CN109863399B - 计数存在于细胞组合物中的颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了评估或测定存在于细胞组合物中的颗粒(例如珠粒)的存在或不存在的方法。还提供了供该方法使用的制品和试剂盒。

Description

计数存在于细胞组合物中的颗粒的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年8月26日提交的标题为“计数存在于细胞组合物中的颗粒的方法”的美国临时专利申请62/380,241的优先权的权益，出于所有目的，其内容通过提述以其整体并入本文。

发明领域

本公开涉及评估或测定存在于细胞组合物中的颗粒(例如珠粒)的存在或不存在的方法。还提供了用于在该方法中使用的制品和试剂盒。

发明背景

颗粒(例如磁珠)用作固定亲和试剂(例如抗体)的表面。在一些情况下，这种亲和包被的颗粒可用于多种方法，例如用于细胞的检测、选择、富集、分离、激活和/或刺激。在一些情况下，亲和包被的颗粒在这些过程之后可保持与细胞结合。现有的用于检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法对于测定与细胞结合或相关联的颗粒的实际数量可能是不准确的。需要改进的用于计数或检测细胞组合物中的颗粒的方法。本文提供了满足这种需求的方法、组合物、系统和试剂盒。

发明内容

提供了用于评估或测定细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，例如包含抗体(如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)的珠粒。这类方法包括用于检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法和用于计数细胞组合物中颗粒的方法。本公开还提供了用于在该方法中使用的制品和试剂盒。

在一些实施方案中，本文提供了用于计数细胞组合物中颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中的一个或多个细胞渗透压裂解的条件下温育包含至少一部分细胞组合物的样品或来源于所述细胞组合物的样品，和b)测定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。在一些实施方案中，所述足以诱导渗透压裂解的条件包括使所述样品与低渗溶液接触。在一些实施方案中，在诱导渗透压裂解的条件下温育会产生裂解的细胞组合物，且步骤a)中的一次或多次温育进一步包括ii)使所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的组合物与高渗溶液温育。在一些实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育从所述输出组合物中减少或去除细胞碎片。在本文方法的一些实施方案中，步骤a)进一步包括冲洗或洗涤所述输出组合物。在一些另外的实施方案中，冲洗或洗涤所述输出组合物包括使所述颗粒沉淀，并去除一定体积的所述输出组合物或减少所述输出组合物的体积。在一些实施方案中，所述方法进一步包括减少所述输出组合物的体积至在步骤a)的一次或多次温育之前的所述样品的大约相同体积。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述输出组合物的体积减少小于100％但大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。

在一些实施方案中，本文提供用于计数细胞组合物中颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液或高渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物，和ii)使至少一部分所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与所述低渗溶液或所述高渗溶液中的另一个温育，和b)测定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育会从所述输出组合物中减少或去除细胞碎片。在本文方法的一些实施方案中，步骤a)进一步包括冲洗或洗涤所述输出组合物。在一些其他实施方案中，冲洗或洗涤所述输出组合物包括使所述颗粒沉淀并去除一定体积的所述输出组合物或减少所述输出组合物的体积。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述输出组合物的体积减少至在步骤a)的一次或多次温育之前的所述样品的大约相同体积。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述输出组合物的体积减少小于100％但大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。

在一些实施方案中，本文提供用于计数细胞组合物中颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中的一个或多个细胞裂解的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物，且ii)使至少一部分的所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与高渗溶液温育，且b)测定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育从所述输出组合物中减少或去除细胞碎片。在本文方法的一些实施方案中，步骤a)进一步包括冲洗或洗涤所述输出组合物。在一些其他实施方案中，冲洗或洗涤所述输出组合物包括使所述颗粒沉淀和去除一定体积的所述输出组合物或减少所述输出组合物的体积。在一些实施方案中，所述方法进一步包括减少所述输出组合物的体积至在步骤a)的一次或多次温育之前的所述样品的大约相同体积。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述输出组合物的体积减少小于100％但大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。

在一些实施方案中，本文还提供了计数细胞组合物中的颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括步骤下列步骤：a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件下温育包含至少一部分的细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品，其中所述颗粒在其表面包含包含生物分子(如多糖)的包衣，且所述裂解不破坏所述包衣；且b)使用与所述生物分子(如多糖)特异性结合的亲和试剂测定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。在一些实施方案中，所述一次或多次温育诱导所述样品中一个或多个细胞的渗透压细胞裂解。在一些实施方案中，所述一次或多次温育包括使所述样品与低渗溶液温育。在一些实施方案中，所述一次或多次温育进一步包括使所述样品与高渗溶液温育。在一些实施方案中，所述生物分子是葡聚糖，且所述亲和试剂是抗葡聚糖抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是第一抗体(如鼠抗体)，且所述亲和试剂是第二抗体(如抗鼠抗体)。在一些实施方案中，所述生物分子是链霉亲和素，且所述亲和试剂是生物素化的分子。在一些实施方案中，所述生物分子是链霉亲和素，且所述亲和试剂是抗链霉亲和素抗体。在一些实施方案中，步骤b)中的测定包括用于检测一个或多个包含所述包衣的颗粒的荧光激活细胞分选术(FACS)。

