ES2718903T3

ES2718903T3 - Receptores de antígenos quiméricos M971

Info

Publication number: ES2718903T3
Application number: ES13773468T
Authority: ES
Inventors: Rimas Orentas; Ira Pastan; Dimiter Dimitrov; Crystal Mackall
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: RU2658485C2; BR112015009003B1; JP6643394B2; BR112015009003A2; US20150299317A1; JP2018153186A; CN104822705A; AU2018204257A1; AU2018204257B2; US11807682B2; US10703816B2; AU2013335180B2; JP6338252B2; RU2770411C1; JP2016502512A; AU2013335180A1; EP2912061A1; CA2889055C; CN110229834B; US20240084008A1

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígenos quiméricos M971

Declaración sobre la investigación y el desarrollo federalmente patrocinado

Esta invención fue realizada con el apoyo del gobierno bajo el número de proyecto Z01 ZIA BC 010701 por los Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la invención

El cáncer es un problema de salud pública. A pesar de los avances en tratamientos como la quimioterapia, el pronóstico para muchos cánceres, incluidas las malignidades hematológicas, puede ser malo. Por ejemplo, se estimó que se esperaban más de 45.000 muertes por linfoma no Hodgkin y leucemia en los Estados Unidos en 2000 (Greenlee et al., CA Cáncer J. Clin., 50:7-33 (2000)). Por consiguiente, existe una necesidad no satisfecha de tratamientos adicionales para el cáncer, particularmente las malignidades hematológicas. James SE et al., The Journal of Immunology, 180:7028 - 7038 (2008), desvela TCR quiméricos (cTCR, de sus siglas en inglés) específicos para un epítopo CD22 más distal a la membrana (RFB4, HD39) y los compara con un CAR específico para un epítopo CD22 más proximal a la membrana (Leu16) con respecto a la lisis de líneas celulares tumorales y de linfocitos B autólogos.

Breve sumario de la invención

El objeto de estudio de la invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. Una realización de la invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR, de sus siglas en inglés) que se une específicamente a CD22, comprendiendo el CAR: un dominio de unión a antígeno que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la s Eq ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 6, un dominio transmembrana y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular.

Realizaciones adicionales de la invención proporcionan ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes,células hospedadoras y las composiciones farmacéuticas relacionados a los CAR de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer.

Realizaciones adicionales de la invención proporcionan los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras o las composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Las Figuras 1A-1G son: gráficas que muestran el % de lisis de las líneas celulares diana de leucemia REH (A), SEM (B), NALM6-GL (C), KOPN8 (D), Daudi (E), Raji (F) y K562 (G) marcadas con 51Cr mediante linfocitos T humanos efectores que no se transdujeron (simulado, •; círculos) o se transdujeron con los siguientes CAR: HA22-SH de segunda generación, versión 1 (▼), m971 de segunda generación, versión 1 (▲; triángulo abierto), o CAR específico de CD19 (■; cuadrados) en varias relaciones de efector a diana (E:D).

Las Figuras 2A-2C son gráficas que muestran el porcentaje de lisis de las líneas celulares diana de leucemia Raji (A), NALM6-GL (B) o K562 (C) mediante linfocitos T efectores no transducidos (simulado, •; círculos;), m971-segunda generación, CAR versión 1 (▲), o CAR m971 de tercera generación (▼) en varias relaciones E:D.

Las Figuras 3A-3C son gráficas que muestran las cantidades de interferón (IFN)-y (pg/ml) secretado por linfocitos T que no se transdujeron (simulado) o se transdujeron con uno de los siguientes CAR: anti-CD19, m971 de segunda generación versión 1 (S^eQ ID NO: 23), m971 de tercera generación (SEQ ID NO: 24), HASH22 de segunda generación versión 1, HASH22 de segunda generación versión 2, o HASH22 de tercera generación después de un cultivo conjunto con líneas celulares de leucemia NALM6-GL (CD22bajo) (A), Raji (CD22alto) (B) o K562 (CD22 negativo) (C).

Las Figuras 3D-3F son gráficas que muestran las cantidades de interleucina (IL)-2 (pg/ml) secretada por linfocitos T que no se transdujeron (simulado) o se transdujeron con uno de los siguientes CAR: anti-CD19, m971 de segunda generación versión 1 (S^eQ ID NO: 23), m971 de tercera generación (SEQ ID NO: 24), HASH22 de segunda generación versión 1, HASH22 de segunda generación versión 2, o HASH22 de tercera generación después de un cultivo conjunto con líneas celulares de leucemia NALM6-GL (CD22bajo) (A), Raji (CD22alto) (B) o K562 (CD22 negativo) (C).

Las Figuras 3G-3I son gráficas que muestran las cantidades de factor de necrosis tumoral (TNF)-a (pg/ml) secretado por linfocitos T que no se transdujeron (simulado) o se transdujeron con uno de los siguientes CAR: anti-CD19, m971 de segunda generación versión 1 (SEQ ID No : 23), m971 de tercera generación (SEQ ID NO: 24), HASH22 de segunda generación versión 1, HASH22 de segunda generación versión 2, o HASFl22 de tercera generación después de un cultivo conjunto con líneas celulares de leucemia NALM6-GL (CD22bajo) (A), Raji (CD22alto) (B) o K562 (CD22 negativo) (C).

La Figura 4A es una gráfica que muestra señales bioluminiscentes (fotones/s/cm2/sr) generadas por la reacción de luciferasa (transfectada en células de leucemia, que se inyectaron en ratones) con luciferina que se inyectó en los ratones, medidas durante un período de tiempo de 30 días. Los ratones se trataron con linfocitos T de control ("simulado", no transducidos, •; círculos) o linfocitos T transducidos con el CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 (■; cuadrados) o m971 de segunda generación versión 1 (triángulos, SEQ ID NO: 23). Los valores más altos de fotones/s/cm2/sr indican una mayor carga tumoral.

La Figura 4B es una gráfica que muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones tratados con linfocitos T de control ("simulado", no traducidos, cuadrados) o linfocitos T transducidos con el CAR MASH22 de segunda generación versión 1 (círculos) o el CAR 971 de segunda generación versión 1 (triángulos, SEQ ID NO: 23) durante 30 días. (Simulado v. HA22, p = 0,0019; simulado v. m97l, p = 0,0019; m971 v. HA22, p = 0,003).

La Figura 5 es una tabla que muestra imágenes bioluminiscentes de ratones con leucemia tres, cinco y ocho días después del tratamiento con linfocitos T no transducidos (simulado) o 15 x 106, 5 x 106, 1 x 106, o 1 x 105 linfocitos T que se transdujeron con una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR m971 de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 22). Un cambio en el sombreado de gris a blanco indica una mayor carga tumoral.

La Figura 6 es una gráfica que muestra el número total de fotones emitidos en la bioluminiscencia de los ratones mostrados en la Figura 5 durante un período de 44 días. El número total de fotones se cuantificó y trazó, y se muestran los promedios y las desviaciones estándar para cada punto temporal. Los ratones se trataron con linfocitos T no transducidos (simulado) (signo más) o 15 x 106 (diamante), 5 x 106 (flor), 1 x 106 (cruz) o 1 x 10s (asterisco) linfocitos T que se transdujeron con una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR m971de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 22).

