最后的溶液在Procept喷雾干燥器上进行喷雾干燥，入口温度为160℃，出口温度为75℃，气流为600升/小时，进料速度为8毫升/分钟。得到的粉末呈白色至米白色，在10％的浓度下重新溶于水后，pH值在4至6之间。寡糖混合物的纯度在干燥固体上的寡糖含量高于80％。喷雾干燥的寡糖混合物的含水量约为3-10％，蛋白质含量低于每公斤干燥固体100mg，DNA含量低于每克干燥固体10ng，内毒素低于每克干燥固体10000EU。滤液中检测不到生产宿主的DNA。处理后的灰分含量低于5％(总干燥固体)，铅含量低于0.1mg/kg干燥固体，砷含量低于0.2mg/kg干燥固体，镉低于0.1mg/kg干燥固体，汞低于0.5mg/kg干燥固体。所得粉末中存在的寡糖是2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT和LNFP-I。
实施例23.逐步纯化唾液基寡糖混合物
通过首先用0.45微米孔径的膜进行微滤来澄清实施例8的培养液，在60℃和4至5的pH值下来去除生物量。微滤步骤的滤液在第二步中进行超滤，其中使用10kDa的PES膜，去除蛋白质、内毒素和DNA。将所得的滤液进一步浓缩并通过电渗析去离子，形成导电率约为0.9mS/cm的液体溶液。在电渗析步骤之后，渗余物(retentate)在纳米过滤步骤中进一步处理，将寡糖混合物浓缩到大约200克/升或20白利糖度的浓度。得到的浓缩物通过活性碳进一步脱色，并在灰分含量低于8％干燥质量的情况下进行阳离子交换步骤处理。将此去离子液体的pH值设定为5至7，并通过蒸发浓缩至约50白利糖度。在Procept喷雾干燥器上以160oC的入口温度、75oC的出口温度、600L/h的气流和8ml/min的进料速率对最终溶液进行喷雾干燥。所得粉末呈白色至灰白色，以10％浓度再次溶解在水中后，其pH值在4-6之间。寡糖混合物的纯度以干燥固体计，寡糖含量高于80％。喷雾干燥的寡糖混合物具有约3％至10％的水分，蛋白质含量低于100mg/kg干燥固体，DNA含量低于10ng/g干燥固体并且内毒素低于10000EU/g干燥固体。在滤液中没有检测到来自生产宿主的DNA。处理后灰分低于5％(以总干燥固体计)，铅含量低于0.02mg/k干燥固体，砷含量低于0.05mg/kg干燥固体，镉含量低于0.05mg/kg干燥固体且汞含量低于0.1mg/kg干燥固体。
实施例24.本发明的逐步实施的实施例
下文描述的每个步骤必须理解为如本文所述。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得寡糖混合物的的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、
从培养或4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、54)活性碳处理、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)浓缩至具有至少40％干燥物质的糖浆。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)冻干。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
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培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的中性及酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的酸性寡糖混合物的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)结晶。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)结晶。
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从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)电渗析、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)纳米过滤、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)纳米过滤、3)阳离子交换、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)电渗析、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、4)阳离子交换、5)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、6)活性碳处理、7)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过微滤来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过离心来澄清培养液、2)超滤、3)阳离子交换、4)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、5)活性碳处理、6)喷雾干燥。
从培养或发酵方法中获得的单一酸性寡糖的纯化，包括以下步骤1)通过超滤来澄清培养液、2)阳离子交换、3)浓缩，通过纳米过滤来移除单糖及双糖、4)活性碳处理、5)喷雾干燥。

Claims (83)

1.一种以批次方式或连续方式从细胞培养或微生物发酵获得的培养或发酵液中纯化寡糖溶液的方法，该培养或发酵液还包括生物量、培养基成分及污染物，其中该培养或发酵液中的寡糖溶液的纯度较佳地占总干燥固体的<80％，并且该培养或发酵液应用于以下纯化步骤：