在本文提供的一些实施方案中，所述低渗溶液具有小于270mOsm/L的渗透压。在一些实施方案中，所述低渗溶液具有介于或介于约0mOsm/L和270mOsm/L之间、50mOsm/L和200mOsm/L之间或10mOsm/L和100mOsm/L之间的渗透压。在一些实施方案中，所述低渗溶液具有小于或小于约250mOsm/L、200mOsm/L、150mOsm/L、100mOsm/L、50mOsm/L、10mOsm/L或更低的渗透压。在一些实施方案中，所述低渗溶液包含介于或介于约0mM和140mM之间的溶质浓度。在一些实施方案中，所述低渗溶液包含小于或约小于140mM、小于或约小于100mM、小于或约小于50mM或小于或约小于10mM的溶质浓度。在一些实施方案中，所述低渗溶液包含介于或介于约0％和0.8％之间或0％和0.5％之间的溶质的重量对体积百分比(％w/v)。在一些实施方案中，所述低渗溶液包含小于或约小于0.8％、小于或约小于0.6％、小于或约小于0.4％或小于或约小于0.2％的溶质的％w/v。在一些实施方案中，所述低渗溶液是无溶质的。在一些实施方案中，所述低渗溶液是注射用无菌水。

在本文提供的一些实施方案中，所述高渗溶液具有大于300mOsm/L的渗透压。在一些实施方案中，所述高渗溶液具有大于或约300mOsm/L、大于或约400mOsm/L、大于或约800mOsm/L、大于或约1200mOsm/L、大于或约1500mOsm/L、大于或约2000mOsm/L、大于或约2500mOsm/L、大于或约3000mOsm/L或大于或约4000mOsm/L的渗透压。在一些实施方案中，所述高渗溶液具有介于或约介于300mOsm/L和5000mOsm/L之间、1000和5000mOsm/L之间或1000至3000mOsm/L之间的渗透压。在一些实施方案中，所述高渗溶液具有大于或约200mM、大于或大于约400mM、大于或大于约600mM、大于或大于约800mM、大于或大于约1000mM、大于或大于约2000mM；或大于或大于约5000mM的溶质浓度。在一些实施方案中，所述高渗溶液具有介于或介于约200mM和5000mM之间、500mM和2000mM之间或1000mM和2000mM之间的溶质浓度。在一些实施方案中，所述高渗溶液包含介于或介于约1.5％和15％之间或2.5％和12％之间的溶质的重量对体积百分比(％w/v)。在一些实施方案中，所述高渗溶液包含大于或约大于1.5％、大于或约大于3.0％、大于或约大于6.0％、或者大于或约大于8.0％、或者大于或约大于10.0％的溶质的％w/v。在一些实施方案中，所述高渗溶液包含溶质，所述溶质为NaCl。

在一些任何此类的实施方案中，所述低渗溶液和/或高渗溶液的体积为至少或至少约1mL、3mL、9mL、12mL、15mL、18mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL或更多。在一些任何此类的实施方案中，所述低渗溶液和/或高渗溶液的体积为或约为1mL至50mL、2mL至30mL、5mL至25mL、或10mL至20mL。

在一些任何此类的实施方案中，所述一次或多次温育持续至少或至少约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟或30分钟。在一些任何此类的实施方案中，所述一次或多次温育持续或持续约30秒至30分钟、1分钟至20分钟、1分钟至10分钟、或1分钟至5分钟。

在一些任何此类的实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育在约15℃至30℃、18℃至28℃或20℃至25℃的温度进行。在一些任何此类的实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育在23℃或约23℃的温度进行。在一些任何此类的实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育在24℃或约24℃的温度进行。在一些任何此类的实施方案中，步骤a)中的一次或多次温育在25℃或约25℃的温度进行。