Descripción detallada de la invención

El objeto de estudio de la invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. Una realización de la invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR, de sus siglas en inglés) que se une específicamente a CD22, comprendiendo el CAR: un dominio de unión a antígeno que comprende una ^cDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la ^sE^qID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 6, un dominio transmembrana y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular.

Un CAR es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene los dominios de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento variable de cadena única (scFv)) unido a los dominios de señalización de linfocitos T. Las características de los CAR incluyen su capacidad para redireccionar la especificidad y la reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de una manera no restringida por MHC, explotando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígeno no restringido por MHC da a los linfocitos T, que expresan CAR, la capacidad para reconocer el antígeno independientemente del procesamiento del antígeno, evitando así un importante mecanismo de resistencia tumoral. Además, cuando se expresan en linfocitos T, los CAR ventajosamente no dimerizan con las cadenas alfa y beta de receptores de linfocitos T endógenos (TCR, de sus siglas en inglés).

Las frases "tienen especificidad de antígeno" y "provocan: respuesta específica de antígeno" tal como se usa en el presente documento significa que el CAR puede unirse específicamente a y reconocer inmunológicamente un antígeno, de manera que la unión del CAR al antígeno provoca una respuesta inmunitaria.

Los CAR de la invención tienen especificidad de antígeno para CD22. CD22 es un antígeno de linfocitos B con restricción de linaje que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig). CD22 se expresa en el 60-70 % de los linfomas de linfocitos B y leucemias (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt) y no está presente en la superficie celular en etapas tempranas del desarrollo de linfocitos B o en células madre. Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol., 11:267-297 (1991); Bang: et al., Clin Cáncer Res., 11:1545-50 (2005).

Sin estar vinculado a una teoría o mecanismo particular, se cree que mediante la provocación de una respuesta específica de antígeno contra CD22, los CAR inventivos proporcionan uno o más de cualquiera de los siguientes: direccionamiento y destrucción de células cancerosas que expresan CD22, reducción o eliminación de células cancerosas, facilitación de la infiltración de células inmunitarias en el (los) sitio(s) del tumor, y mejora/extensión de las respuestas contra el cáncer. Debido a que CD22 no se expresa en las etapas tempranas del desarrollo de linfocitos B o en células madre, se contempla que los CAR inventivos eviten ventajosamente dirigirse/destruir substancialmente células madre y/o linfocitos B en las etapas tempranas del desarrollo.

Una realización de la invención proporciona un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno del anticuerpo m971 ("m971"). El dominio de unión a antígeno de m971 se une específicamente a CD22. A este respecto, una realización preferida de la invención proporciona CAR que comprenden un dominio de unión a antígeno que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, un fragmento variable de cadena única (scFv) del dominio de unión a antígeno de m971. El anticuerpo m971 proporciona una unión mejorada a CD22 en comparación con la inmunotoxina HA22 y también se une a un epítopo CD22 diferente, (Xiao et al., mAbs 1:3, 297-303 (2009) y el documento WO 2009/124109 A1

El dominio de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 6.

La región variable de cadena ligera del dominio de unión a antígeno puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO 7. La región variable de cadena pesada del dominio de unión a antígeno puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID No 8. Por consiguiente, en una realización de la invención, el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 7 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 8. Preferentemente, el dominio de unión a antígeno comprende ambas SEQ ID NO: 7 y 8.

En una realización de la invención, la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada pueden unirse mediante un conector. El conector puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. En una realización de la invención, el conector puede comprender, consistir, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO 11. En una realización, el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada. A este respecto, una realización del dominio de unión a antígeno que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, la SEQ ID NO 9.

En una realización, el dominio de unión a antígeno comprende una secuencia líder. La secuencia líder puede colocarse en el extremo amino de la región variable de cadena ligera. La secuencia líder puede comprender cualquier secuencia líder adecuada. En una realización, la secuencia líder es una secuencia del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, de sus siglas en inglés). A este respecto, el dominio de unión a antígeno comprende una secuencia líder que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 10. En una realización de la invención, si bien la secuencia líder puede facilitar la expresión del CAR en la superficie de la célula, la presencia de la secuencia líder en un CAR expresado no es necesaria para que el CAR funcione. En una realización de la invención, tras la expresión del CAR en la superficie celular, la secuencia líder puede escindirse del CAR. Por consiguiente, en una realización de la invención, el CAR carece de una secuencia líder.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana. En una realización de la invención, el dominio transmembrana comprende i) CD8 y/o ii) CD28. En una realización preferida, el CD8 y el CD28 son humanos. El CD8 o el CD28 puede comprender menos que el CD8 o el CD28 completo, respectivamente. A este respecto, el CAR comprende un dominio transmembrana de CD8 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 12 o 18 y/o un dominio transmembrana de CD28 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 15.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende uno o más de i) CD28, ii) CD137, y/o iii) CD3 zeta (Z). En una realización preferida, el CD28, CDI37 y CD3 zeta son humanos. CD28 es un marcador de linfocitos T importante en la coestimulación de linfocitos T. CD137, conocido también como 4-1BB, transmite una potente señal coestimuladora a los linfocitos T, promoviendo la diferenciación y mejorando la supervivencia a largo plazo de los linfocitos T. CD3Z se asocia con TCR para producir una señal y contiene motivos de activación basados en tirosina de inmunoreceptores (ITAM, de sus siglas en inglés). El CD28, CD137 o CD3 zeta puede comprender menos que el CD28, CD137 o CD3 zeta completo, respectivamente.

A este respecto, el dominio de señalización de linfocitos T intracelular comprende una secuencia de aminoácidos de CD28 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, la SEQ ID NO:16 o 19, una secuencia de aminoácidos de CD137 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, la SEQ ID NO: 13 o 20, y/o una secuencia de aminoácidos de CD3 zeta que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, la SEQ ID NO:14, 17 o 21.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana que comprende CD28 y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD28 y CD3 zeta. A este respecto, el CAR puede comprender cada una de las SEQ ID NO: 15-17. Preferentemente, el ^cA^rcomprende a) cada una de las SEQ ID NO: 1-6 y 15-17; b) 7-8 y 15-17; c) 9 y 15-17; o d) 9-10 y 15-17.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana que comprende CD8 y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD28, CD137, y CD3 zeta. A este respecto, el CAR puede comprender cada una de las SEQ ID NO: 18-21. Preferentemente, el CAR comprende a) cada una de las SEQ ID NO: 1-6 y 18-21; b) 7-8 y 18-21; c) 9 y 18-21; o d) 9-10 y 18-21.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana que comprende CD8 y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD137 y CD3 zeta. A este respecto, el CAR puede comprender cada una de las SEQ ID NO: 12-14. Preferentemente, el CAR comprende a) cada una de las SEQ ID NO: 1-6 y 12-14; b) 7-8 y 12-14; c) 9 y 12-14; o d) 9-10 y 12-14.

