ES2654060T3

ES2654060T3 - Receptores de antígenos quiméricos anti-CD22

Info

Publication number: ES2654060T3
Application number: ES12781544.7T
Authority: ES
Inventors: Rimas J. ORENTAS; Crystal L. MACKALL; Ira H. Pastan
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2011-10-20
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2018-02-12
Anticipated expiration: 2032-10-19
Also published as: EP2768863A1; JP2017212996A; RU2644243C2; BR112014008849A2; CA2851795A1; CA2851795C; JP6267644B2; AU2017225049A1; CN109485730A; AU2012325915A1; EP2768863B1; US9868774B2; JP2014534207A; IN2014CN02906A; WO2013059593A1; RU2014118555A; CN103946242A; US20140274909A1; AU2017225049B2

Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno de HA22, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3.

Description

Receptores de antígenos quiméricos anti-CD22

Antecedentes de la invención

El cáncer es un problema de salud pública. A pesar de los avances realizados en tratamientos tales como quimioterapia, el pronóstico de muchos cánceres, incluidas las neoplasias malignas hematológicas, puede ser deficiente. Por ejemplo, en el año 2000, en los Estados Unidos, se ha estimado que se esperaban más de 45.000 muertes por linfoma no Hodgkin y leucemia (Greenlee y col., CA Cancer J. Clin., 50: 7-33 (2000)). En consecuencia, existe una necesidad insatisfecha de tratamientos adicionales para el cáncer, particularmente para neoplasias malignas hematológicas. James y col., J. Immunol., 180 (10): 7028-38 (2008) desvelan dos TCR (Receptores de Linfocitos T, por las siglas del inglés T cell receptor) quiméricos específicos de CD22 que constan de un módulo de reconocimiento antigénico de fragmento variable monocatenario (scFv, single chain FV), un espaciador Fc de IgG1, el dominio transmembrana CD4 y, como transductor de señal, el dominio citoplasmático CD3ζ. Las secuencias del fragmento scFv se obtuvieron de los anticuerpos monoclonales (mAb, monoclonal antibodies) específicos de CD22, RFB4 y HD39.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR, por las siglas del inglés Chimeric Antigen Receptor) que comprende un dominio de unión a antígeno de HA22, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de linfocito T; en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº: 1, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº: 3.

Otras realizaciones de la invención proporcionan ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, y composiciones farmacéuticas relacionadas con los CAR de la invención.

Las realizaciones adicionales de la invención proporcionan procedimientos para detectar la presencia de cáncer en un mamífero y procedimientos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero.

Breve descripción de algunas vistas de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que muestra el % de lisis de células leucémicas marcadas con 51Cr por linfocitos T humanos efectores transducidos con uno de los siguientes CAR: HA22 de segunda generación, versión 1 (■, cuadrado negro, SEQ ID NO: 15), HA22 de tercera generación (□, cuadrado blanco, SEQ ID NO: 16), BL22

; círculo blanco,
ס ; círculo negro, SEQ ID NO: 19), BL22detercera generación (segunda generación, versión 1 (

SEQ ID NO: 20), HA22-SH de segunda generación, versión 1 (▲; triángulo negro, SEQ ID NO: 17), HA22-SH de tercera generación (Δ, triángulo blanco, SEQ ID NO: 18), transducción simulada (no transducida, X) o CAR específico de CD19 (*) a diversas relaciones de células efectoras con respecto a células diana (E: D). La relación

E: D se muestra en el eje x y en el eje y se muestra el % de lisis de las células diana. La figura ilustra el análisis directo de la línea celular SEM y representa el perfil lítico observado para las otras líneas celulares ensayadas. Las Figuras 2A-2B son gráficos que muestran el porcentaje de lisis de líneas celulares de leucemia diana KOPN8

(A): o NALM6 (B) por células efectoras transducidas con una de tres construcciones CAR diferentes de segunda generación, versión 1 anti CD22: HA22-CH2CH3 (■; cuadrados, SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3, (▲; triángulo, SEQ ID NO: 19) o HA22-SH (secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina; X, SEQ ID NO: 17) a diversas proporciones entre E:D. Como control se incluyó el CAR anti CD19 (♦; rombo). El eje y indica el porcentaje de lisis de las células diana. El eje x muestra las proporciones entre E: D que se han normalizado según el porcentaje de transducción de cada construcción de CAR individual como se describe en el Ejemplo 4. Las líneas se dibujaron utilizando un ajuste de curva logarítmica en Excel (Microsoft). Las Figuras 3A-3B son gráficos que muestran el porcentaje de lisis de líneas celulares de leucemia diana REH

(A): o SEM (B) mediante células efectoras transducidas con una de las tres construcciones CAR diferentes de segunda generación, versión 1, anti CD22: HA22-CH2CH3 (■; cuadrados, SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3, (▲; triángulo, SEQ ID NO: 19) o HA22-SH (secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina, X, SEQ ID NO: 17) a diversas proporciones entre E:D. Como control se incluyó el CAR anti CD19 (♦; rombo). El eje y indica el porcentaje de lisis de las células diana. El eje x muestra proporciones entre E: D que se han normalizado según el porcentaje de transducción de cada construcción de CAR individual como se describe en el Ejemplo 4. Las líneas se dibujaron utilizando un ajuste de curva logarítmica en Excel (Microsoft). La Figura 4 es un gráfico que muestra el porcentaje de lisis de líneas celulares diana K562 (gris oscuro) REH (negro), SEM (blanco) o NALM6 (gris claro) por linfocitos T efectores transducidos con un vector retrovírico que expresa una de diversas construcciones CAR: HA 2ND (SEQ ID NO: 15); HA 3RD (SEQ ID NO: 16); HASH 2ND (SEQ ID NO: 17) o HASH 3RD (SEQ ID NO: 18). El eje x describe cada una de las poblaciones de células transfectadas que se somete a ensayo. Simulación: linfocitos T que se activaron y cultivaron como los otros grupos, pero que no se expusieron a sobrenadante retrovírico (s/n) que contenía el vector CAR (no

transducido). Como control se utilizó el CAR anti CD19. Las Figuras 5 A y 5B son gráficos que muestran el porcentaje de lisis de líneas celulares diana de leucemia que expresan CD22, REH (rombos), SEM (cuadrados), NALM6 (triángulos), OPN8 (X), Daudi (círculos), Raji ( |), o la línea celular diana de control negativo CD22, K562 (*) por linfocitos T efectores no transducidos (A, "simulación")

o células efectoras transducidas con CAR HASH22 de segunda generación, versión 1, (SEC ID Nº: 17) (B, "HASH 28z") a diversas proporciones entre E: D. Las Figuras 6A-6D son gráficos que muestran el porcentaje de lisis de líneas celulares diana de leucemia que expresan CD22, REH (A), SEM (B), NALM-6 (C) o KOPN-8 (D) por linfocitos T efectores no transducidos (triángulos, "simulación") o células efectoras transducidas con CAR HA22 de segunda generación, versión 1, (círculos, HA22 28z, SEQ ID NO: 15) o CAR BL22 de segunda generación, versión 1, (cuadrados, BL22 28z, SEQ ID NO: 19) a diversas proporciones entre E: D. Las Figuras 6E-6H son gráficos que muestran el porcentaje de lisis de líneas celulares diana de leucemia que expresan CD22, REH (E), SEM (F), NALM-6 (G) o KOPN-8 (H) por linfocitos T efectores no transducidos (triángulos, "simulación") o células efectoras transducidas con CAR HA22 de tercera generación (círculos, HA22 28BBz, SEQ ID NO: 16) o CAR BL22 de tercera generación (cuadrados, BL22 28BBz, SEQ ID NO: 20) a diversas proporciones E: D. Las Figuras 6I-6L son gráficos que muestran el porcentaje de lisis de líneas celulares diana de leucemia que expresan CD22, REH (I), SEM (J), NALM-6 (K) o KOPN-8 (L) por linfocitos T efectores no transducidos (triángulos, "simulación") o células efectoras transducidas con CAR HA22 de segunda generación, versión 1, con (círculos, HA22 28z, SEQ ID NO: 15) o sin (cuadrados, HASH22 28z, SEQ ID NO: 17) un dominio CH2CH3, a diversas proporciones entre E: D. La figura 7A es un gráfico que muestra señales bioluminiscentes (fotones/s/cm2/sr) generado por la reacción de luciferasa (transfectada en células de leucemia, que se inyectaron en ratones) con luciferina que se inyectó en los ratones, medida durante un período de tiempo de 30 días. Los ratones se trataron con linfocitos T de control ("simulación", no transducidos, ▼) o linfocitos T transducidos con CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 17, cuadrados negros), CAR HASH22 de tercera generación (SEQ ID NO: 18, ▲), o CAR HA22SH de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 32, cuadrados blancos). Los valores más altos de fotones/s/cm2/sr indican mayor carga tumoral. La Figura 7B es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con linfocitos T de control (“simulación”, no transducidos, círculos) o linfocitos T transducidos con CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 17, cuadrados), CAR HASH22 de tercera generación (SEQ ID NO: 18, Δ), o HA22SH de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 32, ∇) durante 30 días. (Simulado frente a HA22SH 28z, p=0,001; simulado frente a HA22SH 28BBz, p=0,004; simulado frente a HA22SHBBz, p=0,001; HA22SH 28Z frente a HA22SH 28 BBz, p = 0,03, HA22SH 28z frente a HA22SH BBz, no significativo). Las Figuras 8A-8D son gráficos que muestran unidades líticas calculadas como se describe en el Ejemplo 4 para células efectoras transducidas con uno de HA22 28z (SEQ ID NO: 15), HA22 28BBz (SEQ ID NO: 16), BL22 28z (SEQ ID NO: 19), BL22 28BBz (SEC ID Nº: 20), HASH22 28z (SEC ID Nº: 17), o HASH22 28BBz (SEC ID Nº: 18) después de cultivo conjunto con las células diana REH (A), SEM (B ), NALM-6 (C) o KOPN-8 (D). Las Figuras 9A-9C son gráficos que muestran las cantidades de interferón (IFN)- (pg/ml) secretadas por linfocitos T que no se han transducido (simulación) o que se han transducido con uno de los siguientes CAR: HASH22 de segunda generación, versión 1 (HA22SH-28Z), HASH22 de segunda generación, versión 2 (HA22SH-BBZ) o HASH22 de tercera generación (HA22SH-28BBZ), anti CD19, después de cultivo conjunto con las líneas celulares de leucemia NALM6-GL (CD221ow) (A), Raji (CD22hi) (B) o K562 (CD22 negativo) (C). Las Figuras 9D-9F son gráficos que muestran las cantidades de interleucina (IL)-2 (pg/ml) secretadas por linfocitos T que no se han transducido (simulación) o que se han transducido con uno de los siguientes CAR: HASH22 de segunda generación, versión 1, HASH22 de segunda generación, versión 2, o HASH22 de tercera generación, anti CD1, después de cultivo conjunto con las líneas celulares de leucemia NALM6-GL (CD221ow) (A), Raji (CD22hi) (B) o K562 (CD22 negativo) (C). Las Figuras 9G-9I son gráficos que muestran las cantidades de factor de necrosis tumoral (TNF)- (pg/ml) secretadas por linfocitos T que no se han transducido (simulación) o que se han transducido con uno de los siguientes CAR: HASH22 de segunda generación, versión 1, HASH22 de segunda generación, versión 2, o HASH22 de tercera generación, anti CD19, después de cultivo conjunto con las líneas celulares de leucemia NALM6-GL (CD221ow) (A), Raji (CD22hi) (B) o K562 (CD22 negativo) (C).