i)澄清该培养或发酵液。
ii)从该澄清的培养或发酵液中去除盐及/或培养基成分，以及
iii)较佳为浓缩该寡糖溶液，
其中，提供占总干燥固体≥80％的纯度的纯化寡糖溶液，
其特征在于，从该澄清的培养液或发酵液中去除盐分及/或培养基成分的步骤ii)包括由用于去除正电材料的阳离子交换处理所组成的离子交换处理，并且不包括用于去除负电材料的阴离子交换处理。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤iii)在步骤ii)之前进行。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液具有占总干燥固体≤10％的灰分含量，较佳为占总干燥固体的≤9％、更佳为占总干燥固体的≤8％、更佳为占总干燥固体的≤7％、更佳为占总干燥固体的≤6％、更佳为占总干燥固体的≤5％、更佳为占总干燥固体的≤4％、更佳为占总干燥固体的≤3％、更佳为占总干燥固体的≤2％、更佳为占总干燥固体的≤1％、更佳为占总干燥固体的≤0.5％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液从由细胞培养获得的培养或发酵液中纯化，该细胞培养使用至少一种细胞，较佳为在化学限定培养基中生长的重组细胞，其中在步骤i)中分离的生物量可视需要地回收至该培养中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液从由微生物发酵获得的发酵液中纯化，该微生物发酵使用至少一种微生物，较佳为细菌或酵母，更佳为在化学限定培养基中生长的重组微生物，其中在步骤i)中分离的生物量可视需要地回收至该微生物发酵中。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该细胞培养使用重组细胞，并包括至少一种细胞，其经基因改造以产生寡糖，较佳为该至少一种细胞已被基因改造以产生至少两种不同寡糖。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该细胞培养为使用重组微生物的微生物发酵，并包括至少一种微生物，其经基因改造以产生寡糖，较佳为该至少一种微生物已被经基因改造以产生至少两种不同寡糖。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该培养或发酵液中的该寡糖溶液是由使用至少一种基因改造细胞的细胞培养或微生物发酵获得的，该至少一种基因改造细胞能够产生该寡糖溶液，较佳为来自内化的碳水化合物前体。
9.如权利要求1至8所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵在具有碳源的基础盐培养基中培养，该至少一种细胞或微生物在其上生长。
10.如权利要求9所述的方法，其中该基础盐培养基含有硫酸盐、磷酸盐、氯化物、铵、钙离子、镁离子、钠离子、钾离子、铁离子、铜离子、锌离子、锰离子、钴离子及/或硒离子。
11.如权利要求9或10中任一项所述的方法，其中该碳源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、玉米浸液、乳糖、半乳糖、高果糖浆、淀粉、纤维素、半纤维素、麦芽寡糖、海藻糖、甘油、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和丙酮酸盐中的一种或多种。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中纯化前在该培养或发酵液中的该寡糖溶液的纯度为占总干燥固体的<70％、<60％、<50％、<40％、<30％、<20％、<10％，及/或纯化后的该寡糖溶液的纯度为占总干燥固体的>80％、较佳为>85％、更佳为>90％、甚至更佳为>95％、最佳为>97％。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液的纯化产率为＞60％，较佳为＞65％，更佳为＞70％，最佳为＞75％。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少2种不同的寡糖，较佳为至少3种不同的寡糖，更佳为至少4种不同的寡糖，甚至更佳为至少5种不同的寡糖，最佳为至少6种不同的寡糖。
15.如权利要求14所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少2种聚合度不同的不同寡糖，较佳为该寡糖溶液包括至少3种聚合度不同的不同寡糖，更佳为该寡糖溶液包括至少4种聚合度不同的不同寡糖。
16.如权利要求14或15中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少一种中性寡糖和至少一种带电寡糖。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中澄清该培养或发酵液的该步骤i)包含澄清、清除、过滤、微滤、离心、倾析和超滤中的一种或多种，较佳地，该步骤i)还包含使用助滤剂及/或絮凝剂；该助滤剂较佳为吸附剂，更佳为活性碳。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该步骤ii)从澄清的培养或发酵液中去除盐及/或培养基成分，还包纳米过滤、透析、电渗析、使用活性碳或碳、使用溶剂、使用醇类和使用水醇混合物、使用木碳、切向流高效能过滤(tangential flow high-performancefiltration)、切向流超滤(tangential flow ultrafiltration)、亲和性层析、阳离子交换、模拟移动床层析(simulated moving bed chromatography)、疏水性相互作用层析、凝胶过滤、配体交换层析、管柱层析、阳离子交换吸附树脂，以及使用阳离子交换树脂中的至少一种或多种。