Realizaciones adicionales de la invención proporcionan CAR que comprenden, que consisten en, o que consisten esencialmente en cualquiera de, las secuencias de aminoácidos expuestas en la Tabla 1.

TABLA 1

Las partes funcionales de los CAR inventivos descritos en el presente documento están incluidas en el alcance de la invención. La expresión "parte funcional" cuando se usa en referencia a un CAR se refiere a cualquier parte o fragmento del ^cA^rde la invención, cuya parte o fragmento conserva la actividad biológica del CAR del cual forma parte (el CAR precursor). Las partes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que retienen la capacidad de reconocer células diana, o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, en una medida similar, en la misma medida, o en mayor medida, que el CAR precursor. En referencia al CAR precursor, la parte funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95% o más, del CAR precursor.

La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo de la parte, o en ambos extremos, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia aminoácidos del CAR precursor. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, por ejemplo, reconocer células diana, detectar cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del CAR precursor.

Las variantes funcionales de los CAR inventivos descritos en el presente documento están incluidas en el alcance de la invención. La expresión "variante funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a un CAR, polipéptido o proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un CAR precursor, cuya variante funcional retiene la actividad biológica del CAR del cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en el presente documento (el CAR precursor) que conservan la capacidad de reconocer células diana en una medida similar, en la misma medida, o en mayor medida, que el CAR precursor. En referencia al CAR precursor, la variante funcional puede, por ejemplo, ser al menos aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99% o más idéntica en la secuencia de aminoácidos al CAR precursor.

Una variante funcional puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos del CAR precursor con al menos una sustitución de aminoácidos conservadora. De forma alternativa o adicional, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR precursor con al menos una sustitución de aminoácidos no conservadora. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservadora no interfiera con o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución de aminoácidos no conservadora puede aumentar la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional se incrementa en comparación con el CAR precursor.

Las sustituciones de aminoácidos de los CAR de la invención son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son conocidas en la materia e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas o similares propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos conservadora puede ser un aminoácido polar ácido/cargado negativamente sustituido por otro aminoácido polar ácido/cargado negativamente (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), un aminoácido polar básico/cargado positivamente sustituido por otro aminoácido polar básico/cargado positivamente (por ejemplo, Lys, His, Arg, etc.), un aminoácido no cargado con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido no cargado con una cadena lateral polar (por ejemplo, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), un aminoácido con una cadena lateral beta ramificada sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral beta ramificada (por ejemplo, Ile, Thr, y Val), un aminoácido con una cadena lateral aromática sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral aromática (por ejemplo, His, Phe, Trp y Tyr), etc.

El CAR puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de modo que otros componentes, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional.

Los CAR de las realizaciones de la invención (que incluyen partes funcionales y variantes funcionales) pueden tener cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los CAR (o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente al antígeno, detectar células enfermas en un mamífero, o tratar o prevenir enfermedades en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud.

Los CAR de las realizaciones de la invención (que incluyen partes funcionales y variantes funcionales de la invención) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Dichos aminoácidos sintéticos son bien conocidos en la materia, e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido a-amino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina phidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentano carboxílico, ácido aaminociclohexano carboxílico, ácido a-aminocicloheptano carboxílico, acido a-(2-amino-2-norbomano)-carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, homofenilalanina y a-terf-butilglicina.

Los CAR de las realizaciones de la invención (que incluyen partes funcionales y variantes funcionales) pueden estar glucosilados, amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclados a través de, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertidos en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizados o polimerizados, o conjugados.

Los CAR de las realizaciones de la invención (que incluyen partes funcionales y variantes funcionales) pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la materia. Los cAr se pueden producir mediante cualquier método adecuado para producir polipéptidos o proteínas. Los métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas se describen en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, Ed., Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2001; y la patente de EE.UU. 5.449.752. Asimismo, los polipéptidos y proteínas se pueden producir de forma recombinante utilizando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento utilizando métodos recombinantes estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3' ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los CAR de la invención (que incluyen las partes funcionales y las variantes funcionales de los mismos) se pueden aislar y/o purificar a partir de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la materia. Como alternativa, los CAR descritas en el presente documento (que incluyen partes funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden sintetizar comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Múltiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los CAR inventivos pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

Además, se desvela un anticuerpo, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de los CAR de la invención. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que sea conocida en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado a partir de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de diseñado mediante ingeniería genética, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Asimismo, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por la parte funcional del cAr inventivo.

Los métodos de prueba de anticuerpos para determinar la capacidad de unirse a cualquier parte funcional del CAR inventivo se conocen en la materia e incluyen cualquier ensayo de unión anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, por ejemplo, Janeway et al., infra, y la Publicación de Solicitud de Patente de ^eE.UU n.° 2002/0197266 A1).

Se conocen en la materia métodos adecuados para fabricar anticuerpos. Por ejemplo, los métodos de hibridoma estándar se describen en, por ejemplo, Kohler y Milsteirt, Eur. J. Immunol., 5, 511 -519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5' Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). Como alternativa, otros métodos, tales como los métodos de hibridoma EBV (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y los sistemas de expresión de vectores de bacteriófagos (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) son conocidos en la materia. Además, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, y en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2002/0197266 A1.

Además, la visualización de fagos se puede utilizar para generar un anticuerpo. A este respecto, se pueden generar bibliotecas de fagos que codifican dominios variables (V) de unión a antígeno de anticuerpos utilizando técnicas estándar de biología molecular y ADN recombinante (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra). Los fagos que codifican una región variable con la especificidad deseada se seleccionan para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridomas, de modo que la célula secreta los anticuerpos que tienen las características de los anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Janeway et al., supra, Huse et al., supra, y la patente de EE.UU. 6.265.150).

Los ratones transgénicos pueden producir anticuerpos que son transgénicos para genes específicos de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera. Dichos métodos son conocidos en la materia y se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.545.806 y 5.569.825, y Janeway et al., supra.

Los métodos para generar anticuerpos humanizados son bien conocidos en la materia y se describen en detalle en, por ejemplo, Janeway et al., supra, las patentes de EE.UU. 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la patente europea n.° 0239400 B1 y la patente de Reino Unido n.° 2188638. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar utilizando la tecnología de rechapado de anticuerpos descrita en la Patente de EE.UU. 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

Además, se desvelan partes de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. La parte de unión a antígeno puede ser cualquier parte que tenga al menos; un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F(ab')², dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.

Un fragmento de anticuerpo de fragmento de región variable (sFv) de cadena única, que es un fragmento Fab truncado que incluye el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unida a un dominio V de una cadena de anticuerpo ligera a través de un péptido sintético, se puede generar utilizando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, por ejemplo, Janeway et al., supra), De forma similar, los fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) se pueden preparar mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpos de la invención, sin embargo, no se limitan a estos tipos ejemplares de fragmentos de anticuerpos.

Asimismo, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, se puede modificar para que comprenda un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).