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona las siguientes realizaciones definidas en los apartados 1-21:

1.: Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno de HA22, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3.

2.: El CAR de acuerdo con el apartado 1, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5.

3.: El CAR de acuerdo con el apartado 1 o 2, que comprende adicionalmente una secuencia líder que comprende la SEQ ID NO: 7.

4.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-3, que comprende adicionalmente un dominio de inmunoglobulina.

5.: El CAR de acuerdo con el apartado 4, en el que el dominio de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 8, 9 o 36.

6.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-5, en el que el dominio transmembrana comprende i) CD8 y o ii) CD28.

7.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-6, en el que el dominio transmembrana comprende a) una secuencia de aminoácidos CD8 que comprende la SEQ ID NO: 10 o 33 y/o b) una secuencia de aminoácidos CD28 que comprende la SEQ ID NO: 1 1.

8.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-7, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende uno o más de i) CD28, ii) CD137 y iii) CD3 zeta.

9.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-8, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una secuencia de aminoácidos CD28 que comprende la SEQ ID NO: 12.

10.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-9, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una secuencia de aminoácidos CD137 que comprende la SEQ ID NO: 13 o 34.

11.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-10, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una secuencia de aminoácidos CD3 zeta que comprende la SEQ ID NO: 14 o 35.

12.: El CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-8 que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 15-18 y 32.

13.: Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1-12.

14.: El ácido nucleico de acuerdo con el apartado 13, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 21-23 y 38.

15.: El ácido nucleico de acuerdo con el apartado 14, que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 24-25 y 39.

16.: Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de los apartados 13-15.

17.: Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante del apartado 16.

18.: Una población de células que comprende al menos una célula hospedadora del apartado 17.

19.: Una composición farmacéutica que comprende el CAR de uno cualquiera de los apartados 1-12, el ácido nucleico de uno cualquiera de los apartados 13-15, el vector de expresión recombinante del apartado 16, la célula hospedadora del apartado 17, o la población de células del apartado 18, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20.: Un procedimiento para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende:

(a): poner en contacto una muestra que comprenda una o más células del mamífero con el CAR de uno cualquiera de los apartados 1-12, formando de ese modo un complejo, y

(b): detectar el complejo, indicando la detección del complejo la presencia de cáncer en el mamífero.

21.: El CAR de uno cualquiera de los apartados 1-12, el ácido nucleico de uno cualquiera de los apartados 13-15, el vector de expresión recombinante del apartado 16, la célula hospedadora del apartado 17, la población de células del apartado 18, o la composición farmacéutica del apartado 19, para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en un mamífero que expresa CD22.

En el presente documento se desvelan receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden: a) un dominio de unión a antígeno de HA22, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T; o b) un dominio de unión a antígeno de BL22, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende i) CD28 y / o ii) CD137.

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene los dominios de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, fragmento variable monocatenario (scFv)) unido a dominios de señalización de linfocitos T. Las características de los CAR incluyen su capacidad para redirigir la especificidad y reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de una manera no restringida por MHC, aprovechando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento del antígeno no restringido por MHC otorga a los linfocitos T que expresan los CAR, la capacidad de reconocer el antígeno independientemente del procesamiento del antígeno, evitando así un mecanismo principal de escape del tumor. Además, como ventaja, cuando se expresan en linfocitos T, los CAR no forman dímeros con las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T (TCR) endógeno.

Las frases "tiene especificidad antigénica" y "provoca una respuesta específica de antígeno" como se usan en el presente documento, significan que el CAR puede unirse específicamente a, y reconocer inmunológicamente, un antígeno, de tal manera que la unión del CAR con el antígeno provoca una respuesta inmunitaria.

Los CAR de la invención tienen especificidad antigénica por CD22. CD22 es un antígeno de linfocitos B restringido

por linaje que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig). CD22 se expresa en el 60-70% de los linfomas y leucemias de linfocitos B (p. ej., leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt) y no está presente en la superficie celular en etapas tempranas del desarrollo de linfocitos B o en células madre. Vaickus y col, Crit. Rev. Oncol./Hematol, 1 1: 267 -297 (1991); Bang y col., Clin. Cancer Res., 11: 1545 -50 (2005).

Sin estar ligado a una teoría o mecanismo particular, se cree que al provocar una respuesta específica de antígeno anti CD22, los CAR de la invención proporcionan uno o más de lo siguiente: dirigirse y destruir células cancerosas que expresan CD22, reducir o eliminar células cancerosas, facilitar la infiltración de células inmunitarias al sitio (o sitios) tumoral(es) y mejorar/ampliar las respuestas contra el cáncer. Debido a que el CD22 no se expresa en etapas tempranas del desarrollo de linfocitos B o en células madre, se contempla que los CAR de la invención impidan de forma ventajosa y sustancialmente, el direccionamiento/destrucción de células madre y/o linfocitos B en los primeros estadios del desarrollo.

La divulgación proporciona un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno de las inmunotoxinas HA22 o BL22. Las inmunotoxinas BL22 y HA22 son agentes terapéuticos que comprenden un scFv específico para CD22 fusionado a una toxina bacteriana. La inmunotoxina se une a la superficie de las células cancerosas y produce la muerte de las mismas. BL22 comprende un fragmento variable monocatenario estabilizado con disulfuro (dsFv) de un anticuerpo anti CD22, RFB4, fusionado a una forma truncada de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (Bang y col., Clin. Cancer Res., 1 1: 1545-50 (2005)). HA22 (CAT8015, moxetumomab pasudotox) es una versión mutada, de mayor afinidad, de BL22 (Ho y col., J. Biol. Chem., 280 (1): 607-17 (2005)).

Los dominios de unión a antígeno de HA22 y BL22 se unen específicamente a CD22. Por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 7.541.034; 7.355.012 y 7.982.011, incorporadas en el presente documento como referencia en su totalidad, se desvelan secuencias adecuadas de dominios de unión a antígeno de HA22 y BL22. A este respecto, una realización preferida de la invención proporciona CAR que comprenden un dominio de unión a antígeno que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, un fragmento variable monocatenario (scFv) del dominio de unión a antígeno de HA22 o BL22.

Cada uno de los dominios de unión a antígeno de HA22 y BL22 comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada. La región variable de cadena ligera de HA22 o BL22 puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente. La región variable de cadena pesada de HA22 o BL22 puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, la SEQ ID NO: 3 o 4, respectivamente. Por consiguiente, el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 1 o 2 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3 o 4.

La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada pueden unirse mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. El enlazador puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 37.

El dominio de unión a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada. A este respecto, los dominios de unión a antígeno HA22 o BL22, comprendiendo cada uno una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, consisten en, o consisten esencialmente en, la SEC ID Nº: 5 o 6, respectivamente.

