ES2819553T3

ES2819553T3 - Métodos y composiciones para terapia celular adoptiva

Info

Publication number: ES2819553T3
Application number: ES15816318T
Authority: ES
Inventors: Mark J Gilbert
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: US20220280642A1; JP2024120077A; US20240066122A1; EP3766895A1; ES2987087T3; US11266739B2; JP2017537919A; KR102804498B1; JP2022101625A; EP3766895B1; KR20250067192A; CN107206025A; EP3227323A1; MX2022005955A; AU2024202225A1; JP7068820B2; MX2017007138A; KR20170087514A; AU2020281158B2; AU2015358400A1

Abstract

Una composición que comprende células T humanas que expresan un segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección que es una enfermedad maligna de células B en un sujeto humano, el método comprendiendo administrar la composición a un sujeto humano que ha sido tratado anteriormente con células que expresan un primer receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde: el primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección en el sujeto, en donde el antígeno se selecciona de entre CD19, CD20 y CD22; la enfermedad o afección ha recaído o persiste en el sujeto después de la administración de las células que expresan el primer CAR; y el segundo CAR, que es distinto del primer CAR, se une específicamente a otro antígeno asociado con la enfermedad o afección que se selecciona de entre CD19, CD22 y CD20 que es distinto del antígeno al que se ha unido el primer CAR.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para terapia celular adoptiva

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/087.224 presentada el 3 de diciembre de 2014, titulada "Methods and Compositions for Adoptive Cell Therapy".

Listado de secuencias

La presente solicitud está siendo presentada con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de secuencias se divulga como un archivo titulado 735042001240SeqList.txt, creado el 3 de diciembre de 2015, que tiene un tamaño de 65.266 bytes.

Campo

La presente divulgación se refiere a la terapia celular adoptiva que implica la administración de múltiples dosis de células que expresan receptores modificados genéticamente (recombinantes), por ejemplo, mediante múltiples pasos de administración y/o mediante la administración a sujetos que han recibido una administración anterior. En general, las células administradas en relación con ciertos pasos de administración diferentes expresan receptores distintos. Los receptores recombinantes pueden incluir receptores quiméricos, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR) y/u otros receptores transgénicos, como receptores de células T transgénicas (TCR). Las características de los métodos proporcionan varias ventajas como una eficacia mejorada, por ejemplo, debido a una exposición aumentada del sujeto tratado a las células administradas que expresan receptores que se dirigen a los antígenos asociados con enfermedades. Una administración posterior de células que expresan un receptor distinto del expresado por las células en una primera administración o anterior puede mejorar la eficacia. Por ejemplo, puede minimizar el riesgo de exposición reducida a las células, que puede resultar de una respuesta inmune anti-receptor específica en el sujeto, y/o permitir un direccionamiento efectivo en casos de pérdida de antígeno y/o regulación por disminución o modificación del antígeno o epítopo dirigido por el primer receptor o anterior.

Antecedentes

Están disponibles varios métodos para la terapia celular adoptiva usando células modificadas genéticamente que expresan receptores recombinantes, como el receptor de antígeno quimérico (CAR). Se necesitan métodos mejorados, por ejemplo, para mejorar la eficacia de tales terapias, por ejemplo, aumentando la exposición del sujeto a las células administradas. Tales métodos son necesarios, por ejemplo, que mejoren la expansión y/o persistencia de las células administradas, proporcionen la capacidad de tratar sujetos refractarios o en recaída y/o que reduzcan el riesgo de toxicidad u otros resultados no deseados. Se divulgan métodos, composiciones y artículos de fabricación que satisfacen tales necesidades.

Fry et al. "T cell adoptive immunotherapy for acute lymphoblastic leukemia", Haematology, 2013:348-353, describe métodos para tratar leucemia linfoblástica aguda de células B con inmunoterapia adoptiva usando células T modificadas genéticamente para expresar CAR que se dirigen a CD19 o CD22.

Pegram et al. "CD28z CARs and armored CARs", Cancer Journal, 20:127-133, describe datos clínicos y enfoques de células T de CAR blindadas para mejorar la eficacia de la terapia antitumoral.

Sumario

La presente invención proporciona una composición que comprende células T humanas que expresan un segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección que es una enfermedad maligna de células B en un sujeto humano, el método comprendiendo administrar la composición a un sujeto humano que ha sido tratado anteriormente con células que expresan un primer receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde:

el primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección en el sujeto, en donde el antígeno se selecciona de entre CD19, CD20 y CD22;

la enfermedad o afección ha recaído o persiste en el sujeto después de la administración de las células que expresan el primer CAR; y

el segundo CAR, que es distinto del primer CAR, se une específicamente a otro antígeno asociado con la enfermedad o afección que se selecciona de entre CD19, CD22 y CD20 que es distinto del antígeno al que se ha unido el primer CAR.

Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos siguientes.

Se divulgan métodos para administrar células a sujetos, como para la terapia celular adoptiva, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades, afecciones o trastornos, así como células, composiciones y artículos de fabricación para su uso en tales métodos. Las células generalmente expresan uno o más receptores recombinantes, como el receptor de antígeno quimérico (CAR), otros receptores de antígenos y/u otros receptores quiméricos. En algunos casos, los métodos aumentan la exposición del sujeto a las células administradas, por ejemplo mejorando la expansión y/o persistencia de las células administradas, proporcionan la capacidad de tratar sujetos refractarios o en recaída y/o sujetos que muestran pérdida, regulación por disminución o modificación de un antígeno dirigido o epítopo del mismo. En algunos casos, los métodos reducen el riesgo de toxicidad u otros resultados no deseados en comparación con otros métodos de terapia celular.

En algunos casos, se divulgan métodos de tratamiento, llevados a cabo administrando células a un sujeto, donde las células expresan un segundo (o posterior) receptor, como un segundo (o posterior) receptor de antígeno quimérico (CAR) o TCR transgénico, donde el sujeto ha recibido previamente una administración o dosis de células que expresan un primer (o anterior) receptor, como un primer (o anterior) CAR o TCR. El segundo receptor o posterior es generalmente distinto del primer o anterior receptor. En algunos casos, los métodos incluyen además administrar las células que expresan el primer o anterior receptor antes de la administración de las células que expresan el segundo o posterior receptor. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos se llevan a cabo (a) administrando al sujeto las células que expresan el primer o anterior receptor (por ejemplo, primer o anterior CAR), y (b) administrando al sujeto las células que expresan un primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR; y (b) administrando a las células sujeto que expresan un segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR.

En algunos casos, las células que expresan el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR, no expresan el primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el primer (o anterior) y/o el segundo (o posterior) receptor es un receptor de antígeno como un CAR o un TCR transgénico. En algunas de tales casos, el primer o anterior receptor , por ejemplo, CAR, se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad o afección o trastorno en el sujeto. En algunos casos, el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR, se une específicamente al antígeno unido específicamente al primer o anterior receptor. En algunos casos, el primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR, y el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR, se unen específicamente al mismo epítopo del antígeno. En algunos casos, el primer o anterior receptor compite por unirse al antígeno con el segundo o posterior receptor , o viceversa. En algunos casos, el primer o anterior receptor y el segundo o posterior receptor se unen específicamente a distintos epítopos o porciones del antígeno.

En algunos casos, el segundo o posterior receptor se une específicamente a un antígeno diferente asociado con la enfermedad o afección o trastorno en el sujeto. Por ejemplo, en algunos casos, el antígeno reconocido o unido por el primer receptor es CD 19 y el antígeno unido específicamente o reconocido por el segundo o posterior receptor es un antígeno específico de células B o asociado a células B (o antígeno asociado con o específico para las enfermedades de células B, por ejemplo, enfermedad maligna de células B), que es diferente de CD19, como CD22 o CD20.

En algunos casos, el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR, no se une específicamente al antígeno unido específicamente por el primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, las células que expresan el segundo o posterior receptor no incluyen un receptor que se una específicamente al antígeno unido específicamente al primer o anterior receptor.

En algunos casos, en el momento de, antes de y/o inmediatamente antes de la administración de células que expresan el segundo o posterior receptor, el sujeto muestra una respuesta inmune humoral y/o mediada por células detectable específica para el primer o anterior receptor. En algunos casos, el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable contra el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR en el plazo de aproximadamente 30 días, en el plazo de aproximadamente 60 días, o en el plazo de aproximadamente 90 días, de la administración de las células que expresa el segundo o posterior receptor, como la administración en (b).

En algunos casos, en el momento de, antes de y/o inmediatamente antes de la administración de células que expresan el segundo o posterior receptor, la enfermedad o afección persiste en el sujeto; y/o la enfermedad o afección ha recaído en el sujeto.

En algunos casos, en el momento de, antes de y/o inmediatamente antes de la administración de células que expresan el segundo o posterior receptor, el sujeto muestra regulación por disminución, pérdida o modificación del antígeno unido específicamente por el primer o anterior receptor.

En algunos casos, el tiempo entre la administración de las células que expresan el primer o anterior receptor y la administración de las células que expresan el segundo o posterior receptor es de por lo menos aproximadamente 28 días; por lo menos aproximadamente 35 días; por lo menos aproximadamente 42 días; por lo menos aproximadamente 49 días; o por lo menos aproximadamente 60 días. En algunos casos, el tiempo es de por lo menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 días, como por lo menos 14 días o por lo menos 21 días.

En algunos casos, el primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR, incluye por lo menos un epítopo inmunorreactivo que no está presente en el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el por lo menos un epítopo inmunorreactivo incluye por lo menos un epítopo de células B o epítopo reconocido por el sistema inmunológico humoral; y/o incluye por lo menos un epítopo de células T o un epítopo reconocido por una respuesta mediada por células como una reconocida por una célula T citotóxica y/o auxiliar.

En algunos casos, el sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el primer o anterior receptor antes de la administración en (a); y/o no ha recibido una dosis de células que expresan el segundo o posterior receptor antes de la administración en (b) o antes del inicio del método.

En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor. En algunos casos, es o está asociado con una enfermedad infecciosa. En algunos casos, es o está asociado con una enfermedad o trastorno autoinmune.

El segundo o posterior receptor, por ejemplo, el segundo o posterior CAR, generalmente incluye una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con el primer o anterior receptor, por ejemplo, el primer o anterior CAR. En algunos casos, la una o más diferencias incluyen por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con una región del primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR, para la que se genera una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la administración en (a) o la administración anterior de células que expresan el primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, tales una o más diferencias incluyen por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con cada región del primer o anterior receptor para el que se genera una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la administración en (a) o la administración anterior. En algunos casos, tal respuesta inmune se detecta en relación con los métodos.

En algunos casos, los métodos incluyen además, antes de la administración de las células que expresan el segundo o posterior receptor o antes de la administración en (b), detectar la presencia de una respuesta inmune específica del receptor, por ejemplo específica de CAR, en el sujeto. En algunos casos, la detección comprende identificar por lo menos una región del primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR, para el que el sujeto muestra una respuesta inmune específica, como una respuesta inmune específica mediada por anticuerpos o células.

En algunos casos, el segundo o posterior receptor, por ejemplo, CAR, contiene una o más diferencias de secuencias de aminoácidos en comparación con la región del primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR, para la cual es específica una respuesta inmune en el sujeto, como una respuesta inmune detectable en el sujeto. En algunos de tales casos, dicha región del primer o anterior receptor es o incluye una unión entre dos secuencias o dominios endógenos. En algunos casos, es o incluye una región dentro de una o más porciones de CAR seleccionadas del grupo que consiste de una porción scFv, una porción conectora, una secuencia de aminoácidos no endógena al sujeto, una secuencia derivada de una especie diferente de la del sujeto y/o unión entre dos dominios de CAR. En algunos casos, es o incluye una región marco (FR) dentro de la porción scFv, una secuencia de FR de la cadena pesada, una secuencia de la CDR de la cadena pesada, una secuencia de FR de la cadena ligera, y/o una secuencia de la CDR de la cadena ligera.

En algunos casos, el receptor posterior o segundo, por ejemplo, CAR, incluye por lo menos una región que es idéntica en la secuencia de aminoácidos a una región correspondiente del primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, dicha región correspondiente del primer o anterior receptor, por ejemplo, CAR, es una región en la que el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable, por ejemplo, antes de o en el momento de la administración de células que expresan el segundo receptor. En algunos casos, es o incluye una secuencia endógena. En algunos casos, es o incluye una región dentro de una porción de CAR seleccionada del grupo que consiste de un dominio coestimulador, un dominio que contiene ITAM, un dominio de transmembrana, un marcador de transducción o expresión, una secuencia endógena al huésped, y/o un dominio de anticuerpo derivado de la misma especie que el huésped.

En algunos casos, los métodos dan como resultado un aumento o mejora de la exposición del sujeto a las células en comparación con otros métodos. En algunos casos, el número máximo de células que expresan CAR, el área bajo la curva (AUC) para las células que expresan CAR a lo largo del tiempo y/o la duración de las células que expresan CAR detectables en el sujeto después de la administración de las células que expresan el segundo o posterior receptor es mayor en comparación con el logrado mediante un método que usa un régimen de dosificación alternativo que implica la administración de las células que expresan el primer o anterior receptor, por ejemplo, la administración en (a), y una segunda o posterior administración de células que expresan el primer o anterior receptor, que se lleva a cabo en el mismo punto temporal y/o de otra forma bajo las mismas condiciones que la administración en el método divulgado de las células que expresan el receptor posterior o segundo, por ejemplo, como la administración en (b).

En algunos casos, el método da como resultado una concentración máxima o número de células que expresan receptor, por ejemplo, que expresan CAR, en la sangre del sujeto de por lo menos o aproximadamente 10 células que expresan receptor (por ejemplo, que expresan CAR) por microlitro, por lo menos el 50% del número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por lo menos aproximadamente 1 x 105 células que expresan CAR, o por lo menos 1.000, 2.000, 3.000, 4.000 o 5.000 copias de ADN que codifica CAR por microgramos de ADN. En algunos casos, el día 30, el día 60 o el día 90 después del inicio de la administración de las células que expresan el segundo o posterior receptor, por ejemplo, la administración en (b), de células que expresan el receptor, por ejemplo, que expresan CAR, son detectables en la sangre o el suero del sujeto; y/o la sangre del sujeto contiene por lo menos un 20% de células que expresan receptor (por ejemplo, que expresan CAR), por lo menos 10 células que expresan el receptor (por ejemplo, que expresan CAR) por microlitro o por lo menos 1 x 104 células que expresan el receptor (por ejemplo, que expresan CAR).

En algunos casos, cualquiera de las casos anteriores puede implicar múltiples administraciones posteriores. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos se llevan a cabo de manera iterativa, en la que múltiples administraciones de células, expresa cada una un receptor posterior adicional (por ejemplo, administraciones de células que expresan el tercer, el cuarto, el quinto, el sexto, y demás receptores, cada uno distinto de alguna forma, del primero o anterior los receptor(es).

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los resultados de un ensayo de liberación de cromo ejemplar que detecta la presencia de una respuesta inmune citolítica específica para células que expresan cAr después de la administración de células que expresan CAR anti-CD19 en un sujeto humano. Los resultados se muestran para cultivos de linfocitos mixtos que contienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas del sujeto antes de la infusión (panel izquierdo) y después de la infusión (panel derecho) con las células que expresan CAR, en presencia de células que expresan CAR ("CD19-CAR") y que no expresan CAR ("Mock"). "E/T'-relación entre el efectory la célula objetivo.

La Fig. 2 muestra los resultados de un análisis ELISpot ejemplar que confirma las respuestas inmunitarias a ciertos péptidos superpuestos que representan regiones particulares de un CAR en un sujeto humano ejemplar. Los números marcados con "pep" representan varios péptidos superpuestos a lo largo de la secuencia de CAR, con las regiones correspondientes indicadas encima del gráfico.

La Fig. 3 muestra un mapa de afinidad de epítopo para las afinidades de unión predichas de péptidos de una región ejemplar de un receptor quimérico para unirse a HLA-A2:01, incluyendo una serie de péptidos de 8mer a 14mer superpuestos de una región de unión ejemplar que tiene una secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 6) donde los residuos 1-15 corresponden a un dominio transmembrana CD28 ejemplar y los residuos 16-30 corresponden a un dominio coestimulador 4-1BB ejemplar. La figura también representa las afinidades de unión predichas de una serie de péptidos de 8mer a 14mer superpuestos de una región de unión variante que tiene una secuencia de aminoácidos CYSLLVTVAFIIFWNNVKRGRKKLLYIFKQPF (SEQ ID NO: 13), que contiene residuos de asparagina insertados entre el dominio transmembrana CD28 y el dominio coestimulador 4-1BB.

La Fig. 4A y la Fig. 4B representan predicciones de epítopos de células T basadas en algoritmos para alelos HLA clase I y HLA clase II, respectivamente, mostrando el número total de secuencias en el conjunto de datos que incluye cada posición a lo largo de la secuencia con una IC50 prevista de menos de 50 nm ponderada de acuerdo con la frecuencia de los alelos de HLA individuales en la población.

La Fig. 5 representa predicciones de epítopos de células T basadas en algoritmos para alelos HLA de clase I y HLA de clase II de una serie de péptidos variantes. Las puntuaciones se determinaron y ponderaron como se describe en el Ejemplo 2. Los triángulos y una línea de puntos indicaban las puntuaciones ponderadas de clase I. Los círculos y una línea continua indican puntuaciones ponderadas de clase II.

La Fig. 6 representa la secuencia de aminoácidos de una secuencia de CD28-4-1BB ejemplar de SEQ ID NO: 5. Los aminoácidos correspondientes al dominio transmembrana de CD28 se indican mediante una línea continua con flechas que indican las posiciones iniciales y finales; los aminoácidos del dominio coestimulador 4-1BB ejemplar están indicados por una línea discontinua con flechas que indican las posiciones iniciales y finales; los aminoácidos de la región de unión ejemplar se indican mediante una línea de puntos y rayas con flechas que indican las posiciones iniciales y finales y en cursiva. Los dos aminoácidos que flanquean inmediatamente el sitio de unión se indican con un cuadro. Los aminoácidos ejemplares que en algunos casos se dirigen para modificación, incluyendo K28, R31 y L34, están en negrita y subrayados. Las regiones de los residuos ácidos que pueden estar implicados en la unión y señalización de TRAF mediada por 4-1BB se indican mediante un subrayado doble.

Descripción detallada

I. Métodos de tratamiento con células que expresan receptores recombinantes

Se divulgan métodos, composiciones y artículos de fabricación para su uso en terapia celular, por ejemplo, para el tratamiento de varias enfermedades y afecciones como tumores. Los métodos implican administrar a un sujeto células modificadas genéticamente que expresan moléculas recombinantes, típicamente receptores recombinantes diseñados para reconocer y/o unirse específicamente a moléculas asociadas con la enfermedad o afección y/o promover un efecto terapéutico particular. Tal unión puede resultar en una respuesta, como una respuesta inmune dirigida a tales moléculas. Los receptores recombinantes pueden incluir receptores quiméricos, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR) y/u otros receptores transgénicos, como receptores de antígenos transgénicos incluyendo los receptores de células T transgénicas (TCR).

En particular, los métodos implican múltiples administraciones de tales células o la administración de células a un sujeto que ha recibido una administración o dosis previa. Típicamente, las células administradas en una primera o anterior administración (por ejemplo, en una primera o anterior dosis) son distintas de las administradas en la segunda o posteriores administraciones o dosis. Típicamente, las células son distintas por lo menos en parte por medio de su expresión de moléculas recombinantes distintas, por ejemplo, receptores recombinantes distintos. En algunos casos, las células de la segunda o posterior administración o dosis no expresan el receptor expresado por las de la primera dosis o administración. En algunos casos, tales células expresan un receptor que es distinto del de la primera administración o dosis. Por tanto, en algunos casos, los métodos implican administrar una segunda (y/o tercera, cuarta, quinta, etc.) dosis de células a sujetos que han recibido una primera dosis, y/o administrar al sujeto la primera y la segunda (y/o tercera, cuarta, quinta, y demás) dosis, en donde las células administradas en la segunda dosis expresan un receptor que es distinto del receptor expresado por las células administradas en la primera dosis. Los métodos pueden llevarse a cabo de forma iterativa.

En algunos aspectos, las casos divulgados se basan en observaciones de la presente de que una exposición aumentada del sujeto a las células administradas que expresan los receptores recombinantes (por ejemplo, un número de células o duración a lo largo del tiempo aumentados) puede mejorar la eficacia y los resultados terapéuticos en la terapia celular adoptiva. Los análisis preliminares realizados después de la administración de las diferentes células T que expresan CAR dirigidas a CD19 a sujetos con varios cánceres que expresan CD19 en múltiples ensayos clínicos revelaron una correlación entre un grado mayor y/o más largo de exposición a las células que expresan CAR y los resultados del tratamiento.

Tales resultados incluyeron la supervivencia y remisión del paciente, incluso en individuos con una carga tumoral grave o significativa. No obstante, la exposición puede estar limitada por las respuestas inmunes del huésped contra los receptores recombinantes expresados por las células administradas, que pueden eliminar las células prematuramente. Una vez que se desarrolla dicha respuesta inmune del huésped, ya sea adquirida o innata, puede que no sea factible o eficaz intentar aumentar la exposición o proporcionar un retratamiento de los sujetos administrando una dosis posterior de células que expresan el mismo receptor recombinante. Una vez que se ha desarrollado tal respuesta inmune contra el receptor, la administración de dicha segunda o posterior dosis de células que expresan el mismo receptor o uno con epítopos inmunogénicos similares puede dar como resultado la eliminación rápida de las células antes de que hayan tenido la oportunidad de expandirse y/o persistir en un grado eficaz o sustancial. Se divulgan casos que abordan estos desafíos.

En algunos casos, al proporcionar una segunda (y/u otra posterior) dosis de células que expresan un segundo (y/u otro posterior) receptor (por ejemplo, CAR) distinto del primer o anterior receptor expresado por una primera o anterior dosis, los métodos divulgados abordan el problema de la exposición reducida debido a una respuesta inmune del huésped contra el primer o anterior receptor. En particular, como las células de la segunda o posterior dosis no expresan el mismo receptor expresado por las células de la primera o anterior dosis, el riesgo de que el sujeto haya montado una respuesta inmune específica para una molécula presente en las células de la segunda o posterior dosis se reduce.

En algunos aspectos, los casos divulgados se basan en observaciones de pérdida de antígeno, mutación, modificación y/o regulación por disminución en el contexto de inmunoterapia, por ejemplo, inmunoterapia celular adoptiva. Por ejemplo, se ha observado enfermedad negativa para CD19 en ciertos sujetos a los que se les ha administrado terapia dirigida a CD19, incluyendo células T que expresan CAR anti-CD 19. En algunos casos, los métodos divulgados ofrecen ventajas en tales contextos de regulación por disminución o pérdida o modificación de antígenos. Por ejemplo, la administración de células que expresan un segundo o posterior receptor que se une específicamente a un antígeno diferente en comparación con el antígeno o epítopo dirigido por un primer o anterior receptor, cuando el sujeto experimenta o muestra pérdida o modificación de dicho epítopo o antígeno, puede permitir el tratamiento continuado de la enfermedad o afección y/o para mejorar la eficacia. El antígeno diferente en algunos casos es otro antígeno específico o asociado con la misma enfermedad o afección para o con el cual el primer antígeno es específico o está asociado. En algunos casos, es una variante del primer antígeno, como una variante de corte y empalme o una versión mutada expresada en el sujeto, por ejemplo, durante o después de una intervención terapéutica. Por tanto, también entre las ventajas de ciertos métodos y composiciones divulgados en la presente se incluyen la capacidad de proporcionar un tratamiento continuado eficaz en un sujeto que experimenta pérdida de antígeno, regulación por disminución, o modificación que vuelve un primer enfoque de tratamiento menos efectivo.

En algunos casos, el sujeto muestra una respuesta inmune contra el primer o anterior receptor después de la primera o anterior administración, por ejemplo, en el momento o inmediatamente antes de la segunda o posterior administración, de tal manera que la administración adicional de células que expresan el primer receptor o un método con inmunogenicidad similar, puede no ser eficaz. En algunos casos, el sujeto no muestra una respuesta inmune o un tipo o grado particular de respuesta inmune contra el segundo receptor después de la administración de las células que expresan el segundo receptor, o no muestra dicha respuesta dentro de un cierto período de tiempo, como en el plazo de aproximadamente 60 días de la administración de esas células. El tipo de respuesta inmune puede ser una respuesta inmune detectable, una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune mediada por células. En algunos casos, se detecta la presencia o ausencia de dicha respuesta inmune después de la primera o anterior administración, y puede informar qué diferencias están diseñadas para estar presentes en el segundo o posterior receptor en comparación con el primer o anterior receptor. Tal detección puede incluir identificar por lo menos una región del primer o de otro modo anterior receptor (por ejemplo, CAR) para el que el sujeto muestra una respuesta inmune específica. Tal región identificada puede variarse en el segundo o de otro modo posterior receptor, por ejemplo, un receptor seleccionado en la segunda administración que difiera en esa una o más regiones.

En particular, la segunda molécula, por ejemplo, el segundo receptor (por ejemplo, el segundo CAR), difiere generalmente en algún grado, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos y/o epítopos inmunológicos, del primer receptor (por ejemplo, el primer CAR). Por tanto, el primer o anterior receptor incluye generalmente por lo menos un epítopo inmunorreactivo que no está presente en el segundo o posterior receptor, como por lo menos un epítopo de células B y/o por lo menos un epítopo de células T, que puede ser reconocido por el sistema inmunitario del sujeto al que se administran las células. En casos particulares, el segundo (o posterior) receptor, por ejemplo CAR, incluye una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con el primer o anterior receptor.

Tales diferencias pueden incluir por lo menos una diferencia en comparación con una región del primer o anterior receptor al que se muestra una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la primera o anterior administración, por ejemplo, una diferencia en una región en el segundo o posterior receptor que corresponde a dicha región en el primer o anterior receptor. Las regiones, incluida las diferencias pueden incluir una porción de unión a antígeno, como una porción de scFv, incluyendo las regiones marco (FR) dentro de un scFv o una porción de región variable, como FR1, FR2, FR3, por ejemplo, de la VH, una porción de la región variable de la cadena pesada y/o ligera, una porción conectora, una porción bisagra, una unión entre dos dominios CAR, un marcador de transducción o expresión, y/o una secuencia de aminoácidos dentro del CAR que no es endógena, por ejemplo, no es idéntica a una secuencia presente en una molécula endógena del huésped, como una región de unión entre dos dominios que no están asociados naturalmente entre sí en una única secuencia de aminoácidos en el entorno natural, por ejemplo, una unión entre dos secuencias endógenas dentro de un receptor quimérico o fragmento de anticuerpo/anticuerpo.

Aunque generalmente están presentes una o más diferencias en el segundo u otro receptor posterior en comparación con el primer o anterior receptor, los receptores también pueden incluir regiones de similitud, por ejemplo, regiones de identidad de secuencia de aminoácidos. En algunos casos, las regiones de identidad son aquellas para las que el sujeto no muestra o es poco probable que muestre una respuesta inmune después de la primera o anterior administración. Tales regiones pueden incluir regiones dentro de un dominio coestimulador, un dominio que contiene ITAM, un dominio transmembrana, una CDR y/o un marcador de transducción o expresión. Cuando un scFv y/o una región variable difieren entre los diferentes receptores, puede ser que los scFv o regiones variables respectivos se deriven de la misma especie (por ejemplo, ratón o ser humano), se deriven de diferentes especies y/o combinaciones de los mismos.

En algunos casos, las diferencias indicadas son las únicas diferencias o sustancial o esencialmente las únicas diferencias entre la molécula recombinante, por ejemplo el receptor, en las células de la primera dosis o administración en comparación con la segunda dosis o administración. En algunos casos, aparte de las diferencias en el receptor y/u otras diferencias indicadas, las células y/o poblaciones de células administradas en una administración anterior y posterior son idénticas o esencialmente o sustancialmente idénticas. En algunos casos, la proporción de células que expresan niveles de superficie detectables de uno o más marcadores es la misma o similar en una administración en comparación con la administración posterior. En algunos casos, los porcentajes de poblaciones y/o subpoblaciones de células en las diferentes dosis o administraciones son iguales o sustancial o esencialmente iguales. Las diferentes dosis pueden contener el mismo porcentaje de células T, células T CD8 y/o CD4+, células T de un linaje particular o estado o experiencia de activación, como porcentajes relativos de células T efectoras, sin tratamiento previo y/o de memoria, y/o subpoblaciones de las mismas como las células Tcm, Tem, Tscm y/o las células pueden derivarse del mismo sujeto, muestra, tejido y/o fluido o compartimento. En algunos casos, se usa otra porción de la misma composición de células usada para modificar las células de la primera dosis, por ejemplo, mediante transducción con un vector que codifica el receptor recombinante, para modificar las células de la segunda administración. En algunos casos, la composición se conserva, por ejemplo, mediante crioconservación, antes de la segunda administración.

En algunos casos, las dosis se administran en cantidades particulares y/o de acuerdo con parámetros de tiempo particulares. En algunos casos, la segunda o de otro modo posterior dosis de células que expresan el segundo (o tercero, cuarto, quinto, etc.) receptor se administra en un momento después de que se haya desarrollado una respuesta inmune, haya tenido la oportunidad de desarrollarse y/o haya sido detectada o se ha confirmado de otro modo que está presente, contra el receptor en la primera u otra dosis anterior, como de o aproximadamente o por lo menos de o aproximadamente 28 días o 35 días después de la primera u otra dosis anterior.

La dosis posterior puede usarse para retratamiento tras recaída y/o para prevenir la recurrencia de la enfermedad o trastorno objetivo, y/o para abordar o prevenir una reducción en la exposición a células que expresan un receptor recombinante dirigido a la enfermedad o afección o antígeno de interés después de una primera o anterior dosis. Por ejemplo, la dosis posterior en algunos casos se administra después o tras la detección de una disminución en la persistencia o expansión de tales células o en el número total o relativo de tales células en el sujeto u órgano o fluido del mismo. Por tanto, en algunos casos, se miden, detectan o evalúan uno o más de estos parámetros en el tiempo entre la primera u otra dosis anterior y la segunda u otra dosis posterior, y el momento o la decisión de administrar la dosis posterior en base al resultado de dicha evaluación. Por ejemplo, la segunda dosis puede administrarse en un momento en el que se determina que el número o la concentración de las células que expresan el receptor está por debajo de un nivel deseado o ha disminuido por debajo de un cierto porcentaje del máximo o de otra concentración o número medido.