在一些任何此类的实施方案中，步骤b)中的测定包括手动计数、电子颗粒计数、基于亲和力的检测、显微镜检查(如荧光显微镜)、流式细胞术或磁性细胞分选术。

在一些任何此类的实施方案中，步骤b)中的测定包括用于检测一个或多个包含包衣的颗粒的荧光激活细胞分选术(FACS)，其中所述包衣包含本文所述的材料，例如聚合物。在一些实施方案中，所述材料是多糖。在一些实施方案中，所述多糖是葡聚糖，且所述亲和试剂是抗葡聚糖抗体。在一些实施方案中，所述材料是第一抗体(如鼠抗体)，且所述亲和试剂是第二抗体(如抗鼠抗体)。在一些实施方案中，所述材料是链霉亲和素，且所述亲和试剂是生物素化的分子。在一些实施方案中，所述材料是链霉亲和素，且所述亲和试剂是抗链霉亲和素抗体。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物包含或被怀疑包含与所述细胞组合物中的一个或多个细胞的表面结合的一个或多个颗粒，所述细胞组合物包含或被怀疑包含残留的颗粒，所述细胞组合物源自含有与一个或多个所述颗粒结合的细胞的组合物，和/或所述细胞组合物源自从输入组合物的颗粒去除物。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物通过一种方法产生，所述方法包括：i)使细胞群与一个或多个所述颗粒混合从而产生输入组合物；和ii)从所述输入组合物中的细胞中去除一个或多个所述颗粒，从而产生所述细胞组合物。在一些实施方案中，所述一个或多个颗粒能够结合所述群中的一个或多个细胞。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物的浓度为至少或至少约2x 10⁵个细胞/mL、至少或至少约5x 10⁵个细胞/mL、至少或至少约1x 10⁶个细胞/mL、至少或至少约5x10⁶个细胞/mL或至少或至少约1x 10⁷个细胞/mL。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物的体积为或约为0.2mL至50mL、0.2mL至20mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、或0.75mL至1.5mL。在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物的体积为至少或至少约0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL或20mL、50mL或更大。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞具有介于或约介于10μm和30μm之间的直径。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞是动物细胞，或所述细胞组合物包含动物细胞。在一些任何此类的实施方案中，所述细胞是人细胞，或所述细胞组合物包含人细胞。在一些任何此类的实施方案中，所述细胞是干细胞，或所述细胞组合物包含干细胞。在一个另外的实施方案中，所述干细胞是诱导性多功能干细胞(iPSC)。在一些任何此类的实施方案中，所述细胞是免疫细胞，或所述细胞组合物包含免疫细胞。在一个另外的实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物已与一个或多个所述颗粒混合，其中所述颗粒包含刺激剂以在步骤a)中的一次或多次温育之前实现刺激和/或激活所述细胞组合物中的细胞。在一个进步的实施方案中，所述细胞是T细胞，且所述刺激剂是抗CD3抗体和/或抗CD28抗体、或其抗原结合片段。在另一个进一步的实施方案中，所述细胞是抗原递呈细胞，且所述刺激剂是抗CD80抗体和/或抗CD86抗体、或其抗原结合片段。

在一些任何此类的实施方案中，所述细胞组合物已与一个或多个所述颗粒混合，其中所述颗粒包含刺激剂以在步骤a)中的一次或多次温育之前实现分离或富集所述细胞组合物中的细胞。在进一步的实施方案中，所述亲和试剂包含与所述细胞组合物中的一个或多个细胞上的细胞表面蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中，所述细胞表面蛋白选自以下之中，但不限于以下：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(如Delta样1/4,锯齿状1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3。

在一些任何此类的实施方案中，一个或多个所述颗粒包含能够与所述细胞组合物中的细胞的表面上的大分子(如细胞表面蛋白)结合的生物分子(如亲和试剂和刺激剂)。在一些实施方案中，所述生物分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述生物分子是链霉亲和素。在一些任何此类的实施方案中，所述颗粒是珠粒。在具体的实施方案中，所述颗粒是包含抗体(如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)和/或包衣(例如本文所述的包衣)的珠粒。

在一些任何此类的实施方案中，一个或多个所述颗粒具有或包含具有大于0.001μm、大于0.01μm、大于0.1μm、大于1.0μm、大于10μm、大于50μm、大于100μm或大于1000μm的直径的颗粒。在一些任何此类的实施方案中，一个或多个所述颗粒具有或包含具有1.0μm至500μm、1.0μm至150μm、1.0μm至30μm、1.0μm至10μm或1.0μm至5.0μm的直径的颗粒。在一些实施方案中，一个或多个所述颗粒具有或包含具有与所述细胞组合物中的细胞的平均直径基本相同的直径的颗粒。在一些实施方案中，一个或多个所述颗粒具有或包含具有大于或小于所述细胞组合物中的细胞的平均直径的1.5倍以内的直径的颗粒。

在一些任何此类的实施方案中，一个或多个所述颗粒包含包衣。在一些实施方案中，所述包衣包含聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、碳或其组合。在一些实施方案中，所述聚合物、所述多糖、所述二氧化硅、所述脂肪酸、所述碳或其组合是可生物降解的。在一些实施方案中，所述多糖是壳聚糖、琼脂糖、淀粉、葡聚糖、葡聚糖衍生物或其组合。在一些实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇、聚(乳酸-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯和聚乙烯醇或其组合。在一些实施方案中，所述包衣在所述颗粒的表面上。

在一些任何此类的实施方案中，一个或多个所述颗粒是磁性的。在一些任何此类的实施方案中，一个或多个所述颗粒包含磁芯、顺磁芯或超顺磁芯。在一些进一步的实施方案中，所述磁芯选自金属氧化物、铁氧体、金属、赤铁矿、金属合金及其组合之中。在一些任何此类实施方案中，一个或多个所述颗粒包含铁氧化物芯。在一些实施方案中，所述磁芯包含褒义，诸如本文所述的包衣(如包含聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、碳或其组合的包衣)。在一些实施方案中，所述包衣防护、减少或防止磁芯氧化。在一些实施方案中，所述包衣在所述颗粒的表面上。

在一些任何此类的实施方案中，本文提供的方法不破坏所述颗粒表面上的包衣。

还提供了一种制品，其包括容器，所述容器包含用于实现渗透压细胞裂解的溶液(低渗溶液和/或高渗溶液)；包装材料；标签或包装插页，其包含用于计数细胞组合物中颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的说明。在一些实施方案中，实现渗透压裂解的溶液是低渗溶液，且所述制品任选地进一步包括包含高渗溶液的容器。在一些实施方案中，所述制品进一步包括用于检测或鉴定颗粒的仪器或试剂。在一些实施方案中，所述仪器或试剂包含血细胞计数器。在一些实施方案中，所述仪器或试剂包含对所述颗粒的表面上的生物分子(例如多糖(如葡聚糖)、抗体或可被所述亲和试剂结合的任何其他生物分子(如链霉亲和素))特异的亲和试剂。在一些实施方案中，所述亲和试剂为或包含抗体或抗原结合片段，例如抗葡聚糖抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述亲和试剂是荧光标记的。