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该步骤iii)浓缩包括纳米过滤、渗滤、逆渗透、蒸发、刮膜蒸发(wiped film evaporation)和降膜蒸发(falling filmevaporation)中的一种或多种。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括至少一种寡糖，该寡糖选自包括岩藻糖基化寡糖、唾液酸化寡糖、路易斯抗原、含N-乙酰葡萄糖胺的中性寡糖、含N-乙酰乳糖胺的寡糖、含乳糖基-N-双糖的寡糖、非岩藻糖基化中性寡糖、几丁聚糖、几丁寡糖、肝素原(heparosan)、软骨素硫酸盐、糖胺聚糖寡糖、肝素(heparin)、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、玻尿酸或玻糖醛酸及/或硫酸角质素的列表。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括哺乳类乳寡糖(mammalian milk oligosaccharide；MMO)，较佳为人类乳寡糖(human milkoligosaccharide；HMO)。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该寡糖溶液包括中性HMO，较佳为选自由2'-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、2',3-双岩藻基乳糖、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖基戊糖I、乳糖基-N-新岩藻基戊糖、乳糖基-N-岩藻基戊糖II、乳糖基-N-岩藻基戊糖III、乳糖基-N-岩藻基戊糖V、乳糖基-N-新岩藻基戊糖V、乳糖-N-双岩藻基己糖I、乳糖-N-双岩藻基己糖II、6′-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖，乳糖基-N-己糖及乳糖基-N-新己糖所组成的群组。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含藉由微滤进行澄清的第一步骤。
24.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含藉由离心进行澄清的第一步骤。
25.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含藉由絮凝进行澄清的第一步骤。
26.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含藉由超滤进行澄清的第一步骤。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含超滤。
28.如权利要求26或27中任一项所述的方法，其中在该步骤i)中，该超滤的截留分子量(molecular weight cut-off)等于或高于1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kda、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中该步骤i)包含两次连续的超滤，且其中第一次超滤的膜截留分子量(membrane molecular weight cut-off)高于第二次超滤的膜截留分子量。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中该步骤ii)包含纳米过滤及/或电渗析。
31.如权利要求30所述的方法，其中纳米过滤及/或电渗析进行两次。
32.如权利要求31所述的方法，其中纳米过滤及/或电渗析步骤连续进行。
33.如权利要求26至32中任一项所述的方法，其中该步骤i)的超滤渗透物在该步骤ii)中进行纳米过滤及/或电渗析。
34.如权利要求1至22、26至33中任一项所述的方法，其中该步骤i)为超滤，该步骤ii)为纳米过滤及/或电渗析处理与阳离子交换处理相结合。
35.如权利要求34所述的方法，其中阳离子交换处理之前为超滤，之后为纳米过滤及/或电渗析。
36.如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中该步骤ii)中该纳米过滤膜的截留分子量低于该步骤i)中该超滤纳米过滤膜的截留分子量。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中阳离子交换处理是强酸性阳离子交换处理，较佳为H+形式、K+或Na+形式的强阳离子交换树脂处理。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中将阳离子交换处理的洗脱液的pH值控制在4和7之间，较佳为通过磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸的方式。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，不包括电渗析。