Los receptores recombinantes, por ejemplo, CAR o TCR transgénicos, generalmente se unen específicamente a uno o más antígenos expresados por, asociados con y/o específicos para una enfermedad o afección en el sujeto y/o células o tejidos del mismo. Tales enfermedades pueden incluir tumores, cánceres, otras enfermedades proliferativas, enfermedades o trastornos autoinmunes y/o agentes o enfermedades infecciosos. En algunos casos, el primer (u otro anterior) y el segundo (u otros posteriores) receptores, aunque distintos, se unen específicamente al mismo antígeno. La unión puede ser a un epítopo similar o al mismo. En algunos casos, la unión de un receptor al antígeno compite por la unión al antígeno con el otro. La unión en algunos casos es a un epítopo completamente diferente, sin competir con el del otro receptor, y/o a un antígeno completamente diferente. A este respecto, los métodos en algunos casos pueden ser útiles en el tratamiento de sujetos cuya enfermedad o afección se ha vuelto resistente a tratamientos dirigidos a un epítopo o antígeno particular, como los resultantes de la regulación por disminución o mutación del objetivo por la enfermedad o afección o células de la misma, y/o que experimentan pérdida de antígeno. Por ejemplo, en algunos casos, el antígeno reconocido o unido por el primer receptor es CD19 y el antígeno específicamente unido o reconocido por el segundo o posterior receptor es un antígeno específico de células B o asociado a células B (o antígeno asociado o específico para enfermedades de células B, por ejemplo, enfermedad maligna de células B), que es distinto de CD19, como CD22 o CD20.

Por tanto, al ofrecer la capacidad de dirigirse a un epítopo o antígeno asociado a la enfermedad similar pero distinto, los métodos en algunos casos mejoran la eficacia no solo aumentando la persistencia general de las células modificadas genéticamente en el sujeto, sino también permitiendo que las células y/o forma de terapia para funcionar incluso en el contexto de regulación por disminución o mutación del objetivo original. En algunos casos, el segundo receptor se une al mismo antígeno y a un antígeno diferente en la misma enfermedad, y/o la célula contiene múltiples receptores, cada uno de los cuales se une a un antígeno o epítopo diferente, uno o más de los cuales pueden ser distintos de o iguales al reconocido por el primer receptor. En algunos casos, el segundo o posterior receptor se une a una variante, por ejemplo, una variante de corte y empalme diferente o una versión modificada, del antígeno reconocido por el primer receptor.

En algunos casos, los diferentes receptores tienen dominios (como dominios de unión al antígeno, por ejemplo, sFvs, y/u otros dominios de receptores quiméricos, por ejemplo, otros dominios CAR) que tienen secuencias con orígenes en la misma especie y/o aquellos que tienen secuencias con orígenes en diferentes especies. Por ejemplo, en algunos casos, los diferentes receptores contienen dos dominios de unión distintos derivados de la misma especie, como dos dominios scFv derivados de ratón o dos dominios scFv con secuencias de región marco (FR) derivadas de ratón, como las derivadas de FMC63. y SJ25C1, respectivamente. En otros casos, los diferentes receptores contienen dos dominios de unión distintos para el mismo o diferentes antígenos derivados de diferentes especies, como un primer receptor que tiene un scFv u otro dominio de unión derivado de una secuencia murina, como FMC63 o SJ25C1 y otro receptor con un dominio derivado en su totalidad o en parte de otra especie, como una secuencia humana o humanizada, como una que se une al mismo antígeno, por ejemplo, para un mismo epítopo o uno similar o distinto, o para un antígeno distinto.

En algunos casos, el receptor es un receptor distinto de un receptor de antígeno, como uno de un par de compañeros de unión y/o una variante del mismo, el otro compañero del cual se expresa específicamente en el contexto de una enfermedad o afección o células o tejidos de las mismas, y/o la expresión de las cuales está asociada con la enfermedad o afección. En algunos casos, tales receptores son receptores quiméricos. En algunos casos, tales receptores quiméricos contienen porciones de unión extracelular que interactúan específicamente con dicho compañero de unión y contienen, por ejemplo, dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares capaces de potenciar una señal o señales inmunoestimuladoras, como una activación y/o dominios coestimuladores como los presentes en ciertos receptores de antígenos quiméricos.

En algunos casos, los métodos divulgados son para el tratamiento o gestión continua o a largo plazo de la enfermedad o trastorno en el sujeto, que implican una primera, segunda, tercera y/o múltiples administraciones posteriores adicionales de células modificadas, en las que una o más de las dosis incluyen células que expresan receptores recombinantes distintos de los de otras dosis, pero que se dirigen a la misma enfermedad o afección en el sujeto, como receptores distintos que se dirigen al mismo antígeno específico de la enfermedad o asociado a la enfermedad o uno diferente, al mismo o diferentes epítopos. El tratamiento o gestión crónica o a largo plazo en algunos casos es un proceso iterativo, en el que se monitoriza al sujeto para determinar su inmunogenicidad y/o caída en la exposición, presencia, persistencia, números y/o porcentajes de las células, y se introduce una siguiente administración posterior (por ejemplo, siguiente receptor posterior) si y cuando se detecta un indicador particular de pérdida de eficacia o riesgo de la misma con respecto al primer o anterior receptor o células. En algunos casos, cada administración posterior se inicia tras la detección de uno o más indicadores de un riesgo de pérdida de eficacia, como la reducción de la persistencia, expansión o exposición de las células en la dosis anterior, una respuesta inmune específica a las mismas en el sujeto, recaída, resistencia y/o regulación por disminución o cambio en el antígeno objetivo.

Métodos ejemplares de dosificación con un segundo receptor quimérico

En algunos casos, los métodos incluyen la administración de un segundo receptor quimérico a un sujeto que ha desarrollado una respuesta inmune y/o es probable que sea inmunogénico al primer receptor quimérico. En algunos casos, el primer receptor quimérico contiene una región de unión de un primer y segundo dominio que es inmunogénico. En algunos casos, la región inmunogénica incluye uno o más epítopos de péptidos (también denominados epítopos de células T). En algunos casos, una región de unión que contiene epítopos de péptidos potenciales que abarcan la unión de los dos dominios puede ser inmunogénica y dar como resultado la generación de una respuesta inmune tras la administración a un sujeto de un receptor quimérico que contiene la región de unión. En algunos casos, la región de unión puede incluir una pluralidad de fragmentos peptídicos que se superponen individuales de secuencia contigua de aproximadamente 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 aminoácidos o más) directamente C-terminales de la unión que une un primer dominio y un segundo dominio del receptor quimérico y/o de aproximadamente 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 aminoácidos o más) directamente N-terminales de la unión, tales fragmentos peptídicos pueden incluir cada uno o abarcar la unión de los dos dominios. Por tanto, en algunos casos, la región de unión puede contener una pluralidad de epítopos de péptidos potenciales que pueden mostrar una afinidad de unión por una molécula de HLA y/o ser capaces de inducir una respuesta inmune

En algunos casos puede identificarse una región inmunogénica, como una región de unión, de un receptor quimérico. En algunos casos, la región inmunogénica puede identificarse por su capacidad para unirse a una molécula de MHC o por su capacidad para provocar una respuesta inmune bajo ciertas condiciones. En algunos casos, los péptidos que se superponen de un receptor quimérico, como los péptidos superpuestos de 8mer a 20mer, como los de 9mers, 10mers, 11mers, 12mers, 13mers, 14mers o 15mers, pueden evaluarse para determinar la unión de MHC usando métodos algorítmicos u otros métodos computacionales, como como se describe a continuación. En algunos casos, puede evaluarse un receptor quimérico para determinar si es inmunogénico evaluando una respuesta inmune en un sujeto al que se le ha administrado, como un sujeto al que se le administraron células modificadas genéticamente con el receptor quimérico (por ejemplo, CAR). Los métodos ejemplares para evaluar respuestas inmunes se describen a continuación.

En algunos casos, el por lo menos un epítopo peptídico es capaz de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), como una proteína de clase I o de clase II, que son moléculas que contienen un sitio de unión de péptido polimórfico o un surco de unión que puede, en algunos casos, formar complejos con fragmentos peptídicos de polipéptidos, incluyendo péptidos procesados por la maquinaria celular. En algunos casos, el epítopo peptídico es capaz de unirse a una molécula de MHC que es una molécula de MHC humana. En algunos casos, la molécula de ^mH^ces una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA). En algunos casos, el por lo menos un epítopo peptídico muestra una afinidad de unión (por ejemplo, IC50) por una molécula de HLA, como una molécula de HLA de clase I o una molécula de HLA de clase II. En algunos casos, la región de unión del receptor quimérico de referencia contiene un epítopo peptídico que muestra una afinidad de unión de menos de 1000 nM, menos de 500 nM o menos de 50 nM.

En algunos casos, por lo menos uno o más epítopos peptídicos de una región de unión de un receptor quimérico de referencia es un epítopo MHC de clase II. En algunos casos, los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase II pueden tener una longitud de entre 8 y 20 aminoácidos, incluyendo entre 10 y 17 aminoácidos de longitud. En algunos casos, los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase II pueden tener más de 20 aminoácidos de longitud. En algunos casos, el péptido se encuentra en una conformación extendida a lo largo del surco de unión del péptido MHC II. En algunos casos, el surco de unión del péptido MHC II está abierto en ambos extremos. En algunos casos, el péptido se mantiene en su lugar por lo menos en parte por los contactos de los átomos de la cadena principal con residuos conservados que recubren el surco de unión del péptido. En algunos casos, el alelo del MHC de clase II puede ser cualquiera que se sepa que esté presente en un sujeto, como un sujeto humano. En algunos casos, el alelo de MHC puede ser, pero no está limitado a, DR1, DR3, DR4, DR7, DR52, DQ1, DQ2, DQ4, DQ8 y DPI. En algunos casos, el alelo del MHC de clase II puede ser cualquiera expuesto en las Tablas 1B. En algunos casos, el alelo de MHC de clase II es un HLA-DRB1*0101, un HLA-DRB*0301, HLA-DRB*0701, HLA-DRB*0401 un HLADQB1*0201.

En algunos casos, el por lo menos un epítopo peptídico de una región de unión de un receptor quimérico de referencia es un epítopo de MHC de clase I. En algunos casos, los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase I pueden tener una longitud de entre 7 y 15 aminoácidos. En algunos casos, los péptidos que se unen a la molécula del MHC de clase I pueden tener una longitud de entre 8 y 13 aminoácidos. En algunos casos, la unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos mediante contactos entre átomos en la cadena principal del péptido y sitios invariantes en el surco de unión al péptido de todas las moléculas de MHC de clase I. En algunos casos, existen sitios invariantes en ambos extremos del surco que se unen a los extremos terminales amino y carboxi del péptido. En algunos casos, las variaciones en la longitud del péptido pueden acomodarse mediante un retorcimiento en la estructura principal del péptido. En algunos casos, la retorcedura incluye residuos de prolina o glicina, que pueden permitir flexibilidad. En algunos casos, el alelo del MHC de clase I puede ser cualquiera que se sepa que está presente en un sujeto, como un sujeto humano. En algunos casos, el alelo de MHC de clase I es un alelo HLAA2, HLA-A1, HLA- A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 o HLA-Cw8. En algunos casos, el alelo de MHC de clase I puede ser cualquiera de los expuestos en las Tablas 1A, que se encuentran entre los alelos de MHC de clase I más frecuentes (Solberg et al., (2008) Hum Immunol. 2008 Jul; 69(7):443-6). En algunos casos, el alelo de HLA de clase I es HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01 o HLA-B*08:01.

En algunos casos, el alelo de MHC de clase I es un alelo de HLA-A2, que en algunas poblaciones se expresa en aproximadamente el 50% de la población. En algunos casos, el alelo de HLA-A2 puede ser un producto génico de HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206, o *0207. En algunos casos, puede haber diferencias en la frecuencia de subtipos entre diferentes poblaciones. Por ejemplo, en algunos casos, más del 95% de la población caucásica positiva para HLA-A2 es HLA-A*0201, mientras que en la población china se ha informado que la frecuencia es aproximadamente del 23% de HLA-A*0201, 45% de HLA-A*0207, 8% de HLA-A*0206 y 23% de HLA-A*0203. En algunos casos, la molécula de MHC es HLA-A*0201.

En algunos casos, el segundo receptor quimérico es un receptor quimérico variante que contiene una región de unión modificada en comparación con una región de unión del receptor quimérico de referencia, que puede ser el primer receptor quimérico, en el que uno o más residuos de aminoácidos en una posición de 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos) directamente C-terminales de la unión que une un primer dominio y un segundo dominio del receptor quimérico de referencia y/o en una posición de 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos) directamente N-terminales de la unión se modifican, como por inserción, deleción o reemplazo de aminoácidos. En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 diferencias o modificaciones de aminoácidos en la región de unión modificada en comparación con la región de unión en el receptor quimérico de referencia.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene un dominio de por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el primer dominio del receptor quimérico de referencia y/o contiene un dominio de por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el segundo dominio del receptor quimérico de referencia. En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene un dominio que es idéntico en secuencia al primer dominio del receptor quimérico de referencia y contiene un dominio de por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el segundo dominio del receptor quimérico de referencia. En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene un dominio de por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el primer dominio del receptor quimérico de referencia y contiene un dominio que es idéntico en secuencia al segundo dominio del receptor quimérico de referencia. En algunos casos, por lo menos uno o ambos dominios presentes en el receptor quimérico variante se modifica en comparación con el primer dominio y/o el segundo dominio del receptor quimérico de referencia en la porción que contiene la región de unión modificada.

En algunos casos, el receptor quimérico variante tiene por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el receptor quimérico de referencia. En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 diferencias o modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos de aminoácidos) en comparación con el receptor quimérico de referencia.

En algunos casos, el primer y/o el segundo dominio del receptor quimérico de referencia (por ejemplo, CAR de referencia) es un dominio de una proteína humana endógena natural o un dominio que tiene un 100% de identidad con un dominio o porción de función del mismo de un o proteína endógena. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio no están presentes en la misma molécula in vivo en un sujeto humano. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio no están presentes en una única proteína o polipéptido humano natural o endógeno.

En algunos casos, el primer y/o segundo dominio es o comprende un dominio de unión extracelular, un dominio bisagra, un dominio transmembrana o un dominio de señalización intracelular o porciones funcionales del mismo. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular es o comprende un dominio de señalización coestimuladora, como un dominio de señalización coestimuladora CD28, 4-1BB o ICOS. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular es o comprende un dominio de señalización citoplásmico activador, como un dominio que es o incluye un componente de receptor de células T (TCR) y/o que contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM). En algunos casos, el dominio citoplásmico de activación es o comprende un dominio de señalización citoplásmico de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z) o una variante funcional o porción de señalización de la misma.

En algunos casos, el receptor quimérico de referencia es un CAR. En algunos casos, los receptores quiméricos, como un CAR, contienen desde su extremo N-terminal hasta su extremo C-terminal en orden: un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular es o incluye un dominio de señalización de activación (por ejemplo, un componente de TCR y/o que contiene un ITAM, por ejemplo, un dominio de señalización de CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular es o incluye un dominio de señalización coestimuladora (por ejemplo, un dominio de señalización CD28, 4-1BB o ICOS). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular contiene solo uno del dominio de señalización coestimuladora o el dominio de señalización de activación o contiene ambos dominios en cualquier orden. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular contiene tanto el dominio de señalización coestimuladora como el dominio de señalización de activación.

En algunos casos, el receptor quimérico variante puede contener desde su extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal en orden: un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, que opcionalmente puede incluir un dominio de señalización coestimuladora (por ejemplo, CD28, 4-1BB o ICOS) y/o un dominio de señalización de activación (por ejemplo, un componente de TCR y/o que contiene un ITAM, por ejemplo un dominio de señalización de CD3-zeta) cada uno solo como parte del dominio de señalización intracelular o en cualquier orden, en el que el receptor quimérico variante contiene una modificación en uno o más residuos de aminoácidos dentro de una porción contigua de 8 a 24 aminoácidos (por ejemplo, de 8 a 15 aminoácidos o de 8 a 13 aminoácidos, como aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos) en cualquier lado (N-terminal y/o C-terminal) de la unión.

En algunos casos, las características de un receptor quimérico de referencia pueden ser cualquiera de las descritas en la subsección III a continuación. En algunos casos, las características de un receptor quimérico variante también pueden ser cualquiera como se describe en la subsección III a continuación, excepto que el receptor quimérico variante contiene una o más modificaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos) en una región de unión modificada como se describe.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una región de unión modificada que contiene una o más modificaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos) en una región de unión de un receptor quimérico de referencia como se describe, en donde el receptor quimérico de referencia contiene un primer dominio que es o comprende un dominio de unión a ligando extracelular o una porción del mismo y un segundo dominio que es o comprende un dominio de bisagra o una porción del mismo, unidos en secuencia contigua en una unión.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una región de unión modificada que contiene una o más modificaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos) en una región de unión de un receptor quimérico de referencia como se describe, en donde el receptor quimérico de referencia contiene un primer dominio. que es o comprende un dominio de bisagra o una porción del mismo y un segundo dominio que es o comprende un dominio de transmembrana o una porción del mismo, unidos en secuencia contigua en una unión.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una región de unión modificada que contiene una o más modificaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos) en una región de unión de un receptor quimérico de referencia como se describe, en donde el receptor quimérico de referencia contiene un primer dominio que es o comprende un dominio transmembrana o una porción del mismo y un segundo dominio que es o comprende un dominio de señalización coestimuladora o una porción del mismo, unidos en secuencia contigua en una unión.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una región de unión modificada que contiene una o más modificaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos) en una región de unión de un receptor quimérico de referencia como se describe, en donde el receptor quimérico de referencia contiene un primer dominio que es o comprende un dominio de señalización coestimuladora o una porción del mismo y un segundo dominio que es o comprende un dominio de señalización citoplásmico de activación o una porción del mismo, unidos en secuencia contigua en una unión.

En algunos casos, el primer dominio del receptor quimérico de referencia es o comprende un dominio transmembrana o una parte del mismo. En algunos casos, el dominio transmembrana incluye los derivados de (es decir, comprenden por lo menos la región(es) transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154 y/o regiones transmembrana que contienen variantes funcionales de las mismas como aquellas que retienen una porción sustancial de las propiedades estructurales, por ejemplo, transmembrana de las mismas. En algunos casos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana derivado de CD4, CD28 o CD8, por ejemplo, CD8alfa, o una variante funcional del mismo. En algunos casos, el segundo dominio del receptor quimérico de referencia es o comprende un dominio de señalización coestimuladora, que está directamente enlazado o unido al dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio de señalización coestimuladora es o comprende un dominio de señalización de CD28, 4-1BB, OX40, DAP 10 e ICOS.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una región de unión modificada que contiene una o más modificaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o reemplazos) en una región de unión de un receptor quimérico de referencia como se describe, en donde el receptor quimérico de referencia contiene un primer dominio. que es o comprende un dominio transmembrana de CD28 o una porción del mismo y un segundo dominio que es o comprende un dominio de señalización coestimuladora de 4-1BB o una porción del mismo, unidos en secuencia contigua en una unión. En algunos casos, el dominio transmembrana de CD28 es o comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, 103 o 104 o es una porción funcional o variante de la misma que comprende una secuencia que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, 103 o 104. En algunos casos, el dominio de señalización 4-1BB es o comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3 o una porción funcional o variante de la misma que comprende una secuencia que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio juntos comprenden o tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5 o una porción funcional o variante de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5. En algunos casos, el primer dominio y el segundo dominio del receptor quimérico de referencia tienen o comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:5.

En algunos casos, la variante del receptor quimérico comprende una región de unión modificada que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:137 pero más del 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o 96% con la SEQ ID NO:137 e incluye las modificaciones. En algunos casos, el receptor quimérico variante tiene o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 pero más del 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o 96% con la SEQ ID NO:5 e incluye las modificaciones. En algunos casos, el receptor quimérico variante tiene o comprende una región de unión modificada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO:138-157, una variante funcional del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o 96% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 138-157, o una porción funcional del mismo, cada una que incluye las modificaciones.

En algunos casos, el receptor quimérico variante no contiene una modificación en o de un residuo de aminoácidos hidrófobo o dentro de una porción hidrófoba en el dominio transmembrana, como el dominio transmembrana CD28. En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una o más modificaciones en o de un residuo de aminoácidos hidrófobo o dentro de una porción hidrófoba en el dominio transmembrana, como el dominio transmembrana CD28. En algunos casos, la una o más modificaciones es o comprende una sustitución del aminoácido hidrófobo por otro residuo de aminoácidos hidrófobo diferente. En algunos casos, la una o más modificaciones no es o no comprende una modificación en o de un residuo de aminoácidos hidrófobo o dentro de una parte hidrófoba en el dominio transmembrana distinta de una sustitución con otro residuo de aminoácidos hidrófobo.

En algunos casos, los dominios transmembrana contienen uno o más residuos de triptófano que interactúan con las bicapas lipídicas de una membrana. En algunos casos, el uno o más residuos de triptófano pueden estar localizados cerca de la interfaz lípido-agua. En algunos casos, el uno o más residuos de triptófano anclan o ayudan a anclar el dominio transmembrana dentro de la membrana. Ver, por ejemplo, de Jesus y Allen, Biochim Biophys Acta. febrero de 2013; 1828(2):864-76. En algunos casos, el receptor quimérico variante no contiene una modificación en uno o ambos de un residuo de triptófano en el dominio transmembrana, como el dominio transmembrana CD28. En algunos casos, el receptor quimérico no contiene una modificación en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 2 y/o la posición 26 con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 5, cada una de las cuales corresponde a un triptófano en el receptor quimérico de referencia.

En algunos casos, el dominio en el receptor quimérico variante que corresponde al dominio transmembrana del receptor quimérico de referencia tiene un perfil de hidropatía sustancialmente hidrófobo y/o tiene una media grande valor de hidopatía (GRAVY) de más de 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2 o mayor.

En algunos casos, el receptor quimérico variante no contiene una modificación en o de un residuo de aminoácido implicado o necesario para la señalización del dominio de señalización coestimuladora, como en o de un residuo de aminoácido implicado o necesario para la señalización de 4-1BB. En general, la señalización coestimuladora implica interacciones con moléculas de TRAF. En algunos casos, el receptor quimérico variante no contiene una modificación en o de un residuo de aminoácido que interactúa con o es parte de un motivo de unión para unirse a una molécula de TRAF. En algunos casos, el receptor quimérico variante no contiene una modificación en o de un residuo de aminoácido en el dominio de señalización coestimuladora del receptor quimérico de referencia que comprende el motivo (P/S/A/T)X(Q/E)E. En algunos casos, la molécula de TRAF es TRAF1, TRAF2 y/o TRAF3. En algunos casos, el dominio en el receptor quimérico variante que corresponde al dominio de señalización coestimuladora del receptor quimérico de referencia es capaz de inducir la activación o localización celular de un TRAF y/o es capaz de inducir la señalización mediada por TRAF. En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene los aminoácidos TTQE en las posiciones correspondientes a 49-52 y/o los aminoácidos PEEE en las posiciones correspondientes a los residuos 60-63, cada uno con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una o más modificaciones de aminoácidos dentro de una porción entre el residuo 13 y 42 o entre el residuo de aminoácidos 15 y 40, con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, la modificación es o incluye la inserción de uno o más residuos de aminoácidos. En algunos casos, la una o más inserciones es entre residuos de aminoácidos adyacentes a la unión entre los dominios. En algunos casos, la una o más inserciones de aminoácidos es entre los residuos de aminoácidos 27 y 28 con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunos casos, la una o más inserciones pueden incluir la inserción de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos. En algunos casos, la inserción es de 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos. En algunos casos, la inserción es para cualquier residuo de aminoácidos. En algunos casos, la inserción es la inserción de una asparagina (N).

En algunos casos, la modificación es o incluye uno o más reemplazos de aminoácidos en un residuo correspondiente al residuo 28, 31 o 34 con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunos casos, la sustitución de aminoácidos puede ser para cualquier otro aminoácido. En algunos casos, el reemplazo de aminoácidos es para un residuo de aminoácido que es leucina (L), asparagina (N), glutamina (Q), alanina (A), serina (S) o histidina (H). En algunos casos, el reemplazo de aminoácidos es o corresponde a uno o más de K28A, K28H, K28L, K28Q, K28S, R31A, R31H, R31L, R31N, L34Ay L34S, con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En algunos casos, el receptor quimérico variante contiene una región de unión modificada con dos o más, como hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones de aminoácidos en comparación con un región de unión de un receptor quimérico de referencia. En algunos casos, los reemplazos de aminoácidos son o corresponden con los reemplazos de aminoácidos seleccionados entre K28Q/R31A, K28Q/R31N, K28Q/R31S, K28Q/L34A, K28Q/L34S, R31N/L34A, R31N/L34S, K28Q/R31N/L34A, K28Q/R31N/L34S.

En algunos casos, el receptor quimérico variante tiene o comprende una región de unión modificada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 138-157, una variante funcional de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o 96% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 138-157, o una porción funcional de la misma, cada una de las cuales incluye la modificación(es).

En algunos casos, el receptor quimérico variante tiene o comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 114-134, una variante funcional del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o 96% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 114-134, o una parte funcional del mismo, cada uno de los cuales incluye la modificación(es).

En algunos casos, la variante del receptor quimérico contiene una región de unión modificada de tal manera que los fragmentos peptídicos de dicha región muestran una afinidad de unión más baja por un antígeno leucocitario humano (HLA) y/o la región muestra una inmunogenicidad reducida, incluyendo después de la administración a un sujeto.

En algunos casos, un fragmento peptídico que tiene la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión modificada tiene una afinidad de unión para una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) que es menor que la afinidad de unión, para la misma molécula de HLA, de un fragmento peptídico que tiene la secuencia de la porción correspondiente de la región de unión del receptor quimérico de referencia. En algunos casos, el fragmento peptídico de la porción correspondiente de la región de unión del receptor quimérico de referencia tiene una afinidad de unión de menos de 1000 nM, menos de 500 nM o menos de 50 nM.

En algunos casos, la media de las afinidades de unión de todos los 8-15 fragmentos de aminoácidos, o de todos los 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 fragmentos de aminoácidos, dentro de la región de unión modificada para una molécula de HLA humana es menor que la media de las afinidades de unión de todos los 8-15 fragmentos de aminoácidos, o de todos los 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 fragmentos de aminoácidos, dentro de la región de unión del receptor quimérico de referencia. En algunos casos, la afinidad de unión o la media de afinidades de unión es más de 2 veces, más de 5 veces, más de 10 veces, más de 25 veces, más de 50 veces o más de 100 veces menor.

En algunos casos, el número de fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión modificada que tiene una afinidad de unión para un antígeno leucocitario humano (HLA) de menos de 1000 nM se reduce en comparación con el número de fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión del receptor quimérico de referencia que tiene la misma afinidad para unirse al mismo HLA. En algunos casos, el número de fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión modificada que tiene una afinidad de unión por un antígeno leucocitario humano (HLA) de menos de 500 nM se reduce en comparación con el número de fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión del receptor quimérico de referencia que tiene la misma afinidad para unirse al mismo HLA. En algunos casos, el número de fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión modificada que tiene una afinidad de unión para un antígeno leucocitario humano (HLA) de menos de 50 nM se reduce en comparación con el número de fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos de la región de unión del receptor quimérico de referencia que tiene la misma afinidad para unirse al mismo HLA.

En algunos casos, la afinidad de unión puede determinarse experimental o algorítmicamente. En algunos casos, una afinidad de unión de péptidos para un MHC puede determinarse computacionalmente, como mediante el uso de algoritmos basados en modelos de afinidad de unión cuantitativos (Lafuente y Reche (2009) Current Pharmaceutical Design, 15:3209-3220). En algunos casos, la afinidad de unión puede determinarse en un ensayo in vitro.

En algunos casos, la determinación de la afinidad de unión de un péptido a una molécula de MHC implica ensayos de unión competitiva de radioactividad o fluorescencia. Ver, por ejemplo, Ettinger et al., J. Immunol.

160:2365 (1998). En algunos casos, el ensayo de competición produce una comparación de las afinidades de unión de diferentes péptidos. Algunos estudios de unión de MHC utilizan moléculas de clase I solubilizadas con detergente de líneas celulares transformadas con EBV (ver, por ejemplo, Sette, A., et al., MolImmunol, 31(11):813-22 (1994). En algunos casos, el ensayo competitivo implica m Hc cargado naturalmente, y la molécula de MHC de interés puede purificarse de otras moléculas de MHC en el lisado de detergente o usarse en una mezcla con otras moléculas de MHC. En algunos casos, pueden identificarse péptidos radiomarcados que tienen una alta afinidad por la molécula de MHC en cuestión. En algunos casos, la afinidad de péptidos “de prueba” adicionales para la molécula de MHC en cuestión se determina entonces por su capacidad para competir con el péptido radiomarcado de alta afinidad.

En algunos casos, la determinación de la afinidad del péptido puede implicar un ensayo de reconstitución, por ejemplo, usando células "T2", en el que las células que expresan un alelo de MHC apropiado se "despojan" de un péptido de unión nativo incubando a pH 2-3 durante un período corto período de tiempo. En algunos casos, para determinar la afinidad de unión de un péptido de unión a MHC putativo por el mismo alelo de MHC, el monómero de MHC despojado puede combinarse en solución con el péptido de unión a MHC putativo, beta2-microglobulina y un anticuerpo monoclonal dependiente de la conformación. En algunos casos, puede usarse la diferencia en la intensidad de fluorescencia determinada entre las células incubadas con y sin el péptido de unión de prueba después del marcado, por ejemplo, o directamente con el anticuerpo monoclonal marcado o un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, para determinar la unión del péptido de prueba.

En algunos casos, la afinidad de unión por una molécula de MHC (por ejemplo, HLA) está representada por una IC50, que es la concentración de péptido en un ensayo de unión en la que se observa una inhibición del 50% de la unión de un péptido de referencia. En algunos casos, tales ensayos pueden ejecutarse en condiciones en las que los valores de IC50 se aproximan a los valores de Kd (es decir, concentraciones de proteínas HLA y péptidos marcados limitativas). En algunos casos, la unión se puede expresar en relación con un péptido de referencia.

