TW202219275A

TW202219275A - 在細胞中之含有ＧｌｃＮＡｃ的生物產品的產生

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Publication number: TW202219275A
Application number: TW110129455A
Authority: TW
Inventors: 蘇菲艾斯艾特; 喬瑞博普雷茲; 彼得考斯蒙特; 托馬斯德科恩; 娜烏西卡蘭諾; 格特彼得斯; 克里斯托夫范德瓦勒; 安妮莉絲維考特倫
Original assignee: 比利時商因比奥斯公司
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2021-08-10
Publication date: 2022-05-16

Abstract

本發明是屬於合成生物學和代謝工程之技術領域。更具體而言，本發明是屬於代謝工程細胞的發酵之技術領域。本發明描述藉由細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺的雙醣或寡醣，且自培養物純化該雙醣或寡醣之方法。此外，本發明提供一種用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺的雙醣或寡醣之代謝工程細胞。

Description

在細胞中之含有GlcNAc的生物產品的產生

本發明是屬於合成生物學和代謝工程之技術領域。更具體而言，本發明是屬於代謝工程細胞的發酵之技術領域。本發明描述一種藉由細胞產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元（N-acetylglucosamine unit）的雙醣或寡醣以及從培養物中純化該雙醣或寡醣的方法。此外，本發明提供一種代謝工程化的細胞，其用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。

碳水化合物經常以蛋白質和脂質的醣-共軛形式存在，參與許多重要現象，例如與受精、胚胎發生、發炎、轉移（metastasis）和宿主病原體黏附的發展和進程相關的分化、發展和生物識別過程。碳水化合物也可於體液和母乳中以未共軛的聚醣存在，其中其亦調節重要的發展及免疫過程（Bode, Early Hum. Dev. 1-4 （2015）；Reily et al., Nat. Rev. Nephrol. 15, 346-366 （2019）；Varki, Glycobiology 27, 3-49 （2017））。

雙醣Galβ1,3GlcNAc，亦稱為lacto-N-biose、LNB、第1型N-乙醯乳糖胺（ N-acetyllactosaminetype 1）或第1型LacNAc，其由β-1,3連接至N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）的半乳糖組成。GlcNAc存在於雙醣的還原端。LNB已知是幾種重要血型表位的前驅物，例如路易斯（Lewis）A、路易斯B或唾液酸化路易斯A。含有聚醣的第1型LacNAc亦在腫瘤轉移中具有重要的作用，因此被視為腫瘤標誌物（Fischöder et al., Molecules 22, 1320 （2017））。它們也是黏蛋白型醣蛋白的重要成分。廣布的雙醣Galβ1,4GlcNAc，亦稱為N-乙醯乳糖胺、LacNAc或第2型LacNAc，其由β-1,4連接至N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）的半乳糖組成。同樣地，GlcNAc存在於雙醣的還原端。LacNAc經常在癌細胞表面過度表現，在癌細胞表面其與腫瘤分泌的半乳糖凝集素（galectins）結合，以促進癌症相關過程，如轉移、黏附、腫瘤存活及免疫逃脫（Romano and Oscarson, Org. Biomol. Chem. 17, 2265-2278 （2019））。LacNAc亦為路易斯X、路易斯Y和唾液酸化路易斯X表位的一部分。第1型（Galβ1,3GlcNAc）及第2型（Galβ1,4GlcNAc）兩者的二聚及延長的LacNAc結構和聚-N-乙醯乳糖胺（poly-LacNAc）通常與發炎進程及癌症相關。雙醣LNB和LacNAc及其部分和路易斯型表位亦存在於人乳中，作為人乳寡醣(HMO)組合物的一部分（Prudden et al., PNAS USA 114, 6954-6959 （2017））。存在於結腸中的部分的雙叉乳桿菌（ Bifidobacterium）物種能夠特定消耗HMO，例如LNB或含有醣類的LNB。一些乳酸桿菌（lactobacilli）（例如乾酪乳桿菌（ L. casei））已顯示可以在泌乳早期代謝人乳中存在的LacNAc雙醣（Bidart et al., Sci. Rep. 8, 7152（2018））。因此，乳酸桿菌和雙叉乳桿菌佔母乳餵養的嬰兒的總腸道菌相（total gut flora）達90%（Fischöder et al., Molecules 22, 1320 （2017））。

由於這些在還原端具有GlcNAc的雙醣及寡醣參與大量（plethora）的重要進程，因此有許多製藥及營養品關注在開發新型N-乙醯乳糖胺類（第1型或第2型）的治療劑或有益的營養化合物。相當多的努力投入在發展聚醣（如雙醣LNB和LacNAc）或在還原端含有LNB或LacNAc的聚醣的合成製程上。

化學合成方法是費力和費時的，而且由於涉及大量的步驟，其很難進行擴大規模。生物催化方式提供許多優勢，因此有大量與產生LNB、LacNAc及其變體有關的公開。Bayón et al. (RSC Advances 3(30) （2013）)報告使用來自環狀芽孢桿菌（ Bacillus circulans）的經純化β-Gal-3半乳糖苷酶，以自補充有p-NP-Gal作為供給者且補充有GlcNAc作為接受者的生質中產生LNB。專利申請案JP2017195793A另一種半乳糖苷酶，由一種芽孢桿菌（Bacillus species）重組產生並從芽孢桿菌中純化，以用於經由水解體外合成例如LNB的半乳寡醣（galacto-oligosaccharide）。其他報告利用來自雙歧桿菌（Bifidobacteria）的LNB磷酸化酶，在從蔗糖和補充GlcNAc起始的酶反應混合物，另外補充有蔗糖磷酸化酶、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶（UDP-glucose-hexose-1-phosphate uridylyltransferase）和UDP-葡萄糖4-表異構酶（UDP-glucose 4-epimerase），以產生LNB（Nishimoto and Kitaoka, Biosci. Biotechnol. Biochem. 71, 2101-2104 （2007）；Nishimoto, Biosci. Biotechnol. Biochem. 84, 17-24 （2020）；US2010120096A; JP4264742 B2；JP2005341883 A2）。並且，提出一種使用含有半乳糖、GlcNAc、半乳糖激酶與LNB磷酸化酶一起的體外反應混合物（CN110527704 A）。經常報導的另一種作用方式是利用偶合偶接以進行催化轉化。在這樣的例子中，表現參與本發明的醣類催化途徑的酶的幾個重組細菌菌株被培育和裂解，以獲得分解反應混合物中必要的酶。專利申請案JP2013201913的發明人描述了在含有補充蔗糖、GlcNAc、磷酸鹽、UDP-葡萄糖及/或UDP-半乳糖的混合物中，將布氏雙叉乳桿菌（ Bifidobacterium breve）MCC1320或嬰兒雙叉乳桿菌菌株（ Bifidobacterium infantisstrain）和長雙叉乳桿菌菌株（ B. longumstrain）一起偶合使用，而分別表現LNB磷酸化酶和蔗糖磷酸化酶，以製造LNB。Endo和共同工作者甚至報告三個細菌菌株的偶合使用，即用於過度表現來自淋病雙球菌（ Neisseria gonorrhoeae）的galT、galK、galU、ppa和lgtB的兩個重組大腸桿菌菌株以及用於產生UTP的產胺棒狀桿菌（ Corynebacterium ammoniagenes）菌株，以在補充半乳糖和GlcNAc的反應中製造LacNAc（Endo et al., Carb. Res. 316(1-4), 179-183 （1999））。同一小組描述了一個類似的偶合系統，其中一種大腸桿菌菌株表現來自幽門螺旋桿菌（ H. pylori）的β1,4-galT，而不是NgLgtB，以參與酶的轉換，輔以額外的GlcNAc，以產生LacNAc（Endo et al., Glycobiology 10(8), 809-813（2000））。腦膜炎雙球菌（ N. meningitidis）的NmLgtB酶（Wakarchuk et al., Protein Engineering, Design and Selection 11(4), 295-302 （1998））也經常被選殖與來自大腸桿菌或嗜熱鏈球菌（ Streptococcus thermophilus）的galE一起作為融合蛋白的一部分，以用於在額外的GlcNAc反應中合成LacNAc類寡醣（Blixt et al., J. Org. Chem. 66(7), 2442-2448 (2001); Ruffing et al., Metab. Eng. 8(5), 465-473 （2006）；Mao et al., Biotechnol. Prog. 22(2), 369-374 （2006））。在路易士X表位的合成方法中也描述了細菌偶合，也被稱為3'-岩藻糖基化（3’-fucosylated）的LacNAc（Koizumi et al., J. Ind. Microbiol. Biotech. 25, 213-217 （2000））。

上述方法通常存在以下問題：醣基轉移酶及/或醣基水解酶的可用性及/或穩定性相對較差，對最佳化學計算平衡的要求、需要原位再生核苷酸-糖、添加多種反應化合物，例如包括GlcNAc或在其還原端含有GlcNAc的寡醣的接受者，以及需要培育不同的產生生物體，這些生物體分別產生一或多種催化轉換中所必需的酶或融合酶。這些列舉中最重要的障礙是包括GlcNAc或在其還原端含有GlcNAc的寡醣的主接受者的細胞合成。在提到的例子中，用於合成LNB、LacNAc或在其還原端具有GlcNAc的寡醣的GlcNAc單醣被外部補充到相關的反應或細胞中。

Bettler和共同工作者描述了六醣βGal(1,4)[βGlcNAc(1,4)] ₄GlcNAc的產生，其在沒有補充GlcNAc的情況下以單一細胞所構建（Bettler et al., Glycoconj. J. 16, 205-212 （1999））。此種六醣在其還原端具有GlcNAc單元，在其非還原端具有終端LacNAc部分。為此，在一個重組的大腸桿菌細胞中，來自細菌性固氮根瘤菌屬（ Azorhizobium）的NodC酶（β1,4-GlcNAc-寡醣合成酶）與來自腦膜炎雙球菌的LgtB 酶（β(1,4)-半乳糖基轉移酶(β(1,4)-galactosyltransferase)）共同表現。然而在這個例子中，存在於這種六醣中，並且在其還原端具有GlcNAc的甲殼素結構(GlcNAc-GlcNAc) _n是藉由UDP-GlcNAc部分的連接而產生。Bettler和共同工作者亦描述在類似的系統中，以重組大腸桿菌細胞共同表現NodC、LgtB和牛a1,3-半乳糖基轉移酶GstA而產生在其還原端含有GlcNAc的異種移植抗原Galα1,3Galβ1,4[βGlcNAc(1,4)] ₄GlcNAc（Bettler et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 302(3), 620-624 （2003））。同樣，甲殼素結構和存在於七醣中的LacNAc部分是由UDP-GlcNAc部分替代非活化的GlcNAc的使用而構建。Deng和共同工作者描報告了使用重組大腸桿菌細胞經由發酵成功產生GlcNAc的情況（Deng et al., Metab. Eng. 7, 201-214 （2005）； EP1576106）。在Deng和共同工作者開發的微生物系統中，GlcNAc是在大腸桿菌細胞的細胞外，更具體而言，是在大腸桿菌的周質（periplasm）中，經由在輸出GlcNAc-6-磷酸鹽的過程中對後者去磷酸化時產生。因此，獲得的GlcNAc部分不能再用於細胞內的轉化，如進一步的醣化，而其為製造本發明的醣類所需。另外，Deng和共同工作者所描述的過程需要兩階段餵養批次系統，其需要精確的控制以使磷酸化胺基糖對產生宿主的抑制作用最小化，其使得該過程對產生高力價的（細胞外）GlcNAc不具商業價值。

本發明克服上述問題，由於其提供一種在相對容易情況下產生所欲產品之方法及細胞，且若需要，可進行連續產生。

令人驚訝的是，現已發現可由單一細胞產生GlcNAc，並由同一細胞進一步將此GlcNAc單醣醣化，以製造在其還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣。本發明提供了一種由細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之方法。該方法包括以下步驟：提供能夠合成核苷酸-糖的細胞，以合成GlcNAc，以使該GlcNAc單醣醣化。本發明亦關於一種藉由在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞，以產生還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣之方法。並且，本發明還提供了從培養物中分離該雙醣或寡醣之方法。此外，本發明提供一種經過代謝工程的細胞，其用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。

定義

本說明書中用來描述本發明及其各項實施例之字詞不僅應被理解為其等通常定義含義之意義，而且在本說明書中藉由特殊定義包含超出通常定義含義之範疇之結構、材料及動作。因此，若一元件在本說明書之內文中可被理解為包含一個以上含義，則其在一發明申請專利範圍中之使用必須被理解為對於由說明書及其字詞本身支援之所有可能含義的通用。

此處揭露的本發明的各種實施例和實施例的各態樣不僅應按照本說明書中具體描述的順序和上下文來理解，而且應包括任何順序和其任何組合。只要上下文需要，所有用於單數的字詞應被視為包括複數，反之亦然。除非另有定義，本文中所用的所有技術和科學用語通常具有如所屬技術領域中具通常知識者所通常理解的涵義相同。一般而言，本文使用的用語和細胞培養、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜交的實驗室程序是所屬技術領域已知且普遍採用。標準技術用於核酸和胜肽的合成。一般而言，純化步驟是根據製造商的說明書進行。

在說明書中，已揭露本發明的實施例，而儘管使用特定的用語，這些用語只於描述性的意義使用，而不意圖為限制，本發明的範圍由以下的發明申請專利範圍所闡述。應理解的是，圖示的實施例只為了舉例說明的目的，不應該被視為對本發明的限制。對於所屬技術領域中具通常知識者而言顯而易見的是，可與本文內發明的文字和精神一致並在本發明的範圍內進行修飾、其他實施例、改善、細節及用途，其僅受發明申請專利範圍的限制，並根據專利法，包括等效物原則進行解釋。在以下的發明申請專利範圍中，所提供用於指定發明申請專利範圍步驟的參考特徵只為了方便描述，而不表示執行步驟的任何特定順序。

在本文及其發明申請專利範圍中，動詞「包括（to comprise）」及其詞形變化在其非限制性意義上使用，意味著該字詞後面的項目被包括在內，但未具體提及的項目不被排除。在本申請中，動詞「包括」可以用「構成（to consist）」或「實質上構成（to consist essentially of）」來代替，反之亦然。此外，動詞「構成（to consist）」可以由「實質上構成（to consist essentially of）」代替，其表示本文定義的組合物可包括比具體確定的成分更多的成分，該額外成分不會改變本發明的獨特特徵。此外，以不定冠詞「一（a）」或「一（an）」提到一個元件並不排除存在一個以上的元件的可能性，除非上下文明確要求存在一個且只有一個元件。因此，不定冠詞「一（a）」或「一（an）」通常表示「至少一個（at least one）」。

在本申請中，除非另有明確說明，冠詞「一（a）」及「一（an）」較佳由「至少二個（at least two）」取代，更佳由「至少三個（at least three）」取代，再更佳由「至少四個（at least four）」取代，再更佳由「至少五個（at least five）」取代，再更佳由「至少六個（at least six）」取代，最佳由「至少二個（at least two）」取代。

在本申請中，除非另有明確說明，否則「合成（synthesize）」、「合成（synthesized）」和「合成（synthesis）」的特徵分別可與「產生（produce）」、「產生（produced）」和「產生（production）」的特徵互換使用。

除非另有說明，否則本文所確定的各實施例都可組合在一起。此說明書中提到的所有公開、專利、及專利申請案在此藉由參照而併入，其程度與每個單獨的公開、專利、或專利申請案被具體和單獨指定為藉由參照而併入相同。優先權申請案的全部內容，包括EP20190198、EP20190200和EP20190206亦藉由參照而併入，其程度與該優先權申請案被具體和單獨指示以引用方式併入一樣。

根據本發明，用語「多核苷酸（polynucleotide(s)）」通常是指任何多核肽酸（polyribonucleotide）或聚去氧核糖核苷酸（polydeoxyribonucleotide），其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。「多核苷酸」包括但不限於單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區域或單鏈、雙鏈和三鏈區域的混合的DNA、以及單鏈和雙鏈RNA及單雙鏈區域混合的RNA、包括可為單鏈或更典型的雙鏈或三鏈區、或單鏈及雙鏈區域的混合之DNA和RNA的混合分子（hybrid molecules）。此外，本文所用的「多核苷酸」是指包括RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三鏈區域。這些區域的鏈可以來自同一個分子，也可以來自不同的分子。這些區域可以包括一個或多個分子的全部，但更典型的是只關於一些分子的區域。三螺旋區域的分子之一經常是寡核苷酸。如本文所用的用語「多核苷酸」也包括上述含有一個或多個修飾鹼基的DNA或RNA。因此，根據本發明，為了穩定性或其他原因而修飾了骨架的DNA或RNA是「多核苷酸」。此外，包含特殊鹼基（unusual bases）（如肌苷）或經修飾的鹼基（如三苯甲基化鹼基（tritylated bases））的DNA或RNA應理解為涵蓋在用語「多核苷酸」中。可以理解的是，已經對DNA和RNA進行了各種各樣的修飾，這些修飾可用於所屬技術領域中具通常知識者已知的許多有用目的。本文使用的用語「多核苷酸」包括多核苷酸的此種化學、酶或代謝修飾形式，以及病毒和細胞（包括例如，簡單及複雜細胞）所特有的DNA和RNA的化學形式。用語「多核苷酸」亦包括經常被稱為寡核苷酸的短多核苷酸。

「多肽（Polypeptide(s)）」是指包含藉由肽鍵或修飾的肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。「多肽」既指短鏈（通常稱為肽、寡肽和寡聚物），也指長鏈（通常稱為蛋白質）。多肽可含有20種基因編碼胺基酸以外的胺基酸。「多肽」包括通過藉由過程（例如加工和其他轉譯後修飾）修飾的多肽，也包括藉由化學修飾技術修飾的多肽。這樣的修飾已在基礎教科書和更詳細的專著中以及多卷研究文獻中充分描述，並且其對於所屬技術領域中具通常知識者是已知的。相同類型的修飾可以相同的程度或不同的程度存在於給定多肽中的數個位點上。此外，給定的多肽可包含許多類型的修飾。修飾可以在多肽的任意位置發生，包括肽主鏈、胺基酸側鏈和胺基末端或羧基末端。修飾包括，例如，乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素（flavin）的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂醯肌醇的共價連接、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化作用、共價交聯的形成、焦穀胺酸的形成、甲醯化作用、γ-羧基化、醣化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯化（myristoylation）作用、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化（prenylation）、外消旋化、脂質連接、硫化、麩胺酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化、硒化(selenoylation)、轉移RNA介導的向蛋白添加胺基酸（例如精胺酸化）和泛蛋白化（ubiquitination）。多肽可以是分支的或有或無分支的環狀。環狀、分支的和分支環狀的多肽可以由後轉譯天然過程形成，並且也可以藉由完全合成法製得。

本文所用的用語「編碼多肽的多核苷酸」涵蓋包含編碼本發明多肽的序列的多核苷酸。該用語亦涵蓋包括編碼多肽的單一連續區域或不連續區域（例如，被整合的噬菌體或插入序列或編輯所間隔)以及也可含有編碼及/或非編碼序列的附加區域之多核苷酸。

「分離（Isolated）」表示「經人之手」改變了其自然狀態，亦即，若其在自然界中出現，則已經被改變或從其原來的環境中移走，或兩者都是。例如，自然存在於生物體內的多核苷酸或多肽不是「分離的」，但從其自然狀態的共存材料中分離出來的同一多核苷酸或多肽是「分離的」，正如本文所使用的用語。同樣地，如本文所用的「合成（synthetic）」序列表示以合成方式產生的任何序列，而不是直接從天然來源中分離出來。如本文所用「經合成的（Synthesized）」一詞表示任何合成產生的序列，而不是直接從自然來源中分離出來。

用語「重組（recombinant）」或「基因轉殖（transgenic）」或「代謝工程（metabolically engineered）」或「基因改造（genetically modified）」，在本文提及細胞或宿主細胞時可互換使用，並表示細菌細胞複製異源核酸，或表現由異源核酸編碼的胜肽或蛋白質（即，「對該細胞而言是外來的」序列或「對該細胞中的該位置或環境而言是外來的」序列）。這種細胞被描述為用至少一個異源或外源基因進行轉形，或被描述為藉由引入至少一個異源或外源基因進行轉形。代謝工程或重組或基因轉殖細胞可包含在細胞的原始（非重組）形式中沒有的基因。重組細胞也可包含在原生形式的細胞中發現的基因，其中基因被修飾並藉由人工手段重新引入細胞中。這些用語亦涵蓋含有細胞內源性核酸的細胞，該核酸已被修飾、或其表現或活性已被修飾，而沒有從細胞中移除核酸；這種修飾包括藉由基因取代、取代啟動子、特定位突變；以及相關技術獲得的修飾。因此，「重組多肽（recombinant polypeptide）」是一種由重組細胞產生的多肽。本文所用的「異源序列（heterologous sequence）」或「異源核酸（heterologous nucleic acid）」是指來自特定細胞以外的起源（例如來自不同的物種），或者若為同一來源，則從其原始形式或在基因組中的位置被修飾。因此，與啟動子可操作連接的異源核酸的來源與衍生的啟動子的來源不同，或者若為同一來源，則從其原始形式或在基因組中的位置進行了修飾。異源序列可藉由例如轉染、轉形、共軛或轉導等方式穩定地引入到宿主微生物細胞的基因組中，其中可應用的技術將取決於細胞和待引入的序列。各種技術是所屬技術領域中具通常知識者已知，且例如，描述在Sambrook等人的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989）。在本發明內容中內使用的用語「突變（mutant）」細胞或微生物是指經過基因改造的細胞或微生物。

在本發明內容中內使用的用語「用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣或寡醣之細胞基因改造」是指在一或多種選自包括以下群組的酶的表現或活性方面進行基因改造的微生物細胞：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase）、磷酸酶（磷酸酶）、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸轉胺酶（L-glutamine—D-fructose-6-phosphate aminotransferase）及UDP-葡萄糖4-表異構酶。

在本發明內容的上下文中，用語「內源性（endogenous）」是指任何多核苷酸、多肽或蛋白質序列，其是細胞的天然部分並且存在於其在細胞染色體中的天然位置，與作用於其表現的自然控制機制相比，其表現控制沒有被改變。用語「外源性（exogenous）」是指任何多核苷酸、多肽或蛋白質序列，其來源於所研究的細胞外部，並且不是細胞的天然部分，或不存在於細胞染色體或質體中的其天然位置。

用語「異源（heterologous）」當用於提及多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶時，是指來自或衍生自宿主物種以外的來源的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相反，本文使用的「同源（homologous）」多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶來表示衍生自宿主生物體物種的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。當提及用於維持或操縱基因序列的基因調控序列或輔助核酸序列（例如，啟動子、5'非轉譯區域、3'非轉譯區域、poly A附加序列、內含子序列、剪接位點、核糖體結合位點、內部核糖體進入序列、基因組同源區域、重組位點等）時，「異源」是指調控序列或輔助序列與在構建體、基因組、染色體或附加體中與調控或輔助核酸序列並列（juxtaposed）的基因不天然相關聯。因此，在本文中所謂的「異源啟動子」是指可操作地連接至在其天然狀態下（即，在非基因工程生物體的基因組中）不是可操作地連接的基因的啟動子，即使該啟動子可衍生自與其所連接的基因相同的物種（或在一些情況下，同一個生物體）。

用語蛋白質或酶的「修飾活性（modified activity）」是關於與該蛋白質或酶的野生型（即，天然）的活性相比，該蛋白質或酶的活性發生變化。與蛋白質或酶的野生型活性相比，該修飾活性可以是該蛋白質或酶的破壞（abolished）、受損、減少或延遲的活性，但也可以是與蛋白質或酶的野生型活性相比，該蛋白質或酶的加速或增強的活性。蛋白質或酶的修飾活性是藉由修飾該蛋白質或酶的表現而獲得或藉由表現經修飾，即突變形式的蛋白質或酶而獲得。酶的修飾活性進一步關於在酶的顯著的米氏（Michaelis）常數Km及/或顯著的最大速度（Vmax）的改變。

用語基因的「修飾表現（modified expression）」是關於在編碼蛋白質的產生過程的任何階段與該基因的野生型相比的表現變化。與野生型相比，該修飾表現是較低或較高的表現，其中用語「較高的表現（higher expression）」是指在內源基因的情況下也被定義為該基因的「過度表現（過度表現）」，或在野生型菌株中不存在的異源基因的情況下「表現」。較低的表現或減少的表現是藉由對所屬技術領域中具通常知識者而言通常已知的技術（如使用siRNA、CrispR、CrispRi、核糖開關、重組、同源重組、ssDNA突變誘發（mutagenesis）、RNAi、miRNA、asRNA、突變基因、敲除基因、轉位子突變誘發..）所獲得，該技術用於改變基因，使其能力較差（less-able）（即，與功能性野生型基因相比，在統計學上顯著地「能力較差」）或完全不能（如敲除的基因）產生功能性最終產物。本文所用的用語「核糖開關（riboswitch）」定義為訊息RNA的一部分，其折疊成複雜的結構，以藉由干擾轉譯而阻止表現。效應分子的結合誘導構象變化，其允許後轉錄地（post-transcriptionally）調節表現。除了以上述方式改變感興趣的基因以獲得較低的表現外，亦可藉由改變轉錄單元、啟動子、非轉譯區、核糖體結合位點、Shine Dalgarno序列或轉錄終止子獲得較低的表現。例如，可以藉由突變啟動子序列中的一個或多個鹼基對或將啟動子序列完全改變為與野生型相比具有較低表現強度的持續型（constitutive）啟動子或導致調節表現的誘導型（inducible）啟動子或導致調節表現的抑制型（repressible）啟動子來獲得較低表現或減少的表現。過量表現或表現是對所屬技術領域中具通常知識者而言通常已知的技術（例如，使用人工轉錄因子、重新設計（de novo design）啟動子序列、核糖體工程、在真染色質上引入或再引入表現模組，高複製數的質體的使用）而獲得，其中該基因是「表現盒（expression cassette）」的一部分，其關於任何序列，其中存在啟動子序列、非轉譯區域序列（含有核糖體結合序列、Shine Dalgarno或Kozak序列）、編碼序列及可選的轉錄終止子，並導致功能性活性蛋白的表現。該表現是持續性的或調節性的。

用語「持續型表現（constitutive expression）」定義為在一些生長條件下不受除RNA聚合酶的子單元以外的轉錄因子（如σ ⁷⁰、σ ⁵⁴或相關的細菌σ因子以及與RNA聚合酶核心酶共同關聯的酵母粒線體RNA聚合酶特異性因子MTF1）調節的表現。這種轉錄因子的非限制性例子是大腸桿菌中的CRP、LacI、ArcA、Cra、IclR，或啤酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）中的Aft2p、Crz1p、Skn7，或枯草芽孢桿菌（ B. subtilis）中的DeoR、GntR、Fur。這些轉錄因子結合在一個特定的序列上，在一些生長條件下可能阻止或促進表現。RNA聚合酶是由DNA模板合成RNA的催化機。RNA聚合酶結合特定的序列以起始轉錄，例如在原核生物宿主中經由σ因子或在酵母中經由MTF1。持續型表現提供了一個恆定的表現水準，不需要誘導或抑制。

用語「調節表現（regulated expression）」定義為在一些生長條件下由RNA聚合酶的子單元以外的轉錄因子（例如細菌σ因子）調節的表現。這種轉錄因子的例子已於上文描述。常見的表現調節是藉由誘導或抑制的方式獲得，例如但不限於IPTG、阿拉伯糖、鼠李糖（rhamnose）、岩藻糖、異乳糖（allo-lactose）或pH轉變或溫度轉變或碳耗竭或接受者或產生的產物或化學抑制。

用語「由天然誘導物的表現（expression by a natural inducer）」定義為基因的偶發性（facultative）或調節性表現，該基因僅在宿主的某種自然條件下（例如，生物體正在分娩、或在哺乳期）作為對環境變化（例如，包括但不限於激素、熱、冷、pH轉變、光、氧化或滲透壓力/訊號）的反應或取決於該宿主細胞的發育階段或細胞週期的位置（包括但不限於細胞凋亡和自噬）。

用語「化學處理後的誘導性表現（inducible expression upon chemical treatment）」定義為一種基因的偶發性或調節性表現，該基因僅在用化學誘導物或抑制物處理時表現，其中該誘導物和抑制物包括但不限於酒精（如乙醇、甲醇）、碳水化合物（如葡萄糖、半乳糖、甘油、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、異乳糖）、金屬離子（如鋁、銅、鋅）、氮、磷酸鹽、IPTG、乙酸鹽、甲酸鹽、二甲苯。

用語「控制序列（control sequences）」是指由細胞轉錄和轉譯系統識別的序列，其允許將多核苷酸序列轉錄和轉譯成多肽。因此，此DNA序列對於特定的細胞或生物體中可操作結合的編碼序列的表現是必要的。此控制序列可為但不限於啟動子序列、核糖體結合序列、Shine Dalgarno序列、Kozak序列、轉錄終止子序列。例如，適用於原核生物的控制序列包括啟動子、可選的操作子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺核苷酸化訊號和強化子。若作為參與多肽分泌的前蛋白表現，前序列或分泌前導的DNA可與多肽的DNA可操作地結合；若啟動子或強化子影響編碼序列的轉錄，則與編碼序列可操作地結合；或者若核糖體結合位點影響編碼序列的轉錄，則與編碼序列可操作地結合；或者若核糖體結合位點有利於轉譯，則與編碼序列可操作地結合。該控制序列可進一步用外部化學品，例如但不限於，IPTG、阿拉伯糖、乳糖、異乳糖、鼠李糖或岩藻糖經由誘導型啟動子或經由誘導或抑制該多核苷酸轉錄或轉譯成多肽的基因電路（genetic circuit）而進行控制。

一般而言，「可操作地結合（operably linked）」表示連接的DNA序列是連續的，且在分泌前導的情況下，是連續性並且處於閱讀階段（reading phase）。然而，強化子不一定是連續的。

用語「野生型（wild type）」是指自然界中常見的基因或表現型情況。

如本文所用的用語「蛋白質的修飾表現」是指i）內源性蛋白質的較高表現或過度表現，ii）異源蛋白質的表險、或iii）與野生型（即，天然（native））蛋白質相比，具有更高活性的變體蛋白質的表現及/或過度表現。

如本文所用的用語「乳腺細胞（mammary cell(s)）」一般是指乳腺上皮細胞、乳腺上皮管腔細胞（mammary-epithelial luminal cell(s)）或哺乳動物上皮肺泡細胞（mammalian epithelial alveolar cell(s)）或其任意組合。如本文所用的用語「乳腺樣細胞（mammary-like cell(s)）」一般是指具有與天然乳腺細胞相似（或實質上相似）的表型/基因型的細胞，但其衍生自非乳腺細胞來源。如此的乳腺樣細胞可以被改造，以移除至少一種不需要的基因成分及/或包含至少一種乳腺細胞典型的預定遺傳結構。乳腺樣細胞的非限制性例子可包括乳腺樣上皮細胞、乳腺樣上皮管腔細胞、展現乳腺細胞系細胞的一或多個特徵的非乳腺細胞或其任意組合。乳腺樣細胞的進一步非限制性例子可包括具有與天然乳腺細胞相似（或實質上相似）的表型的細胞，或更具體而言是與天然乳腺上皮細胞相似（或實質上相似）的表型的細胞。與天然乳腺細胞或乳腺上皮細胞相似（或實質上相似）的表型或展現出與其至少一種特徵相似（或實質上相似）的細胞可以包括自然展現出或經過改造能夠表現至少一種乳成分的細胞（例如，衍生自乳腺細胞系或非乳腺細胞系）。

如本文所用的用語「非乳腺細胞（non-mammary cell(s)）」一般可包括非乳腺系的任意細胞。在本發明的內文中，非乳腺細胞可以是能夠被改造成表現至少一種乳成分的任何哺乳動物細胞。如此的非乳腺細胞的非限制性例子包括肝細胞、血細胞、腎細胞、臍帶血細胞、上皮細胞、表皮細胞、肌細胞、纖維母細胞、間質細胞或其任意組合。在一些情況下，分子生物學和基因組編輯技術可以被設計成同步消除、沉默或弱化無數的基因。

在本申請中，除非另有明確說明，「能夠…＜動詞＞（capable of…＜verb＞）」和「能夠.....＜動詞＞（capable to…＜verb＞）」的表現較佳以該動詞的主動語態代替，反之亦然。例如，表現「能夠表現（capable of expressing）」較佳替換為「表現（expresses）」，反之亦然，亦即，「表現」較佳替換為「能夠表現」。

在本文中所用的用語「變體（Variant(s)）」是分別與參照多核苷酸或多肽不同但是保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型變體在核苷酸序列上與另一種參照多核苷酸不同。變體的核苷酸序列中的變化可以改變或可以不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的胺基酸序列。核苷酸變化可導致由參照序列編碼的多肽中的胺基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下文所述。多肽的典型變體在胺基酸序列上與另一種參照多肽不同。一般而言，限制差異以使參照多肽和變體的序列在整體上緊密相似，並且在許多區域中是相同的。變體和參照多肽可以在胺基酸序列中有以任意組合的一或多個取代、添加、缺失的不同。取代或插入的胺基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的胺基酸殘基。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，諸如對偶基因變體，或者其可以是不已知天然存在的變體。多核苷酸和多肽的非天然存在的變體可以藉由突變誘發技術、藉由直接合成和藉由所屬技術領域中具通常知識者已知的其他重組方法製得。

本文所用的用語多肽的「衍生物（derivative）」是指在多肽的胺基酸序列中可能包含胺基酸殘基的缺失、添加或取代，但其造成無徵狀變化（silent change），從而產生功能等效的多肽。胺基酸的取代可以基於相關殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或雙性本質（amphipathic nature）的相似性來進行。例如，非極性（疏水性）胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；平面中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺和麩醯胺；帶正電（鹼性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；帶負電（酸性）胺基酸包括天冬胺酸和麩胺酸。在本發明的內容中，本文所用的衍生多肽是指能夠展現出與原始多肽實質上相似的體外及/或體內活性的多肽，其如藉由許多標準中的任意來判斷，包括但不限於酶活性，並且在轉譯中或轉譯後可進行不同的修飾。此外，非經典胺基酸或化學胺基酸類似物可以作為替代物或添加物引入原始多肽序列中。

在一些實施例中，本發明設想藉由修飾本發明中使用的酶結構來製備功能性變體。可以藉由胺基酸取代、缺失、添加或其組合來產生變體。例如，有理由期望用異白胺酸或纈胺酸單獨取代白胺酸、用麩胺酸單獨取代天冬胺酸、用絲胺酸單獨取代蘇胺酸、或用結構上相關的胺基酸對胺基酸的相似取代(例如，保守突變)不會對所得分子的生物活性產生重大影響。保守取代是發生在與其側鏈相關的胺基酸家族內的取代。藉由評估變體多肽以類似於野生型多肽的方式在細胞中產生應答的能力，可以容易地確定本發明的多肽的胺基酸序列中的改變是否導致功能性同源物。

本文所使用的用語「功能性同源物（functional homolog）」描述具有序列相似性（換句而言，同源性）並且還共用諸如生化活性的至少一功能特徵的那些分子（Altenhoff et al.,PLoS Comput. Biol. 8 (2012) e1002514）。功能性同源物通常對於相同的特徵產生相似的，但不一定相同的程度。功能上同源的蛋白質具有相同的特徵，其中由一個同源物產生的定量測量值為另一個的至少10%；更典型為原始分子所產生的定量測量值的至少20%，在約30%和約40%之間；例如，在約50%和約60%之間；在約70%和約80%之間；或者在約90%和約95%之間；在約98%和約100%之間，或者超過100%。因此，當分子具有酶活性時，功能性同源物將具有與原始酶相比的上述酶活性百分比。當分子為DNA結合分子（例如，多肽）時，則同源物將具有與原始分子相比，藉由結合分子的重量所測定的上述結合親和力百分比。

功能性同源物和參照多肽可為天然存在的多肽，並且序列相似性可因趨同或發散的演化事件造成。功能性同源物有時被稱為異種同源物，其中「異種同源物（ortholog）」是指在另一物種中與參考基因或蛋白質功能等效的同源基因或蛋白質。

異種同源基因（orthologous genes）是指不同物種中的同源基因，該基因藉由垂直遺傳起源於最後共同祖先的單一基因，其中的基因及其主要功能是保守的。同源基因是指在兩個物種中由共同的祖先遺傳的基因。

用語「異種同源物（ortholog）」在提到一特定物種的胺基酸或核苷酸/核酸序列時，是指來自不同物種的相同胺基酸或核苷酸/核酸序列。應該理解的是，當兩個序列經由線性血緣關係從一個共同祖先序列衍生出來、及/或在其序列和生物功能方面密切相關時，該兩個序列為彼此的異種同源物。異種同源物通常具有高度的序列同一性，但不一定（且經常不一定）具有100%的序列同一性。

同種同源（Paralogous）基因是由基因複製事件產生的同源基因。同種同源基因通常屬於同一物種，但其非必須的。同種同源物可分為內同種同源物（in-paralogs）（發生在物種演變事件之後的同種同源對）和外同種同源物（out-paralogs）（發生在物種演變事件之前的同種同源對）。物種之間的外同種同源物是指兩個生物體之間在物種演變前因複製而存在的一對同種同源物。在物種內，外同種同源物是存在於同一生物體內的一對同種同源物，但其複製是發生在物種演變之後。同種同源物通常具有相同或相似的功能。

可以藉由分析核苷酸和多肽序列比對來確定功能性同源物。例如，對核苷酸或多肽序列的資料庫進行查詢可以確定感興趣的多肽的同源物，如生質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活性糖合成的蛋白質或膜轉運蛋白。序列分析可以關於非冗餘資料庫的BLAST、倒數（Reciprocal BLAST）或PSI-BLAST分析，其分別使用生質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活性糖合成的蛋白質或膜轉運蛋白的胺基酸序列作為參照序列。在一些情況下，胺基酸序列是由核苷酸序列所推導出來。通常情況下，資料庫中序列一致性大於40%的那些多肽是進一步評估是否分別適合作為生質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活性糖合成的蛋白質或膜轉運蛋白的候選者。胺基酸序列的相似性允許保守的胺基酸取代，如用一個疏水殘基取代另一個疏水殘基、或用一個極性殘基取代另一個極性殘基、或用一個酸性胺基酸取代另一個酸性胺基酸、或用一個鹼性胺基酸取代另一個鹼性胺基酸等。較佳的是，保守取代是指一些組合，例如由丙胺酸取代甘胺酸，反之亦然；由甲硫胺酸取代纈胺酸、異白胺酸和白胺酸，反之亦然；由麩胺酸取代天冬胺酸，反之亦然；由麩醯胺取代天冬醯胺，反之亦然；由蘇胺酸取代絲胺酸，反之亦然；由精胺酸取代離胺酸，反之亦然；由甲硫胺酸取代半胱胺酸，反之亦然；以及由色胺酸取代苯丙胺酸和酪胺酸，反之亦然。如果需要，可以對這些候選者進行人工檢查，以縮小進一步評估的候選者的數量。人工檢查可藉由選擇似乎具有調節產生力的多肽中存在的域（domains）（例如，保守的功能域）的候選者來進行。

「片段（Fragment）」，就多核苷酸而言，是指選殖體或多核苷酸分子的任何部分，特別是多核苷酸的部分，其保留全長多核苷酸分子的可用的功能特徵。有用的片段包括寡核苷酸和多核苷酸，其可用於雜交或擴增技術或者複製、轉錄或轉譯的調控。「多核苷酸片段」是指多核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）的任何子序列，通常包括或由該多核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）的至少約9、10、11、12個連續核苷酸所組成，例如本文提供的任何多核苷酸序列的至少約30個核苷酸或至少約50個核苷酸。示例性片段可另外或替代地包括片段，該片段包括編碼多肽的保守家族域的區域、實質上由該區域所組成、或由該區域所組成。示例性片段可另外或替代地包括片段，該片段包括多肽的保守域。因此，多核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）的片段較佳地表示包括或由該多核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）所組成的核苷酸序列，其中缺失的連續核苷酸不超過200、150、100、50或25個，較佳為缺失的連續核苷酸不超過50個，並且保留全長多核苷酸分子的可用的功能特徵（例如，活性），其可由所屬技術領域中具通常知識者藉由常規實驗進行評估。另外，多核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）的片段較佳地表示包括來自該多核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）的一定量的連續核苷酸或由該連續核苷酸所組成的核苷酸序列，其中該連續核苷酸的量為該多核甘酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）全長的至少為50.0 %、60.0 %、70.0 %、80.0 %、81.0 %、82.0 %、83.0 %、84.0 %、85.0 %、86.0 %、87.0 %、88.0 %、89.0 %、90.0 %、91.0 %、92.0 %、93.0 %、94. 0 %、95.0 %、95.5 %、96.0 %、96.5 %、97.0 %、97.5 %、98.0 %、98.5 %、99.0 %、99.5 %、100 %，較佳至少80.0 %，更佳至少87.0 %，又更佳至少90%，又更佳至少95. 0 %，最佳至少97.0 %，並保留了全長多核苷酸分子的可用的功能特徵（例如，活性）。因此，多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段較佳地表示包括或由該多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)組成的核苷酸序列，其中缺少一數量的連續核苷酸，並且該數量不超過該多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的50.0 %、40.0 %、30.0 %，較佳不超過該多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的20.0 %、15.0 %、10.0 %、9.0 %、8.0 %、7.0 %、6.0 %、5.0 %、4.5 %、4. 0 %、3.5 %、3.0 %、2.5 %、2.0 %、1.5 %、1.0 %、0.5 %，更佳不超過15.0 %，又更佳不超過10.0 %，又更佳不超過5.0 %，最佳不超過2.5 %，並且其中該片段保留了全長多核苷酸分子的可用的功能特徵(例如，活性)，該特徵可由所屬技術領域中具通常知識者常規評估。