Además, una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los CAR descritos en el presente documento (incluidas las partes funcionales y las variantes funcionales de los mismos). Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias líder, los dominios de unión a antígeno, los dominios transmembrana y/o los dominios de señalización de linfocitos T intracelulares descritos en el presente documento. Una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder y un dominio de unión a antígeno (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO 25.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los dominios transmembrana y/o dominios de señalización de linfocitos T intracelulares descritos en el presente documento. Una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio transmembrana que comprende CD28, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD28, y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD3Z. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la ^sE^qID NO 27. Otra realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD28, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD137, y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD3Z. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO 28. Aún otra realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD137, y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD3Z. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO 26.

En una realización de la invención, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), un dominio transmembrana que comprende CD28, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD28, y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD3Z. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, las SEQ ID NO: 25 y 27.

En una realización de la invención, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno [que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD28, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD137, y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD3Z. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, las SEQ ID NO: 25 y 28.

En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD137, y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular que comprende CD3Z. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, las SEQ ID NO: 25 y 26. "Ácido nucleico", como se usa en el presente documento, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace de fosforamidato o un enlace de fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no comprende inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se describe en el presente documento, para que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar secuencias de aminoácidos adicionales que no afectan a la función del CAR y que pueden o no traducirse tras la expresión del ácido nucleico mediante una célula hospedadora.

Los ácidos nucleicos de una realización de la invención pueden ser recombinantes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas mediante la unión de segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en (i) arriba. Para los fines del presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Un ácido nucleico recombinante puede ser uno que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se realiza mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial a menudo se logra mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética, como las descritas en Sambrook et al., supra. Los ácidos nucleicos se pueden construir en base a la síntesis química y/o reacciones de ligadura enzimática utilizando procedimientos conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra.. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de manera diferente diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitaciones, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosine, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden comprar de compañías, como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos aislada o purificada que codifique cualquiera de los CAR o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que está degenerada a cualquiera de las secuencias o una combinación de secuencias degeneradas.

Una realización de la invención también proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas puede hibridar en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es de forma detectable más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o un que contenga solo algunos desapareamientos dispersos de una secuencia aleatoria que tenía algunas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que coincidían con la secuencia de nucleótidos. Estas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente altas incluirían, por ejemplo, condiciones de baja sal y/o alta temperatura, tal como las que proporcionan aproximadamente NaCl 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Estas condiciones de alta rigurosidad toleran pocos, o ningún, desapareamiento entre la secuencia de nucleótidos y la plantilla o cadena diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los CAR inventivos. En general, se aprecia que las condiciones pueden ser más estrictas si se agregan cantidades crecientes de formamida.

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente el 70% o más, por ejemplo, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98%, o aproximadamente el 99% idéntico a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

En una realización, los ácidos nucleicos de la invención se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. A este respecto, una realización de la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para los fines del presente documento, la expresión "vector de expresión recombinante" significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido modificado genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedadora, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para tener el ARNm, proteína, polipéptido o péptido expresado dentro de la célula. Los vectores de la invención no son de origen natural en su conjunto.

Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluidos, pero sin limitación, ADN y ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos de origen natural o de origen no natural, o ambos tipos de enlaces. Preferentemente, los nucleótidos o enlaces internucleotídicos de origen no natural o alterados no obstaculizan la transcripción o replicación del vector.

En una realización, el vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede utilizarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambos, tal como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden utilizar vectores de bacteriófagos, tales como AGTlO, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101.2, pBIlOl.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM, y pMAMneo (Clontech). El vector de expresión recombinante puede ser un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral. En algunas realizaciones, el vector puede ser un transposón.

Una serie de técnicas de transfección son generalmente conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Graham et at., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., supra; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); y Chu et al., Gene, 13: 97 (1981). Los métodos de transfección incluyen la precipitación conjunta con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Graham et al., supra), microinyección directa en células cultivadas (véase, por ejemplo, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)), transferencia génica mediada por liposomas (véase, por ejemplo, Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), transducción mediada por lípidos (véase, por ejemplo, Feigner et al., Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)), y suministro de ácido nucleico utilizando microproyectiles de alta velocidad (véase, por ejemplo, Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987)).

En una realización, los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden preparar utilizando técnicas de ADN recombinante estándar descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden proceder, por ejemplo, de ColE1, plásmido 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.

El vector de expresión recombinante puede comprender secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de célula hospedadora (por ejemplo, bacterias, hongos, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, como apropiado, y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. Los ejemplos de secuencias que incluyen codones de terminación incluyen las SEQ ID NO: 32-33. El vector de expresión recombinante puede comprender sitios de restricción para facilitar la clonación. Los ejemplos de secuencias que incluyen sitios de restricción incluyen las SEQ ID NO: 29-31.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxotrófico para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR (incluidas las partes funcionales y las variantes funcionales del mismo), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La selección de promotores, por ejemplo, fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico de desarrollo, está dentro de la habilidad habitual del experto. De forma similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de la habilidad del experto. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV, o un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para una expresión transitoria, para una expresión estable, o para ambos. Asimismo, los vectores de expresión recombinantes se pueden hacer para la expresión constitutiva o para la expresión inducible.

Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden hacer para incluir un gen suicida. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "gen suicida" se refiere a un gen que causa que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, sobre la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando la célula se pone en contacto o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cáncer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), la citosina daminasa, la purina nucleósido fosforilasa y la nitrorreductasa.

Se incluyen en el alcance de la invención conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los CAR inventivos (incluidas cualquiera de las partes funcionales o variantes de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células hospedadoras o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos. Los conjugados, así como los métodos para sintetizar conjugados en general, son conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) y Kirin et al., Inorg Client. 44(15): 5405-5415 (2005)).

Una realización de la invención proporciona además una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacteria o protozoo. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Dichas células hospedadoras son bien conocidos en la materia, e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293, similares. Con el fin de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para los fines de producir un CAR recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula de mamífero. La célula hospedadora puede ser una célula humana. Si bien la célula hospedadora puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, la célula hospedadora puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL, de sus siglas en inglés) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, de sus siglas en inglés). La célula hospedadora puede ser un linfocito T.

Para los fines del presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivada, por ejemplo, Jurkat, SupTI, etc., o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T se puede obtener de numerosas fuentes, que incluyen, aunque no se limitan a sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, el timo u otros tejidos o líquidos. Los linfocitos T también pueden enriquecerse o purificarse. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. El linfocito T puede ser un linfocito T aislado de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, incluyendo, aunque no de forma limitativa, linfocitos T positivos dobles CD4+/CD8+, linfocitos T auxiliares CD4+, por ejemplo, linfocitos Thi y Th², linfocitos T CD8+ (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), células infiltrantes de tumores, linfocitos T de memoria, linfocitos T ingenuos y similares. El linfocito T puede ser un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+.

Además, se desvela una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula hospedadora (por ejemplo, un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinante, o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedadoras (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.