应理解，本文所述的各种实施方案中的一个、一些或所有的特性可以组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员而言将变得明显。通过下面的详细描述进一步描述了本发明的这些和其它实施方案。

附图简述

图1A-1F是一系列直方图，其显示通过流式细胞术测定经过或未经漂白剂处理的样品中珠粒的数量。图1A)通过散射测定的未经漂白剂处理的样品中珠粒的数量；图1B)通过用荧光标记的抗葡聚糖抗体染色而测定的未经漂白剂处理的样品中的珠粒的数量；图1C)通过用荧光标记的抗IgG1和抗IgG2a抗体染色而测定的未经漂白剂处理的样品中珠粒的数量；图1D)通过散射测定的经漂白剂处理的样品中珠粒的数量；图1E)通过用荧光标记的抗葡聚糖抗体染色而测定的经漂白剂处理的样品中珠粒的数量；图1F)通过用荧光标记的抗IgG1和抗IgG2a抗体染色而测定的经漂白剂处理的样品中珠粒的数量。箭头指示珠粒。“SSC-A”和“FSC-A”分别指示侧向散射和前向散射参数。

图2是显示通过计数珠粒的方法在处理后计数的实际珠粒数与预期处理后计数的珠粒的数量比较的图。样品包含与250、500、1000或2000个珠粒混合的去珠的表达CAR的T细胞。通过血细胞计数器计数珠粒。

图3是显示计数的珠粒相对于样品中掺入的珠子的实际数量的百分比的图，所述样品含有在含有人血清白蛋白(HAS)的溶液中的仅增加载量的珠粒并经受细胞裂解方法(NaCl)。通过血细胞计数器或流式细胞术计数珠粒。

图4是显示计数的珠粒相对于样品中掺入的珠子的实际数量的百分比的图，所述样品含有与细胞混合的增加载量的珠粒并经受细胞裂解方法。通过血细胞计数器或流式细胞术计数珠粒。

发明详述

I.用于评估颗粒(如珠粒)的方法和试剂

本文提供了用于测定或评估细胞组合物样品中颗粒的存在或不存在(包括数量或浓度)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括温育含有或可能含有与所述细胞相关联的非细胞颗粒(下文称为“颗粒”，例如珠粒)的细胞组合物样品，其中所述一次或多次温育在足以诱导所述样品中的细胞裂解的一种或多种条件下进行。在一些实施方案中，所述样品包含至少一部分感兴趣的细胞组合物或源自感兴趣的细胞组合物的样品。在一些实施方案中，所述一次或多次温育产生输出组合物，然后测量或评估该输出组合物中颗粒(例如珠粒)的存在或不存在。因此，在所提供的方法中，评估输出组合物(例如，裂解方法后的样品)以测定取样的细胞组合物中颗粒的存在或不存在(例如数量或浓度)。在一些情况中，所提供的方法允许有效且可靠地检测来自细胞本身的颗粒(例如珠粒)，从而提高可视化、检测和/或鉴定样品中的颗粒(例如珠粒)的准确性和可靠性。在一些实施方案中，输出组合物中存在的颗粒的数量可使用用于可视化、检测和/或鉴定颗粒的多种方法中的任何一种来测定。

在一些实施方案中，颗粒(例如微球或珠粒)和细胞可表现出物理相似性，例如尺寸、形状和/或颜色的相似性。在一些情况中，由于所述颗粒(例如微球或珠粒)与细胞之间的物理相似性，可能难以评估包含与颗粒混合的细胞的细胞组合物中的颗粒含量。在一些方面中，为了检测或测定细胞组合物中颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度，必须实施方法以将样品中的细胞和需要计数的颗粒区分开。

在一些情况中，计数样品中颗粒(例如磁性珠粒)的一些方法包括在显微镜下可视化未裂解的细胞样品中的颗粒(例如珠粒)。这是可能的，因为颗粒的棕色或微红色或其他物理特征使颗粒与样品中的细胞区分开。当使用一些颗粒(例如本文所述的某些珠粒)时，这种可视化是不可能的，因为所述颗粒中的至少一些看起来与样品中的细胞基本相同，因此对颗粒计数是不可行的。此外，在浓缩的细胞/颗粒样品(例如本文提供的)中，细胞数量远大于颗粒数量，这进一步使得难以精确计数颗粒。

在一些情况中，可视化或检测颗粒的方法需要从样品中去除完整的细胞(例如裂解或损伤溶液中细胞的方法)，从而仅留下完整的颗粒以更容易地可视化样品中的单个颗粒。用于去除完整细胞的现有方法包括例如化学(例如去污剂或漂白剂)、热和物理裂解方法。例如，先前使用的裂解或细胞损伤的方法包括例如使用漂白剂或表面活性剂。在一些方面中，这些方法并不完全令人满意。