40.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中该步骤ii)包含电渗析。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中该纯化步骤i)至iii)中的至少一个在该方法期间重复至少一次。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中在至少一个纯化步骤i)或ii)之后；将该寡糖溶液进行渗滤及/或浓缩，较佳为通过纳米过滤膜，更佳为通过尺寸筛除限制小于或等于20A的纳米过滤膜，其中最佳为将该溶液进行渗滤，直至达成导电率小于或等于15mS/cm、较佳为小于或等于10mS/cm、更佳为小于或等于5mS/cm。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液具有约8至约75％的白利糖度值(Brix value)，较佳为该纯化寡糖溶液具有约30至约65％的白利糖度值。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进行无菌过滤及/或经过内毒素去除，最佳为通过3kDa的过滤器将纯化寡糖溶液进行过滤。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中步骤i)之前进行酶处理。
46.如权利要求45所述的方法，其中该酶处理包括通过一或多种选自由糖苷酶、乳糖酶、b-半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、唾液酸酶、麦芽糖酶、淀粉酶、己糖胺酶、葡萄糖醛酸酶、海藻糖酶和转化酶所组成的群组的酶与培养液进行培养。
47.如权利要求45或46中任一项所述的方法，其中该酶处理将乳糖及/或蔗糖转化为单糖。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中该方法还包括脱色。
49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液的灰分含量低于10％(以总干燥固体计)，较佳为铅含量低于0.1mg/kg的干燥固体，砷含量低于0.2mg/kg的干燥固体，镉含量低于0.1mg/kg的干燥固体及/或汞含量低于0.5mg/kg的干燥固体。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液具有低于100mg/kg干燥固体的蛋白质含量、低于10ng/g干燥固体的DNA含量及/或低于10000EU/g干燥固体的内毒素含量，较佳地，纯化寡糖溶液不含DNA、蛋白质及/或重组遗传物质。
51.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵包括至少一种细胞，其中该至少一种细胞是细菌、真菌、酵母、植物、动物或原生动物细胞的细胞，该细胞较佳为微生物的细胞，其中该微生物是细菌，较佳为大肠杆菌菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳地该大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655。
52.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵包括至少一种细胞，其中该至少一种细胞是酵母细胞。
53.如权利要求52所述的方法，其中该酵母选自由酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊氏酵母菌属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母菌属(Pichia)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、许旺氏酵母菌属(Schwanniomyces)、有圆孢酵母菌属(Torulaspora)、耶氏酵母菌属(Yarrowia)和接合酵母菌(属Zygosaccharomyces)所组成的群组；较佳为选自由酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊氏酵母菌(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母菌(Pichia methanolica)、树干毕赤酵母菌(Pichia stipites)、博氏念珠菌(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)、戴尔孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)及拜耳接合酵母菌(Zygosaccharomyces bailii)所组成的群组。
54.如权利要求1至53中任一项所述的方法，其中该细胞培养或微生物发酵包括至少一种细胞，其中该至少一种细胞是微生物的该细胞，其中该微生物是乳糖渗透酶阳性表型的大肠杆菌或酵母，其中该乳糖渗透酶分别由基因LacY或LAC12编码。
55.如权利要求1至54中任一项所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进一步浓缩成至少40％为干燥物质的糖浆，将该纯化寡糖溶液进行结晶或将该纯化寡糖溶液进行干燥成粉末。
56.如权利要求1至55中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括使用真空蒸发或逆渗透或纳米过滤a)使寡糖浓度>100g/L，较佳为>200g/L，更佳为>300g/L，更佳为>400g/L，更佳为>500g/L，更佳为>600g/L，最佳为300g/L至650g/L之间；及/或b)在真空蒸发或逆渗透的过程中，温度为<60℃，较佳为<50℃，更佳为20℃至50℃之间，甚至更佳为30℃至45℃之间；及/或c)温度为<80℃，较佳为<50℃，更佳为20℃至50℃之间。
57.如权利要求1至55中任一项所述的方法，其中该纯化寡糖溶液包括一种寡糖并浓缩至>1.5M的浓度且冷却至<25℃，更佳为<8℃的温度，以获得该寡糖的结晶材料。
58.如权利要求1至55中任一项所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进行干燥。