El dominio de unión a antígeno comprende una secuencia líder. La secuencia líder puede posicionarse en el extremo amino de la región variable de la cadena ligera. La secuencia líder puede comprender cualquier secuencia líder adecuada. En una realización, la secuencia líder es una secuencia del receptor del factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) humanos. A este respecto, el dominio de unión a antígeno comprende una secuencia líder que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 7. En una realización de la invención, mientras que la secuencia líder puede facilitar la expresión del CAR en la superficie de la célula, la presencia de la secuencia líder en un CAR expresado no es necesaria para que el CAR funcione. En una realización de la invención, tras la expresión del CAR en la superficie celular, la secuencia líder puede escindirse del CAR. Por consiguiente, en una realización de la invención, el CAR carece de una secuencia líder.

En una realización, el CAR comprende un dominio de inmunoglobulina. Preferiblemente, el dominio de inmunoglobulina es una secuencia de inmunoglobulina humana. En una realización, el dominio de inmunoglobulina comprende una secuencia de dominio de inmunoglobulina G (IgG1) CH2 y CH3 (CH2CH3). A este respecto, el CAR comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, la SEQ ID NO: 8. En una realización de la invención, el dominio de inmunoglobulina puede comprender una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina. A este respecto, el CAR comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 9 o 36. Sin estar ligado a una teoría particular, se cree que el dominio CH2CH3 extiende el motivo de unión del scFv lejos de la membrana de las células que expresan CAR y pueden imitar con mayor precisión el tamaño y la estructura de dominio de un TCR nativo.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana. En una realización de la invención, el dominio transmembrana comprende i) CD8 y/o ii) CD28. En una realización preferida, CD8 y CD28 son

humanos. El CD8 o el CD28 pueden comprender menos que el total de CD8 o CD28, respectivamente. A este respecto, el CAR comprende a) un dominio transmembrana CD8 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 10 o 33 y/o b) un dominio transmembrana CD28 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 11.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende uno o más de i) CD28, ii) CD 137 y iii) CD3 zeta (ζ). En una realización preferida, el uno o más de CD28, CD137 y CD3 zeta son humanos. CD28 es un marcador de linfocitos T importante en la estimulación conjunta de linfocitos T. CD 137, también conocido como 4-1BB, transmite una fuerte señal coestimuladora a las linfocitos T, promoviendo la diferenciación y mejorando la supervivencia prolongada de los linfocitos T. CD3ζ se asocia al TCR para producir una señal y contiene motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based motifs). Uno o más de CD28, CD137 y CD3 zeta pueden comprender menos que la totalidad de CD28, CD137 o CD3 zeta, respectivamente. A este respecto, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una o más de una secuencia de aminoácidos CD28 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, la SEQ ID NO: 12; una secuencia de aminoácidos de CD137 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 13 o 34; y/o una secuencia de aminoácidos CD3 zeta que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en las SEQ ID NO: 14 o 35.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana que comprende CD28 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28 y CD3 zeta. A este respecto, el CAR puede comprender cada una de las SEQ ID NO: 11, 12 y 14. Preferiblemente, el CAR comprende a) cada una de las SEQ ID NO: 1, 3, 8, 11, 12 y 14; b) cada una delas SEQ ID NO: 2, 4, 8, 1 1, 12 y 14; o c) cada una de las SEQ ID NO: 1, 3, 9, 11, 12 y 14.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana que comprende CD8 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, CD137 y CD3 zeta. A este respecto, el CAR puede comprender cada una de las SEQ ID NO: 10, 12, 13 y 14. Preferiblemente, el CAR comprende a) cada una delasSEQ ID NO: 1, 3, 8, 10, 12, 13 y 14; b) cada una de las SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 13 y 14; o c) cada una de las SEQ ID NO: 1, 3, 9, 10, 12, 13 y 14.

En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana que comprende CD8 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD13 y CD3 zeta. A este respecto, el CAR puede comprender cada una de las SEQ ID NO: 33-35. Preferiblemente, el CAR comprende cada una de las SEQ ID NO: 1, 3 y 33-36.

Las realizaciones adicionales de la divulgaciones proporcionan CAR que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en, cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en la Tabla 1.

TABLA 1 5

SEQ ID NO:: Dominio de unión a antígeno Componentes adicionales

SEQ ID NO: 15 (HA22CAR de segunda generación, versión 1): HA22 -CH2CH3 -dominio transmembrana CD28 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD28 y CD3ζ

SEQ ID NO: 16 (CAR HA22 de tercera generación: HA22 -CH2CH3 -dominio transmembrana CD8 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD28, CD137 y CD3ζ

SEQ ID NO: 17 (CAR HASH22 de segunda generación, versión 1): HA22 -secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina -dominio transmembrana CD28 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD28 y CD3ζ

(continuación)

SEQ ID NO:: Dominio de unión a antígeno Componentes adicionales

SEQ ID NO: 18 (CARHASH22 de tercera generación): HA22 -secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina -dominio transmembrana CD28 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD28, CD137 y CD3ζ

SEQ ID NO: 19 (CARBL22 de segunda generación, versión 1): BL22 -CH2CH3 -dominio transmembrana CD28 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD28 y CD3ζ

SEQ ID NO: 20 (CARBL22 de tercera generación): BL22 -CH2CH3 -dominio transmembrana CD8 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD28, CD137 y CD3ζ

SEQ ID NO: 32 (CARHASH22 de segunda generación, versión 2): HA22 -dominio transmembrana CD28 -dominios de señalización intracelular de linfocitos T, CD137 y CD3ζ

Adicionalmente, en el presente documento se describen parte funcionales de los CAR de la invención. La expresión "parte funcional", cuando se usa en referencia a un CAR, se refiere a cualquier parte o fragmento del CAR de la invención, cuya parte o fragmento conserva la actividad biológica del CAR del cual es parte (CAR parental). Las partes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que conservan la capacidad de reconocer células diana, o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, en un grado similar, en el mismo grado, o en mayor grado, que el CAR parental. Con referencia al CAR parental, la parte funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% o más, del CAR parental.

La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en su extremo amino o carboxilo, o en ambos extremos, cuyos aminoácidos adicionales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del CAR parental. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, por ejemplo, reconocen células diana, detectan cáncer, tratan o previenen cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del CAR parental.

Adicionalmente, en el presente documento se desvelan variantes funcionales de los CAR de la invención descritos en el presente documento. La expresión "variante funcional" como se usa en el presente documento se refiere a un CAR, polipéptido o proteína que tiene identidad de secuencia o similitud sustancial o significativa con un CAR parental, cuya variante funcional conserva la actividad biológica del CAR del cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en el presente documento (CAR parental) que conservan la capacidad de reconocer células diana en un grado similar, en el mismo grado, o en mayor grado, que el CAR parental. Con referencia al CAR parental, la variante funcional puede tener una identidad, por ejemplo, de al menos aproximadamente 30%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más, con la secuencia de aminoácidos del CAR parental

Una variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del CAR parental con al menos una sustitución de aminoácidos conservativa. De manera alternativa o adicional, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR parental con al menos una sustitución de aminoácidos no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservativa no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución de aminoácidos no conservativa puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con la del CAR parental.

Las sustituciones de aminoácidos de los CAR de la invención son preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son conocidas en la técnica, e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas o similares propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos conservativa puede ser un aminoácido polar ácido con carga negativa sustituido por otro aminoácido polar ácido con carga negativa (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), un aminoácido polar básico con carga negativa sustituido por otro aminoácido polar básico con carga negativa (por ejemplo, Lys, His, Arg, etc.), un aminoácido no cargado con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido no cargado con una cadena lateral polar (por ejemplo, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), un aminoácido con una cadena lateral beta ramificada sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral beta ramificada (por ejemplo, Ile, Thr y Val), un aminoácido con una cadena lateral aromática sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral aromática (por ejemplo, His, Phe, Trp y Tyr), etc.

El CAR puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de modo que otros componentes, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambian materialmente la actividad biológica de la variante funcional.

Los CAR de realizaciones de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) pueden tener cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los CAR (o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente al antígeno, detectar células enfermas en un mamífero, o tratar o prevenir la enfermedad en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como una longitud de 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000

o más aminoácidos.

Los CAR de las realizaciones de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de la invención) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Dichos aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido amino ciclohexano carboxílico, norleucina, α aminoácido n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3-y trans-4-hidroxiprolina, 4 aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, β-fenilserina, β-hidroxifenilalanina, fenilglicina, α-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, ácido aminomalónico monoamida, N'-bencil-N'-metil-lisina, Ν',Ν'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido α-aminociclopentano carboxílico, ácido α-aminociclohexano carboxílico, ácido α-aminocicloheptano carboxílico, ácido α-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido α,γdiaminobutírico, ácido α, β-diaminopropiónico, homofenilalanina y α-terc-butilglicina.

Los CAR de las realizaciones de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) pueden glucosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse, por ejemplo, a través de un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.