在一些情况中，使用用于细胞裂解的化学方法可损伤或破坏颗粒，或者在其他方面中，由于这种损伤而限制该技术可用于检测颗粒。例如，在一些方面中，这些方法可留下大量残留的细胞碎片，这些碎片会进一步损害测量细胞组合物中颗粒(例如微球或珠粒)的含量、存在、不存在、数量和/或浓度的能力。此外，由于细胞组合物中颗粒和细胞之间的大小相似，可能难以确定可视化的均匀圆形体是颗粒或是尚未被有效裂解的细胞。在一些情况中，某些细胞裂解技术可能不合适，因为它们可导致整个细胞裂解程序中的颗粒降解。此外，先前采用的方法的另一个问题是这些方法经常破裂或破坏颗粒(例如珠粒)的表面或包衣，例如颗粒表面上的包含多糖的包衣。在一些情况中，对颗粒包衣的损伤可改变可视化颗粒时所观察到的颜色，因此使得这种可视化具有挑战性。

本文发现，这些先前的方法不允许从包含细胞的样品中精确计数颗粒(例如珠粒)。在所提供的方法中，所述方法包括至少一个渗透压细胞裂解步骤(例如通过使用低渗溶液)以从所述样品中去除完整的细胞。在一些方面中，可进行一次或多次进一步的温育，其可包括进一步的裂解和/或冲洗(例如用高渗溶液)以去除细胞碎片，从而使任何剩余的细胞碎片与颗粒(例如珠粒)充分不同以允许准确可视化和计数颗粒。本发明公开的方法保护颗粒(例如珠粒)表面的完整性，使得颗粒与使用替代技术的定量相容。因此，例如，如果颗粒(例如珠粒)的表面是完整的，则可以使用光学显微镜、基于抗体的方法(例如FACS)或依赖于完整珠子表面的其他方法来可视化颗粒。

因此，本文提供了用于评估包含颗粒和细胞的混合物的细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法。这样的方法允许裂解细胞和去除所述样品中的细胞物质，同时在裂解过程中保持一致(consistent)的颗粒计数。经计数的颗粒不会被该方法损坏，例如，该方法不损伤具有包含多糖的包衣的颗粒。因此，通过所提供的方法获得的颗粒适用于测量以评估取样的细胞组合物中颗粒的不存在或存在。

在一些实施方案中，所提供的方法用于检测已知包含或可能包含一个或多个颗粒的样品中颗粒(例如珠粒)的存在或不存在。在一些实施方案中，所述样品包含至少一部分细胞组合物或源自细胞组合物。在所述方法的方面中，所述样品是含有多个细胞的样品，所述多个细胞与或可能与一个或多个颗粒(例如珠粒)相关联。在一些实施方案中，所提供的方法可用于计数样品中颗粒(例如珠粒)或测定样品中颗粒(例如珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。在一些实施方案中，所提供的方法提供优于现有方法(包括使用漂白剂或去垢剂的方法)的优点，因为所提供的方法使溶液中残留的细胞碎片最小化，最小化对颗粒(例如微球或珠粒)的损伤，例如最小化对所述颗粒表面上的包衣的损伤，和/或通常提高整个裂解过程中计数颗粒的一致性和/或精确度。

在一些实施方案中，所提供的方法包括在足以诱导样品中细胞裂解的一种或多种条件下温育或接触含有多个细胞的样品，并在已发生细胞裂解后测定的样品中颗粒(例如珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。在一些实施方案中，裂解是或包括渗透压裂解(如由于低渗溶液的存在)和/或质壁分离(plasmolysis)(如由于高渗溶液的存在)。通过本文所述方法裂解(例如通过一次或多次与高渗溶液和/或低渗溶液温育)后的样品也被称为“输出组合物”。作为非限制性实例，所述输出组合物可以是由一次或多次温育样品产生的裂解的细胞组合物，其中所述一次或多次温育样品是在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件下，从而产生所述输出组合物。作为另一非限制性实例，所述输出组合物可以是由一次或多次温育样品以产生裂解的组合物而产生的组合物，其中所述裂解的细胞组合物进一步进行一次或多次温育以减少或去除细胞碎片，从而产生所述输出组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种裂解和/或温育条件使得细胞碎片不会或基本上不会干扰或去除样品中完整颗粒的存在，因此通常，所述输出样品中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度与裂解前样品中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度相同或基本相同。

在一些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：a)进行一次或多次温育以产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导所述样品中一个或多个细胞裂解(如渗透压裂解和/或质壁分离)的条件下温育含有或可能含有颗粒的细胞组合物(如本文部分III中所述的细胞组合物)的样品，从而产生输出组合物；和b)测定输出组合物中颗粒(如珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。在一些实施方案中，所述一种或多种温育条件可包括使所述样品与低渗溶液和/或高渗溶液温育或接触。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)进行一次或多次温育以产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件(如一种或多种条件)下使含有或可能含有颗粒的细胞组合物(如本文部分III中所述的细胞组合物)的样品与低渗溶液或高渗溶液温育或接触，从而产生裂解的细胞组合物；ii)使至少一部分所述裂解的细胞组合物与所述低渗溶液或高渗溶液中的另一个温育或接触，从而产生所述输出组合物；和b)确定所述输出组合物中颗粒(珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。