En algunos casos, la afinidad de unión puede predecirse usando métodos in silico. En la técnica se conocen métodos in silico ejemplares para predecir la afinidad de unión para la unión de MHC usando métodos algorítmicos u otros métodos computacionales. Ver, por ejemplo, Marsh, et al., The HLA Factsbook (Academic Press, 2000). En algunos casos, puede usarse un algoritmo para predecir si un péptido de interés debería unirse a una molécula de MHC dada. Ver, por ejemplo, outhwood, et al., J. Immunol. 160:3363 (1998); Honeyman, et al., Nat. Biotechnol. 16:966-969 (1998); Breisie, et al., Bioinformatics 14:121-131 (1998), así como el algoritmo "SYFPEITHI" (Hans-Georg Rammensee, et al., Immunogenetics (1999) 50: 213-219), Zhang et al., PLoS ONE 7(2): e30483. doi: 10.1371/journal.pone.0030483, the Immune Epitope and Analysis Resource (IEDB) (Peters B, et al. PLoS Biology 3: 379 (2005)), y el algoritmo “BIMAS” (Parker, K. C., M. A. Bednarek, y J. E.Coligan. J. Immunol. 152:163 (1994).

En algunos casos, las herramientas de predicción de algoritmos, incluyendo las disponibles en IEDB, utilizan una o más predicciones usando ANN (Nielsen et al. (2003) Protein Sci., 12:1007-1017 y Lundegaard et al. (2008) NAR, 36: W509-512), SMM (Peters y Sette (2005) BMC Bioinformatics, 6:132) y comblib (Sidney et al. (2008) Immunome Res. 4:2), o la herramienta de consenso (ver Kim, et al. (2012), recurso de análisis de bases de datos de epítopos inmunitarios, NAR, que combina predicciones de cualquiera de los anteriores).

En algunos casos, la predicción del procesamiento de antígenos puede lograrse usando un algoritmo para la escisión proteosómica (PaProC). Ver Kuttler et al., J. Mol. Biol. 298 (2000), 417-429 y Nussbaum et al., Immunogenetics 53 (2001),87-94.

En algunos casos, el receptor quimérico variante, que puede ser el segundo receptor quimérico, muestra una reducción en una respuesta inmune detectable en comparación con el receptor quimérico de referencia, que puede ser el primer receptor quimérico. En algunos casos, la respuesta inmune es una respuesta inmune humoral. En algunos casos, la respuesta inmune es una respuesta inmune mediada por células. En algunos casos, la respuesta inmune se reduce más de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más. En algunos casos, la respuesta inmune se evalúa in vitro. En algunos casos, la respuesta inmune se evalúa in vivo tras la administración de un receptor quimérico a un sujeto, como la administración de células que expresan un receptor quimérico. En algunos casos, una respuesta inmune del huésped al receptor quimérico se evalúa como se describe a continuación.

II. Administración de células en terapia celular adoptiva.

Los métodos divulgados generalmente implican la administración de múltiples dosis de células que expresan moléculas recombinantes como receptores recombinantes, como CAR, otros receptores quiméricos u otros receptores de antígenos, como TCR transgénicos, a sujetos que tienen una enfermedad o afección, como un enfermedad o afección, un componente de la cual es específicamente reconocido y/o tratado por las moléculas recombinantes, por ejemplo, receptores. Las administraciones generalmente efectúan una mejora en uno o más síntomas de la enfermedad o afección y/o tratan o previenen la enfermedad o afección o síntoma de la misma.

Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un ser humano u otro animal, y típicamente es un humano. En algunos casos, el sujeto ha sido tratado con un agente terapéutico dirigido a la enfermedad o afección antes de una o más de las administraciones o dosis. En algunos aspectos, el sujeto es o se vuelve refractario o no respondedor al otro agente terapéutico. En algunos casos, el sujeto no se ha vuelto refractario o no respondedor, pero la administración de las células que expresan el segundo o posterior receptor se lleva a cabo de forma profiláctica, por ejemplo, para prevenir que el sujeto se vuelva refractario o resistente al tratamiento.

En algunos casos, el sujeto en el momento o inmediatamente antes de una o más de las administraciones tiene una enfermedad persistente o en recaída. Por ejemplo, la enfermedad puede haber recaído después del tratamiento con otra intervención terapéutica, incluyendo quimioterapia, radiación y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), por ejemplo, HSCT alogénico o se ha vuelto refractaria a dicho tratamiento. La enfermedad o afección puede haber recaído o volverse refractaria a las células de la primera administración o dosis antes de o en el momento de la segunda administración. En algunos casos, la administración trata eficazmente al sujeto a pesar de que el sujeto se ha vuelto resistente a otra terapia, como una terapia distinta de la terapia celular adoptiva, o una terapia celular adoptiva, como la primera administración de células que expresan un receptor distinto.

En algunos casos, el sujeto responde al otro agente terapéutico o la administración celular y el tratamiento con el agente terapéutico o la administración reduce la carga de enfermedad. En algunos aspectos, el sujeto responde inicialmente al agente terapéutico o la administración, pero muestra una recaída de la enfermedad o afección a lo largo del tiempo, por ejemplo, en cuyo punto se lleva a cabo la administración de la terapia celular o la segunda dosis o administración. En algunos casos, el sujeto no ha recaído. En algunas de tales casos, se determina que el sujeto tiene riesgo de recaída, como un alto riesgo de recaída y, por tanto, las células se administran de forma profiláctica, por ejemplo, para reducir la probabilidad de recaída o prevenirla.

En algunos casos, el sujeto no ha recibido tratamiento previo con otro agente terapéutico. En algunos casos, el sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan un receptor, por ejemplo, CAR, antes de la administración de la primera dosis y/o no ha recibido una dosis de células que expresan CAR u otro receptor expresado por tales células o que expresan cualquier receptor recombinante que se dirija a la misma molécula o antígeno. En algunos casos, el sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el receptor de la primera dosis antes de la administración de la primera dosis. En otros casos, se administran múltiples dosis de las células de la primera y/o la segunda administración.

Entre las enfermedades, afecciones y trastornos se encuentran los tumores, incluyendo tumores sólidos, enfermedades malignas hematológicas y melanomas, y que incluyen tumores localizados y metastásicos, enfermedades infecciosas, como infección con un virus u otro patógeno, por ejemplo, VIH, VHC, ^vH^b, CMV, VPH y enfermedades parasitarias, y enfermedades autoinmunes e inflamatorias. En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor, cáncer, enfermedad maligna, neoplasia u otra enfermedad o trastorno proliferativo. Tales enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, leucemia, linfoma, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica (LLC), LLA, linfoma no de Hodgkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, linfoma folicular refractario, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolentes, enfermedades malignas de células B, cánceres de colon, pulmón, hígado, mama, próstata, ovario, piel, melanoma, hueso, y cáncer de cerebro, cáncer de ovario, cánceres epiteliales, carcinoma de células renales, adenocarcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, cáncer colorrectal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma, osteosarcoma, sarcoma sinovial y/o mesotelioma.

En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor y el sujeto tiene una gran carga tumoral antes de la administración de la primera dosis, como un tumor sólido grande o un gran número o masa de enfermedades asociadas, por ejemplo, tumor, células. En algunos aspectos, el sujeto tiene un elevado número de metástasis y/o localización generalizada de metástasis. En algunos aspectos, la carga tumoral en el sujeto es baja y el sujeto tiene pocas metástasis. En algunos casos, el tamaño o cadencia de las dosis está determinado por la carga de enfermedad inicial en el sujeto. Por ejemplo, mientras que en algunos aspectos al sujeto se le puede administrar un número relativamente bajo de células en una primera dosis, en el contexto de carga de enfermedad más baja la dosis puede ser más alta.

En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa, como, pero no limitada a, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus Bk . En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria, como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, esclerodermia, enfermedad tiroidea autoinmune, enfermedad de Grave, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o una enfermedad o afección asociada con el trasplante.

En algunos casos, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste del receptor huérfano de tirosina quinasa RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de hepatitis B, receptor anti-folato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, OEPHa2, ErbB2, 3, o 4, FBP, receptor de aceticolina e fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, efrinaB2, CD 123, CS-1, c-Met, GD-2 y MAGE A3, CE7, Tumor 1 de Wilms (WT-1), una ciclina, como ciclina A1 (CCNA1), y/o moléculas biotiniladas y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos.

Como se usa en la presente, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la mejora o reducción completa o parcial de una enfermedad, afección o trastorno, o un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado con la misma. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no están limitados a, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. Los términos no implican necesariamente la curación completa de una enfermedad o la eliminación completa de cualquier síntoma o efecto en todos los síntomas o resultados.

Como se usa en la presente, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como cáncer). Este retraso puede ser de diferente duración, dependiendo del historial de la enfermedad y/o el individuo que se esté tratando. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, un cáncer en etapa tardía, como el desarrollo de metástasis, puede retrasarse.

"Prevenir", como se usa en la presente, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad. En algunos casos, las células y composiciones divulgadas se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

Como se usa en la presente, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad cuando se compara con las mismas condiciones, excepto por una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otra condición. Por ejemplo, las células que suprimen el crecimiento tumoral reducen la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia de las células.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación, células o composición farmacéutica, en el contexto de la administración, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones/cantidades y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado, como un resultado terapéutico o profiláctico.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica o células, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, como para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno y/o efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto y las poblaciones de células administradas. En algunos casos, los métodos divulgados implican la administración de células y/o composiciones en cantidades eficaces, por ejemplo, cantidades terapéuticamente eficaces.

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, como se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. En el contexto de una menor carga tumoral, la cantidad profilácticamente eficaz en algunos aspectos será mayor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Los métodos para la administración de células para terapia celular adoptiva son conocidos y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones divulgados. Por ejemplo, los métodos de terapia adoptiva de células T se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente de Estados Unidos N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.

8(10):577-85). Ver, por ejemplo., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia adoptiva con células T, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, con necesidad de tratamiento y las células, tras el aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.

En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, por ejemplo, la terapia adoptiva con células T, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo de un sujeto que no es un sujeto que va a recibir o que en última instancia recibe la terapia celular, por ejemplo, un primer sujeto. En tales casos, las células se administran luego a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, el primer y el segundo sujetos son genéticamente idénticos o similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.

Las células pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante infusión de bolo, mediante inyección, por ejemplo, inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjectival, inyección subconjuntival, inyección sub-Tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunos casos, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratorácica, intracraneal o subcutánea. En algunos casos, una dosis determinada se administra mediante una única administración en bolo de las células. En algunos casos, se administra mediante múltiples administraciones en bolo de las células, por ejemplo, durante un período de no más de 3 días, o mediante administración por infusión continua de las células.

Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de células o receptores recombinantes, la gravedad y el curso de la enfermedad, si las células se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del sujeto y la respuesta a las células, y la discreción del médico tratante. En algunos casos, las composiciones y las células se administran adecuadamente al sujeto de una vez o durante una serie de tratamientos.

En algunos casos, las células se administran como parte de un tratamiento de combinación, como simultáneamente o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, como un anticuerpo o célula o receptor modificado u otro agente, como un agente citotóxico o terapéutico. Por tanto, las células en algunos casos se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cercana en el tiempo como para que las poblaciones celulares mejoren el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las células se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, las células se administran después del uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos el uno o más agentes adicionales incluyen una citoquina, como IL-2 u otra citoquina, por ejemplo, para mejorar la persistencia.

En algunos casos, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico acondicionador, por ejemplo, para reducir la carga tumoral antes de las administraciones de dosis.

Una vez que las células se administran al sujeto (por ejemplo, un humano), la actividad biológica de las poblaciones de células modificadas en algunos aspectos se mide mediante cualquiera de varios métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o modificada u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, por ejemplo, mediante imagenología, o ex vivo, por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células modificadas para destruir células objetivo puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos en, por ejemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7):689-702 (2009) y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1):25-40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células también puede medirse ensayando la expresión y/o secreción de ciertas citoquinas, como CD 107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral. En algunos aspectos, se evalúan los resultados tóxicos, la persistencia y/o expansión de las células y/o la presencia o ausencia de una respuesta inmune del huésped.

En ciertos casos, las células manipuladas se modifican de diversas formas, de tal manera que se aumenta su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, los CAR o TCR modificados expresados por la población pueden conjugarse directa o indirectamente a través de un conector a una fracción de direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, CAR o TCR, a fracciones de direccionamiento es conocida en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) y la Patente de Estados Unidos 5.087.616. MI. Receptores recombinantes expresados por las células

Las células generalmente expresan receptores recombinantes. Los receptores expresados por las células de las diferentes dosis son típicamente distintas entre sí, por lo menos en parte. Los receptores pueden incluir receptores de antígenos, como receptores de antígenos funcionales no TCR, incluyendo receptores de antígenos quiméricos (CAR), y otros receptores de unión a antígenos, como receptores de células T transgénicas (TCR). Los receptores también pueden incluir otros receptores quiméricos, como receptores que se unen a ligandos particulares y que tienen dominios de señalización transmembrana y/o intracelulares similares a los presentes en un CAR.

Los receptores de antígenos ejemplares, incluidos los CAR, y los métodos para modificar e introducir tales receptores en las células, incluyen los descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional con números de publicación WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos N° US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N° 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, y 8.479.118, y la Solicitud de Patente Europea N° EP2537416, y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. abril 2013; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo 2012 18(2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígeno incluyen un CAR como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO/2014055668 A1. Los ejemplos de los CAR incluyen los CAR que se divulgan en cualquiera de las publicaciones mencionadas anteriormente, como WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, la Patente de Estados Unidos N°: 7.446.190, la Patente de Estados Unidos N° 8.389.282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother.

35(9): 689-701; y Brentjens et al., Sci TranslMed. 2013 5(177). Ver también la Publicación de Patente Internacional N° WO2014031687, las Patentes de Estados Unidos N° 8.339.645, 7.446.179, 7.446.190 y 8.389.282, y la Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° US 2013/0149337. Entre los receptores quiméricos se encuentran los receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los receptores quiméricos, como los CAR, generalmente incluyen un dominio de unión al antígeno extracelular, como una porción de una molécula de anticuerpo, generalmente una región de cadena pesada variable (V^h) y/o una región de cadena ligera variable (V^l) del anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo scFv.

En algunos casos, el dominio(s) de unión, por ejemplo, el anticuerpo, por ejemplo, el fragmento de anticuerpo, la porción del receptor recombinante incluye además por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, como una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra de IgG4 y/o una región CH1/CL y/o Fc. En algunos casos, la región o porción constante es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos aspectos, la porción de la región constante sirve como una región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una capacidad de respuesta aumentada de la célula después de la unión del antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. Los espaciadores ejemplares, por ejemplo, regiones de bisagra, incluyen los descritos en la publicación de la solicitud de patente internacional N° WO2014031687. En algunos ejemplos, el espaciador tiene aproximadamente 12 aminoácidos de longitud o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen aquellos que tienen por lo menos aproximadamente de 10 a 229 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 200 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 175 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 150 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 125 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 100 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 75 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 50 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 40 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 30 aminoácidos, aproximadamente de 10 a 20 aminoácidos o aproximadamente de 10 a 15 aminoácidos, e incluyendo cualquier número entero entre los puntos finales de cualquiera de los intervalos enumerados. En algunos casos, una región espaciadora tiene aproximadamente 12 aminoácidos o menos, aproximadamente 119 aminoácidos o menos, o aproximadamente 229 aminoácidos o menos. Los espaciadores ejemplares incluyen bisagra de IgG4 sola, bisagra de IgG4 unida a los dominios CH2 y CH3, o bisagra de IgG4 unida al dominio CH3. Los espaciadores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, número de publicación de solicitud de patente internacional WO2014031687, Patente de Estados Unidos N° 8.822.647 o Solicitud Publicada. N° US2014/0271635.

En algunos casos, la región constante o porción es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCP (expuesta en la SEQ ID NO: 1), y está codificado por la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 158. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 107. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 108. En algunos casos, la región constante o porción es de IgD. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 109. En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 107, 108 o 109.

Este dominio de reconocimiento de antígeno generalmente está enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo de receptor de antígeno, como un complejo de TCR, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. La señal puede ser inmunoestimuladora y/o coestimuladora en algunos casos. En algunos casos, puede ser supresora, por ejemplo, inmunosupresora. Por tanto, en algunos casos, el componente de unión a antígeno (por ejemplo, Anticuerpo) está enlazado a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelulares. En algunos casos, el dominio transmembrana se fusiona con el dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana de superficie o unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo del receptor.

El dominio transmembrana en algunos casos se deriva de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen las derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región(es) transmembrana de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154 y/o regiones transmembrana que contienen variantes funcionales de las mismas como aquellas que retienen una porción sustancial de las propiedades estructurales, por ejemplo, transmembrana de las mismas. En algunos casos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana derivado de CD4, CD28 o CD8, por ejemplo, CD8alfa, o una variante funcional del mismo. El dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende predominantemente residuos hidrófobos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace se realiza mediante conectores, espaciadores y/o dominio(s) transmembrana.

Entre los dominios de señalización intracelular se encuentran aquellos que imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunos casos, un conector oligo o polipéptido corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, doblete de glicina-serina, está presente y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmica del CAR.

El receptor, por ejemplo, el CAR, incluye generalmente por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo de TCR, como una cadena de CD3 de TCR que media la activación y citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta de CD3. Por tanto, en algunos aspectos, la porción de unión al antígeno se enlaza a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunos casos, el receptor, por ejemplo, CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales como el receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (Cd3-Z) receptor y de Fc y CD8, CD4, CD25 o CD16.

En algunos casos, tras la ligación del CAR u otro receptor quimérico, el dominio citoplásmico o el dominio de señalización intracelular del receptor activa por lo menos una de las funciones efectoras o respuestas normales de la célula inmunitaria, por ejemplo, células T modificadas para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T auxiliar, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunos casos, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de la función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también las de los correceptores que en el contexto natural actúan en combinación con tales receptores para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento del antígeno al receptor.

En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, un CAR adicional se expresa en la misma celda y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.

La activación de las células T se describe en algunos aspectos como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmática primarias) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos de tales componentes de señalización.

En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplásmica primaria derivada de una molécula o dominio de señalización que promueve la activación primaria de un complejo de TCR en un entorno natural. Las secuencias de señalización citoplásmica primarias que actúan de manera estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM. Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmica primarias incluyen aquellos derivados de la cadena zeta de CD3, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunos casos, la molécula(s) de señalización citoplásmica en el CAR contiene un dominio de señalización citoplásmico, porción del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador.

En algunos casos, el dominio de activación se incluye dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador lo proporciona otro CAR que reconoce otro antígeno, presente en la misma célula. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores, CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver WO2014/055668). En algunos aspectos, las células incluyen uno o más CAR estimuladores o activadores y/o un CAR coestimulador. En algunos casos, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, ver Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del asociado con y/o específico para la enfermedad o afección mediante el cual una señal de activación suministrada a través del ^cA^rque se dirige a la enfermedad se reduce o inhibe mediante la unión del CAR inhibidor a su ligando, por ejemplo, para reducir los efectos fuera del objetivo.

En algunos casos, el componente de señalización intracelular del receptor recombinante, como CAR, comprende un dominio intracelular CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización y transmembrana de CD28 enlazado a un dominio intracelular de CD3 (por ejemplo, CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores c D28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9) quiméricos, enlazados a un dominio intracelular CD3 zeta.

En algunos casos, el CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo, dominio de activación primario, en la porción citoplásmica. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.

En algunos casos, el receptor CAR u otro receptor de antígeno incluye además un marcador, como un marcador de superficie celular, que puede usarse para confirmar la transducción o modificación de la célula para expresar el receptor, como una versión truncada de un receptor de superficie celular, como EGFR truncado (tEGFR). En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo, forma truncada) de CD34, un NGFR, o receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, tEGFR). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia conectora, puede ser cualquiera de los divulgados en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, enlazado a una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible T2A. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (por ejemplo, tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 111o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 111. Una secuencia conectora de T2A ejemplar comprende la secuencia de amino ácidos expuesta en la SEQ ID NO: 110 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 110.

En algunos casos, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una porción de las mismas.

En algunos casos, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo, una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunológico del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.

En algunos casos, el marcador no tiene ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto que no sea el de usarse como marcador para ingeniería genética, por ejemplo, para seleccionar células diseñadas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que ejerce de otra manera algún efecto deseado, como un ligando para una célula que se encontrará in vivo, como una molécula coestimuladora o de punto de control inmune para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.

En algunos casos, los CAR se denominan CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es uno que proporciona únicamente una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es uno que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como una que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD 137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación es aquel que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene un dominio de unión a antígeno, como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, como un scFv o Fv. En algunos aspectos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv y el dominio intracelular contiene un ITAM. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. El dominio extracelular y el dominio transmembrana pueden enlazarse directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y la transmembrana están enlazados por un espaciador, como cualquiera de los descritos en la presente. En algunos casos, el receptor contiene una porción extracelular de la molécula de la que se deriva el dominio transmembrana, como una porción extracelular de CD28. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular derivado de una molécula coestimuladora de células T o una variante funcional del mismo, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41BB.

Por ejemplo, en algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de ^cD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de CD28 o variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de ^cD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1BB o variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunas de tales casos, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, como una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, como un espaciador solo bisagra.

En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, es o incluye un dominio transmembrana de CD28 humano (por ejemplo, N° de Registro P01747.1) o una variante del mismo, como un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; en algunos casos, la porción que contiene el dominio transmembrana del receptor recombinante comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 104 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos o aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los mismos.

En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41BB.

En algunos casos, el componente(s) de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, contiene un dominio de señalización coestimuladora intracelular de CD28 humano o una variante funcional o porción del mismo, como un dominio con una sustitución de LL a GG en las posiciones 186-187 de una proteína CD28 nativa. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 112 o 113 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 112 o 113. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimuladora intracelular de 4-1BB (por ejemplo, (N° de registro Q07011.1) o variante funcional o parte del mismo, como la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.

En algunos casos, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, comprende un dominio de señalización estimulante de CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplasmático 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de registro).: P20963.2) o un dominio de señalización c D3 zeta como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190 o la Patente de Estados Unidos N° 8.911.993. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, 105 o 159 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, 105 o 159.

En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región de bisagra de una IgG, como solo una bisagra de IgG4 o IgG1, como el espaciador de solo bisagra expuesto en la SEQ ID NO: 1. En otros casos, el espaciador es o contiene una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra derivada de IgG4, opcionalmente enlazada a los dominios CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, enlazada a los dominios CH2 y CH3, como se expone en la SEC ID NO: 108. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, unida a un dominio CH3 solamente, como se expone en la SEQ ID NO: 107. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible como conectores flexibles conocidos.

Por ejemplo, en algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo como un fragmento de anticuerpo, incluyendo scFv, un espaciador, como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, como una región bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de la cadena pesada, como un espaciador que contiene bisagra de Ig, un dominio transmembrana que contiene todo o una parte de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización CD3 zeta. En algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo o fragmento, como scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra de Ig, un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB y un dominio de señalización derivado CD3 zeta.

En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican tales construcciones de CAR incluyen además una secuencia que codifica un elemento de omisión ribosómico T2A y/o una secuencia de tEGFR, por ejemplo, en sentido descendente de la secuencia que codifica CAR. En algunos casos, la secuencia codifica un elemento de omisión ribosómico T2A expuesto en la SEQ ID NO: 110, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 110. En algunos casos, también pueden generarse células T que expresan un receptor de antígeno (por ejemplo, CAR) para expresar un EGFR truncado (EGFRt) como un epítopo de selección no inmunogénico (por ejemplo, mediante la introducción de un constructo que codifica CAR y EGFRt separados por un interruptor de ribosoma T2A para expresar dos proteínas del mismo constructo), que luego puede usarse como marcador para detectar tales células (ver por ejemplo la Patente de Estados Unidos N° 8.802.374). En algunos casos, la secuencia codifica una secuencia de tEGFR expuesta en la SEQ ID NO: 111, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 111.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima. Los polipéptidos, incluyendo los receptores divulgados y otros polipéptidos, por ejemplo, conectores o péptidos, pueden incluir residuos de aminoácidos que incluyen residuos de aminoácidos naturales y/o no naturales. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación y fosforilación. En algunos aspectos, los polipéptidos pueden contener modificaciones con respecto a una secuencia nativa o natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, como por mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación por PCR.

Los receptores recombinantes, como los CAR, expresados por las células administradas al sujeto en las varias dosis, generalmente reconocen o se unen específicamente a una molécula que se expresa en, está asociada con y/o es específica para la enfermedad o afección o células de las mismas que se están tratando. Tras la unión específica a la molécula, por ejemplo, el antígeno, el receptor generalmente entrega una señal inmunoestimuladora, como una señal transducida por iTa M, en la célula, promoviendo de este modo una respuesta inmune dirigida a la enfermedad o afección. Por ejemplo, en algunos casos, las células en la primera dosis expresan un receptor, por ejemplo, CAR, que se une específicamente a un antígeno expresado por una célula o tejido de la enfermedad o afección o asociado con la enfermedad o afección.

En algunos casos, las células en la dosis posterior expresan un receptor, por ejemplo, CAR, que se une específicamente a un antígeno expresado por una célula o tejido de la enfermedad o afección o asociado con la enfermedad o afección. En algunos aspectos, el receptor expresado por las células de la segunda dosis se une específicamente al mismo antígeno que, o compite por unirse con, el receptor de la primera dosis. En otros casos, el receptor expresado por las células de la segunda dosis se une específicamente a un antígeno diferente al que se une el receptor de la primera dosis.

Por tanto, en algunos casos, el segundo receptor (por ejemplo, el segundo CAR) difiere en cierto grado, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos y/o epítopo(s) inmunológico, del primer receptor (por ejemplo, primer CAR). Por ejemplo, en algunos aspectos, el receptor, por ejemplo el CAR, expresado por las células administradas en la primera dosis contiene por lo menos un epítopo inmunorreactivo que no es expresado por las células de la dosis posterior. En algunos casos, el receptor, por ejemplo el CAR, expresado por las células de la segunda dosis, no contiene un epítopo inmunorreactivo expresado por las células de la primera dosis. Los epítopos inmunorreactivos ejemplares incluyen epítopos de células B y epítopos de células T, que pueden ser reconocidos por el sistema inmunológico del sujeto al que se administran las células.

Por tanto, en algunos casos, uno o más componentes del CAR de la dosis posterior es distinto del CAR de la primera dosis. En algunos casos, el segundo (o posterior) receptor, por ejemplo, CAR, incluye una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con el primer o anterior receptor. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR expresado por las células de la dosis posterior contiene un scFv distinto, dominios de señalización distintos y/o uniones distintas en comparación con el CAR expresado por las células de la primera dosis. En algunos casos, las secuencias en el primer y/o segundo receptor u otra molécula que no son endógenas para el huésped, por ejemplo, no están presentes como tales en una molécula presente de forma natural en el huésped. Ejemplos de tales secuencias no endógenas son secuencias que abarcan las uniones de dominios fusionados o no asociados naturalmente dentro de una molécula quimérica, como un CAR. En algunos casos, el CAR expresado por las células de la dosis posterior contiene dominios coestimuladores, estimuladores, transmembrana y/u otros distintos de los de la primera dosis.

Tales diferencias pueden incluir por lo menos una diferencia en comparación con una región del primer o anterior receptor para el que se muestra una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la primera o anterior administración, por ejemplo, una diferencia en una región en el segundo o posterior receptor que corresponde a dicha región en el primer o anterior receptor. Las regiones que incluyen las diferencias pueden incluir una porción de unión a antígeno, como una porción de scFv, incluyendo las regiones marco dentro de un scFv o porción de región variable, como una porción de región variable de la cadena pesada y/o ligera, una porción conectora, una porción de bisagra, una unión entre dos dominios CAR y/o un marcador de transducción o expresión.

En algunos casos, el primer u otros receptores anteriores y segundos u otros posteriores pueden incluir regiones de similitud, por ejemplo, regiones de identidad de secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, en algunos casos, el CAR expresado por las células de la dosis posterior contiene el mismo scFv, los mismos dominios de señalización y/o las mismas uniones que el CAR expresado por las células de la primera dosis. En algunos casos, contiene además los mismos dominios coestimuladores, estimuladores, transmembrana y/u otros que el de la primera dosis.

En algunos aspectos, la región(es) de identidad es aquella en la que el sujeto no muestra o es poco probable que muestre una respuesta inmune después de la primera o anterior administración. Tales regiones pueden incluir regiones dentro de un dominio coestimulador, un dominio que contiene ITAM, un dominio transmembrana, una CDR y/o un marcador de transducción o expresión.

En algunos aspectos, los dominios de unión a antígeno, como el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo y/o dominios de los mismos, por ejemplo, regiones variables de la cadena ligera y/o pesada, por ejemplo, scFv, del segundo receptor, por ejemplo segundo CAR, son o se derivan de una especie diferente a la del primer receptor, por ejemplo, el primer CAR. Las especies ejemplares de las que pueden derivarse tales dominios o fragmentos incluyen especies humanas y no humanas, como el ratón. Por ejemplo, en algunos casos, un scFv de un primer o anterior ^cA^rse deriva de un anticuerpo de ratón o un anticuerpo con una porción derivada de murino, como un scFv FMC63 o SJ25C1, y el scFv del segundo o posterior CAR se deriva de un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo, o viceversa.

En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, por ejemplo, la porción o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, scFv, del primer CAR y la del segundo CAR se derivan de la misma especie. En algunas de tales casos, el dominio del primer y el segundo receptores se deriva de la misma especie pero contiene una o más diferencias en la secuencia. En algunos aspectos, el scFv del primer CAR se deriva de una secuencia de ratón, por ejemplo, FMC63, y el scFv del segundo CAR se deriva de una secuencia de ratón distinta, por ejemplo, SJ25C1, o viceversa.

En algunos aspectos, el receptor, por ejemplo CAR, de la segunda dosis contiene el mismo dominio de unión a antígeno, por ejemplo, fragmento o porción de anticuerpo, por ejemplo, scFv, que el receptor, por ejemplo, CAR, de la primera dosis. En algunos casos, tal receptor posterior o segundo contiene una o más regiones de unión distintas en comparación con el CAR de la primera o anterior dosis.

En algunas de tales casos, la administración de células que expresan el segundo o posterior CAR da como resultado una eliminación reducida de las células de la segunda o posterior dosis en comparación con un método en el que el segundo CAR contiene la misma unión o uniones que las células de la primera dosis y/o contiene secuencias no endógenas presentes en el receptor de la primera dosis.