Los CAR de las realizaciones de la invención (incluyendo partes funcionales y sus variantes funcionales) pueden obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica. Los CAR pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado para fabricar polipéptidos o proteínas. Se describen procedimientos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas en referencias, tales como Chan y col., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood y col., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2001; y en la Patente de Estados Unidos 5.449.752. Además, los polipéptidos y las proteínas se pueden producir de forma recombinante utilizando los ácidos nucleicos descritos en este documento utilizando procedimientos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ªed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los CAR de la invención (incluyendo partes funcionales y sus variantes funcionales) pueden aislarse y/o purificarse de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. Los procedimientos de aislamiento y purificación son muy conocidos en la técnica. Como alternativa, los CAR descritos en este documento (incluyendo partes funcionales y sus variantes funcionales) pueden sintetizarse desde el punto de vista comercial en compañías tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los CAR de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, pueden aislarse y/o purificarse.

La divulgación proporciona además un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de los CAR de la invención. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que sea conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado por ingeniería

genética, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Además, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por la parte funcional del CAR de la invención.

Los procedimientos para analizar la capacidad de los anticuerpos para unirse a cualquier parte funcional de los CAR de la invención son conocidos en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión entre un anticuerpo y un antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia de Western, inmunoprecipitación, y ensayos de inhibición competitiva (véase, por ejemplo, Janeway y col., citados más adelante, y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2002/0197266 A1).

En la técnica se conocen procedimientos adecuados para producir anticuerpos. Por ejemplo, en Köhler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 51 -1-519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laborator y Manual, CSH Press (1988), y en CA Janeway y col. (eds.), Immunobiology, 5ª ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)), se describen procedimientos convencionales de hibridoma. Como alternativa, en la técnica se conocen otros procedimientos, tales como los procedimientos de EBV-hibridoma (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74 (2), 361 -67 (1984), y Roder y col., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y los sistemas de expresión de vector bacteriófago (véase, por ejemplo, Huse y col., Science, 246, 1275-81 (1989)). Además, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352 y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2002/0197266 A1, se describen procedimientos para producir anticuerpos en animales no humanos.

Adicionalmente, para generar un anticuerpo puede utilizarse la presentación en fagos. A este respecto, pueden generarse fagotecas que codifican dominios variables (V) de unión a antígeno de anticuerpos utilizando técnicas estándar de biología molecular y ADN recombinante (véase, por ejemplo, Sambrook y col., y Ausubel y col., ambos citados anteriormente). Los fagos que codifican una región variable con la especificidad deseada se seleccionan para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridoma, de modo que los anticuerpos que tienen las características de anticuerpos monoclonales son secretados por la célula (véase, por ejemplo, Janeway y col., y Huse y col., ambos citados anteriormente, y la Patente de Estados Unidos 6.265.150).

Los anticuerpos pueden producirse a través de ratones transgénicos que son transgénicos para genes específicos de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera. Dichos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.545.806 y 5.569.825, y en Janeway y col., citados anteriormente.

En la técnica se conocen bien procedimientos para generar anticuerpos humanizados y se describen con detalle, por ejemplo, en Janeway y col., citados anteriormente, en las Patentes de Estados Unidos 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, Patente Europea No. 0239400 B1 y Patente del Reino Unido Nº 2188638. También se pueden generar anticuerpos humanizados utilizando la tecnología de recubrimiento de anticuerpos descrita en la patente de Estados Unidos 5.639.641 y en Pedersen y col., J. Mol. Biol., 235, 959 -973 (1994).

La divulgación también proporciona partes de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento. La parte de unión a antígeno puede ser cualquier parte que tenga al menos un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F (ab')2, dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.

Un fragmento de anticuerpo del fragmento monocatenario (sFv) de la región variable, que es un fragmento Fab truncado que incluye el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unida a un dominio V de una cadena ligera de anticuerpo a través de un péptido sintético, puede generarse utilizando técnicas habituales de tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Janeway y col., citados anteriormente). De forma similar, pueden preparase fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Reiter y col., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Sin embargo, los fragmentos de anticuerpos de la invención, no están limitados a estos tipos ejemplares de fragmentos de anticuerpos.

Además, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, se puede modificar para que comprenda un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).

Además, en una realización de la invención se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los CAR de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias líder, dominios de unión a antígeno, dominios de inmunoglobulina, dominios transmembrana, y/o dominios de señalización intracelular de linfocitos T descritos en este documento.

La divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de BL22 o HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada) y CH2CH3. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir

en, o consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 21 o 22, respectivamente. Otra realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada) y una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 23 o 38.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los dominios transmembrana y/o dominios de señalización intracelular de linfocitos T descritos en el presente documento. Una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio transmembrana que comprende CD28, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 24. Otra realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD137, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 25. Otra realización más de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD137, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 39.

Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de BL22 o HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), CH2CH3, un dominio transmembrana que comprende CD28, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, las dos SEQ ID NO: 21 y 24 o las dos SEQ ID NO: 22 y 24.

Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina, un dominio transmembrana que comprende CD28, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en las dos SEQ ID NO: 23 y 24.

Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), CH2CH3, un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD137, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, las dos SEQ ID NO: 21 y 25 o las dos SEQ ID NO: 22 y 25.

En otra realización preferida, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina, un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD28, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD137, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en,

o consistir esencialmente en, las dos SEQ ID NO: 23 y 25.

En otra realización preferida adicional, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder, un dominio de unión a antígeno de HA22 (que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada), una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina, un dominio transmembrana que comprende CD8, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD137, y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T que comprende CD3ζ. A este respecto, el ácido nucleico puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, las dos SEQ ID NO: 38 y 39.

"Ácido nucleico" como se usa en este documento incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y / o purificado) de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace de fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Sin embargo, en algunos casos, puede ser adecuado, como se indica en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar secuencias de aminoácidos adicionales que no afectan a la función del CAR y que pueden o no traducirse después de la expresión del ácido nucleico por

una célula hospedadora (por ejemplo, SEQ ID NO: 31).

Los ácidos nucleicos de una realización de la invención pueden ser recombinantes. Como se usa en este documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos con moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas resultantes de la replicación de las descritas anteriormente en (i). Para los fines del presente documento, la replicación puede ser una replicación in vitro o una replicación in vivo.

Un ácido nucleico recombinante puede ser uno que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o que tiene una secuencia que se obtiene mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial a menudo se realiza mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética, tales como las descritas en Sambrook y col., citado anteriormente. Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en síntesis química y/o en reacciones de ligamiento enzimático utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col, y Ausubel y col., ambos citados anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados diversamente diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcinosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6 sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-Dmanosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, metilester del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo y 2,6diaminopurina. Como alternativa, es posible adquirir uno o más de los ácidos nucleicos de la invención en compañías, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos aislada o purificada que codifique cualquiera de los CAR o sus partes funcionales o variantes funcionales. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que esté degenerada en cualquiera de las secuencias

o en una combinación de secuencias degeneradas.

La divulgación también proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento.

La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas puede hibridarse en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o una que contiene solo unos pocos emparejamientos erróneos dispersos de una secuencia aleatoria que tenía pocas regiones pequeñas (p. ej., 3-10 bases) que coincidían con la secuencia de nucleótidos. Dichas regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 bases o más, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente altas incluirían, por ejemplo, condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl a aproximadamente 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70ºC. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran pocos, si es que hubiese alguno, emparejamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y el molde o cadena diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los CAR de la invención. En general, se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas a través de la adición de cantidades en aumento de formamida.

La divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 70% o más, por ejemplo, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99%, idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en este documento.

En una realización, los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante. A este respecto, una realización de la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para los fines del presente documento, la expresión "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótidos o polinucleótidos modificada por ingeniería genética, que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una

célula hospedadora, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, la proteína, el polipéptido o el péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, la proteína, el polipéptido o el péptido se expresen en la célula. En conjunto, los vectores de la invención no son de origen natural. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, que incluyen, pero no se limitan a, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintéticos u obtenerse en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos de origen natural o no natural, o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los enlaces nucleotídicos o internucleotídicos de origen no natural o alterados no obstaculizan la transcripción o replicación del vector.

En una realización, el vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede utilizarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas cosas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Bumie, MD), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También pueden utilizarse vectores de bacteriófagos, tales como Gt10, GT11, ΖapΙΙ (Stratagene), ΕΜΒL4 y ΝΜ1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI10, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión de animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). El vector de expresión recombinante puede ser un vector vírico, por ejemplo, un vector retrovírico.

En la materia se conocen en general diversas técnicas de transfección (véase, por ejemplo, Graham y col., Virology,

52: 456-467 (1973); Sambrook y col., citado anteriormente; Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986), y Chu y col., Gene, 13: 97 (1981). Los procedimientos de transfección incluyen coprecipitación con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Graham y col., citados anteriormente), microinyección directa en células cultivadas (véase, por ejemplo, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y col., BioTechniques, 6:. 742-751 (1988)), transferencia de genes a través de liposomas (véase, por ejemplo, Mannino y col., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), transducción a través de lípidos (véase, por ejemplo, Felgner y col., Proc Natl Acad Sci USA, 84: 7413-7417 (1987)), y suministro de ácido nucleico utilizando microproyectiles de alta velocidad (véase, por ejemplo, Klein y col., Nature, 327.: 70 -73 (1987)).