在一些实施方案中，渗透压裂解(例如在低渗溶液存在下)可形成裂解的样品，所述裂解的样品包含细胞碎片和/或可以是粘性的(例如由于脂质、DNA和来自细胞的其他分子的释放)。因此，在一些实施方案中，使细胞与低渗溶液温育或接触后，所述方法通常包括至少一个进一步的步骤以便去除可影响检测所述颗粒(例如珠粒)的数量、存在或浓度的能力的细胞碎片或其他组分。在一些实施方案中，所述进一步的步骤可包括超声处理、冲洗或洗涤输出组合物(其可以是裂解的细胞组合物)、使裂解的细胞组合物与高渗溶液温育或进一步温育或其它方法以从所述输出组合物中减少、变少或去除细胞碎片。在一些实施方案中，所述方法是对颗粒(例如珠粒)不严酷(harsh)和/或不破坏这样的颗粒(例如珠粒)的包衣或表面的方法。

在一些实施方案中，所述方法通常包括在使样品与低渗溶液温育或接触从而产生裂解的组合物后，使该裂解的细胞组合物与高渗溶液进一步温育或接触以产生用于测量颗粒的输出组合物。通常，与低渗溶液温育或接触在与高渗溶液温育或接触之前进行。在一些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：a)进行一次或多次温育以产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中的一个或多个细胞裂解的条件(如一种或多种条件)下使含有或可能含有颗粒的细胞组合物(如本文部分III中所述的细胞组合物)的样品与低渗溶液温育或接触，从而产生裂解的细胞组合物；ii)使至少一部分的所述裂解的细胞组合物与高渗溶液温育或接触，从而产生所述输出组合物；和b)测定所述输出组合物中颗粒(例如珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。

在一些实施方案中，在测定或检测所述输出组合物中颗粒(例如珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度之前，所述方法可进一步包括用于去除或减少所述输出组合物中细胞碎片的一个或多个步骤，例如通过进行一个或多个洗涤或冲洗输出组合物的步骤。

在一些实施方案中，测定所述输出组合物中颗粒(例如珠粒)的数量可通过任何可以可视化、检测这些组合物和确定这些颗粒的存在、不存在、数量或浓度的方法进行。在一些实施方案中，这样的方法可包括显微镜检查(例如使用血细胞计数器)、流式细胞术和荧光激活细胞分选术(FACS)以及其他基于亲和力的方法和本领域技术人员已知的其它方法。示例性方法在以下描述。

在一些实施方案中，所提供的裂解方法对细胞具有选择性，因此不会对非细胞颗粒(例如微球或珠粒)造成不利的结构或物理损伤。在一些情况中，所提供的裂解方法基本上不破坏、损伤或改变颗粒(例如微球或珠粒)的表面包衣。因此，由于所述颗粒(例如微球或珠粒)的表面在裂解方法后保持相对完整，所以所提供的方法允许使用基于亲和力的试剂(例如抗体试剂或其它结合剂)检测或鉴定表面包衣。在一些实施方案中，通过基于亲和力的方法评估、检测或鉴定颗粒(例如珠粒)的能力可产生更可靠的结果，并且在一些情况中，与手动可视化方法相比(例如使用血球计数器)可在很短的时间内进行。

在一些实施方案中，所述方法在源自细胞组合物或包含至少一部分细胞组合物的细胞样品上进行。在一些实施方案中，所述细胞组合物是已经经过至少一个在至少一个颗粒(如珠粒)的存在下的处理步骤的细胞组合物，所述处理步骤产生或可能产生包含与至少一个颗粒(如珠粒)特异性相关联的至少一个细胞的组合物。在一些实施方案中，所述处理步骤是或包括富集、分离、选择、分离、刺激、激活和/或扩增细胞群或细胞样品中的至少一个细胞。

在一些实施方案中，所述细胞组合物是预期用于细胞治疗的细胞组合物，其中细胞治疗组合物含有或可能含有与细胞的组合物中的一个或多个细胞相关联的一个或多个颗粒(如珠粒)。例如，使用免疫细胞(例如T细胞)的过继性细胞疗法用于治疗癌症和其他疾病或病症。在某些情况中，用于过继性转移的免疫细胞(例如T细胞)获自血液或组织部位，并随后用重组受体工程化，所述重组受体在重新引入受试者之前结合至与疾病或病症相关的靶抗原。通常，这样的方法涉及使用各种类型的基于亲和力的颗粒试剂来选择、分离、激活和/或扩增细胞。例如，抗CD3(一种作为T细胞共受体以激活T细胞的多聚体蛋白质复合物)抗体的使用通常用于离体T细胞增殖方法，用于伴随着共刺激信号(例如通过使用抗CD28抗体)扩增T细胞。当抗CD3抗体和抗CD28抗体固定在表面时，它们同时传递增殖信号和共刺激信号，以便增强T细胞增殖。参见Li等(2010)J Transl Med.,8:104。