En algunos aspectos, el primer y el segundo receptor se dirigen al mismo antígeno. En algunos casos, el primer y el segundo receptor se dirigen al mismo epítopo del antígeno. Por ejemplo, en algunos casos, el primer y el segundo receptor se dirigen al mismo epítopo o uno superpuesto y/o compiten por unirse al antígeno entre sí, pero se derivan de especies diferentes, como de ratón y de humano, respectivamente. En otros casos, el primer y el segundo receptor se dirigen a diferentes epítopos del mismo antígeno.

En algunos casos, la segunda molécula, por ejemplo, el receptor, por ejemplo, CAR, no incluye una o más porciones inmunogénicas contenidas en la primera; en algunos casos, el segundo receptor no contiene ninguna porción inmunogénica en el primer receptor (o porciones consideradas inmunogénicas por un ensayo específico). En algunos de tales casos, el segundo receptor, por ejemplo, CAR, se elige y/o diseña específicamente de tal manera que no incluya una porción inmunogénica contenida en el primer receptor y/o no contenga una porción considerada inmunogénica, por ejemplo, en un sujeto particular y/o al que se ha detectado una respuesta inmune específica, por ejemplo, en el sujeto que está siendo tratado. En algunos aspectos, las porciones inmunogénicas del primer receptor, por ejemplo, ^cA^r, han sido reemplazadas con una secuencia distinta o secuencias distintas.

En algunos casos, como cuando el sujeto se ha vuelto resistente al tratamiento dirigido al antígeno u otro compañero de unión dirigido por el primer receptor o molécula, y/o cuando el antígeno o compañero de unión está o ha sido regulado por disminución o mutado en el sujeto o tejido enfermo (por ejemplo, tumor), el receptor (por ejemplo, CAR) de la segunda dosis se diseña o se elige para dirigirse a un antígeno distinto en comparación con el objetivo del receptor de la primera dosis. En algunos de tales aspectos, la administración de la segunda dosis (es decir, las células que expresan la segunda molécula, por ejemplo, el segundo receptor) produce una mayor reducción de la carga de enfermedad en el sujeto, por ejemplo, carga tumoral, que la administración de una dosis posterior de las mismas células, células que expresan el mismo receptor y/o que contienen células que expresan un receptor que se dirige al mismo antígeno.

A este respecto, los métodos en algunos casos pueden ser útiles en el tratamiento de sujetos cuya enfermedad o afección se ha vuelto resistente a tratamientos dirigidos a un epítopo o antígeno particular u otro objetivo de la enfermedad, como el resultante de una regulación por disminución o mutación por la enfermedad o afección o células de la misma. Por tanto, al ofrecer la capacidad de dirigirse a un epítopo asociado a una enfermedad o enfermedad similar pero distinta, los métodos en algunos casos mejoran la eficacia no solo aumentando la exposición general del sujeto a las células que expresan los receptores u otras moléculas recombinantes, por ejemplo, mediante una expansión aumentada o la persistencia de tales células modificadas en el sujeto, sino también permitiendo que las células funcionen incluso en el contexto de regulación por disminución o mutación del objetivo original.

IV. Respuestas inmunes del huésped a las células administradas

En algunos casos, la eficacia de la terapia celular adoptiva puede estar limitada por el desarrollo de una respuesta inmune en el sujeto a las células y/o constructo administrados. Se observa en la presente que incluso en ciertos sujetos que tienen enfermedades malignas de células B, que a menudo están inmunodeprimidos, pueden detectarse respuestas inmunes que son específicas para regiones de receptores expresados por células administradas en terapia celular adoptiva. Adicionalmente, en algunos contextos, puede producirse la pérdida, la regulación por disminución y/o la modificación de un antígeno específico de la enfermedad o asociado a la enfermedad al que se dirige la terapia celular en un sujeto, lo que puede deteriorar la eficacia de la terapia dirigida a ese antígeno o epítopo. Por ejemplo, se ha observado enfermedad negativa para CD19 en ciertos sujetos que han sido tratados con inmunoterapia anti-CD 19. En algunos casos, los métodos divulgados proporcionan eficacia mejorada en uno o más de tales contextos.

En algunos casos de los métodos divulgados, una o más de las dosis o administraciones, por ejemplo, las dosis(s) o la administración posteriores de células que expresan el segundo receptor, se administra en un momento en el que una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta inmune adaptativa o específica para el primer receptor recombinante y/o células, está presente, es detectable o detectable por encima de un cierto nivel en el sujeto. La presencia o el grado de una respuesta inmune específica a la molécula recombinante puede estar relacionada con las propiedades inmunogénicas del receptor, por ejemplo, el CAR o TCR transgénico, expresado por las células, y/o el tiempo durante el cual el sujeto ha estado expuesto a las mismas. Por ejemplo, en algunos casos, una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta inmune humoral y/o mediada por células específica contra el receptor, se detecta a o aproximadamente a los 28 días, a o aproximadamente a los 35 días, o a o aproximadamente a los 42 días después de la primera exposición del sujeto a las células que expresan el primer receptor. Por tanto, en algunos casos, la dosis posterior de células que expresan el receptor que no expresan el receptor expresado por las células de la primera dosis, se administra después de una respuesta inmune, una respuesta inmune adaptativa o específica, una respuesta inmune detectable, y/o se ha desarrollado en el sujeto una respuesta de memoria contra el primer receptor o células recombinantes de la primera o anterior dosis. A este respecto, la capacidad de las células de la dosis posterior para expandirse y/o persistir en el sujeto se mejora en comparación con otros métodos en los que las células de la dosis posterior expresan el mismo receptor que la primera dosis. En algunos casos, la segunda o posterior dosis se administra en un momento temporal que es por lo menos o es mayor que o aproximadamente 28 días, 35 días o 42 días. En algunos casos, se administra de o aproximadamente en o por lo menos de o aproximadamente en 14 o 21 días.

Los métodos pueden implicar la detección de la presencia o ausencia o nivel de tal respuesta inmune o indicador de la misma, por ejemplo, después de la administración de una primera o segunda dosis y antes de la administración de la dosis posterior o la siguiente posterior.

En algunos casos, la decisión de cuándo y/o si administrar la dosis posterior depende de si el sujeto muestra dicha respuesta inmune o una lectura detectable de la misma, por ejemplo, una respuesta inmune del huésped específica o adaptativa detectable específica para las células o receptor recombinante, por ejemplo, CAR, expresada por las células de la primera dosis, y/o si dicha respuesta se detecta por encima de un cierto nivel. En algunos casos, cuando se detecta tal respuesta, al sujeto se le administra la dosis posterior.

En general, la dosis posterior se administra en un momento en el que el sujeto muestra una respuesta inmune específica o adaptativa, por ejemplo humoral o mediada por células, contra el receptor, por ejemplo, CAR, expresado por las células de la primera dosis, o muestra tal respuesta o indicador de la misma en un nivel detectable o por encima de un nivel aceptable. En algunos aspectos, en el momento de la administración de la dosis posterior, el sujeto muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células contra el receptor, por ejemplo, CAR, expresada por las células de la primera dosis.

En algunos casos, la respuesta inmune del huésped es o comprende una respuesta inmune humoral. La respuesta inmune humoral puede estar indicada por la presencia de anticuerpos específicos para las células o receptores expresados por ellas en el suero, otro fluido corporal y/u órgano o tejido del sujeto. En algunos casos, están presentes tales anticuerpos de un isotipo particular como IgM o IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4; en algunos casos incluyen IgE.

En algunos casos, la respuesta inmune es o comprende un componente mediado por células. Una respuesta mediada por células puede estar indicada por la presencia de células, por ejemplo, células T, por ejemplo, células T auxiliares o citotóxicas, que reconocen específicamente uno o más epítopos del receptor o células recombinantes a través de un receptor de células T.

En algunos casos, la respuesta inmune es una respuesta inmune primaria; en algunos aspectos, la respuesta inmune es una respuesta de memoria.

En algunos de cualquiera de los casos anteriores, una respuesta inmune detectable se refiere a una cantidad detectable por cualquiera de una serie de métodos conocidos para evaluar respuestas inmunes específicas a antígenos y células particulares. Por ejemplo, en algunos casos, la respuesta inmune del tipo especificado es detectable realizando ELISpot, ELISAs o métodos de detección de anticuerpos basados en células, por ejemplo, mediante citometría de flujo, en suero del sujeto para detectar la presencia de anticuerpos que se unen específicamente y/o neutralizan los antígenos presentes en las células, por ejemplo, unión a los epítopos del receptor recombinante, por ejemplo, CAR. En algunos de estos ensayos, se determina el isotipo del anticuerpo detectado y puede indicar el tipo de respuesta y/o si la respuesta es una respuesta de memoria.

En algunos casos, la respuesta inmune especificada es detectable mediante ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) para la detección de células T CD8 que se unen específicamente e inducen citotoxicidad en respuesta a epítopos en el receptor recombinante y/o una reacción de linfocitos mixta, usando células, por ejemplo, células irradiadas, que expresan el receptor recombinante, como células estimuladoras.

En algunos aspectos, la respuesta inmune detectable es aquella que se detecta mediante dicho método por encima o significativamente por encima del nivel de una muestra de control, como un pocillo no recubierto o pocillo recubierto con un péptido de control o células que no expresan el receptor recombinante y/o niveles detectados en base al tratamiento previo a la muestra de sangre o suero del sujeto antes del tratamiento con las células que expresan los receptores recombinantes.

En algunos aspectos, la presencia o ausencia de dicha respuesta inmune del huésped y/o la cantidad, grado o extensión de la misma, se detecta o mide, por ejemplo, después de la administración de la primera dosis o dosis posteriores.

Las respuestas inmunes humorales pueden detectarse mediante cualquiera de una serie de ensayos bien conocidos para la detección de anticuerpos específicos para antígenos o células particulares, incluyendo ensayos de unión, inmunoensayos e incluyendo ensayos basados en células. Los ensayos pueden incluir aquellos diseñados para evaluar la presencia o ausencia de funciones particulares de los anticuerpos, como su capacidad para llevar a cabo una función efectora particular tras unirse al antígeno, como ensayos de anticuerpos neutralizantes. En algunos casos, los resultados de las respuestas inmunes humorales, como anticuerpos específicos de antígeno, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes, se detectan usando ensayos basados en células, por ejemplo, incubando células antes y después del tratamiento del sujeto con células que expresan el receptor recombinante. (y células de control) y detectando la unión específica de antígeno y/u otros resultados, como neutralizar los resultados, por ejemplo, mediante citometría de flujo o ensayos enzimáticos. En algunos casos, se usan ensayos ELISA y/o ELISpot para detectar y cuantificar anticuerpos específicos para los receptores recombinantes, como los CAR, y los epítopos mapeados usando técnicas conocidas, como las que usan péptidos individuales que representan porciones del receptor. Ver, por ejemplo, Blood. marzo de 2006; 107(6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. enero de 2001 75(2): 799 808, Riddell et al. Nature Medicine. febrero de 19962(2): 216-223, Berger et al. Blood. febrero de 2005105(4): 1640 1647, Jensen etal. Biol Blood Marrow Transplant. septiembre de 2010; 16(9): 1245-1256. En algunos casos se evalúa el isotipo de los anticuerpos detectados, por ejemplo, usando anticuerpos de detección específicos para isotipos particulares, por ejemplo, isotipos humanos.

La respuesta inmune celular o basada en células a las células y/o receptores puede detectarse y/o medirse usando cualquiera de varias técnicas bien conocidas. Tales técnicas pueden incluir ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) para la detección de células T CD8+ que se unen específicamente e inducen citotoxicidad en respuesta a epítopos en el receptor recombinante, por ejemplo, CAR, y/o células administradas. En algunos casos, el ensayo es una reacción de linfocitos mixta, como las que usan PBMC u otras células derivadas del huésped de la sangre u otro órgano o tejido como células respondedoras, y células inducidas para expresar el receptor recombinante, por ejemplo, células T irradiadas que expresan el CAR, como células estimuladoras. Las células estimulantes son generalmente autólogas y pueden ser las mismas células administradas al sujeto y pueden irradiarse. Las células no transducidas o las células que no expresan el transgén de interés pueden usarse como controles negativos en lugar de las células estimuladoras en las muestras de control. De igual manera, las muestras de células respondedoras de puntos temporales pretratados u otros sujetos pueden usarse en muestras de control. En algunos aspectos, tales ensayos evalúan la capacidad de las células huésped para llevar a cabo una o más funciones efectoras, por ejemplo, lisis celular específica del antígeno, por ejemplo, usando un ensayo de liberación de cromo para detectar células T citotóxicas presentes en el sujeto que reconocen específicamente antígenos presentes sobre o en las células administradas e inducen una respuesta citotóxica. En algunos casos, las células de sangre periférica, por ejemplo, PBMC, se obtienen de un sujeto antes y después de la administración de las células, y cada una se usa en un ensayo, como un ensayo de lisis celular, usando células T autólogas modificadas para expresar el receptor recombinante, que generalmente se irradian. La lisis específica indica la presencia de una respuesta inmune mediada por células específicas del receptor. El mapeo de epítopos puede llevarse a cabo usando paneles de péptidos que representan porciones del receptor recombinante. Ver, por ejemplo, Berger et al. Blood. marzo de 2006; 107(6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. enero de 2001 75(2):799-808, Riddell et al. Nature Medicine. febrero de 19962(2): 216-223, Berger et al. Blood. febrero de 2005 105(4):1640-1647, Lamers, Blood 2011 117: 72 82. Pueden usarse ensayos de unión de tetrámero de HLA para la enumeración de células T específicas de antígenos. En algunos aspectos, se usan ensayos linfoproliferativos (LPA) y/o ensayos para evaluar las citoquinas secretadas, como ELISA y/o tinción intracelular y evaluación por citometría de flujo, para la detección de células T CD4+ específicas de transgenes.

En algunos casos, la presencia o ausencia de una respuesta inmune específica contra las células o el receptor en el sujeto se evalúa, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos descritos en la presente, por ejemplo, mapeo de epítopos. En algunos aspectos, se determinan los epítopos y/o regiones inmunogénicas dentro del primer receptor, por ejemplo, para los que se ha desarrollado una respuesta inmune o es probable que se haya desarrollado en el sujeto después de la primera administración, y se elige un segundo receptor que no contenga tales epítopos o regiones inmunogénicas y/o que contenga diferencias de aminoácidos en dichas regiones.

En algunos casos, se detecta la presencia o ausencia de dicha respuesta inmune después de la primera o anterior administración, e informa qué diferencias están diseñadas para estar presentes en el segundo o posterior receptor en comparación con el primero o anterior receptor. Tal detección puede incluir identificar por lo menos una región del primer o de otra manera anterior receptor (por ejemplo, CAR) para el que el sujeto muestra una respuesta inmune específica.

Por tanto, en algunos casos, las células de la segunda dosis se seleccionan en base al receptor que expresan. En algunos casos, la segunda dosis contiene células que expresan un receptor (por ejemplo, CAR) que no contiene un epítopo inmunorreactivo particular para el cual el sujeto ha desarrollado una respuesta inmune después de la administración de la primera o anterior dosis y/o no contiene ninguno de tales epítopos inmunorreactivos o cualquier epítopo que se determine que es inmunogénico. En algunos aspectos, a un sujeto se le puede administrar una segunda o posterior dosis de células que expresan un receptor que es distinto del receptor expresado por las células de la primera dosis en una o más regiones que se ha determino que son inmunogénicas. Por tanto, en algunos casos, la selección de las células que expresan el receptor a administrar en la segunda (u otra posterior) dosis es específica del paciente.

En algunos casos, la administración de la segunda dosis que contiene células que expresan un receptor, por ejemplo CAR, que es distinto del receptor expresado por las células de la primera dosis, no provoca una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable específica para el receptor de la primera dosis. En algunos aspectos, la segunda dosis no provoca una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable contra el receptor expresado por las células de la segunda dosis.

Por tanto, en algunos casos, el sujeto no muestra una respuesta inmune, como una respuesta inmune detectable, por ejemplo, una respuesta inmune humoral o mediada por células, contra el segundo receptor después de la administración de las células que expresan el segundo receptor, o no muestra tal respuesta dentro de un cierto período de tiempo, como en el plazo de aproximadamente 60 días de la administración de esas células.

En algunos casos, el método evita la inducción de o reduce el nivel de anticuerpos contra el receptor expresado por las células de la segunda dosis. Por ejemplo, los títulos de anticuerpos de anti-receptor, por ejemplo anticuerpos anti-CAR, por ejemplo, medidos en el suero del sujeto mediante ELISA, disminuyen tras la administración de la dosis posterior, en comparación con los métodos en los que se administra una dosis posterior de células que expresan el mismo receptor que las células de la primera dosis. Por tanto, en algunos casos, los métodos mejoran la eficacia aumentando la exposición del sujeto a las células administradas previniendo o reduciendo las respuestas inmunes del huésped que de otro modo depurarían o evitarían la expansión de las células administradas.

V. Dosificación

Los métodos generalmente están diseñados para mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva, por ejemplo, proporcionando una exposición aumentada del sujeto a las células, por ejemplo, a lo largo del tiempo. Los métodos implican la administración de una primera dosis, generalmente seguida de una segunda y/o una o más dosis posteriores adicionales, con marcos temporales particulares entre ciertas dosis diferentes.

En el contexto de la terapia celular adoptiva, la administración de una "dosis" dada abarca la administración de la cantidad dada o el número de células como una única composición y/o una única administración ininterrumpida, por ejemplo, como una única inyección o infusión continua, y también abarca la administración de la cantidad o número de células dados como una dosis dividida, divulgada en múltiples composiciones o infusiones individuales, durante un período de tiempo especificado, que no es más de 3 días. Por tanto, en algunos contextos, la dosis es una administración única o continua del número especificado de células, administrada o iniciada en un único punto temporal. En algunos contextos, sin embargo, la dosis se administra en múltiples inyecciones o infusiones durante un período de no más de tres días, como una vez al día durante tres días o durante dos días o mediante múltiples infusiones durante un único periodo de un día.

Por tanto, en algunos aspectos, las células se administran en una única composición farmacéutica.

En algunos casos, las células se administran en una pluralidad de composiciones, que contienen colectivamente las células de una única dosis.

El término "dosis dividida" se refiere a una dosis que se divide para que se administre en más de una infusión, por ejemplo, durante más de un día. Este tipo de dosificación está abarcado por los presentes métodos y se considera que es una dosis única. La dosis dividida se infunde durante un período de no más de tres días.

Por tanto, una o más de las dosis en algunos aspectos pueden administrarse como una dosis dividida. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis puede administrarse al sujeto durante 2 días o durante 3 días. Los métodos ejemplares para la dosificación dividida incluyen administrar el 25% de la dosis el primer día y administrar el 75% restante de la dosis el segundo día. En otros casos, el 33% de la dosis puede administrarse el primer día y el 67% restante administrarse el segundo día. En algunos aspectos, el 10% de la dosis se administra el primer día, el 30% de la dosis se administra el segundo día y el 60% de la dosis se administra el tercer día. En algunos casos, la dosis dividida no se distribuye durante más de 3 días.

En algunos casos, se administran múltiples dosis, en algunos aspectos usando las mismas pautas de cadencia que las que se refieren a la cadencia entre la primera y la segunda dosis, por ejemplo, administrando una primera y múltiples dosis posteriores, con cada dosis posterior administrada en un punto temporal que es mayor de aproximadamente 28 días después de la administración de la primera o anterior dosis.

Como se usa en la presente, "primera dosis" se usa para describir la cadencia de una dosis dada antes de la administración de una dosis posterior o segunda. El término no implica necesariamente que el sujeto nunca antes haya recibido una dosis de terapia celular o incluso que el sujeto no haya recibido antes una dosis de las mismas células o células que expresan el mismo receptor recombinante o uno diferente o que se dirijan al mismo antígeno o uno diferente. Por ejemplo, en algunos casos, la primera dosis como se usa en la presente representa la segunda o mayor infusión de las células al sujeto.

Como se usa en la presente, "segunda dosis" se usa para describir la cadencia en que una dosis dada es posterior a la administración de una dosis anterior, por ejemplo, la primera. El término no implica necesariamente que el sujeto solo haya recibido antes una dosis de terapia celular o que el sujeto solo haya recibido antes dosis de células que expresan el mismo receptor recombinante o que se dirigen al mismo antígeno. En algunos casos, se administran múltiples dosis entre la primera y la segunda dosis, y/o antes de la primera o después de la segunda dosis. Por ejemplo, pueden administrarse múltiples dosis de células de la primera dosis (o células que expresan el receptor de la primera dosis), seguidas de múltiples dosis de las células o del receptor de la segunda dosis. Los términos primero y segundo se usan simplemente para describir diferentes dosis relativas en el tiempo entre sí.

Con referencia a una dosis anterior, como una primera dosis, el término "dosis posterior" se refiere a una dosis que se administra al mismo sujeto después de la dosis anterior, por ejemplo, la primera. En algunos aspectos, la dosis posterior es la segunda, tercera, cuarta y demás. Ni el término "posterior" ni un valor numérico particular (por ejemplo, "segundo"), cuando se describe una dosis, implica la ausencia de dosis intermedias.

En algunos casos, pueden administrarse al sujeto una o más dosis consecutivas de células que expresan el mismo receptor, por ejemplo, CAR, como primera dosis.

Con referencia a una dosis anterior, como una primera dosis, el término "dosis consecutiva" se refiere a una dosis que se administra al mismo sujeto después de la dosis anterior, por ejemplo la primera, sin que se haya administrado ninguna dosis intermedia al sujeto en el ínterin. No obstante, el término no abarca la segunda, tercera y/o demás, inyección o infusión en una serie de infusiones o inyecciones comprendidas en una única dosis dividida. Por tanto, a menos que se especifique lo contrario, una segunda infusión dentro de un período de uno, dos o tres días no se considera una dosis "consecutiva" como se usa en la presente. De igual manera, una segunda, tercera y demás en la serie de dosis múltiples dentro de una dosis dividida tampoco se considera una dosis "intermedia" en el contexto del significado de dosis "consecutiva". Por tanto, a menos que se especifique lo contrario, una dosis administrada un cierto periodo de tiempo, mayor de tres días, después del inicio de un primera o anterior dosis, se considera que es una dosis “consecutiva” incluso si el sujeto recibió una segunda o posterior inyección o infusión de las células después del inicio de la primera dosis, siempre que la segunda o posterior inyección o infusión se produjese en el plazo del periodo de tres días después del inicio de la primera o anterior dosis.

Por tanto, a menos que se especifique lo contrario, las administraciones múltiples de las mismas células durante un período de hasta 3 días se considera una dosis única, y la administración de células en el plazo de 3 días desde una administración inicial no se considera una dosis consecutiva y es no se considera una dosis intermedia a los efectos de determinar si una segunda dosis es "consecutiva" a la primera. En algunos

En algunos casos, se administran múltiples dosis consecutivas. Las múltiples dosis consecutivas pueden administrarse, por ejemplo, usando las mismas pautas de cadencia que las especificadas para la cadencia entre una primera y la primera dosis consecutiva, como administrando una primera y múltiples dosis consecutivas, con cada dosis consecutiva administrada en el plazo de un período de tiempo que es mayor de aproximadamente 14 y menor de aproximadamente 28 días, por ejemplo, aproximadamente 21 días, después de la administración de la primera o inmediatamente anterior dosis. En algunos casos, con respecto a la primera dosis, las dosis consecutivas incluyen cada una las mismas células que las administradas en la primera dosis, y/o el mismo receptor recombinante expresado por las de la primera dosis. En algunas de tales casos, la administración de dichas dosis consecutivas va seguida de la administración de una segunda dosis, y en algunos casos dosis consecutivas adicionales.

Por tanto, en algunos aspectos, al sujeto se le pueden administrar múltiples dosis de células que expresan el mismo receptor. En algunos casos, al sujeto se le pueden administrar múltiples dosis consecutivas que contienen células que expresan un primer receptor antes de la posterior administración de células que expresan un receptor distinto, como antes de la administración de la segunda dosis, que en algunos casos también puede estar seguida por una administración consecutiva de células de la segunda dosis. En algunos aspectos, pueden administrarse al sujeto múltiples dosis consecutivas de células que expresan el segundo (o tercer, cuarto, quinto, y demás) receptor.

En algunos casos, por ejemplo, en el contexto de múltiples ensayos clínicos, a un sujeto se le puede administrar una primera dosis de células que expresan un receptor que se está investigando en un primer ensayo clínico y una segunda (u otra posterior) dosis de células que expresan un receptor que se está investigando en un segundo ensayo clínico.

En algunos casos, los métodos divulgados son para el tratamiento o gestión continuos o a largo plazo de la enfermedad o trastorno en el sujeto, que implican una primera, segunda, tercera y/o múltiples administraciones posteriores adicionales de células modificadas, cada una de las cuales expresa distintos receptores recombinantes dirigidos a la misma enfermedad o afección en el sujeto. Tal tratamiento o gestión a largo plazo puede implicar un proceso iterativo, en el que se monitoriza al sujeto y se introduce una siguiente administración posterior (por ejemplo, siguiente receptor posterior) si y cuando se detecta un indicador particular de pérdida de eficacia o riesgo de la misma. En algunos casos, cada administración posterior se inicia tras la detección de uno o más indicadores de un riesgo de pérdida de eficacia, como persistencia reducida, expansión, o exposición a las células en la dosis anterior, una respuesta inmune específica a las mismas en el sujeto, recaída, resistencia, y/o regulación descendente o cambio en el antígeno objetivo.

En algunos casos, la dosis posterior se administra para retratamiento tras la recaída y/o para prevenir la recurrencia de la enfermedad o trastorno objetivo, y/o para abordar o prevenir una reducción en la exposición a las células que expresan los receptores recombinantes después de una primera dosis, por ejemplo, tras la detección de una disminución en la persistencia o expansión de tales células o en el número de tales células. Por tanto, en algunos casos, uno o más de estos parámetros se miden, detectan o evalúan en el tiempo entre la primera u otra dosis anterior y la segunda u otra dosis posterior, y la cadencia o la decisión de administrar la dosis posterior se toma en base al resultado de dicha evaluación. Por ejemplo, la segunda dosis puede administrarse en un momento en el que se determina que el número o concentración de las células que expresan el receptor está por debajo de un nivel deseado o ha disminuido por debajo de un cierto porcentaje de concentración o número medidos máximos. Cantidad o tamaño de la dosificación

En algunos casos, la primera o posterior dosis contiene una serie de células, número de células que expresan receptor recombinante (por ejemplo, CAR), número de células T o número de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en el intervalo de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 de tales células por kilogramo de peso corporal del sujeto, y/o un número de tales células que no es más de aproximadamente 105 o aproximadamente 106 de tales células por kilogramo de peso corporal del sujeto. Por ejemplo, en algunos casos, la primera o posterior dosis incluye menos o no más de o aproximadamente 1 x 105, de o aproximadamente 2 x 105, de o aproximadamente 5 x 105, o de o aproximadamente 1 x 106de dichas células por kilogramo de peso corporal del sujeto. En algunos casos, la primera dosis incluye de o aproximadamente 1 x 105, de o aproximadamente 2 x 105 de o aproximadamente, 5 x 105, de o aproximadamente 1 x 106 de tales células por kilogramo de peso corporal del sujeto., o un valor dentro del intervalo entre dos cualquiera de los valores anteriores. En casos particulares, los números y/o concentraciones de células se refieren al número de células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, CAR). En otros casos, los números y/o concentraciones de células se refieren al número o concentración de todas las células, células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) administradas.

En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es un humano, la primera o posterior dosis incluye menos de aproximadamente 1 x 108 células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, CAR), células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 108 de tales células, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, o 1 x 108 de tales células totales, o el intervalo entre dos de los valores anteriores.

En algunos casos, la primera o posterior dosis contiene menos de aproximadamente 1 x 108 células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, CAR), células T, o células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) totales por m2 del sujeto, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 108 células por m2 del sujeto, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, o 1 x 108 de tales células por m2 del sujeto, o el intervalo entre dos cualquiera de los valores anteriores.

En ciertos casos, el número de células, células que expresan receptor recombinante (por ejemplo, CAR), células T, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la primera o posterior dosis es mayor de aproximadamente 1 x 106 de tales células por kilogramo de peso corporal del sujeto, por ejemplo, 2 x 106, 3 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1 x 109 o 1 x 1010 de tales células por kilogramo de peso corporal y/o,1 x 108, o 1 x 109, 1 x 1010 de tales células por m2 del sujeto o totales, o el intervalo entre dos cualesquiera de los valores anteriores.

En algunos casos, el número de células administradas en la dosis posterior es el mismo o similar al número de células administradas en la primera dosis en cualquiera de los casos de la presente, como menos o no más de o aproximadamente 1 x 105, de o aproximadamente 2 x 105, de o aproximadamente 5 x 105, o de o aproximadamente 1 x 106 de tales células por kilogramo de peso corporal del sujeto. En algunos casos, la dosis(s) posterior contiene de o aproximadamente 1 x 105, de o aproximadamente 2 x 105, de o aproximadamente 5 x 105, o de o aproximadamente 1 x 106de tales células por kilogramo de peso corporal del sujeto, o un valor dentro del intervalo entre dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, tales valores se refieren a números de células que expresan receptores recombinantes; en otros casos, se refieren al número de células T o PBMC o células totales administradas. En algunos aspectos, la dosis posterior es mayor que la primera dosis. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis posterior contiene más de aproximadamente 1 x 106 células, células que expresan receptor recombinante (por ejemplo, CAR), células T y/o PBMC por kilogramo de peso corporal del sujeto, como aproximadamente 3 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1 x 108 o 1 x 109 de dichas células por kilogramo de peso corporal del sujeto. En algunos casos, la cantidad o tamaño de la dosis posterior es suficiente para reducir la carga de enfermedad o un indicador de la misma, y/ o uno o más síntomas de la enfermedad o afección. En algunos casos, la segunda (u otra posterior) dosis es de un tamaño eficaz para mejorar la supervivencia del sujeto, por ejemplo, para inducir la supervivencia, la supervivencia sin recaídas, o la supervivencia sin eventos del sujeto durante por lo menos 6 meses o por lo menos 1, 2, 3, 4 o 5 años. En algunos casos, el número de células, células que expresan receptor recombinante (por ejemplo, CAR), células T y/o PBMC administradas y/o el número de dichas células administradas por peso corporal del sujeto en la dosis posterior es de por lo menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces o 100 veces o más que el número administrado en la primera dosis. En algunos casos, la carga de enfermedad, el tamaño del tumor, el volumen del tumor, la masa del tumor, y/o la carca o masa del tumor se reduce después de la dosis posterior en por lo menos o aproximadamente un 50, 60, 70, 80, 90% o más en comparación con la inmediatamente antes de la administración de la primera dosis o de la segunda (u otra posterior) dosis.