在本申請中，多核苷酸的序列可以SEQ ID NO表示，也可以用GenBank NO表示。因此，用語「多核苷酸SEQ ID NO」和「多核苷酸GenBank NO. 」可互換使用，除非另有明確說明。片段可以額外地或替代地包括多肽和蛋白質分子的子序列、或多肽的子序列。在一些情況下，片段或域是多肽的子序列，其以與完整多肽實質上相同的方式、較佳為相似程度的方式執行完整多肽的至少一種生物功能。本文定義的「多肽的子序列（subsequence of the polypeptide）」是指來自多肽衍生的連續的胺基酸殘基的序列。例如，多肽片段可包括可識別的結構模體或功能域，如與DNA啟動子區域結合的DNA結合位或結合域、活化域或蛋白質-蛋白質相互作用的域，並可啟始轉錄。片段可從少至3個胺基酸殘基到完整多肽的全長內改變大小，例如至少約20個胺基酸殘基的長度，例如至少約30個胺基酸殘基的長度。因此，多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）的片段較佳地表示包括或由該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）組成的多肽序列，其中不缺少超過80、60、50、40、30、20或15個連續的胺基酸殘基，較佳不缺少超過40個連續的胺基酸殘基，並且其以與完整多肽實質上相同的方式、較佳為相似或更大程度的方式執行完整多肽的至少一種生物功能，其可由所屬技術領域中具通常知識者常規評估。另外，多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）的片段較佳地表示包括或由來自該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）的連續胺基酸殘基數量組成的多肽序列，其中該連續胺基酸殘基的數量為該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO）全長的至少50.0 %、60.0 %、70.0 %、80.0 %、81.0 %、82.0 %、83.0 %、84. 0 %、85.0 %、86.0 %、87.0 %、88.0 %、89.0 %、90.0 %、91.0 %、92.0 %、93.0 %、94.0 %、95.0 %、95.5%、96.0 %、96.5 %、97.0 %、97.5 %、98. 0 %、98.5 %、99.0 %、99.5 %、100 %，較佳至少80.0 %，更佳至少87.0 %，又更佳至少90.0 %，又更佳至少95.0 %，最佳至少97.0 %，並其以與完整多肽實質上相同的方式、較佳為相似或更大程度的方式執行完整多肽的至少一種生物功能，其可由所屬技術領域中具通常知識者常規評估。因此，多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）的片段較佳地表示包括或由該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）組成的多肽序列，其中缺少一數量的連續胺基酸殘基，並且不超過該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）全長的50.0 %、40.0 %、30.0 %，較佳不超過該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）全長的20.0 %、15.0 %、10.0 %、9.0 %、8.0 %、7.0 %、6.0 %、5.0 %、4.5 %、4.0 %、3.5 %、3.0 %、2.5 %、2.0 %、1.5 %、1.0 %、0.5 %，更佳不超過15.0 %，又更佳不超過10.0 %，又更佳不超過5.0 %，最佳不超過2.5 %，並且其以與完整多肽實質上相同的方式、較佳為相似或更大程度的方式執行完整多肽的至少一種生物功能，其可由所屬技術領域中具通常知識者常規評估。

在本申請中，多肽的序列可以SEQ ID NO表示，或者以UniProt ID或GenBank No.表示。因此，用語「多肽SEQ ID NO」以及「多肽Uniprot ID」以及「多肽GenBank No.」可以互換使用，除非另有明確說明。

較佳地，多肽的片段是功能片段，其具有其衍生的多肽的至少一種特性或活性，較佳是相似或更大的程度。例如，功能片段可以包括多肽的功能域或保守域。可理解的是，多肽或其片段可具有保守的胺基酸取代，這些取代對多肽的活性實質上沒有影響。所謂的保守取代是指用一個疏水胺基酸取代另一個疏水胺基酸、或用一個極性胺基酸取代另一個極性胺基酸、或用一個酸性胺基酸取代另一個酸性胺基酸、或用一個鹼性胺基酸取代另一個鹼性胺基酸等。較佳的是，保守替代是指組合，例如由丙胺酸取代甘胺酸，反之亦然；由甲硫胺酸取代纈胺酸、異白胺酸和白胺酸，反之亦然；由麩胺酸取代天冬胺酸，反之亦然；由麩醯胺取代天冬醯胺，反之亦然；由蘇胺酸取代絲胺酸，反之亦然；由精胺酸取代離胺酸，反之亦然；由甲硫胺酸取代半胱胺酸，反之亦然；以及由色胺酸取代苯丙胺酸和酪胺酸，反之亦然。例如，一個域可以藉由Pfam（El-Gebali et al., Nucleic Acids Res. 47 （2019） D427-D432）或保守結構域資料庫（CDD）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）（Lu et al., Nucleic Acids Res. 48 （2020） D265-D268）指定進行特徵化。每個資料庫的內容在每次發佈時都是固定的，不得更改。當改變特定資料庫的內容時，此特定資料庫會接收新的發佈版本並有新的發佈日期。每個資料庫的所有發佈版本及其相應的發佈日期和在這些特定的發佈日期所注釋的特定內容都是可用的，也是所屬技術領域中具通常知識者所知。本文使用的PFAM資料庫（https://pfam.xfam.org/）是2020年6月11日發佈的Pfam 33.1版本。蛋白質序列資訊和功能資訊可以由蛋白質序列和注釋資料的綜合資源提供，例如通用蛋白質資源（UniProt）（www.uniprot.org）（Nucleic Acids Res. 2021, 49(D1), D480-D489）。UniProt包括被稱為UniProt知識庫（UniProtKB）的專業且豐富的蛋白質資料庫，以及UniProt參考簇（UniRef）和UniProt檔案（UniParc）。UniProt識別碼（UniProt ID）對存在於資料庫中的每個蛋白質都是獨特的。本文中使用的UniProt ID是2021年5月5日UniProt資料庫版本中的UniProt ID。不具有UniProt ID的蛋白質在本文中使用各自的GenBank登錄號（GenBank No.），該登錄號存在於2021年5月5日的NIH基因序列資料庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）（Nucleic Acids Res. 2013, 41(D1), D36-D42）版本中。

在本發明中，多肽序列延伸用於指本發明中使用的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶及N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶的片段，這些片段為那些N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶及N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶所共通的。如此的多肽延伸是以單字母代碼的胺基酸序列的形式書寫。如果在如此的多肽延伸的特定位置上的胺基酸可為幾個胺基酸，該特定位置將為胺基酸代碼X。除非本文另有描述，字母「X」是指可能的任何胺基酸。用語(Xn)是指由數量n個胺基酸殘基X組成的蛋白質序列的延伸，其中每個所述X是可能的任何胺基酸，且其中n是2、3、4或更多。用語(Xm)是指由數量m個胺基酸殘基X組成的蛋白質序列的延伸，其中每個所述X是可能的任何胺基酸，其中m是2、3、4或更多。用語(Xp)是指由數量p個胺基酸殘基X組成的蛋白質序列的延伸，其中每個所述X是可能的任何胺基酸，其中p是2、3、4或更多。用語「[X，無A、G或S]」是指任何胺基酸，其排除胺基酸殘基丙胺酸（A）、甘胺酸（G）或絲胺酸（S）。用語「[X，無F、H、W或Y]」是指任何胺基酸，其排除胺基酸殘基苯丙胺酸（F）、組胺酸（H）、色胺酸（W）和酪胺酸（Y）。

本文所用的用語「核苷酸-糖（nucleotide-sugar）」或「活性糖（activated sugar）」是指單醣的活化形式。活化的單醣之例子包含但不限於UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣（UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy--L-arabino-4-hexulose）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺（dTDP-N-acetylfucosamine）、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-N-acetyl-L-pneumosamine）（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖（UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-talose））、UDP-N-乙醯胞壁酸（UDP-N-acetylmuramic acid）、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-N-acetyl-L-quinovosamine）（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖（GDP-L-quinovose）、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-N-acetylneuraminic acid）（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-N-glycolylneuraminic acid）（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽（UDP-glucuronate）、UDP-半乳糖醛酸鹽（UDP-galacturonate）、GDP-鼠李糖或UDP-木糖。核苷酸-糖作為醣化反應中的醣苷基供給者。這些反應藉由稱為醣基轉移酶的一組酶進行催化。

本發明所用的用語「N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine b-1,3-galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine beta-1,3-galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺β 1,3 半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine beta 1,3 galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺 β-1,3-半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine β-1,3-galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺 β 1,3 半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine β 1,3 galactosyltransferase）」可互換使用，且是指催化將來自供給者UDP-半乳糖的半乳糖以β-1,3醣苷鍵結轉移至接受者N-乙醯葡萄糖胺之半乳糖基轉移酶。編碼「N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶」或任何上述用語的多核苷酸是指編碼如此的醣基轉移酶之多核苷酸，該醣基轉移酶催化以將來自供給者UDP-半乳糖的半乳糖以β-1,3醣苷鍵結轉移至接受者N-乙醯葡萄糖胺。

本發明所用的用語「N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine b-1,4-galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine beta-1,4-galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺β 1,4 半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine beta 1,4 galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine β-1,4-galactosyltransferase）」、「N-乙醯葡萄糖胺β 1,4 半乳糖基轉移酶（N-acetylglucosamine β 1,4 galactosyltransferase）」可互換使用，且是指催化將來自供給者UDP-半乳糖的半乳糖以β-1,4醣苷鍵結轉移至接受者N-乙醯葡萄糖胺之半乳糖基轉移酶。編碼「N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶」或任何上述用語的多核苷酸是指編碼如此的醣基轉移酶之多核苷酸，該醣基轉移酶催化以將來自供給者UDP-半乳糖的半乳糖以β-1,4醣苷鍵結轉移至接受者N-乙醯葡萄糖胺。

本發明所用的用語「N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase）」、「葡萄糖胺-磷酸鹽N-乙醯轉移酶（glucosamine-phosphate N-acetyltransferase）」、「GNA」、「GNA1」、「葡萄糖胺-6P N-乙醯轉移酶（glucosamine-6P N-acetyltransferase）」、「GlcN6P N-乙醯轉移酶」可互換使用，且是指催化以將來自乙醯輔酶A（acetyl-CoA）的乙醯基轉移至葡萄糖胺-6-磷酸鹽中的一級胺，產生N-乙醯-D-葡萄糖胺-6-磷酸鹽（亦稱為GlcNAc-6P）之酶。編碼「N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶」或任何上述用語的多核苷酸是指編碼如此的酶之多核苷酸，該酶催化以將來自乙醯輔酶A的乙醯基轉移至葡萄糖胺-6-磷酸鹽中的一級胺，產生N-乙醯-D-葡萄糖胺-6-磷酸鹽。

本發明所用的用語「果糖-6-磷酸轉胺酶（fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「麩醯胺--果糖-6-磷酸-轉胺酶（glutamine--fructose-6-phosphate-aminotransferase）」、「麩醯胺--果糖-6-磷酸轉胺酶（glutamine--fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶（L-glutamine—D-fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「glmS」、「glms」、「glmS*54」可互換使用，且是指催化以利用麩醯胺作為氮源而將果糖-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽之酶。編碼「果糖-6-磷酸轉胺酶」或任何上述用語的多核苷酸是指編碼如此的酶之多核苷酸，該酶催化以利用麩醯胺作為氮源而將果糖-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽。

本文所用的用語「生物產品（bioproduct）是指在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，其是以生物方式合成，即藉由微生物合成、細胞合成。

本文所用的用語「雙醣（disaccharide）」是指由兩個單醣單元組成的醣類。本文所用的用語「寡醣（Oligosaccharide ）」，按照本領域的一般理解，是指含有少量（通常為三至二十個）單糖，即單醣的醣類聚合物。本文所用的單醣是還原糖。雙醣及寡醣可以是還原糖或非還原糖，並且具有還原端和非還原端。還原糖是能夠還原另一種化合物並且本身被氧化（即，糖的羰基被氧化成羧基）的任何糖。本發明中使用的用語「糖的還原端（reducing end of a saccharide）」是指醣中可用於還原另一種化合物的自由異構碳。

本文所用的用語「單醣（monosaccharide）」是指不能藉由水解分解為更簡單的糖，屬於醛糖或酮糖，每個分子中含有一個或多個羥基的糖。單醣是只含有一種單醣的醣類。單醣的例子包括己糖、D-哌喃葡萄糖（D-Glucopyranose）、D-半乳糖呋喃糖（D-galactofuranose）、D-半乳糖哌喃糖（D-galactopyranose）、L-半乳糖哌喃糖、D-哌喃甘露糖（Mannopyranose）、D-哌喃阿洛糖（D-Allopyranose）、D-哌喃古洛糖（D-Gulopyranose）、D-艾杜哌喃糖（D-idopyranose）、D-塔羅哌喃糖（D-talopyranose）、D-核呋喃糖（D-ribofuranose）、D-核哌喃糖（D-ribopyranose）、D-阿拉伯呋喃糖（D-arabinofuranose）、D-阿拉伯哌喃糖（D-arabinopyranose）、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-木哌喃糖（D-xylopyranose）、D-來蘇哌喃糖（D-lyxopyranose）、D-赤藻呋喃糖（D-erythrofuranose）、D-蘇呋喃糖（D-threofuranose）、庚糖（heptose）、L-甘油-D-甘露-哌喃庚糖（L-glycero-D-manno-Heptopyranose，LDmanHep）、D-甘油-D-甘露-庚哌喃糖（D-glycero-D-manno-Heptopyranose，DDmanHep）、6-去氧-L-阿卓哌喃糖（6-Deoxy-L-altropyranose）、6-去氧--D-哌喃古洛糖、6-去氧-D-塔羅哌喃糖、6-去氧-D-半乳糖哌喃糖、6-去氧-L-半乳糖哌喃糖、6-去氧-D-哌喃甘露糖、6-去氧-L-哌喃甘露糖、6-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-去氧-D-阿拉伯-己糖（2-Deoxy-D-arabino-hexose）、2-去氧-D-赤藻-戊糖（2-Deoxy-D-erythro-pentose）、2,6-雙去氧-D-阿拉伯-己哌喃糖（2,6-Dideoxy-D-arabino-hexopyranose）、3,6-雙去氧-D-阿拉伯-己哌喃糖、3,6-雙去氧-L-阿拉伯-己哌喃糖、3,6-雙去氧-D-木糖-己哌喃糖（3,6-Dideoxy-D-xylo-hexopyranose）、3,6-雙去氧-D-核糖-己哌喃糖（3,6-Dideoxy-D-ribo-hexopyranose）、2,6-雙去氧-D-核糖-己哌喃糖、3,6-雙去氧-L-木糖-己哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-胺基-2-去氧-D-半乳糖哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃甘露糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃阿洛糖、2-胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-哌喃古洛糖、2-胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-塔羅哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-半乳糖哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃甘露糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃阿洛糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-哌喃古洛糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-塔羅哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-半乳糖哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-哌喃甘露糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-哌喃葡萄糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-塔羅哌喃糖、D-哌喃葡糖醛酸（D-glucopyranuronic acid）、D-哌喃半乳糖醛酸（D-Galactopyranuronic acid）、D-哌喃甘露糖醛酸（D-Mannopyranuronic acid）、D-哌喃阿洛糖醛酸（D-Allopyranuronic acid）、L-哌喃阿卓糖醛酸（L-Altropyranuronic acid）、D-哌喃古洛糖醛酸（D-Gulopyranuronic acid）、L-哌喃古洛糖醛酸、L-哌喃艾杜糖醛酸（L-Idopyranuronic acid）、D-哌喃塔羅糖醛酸（D-Talopyranuronic acid）、唾液酸（sialic acid）、5-胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸（5-Amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid）、5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、5-乙醇醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸（5-Glycolylamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid）、赤藻糖醇（erythritol）、阿拉伯糖醇（Arabinitol）、木糖醇（Xylitol）、核糖醇（Ribitol）、山梨醇（Glucitol）、半乳糖醇（Galactitol）、甘露醇（Mannitol）、D-核糖-己-2-酮哌喃醣（D-ribo-Hex-2-ulopyranose）、D-阿拉伯-己-2-酮呋喃糖（D-arabino-Hex-2-ulofuranose）（D-果呋喃糖（D-fructofuranose））、D-阿拉伯-己-2-酮哌喃醣（D-arabino-Hex-2-ulopyranose）、L-木糖-己-2-酮哌喃醣（L-xylo-Hex-2-ulopyranose）、D-木糖-己-2-酮哌喃醣（D-lyxo-Hex-2-ulopyranose）、D-蘇-戊-2-酮哌喃醣（D-threo-Pent-2-ulopyranose）、D-阿卓糖-庚-2-酮哌喃醣（D-altro-Hept-2-ulopyranose）、3-C-(羥基甲基)-D-赤藻呋喃糖（3-C-(Hydroxymethyl)-D-erythofuranose）、2,4,6-三去氧-2,4-二胺基-D-哌喃葡萄糖（2,4,6-Trideoxy-2,4-diamino-D-glucopyranose）、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖、2,6-雙去氧-3-甲基-D-核糖-己糖、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-乙醯胺基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、2-乙醇醯胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-哌喃葡萄糖、3-去氧-D-木糖-庚-2-酮哌喃糖酸（3-Deoxy-D-lyxo-hept-2-ulopyranosaric acid）、3-去氧-D-甘露-辛-2-酮哌喃糖酸（3-Deoxy-D-manno-oct-2-ulopyranosonic acid）、3-去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮哌喃糖酸（3-Deoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid）、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-甘露-壬-2-酮哌喃糖酸（5,7-Diamino-3,5,7,9-tetradeoxy-L-glycero-L-manno-non-2-ulopyranosonic acid ）、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油o-L-阿卓糖-壬-2-酮哌喃糖酸（5,7-Diamino-3,5,7,9-tetradeoxy-L-glycero-L-altro-non-2-ulopyranosonic acid）、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮哌喃糖酸（5,7-Diamino-3,5,7,9-tetradeoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid）、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-塔羅-壬-2-酮哌喃糖酸（5,7-Diamino-3,5,7,9-tetradeoxy-D-glycero-D-talo-non-2-ulopyranosonic acid）、葡萄糖、半乳糖、N-乙醯葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯基神經胺酸、N-乙醇醯神經胺酸、N-乙醯半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、果糖及多元醇。

用語「多元醇」是指含有多個羥基的醇。例如，甘油、山梨醇或甘露醇。

用語「在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣」包含但不限於產物Gal-b1,3-GlcNAc或Gal-b1,4-GlcNAc，其中半乳糖分別以β-1,3-鍵結或β-1,4-鍵結的方式與N-乙醯葡萄糖胺連接，且其中N-乙醯葡萄糖胺位於雙醣的還原端。

用語「Gal-b1,3-GlcNAc」、「Gal-beta-1,3-GlcNAc」、「Gal-β1,3-GlcNAc」、「Galb1,3GlcNAc」、「Galβ1,3GlcNAc」、「lacto-N-biose」、「LNB」、「LacNAc type I」、「type 1 LacNAc」、「LacNAc （i）」可互換使用，且是指雙醣，其中半乳糖以β-1,3-鍵結的方式與N-乙醯葡萄糖胺連接，且其中N-乙醯葡萄糖胺位於雙醣的還原端。

用語「Gal-b1,4-GlcNAc」、「Gal-beta-1,4-GlcNAc」、「Gal-β1,4-GlcNAc」、「Galb1,4GlcNAc」、「Galβ1,4GlcNAc」、「N-乙醯乳糖胺」、「LacNAc」、「LacNAc type II」、「type 2 LacNAc」、「LacNAc （ii）」可互換使用，且是指雙醣，其中半乳糖以β-1,4-鍵結的方式與N-乙醯葡萄糖胺連接，且其中N-乙醯葡萄糖胺位於雙醣的還原端。

在本發明使用的用語「在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣」是指由三至二十個單醣單位組成的寡醣，其中N-乙醯葡萄糖胺存在於寡醣的還原端。在本發明使用的寡醣可為線性結構或可包括分支。兩個糖單元之間的鍵結（如，醣苷鍵結、半乳糖苷鍵結、葡萄糖苷鍵結等）可以表示為，例如，1,4、1-＞4或（1-4），在此可互換使用。例如，用語「Gal-b1,4-Glc」、「β-Gal-(1-＞4)-Glc」、「Galbeta1-4-Glc」及「Gal-b(1-4)-Glc」具有相同的含義，即β-糖苷鍵將半乳糖（Gal）的碳1與葡萄糖（Glc）的碳4連接。每個單醣都可為環狀形式（如，呋喃糖的哌喃醣形式）。單個單醣單元之間的鍵結可以包括α1-＞2、α1-＞3、α1-＞4、α1-＞6、α2-＞1、α2-＞3、α2-＞4、α2-＞6、β1-＞2、β1-＞3、β1-＞4、β1-＞6、β2-＞1、β2-＞3、β2-＞4及β2-＞6。寡醣可以同時含有α-和β-糖苷鍵或可以只含有β-糖苷鍵。本發明中使用的寡醣可以根據通式1定義：

該寡醣由以下以α或β糖苷鍵鍵結的單醣組成，其中B為N-乙醯葡萄糖胺，且其中A、V、W、X、Y及/或Z不存在，或為半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、N-乙醯基神經胺酸、N-乙醇醯神經胺酸、葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯葡萄糖胺及/或由通式2定義的寡醣結構：

其中B是N-乙醯葡萄糖胺，且其中A、V、W、X、Y及/或Z不存在，或為半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、N-乙醯基神經胺酸、N-乙醇醯神經胺酸、葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯甘露糖胺或N-乙醯葡萄糖胺；且其中，在通式1和通式2中，m是3且可選地v是4，或者m是4且可選地v是3，並且其中p是3及/或4，且其中w是6，並且其中如果n＞1且p是3，x是3且X不是單醣，並且其中如果n＞1且p為4，y是4且Y不是單醣，並且其中z是6，且其中n從1至10。

如本文所使用的「哺乳動物乳寡醣（mammalian milk oligosaccharide）」（MMO）是指寡醣，例如但不限於乳-N-三糖II（lacto-N-triose II）、3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose）、2′-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、2’,2-二岩藻糖基乳糖、3,4-二岩藻糖基乳糖、6′-唾液酸乳糖（6′-sialyllactose）、3′-唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳糖、6,6’-二唾液酸乳糖、8,3-二唾液酸乳糖、3,6-二唾液酸乳-N-四糖（3,6-disialyllacto-N-tetraose）、乳二岩藻四糖（lactodifucotetraose）、乳-N-四糖（lacto-N-tetraose）、乳-N-新四糖（lacto-N-neotetraose）、乳-N-岩藻五糖II（lacto-N-fucopentaose II）、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、唾液酸乳-N-四糖c（sialyllacto-N-tetraose c）、唾液酸乳-N-四糖b、唾液酸乳-N-四糖a、乳-N-二岩藻六糖I（lacto-N-difucohexaose I）、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-六糖、乳-N-新六糖（lacto-N-neohexaose）、對乳-N-六糖（para-lacto-N-hexaose）、單岩藻糖基單唾液酸乳-N-四糖c（monofucosylmonosialyllacto-N-tetraose c）、單岩藻糖基對乳-N-六糖（monofucosyl para-lacto-N-hexaose）、單岩藻糖基乳-N-六糖III、異構岩藻糖基化乳-N-六糖III（isomeric fucosylated lacto-N-hexaose III）、異構岩藻糖基化乳-N-六糖I、唾液酸乳-N-六糖、唾液酸乳-N-新六糖II、二岩藻糖-對乳-N-六糖、二岩藻糖乳-N-六糖、二岩藻糖乳-N-六糖a、二岩藻糖乳-N-六糖c、岩藻糖基化幾丁聚醣、岩藻糖基化寡醣、中性寡醣及/或唾液酸化寡醣。哺乳動物乳寡醣（MMO）包括存在於哺乳期任何階段的乳中的寡醣，包括人類（即，人乳寡醣或HMO）和哺乳動物的初乳，該哺乳動物包括但不限於牛（ Bos Taurus）、羊（ Ovis aries）、山羊（ Capra aegagrus hircus）、雙峰駱駝（ Camelus bactrianus）、馬（ Equus ferus caballus）、豬（ Sus scropha）、狗（ Canis lupus familiaris）、日本棕熊（ Ursus arctos yesoensis）、北極熊（ Ursus maritimus）、日本黑熊（ Ursus thibetanus japonicus）、條紋臭鼬（ Mephitis mephitis）、冠海豹（ Cystophora cristata）、亞洲象（ Elephas maximus）、非洲象（ Loxodonta africana）、巨型食蟻獸（ Myrmecophaga tridactyla）、真瓶鼻海豚（ Tursiops truncates）、北方小鬚鯨（ Balaenoptera acutorostrata）、尤金袋鼠（ Macropus eugenii）、紅袋鼠（ Macropus rufus）、刷尾負鼠（ Trichosurus Vulpecula）、無尾熊（ Phascolarctos cinereus）、東袋鼬（ Dasyurus viverrinus）、鴨嘴獸（ Ornithorhynchus anatinus）。人乳寡醣(HMOs)也被稱為同人乳寡醣（human identical milk oligosaccharides），其化學成分與人乳中的人乳寡醣相同，但其藉由生物技術產生的（例如，使用無細胞系統或包括細菌、真菌、酵母、植物、動物或原生動物細胞的細胞和生物體，較佳為基因工程細胞和生物體）。同人乳寡醣在市場上以HiMO的名義販售。

用語「純化的（purified）」是指實質上或基本上不含干擾生物分子活性成分的材料。對於細胞、醣類、核酸和多肽，用語「純化的」是指實質上或基本上不含通常在材料以其天然狀態存在時伴隨材料的組分的材料。典型地，本發明的純化的醣類、寡醣、蛋白質或核酸是藉由銀染凝膠上的條帶強度或其他測定純度的方法測量的至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%純度，通常至少約為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%純度。純度或均一性可藉由本領域已知的許多方法來指示，例如蛋白質或核酸樣品的聚丙烯醯胺凝膠電泳，隨後在染色時視覺化。出於一些目的，需要高解析度，並使用HPLC或類似的純化方法。對於寡醣，可使用例如但不限於薄層色層分析、氣相色層分析、NMR、HPLC、毛細管電泳或質譜的方法來測定純度。

用語「相同（identical）」或「百分比同一性（percent identity）」或「%同一性（% identity）」在兩個或更多個核酸或多肽序列的情形中，是指兩個或更多個序列或子序列，當使用序列比較演算法或目測法測量就最大對應性進行比較和比對時，其是相同的或具有特定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸。對於序列比較，一個序列作為參照序列，將測試序列與之進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參照序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，並指定序列演算法程式參數。然後，序列比較演算法基於指定的程式參數，計算測試序列相對於參照序列的序列同一性百分比。百分比同一性可以藉由參照序列的全長序列總體地計算，從而得到總體的百分比同一性分數。或者，可以在參照序列的部分序列上計算同一性百分比，從而得出局部同一性百分比分數。在局部序列比對中使用參照序列的全長，而得到測試序列與參照序列之間的總體百分比同一性分數。使用不同的演算法確定百分比同一性，例如BLAST和PSI-BLAST（Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403- 410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402）、Clustal Omega方法（Sievers et al., 2011, Mol. Syst. Biol. 7:539）、MatGAT方法（Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics, 4:29）或EMBOSS Needle。

BLAST（Basic Local Alignment Search Tool））的比對方法是由美國國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的一種演算法，使用預設參數（default parameters）來比較序列。該程式將核苷酸或蛋白質序列與序列資料庫進行比較，並計算出統計意義。特定位置反覆運算基本局部排列檢索工具（Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool，PSI-BLAST）是從使用蛋白質-蛋白質BLAST（BLASTp）檢測到的高於給定分數閾值的序列的多序列比對中得出特定位置評分矩陣（PSSM）或概況。BLAST方法可用於成對或多序列比對。成對序列比對用於識別可能表明兩個生物序列（蛋白質或核酸）之間功能、結構及/或進化關係的相似區域。BLAST的網路介面可得自：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

Clustal Omega（Clustal W）是一個多序列比對程式，其使用種子引導樹和HMM輪廓-輪廓（profile-profile）技術以產生三個或更多序列之間的比對。其產生有生物學意義的發散序列（divergent sequences）的多序列比對。Clustal W的網路介面可得自https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/。使用Clustal W方法進行多序列比對和計算蛋白質序列的百分比同一性的預設參數是：啟用輸入序列的去比對：FALSE；啟用mbed-like群集引導樹（mbed-like clustering guide-tree）：TRUE；啟用mbed-like群集迭代法（mbed-like clustering iteration）：TRUE；（結合的引導樹/HMM）迭代法的次數：預設（0）；最大引導樹迭代法：預設[-1]；最大HMM迭代法：預設[-1]；順序：對齊。

矩陣全局比對工具（Matrix Global Alignment Tool，MatGAT）是電腦應用程式，其產生DNA或蛋白質序列的相似性/同一性矩陣，而不需要對資料進行預比對。該程式使用Myers和Miller全局比對演算法執行一系列的成對比對，計算相似性和同一性，然後將結果放在距離矩陣中。使用者可指定哪種類型的比對矩陣（如，BLOSUM50、BLOSUM62和PAM250），以用於那些蛋白質序列檢查。

EMBOSS Needle（https://galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html）使用Needleman-Wunsch全局排列演算法，在考慮到該些序列的整體長度時，找到兩個序列的最佳排列（包括空位（gap））。藉由動態程式設計方法，探索所有可能的排列並選擇最佳排列，以確保最佳排列。Needleman-Wunsch演算法是一類演算法的成員，其可在mn步驟的順序中計算出最佳分數和排列，（其中'n'和'm'是兩個序列的長度）。空位開放罰分（gap open penalty）（預設10.0）是在產生空位時被扣除的分數。預設值是推定使用對於蛋白質序列的EBLOSUM62矩陣。空位延伸（預設0.5）罰分增加至對於空位中的每一個鹼基或殘基的標準空位罰分。其為長空位的懲罰。

如本文所用，具有胺基酸序列與參照多肽序列的全長序列具有至少80%的序列同一性的多肽，應理解為該序列具有80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、91.50 %、92. 00 %、92.50 %、93.00 %、93.50 %、94.00 %、94.50 %、95.00 %、95.50 %、96.00 %、96.50 %、97.00 %、97.50 %、98.00 %、98.50 %、99.00 %、99.50 %、99.60 %、99.70 %、99.80 %、99.90 %、100 %與參照多肽序列的全長胺基酸序列相同。在本申請中，除非明確規定，包括/具有與參照多肽（或核苷酸序列）的全長胺基酸序列（或核苷酸序列）至少80%序列同一性/由其組成的多肽（或DNA序列），通常以SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank NO.表示，較佳具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，更佳具有至少85%，又更佳具有至少90%，最佳具有至少95%與全長參照序列相同的序列。

為了本發明的目的，使用MatGAT2.01（Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4:29）確定百分比同一性。採用了以下用於蛋白質的預設參數：（1）空位成本存在性（Gap cost Existence）：12和延伸：2；（2）採用的矩陣是BLOSUM65。在較佳的實施例中，序列同一性是根據給定的SEQ ID NO的全長序列，即參照序列，或其一部分所計算。其中的一部分較佳是指完整參照序列的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。

用語「培養物（cultivation）」是指培養基，其中培養或發酵細胞、細胞本身、及藉由在培養液中的本發明細胞產生在其還原端帶有GlcNAc的雙醣及/或寡醣，即，細胞的內部（細胞內）以及外部（細胞外）。

本文所用的用語「膜轉運蛋白」是指細胞膜的一部分或與之交互作用並控制分子和資訊橫跨細胞之流動的蛋白質。因此，膜蛋白參與運輸，無論是細胞的輸入或輸出。

如此的膜轉運蛋白可為如轉運分類資料庫（Transporter Classification Database）所定義的運輸蛋白（Porters）、P-P-鍵水解-驅動的轉運體（P-P-bond-hydrolysis-driven transporters）、β-桶狀孔蛋白（β-Barrel Porins）、輔助轉運蛋白（auxiliary transport proteins）、推定轉運蛋白（putative transport proteins）和磷酸轉移-驅動組轉位蛋白（phosphotransfer-driven group translocators），該資料庫由Saier實驗室生物資訊學組（Saier Lab Bioinformatics Group）操作和策劃，且可經由www.tcdb.org獲得，並提供膜轉運蛋白的功能和系統分類。此轉運分類資料庫詳細說明IUBMB批准的膜轉運蛋白的綜合分類系統，稱為轉運分類（TC）系統。本文描述的TCDB分類檢索是基於2019年6月17日發佈的TCDB. Org所定義。

運輸蛋白是利用載體介導過程的單運輸蛋白（uniporters）、共運輸蛋白（symporter）和反向運輸蛋白（antiporter）的總稱（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 （2016） D372-D379）。其屬於電化學電位驅動的轉運體，亦稱為二級載體型促進體。當膜轉運蛋白在單一物種藉由促進擴散或在膜電位依賴過程中（如果溶質是帶電的）運輸時，利用載體介導過程催化單向運輸；當兩個或更多的物種在一個緊密耦合的過程中於反向運輸時，利用載體介導過程催化反向運輸，而不與化學滲透能（chemiosmotic energy）以外的直接形式能量耦合；及/或當兩個或更多的物種在一個緊密耦合過程中以相同方向運輸時，利用載體介導過程催化共同運輸，而不與化學滲透能以外的直接形式能量耦合，則膜轉運蛋白包括在二級載體的此分類中（Forrest et al., Biochim. Biophys. Acta 1807 (2011) 167-188）。這些系統通常具有立體特異性。溶質：溶質反運輸是二級載體的特徵特性。運輸蛋白和酶的動態聯結創造功能性膜，將通常從細胞外腔室獲得的通道基質之代謝群組直接轉運進入到其細胞代謝中（Moraes and Reithmeier, Biochim. Biophys. Acta 1818 (2012), 2687-2706）。經由此運輸蛋白系統運輸的溶質包括但不限於陽離子、有機陰離子、無機陰離子、核苷、胺基酸、多元醇、磷酸化的醣解中間產物、滲透物、螯鐵蛋白（siderophores）。

如果膜轉運蛋白水解無機焦磷酸、ATP或另一種核苷三磷酸的二磷酸鍵，以驅動一或多種溶質的主動攝入及/或排出，則該膜轉運蛋白包含在P-P-鍵水解-驅動的轉運體的分類中（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。膜轉運蛋白可能或不可能被暫時性磷酸化，但基質不被磷酸化。經由P-P-鍵水解-驅動的轉運體運輸的基質包括但不限於陽離子、重金屬、β-葡聚糖、UDP-葡萄糖、脂多醣、磷壁酸（teichoic acid）。

β-桶狀孔蛋白膜轉運蛋白形成跨膜孔，其通常允許溶質不依賴能量穿過膜。這些蛋白的跨膜部分完全由形成β-桶狀的β鏈組成（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。這些孔蛋白類型的蛋白質存在於革蘭氏陰性菌、粒線體、色素體（plastid）和可能在抗酸革蘭氏陽性菌（acid-fast Gram-positive bacteria）的外膜。經由這些β-桶狀孔蛋白運輸的溶質包括但不限於核苷、棉子糖、葡萄糖、β-葡萄糖苷、寡醣。

輔助轉運蛋白被定義為促進跨越一或多個生物膜的運輸，但本身不直接參與運輸的蛋白質。這些膜轉運蛋白總是與一或多個已建立的轉運系統一起發揮作用，例如但不限於外膜因子（OMFs）、多醣（PST）運輸蛋白、ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）型運輸蛋白。其可提供與運輸的能量耦合有關的功能，在複合物的形成中發揮結構性作用，發揮生物或穩定性功能或調節功能（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 （2016） D372-D379）。輔助轉運蛋白的例子包括但不限於參與多醣轉運的多醣共聚酶家族、參與菌素（bacteriocin）和化學毒素轉運的膜融合蛋白家族。

推定轉運蛋白包括一些家族，當成員的轉運功能被確定時，這些家族將被分類到別處，或者如果提出的轉運功能被推翻，將自轉運分類系統刪除。這些家族包括一或多個成員，這些成員被認為具有轉運功能，但此功能的證據尚未被信服（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 （2016）D372-D379）。分類於2019年6月17日發佈的TCDB系統下的此組的推定轉運體的例子包括但不限於銅轉運體。

磷酸轉移-驅動組轉位蛋亦稱為細菌的磷酸烯醇丙酮酸（磷酸烯醇丙酮酸）：糖磷酸轉移酶系統（PTS）的PEP依賴性磷氧基轉移-驅動組轉位蛋白。衍生自細胞外的糖之該反應的產物是細胞質的糖-磷酸鹽。催化糖磷酸化的酶成分是在緊密耦合過程中疊加在運輸過程上。PTS系統關於許多不同態樣，包括調節和趨化（chemotaxis）、生物膜形成及致病機制（Lengeler, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 （2015） 79-93；Saier, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 （2015）73-78)。分類於2019年6月17日發佈的TCDB系統下的磷酸轉移-驅動組轉位蛋白的膜轉運蛋白家族包括與轉運葡萄糖-葡萄糖苷、果糖-甘露醇、乳糖-N,N'-二乙醯幾丁二糖-β-葡萄糖苷、山梨醇、半乳糖醇、甘露糖-果糖-山梨糖和抗壞血酸有關的PTS系統。

主要促進者超級家族（major facilitator superfamily，MFS）是膜轉運蛋白超級家族，其催化單向運輸蛋白、溶質：陽離子（H+，但很少是Na+）共運輸及/或溶質：H+或溶質：溶質反向運輸。如由Saier實驗室生物資訊學組（www.tcdb.org）運作的轉運分類資料庫所定義，大多數轉運體的長度為400-600個胺基酸殘基，擁有12、14或偶爾24個跨膜α-螺旋扳（transmembrane α-helical spanners，TMS）。

本文所用的「SET」或「糖排出轉運體（Sugar Efflux Transporter）」是指SET家族的膜蛋白，其具有InterPRO域IPR004750的蛋白質及/或屬於eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9的蛋白質。InterPro域的識別可藉由使用https://www.ebi.ac.uk/interpro/的線上工具或使用預設值的InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html）獨立版本進行。eggNOGv4.5中異種同源y家族的識別可使用eggNOG-mapperv1的線上版本或獨立版本（http://eggnogdb.embl.de/#/app/home）進行。

本文所用的用語「螯鐵蛋白（Siderophore）」是指各種微生物的二級代謝物，其主要是鐵離子特異性螯合劑。這些分子被分類為兒茶酚鹽（catecholate）、羥胺鹽（hydroxamate）、羧酸鹽（carboxylate）和混合類型。螯鐵蛋白一般是藉由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）依賴途徑或NRPS獨立途徑（NIS）合成。在NRPS依賴性螯鐵蛋白生物合成途徑中，最重要的前驅物是分支鹽酸（chorismate）。2, 3-DHBA可藉由三步驟反應，在異分支鹽酸合成酶（isochorismate synthase）、異分支鹽酸酶（isochorismatase）和2, 3-二羥基苯甲酸-2, 3-脫氫酶（2, 3-dihydroxybenzoate-2, 3-dehydrogenase）的催化下而自分支鹽酸形成。螯鐵蛋白亦可自水楊酸形成，該水楊酸是藉由異分支鹽酸丙酮酸裂解酶（isochorismate 丙酮酸 lyase）而從異分支鹽形成。當鳥胺酸（ornithine）使用作為螯鐵蛋白的前驅物時，生物合成取決於由L-鳥胺酸N5-單氧酶催化（L-ornithine N5-monooxygenase）的鳥胺酸的羥基化。在NIS途徑中，螯鐵蛋白生物合成的重要步驟是N（6）-羥基離胺酸合成酶。