En una realización, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden prepararse utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante descritas, por ejemplo, en Sambrook y col, y en Ausubel y col., ambos citados anteriormente. Pueden prepararse construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden proceder, por ejemplo, del plásmido ColEl, 2 μ, λ, SV40, virus del papiloma bovino, y similares.

El vector de expresión recombinante puede comprender secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos del tipo de célula hospedadora (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en la que se va a introducir el vector, según corresponda, y teniendo en cuenta si el vector es un vector basado en ADN o en ARN. Los ejemplos de secuencias que incluyen codones de terminación incluyen las SEQ ID NO: 29 y 30. El vector de expresión recombinante puede comprender sitios de restricción para facilitar la clonación. Los ejemplos de secuencias que incluyen sitios de restricción incluyen las SEQ ID NO: 26-28.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxótrofo para proporcionar prototrofía y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR (incluyendo sus partes funcionales y variantes funcionales), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a, se hibrida con, la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La selección de promotores, por ejemplo, fuerte, débil, inducible, específica de tejido y específica de desarrollo, se incluye en experiencia del técnico habitual. De forma similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está incluida en la experiencia del técnico habitual en la materia. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV o un promotor encontrado en la repetición larga terminal del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresión transitoria, expresión estable, o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para la expresión constitutiva o inducible.

Adicionalmente, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para que incluyan un gen

suicida. Como se usa en el presente documento, la expresión "gen suicida" se refiere a un gen que causa la muerte de la célula que expresa el gen suicida. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, sobre la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando dicha célula entra en contacto o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) y se incluyen, por ejemplo, el gen de timidina cinasa (TK) del herpesvirus simple (HSV), citosina daminasa, purina nucleósido fosforilasa y nitrorreductasa.

Adicionalmente, en el presente documento se desvelan conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los CAR de la invención (incluyendo cualquiera de sus partes funcionales o variantes), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células hospedadoras, o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos. En la técnica se conocen, en general, conjugados así como los procedimientos de síntesis de los mismos (véase, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209223 (2005) y Kirin y col., Inorg Chem. 44 (15): 5405 -5415 (2005)).

Una realización de la invención proporciona además una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en este documento. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, vegetal, animal, fúngica, o de alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, de una bacteria o protozoo. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, de un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células hospedadoras adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células DH5α de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con el fin de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5α. Para producir un CAR recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula de mamífero. La célula hospedadora puede ser una célula humana. Si bien la célula hospedadora puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier estadio de desarrollo, la célula hospedadora puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL, peripheral blood lymphocyte) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, peripheral blood mononuclear cell). La célula hospedadora puede ser un linfocito T.

Para los fines del presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como una linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario, o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivados, por ejemplo, Jurkat, SupT1, etc. o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T puede obtenerse de numerosas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, médula ósea, ganglio linfático, timo u otros tejidos

o fluidos. Los linfocitos T también pueden enriquecerse o purificarse. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. El linfocito T puede ser un linfocito T aislada de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede ser de cualquier estadio de desarrollo, que incluye, pero no se limita a, linfocitos T CD4+/CD8+ doble positivos, linfocitos T auxiliares CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th 2, linfocitos T CD8+ (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), células infiltrantes de tumores, linfocitos T de memoria, linfocitos T vírgenes, y similares. El linfocito T puede ser un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+.

También se proporciona mediante una realización de la invención, una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en este documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula hospedadora (por ejemplo, un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Como alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedadoras (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una sola célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en este documento.

Los CAR (incluyendo sus partes funcionales y variantes), los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras (incluyendo sus poblaciones) y los anticuerpos (incluyendo sus partes de unión a antígeno), que en su conjunto, y en lo sucesivo, reciben el nombre de "materiales CAR de la invención", pueden aislarse y/o purificarse. El término "aislado" como se usa en el presente documento significa que se ha eliminado de su entorno natural. El término "purificado" o "aislado" no requiere pureza absoluta o aislamiento absoluto; más bien se entiende como un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, una preparación de células hospedadoras purificada (o aislada) es aquella en la que la célula hospedadora es más pura que las células en su entorno natural dentro del organismo. Dichas células hospedadoras pueden producirse, por ejemplo, mediante técnicas de purificación convencionales. En algunas realizaciones, una preparación de una célula hospedadora se

purifica de manera que la célula hospedadora represente al menos aproximadamente el 50%, por ejemplo al menos aproximadamente el 70%, del contenido celular total de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente 50%, puede ser mayor que aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80%, o puede ser de aproximadamente 100%.

Los materiales CAR de la invención pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, una realización de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los CAR, partes funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células hospedadoras (incluyendo sus poblaciones) y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos), y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualquiera de los materiales CAR de la invención pueden comprender más de un material CAR de la invención, por ejemplo, un CAR y un ácido nucleico, o dos o más CAR diferentes. Como alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material CAR de la invención en combinación con otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparraginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende la célula hospedadora de la invención o poblaciones de la misma.

Los materiales CAR de la invención pueden proporcionarse en forma de una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.

Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el transportador farmacéuticamente aceptable puede ser cualquiera de los utilizados convencionalmente y está limitado solo por cuestiones químico-físicas, tales como solubilidad y falta de reactividad con el(los) agente(s) activo(s), y por la vía de administración. Los transportadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, son muy conocidos por los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el transportador farmacéuticamente aceptable sea uno que sea inerte desde el punto de vista químico para el (los) agente (s) activo (s) y que no tenga efectos secundarios o toxicidad perjudiciales en las condiciones de uso.

La elección del transportador se determinará en parte por el material CAR particular de la invención, así como por el procedimiento particular utilizado para administrar el material CAR de la invención. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Pueden utilizarse conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. Se puede utilizar opcionalmente una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o sus mezclas están presentes típicamente en una cantidad de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 2 % en peso de la composición total.

Los agentes tamponadores adecuados pueden incluir, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. Se puede utilizar opcionalmente una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o sus mezclas están presentes típicamente en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 4 % en peso de la composición total.

En las formulaciones farmacéuticas, la concentración del material CAR de la invención puede variar, por ejemplo, de menos de aproximadamente 1%, normalmente al 10 %, o al menos aproximadamente al 10%, hasta tanto como aproximadamente del 20% a aproximadamente el 50% o más en peso, y puede seleccionarse principalmente por volúmenes de fluido y viscosidades, de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.

Los expertos en la materia conocen, o resulta obvio para ellos, cómo preparar composiciones administrables (por ejemplo, administrables por vía parenteral) y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21ª ed. (1 de mayo de 2005).

Las siguientes formulaciones para administración oral, en aerosol, parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intratecal) y tópica son meramente ejemplares y no son de ninguna manera limitantes. Se puede usar más de una vía para administrar los materiales CAR de la invención y, en ciertos casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra.

Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden comprender o consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del material CAR de la invención disuelto en diluyentes, tales como agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, bolsitas, comprimidos, pastillas y trociscos, conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada del principio activo, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y alcoholes de polietileno, con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Las formas en cápsulas pueden ser del tipo habitual de gelatina dura o blanda que

contiene, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. Las formas en comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes disgregantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes y otros excipientes farmacológicamente compatibles. Las formas en pastilla pueden comprender el material CAR de la invención en un aromatizante, generalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, así como pastillas que comprenden el material CAR de la invención en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, emulsiones, geles y similares, que como se sabe en la técnica, contienen adicionalmente dichos excipientes.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El material CAR de la invención puede administrarse en un diluyente fisiológicamente aceptable en un transportador farmacéutico, tal como un líquido o una mezcla de líquidos estéril(es), incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres o glicéridos de ácidos grasos, o glicéridos de ácido graso acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente adecuado, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa,

o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites, que pueden utilizarse en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y aceite mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietileno y polipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-βaminopropionatos, y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán típicamente, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 25 % en peso del material CAR de la invención en solución. Se pueden utilizar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen, por ejemplo, un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB, hydrophilelipophile balance) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dichas formulaciones típicamente variará, por ejemplo, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol, tales como monooleato de sorbitán, y aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes herméticos de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales, y se pueden conservar en un estado criodesecado (liofilizado) que solo requiere la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito previamente.

Las formulaciones inyectables son según una realización de la invención. Los requisitos para los transportadores farmacéuticos eficaces para las composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, JB Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ª ed., páginas 622-630 (1986)).

Las formulaciones tópicas, que incluyen las que son útiles para la liberación transdérmica del fármaco, son bien conocidas por los expertos en la técnica y son adecuadas en el contexto de las realizaciones de la invención para su aplicación en la piel. El material CAR de la invención, solo o en combinación con otros componentes adecuados, puede prepararse en formulaciones de aerosol para administrar por inhalación. Estas formulaciones de aerosol pueden colocarse en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones no presurizadas, tales como en un nebulizador o un atomizador. Dichas formulaciones pulverizadoras también pueden utilizarse para pulverizar la mucosa.