En otros casos, el número de células administradas en la dosis posterior es menor que el número de células administradas en la primera dosis.

En algunos casos, se administran múltiples dosis posteriores después de la primera dosis, de tal manera que se administran una dosis adicional o dosis adicionales después de la administración de la segunda (u otra posterior) dosis. En algunos aspectos, el número de células administradas al sujeto en la dosis o las dosis posteriores adicionales (es decir, la tercera, cuarta, quinta y demás) es igual o similar a la primera dosis, la segunda dosis y/u otra dosis posterior. En algunos casos, la dosis o las dosis adicionales son mayores que las dosis anteriores.

En algunos aspectos, el tamaño de la primera y/o la posterior dosis se determina en base a uno o más criterios como la respuesta del sujeto al tratamiento previo, por ejemplo, quimioterapia, carga de enfermedad en el sujeto, como carga, volumen, tamaño o grado, extensión tumoral, o tipo de metástasis, etapa y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo, CRS, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad y/o una respuesta inmune del huésped contra las células y/o receptores recombinantes que se le están administrando.

En algunos aspectos, el tamaño de la primera y/o posterior dosis está determinado por la carga de la enfermedad o afección en el sujeto. Por ejemplo, en algunos aspectos, el número de células administradas en la primera dosis se determina en base a la carga tumoral que está presente en el sujeto inmediatamente antes de la administración de la primera dosis. En algunos casos, el tamaño de la primera y/o posterior dosis se correlaciona inversamente con la carga de enfermedad. En algunos aspectos, como en el contexto de una gran carga de enfermedad, al sujeto se le administra un número bajo de células, por ejemplo menos de aproximadamente 1 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto. En otros casos, como en el contexto de una menor carga de enfermedad, al sujeto se le administra un mayor número de células, como más de aproximadamente 1 x 106 células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

En algunos aspectos, el número de células administradas en la dosis posterior se determina en base a la carga tumoral que está presente en el sujeto después de la administración de la primera dosis. En algunos casos, por ejemplo, cuando la primera dosis ha disminuido la carga de enfermedad o lo ha hecho por debajo de una cantidad o nivel umbral particular, por ejemplo, uno por encima del cual hay un mayor riesgo de resultado tóxico, la dosis posterior es grande, por ejemplo, más de 1 x 106 células (por ejemplo, células totales, células que expresan receptores, células T o PBMC) por kilogramo de peso corporal y/o es mayor que la primera dosis. En otros aspectos, el número de células administradas en la dosis posterior es bajo, por ejemplo, menos de aproximadamente 1 x 106, por ejemplo, igual o menor que la primera dosis, cuando la primera dosis ha reducido la carga tumoral en un pequeño grado o cuando la primera dosis no ha llevado a una reducción detectable de la carga tumoral.

En algunos casos, el número de células administradas en la primera dosis es menor que el número de células administradas en otros métodos, como aquellos en los que se administra una gran dosis única de células, como para administrar las células antes de que se desarrolle una respuesta inmune. Por tanto, en algunos casos, los métodos reducen la toxicidad o los resultados tóxicos en comparación con otros métodos que implican la administración de una dosis mayor.

En algunos casos, la primera dosis incluye las células en una cantidad que no provoca o reduce la probabilidad de toxicidad o resultados tóxicos, como el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), CRS grave (sCRS), síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, fiebre de o aproximadamente de por lo menos 38 grados Celsius durante tres o más días y un nivel en plasma de PCR de por lo menos 20 mg/dl o aproximadamente, y/o neurotoxicidad. En algunos aspectos, el número de células administradas en la primera dosis se determina en base a la probabilidad de que el sujeto muestre toxicidad o resultados tóxicos, como CRS, sCRS y/o resultados relacionados con CRS después de la administración de las células. Por ejemplo, en algunos casos, la probabilidad de que se desarrollen resultados tóxicos en un sujeto se predice en base a la carga tumoral. En algunos casos, los métodos incluyen detectar o evaluar el resultado tóxico y/o carga de la enfermedad antes de la administración de la dosis.

En algunos casos, la segunda (u otra posterior) dosis se administra en un punto temporal el que no existe un riesgo clínico de desarrollar síndrome de liberación de citoquinas (SRC), síndrome de activación de macrófagos o síndrome de lisis tumoral, o neurotoxicidad o ha pasado o ha disminuido después de la primera administración, como después de una ventana crítica después de la cual tales eventos generalmente han disminuido y/o es menos probable que se produzcan, por ejemplo en el 60, 70, 80, 90, o 95% de los sujetos con una enfermedad o afección en particular.

Cadencia de las dosis

En algunos aspectos, la cadencia de la segunda o posterior dosis se mide desde el inicio de la primera dosis hasta el inicio de la dosis posterior. En otros casos, la cadencia de la dosis posterior se mide desde la finalización de la primera dosis, o desde el día mediano de administración de la primera dosis, por ejemplo, en el contexto de dosificación dividida, descrita en la presente, donde una dosis se administra durante más de un día, por ejemplo, durante 2 días o durante 3 días.

En algunos casos, si se administra una dosis posterior de células que expresan un receptor, por ejemplo, CAR, que es distinta de la expresada por las células de la primera dosis, se determina en base a la presencia o el grado de una respuesta inmune o respuesta inmune detectable en el sujeto a las células de la primera dosis o receptor recombinante expresado por las mismas. En algunos aspectos, una dosis posterior que contiene células que expresan un receptor diferente que el de las células de la primera dosis se administrará a un sujeto con una respuesta inmune adaptativa del huésped, o una respuesta inmune que se ha estabilizado o que ha alcanzado un cierto nivel, etapa, o grado.

En algunos casos, la segunda (u otra posterior) dosis se administra en un punto temporal en el que es probable que la segunda administración de células que expresan el primer receptor (por ejemplo, CAR) sea o se prediga que será eliminada por el sistema inmunológico del huésped. La probabilidad de desarrollar una respuesta inmunitaria puede determinarse midiendo las respuestas inmunes específicas del receptor en el sujeto después de la administración de la primera dosis, como se describe en la presente.

Por ejemplo, en algunos casos, los sujetos se pueden analizar después de la primera (u otra anterior) dosis y antes de la segunda (u otra posterior) dosis para determinar si una respuesta inmune es detectable en el sujeto después de la primera dosis. En algunos de tales casos, la detección de una respuesta inmune a la primera dosis puede desencadenar la necesidad de administrar la segunda dosis.

En algunos aspectos, las muestras de los sujetos pueden probarse como se describe en la presente para determinar si hay una disminución o una exposición menor que la deseada, por ejemplo, menor que un cierto número o concentración de células, como se describe en la presente, en la sujeto después de la primera o anterior dosis. En algunos de tales aspectos, la detección de una disminución en la exposición del sujeto a las células puede desencadenar la necesidad de administrar la segunda dosis.

En algunos casos, la dosis posterior se administra en un punto temporal en el que la enfermedad o afección en el sujeto no ha recaído después de la reducción de la carga de la enfermedad en respuesta a la primera o anterior dosis. En algunos casos, la reducción de la carga de enfermedad está indicada por una reducción en uno o más factores, como la carga o el número de células de enfermedad en el sujeto o fluido u órgano o tejido de las mismas, la masa o volumen de un tumor, o el grado o extensión de las metástasis. Se considera que dicho factor ha recaído si después de la reducción del factor en respuesta a un tratamiento o administración inicial, el factor aumenta posteriormente.

En algunos casos, la segunda dosis se administra en un punto temporal en el que la enfermedad ha recaído. En algunos casos, la recaída se produce en uno o uno o más factores, o en la carga de enfermedad en general. En algunos aspectos, la dosis posterior se administra en un punto temporal en el que el sujeto, la carga de enfermedad o el factor de la misma ha recaído en comparación con el punto más bajo medido o alcanzado después de la primera o anterior administración, pero aún es menor en comparación con el tiempo inmediatamente antes de la primera dosis. En algunos casos, al sujeto se le administra la dosis posterior en un punto temporal en el que la carga de enfermedad o el factor indicativo de la misma no ha cambiado, por ejemplo, en un tiempo en el que se ha evitado un aumento de la carga de enfermedad.

En algunos casos, la dosis posterior se administra en un momento en el que se detecta, se ha establecido o se ha alcanzado un cierto nivel, grado o etapa de una respuesta inmune adaptativa del huésped. En algunos aspectos, la dosis posterior se administra siguiendo el desarrollo de una respuesta inmune de memoria en el sujeto.

En algunos aspectos, el tiempo entre la administración de la primera dosis y la administración de la dosis posterior es de aproximadamente 28 a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 29 a aproximadamente 35 días o más de aproximadamente 35 días. En algunos casos, la administración de la segunda dosis es en un punto temporal de más de aproximadamente 28 días después de la administración de la primera dosis. En algunos aspectos, el tiempo entre la primera y la siguiente dosis es de aproximadamente 28 días.

En algunos casos, se administra una dosis o dosis adicionales, por ejemplo, dosis posteriores, después de la administración de la segunda dosis. En algunos aspectos, la dosis o las dosis adicionales se administran por lo menos aproximadamente 28 días después de la administración de una dosis anterior. En algunos casos, no se administra ninguna dosis antes de aproximadamente 28 días después de la dosis anterior.

En algunos aspectos, los presentes métodos son ventajosos porque permiten la administración de células que expresan receptor en puntos temporales que se extienden más allá del intervalo de tiempo en el que otros métodos pueden administrar una segunda dosis que contiene células que expresan el receptor de la primera dosis, por ejemplo, después de que se detecta una respuesta inmune a las células de la primera dosis.

En algunos casos, los métodos reducen la toxicidad o los resultados tóxicos en comparación con otros métodos, por ejemplo, al permitir que se produzca la segunda administración después de que los resultados tóxicos después de la primera dosis se hayan depurado, por ejemplo, que pueden ser en un punto temporal determinado en el que una segunda administración de células que expresan el primer receptor se depuraría mediante una respuesta inmune al primer receptor.

En algunos aspectos, los métodos permiten la administración de una segunda dosis en un punto temporal en el que se ha producido una recaída, por ejemplo, cuando el sujeto ha respondido inicialmente al tratamiento pero desarrolla una recaída, por ejemplo, en un punto temporal en el que una segunda administración de células que expresan el primer receptor se depuraría mediante una respuesta inmune al primer receptor.'

En algunos casos, por ejemplo, cuando se administran al sujeto una o más dosis consecutivas que expresan el receptor expresado por las células de la primera dosis, las dosis consecutivas pueden estar separadas por aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 21, aproximadamente 27, o alrededor de 28 días. En algunos aspectos, la dosis consecutiva se administra 21 días después de una dosis anterior. En algunos casos, la dosis consecutiva se administra entre 14 y 28 días después de la administración de una dosis anterior.

En cualquiera de las casos, los métodos en algunos casos incluyen la administración de la primera o anterior dosis y las dosis posteriores, y en otros casos incluyen la administración de las dosis posteriores a un sujeto que ha recibió anteriormente la primera o anterior dosis, pero no incluye la administración de la propia primera o anterior dosis. Por tanto, los métodos en algunos casos implican la administración de un tratamiento de consolidación, como la administración de una dosis posterior de consolidación a un sujeto que ha recibido anteriormente una dosis de células que expresan receptor recombinante, por ejemplo, que expresan CAR.

En algunos casos, la carga de enfermedad, el tamaño del tumor, el volumen del tumor, la masa del tumor y/o la carga o la masa del tumor se reduce después de la dosis posterior en por lo menos o aproximadamente un 50, 60, 70, 80, 90% o más en comparación con el inmediatamente anterior a la administración de la primera o anterior dosis o de la segunda o posterior dosis.

VI. Exposición y persistencia celular

En algunos casos, los métodos divulgados aumentan la exposición del sujeto a las células administradas (por ejemplo, mayor número de células o duración a lo largo del tiempo) y/o mejoran la eficacia y los resultados terapéuticos en la terapia celular adoptiva. En algunos aspectos, los métodos son ventajosos porque un grado mayor y/o más largo de exposición a las células que expresan los receptores recombinantes, por ejemplo, células que expresan CAR, mejora los resultados del tratamiento en comparación con otros métodos. Tales resultados pueden incluir la supervivencia y la remisión del paciente, incluso en individuos con una carga tumoral grave.

En algunos casos, se detecta la presencia y/o cantidad de células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) en el sujeto después de la primera dosis y/o después de la dosis posterior. En algunos aspectos, se usa PCR cuantitativa (qPCR) para evaluar la cantidad de células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) en la sangre o suero u órgano o tejido (por ejemplo, sitio de la enfermedad) del sujeto. En algunos aspectos, la persistencia se cuantifica como copias de ADN o plásmido que codifica el receptor, por ejemplo, CAR, por microgramo de ADN, o como el número de células que expresan el receptor, por ejemplo, que expresan cAr , por microlitro de la muestra, por ejemplo, de sangre o suero, o por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o glóbulos blancos o células T por microlitro de muestra.

En algunos casos, las células se detectan en el sujeto al de o por lo menos al de 4, 14, 15, 27 o 28 días después de la administración de la segunda (u otra posterior) dosis. En algunos aspectos, las células se detectan al de o por lo menos al de 2, 4 o 6 semanas después, o 3, 6, o 12, 18, o 24, o 30 o 36 meses, o 1, 2, 3, 4, 5 años o más después de la administración de la segunda (u otra posterior) dosis.

En algunos casos, la persistencia del receptor, por ejemplo, células que expresan CAR, en el sujeto mediante los métodos, después de la administración de la dosis posterior, es mayor en comparación con la que se lograría mediante métodos alternativos como los que implican la administración de una dosis única o administración de una dosis posterior de células que expresan el mismo receptor, por ejemplo, CAR, que las células de la primera (u otra dosis) anterior.

En algunos casos, la persistencia y/o expansión y/o presencia de células que expresan receptor recombinante, por ejemplo, que expresan CAR, en el sujeto después de la administración de la segunda dosis es mayor en comparación con la lograda mediante un método que usa un régimen de dosificación alternativo, como uno que implica la administración de una dosis única de células que expresan receptor o uno que implica una segunda dosis o múltiples dosis de células que expresan el mismo receptor que el expresado por las células de la primera dosis.

La exposición, por ejemplo, el número de células, indicativa de expansión y/o persistencia, puede expresarse en términos de números máximos de células a las que está expuesto el sujeto, duración de células detectables o células por encima de un cierto número o porcentaje, área bajo la curva para el número de células a lo largo del tiempo, y/o combinaciones de los mismos e indicadores de los mismos. Tales resultados pueden evaluarse usando métodos conocidos, como qPCR para detectar el número de copias del ácido nucleico que codifica el receptor recombinante en comparación con la cantidad total de ácido nucleico o ADN en la muestra particular, por ejemplo, sangre o suero, y/o análisis de citometría de flujo que detectan las células que expresan el receptor generalmente usando anticuerpos específicos para los receptores. Los ensayos basados en células también pueden usarse para detectar el número o porcentaje de células funcionales, como células capaces de unirse y/o neutralizar y/o inducir respuestas, por ejemplo, respuestas citotóxicas, contra células de la enfermedad o afección o que expresan el antígeno reconocido por el receptor.

En algunos aspectos, una exposición aumentada del sujeto a las células incluye una expansión aumentada de las células. En algunos casos, las células que expresan el receptor (por ejemplo, ^cA^r-) se expanden en el sujeto después de la administración de la primera dosis y/o después de la administración de la dosis posterior. En algunos aspectos, los métodos dan como resultado una mayor expansión de las células en comparación con otros métodos, como los que implican la administración de una dosis única de células o una dosis o unas dosis posteriores de células que expresan el mismo receptor que la primera dosis.

En algunos aspectos, el método da como resultado una alta proliferación in vivo de las células administradas, por ejemplo, como se mide mediante citometría de flujo. En algunos aspectos, se detectan altas proporciones de picos de células. Por ejemplo, en algunos casos, en un pico o nivel máximo después de la primera o posterior administración, en la sangre o en el sitio de la enfermedad del sujeto o en una fracción de glóbulos blancos de la misma, por ejemplo, fracción de PBMC o fracción de células T, por lo menos aproximadamente el 10%, por lo menos aproximadamente el 20%, por lo menos aproximadamente el 30%, por lo menos aproximadamente el 40%, por lo menos aproximadamente el 50%, por lo menos aproximadamente el 60%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 80% o por lo menos aproximadamente el 90% de las células expresan el receptor recombinante, por ejemplo, el CAR.

En algunos casos, el método da como resultado una concentración máxima, en la sangre o suero u otro fluido corporal u órgano o tejido del sujeto, de por lo menos 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10.000 o 15.000 copias de o ácido nucleico que codifica el receptor, por ejemplo, el CAR por microgramo de ADN, o por lo menos 0. 1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9 de células que expresan el receptor, por ejemplo CAR, por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), número total de células mononucleares, número total de células T o número total de microlitros. En algunos casos, las células que expresan el receptor se detectan como por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50 o 60% de PBMC totales en la sangre del sujeto, y/o a tal nivel durante por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, o 52 semanas después de la primer o posterior administración o durante 1, 2, 3, 4, o 5, o más años después de tal administración.

En algunos aspectos, el método da como resultado un aumento de por lo menos 2 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 10 veces o por lo menos 20 veces de copias de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo, CAR, por microgramo de ADN, por ejemplo, en el suero del sujeto.

En algunos casos, las células que expresan el receptor son detectables en la sangre o el suero del sujeto, por ejemplo, mediante un método específico, como qPCR o un método de detección basado en citometría de flujo, por lo menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 o más días después de la administración de la primera dosis o después de la administración de la segunda (u otra posterior) dosis, o durante por lo menos en o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 o más semanas después de la administración de la primera dosis o dosis posteriores.

En algunos aspectos, por lo menos aproximadamente 1 x 102, por lo menos aproximadamente 1 x 103, por lo menos aproximadamente 1 x 104, por lo menos aproximadamente 1 x 105, o por lo menos aproximadamente 1 x 106 o por lo menos aproximadamente 5 x 106 o por lo menos aproximadamente 1 x 107 o por lo menos aproximadamente 5 x 107 o por lo menos aproximadamente 1 x 108 de células que expresan receptor recombinante, por ejemplo, que expresan CAR, y/o por lo menos 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 o 500, o 1000 células que expresan receptor por microlitro, por ejemplo, Por lo menos 10 por microlitro, son detectables o están presentes en el sujeto o fluido, tejido o compartimento de los mismos, como en la sangre, por ejemplo, sangre periférica o el sitio de enfermedad del mismo. En algunos casos, tal número o concentración de células es detectable en el sujeto durante por lo menos aproximadamente 20 días, por lo menos aproximadamente 40 días, o por lo menos aproximadamente 60 días, o por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, o por lo menos 2 o 3 años, después de la administración de la primera dosis o después de la administración de las dosis posteriores. Tales números de células pueden detectarse mediante métodos basados en citometría de flujo o basados en PCR cuantitativa y extrapolación al número total de células usando métodos conocidos. Ver, por ejemplo, Brentjens et al., Sci Transl Med. 20135(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al., JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al., Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al. Biol Blood Marrow Transplant septiembre de 2010; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828.

En algunos aspectos, el número de copias del ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo, el número de copias del vector, por 100 células, por ejemplo en la sangre periférica o la médula ósea u otro compartimento, medido por inmunohistoquímica, PCR y/o citometría de flujo, es por lo menos 0,01, por lo menos 0,1, por lo menos 1, o por lo menos 10, a aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas o por lo menos aproximadamente 6 semanas, o por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11 o 12 meses o por lo menos 2 o 3 años después de la administración de las células, por ejemplo, la primera o posteriores dosis. En algunos casos, el número de copias del vector que expresa el receptor, por ejemplo, CAR, por microgramo de ADN genómico es por lo menos 100, por lo menos 1000, por lo menos 5000, o por lo menos 10.000, o por lo menos 15.000 o por lo menos 20.000 en un tiempo aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, o por lo menos aproximadamente 4 semanas después de la administración de la primera dosis o dosis posteriores de células que expresan receptor, por ejemplo, que expresan CAR, o por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o por lo menos 2 o 3 años después de dicha administración.

En algunos aspectos, el receptor, por ejemplo, CAR, expresado por las células, es detectable por PCR cuantitativa (qPCR) o por citometría de flujo en el sujeto, sangre del mismo y/o sitio de enfermedad del mismo, en un momento en por lo menos aproximadamente 3 meses, por lo menos aproximadamente 6 meses, por lo menos aproximadamente 12 meses, por lo menos aproximadamente 1 año, por lo menos aproximadamente 2 años, por lo menos aproximadamente 3 años, o más de 3 años, después de la administración de las células, por ejemplo, después del inicio de la administración de la primera dosis o la segunda o posterior dosis.

En algunos casos, el área bajo la curva (AUC) para la concentración de células que expresan receptor (por ejemplo, CAR) en un fluido, tejido u órgano, por ejemplo, sangre, del sujeto a lo largo del tiempo después de la administración de la primera dosis es mayor en comparación con la lograda mediante un régimen de dosificación alternativo en el que se administra al sujeto una dosis única de células o múltiples dosis de células que expresan el mismo receptor.

En algunos aspectos, el área bajo la curva (AUC) para la concentración de células que expresan el receptor (por ejemplo, CAR) en un fluido, tejido u órgano, por ejemplo, sangre, del sujeto a lo largo del tiempo después de la administración de la dosis posterior es mayor en comparación con la lograda mediante un régimen de dosificación alternativo en el que se administra al sujeto una única dosis de células o múltiples dosis de células que expresan el mismo receptor.

VII. Carga de enfermedad

La administración de las dosis generalmente reduce o previene la expansión o carga de la enfermedad o afección en el sujeto. Por ejemplo, cuando la enfermedad o afección es un tumor, los métodos generalmente reducen el tamaño, el volumen o la metástasis del tumor y/o mejoran el pronóstico o la supervivencia u otros síntomas asociados con la carga tumoral. En algunos casos, la administración de la segunda o posterior dosis se sincroniza con respecto al desarrollo de una respuesta inmune específica del transgén y/o recaída después de la primera o anterior dosis.

La carga de la enfermedad puede abarcar un número total de células de la enfermedad en el sujeto o en un órgano, tejido o fluido corporal del sujeto, como el órgano o tejido del tumor u otra localización, por ejemplo, lo que indicaría metástasis. Por ejemplo, las células tumorales pueden detectarse y/o cuantificarse en la sangre o la médula ósea en el contexto de ciertas enfermedades malignas hematológicas. La carga de enfermedad puede incluir, en algunos casos, la masa de un tumor y/o el número o extensión de metástasis.

En algunos casos, la administración de las dos o más dosis produce una reducción de la carga de enfermedad. En algunos aspectos, la administración de las dosis puede prevenir un aumento de la carga de enfermedad, y esto puede evidenciarse por ningún cambio en la carga de enfermedad.

En algunos aspectos, la enfermedad o afección persiste después de la administración de la primera dosis y/o la administración de la primera dosis no es suficiente para erradicar la enfermedad o afección en el sujeto.

En algunos aspectos, la administración de la segunda dosis reduce la carga de enfermedad en comparación con la carga de enfermedad en un momento inmediatamente anterior a la primera dosis, o en un momento inmediatamente anterior a la segunda dosis. En algunos aspectos, por ejemplo en el contexto de una recaída, la administración de la segunda dosis produce una reducción de la carga de enfermedad en comparación con el nivel máximo de carga de enfermedad después de la administración de la primera dosis.

En algunos casos, el método reduce la carga de la enfermedad o afección, por ejemplo, el número de células tumorales, el tamaño del tumor, la duración de la supervivencia del paciente o la supervivencia libre de eventos, en un mayor grado y/o durante un período de tiempo mayor en comparación con la reducción que se observaría con un método que usa un régimen de dosificación alternativo, como uno en el que el sujeto recibe una única dosis de células o múltiples dosis de células que expresan el mismo receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, la carga de enfermedad se reduce en mayor medida o durante una mayor duración después de la segunda dosis en comparación con la reducción que se efectuaría administrando una segunda dosis de células que expresan el mismo receptor, por ejemplo, CAR.

En algunos casos, se detecta, evalúa o mide la carga de enfermedad o afección en el sujeto. La carga de enfermedad puede detectarse en algunos aspectos detectando el número total de células de enfermedad o asociadas a la enfermedad, por ejemplo, células tumorales, en el sujeto o en un órgano, tejido o fluido corporal del sujeto, como sangre o suero. En algunos casos, la carga de enfermedad, por ejemplo, la carga tumoral, se evalúa midiendo la masa de un tumor sólido y/o el número o extensión de la metástasis. En algunos aspectos, se evalúa la supervivencia del sujeto, la supervivencia dentro de un cierto período de tiempo, el grado de supervivencia, la presencia o duración de la supervivencia sin eventos o sin síntomas, o la supervivencia sin recaídas. En algunos casos, se evalúa cualquier síntoma de la enfermedad o afección. En algunos casos, se especifica la medida de la carga de enfermedad o afección.

En algunos aspectos, la carga de enfermedad se mide o detecta antes de la administración de la primera dosis, después de la administración de la primera dosis pero antes de la administración de la segunda dosis y/o después de la administración de la segunda o posterior dosis. En el contexto de múltiples dosis posteriores, la carga de enfermedad en algunos casos puede medirse antes o después de cualquiera de las dosis posteriores, o en un momento entre la administración de dosis posteriores.

En algunos aspectos, la administración de las dosis produce una reducción en la carga de enfermedad, por ejemplo, la carga tumoral, como una disminución de aproximadamente el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 90 o 100 por ciento en la carga en comparación con inmediatamente antes de la administración de la segunda dosis o en general en comparación con inmediatamente antes de la primera dosis. En algunos casos, la carga de enfermedad, el tamaño del tumor, el volumen del tumor, la masa del tumor y/o la carga o la masa del tumor se reducen después de la segunda dosis en por lo menos un 50, 60, 70, 80, 90% o más en comparación con la inmediatamente antes de la administración de la primera dosis o de la dosis posterior.

En algunos casos, la reducción de la carga de enfermedad por el método comprende una inducción en la remisión morfológica completa, por ejemplo, como se evalúa 1 mes, 2 meses, 3 meses o más de 3 meses, después de la administración de, por ejemplo, el inicio de, la primera o cualquier dosis posterior. En algunos aspectos, un ensayo para la enfermedad residual mínima, por ejemplo, medido por citometría de flujo multiparamétrica, es negativo, o el nivel de enfermedad residual mínima es menos de aproximadamente el 0,3%, menos de aproximadamente el 0,2%, menos de aproximadamente el 0,1%, o menos de aproximadamente el 0,05%.

En algunos casos, la tasa de supervivencia sin eventos o la tasa de supervivencia global del sujeto se mejora mediante los métodos, en comparación con otros métodos. Por ejemplo, en algunos casos, la tasa o probabilidad de supervivencia sin eventos para los sujetos tratados por los métodos a los 6 meses después de la primera dosis es mayor de aproximadamente el 40%, mayor de aproximadamente el 50%, mayor de aproximadamente el 60%, mayor de aproximadamente el 70%, mayor de aproximadamente el 80%, mayor de aproximadamente el 90% o mayor de aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la tasa de supervivencia global es mayor de aproximadamente el 40%, mayor de aproximadamente el 50%, mayor de aproximadamente el 60%, mayor de aproximadamente el 70%, mayor de aproximadamente el 80%, mayor de aproximadamente el 90% o mayor de aproximadamente el 95%. En algunos casos, el sujeto tratado con los métodos muestra supervivencia sin eventos, supervivencia sin recaídas o supervivencia de por lo menos 6 meses, o por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años. En algunos casos, se mejora el tiempo para la progresión, como un tiempo para la progresión de más de o aproximadamente 6 meses, o por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años.

En algunos casos, después del tratamiento mediante el método, la probabilidad de recaída se reduce en comparación con otros métodos. Por ejemplo, en algunos casos, la probabilidad de recaída a los 6 meses después de la primera dosis es menor de aproximadamente el 80%, menor de aproximadamente el 70%, menor de aproximadamente el 60%, menor de aproximadamente el 50%, menor de aproximadamente el 40%, menor de aproximadamente el 30%, menor de aproximadamente el 20% o menor de aproximadamente el 10%.

VIII. Toxicidad y resultados tóxicos

En algunos casos, los métodos reducen o previenen la toxicidad o un resultado o síntoma de la misma, por ejemplo, en comparación con la administración de células como una dosis única, la administración de una dosis posterior de células que expresan el mismo receptor que la primera dosis y/o la administración de la dosis posterior en un momento anterior al tiempo entre la primera y la dosis posterior especificadas por el método.

La administración de terapia con células T adoptiva, como el tratamiento con células T que expresan receptores de antígenos quiméricos, puede inducir efectos tóxicos o resultados como el síndrome de liberación de citoquinas y neurotoxicidad. En algunos ejemplos, tales efectos o resultados son paralelos a los altos niveles de citoquinas circulantes, que pueden ser la base de la toxicidad observada.

En algunos aspectos, los métodos presentes pueden reducir la toxicidad o los resultados tóxicos en comparación con otros métodos al permitir la administración de una primera dosis más pequeña que otros métodos, por ejemplo, en donde se administra una única dosis grande, por ejemplo, en donde se administran múltiples dosis más pequeñas las dosis de células que expresan el mismo receptor pueden eliminarse mediante una respuesta inmune del huésped.

En algunos casos, los presentes métodos pueden reducir la toxicidad o los resultados tóxicos en comparación con otros métodos al permitir la administración de una dosis posterior más de 28 días después de la administración de la primera dosis, por ejemplo, en un punto temporal en el que se ha desarrollado una respuesta inmune al primer receptor de tal manera que las células que expresan el primer receptor se eliminarían si se administraran de nuevo. Por tanto, en algunos aspectos, los métodos reducen la toxicidad en comparación con los métodos que administran múltiples dosis en un punto temporal en el que el sujeto está en riesgo de desarrollar CRS.