需要轉運體需要將螯鐵蛋白輸出到細胞外。在這一過程中，在此過程中，已識別出四個膜蛋白的超級家族：主要促進者超級家族（major facilitator superfamily，MFS）；多藥/寡醣-脂/多醣翻轉酶超級家族（Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide Flippase Superfamily，MOP）；抗性、結核作用和細胞分裂超級家族（resistance, nodulation and cell division superfamily，RND）；以及ABC超級家族。一般而言，參與螯鐵蛋白輸出的基因與螯鐵蛋白生物合成基因聚集在一起。本文所使用的用語「螯鐵蛋白輸出體（siderophore exporter）」是指需要將螯鐵蛋白輸出到細胞外的這類轉運體。

ATP結合盒（ABC）超級家族包含攝入和排出轉運系統，這兩組成員通常鬆散地群集。ATP水解而不需要蛋白質磷酸化就能為運輸提供能量。ABC超級家族內有幾十個家族，家族一般與基質特異性相關。成員根據經由www.tcdb.org可獲得的Saier實驗室生物資訊學組運作的轉運分類資料庫所定義的3.A.1類進行分類，且該資料庫提供了膜轉運蛋白的功能和系統分類。

用語「允許排出（enabled efflux）」表示在細胞質膜及/或細胞壁上引入溶質的轉運活性。可藉由引入及/或增加本發明所述的轉運蛋白的表現允許所述的轉運。用語「促進排出（enhanced efflux）」是指改善溶質在細胞質膜及/或細胞壁上的轉運活性。可藉由引入及/或增加本發明所述的膜轉運蛋白的表現促進溶質在細胞質膜及/或細胞壁上的轉運。膜轉運蛋白的「表現」定義為在編碼該膜轉運蛋白的基因是內源性基因的情況下，該基因的「過度表現」，或在編碼該膜轉運蛋白的基因是異源基因（於野生型菌株或細胞中不存在）的情況下的「表現」。

本文所使用的用語「前驅物（precursor）」是指被用於具體產生雙醣及/或寡醣（例如，在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣）的細胞攝入及/或合成的物質。在此意義上，前驅物可為本文定義的接受者，但也可以是另一種物質、代謝物，其在細胞內先被修飾而作為雙醣及/或寡醣（例如，在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣）的生化合成途徑的一部分。這種前驅物的例子包括本文定義的接受者，及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、二羥丙酮、葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙醯甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺、磷酸化糖，例如但不限於葡萄糖-1-磷酸鹽（glucose-1-phosphate）、半乳糖-1-磷酸鹽（galactose-1-phosphate）、葡萄糖-6-磷酸鹽、果糖-1,6-二磷酸鹽、甘露糖-6-磷酸鹽、甘露糖-1-磷酸鹽、甘油-3-磷酸鹽、甘油醛-3-磷酸鹽、二羥基丙酮-磷酸鹽（dihydroxyacetone-phosphate）、葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙醯-葡萄糖胺-6-磷酸鹽、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸鹽、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸鹽、N-乙醯神經胺酸-9-磷酸鹽及/或本文定義的核苷酸活性糖，例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙醯葡萄糖胺、CMP-唾液酸、GDP-甘露糖、GDP-4-脫氫-6-去氧-α-D-甘露糖、GDP-岩藻糖。

本文所使用的用語「接受者（acceptor）」是指可藉由醣基轉移酶修飾的單醣、雙醣或寡醣。此接受者的例子包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、乳-N-雙糖（LNB）、乳-N-三糖、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新四糖（LNnT）、N-乙醯-乳糖胺（LacNAc）、乳-N-五糖（LNP）、乳-N-新戊糖、對乳-N-戊糖、對乳-N-新戊糖、乳-N-新戊糖I、乳-N-六糖（LNH）、乳-N-新六糖（LNNH）、對乳-N-新六糖（pLNNH）、對乳-N-六糖（pLNH）、乳-N-庚糖（lacto-N-heptaose）、乳-N-新庚糖（lacto-N-neoheptaose）、對乳-N-新庚糖（para lacto-N-neoheptaose）、對乳-N-庚糖（para lacto-N-heptaose）、乳-N-辛糖（lacto-N-octaose，LNO）、乳-N-新辛糖、異乳-N-辛糖、對乳-N-辛糖、異乳-N-新辛糖（iso lacto-N-neooctaose）、新乳-N-新辛糖（novo lacto-N-neooctaose）、對乳-N-新辛糖（para lacto-N-neooctaose）、異乳-N-壬糖（iso lacto-N-nonaose）、新乳-N-壬糖（novo lacto-N-nonaose）、乳-N-壬糖（lacto-N-nonaose）、乳-N-癸糖（lacto-N-decaose）、異乳-N-癸糖（iso lacto-N-decaose）、新乳-N-癸糖（novo lacto-N-decaose）、乳-N-新癸糖（lacto-N-neodecaose）、半乳糖乳醣（galactosyllactose）、以1、2、3、4、5或多個的N-乙醯乳糖胺單元及/或以1、2、3、4、5或多個的乳-N-雙糖單元延伸的乳糖、及包含1個或多個N-乙醯乳糖胺單元及/或1個或多個乳糖-N-雙糖單元的寡醣或其寡醣、岩藻糖基化及唾液酸化形式的中間體。

本發明的詳細說明

根據第一態樣，本發明提供一種藉由細胞，較佳為單一細胞產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣或寡醣之方法。該方法包括以下步驟： - 提供能夠合成核苷酸-糖及單醣GlcNAc並能夠醣化該GlcNAc單醣的細胞， - 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， - 較佳地，自培養物分離該雙醣或寡醣。

在本發明的範疇中，字詞「允許產生該雙醣或寡醣的條件（conditions permissive for producing said di- or oligosaccharide）」應理解為與物理或化學參數有關的條件，其包括但不限於溫度、pH值、壓力、滲透壓和產物/前驅物/接受者濃度。

在特定實施例，此條件可包含30 +/- 20攝氏度的溫度範圍、7 +/- 3的 pH值範圍。

在本申請中，特徵「雙醣或寡醣」較佳以「寡醣」替代，特徵「雙醣及/或寡醣」較佳以「寡醣」替代。根據本發明，細胞能夠合成GlcNAc且此GlcNAc單醣進一步藉由醣化修飾，該醣化在同一細胞中進行，以合成在還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣。藉此，細胞表現醣基轉移酶，以使合成的N-乙醯葡萄糖胺醣化，形成本發明的在還原端帶有GlcNAc的雙醣或寡醣。

因此，本發明提供一種藉由細胞，較佳為單一細胞產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣或寡醣之方法。該方法包括以下步驟： - 提供能夠合成核苷酸-糖及單醣GlcNAc並能夠表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣而形成該雙醣或寡醣的細胞， - 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， - 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， - 較佳地，自培養物分離該雙醣或寡醣。

醣基轉移酶是催化來自活化的供給者分子的糖部分轉移到特定的接受者分子，以形成醣苷鍵的酶。如本文所用的該醣基轉移酶可選自包含下列的列舉但不限於此：α-1,2-岩藻糖基轉移酶（alpha-1,2- fucosyltransferases）、α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶、α-1,6-岩藻糖基轉移酶、α-2,3-唾液酸轉移酶（alpha-2,3-sialyltransferases）、α-2,6-唾液酸轉移酶，α-2,8-唾液酸轉移酶、β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、葡萄糖基轉移酶（glucosyltransferases）、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶（glucuronyltransferases）、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶（glycolylneuraminyltransferases）。

細胞需要在細胞內產生GlcNAc，以便能夠進一步對合成的GlcNAc進行醣化。GlcNAc的細胞內產生需要理解為在細胞內或細胞質內的合成GlcNAc，而不是在胞器或胞器膜或細胞的周質或細胞膜或細胞壁內的合成。

在較佳實施例中，本文所述的細胞表現至少一N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶，以合成N-乙醯葡萄糖胺。在此較佳實施例中，該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為在細胞中能夠將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉變成N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽的酶，且該磷酸酶為在細胞中能夠將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去磷酸化以產生N-乙醯葡萄糖胺。在更佳實施例中，此磷酸酶為HAD樣（HAD-like）磷酸酶。來自HAD超級家族和HAD樣家族的磷酸酶在本領域中被描述。這些家族的例子可以在來自大腸桿菌的基因 yqaB、 inhX、 yniC、 ybiV、 yidA、 ybjI、 yigL或 cof 、或例如包括aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的任一或多個的大腸桿菌基因；或來自惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）的 PsMupP 、來自啤酒酵母菌（ S. cerevisiae）的ScDOG1、或來自枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）的BsAraL基因（如WO18122225所述）所表現的酶中發現。在埃默森小芽枝黴（ Blastocladiella emersonii）識別出催化此反應的一種磷酸酶。磷酸酶通常並不特異且活性通常與家族或結構相關。因此，在所有的磷酸酶家族中都可以找到其他的例子。特定的磷酸酶藉由如Fahs等人（ACS Chem. Biol. 11(11), 2944-2961 （2016））描述的已知方法可容易地識別和篩選。

在本發明的內容中，應理解的是根據本發明的在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣是在細胞內合成。所屬技術領域中具通常知識者將進一步理解，部分（fraction）或實質上全部合成的還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣保留在細胞內及/或經由被動或主動運輸排出細胞外。

在較佳實施例中，該細胞能夠表現至少一種醣基轉移酶，以醣化該GlcNAc單醣而形成該雙醣或寡醣。在另一較佳實施例中，該細胞能夠表現至少兩種、更佳為至少三種、又更佳為至少四種、又更佳為至少五種、最佳為至少六種醣基轉移酶，以醣化該GlcNAc單醣而形成根據本發明的該雙醣或寡醣。

在本發明的內容中，該核苷酸-糖較佳為用於該醣基轉移酶的供給者。較佳地，該細胞能夠合成至少兩種、更佳為至少三種、又更佳為至少四種、最佳為至少五種核苷酸-糖。

在較佳實施例中，該雙醣或寡醣為乳-N-雙糖（LNB）或N-乙醯乳糖胺（LacNAc），較佳為在還原端含有LNB或LacNAc的寡醣，更佳為LNB或LacNAc的唾液酸化及/或岩藻糖基化及/或半乳糖基化及/或GlcNAc-修飾形式、或者又更佳為在還原端含有LNB或LacNAc的寡醣的唾液酸化及/或岩藻糖基化及/或半乳糖基化及/或GlcNAc-修飾形式。在另一較佳實施例中，該雙醣或寡醣為在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的中性雙醣或寡醣，較佳為在還原端含有LNB或LacNAc的中性寡醣。較佳地，該中性寡醣為岩藻糖基化。或者，較佳為該中性寡醣並未岩藻糖基化。

在另一較佳實施例中，本發明提供一種藉由細胞，較佳為單一細胞產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣及/或寡醣混合物之方法。該方法包括以下步驟： - 提供能夠合成核苷酸-糖及單醣GlcNAc並能夠表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣而形成其還原端具有GlcNAc的該雙醣及/或寡醣混合物的細胞， - 在允許產生該還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣的混合物的條件下培養該細胞， - 較佳地，自培養物分離該混合物。

根據本發明，該混合物包括或由至少兩種不同的其還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣所組成，較佳為包括或由至少三種不同的其還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣所組成，更佳為包括或由至少四種不同的其還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣所組成。較佳地，該混合物包括或由中性雙醣及/或寡醣所組成。更佳地，該混合物包括或由帶電及/或中性的雙醣及/或寡醣所組成。在本方法及/或細胞的較佳實施例中，帶電雙醣及/或寡醣為唾液酸化的雙醣及/或寡醣。在本方法及/或細胞的較佳實施例中，中性的雙醣及/或寡醣為岩藻糖基化的。在本方法及/或細胞的另一較佳實施例中，中性的雙醣及/或寡醣並未岩藻糖基化。

在本發明的範疇中較佳為一種藉由細胞，較佳為單一細胞產生混合物之方法，該混合物包括（i）如本文所述之在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣及/或寡醣、及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣（MMO），較佳為一或多種基於乳糖的人乳寡醣（HMOs）。該方法包括以下步驟： - 提供細胞，該細胞（i）能夠合成核苷酸-糖及單醣GlcNAc且能夠表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣而產生該雙醣及/或寡醣，且（ii）其中該細胞進一步能夠表現一或多種醣基轉移酶以醣化乳糖而產生該一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣且其中該細胞能夠合成一或多種核苷酸-糖，其為用於該醣基轉移酶的供給者，其中該乳糖是由細胞（較佳為細胞內）所製造或在培養之前及/或之後添加， - 在允許產生包括（i）雙醣及/或寡醣及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣的混合物的條件下培養該細胞， - 較佳地，自培養物分離該混合物。

所屬技術領域中具通常知識者將理解的是，參與產生該還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣的一或多種醣基轉移酶可與醣化乳糖以形成一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣的醣基轉移酶相同。或者，參與產生該還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣的醣基轉移酶與參與產生一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣的醣基轉移酶不同。

所屬技術領域中具通常知識者亦將理解的是，參與產生該還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣的一或多種核苷酸-糖可以與參與產生一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣的核苷酸-糖相同。或者，參與產生該還原端具有GlcNAc的雙醣及/或寡醣的一或多種核苷酸-糖可以與參與產生一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣的核苷酸-糖不同。

產生在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣以及產生在還原端具有GlcNAc單元的雙醣及/或寡醣混合物的方法及/或細胞的內容中所揭露的每個實施例亦揭露在產生混合物之方法的內容中，該混合物包括（i）在還原端具有GlcNAc單元的雙醣及/或寡醣、及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣，較佳為一或多種基於乳糖的人乳寡醣。

此外，本文在產生還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣或包括還原端具有GlcNAc單元的雙醣及/或寡醣的混合物的方法及/或細胞方面的內容中所揭露的每個實施例亦揭露用於產生一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣。例如，為了產生在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣而揭露的醣基轉移酶和核苷酸-糖的量和同一性亦可應用於產生一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣的內容。這同樣適用於本發明的其他態樣，如該細胞產生在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之用途。

另一實施例提供一種藉由基因改造細胞，較佳為單一基因改造細胞產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之方法，該方法包括以下步驟： - 提供能夠合成核苷酸-糖及單醣GlcNAc並能夠醣化該GlcNAc單醣的基因改造細胞， - 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， - 較佳地，自培養物分離該雙醣或寡醣。

在本申請中，除非另有明確說明，「基因改造細胞（genetically modified cell）」或「代謝工程細胞（metabolically engineered cell）」較佳是指分別經過基因改造或代謝工程的細胞，其用於產生根據本發明的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。

根據第二態樣，提供一種代謝工程細胞，其能夠（i）合成核苷酸-糖、（ii）合成N-乙醯葡萄糖胺、及（iii）醣化該N-乙醯葡萄糖胺單醣，其中該細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所揭露的混合物），即，該細胞經代謝工程以用於產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所揭露的混合物）。還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所揭露的混合物）較佳不發生在該代謝工程細胞的野生型中。

因此，本發明提供一種經代謝工程以用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之細胞，其中該細胞能夠（i）合成核苷酸-糖、（ii）合成N-乙醯葡萄糖胺、及（iii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣而形成該雙醣或寡醣。進一步具體說明第二態樣的任何特徵（例如，該核苷酸-糖及醣基轉移酶的量和同一性；包含其混合物之該雙醣或寡醣的量和同一性；等）之本發明的第一態樣之各實施例視為亦揭露在第二態樣的內容中。

在本文所述的方法及細胞中，細胞較佳包括包括編碼一種蛋白質的同一編碼DNA序列的多個拷貝。在本發明的內容中，該蛋白質可為醣基轉移酶、膜轉運蛋白或本文揭露的任何其他蛋白質。在本申請中，「多個（multiple）」表示至少2個，較佳至少3個，更佳至少4個，又更佳至少5個。

在本發明所述的方法和細胞中，細胞較佳對選自以下群組的酶的表現或活性進行基因改造：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶或UDP-葡萄糖4-表異構酶。根據本發明，包括N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶或UDP-葡萄糖4-表異構酶的上述列舉的酶是經修飾的表現或活性的內源性蛋白質，較佳地該內源性蛋白質為過度表現；或者上述組的酶是異源蛋白質，其可以由細胞進行異源表現。然後，異源表現的蛋白質被引入並表現，較佳為過度表現。在另一個實施例中，內源性蛋白質在細胞中可具有經修飾的表現，該細胞亦表現異源蛋白質。異源表現可來自宿主的基因組或也可來自本文所述的引入細胞的載體。

包括N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶或UDP-葡萄糖4-表異構酶的上述列舉的酶可以使用本領域已知的技術經由重組DNA技術產生的多核苷酸表現而產生。所屬技術領域中具通常知識者已知的方法可用於構建含有本發明多肽的編碼序列和適當的轉錄及/或轉譯控制訊號的表現載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術、合成技術及體內基因重組。例如，參照Sambrook et al. （2001） Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. （1989 and yearly updates）中描述的技術。

根據本發明的另一個態樣，提供載體至細胞，該載體含有編碼包括本文所述之N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶或UDP-葡萄糖4-表異構酶的如上所列的酶之多核苷酸，其中該多核苷酸與用該載體轉形的細胞識別的控制序列可操作地連接。在一個特佳的實施例中，該載體為表現載體，根據本發明的另一個態樣，該載體可以質體、黏接質體（cosmid）、噬菌體、脂質體或病毒的形式存在。因此，編碼本發明之多肽的多核苷酸可例如包含在載體中，該載體被穩定轉形/轉染至細胞中。在該載體中，本文所述的多肽的編碼序列受啟動子控制。啟動子可為例如誘導型啟動子，以使基因/多核苷酸的表現可被特定地靶向，如果需要，基因可以此方式過度表現。該啟動子亦可為持續型啟動子。可以使用大量的表現系統以產生本發明的多肽。此載體包括，特別是染色體、外顯體（episomal）和病毒衍生的載體，例如，從細菌質體、噬菌體、轉位子、酵母外顯體、插入元件（insertion elements）、酵母染色體元件、病毒衍生的載體，以及從其組合衍生的載體，如從質體和噬菌體基因元件衍生的載體，如黏接質體和噬質體（phagemids）。這些載體可含有選擇標記，例如但不限於抗生素標記、輔助性標記、毒素-抗毒素標記、RNA有義/反義標記。表現系統構建體可含有調節以及引起表現的控制區域。一般而言，任何適合維持、繁殖或表現多核苷酸及/或在宿主中表現多肽的系統或載體可用於此方面的表現。適當的DNA序列可以藉由各種已知且常規技術中的任一插入至表現系統中，例如上述Sambrook等人提出的技術等。為了進行重組產生，可對細胞進行基因工程，以併入本發明的表現系統或其部分或多核苷酸。將多核苷酸引入細胞可藉由許多標準實驗室手冊中描述的方法進行，如Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology，（1986）及上文的Sambrook等人，1989。

根據本發明的進一步態樣，編碼N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶或UDP-葡萄糖4-表異構酶的多核苷酸適用於各細胞或表現系統的密碼子用法。

在另一實施例，本文所用的細胞包括N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶及N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為能夠將來自UDP-半乳糖供給者的半乳糖單元以分別以β-1,3和β-1,4-依賴性醣苷鍵結方式轉移至在GlcNAc接受者之醣基轉移酶。

在另一較佳實施例中，本文所用的細胞，無論是否經基因改造，能夠產生選自以下群組之核苷酸-糖：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖或UDP-木糖。在進一步實施例中，細胞經基因改造以用於產生該核苷酸-糖。在另一較佳實施例中，細胞經基因改造以用於優化產生該核苷酸-糖。

在另一實施例中，細胞能夠產生UDP-半乳糖。在優化實施例中，細胞經優化以用於UDP-半乳糖產生。在優化實施例中，細胞在UDP-葡萄糖4-表異構酶GalE的表現或活性方面經修飾，該酶能夠將UDP-葡萄糖轉化為UDP-半乳糖。

在進一步實施例中，由細胞合成的核苷酸-糖為UDP-半乳糖且醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。

在較佳實施例中，細胞中產生的雙醣為乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc），其在非還原端含有半乳糖單元，該半乳糖單元分別以β-1,3-或β-1,4-依賴性醣苷鍵結的方式連接至存在於雙醣還原端的GlcNAc部分。在另一較佳實施例中，細胞中產生的寡醣在還原端含有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。

在另一較佳實施例中，根據本發明之由細胞合成的雙醣或寡醣（或本文所述的混合物）在還原端不包括幾丁二糖（即，GlcNAc-b1,4-GlcNAc），更佳為不包括N-聚醣。換句而言，細胞經基因改造以用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣或寡醣（或本文所述的混合物），其中該雙醣或寡醣在還原端不包括幾丁二糖，更佳為不包括N-聚醣。

在另一較佳實施例中，細胞中表現的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶1）具有PFAM域PF00535，並且（i）包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17、或（ii）包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115、或（iii）包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的多肽序列、或（iv）為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性、或（v）包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性、或（vii）包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或2）具有PFAM域IPR002659，並且（i）包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45、或（ii）包括根據SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列、或（iii）為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性、或（iv）包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性、或（v）為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。

在另一較佳實施例中，細胞中表現的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶1）具有PFAM域PF01755，並且（i）包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76、或（ii）包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的多肽序列、或（iii）為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（v）為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能片段，且具有具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或2）具有PFAM域PF00535，並且（i）包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30、或（ii）包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25、或（iii）包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列、或（iv）為SEQ ID NO：58、59或60中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（v）包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vii）包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：26、27或28中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或3）具有PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，並且（i）包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸、或（ii）包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24、或（iii）包括根據SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列、或（iv）為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（v）包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vii）包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或4）具有PFAM域PF03808，並且（i）包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25、或（ii）包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30、或（iii）包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列、或（iv）為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（v）包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vi）為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性、或（vii）包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：39、40或41中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。

本文使用的PFAM模體，PF00535、IPR002659、PF01755、PF02709、PF03808是2020年6月11日發佈的PFAM資料庫Pfam 33.1版本中註釋的蛋白質域。PF00535屬於醣基轉移酶2（GT2）家族，該家族包括將來自UDP-葡萄糖、UDP-N-乙醯基-半乳糖胺、GDP-甘露糖或CDP-阿比可糖（CDP-abequose）的糖轉移到一系列接受者（包括纖維素、多萜醇磷酸（dolichol phosphate）及磷壁酸）的酶。

IPR002659屬於醣基轉移酶家族31（GH31），該家族包括具有許多已知活性的酶，包括N-乙醯乳糖胺β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶（N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase）（2.4.1.149）、β-1,3-半乳糖基轉移酶（2.4.1），岩藻糖特異性β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶（2.4.1）、醯基鞘鞍醇三己糖β-1,3-GalNAc轉移酶（globotriosylceramide β-1,3-GalNAc transferase）（2.4.1.79）。PF01755屬於醣基轉移酶25（GT25）家族。此為參與脂多醣（LPS）的生物合成的醣基轉移酶家族。這些酶在生物合成過程中催化各種糖類轉移到生長中的LPS鏈上。PF02709是指Glyco_transf_7C家族。此為來自廣泛的後生動物（Metazoa）的半乳糖基轉移酶家族的N端域，其具有三種相關的半乳糖基轉移酶活性，在某些情況下，這三種活性都是由一個序列所擁有：EC:2.4.1.90，N-乙醯乳糖胺合成酶、EC:2.4.1.38，β-N-乙醯基葡糖胺-醣肽β-1,4-半乳糖基轉移酶，以及EC:2.4.1.22乳糖合成酶。PF03808是指醣基轉移酶26（GT26）家族，該家族包括具有如β-N-乙醯基甘露糖胺糖醛酸基轉移酶（β-N-acetyl mannosaminuronyltransferase）（EC 2.4.1.-）、β-N-乙醯-甘露糖胺基轉移酶（β-N-acetyl-mannosaminyltransferase）（EC 2.4.1.-）、β-1,4-葡萄糖基轉移酶（EC 2.4.1.-）和β-1,4-半乳糖基轉移酶（EC 2.4.1.-）等活性的酶。

具有與該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶的各類指定的相同PFAM域和模體的蛋白質可以經由RegEx分析進行檢索。

RegEx或稱正規表示式（Regular Expression）特殊的字符序列，其使用模式中的專門語法，幫助配對或搜尋其他字串或字串集。許多程序都可用以進行RegEx檢索。其中一個是Python模組「re」，其提供了對Python中正規表示式的全面支援。詳細訊息，以及所屬技術領域中具通常知識者已知的訊息可得自2019年4月6日發佈的https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2。用於所述發明的蛋白質的RegEx分析已經包括在本文的實施例部分。

醣基轉移酶家族是一個非常廣泛的酶家族，能夠催化以將糖部分從活化的供給者分子轉移到特定的接受者分子，以形成醣苷鍵。已描述使用核苷酸二磷酸糖（nucleotide diphospho-sugar）、核苷酸單磷酸糖（nucleotide monophospho-sugar）和糖磷酸鹽（sugar phosphates）及相關蛋白的醣基轉移酶分類成基於序列的不同家族（Campbell et al., Biochem. J. 326, 929-939 (1997)），並可得自CAZy（CArbohydrat-Active EnZymes）網站（www.cazy.org）。

在另一較佳實施例中，該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶由異源核酸編碼。換句而言，該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶在該細胞中異源地表現。在另一較佳實施例中，該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（i）包括，較佳為來自啤酒酵母菌的具有UniProt ID P43577的多肽序列，或（ii）為具有UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性、或（iii）為具有UniProt ID P43577的多肽的功能片段，並具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶的活性、或（iv）包括或由胺基酸序列組成的多肽，該胺基酸序列具有與UniProt ID P43577的多肽全長胺基酸序列的至少80%的序列同一性，並具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性。在另一較佳實施例中，該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶（i）包括，較佳為來自大腸桿菌的UniProt ID P17169的多肽序列、或（ii）為具有UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性、或（iii）為具有UniProt ID P17169的多肽之功能片段，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性、或（iv）包括或由胺基酸序列組成的多肽，該胺基酸序列具有與UniProt ID P17169的多肽全長胺基酸序列的至少80%的序列同一性，並具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性。在替代性較佳實施例中，該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶（i）包括，較佳為與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌蛋白不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)）的多肽序列、或（ii）為該突變多肽（與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌蛋白不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變）的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與該突變多肽（與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌蛋白不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變）全長的至少80%整體序列同一性，並具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性、或（iii）為該突變多肽（與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌蛋白不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變）的功能片段，並具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性、或（iv）包括或由胺基酸序列組成的多肽，該胺基酸序列具有與該突變多肽（與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌蛋白不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變）全長胺基酸序列的至少80%的序列同一性，並具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性。

整體序列同一性是使用全局比對演算法（global alignment algorithm）確定，例如程式GAP（GCG Wisconsin Package, Accelrys）中的Needleman Wunsch演算法，較佳使用預設參數，且較佳使用成熟蛋白質的序列（即，不考慮分泌訊號或轉運肽）。與整體序列同一性相比，當只考慮保守域或模體時，序列同一性通常會更高。

與SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40或41的多肽、或者UniProt ID P43577或P17169、或者與UniProt ID P17169不同的A39T、R250C和G472S突變的該突變多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性應理解分別為與SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40或41的多肽、或者UniProt ID P43577或P17169、或者與UniProt ID P17169不同的A39T、R250C和G472S突變的該突變多肽中的任一的至少80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %整體序列同一性，如本文所述。來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40或41的多肽、或者UniProt ID P43577或P17169、或者與UniProt ID P17169不同的A39T、R250C和G472S突變的該突變多肽中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列應理解分別為連續胺基酸殘基的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個胺基酸殘基總數以內的寡肽序列中的任一，該連續胺基酸殘基來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40或41的多肽、或者UniProt ID P43577或P17169、或者與UniProt ID P17169不同的A39T、R250C和G472S突變的該突變多肽中的任一，較佳其中該寡肽不與PFAM域完全重疊（如果存在），更佳其中該寡肽不與PFAM域重疊（如果存在）。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，該細胞能夠分解代謝選自包括以下列表的碳源：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣（malto-oligosaccharides）、麥芽三糖（maltotriose）、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖（trehalose）、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜（molasses）、玉米浸液（corn-steep liquor）、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞在醣化反應中使用乳糖以產生寡醣，較佳為本文所述的基於乳糖的MMO。乳糖可以由細胞產生（例如，藉由細胞的代謝及/或如所屬技術領域中具通常知識者所知的為此目的對細胞進行代謝工程後產生)，較佳在細胞內產生，或者可添加到細胞中，該細胞可以通過被動或主動運輸引入該乳糖。由細胞產生乳糖可藉由N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶和UDP-葡萄糖4-表異構酶的表現而獲得。更佳地，該細胞被修飾以促進乳糖產生。該修飾可為選自包括過度表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、過度表現UDP-葡萄糖4-表異構酶的群組的一或多種。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，在醣化反應中使用乳糖作為接受者的細胞較佳具有從培養物中攝取乳糖的轉運體。更佳地，該細胞為攝取乳糖而進行優化。該優化可以是過度表現乳糖轉運體，如大腸桿菌或乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis）的乳糖通透酶。較佳地，細胞持續表現乳糖通透酶。乳糖可以在培養開始時添加，也可以在培養的生長階段形成足夠的生質後立即添加，亦即，藉由向培養物中添加乳糖而起始的基於乳糖的MMO產生階段是與生長階段分開（decoupled）。在較佳實施例中，乳糖是在開始及/或在培養過程中添加的，亦即，生長階段和產生階段沒有分開。

在根據本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，當細胞在乳糖與一或多種其他碳源結合的環境中生長時，細胞抵抗乳糖殺傷現象。用與「乳糖殺傷（lactose killing）」是指細胞在乳糖與其他碳源一起存在的培養基中的生長受阻。在較佳實施例中，細胞經基因改造，使其保留至少50%的乳糖流入而不發生乳糖殺傷，即使在高乳糖濃度下也是如此，如WO 2016/075243所述。該基因修飾包括藉由不導致乳糖殺傷表型的異源啟動子表現及/或過度表現外源及/或內源乳糖轉運體基因及/或修飾乳糖轉運體的密碼子用法，以產生不導致乳糖殺傷表型的該乳糖轉運體的改變表現。WO 2016/075243的內容於此方面併入作為參照。

在本發明的進一步實施例中，果糖-6-磷酸鹽是L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶的基質，該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶在細胞中表現且能夠將果糖-6-磷酸鹽轉換為葡萄糖胺-6-磷酸鹽，作為合成GlcNAc的前驅物。葡萄糖胺-6-磷酸鹽是N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶的基質，該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶在細胞內表現，能夠將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換為N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽。N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽是磷酸酶的基質，該磷酸酶在細胞中表現，能夠將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去磷酸化以合成單醣GlcNAc。

在另一較佳實施例中，該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。在細胞中，N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽可藉由N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶（如nagA）的活性轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，且葡萄糖胺-6-磷酸鹽可藉由葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶（如nagB）的活性轉換成果糖-6-磷酸鹽。如此的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶及/或葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶可藉由所屬技術領域中具通常知識者已知的方法使編碼編碼序列的對應多核苷酸的突變誘發或部分或完全缺失、或控制對應編碼多核苷酸表現的啟動子序列的突變誘發而獲得減少的表現或減少的活性或被去活性。

在一實施例中，細胞能夠合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖。GDP-岩藻糖可藉由在細胞中表現的酶或藉由細胞的代謝而提供。此合成GDP-岩藻糖的細胞可表現將例如添加至細胞的岩藻糖轉換成GDP-岩藻糖的酶。此酶可例如為雙官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶（guanylyltransferase），如來自脆弱擬桿菌（ Bacteroides fragilis）的Fkp、或一種獨立的岩藻糖激酶與一種獨立的岩藻糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶的組合，其該些酶已知來自包括智人（ Homo sapiens）、豬（ Sus scrofa）及褐鼠（ Rattus norvegicus）的幾個物種。

較佳地，該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。

更佳地，該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生。該修飾可選擇自包括UDP-葡萄糖：十一異戊二烯（undecaprenyl）-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除（knock-out）、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase）編碼基因的過度表現、以及甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現之群組中的一或多種。

在一實施例中，該細胞能夠合成核苷酸-糖UDP-半乳糖。UDP-半乳糖可藉由在細胞中表現的酶或藉由細胞的代謝而提供。較佳地，該細胞經修飾以合成UDP-半乳糖。更佳地，該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生。該修飾可選擇自包括5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶（5'-nucleotidase / UDP-sugar hydrolase）編碼基因的剃除、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶（galactose-1-phosphate uridylyltransferase）編碼基因的剃除以及UDP-半乳糖4-表異構酶（如，galE）的過度表現之群組中的一或多種。

在一實施例中，該細胞能夠合成核苷酸-糖CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-唾液酸）。CMP-N-乙醯基神經胺酸可藉由在細胞中表現的酶或藉由細胞的代謝而提供。較佳地，該細胞經修飾以合成CMP-N-乙醯基神經胺酸。更佳地，該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生。該修飾可選擇自CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸（sialate）合成酶編碼基因的過度表現、以及N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現之群組中的一或多種。

CMP-N-乙醯基神經胺酸的合成使用GlcNAc，但如本文所述的細胞中的GlcNAc用於還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的合成。因此，細胞中CMP-N-乙醯基神經胺酸的產生可能會降低可用於產生感興趣的生物產品的GlcNAc，亦即，在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。CMP-N-乙醯基神經胺酸和GlcNAc的產生需要彼此仔細優化，以確保CMP-N-乙醯基神經胺酸和GlcNAc兩者的高水平。優化可能包括有效平衡和微調參與CMP-N-乙醯基神經胺酸和GlcNAc兩者合成的多肽的表現水平。

在另一較佳實施例中，細胞表現至少一種其他醣基轉移酶，以將合成的N-乙醯葡萄糖胺單醣醣化而形成如本文所述的在還原端具有GlcNAc的寡醣。較佳地，表現至少一種醣基轉移酶，以將該GlcNAc單醣醣化而形成雙醣或寡醣。更佳地，該細胞表現至少二種、又更佳至少三種、又更佳至少四種醣基轉移酶，最佳為表現至少五種醣基轉移酶，以將該GlcNAc單醣醣化而形成根據本發明之雙醣或寡醣。該醣基轉移酶可選自包括但不限於以下之列舉：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶、α-1,6-岩藻糖基轉移酶、α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶、α-2,8-唾液酸轉移酶、β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶。在較佳實施例中，該醣基轉移酶為具有經修飾的表現或活性的細胞內源性蛋白質，較佳地，該內源性醣基轉移酶是過度表現；或者該醣基轉移酶是異源性蛋白質，其異源地引入至該細胞並在該細胞中表現，較佳為過度表現。該內源性醣基轉移酶可在細胞中具有經修飾的表現，其亦表現異源性醣基轉移酶。如此合成的寡醣可為線性類型或分支類型並且可包含多個單醣建構區塊（monosaccharide building blocks），如本文所述的定義中所解釋。

藉由在如本文所述的相同細胞中組合不同的活性醣基轉移酶，產生GlcNAc和包含UDP-半乳糖（UDP-Gal）的核苷酸-活性糖，其包括UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽、 UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖或UDP-木糖，該細胞能夠產生根據通式1的還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣：

如本文所述的寡醣可以線性或分支結構形成，其包含α-和β-醣苷鍵兩者或可僅包含β-醣苷鍵，其中B為N-乙醯葡萄糖胺，且其中A、V、W、X、Y及/或Z不存在，或為半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、N-乙醯基神經胺酸、N-乙醇醯神經胺酸、葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯葡萄糖胺及/或由通式2定義的寡醣結構：

其中B為N-乙醯葡萄糖胺，其中A、V、W、X、Y及/或Z不存在，或為半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、N-乙醯基神經胺酸、N-乙醇醯神經胺酸、葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯甘露糖胺或N-乙醯葡萄糖胺，且在通式1及通式2中，m是3且可選地v是4，或者m是4且可選地v是3，並且其中p是3及/或4，且其中w是6，並且其中如果n＞1且p是3，x是3且X不是單醣，並且其中如果n＞1且p為4，y是4且Y不是單醣，並且其中z是6，且其中n從1至10。

在較佳實施例中，如本文所述的細胞在該其他糖基轉移酶的表現或活性方面被修飾。

在另一較佳實施例中，如本文所述之方法及由本文所述之細胞所產生的還原端具有GlcNAc單元之寡醣選擇自包括以下之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3'-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3'-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（P1 trisaccharide）（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（xenotransplantation epitope）（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。

在根據本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞表現膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽，以轉運化合物穿過細胞壁的外膜。在本發明的方法及/或細胞的更佳實施例中，細胞在該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽的表現或活性方面被修飾。該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽為具有經修飾的表現或活性的細胞內源性蛋白質，較佳為該內源性膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽為過度表現；或者，該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽為異源性蛋白質，其異源地引入該細胞並在該細胞中表現，較佳為過度表現。該內源性膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽可在細胞中具有修飾的表現，該細胞亦表現異源性膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽。

在本發明的方法及/或細胞的更佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽選自包括以下的列舉：運輸蛋白、P-P-鍵-水解-驅動的轉運體、β-桶狀孔蛋白、輔助轉運蛋白、推定轉運蛋白及磷酸轉移-驅動組轉位蛋白。在本發明的方法及/或細胞的又更佳實施例中，運輸蛋白包括MFS轉運體、糖排出轉運體及螯鐵蛋白輸出體。在本發明的方法及/或細胞的另一更佳實施例中，P-P-鍵-水解-驅動的轉運體包括ABC轉運體及螯鐵蛋白輸出體。

在本發明之方法及/或細胞的另一較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣在細胞壁外膜上的流動。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該還原端具有GlcNAc單元的雙醣及寡醣在細胞壁外膜上的流動。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該一或多種基於乳糖的MMO在細胞壁外膜上的流動。

在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制一或多種前驅物在細胞壁外膜上的流動，該前驅物用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制一或多種前驅物在細胞壁外膜上的流動，該前驅物用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣及寡醣。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制一或多種前驅物在細胞壁外膜上的流動，該前驅物用於產生一或多種基於乳糖的MMO。

在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制一或多種接受者在細胞壁外膜上的流動，該接受者用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制一或多種接受者在細胞壁外膜上的流動，該接受者用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣及寡醣。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制一或多種接受者在細胞壁外膜上的流動，該接受者用於產生該一或多種基於乳糖的MMO。

在本發明之方法及/或細胞的另一較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的改善產生。在本發明之方法及/或細胞的另一較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該還原端具有GlcNAc單元的雙醣及寡醣的改善產生。在本發明之方法及/或細胞的另一較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該一或多種基於乳糖的MMO的改善產生。

在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供允許該還原端具有GlcNAc殘基的雙醣或寡醣的流出。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供允許該還原端具有GlcNAc殘基的雙醣及寡醣的流出。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供允許該一或多種基於乳糖的MMO的流出。

在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供促進該還原端具有GlcNAc殘基的雙醣或寡醣的流出。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供促進該還原端具有GlcNAc殘基的雙醣及寡醣的流出。在本發明之方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供促進該一或多種基於乳糖的MMO的流出。

在本發明之方法及/或細胞的另一較佳實施例中，細胞表現選自包括乳糖轉運體的群組的多肽，例如LacY或lac12通透酶、葡萄糖轉運體、半乳糖轉運體、岩藻糖轉運體、核苷酸活性糖的轉運體，例如UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc或CMP-唾液酸的轉運體。如此，該轉運體將內化經添加前驅物及/或接受者的培養基，以用於合成在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及/或基於乳糖的MMO。