Las expresiones “una cantidad eficaz" o "una cantidad eficaz para tratar", se refieren a una dosis que es adecuada para prevenir o tratar un cáncer en un individuo. Las cantidades eficaces para un uso terapéutico o profiláctico dependerán, por ejemplo, del estadio y la gravedad de la enfermedad o trastorno que vaya a tratarse, de la edad, peso y estado de salud general del paciente, y del criterio del médico que prescribe. El tamaño de la dosis también estará determinado por el procedimiento de administración, el momento y la frecuencia de administración que se seleccionen, por la existencia, la naturaleza y el grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un activo particular, y por el efecto fisiológico deseado. Un experto en la materia apreciará que diversas enfermedades o trastornos podrían requerir un tratamiento prolongado que implique administraciones múltiples, tal vez utilizando los materiales CAR de la invención en cada una o en las diversas rondas de administración. Como ejemplo y sin intención de limitar la invención, la dosis del material CAR de la invención puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día. Cuando el material CAR de la invención es una célula hospedadora, una dosis ejemplar de células hospedadoras puede ser un mínimo de un millón de células (1 mg células/dosis). Cuando el material CAR de la invención es un ácido nucleico empaquetado en un virus, una dosis ejemplar de virus puede ser de 1 ng/dosis.

Para los fines de la invención, la cantidad o dosis administrada del material CAR de la invención debería ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal durante un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material CAR de la invención debería ser suficiente para unirse al antígeno, o detectar, tratar o prevenir la enfermedad en un período de aproximadamente 2 horas o más largo, por ejemplo, de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas o más, desde el momento de administración. En ciertas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis se determinará por la eficacia del material CAR particular de la invención y la condición del animal (por ejemplo, ser humano), así como por el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) a tratar.

Para los fines de la invención, para determinar una dosis inicial para administrar a un mamífero, podría utilizarse un ensayo, que comprendiese, por ejemplo, comparar el grado en el que se produce la lisis de las células diana y/o se secreta el IFN-γ por los linfocitos T que expresan el CAR de la invención después de la administración de una dosis determinada de dichos linfocitos T a un mamífero, entre un conjunto de mamíferos a los que se les administra una dosis diferente de los linfocitos T. El grado en el que se produce la lisis de las células diana y/o se secreta el IFN-γ después de la administración de una dosis determinada puede analizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Además de las composiciones farmacéuticas anteriormente descritas, los materiales CAR de la invención pueden formularse como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina, o liposomas. Los liposomas pueden servir para dirigir los materiales CAR de la invención a un tejido particular. Los liposomas también pueden utilizarse para aumentar la semivida de los materiales CAR de la invención. Hay muchos procedimientos disponibles para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka y col., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) y en las Patentes de Estados Unidos 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Los sistemas de suministro útiles en el contexto de las realizaciones de la invención pueden incluir sistemas de suministro por liberación temporal, liberación retardada y liberación sostenida, de tal manera que la administración de la composición de la invención se produce antes de, y con tiempo suficiente para, producir la sensibilización del sitio a tratar. La composición de la invención puede utilizarse junto con otros agentes terapéuticos o terapias. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición de la invención, aumentando así la comodidad para el sujeto y el médico, y pueden ser particularmente adecuados para ciertas realizaciones de composición de la invención.

Se dispone de muchos tipos de sistemas de suministro por liberación y los expertos en la materia conocen dichos sistemas que incluyen sistemas basados en polímeros, tales como poli(láctido-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico y polianhídridos. Las microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos

5.075.109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no basados en polímeros que son lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-diy tri-glicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas Silastic; sistemas basados en péptidos; revestimientos de cera; comprimidos fabricados por compresión que utilizan aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Como ejemplos específicos se incluyen, pero no están limitados a: (a) sistemas erosivos en los que la composición activa está contenida en una forma dentro de una matriz tal como la descrita en las Patentes de Estados Unidos 4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 y 5.239.660 y (b) sistemas difusionales en los que un componente activo penetra a una velocidad controlada desde un polímero tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 3.832.253 y 3.854.480. Además, se pueden utilizar sistemas de suministro de componentes informáticos basados en bombas, algunos de los cuales están adaptados para la implantación.

Un experto habitual en la materia apreciará fácilmente que los materiales CAR de la invención pueden modificarse de diversas maneras, de manera que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales CAR de la invención se incrementa con la modificación. Por ejemplo, los materiales CAR de la invención pueden conjugarse directa o

indirectamente a través de un puente con un residuo de direccionamiento. En la técnica se conoce la práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, materiales CAR de la invención, con residuos de direccionamiento. Véase, por ejemplo, Wadwa y col., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) y la patente de Estados Unidos 5.087.616.

Como alternativa, los materiales CAR de la invención pueden modificarse en una forma de depósito, de tal manera que la forma en la que se liberan los materiales CAR de la invención en el organismo al que se administra, se controla con respecto al tiempo y a la ubicación dentro del organismo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.450.150). Las formas de depósito de los materiales CAR de la invención pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales CAR de la invención y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en el que los materiales CAR de la invención están encapsulados o difundidos por todo el material y/o degradación del material no poroso. Después, el depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del organismo y los materiales CAR de la invención se liberan del implante a una velocidad predeterminada.

Cuando los materiales CAR de la invención se administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales, se pueden coadministrar uno o más agentes terapéuticos adicionales al mamífero. Por "coadministración" se entiende administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales y los materiales CAR de la invención están suficientemente cerca en el tiempo de modo que los materiales CAR de la invención pueden potenciar el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. A este respecto, los materiales CAR de la invención pueden administrarse en primer lugar y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en segundo lugar, o viceversa. Como alternativa, los materiales CAR de la invención y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse simultáneamente. Un agente terapéutico ejemplar que puede coadministrarse con los materiales CAR es la IL-2. Se cree que la IL-2 potencia el efecto terapéutico de los materiales CAR de la invención. Para los fines de los procedimientos de la invención, en los que las células hospedadoras o poblaciones de células se administran al mamífero, las células pueden ser células que sean alogénicas o autólogas para el mamífero.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención, los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, o poblaciones de células, pueden utilizarse para tratar o prevenir una enfermedad en un mamífero. Sin estar ligados a una teoría o mecanismo particular, los CAR de la invención tienen actividad biológica, por ejemplo, capacidad de reconocer a un antígeno, por ejemplo, CD22, de modo que cuando una célula expresa el CAR puede mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa el antígeno, por ejemplo, CD22, para el cual el CAR es específico. A este respecto, una realización de la invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células, los anticuerpos y/o las partes de unión a antígeno de los mismos, y/o las composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Una realización de la invención comprende adicionalmente el empobrecimiento de linfocitos del mamífero antes de administrar los materiales CAR de la invención. Los ejemplos de empobrecimiento de linfocitos incluyen, pero sin limitación, quimioterapia no mieloablativa de empobrecimiento de linfocitos, quimioterapia mieloablativa de empobrecimiento de linfocitos, irradiación corporal total, etc.

Para los fines de los procedimientos de la invención, en los que se administran células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas para el mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas para el mamífero.

El mamífero al que se hace referencia en este documento puede ser cualquier mamífero. Como se usa en este documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitación, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsters, y mamíferos del orden Lagomorpha, tales como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden Carnivora, incluidos felinos (gatos) y caninos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden Artiodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluyendo equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Anthropoids (humanos y simios). Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

Con respecto a los métodos de la invención, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de vejiga (por ejemplo, carcinoma de vejiga), cáncer de hueso, cáncer de cerebro (por ejemplo, meduloblastoma), cáncer de mama , cáncer de ano, canal anal o anorectum; cáncer ocular, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, fibrosarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, tumores líquidos, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón no microcítico), linfoma, mesotelioma maligno, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y Linfoma de Burkitt, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, próstata, rectal, renal, cutáneo, de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, tumores sólidos, cáncer de estómago, cáncer

testicular, cáncer de tiroides y cáncer de uréter. Preferiblemente, el cáncer es una neoplasia maligna hematológica (por ejemplo, leucemia o linfoma, que incluye, pero no se limita a, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt). Preferiblemente, el cáncer se caracteriza por la expresión de CD22.

Los términos "tratar" y "prevenir", así como palabras raíces de los mismos, como se usan en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o prevención completos o al 100%. Por el contrario, existen diversos grados de tratamiento o prevención de los cuales los expertos en la técnica reconocen que tienen un posible beneficio o efecto terapéutico. A este respecto, los procedimientos de la invención pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención que proporciona el procedimiento de la invención, puede incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que se tratan o se previenen. Además, para los fines del presente documento, la "prevención" puede abarcar retrasar el inicio de la enfermedad, o de un síntoma o afección de la misma.

Otra realización de la invención proporciona un uso de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, o composiciones farmacéuticas de la invención, para el tratamiento o la prevención de cáncer en un mamífero.

Otra realización de la invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprenda una o más células del mamífero, con los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, la células hospedadora, la población de células, los anticuerpos, y/o las partes de unión a antígeno de los mismos de la invención, formando así un complejo, (b) y detectar el complejo, indicando la detección del complejo la presencia de cáncer en el mamífero.

La muestra puede obtenerse mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, biopsia o necropsia. Una biopsia es la extracción de tejido y/o de células de un individuo. Dicha extracción puede consistir en recoger tejido y/o células del individuo para analizar el tejido y/o las células que se han extraído. Este análisis puede incluir análisis para determinar si el individuo tiene y/o padece una determinada afección o patología. La afección o enfermedad puede ser, por ejemplo, cáncer.