Los CAR (incluidas las partes y variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas las partes de unión a antígeno de los mismos), todos los cuales se denominan colectivamente como "materiales CAR inventivos" a continuación, pueden ser aislados y/o purificados. El término "aislado" como se usa en el presente documento significa que se ha eliminado de su entorno natural. El término "purificado" o "aislado" no requiere pureza absoluta ni aislamiento; más bien, se pretende como un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, una preparación de células hospedadoras purificada (o aislada) es aquella en la que la célula hospedadora es más pura que las células en su entorno natural dentro del cuerpo. Dichas células hospedadoras pueden producirse, por ejemplo, mediante técnicas de purificación estándar. En algunas realizaciones, una preparación de una célula hospedadora se purifica de tal manera que la célula hospedadora representa al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 %, del contenido total de células de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser al menos aproximadamente el 50 %, puede ser mayor que aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 % o aproximadamente el 80 %, o puede ser aproximadamente el 100 %.

Los materiales CAR inventivos se pueden formular en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, una realización de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los CAR, partes funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células hospedadoras (incluidas poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas partes de unión a antígeno), y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen, cualquiera de los materiales CAR inventivos pueden comprender más de un material CAR inventivo, por ejemplo, un CAR y un ácido nucleico, o dos o más CAR diferentes. Como alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material CAR inventivo en combinación con otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende la célula hospedadora de la invención o poblaciones de la misma.

Los materiales CAR inventivos se pueden proporcionar en forma de una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen aquellas procedentes de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluensulfónico.

Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser cualquiera de los utilizados convencionalmente y está limitado solo por consideraciones químico-físicas, tales como la solubilidad y la falta de reactividad con el (los) agente(s) activo(s), y por la vía de administración. Los vehículos farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, son bien conocidos por los expertos en la materia y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte a los agentes activos y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del vehículo se determinará en parte por el material CAR de la invención particular, así como por el método particular utilizado para administrar el material CAR de la invención. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Se pueden utilizar conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. Se puede utilizar opcionalmente una mezcla de uno o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están presentes normalmente en una cantidad de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 2 % en peso de la composición total.

Los agentes tamponantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, ácido cítrico, citrato sódico, ácido fosfórico, fosfato de potasio, y varios otros ácidos y sales. Se puede utilizar opcionalmente una mezcla de dos o más agentes tamponantes. El agente tamponante o mezclas de los mismos están presentes normalmente en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 4 % en peso de la composición total.

La concentración del material CAR inventivo en las formulaciones farmacéuticas puede variar, por ejemplo, desde menos de aproximadamente el 1 %, generalmente en o al menos aproximadamente el 10 %, hasta aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 50 % o más en peso, y se puede seleccionar principalmente por volúmenes de fluidos y viscosidades, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

Los métodos para preparar composiciones administrables (por ejemplo, administrables por vía parenteral) son conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).

Las siguientes formulaciones para administración oral, en aerosol, parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, interperitoneal e intratecal) y tópica son meramente ejemplares y de ninguna manera son limitantes. Se puede utilizar más de una ruta para administrar los materiales CAR de la invención, y en ciertos casos, una ruta particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra ruta.

Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden comprender o consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del material CAR de la invención disuelto en diluyentes, tal como agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, sobres, comprimidos, pastillas y trociscos, conteniendo cada una cantidad predeterminada del principio activo, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y los alcoholes de polietileno, con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Las formas de la cápsula pueden ser del tipo ordinario de gelatina dura o de gel blando que contiene, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y rellenos inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes disgregantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, y otros excipientes farmacológicamente compatibles. Las formas de pastillas pueden comprender el material CAR inventivo en un sabor, usualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, así como pastillas que comprenden el material CAR inventivo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, emulsiones, geles y similares que contienen, además de, dichos excipientes conocidos en la materia.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El material CAR inventivo se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un vehículo farmacéutico, tal como un líquido estéril o una mezcla de líquidos, que incluye agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos o glicéridos, o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tales como un jabón o un detergente, un agente suspensor, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites, que se pueden utilizar en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen maní, soja, sésamo, semillas de algodón, maíz, aceituna, vaselina y minerales. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isostárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de metales alcalinos grasos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicéridos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, sales de amonio cuaternario de alquil-p-aminopropionatos y 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán normalmente, por ejemplo, desde aproximadamente el 0,5 % hasta aproximadamente el 25 % en peso del material CAR inventivo en solución. Se pueden utilizar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen, por ejemplo, un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB, de sus siglas en inglés) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dichas formulaciones variará normalmente, por ejemplo, desde aproximadamente el 5 % hasta aproximadamente el 15 % en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán polietilenglicol, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitarias o de dosis múltiples, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado liofilizado (liofilizado) que requiere solo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

Las formulaciones inyectables están de acuerdo con una realización de la invención. Los requisitos para vehículos farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Las formulaciones tópicas, que incluyen aquellas que son útiles para la liberación transdérmica de fármacos, son bien conocidas por los expertos en la materia y son adecuadas en el contexto de realizaciones de la invención para aplicación a la piel. El material CAR inventivo, solo o en combinación con otros componentes adecuados, se puede convertir en formulaciones en aerosol para administrarse mediante inhalación. Estas formulaciones en aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones sin presión, tales como en un nebulizador o un atomizador. Dichas formulaciones en aerosol también se pueden utilizar para pulverizar la mucosa.

Una "cantidad eficaz" o "una cantidad eficaz para tratar" se refiere a una dosis que es adecuada para prevenir o tratar el cáncer en un individuo. Las cantidades eficaces para un uso terapéutico o profiláctico dependerán, por ejemplo, de la etapa y la gravedad de la enfermedad o trastorno que se esté tratando, la edad, el peso y el estado general de salud del paciente, y el criterio del médico que prescribe. El tamaño de la dosis también estará determinado por el principio activo seleccionado, el método de administración, el momento y la frecuencia de administración, la existencia, la naturaleza y el alcance de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un principio activo en particular, y el efecto fisiológico deseado. Un experto en la materia apreciará que diversas enfermedades o trastornos pueden requerir un tratamiento prolongado que implique múltiples administraciones, tal vez utilizando los materiales CAR inventivos en cada una o varias rondas de administración. A modo de ejemplo y sin intención de limitar la invención, la dosis del material CAR inventivo puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto tratado/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día. Cuando el material CAR de la invención es una célula hospedadora, una dosis ejemplar de células hospedadoras puede ser un mínimo de un millón de células (1 mg de células/dosis). Cuando el material CAR de la invención es un ácido nucleico empaquetado en un virus, una dosis ejemplar de virus puede ser 1 ng/dosis.

Para los fines de la invención, la cantidad o dosis del material CAR de la invención administrado debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal durante un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material CAR de la invención debe ser suficiente para unirse al antígeno, o detectar, tratar o prevenir la enfermedad en un período de aproximadamente 2 horas o más, por ejemplo, de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas o más, desde el momento de la administración. En determinadas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis se determinará mediante la eficacia del material CAR particular de la invención y la condición del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) a tratar.