在本發明之方法及/或細胞的更佳實施例中，細胞表現屬於MFS轉運體家族的膜轉運蛋白，例如來自包括大腸桿菌（UniProt ID P0AEY8）、阪崎腸桿菌（ Cronobacter muytjensii）（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、楊氏檸檬酸桿菌（ Citrobacter youngae）(UniProt ID D4BC23)和肺炎克雷伯氏菌（ Yokenella regensburgei）（UniProt ID G9Z5F4）物種的多藥轉運體MdfA家族的MdfA多肽。在本發明之方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞表現屬於糖排出轉運體家族的膜轉運蛋白，例如來自包含大腸桿菌（UniProt ID P31675）、科氏檸檬酸桿菌（ Citrobacter koseri）（UniProt ID A0A078LM16）和克雷伯氏菌肺炎菌（ Klebsiella pneumoniae ）（UniProt ID A0A0C4MGS7）的物種的SetA家族的SetA多肽。在本發明之方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞表現屬於螯鐵蛋白輸出體家族的膜轉運蛋白，例如大腸桿菌entS（UniProt ID P24077）和大腸桿菌iceT（UniProt ID A0A024L207）。在本發明之方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞表現屬於ABC轉運體家族的膜轉運蛋白，例如來自大腸桿菌的oppF（UniProt ID P77737）、來自乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙醯生物突變株（ Lactococcus lactis subsp. lactis bv. Diacetylactis）（UniProt ID A0A1V0NEL4）的lmrA以及來自雙叉乳桿菌嬰兒亞種（ Bifidobacterium longum subsp. Infantis ）（UniProt ID B7GPD4）的Blon_2475。

根據本發明的方法及/或細胞的另一實施例，細胞能夠產生磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。根據本發明的方法及/或細胞的另一實施例，細胞包含還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的產生途徑，其包括PEP的產生途徑。在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，與未修飾的先驅細胞（progenitor）相比，該細胞被修飾以促進PEP的產生及/或供應。

在另一較佳實施例中，細胞包含還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的產生途徑，其包括與未修飾的先驅細胞相比，用於促進PEP的產生及/或供應的任一或多個修飾。

在較佳實施例中且作為促進PEP產生及/或供應的手段，一或多個PEP依賴性的糖轉運磷酸轉移酶系統被破壞，例如但不限於：1）N-乙醯基-D-葡糖胺 Npi-磷酸轉移酶（EC 2.7.1.193），例如由大腸桿菌或芽孢桿菌中的nagE基因（或簇nagABCD）編碼、2）編碼酶ll Man複合物（甘露糖PTS通透酶、蛋白質-Npi-磷酸組胺酸-D-甘露糖磷酸轉移酶）的ManXYZ導入外源己糖（甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-脫氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙醯葡萄糖胺等）並將磷酸酯釋放到細胞質中、3）葡萄糖特異性PTS轉運體（例如由PtsG/Crr編碼），其吸收葡萄糖並在細胞質中形成葡萄糖-6-磷酸鹽、4）蔗糖特異性PTS轉運體，其吸收蔗糖並在細胞質中形成蔗糖-6-磷酸鹽、5）果糖特異性PTS轉運體（例如由基因fruA和fruB和激酶fruK編碼，其吸收果糖並在第一步中形成果糖-1-磷酸鹽且在第二步中形成果糖1,6-二磷酸鹽、6）乳糖PTS轉運體（例如，由乾酪乳桿菌（ Lactococcus casei）中的lacE 編碼），其吸收乳糖並形成乳糖-6-磷酸鹽、7）半乳糖醇特異性PTS酶，其吸收半乳糖醇及/或山梨醇並分別形成半乳糖醇-1-磷酸鹽或山梨醇-6-磷酸鹽、8）甘露醇特異性PTS酶，其吸收甘露醇及/或山梨醇並分別形成甘露醇-1-磷酸鹽或山梨醇-6-磷酸鹽、以及9）海藻糖特異性PTS酶，其吸收海藻糖並形成海藻糖-6-磷酸鹽。

在另一及/或另外較佳實施例且作為促進PEP產生及/或供應的手段，藉由破壞PtsIH/Crr基因簇而破壞PTS系統整體。PtsI（酶 I）是細胞質蛋白，其可作為大腸桿菌K-12的磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸轉移酶系統（PTSsugar）的門戶。PtsI是PTSsugar的兩種（PtsI和PtsH）糖非特異性蛋白質建構之一，其與糖特異性內膜通透酶一起影響磷酸轉移級聯（phosphotransfer cascade），導致多種碳水化合物基質的耦合磷酸化及轉運。HPr（含組胺酸蛋白質）是PTSsugar的兩種糖非特異性蛋白質建構之一。其接受來自磷酸化酶I(PtsI-P)的磷醯基，接著將其轉移到PTSsugar的許多糖特異性酶（統稱為酶II）中的任一種的EIIA域。Crr或EIIAGlc在需要PtsH和PtsI的反應中藉由PEP磷酸化。

在另一及/或另外較佳實施例，藉由引入及/或過度表現對應的通透酶，進一步修飾細胞以補償碳源的PTS系統缺失。這些是例如通透酶或ABC轉運體，其包括但不限於特異性輸入乳糖（例如由大腸桿菌的LacY基因編碼的轉運體等）、蔗糖（例如由來自大腸桿菌的cscB基因編碼的轉運體等）、葡萄糖（例如由來自大腸桿菌的galP基因編碼的轉運體等）、果糖（例如由變異鏈球菌（Streptococcus mutans）的fruI基因編碼的轉運體等）、或山梨醇/甘露醇ABC轉運蛋白（例如由類紅球桿菌（ Rhodobacter sphaeroides ）的SmoEFGK簇編碼的轉運體等）、海藻糖/蔗糖/麥芽糖轉運體（例如由苜蓿中華根瘤菌（ Sinorhizobium meliloti）的基因簇ThuEFGK編碼的轉運轉運體等）、和N-乙醯葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖轉運體（例如由奧奈達希瓦氏菌（ Shewanella oneidensis ）的NagP編碼的轉運體）之轉運體。PTS缺失與替代轉運體過度表現的組合的例子是：1）葡萄糖PTS系統（例如，ptsG基因）的缺失結合葡萄糖通透酶（例如，glcP的galP）的引入及/或過度表現、2）果糖PTS系統（例如，一或多個fruB、fruA、fruK基因）的缺失結合果糖通透酶（例如，fruI）的引入及/或過度表現、3）乳糖PTS系統的缺失結合乳糖通透酶（例如，LacY）的引入及/或過度表現、及/或4）蔗糖PTS系統的缺失結合蔗糖通透酶（例如，cscB）的引入及/或過度表現。

在進一步較佳實施例中，藉由引入碳水化合物激酶（例如葡萄糖激酶（EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63）、半乳糖激酶（EC 2.7.1.6）及/或果糖激酶（EC 2.7.1.3、EC 2.7.1.4））修飾細胞以補償碳源的PTS系統的缺失。PTS缺失與替代轉運體和激酶的過度表現的組合的例子是：1）葡萄糖PTS系統（例如，ptsG基因）的缺失結合葡萄糖通透酶（例如，glcP的galP）的引入及/或過度表現、結合葡萄糖激酶（例如，glk）的引入及/或過度表現、及/或2）果糖PTS系統（例如，一或多個fruB、fruA、fruK基因）的缺失結合結合果糖通透酶（例如，fruI）的引入及/或過度表現、結合果糖激酶（例如，frk或mak）的引入及/或過度表現。

在另一及/或另外較佳實施例並且作為促進PEP產生及/或供應的手段，藉由包含以下列舉中的任一或多種進行引入或修飾：磷酸烯醇丙酮酸合成酶活性（例如在大腸桿菌中由ppsA編碼的EC: 2.7.9.2）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性（分別例如在麩胺酸棒狀桿菌（ Corynebacterium glutamicum）中由PCK編碼或在大腸桿菌中由pckA編碼的EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49）、磷酸烯醇丙酮酸羧酶活性（例如在大腸桿菌中由ppc編碼的EC 4.1.1.31）、草醯乙酸鹽去羧酶（oxaloacetate decarboxylase）（例如在大腸桿菌中由eda編碼的EC 4.1.1.112）、丙酮酸激酶活性（例如在大腸桿菌中由pykA及pykF編碼的EC 2.7.1.40）、丙酮酸羧酶活性（例如在枯草芽孢桿菌中由pyc編碼的EC 6.4.1.1）和蘋果酸脫氫酶活性（分別例如在大腸桿菌中由maeA或maeB編碼的EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.40）。

在更佳實施例中，細胞經修飾以過度表現任一或多種多肽，其包括來自大腸桿菌的ppsA（UniProt ID P23538）、來自麩胺酸棒狀桿菌的PCK（UniProt ID Q6F5A5）、來自大腸桿菌的pcka（UniProt ID P22259）、來自大腸桿菌的eda（UniProt ID P0A955）、來自大腸桿菌的maeA（UniProt ID P26616）和來自大腸桿菌的maeB（UniProt ID P76558）。

在另一及/或另外較佳實施例，細胞經修飾以表現具有磷酸烯醇丙酮酸合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、草醯乙酸鹽去羧酶活性或蘋果酸脫氫酶活性的任一或多種多肽。

在另一及/或另外較佳實施例並且作為促進PEP產生及/或供應的手段，藉由磷酸烯醇丙酮酸羧酶活性及/或丙酮酸激酶活性的降低活性，較佳為編碼磷酸烯醇丙酮酸羧酶、丙酮酸羧酶活性及/或丙酮酸激酶的基因缺失進行細胞修飾。

在例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合丙酮酸羧酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合丙酮酸激酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合丙酮酸羧酶基因的缺失、蘋果酸脫氫酶的過度表現結合丙酮酸激酶基因的缺失、蘋果酸脫氫酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、及/或蘋果酸脫氫酶的過度表現結合丙酮酸羧酶基因的缺失。

在另一例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現、及/或磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現。

在另一例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失。

在另一例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失。

在另一例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因的缺失。

在另一例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失。

在另一例示性實施例中，細胞藉由不同的適應進行基因改造，例如磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現結合蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現及草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因的缺失和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失、磷酸烯醇丙酮酸合成酶的過度表現結合草醯乙酸鹽去羧酶的過度表現及蘋果酸脫氫酶的過度表現及丙酮酸激酶基因和丙酮酸羧酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因的缺失。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，用於降低乙酸鹽產生的修飾。該修飾可選自包括以下的群組之任一或多種：乙醯輔酶A合成酶的過度表現、丙酮酸脫氫酶、完全或部分剃除或降低功能的丙酮酸脫氫酶和完全或部分剃除或降低功能的乳酸脫氫酶。

在本發明的方法及/或細胞的進一步實施例中，細胞在至少一種乙醯輔酶A合成酶（例如，來自大腸桿菌、啤酒酵母菌、智人、小鼠的acs）的表現或活性方面進行修飾。在較佳實施例中，該乙醯輔酶A合成酶為具有經修飾的表現或活性的細胞內源性蛋白質，較佳為該乙醯輔酶A合成酶為過度表現；或者，該乙醯輔酶A合成酶為異源性蛋白質，其異源地引入該細胞並在該細胞中表現，較佳為過度表現。該內源性乙醯輔酶A合成酶可在細胞中具有修飾的表現，該細胞亦表現異源性乙醯輔酶A合成酶。在更佳實施例中，細胞在乙醯輔酶A合成酶的表現或活性方面進行修飾，例如來自大腸桿菌（UniProt ID P27550）的acs。在另一及/或另外較佳實施例，細胞在來自大腸桿菌（UniProt ID P27550）的acs的功能性同源物、變體或衍生物的表現或活性方面進行修飾，該功能性同源物、變體或衍生物具有與來自大腸桿菌（UniProt ID P27550）的該多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有乙醯輔酶A合成酶活性。

在本發明的方法及/或細胞的替代及/或另外進一步實施例中，細胞在至少一種丙酮酸脫氫酶（例如，來自大腸桿菌、啤酒酵母菌、智人及褐鼠）的表現或活性方面進行修飾。在較佳實施例中，藉由所屬技術領域中具通常知識者已知的手段修飾為具有至少一種部分或完全剔除或突變的丙酮酸脫氫酶編碼基因，從而產生至少一種功能較差或失能的丙酮酸脫氫酶活性的蛋白質。在更佳實施例中，細胞的poxB編碼基因被完全剃除，導致細胞缺乏丙酮酸脫氫酶活性。

在本發明的方法及/或細胞的替代及/或另外進一步實施例中，細胞在至少一種乳酸脫氫酶（例如，來自大腸桿菌、啤酒酵母菌、智人及褐鼠）的表現或活性方面進行修飾。在較佳實施例中，藉由所屬技術領域中具通常知識者已知的手段修飾為具有至少一種部分或完全剔除或突變的乳酸脫氫酶編碼基因，從而產生至少一種功能較差或失能的乳酸脫氫酶活性的蛋白質。在更佳實施例中，細胞的ldhA編碼基因被完全剃除，導致細胞缺乏乳酸脫氫酶活性。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，任一或多種蛋白質的較低或減少的表現及/或消除、受損、降低或延遲的活性，該蛋白質包含：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯轉移酶（galactoside O-acetyltransferase）、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶（UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase）、L-岩藻酮糖激酶（L-fuculokinase）、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯神經胺酸解離酶（N-acetylneuraminate lyase）、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸鹽2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸鹽腺苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸鹽異構酶、有氧呼吸調控蛋白（aerobic respiration control protein）、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶酶IIBC成分ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶（PTS）酶IIBC成分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯轉移蛋白（fructose-specific PTS multiphosphoryl transfer protein）FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸鹽解離酶、乙酸鹽激酶、磷醯基轉移酶（phosphoacyltransferase）、磷酸乙醯轉移酶（phosphate acetyltransferase）、丙酮酸去羧酶。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，該細胞包含至少部分失活的所選單醣、雙醣或寡醣的分解代謝途徑，該單醣、雙醣或寡醣參與還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的產生及/或為產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣所需。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞使用前驅物以產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，較佳地，該前驅物從培養基供給細胞。根據方法及/或細胞的更佳態樣，細胞使用至少兩種前驅物以產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，較佳地，該前驅物從培養基供給細胞。根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳態樣，細胞產生至少一種前驅物，較佳為至少兩種前驅物，以產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。在本方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的前驅物完全轉化為該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞在整個培養液及/或上清液產生90 g/L或多於90 g/L的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。在更佳實施例中，在整個培養液及/或上清液中產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣具有至少80%的純度，其以在整個培養液及/或上清液中分別由細胞產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣及其前驅物的總量計。

本發明的另一實施例提供一種方法及細胞，其中還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣產生在及/或由本文所述的真菌、酵母、細菌、昆蟲、動物、植物或原生動物細胞所產生。表現系統或細胞選自包括細菌、酵母或真菌的列表，或指植物或動物細胞。細胞選自包括細菌、酵母、原生動物或真菌、或者所指的植物或動物細胞之列舉。後者的細菌較佳屬於變形菌（Proteobacteria）門或厚壁菌（Firmicutes）門或藍細菌（Cyanobactria）門或者異常球菌-棲熱菌（Deinococcus-Thermus）門。屬於變形菌門的後者細菌較佳屬於腸桿菌科（Enterobacteriaceae），較佳屬於大腸桿菌種。後者細菌較佳關於屬於大腸桿菌種的任何菌株，例如但不限於大腸桿菌B、大腸桿菌C、大腸桿菌W、大腸桿菌K12、大腸桿菌Nissle。更具體而言，後者用與關於培養的大腸桿菌菌株——稱為大腸桿菌菌株K12菌株—其非常適合於實驗室環境，並且與野生型菌株不同，其已喪失了在腸中繁殖的能力。大腸桿菌菌株K12菌株的已知實例是K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111和AA200。因此，本發明特別關於如上所述突變和/或轉形的大腸桿菌宿主細胞或菌株，其中該大腸桿菌菌株是K12菌株。更具體而言，大腸桿菌菌株K12菌株是大腸桿菌MG1655。屬於厚壁菌門的後者細菌較佳屬於芽孢桿菌綱（Bacilli），較佳屬於乳桿菌目（Lactobacilliales），其成員例如，乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）、腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），或芽孢桿菌目（Bacillales），其成員例如，來自芽孢桿菌屬，例如，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或解澱粉芽孢桿菌（ B. amyloliquefaciens）。屬於放線菌（Actinobacteria）門的後者細菌較佳屬於棒桿菌科（Corynebacteriaceae），其成員為麩胺酸棒狀桿菌或非發酵棒桿菌（C. afermentans），或屬於鏈黴菌科（Streptomycetaceae），其成員為灰鏈黴菌（ Streptomyces griseus）或弗雷迪鏈黴菌（ S. fradiae）。後者酵母較佳屬於子囊菌門（Ascomycota）或擔子菌門（Basidiomycota）或半知菌門（Deuteromycota）或接合菌門（Zygomycetes）。後者酵母較佳屬於酵母屬（ Saccharomyces）（其成員為例如，啤酒酵母菌、貝酵母（ S. bayanus ）、布拉氏酵母菌（ S. boulardii））、接合酵母菌屬（ Zygosaccharomyces）、畢赤酵母菌屬（Pichia）（其成員為例如，巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）、異常畢赤酵母（ P. anomala）、克魯維畢赤酵母（ P. kluyveri））、克馬格特勒酵母（ Komagataella）、漢遜氏酵母菌屬（ Hansenula）、克魯維酵母菌屬（ Kluyveromyces）（其成員為例如，乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母（ K. marxianus）、耐熱克魯維酵母（ K. thermotolerans)））、德巴利酵母菌屬（ Debaromyces）、子囊菌酵母屬（ Yarrowia）（其成員為例如，解脂耶氏酵母（ Yarrowia lipolytica））或擬球酵母菌屬（ Starmerella）（其成員為例如，球擬假絲酵母（ Starmerella bombicola）。後者的酵母較佳選自巴斯德畢赤酵母、解脂耶氏酵母（ Yarrowia lipolitica）、啤酒酵母菌及乳酸克魯維酵母。後者真菌較佳屬於黑黴菌屬（ Rhizopus）、網柱黏菌屬（ Dictyostelium）、青黴菌屬（ Penicillium）、白黴菌屬（ Mucor）或麴菌屬（ Aspergillus）。植物細胞包括開花和非開花植物細胞，以及藻類細胞，例如單胞藻屬（Chlamydomonas）、綠球藻屬（Chlorella）等。較佳地，植物是煙草、苜蓿、稻米、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米或穀類植物。後者的動物細胞較佳衍生自非人類哺乳動物（例如，牛、水牛、豬、羊、小鼠、大鼠）、鳥類（例如，雞、鴨、鴕鳥、火雞、雉）、魚類（例如，箭魚、鮭魚、鮪、海鱸、鱒魚、鯰魚）、無脊椎動物（例如，龍蝦、螃蟹、蝦、蛤蜊、牡蠣、貽貝、海膽）、爬蟲類（例如，蛇、鱷魚、烏龜）、兩棲類（例如，青蛙）或昆蟲類（例如，蒼蠅、線蟲）或為基因改造細胞株，其衍生自排除胚胎幹細胞的人類細胞。人類和非人類哺乳動物細胞均較佳選自包含上皮細胞的列舉，例如，乳腺上皮細胞、胚胎腎細胞（例如，HEK293或HEK 293T細胞）、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、鼠骨髓瘤細胞，例如N20、SP2/0或YB2/0細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，如WO21067641所述。後者的昆蟲細胞較佳衍生自秋行軍蟲（Spodoptera frugiperda），例如，Sf9或Sf21細胞、蠶（Bombyx mori）、甘藍夜蛾（Mamestra brassicae）、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）等，例如BTI-TN-5B1-4細胞或黑腹果蠅（Drosophila melanogaster），例如果蠅S2細胞。後者的原生動物細胞較佳為狼蛛利什曼原蟲（Leishmania tarentolae）細胞。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞為活的革蘭氏陰性菌，其包含與未修飾的先驅細胞相比，降低或消除聚-N-乙醯-葡萄糖胺（PNAG）、腸細菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸（colanic acid）、核心寡醣、滲壓調節間質葡聚糖（Osmoregulated Periplasmic Glucan，OPG）、葡萄糖基甘油（Glucosylglycerol）、聚醣及/或海藻糖的合成。

在方法及/或細胞的更佳實施例中，該降低或消除聚-N-乙醯-葡萄糖胺（PNAG）、腸細菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲壓調節間質葡聚糖（OPG）、葡萄糖基甘油、聚醣及/或海藻糖的合成是由參與該聚-N-乙醯-葡萄糖胺（PNAG）、腸細菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲壓調節間質葡聚糖（OPG）、葡萄糖基甘油、聚醣及/或海藻糖中的任一合成的任一或多種醣基轉移酶的突變所提供，其中該突變提供任一種該醣基轉移酶的缺失或較低的表現。該醣基轉移酶包括醣基轉移酶基因，其編碼聚-N-乙醯-D-葡萄糖胺合成酶子單元、UDP-N-乙醯葡萄糖胺—十一異戊二烯-磷酸N-乙醯葡萄糖胺磷酸轉移酶、Fuc4NAc（4-乙醯胺基-4,6-雙去氧-D-半乳糖）轉移酶、UDP-N-乙醯基-D-甘露糖胺糖醛酸轉移酶（UDP-N-acetyl-D-mannosaminuronic acid transferase）、編碼纖維素合成酶催化子單元的醣基轉移酶基因、纖維素生物合成蛋白、可拉酸生物合成葡萄糖醛酸轉移酶（colanic acid biosynthesis glucuronosyltransferase）、可拉酸生物合成半乳糖基轉移酶、可拉酸生物合成岩藻糖基轉移酶、UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、推定的結腸生物合成醣基轉移酶（putative colanic biosynthesis glycosyl transferase）、UDP-葡萄糖醛酸鹽：LPS(HepIII)醣基轉移酶、ADP-庚糖—LPS庚糖基轉移酶（heptosyltransferase）2、ADP-庚糖：LPS庚糖基轉移酶1、推定的ADP-庚糖：LPS庚糖基轉移酶4、脂多醣核心生物合成蛋白、UDP-葡萄糖:（葡萄糖基）LPS α-1,2-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-葡萄糖：（葡萄糖基）LPS α-1,3-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-半乳糖：（葡萄糖基）脂多醣-1,6-D-半乳糖基轉移酶、脂多醣葡萄糖基轉移酶I、脂多醣核心庚糖基轉移酶3、β-1,6-呋喃半乳糖基轉移酶（β-1,6-galactofuranosyltransferase）、十一異戊二烯-磷酸4-去氧-4-甲磺醯胺-L-阿拉伯糖轉移酶、脂質IVA 4-胺基-4-去氧-L-阿拉伯糖基轉移酶、細菌萜醇葡萄糖基轉移酶（bactoprenol glucosyl transferase）、堆定的家族2醣基轉移酶、滲壓調節間質葡聚糖（OPG）生物合成G、OPG生物合成H、葡萄糖基甘油酸酯（glucosylglycerate）磷酸化酶、酐醣合成酶（glycogen synthase）、1,4-α-葡聚糖分支酶、4-α葡聚糖轉移酶（4-α-glucanotransferase）及海藻糖-6-磷酸鹽合成酶。在例示性實施例中。細胞在包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP的任一或多種醣基轉移酶中發生突變，其中該突變提供該醣基轉移酶中任一的缺失或較低的表現。

在方法及/或細胞的替代及/或另外較佳實施例中，該降低或消除聚-N-乙醯-葡萄糖胺（PNAG）的合成是藉由碳儲存調節子編碼基因的過度表現、Na+/H+反向運輸調節劑編碼基因的缺失及/或感測器組胺酸激酶編碼基因的缺失提供。

如本文所述的微生物或細胞能夠在單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米漿、蛋白腖、胰蛋白腖、酵母萃取物的複合培養基或其混合物（例如，混合原料，較佳為混合單醣原料，例如水解蔗糖）作為主要碳源上生長。用語「複合培養基（complex medium）」是指其未定義的精確構成介質。該用與主要是指所關注的生物產品、生質形成、二氧化碳及/或副產物形成（例如，酸及/或醇，例如乙酸鹽、乳酸及/或乙醇）的最重要的碳源，即所有所需碳的20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、99%來自上述所指碳源。在本發明的實施例中，該碳源是該生物體的唯一碳源，即所有所需碳的100%源自上述所指碳源。通常主要碳源包括但不限於葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖漿、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸和丙酮酸。用語複合培養基是指其未定義的精確構成介質。實例為糖蜜、玉米漿、蛋白腖、胰蛋白腖或酵母萃取物。

在進一步較佳實施例中，此處描述的微生物或細胞使用具有產生途徑和生質途徑的分裂代謝，如WO2012/007481所述，其藉由併入本文作為參照。可以例如藉由改變選自以下的基因而對該生物體進行基因改造以累積果糖-6-磷酸鹽，該基因選自：磷酸葡萄糖異構酶（phosphoglucoisomerase）基因、磷酸果糖激酶基因、果糖-6-磷酸鹽醛醇縮酶基因、果糖異構酶基因及/或果糖：PEP磷酸轉移酶基因。

根據本發明方法的另一實施例中，允許產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的條件包括使用包含至少一種前驅物及/或接受者的培養基以用於產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。較佳地，培養基包含選自包括乳糖、半乳糖、岩藻糖、唾液酸的群組的至少一種前驅物。

根據本發明方法的替代及/或另外的實施例，允許產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的條件包括向培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料以用於產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。

根據本發明方法的替代實施例，允許產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的條件包括使用培養基培養本發明的細胞以產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，其中該培養基缺乏用於產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的任何前驅物及/或接受者，並且進一步結合向該培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料以用於產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。

在較佳實施例中，如本文所述的用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之方法，其包括以下步驟中的至少一者： i) 使用包括至少一種前驅物及/或接受者的培養基； ii) 向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，並且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，較佳以連續方式，並且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且其中較佳地，該前驅物及/或接受者原料的pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該前驅物及/或接受者原料的溫度維持在20°C與80°C之間； iv) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基； v) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基，且其中較佳地，該進料溶液的pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。

在另一及/或另外較佳實施例，如本文所述的用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之方法，其包括以下步驟中的至少一者： i) 使用每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的培養基，其中反應器體積為250 mL至10,000 m ³（立方米）； ii) 以一次脈衝輸送或以不連續（脈衝輸送）方式將至少一種前驅物及/或接受者添加至培養基，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳地使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料脈衝之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 以一次脈衝輸送或以不連續（脈衝輸送）方式向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料脈衝之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且其中該前驅物及/或接受者原料脈衝的pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該前驅物及/或接受者原料脈衝的溫度維持在20°C與80°C之間； iv) 藉由進料溶液的手段在5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天的過程中以不連續（脈衝輸送）方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基； v) 藉由進料溶液的手段在5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天的過程中以不連續（脈衝輸送）方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基，且其中該進料溶液的pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。

在進一步更佳的實施例中，如本文所述的用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之方法，其包括以下步驟中的至少一者： i) 使用每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米）； ii) 添加每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的乳糖原料至培養基，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該乳糖原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 添加每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的乳糖原料至培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該乳糖原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且其中較佳地，該乳糖原料的pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該乳糖原料的溫度維持在20°C與80°C之間； iv) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加乳糖原料至培養基； v) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加乳糖原料至培養基，且其中該乳糖進料溶液的濃度為50 g/L，較佳為75 g/L，更佳為100 g/L，更佳為125 g/L，更佳為150 g/L，更佳為175 g/L，更佳為200 g/L，更佳為225 g/L，更佳為250 g/L，更佳為275 g/L，更佳為300 g/L，更佳為325 g/L，更佳為350 g/L，更佳為375 g/L，更佳為400 g/L，更佳為450 g/L，更佳為500 g/L，又更佳為550 g/L，最佳為600 g/L；且其中較佳地，該進料溶液的pH設定在3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。

在本文所述的方法的進一步實施例中，宿主細胞培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。

在較佳實施例中，在培養基中提供碳源（較佳為蔗糖）持續3天或3天以上，較佳為長達7天；及/或在培養基中以連續方式提供每公升初始培養體積至少100克，較佳為至少105克，更佳為至少110克，又更佳為至少120克蔗糖，使得培養基的最終體積不超過培養前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，更佳為小於兩倍。

較佳地，當進行如本文所述的方法時，在第二階段將前驅物添加至培養物之前，藉由向培養基添加碳源（較佳為葡萄糖或蔗糖）而提供指數細胞生長的第一階段。

在本發明方法之另一較佳實施例中，藉由向包含前驅物的培養基添加碳類基質（較佳為葡萄糖或蔗糖）而提供指數細胞生長的第一階段，接著在第二階段，其中僅將碳類基質（較佳為葡萄糖或蔗糖）添加到培養物中。

在本發明方法之另一較佳實施例中，藉由向包含前驅物的培養基中加入碳類基質（較佳為葡萄糖或蔗糖）而提供指數細胞生長的第一階段，接著在第二階段，其中碳類基質（較佳為葡萄糖或蔗糖）及前驅物添加到培養物中。

在替代性較佳實施例中，如本文所述的方法，前驅物已在指數增長的第一階段與碳類基質一起添加。

如本文所述的用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之方法，其進一步包括：自細胞或其生長的培養基中分離該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之步驟。

用與「分離（separating）」是指從細胞及/或其生長的培養基中收穫、收集或回收還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣或其混合物。

在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣可以常規方式從細胞在其中生長的水性培養基中分離。在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣仍然存在於產生還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的細胞中的情況下，則能夠使用常規方法以釋放或萃取還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣至細胞外，如使用高pH、熱休克、音振、法式壓碎、均質化、酶水解、化學水解、溶劑水解、清潔劑、水解等破壞細胞。接著可將培養基及/或細胞萃取物一起和單獨地進一步用於分離還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。此較佳地包括使含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物澄清以去除懸浮顆粒及污染物，特別是細胞、細胞成分、不溶性代謝物和藉由培養基因改造細胞產生的碎片。在此步驟中，在含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物可以常規方式進行澄清。較佳地，在含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物藉由離心、凝聚、傾析及/或過濾進行澄清。自含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物分離還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的另一步驟較佳包括自含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物，較佳地在進行澄清之後，實質上去除所有蛋白質，以及胜肽、胺基酸、RNA及DNA和任何內毒素和醣脂，其可能會干擾隨後的分離步驟。在此步驟中，可以常規方式自含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物去除蛋白質和相關雜質。較佳地，藉由超微過濾、奈米過濾、兩相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流（tangential flow）高性能過濾、切向流超微過濾、電泳（例如，使用平板-聚丙烯醯胺或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE））、親和層析（使用親和配體，包括例如DEAE-Sepharose、聚-L-離胺酸及多黏菌素-B（polymyxin-B）、內毒素選擇性吸附劑基質）、離子交換層析（例如但不限於，陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換、裏面朝外配體連接（inside-out ligand attachment））、疏水交互作用層析及/或凝膠過濾（即，尺寸排阻層析），特別是藉由層析法，更具體而言藉由離子交換層析或疏水交互作用層析或配體交換層析，自含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物去除蛋白質、鹽類、副產物、色素、內毒素和其他相關雜質。除了尺寸排阻層析，蛋白質和相關雜質藉由層析介質或選定的膜保留，而還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣保留在含有還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的混合物。

在進一步較佳實施例中，如本文所述的方法亦提供進一步純化還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的進一步純化可藉由例如使用（活性）炭或碳、奈米過濾、超微過濾、電泳、酶處理或離子交換以除去任何殘留的DNA、蛋白質、LPS、內毒素或其他雜質而完成。亦可以使用醇類，例如乙醇、和含水的醇類混合物。另一純化步驟是藉由產物的結晶、蒸發或沉澱而完成。另一純化步驟是藉由例如噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥（band dry）、傳送帶乾燥（belt dry）、真空帶式乾燥（vacuum band dry）、真空帶式乾燥（vacuum belt dry）、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥進行乾燥所產生的在還原端帶有GlcNAc的雙醣或寡醣。

在例示性實施例中，所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的分離及純化是在製程中進行，其包括以任何順序的以下步驟： a) 將培養物或其澄清形式與截留分子量（molecular weight cut-off，MWCO）為600-3500 Da的奈米過濾膜接觸，以確保保留產生的雙醣或寡醣並允許至少部分蛋白質、鹽類、副產物、色素和其他相關雜質通過， b) 使用該膜以無機電解質的水溶液對來自步驟a)的滲餘物進行透析（Diafiltration）製程，然後可選地用純水透析以去除過量的電解質， c) 並從該電解質的陽離子中以鹽類形式收集富含還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的截留物， d) 較佳地，乾燥滲餘物。

在替代的例示性實施例中，所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的分離及純化是在製程中進行，其包括以任何順序的以下步驟：使用不同的膜對培養物或其澄清形式進行兩個膜過濾的步驟，其中一個膜的截留分子量為約300至約500道爾頓之間，且另一個膜的截留分子量為約600到約800道爾頓之間。

在替代的例示性實施例中，所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的分離和純化是在製程中進行，其包括以任何順序的以下步驟：包括以H+形式的強陽離子交換樹脂和游離鹼形式的弱陰離子交換樹脂處理培養物或其澄清形式的步驟。

在替代的例示性實施例中，所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的分離和純化是以下列方式進行。包含所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣、生質、介質成分及污染物的培養物適用於以下分離及純化步驟： i) 自培養物分離生質， ii) 用於去除帶正電材料的陽離子交換劑處理， iii) 用於去除帶負電材料的陰離子交換劑處理， iv) 奈米過濾步驟及/或電透析步驟，其中提供純度大於或等於80%的包括所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之純化溶液。可選地，藉由選自包含噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥、傳送帶乾燥、真空帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥的列舉的任一或多種乾燥步驟進行乾燥純化溶液。

在替代的例示性實施例中，所產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的分離及純化是在製程中進行，其包括以任何順序的以下步驟：培養物的酶處理；從培養物中去除生質；超微過濾；奈米過濾；及柱層析步驟。較佳地，如此的柱層析是單柱或多柱。更佳地，柱層析步驟是模擬移動床層析（simulated moving bed chromatography）。如此的模擬移動床層析較佳包括i）至少4個柱，其中至少一個柱包含弱或強陽離子交換樹脂；及/或ii）具有不同流速的四個區I、II、III和IV；及/或iii）包含水的溶析液；及/或iv）15至60攝氏度的工作溫度。較佳地，該製程進一步包括選自包括噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥、傳送帶乾燥、真空帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥之列舉的步驟。

在特定實施例中，本發明提供藉由選自包含噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥、傳送帶乾燥、真空帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥的列舉的任一或多種乾燥步驟所乾燥成粉末的所產生的在還原端帶有GlcNAc的雙醣或寡醣，其中乾燥粉末含有＜15%-wt的水，較佳為＜10%-wt的水，更佳為＜7%-wt的水，最佳為＜5%-wt的水。

在第三態樣中，本發明提供如本文所述的代謝工程細胞用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之用途，較佳為用於產生LNB或LacNAc，更佳為用於產生在還原端含有LNB或LacNAc的寡醣，又更佳為用於產生唾液酸化及/或岩藻糖基化及/或半乳糖基化及/或GlcNAc-修飾形式的LNB或LacNAc，或最佳為用於產生唾液酸化及/或岩藻糖基化及/或半乳糖基化及/或 GlcNAc修飾形式的在還原端含有LNB或LacNAc的寡醣。

在第三態樣的另一較佳實施例中，如本文所述的代謝工程細胞用於產生在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的中性雙醣或寡醣，更佳為在還原端含有LNB或LacNAc的中性寡醣。

在第三態樣的另一較佳實施例中，如本文所述的代謝工程細胞用於產生如本文所述的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元之雙醣及/或寡醣混合物。

在第三態樣的另一較佳實施例中，如本文所述的代謝工程細胞用於產生混合物，該混合物包括（i）在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物）及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣，較佳為如本文所述的一或多種基於乳糖的人乳寡醣。

為了識別如本文所述的細胞中產生的還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣、單體建構區塊（例如，單醣或聚醣單元組成）、側鏈的變旋異構構型（anomeric configuration）、取代基的存在及位置、聚合度/分子量和連接模式的程度可藉由本領域已知的標準方法進行識別，例如甲基化分析、還原裂解、水解、GC-MS（氣相層析-質譜測定）、MALDI-MS（間質輔助雷測脫附/電離-質譜測定）、ESI-MS（電噴霧電離-質譜測定）、HPLC（帶紫外光或折射率檢測的高效能液相層析）、HPAEC-PAD（帶脈衝電流檢測的高效能陰離子交換層析）、CE（毛細管電泳）、IR（紅外光）/拉曼光譜和NMR（核磁共振）光譜技術。晶體結構可使用例如固態NMR、FT-IR（傅立葉變換紅外光譜）和WAXS（廣角X射線散射）進行解析。聚合度（DP）、DP分佈和多分散性可以藉由例如黏度測定法和SEC（SEC-HPLC，高效能尺寸排阻層析法）進行確定。為了識別醣類方法的單體成分，例如可使用酸-催化水解、HPLC（高效能液相層析）或GLC（氣液層析）（轉化為醛醣醇乙酸鹽後）。為了確定醣苷鍵結，在DMSO中用碘甲烷和強鹼將醣進行甲基化，執行水解，完成還原為部分甲基化的醛醣醇，執行乙醯化為甲基化的醛醣醇乙酸鹽，並藉由GLC/MS（氣液層析與質譜測定聯用）進行分析。為了確定寡糖序列，使用酸或酶進行部分解聚合以確定結構。為了識別變旋異構構型，對寡糖進行酶促分析，例如將其與對於特定類型的鍵（例如，β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶等）具有特異性的酶接觸，並可使用NMR進行產物分析。

包括還原端具有 N- 乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣的產物

在部分實施例中，將如本文所述產生的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物）摻入食物（例如人類食物或飼料）、膳食補充劑、藥物成分、化妝品成分或藥物中。在部分實施例中，還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣與一或多種適用於食品、飼料、膳食補充劑、藥物成分、化妝品成分或藥物的成分混合。

在部分實施例中，膳食補充劑包括至少一種益生質成分及/或至少一種益生菌成分。

「益生質（prebiotic）」是促進有益於宿主的微生物的，特別是胃腸道中微生物生長的物質。在部分實施例中，膳食補充劑提供多種益生質，其包括節由本說明書中揭露的製程產生及/或純化的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，以促進一種或多種有益微生物的生長。用於膳食補充劑的益生質成分的例子包括其他益生質分子（如HMO）和植物多醣（例如，菊糖、果膠、b-葡聚糖和木質寡醣）。「益生菌（probiotic）」產物通常含有活的微生物，其替代或添加至胃腸道微生物群中，而有益於受體。此類微生物的實例包括乳酸桿菌種（例如，嗜酸乳桿菌（ L. acidophilus）和保加利亞乳桿菌（ L. bulgaricus））、雙叉乳桿菌種（例如，動物雙叉乳桿菌（ B. animalis）、長雙叉乳桿菌（ B. longum）和嬰兒雙叉乳桿菌（ B. infantis）（例如Bi-26））和布拉氏酵母菌。在部分實施例中，通過本說明書的製程產生及/或純化的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣與此類微生物組合口服施予。

膳食補充劑的其他成分的實例包括雙醣（例如，乳糖）、單醣（例如，葡萄糖和半乳糖）、增稠劑（例如，阿拉伯樹膠）、酸度調節劑（例如，檸檬酸三鈉）、水、脫脂牛奶和調味劑。

在部分實施例中，還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物）摻入人類嬰兒食品（例如，嬰兒配方）中。嬰兒配方通常是用於餵養嬰兒的人造食品，作為人類母乳的完全或部分替代品。在部分實施例中，嬰兒配方作為粉末出售並藉由與水混合製備於嬰兒餵養用的奶瓶或杯子。嬰兒配方的成分通常設計為大致模仿人類母乳。在部分實施例中，藉由本說明書中的方法產生及/或純化的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物）被包括在嬰兒配方中以提供營養益處，其類似於由人類母乳中的寡醣提供所提供的益處。在部分實施例中，還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣與嬰兒配方的一或多種成分混合。嬰兒配方成分的例子包括脫脂奶、碳水化合物來源（例如，乳糖）、蛋白質來源（例如，乳清蛋白濃縮物和酪蛋白）、脂肪來源（例如，植物油-例如棕櫚、高油酸紅花油、菜籽油、椰子油及/或葵花籽油；和魚油）、維生素（例如，維生素A、Bb、Bi2、C和D）、礦物質（例如，檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、氯化鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和磷酸鈣）及可能的人乳寡糖（HMO）。此類HMO可包括例如DiFL、乳-N-三糖II、LNT、LNnT、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖。

在部分實施例中，一或多種嬰兒配方成分包括脫脂奶、碳水化合物來源、蛋白質來源、脂肪來源及/或維生素和礦物質。

在部分實施例中，一或多種嬰兒配方成分包括乳糖、乳清蛋白濃縮物及/或高油酸紅花油。

在部分實施例中，嬰兒配方中的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物）的濃度與人類母乳中通常存在的寡醣濃度大致相同。在部分實施例中，嬰兒配方中的雙醣或寡醣濃度大約與人類母乳中通常存在的寡醣的濃度相同。

在部分實施例中，還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物）被摻入飼料製劑中，其中該飼料選自包括寵物食品、動物代乳品、獸醫產品、斷奶後的飼料，或教槽飼料的列舉。