Con respecto a una realización del procedimiento de la invención para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, la muestra que comprende células de mamífero puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de la misma, o una fracción de los lisados de células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteína completa o una fracción de ácido nucleico. Si la muestra comprende células completas, las células pueden ser cualquier célula del mamífero, por ejemplo, las células de cualquier órgano o tejido, incluyendo células sanguíneas o células endoteliales.

Para los fines del procedimiento de detección de la invención, la puesta en contacto se realiza in vitro.

Además, la detección del complejo puede tener lugar a través de varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células, o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).

En la técnica se conocen procedimientos para ensayar un CAR con respecto a su capacidad para reconocer células diana y a su especificidad antigénica. Por ejemplo, Clay y col., J. Immunol, 163: 507-513 (1999), enseñan procedimientos para medir la liberación de citocinas (por ejemplo, interferón-γ, factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos (GM-CSF), factor  de necrosis tumoral (TNF-) o interleucina 2 (IL-2)). Además, la función del CAR puede evaluarse midiendo la citotoxicidad celular, como se describe en Zhao y col., J. Immunol, 174: 44154423 (2005).

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero por supuesto no deben interpretarse, de ninguna manera, como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la síntesis de los CAR anti CD22, la transducción de PBMC con los CAR anti CD22 y el análisis de expresión en superficie del CAR en PBMC transducidas.

Utilizando algoritmos de optimización de codones (Mr. Gene GmBH, Regensburg, Alemania) se sintetizaron secuencias que codificaban al receptor de antígeno quimérico, CAR, y se subclonaron en vectores de "destino" como se describe en (Zhao y col., J. Immunol, 183 (9): 5563. -74 (2009)) que codificaban secuencias de segunda generación, versión 1 (dominios transmembrana CD28 y de señalización intracelular de linfocitos T y dominio de señalización intracelular de linfocitos T de cadena CD3-zeta); de segunda generación, versión 2 (dominio

transmembrana CD8 unido a dominios de señalización intracelular de linfocitos T CD137 y CD3-zeta); o de tercera generación (dominio transmembrana CD8 unido dominios de señalización intracelular de linfocitos T CD28, CD137 y CD3-zeta) como se muestra en la Tabla 1 anterior.

Se crearon sobrenadantes de vector retrovírico transfectando células 293GP con plásmidos que codificaban vectores retrovíricos CAR y la glicoproteína de envoltura RD114, recogiendo los sobrenadantes del cultivo (s/n) 4872 horas más tarde. Los sobrenadantes del cultivo se congelaron o se utilizaron inmediatamente para transducir PBMC humanas activadas con OKT3 e IL-2 utilizando el procedimiento "en placa" durante 2 días consecutivos (cultivo de linfocitos en placas recubiertas con RECTRONECTINA (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) previamente expuesta a diluciones del vector que contenía s/n, como se describió previamente en Y. Zhao y col., J. Immunol,

183: 5563 (2009). En este estudio también se utilizó s/n retrovírico que contenía un CAR específico de CD19 procedente de una línea celular productora permanente (Kochenderfer y col., Blood, 1 16: 4099 (2010)).

La expresión del CAR en linfocitos T transducidos se determinó por citometría de flujo. Para detectar los CAR que no codifican CH2CH3, los linfocitos T transducidas se incubaron con CD22-Fc (R & D Systems, Minneapolis, MN) seguido de FITC-F(ab') 2 específico del fragmento Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Para detectar células que expresan CAR en virtud del dominio CH2CH3, se utilizó anticuerpo de cabra contra IgG humana (H & L). El CAR HA22SH expresa una secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina en lugar de CH2CH3. El CAR específico de CD19 no contiene regiones Ig y se detectó utilizando Proteína L. La proteína L biotinilada (50 ng/ul, Thermo Scientific, Waltham, MA) se unió, las células se lavaron y después se detectaron con SA-FITC (4 ug/ml, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Se utilizaron dos diluciones de vector retrovírico que contenía sobrenadante (1: 4 y 1: 8). Para establecer una comparación, también se evaluó un vector CD19-CAR s/n. Los experimentos de citometría de flujo confirmaron la expresión del CAR de los CAR expuestos en la Tabla 1 en linfocitos T transducidos.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la expresión de los antígenos CD22 y CD19 en líneas celulares de leucemia.

Se evaluaron las líneas celulares de leucemia humana (REH, SEM, NALM-6, KOPN-8, Daudi, Raji y K562) para determinar el nivel de expresión de CD19 y CD22 en la superficie celular utilizando perlas QUANTI-BRITE PE (BD Biosciences) y anticuerpos anti CD19 y anti CD22 marcados con PE (Tabla 2). El "Número de receptor por célula" indica el número absoluto aproximado de moléculas por célula en cada una de las líneas celulares indicadas. Los datos se calcularon determinando los anticuerpos unidos por célula (ABC, antibodies bound per cell) utilizando las herramientas informáticas de análisis de datos CELLQUEST (BD) siguiendo las instrucciones del fabricante.

TABLA 2

Línea celular de leucemia: Número de receptor por célula

REH CD19: 15,100

SEM CD 19: 50,800

NALM-6 CD 19: 50,500

KOPN-8 CD 19: 60,800

Daudi CD 19: 15,000

Raji CD19: 50,000

K562 CD19: <100

REH CD22: 7,000

SEM CD22: 7,000

NALM-6 CD22: 8,000

KOPN-8 CD22: 15,300

Daudi CD22: 8,000

Raji CD22: 60,800

K562 CD22: <200

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra el efecto de los motivos de señalización y de CH2CH3 sobre la actividad del CAR in vitro.

Para determinar si las construcciones del CAR de segunda o tercera generación proporcionan aumento de la actividad lítica, líneas celulares de leucemia se marcaron con 51Cr y se utilizaron como dianas en ensayos CTL. Las células efectoras eran linfocitos T humanos transducidos con uno de los siguientes CAR: HA22 de segunda generación (SEQ ID NO: 15), HA22 de tercera generación (SEQ ID NO: 16), BL22 de segunda generación (SEQ ID NO: 19), BL22 de tercera generación (SEQ ID NO: 20), HA22-SH de segunda generación (SEQ ID NO: 17), HA22-SH de tercera generación (SEQ ID NO: 18), transducción simulada (no transducida) y CAR específico de CD19. Las células efectoras se cocultivaron con células diana a diversas proporciones entre efector con respecto a diana (E: D). Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 6A-6L. Como se muestra en las Figuras 1 y 6A-6H, los CAR de segunda generación demostraron una actividad lítica superior en comparación con los CAR de tercera generación. Además, como se muestra en las Figuras 6I-6L, la adición de un CH2CH3 de IgG1 no afecta a la función del CAR en ensayos realizados in vitro.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que para normalizar la eficacia de la transducción cuando se analizan diferentes construcciones de CAR, pueden utilizarse unidades líticas.

Para normalizar la eficacia de la transducción de cada CAR, los linfocitos T efectores se analizaron para determinar el porcentaje de expresión de CAR. La proporción entre E: D se corrigió después al número real de efectores por pocillo (es decir, la proporción entre E: T disminuyó de 10: 1 a 5: 1 si el porcentaje de transducción es de 50%). Posteriormente, se creó un gráfico de la proporción entre E: D corregida frente al porcentaje de lisis. Una unidad lítica se definió como el 30% de lisis de células diana a una proporción E: D de 10: 1. Esta definición de "unidades" funcional cuantifica la cantidad de actividad lítica en cada población de células efectoras transducidas que se está comparando. Las unidades líticas representan proporciones E: D normalizadas para las diferencias en la eficacia de transducción entre las construcciones. Las Figuras 8A-8D muestran la actividad lítica de los CAR: HA22 28z (SEQ ID NO: 15); HA22 28BBz (SEQ ID NO: 16); BL22 28z (SEQ ID NO: 19); BL22 28BBz (SEQ ID NO: 20); HASH22 28z (SEQ ID NO: 17); o HASH22 28BBz (SEQ ID NO: 18) con respecto a las líneas celulares REH, SEM, NALM-6 o KOPN-8.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la actividad lítica de los CAR22 anti CD22 basados en HA22 y BL22.

Para determinar si las diferencias en la afinidad por CD22 constituían una diferencia en la actividad lítica del CAR, se compararon los CAR que codificaban las secuencias de scFV de HA22 y BL22 en ensayos de CTL de liberación de 51Cr utilizando, como diana, las cuatro líneas celulares de leucemia descritas en el Ejemplo 2: KOPN8 (Figura 2A), NALM6 (Figura 2B), REH (Figura 3A) y SEM (Figura 3B). Se compararon tres construcciones diferentes de CAR anti CD22 de segunda generación, versión 1: HA22-CH2CH3 (SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3 (SEQ ID NO: 19) y HA22-SH (secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina) (SEQ ID NO: 17). El CAR anti CD19 muy activo se incluyó como control. Las proporciones entre E: D se normalizaron de acuerdo con el porcentaje de transducción de cada construcción CAR individual como se describe en el Ejemplo 4, y por lo tanto los valores líticos fueron directamente comparables. Como se muestra en la Figura 2A, la línea celular KOPN8 demostró claramente una diferencia en la actividad lítica basada en la afinidad por scFv. La actividad de BL22 fue significativamente más baja que la de HA22 (p <0,04) o HASH (p <0,005) cuando se compararon las proporciones entre E: D individuales mediante la prueba de la t de Student (bilateral, para datos independientes) en todas las proporciones 1:1 anteriores. Este ejemplo demostró que una alta afinidad por scFV produce una lisis celular más eficaz de la diana cuando se utiliza en construcciones CAR en algunas líneas celulares leucémicas, y que esta diferencia no parecía estar relacionada con el nivel de expresión de CD22 ,

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la actividad lítica de los CAR anti CD22 basados en HA22.