Para los fines de la invención, un ensayo, que comprende, por ejemplo, comparar el grado en que las células diana se lisan y/o el IFN-^yse secreta por los linfocitos T que expresan el CAR inventivo tras la administración de una dosis dada de dichos linfocitos T a un mamífero, entre un conjunto de mamíferos a los que se les da una dosis diferente de linfocitos T, podría utilizarse para determinar la dosis inicial que se administrará a un mamífero. La medida en que se lisan las células diana y/o el IFN-y se secreta tras la administración de una cierta dosis se puede analizar mediante métodos conocidos en la materia.

Además de las composiciones farmacéuticas antes descritas, los materiales CAR inventivos se pueden formular como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina, o liposomas. Los liposomas pueden servir para dirigir los materiales CAR inventivos a un tejido particular. Los liposomas también se pueden utilizar para aumentar la semivida de los materiales CAR inventivos. Hay muchos métodos disponibles para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) y las patentes de EE.UU. 4.235.871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Los sistemas de suministro útiles en el contexto de las realizaciones de la invención pueden incluir sistemas de suministro de liberación constante, liberación retardada y liberación prolongada, de modo que el suministro de la composición de la invención se produce antes y con tiempo suficiente para causar la sensibilización del sitio a ser tratado. La composición de la invención se puede utilizar junto con otros agentes terapéuticos o terapias. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición de la invención, aumentando así la conveniencia para el sujeto y el médico, y pueden ser particularmente adecuados para ciertas realizaciones de la composición de la invención.

Muchos tipos de sistemas de suministro de liberación están disponibles y son conocidos por los expertos en la materia. Incluyen sistemas de bases de polímeros tales como poli(lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliésteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico y polianhídridos. Las microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.075.109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no poliméricos que son lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono- di- y tri-glicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; revestimientos de cera; comprimidos comprimidos utilizando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fundidos; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, aunque no de forma limitativa a: (a) sistemas de erosión en los que la composición activa está contenida en una forma dentro de una matriz como las descritas en las patentes de EE.UU. 4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 y 5.239.660 y (b) sistemas difusionales en que un componente activo se impregna a una velocidad controlada de un polímero tal como se describe en las patentes de EE.UU. 3.832.253 y 3.854.480. Además, se pueden utilizar sistemas de suministro de hardware basados en bombas, algunos de los cuales están adaptados para la implantación.

Un experto ordinario en la materia apreciará fácilmente que los materiales CAR inventivos de la invención se pueden modificar de varias formas, de manera que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales CAR inventivos se incremente a través de la modificación. Por ejemplo, los materiales CAR inventivos se pueden conjugar directa o indirectamente a través de un conector a una fracción de direccionamiento. La práctica de la combinación de compuestos, por ejemplo, materiales CAR de la invención, para dirigir fracciones, es conocida en la materia. Véase, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) y la patente de EE.UU. 5.087.616.

Como alternativa, los materiales CAR de la invención se pueden modificar en una forma de depósito, de tal manera que la manera en que los materiales CAR de la invención se liberan en el cuerpo al que se administra se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.450.150). Las formas de depósito de los materiales CAR de la invención pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales CAR de la invención y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en el que los materiales CAR inventivos están encapsulados o difundidos por todo el material y/o la degradación del material no poroso. Luego, el depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del cuerpo y los materiales CAR inventivos se liberan del implante a una velocidad predeterminada.

Cuando los materiales CAR inventivos se administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales, se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales conjuntamente al mamífero. Por "coadministración" se entiende la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales y los materiales CAR de la invención lo suficientemente cerca en el tiempo, de manera que los materiales CAR de la invención pueden aumentar el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. A este respecto, los materiales CAR inventivos se pueden administrar primero y el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar segundo, o viceversa. Como alternativa, los materiales CAR inventivos y el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar simultáneamente. Un agente terapéutico ejemplar que se puede coadministrar con los materiales CAR es IL-2. Se cree que la IL-2 aumenta el efecto terapéutico de los materiales CAR inventivos. Para los fines de los métodos de la invención, en los que las células hospedadoras o las poblaciones de células se administran al mamífero, las células pueden ser células alogénicas o autólogas para el mamífero.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención, CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras o poblaciones de células se pueden utilizar para el uso de métodos para tratar o prevenir una enfermedad en un mamífero. Sin estar vinculado a una teoría o mecanismo particular, los CAR inventivos tienen actividad biológica, por ejemplo, capacidad para reconocer antígenos, por ejemplo, CD22, de modo que cuando se expresan por una célula, el ^cA^res capaz de mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa el antígeno, por ejemplo, CD22, para el cual el CAR es específico. A este respecto, una realización de la invención proporciona los ^cA^r, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras o las composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes y/o las composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Una realización de la invención comprende además la linforreducción del mamífero antes de administrar los materiales CAR inventivos. Los ejemplos de linforreducción incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia de linforreducción no mieloblativa, quimioterapia de linforreducción mieloblativa, irradiación corporal total, etc.

Para los fines de los métodos de la invención, en los que se administran células hospedadoras, las células pueden ser células alogénicas o autólogas para el mamífero. Preferentemente, las células son autólogas para el mamífero.

El mamífero al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier mamífero. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, que incluye, pero no se limita a, mamíferos del orden Rodentia, como ratones y hámsters, y mamíferos del orden Logomorplia, como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden Carnívora, incluidos los felinos (gatos) y los caninos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden Artiodactyla, incluidos los bovinos (vacas) y los porcinos (cerdos) o del Orden Perssodactyla, incluidos los equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Antropoides (seres humanos y simios). Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Con respecto a los métodos de la invención, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluido cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de vejiga), cáncer de huesos, cáncer cerebral (por ejemplo, meduloblastoma), cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorecto, cáncer de ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer esofágico, cáncer de cuello de útero, fibrosarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, tumores líquidos, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón de células no pequeñas), linfoma, mesotelioma maligno, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de la nasofaringe, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de peritoneo, omento y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, tumores sólidos, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de tiroides; y cáncer de uréter. Preferentemente, el cáncer es una malignicencia hematológica (por ejemplo, leucemia o linfoma, que incluye, pero no se limita a, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt). Preferentemente, el cáncer se caracteriza por la expresión de CD22.

Los términos "tratar," y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, como se usa en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o prevención del 100 % o completos. Por el contrario, existen diversos grados de tratamiento o prevención, de los cuales un experto en la materia reconoce que tiene un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos de la invención pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Adicionalmente, el tratamiento o la prevención proporcionada por el método de la invención puede incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que se está tratando o previniendo. Asimismo, para los fines del presente documento, "prevención" puede abarcar el retraso del inicio de la enfermedad, o un síntoma o afección de la misma.

Otra realización de la invención proporciona los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras o composiciones farmacéuticas de la invención, para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero.

Además, se desvela un método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células, los anticuerpos y/o las partes de unión a antígeno de los mismos de la invención, formando así un complejo, (b) y detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.