在部分實施例中，食物、飼料、膳食補充劑、藥物成分及/或藥物包含至少一種免疫調節成分。

「免疫調節（immunomodulatory）」是改變免疫反應或免疫系統功能的物質。「免疫調節」成分可藉由增加（免疫刺激）或減少（免疫抑制劑）血清抗體的產生而改變免疫反應。免疫刺激劑用於增強例如針對傳染病、腫瘤、原發性或繼發性免疫缺陷以及抗體轉移改變的免疫反應。免疫抑製成分用於降低對移植器官的免疫反應，並治療自身免疫性疾病，如天疱瘡（pemphigus）、狼瘡或過敏症。在部分實施例中，免疫調節成分具有抗炎活性。在部分實施例中，食物、飼料、膳食補充劑、藥物成分及/或藥物提供多種免疫調節劑，其包括藉由本說明書中揭露的製程產生及/或純化的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣（或如本文所述的混合物），以使免疫系統適應正常功能。在可區分的生命階段，免疫力差異很大。不同的食物成分會影響特定的免疫反應，其依據偏向的代謝過程、以及消費者和患者的特徵。添加有免疫調節成分的食品亦稱為功能性食品。功能性食品是對特定消費者群體具有特定健康益處的食品。存在於功能性食品以及飼料和膳食補充劑中的免疫調節成分的例子包括其他免疫調節分子，例如作為本說明書指定的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣和脂肪酸（PUFA）、魚油、胺基酸（例如，精胺酸和麩醯胺）、凝集素（例如，選滯蛋白）、維生素（例如，維生素A、B6、C、E、硫胺素、葉酸）和礦物質（例如，鋅）。這種在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣可以包括LNB、LacNAc、聚-LacNAc和路易斯X、路易斯Y和唾液酸路易斯X抗原決定位。此外，存在於藥物成分和藥物中的免疫調節成分的例子包括其他免疫調節分子，例如例如作為本說明書指定的還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣以及介白素、脂多醣、葡聚糖、干擾素γ和特異性抗體。存在於藥物混合物及/或藥物中這種在還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣可包括LNB、LacNAc、聚-LacNAc和路易斯X、路易斯Y和唾液酸路易斯X抗原決定位。

在本發明的一態樣的上下文中揭露的各實施例，亦在本發明的所有其他態樣的上下文中揭露，除非另有明確說明。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學用語通常具有與本發明所屬技術領域中具通常知識者通常理解的相同含義。一般而言，本文中使用的用語以及上下文描述的細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及雜交中的實驗室程序是所屬技術領域中習知和常用。核酸和肽的合成使用標準技術。一般而言，純化步驟根據製造商的說明書執行。

其他優點來自具體實施例、實例及附圖。不言而喻，在不脫離本發明的範圍的情況下，上述特徵和下面仍要說明的特徵不僅可以在各自指定的組合中使用，亦可以在其他組合中使用或單獨使用。

本發明關於下列較佳實施例： 1. 一種藉由細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之方法，該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠（i）合成核苷酸-糖、（ii）合成N-乙醯葡萄糖胺、以及（iii）醣化該N-乙醯葡萄糖胺單醣， b. 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， c. 自該培養物分離所欲的雙醣或寡醣。 2. 根據實施例1之方法，其中該細胞表現至少一種N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶以合成單醣N-乙醯葡萄糖胺。 3. 根據實施例1及2中任一項之方法，其中該細胞表現至少一種醣基轉移酶，以醣化N-乙醯葡萄糖胺。 4. 根據實施例1至3中任一項之方法，其中該細胞被基因改造以產生該雙醣或寡醣。 5. 根據實施例1至4中任一項之方法，其中該細胞是在選自包含下列之群組中的酶的表現或活性上被修飾：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。 6. 根據實施例1至5中任一項之方法，其中該核苷酸-糖選自包含下列之群組：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖以及UDP-木糖。 7. 根據實施例1至6中任一項之方法，其中該核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且該醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。 8. 根據實施例1至7中任一項之方法，其中該雙醣為乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc），或該寡醣在該還原端具有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。 9. 根據實施例1至8中任一項之方法，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF00535，且 i) 包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17，或 ii) 包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域IPR002659，且 i) 包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或 ii) 包括根據SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或 iii) 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 iv) 包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。 10. 根據實施例1至8中任一項之方法，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF01755，且 i) 包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76，或 ii) 包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的多肽序列，或 iii) 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 iv) 包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域PF00535，且 i) 包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，或 ii) 包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 c. PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且 i) 包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，或 ii) 包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 d. PFAM域PF03808，且 i) 包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25，或 ii) 包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。 11. 根據上述實施例中任一項之方法，其中 a. 該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列，或為UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性，且 b. 該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶為包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列，或為具有UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性；或為與UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突變的修飾版本。 12. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞可代謝碳源，其選自包含下列列舉之群組：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。 13. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。 14. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。 15. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因的過度表現、或甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現。 16. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以產生UDP-半乳糖。 17. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：5’-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因的剃除或半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶編碼基因的剃除。 18. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以產生CMP-N-乙醯基神經胺酸。 19. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現。 20. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該細胞能夠表現至少一種其他醣基轉移酶，且其中該其他醣基轉移酶選自包括下列之群組：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶、鼠李糖基轉移酶（rhamnosyltransferases）。 21. 根據實施例20之方法，其中該細胞在該其他醣基轉移酶的表現或活性方面被修飾。 22. 根據上述實施例中任一項之方法，其中該寡醣選自包括下列之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3'-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3'-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。 23. 一種代謝工程細胞，其能夠（i）合成核苷酸-糖、（ii）合成N-乙醯葡萄糖胺、及（iii）醣化該N-乙醯葡萄糖胺單醣，其中該細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。 24. 根據實施例23之細胞，其中該細胞表現至少一種N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶，以合成N-乙醯葡萄糖胺。 25. 根據實施例23及24中任一項之細胞，其中該細胞表現至少一種醣基轉移酶，以醣化N-乙醯葡萄糖胺。 26. 根據實施例23至25中任一項之細胞，其中該細胞在選自包括下列之群組之酵素的表現或活性方面被修飾：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。 27. 根據實施例23至26中任一項之細胞，其中該核苷酸-糖選自包含下列之群組：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖以及UDP-木糖。 28. 根據實施例23至27中任一項之細胞，其中該核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且該醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。 29. 根據實施例23至28中任一項之細胞，其中該雙醣為乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc），或其中該寡醣在該還原端具有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。 30. 根據實施例23至29中任一項之細胞，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF00535，且 i) 包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17，或 ii) 包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域IPR002659，且 i) 包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或 ii) 包括根據SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或 iii) 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 iv) 包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。 31. 根據實施例23至29中任一項之細胞，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF01755，且 i) 包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76，或 ii) 包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的多肽序列，或 iii) 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 iv) 包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域PF00535，且 i) 包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，或 ii) 包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 c. PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且 i) 包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，或 ii) 包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 d. PFAM域PF03808，且 i) 包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25，或 ii) 包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或 iii) 包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或 iv) 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v) 包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。 32. 根據實施例23至31中任一項之細胞，其中 a. 該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列，或為UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性，且 b. 該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶為包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列，或為具有UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性；或為與UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突變的修飾版本。 33. 根據實施例23至32中任一項之細胞，其中該細胞可代謝碳源，其選自包含下列列舉之群組：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。 34. 根據實施例23至33中任一項之細胞，其中該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。 35. 根據實施例23至34中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。 36. 根據實施例23至35中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因的過度表現、或甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現。 37. 根據實施例23至36中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以產生UDP-半乳糖。 38. 根據實施例23至37中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：5’-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因的剃除或半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶編碼基因的剃除。 39. 根據實施例23至38中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以產生CMP-N-乙醯基神經胺酸。 40. 根據實施例23至39中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現。 41. 根據實施例23至40中任一項之細胞，其中該細胞能夠表現至少一種其他醣基轉移酶，且其中該其他醣基轉移酶選自包括下列之群組：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶、鼠李糖基轉移酶。 42. 根據實施例41之細胞，其中該細胞在該其他醣基轉移酶的表現或活性方面被修飾。 43. 根據實施例23至41中任一項之細胞，其中該寡醣選自包括下列之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。 44. 根據實施例23至43中任一項之細胞或根據實施例1至22中任一項之方法，其中該細胞選自由微生物、植物或動物細胞所組成之群組，較佳地，該微生物為細菌、真菌或酵母，較佳地，該植物為棉花、油菜籽、大豆、玉米或穀類植物，較佳地，該動物為昆蟲類、魚類、鳥類或非人類哺乳動物；較佳地，該細胞為大腸桿菌細胞。 45. 根據實施例23至44中任一項之細胞或根據實施例1至22或44中任一項之方法，其中該細胞為細菌細胞，較佳為大腸桿菌菌株，更佳為大腸桿菌菌株K12菌株，又更佳地，該大腸桿菌菌株K12菌株為大腸桿菌MG1655。 46. 根據實施例23至45中任一項之細胞或根據實施例1至22、44或45中任一項之方法，其中該細胞為酵母菌細胞。 47. 根據實施例1至22、44至46中任一項之方法，其中該分離包括下列列舉的至少一種：澄清、超微過濾、奈米過濾、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、切向流高性能過濾、切向流超微過濾、親和層析、離子交換層析、疏水交互作用層析及/或凝膠過濾、配體交換層析。 48. 根據實施例1至22、44至47中任一項之方法，其進一步包括自該細胞純化該雙醣或寡醣。 49. 根據實施例1至22、44至48中任一項之方法，其中該純化包括下列步驟的至少一種：活性炭或碳的使用、炭的使用、奈米過濾、超微過濾或離子交換、醇類的使用、含水的醇類混合物的使用、結晶、蒸發、沉澱、乾燥、噴霧乾燥或凍乾。 50. 一種根據實施例23至46中任一項之細胞用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣，較佳為用於產生LNB或LacNAc，更佳為用於產生唾液酸化或岩藻糖基化形式的LNB或LacNAc之用途。此外，本發明關於以下較佳特定實施例： 1. 一種藉由細胞，較佳為單一細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣或雙醣之方法，該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該雙醣或寡醣， b. 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， c. 較佳地，自培養物分離該雙醣或寡醣。 2. 一種藉由細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣之方法，該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該寡醣， b. 在允許產生該寡醣的條件下培養該細胞， c. 較佳地，自該培養物分離該寡醣。 3. 一種藉由細胞用於產生混合物之方法，該混合物包括：（i）還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣及/或寡醣、以及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣（MMOs），該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該 GlcNAc單醣，而產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣及/或寡醣， b. 在允許產生該混合物的條件下培養該細胞， c. 較佳地，自培養物分離該混合物。 4. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞表現至少一種N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶，以合成單醣N-乙醯葡萄糖胺。 5. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞表現至少一種醣基轉移酶，以醣化N-乙醯葡萄糖胺。 6. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經基因改造，以產生該雙醣或寡醣。 7. 根據特定實施例6之方法，其中該細胞以一或多種基因表現模組進行修飾，其特徵在於任何該表現模組的表現形式是組成型或由天然誘導物所產生。 8. 根據特定實施例6或7之任一項之方法，其中該細胞包括編碼一蛋白質的相同編碼DNA序列的多個複製（multiple copies）。 9. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞在選自包括下列之群組之酵素的表現或活性方面被修飾：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。 10. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該核苷酸-糖選自包含下列之群組：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。 11. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且該醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。 12. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中寡醣在該還原端具有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。 13. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17，或 ii. 包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域IPR002659，且 i. 包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或 ii. 包括根據SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或 iii. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 iv. 包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。 14. 根據上述特定實施例1至12之任一項之方法，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF01755，且 i. 包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76，或 ii. 包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的多肽序列，或 iii. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 iv. 包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能片段，且具有具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，或 ii. 包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：26、27或28中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 c. PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，或 ii. 包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性 and 具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 d. PFAM域PF03808，且 i. 包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25，或 ii. 包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：39、40或41中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。 15. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中 a. 該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列、或為UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性，以及 b. 該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶為包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列、或為具有UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性；或為與UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突變的修飾版本。 16. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞可代謝碳源，其選自包含下列列舉之群組：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液、高果糖漿、糖蜜、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。 17. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。 18. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。 19. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因的過度表現、或甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現。 20. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以產生UDP-半乳糖。 21. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：5’-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因的剃除或半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶編碼基因的剃除。 22. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以產生CMP-N-乙醯基神經胺酸。 23. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現。 24. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞能夠表現至少一種其他醣基轉移酶，其中該其他醣基轉移酶選自包括下列之群組：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶（UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-beta-L-altrosamine transaminases）, UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶（UDP- N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferases）和岩藻糖胺基轉移酶（fucosaminyltransferases）， - 較佳地，該岩藻糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， - 較佳地，該唾液酸轉移酶選自包括下列列舉：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶， - 較佳地，該半乳糖基轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， - 較佳地，該葡萄糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， - 較佳地，該甘露糖基轉移酶（mannosyltransferase）選自包括下列列舉：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基葡糖胺轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡糖胺轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺轉移酶為α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺轉移酶。 25. 根據特定實施例24之方法，其中該細胞在該其他醣基轉移酶的表現或活性方面被修飾。 26. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞使用用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的一或多種前驅物，該前驅物從培養基供給該細胞。 27. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞產生一或多種前驅物，其用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 28. 根據特定實施例26或27中任一項之方法，其中用於產生該雙醣或寡醣之前驅物完全轉化為還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 29. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞在細胞內產生還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，且其中部分或實質上全部的所產生的還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣保留在細胞內及/或經由被動或主動運輸排出細胞外。 30. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞表現膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽，以轉運化合物穿過細胞壁的外膜，較佳地，該細胞在該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽的表現或活性方面被修飾。 31. 根據特定實施例30之方法，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽選自包括下列列舉：運輸蛋白、P-P-鍵-水解-驅動的轉運體、β-桶狀孔蛋白、輔助轉運蛋白、推定轉運蛋白及磷酸轉移-驅動組轉位蛋白，較佳地，該運輸蛋白包括MFS轉運體、糖排出轉運體及螯鐵蛋白輸出體，較佳地，該P-P-鍵-水解-驅動的轉運體包括ABC轉運體及螯鐵蛋白輸出體。 32. 根據特定實施例30或31中任一項之方法，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及/或一或多種前驅物及/或接受者在細胞壁外膜上的流動，該一或多種前驅物及/或接受者用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 33. 根據特定實施例30或32中任一項之方法，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的改善產生及/或允許排出及/或促進排出。 34. 根據特定實施例6或33中任一項之方法，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，用於降低乙酸鹽產生的修飾。 35. 根據特定實施例34之方法，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，任一或多種蛋白質的較低或減少的表現及/或消除、受損、降低或延遲的活性，該蛋白質包含：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-岩藻酮糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯神經胺酸解離酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸鹽2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸鹽腺苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸鹽異構酶、有氧呼吸調控蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶酶IIBC成分ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶（PTS）酶IIBC成分malX、enzyme IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸鹽解離酶、乙酸鹽激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶、丙酮酸去羧酶。 36. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞能夠產生磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。 37. 根據特定實施例6或36中任一項之方法，其中該細胞與未修飾的先驅細胞相比，具有用於磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的促進產生及/或供應的修飾。 38. 根據特定實施例6至37中任一項之方法，其中該細胞包含至少部分失活的所選單醣、雙醣或寡醣的分解代謝途徑，該單醣、雙醣或寡醣參與該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的產生及/或為產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣所需。 39. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中當該細胞在乳糖與一或多種其他碳源結合的環境中生長時，該細胞抵抗乳糖殺傷現象。 40. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞在整個培養液及/或上清液產生90 g/L或多於90 g/L的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣、及/或其中在整個培養液及/或上清液中的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣具有至少80%的純度，其在整個培養液及/或上清液中分別以該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及其前驅物的總量計。 41. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞在培養基中穩定地培養。 42. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該條件包括： - 使用包括至少一種前驅物及/或接受者的培養基，以用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，及/或 - 添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基，以用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 43. 根據上述特定實施例中任一項之方法，該方法包括下列步驟中的至少一者： i) 使用包括至少一種前驅物及/或接受者的培養基； ii) 向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，並且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米）, 較佳以連續方式，並且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，其中較佳地，該前驅物及/或接受者原料的pH設定在3與7之間，且較佳地，該前驅物及/或接受者原料的溫度維持在20°C與80°C之間； iv) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基； v) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基，其中較佳地，該進料溶液的pH設定在3與7之間，且較佳地，該進料溶液的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。 44. 根據特定實施例1至42中任一項之方法，該方法包括下列步驟中的至少一者： i) 使用每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米）； ii) 添加每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的乳糖原料至培養基，其中較佳以連續方式，且較佳地，使得培養基的最終體積不超過在添加該乳糖原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 添加每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的乳糖原料至培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，且較佳地，使得培養基的最終體積不超過在添加該乳糖原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，其中較佳地，該乳糖原料的pH設定在3與7之間，且較佳地，該乳糖原料的溫度維持在20°C與80°C之間； iv) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加乳糖原料至培養基； v) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加乳糖原料至培養基，其中該乳糖進料溶液的濃度為50 g/L，較佳為75 g/L，更佳為100 g/L，更佳為125 g/L，更佳為150 g/L，更佳為175 g/L，更佳為200 g/L，更佳為225 g/L，更佳為250 g/L，更佳為275 g/L，更佳為300 g/L，更佳為325 g/L，更佳為350 g/L，更佳為375 g/L，更佳為400 g/L，更佳為450 g/L，更佳為500 g/L，又更佳為550 g/L，最佳為600 g/L；其中較佳地，該進料溶液的pH設定在3與7之間，且較佳地，該進料溶液的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。 45. 根據特定實施例44之方法，其中該乳糖原料是藉由從培養開始以至少5 mM，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的濃度添加乳糖，更佳為以＞ 300 mM的濃度添加乳糖而完成。 46. 根據特定實施例44或45中任一項之方法，其中該乳糖原料是藉由將乳糖以一定濃度添加至培養物中而完成，使得在培養物的整個生產階段獲得至少5mM，較佳為10mM或30mM的乳糖濃度。 47. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。 48. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該培養基包含選自包括乳糖、半乳糖、岩藻糖及唾液酸的群組的至少一種前驅物。 49. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中藉由向包含前驅物的培養基添加碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，而提供指數細胞生長的第一階段，接著在第二階段，僅將碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加到培養基中。 50. 根據特定實施例1至49中任一項之方法，其中藉由向包含前驅物的培養基中加入碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，而提供指數細胞生長的第一階段，接著在第二階段，其中碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，及前驅物添加到培養基中。 51. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少一種還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的雙醣及/或寡醣及/或中性的雙醣及/或寡醣。 52. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少還原端具有GlcNAc單元的寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的寡醣及/或中性的寡醣。 53. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該寡醣選自包括下列之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。 54. 根據特定實施例1或3至53中任一項之方法，其中該還原端具有GlcNAc單元的雙醣不包括幾丁二糖（GlcNAc-GlcNAc）。 55. 根據上述特定實施例中任一項之方法，其中該還原端具有GlcNAc單元的寡醣在還原端不包括幾丁二糖，較佳為不包括N-聚醣。 56. 一種用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣或雙醣之代謝工程細胞，其中該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該 GlcNAc單醣，而產生該雙醣或寡醣。 57. 一種用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣之代謝工程細胞，其中該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生寡醣。 58. 一種用於產生混合物之代謝工程細胞，該混合物包括（i）還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣及/或寡醣、以及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣（MMOs），其中該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。 59. 根據特定實施例56或58中任一項之細胞，其中該細胞經代謝工程以產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺的雙醣或寡醣。 60. 根據特定實施例57之細胞，其中該細胞經代謝工程以產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺的寡醣。 61. 根據特定實施例56至60中任一項之細胞，其中該細胞以一或多種基因表現模組進行修飾，其特徵在於任何該表現模組的表現形式是組成型或由天然誘導物所產生。 62. 根據特定實施例56至61中任一項之細胞，其中該細胞包括編碼一蛋白質的相同編碼DNA序列的多個複製。 63. 根據特定實施例56至62中任一項之細胞，其中該細胞表現至少一種N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶，以合成N-乙醯葡萄糖胺。 64. 根據特定實施例56至63中任一項之細胞，其中該細胞表現至少一種醣基轉移酶，以醣化N-乙醯葡萄糖胺。 65. 根據特定實施例56至64中任一項之細胞，其中該細胞在選自包括下列之群組之酵素的表現或活性方面被修飾：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。 66. 根據特定實施例56至65中任一項之細胞，其中該核苷酸-糖選自包含下列之群組：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。 67. 根據特定實施例56至66中任一項之細胞，其中該核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且該醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。 68. 根據特定實施例56至67中任一項之細胞，其中寡醣在該還原端具有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。 69. 根據特定實施例56至68中任一項之細胞，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17，或 ii. 包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域IPR002659，且 i. 包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或 ii. 包括根據SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或 iii. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 iv. 包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。 70. 根據特定實施例56至69中任一項之細胞，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF01755，且 i. 包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76，或 ii. 包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的多肽序列，或 iii. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 iv. 包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，或 ii. 包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：26、27或28中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 c. PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，或 ii. 包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 d. PFAM域PF03808，且 i. 包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25，或 ii. 包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：39、40或41中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。 71. 根據特定實施例56至70中任一項之細胞，其中 a. 該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列，或為UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性，以及 b. 該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶為包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列，或為具有UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性；為與UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突變的修飾版本。 72. 根據特定實施例56至71中任一項之細胞，其中該細胞可代謝碳源，其選自包含下列列舉之群組：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液、高果糖漿、糖蜜、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。 73. 根據特定實施例56至72中任一項之細胞，其中該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。 74. 根據特定實施例56至73中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。 75. 根據特定實施例56至74中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因的過度表現、或甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現。 76. 根據特定實施例56至75中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以產生UDP-半乳糖。 77. 根據特定實施例56至76中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：5’-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因的剃除或半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶編碼基因的剃除。 78. 根據特定實施例56至75中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以產生CMP-N-乙醯基神經胺酸。 79. 根據特定實施例56至78中任一項之細胞，其中該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生，其中該修飾選擇自包含下列列舉之群組：CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現。 80. 根據特定實施例56至79中任一項之細胞，其中該細胞能夠表現至少一種其他醣基轉移酶，其中該其他醣基轉移酶選自包括下列之群組：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶和岩藻糖胺基轉移酶， - 較佳地，該岩藻糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， - 較佳地，該唾液酸轉移酶選自包括下列列舉：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶， - 較佳地，該半乳糖基轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， - 較佳地，該葡萄糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， - 較佳地，該甘露糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基葡糖胺轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡糖胺轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺轉移酶為α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺轉移酶。 81. 根據特定實施例80之細胞，其中該細胞在該其他醣基轉移酶的表現或活性方面被修飾。 82. 根據特定實施例56至81中任一項之細胞，其中該細胞使用用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的一或多種前驅物，該前驅物從培養基供給該細胞。 83. 根據特定實施例56至82中任一項之細胞，其中該細胞產生一或多種前驅物，其用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 84. 根據特定實施例82或83中任一項之細胞，其中用於產生該雙醣或寡醣之前驅物完全轉化為還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 85. 根據特定實施例56至84中任一項之細胞，其中該細胞在細胞內產生還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，且其中部分或實質上全部的所產生的還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣保留在細胞內及/或經由被動或主動運輸排出細胞外。 86. 根據特定實施例56至85中任一項之細胞，其中該細胞表現膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽，以轉運化合物穿過細胞壁的外膜，較佳地，該細胞在該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽的表現或活性方面被修飾。 87. 根據特定實施例86之細胞，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽選自包括下列列舉：運輸蛋白、P-P-鍵-水解-驅動的轉運體、β-桶狀孔蛋白、輔助轉運蛋白、推定轉運蛋白及磷酸轉移-驅動組轉位蛋白，較佳地，該運輸蛋白包括MFS轉運體、糖排出轉運體及螯鐵蛋白輸出體，較佳地，該P-P-鍵-水解-驅動的轉運體包括ABC轉運體及螯鐵蛋白輸出體。 88. 根據特定實施例86或87中任一項之細胞，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及/或一或多種前驅物及/或接受者在細胞壁外膜上的流動，該一或多種前驅物及/或接受者用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。 89. 根據特定實施例86至88中任一項之細胞，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的改善產生及/或允許排出及/或促進排出。 90. 根據特定實施例56至89中任一項之細胞，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，用於降低乙酸鹽產生的修飾。 91. 根據特定實施例90之細胞，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，任一或多種蛋白質的較低或減少的表現及/或消除、受損、降低或延遲的活性，該蛋白質包含：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-岩藻酮糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯神經胺酸解離酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸鹽2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸鹽腺苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸鹽異構酶、有氧呼吸調控蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶酶IIBC成分ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶（PTS）酶IIBC成分malX、enzyme IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸鹽解離酶、乙酸鹽激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶、丙酮酸去羧酶。 92. 根據特定實施例56至91中任一項之細胞，其中細胞能夠產生磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。 93. 根據特定實施例56至92中任一項之細胞，該細胞與未修飾的先驅細胞相比，具有用於磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的促進產生及/或供應的修飾。 94. 根據特定實施例56至93中任一項之細胞，其中該細胞包含至少部分失活的所選單醣、雙醣或寡醣的分解代謝途徑，該單醣、雙醣或寡醣參與該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的產生及/或為產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣所需。 95. 根據特定實施例56至94中任一項之細胞，其中當該細胞在乳糖與一或多種其他碳源結合的環境中生長時，該細胞抵抗乳糖殺傷現象。 96. 根據特定實施例56至95中任一項之細胞，其中該細胞在整個培養液及/或上清液產生90 g/L或多於90 g/L的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣、及/或其中在整個培養液及/或上清液中的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣具有至少80%的純度，其在整個培養液及/或上清液中分別以該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及其前驅物的總量計。 97. 根據特定實施例56至96中任一項之細胞，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少一種還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的雙醣及/或寡醣及/或中性的雙醣及/或寡醣。 98. 根據特定實施例56至97中任一項之細胞，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少還原端具有GlcNAc單元的寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的寡醣及/或中性的寡醣。 99. 根據特定實施例56至98中任一項之細胞，其中該寡醣選自包括下列之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。 100. 根據特定實施例56或58至99中任一項之細胞，其中該還原端具有GlcNAc單元的雙醣不包括幾丁二糖（GlcNAc-GlcNAc）。 101. 根據特定實施例56至100中任一項之細胞，其中該還原端具有GlcNAc單元的寡醣在還原端不包括幾丁二糖，較佳為不包括N-聚醣。 102. 根據特定實施例56至101中任一項之細胞或根據特定實施例1至55中任一項之方法，其中該細胞為細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞或原生動物細胞， - 較佳地，該細菌為大腸桿菌菌株，更佳為大腸桿菌菌株K12菌株，又更佳地，該大腸桿菌菌株K12菌株為大腸桿菌MG1655， - 較佳地，該真菌屬於選自包括黑黴菌屬、網柱黏菌屬、青黴菌屬、白黴菌屬或麴菌屬之群組的屬（genus）， - 較佳地，該酵母菌屬於選自包括酵母屬、接合酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、克馬格特勒酵母、漢遜氏酵母菌屬、子囊菌酵母屬、擬球酵母菌屬、克魯維酵母菌屬或德巴利酵母菌屬之群組的屬， - 較佳地，該植物細胞為藻細胞或衍生自煙草、苜蓿、稻米、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米或穀類植物， - 較佳地，該動物細胞衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬蟲類、兩棲類或昆蟲類、或為衍生自排除胚胎幹細胞的人類細胞的基因改造細胞株，更佳地，該人類及非人類哺乳動物細胞為上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、鼠骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，更佳地，該昆蟲細胞衍生自秋行軍蟲、蠶、甘藍夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅， - 較佳地，該原生動物細胞為狼蛛利什曼原蟲細胞。 103. 根據特定實施例102之細胞或根據特定實施例102之方法，其中該細胞為活的革蘭氏陰性菌，其包含與未修飾的先驅細胞相比，降低或消除聚-N-乙醯-葡萄糖胺（PNAG）、腸細菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲壓調節間質葡聚糖（OPG）、葡萄糖基甘油、聚醣及/或海藻糖的合成。 104. 根據特定實施例1至55、102或103中任一項之方法，其中該分離包括下列列舉的至少一種：澄清、超微過濾、奈米過濾、兩相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高性能過濾、切向流超微過濾、親和層析、離子交換層析、疏水交互作用層析及/或凝膠過濾、配體交換層析。 105. 根據特定實施例1至55、102至104中任一項之方法，其更包括自該細胞純化該雙醣或寡醣。 106. 根據特定實施例1至55、102至105中任一項之方法，其中該純化包括下列步驟的至少一種：活性炭或碳的使用、炭的使用、奈米過濾、超微過濾、電泳、酶處理或離子交換、醇類的使用、含水的醇類混合物的使用、結晶、蒸發、沉澱、乾燥、噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥、傳送帶乾燥、真空帶式乾燥、真空傳送帶乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。 107. 一種根據特定實施例56至103中任一項之細胞或根據特定實施例1至55、102至106中任一項之方法用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之用途。 108. 一種根據特定實施例56、58至103中任一項之細胞或根據特定實施例1、3至55、102至106中任一項之方法用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣，較佳為用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的帶電或中性寡醣，更佳為用於產生唾液酸化或岩藻糖基化形式的LNB或LacNAc之用途。

以下實施例將作為本發明的進一步說明和澄清，並且不旨在限制本發明。

實施例

實施例 1 ：材料和方法大腸桿菌

培養基

Luria肉湯（Luria Broth，LB）培養基由1%胰蛋白腖（Difco, Erembodegem, Belgium）、0.5%酵母菌萃取物（Difco）和0.5%氯化鈉（VWR. Leuven, Belgium）組成。用於96孔盤培養物實驗或搖瓶實驗的培養基包含2.00g/L NH4Cl、5.00g/L(NH4)2SO4、2.993g/L KH2PO4、7.315g/L K2HPO4、8.372g/L MOPS、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1ml/L維生素溶液、100μL/L鉬酸鹽溶液和1ml/L硒溶液。如各自實施例中所述，0.30 g/L 唾液酸、20 g/L 乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB額外添加至培養基作為前驅物。用1M KOH將培養基的pH值設為7。維生素溶液由3.6g/L FeCl2.4H2O、5g/L CaCl2.2H2O、1.3g/L MnCl2.2H2O、0.38g/L CuCl2.2H2O、0.5g/L CoCl2.6H2O、0.94g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/L Na2EDTA.2H2O和1.01g/L鹽酸硫胺組成。鉬酸鹽溶液含有0.967g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液含42g/L SeO2。

用於發酵的基本培養基含有6.75g/L NH4Cl、1.25g/L(NH4)2SO4、2.93g/L KH2PO4和7.31g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1mL/L維生素溶液、100μL/L鉬酸鹽溶液和1mL/L硒溶液，組成與上述相同。如各自實施例中所述，0.30 g/L 唾液酸、20 g/L 乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB額外添加至用於發酵的基本培養基作為前驅物。

藉由高壓滅菌（121℃，21分鐘）對複合培養基進行滅菌，並藉由過濾（0.22μm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加抗生素：例如氯黴素（chloramphenicol）（20mg/L）、羧卡本西林（carbenicillin）（100mg/L）、觀黴素（40mg/L）及/或康黴素（kanamycin）（50mg/L)）使培養基具有選擇性。

質體

pKD46（Red輔助質體，胺苄青黴素抗性）、pKD3（包含FRT側接的氯黴素抗性（cat）基因）、pKD4（包含FRT側接的康黴素抗性（kan）基因）和pCP20（表現FLP重組酶活性）質體從R.Cunin教授（Vrije Universiteit Brussel, Belgium in 2007）獲得。

質體維持在從Invitrogen購買的宿主大腸桿菌DH5α（F ^-, phi80d lacZΔM15, Δ( lacZYA- argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk ^-, mk ⁺), phoA, supE44, lambda ^-, thi-1, gyrA96, relA1）中。

菌株和突變

大腸桿菌K12 MG1655[λ ^-，F ^-，rph-1]於2007年3月從Coli Genetic StockCenter（US），CGSC菌株#:7740獲得。使用Datsenko和Wanner（PNAS 97(2000)，6640-6645）發表的技術進行基因破壞、基因導入和基因置換。這項技術是基於藉由lambda Red重組酶進行的同源重組後的抗生素選擇。翻轉酶重組酶的後續催化確保在最終生產菌株中去除抗生素選擇盒。

將攜帶Red輔助質體pKD46的轉形子在含有胺苄青黴素（100mg/L）和L-阿拉伯糖（10mM）的10ml LB培養基中於30℃培養至OD ₆₀₀nm為0.6。藉由第一次用50ml冰冷水洗滌，第二次用1ml冰冷水洗滌，使細胞成為電轉感受態（electrocompetent）。然後，將細胞重懸浮在50μl的冰冷水中。使用Gene Pulser™（BioRad）（600Ω、25μFD和250伏）用50μl細胞和10-100ng線性雙鏈DNA產物進行電穿孔。

電穿孔後，將細胞加入1mL LB培養基中於37℃培養1h，並最後塗佈於含有25mg/L氯黴素或50mg/L康黴素的LB瓊脂上，以選擇抗生素抗性轉形子。所選擇的突變體藉由PCR用修飾區上游和下游的引子進行驗證，並於42℃在LB瓊脂中生長以失去輔助質體。對突變體測試胺苄青黴素敏感性。

使用pKD3、pKD4及其衍生物作為模板，藉由PCR獲得線性ds-DNA擴增子。所用的引子有一部分序列與模板互補，另一部分與染色體DNA上必須發生重組的那一側互補。對於基因敲除，同源區域被設計為目標基因的起始密碼子和終止密碼子的上游50-nt和下游50-nt。對於基因敲入，必須考慮轉錄起點（+1）。PCR產物經PCR純化，Dpnl消化，從瓊脂糖凝膠再純化，並懸浮於溶析緩衝液（5mM Tris，ph8.0）中。

將選擇的突變體用pCP20質體轉形，pCP20質體為胺苄青黴素和氯黴素抗性質體，其顯示溫度敏感複製和熱誘導的FLP合成。於30℃選擇胺苄青黴素抗性轉形子，然後於42℃在LB中純化少數菌落，並且然後測試所有抗生素抗性和FLP輔助質體的丟失。用對照引子檢查基因剃除和敲入。

在GDP-岩藻糖及岩藻糖基化寡醣產生的一實施例中，突變菌株衍生自大腸桿菌K12 MG1655，其包括大腸桿菌 wcaJ和 thyA基因的剃除及持續型表現建構體的基因敲入，該建構體含有蔗糖轉運體（例如，源自大腸桿菌W的CscB（UniProt ID E0IXR1））、果糖激酶（例如，源自運動醱酵單胞菌（ Zymomonas mobilis，ZmFrk）的frk（UniProt ID Q03417））、蔗糖磷酸化酶（例如，源自青春雙歧桿菌（ Bifidobacterium adolescentis）的BaSP（UniProt ID A0ZZH6）），另外包括表現質體，其具有用於α-1,2-岩藻糖基轉移酶（例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1））及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶（例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511））的持續型表現建構體、且具有用於大腸桿菌thyA（UniProt ID P0A884）的持續型表現建構體作為選擇性標記。岩藻糖基轉移酶基因的亦可經由基因敲入而存在於突變的大腸桿菌菌株。藉由基因剃除大腸桿菌基因（包括 glgC、 agp、 pfkA、 pfkB、 pgi、 arcA、 iclR、 pgi和 lon）可進一步優化在突變大腸桿菌菌株中GDP-岩藻糖產生，如WO2016075243及WO2012007481所述。GDP-岩藻糖產生可另外被優化，其包括甘露糖-6-磷酸鹽異構酶（例如，來自大腸桿菌的manA（UniProt ID P00946））、磷酸甘露糖變位酶（例如，來自大腸桿菌的manB（UniProt ID P24175））、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶（例如，來自大腸桿菌的manC（UniProt ID P24174））、GDP-甘露糖4,6-脫水酶（例如，來自大腸桿菌的gmd（UniProt ID P0AC88））及GDP-L-岩藻糖合成酶（例如，來自大腸桿菌的fcl（UniProt ID P32055））的持續型表現建構體的基因敲入。GDP-岩藻糖產生亦可藉由大腸桿菌fucK及fucI的基因剃除與含有岩藻糖通透酶（例如，來自大腸桿菌的fucP（UniProt ID P11551））及具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶活性的雙官能酶（例如，來自脆弱擬桿菌的fkp（UniProt ID SUV40286.1））的持續型表現建構體之基因敲入而獲得。如果產生GDP-岩藻糖的突變菌株旨在製造岩藻糖基化乳糖結構，則該菌株還需藉由基因剃除大腸桿菌LacZ、LacY和LacA基因以及用於乳糖通透酶（例如，大腸桿菌LacY（UniProt ID P02920））的持續型表現建構體之基因敲入進行修飾。或者，及/或另外，GDP-岩藻糖及/或岩藻糖基化寡醣產生可藉由持續型轉錄單元（constitutive transcriptional units）的基因敲入而在突變大腸桿菌菌株中進一步優化，該轉錄單元包含膜轉運蛋白，例如來自阪崎腸桿菌的MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌的的MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌的MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自肺炎克雷伯氏菌的MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌的iceT（UniProt ID A0A024L207）或來自楊氏檸檬酸桿菌的iceT（UniProt ID D4B8A6）。

在唾液酸產生的一實施例中，突變菌株衍生自大腸桿菌K12 MG1655，其包括持續型轉錄單元的基因敲入，該持續型轉錄單元含有一或多個複製的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（例如，來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577））、N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶（例如，來自卵形擬桿菌（ Bacteroides ovatus）的AGE（UniProt ID A7LVG6））、N-乙醯神經胺酸合成酶（例如，來自腦膜炎雙球菌（ Neisseria meningitidis）（UniProt ID E0NCD4）或空腸曲桿菌（ Campylobacter jejuni）（UniProt ID Q93MP9））。

或者，及/或另外，唾液酸產生可藉由持續型轉錄單元的基因敲入而獲得，該持續型轉錄單元含有UDP-N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶（例如，來自空腸曲桿菌的NeuC（UniProt ID Q93MP8））及N-乙醯神經胺酸合成酶（例如，來自腦膜炎雙球菌（UniProt ID E0NCD4）或空腸曲桿菌（UniProt ID Q93MP9））。

或者及/或另外，唾液酸產生可藉由持續型轉錄單元的基因敲入而獲得，該持續型轉錄單元含有磷葡萄胺變位酶（phosphoglucosamine mutase）（例如，來自大腸桿菌的glmM（UniProt ID P31120））、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸鹽尿苷轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸鹽乙醯基轉移酶（例如，來自大腸桿菌的glmU（UniProt ID P0ACC7））、UDP-N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶（例如，來自空腸曲桿菌的NeuC（UniProt ID Q93MP8））和N-乙醯神經胺酸合成酶（例如，來自腦膜炎雙球菌（UniProt ID E0NCD4）或空腸曲桿菌（UniProt ID Q93MP9））。

或者，及/或另外，唾液酸產生可藉由持續型轉錄單元的基因敲入而獲得，該持續型轉錄單元含有雙官能UDP-GlcNAc2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶（例如，來自小鼠（品系C57BL/6J）（UniProt ID Q91WG8））、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶（N-acylneuraminate-9-phosphate synthetase）（例如，來自假單胞菌屬（ Pseudomonassp.）UW4（UniProt ID K9NPH9）及N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶（例如，來自磁藻屬候選（ Candidatus Magnetomorumsp.）HK-1（UniProt ID KPA15328.1）或來自多形擬桿菌（ Bacteroides thetaiotaomicron）（UniProt ID Q8A712））。

或者，及/或另外，唾液酸產生可藉由持續型轉錄單元的基因敲入而獲得，該持續型轉錄單元含有磷葡萄胺變位酶（例如，來自大腸桿菌的glmM（UniProt ID P31120））、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸鹽尿苷轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸鹽乙醯基轉移酶（例如，來自大腸桿菌的glmU（UniProt ID P0ACC7））、雙官能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶（例如，來自小鼠(品系C57BL/6J）（UniProt ID Q91WG8）、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶（例如，來自假單胞菌屬UW4（UniProt ID K9NPH9）及N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶（例如，來自磁藻屬候選（ Candidatus Magnetomorumsp.）HK-1（UniProt ID KPA15328.1）或來自多形擬桿菌（UniProt ID Q8A712））。