在部分III中描述了在颗粒(例如微球或珠粒)存在下处理细胞的示例性方法，其可以产生或可能产生与至少一个这样的颗粒相关联的细胞。对于某些方法，颗粒(例如磁性珠粒)用作用于固定亲和试剂(例如抗体)的表面，以用于各种方法，例如用于细胞的检测、选择、富集、分离、激活和/或刺激。例如，用这样的抗体包被的颗粒已被用作试剂以扩增功能性T细胞，所述功能性T细胞用于随后(例如通过输注)递送至受试者。用于T细胞激活和扩增的颗粒通常是均匀的圆形，且具有与细胞大约相同的大小。这些颗粒特征可能导致细胞过继疗法(例如T细胞过继疗法)的生产和安全性中的一些缺点。例如，由于颗粒和已与它们一起温育的细胞之间的大小相似，所以从包含细胞群和颗粒的细胞组合物中完全除去颗粒是重大挑战。在评估随后在细胞过继治疗期间用于个体施用的细胞组合物中遗留的刺激性颗粒的毒性作用的风险时，颗粒去除步骤后遗留在细胞组合物中的残留颗粒的实际数量是要考虑的重要因素。在一些实施方案中，从细胞中分离后去除颗粒(如珠粒，其包括磁珠)的过程可产生可含有残留颗粒的细胞组合物。例如，在一些情况中，其中磁珠用于细胞(例如T细胞)的选择、富集和/或激活，颗粒的去除通常需要使细胞/珠子溶液通过磁体。该过程可以大大减少与细胞(如T细胞)一起剩余的颗粒的数量，但可能不会完全消除颗粒。珠子的不完全去除会导致一些颗粒被输注入患者体内，这会导致毒性作用。因此，必须能够准确、可靠和/或有效地测定或评估意图用于细胞治疗的这种细胞组合物中存在的非细胞颗粒(例如珠粒)的存在或不存在。

在一些实施方案中，在测定所述样品中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度后，所述方法进一步包括计算或测定存在于细胞组合物中的细胞的数量。因此，在一些情况中，所述方法可提供关于所述样品获自或源自的较大细胞组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度的信息。在一些情况中，所述方法可用于测定或评估细胞组合物是否适合作为细胞疗法(例如与过继性细胞疗法方法相关的细胞疗法)用于使用。

在一些实施方案中，所提供的裂解方法导致高度一致和/或可重复地计数所述裂解方法后的样品中(例如输出组合物)的颗粒(例如微球或珠粒)。在一些实施方案中，所述裂解方法后的样品中(例如，在输出组合物中)的不具有降解或损伤的表面的完整颗粒(例如完整的微球或珠粒)的数量，与裂解前的样品中的颗粒总数和/或预期的颗粒数相比大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％，或是裂解前的样品中的颗粒总数和/或预期的颗粒数的大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。在一些实施方案中，所述裂解方法后的样品中(例如，在输出组合物中)的不具有降解或损伤的表面的完整颗粒(例如完整的微球或珠粒)的数量，与裂解前的样品中的颗粒总数和/或预期的颗粒数相比大于或大于约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，颗粒(如微球或微珠)的数量通常为或约为40％至100％，例如通常大于40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，与已知或可用于计数颗粒(例如微球或珠粒)的其他方法(例如涉及漂白剂或去垢剂的其他方法)相比，通过所提供的方法的样品中的颗粒(例如微球或珠粒)的可重复和/或一致的计数有所改善。在一些实施方案中，完整颗粒的数量和/或浓度比使用涉及漂白剂或去垢剂的方法评估样品中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度的方法至少高1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。

在一些实施方案中，借助改善的或更大地计数不具有降解或损坏表面的完整颗粒(例如完整的微球或珠粒)，所提供的方法与其他方法相比导致了检测或评估样品或细胞组合物中颗粒的改善或更高准确度。在一些实施方案中，因为本方法导致样品中基本上所有或所有细胞的裂解，并任选地去除残留的细胞碎片，所以细胞被计数或鉴定为颗粒时的假阳性的可能性减少或降低。在一些实施方案中，由于所述方法不损伤颗粒(如微球或珠粒)的表面，所以能够可靠地使用用于检测或鉴定颗粒的基于亲和力的方法，从而减少或最小化假阴性。

在一些实施方案中，检测或计数的精确度(例如，不存在假阳性或假阴性)通常为大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。在一些实施方案中，检测或计数的精确度(例如，不存在假阳性或假阴性)通常为大于或大于约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，检测或计数细胞样品或细胞组合物中的颗粒(如微球或珠粒)的精确度通常为或约为95％至100％，例如通常大于97％、98％或99％。在一些实施方案中，与其他已知的或可用于计数颗粒的方法(例如涉及漂白剂或去垢剂的其他方法)相比，通过所提供的方法检测或计数来自细胞样品或细胞组合物的颗粒的精确度有所提高(例如，提高了至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍)。