La muestra se puede obtener por cualquier método adecuado, por ejemplo, biopsia o necropsia. Una biopsia es la extracción de tejido y/o células de un individuo. Dicha extracción puede consistir en recoger tejido y/o células del individuo para realizar la experimentación en el tejido y/o células extraídos. Esta experimentación puede incluir experimentos para determinar si el individuo tiene y/o sufre de una determinada afección o estado de enfermedad. La afección o enfermedad puede ser, por ejemplo, cáncer.

Con respecto a la divulgación del método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, la muestra que comprende células del mamífero puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados celulares completos, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplásmica, una fracción de proteína completa, o una fracción de ácido nucleico. Si la muestra comprende células completas, las células pueden ser cualquier célula del mamífero, por ejemplo, las células de cualquier órgano o tejido, incluidas células sanguíneas o células endoteliales.

Para los fines del método de detección desvelado, la puesta en contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al mamífero. Preferentemente, la puesta en contacto en in vitro.

Asimismo, la detección del complejo puede ocurrir de varias formas conocidas en la materia. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos de la invención, descritos en el presente documento, se pueden marcar con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).

Los métodos de prueba de un CAR para la capacidad de reconocer células diana y para la especificidad de antígeno son conocidos en la materia. Por ejemplo, Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999), enseña métodos para medir la liberación de citocinas (por ejemplo, interferón-Y, factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos (GM-CSF, de sus siglas en inglés), factor de necrosis tumoral a (TNF-a) o interleucina 2 (IL-2). Además, la función CAR se puede evaluar mediante la medición de la citotoxicidad celular, como se describe en Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005)).

Los siguientes ejemplos ilustran más la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse de ningún modo como limitantes de su alcance.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra la síntesis de CAR anti-CD22, la transducción de PBMC con CAR anti-CD22 y el análisis de la expresión de la superficie de los CAR en PBMC transducidas.

Las secuencias que codifican los CAR se sintetizaron utilizando algoritmos de optimización de codones (Mr. Gene GmBH, Regensburg, Alemania) y se subclonaron en vectores de "destino" como se describe en (Zhao y otros, J. Immunol., 183(9):5563-74 (2009)) que codifican secuencias de una primera versión de CAR de segunda generación (dominios de señalización de linfocitos T intracelulares y transmembrana de CD28 y domino de señalización de células de T intracelulares de cadena CD3-zeta), una segunda versión de CAR de segunda generación (dominio transmembrana de CD8 unido a dominios de señalización de linfocitos T de CD137 y CD3-zeta), o un CAR de tercera generación (dominio transmembrana de CD8 unido a dominios de señalización de linfocitos T intracelulares de CD28, CD137 y CD3-zeta) como se muestra en la Tabla A.

TABLA A

Se crearon sobrenadantes de vectores retrovirales mediante la transfección de células 293GP con plásmidos que codifican vectores retrovirales de CAR y la glucoproteína de envoltura de RD114, recogiendo sobrenadantes de cultivo (s/n) 48-72 horas más tarde. Los sobrenadantes de cultivo se congelaron o se utilizaron inmediatamente para transducir PBMC humanas activadas con OKT3 e IL-2 utilizando el método "en placa" durante 2 días consecutivos (cultivo de linfocitos en placas recubiertas con RECTRONECTIN (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) antes de exponerse a diluciones de vectores que contienen s/n) como se describió anteriormente en Y. Zhao et al., J. Immunol., 183: 5563 (2009). También se utilizó en este estudio el s/n retroviral que contiene un CAR específico para CD19 de una línea celular de productor permanente (Kochenderfer et al., Blood, 116: 4099 (2010)).

La expresión del CAR en los linfocitos T transducidos se determinó mediante citometría de flujo. Para medir directamente el número de células capaces de unirse a CD22 en virtud del dominio CH2CH3, se utilizó IgG antihumana de cabra (H&L) (Invitrogen, Grand Island, NY). Para detectar los CAR que no codifican CH2CH3, CD22-Fc (R&D Systems) seguido de anti IgG-Fc PE (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). El CAR HA22SH expresa una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina en lugar de CH2CH3. El CAR CD19 se detectó utilizando la proteína L. La proteína L biotinilada (50 ng/ul, Thermo Scientific, Waltham, MA) se unió, las células se lavaron, y luego se detectaron con SA-PE (4 ug/ml, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Por comparación, también se evaluó un s/n del vector del CAR CD19. Los experimentos de citometría de flujo confirmaron la expresión de CAR en linfocitos T transducidos. Los CAR de segunda generación demostraron niveles de expresión en la superficie aumentados en comparación con los CAR de tercera generación medidos mediante la intensidad de fluorescencia media (MFI, de sus siglas en inglés).

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra la expresión de antígenos CD22 y CD19 en líneas celulares de leucemia.

Las líneas celulares de leucemia humana (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji y K562) se evaluaron para determinar el nivel de expresión de CD19 y CD22 en la superficie celular utilizando perlas de PE QUANTI-BRITE (BD Biosciences); y anticuerpos anti-CD19 y anti-CD22 marcados con PE (Tabla 2). "Número de receptores por célula" indica el número absoluto aproximado de moléculas por célula en cada una de las líneas celulares indicadas. Los datos se calcularon mediante la determinación de los anticuerpos unidos por célula (ABC, de sus siglas en inglés) utilizando las herramientas de análisis de datos del software CELLQUEST (BD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

TABLA 2

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra la actividad lítica de las células que expresan el CAR m971 de segunda generación (versión 1).

Para determinar la actividad lítica, las líneas celulares de leucemia (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji y K562) se marcaron con 51Cr y se utilizaron como dianas en los ensayos de citotoxicidad. Las células no se transdujeron (simulado) o se transdujeron con el CAR m971 de segunda generación (versión 1) (SEQ ID NO: 23), el CAR anti-CD19 o el CAR HASH22 de segunda generación (versión 1) y se utilizaron como células efectoras en varias relaciones de efector a diana en los ensayos de citotoxicidad. El porcentaje de lisis de las células diana se midió y se muestra en la Figura 1A-1G.

Como se muestra en las figuras 1A-1G, las linfocitos Transducidas con el CAR m971 de segunda generación (versión 1) (SEQ ID NO: 23) lisaron las líneas celulares de leucemia REM, SEM, NAL.M6, KOPN8, Daudi y Raji que expresan CD22, y no lisaron la línea celular K562 que no expresa CD22. Las linfocitos Transducidas con el CAR m971 de segunda generación (versión 1) (SEQ ID NO: 23) demostraron una capacidad lítica superior en comparación con las linfocitos Transducidas con el CAR HASH22 de segunda generación (versión 1).

Se analizaron siete muestras de pacientes con BCP-ALL para determinar la expresión de CD22 y CD19. Se observó una amplia gama de expresión de antígenos, como se demostró mediante análisis de citometría de flujo. Algunos pacientes mostraron una fuerte positividad para ambos antígenos, mientras que otros mostraron una disminución en la tinción de CD22. En cada caso, los CAR específicos de CD22 confirieron actividad lítica anti-leucémica a linfocitos de terceros.

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra la actividad lítica de linfocitos T que expresan un CAR m971.