En algunos aspectos, el resultado tóxico es o está asociado con o es indicativo del síndrome de liberación de citoquinas (CRS) o CRS grave (sCRS). El CRS, por ejemplo, sCRS, puede producirse en algunos casos después de la terapia adoptiva de células T y la administración a sujetos de otros productos biológicos. Ver Davila et al., Sci Transl Med 6, 224ra25 (2014); Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38 (2013); Grupp et al., N. Engl. J. Med.

368, 1509-1518 (2013); y Kochenderfer et al., Blood 119, 2709-2720 (2012); Xu et al., Cancer Letters 343 (2014) 172-78.

El CRS puede tratarse usando una terapia antiinflamatoria como una terapia anti-IL-6, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6, por ejemplo, tocilizumab, o antibióticos. En algunos casos, al sujeto se le trata con dicha terapia después de la primera administración y la dosis posterior se administra sólo si y cuando los síntomas asociados con CRS se reducen o disminuyen o disminuyen por debajo de un nivel aceptable después de dicho tratamiento.

Los resultados, signos y síntomas de CRS son conocidos e incluyen los descritos en la presente. En algunos casos, cuando un régimen de dosificación o administración particular afecta o no afecta a un resultado, signo o síntoma asociado con CRS dado, se pueden especificar resultados, signos y síntomas particulares y/o cantidades o grados de los mismos.

Se puede especificar el método para medir o detectar los varios resultados.

En algunos aspectos, antes de la administración de la primera dosis, después de la administración de la primera dosis y antes de la administración de la dosis posterior, o después de la administración de la dosis posterior, se evalúa un resultado asociado con CRS en el sujeto. En algunos casos, el nivel del resultado tóxico, por ejemplo, el resultado relacionado con CRS, por ejemplo, el nivel en suero de un indicador de CRS, se mide mediante ELISA.

En algunos aspectos, el resultado tóxico es o está asociado con neurotoxicidad. En algunos casos, los métodos reducen los síntomas asociados con la neurotoxicidad en comparación con otros métodos. Por ejemplo, los sujetos tratados de acuerdo con los presentes métodos pueden tener síntomas reducidos de neurotoxicidad, como debilidad o entumecimiento de las extremidades, pérdida de memoria, visión y/o intelecto, conductas obsesivas y/o compulsivas incontrolables, delirios, dolor de cabeza, problemas cognitivos y conductuales que incluyen pérdida del control motor, deterioro cognitivo y disfunción del sistema nervioso autónomo, y disfunción sexual, en comparación con sujetos tratados con otros métodos.

En algunos casos, los métodos reducen los resultados asociados con la neurotoxicidad incluyendo daños al sistema nervioso y/o al cerebro, como la muerte de neuronas. En algunos aspectos, los métodos reducen el nivel de factores asociados con la neurotoxicidad como beta amiloide (Ap), glutamato y radicales de oxígeno.

En algunos casos, los sujetos a los que se administran dosis de acuerdo con los métodos tienen síntomas, resultados o factores asociados con la neurotoxicidad reducidos en comparación con la administración de una única dosis, administración de una dosis posterior de células que expresan el mismo receptor, por ejemplo, CAR, como la primera dosis, y/o administración de la dosis posterior en un momento anterior al tiempo entre la primera y la dosis posterior especificadas por el método.

IX. Células

Las células generalmente son células eucariotas, como células de mamífero, y típicamente son células humanas, por ejemplo, aquellas derivadas de sujetos humanos y modificadas, por ejemplo, para expresar los receptores recombinantes. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunológico como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo, células mieloides o linfoides, incluyendo linfocitos, típicamente T células y/o células NK. Otras células ejemplares incluyen células madre, como células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células son típicamente células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidad de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, marcador o perfil de secreción de citoquinas, y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen los métodos disponibles en el mercado. En algunos aspectos, como en el caso de las tecnologías disponibles en el mercado, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como las células madre, como las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, preparar, procesar, cultivar, y/o modificarlas, y reintroducirlas en el mismo sujeto, antes o después de la criopreservación.

Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o CD8+ se encuentran las células T (Tⁿ) vírgenes, las células T efectoras (T^eff), las células T de memoria y subtipos de las mismas, como células T de memoria de células madre (Tscm), T de memoria central (Tcm), T de memoria efectora (Tem), o T de memoria efectora diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas y de origen natural (Treg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.

En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.

En algunos casos, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética, y de este modo expresan productos recombinantes o modificados genéticamente de dichos ácidos nucleicos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está modificando y/o un organismo del que se deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no se encuentran de forma natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.

Vectores y métodos para la ingeniería genética

También se divulgan métodos, composiciones y kits para producir células modificadas genéticamente que expresan receptores recombinantes. La ingeniería genética generalmente implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente recombinante o modificado en la célula como por transducción, transfección o transformación retroviral.

En algunos casos, la transferencia de genes se logra estimulando primero la célula, como combinándola con un estímulo que induce una respuesta como proliferación, supervivencia y/o activación, por ejemplo, medida por la expresión de una citoquina o marcador de activación, seguido de transducción de las células activadas, y expansión en cultivo hasta cantidades suficientes para aplicaciones clínicas.

En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulador (por ejemplo, una linfocina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células modificadas incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están modificadas de tal manera que pueden eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del sujeto al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede ser el resultado de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa de tipo I del virus del Herpes simple (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II: 223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de hipoxantina fosfribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT), citosina desaminasa bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).

En algunos aspectos, las células se diseñan además para promover la expresión de citoquinas u otros factores. Varios métodos para la introducción de componentes modificados genéticamente, por ejemplo, receptores de antígenos, por ejemplo, CAR, son bien conocidos y pueden usarse con los métodos y composiciones divulgados. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo los virales, por ejemplo, retrovirales o lentivirales, transducción, transposones y electroporación.

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando partículas de virus infecciosos recombinantes como, por ejemplo, vectores derivados del virus de simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy abril 2014 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. noviembre 2011 29(11): 550-557.

En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), virus de células madre embrionarias murinas (MESV), virus de células madre murinas (MSCV), virus formador de focos del bazo (SFFV) o virus adenoasociados (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente celular de aves o mamíferos. Los retrovirus son típicamente anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo las humanos. En un caso, el gen que se va a expresar reemplaza las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Se conocen métodos de transducción lentiviral. Métodos ejemplares se describen en, por ejemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505

En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (ver, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos de introducción y expresión de material genético en células inmunes incluyen transfección con fosfato de calcio (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, N° de publicación: WO2014055668 y la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190.

Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para la introducción son aquellos para mejorar la eficacia de la terapia, como por ejemplo, promoviendo la viabilidad y/o la función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como describen Lupton S.D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); ver también las publicaciones de PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Ver, por ejemplo, Riddell et al., Patente de Estados Unidos N° 6.040.177, en las columnas 14-17.

Preparación de células para modificación

En algunos casos, la preparación de las células modificadas incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del ácido nucleico que codifica el receptor transgénico, como el cAr , pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo, una obtenida o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es uno que tiene la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se administrará la terapia celular. En algunos casos, el sujeto es un humano que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o modifican las células.

Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento como separación, centrifugación, ingeniería genética (por ejemplo, transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que está procesada. Las muestras biológicas incluyen, pero no están limitadas a, fluidos corporales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo muestras procesadas derivadas de los mismos.

En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Ejemplos de muestras incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a mucosas, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdalas u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

En algunos aspectos, las células de la segunda dosis se derivan del mismo producto de aféresis que las células de la primera dosis. En algunos casos, las células de múltiples dosis, por ejemplo, primera, segunda, tercera, y demás, se derivan del mismo producto de aféresis.

En otros casos, las células de la segunda (u otra posterior) dosis se derivan de un producto de aféresis que es distinto del que se derivan las células de la primera (u otra anterior) dosis.

En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo, líneas de células T. Las células en algunos casos se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.

En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación de células no basados en afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer para obtener componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan en base a una o más propiedades como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.

En algunos ejemplos, las células de la sangre circulante de un sujeto se obtienen, por ejemplo, por aféresis o leucaféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de los glóbulos rojos y plaquetas.

En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, un paso de lavado se logró con una centrífuga semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, un paso de lavado se logra mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se resuspenden en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, tales como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En determinados casos, los componentes de una muestra de células sanguíneas se extraen y las células se resuspenden directamente en medio de cultivo.

En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células basándose en la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación en base a tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones de células en base a la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo o un compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o al compañero de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión.

Tales pasos de separación pueden estar basados en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se retienen para un uso posterior, y/o en la selección negativa, en la que se retienen las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay ningún anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se lleva a cabo mejor basándose en marcadores expresados por células distintas de la población deseada.

La separación no necesita dar como resultado un 100% de enriquecimiento o eliminación de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a aumentar el número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una ausencia completa de células que no expresan el marcador. De igual manera, la selección negativa, la eliminación o el agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a disminuir el número o porcentaje de tales células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.

En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, en las que la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un único paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador dirigido a la selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos de células simultáneamente incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los varios tipos de células.

Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, ^cD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y/o CD45RO+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa.

Por ejemplo, pueden seleccionarse células T CD3+, CD28+ positivamente usando perlas magnéticas conjugadas CD3/CD28 (por ejemplo, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo mediante el enriquecimiento de una población celular particular mediante selección positiva, o el agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se una específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto). en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.

En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante la selección negativa de marcadores expresados en células que no son T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD 14. En algunos aspectos, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y las células T citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa de marcadores expresados o expresados a un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.

En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se agotan de las células madre vírgenes, de memoria central, memoria efectora y/o de memoria central, como mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto después de la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusto en tales subpoblaciones. Ver Terakura et al. (2012) Blood 1: 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con T^cmy células T CD4+ mejora aún más la eficacia.

En los casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC pueden enriquecerse o agotarse en fracciones de CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, como el uso de anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.

En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (T^cm) se basa en una expresión de superficie positiva o alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o que expresan en gran medida CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población CD8+ enriquecida en células T^cmse lleva a cabo mediante el agotamiento de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento de las células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo partiendo de una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva en base a CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 que se usa en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+ también se usa para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 se retienen y se usan en pasos posteriores de los métodos, siguiendo opcionalmente uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.

En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se retienen tanto las fracciones negativas como las positivas. Luego, la fracción negativa se somete a una selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y una selección positiva en base a un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde se llevan a cabo las selecciones positivas y negativas en cualquier orden.

Las células auxiliares T CD4+ se clasifican en células vírgenes, de memoria central y efectoras identificando poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.

En un ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos para CD14, CD20, CD11 b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión se une a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones de células se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o de afinidad magnética) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Editado por: S.A. Brooks and U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).

En algunos aspectos, la muestra o composición de células que se van a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o sensible magnéticamente, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, perlas Dynalbeads o MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.

En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales sensibles magnéticamente bien conocidos que se usan en métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos 4.452.773, y en la Especificación de Patente Europea EP 452342B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 4.795.698 y Liberti et al., Patente de Estados Unidos 5.200.084 son otros ejemplos.

La incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o compañeros de unión, o moléculas, como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a tales anticuerpos o compañeros de unión, que se unen a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células de la muestra.

En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y las células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a las mismas serán atraídas por el imán y se separarán de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no se atraen (células sin marcar). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positiva y negativa se retienen y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.

En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles se recubren en anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión, y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico del tipo celular u otro compañero de unión (por ejemplo, estreptavidina). En ciertos casos, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan unidas a las células que se incubarán, cultivarán y/o manipularán posteriormente; en algunos aspectos, las partículas se dejan unidas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se eliminan de las células. Los métodos para eliminar partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos competidores no marcados y partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

En algunos casos, la selección basada en afinidad se realiza mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Los sistemas de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) son capaces de realizar una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertos casos, la MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras las especies no unidas se eluyen. Luego, después de que se haya completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y se impidió que fueran eluidas se liberan de alguna manera de tal manera que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y se agotan de la población heterogénea de células.

En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de la métodos. En algunos aspectos, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un ambiente cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar errores, manipulación por parte del usuario y/o contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o US 20110003380 A1.

En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo, todos los pasos de aislamiento, procesamiento, modificación y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de forma automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o programa de ordenador en comunicación con el sistema o aparato, lo que permite a un usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, ingeniería y formulación.

En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotic), por ejemplo, para la separación automatizada de células a nivel clínico en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pinzamiento. El ordenador integrado controla en algunos aspectos todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. La unidad de separación magnética en algunos aspectos incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal a través del conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinzamiento, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

El sistema CliniMACS en algunos aspectos usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución no pirógena estéril. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. Luego, se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez se conecta a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste de tubos estériles preensamblados, que incluyen una columna previa y una columna de separación, y son para un solo uso. Después del inicio del programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de la célula a la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se marcan y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). En algunos aspectos, el sistema CliniMACS Prodigy está equipado con una unidad de procesamiento de células que permite el lavado y el fraccionamiento automatizados de las células por centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final de fraccionamiento celular óptimo al discernir las capas macroscópicas del producto de la célula de origen. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en eritrocitos, glóbulos blancos y capas de plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que logra protocolos de cultivo celular como, por ejemplo, diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la eliminación estéril y el reabastecimiento de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Ver, por ejemplo, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood 1:72-82 y Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y se enriquece (o se agota) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunos casos, una población celular descrita en la presente se recoge y se enriquece (o se agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población de células descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, por ejemplo, la WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T bien definidos de alta pureza.

En algunos casos, los anticuerpos o compañeros de unión se marcan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros compañeros de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluyendo la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo, en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.

En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo, criopreservar las células, antes o después del aislamiento, incubación y/o modificación. En algunos casos, el paso de congelación y descongelación posterior elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. Puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos en algunos aspectos. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene 20% de DMSO y 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otros medios de congelación de células adecuados. A continuación, este se diluye 1:1 con medio de tal manera que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y el 4%, respectivamente. A continuación, las células se congelan generalmente a -80° C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

En algunos casos, los métodos divulgados incluyen pasos de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. Por ejemplo, en algunos casos, se proporcionan métodos para incubar y/o modificar las poblaciones de células agotadas y las composiciones iniciadoras del cultivo.

Por tanto, en algunos casos, las poblaciones de células se incuban en una composición de iniciación de cultivo. La incubación y/o modificación puede llevarse a cabo en un recipiente de cultivo como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para el cultivo o cultivar células.

En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en conexión con la ingeniería genética. Los pasos de incubación pueden incluir cultivo, cultivación, estimulación, activación y/o propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o un agente estimulador. Tales condiciones incluyen las diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o cebar las células para la ingeniería genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.

Las condiciones pueden incluir uno o más medios, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores como citoquinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células particulares.

En algunos casos, las condiciones o agentes estimuladores incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente enciende o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un componente de TCR y/o receptor coestimulador, por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28, por ejemplo, unidos a un soporte sólido como una perla y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpo anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimuladores incluyen IL-2 y/o IL-15, por ejemplo, una concentración de IL-2 de por lo menos aproximadamente 10 unidades/ml.

En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a la composición de iniciación del cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica que no se dividen (PBMC), (por ejemplo, re tal manera que la población de células resultante contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T en la población inicial a expandir); e incubar el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.

En algunos casos, las condiciones estimulantes incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados y generalmente a o aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además añadir células linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en el intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras de LCL en algunos aspectos se divulgan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras de LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.

En casos, las células T específicas de antígeno, como células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T específicos de antígeno o vírgenes con antígeno. Por ejemplo, pueden generarse líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.

X. Composiciones y formulaciones

También se divulgan composiciones que incluyen las células, incluyendo composiciones y formulaciones farmacéuticas, como composiciones en forma de dosis unitaria que incluyen el número de células para la administración en una dosis dada o fracción de la misma. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas incluyen generalmente uno o más portadores o excipientes opcionales farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, la composición incluye por lo menos un agente terapéutico adicional.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

En algunos aspectos, la elección del portador está determinada en parte por la célula particular y/o por el método de administración. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo, por Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no están limitados a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como polietilenglicol (PEG).

En algunos aspectos se incluyen en las composicione agentes tamponadores s. Los agentes tamponadores adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).

Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se está tratando con las células, preferiblemente aquellas con actividades complementarias a las células, donde las actividades respectivas no se afectan adversamente entre sí. Tales ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes farmacéuticamente activos o fármacos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, y/o vincristina.

La composición farmacéutica en algunos casos contiene las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. La eficacia terapéutica o profiláctica en algunos casos se monitoriza mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. La dosificación deseada puede administrarse mediante una administración de un solo bolo de las células, mediante múltiples administraciones de bolo de las células o mediante la administración por infusión continua de las células.

Las células y composiciones pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. La administración de las células puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, pueden obtenerse de un sujeto células o progenitores inmunorespondedores y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células inmunorespondedoras derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo, in vivo, ex vivo o derivadas in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunorespondedora modificada genéticamente), generalmente se formulará en una forma de dosificación unitaria inyectable (solución, suspensión, emulsión).

Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenoso, intraperitoneal, subcutáneo, pulmonar, transdérmico, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o supositorio. En algunos casos, las poblaciones de células se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunos casos, las células se administran al sujeto usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

Las composiciones en algunos casos se divulgan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más convenientes de administrar, especialmente por inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más largos con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un medio solvente o dispersante que contiene, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando las células en un solvente como una mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo, metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes y/o colorantes, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseadas. En algunos aspectos, pueden consultarse textos estándar para preparar las preparaciones adecuadas.

Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. XI. Artículos de fabricación

También se divulgan artículos de fabricación, como kits y dispositivos, para la administración de las células a sujetos de acuerdo con los métodos divulgados para la terapia celular adoptiva, y para el almacenamiento y administración de las células y composiciones.

Los artículos de fabricación incluyen uno o más recipientes, típicamente una pluralidad de recipientes, material de envasado y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente o recipientes y/o envase, generalmente incluyendo instrucciones para la administración de las células a un sujeto.

Los recipientes contienen generalmente las células a administrar, por ejemplo, una o más dosis unitarias de las mismas. El artículo de fabricación incluye típicamente una pluralidad de recipientes, cada uno de los cuales contiene una única dosis unitaria de las células. La dosis unitaria puede ser una cantidad o número de células que se administrarán al sujeto en la primera dosis o el doble del número (o más) de células que se administrarán en la primera o dosis posteriores. Puede ser la dosis más baja o la dosis más baja posible de las células que se administrarían al sujeto en relación con el método de administración. En algunos casos, la dosis unitaria es el número mínimo de células o el número de células que se administraría en una sola dosis a cualquier sujeto que tenga una enfermedad o afección particular o cualquier sujeto, de acuerdo con los métodos de la presente. Por ejemplo, la dosis unitaria en algunos aspectos puede incluir un número mínimo de células que se administrarían a un paciente de un peso corporal relativamente menor y/o con una carga de enfermedad relativamente alta, de tal manera que en algunos casos se administra más de una dosis unitaria a un determinado sujeto como una primera dosis y se administra una o más de una dosis unitaria a un sujeto dado en una o más dosis posteriores, por ejemplo, de acuerdo con los métodos divulgados. En algunos casos, el número de células en la dosis unitaria es el número de células o el número de células que expresan receptor recombinante o que expresan CAR que se desea administrar a un sujeto particular en una primera dosis, como un sujeto del que se han derivado las células. En algunos casos, las células se han derivado del sujeto que se va a tratar mediante métodos divulgados en la presente o con necesidad de ello.

En algunos casos, una o más de las dosis unitarias contienen células que expresan el mismo receptor, por ejemplo, CAR. En algunos aspectos, una o más de las dosis unitarias contienen células que expresan un receptor diferente, por ejemplo, CAR, que una o más de las otras dosis unitarias.

En algunos casos, cada uno de los recipientes comprende individualmente una dosis unitaria de las células que expresan el primer, segundo o tercer, y demás, receptor que contiene el mismo o sustancialmente el mismo número de células. Por tanto, en algunos casos, cada uno de los recipientes comprende el mismo o aproximadamente o sustancialmente el mismo número de células o número de células que expresan el receptor recombinante. En algunos casos, la dosis unitaria incluye menos de aproximadamente 1 x 108, menos de aproximadamente 5 x 107, menos de aproximadamente 1 x 106 o menos de aproximadamente 5 x 105de las células modificadas, de las células totales, de las células T o PBMC, por kg del sujeto a tratar y/o del que se han derivado las células. En algunos casos, cada dosis unitaria contiene o aproximadamente 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 o 1 x 108 células modificadas, células totales, células T o PBMC.

Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas y bolsas flexibles, como bolsas de infusión. En casos particulares, los recipientes son bolsas, por ejemplo, bolsas flexibles, como las adecuadas para la infusión de células a los sujetos, por ejemplo, bolsas de plástico o PVC flexibles y/o bolsas de solución IV. En algunos casos, las bolsas pueden sellarse y/o pueden esterilizarse, para proporcionar una solución estéril y la administración de las células y composiciones. En algunos casos, los recipientes, por ejemplo, bolsas, tienen una capacidad de o aproximadamente o por lo menos de o aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o 1000 ml, como entre de o aproximadamente 10 y de o aproximadamente 100 o entre de o aproximadamente 10 y de o aproximadamente 500 ml de capacidad. En algunos casos, los recipientes, por ejemplo, bolsas, pueden elaborarse de un material que es estable y/o proporcionar almacenamiento estable y/o mantenimiento de las células a una o más de varias temperaturas, como en temperaturas frías, por ejemplo por debajo de o aproximadamente o de o aproximadamente -20°C, -80°C, -120°C, 135°C y/o otras temperaturas adecuadas para criopreservación, y/o otras temperaturas, como temperaturas adecuadas para descongelar las células y la temperatura corporal como de o aproximadamente 37° C, por ejemplo, para permitir la descongelación, por ejemplo en la localización del sujeto o la localización de tratamiento, por ejemplo en la cabecera de la cama inmediatamente antes del tratamiento.

Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. En algunos casos, el recipiente tiene uno o más puertos, por ejemplo, puertos de acceso estériles, por ejemplo, para la conexión de tubos o canulación a uno o más tubos, por ejemplo, para infusión intravenosa u otra infusión y/o para conexión con propósitos de transferencia a y de otros recipientes, como cultivo celular y/o bolsas de almacenamiento u otros recipientes. Los recipientes ejemplares incluyen bolsas de infusión, bolsas de solución intravenosa, viales, incluyendo los que tienen tapones que pueden perforarse con una aguja para inyección.

El artículo de fabricación puede incluir además un prospecto o una etiqueta con una o más piezas de información de identificación y/o instrucciones de uso. En algunos casos, la información o las instrucciones indican que el contenido puede o debe usarse para tratar una afección o enfermedad particular, y/o proporcionar instrucciones para la misma. La etiqueta o el prospecto puede indicar que el contenido del artículo de fabricación es para el uso para tratar la enfermedad o afección. En algunos casos, la etiqueta o prospecto proporciona instrucciones para tratar a un sujeto, por ejemplo, el sujeto del que se derivan las células, mediante un método que implica la administración de una primera y una o más dosis posteriores de las células, por ejemplo, de acuerdo con cualquiera de las casos de los métodos divulgados. En algunos casos, las instrucciones especifican la administración, en una primera dosis, de una dosis unitaria, por ejemplo, el contenido de un único recipiente individual en el artículo de fabricación, seguido por una o más dosis posteriores en un punto temporal especificado o en el plazo de una ventana temporal especificada y/o después de la detección de la presencia o ausencia o cantidad o grado de uno o más factores o resultados en el sujeto.

En algunos casos, las instrucciones especifican la administración de una pluralidad de dosis unitarias al sujeto llevando a cabo una primera administración y una administración posterior. En algunos casos, la primera administración comprende administrar una de dichas dosis unitarias que contienen células que expresan un primer receptor, por ejemplo, CAR, al sujeto y la administración posterior comprende administrar una o una pluralidad de dichas dosis unitarias que contienen células que expresan el mismo receptor, por ejemplo CAR, como la primera administración al sujeto.

En algunos aspectos, la primera administración comprende administrar una de dichas dosis unitarias que contienen células que expresan un primer receptor, por ejemplo, CAR, al sujeto y la administración posterior comprende administrar una o una pluralidad de dichas dosis unitarias que contienen células que expresan un receptor distinto, por ejemplo, CAR, al sujeto. En algunos casos, si el paciente recibe una segunda administración que contiene células que expresan el mismo receptor que la primera administración o recibe una segunda administración que contiene células que expresan un receptor, por ejemplo, CAR, que es distinto del expresado por las células de la primera administración, puede determinarse en base a cualquiera de los parámetros de los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, en algunos aspectos, por ejemplo, cuando el paciente ha desarrollado una respuesta inmune al primer receptor, puede administrarse una dosis unitaria que contiene células que expresan un receptor que es distinto del de el primer receptor.

En algunos casos, las instrucciones especifican que la segunda (u otra posterior) administración debe realizarse en un momento por lo menos aproximadamente 28 o por lo menos aproximadamente 35 días después de la primera administración, por ejemplo, después del inicio de la primera administración o la administración anterior.

En algunos casos, las instrucciones especifican que la dosis posterior debe administrarse en un momento después del cual se ha determinado que el sujeto muestra una respuesta inmune adaptativa del huésped detectable específica para el receptor, por ejemplo, CAR, expresada por las células de la primera (u otra anterior) dosis.

En algunos casos, la etiqueta o prospecto o envase comprende un identificador para indicar la identidad específica del sujeto del que se derivan las células y/o al que se van a administrar. En el caso de la transferencia autóloga, la identidad del sujeto del que se derivan las células es la misma que la identidad del sujeto al que se van a administrar las células. Por tanto, la información de identificación puede especificar que las células deben administrarse a un paciente en particular, como aquel del que se derivaron originalmente las células. Dicha información puede estar presente en el material de envasado y/o etiqueta en forma de código de barras u otro identificador codificado, o puede indicar el nombre y/u otras características de identificación del sujeto.

El artículo de fabricación en algunos casos incluye uno o más, típicamente una pluralidad de recipientes que contienen composiciones que comprenden las células, por ejemplo, formas de dosis unitarias individuales de las mismas, y además incluyen uno o más recipientes adicionales con una composición contenida en ellos que incluye un agente adicional, como un agente citotóxico o de otro modo terapéutico, por ejemplo, que se administrará en combinación, por ejemplo, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con las células. Alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede incluir además otro o el mismo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable. Además, puede incluir otros materiales tales como otros tampones, diluyentes, filtros, tubos, agujas y/o jeringuillas.

El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones que habitualmente se incluyen en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de tales productos terapéuticos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o terminología técnicos y científicos usados en la presente se pretende que tengan el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente por claridad y/o para una fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica.

Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en la presente incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente de” aspectos y variaciones.

A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se divulga un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está abarcado dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están incluidos dentro de la materia reivindicada, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) casos que están dirigidos a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión en la superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente más alto que el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

Como se usa en la presente, una afirmación de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de presencia sustancial detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión en la superficie detectada mediante citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente más bajo que el de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una células que se sabe que es negativa para el marcador.

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión".

Los encabezados de las secciones usados en la presente son solo para propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.

XII. Casos ejemplares

Entre los casos divulgados están:

1. Un método de tratamiento, que comprende:

(a) administrar a un sujeto células que expresan un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad o afección en el sujeto; y

(b) administrar al sujeto células que expresan un segundo CAR, que es distinto de dicho primer CAR, y no expresan el primer CAR.

2. El método del caso 1, en donde, en el momento o inmediatamente antes de la administración de las células que expresan el segundo CAR:

el sujeto muestra una respuesta inmune humoral y/o mediada por células detectable específica para el primer CAR;

la enfermedad o afección persiste en el sujeto; y/o

la enfermedad o afección ha recaído en el sujeto.

3. El método del caso 1 o el caso 2, en donde:

el tiempo entre la administración de células que expresan el primer CAR y la administración de las células que expresan el segundo CAR es de por lo menos aproximadamente 28 días, por lo menos aproximadamente 35 días, por lo menos aproximadamente 42 días, por lo menos aproximadamente 49 días y/o por lo menos aproximadamente 60 días.

4. El método de cualquiera de las casos 1-3, en donde dicho primer CAR comprende por lo menos un epítopo inmunorreactivo que no está presente en dicho segundo CAR.

5. El método del caso 4, en donde:

dicho por lo menos un epítopo inmunorreactivo comprende por lo menos un epítopo de células B; y/o dicho por lo menos un epítopo inmunorreactivo comprende por lo menos un epítopo de células T.

6. El método de cualquiera de los casos 1-5, en donde:

dicho sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el primer CAR antes de dicha administración en (a); y/o

dicho sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el segundo CAR antes de la administración en (b).

7. El método de cualquiera de los casos 1-6, en donde el segundo CAR se une específicamente al mismo antígeno que el primer CAR.

8. El método de cualquiera de los casos 1-7, en donde la enfermedad o afección es un tumor.

9. El método de cualquiera de los casos 1-8, en donde la enfermedad o afección es una enfermedad maligna de células B.

10. El método del caso 9, en donde el primer CAR y el segundo CAR se unen específicamente al mismo epítopo de dicho antígeno.

11. El método de cualquiera de los casos 7-10, en donde el primer CAR compite por unirse a dicho antígeno con el segundo CAR.

12. El método de cualquiera de los casos 7, -9 y 11, en donde el primer CAR y el segundo CAR se unen específicamente a distintos epítopos de dicho antígeno.

13. El método de cualquiera de los casos 1-12, en donde:

el segundo CAR se une específicamente a otro antígeno asociado con dicha enfermedad o afección en comparación con el antígeno unido por el primer CAR; o

el segundo CAR no se une específicamente al antígeno unido específicamente por el primer CAR.

14. El método de cualquiera de los casos 9-13, en donde el primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad maligna de células B que se selecciona de CD19, CD22 o CD20 y el segundo CAR se une a otro antígeno de entre CD19, CD22 o CD20 que es distinto del antígeno unido por el primer CAR.

15. El método del caso 14, en donde el primer CAR se une específicamente a CD19 y el segundo CAR se une específicamente a CD22.

16. El método de cualquiera de los casos 1-6, en donde las células que expresan el segundo CAR no comprenden un receptor que se una específicamente a dicho antígeno unido específicamente por el primer CAR.

17. El método de cualquiera de los casos 1-16, en donde el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable contra el segundo CAR en el plazo de aproximadamente 30 días, en el plazo de aproximadamente 60 días, o en el plazo de aproximadamente 90 días, desde la administración de las células que expresan el segundo CAR.