藉由大腸桿菌基因（包括一或多個 nagA、 nagB、 nagC、 nagD、 nagE、 nanA、 nanE、 nanK、 manX、 manY及 manZ）的基因剃除，如WO18122225所述、及/或大腸桿菌基因（包括一或多個 nanT、 poxB、 ldhA、 adhE、 aldB、 pflA、 pflC、 ybiY、 ackA及/或 pta）的基因剃除、以及持續型轉錄單元的基因敲入可進一步優化在突變大腸桿菌菌株中的唾液酸產生，該持續型轉錄單元包括一或多個複製的L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶（例如，來自大腸桿菌的突變體glmS*54（與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)）），較佳為一個磷酸酶（例如，來自包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或者來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草芽孢桿菌的BsAraL）及乙醯輔酶A合成酶（例如，來自大腸桿菌的acs（UniProt ID P27550）），如WO18122225所述。

對於唾液酸化寡醣產生，該唾液酸產生菌株進一步修飾，以表現N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶（N-acylneuraminate cytidylyltransferase）（例如，來自空腸曲桿菌的NeuA酶（UniProt ID Q93MP7）、來自流感嗜血桿菌（ Haemophilus influenzae）的NeuA酶（GenBank No. AGV11798.1）或來自出血性巴氏桿菌（ Pasteurella multocida）的NeuA酶（GenBank No. AMK07891.1）以及表現一或多個複製的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶（例如，來自出血性巴氏桿菌的PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的1至268胺基酸殘基所組成的PmultST3樣多肽、來自腦膜炎雙球菌的NmeniST3（GenBank No. ARC07984.1）或來自出血性巴氏桿菌出血性亞種菌株（ P. multocida subsp. multocidastr.）Pm70的PmultST2（GenBank No. AAK02592.1））、β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸轉移酶（例如，來自海鱺發光桿菌（ Photobacterium damselae）的PdST6（UniProt ID O66375）或由具有β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的108至497胺基酸殘基所組成的PdST6樣多肽或來自發光桿菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6（UniProt ID A8QYL1）或由具有β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的18至514胺基酸殘基所組成的P-JT-ISH-224-ST6樣多肽）及/或α-2,8-唾液酸轉移酶（例如，來自小鼠（UniProt ID Q64689））。N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶及唾液酸轉移酶的持續型轉錄單元可經由基因敲入或表現質體傳遞給突變株。若產生唾液酸及CMP-唾液酸的突變株旨在使乳糖結構唾液酸化，則該菌株藉由基因剃除大腸桿菌 LacZ、 LacY和 LacA基因以及基因組敲入乳糖通透酶的持續型轉錄單元（例如，大腸桿菌LacY（UniProt ID P02920））進行額外修飾。產生唾液酸、CMP-唾液酸及/或唾液酸化寡醣的所有突變株可選擇性地經由含有蔗糖轉運體（例如，源自大腸桿菌Ｗ的CscB（UniProt ID E0IXR1））、果糖激酶（例如，來自運動醱酵單胞菌的Frk（UniProt ID Q03417））及蔗糖磷酸化酶（例如，來自青春雙歧桿菌的BaSP（UniProt ID A0ZZH6））的持續型轉錄單元的基因敲入來適應在蔗糖上的生長。

或者，及/或另外，唾液酸及/或唾液酸化寡醣產生可進一步藉由包括持續型轉錄單元的持續型轉錄單元之基因敲入使突變大腸桿菌株優化，該膜轉運蛋白例如為唾液酸轉運體，例如來自大腸桿菌K-12 MG1655的nanT（UniProt ID P41036）、來自大腸桿菌O6:H1的nanT（UniProt ID Q8FD59）、來自大腸桿菌O157:H7的nanT（UniProt ID Q8X9G8）或來自艾伯特埃希菌（ E. albertii）的nanT（UniProt ID B1EFH1）、或者為運輸蛋白，例如來自大腸桿菌的EntS（UniProt ID P24077）、來自抗壞血酸克呂沃爾氏菌（ Kluyvera ascorbata）的EntS（UniProt ID A0A378GQ13）、來自腸道沙門桿菌亞利桑那亞種（ Salmonella enterica subsp. arizonae）的EntS（UniProt ID A0A6Y2K4E8）、來自阪崎腸桿菌的MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌的的MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌的MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自肺炎克雷伯氏菌的MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌的iceT（UniProt ID A0A024L207）、來自楊氏檸檬酸桿菌的iceT（UniProt ID D4B8A6）、來自大腸桿菌的SetA（UniProt ID P31675）、來自大腸桿菌的SetB（UniProt ID P33026）或來自大腸桿菌的SetC（UniProt ID P31436）、或者為ABC轉運體，例如來自大腸桿菌的oppF（UniProt ID P77737）、來自乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙醯生物突變株的lmrA（UniProt ID A0A1V0NEL4）、或來自雙叉乳桿菌嬰兒亞種的Blon_2475（UniProt ID B7GPD4）。

在用於促進UDP-半乳糖產生的實施例中，大腸桿菌K12 MG1655菌株藉由將大腸桿菌 ushA、 galT、 ldhA及 agp基因中的一或多種之基因剃除並藉由大腸桿菌的UDP-葡萄糖-4-表異構酶（galE）（UniProt ID P09147）的持續型表現建構體之基因敲入進行修飾。

在用於促進UDP-GlcNAc產生的實施例中，大腸桿菌K12 MG1655菌株藉由將L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶（例如來自大腸桿菌的突變體glmS*54（其不同於UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS蛋白質具有A39T、R250C及G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 2006, 88: 419-429）））的持續型轉錄單元之基因敲入進行修飾。

在用於產生乳-N-三糖（LN3，GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）的實施例中，突變菌株衍生自大腸桿菌K12 MG1655並藉由將大腸桿菌 lacZ、 lacY、 lacA及 nagB基因剃除以及藉由乳糖通透酶（例如，大腸桿菌LacY（UniProt ID P02920））及半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶（例如，來自腦膜炎雙球菌的lgtA（UniProt ID Q9JXQ6））的持續型轉錄單元之基因敲入進行修飾。

在用於產生LN3衍生的寡醣（例如，乳-N-四糖）（LNT，Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之實施例中，突變的LN3產生菌株進一步以經由N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（例如，來自大腸桿菌O55:H7的具有SEQ ID NO 03的wbgO）的基因敲入或形成表現質體而將持續型轉錄單元遞送至菌株的方式進行修飾。

在用於產生LN3衍生的寡醣（例如，乳-N-新四糖）（LNnT，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之實施例中，突變的LN3產生菌株進一步以經由N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（例如，來自腦膜炎雙球菌的具有SEQ ID NO 15的lgtB）的基因敲入或形成表現質體而將持續型轉錄單元遞送至菌株的方式進行修飾。

在用於產生乳-N-雙糖（LNB，Gal-b1,3-GlcNAc）及LNB衍生的寡醣之實施例中，菌株進一步經由針對一或多個複製的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（例如，來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577））及N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（選自包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12及13之項次）的基因敲入或包含持續型轉錄單元的表現質體進行修飾。

在用於產生N-乙醯乳糖胺（LacNAc，Gal-b1,4-GlcNAc）及LacNAc衍生的寡醣之實施例中，菌株進一步經由針對一或多個複製的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（例如，來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577））及N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（選自包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40或41之項次）的基因敲入或包含持續型轉錄單元的表現質體進行修飾。

突變體LNB、LacNAc、LN3、LNT及LNnT產生大腸桿菌菌株亦可選擇性地經由含有蔗糖轉運體（例如，源自大腸桿菌Ｗ的CscB（UniProt ID E0IXR1））、果糖激酶（例如，來自運動醱酵單胞菌的Frk（UniProt ID Q03417））及蔗糖磷酸化酶（例如，來自青春雙歧桿菌的BaSP（UniProt ID A0ZZH6））的持續型轉錄單元的基因敲入來適應在蔗糖上的生長。

或者，及/或另外，LN3、LNT、LNnT、LNB及LacNAc及其衍生的寡醣之產生可藉由持續型轉錄單元的基因敲入而在突變大腸桿菌菌株中進一步優化，該轉錄單元包含膜轉運蛋白，例如來自阪崎腸桿菌的MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌的的MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌的MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自肺炎克雷伯氏菌的MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌的iceT（UniProt ID A0A024L207）或來自楊氏檸檬酸桿菌的iceT（UniProt ID D4B8A6）。

較佳但並非必須，醣基轉移酶、核苷酸活性糖合成的蛋白質及/或膜轉運蛋白中的任一或多種在N-和/或C-端融合至溶解度強化子標籤，例如例如SUMO標籤、MBP標籤、His、FLAG、Strep-II、Halo-tag、NusA、硫氧還蛋白（thioredoxin）、GST及/Fh8標籤，以提高其溶解度（Costa et al., Front. Microbiol. 2014, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063; Fox et al., Protein Sci. 2001, 10(3), 622-630; Jia and Jeaon, Open Biol. 2016, 6: 160196）。

可選地，突變大腸桿菌菌株藉由持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元編碼伴護蛋白（chaperone protein）（例如，DnaK、DnaJ、GrpE或the GroEL/ES伴護蛋白系統（chaperonin system）（Baneyx F., Palumbo J.L. (2003) Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and Foldase Co-Expression. In: Vaillancourt P.E. (eds) E. coli Gene Expression Protocols. Methods in Molecular Biology™, vol 205. Humana Press）。

可選地，突變大腸桿菌菌株進行修飾以製造醣最小化大腸桿菌菌株，其包含非必須醣基轉移酶基因的任一或多種的基因剃除，該非必須醣基轉移酶基因包括pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP。

所有持續型啟動子及UTRs均源自De Mey等人（BMC Biotechnology, 2007）、Dunn等人（Nucleic Acids Res. 1980, 8(10), 2119-2132）、Kim和Lee（FEBS letters 1997, 407(3), 353-356）、以及Mutalik等人（Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360）描述的資料庫。

本發明所述的SEQ ID NO總結於表1。

所有基因均在Twist Bioscience（twistbioscience.com）或IDT（eu.idtdna.com）合成訂購，並使用供應商的工具調整密碼子使用。

所有菌株都儲存在-80℃的冷凍小瓶中（過夜LB培養物與70％甘油按1:1比率混合）。

表1：本發明中描述的SEQ ID NO的概述

SEQ ID NO	生物體	來源	數位序列資訊的來源國家
01	N.A.	合成	人工序列
02	N.A.	合成	人工序列
03	大腸桿菌O55:H7	合成	德國
04	氧化亞鐵假高炳根氏菌（ Pseudogulbenkiania ferrooxidans）	合成	美國
05	血清型腸道沙門桿菌薩拉姆亞種（ Salmonella entericasubsp. salamae serovar）	合成	澳洲
06	麩胺酸棒狀桿菌	合成	日本
07	海洋發光桿菌（ Photobacterium leiognathi）	合成	美國
08	紫色桿菌（ Chromobacterium violaceum）	合成	美國
09	N.A.	合成	人工序列
10	阿拉伯芥（ A. thaliana）	合成	美國
11	布氏錐蟲（ Trypanosoma brucei）	合成	蘇格蘭（英國）
12	小鼠	合成	美國
13	智人	合成	未知
14	N.A.	合成	人工序列
15	腦膜炎雙球菌MC58	合成	英國
16	腦膜炎雙球菌MC58	合成	英國
17	幽門螺旋桿菌（ Helicobacter pylori）	合成	澳洲
18	幽門螺旋桿菌	合成	澳洲
19	嗜沫聚集桿菌（ Aggregatibacter aphrophilus）	合成	英國
20	幽門螺旋桿菌	合成	澳洲
21	出血性巴氏桿菌	合成	澳洲
22	流感嗜血桿菌	合成	美國
23	去硝化金氏菌（ Kingella denitrificans）	合成	未知
24	N.A.	合成	人工序列
25	N.A.	合成	人工序列
26	肺炎鏈球菌（ Streptococcus pneumoniae）	合成	美國
27	無乳鏈球菌（ Streptococcus agalactiae）	合成	英國
28	蜂房哈夫尼菌（ Hafnia alvei）	合成	未知
29	N.A.	合成	人工序列
30	N.A.	合成	人工序列
31	去硝化類固醇桿菌（ Steroidobacter denitrificans）	合成	德國
32	副衣原體科菌（ Parachlamydiaceae bacterium）HS-T3	合成	日本
33	柯克斯氏體屬（ Coxiella sp. ）DG_40	合成	美國
34	脆弱擬桿菌	合成	英國
35	珊瑚球菌屬（ Corallococcus exercitus）	合成	英國
36	黏附金絲桃菌（ Hypericibacter adhaerens）	合成	德國
37	N.A.	合成	人工序列
38	N.A.	合成	人工序列
39	普通擬桿菌（ Bacteroides vulgatus）	合成	英國
40	普雷沃氏菌（ Prevotella copri）	合成	美國
41	螢光假單胞菌（ Pseudomonas fluorescens） 90F12-2	合成	美國

培養條件

從冷凍小瓶開始96孔微量滴定盤實驗的預培養，在150μL LB中並於37℃在800rpm的軌道振盪器上培養過夜。將該培養物用作96孔方形微量滴定盤的接種物，用400μL MMsf培養基稀釋400倍。然後將這些最終的96孔培養盤於37℃在800rpm的軌道振盪器上培養72h或更短或更長時間。為了在培養實驗結束時測定糖濃度，藉由將細胞離心之前將培養液於60℃煮沸15分鐘，從每個孔中取出全肉湯樣品（＝細胞內和細胞外的糖濃度平均值）。

生物反應器的預培養從特定菌株的整個1mL冷凍小瓶開始，接種在1L或2.5L搖瓶中的250mL或500mL MMsf培養基中，並於37℃在200rpm的軌道振盪器上培養24h。然後接種5L生物反應器（在2L批次培養基中接種250mL）；該過程由MFCS控制軟體（Sartorius StedimBiotech，Melsungen，德國）控制。培養條件設置為37℃，最大攪拌；壓力氣體流速取決於菌株和生物反應器。使用0.5M H2SO4和20％NH4OH將pH控制在6.8。冷卻廢氣。發酵過程中發泡時加入10%的有機矽消泡劑溶液。

光密度

藉由測定600nm處的光密度（Implen Nanophotometer NP80，Westburg，比利時或Spark 10M微孔盤讀取器，Tecan，瑞士）經常監測培養物的細胞密度。

分析性解析

標準品，例如但不限於，蔗糖、葡萄糖、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯乳糖胺、乳-N-雙糖、岩藻糖基化 N-乙醯乳糖胺（2’FLAcNAc、3-FlacNAc）、岩藻糖基化乳-N-雙糖（2’FLNB、4-FLNB）、唾液酸化N-乙醯乳糖胺（3’SLacNAc、6’SLacNAc）購自Carbosynth（英國）、Elicityl（法國）及IsoSep（瑞典）。其他化合物使用內部製定的標準進行分析。

N-乙醯葡萄糖胺及N-乙醯乳糖胺在Dionex HPAEC系統上使用脈衝安培檢測（PAD）進行分析。將5µL樣品注射到Dionex CarboPac PA1管柱4x250mm與Dionex CarboPac PA1保護管柱4 x 50mm。管柱溫度為20°C。使用3種溶析液進行分離：A）去離子水、B）200 mM氫氧化鈉、以及C）500mM 乙酸鈉。溶析曲線如下應用：0-10分鐘50% A和50% B；10-18分鐘50-44%A和50%B；18-28分鐘 44%A和50%B； 28-32分鐘 44-30.8%A和50%B；32-39分鐘 30.8%A和50%B；39-40分鐘30.8-2%A和50%B；40-43分鐘2%A和50%B；43-44分鐘2-50%A和50%B；44-50分鐘50%A和50%B。流速為1.0mL/min。

N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯乳糖胺、乳-N-雙糖、岩藻糖基化N-乙醯乳糖胺、及岩藻糖基化LNB在配有蒸發光散射檢測器（ELSD）或折射率（RI）檢測器的Waters Acquity H級UPLC上進行分析。將體積0.7µL的樣品注入Waters Acquity UPLC BEH Amide 管柱（2.1 x 100mm；130Å；1.7 µm）和配有Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱，130Å，2.1x 5mm。管柱溫度為50°C。移動相由¼水和 ¾乙腈溶液組成，並添加了0.2%三乙胺。該方法是以流速為0.130mL/min進行等度。ELS檢測器的漂移管溫度為50°C，N ₂氣壓為50 psi，增益為200，數據速率為10pps。RI檢測器的溫度設為35°C。

唾液酸化N-乙醯乳糖胺及唾液酸化乳-N-雙糖以配有折射率（RI）檢測器的Waters Acquity H級UPLC上進行分析。將體積0.5 µL的樣品注入具有移動相之Waters Acquity UPLC BEH Amide 管柱（具有1.7 µm粒徑的2.1 x 100mm），該移動相包含70 mL乙腈、26 mL 超純水中的150 mM乙酸銨以及4 mL添加有0.05%吡咯啶的甲醇。該方法是以流速為0.150mL/min進行等度。管柱溫度設為50°C。

在Dionex HPAEC系統上使用脈衝安培檢測（PAD）分析低濃度（低於50 mg/L）的糖。將體積5 µL的樣品注入Dionex CarboPac PA200管柱4 x 250 mm和 Dionex CarboPac PA200保護柱4 x 50 mm。管柱溫度設為30°C。使用梯度，其中溶析液A是去離子水，其中溶析液B是200mM氫氧化鈉並且其中溶析液C是500mM乙酸鈉。寡醣在60分鐘內分離，同時使用以下梯度保持25%的溶析液B的恆定比例：初始等度步驟將75%的溶析液A保持10分鐘，在8分鐘內初始增加溶析液C從0到4%，第二等度步驟將71%的溶析液A和4%的溶析液C保持6分鐘，在2.6分鐘內第二次增加溶析液C從4%到12%，第三等度步驟將63%溶析液A和12%的溶析液C保持3.4分鐘，在5分鐘內第三次增加溶析液C從12%到48%。作為洗滌步驟，使用48%的溶析液C洗滌3分鐘。對於管柱平衡，75%的溶析液A和0%的溶析液C的初始條件在1分鐘內恢復並保持11分鐘。施加的流速為0.5mL/min。

數據的標準化

對於所有類型的培養條件，從突變菌株獲得的數據針對在與參考菌株相同的培養條件下獲得的數據進行標準化。

實施例 2 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

在此實施例中，首先，野生型大腸桿菌K-12 MG1655可藉由同源大腸桿菌N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶（ nagA）基因及大腸桿菌葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶（ nagB）基因的剔除進行修飾，接著以表現質體進一步轉形，該表現質體包括來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）的持續型表現匣。當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，由此獲得的突變大腸桿菌菌株在全肉湯樣品中產生GlcNAc。

實施例 3 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

如實施例2所述的經修飾以產生GlcNAc之突變大腸桿菌菌株可進一步以第二相容表現質體進行轉形，該第二相容表現質體包括來自大腸桿菌的L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶glmS*54的突變變體的持續型表現匣，該突變變體與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 2006: 88, 419-429）。當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，新穎菌株亦在全肉湯樣品中產生GlcNAc，且在該菌株中所獲得的GlcNAc力價高於在實施例2產生且缺乏突變glmS*54的突變菌株所獲得的GlcNAc力價。

實施例 4 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

野生型大腸桿菌K-12 MG1655可藉由大腸桿菌 nagA及 nagB基因的剔除及來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577）之持續型表現匣的基因敲入進行修飾。當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，由此獲得的突變大腸桿菌菌株在全肉湯樣品中產生GlcNAc。

實施例 5 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

如實施例4所述的經修飾以產生GlcNAc之突變大腸桿菌菌株可進一步以表現質體進行轉形，該表現質體包括來自大腸桿菌的glmS*54的持續型表現匣，該glmS*54與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 2006: 88, 419-429）。當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，新穎菌株亦在全肉湯樣品中產生GlcNAc，且在此菌株中所獲得的GlcNAc力價高於在實施例4產生且缺乏突變glmS*54的突變菌株所獲得的GlcNAc力價。

實施例 6 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

如實施例4所述的經修飾以產生GlcNAc之突變大腸桿菌菌株可進一步以包括來自大腸桿菌的glmS*54之持續型表現匣之基因敲入進行轉形，該glmS*54與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 2006: 88, 419-429）。當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，新穎菌株亦在全肉湯樣品中產生GlcNAc，且在此菌株中所獲得的GlcNAc力價高於在實施例4產生且缺乏突變glmS*54的突變菌株所獲得的GlcNAc力價。

實施例 7 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

如實施例2所述的經修飾以產生GlcNAc之突變大腸桿菌菌株可進一步以包括來自大腸桿菌的glmS*54之持續型表現匣之基因敲入進行轉形，該glmS*54與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 2006: 88, 419-429）。當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，新穎菌株亦在全肉湯樣品中產生GlcNAc，且在此菌株中所獲得的GlcNAc力價高於在實施例2產生且缺乏突變glmS*54的突變菌株所獲得的GlcNAc力價。

實施例 8 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 LacNAc 或 LNB 的產生

如實施例2及4至7所述，具有 nagABKO並表現GNA1（UniProt ID P43577）且具有或不具有額外的突變glmS*54表現（與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 2006: 88, 419-429））之的突變GlcNAc產生大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以含有持續型轉錄單元的質體進行轉形以表現具有SEQ ID NO 15的腦膜炎雙球菌的N-乙醯葡萄糖胺β1,4-半乳糖基轉移酶LgtB或具有SEQ ID NO 03的來自大腸桿菌O55:H7的N-乙醯葡萄糖胺β1,3-半乳糖基轉移酶WbgO。

當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，表現SEQ ID NO 15的LgtB之各新穎菌株在全肉湯樣品中產生GlcNAc及LacNAc。與表現SEQ ID NO 15但缺乏突變glmS*54的修飾菌株相比，表現SEQ ID NO 15且亦表現突變glmS*54的新穎菌株中的GlcNAc及LacNAc力價較高。

當根據實施例1中的培養條件（其中培養基含有甘油）在生長實驗中進行評估時，表現SEQ ID NO 03的WbgO之各新穎菌株在全肉湯樣品中產生GlcNAc及LNB。與表現SEQ ID NO 03的WbgO但缺乏突變glmS*54的修飾菌株相比，表現SEQ ID NO 03且亦表現突變glmS*54的新穎菌株中的GlcNAc及LNB力價較高。

實施例 9 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 的產生

如實施例1所述，優化GDP-岩藻糖產生的大腸桿菌突變K-12 MG1655菌株可進一步突變以額外產生GlcNAc。該突變包括大腸桿菌 nagA及 nagB基因的剃除與持續型表現建構體的敲入，該持續型表現建構體含有突變glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）及來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577）。根據實施例1提供的培養條件（其中培養基含有30g/L蔗糖），在生長實驗中評價新穎菌株並與其親本菌株進行比較。各菌株在96孔盤的多個孔中生長72小時。實驗顯示，在新穎突變菌株的全肉湯樣品中可以測量到0.90 ± 0.10 g/L GlcNAc，而在原始親本菌株的全肉湯樣品中沒有檢測到GlcNAc產生。實驗進一步證明，與原始親本菌株相比，為GlcNAc產生添加的突變不影響新穎菌株產生GDP-岩藻糖。

實施例 10 ：經修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 及 LacNAc 的產生

如實施例1所述，優化GDP-岩藻糖產生的大腸桿菌突變K-12 MG1655菌株可以大腸桿菌 nagA及 nagB基因的剃除與具有SEQ ID NO 15的腦膜炎雙球菌的N-乙醯葡萄糖胺β1,4-半乳糖基轉移酶（LgtB）之持續型表現建構體的基因敲入進行進一步突變。下一步，用由不同轉錄單元（TU）構建的不同持續型表現載體轉形該突變株的細胞，該轉錄單元含有來自大腸桿菌的突變glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）及來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577），如表2及表3所列。根據實施例1提供的培養條件在生長實驗中評估所有新穎菌株（A-H）。表2顯示在含有30 g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後，採集來自每個新穎突變大腸桿菌菌株的全肉湯樣品中的GlcNAc（g/L）和LacNAc（g/L）的產量。數據證明，所有新菌株均能夠產生GlcNAc和LacNAc兩者，無需向培養基中補充添加GlcNAc。相比之下，具有相同遺傳背景但缺乏glmS*54和GNA1表現質體的參考菌株只能在補充有GlcNAc的培養基中產生LacNAc（結果未示出）。表2亦顯示，所有新穎菌株中GlcNAc和LacNAc兩者的產生力價可以根據表現載體A-H中選擇的轉錄單元而變化，以表現SEQ ID NO 15和19。

表2：在含有30 g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後，採集來自突變大腸桿菌菌株的全肉湯樣品中的GlcNAc（g/L）和LacNAc（g/L）的產量

菌株	*glmS54 ()* 的 TU	GNA1 的 TU （ UniProt IDP43577 ）	GlcNAc （ g/L ）（ ± sd ）	LacNAc （ g/L ）（ ± sd ）
A	TU45	TU44	0.98 (± 0.07)	1.22 (± 0.12)
B	TU53	TU44	1.90 (± 0.14)	1.53 (± 0.13)
C	TU53	TU52	2.08 (± 0.06)	1.45 (± 0.08)
D	TU47	TU55	2.14 (± 0.25)	1.86 (± 0.25)
E	TU46	TU44	2.40 (± 0.22)	1.74 (± 0.23)
F	TU45	TU57	2.81 (± 0.02)	1.60 (± 0.08)
G	TU47	TU54	3.02 (± 0.17)	2.19 (± 0.17)
H	TU45	TU54	3.21 (± 0.54)	2.26 (± 0.46)

*與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變

表3：用於轉錄單元（TU）的啟動子及UTR序列，以表現如表2所示的glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）及GNA1（UniProt ID P43577）

TU	啟動子 *	UTR*	終止子
TU44	Mutalik_P11	GalE_BCD18	rnpB_T1**
TU45	Mutalik_P5	Gene10_LeuL	T7early***
TU46	Mutalik_P5	GalE_LeuAB	T7early***
TU47	Mutalik_P9	Gene10_LeuL	T7early***
TU52	Mutalik_P11	ThrA_BCD2	rnpB_T1**
TU53	Mutalik_P9	GalE_LeuAB	T7early***
TU54	Mutalik_P10	GalE_BCD18	rnpB_T1**
TU55	Mutalik_P10	GalE_BCD18	rnpB_T1**
TU57	Mutalik_P10	ThrA_BCD2	rnpB_T1**

*取自Mutalik等人的序列（Nat. Methods 2013, 10, 354-360） **取自Kim及Lee的序列（FEBS letters 1997, 407(3), 353-356） ***取自Dunn等人的序列（Nucleic Acids Res. 1980, 8(10), 2119-2132）

實施例 11 ：評估經修飾的大腸桿菌宿主中 LacNAc 產生

在下一實驗中，優化GDP-岩藻糖產生且如實施例9所述的產生GlcNAc之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以具有SEQ ID NO 15的腦膜炎雙球菌的N-乙醯葡萄糖胺β1,4-半乳糖基轉移酶（LgtB）的敲入進行修飾。在如實施例1所述的生長實驗中評估此新穎菌株，其與參考菌株共享 nagAB剃除及 LgtB敲入但表現來自相同轉錄單元的glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）及GNA1（UniProt ID P43577）呈遞給來自質體的菌株。表4顯示來自在具有30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後採集的每個突變大腸桿菌菌株的全肉湯樣品中GlcNAc（g/L）和LacNAc（g/L）的產生。數據顯示，突變菌株兩者皆產生GlcNAc和LacNAc，其與GNA1和glmS*54兩者如何呈遞給菌株無關。

表4：在包括30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後，採集自突變大腸桿菌菌株的全肉湯樣品中GlcNAc（g/L）和LacNAc（g/L）的產生

*GNA1() 及 glmS54 ()* 的轉錄單元的表現	GlcNAc （ g/L ）（ ± sd ）	LacNAc （ g/L ）（ ± sd ）
來自基因敲入	1.62 (± 0.12)	1.60 (± 0.06)
來自表現質體	6.71 (± 0.57)	2.73 (± 0.23)

*UniProt ID P43577 **與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變

實施例 12 ：修飾的大腸桿菌宿主中 GlcNAc 和 LacNAc 的產生

在下一實驗中，大腸桿菌K-12 MG1655菌株藉由具有SEQ ID NO 15的腦膜炎雙球菌的N-乙醯葡萄糖胺β1,4-半乳糖基轉移酶（LgtB）的敲入進行進一步修飾，該大腸桿菌K-12 MG1655菌株如實施例1所述，產生唾液酸且含有大腸桿菌 nagA及 nagB基因的剃除及含有glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）、GNA1（UniProt ID P43577）、來自卵形擬桿菌的N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）（UniProt ID A7LVG6）及來自腦膜炎雙球菌的N-乙醯神經胺酸合成酶（NeuB）（UniProt ID E0NCD4）之持續型表現建構體的基因敲入。

並且，如實施例1所述的以基因剃除大腸桿菌 ushA及 galT基因並以基因敲入大腸桿菌的UDP-葡萄糖-4-表異構酶（galE）（UniProt ID P09147）的持續型表現建構體優化促進UDP-半乳糖產生且大腸桿菌K-12 MG1655菌株藉由剃除大腸桿菌 nagB基因和基因敲入編碼SEQ ID NO 15的基因的持續型表現構建體進行額外的突變。根據實施例1中提供的培養條件（其中，該培養基含有蔗糖）在生長實驗中評估新穎菌株並與其各自的親本菌株進行比較。各菌株在96孔盤的多個孔中生長72小時。實驗證實，在全肉湯樣品中，各新穎菌株均產生GlcNAc和LacNAc，而親本菌株兩者均不產生LacNAc。

實施例 13 ：修飾的大腸桿菌宿主中半乳糖基化寡醣的產生

優化促進UDP-半乳糖產生且如實施例12所述的產生GlcNAc和LacNAc之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以含有SEQ ID NO 3的來自 E. coliO55:H7的N-乙醯葡萄糖胺 β1,3-半乳糖基轉移酶WbgO的持續型表現建構體之表現載體進行額外轉形。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，除了GlcNAc、LacNAc和LNB之外，新穎菌株還產生Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc，其含有兩個將β-1,3及β-1,4連接至GlcNAc的半乳糖部分。

實施例 14 ：修飾的大腸桿菌宿主中岩藻糖基化 LacNAc 的產生

優化GDP-岩藻糖產生且如實施例10所述的產生GlcNAc及LacNAc之大腸桿菌K-12 MG1655突變菌株H可以含有皆來自幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（GenBank NO. AAD29863.1）或a1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT（UniProt ID O30511）的持續型表現建構體之表現質體進行額外轉形。根據實施例1中提供的培養條件在生長實驗中評估新穎菌株。表5顯示來自在具有30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後採集的兩種突變菌株的全肉湯樣品中2'FLacNAc（g/L）或3-FLacNAc（g/L）的產生。數據證實，各新穎菌株產生GlcNAc、LacNAc及岩藻糖基化形式的LacNAc，其中2'FLacNAc在表現HpFutC（GenBank NO. AAD29863.1）的菌株中產生，3-FLacNAc在表現HpFucT（UniProt ID O30511）的菌株中產生。在此實驗中未檢測到二岩藻糖基化LacNAc。在缺乏岩藻糖基轉移酶表現載體的相同遺傳背景的親本菌株的全肉湯樣品中無法檢測到岩藻糖基化LacNAc變體。

表5：來自在包括30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後的突變大腸桿菌菌株採集的全肉湯樣品中2'FLacNAc（g/L）及3-FLacNAc（g/L）的產生

突變大腸桿菌 LacNAc 產生菌株表現	2’FLacNAc （ g/L ）（ ± sd ）	3-FLacNAc （ g/L ）（ ± sd ）
參考（ = 無岩藻糖基轉移酶）	0	0
a1,2- 岩藻糖基轉移酶 HpFutC （ GenBank NO. AAD29863.1 ）	0.46 (± 0.02)	0
a1,3/4- 岩藻糖基轉移酶 HpFucT （ UniProt ID O30511 ）	0	0.53 (± 0.02)

實施例 15 ：修飾的大腸桿菌宿主中二岩藻糖基化 LacNAc 的產生

優化GDP-岩藻糖產生且如實施例10所述的產生GlcNAc及LacNAc之大腸桿菌K-12 MG1655突變菌株H可以含有岩藻糖基轉移酶HpFutC（GenBank NO. AAD29863.1）及HpFucT（UniProt ID O30511）的持續型表現建構體之表現質體進行額外轉形。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，在全肉湯樣品中除了GlcNAc及LacNAc之外，新穎菌株還產生2’-岩藻糖基化、3-岩藻糖基化及二岩藻糖基化LacNAc。

實施例 16 ：修飾的大腸桿菌宿主中唾液酸化 LacNAc 的產生

如實施例1所述的產生唾液酸之大腸桿菌K-12 MG1655菌株進一步以具有SEQ ID NO 15的LgtB之持續型表現建構體的敲入進行突變並以表現質體進行轉形，該表現質體含有來自出血性巴氏桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶（NeuA）（GenBank NO. AMK07891.1）及由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽之持續型表現建構體。根據實施例1提供的培養條件（其中培養基含有30g/L蔗糖），在生長實驗中評價新穎菌株並與其親本菌株進行比較。各菌株在96孔盤的多個孔中生長72小時。數據顯示，在全肉湯樣品中，除了GlcNAc及LacNAc之外，新穎菌株產生0.32 ± 0.02 g/L a2,3-唾液酸化LacNAc。無法檢測到二唾液酸化LacNAc。在缺乏唾液酸轉移酶表現載體的相同遺傳背景的親本菌株的全肉湯樣品中無法檢測到唾液酸化的LacNAc變體。

相似地，如實施例1所述的產生唾液酸之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以具有SEQ ID NO 15的LgtB之持續型表現建構體的敲入進行突變並以表現質體進行轉形，該表現質體含有來自出血性巴氏桿菌的NeuA（GenBank NO. AMK07891.1）及由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽之持續型表現建構體。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，在全肉湯樣品中新穎菌株產生GlcNAc及LacNAc、以及a2,6-唾液酸化LacNAc。

實施例 17 ：修飾的大腸桿菌宿主中二唾液酸化 LacNAc 的產生

如實施例1所述的產生CMP-唾液酸之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以具有SEQ ID NO 15的LgtB之持續型表現建構體的敲入進行突變並以表現質體進行轉形，該表現質體含有由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽及由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽之持續型表現建構體。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，在全肉湯樣品中新穎菌株產生GlcNAc及LacNAc、以及3’-唾液酸化、6’-唾液酸化以及二唾液酸化LacNAc。

實施例 18 ：大腸桿菌宿主中修飾的 LacNAc 的產生

優化GDP-岩藻糖產生且如實施例11所述的產生GlcNAc及LacNAc之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可以含有皆來自腦膜炎雙球菌的b1,3-N-乙醯基-己醣胺轉移酶lgtA（GenBank NO. AAM33849.1）的持續型表現建構體之表現質體進行額外轉形。藉由突變體glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）、同源EcGlmM和EcGlmU以及異源NmLgtA（GenBank NO. AAM33849.1）的後續作用，由此產生的菌株當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，在細胞內將果糖-6-磷酸鹽轉化為UDP-GlcNAc，並使用此UDP-GlcNAc進行細胞內修飾LacNAc以導致在全肉湯樣品中產生GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。該菌株亦產生聚-LacNAc結構，即（Gal-b1,4-GlcNAc）n，其由重複的N-乙醯乳糖胺建構而成，該重複的N-乙醯乳糖胺是藉由具有SEQ ID NO 15的LgtB的替代活性以及在菌株中表現的LgtA（GenBank NO. AAM33849.1）將beta1,3相互連接。

優化UDP-半乳糖產生且如實施例12所述的產生GlcNAc和LacNAc之大腸桿菌K-12 MG1655菌株經修飾以持續性表現來自綠膿桿菌（ Pseudomonas aeruginosa）的UDP-GlcNAc表異構酶wbpP（UniProt ID Q8KN66）以及來自流感嗜血桿菌的醣基轉移酶lgtD（UniProt ID A0A2X4DBP3）。藉由突變大腸桿菌glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）、同源大腸桿菌GlmM和GlmU以及綠膿桿菌wbpP（UniProt ID Q8KN66）的後續作用，果糖-6-磷酸鹽經由中間化合物葡萄糖胺-6-磷酸鹽、葡萄糖胺-1-磷酸鹽和UDP-GlcNAc在細胞內將果糖-6-磷酸鹽轉換為UDP-GalNAc。藉由新表現的LgtD酶（UniProt ID A0A2X4DBP3）的後續作用，新穎菌株當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有30 g/L蔗糖）評估的生長實驗中，能夠用GalNAc修飾細胞內產生的LacNAc，在全肉湯樣品中產生0.12 ± 0.02 g/L GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。

實施例 19 ：修飾的大腸桿菌中唾液酸化的聚 LacNAc 的產生

如實施例16及17所述的全肉湯樣品中產生LacNAc及LacNAc的唾液酸化形式之大腸桿菌菌株可進一步以表現質體進行轉形，該表現質體含有LgtA（GenBank NO. AAM33849.1）之持續型表現建構體。藉由分別具有SEQ ID NO 15及GenBank NO. AAM33849.1的LgtB和LgtA轉移酶的替代活性，當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，新穎菌株另外產生聚-LacNAc結構，即（Gal-b1,4-GlcNAc）n，其由重複的N-乙醯乳糖胺構成，該重複的N-乙醯乳糖胺是連同其中Gal被唾液酸化的唾液酸化聚lacNAc結構，將β1,3-互相連接。

實施例 20 ：修飾的大腸桿菌宿主中 LNB 的產生

在下一實驗中，優化GDP-岩藻糖產生且如實施例9所述的產生GlcNAc之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以具有SEQ ID NO 03或者來自質體或來自基因敲入的WbgO的持續型表現進行修飾。根據實施例1提供的培養條件，在生長實驗中評價新穎菌株並與缺少SEQ ID NO 03表現構建體的親本菌株進行比較。表6顯示在含有30 g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後獲取的每個突變菌株的全肉湯樣品中LNB（g/L）的產生。數據證實，這兩種新穎菌株在全肉湯樣品中都產生LNB，與WbgO如何呈遞給菌株無關。

表6：在包括30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後，採集自突變大腸桿菌菌株的全肉湯樣品中LNB（g/L）的產生

具有 SEQ ID NO 03 的 EcWbgO 的轉錄單元的表現	LNB （ g/L ）（ ± sd ）
來自基因敲入	0.63 (± 0.12)
來自表現質體	2.81 (± 0.11)

實施例 21 ：修飾的大腸桿菌宿主中岩藻糖基化 LNB 的產生

優化GDP-岩藻糖產生且如實施例20（其中具有SEQ ID NO 03的WbgO是來自基因敲入的表現）所述的產生GlcNAc及LNB之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可以含有皆來自幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（GenBank NO. AAD29863.1）或a1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT（UniProt ID O30511）的持續型表現建構體之表現質體進行額外轉形。根據實施例1中提供的培養條件在生長實驗中評估新穎菌株。表7顯示來自在具有30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後採集的兩種突變菌株的全肉湯樣品中2’FLNB（g/L）或4-FLNB（g/L）的產生。數據證實，各新穎菌株在全肉湯樣品產生岩藻糖基化形式的LNB，其中2’FLNB在表現HpFutC（GenBank NO. AAD29863.1）的菌株中測量到，且4-FLNB在表現HpFucT（UniProt ID O30511）的菌株中測量到。在此實驗中未檢測到二岩藻糖基化LNB。在缺乏岩藻糖基轉移酶表現載體的相同遺傳背景的親本菌株的全肉湯樣品中無法檢測到岩藻糖基化LNB變體。

表7：來自在包括30g/L蔗糖的基本培養基中培養72小時後的突變大腸桿菌菌株採集的全肉湯樣品中2’FLNB（g/L）及4-FLNB（g/L）的產生

突變大腸桿菌 LNB 產生菌株表現	2’FLNB （ g/L ）（ ± sd ）	4-FLNB （ g/L ）（ ± sd ）
參考（ = 無岩藻糖基轉移酶）	0	0
a1,2- 岩藻糖基轉移酶 HpFutC （ GenBank NO. AAD29863.1 ）	0.19 (± 0.03)	0
a1,3- 岩藻糖基轉移酶 HpFucT （ UniProt ID O30511 ）	0	0.04 (± 0.01)

實施例 22 ：修飾的大腸桿菌宿主中二岩藻糖基化 LNB 的產生

優化GDP-岩藻糖產生且如實施例20（其中具有SEQ ID NO 03的WbgO是來自基因敲入的表現）所述的產生GlcNAc及LNB之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可以含有a1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（GenBank NO. AAD29863.1）及a1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT（UniProt ID O30511）兩者的持續型表現建構體之表現質體進行額外轉形。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，新穎菌株在全肉湯樣品產生GlcNAc和LNB以及2'-岩藻糖基化、4-岩藻糖基化和二岩藻糖基化的LNB。