59.如权利要求58所述的方法，其中该干燥步骤包括喷雾干燥、冷冻干燥(lyophilization)、蒸发、沉淀、喷雾冷冻干燥(spray freeze drying)、冷冻喷雾干燥、带式干燥(band drying或belt drying)、真空带式干燥(vacuum band drying或vacuum beltdrying)、滚筒式干燥(drum drying或roller drying)、真空滚筒式干燥(vacuum drumdrying或vacuum roller drying)及其他干燥方式中的一或多种。
60.如权利要求59所述的方法，其中将该纯化寡糖溶液进行喷雾干燥。
61.如权利要求59所述的方法，其中该干燥步骤为将该纯化寡糖溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥并且较佳地其中溶液的pH为低于5.0。
62.如权利要求58-61中任一项所述的方法，其特征在于将该纯化溶液进行喷雾干燥，特别是在20-60(w/v)、较佳为30-50(w/v)、更佳为35-45(w/v)的寡糖溶液浓度下，以及在110-150℃、较佳为120-140℃、更佳为125-135℃的喷嘴温度及/或60-80℃、较佳为65-70℃的出口温度进行喷雾干燥。
63.根据如权利要求1至62中任一项所述的方法获得的纯化寡糖溶液、寡糖或寡糖混合物。
64.通过如权利要求1至62中任一项所述的方法所生产的寡糖，其中将该寡糖溶液较佳为进行喷雾干燥、冻干或结晶。
65.通过如权利要求1至62中任一项所述的方法所生产的寡糖混合物，其中将该寡糖溶液较佳为进行喷雾干燥、冻干或浓缩成至少40％为干燥物质的糖浆。
66.一种寡糖溶液，其是通过培养或发酵所产生的，其中将该寡糖溶液在没有阴离子交换的情况下进行纯化，并且其中该寡糖溶液含有少于10％的灰分。
67.一种喷雾干燥的寡糖或寡糖混合物，其是通过培养或发酵所产生的，其中将该寡糖或寡糖混合物在没有阴离子交换的情况下进行纯化，并且其中该喷雾干燥的寡糖或寡糖混合物含有少于10％的灰分。
68.一种干燥粉末，其是利用如权利要求58至62中任一项所述的方法获得，其中该干燥粉末含有≤15重量％的水、较佳为≤10重量％的水、更佳为≤7重量％的水、最佳为≤5重量％的水。
69.如权利要求58-62中任一项所述的方法获得的一种喷雾干燥粉末，其中该喷雾干燥粉末的平均粒径为50-250μm，由激光衍射测定；较佳为粉末具有95至120μm的平均粒径，更佳为粉末具有110至120μm的平均粒径。
70.如权利要求58至62中任一项所述的方法获得的干燥粉末，其中该干燥粉末展现出：
约500至700g/L的松散体积密度(loose bulk density)，
约600至约850g/L的100倍振实体积密度(tapped bulk density)，
约600至约900g/L的625x振实体积密度，及/或
约650至约900g/L的1250x振实体积密度。
71.如权利要求70中所述的方法获得的干燥粉末，其中该干燥粉末展现出：
约600至700g/L的松散体积密度，
约750至约850g/L的100倍振实体积密度
约750至约850g/L的一625x振实体积密度，及/或
约850至约900g/L的1250x振实体积密度。
72.如权利要求70中所述的方法获得的干燥粉末，其中该干燥粉末展现出：
约500至600g/L的松散体积密度，
约600至约700g/L的100倍振实体积密度
约700至约800g/L的625x振实体积密度，及/或
约750至约800g/L的1250x振实体积密度。
73.如权利要求64、65、67至72中任一项所述的干燥粉末，其中当该干燥粉末以10％(体积质量)的浓度重新溶解在水中时提供具有4至7之间的pH值、较佳为具有4至6之间的pH值的溶液。
74.如权利要求63、64或67至73中任一项所述的寡糖，其中该寡糖是哺乳类乳寡糖，较佳为人类乳寡糖(human milk oligosaccharide；HMO)。
75.如权利要求64、65或67至73中任一项所述的寡糖混合物，其中该寡糖混合物包含哺乳类乳寡糖，较佳为人类乳寡糖(human milk oligosaccharide；HMO)。
76.如权利要求74或75中任一项所述的HMO，其中该乳寡糖为中性HMO，较佳为选自由2′-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、2′,3-双岩藻基乳糖、乳糖基-N-丙糖II、乳糖基-N-丁糖、乳糖基-N-新丁糖、乳糖基-N-岩藻糖基戊糖I、乳糖基-N-新岩藻基戊糖、乳糖基-N-岩藻基戊糖II、乳糖基-N-岩藻基戊糖III、乳糖基-N-岩藻基戊糖V、乳糖基-N-新岩藻基戊糖V、乳糖-N-双岩藻基己糖I、乳糖-N-双岩藻基己糖II、6′-半乳糖基乳糖、3′-半乳糖基乳糖，乳糖基-N-己糖及乳糖基-N-新己糖所组成的群组。
77.如权利要求63至70中任一项所述的寡糖或寡糖混合物，其中该寡糖或寡糖混合物a)在300g/l溶液中具有小于1mS/cm的导电率；b)不含重组DNA材料，可视需要不含任何DNA；及/或c)不含源自重组微生物的蛋白质，可视需要不含任何蛋白质。
78.如权利要求63至77中任一项所述的寡糖或寡糖混合物在医药的用途，最佳为用于预防或治疗胃肠道疾病。
79.如权利要求1至62中任一项所述的方法获得的纯化寡糖在食品或饲料制备、膳食补充品、化妆品成分或药物成分中的用途。
80.如权利要求63至77中任一项所述的纯化寡糖溶液在食品或饲料制备、膳食补充品、化妆品成分或药物成分中的用途。
81.如权利要求79或80中任一项所述的用途，其中该食品是人类食品，更佳为婴儿食品及/或婴儿补充品。
82.如权利要求74至76中任一项所述的HMO作为食品添加剂的用途，较佳为作为人类食品及/或宠物食品的添加剂，更佳为作为人类婴儿食品的添加剂。
83.如权利要求79或80中任一项所述的用途，其中该饲料是宠物食品、动物代乳品、兽医用产品、断奶后饲料或教槽饲料。
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