18. El método de cualquiera de los casos 1-17, en donde el segundo CAR comprende una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con el primer CAR.

19. El método del caso 18, en donde

la una o más diferencias comprenden por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con una región del primer CAR para la que se genera una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la administración de células que expresan el primer CAR; y/o

la una o más diferencias comprenden por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con cada región del primer ^cA^rpara la que se genera una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la administración de células que expresan el primer CAR.

20. El método de cualquiera de los casos 1-19, que comprende además, antes de la administración de células que expresan el segundo CAR, detectar la presencia de una respuesta inmune específica de CAR en el sujeto.

21. El método del caso 20, en donde la detección comprende identificar por lo menos una región del primer CAR para la que el sujeto muestra una respuesta inmune específica.

22. El método del caso 21, en donde el segundo CAR contiene una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con dicha región del primer CAR para el que la respuesta inmune es específica. 23. El método de cualquiera de los casos 19-22, en donde la región del primer CAR comprende una región dentro de una o más porciones del CAR seleccionadas del grupo que consiste de una porción scFv, una porción conectora, una secuencia de aminoácidos no endógena al sujeto, una secuencia derivada de una especie diferente de la del sujeto, y/o una unión entre dos dominios de CAR; y/o donde la región del primer CAR es una región de unión que comprende aminoácidos en cada lado de una unión entre dos dominios.

24. El método del caso 23, en donde:

la región comprende una región marco (FR) dentro de la porción scFv,

la región comprende una secuencia de FR de la cadena pesada

la región comprende una secuencia de CDR de la cadena pesada,

la región comprende una secuencia de FR de la cadena ligera, y/o

la región comprende una secuencia de CDR de la cadena ligera.

25. El método del caso 24, en donde la región comprende una región de unión, en donde la región de unión comprende hasta 15 aminoácidos contiguos directamente C-terminales de una unión que une un primer dominio y un segundo dominio del primer CAR y/o hasta 15 aminoácidos contiguos directamente N-terminales de la unión, y opcionalmente comprende además la unión.

26. El método del caso 25, en donde:

el primer dominio y/o el segundo dominio comprenden un dominio de una proteína humana natural o endógena o un dominio que tiene un 100% de identidad con un dominio o porción funcional del mismo de una proteína humana natural o endógena, en donde la proteína humana natural o endógena es expresada opcionalmente por el sujeto a tratar; y/o

el primer dominio y/o el segundo dominio comprende un dominio de unión extracelular, un dominio de bisagra, un dominio transmembrana o un dominio de señalización intracelular, dicho dominio de señalización intracelular es, opcionalmente, un dominio de señalización coestimuladora o un dominio de señalización citoplásmico de activación.

27. El método del caso 26, en donde el primer dominio y el segundo dominio no están presentes en la misma molécula in vivo en un sujeto humano, o no están presentes en una única proteína o polipéptido humano natural o endógeno.

28. El método del caso 26 o el caso 27, en donde el primer dominio y el segundo dominio son o comprenden, respectivamente, un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio bisagra, un dominio bisagra y un dominio transmembrana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora intracelular, y un dominio de señalización coestimuladora intracelular y un dominio de señalización citoplásmico de activación, que puede incluir porciones funcionales de tales dominios.

29. El método de cualquiera de los casos 26-28, en donde el primer dominio es o comprende un dominio transmembrana o una parte funcional del mismo y el segundo dominio es o comprende un dominio de señalización coestimuladora o una parte funcional del mismo.

30. El método del caso 29, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana CD28 o una parte funcional del mismo y el dominio de señalización coestimuladora es un dominio de señalización 4-1BB o una parte funcional del mismo.

31. El método de cualquiera de los casos 26-30, en donde el segundo CAR comprende:

un dominio de por lo menos un 95% de identidad de secuencia con el primer dominio y/o un dominio de por lo menos un 95% de identidad de secuencia con el segundo dominio;

un dominio de idéntica secuencia al primer dominio y un dominio de por lo menos un 95% de identidad de secuencia con el segundo dominio; o

un dominio de por lo menos un 95% de identidad de secuencia con el primer dominio y un dominio de idéntica secuencia al segundo dominio,

en donde por lo menos uno o ambos dominios presentes en el segundo CAR comprende por lo menos una o más diferencias de secuencias de aminoácidos en comparación con uno o ambos del primer dominio y el segundo dominio del primer CAR en la porción que comprende la región de unión modificada.

32. El método de cualquiera de los casos 29-31, en donde:

el primer CAR comprende un dominio transmembrana CD28 y un dominio coestimulador 4-1BB que juntos comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una variante o porción funcional del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 5 y comprende la región de unión; y

el segundo CAR comprende una secuencia que se modifica en comparación con el primer CAR, la modificación comprendiendo por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en una porción que comprende una secuencia entre el residuo 13 y 42 o entre 15 y 40, con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5.

33. El método de cualquiera de los casos 18-32, en donde el segundo CAR comprende no más de 20 diferencias de secuencia de aminoácidos en comparación con el primer CAR o el segundo CAR comprende por lo menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el primer CAR.

34. El método de cualquiera de los casos 18-33, en donde una región del segundo CAR que contiene por lo menos una de las una o más diferencias de secuencia:

contiene menos porciones de 8-15 aminoácidos, en comparación con la región correspondiente del primer CAR, que tiene una afinidad de unión por una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) de una IC50 de menos de 1000 nM; o

tiene una afinidad de unión por una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) que es menor que la afinidad de unión para la misma molécula de HLA de un fragmento peptídico que tiene la secuencia de la porción correspondiente de la región de unión del receptor quimérico de referencia; o

tiene una afinidad de unión de por lo menos un fragmento peptídico dentro de la región, o una afinidad de unión media reducida de todos los fragmentos peptídicos que tienen la secuencia de una porción de 8-15 aminoácidos dentro de la región, para una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA), en comparación con la región correspondiente del primer CAR.

35. El método de cualquiera de los casos 18-34, en donde se genera una respuesta inmunitaria detectable reducida en el sujeto después de la administración de células que expresan el segundo CAR a la región correspondiente del segundo CAR que comprende por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación a la respuesta inmune generada en el sujeto para la región en el primer CAR después de su administración al sujeto.

36. El método de cualquiera de los casos 1-17, en donde:

el primer CAR comprende un dominio transmembrana de CD28 o una parte funcional del mismo y un dominio de señalización coestimuladora de 4-1BB o una parte funcional del mismo; y

el segundo CAR comprende un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora que es distinto de uno o ambos de dichos dominios en el primer CAR.

37. El método de cualquiera de los casos 1-36, en donde el segundo CAR comprende por lo menos una región idéntica en la secuencia de aminoácidos a una región correspondiente del primer CAR.

38. El método del caso 37, en donde la región correspondiente del primer CAR es una región en la que el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable en el momento de la administración de las células que expresan el segundo CAR.

39. El método del caso 37 o el caso 38, en donde la región correspondiente del primer CAR comprende una región dentro de una porción del CAR seleccionada del grupo que consiste de un dominio coestimulador, un dominio que contiene ITAM, un dominio transmembrana, un marcador de transducción o expresión, una secuencia endógena al huésped y/o un dominio de anticuerpo derivado de la misma especie que el huésped. 40. El método de cualquiera de los casos 1-39, en donde el número máximo de células que expresan CAR, el área bajo la curva (AUC) para las células que expresan CAR a lo largo del tiempo y/o la duración de las células que expresan CAR detectables en el sujeto después de la administración de células que expresan el segundo CAR es mayor en comparación con la lograda mediante un método que comprende un régimen de dosificación alternativo que comprende realizar la administración de células que expresan el primer CAR seguido de realizar una segunda administración de células que expresan el primer CAR, dicha segunda administración siendo llevada a cabo en el mismo momento que la administración de células que expresan el segundo CAR.

41. El método de cualquiera de los casos 1-40, en donde:

el método da como resultado una concentración o número máximo de células que expresan CAR en la sangre del sujeto de por lo menos por lo menos o aproximadamente 10 células que expresan CAR por microlitro, por lo menos el 50% del número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por lo menos por lo menos aproximadamente 1 x 105 células que expresan CAR, o por lo menos 1000, o por lo menos 2000, o por lo menos 3000, o por lo menos 4000, o por lo menos 5.000 copias del ADN que codifica el CAR por microgramos de ADN; y/o

el día 30, el día 60 o el día 90 después del inicio de la administración de células que expresan el segundo CAR, las células que expresan CAR son detectables en la sangre o suero del sujeto; y/o

el día 30, el día 60 o el día 90 después del inicio de la administración de células que expresan el segundo CAR, la sangre del sujeto contiene por lo menos un 20% de células que expresan CAR, por lo menos 10 células que expresan CAR por microlitro o por lo menos 1 x 104 células que expresan CAR.

42. El método de cualquiera de los casos 1-41, en donde la dosis de células que expresan el primer CAR y/o la dosis de células que expresan el segundo CAR comprenden independientemente células en una cantidad suficiente para reducir la carga de una enfermedad o afección en el sujeto.

43. El método de cualquiera de los casos 1-42, en donde la administración de células que expresan el primer CAR y/o la administración de células que expresan el segundo CAR produce una reducción en la carga de la enfermedad o afección en el sujeto, tratando de este modo la enfermedad o afección.

44. El método de cualquiera de los casos 1-43, en donde las células son células T.

45. El método de cualquiera de los casos 1-44, en donde las células T son autólogas para el sujeto.

46. Un método de tratamiento, que comprende administrar células a un sujeto, en donde dichas células no expresan un primer receptor de antígeno quimérico (CAR) y expresan un segundo CAR, en donde:

dicho sujeto ha recibido anteriormente una administración de células que expresan el primer CAR; dicho primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad o afección en el sujeto; y

dicho segundo CAR se une específicamente al antígeno unido específicamente por el primer CAR o un antígeno diferente asociado con la enfermedad o afección en el sujeto.

47. El método del caso 46, en donde antes de administrar células que expresan el segundo CAR, se administran al sujeto células que expresan el primer CAR.

48. El método de cualquiera de los casos 46-47, en donde, en el momento o inmediatamente antes de la administración de células que expresan el segundo CAR:

la enfermedad o afección persiste en el sujeto; y/o

la enfermedad o afección ha recaído en el sujeto.

49. El método de cualquiera de los casos 46-48, en donde:

el tiempo entre la administración de células que expresan el primer CAR y la administración de células que expresan el segundo CAR es de por lo menos aproximadamente 28 días, por lo menos aproximadamente 35 días, por lo menos aproximadamente 42 días, por lo menos aproximadamente 49 días y/o por lo menos aproximadamente 60 días.

50. El método de cualquiera de los casos 46-49, en donde dicho primer CAR comprende por lo menos un epítopo inmunorreactivo que no está presente en dicho segundo CAR.

51. El método del caso 50, en donde:

52. El método de cualquiera de los casos 46-51, en donde dicho sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el segundo CAR antes de la administración.

53. El método de cualquiera de los casos 46-52, en donde el segundo CAR se une específicamente al mismo antígeno que el primer CAR.

54. El método de cualquiera de los casos 46-53, en donde la enfermedad o afección es un tumor.

55. El método de cualquiera de los casos 46-54, en donde la enfermedad o afección es una enfermedad maligna de células B.

56. El método del caso 53, en donde el primer CAR y el segundo CAR se unen específicamente al mismo epítopo de dicho antígeno.

57. El método de cualquiera de los casos 53-56, en donde el primer CAR compite por unirse a dicho antígeno con el segundo CAR.

58. El método de cualquiera de los casos 53-55 y 57, en donde el primer CAR y el segundo CAR se unen específicamente a distintos epítopos de dicho antígeno.

59. El método de cualquiera de los casos 46-58, en donde:

el segundo CAR se une específicamente a otro antígeno asociado con dicha enfermedad o afección en comparación con el antígeno al que se une el primer CAR; o

el segundo CAR no se une específicamente al antígeno al que se une específicamente el primer CAR.

60. El método de cualquiera de los casos 55-59, en donde el primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad maligna de células B que se selecciona de CD19, CD22 o CD20 y el segundo CAR se une a otro antígeno de entre CD19, CD22 o CD20 que es distinto del antígeno al que se une el primer CAR.

61. El método del caso 60, en donde el primer CAR se une específicamente a CD19 y el segundo CAR se une específicamente a CD22.

62. El método de cualquiera de los casos 46-52, en donde las células que expresan el segundo CAR no comprenden un receptor que se une específicamente a dicho antígeno al que se une específicamente el primer CAR.

63. El método de cualquiera de los casos 46-62, en donde el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable contra el segundo CAR en el plazo de aproximadamente 30 días, en el plazo de aproximadamente 60 días, o en el plazo de aproximadamente 90 días, desde la administración de células que expresan el segundo CAR.

64. El método de cualquiera de los casos 46-63, en donde el segundo CAR comprende una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con el primer CAR.

65. El método del caso 64, en donde

la una o más diferencias comprenden por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con cada región del primer CAR para la que se genera una respuesta inmune detectable en el sujeto después de la administración de células que expresan el primer CAR.

66. El método de cualquiera de los casos 46-65, que comprende además, antes de la administración de células que expresan el segundo CAR, detectar la presencia de una respuesta inmune específica del CAR en el sujeto.

67. El método del caso 66, en donde la detección comprende identificar por lo menos una región del primer CAR para la que el sujeto muestra una respuesta inmune específica.

68. El método del caso 67, en donde el segundo CAR contiene una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con dicha región del primer CAR para el que la respuesta inmune es específica. 69. El método de cualquiera de los casos 65-68, en donde la región del primer CAR comprende una región dentro de una o más porciones del CAR seleccionadas del grupo que consiste de una porción scFv, una porción conectora, una secuencia de aminoácidos no endógena al sujeto, una secuencia derivada de una especie diferente a la del sujeto, y/o una unión entre dos dominios de CAR; y/o donde la región del primer CAR es una región de unión que comprende aminoácidos en cada lado de una unión entre dos dominios.

70. El método del caso 69, en donde:

la región comprende una región marco (FR) dentro de la porción scFv,

la región comprende una secuencia de FR de la cadena pesada

la región comprende una secuencia de CDR de la cadena pesada,

la región comprende una secuencia de FR de la cadena ligera, y/o

la región comprende una secuencia de CDR de la cadena ligera.

71. El método del caso 69, en donde la región comprende una región de unión, en donde la región de unión comprende hasta 15 aminoácidos contiguos directamente C-terminales de una unión que une un primer dominio y un segundo dominio del primer CAR y/o hasta 15 aminoácidos contiguos directamente N-terminales de la unión, y opcionalmente comprende además la unión.

72. El método del caso 71, en donde:

el primer dominio y/o el segundo dominio comprenden un dominio de una proteína humana natural o endógena o un dominio que tiene una identidad del 100% con un dominio o porción funcional del mismo de una proteína humana natural o endógena, en donde la proteína humana natural o endógena se expresa opcionalmente por el sujeto a tratar; y/o

73. El método del caso 72, en donde el primer dominio y el segundo dominio no están presentes en la misma molécula in vivo en un sujeto humano, o no están presentes en una única proteína o polipéptido humano natural o endógeno.

74. El método del caso 72 o el caso 73, en donde el primer dominio y el segundo dominio son o comprenden, respectivamente, un dominio de unión de ligando extracelular y un dominio de bisagra, un dominio de bisagra y un dominio transmembrana, un dominio de transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora intracelular, y un dominio de señalización coestimuladora intracelular y un dominio de señalización citoplásmico de activación, que puede incluir porciones funcionales de tales dominios.

75. El método de cualquiera de los casos 72-74, en donde el primer dominio es o comprende un dominio transmembrana o una parte funcional del mismo y el segundo dominio es o comprende un dominio de señalización coestimuladora o una parte funcional del mismo.

76. El método del caso 75, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 o una parte funcional del mismo y el dominio de señalización coestimuladora es un dominio de señalización de 4-1BB o una parte funcional del mismo.

77. El método de cualquiera de los casos 72-76, en donde el segundo CAR comprende:

en donde por lo menos uno o ambos dominios presentes en el segundo CAR comprende por lo menos una o más diferencias de secuencia de aminoácidos en comparación con uno o ambos del primer dominio y el segundo dominio del primer CAR en la porción que comprende la región de unión modificada.

78. El método de cualquiera de los casos 75-77, en donde:

el primer CAR comprende un dominio transmembrana de CD28 y un dominio coestimulador de 4-1BB que juntos comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una variante o porción funcional del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 5 y comprende la región de unión; y

79. El método de cualquiera de los casos 64-78, en donde el segundo CAR comprende no más de 20 diferencias de secuencia de aminoácidos en comparación con el primer CAR o el segundo CAR comprende por lo menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el primer CAR.

80. El método de cualquiera de los casos 64-79, en donde una región del segundo CAR que contiene por lo menos una de las una o más diferencias de secuencia:

contiene menos porciones de 8-15 aminoácidos, en comparación con la región correspondiente del primer CAR, que tiene una afinidad de unión para una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) de una IC50 de menos de 1000 nM; o

81. El método de cualquiera de los casos 64-80, en donde se genera una respuesta inmune detectable reducida en el sujeto después de la administración de células que expresan el segundo CAR a la región correspondiente del segundo CAR que comprende por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con la respuesta inmune generada en el sujeto para la región en el primer CAR después de su administración al sujeto.

82. El método de cualquiera de los casos 46-63, en donde:

83. El método de cualquiera de los casos 46-82, en donde el segundo CAR comprende por lo menos una región idéntica en la secuencia de aminoácidos a una región correspondiente del primer CAR.

84. El método del caso 83, en donde la región correspondiente del primer CAR es una región para la que el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable en el momento de la administración de las células que expresan el segundo CAR.

85. El método del caso 83 o del caso 84, en donde la región correspondiente del primer CAR comprende una región dentro de una porción del CAR seleccionada del grupo que consiste de un dominio coestimulador, un dominio que contiene ITAM, un dominio transmembrana, un marcador de transducción o expresión, una secuencia endógena al huésped y/o un dominio de anticuerpo derivado de la misma especie que el huésped. 86. El método de cualquiera de los casos 46-85, en donde el número máximo de células que expresan CAR, el área bajo la curva (AUC) para las células que expresan CAR a lo largo del tiempo, y/o la duración de las células que expresan CAR detectables en el sujeto que sigue a la administración de células que expresan el segundo CAR es mayor en comparación con la lograda mediante un método que comprende un régimen de dosificación alternativo que comprende realizar la administración de células que expresan el primer CAR seguido de realizar una segunda administración de células que expresan el primer CAR, dicha segunda administración siendo llevada a cabo en el mismo momento que la administración de células que expresan el segundo CAR.

87. El método de cualquiera de los casos 46-86, en donde:

el método da como resultado una concentración o número máximo de células que expresan CAR en la sangre del sujeto de por lo menos o aproximadamente 10 células que expresan CAR por microlitro, por lo menos el 50% del número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por lo menos por lo menos aproximadamente 1 x 105 células que expresan CAR, o por lo menos 1000, o por lo menos 2000, o por lo menos 3000, o por lo menos 4000, o por lo menos 5.000 copias de ADN que codifica el CAR por microgramos de ADN; y/o

88. El método de cualquiera de los casos 46-87, en donde la dosis de células que expresan el primer CAR y/o la dosis de células que expresan el segundo CAR comprenden independientemente células en una cantidad suficiente para reducir la carga de una enfermedad o afección en el sujeto.

89. El método de cualquiera de los casos 46-88, en donde la administración de células que expresan el primer CAR y/o la administración de células que expresan el segundo CAR produce una reducción de la carga de la enfermedad o afección en el sujeto, tratando de este modo la enfermedad o afección.

90. El método de cualquiera de los casos 46-89, en donde las células son células T.

91. El método de cualquiera de los casos 46-90, en donde las células T son autólogas para el sujeto.

92. Uso de una composición que comprende células que expresan un segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección de un sujeto tratado previamente con células que expresan un primer receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde:

el primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección en el sujeto; y el segundo CAR se une específicamente al antígeno al que se une específicamente el primer CAR o un antígeno diferente asociado con la enfermedad o afección.

93. Una composición que comprende células que expresan un segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto tratado previamente con un primer receptor quimérico (CAR), en donde:

94. El uso del caso 92 o la composición del caso 93, en donde el uso es en un sujeto que:

muestra una respuesta inmune humoral y/o mediada por células detectable específica para el primer CAR; en donde la enfermedad o afección persiste en el sujeto después de la administración de células que expresan el primer CAR; y/o

en donde la enfermedad o afección ha recaído en el sujeto después de la administración de células que expresan el primer CAR.

95. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-94, en donde la composición es para uso por lo menos aproximadamente 28 días, por lo menos aproximadamente 35 días, por lo menos aproximadamente 42 días, por lo menos aproximadamente 49 días y/o por lo menos aproximadamente 60 días después de la administración de células que expresan el primer CAR.

96. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-95, en donde dicho primer CAR comprende por lo menos un epítopo inmunorreactivo que no está presente en dicho segundo CAR.

97. El uso o composición del caso 96, en donde:

98. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-97, en donde dicho sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el segundo CAR antes del uso.

99. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-98, en donde el segundo CAR se une específicamente al mismo antígeno que el primer CAR.

100. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-99, en donde la enfermedad o afección es un tumor. 101. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-100, en donde la enfermedad o afección es una enfermedad maligna de células B.

102. El uso o composición de cualquiera de los casos 56-101, en donde el primer CAR y el segundo CAR se unen específicamente al mismo epítopo de dicho antígeno.

103. El uso o composición de cualquiera de los casos 99-102, en donde el primer CAR compite por unirse a dicho antígeno con el segundo CAR.

104. El uso o composición de cualquiera de los casos 99-101 y 103, en donde el primer CAR y el segundo CAR se unen específicamente a distintos epítopos de dicho antígeno.

105. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-98, en donde:

106. El uso o composición de cualquiera de los casos 101-105, en donde el primer CAR se une específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad maligna de células B que se selecciona de CD19, c D22 o CD20 y el segundo CAR se une a otro antígeno de entre CD19, CD22 o CD20 que es distinto del antígeno al que se une el primer CAR.

107. El uso o composición del caso 106, en donde el primer CAR se une específicamente a CD19 y el segundo CAR se une específicamente a CD22.

108. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-98, en donde las células que expresan el segundo CAR no comprenden un receptor que se una específicamente a dicho antígeno al que se une específicamente el primer CAR.

109. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-108, en donde el uso del segundo CAR no da como resultado una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable contra el segundo CAR en el plazo de aproximadamente 30 días, en el plazo de aproximadamente 60 días, o en el plazo de aproximadamente 90 días, desde su administración al sujeto.

110. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-109, en donde el segundo CAR comprende una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con el primer CAR.

111. El uso o composición del caso 110, en donde

112. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-11, en donde el sujeto es uno en el que se ha detectado en el sujeto una respuesta inmune específica de CAR para el primer CAR.

113. El uso o composición del caso 112, en donde la detección comprende identificar por lo menos una región del primer CAR para la que el sujeto muestra una respuesta inmune específica.

114. El uso o composición del caso 113, en donde el segundo CAR contiene una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con dicha región del primer CAR para el que la respuesta inmune es específica.

115. El uso o composición de cualquiera de los casos 111-114, en donde la región del primer CAR comprende una región dentro de una o más porciones del CAR seleccionadas del grupo que consiste de una porción scFv, una porción conectora, una secuencia de aminoácidos no endógena para el sujeto, una secuencia derivada de una especie diferente a la del sujeto, y/o una unión entre dos dominios de CAR; y/o donde la región del primer CAR es una región de unión que comprende aminoácidos en cada lado de una unión entre dos dominios.

116. El uso o composición del caso 115, en donde:

la región comprende una región marco (FR) dentro de la porción scFv,

la región comprende una secuencia de FR de la cadena pesada

la región comprende una secuencia de CDR de la cadena pesada,

la región comprende una secuencia de FR de la cadena ligera, y/o

la región comprende una secuencia de CDR de la cadena ligera.

117. El uso o composición del caso 115, en donde la región comprende una región de unión, en donde la región de unión comprende hasta 15 aminoácidos contiguos directamente C-terminales de una unión que une un primer dominio y un segundo dominio del primer CAR y/o hasta 15 aminoácidos contiguos directamente N-terminales de la unión, y opcionalmente comprende además la unión.

118. El uso o composición del caso 117, en donde:

el primer dominio y/o el segundo dominio comprende un dominio de unión extracelular, un dominio de bisagra, un dominio transmembrana o un dominio de señalización intracelular, dicho dominio de señalización intracelular es, opcionalmente, un dominio de señalización coestimuladora o un dominio de señalización citoplásmico activador.

119. El uso o composición del caso 117 o el caso 118, en donde el primer dominio y el segundo dominio no están presentes en la misma molécula in vivo en un sujeto humano, o no están presentes en una única proteína o polipéptido humano natural o endógeno.

120. El uso o composición de cualquiera de los casos 117-119, en donde el primer dominio y el segundo dominio son o comprenden, respectivamente, un dominio de unión de ligando extracelular y un dominio de bisagra, un dominio de bisagra y un dominio transmembrana, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora intracelular, y un dominio de señalización coestimuladora intracelular y un dominio de señalización citoplasmático de activación, que puede incluir porciones funcionales de tales dominios.

121. El uso o composición de cualquiera de los casos 117-120, en donde el primer dominio es o comprende un dominio transmembrana o una parte funcional del mismo y el segundo dominio es o comprende un dominio de señalización coestimuladora o una parte funcional del mismo.

122. El uso o composición del caso 121, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 o una parte funcional del mismo y el dominio de señalización coestimuladora es un dominio de señalización de 4-1BB o una parte funcional del mismo.

123. El uso o composición de cualquiera de los casos 117-122, en donde el segundo CAR comprende:

un dominio de secuencia idéntica al primer dominio y un dominio de por lo menos un 95% de identidad de secuencia con el segundo dominio; o

124. El uso o composición de cualquiera de los casos 121-132, en donde:

el segundo CAR comprende una secuencia que se modifica en comparación con el primer CAR, la modificación comprendiendo por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en una porción que comprende una secuencia entre el residuo 13 y 42 o entre 15 y 40 con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5.

125. El uso o composición de cualquiera de los casos 110-124, en donde el segundo CAR comprende no más de 20 diferencias de secuencia de aminoácidos en comparación con el primer CAR o el segundo CAR comprende por lo menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el primer CAR.

126. El uso o composición de cualquiera de los casos 110-125, en donde una región del segundo CAR que contiene por lo menos una de las una o más diferencias de secuencia:

contiene menos porciones de 8-15 aminoácidos, en comparación con la región correspondiente del primer CAR, que tiene una afinidad de unión por una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) de una IC50 de menos de 1000 nM;

o tiene una afinidad de unión por una molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) que es menor que la afinidad de unión para la misma molécula de HLA de un fragmento peptídico que tiene la secuencia de la porción correspondiente de la región de unión del receptor quimérico de referencia; o

127. El uso o composición de cualquiera de los casos 110-126, en donde el uso del segundo CAR produce una reducción en la respuesta inmune detectable que se genera en el sujeto para la región correspondiente del segundo CAR que comprende por lo menos una diferencia de secuencia de aminoácidos en comparación con la respuesta inmune generada en el sujeto para la región en el primer CAR después de su administración al sujeto.

128. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-113, en donde:

129. El uso o composición de cualquiera de los casos 92-128, en donde el segundo CAR comprende por lo menos una región idéntica en la secuencia de aminoácidos a una región correspondiente del primer CAR.

130. El uso o composición del caso 129, en donde la región correspondiente del primer CAR es una región en la que el sujeto no muestra una respuesta inmune humoral o mediada por células detectable en el momento de la administración de las células que expresan el segundo CAR.

131. El uso o composición del caso 129 o el caso 130, en donde la región correspondiente del primer CAR comprende una región dentro de una porción del CAR seleccionada del grupo que consiste de un dominio coestimulador, un dominio que contiene ITAM, un dominio transmembrana, un marcador de transducción o expresión, una secuencia endógena al huésped y/o un dominio de anticuerpo derivado de la misma especie que el huésped.

XNI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen solo con propósitos ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Análisis de respuestas inmunes del huésped específicas de productos transgénicos

Se obtuvieron muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes y después del tratamiento de cuatro (4) sujetos con enfermedades malignas de células B tratados con células T autólogas que expresan un CAR específico de CD19. El CAR incluía un scFv anti-CD19 derivado de un anticuerpo murino, un dominio bisagra, un dominio transmembrana de CD28, un dominio de señalización intracelular de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular de CD3-zeta, un dominio de T2A y una porción de EGFR truncada (EGFRt).

Se evaluaron las PBMC antes y después de la infusión (día 42) obtenidas de los sujetos para detectar la presencia o ausencia de respuestas inmunes anti-CAR específicas esencialmente como describen Berger et al. Blood. marzo de 2006; 107(6): 2294-2302, Berger et al. J Virol. enero de 2001 75(2): 799-808, Riddell et al. Nature Medicine. febrero 1996 2(2): 216-223, Berger et al. Blood. febrero de 2005 105(4): 1640-1647. Brevemente, se estimularon las PBMC (respondedoras) in vitro con células autólogas irradiadas con rayos gamma transducidas con el CAR expresado por las células administradas (estimuladores en una proporción de respondedor a estimulador de 1:1 o 2:1). A continuación, los cultivos se evaluaron en un ensayo de liberación de cromo para determinar la citotoxicidad contra Células T transducidas con CAR marcadas con 51Cr ("CD19 CAR") y no transducidas ("Mock") (objetivos) en varias proporciones de efector a objetivo (E/T). Después de la coincubación, se cuantificó la liberación de cromo y se determinó el porcentaje de lisis máxima alcanzable en cada muestra.

Los resultados de las muestras derivadas de un paciente ejemplar se muestran en la Figura 1, que representa la actividad citolítica de las PBMC antes de la infusión y después de la infusión en el día 42. Mientras que no se detectó actividad citolítica específica para las células objetivo transducidas con CAR en ningún cultivo derivado de PBMC previo a la infusión, en dos de los cuatro sujetos evaluados, se detectó actividad lítica específica de CAR en cultivos derivados de muestras de PBMC posteriores a la infusión. Estos resultados indican que se pueden desarrollar respuestas inmunes específicas de CAR después de una única infusión de células T que expresan CAR.