Para determinar si las construcciones de CAR de segunda o tercera generación proporcionaron mayor actividad lítica, las líneas celulares de leucemia Raji (CD22alto), NALM6-GL (CD22bajo) o K562 (CD22-negativo) se marcaron con 51Cr y se utilizaron como dianas en ensayos de citotoxicidad. Las células efectoras eran linfocitos T humanos que eran no transducidos (simulado) o transducidos con el CAR m971 -segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 23) o el CAR m971-tercera generación (SEQ ID NO: 24). Las células efectoras se cultivaron conjuntamente con células diana en varias relaciones de efector a diana (E:D). Los resultados se muestran en las figuras 2A-2C.

Como se muestra en las figuras 2A-2C, los CAR m971 de segunda generación demostraron una actividad lítica superior en comparación con los CAR m971 de tercera generación.

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra la reactividad de linfocitos T que expresan un CAR m971.

Linfocitos T no transducidos (simulado) o transducidos con uno de los siguientes CAR: anti-CD19, m971 de segunda generación versión 1 (SEQ ID NO: 23), m971 de tercera generación (SEQ ID NO: 24), HASH22 de segunda generación versión 1, HASH22 de segunda generación versión 2, o HASH22 de tercera generación se cultivaron conjuntamente con líneas celulares de leucemia Raji (CD22alto), NALM6-GL (CD22bajo), o K562 (CD22 negativo) y las cantidades de interferón (IFN)-y, factor de necrosis tumoral (TNF) a, e interleucina (IL)-2 secretadas se midieron. Los resultados se muestran en las figuras 3A-3I.

Como se muestra en las figuras 3A-3I, las linfocitos Transducidas con el CAR m971-segunda generación, versión 1 secretaron mayores cantidades de IFN-^y, IL-2 y TNFa en respuesta al cultivo conjunto con líneas celulares que expresan CD22 en comparación con los CAR m97l de tercera generación.

EJEMPLO 6

Este ejemplo demuestra que las células transducidas con el CAR m971 retrasan la progresión de la enfermedad y alargan la duración de la supervivencia in vivo en comparación con un CAR HA22.

Los ratones NOD scid gamma (NSG, de sus siglas en inglés) inmunodeficientes se inyectaron en el día 0 con 0,5 x 106 NALM6-GL (NAML6 transfectado con luciferasa). El día 3, los ratones se trataron con 1 x 107 linfocitos T no transducidos (simulado) o linfocitos T transducidos con el CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 o el CAR m971-segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 23). La carga tumoral se midió en términos de señales bioluminiscentes para cada ratón como fotones/s/cm2/sr con imágenes bioluminiscentes utilizando el instrumento Xenogen IVIS. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) 3 mg de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA) y 4 minutos después de la inyección, se tomaron imágenes de ratones anestesiados con un tiempo de exposición de 30 segundos. El software LIVING IMAGE se utilizó para analizar las señales bioluminiscentes de cada ratón como fotones/s/cm2/sr en los días 3, 7 y 15. La intensidad de la señal se trazó a lo largo del tiempo y los resultados se muestran en la figura 4A.

Como se muestra en la figura 4A, todos los ratones tenían una enfermedad equivalente en el Día 3. Los ratones tratados con linfocitos T transducidos con el CAR m971-segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 23) redujeron la carga tumoral en comparación con los ratones tratados con células de control o linfocitos Transducidas con el CAR HA22.

La supervivencia de los ratones se midió durante 50 días, las estadísticas de supervivencia se calcularon utilizando el análisis de Log-rank (Mantel-Cox), y los resultados de supervivencia se muestran en la figura 4B. Como se muestra en la figura 4B, los ratones tratados con linfocitos T transducidos con el CAR m971-segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 23) demostraron una mayor supervivencia en comparación con los ratones tratados con células de control o linfocitos Transducidas con el CAR HA22.

Para determinar si el fracaso del tratamiento se debió a una pérdida antigénica, se sometieron los ratones a eutanasia debido a la carga de la enfermedad de acuerdo con el protocolo institucional, y se analizaron los bazos mediante citometría de flujo. Antes de la terapia, se observaron altos niveles de expresión de CAR en HASH-28z y m971-28z, linfocitos T transducidos, y las células NALM6-GL expresaron tanto CD19 como CD22. Tras el sacrificio, los bazos se analizaron primero para la expresión de CD45 y GFP humano. Las células positivas GFP bloqueadas representan un tumor, y después de un análisis adicional, esta población bloqueada continuó expresando GFP. Sin embargo, las células c D45 positivas y GFP negativas que quedaron ya no expresaron el CAR anti-CD22. Esto indica que la leucemia continuó expresando CD22 y que los linfocitos T de CAR no persistieron en el momento del sacrificio. Cuando se repitió el experimento y los ratones se sacrificaron el día 12, cuando los linfocitos T terapéuticos aún tenían un efecto, podían detectarse fácilmente en la sangre, el bazo y la médula ósea. El CAR

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une específicamente a CD22, comprendiendo el CAR: un dominio de unión a antígeno que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2, una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 6,

un dominio transmembrana y un dominio de señalización de linfocitos T intracelular.

2. El CAR de la reivindicación 1, en donde:

(a) el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7; y/o

(b) el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 8; y/o

(c) el dominio de unión a antígeno comprende un conector que comprende la SEQ ID NO: 11; y/o

(d) el CAR comprende además una secuencia líder que comprende la SEQ ID NO: 10.

3. El CAR de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el dominio de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 9.

4. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de i) CD8 y/o ii) CD28,

en donde el dominio transmembrana de CD8 comprende la SEQ ID NO: 12 o 18 y/o en donde el dominio transmembrana de CD28 comprende la SEQ ID NO: 15.

5. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el dominio de señalización de linfocitos T intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de uno o más de i) CD28, ii) CD137, y iii) CD3 zeta,

en donde el dominio de señalización de linfocitos T intracelular comprende uno o más de

(a) una secuencia de aminoácidos de CD28 que comprende la SEQ ID NO: 16 o 19,

(b) una secuencia de aminoácidos de CD137 que comprende la SEQ ID NO: 13 o 20, y

(c) una secuencia de aminoácidos de CD3 zeta que comprende la SEQ ID NO: 14, 17 o 21.

6. El CAR de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el dominio de señalización de linfocitos T intracelular comprende la secuencia de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de CD28 o CD137.

7. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 22-24.

8. El CAR de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el dominio de señalización de linfocitos T intracelular comprende la secuencia de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de CD137 o CD3 zeta.

9. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 25, preferentemente en donde el ácido nucleico comprende además una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26-28.

11. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o la reivindicación 10.

12. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el ácido nucleico de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 11, o la célula hospedadora de la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el ácido nucleico de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 11, la célula hospedadora de la reivindicación 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso como un medicamento.

15. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el ácido nucleico de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 11, la célula hospedadora de la reivindicación 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer.

16. El CAR, ácido nucleico, vector de expresión recombinante, célula hospedadora, o composición para el uso de la reivindicación 15, en donde el cáncer comprende un linfoma de linfocitos B o una leucemia de linfocitos B.