Durante dos días se activaron linfocitos T con OKT3 e IL-2, se transdujeron con un vector vacío (simulación) o con un vector retrovírico que expresaba las siguientes construcciones CAR: HA22 (segunda generación, versión 1) (SEC ID Nº: 15 ), HA22 (tercera generación) (SEQ ID NO: 16), CAR anti CD 19, HASH22 (segunda generación, versión 1, secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina) (SEQ ID NO: 17), o HASH22 (tercera generación, secuencia corta de dominio constante de inmunoglobulina) (SEQ ID NO: 18). Los linfocitos transducidos se analizaron posteriormente para determinar la capacidad de producir la lisis de las líneas celulares de leucemia, REH, SEM y NALM6 (Figura 4), que expresan CD22 (ensayo de liberación de 51Cr durante 8 horas). Estas tres líneas celulares también expresaron el antígeno CD19. La proporción entre las células efectoras con respecto a las células diana fue de 30: 1. La línea celular K562 se incluyó como un control de antígeno negativo. Como se muestra en la Figura 4, los CAR anti CD22 produjeron de manera eficaz la lisis de las líneas celulares de leucemia REH, SEM y NALM6.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra la actividad lítica de un CAR de segunda generación, versión 1, HASH22.

Para generar sobrenadante con vector retrovírico, se utilizaron secuencias de nucleótidos que codificaban el CAR de segunda generación HASH22 (SEQ ID NO: 17). Estos sobrenadantes se utilizaron para transducir linfocitos T humanos, y los linfocitos T transducidos se sometieron a ensayo con respecto a su capacidad para producir la lisis de líneas celulares portadoras del antígeno CD22.

Durante dos días, se activaron linfocitos T con OKT3 e IL-2, se transdujeron con el sobrenadante que contenía el vector CAR retrovírico y se analizaron posteriormente para determinar la capacidad de producir la lisis de las líneas celulares de leucemia REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji, que expresan CD22, y la línea celular K562 de control de CD22 negativo. Como control (simulación), los linfocitos T se activaron y se cultivaron de la misma manera, pero no se expusieron a sobrenadante retrovírico que contenía el vector CAR (no transducido).

Los resultados se muestran en las Figuras 5A y 5B. Se observó poca o ninguna lisis de las dianas tumorales en las células de control (Figura 5A). Se observó lisis de las líneas celulares REH, SEM y OPN8 para las células transducidas con CAR HASH22 (Figura 5B).

Ejemplo 8

Este ejemplo demuestra que las células transducidas con un CAR basado en HA22 retrasan el avance de la enfermedad y prolongan la duración de la supervivencia in vivo.

El día 0, ratones NSG (NOD scid gamma) inmunodeficientes recibieron una inyección de leucemia humana CD22 positiva, modificada por ingeniería genética para expresar luciferasa (0,5 x 106 NALM6-GL (NAML6 transfectado con luciferasa)). El día 3, los ratones se trataron con 1 x 107 linfocitos T de control ("simulación", no transducidos) o con 1 x 107 linfocitos T transducidos con CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 17), CAR HASH22 de tercera generación (SEQ ID NO: 18) o CAR HASH22 de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 32). La carga tumoral se midió durante un período de tiempo de 30 días con imágenes bioluminiscentes utilizando el instrumento Xenogen IVIS. Los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (ip) de 3 mg de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Inc.) y 4 minutos después de la inyección se obtuvieron imágenes de los ratones anestesiados con un tiempo de exposición de 30 segundos. Se utilizó el programa informático LIVING IMAGE para analizar las señales bioluminiscentes de cada ratón como fotones/s/cm2/sr. En la Figura 7A se muestra el gráfico de Kaplan-Meier.

Como se muestra en la Figura 7A, todos los ratones tuvieron enfermedad equivalente el Día 3. Los ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 17), CAR HASH22 de tercera generación (SEQ ID NO: 18) o CAR HASH22 de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 32) redujeron la carga tumoral en comparación con los ratones tratados con células de control.

Durante 30 días se midió la supervivencia de los ratones, se calcularon los datos estadísticos de supervivencia utilizando análisis de rango logarítmico (Mantel-Cox), y los resultados de supervivencia se muestran en la Figura 7B. Como se muestra en la Figura 7B, los ratones tratados con linfocitos T transducidos con CAR HASH22 de segunda generación, versión 1 (SEQ ID NO: 17), CAR HASH22 de tercera generación (SEQ ID NO: 18), o CAR HASH22 de segunda generación, versión 2 (SEQ ID NO: 32) demostraron un aumento en la supervivencia en comparación con los ratones tratados con células de control.

El uso de los términos "un", "uno(a)", "el" y “la” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que incluye tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o que claramente lo contradiga el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como expresiones abiertas (es decir, que significa "que incluye, pero no se limita a") a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores del presente documento, está simplemente destinada a servir como un procedimiento de abreviatura para referirse individualmente a cada valor distinto que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en este documento, y cada valor distinto se incorpora en la memoria descriptiva como si se enumerase individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en este documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en este documento o que claramente lo contradiga el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, pretende únicamente aclarar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

<120> RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS DIRIGOS ANTI CD22

<130> 711021

<150> US 61/549.516 <151>

5: <160> 39 <170> PatentIn versión 3.5

10: <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Sintética <400> 1

20 <210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Sintética

<400> 2

<210> 3

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 3

<210> 4

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 4

15 <210> 5

<211> 245

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 5

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 6

10

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 7

10

<210> 8

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 20

<400> 8

<210> 9

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 9

15 <210> 10

<211> 84

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 10

<210> 11

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 11

15 <210> 12

<211> 40

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 12

<210> 13

<211> 47 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 13

15 <210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 14

<210> 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 15

<210> 16

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 16

<210> 17

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 17

<210> 18

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 18

<210> 19

<211> 727 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 19

<210> 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 20

<210> 21

<211> 1515 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 21

<210> 22

<211> 1515 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 22

<210> 23

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 23

<210> 24

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 24

<210> 25

<211> 848

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 25

10

<210> 26 15 <211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 26 ccctcgagcc gccacc 16

25 <210> 27

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintética

<400> 27

gcggccgcaa ttgaa 15 35

<210> 28

<211> 18

<212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Sintética

<400> 28 gctgcggccg caattgaa: 18

10: <210> 29 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Sintética

20 25: <400> 29 taaggatccg ataaaataa 19 <210> 30 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

30: <400> 30 ctaaggatcc gataa 15

35: <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

40: <400> 31

<211>: 511 45 <212> PRT

<210> 32

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 50

<400> 32

<210> 33

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 33 <210> 34

<211> 42 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 34

15 <210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 35

<210> 36

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 36

15 <210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 37

<210> 38

<211> 864

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 38

<210> 39

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 15

<400> 39

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno de HA22, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T,

en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1,

en el que el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 3.
2.

El CAR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5.
3.

El CAR de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente una secuencia líder que comprende la SEQ ID NO: 7.
4.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente un dominio de inmunoglobulina.
5.

El CAR de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el dominio de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 8, 9 o 36.
6.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el dominio transmembrana comprende i) CD8 y o ii) CD28.
7.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el dominio transmembrana comprende a) una secuencia de aminoácidos CD8 que comprende la SEQ ID NO: 10 o 33 y/o b) una secuencia de aminoácidos CD28 que comprende la SEQ ID NO: 1 1.
8.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende uno o más de i) CD28, ii) CD137 y iii) CD3 zeta.
9.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una secuencia de aminoácidos CD28 que comprende la SEQ ID NO: 12.
10.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una secuencia de aminoácidos CD137 que comprende la SEQ ID NO: 13 o 34.
11.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T comprende una secuencia de aminoácidos CD3 zeta que comprende la SEQ ID NO: 14 o
35.
12.

El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 15-18 y 32.
13.

Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14.

El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22-23 y 38.
15.

El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 24-25 y 39.
16.

Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15.
17.

Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 16.
18.

Una población de células que comprende al menos una célula hospedadora de la reivindicación 17.
19.

Una composición farmacéutica que comprende el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 16, la célula hospedadora de la reivindicación 17, o la población de células de la reivindicación 18, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20.

Un procedimiento de detección de la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra que comprenda una o más células del mamífero con el CAR de una

cualquiera de las reivindicaciones 1-12, formando de ese modo un complejo, y

(b)

detectar el complejo, indicando la detección del complejo la presencia de cáncer en el mamífero.
21. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 16, la célula hospedadora de la reivindicación 17, la población de células de la reivindicación 18, o la composición farmacéutica de la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en un mamífero que expresa CD22.