Se llevó a cabo un mapeo de epítopos para evaluar las regiones del CAR reconocidas por las respuestas inmunes específicas. Las muestras de p Bm C antes y después de la infusión se estimularon en presencia de grupos individuales de múltiples péptidos de 15 mer, con secuencias que representan porciones superpuestas (superposición de 11 aminoácidos) de la longitud completa de una secuencia de aproximadamente 500 aminoácidos del CAR expresada por las células administradas. Las células se tiñeron con anticuerpos para detectar la expresión de superficie de CD8 y CD4 y la expresión intracelular de citoquinas. Se evaluaron veintitrés (23) grupos, cada uno de los cuales contenía diez (10) péptidos cada uno y colectivamente incluían 125 péptidos superpuestos individuales, con cada péptido representado en por lo menos dos de los grupos.

Este diseño permitió la generación de una cuadrícula analítica para evaluar respuestas específicas para péptidos individuales, por lo que un péptido presente en más de un grupo detectado como aciertos en este ensayo se consideró un acierto de péptido potencialmente inmunogénico. Para los dos pacientes en los que se había detectado una respuesta inmune específica de CAR, se identificaron seis y tres péptidos, respectivamente.

Se realizaron ensayos de ELISpot individuales usando un anticuerpo de captura anticitoquinas para evaluar la presencia o ausencia de una respuesta inmune específica para cada uno de estos éxitos individuales (ver Berger et al. (2006); Berger et al. (2001); Riddell et al. (1996); y Berger et al. (2005), supra). Los resultados de un ensayo ejemplar para un paciente se muestran en la FIG. 2. Se detectaron respuestas inmunes específicas contra péptidos con secuencias dentro de la porción de la Vh del scFv del CAR en ambos pacientes evaluados (incluyendo las regiones dentro de las regiones de FR1, CDR1 y FR2 para un paciente y dentro de FR3 para el otro). Para el primer paciente, también se detectaron respuestas inmunes específicas contra dos péptidos de 15 mer superpuestos, cada uno de los cuales contiene la unión entre el dominio transmembrana y el dominio coestimulador del CAR (marcado como "sitio de fusión" en la FIG 2). Estos dos péptidos de 15 mer superpuestos tenían las secuencias de aminoácidos AFIIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 8) y FWVKRGRKKLLYIFK (SEQ ID NO: 9), respectivamente. En otro estudio después de la administración con un CAR diferente que tiene un scFv murino, dominios transmembrana y coestimuladores de CD28 y un dominio zeta CD3, usando métodos similares, también se detectó una respuesta inmune para un sujeto contra un grupo que contenía porciones de la V^hde un scFv anti-CD19 y para otro sujeto en un grupo que contenía porciones de unión.

No se detectaron respuestas inmunes específicas en los pacientes mediante este ensayo contra péptidos dentro de otras regiones. Por ejemplo, en este ensayo, no se detectaron respuestas específicas contra péptidos que tenían secuencias dentro de otras CDR o regiones marco del scFv, péptidos dentro de regiones de dominio coestimulador o transmembrana pero que no abarcaban la unión entre los dos, o péptidos dentro de la región EGFRt o CD3-Z del CAR. No se detectaron respuestas inmunes específicas contra secuencias endógenas.

Ejemplo 2: Análisis in silico de péptidos derivados de regiones de unión de un CAR para la unión a HLA Clase I y HLA Clase II

Se usaron las herramientas de predicción de epítopos de células T, disponibles de la Base de datos de Epítopos Inmunes y el recurso de análisis (IEDB), para el análisis in silico para predecir las afinidades de unión al MHC y otras propiedades relacionadas con la inmunogenicidad potencial para cada una de una serie de secuencias de péptidos superpuestas dentro de una porción de una secuencia de CAR ejemplar. La porción incluía un espaciador que tenía un dominio de bisagra derivado de inmunoglobulina, un dominio transmembrana de CD28 humano, un dominio coestimulador de 4-1BB humano y un dominio de señalización de CD3zeta humano. En la porción evaluada, el dominio bisagra era un dominio bisagra de IgG4 humano, el dominio transmembrana de CD28 comprendía una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2 y el dominio coestimulador de 4-1BB contenía la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3. Esta porción por tanto contenía tres uniones entre diferentes dominios derivados de secuencias humanas (cuyas uniones pueden haber representado sitios de inmunogenicidad potencial contra un CAR tras la administración a un sujeto humano); la unión entre la región espaciadora y el dominio transmembrana, la unión entre el dominio transmembrana y el dominio coestimulador, y la unión entre el dominio coestimulador y el dominio de señalización intracelular (ver Figuras 3A y 3B).

Para identificar porciones de la secuencia que pueden tener propiedades particulares que hacen que sea más probable que se presenten a las células T, se predijeron afinidades por la unión a 27 alelos individuales de HLA de clase I y 56 alelos individuales de HLA de clase II para péptidos superpuestos a lo largo de la longitud de la porción, de 8-14 aminoácidos de longitud y de 15 aminoácidos de longitud (que contenían un núcleo de unión de 9 mer), respectivamente. Estos alelos, que representan colectivamente los alelos de HLA presentes en más del 99% de la población mundial, y su frecuencia aproximada en la población de los Estados Unidos se enumeran en las Tablas 1Ay 1B.

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Se usaron herramientas de predicción de epítopos de células T basadas en algoritmos disponibles de la IEDB para predecir los valores de IC50 para la unión a moléculas de HLA de clase I para cada péptido de 8-14 aminoácidos en el conjunto de datos usando ANN (Nielsen et al. (2003) Protein Sci., 12:1007-1017 y Lundegaard et al. (2008) NAR, 36:W509-512) y, en algunos casos, una o más predicciones adicionales usando SMM (Peters y Sette (2005) BMC Bioinformatics, 6:132) y comblib (Sidney et al. (2008) Immunome Res. 4:2, o la herramienta Consensus (ver Kim, et al. (2012) Recurso de análisis de la base de datos de epítopos inmunes, NAR (combinando predicciones de cualquiera de los anteriores). Las predicciones para los valores de IC50 para la unión a HLA clase II para cada péptido de 15 aminoácidos en el conjunto de datos se hizo usando el método NetMHCIIpan (Karosiene et al. (2013) Immunogenetics 65(10):711; Nielsen et al. (2008) PLoS Comput Biol.4(7)e1000107). Para cada posición individual dentro de la porción de la secuencia de aminoácidos del CAR, se determinó el número total de secuencias en el conjunto de datos que incluían la posición y se predijo que se unirían a cualquiera de los alelos de clase I o clase II con una IC50 prevista de menos de 50 nm. Las FIG. 4^a(HLA clase I) y 4B (HLA clase II), representan los resultados para los alelos de clase I y clase II, respectivamente, mostrando una cobertura posicional a lo largo de la secuencia, en base al número total determinado, ponderado de acuerdo con la frecuencia de los alelos de HLA individuales en la población. El área bajo la curva (AUC) en toda la región evaluada fue de aproximadamente 1321 para la unión de HLA de clase I y de 2943 para la unión de HLA de clase II. La AUC para la región del dominio coestimulador transmembrana fue de aproximadamente 931 para la unión de HLA de clase I y de 2212 para la unión de HLA de clase II.

Como se muestra en las FIGS. 4A y 4B, se predijo por este método que ciertas porciones de la secuencia contenían fragmentos con mayor probabilidad de unirse bien en complejos de MHC y, por lo tanto, se presentaban como epítopos para un posible reconocimiento por las células T. La afinidad de unión por los alelos HLA por sí sola no predice necesariamente la inmunogenicidad. Como los dominios individuales (por ejemplo, transmembrana, coestimulador) en este ejemplo de CAR eran derivados de humano, tras la administración a un sujeto humano, era menos probable que se desarrollasen respuestas inmunogénicas contra un epítopo dentro de cualquiera de estas regiones individuales solo (en oposición a un epítopo que abarca múltiples regiones que no están normalmente asociadas entre sí, y/o que incluye una unión entre tales regiones). Por ejemplo, incluso para un péptido que se predice que se une bien y se presenta en el contexto de una molécula de MHC, si el péptido se derivó completamente de una proteína endógena, puede reconocerse como "propio y, por tanto, puede fallar al inducir una respuesta inmune productiva. Por ejemplo, mientras que ciertas regiones completamente dentro de un único dominio transmembrana o citoplasmático puntuaron altamente en la predicción de afinidad de unión a HLA, en los resultados descritos en el Ejemplo 1, no se detectaron respuestas inmunes contra secuencias de péptidos únicamente dentro de cualquiera de estos dominios de una secuencia de CAR similar. Por consiguiente, aunque se observaron varios "puntos calientes" con respecto a la afinidad de unión a HLA predicha, la evaluación y la alteración posteriores se enfocaron en aquellas áreas que no solo tenían valores de IC50 predichos más altos, sino que también incluían epítopos potenciales que abarcaban la unión entre diferentes dominios derivados de dos proteínas diferentes.

En particular, se evaluó adicionalmente una región de unión que incluye uno o más epítopos de péptidos potenciales que abarcan la unión del dominio transmembrana de CD28 y el dominio de señalización de 4-1BB del CAR ejemplar. Con respecto a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, que incluye el dominio transmembrana de CD28 humano ejemplar (SEQ ID NO: 2) y el dominio coestimulador 4-1BB humano ejemplar (SEQ ID NO: 3), la región de unión evaluada contenía 13 aminoácidos a cada lado de la unión que abarca los dominios de transmembrana de CD28 y coestimulador de 4-1BB de la siguiente manera: FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFNFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:5), en donde una región de unión de 26 aminoácidos se indica en negrita, y los dos aminoácidos exactamente C' y N' de la unión entre los dominios se indican con subrayado. La región de unión de 26 aminoácidos evaluada se expone en la SEQ ID NO: 137 y corresponde a los residuos de aminoácidos 15 a 40 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.

Se llevó a cabo un modelado in silico para identificar una o más modificaciones de aminoácidos (mutaciones) dentro de la región de unión de 26 aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 137 dando como resultado fragmentos peptídicos que se predijo que se unirían con valores altos de IC50 a alelos de clase I y clase II, y por tanto es probable que reduzcan el potencial para inducir inmunogenicidad contra un CAR que contiene esta región. Específicamente, se hicieron predicciones para fragmentos peptídicos variantes de la región de unión que contenían una o más mutaciones en las posiciones de los residuos de aminoácidos correspondientes a las posiciones 14, 17 y 20 con numeración con referencia a la SEQ ID NO: 137 (que corresponden a una o más mutaciones en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 28, 31 y 34 con numeración con referencia a la SEQ ID NO: 5). En este estudio ejemplar, estos residuos se eligieron para un análisis adicional después de la mutagénesis in silico y las predicciones de unión de todos los epítopos de alta afinidad en los que se examinaron todos los posibles reemplazos de un único aminoácido a través de ese epítopo para determinar su impacto sobre los valores de IC50 previstos. Se identificaron los residuos que dieron como resultado mayores predicciones de IC50 (disminución de la unión), que identificaron los residuos anteriores como sensibles a los reemplazos.

Se evaluó una serie de regiones de unión variantes diferentes, cada una de las cuales contenía uno o más reemplazos de aminoácidos en la posición(es) evaluadas, en comparación con la región de unión no mutada dentro de la secuencia de CAR ejemplar. Se eligió un subconjunto ejemplar de reemplazos de aminoácidos en las posiciones identificadas que pueden ser menos perjudiciales para la estructura o función de la región transmembrana del dominio de señalización coestimuladora. Además, se eligieron reemplazos que eran capaces de afectar a más de un epítopo a la vez, ya que los epítopos se superponen. Específicamente, las regiones de unión variantes individuales contenían las siguientes modificaciones (reemplazos de aminoácidos): K28A, K28H, K28L, K28Q, K28S, R32A, R31H, R31L, R31N, L34A, L34S, K28Q/R31A, K28Q/R31N, K28Q/R31S, K28Q/L34A, K28Q/L34S, R31N/L34A, R31N/L34S, K28Q/R31N/L34A, K28Q/R31N/L34S,, con la numeración con referencia a la SEQ ID NO: 5.

Para las regiones de unión no variante y variante, se obtuvieron puntuaciones de inmunogenicidad ponderadas para los alelos de clase I y clase II, usando las herramientas de predicción de epítopos de células T disponibles de IEDB. Las puntuaciones se derivaron usando valores de IC50 predichos para cada una de una serie péptidos superpuestos de 8-mer a 14-mer (para cada uno de los 27 alelos HLA clase I, individualmente) y una serie de péptidos superpuestos de 15-mer (para cada uno de los 56 alelos HLA de clase II, individualmente) dentro de la región de unión de 26 aminoácidos respectiva (variante o no variante), y se ponderaron en base a la frecuencia relativa en la población de los alelos de HLA de clase I y de clase II individuales. Una puntuación relativa más alta indica un grado más alto de unión prevista.

Los resultados se exponen en la FIG. 5. Los resultados demuestran la capacidad de disminuir la puntuación global de inmunogenicidad de HLA clase I prevista dentro de una región de unión de CAR modificando los aminoácidos dentro de la región. Los resultados también confirman la capacidad de reducir la afinidad de unión de HLA de clase I prevista (y, por tanto, la puntuación de inmunogenicidad prevista reducida) sin dar como resultado un aumento sustancial en la puntuación de inmunogenicidad prevista para la unión de HLA de clase II. Por tanto, en general, los resultados mostraron que las modificaciones de aminoácidos dentro de una región que abarca una unión entre un dominio transmembrana de CD28 y un dominio coestimulador de 4-1BB de un CAR podrían realizarse y producir una reducción general en la afinidad predicha para unión de HLA humana, que sería consistente con una reducción del potencial de inmunogenicidad, tras la administración a un sujeto humano, de un receptor quimérico idéntico a un receptor que tiene esta región, pero que contiene la modificación o combinación de modificaciones en esta región.

Ejemplo 3: Comparación del análisis in silico y la unión in vitro de péptidos derivados de las regiones de unión de un CAR para la unión a HLA de clase I

Se evaluaron in vitro las afinidades de unión reales para ciertos alelos HLA de clase I (A*02:01, A*03:01, A*11:01, y B*08:01) para las secuencias del péptido de 9 aminoácidos superpuesto ejemplares dentro de una porción de la región de unión de 26 aminoácidos que abarca la unión de c D28 y 4-1BB. Específicamente, la evaluación fue de una serie de péptidos de 9-mer superpuestos derivados de la secuencia VAFIIFWVKRGRKKLL (expuesta en la SEQ ID NO: 7), que contiene una porción del dominio transmembrana de CD28 y el dominio coestimulador de 4-1BB que abarca la unión entre los dominios (enlace que une los dos aminoácidos subrayados). Además, también se evaluó una serie de péptidos 9-mer superpuestos de cada una de varias variantes diferentes de esta porción, cada variante conteniendo una mutación o mutaciones en esta región como se describe en el Ejemplo 2.

Se sintetizaron los diversos péptidos superpuestos de 9-mer y se probó su pureza mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Luego los péptidos sintéticos se incubaron con moléculas MHC recombinantes para evaluar las propiedades de unión usando el sistema REVEAL Epitope Discovery, que es un ensayo de unión de alto rendimiento que mide el grado en que cada péptido es capaz de estabilizar un complejo de MHC-péptido ternario (Prolmmune, Oxford, Reino Unido). Cada péptido se probó por separado para esta capacidad con respecto a cada uno de los alelos de HLA de clase I, normalizados al grado observado para un control positivo (epítopo de células T conocido para el alelo relevante). Los resultados se informan como una puntuación, en la que la unión se normalizó al péptido de control positivo fijado al 100%. En este análisis, generalmente se consideró que una puntuación superior a 50 representaba una unión de buena o de alta afinidad.

Los resultados se compararon con los valores de unión previstos (IC50) obtenidos para la unión del mismo complejo péptido:MHC, usando los métodos de predicción in silico como se describe en el Ejemplo 2. Como el valor máximo de IC50 predicho fue de aproximadamente 50.000, los valores de IC50 se transformaron logarítmicamente, se restaron de LOG(50000) y se dividieron por LOG(50000) para obtener una puntuación in silico normalizada ((Log(50000)-logIC50)/Log(50000)). En este análisis, se consideró que una puntuación de predicción de unión in silico superior a 2,0 representa generalmente una unión de afinidad buena o de alta afinidad predicha.

Los resultados se exponen en la Tabla 2A(HLA-A*02: 1 y HLA-A*03:01) y la Tabla 2B (HLA-A*11:01 y HLA-B*08:01). En general, las predicciones de unión in silico fueron predictivas de los resultados reales de unión in vitro. En algunos casos, se predijo in silico una unión relativamente más alta, pero no se observó en el ensayo in vitro.

Los resultados también fueron consistentes con que la afinidad de unión predicha es generalmente predictiva de la afinidad medida en el ensayo in vitro. Además, los resultados demostraron una reducción con éxito de la afinidad de unión a un HLA mediante modificaciones dentro de una región de unión, y que era posible modificar la secuencia de una manera que resultaba en una afinidad de unión o puntuación prevista o real menor de uno de los potenciales epítopos superpuestos, sin aumentar (o al mismo tiempo también reducir) la afinidad o puntuación de unión por otro de los epítopos superpuestos que contienen el mismo residuo. En algunos casos, tales mutaciones o modificaciones pueden ser particularmente ventajosas. Como ejemplo no limitativo de los resultados, las modificaciones K29L, R31H, L34S y/o L34A, con referencia a la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 5, dieron como resultado generalmente una afinidad de unión o puntuación prevista o real reducida para por lo menos un alelo de HLA y/o por lo menos un péptido dentro de la región evaluada, sin dar como resultado un afinidad de unión más alta para otro alelo de HLA y/o sin dar como resultado una afinidad de unión más alta para otro péptido.

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Ejemplo 4: Análisis de péptidos derivados de la región de unión de un CAR para la unión a HLA-A2:01

Para identificar péptidos derivados de CAR potencialmente capaces de inducir respuestas inmunogénicas, se evaluaron in silico una serie de péptidos superpuestos dentro de la secuencia no variante (de referencia) que contiene la unión entre el dominio transmembrana de CD28 y el dominio coestimulador de 4-1BB de un CAR. Se usaron algoritmos para predecir las afinidades de unión por el surco peptídico de una molécula de MHC de clase I humana común (HLA-A2:01) usando análisis in silico para predecir la afinidad por la unión. Como se expone en la FIG. 3, la porción evaluada del CAR tenía la secuencia Y^sLLVTVAFIIFWV^kR^gRKKLLYIFKQPF (expuesta en la SEQ ID NO: 6), que contiene una porción del dominio transmembrana de CD28 (expuesta en la SEQ ID NO: 2) y una porción del dominio coestimulador de 4-1BB (expuesta en la SEQ ID NO: 3), con los residuos que abarcan la unión de los dominios mostrados en subrayado. La afinidad de unión de HLA-A2:01 prevista se evaluó in silico para una serie de 140 péptidos superpuestos de 8-14 aminoácidos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6. Treinta y cinco (35) de los péptidos contenían solo la secuencia de la porción del dominio transmembrana; 35 de los péptidos contenían solo de la porción del dominio coestimulador, y 70 de los péptidos tenían una secuencia de región de unión o fusión, que contenía residuos de aminoácidos que formaban un puente en la unión entre los dominios. Para esta evaluación, se consideró que los fragmentos peptídicos que se predice que se unirán a HLA-A2:01 con una constante de disociación de 0 nM a 50 nM se unirán con alta afinidad. Se consideró que los fragmentos peptídicos que se predice que se unirán con una constante de disociación de 51 nM a 1000 nM se unirán con baja afinidad. Se consideró que los fragmentos peptídicos que se predice que se unirán con una afinidad prevista de 1000 nM a 5000 nM se unirán con una afinidad rara. Los resultados se presentan en la FIG. 3.

Como se muestra en la FIG. 3, se predijo que dos de los péptidos derivados de la secuencia de referencia en esta región, cada uno de los cuales contenía una secuencia con una región solapada que abarcaba la unión entre los dominios, mostrarían una baja afinidad de unión por HLA-A2:01. Específicamente, se predijo que un péptido de 14- mer que tiene la secuencia FIIFWVKRGRKKLL (SeQ ID NO: 10) se uniría con una constante de disociación de 294 nM, y se predijo que un péptido de 13-mer que tiene la secuencia de FIIFWVKRGRKKL (SEQ ID NO: 11) se uniría con una constante de disociación de 618 nM. Cada uno de estos péptidos incluía una porción del péptido de 15- mer expuesto en la SEQ ID NO: 1 e identificado en el Ejemplo 1. No se predijo que los péptidos de 8-mer a 12-mer más cortos dentro de esta secuencia mostraran unión a ^hLA-A2:01. Se predijo que otro péptido de 13-mer que contenía la secuencia de aminoácidos IIFWVKRGRKKLL (SEQ ID NO: 12) tenía una afinidad de unión rara con una constante de disociación prevista de aproximadamente 3000 nM. Este ensayo predijo que ninguno de los fragmentos restantes que formaron un puente en la unión entre los dos dominios mostraría afinidad de unión por HLA-A2:01 (todos tenían una constante de disociación predicha mucho mayor que 5000 nM, y en la mayoría de los casos mayor de 14.000 nm o 20.000 nM o mayor). En cada uno de los péptidos que se predijo que se unirán a HLA-A2:01, se predijo que ninguno de los dos residuos que abarcan la unión (VK) en sí mismos sería un residuo de anclaje; más bien, tales péptidos contenían estos residuos en posiciones no flanqueantes.

Se predijo que aproximadamente 15 de los péptidos que contienen la secuencia derivada únicamente del dominio transmembrana tenían una constante de disociación para HLA-A2:01 de menos de 5000 nM. Se predijo que dos péptidos que contenían la secuencia únicamente del dominio coestimulador tenían una constante de disociación para la unión a HLA-A2:01 de menos de 5000 nM. El dominio coestimulador y el dominio transmembrana en la secuencia evaluada se derivan de secuencias humanas endógenas, que generalmente tienen menos probabilidades de ser inmunogénicas para un sujeto humano. Por ejemplo, en el estudio descrito en el Ejemplo 1, no se detectaron respuestas inmunes que fueran específicas para secuencias de péptidos únicamente dentro de cualquiera de estos dominios del CAR. Por consiguiente, se evaluaron variantes de péptidos que contienen secuencias que abarcan la región de unión.

Para generar péptidos variantes que se predice que tienen afinidades de unión reducidas para HLA-A2:01 y/o inmunogenicidad reducida en un sujeto humano que tiene este alelo de HLA, se generó una secuencia variante in silico, que contenía mutaciones en la región de unión en comparación con la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6. Como se predijo que los péptidos que contenían los residuos "VK" que abarcan la unión (en posiciones de no anclaje) mostrarían altas afinidades de unión para HLA-A2:01, se insertaron dos residuos de asparagina en la unión entre los dominios transmembrana de CD28 y coestimulador de 4-1BB. La variante contenía la secuencia CYSLLVTVAFIIFWVNNKRGRKKLLYIFKQPF (expuesta en la SEQ ID NO: 13, la secuencia que flanquea la unión que se generó mediante la inserción de los residuos de asparagina se muestra en subrayado). La secuencia variante ejemplar de la SEQ ID NO: 13 se evaluó mediante los mismos métodos predictivos. Para evaluar las afinidades de unión predichas para esta secuencia variante, se evaluó una serie de 154 fragmentos superpuestos de 8-14 aminoácidos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13 mediante análisis in silico como se ha descrito anteriormente, en donde 35 péptidos tenían una secuencia solamente en la porción transmembrana, 35 péptidos tenían una secuencia sólo en la porción del dominio coestimulador y 84 péptidos contenían una secuencia de la región de unión que contenía aminoácidos que formaban puentes entre los dominios, incluyendo uno o ambos residuos de asparagina insertados.

Los resultados se representan en la FIG. 3. Como se muestra, en general, las afinidades de unión de HLA-A2:01 de péptidos solapados dentro de la región variante que contenía la unión, colectivamente, se redujeron sustancialmente en comparación con la secuencia no variante. En particular, la constante de disociación predicha para la unión a HLA-A2:01 de péptidos en la porción de la región de unión previamente predicha como inmunogénica se redujo sustancialmente. Por ejemplo, se predijo que las variantes de péptidos IIFWVNNKRGRKKL (SEQ ID NO: 14) y IIFWVNNKRGRKK (SEQ ID NO: 15), que incluían residuos flanqueantes alterados en comparación con los péptidos identificados como se expone en las SEQ ID NO: 10 y 11, respectivamente, no mostrarían afinidad de unión detectable para HLA-A2:01. Se predijo que dos péptidos de 14-mer, FIIFWVNNKRGRKK (SEQ ID NO: 11) e IFWVNNKRGRKKLL (SEQ ID ⁿO: 12), mostrarían una constante de disociación para unirse a este HLA, lo que indica una afinidad de unión rara, dentro del intervalo de 1000 nM a 5000 nM. Se predijo que todos los demás péptidos que contenían la secuencia de la región de unión modificada mostrarían una constante de disociación de más de 5000 nM y, en la mayoría de los casos, de más de 14.000 nM o 20.000 nM o mayor, y por lo tanto no se predijo que mostrarían afinidad de unión por HLA-A2:01 por esta evaluación. Además, la modificación de la secuencia de la región de unión no creó ningún péptido nuevo que se predijese que tuviese mayores afinidades de unión para HLA-A2:01 dentro de las regiones del dominio coestimulador o transmembrana.

Ejemplo 5: Administración de células que expresan CAR anti-CD22 a sujetos tratados anteriormente con CAR anti-CD19

A seis sujetos con leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B CD22+ en recaída/refractaria se les administraron células T autólogas que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD22. El CAR incluía un anticuerpo scFv anti-CD22 humano, un dominio transmembrana de CD8alfa, un dominio de señalización intracelular de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular de CD3zeta.

Todos los sujetos se habían sometido anteriormente por lo menos a un trasplante de células madre hematopoyéticas alogénico y habían recibido tratamiento con una de varias terapias de células CAR-T dirigidas a CD19. Cinco de los sujetos habían recaído con LLA en la que no se detectó CD 19 ("CD 19 neg") y, por lo demás, un sujeto no respondió a la terapia previa con CAR CD19.

Antes de la administración de las células, los pacientes se sometieron a leucaféresis autóloga para recolectar células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células T se aislaron de las PBMC recogidas mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad para la expresión de CD3 y se cultivaron en presencia de perlas anti-CD3/-CD28, seguido de transducción con un vector lentiviral que codifica el CAR anti-CD22. Las células se cultivaron durante 7-10 días. Los sujetos recibieron quimioterapia de inducción con 25 mg/m2 de fludarabina los días -4, -3 y -2 y 900 mg/m2 de ciclofosfamida el día -2 (infusión de células el día 0). Cada paciente recibió una dosis inicial de células T de CAR de 3 x 105 células T transducidas/peso del receptor (kg) mediante infusión intravenosa. El segundo sujeto inscrito desarrolló diarrea de grado 3, que cumplía con los criterios de toxicidad limitante de la dosis (DLT), lo que llevó a una expansión de la dosis en el primer nivel de dosis para tratar un total de 6 sujetos. No se observaron DLT posteriores a esta dosificación. Dos sujetos desarrollaron síndrome de liberación de citoquinas (SRC) de grado 1, un sujeto desarrolló SRC de grado 2 y en dos sujetos no hubo CRS.

El número de células T de CAR en sangre periférica, médula ósea o líquido cefalorraquídeo se determinó en ciertos puntos temporales después del tratamiento incubando células con CD22-Fc. Para los pacientes en los que se observó expansión, se observó evidencia de expansión de células T del CAR en sangre periférica, médula ósea y líquido cefalorraquídeo, comenzando aproximadamente el día 7. La expansión máxima o pico de CAR-células T se observó generalmente entre aproximadamente el día 12 y aproximadamente el día 15 después de la infusión. La Tabla 7 expone el porcentaje máximo o pico de células T del CAR anti-CD22 observado en este período de evaluación como porcentaje del total de células T en cada muestra para los sujetos tratados. Las respuestas clínicas se evaluaron el día 28 (+/- 4 días) después de la infusión.

Como se muestra en la Tabla 4, los resultados fueron consistentes con las respuestas que se correlacionan generalmente con el grado de expansión de las células T de CAR. Para tres sujetos que mostraron poca o ninguna expansión de células T de CAR también mostraron evidencia de progresión de la enfermedad. Otros dos sujetos tenían enfermedad estable y uno se observó con remisión completa sin MRD. Se detectó persistencia de CAR citométrica de flujo hasta 47 días después de la infusión en este sujeto, manteniéndose la remisión durante 3 meses después de la infusión. Los resultados demuestran una terapia de células T de CAR anti-CD22 segura, factible y clínicamente activa en sujetos que se han sometido (y han dejado de responder, por ejemplo, debido a la pérdida de epítopo/antígeno) a terapia anti-CD19 CAR anterior.

Tabla 5: Secuencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende células T humanas que expresan un segundo receptor de antígeno quimérico (CAR) para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección que es una enfermedad maligna de células B en un sujeto humano, el método comprendiendo administrar la composición a un sujeto humano que ha sido tratado anteriormente con células que expresan un primer receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde:

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la composición es para su uso por lo menos aproximadamente 28 días, por lo menos aproximadamente 35 días, por lo menos aproximadamente 42 días, por lo menos aproximadamente 49 días, y/o por lo menos aproximadamente 60 días después de la administración de las células que expresan el primer CAR.

3. La composición para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho sujeto no ha recibido una dosis de células que expresan el segundo CAR antes del uso.

4. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el sujeto muestra pérdida de antígeno y/o regulación por disminución o modificación el epítopo o antígeno al que se dirige el primer CAR.

5. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el primer CAR se une específicamente a CD19 y el segundo CAR se une específicamente a CD22.

6. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el uso del segundo CAR no da como resultado una respuesta inmune o mediada por células detectable contra el segundo CAR en el plazo de aproximadamente 30 días, en el plazo de aproximadamente 60 días, o en el plazo de aproximadamente 90 días, de su administración al sujeto.

7. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el número de células que expresan el segundo CAR es suficiente para la reducción en la carga de la enfermedad o afección en el sujeto.

8. La composición para el uso de la reivindicación 7, en donde la administración de células que expresan el segundo CAR comprende la administración de aproximadamente 1x 106 a aproximadamente 1 x 108 de las células T que expresan el CAR.

9. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1a 8, en donde las células T son autólogas para el sujeto.

10. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la enfermedad o afección es leucemia o linfoma.

11. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde la enfermedad o afección es una leucemia y la leucemia es una leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B.