實施例 23 ：修飾的大腸桿菌宿主中半乳糖基化 LNB 的產生

如實施例1所述的優化促進UDP-半乳糖產生之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步藉由大腸桿菌 nagB基因的剃除進行額外突變並進一步以具有SEQ ID NO 03或者來自質體或來自基因敲入的WbgO的持續型表現進行進一步修飾。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，在全肉湯樣品中新穎菌株皆產生LNB。當用α-1,2-半乳糖基轉移酶及/或α-1,3-半乳糖基轉移酶及/或β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或β-1,4-半乳糖基轉移酶的表現構建體額外轉化新穎的LNB產生菌株時，在根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，各新穎菌株在全肉湯樣品中產生GlcNAc和LNB以及半乳糖基化的LNB形式。

實施例 24 ：修飾的大腸桿菌宿主中唾液酸化 LNB 的產生

如實施例1所述的產生CMP-唾液酸之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以具有SEQ ID NO 03的WbgO之持續型表現建構體的敲入進行突變並以表現質體進行轉形，該表現質體含有由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽之持續型表現建構體。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，新穎菌株在全肉湯樣品中，除了GlcNAc及LNB之外，產生唾液酸化LacNAc LNB形式。相似地，另外表現具有SEQ ID NO 03的WbgO及由具有β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽之大腸桿菌K-12 MG1655 CMP-唾液酸產生菌株，當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗時，在全肉湯樣品中產生GlcNAc和LNB以及唾液酸化LNB形式。

實施例 25 ：修飾的大腸桿菌宿主中二唾液酸化 LNB 的產生

如實施例1所述的產生CMP-唾液酸之大腸桿菌K-12 MG1655菌株可進一步以具有SEQ ID NO 03的WbgO之持續型表現建構體的敲入進行突變並以表現質體進行轉形，該表現質體含有由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽及/或由具有β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽之持續型表現建構體。當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖）評估的生長實驗中，在全肉湯樣品中新穎菌株產生GlcNAc及LNB、以及單唾液酸化及/或二唾液酸化LNB。

實施例 26 ：用突變大腸桿菌宿主發酵生產 LacNAc

優化GDP-岩藻糖產生且如實施例11中所述的藉由從表達質體呈遞給宿主的glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）及GNA1（UniProt ID P43577）產生GlcNAc和LacNAc之突變大腸桿菌K-12 MG1655菌株根據實施例1提供的條件，在5L生物反應器規模的補料批次發酵中進行評估。在此實施例中，蔗糖用作碳源。如實施例1所述，定期取樣並測量LacNAc的產生。

實施例 27 ：當在除了蔗糖以外的其他碳源上生長時，經修飾的大腸桿菌宿主中 LacNAc 或 LNB 的產生

當根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有甘油）評估的生長實驗中，如實施例10至12所述的經修飾產生GlcNAc和LacNAc的突變大腸桿菌菌株或如實施例20所述的經修飾產生GlcNAc和LNB的突變大腸桿菌菌株分別產生GlcNAc和LacNAc或GlcNAc和LNB。當如實施例1中所述，使用以下任一或多種的碳源，但不限於此：甘油、葡萄糖、果糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖及甘露糖而在生物反應器規模的補料批次發酵中進行評估時，該突變菌株也分別產生GlcNAc和LacNAc或GlcNAc和LNB。

實施例 28 ：材料與方法啤酒酵母菌

培養基

菌株在含有6.7 g/L酵母氮基不含胺基酸（YNB w/o AA, Difco）、20 g/L瓊脂（Difco）（固體培養物）、22 g/L一水合葡萄糖或20 g/L乳糖與0.79 g/L CSM或0.77 g/L CSM-Ura之具有完全補充混合物（SD CSM）或CSM脫落（CSM drop-out）（SD CSM-Ura）的合成限定酵母培養基（MP 生物醫學）上生長。

菌株

由Bachmann等人（Yeast (1998) 14:115-32）創建的啤酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）BY4742從Euroscarf培養物中心獲得。所有突變體菌株均採用Gietz的方法（Yeast 11:355-360, 1995）Y藉由同源重組或質體轉形產生。

質體

酵母菌表現質體p2a_2µ（Chan 2013, Plasmid 70, 2-17）用於啤酒酵母菌的表現外源基因。此質體包含胺苄青黴素抗性基因和細菌複製起點，以允許在大腸桿菌中進行選擇和維持。質體進一步含有2μ酵母ori和Ura3選擇標誌物以用於在酵母中的選擇和維持。

在一實施例中，酵母菌表現質體p2a_2µ可經修飾以獲得如WO18122225所述之來自大腸桿菌突變果糖-6-磷酸轉胺酶glmS*54（其與野生型glmS蛋白質（UniProt ID P17169）不同在於A39T、R250C和G472S突變）、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、例如包括aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個基因、或來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草芽孢桿菌的BsAraL之磷酸酶，如WO18122225所述。該修飾的質體可進一步經修飾以獲得選自包括以下列舉的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12及13及/或選自包括以下列舉的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41。

在產生GDP-岩藻糖的一實施例中，酵母菌表現質體例如p2a_2µ_Fuc（Chan 2013, Plasmid 70, 2-17）可以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元為針對例如來自乳酸克魯維酵母（ K. lactis）的LAC12（UniProt ID P07921）之乳糖通透酶、例如來自大腸桿菌的gmd（UniProt ID P0AC88）之GDP-甘露糖 4,6-脫水酶、以及例如來自大腸桿菌的fcl（UniProt ID P32055）之GDP-L-岩藻糖合成酶。酵母菌表現質體p2a_2μ_Fuc2可使用作為p2a_2μ_Fuc質體的替代表現質體，該質體包含胺苄青黴素抗性基因、細菌ori、2μ酵母ori和Ura3選擇標誌物持續型轉錄單元，其用於例如來自乳酸克魯維酵母的LAC12（UniProt ID P07921）之乳糖通透酶、例如來自大腸桿菌的fucP（UniProt ID P11551）之岩藻糖通透酶、以及例如來自脆弱擬桿菌的fkp（UniProt ID SUV40286.1）之具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶活性之雙官能酶。為了進一步生產岩藻糖基化寡糖，p2a_2µ_Fuc及其變體p2a_2µ_Fuc2還包含一個持續型轉錄單元，其用於例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或例如來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。

在產生UDP-半乳糖的一實施例中，酵母菌表現質體可衍生自pRS420-質體系列（Christianson et al., 1992, Gene 110: 119-122），該質體系列含有HIS3選擇標誌物及用於例如來自大腸桿菌的galE（UniProt ID P09147）之UDP-葡萄糖-4-表異構酶的持續型轉錄單元。此質體可進一步以例如來自乳酸克魯維酵母的LAC12（UniProt ID P07921）之乳糖通透酶和例如來自腦膜炎雙球菌的lgtA（UniProt ID Q9JXQ6）之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶活性的持續型轉錄單元進行修飾，以產生LN3。為了進一步產生LN3衍生的寡糖，例如LNT，突變LN3產生菌株進一步以選自包含SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12及13的列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續型轉錄單元進行修飾。為了進一步產生LN3衍生的寡糖，例如LNnT，突變LN3產生菌株進一步以選自包含SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41的列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續型轉錄單元進行修飾。

在產生唾液酸及CMP-唾液酸的一實施例中，酵母菌表現質體可衍生自pRS420-質體系列（Christianson et al., 1992, Gene 110: 119-122），該質體系列含有TRP1選擇標誌物及持續型轉錄單元，該持續型轉錄單元用於一或多個複製的L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶，例如，來自大腸桿菌的突變體glmS*54（與UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)）、一個磷酸酶，例如，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或者來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草芽孢桿菌的BsAraL，如WO18122225所述、例如來自卵形擬桿菌的AGE（UniProt ID A7LVG6）之N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶、例如來自腦膜炎雙球菌的N-乙醯神經胺酸合成酶（UniProt ID E0NCD4）以及例如來自空腸曲桿菌的NeuA酶（UniProt ID Q93MP7）之N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶、來自流感嗜血桿菌的NeuA酶（GenBank No. AGV11798.1）或來自出血性巴氏桿菌的NeuA酶（GenBank No. AMK07891.1）。可選地，包括一或多個複製的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶的持續型轉錄單元例如更添加例如來自啤酒酵母菌的GNA1（UniProt ID P43577）。為了產生唾液酸化寡醣，該質體進一步包括持續型轉錄單元，其用於例如來自乳酸克魯維酵母的LAC12（UniProt ID P07921）之乳糖通透酶、以及一或多個複製的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶，例如來自出血性巴氏桿菌的PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽及、來自腦膜炎雙球菌的NmeniST3（GenBank No. ARC07984.1）或來自出血性巴氏桿菌出血性亞種菌株Pm70的PmultST2（GenBank No. AAK02592.1）、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶，例如來自海鱺發光桿菌的PdST6（UniProt ID O66375）或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽或來自發光桿菌屬（ Photobacterium sp）JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6（UniProt ID A8QYL1）或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的P-JT-ISH-224-ST6樣多肽及/或例如來自小鼠（UniProt ID Q64689）的α-2,8-唾液酸轉移酶。

較佳但非必須地，醣基轉移酶蛋白及/或參與核苷酸活化糖合成的蛋白質在N端融合到SUMOstar標籤（例如從pYSUMOstar，Life Sensors，Malvern，PA獲得）以提高其溶解度。

可選地，以編碼例如Hsp31、Hsp32、Hsp33、Sno4、Kar2、Ssb1、Sse1、Sse2、Ssa1、Ssa2、Ssa3、Ssa4、Ssb2、Ecm10、Ssc1、Ssq1、Ssz1、Lhs1、Hsp82、Hsc82、Hsp78、Hsp104、Tcp1、Cct4、Cct8、Cct2、Cct3、Cct5、Cct6或Cct7（Gong et al., 2009, Mol. Syst. Biol. 5: 275）的伴護蛋白的持續型轉錄單元的敲入修飾突變酵母菌株。

質體維持在購自Invitrogen的宿主大腸桿菌DH5α（F ^-, phi80d lacZdeltaM15, delta( lacZYA- argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk ^-, mk ⁺), phoA, supE44, lambda ^-, thi-1, gyrA96, relA1）。

異源及同源表現

需要表現的基因，無論是來自質體還是來自基因組，都是由以下公司之一以合成方法合成：DNA2.0、Gen9、IDT或Twist Bioscience。

藉由針對表現宿主的密碼子使用優化密碼子的使用，可以進一步促進表現。利用供應商的工具對基因進行優化。

培養條件

一般而言，酵母菌菌株最初生長在SD-CSM平板上以獲得單一菌落。這些平板於30℃生長2-3天。

從單一菌落開始，預培養物於30℃，以200rpm搖動在5mL中過夜生長。隨後的125ml搖瓶實驗在25 mL培養基中接種2%的此類預培養物。這些搖瓶於30℃使用200rpm的軌道振盪進行培養。

基因表現啟動子

基因利用由Blazeck（Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 11, 2012）所述的合成持續型啟動子表現。

實施例 29 ：啤酒酵母菌中 GlcNAc 及 LacNAc ；或 GlcNAc 及 LNB 的產生

另一實施例提供以啤酒酵母菌形式的真核生物用於實施本發明的用途。使用如實施例28所述的菌株、質體及方法，生成產生GlcNAc和LacNAc的突變啤酒酵母菌菌株。此些修飾包括額外的持續型表現單元，其用於大腸桿菌的突變果糖-6-磷酸轉胺酶glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變）、啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、選自以下列舉的一磷酸酶，該列舉包括：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1以及來自枯草芽孢桿菌的BsAraL，如WO18122225所述，以及SEQ ID NO 15的腦膜炎雙球菌的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB。突變啤酒酵母菌菌株能夠以葡萄糖或甘油為碳源生長，將碳源轉化為果糖-6-磷酸鹽，然後藉由新表現的果糖-6-磷酸轉胺酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶及N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶的活性將其轉化為GlcNAc和隨後的LacNAc。

該菌株的預培養物在含有22 g/L葡萄糖的5 mL合成成分確定培養基SD-CSM中進行，並如實施例28所述在30°C下生長。然後將此預培養物接種在搖瓶中的25 mL培養基，其中含有10 g/L葡萄糖作為唯一碳源並在30°C下生長。定期取樣並如實施例1中所述地測量GlcNAc和LacNAc的產生。在類似實驗中，含有SEQ ID NO 03的大腸桿菌O55:H7的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶WbgO，而不是SEQ ID NO 15的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB的類似酵母菌株能夠產生GlcNAc和LNB。

實施例 30 ：用於具有 PFAM 域 PF00535 的 N- 乙醯葡萄糖胺 b-1,3- 半乳糖基轉移酶基因的 RegEx 檢索

針對具有PFAM域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶基因執行RegEx分析，以找到包含具有SEQ ID NO 01的[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD的成員，其中X為是任何胺基酸，其中n為12至17、或找到包含具有SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]的成員，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115。為此，如Pfam數據庫版本Pfam 33.1（2020年6月11日發佈）註釋的所有具有PFAM域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶基因均從UniProt數據庫（2020年7月03日發佈）下載並根據如得自https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2（2019年4月06日發佈）的方法分析該模體的存在。來自該RegEx檢索的相應成員包括：A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0、A0A3N2I9V8, A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28及A0A538TXM3。

實施例 31 ：用於其他 N- 乙醯葡萄糖胺 b-1,3- 半乳糖基轉移酶或 N- 乙醯葡萄糖胺 b-1,4- 半乳糖基轉移酶基因的 RegEx 檢索

可針對具有PFAM域IPR002659的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶基因執行RegEx分析，以找到包含具有SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]的成員，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45。為此，如Pfam數據庫版本Pfam 33.1（2020年6月11日發佈）註釋的所有具有PFAM域IPR002659的N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶基因均從UniProt數據庫（2020年7月03日發佈）下載並根據如得自https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2（2019年4月06日發佈）的方法分析該模體的存在。

可針對具有PFAM域PF01755的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因執行相似的RegEx分析，以找到具有SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]的成員，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76。為此，如Pfam數據庫版本Pfam 33.1（2020年6月11日發佈）註釋的所有具有PFAM域PF01755的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因均從UniProt數據庫（2020年7月03日發佈）下載並根據如得自https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2（2019年4月06日發佈）的方法分析該模體的存在。

相似地，可針對具有PFAM域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因執行RegEx分析，以找到具有SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]的成員，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30、或具有SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]的成員，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25。為此，如Pfam數據庫版本Pfam 33.1（2020年6月11日發佈）註釋的所有具有PFAM域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因均從UniProt數據庫（2020年7月03日發佈）下載並根據如得自https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2（2019年4月06日發佈）的方法分析該模體的存在。

可針對具有PFAM域PF02709而不具有PFAM域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因執行相似的RegEx分析，以找到具有SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D的成員，其中X是任何胺基酸、或者具有SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D的成員，其中X是任何胺基酸，且n為21至24。為此，如Pfam數據庫版本Pfam 33.1（2020年6月11日發佈）註釋的所有具有PFAM域PF02709而不具有PFAM域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因均從UniProt數據庫（2020年7月03日發佈）下載並根據如得自https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2（2019年4月06日發佈）的方法分析該模體的存在。

最後，可針對具有PFAM域PF03808的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因執行RegEx分析，以找到具有SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA的成員，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25、或者具有SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]的成員，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30。為此，如Pfam數據庫版本Pfam 33.1（2020年6月11日發佈）註釋的所有具有PFAM域PF03808的N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶基因均從UniProt數據庫（2020年7月03日發佈）下載並根據如得自https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2（2019年4月06日發佈）的方法分析該模體的存在。

實施例 32 ：以修飾的大腸桿菌宿主產生包含 6'-SL 、 LacNAc 、唾液酸化 LacNAc 、 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNnT 及 LSTc 的寡醣混合物

大腸桿菌K-12菌株MG1655經修飾以如實施例1所述的產生唾液酸，其包括大腸桿菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剃除及持續型轉錄單元的基因敲入，該持續型轉錄單元包括編碼來自大腸桿菌的乳糖通透酶（LacY）（UniProt ID P02920）、來自大腸桿菌的唾液酸轉運體（nanT）（UniProt ID P41036）、來自大腸桿菌的突變L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變）、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶（GNA1）（UniProt ID P43577）、來自卵形擬桿菌的N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶（AGE）（UniProt ID A7LVG6）、來自空腸曲桿菌N-乙醯神經胺酸合成酶（NeuB）（UniProt ID Q93MP9）、來自大腸桿菌Ｗ的蔗糖轉運體（CscB）（UniProt ID E0IXR1）、來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）（UniProt ID Q03417）及來自青春雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶（BaSP）（UniProt ID A0ZZH6）之基因。因此，所獲得的產生唾液酸之突變大腸桿菌菌株進一步以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，以表現來自空腸曲桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶NeuA（UniProt ID Q93MP7）及來自海鱺發光菌（ P. damselae）的α-2,6-唾液酸轉移酶PdbST（UniProt ID O66375）而產生6’-唾液酸乳糖。在下一步驟中，突變菌株進一步以包含持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元用於來自腦膜炎雙球菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶lgtA（UniProt ID Q9JXQ6）及選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，以產生包括6’-SL、LacNAc、唾液酸化LacNAc、LN3、唾液酸化LN3、LNnT及LSTc（Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）的寡醣混合物。根據實施例1（其中，培養基含有蔗糖及乳醣）中提供的培養條件在生長實驗中評估新穎菌株。該菌株在96孔盤中以四個生物學重複進行生長。培養72小時後，收集培養肉湯，並在UPLC分析糖類。

實施例 33 ：以修飾的大腸桿菌宿主產生 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNT 、 LNB 、唾液酸化 LNB 、 3’-SL 及 LSTa 的寡醣混合物

如實施例32所述的修飾以產生唾液酸（Neu5Ac）之大腸桿菌進一步以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，以表現來自空腸曲桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶NeuA（UniProt ID Q93MP7）及來自出血性巴氏桿菌的α-2,3-唾液酸轉移酶PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）以產生3’-唾液乳糖（3’-siayllactose）。在下一步驟中，突變菌株進一步以包含持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元用於來自腦膜炎雙球菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶lgtA（UniProt ID Q9JXQ6）及選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12或13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，以產生包括LN3、3’-唾液酸化LN3（Neu5Ac-a2,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、LNT、LNB、唾液酸化LNB、3’-SL及LSTa（Neu5Ac-a2,3-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）的寡醣混合物。根據實施例1中提供的培養條件（其中，培養基含有蔗糖及乳醣）在生長實驗中評估新穎菌株。該菌株在96孔盤中以四個生物學重複進行生長。培養72小時後，收集培養肉湯，並在UPLC分析糖類。

實施例 34 ：材料及方法枯草芽孢桿菌

培養基

使用兩種不同的培養基，名為豐富的Luria肉湯（LB）和用於搖瓶的基本培養基（MMsf）。基本培養基使用微量元素混合物。

微量元素混合物由0.735 g/L CaCl2.2H2O、0.1 g/L MnCl2.2H2O、0.033 g/L CuCl2.2H2O、0.06 g/L CoCl2.6H2O、0.17 g/L ZnCl2、0.0311 g/L H3BO4、0.4 g/L Na2EDTA.2H2O及0.06 g/L Na2MoO4組成。檸檬酸鐵溶液含有0.135 g/L FeCl3.6H2O、1 g/L檸檬酸鈉（Hoch 1973 PMC1212887）。

Luria肉湯（LB）培養基由1%胰蛋白腖（Difco, Erembodegem, Belgium）、0.5%酵母菌萃取物（Difco）和0.5%氯化鈉（VWR. Leuven, Belgium）組成。Luria肉湯瓊脂（LBA）盤由具有2 g/L瓊脂（Difco, Erembodegem, Belgium）的LB培養基組成。

用於搖瓶實驗的基本培養基（MMsf）由2.00 g/L (NH4)2SO4、7.5 g/L KH2PO4、17.5 g/L K2HPO4、1.25 g/L檸檬酸鈉、0.25 g/L MgSO4.7H2O、0.05 g/L色胺酸、10至30 g/L葡萄糖或其他碳源，包括但不限於果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和麥芽三糖（當在實施例中指定時）、10 ml/L微量元素混合物及10 ml/L檸檬酸鐵溶液組成。使用1M KOH將培養基的pH值設為7。根據實驗，可以添加唾液酸或乳糖作為前驅物。

例如LB的複合培養基藉由高壓滅菌（121°C，21'）且基本培養基藉由過濾（0.22 µm Sartorius）進行滅菌。當必要時，藉由添加抗生素（例如吉歐黴素（zeocin）（20mg/L））使培養基具有選擇性。

菌株、質體及突變

枯草芽孢桿菌168獲得自Bacillus Genetic Stock Center（Ohio，USA）。

用於經由Cre/lox進行基因刪除的質體由Yan等人（Appl. & Environm. Microbial., Sept 2008, p5556-5562）的描述進行構建。如Xue等人（J. Microb. Meth. 34 (1999) 183-191）所述，基因破壞是經由與線性DNA的同源重組和經由電穿孔進行轉形而完成。Liu等人（Metab. Engine. 24 (2014) 61-69）描述基因剃除的方法。此方法使用目標基因的上游和下游的1000bp同源性。

由Popp等人（Sci. Rep., 2017, 7, 15158）所述的整合載體使用作為表現載體，如必要時可進一步用於基因整合。用於表現的合適啟動子可以從部件儲存庫（iGem）中獲得：sequence id：Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。可使用Gibson組件、Golden Gate組件、Cliva組件、LCR或限制性連接進行選殖。

在產生LNB的實施例中，枯草芽孢桿菌突變株以包括持續型轉錄單元的基因組敲入進行修飾，該持續型轉錄單元針對來自大腸桿菌的glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、選自以下列舉的一磷酸酶，該列舉包括：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的DOG1或來自枯草芽孢桿菌的AraL，如WO18122225所述、以及選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12或13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶。

在產生LacNAc的實施例中，枯草芽孢桿菌突變株以包括持續型轉錄單元的基因組敲入進行修飾，該持續型轉錄單元針對來自大腸桿菌的glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、選自以下列舉的一磷酸酶，該列舉包括：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的DOG1或來自枯草芽孢桿菌的AraL，如WO18122225所述、以及選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。為了進一步使該LNB或LacNAc岩藻糖基化，LNB或LacNAc產生菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。

在產生乳糖類的寡醣的實施例中，創建枯草芽孢桿菌突變菌株以含有編碼乳糖輸入蛋白的基因（例如，UniProt ID P02920的大腸桿菌LacY）。對於2'FL、3FL和diFL產生，α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶表現建構體額外添加到菌株中。

在產生乳-N-三糖（LNT-II、LN3、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）的實施例中，枯草芽孢桿菌菌株以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元包含乳糖輸入蛋白（lactose importer）（例如，UniProt ID P02920的大腸桿菌LacY）和半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶，例如來自腦膜炎雙球菌的LgtA（GenBank: AAM33849.1）。為了LNT產生，LN3產生菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12或13的列舉之N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其可經由基因敲入或自表現質體呈遞給菌株。為了LNnT產生，LN3產生菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41的列舉之N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。為了進一步使LN3、LNT或LNnT岩藻糖基化，突變菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。

在唾液酸產生的實施例中，突變枯草芽孢桿菌菌株藉由過度表現天然的果糖-6-P-轉胺酶（UniProt ID P0CI73）創建，以促進細胞內葡萄糖胺-6-磷酸鹽庫。此外，nagA、nagB及gamA基因的酶活性藉由基因剃除而破壞且來自啤酒酵母菌的葡萄糖胺-6-P-轉胺酶GNA1（UniProt ID P43577）、來自卵形擬桿菌的N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶（UniProt ID A7LVG6）和來自空腸曲桿菌的N-乙醯神經胺酸合成酶（UniProt ID Q93MP9）在基因組上過度表現。為了允許唾液酸化寡醣的產生，唾液酸產生菌株進一步以表現建構體進行修飾，該表現建構體包括N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶，例如來自空腸曲桿菌的NeuA酶（UniProt ID Q93MP7）、來自流行性感冒嗜血桿菌（ H. influenzae）的NeuA酶（GenBank No. AGV11798.1）或來自出血性巴氏桿菌的NeuA酶（GenBank No. AMK07891.1）、以及一或多個複製的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶，例如來自出血性巴氏桿菌的PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽及、來自腦膜炎雙球菌的NmeniST3（GenBank No. ARC07984.1）或來自出血性巴氏桿菌出血性亞種菌株Pm70的PmultST2（GenBank No. AAK02592.1）、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶，例如來自海鱺發光桿菌的PdST6（UniProt ID O66375）或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽或來自發光桿菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6（UniProt ID A8QYL1）或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的P-JT-ISH-224-ST6樣多肽及/或例如來自小鼠（UniProt ID Q64689）的α-2,8-唾液酸轉移酶。在產生乳糖類唾液酸化寡醣的實施例中，枯草芽孢桿菌突變菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對乳糖輸入蛋白（例如，UniProt ID P02920的大腸桿菌LacY）。

為了在蔗糖上生長，突變菌株可額外以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元包括來自大腸桿菌Ｗ的蔗糖轉運體（CscB）（UniProt ID E0IXR1）、來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）（UniProt ID Q03417）及來自青春雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶（BaSP）（UniProt ID A0ZZH6）。

異源及同源表現

需要表現的基因，無論是來自質體還是來自基因組，都是由以下公司之一以合成方法合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。

培養條件

從冷凍小瓶或LB盤的單一菌落開始96孔微量滴定盤實驗的預培養，在150μL LB中並於37℃在800rpm的軌道振盪器上培養過夜。將此培養物用作96孔方形微量滴定盤的接種物，用400μL MMsf培養基稀釋400倍。每個菌株在96孔盤的多個孔中以生物學重複進行生長。然後將這些最終的96孔培養盤於37℃在800rpm的軌道振盪器上培養72h或更短或更長時間。在培養實驗結束時，從每個孔中取出樣品以測量上清液濃度（細胞離心（spinning down）5分鐘後的細胞外糖濃度），或者藉由在離心細胞之前將培養肉湯在90°C下煮沸15分鐘或在60°C下煮沸60分鐘（＝如本文所定義的全肉湯濃度、細胞內及細胞外糖濃度）。

再者，稀釋培養物以測量600 nm的光密度。細胞性能指數或CPI是藉由將寡醣濃度除以生質而確定，與參考菌株相比的相對百分比。生質根據經驗確定為在600 nm處測量的光密度的約1/3。

實施例 35 ：以修飾的枯草芽孢桿菌菌株產生 2’FLNB

枯草芽孢桿菌菌株首先藉由nagB、glmS及gamA基因的基因剃除以及持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾以用於產生LNB及在蔗糖上生長，該持續型轉錄單元包括編碼天然的果糖-6-P-轉胺酶（UniProt ID P0CI73）、來自大腸桿菌的glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、來自枯草芽孢桿菌的磷酸酶AraL（UniProt ID P94526）、選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12或13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、來自大腸桿菌Ｗ的蔗糖轉運體（CscB）（UniProt ID E0IXR1）、來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）（UniProt ID Q03417）及來自青春雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶（BaSP）（UniProt ID A0ZZH6）的基因。在下一步驟中，LNB產生菌株以包括針對例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）的α-1,2-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元的表現質體進行轉形。

根據實施例34提供的培養條件，在缺乏前驅物的MMsf培養基的生長實驗中評估新穎菌株的2’FLNB產生。培養72小時後，收集培養肉湯，並在UPLC分析糖類。

實施例 36 ：以修飾的枯草芽孢桿菌菌株產生包括 6’-SL 、 LacNAc 、唾液酸化 LacNAc 、 LN3 、唾液酸化 LN3 、 LNnT 及 LSTc 的寡醣混合物

在第一步驟中，枯草芽孢桿菌菌株以nagA、nagB及gamA基因的基因剃除以及持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾以用於產生唾液酸，該持續型轉錄單元包括編碼天然的果糖-6-P-轉胺酶（UniProt ID P0CI73）、來自啤酒酵母菌的葡萄糖胺-6-P-轉胺酶（UniProt ID P43577）、來自卵形擬桿菌的N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶（UniProt ID A7LVG6）、及來自空腸曲桿菌的N-乙醯神經胺酸合成酶（UniProt ID Q93MP9）的基因。在下一步驟中，突變菌株進一步以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元包括編碼來自空腸曲桿菌的N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶NeuA（UniProt ID Q93MP7）及來自海鱺發光桿菌（ P. damselae）的α-2,6-唾液酸轉移酶PdbST（UniProt ID O66375）的基因，以產生6’-唾液酸乳糖。在下一步驟中，突變菌株進一步包括持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元針對來自腦膜炎雙球菌的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶lgtA（UniProt ID Q9JXQ6）及選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。根據實施例34提供的培養條件，在含有乳糖作為前驅物的MMsf培養基的生長實驗中評估新穎菌株的包括6’-SL、LacNAc、唾液酸化LacNAc、LN3、唾液酸化LN3、LNnT及LSTc（Neu5Ac-a2,6-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物的產生。培養72小時後，收集培養肉湯，並在UPLC分析糖類。

實施例 37 ：材料及方法麩胺酸棒狀桿菌

培養基

使用兩種不同的培養基，名為豐富胰蛋白腖-酵母菌萃取物（TY）培有基和用於搖瓶的基本培養基（MMsf）。基本培養基使用1000倍庫存微量元素混合物。

微量元素混合物由10 g/L CaCl2、10 g/L FeSO4.7H2O、10 g/L MnSO4.H2O、1 g/L ZnSO4.7H2O、0.2 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2.6H2O、0.2 g/L生物素（pH 7.0）及0.03 g/L原兒茶酸組成。

用於搖瓶實驗的基本培養基（MMsf）含有20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4.7H2O、42 g/L MOPS、10至30 g/L葡萄糖或其他碳源，包括但不限於果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和麥芽三糖（當在實施例中指定時）、及1 ml/L微量元素混合物。根據實驗，可以添加乳糖及/或唾液酸作為前驅物。

TY培養基由1.6%胰蛋白腖（Difco, Erembodegem, Belgium）、1%酵母菌萃取物（Difco）和0.5% 氯化鈉（VWR. Leuven, Belgium)組成。TY瓊脂（TYA）盤由添加12 g/L瓊脂（Difco, Erembodegem, Belgium）的TY培養基組成。

例如TY的複合培養基藉由高壓滅菌（121°C，21'）且基本培養基藉由過濾（0.22 µm Sartorius）進行滅菌。當必要時，藉由添加抗生素（例如，康黴素、胺苄青黴素）使培養基具有選擇性。

菌株及突變

麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032獲得自American Type Culture Collection。

構建基於由Suzuki等人（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005 Apr, 67(2):225-33）所述的Cre/loxP技術的整合質粒載體和由Okibe等人（Journal of Microbiological Methods 85, 2011, 155-163）所述的溫度敏感的穿梭載體以用於基因缺失、突變和插入。（異源）基因表現的合適啟動子可來自Yim等人（Biotechnol. Bioeng., 2013 Nov, 110(11):2959-69）。可使用Gibson組件、Golden Gate組件、Cliva組件、LCR或限制性連接進行選殖。

在產生LNB的實施例中，麩胺酸棒狀桿菌以持續型表現單元的基因組敲入進行修飾，該持續型表現單元包括來自大腸桿菌的glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、選自以下列舉的一磷酸酶，該列舉包括：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草芽孢桿菌的BsAraL，如WO18122225所述、以及選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12或13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶。

在產生LacNAc的實施例中，麩胺酸棒狀桿菌菌株以持續型表現單元的基因組敲入進行修飾，該持續型表現單元包括來自大腸桿菌的glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、選自以下列舉的一磷酸酶，該列舉包括：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大腸桿菌基因中任一或多個、或來自惡臭假單胞菌的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草芽孢桿菌的BsAraL，如WO18122225所述、以及選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。為了進一步使該LNB或LacNAc岩藻糖基化，LNB或LacNAc產生菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。

在產生乳糖類的寡醣的實施例中，創建突變麩胺酸棒狀桿菌菌株以含有編碼乳糖輸入蛋白的基因（例如，UniProt ID P02920的大腸桿菌LacY）。對於2'FL、3FL和diFL產生，例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶額外添加到菌株中。

在產生乳-N-三糖（LNT-II、LN3、GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）的實施例中，麩胺酸棒狀桿菌菌株以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元包含乳糖輸入蛋白（例如，UniProt ID P02920的大腸桿菌LacY）和半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶，例如來自腦膜炎雙球菌的LgtA（GenBank: AAM33849.1）。為了LNT產生，LN3產生菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12或13的列舉之N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其可經由基因敲入或自表現質體呈遞給菌株。為了LNnT產生，LN3產生菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41的列舉之N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。為了進一步使LN3、LNT或LNnT岩藻糖基化，突變菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。

在唾液酸產生的實施例中，突變麩胺酸棒狀桿菌菌株藉由過度表現天然的果糖-6-P-轉胺酶（UniProt ID Q8NND3）創建，以促進細胞內葡萄糖胺-6-磷酸鹽庫。此外，麩胺酸棒狀桿菌基因ldh、cgl2645、nagB、gamA及nagA的酶活性藉由基因剃除而破壞且來自啤酒酵母菌的葡萄糖胺-6-P-轉胺酶GNA1（UniProt ID P43577）、來自卵形擬桿菌的N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶（UniProt ID A7LVG6）和來自空腸曲桿菌的N-乙醯神經胺酸合成酶（UniProt ID Q93MP9）在基因組上過度表現。為了允許唾液酸化寡醣的產生，唾液酸產生菌株進一步以表現建構體進行修飾，該表現建構體包括N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶，例如來自空腸曲桿菌的NeuA酶（UniProt ID Q93MP7）、來自流行性感冒嗜血桿菌（ H. influenzae）的NeuA酶（GenBank No. AGV11798.1）或來自出血性巴氏桿菌的NeuA酶（GenBank No. AMK07891.1）、以及一或多個複製的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶，例如來自出血性巴氏桿菌的PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的PmultST3樣多肽及、來自腦膜炎雙球菌的NmeniST3（GenBank No. ARC07984.1）或來自出血性巴氏桿菌出血性亞種菌株Pm70的PmultST2（GenBank No. AAK02592.1）、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶，例如來自海鱺發光桿菌的PdST6（UniProt ID O66375）或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的PdST6樣多肽或來自發光桿菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6（UniProt ID A8QYL1）或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的P-JT-ISH-224-ST6樣多肽及/或例如來自小鼠（UniProt ID Q64689）的α-2,8-唾液酸轉移酶。在產生乳糖類唾液酸化寡醣的實施例中，麩胺酸棒狀桿菌突變菌株進一步以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對乳糖輸入蛋白（例如，UniProt ID P02920的大腸桿菌LacY）。

異源及同源表現

培養條件

從冷凍小瓶或TY盤的單一菌落開始96孔微量滴定盤實驗的預培養，在150μL TY中並於37℃在800rpm的軌道振盪器上培養過夜。將此培養物用作96孔方形微量滴定盤的接種物，用400μL MMsf培養基稀釋400倍。每個菌株在96孔盤的多個孔中以生物學重複進行生長。然後將這些最終的96孔培養盤於37℃在800rpm的軌道振盪器上培養72h或更短或更長時間。在培養實驗結束時，從每個孔中取出樣品以測量上清液濃度（細胞離心（spinning down）5分鐘後的細胞外糖濃度），或者藉由在離心細胞之前將培養肉湯在60°C下煮沸15分鐘（＝如本文所定義的全肉湯濃度、細胞內及細胞外糖濃度）。

再者，稀釋培養物以測量600 nm的光密度。細胞性能指數或CPI是藉由將整個肉湯中測量的寡糖濃度除以生質而確定，與參考菌株相比的相對百分比。生質根據經驗確定為在600 nm處測量的光密度的約1/3。

實施例 38 ：以修飾的麩胺酸棒狀桿菌菌株產生 2’FLNB

麩胺酸棒狀桿菌菌株首先藉由ldh、cgl2645及nagB基因的基因剃除以及持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾以用於產生LNB及在蔗糖上生長，該持續型轉錄單元包括編碼來自大腸桿菌的glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、來自枯草芽孢桿菌的磷酸酶AraL（UniProt ID P94526）、選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12及13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、來自大腸桿菌Ｗ的蔗糖轉運體（CscB）（UniProt ID E0IXR1）、來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）（UniProt ID Q03417）及來自青春雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶（BaSP）（UniProt ID A0ZZH6）的基因。在下一步驟中，LNB產生菌株以包括針對例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）的α-1,2-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元的表現質體進行轉形。根據實施例37提供的培養條件，在缺乏前驅物的MMsf培養基的生長實驗中評估新穎菌株的2’FLNB產生。培養72小時後，收集培養肉湯，並在UPLC分析糖類。

實施例 39 ：以修飾的麩胺酸棒狀桿菌菌株產生包括唾液酸化 LacNAc 的混合物

麩胺酸棒狀桿菌首先以ldh、cgl2645、nagB、nagA及gamA基因的基因剃除以及持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾以用於產生LacNAc及在蔗糖上生長，該持續型轉錄單元包括編碼天然的果糖-6-P-轉胺酶（UniProt ID Q8NND3）、來自大腸桿菌的突變glmS*54（與具有UniProt ID P17169的野生型大腸桿菌glmS不同之處在於具有A39T、R250C和G472S突變，如Deng等人所述（Biochimie 88, 419-29 (2006)））、來自啤酒酵母菌的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶GNA1（UniProt ID P43577）、來自枯草芽孢桿菌的磷酸酶AraL（UniProt ID P94526）、選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、來自大腸桿菌Ｗ的蔗糖轉運體（CscB）（UniProt ID E0IXR1）、來自運動醱酵單胞菌的果糖激酶（Frk）（UniProt ID Q03417）及來自青春雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶（BaSP）（UniProt ID A0ZZH6）的基因。在唾液酸合成的下一步驟中，突變菌株進一步以持續型轉錄單元的基因敲入進行修飾，該持續型轉錄單元包括編碼來自卵形擬桿菌的N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶（UniProt ID A7LVG6）以及來自空腸曲桿菌的N-乙醯神經胺酸合成酶（UniProt ID Q93MP9）之基因。在下一步驟中，新穎菌株以包括持續型轉錄單元的表現質體進行轉形，該持續型轉錄單元包括編碼來自空腸曲桿菌的NeuA酶（UniProt ID Q93MP7）之基因且與編碼來自出血性巴氏桿菌之β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶PmultST3（UniProt ID Q9CLP3）或來自海鱺發光桿菌的β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸轉移酶PdST6（UniProt ID O66375）之基因組合。

根據實施例37提供的培養條件，在缺乏前驅物的MMsf培養基的生長實驗中評估新穎菌株的LacNAc、唾液酸及唾液酸化LacNAc的產生。當將乳糖作為前驅物添加到MMsf培養基中時，依據α-唾液酸轉移酶的表現，亦評估突變菌株是否額外產生3'-SL或6'-SL。培養72小時後，收集培養肉湯，並在UPLC分析糖類。

實施例 40 ：材料及方法萊茵衣藻（ Chlamydomonas reinhardtii ）

培養基

萊茵衣藻細胞在Tris-乙酸-磷酸鹽（Tris-acetate-phosphate，TAP）培養基（pH 7.0）中培養。TAP培養基使用1000倍的Hutner微量元素混合物。Hutner微量元素混合物由50 g/L Na2EDTA.H2O（Titriplex III）、22 g/L ZnSO4.7H2O、11.4 g/L H3BO3、5 g/L MnCl2.4H2O、5 g/L FeSO4.7H2O、1.6 g/L CoCl2.6H2O、1.6 g/L CuSO4.5H2O及1.1 g/L (NH4)6MoO3所組成。

1.6 g/L CuSO4.5H2O含有2.42 g/L Tris（参（羥甲基）胺基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane））、25 mg/L鹽儲備溶液、0.108 g/L K2HPO4、0.054 g/L KH2PO4及1.0 mL/L冰醋酸。鹽儲備溶液由15 g/L NH4CL、4 g/L MgSO4.7H2O及2 g/L CaCl2.2H2O所組成。作為醣類合成的前驅物，可添加例如半乳糖、葡萄糖、果糖及/或岩藻糖的前驅物。培養基藉由高壓滅菌（121°C，21'）滅菌。對於在瓊脂斜面上的原種培養，使用含有1%瓊脂（純化的高強度，1000 g/cm2）的TAP培養基。

菌株、質體及突變

萊茵衣藻野生型菌株21gr（CC-1690，野生型，mt+）、6145C（CC-1691，野生型，mt−）、CC-125（137c，野生型，mt+）、CC-124（137c，野生型，mt−）獲得自Chlamydomonas Resource Center（https://www.chlamycollection.org），University of Minnesota，U.S.A。

源自pSI103的表現質體或得自Chlamydomonas Resource Center。可使用Gibson組件、Golden Gate組件、Cliva組件、LCR或限制性連接進行選殖。（異源）基因表現的合適啟動子可來自例如Scranton等人（Algal Res. 2016, 15: 135-142）。目標基因的修飾（例如，基因剔除或基因替代）可使用由Jiang等人（Eukaryotic Cell 2014, 13(11): 1465-1469）所述的Crispr-Cas技術執行。

可如Wang等人（Biosci. Rep. 2019, 39: BSR2018210）所述經由電穿孔執行轉形。細胞在在液體 TAP 培養基中在恆定通氣和連續光照下生長，光強度為8000 Lx，直到細胞密度達到1.0至2.0 × 10 ⁷cells/mL。接著，將細胞以1.0 × 10 ⁶cells/mL的濃度接種到新鮮的液體TAP培養基中，並在連續光照下生長18-20小時，直至細胞密度達到4.0 × 10 ⁶cells/mL。然後，藉由在室溫下以1250 g離心5分鐘收集細胞，以含有60 mM山梨醇（Sigma，U.S.A.）的預冷液體TAP培養基洗滌並再懸浮，並冰凍10分鐘。接著，將250 µL細胞懸浮液（對應於5.0 × 10 ⁷cells）與含有100 ng質體DNA（400 ng/mL）放入預冷的0.4 cm電穿孔比色管中。使用BTX ECM830電穿孔設備（1575Ω，50μFD）以6個500V脈衝進行電穿孔，每個脈衝具有4ms的脈衝長度和100ms的脈衝間隔時間。電穿孔後，立即將比色管置於冰上10分鐘。最後，將細胞懸浮液轉移到含有10 mL新鮮液體TAP培養基和60 mM山梨醇的50 mL錐形離心管中，在昏暗的光線下緩慢搖動過夜恢復。在過夜恢復後，重新收集細胞並用澱粉包埋（starch embedding）法將細胞接種到含有胺苄青黴素（100 mg/L）或氯黴素（100 mg/L）的選擇性1.5%（w/v）瓊脂-TAP盤上。然後將盤在23+-0.5°C下，以8000 Lx的光強度連續照明下進行培養。5-7天後分析細胞。

在用於產生UDP-半乳糖的實施例中，萊茵衣藻細胞以轉錄單元進行修飾，該轉錄單元包括編碼來自阿拉伯芥（ Arabidopsis thaliana）的半乳糖激酶（KIN, UniProt ID Q9SEE5）之基因、及編碼來自阿拉伯芥的UDP-糖焦磷酸化酶（USP）（UniProt ID Q9C5I1）之基因。

在產生LNB的實施例中，修飾以產生UDP-半乳糖的萊茵衣藻細胞以表現質體進行修飾，該表現質體包括選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12及13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的轉錄單元。另外，突變萊茵衣藻細胞可以表現質體進行修飾，該表現質體包括例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶之轉錄單元。

在產生LacNAc的實施例中，修飾以產生UDP-半乳糖的萊茵衣藻細胞進一步以表現質體進行修飾，該表現質體包括選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的轉錄單元。另外，突變萊茵衣藻細胞可以表現質體進行修飾，該表現質體包括例如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶之轉錄單元。

在CMP-唾液酸合成的實施例中，萊茵衣藻細胞以持續型轉錄單元進行修飾，該持續型轉錄單元針對例如來自智人的GNE（UniProt ID Q9Y223）之UDP-N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶或包括R263L突變的人類GNE多肽的突變形式、例如來自智人的NANS（UniProt ID Q9NR45）之N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶及例如來自智人的CMAS（UniProt ID Q8NFW8）之N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶。在產生唾液酸化寡醣的實施例中，萊茵衣藻細胞以例如來自小鼠的CST（UniProt ID Q61420）之CMP唾液酸轉運子、及選自例如智人、小鼠、褐鼠的物種之高基氏體定位的唾液酸轉移酶（Golgi-localised sialyltransferase）進行修飾。

異源及同源表現

培養條件

萊茵衣藻細胞在23 +/- 0.5°C下，以8000 Lx的光強度的14/10小時光照/黑暗循環下於選擇性TAP瓊脂盤中進行培養。培養5至7天後進行細胞分析。

對於高密度培養，細胞可以在封閉系統，例如如Chen等人（Bioresour. Technol. 2011, 102: 71-81）和Johnson等人（Biotechnol. Prog. 2018, 34: 811-827）所述的垂直或水平管光生物反應器、攪拌槽光生物反應器或平板光生物反應器(Bioresour. Technol. 2011, 102: 71-81)中進行培養。

實施例 41 ：於修飾的萊茵衣藻細胞中產生 LNB 及 2’FLNB

如實施例40中所述，以持續型轉錄單元的基因敲入改造萊茵衣藻細胞以產生UDP-Gal，該持續型轉錄單元包括來自阿拉伯芥的半乳糖激酶（KIN, UniProt ID Q9SEE5）及來自阿拉伯芥的UDP-糖焦磷酸化酶（USP）（UniProt ID Q9C5I1）。在下一步驟中，以包括轉錄單元的表現質體將突變細胞進行轉形，該轉錄單元包括選自包括SEQ ID NO：03、04、05、06、07、08、10、11、12及13之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及來自幽門螺旋桿菌的α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（GenBank No. AAD29863.1）。根據實施例40提供的培養條件，在包括半乳糖作為前驅物的TAP瓊脂盤的培養實驗中評估新穎菌株。培養5天後，收穫細胞，並在UPLC分析LNB及2’FLNB的產生。

實施例 42 ：於修飾的萊茵衣藻細胞中產生 LacNAc 及 3’- 岩藻糖基化 LacNAc

如實施例40中所述，以持續型轉錄單元的基因敲入改造萊茵衣藻細胞以產生UDP-Gal，該持續型轉錄單元包括來自阿拉伯芥的半乳糖激酶（KIN, UniProt ID Q9SEE5）及來自阿拉伯芥的UDP-糖焦磷酸化酶（USP）（UniProt ID Q9C5I1）。在下一步驟中，以包括轉錄單元的表現質體將突變細胞進行轉形，該轉錄單元包括選自包括SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶及例如來自幽門螺旋桿菌的HpFucT（UniProt ID O30511）之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。根據實施例40提供的培養條件，在包括半乳糖作為前驅物的TAP瓊脂盤的培養實驗中評估新穎菌株。培養5天後，收穫細胞，並在UPLC分析LacNAc及3’-岩藻糖基化LacNAc的產生。

實施例 43 ：材料及方法動物細胞

從不同哺乳動物的脂肪組織中分離間質幹細胞

新鮮脂肪組織獲得自屠宰場（例如，牛、豬、羊、雞、鴨、鯰魚、蛇、青蛙）或抽脂（例如，在人類的情況下，在知情同意後）並保存在補充有抗生素的磷酸鹽緩衝鹽水中。對脂肪組織進行酶消化，然後離心以分離間質幹細胞。將分離的間質幹細胞轉移到細胞培養瓶中並在標準生長條件下生長，例如37°C，5%CO2。初始培養基包括DMEM-F12、RPMI及Α-MEM培養基（補充有15%胎牛血清）和1%抗生素。在第一次繼代後，隨後將培養基替換為添加10% FBS（胎牛血清）的培養基。例如，出於所有目的藉由參照整體而併入本文的Ahmad和Shakoori（2013, Stem Cell Regen. Med. 9(2): 29-36）描述此實施例中在此描述的方法的部分變化。

從乳汁分離間質幹細胞

本實施例說明了從人類或如本文所述的任何其他哺乳動物在無菌條件下收集的乳汁中分離間質幹細胞。將等體積的磷酸鹽緩衝鹽水加入稀釋的乳汁中，然後離心20分鐘。物用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌細胞沉澱三次，並且在標準培養條件下，將細胞接種在細胞培養瓶的補充有10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM-F12、RPMI及Α-MEM培養基中。例如，出於所有目的藉由參照整體而併入本文的Hassiotou等人（2012, Stem Cells. 30(10): 2164-2174）描述此實施例中在此描述的方法的部分變化。

使用 2D 及 3D 培養系統分化幹細胞

分離的間質細胞可以在2D及3D培養系統中分化為乳腺樣上皮細胞和管狀細胞（luminal cells）。例如，參照Huynh et al. 1991. Exp Cell Res. 197(2): 191 -199；Gibson et al.1991, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 27(7): 585-594；Blatchford et al. 1999；Animal Cell Technology’: Basic & Applied Aspects, Springer, Dordrecht. 141-145；Williams et al. 2009, Breast Cancer Res 11(3): 26-43；以及Arevalo et al. 2015, Am J Physiol Cell Physiol. 310(5): C348 - C356；其皆出於所有目的藉由參照整體而併入本文。

針對2D培養，最初將分離的細胞接種在補充有10 ng/ml上皮生長因子及5 pg/ml胰島素的生長培養基中的培養盤中。在匯合時，以補充有2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素（100 U/ml青黴素、100 ug/ml鏈黴素）和5 pg/ml胰島素的生長培養基餵養細胞48小時。為了誘導分化，以含有5 pg/ml胰島素、1 pg/ml氫化可體松、0.65 ng/ml三碘甲狀腺素、100 nM地塞米松及1 pg/ml泌乳素的完全生長培養基餵養細胞。24小時後，從完全誘導培養基中去除血清。

針對3D培養，將分離的細胞以胰蛋白酶消化並在基質膠（Matrigel）、透明質酸或超低附著表面培養盤中培養6天，並藉由添加補充有10 ng/ml上皮生長因子和5 pg/ml胰島素的生長培養基誘導分化和乳酸。在匯合時，以補充有2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素（100 U/ml青黴素、100 ug/ml鏈黴素）及5 pg/ml胰島素的生長培養基餵養細胞48小時。為了誘導分化，以含有5 pg/ml胰島素、1 pg/ml氫化可體松、0.65 ng/ml三碘甲狀腺素、100 nM地塞米松和1 pg/ml泌乳素的完全生長培養基餵養細胞。24小時後，從完全誘導培養基中除去血清。

製備乳腺樣細胞的方法

藉由編碼Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的病毒載體的再編程，使哺乳動物細胞具有誘導多能性（pluripotency）。接著，將得到的再編程細胞在Mammocult培養基（可獲得自Stem Cell Technologies）或乳腺細胞富集培養基（DMEM，3% FBS、雌激素、黃體酮、肝素、氫化可體松、胰島素、EGF）中培養，使其類似乳腺，從中可誘導選擇乳成分的表現。或者，使用重塑系統（如CRISPR/Cas9）進行表觀遺傳重塑（epigenetic remodelling），以持續性活化選擇的感興趣基因，如酪蛋白、α-乳清蛋白，以使其允許各自的蛋白質表現，及/或下調及/或剔除選擇的內源基因，如例如WO21067641所述，其出於所有目的藉由參照整體而併入本文。

培養

完全生長培養基包括高糖DMEM/F12、10% FBS、1% NEAA、1% pen/strep、1% ITS-X、1% F-Glu、10 ng/ml EGF及5 pg/m氫化可體松。完全泌乳培養基包括高糖DMEM/F12、1% NEAA、1% pen/strep、1% ITS-X、1% F-Glu、10 ng/ml EGF、5 pg/ml氫化可體松及1 pg/ml泌乳素（在Hyunh 1991為5ug/ml）。將細胞以20,000 cells/cm2的密度接種到膠原塗佈的燒瓶上的完全生長培養基，並使其在完全生長培養基中黏附和擴增48小時，之後將培養基切換為完全泌乳培養基。接觸泌乳培養基後，細胞開始分化並停止生長。在約一週內，細胞開始將例如乳脂、乳糖、酪蛋白和乳清等泌乳產物分泌到培養基中。可以藉由超微過濾濃縮或稀釋以獲得所欲濃度的泌乳培養基。泌乳培養基的所欲鹽平衡可以藉由透析完成，例如，從培養基中移除不需要的代謝產物。使用的激素和其他生長因子可藉由樹脂純化選擇性地萃取，例如使用鎳樹脂以移除帶His-標籤的生長因子，以進一步降低乳酸產物中的污染物水平。

實施例 44 ：評估非乳腺成體幹細胞中 2'FL 、 LNFP-I 及 2'FLNB 的產生

如實施例43所述的分離的間質細胞及再編程為乳腺樣細胞經CRISPR-CAS修飾以過度表現選自包含03、04、05、06、07、08、10、11、12及13之列舉之密碼子優化的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、來自智人的GDP-岩藻糖合成酶GFUS（UniProt ID Q13630）、以及來自幽門螺旋桿菌之密碼子優化的α-1,2-岩藻糖基轉移酶（GenBank No. AAD29863.1）。細胞以20,000 cells/cm2的密度接種至膠原塗佈的燒瓶上的完全生長培養基，並使其在完全生長培養基中黏附和擴增48小時，之後將培養基切換為完全泌乳培養基約7天。在如實施例43所述的培養之後，細胞進行UPLC以分析2'FL、LNFP-I（乳-N-岩藻五糖I，Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及2'FLNB的產生。

實施例 45 ：評估非乳腺成體幹細胞中 LacNAc 、唾液酸化 LacNAc 及唾液酸 - 路易斯 x （ sialyl-Lewis x ）的產生

如實施例43所述的分離的間質細胞及再編程為乳腺樣細胞經CRISPR-CAS修飾以過度表現選自包含15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、28、31、32、33、34、35、36、39、40及41之列舉的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、來自智人的GDP-岩藻糖合成酶GFUS（UniProt ID Q13630）、來自智人的半乳糖苷α-1,3-岩藻糖基轉移酶FUT3（UniProt ID P21217）、來自小鼠的N-醯基神經胺酸胞苷醯轉移酶（UniProt ID Q99KK2）及來自智人的CMP-N-乙醯神經胺酸-β-1,4-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶ST3GAL3（UniProt ID Q11203）。導入細胞的所有基因都針對宿主進行密碼子優化。細胞以20,000 cells/cm2的密度接種至膠原塗佈的燒瓶上的完全生長培養基，並使其在完全生長培養基中黏附和擴增48小時，之後將培養基切換為完全泌乳培養基約7天。在如實施例43所述的培養之後，細胞進行UPLC以分析LacNAc、唾液酸化LacNAc及唾液酸-路易斯x的產生。

無。

無。

Claims

一種藉由細胞，較佳為單一細胞，產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣或雙醣之方法，該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）且（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該雙醣或寡醣， b. 在允許產生該雙醣或寡醣的條件下培養該細胞， c. 較佳地，自培養物分離該雙醣或寡醣。
一種藉由細胞產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣之方法，該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）且（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該寡醣， b. 在允許產生該寡醣的條件下培養該細胞， c. 較佳地，自該培養物分離該寡醣。
一種藉由細胞產生混合物之方法，該混合物包括（i）還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣及/或寡醣、及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣（MMOs），該方法包括以下步驟： a. 提供細胞，該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）且（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣及/或寡醣， b. 在允許產生該混合物的條件下培養該細胞， c. 較佳地，自培養物分離該混合物。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞表現至少一N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶，以合成該單醣N-乙醯葡萄糖胺。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞表現至少一種醣基轉移酶，以醣化N-乙醯葡萄糖胺。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經基因改造以產生該雙醣或寡醣。
如請求項6所述之方法，其中該細胞以一或多種基因表現模組進行修飾，其特徵在於任何該表現模組的表現形式是組成型或由天然誘導物所產生。
如請求項6或7中任一項所述之方法，其中該細胞包括編碼一蛋白質的相同編碼DNA序列的多個複製。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞在選自包括下列之群組之酵素的表現或活性方面被修飾：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該核苷酸-糖選自包含下列之群組：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且該醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該寡醣在該還原端具有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17，或 ii. 包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域IPR002659，且 i. 包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或 ii. 包括根據SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或 iii. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 iv. 包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。
如請求項1至12中任一項所述之方法，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF01755，且 i. 包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76，或 ii. 包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的多肽序列，或 iii. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 iv. 包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域PF00535，且 i. 包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，或 ii. 包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：26、27或28中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 c. PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且 viii. 包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，或 ix. 包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24，或 x. 包括根據SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或 xi. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiii. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiv. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 d. PFAM域PF03808，且 i. 包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25，或 ii. 包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或 iii. 包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或 iv. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 v. 包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vi. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 vii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：39、40或41中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中 a. 該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列、或為UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性，以及 b. 該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶為包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列、或為具有UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性；或為與UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突變的修飾版本。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞能夠代謝碳源，該碳源選自包含下列列舉之群組：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液、高果糖漿、糖蜜、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生，且該修飾選擇自包含下列列舉之群組：UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因的過度表現、或甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經修飾以產生UDP-半乳糖。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生，且該修飾選擇自包含下列列舉之群組：5’-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因的剃除或半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶編碼基因的剃除。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經修飾以產生CMP-N-乙醯基神經胺酸。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生，且該修飾選擇自包含下列列舉之群組：CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞能夠表現至少一種其他醣基轉移酶，且該其他醣基轉移酶選自包括下列之群組：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP- N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶和岩藻糖胺基轉移酶， - 較佳地，該岩藻糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， - 較佳地，該唾液酸轉移酶選自包括下列列舉：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶， - 較佳地，該半乳糖基轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， - 較佳地，該葡萄糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， - 較佳地，該甘露糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基葡糖胺轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡糖胺轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺轉移酶為α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺轉移酶。
如請求項24所述之方法，其中該細胞在該其他醣基轉移酶的表現或活性方面被修飾。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞使用用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的一或多種前驅物，該前驅物從培養基供給該細胞。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞產生一或多種前驅物，該前驅物用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如請求項26或27中任一項所述之方法，其中用於產生該雙醣或寡醣之該前驅物完全轉化為該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞在細胞內產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，且其中部分或實質上全部的所產生的該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣保留在細胞內及/或經由被動或主動運輸排出該細胞外。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞表現膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽，以轉運化合物穿過細胞壁的外膜，較佳地，該細胞在該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽的表現或活性方面被修飾。
如請求項30所述之方法，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽選自包括下列列舉：運輸蛋白、P-P-鍵-水解-驅動的轉運體、β-桶狀孔蛋白、輔助轉運蛋白、推定轉運蛋白及磷酸轉移-驅動組轉位蛋白，較佳地，該運輸蛋白包括MFS轉運體、糖排出轉運體及螯鐵蛋白輸出體，較佳地，該P-P-鍵-水解-驅動的轉運體包括ABC轉運體及螯鐵蛋白輸出體。
如請求項30或31中任一項所述之方法，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及/或一或多種前驅物及/或接受者在細胞壁外膜上的流動，該一或多種前驅物及/或接受者用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如請求項30至32中任一項所述之方法，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的改善產生及/或允許排出及/或促進排出。
如請求項6至33中任一項所述之方法，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，用於降低乙酸鹽產生的修飾。
如請求項34所述之方法，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，任一或多種蛋白質的較低或減少的表現及/或消除、受損、降低或延遲的活性，該蛋白質包含：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-岩藻酮糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯神經胺酸解離酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸鹽2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸鹽腺苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸鹽異構酶、有氧呼吸調控蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶酶IIBC成分ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶（PTS）酶IIBC成分malX、enzyme IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸鹽解離酶、乙酸鹽激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶、丙酮酸去羧酶。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中細胞能夠產生磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。
如請求項6至36中任一項所述之方法，其中該細胞與未修飾的先驅細胞相比，具有用於磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的促進產生及/或供應的修飾。
如請求項6至37中任一項所述之方法，其中該細胞包含至少部分失活的所選單醣、雙醣或寡醣的分解代謝途徑，該單醣、雙醣或寡醣參與該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的產生及/或為產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣所需。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中當該細胞在乳糖與一或多種其他碳源結合的環境中生長時，該細胞抵抗乳糖殺傷現象。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞在整個培養液及/或上清液產生90 g/L或多於90 g/L的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣、及/或其中在整個培養液及/或上清液中的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣具有至少80%的純度，其在整個培養液及/或上清液中分別以該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及其前驅物的總量計。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞在培養基中穩定地培養。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該條件包括： - 使用包括至少一種前驅物及/或接受者的培養基，以用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，及/或 - 添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基，以用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如上述請求項中任一項所述之方法，該方法包括下列步驟中的至少一者： vi) 使用包括至少一種前驅物及/或接受者的培養基； vii) 向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，並且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； viii) 向反應器中的培養基添加至少一種前驅物及/或接受者原料，其中總反應器體積範圍為250 mL（毫升）至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，並且較佳使得培養基的最終體積不超過在添加該前驅物及/或接受者原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且較佳地，該前驅物及/或接受者原料的pH設定在3與7之間，且較佳地，該前驅物及/或接受者原料的溫度維持在20°C與80°C之間； ix) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基； x) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加至少一種前驅物及/或接受者原料至培養基，且較佳地，該進料溶液的pH設定在3與7之間，且較佳地，該前驅物及/或接受者原料的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。
如請求項1至42中任一項所述之方法，該方法包括下列步驟中的至少一者： vi) 使用每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米）； vii) 以每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的乳糖原料添加至培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，且較佳地，使得該培養基的最終體積不超過在添加該乳糖原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； viii) 以每公升初始反應器體積包含至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，更佳為至少150克乳糖的乳糖原料添加至培養基，其中反應器體積範圍為250 mL至10,000 m ³（立方米），較佳以連續方式，且較佳地，使得該培養基的最終體積不超過在添加該乳糖原料之前的培養基體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且較佳地，該乳糖原料的pH設定在3與7之間，且較佳地，該乳糖原料的溫度維持在20°C與80°C之間； ix) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加乳糖原料至培養基； x) 藉由進料溶液的手段在1天、2天、3天、4天、5天的過程中以連續方式添加乳糖原料至培養基，其中該乳糖進料溶液的濃度為50 g/L，較佳為75 g/L，更佳為100 g/L，更佳為125 g/L，更佳為150 g/L，更佳為175 g/L，更佳為200 g/L，更佳為225 g/L，更佳為250 g/L，更佳為275 g/L，更佳為300 g/L，更佳為325 g/L，更佳為350 g/L，更佳為375 g/L，更佳為400 g/L，更佳為450 g/L，更佳為500 g/L，又更佳為550 g/L，最佳為600 g/L；以及其中較佳地，該進料溶液的pH設定在3與7之間，且較佳地，該前驅物及/或接受者原料的溫度維持在20°C與80°C之間；該方法產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，其在最終培養物中的濃度為至少50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，更佳為至少200g/L。
如請求項44所述之方法，其中該乳糖原料是藉由從培養開始以至少5 mM，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的濃度添加乳糖，更佳為以＞300 mM的濃度添加乳糖而完成。
如請求項44或45中任一項所述之方法，其中該乳糖原料是藉由將乳糖以一定濃度添加至培養物中而完成，使得在培養物的整個生產階段獲得至少5mM，較佳為10mM或30mM的乳糖濃度。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該培養基包含選自包括乳糖、半乳糖、岩藻糖及唾液酸的群組的至少一種前驅物。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中藉由向包含前驅物的培養基添加碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，而提供指數細胞生長的第一階段，接著在第二階段，僅將碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加到培養基中。
如請求項1至49中任一項所述之方法，其中藉由向包含前驅物的培養基中加入碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，而提供指數細胞生長的第一階段，接著在第二階段，其中碳類基質，較佳為葡萄糖或蔗糖，及前驅物添加到培養基中。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少一種還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的雙醣及/或寡醣及/或中性的雙醣及/或寡醣。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少還原端具有GlcNAc單元的寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的寡醣及/或中性的寡醣。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該寡醣選自包括下列之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。
如請求項1或3至53中任一項所述之方法，其中該還原端具有GlcNAc單元的雙醣不包括幾丁二糖（GlcNAc-GlcNAc）。
如上述請求項中任一項所述之方法，其中該還原端具有GlcNAc單元的寡醣在還原端不包括幾丁二糖，較佳為不包括N-聚醣。
一種用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣或雙醣之代謝工程細胞，其中該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該雙醣或寡醣。
一種用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣之代謝工程細胞，其中該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該寡醣。
一種用於產生混合物之代謝工程細胞，該混合物包括：（i）還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣及/或寡醣、以及（ii）一或多種基於乳糖的哺乳動物乳寡醣（MMOs），其中該細胞能夠：（i）合成核苷酸-糖及單醣N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、以及（ii）表現醣基轉移酶以醣化該GlcNAc單醣，而產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣。
如請求項56或58中任一項所述之細胞，其中該細胞經代謝工程以產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺的雙醣或寡醣。
如請求項57所述之細胞，其中該細胞經代謝工程以產生該還原端具有N-乙醯葡萄糖胺的寡醣。
如請求項56至60中任一項所述之細胞，其中該細胞以一或多種基因表現模組進行修飾，其特徵在於任何該表現模組的表現形式是組成型或由天然誘導物所產生。
如請求項56至61中任一項所述之細胞，其中該細胞包括編碼一蛋白質的相同編碼DNA序列的多個複製。
如請求項56至62中任一項所述之細胞，其中該細胞表現至少一種N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶及磷酸酶，以合成N-乙醯葡萄糖胺。
如請求項56至63中任一項所述之細胞，其中該細胞表現至少一種醣基轉移酶，以醣化N-乙醯葡萄糖胺。
如請求項56至64中任一項所述之細胞，其中該細胞在選自包括下列之群組之酵素的表現或活性方面被修飾：N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。
如請求項56至65中任一項所述之細胞，其中該核苷酸-糖選自包含下列之群組：UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L阿拉伯-4-己酮醣、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧--L-來蘇-4-己酮醣、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-肺炎糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-奎諾糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、CMP-N-乙醯基神經胺酸（CMP-Neu5Ac）、CMP-N-乙醇醯神經胺酸（CMP-Neu5Gc）、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽、UDP-半乳糖醛酸鹽、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。
如請求項56至66中任一項所述之細胞，其中該核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且該醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶。
如請求項56至67中任一項所述之細胞，其中寡醣在該還原端具有乳-N-雙糖（Gal-b1,3-GlcNAc）或N-乙醯乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）。
如請求項56至68中任一項所述之細胞，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： c. PFAM域PF00535，且 viii. 包括SEQ ID NO 01的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X是任何胺基酸，其中n為12至17，或 ix. 包括SEQ ID NO 02的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是12至17且m是100至115，或 x. 包括根據SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的多肽序列，或 xi. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括來自SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 xiii. 為SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 xiv. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：03、04、05、06、07或08中的任一，較佳為SEQ ID NO 03、04、05、06或07中的任一，更佳為SEQ ID NO 03、06或07中的任一，最佳為SEQ ID NO 03或06中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或者 d. PFAM域IPR002659，且 vii. 包括SEQ ID NO 09的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，無A、G、S)(X _p)X(無F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X是任何胺基酸，其中n是13至16，m是35至70，且p是20至45，或 viii. 包括SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的多肽序列，或 ix. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：10、11、12或13的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 x. 包括來自SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 xi. 為SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：10、11、12或13中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,3-半乳糖基轉移酶活性。
如請求項56至69中任一項所述之細胞，其中該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶為醣基轉移酶，其具有： a. PFAM域PF01755，且 vii. 包括SEQ ID NO 14的序列EXXCXXSHXX[ILV][FWY](X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXYX[ILMV]，其中X是任何胺基酸，其中n為13至15且m是50至76，或 viii. 包括根據SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的多肽序列，或 ix. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽全長的至少80%整體序列同一性且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 x. 包括來自SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xi. 為SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22或23中的任一，較佳為SEQ ID NO：15、16、17、18、20或21中的任一，更佳為SEQ ID NO：17、18、20或21中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 b. PFAM域PF00535，且 viii. 包括SEQ ID NO 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL]XDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，或 ix. 包括SEQ ID NO 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXXFXDXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X是任何胺基酸，其中n是50至75，m是10至30，且p是20至25，或 x. 包括根據SEQ ID NO：26、27或28中的任一的多肽序列，或 xi. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：26、27或28的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括來自SEQ ID NO：26、27或28中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiii. 為SEQ ID NO：26、27或28中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性， xiv. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：26、27或28中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 c. PFAM域PF02709且不具有PFAM域PF00535，且 viii. 包括SEQ ID NO 29的序列[FWY]XX[FY][FWY](X ₂₃)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，或 ix. 包括SEQ ID NO 30的序列[PV]W[GHNP](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X是任何胺基酸，其中n是21至24，或 x. 包括SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的多肽序列，或 xi. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括來自SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiii. 為SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiv. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或者 d. PFAM域PF03808，且 viii. 包括SEQ ID NO 37的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X是任何胺基酸，且其中n是20至25，或 ix. 包括SEQ ID NO 38的序列[ST][FHY]XN(X _n)DG(X ₁₆)[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X是任何胺基酸，其中n是20至25，m是40至50，且p是22至30，或 x. 包括根據SEQ ID NO：39、40或41中的任一的多肽序列，或 xi. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與SEQ ID NO：39、40或41的該N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶多肽中的任一全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xii. 包括來自SEQ ID NO：39、40或41中的任一的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiii. 為SEQ ID NO：39、40或41中的任一的功能片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性，或 xiv. 包括多肽，該多肽包括或由具有與SEQ ID NO：39、40或41中的任一的全長胺基酸序列的至少80%序列同一性的胺基酸序列所組成，且具有N-乙醯葡萄糖胺b-1,4-半乳糖基轉移酶活性。
如請求項56至70中任一項所述之細胞，其中 c. 該N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶為包括UniProt ID P43577的多肽的多肽序列、或為UniProt ID P43577的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P43577的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉移酶活性，以及 d. 該L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶為包括UniProt ID P17169的多肽的多肽序列、或為UniProt ID P17169的多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其具有與UniProt ID P17169的多肽全長的至少80%整體序列同一性，且具有L-麩醯胺—D-果糖-6-磷酸轉胺酶活性；或為與UniProt ID P17169多肽不同的A39T、R250C和G472S突變的修飾版本。
如請求項56至71中任一項所述之細胞，其中該細胞可代謝碳源，該碳源選自包含下列列舉之群組：葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、甘露糖、甲醇、乙醇、阿拉伯糖、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液、高果糖漿、糖蜜、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸、丙酮酸。
如請求項56至72中任一項所述之細胞，其中該細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成葡萄糖胺-6-磷酸鹽，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉換成果糖-6-磷酸鹽。
如請求項56至73中任一項所述之細胞，其中該細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。
如請求項56至74中任一項所述之細胞，其中該細胞經修飾以促進GDP-岩藻糖產生，且該修飾選擇自包含下列列舉之群組：UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因的剃除、GDP-L-岩藻糖合成酶編碼基因的過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因的過度表現、甘露糖-1-磷酸鹽鳥苷酸轉移酶編碼基因的過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因的過度表現、或甘露糖-6-磷酸鹽異構酶編碼基因的過度表現。
如請求項56至75中任一項所述之細胞，其中該細胞經修飾以產生UDP-半乳糖。
如請求項56至76中任一項所述之細胞，其中該細胞經修飾以促進UDP-半乳糖產生，且該修飾選擇自包含下列列舉之群組：5’-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因的剃除或半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶編碼基因的剃除。
如請求項56至75中任一項所述之細胞，其中該細胞經修飾以產生CMP-N-乙醯基神經胺酸。
如請求項56至78中任一項所述之細胞，其中該細胞經修飾以促進CMP-N-乙醯基神經胺酸產生，且該修飾選擇自包含下列列舉之群組：CMP-唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、唾液酸合成酶編碼基因的過度表現、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶編碼基因的過度表現。
如請求項56至79中任一項所述之細胞，其中該細胞能夠表現至少一其他醣基轉移酶，且該其他醣基轉移酶選自包括下列之群組：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露醣基轉移酶、N-乙醯基葡糖胺轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺轉移酶、木醣基轉移酶、葡萄糖醛酸苷轉移酶、半乳醣醛酸轉移酶、葡萄糖胺轉移酶、N-乙醇醯神經胺轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶和岩藻糖胺基轉移酶， - 較佳地，該岩藻糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， - 較佳地，該唾液酸轉移酶選自包括下列列舉：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶， - 較佳地，該半乳糖基轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， - 較佳地，該葡萄糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， - 較佳地，該甘露糖基轉移酶選自包括下列列舉：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基葡糖胺轉移酶選自包括下列列舉：β-1,3-N-乙醯基葡糖胺轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡糖胺轉移酶， - 較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺轉移酶為α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺轉移酶。
如請求項80所述之細胞，其中該細胞在該其他醣基轉移酶的表現或活性方面被修飾。
如請求項56至81中任一項所述之細胞，其中該細胞使用用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的一或多種前驅物，該前驅物從培養基供給該細胞。
如請求項56至82中任一項所述之細胞，其中該細胞產生一或多種前驅物，其用於產生該在還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如請求項82或83中任一項所述之細胞，其中用於產生該雙醣或寡醣之前驅物完全轉化為還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如請求項56至84中任一項所述之細胞，其中該細胞在細胞內產生還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣，且其中部分或實質上全部的所產生的還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣保留在細胞內及/或經由被動或主動運輸排出細胞外。
如請求項56至85中任一項所述之細胞，其中該細胞表現膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽，以轉運化合物穿過細胞壁的外膜，較佳地，該細胞在該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽的表現或活性方面被修飾。
如請求項86所述之細胞，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽選自包括下列列舉：運輸蛋白、P-P-鍵-水解-驅動的轉運體、β-桶狀孔蛋白、輔助轉運蛋白、推定轉運蛋白及磷酸轉移-驅動組轉位蛋白，較佳地，該運輸蛋白包括MFS轉運體、糖排出轉運體及螯鐵蛋白輸出體，較佳地，該P-P-鍵-水解-驅動的轉運體包括ABC轉運體及螯鐵蛋白輸出體。
如請求項86或87中任一項所述之細胞，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽控制該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及/或一或多種前驅物及/或接受者在細胞壁外膜上的流動，該一或多種前驅物及/或接受者用於產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣。
如請求項86至88中任一項所述之細胞，其中該膜轉運蛋白或具有轉運活性的多肽提供該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的改善產生及/或允許排出及/或促進排出。
如請求項56至89中任一項所述之細胞，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，用於降低乙酸鹽產生的修飾。
如請求項90所述之細胞，其中該細胞包括與未修飾的先驅細胞相比，任一或多種蛋白質的較低或減少的表現及/或消除、受損、降低或延遲的活性，該蛋白質包含：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸鹽去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸鹽脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一異戊二烯-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-岩藻酮糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯神經胺酸解離酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸鹽2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸鹽腺苷醯轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP-依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸鹽異構酶、有氧呼吸調控蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶酶IIBC成分ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶（PTS）酶IIBC成分malX、enzyme IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷醯轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸鹽解離酶、乙酸鹽激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶、丙酮酸去羧酶。
如請求項56至91中任一項所述之細胞，其中該細胞能夠產生磷酸烯醇丙酮酸（PEP）。
如請求項56至92中任一項所述之細胞，其中該細胞與未修飾的先驅細胞相比，具有用於磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的促進產生及/或供應的修飾。
如請求項56至93中任一項所述之細胞，其中該細胞包含至少部分失活的所選單醣、雙醣或寡醣的分解代謝途徑，該單醣、雙醣或寡醣參與該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣的產生及/或為產生該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣所需。
如請求項56至94中任一項所述之細胞，其中當該細胞在乳糖與一或多種其他碳源結合的環境中生長時，該細胞抵抗乳糖殺傷現象。
如請求項56至95中任一項所述之細胞，其中該細胞在整個培養液及/或上清液產生90 g/L或多於90 g/L的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣、及/或其中在整個培養液及/或上清液中的該還原端具有GlcNAc的雙醣或寡醣具有至少80%的純度，其在整個培養液及/或上清液中分別以該還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣及其前驅物的總量計。
如請求項56至96中任一項所述之細胞，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少一種還原端具有GlcNAc單元的雙醣或寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的雙醣及/或寡醣及/或中性的雙醣及/或寡醣。
如請求項56至97中任一項所述之細胞，其中該細胞產生混合物，該混合物為包含至少還原端具有GlcNAc單元的寡醣之帶電的，較佳為唾液酸化的寡醣及/或中性的寡醣。
如請求項56至98中任一項所述之細胞，其中該寡醣選自包括下列之列舉：2-岩藻糖基乳-N-雙糖、4-岩藻糖基乳-N-雙糖、2-4-二岩藻糖基乳-N-雙糖、3’-唾液酸乳-N-雙糖、6’-唾液酸乳-N-雙糖、3’,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、6,6’-二唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-3’-唾液酸乳-N-雙糖、4-岩藻糖基-6’-唾液酸乳-N-雙糖、2-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、2,3’-二岩藻糖基N-乙醯乳糖胺、3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、6,6’-二唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、2’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3-岩藻糖基-3’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、3’-岩藻糖基-6’-唾液酸N-乙醯乳糖胺、P1三醣（Gal-a1,4-Gal-b1,4-GlcNAc）、異源移植抗原決定位（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc）、Gal-b14-(Galb13)-GlcNAc、聚-N-乙醯乳糖胺、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc。
如請求項56或58至99中任一項所述之細胞，其中該還原端具有GlcNAc單元的雙醣不包括幾丁二糖（GlcNAc-GlcNAc）。
如請求項56至100中任一項所述之細胞，其中該還原端具有GlcNAc單元的寡醣在還原端不包括幾丁二糖，較佳為不包括N-聚醣。
如請求項56至101中任一項所述之細胞或如請求項1至55中任一項所述之方法，其中該細胞為細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞或原生動物細胞， - 較佳地，該細菌為大腸桿菌菌株，更佳為大腸桿菌菌株K12菌株，又更佳地，該大腸桿菌菌株K12菌株為大腸桿菌MG1655， - 較佳地，該真菌屬於選自包括黑黴菌屬、網柱黏菌屬、青黴菌屬、白黴菌屬或麴菌屬之群組的屬， - 較佳地，該酵母菌屬於選自包括酵母屬、接合酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、克馬格特勒酵母、漢遜氏酵母菌屬、子囊菌酵母屬、擬球酵母菌屬、克魯維酵母菌屬或德巴利酵母菌屬之群組的屬， - 較佳地，該植物細胞為藻細胞或衍生自煙草、苜蓿、稻米、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米或穀類植物， - 較佳地，該動物細胞衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬蟲類、兩棲類或昆蟲類、或為衍生自排除胚胎幹細胞的人類細胞的基因改造細胞株，更佳地，該人類及非人類哺乳動物細胞為上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、鼠骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，更佳地，該昆蟲細胞衍生自秋行軍蟲、蠶、甘藍夜蛾、粉紋夜蛾或黑腹果蠅， - 較佳地，該原生動物細胞為狼蛛利什曼原蟲細胞。
如請求項102所述之細胞或如請求項102所述之方法，其中該細胞為活的革蘭氏陰性菌，其包含與未修飾的先驅細胞相比，降低或消除聚-N-乙醯-葡萄糖胺（PNAG）、腸細菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核心寡醣、滲壓調節間質葡聚糖（OPG）、葡萄糖基甘油、聚醣及/或海藻糖的合成。
如請求項1至55、102或103中任一項所述之方法，其中該分離包括下列列舉的至少一種：澄清、超微過濾、奈米過濾、兩相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高性能過濾、切向流超微過濾、親和層析、離子交換層析、疏水交互作用層析及/或凝膠過濾、配體交換層析。
如請求項1至55、102至104中任一項所述之方法，其更包括自該細胞純化該雙醣或寡醣。
如請求項1至55、102至105中任一項所述之方法，其中該純化包括下列步驟的至少一種：活性炭或碳的使用、炭的使用、奈米過濾、超微過濾、電泳、酶處理或離子交換、醇類的使用、含水的醇類混合物的使用、結晶、蒸發、沉澱、乾燥、噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、帶式乾燥、傳送帶乾燥、真空帶式乾燥、真空傳送帶乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。
一種如請求項56至103中任一項所述之細胞、或如請求項1至55、102至106中任一項所述之方法用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的雙醣或寡醣之用途。
一種如請求項56、58至103中任一項所述之細胞、或如請求項1、3至55、102至106中任一項所述之方法用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的寡醣，較佳為用於產生還原端具有N-乙醯葡萄糖胺單元的帶電或中性寡醣，更佳為用於產生唾液酸化或岩藻糖基化形式的LNB或LacNAc之用途。