在一些实施方案中，所述方法可用于评估或测定细胞组合物中颗粒(如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度是否在可接受的水平或范围内，例如是否大于所需的阈值或预定值。例如，对于细胞样品或组合物的某些应用或用途，可能不希望在细胞组合物中存在大量颗粒(如微球或颗粒)。在一些情况中，即使在使用可生物降解的非细胞颗粒的情况下，也有必要监测或测定用于细胞治疗的用于施用所述细胞组合物至受试者来治疗疾病或病症的细胞组合物中这样的颗粒的范围、数量或存在。在一些方面，用于细胞治疗的细胞组合物含有每3x 10⁶个细胞不超过100个颗粒(如微球或珠粒)、每3x 10⁶个细胞不超过75个颗粒、或每3x 10⁶个细胞不超过50个颗粒。在一些方面，用于细胞治疗的细胞组合物通常含有每mL不超过250个颗粒、每mL不超过500个颗粒、每mL不超过1000个颗粒、每mL不超过2000个颗粒或每mL不超过2500个颗粒。

在一些实施方案中，如果所述方法测定颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度大于用于细胞组合物的特定应用的预定值或阈值，则所述细胞组合物可进一步被处理以去除或减少颗粒(例如微球或珠粒)的数量和/或不被释放或不被确认用于这类应用(例如细胞治疗)中。在一些实施方案中，如果所述方法测定非细胞颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度符合或低于用于特定应用的阈值或预定值，则所述细胞组合物可被释放或被确定用于这类应用(例如细胞治疗)中。在一些实施方案中，例如，当怀疑或已知在样品处理过程中丢失了一定量的颗粒时，可以设定阈值以说明已知或怀疑的珠粒损失。

II.一次或多次温育、细胞裂解和检测颗粒

本文提供的用于检测颗粒(例如珠粒)的存在、不存在、数量、量或浓度的方法包括裂解已知含有或可能含有一个或多个颗粒(例如珠粒)的样品中的细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述样品含有至少一部分的含有或可能含有颗粒(例如珠粒)的细胞组合物。在特定的实施方案中，本文提供的方法包含用于测定存在于细胞组合物中的颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度的一个或多个步骤，例如，通过测定含有至少一部分所述细胞组合物的样品中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度。在某些实施方案中，本文提供的方法包括裂解已知含有或可能含有一个或多个颗粒(如珠粒)的样品中的细胞和检测所述样品中颗粒的存在、不存在、数量、量或浓度的一个或多个步骤。

A.温育和细胞裂解

在一些实施方案中，将包含至少一部分的含有或可能含有颗粒的细胞组合物(例如本文部分III中所述的细胞组合物)的样品或源自这种细胞组合物的样品中的细胞混合、温育、接触或重悬以使所述细胞暴露于足以诱导所述样品中的细胞裂解的条件(如一种或多种条件)。在一些实施方案中，细胞样品作为细胞悬液提供，并且所述方法包括使该细胞悬液经受诱导细胞裂解的一种或多种条件。在一些实施方案中，所述裂解方法是保持颗粒完整的裂解方法，使得可以容易地鉴定、可视化和/或检测所述颗粒。在一些实施方案中，所述裂解方法不破坏所述颗粒的包衣或表面，这在一些情况中可有利于它们的检测。

在一些情况中，所述一种或多种条件诱导样品中细胞的渗透压裂解。在一些实施方案中，所述方法涉及在一种或多种产生细胞中渗透压变化的条件下，混合、温育、暴露、接触或重悬包含或可能包含一个或多个颗粒(如微球或珠粒)的细胞样品，这导致渗透压不平衡，所述不平衡导致水转移到细胞中，使得样品中的大量细胞裂解。可以使用各种已知技术来产生细胞中渗透压的变化。在所述方法的一些方面，提供细胞样品，并通过使细胞与低渗溶液混合、温育、暴露、接触或重悬以产生具有降低至小于细胞内部渗透压(例如一般降低至低于生理渗透压)的低渗细胞悬液，而诱导渗透压裂解。通常，细胞暴露的生理渗透压约为290mOsm/L至300mOsm/L。通常，细胞培养基和其他细胞缓冲液的渗透压被设计为维持在270mOsm/L和330mOsm/L之间的渗透压，例如以模拟血清的生理渗透压。因此，通过将细胞暴露于低渗溶液而引起的渗透压的变化，以及产生的在溶液中混合、接触或悬浮的细胞中渗透压的变化，可导致所述组合物中基本上所有细胞的裂解，同时保留颗粒(例如珠粒)完整。

在一些方面，如果细胞的总体积膨胀至原始体积的约150％，则细胞通常由于渗透压而裂解，尽管百分比可能随细胞类型和其他因素而稍微有所不同(Kinosita等,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.,74:1923-7)。在一些实施方案中，所述方法包括使样品(例如具有标准渗透压(如270mOsm/L-330mOsm/L)的细胞悬液)处于低渗溶液中，使得低渗细胞悬液的渗透压充分降低以使该悬液中细胞的总体积膨胀超过在标准生理渗透压条件下时的细胞体积的约150％。通常，可以根据经验确定实现所得低渗细胞悬液的渗透压降低的低渗溶液的具体渗透压，例如基于样品中的特定细胞类型或细胞类型、样品中细胞的密度、所得低渗细胞悬液的体积、温育时长、温育的温度和本领域技术人员已知的其他因素。在一些情况中，具有小的细胞核与细胞直径比的细胞可裂解时的渗透压远高于细胞核与细胞直径比更大的细胞的裂解渗透压(已公开的PCT申请号WO1999054439)。

在一些实施方案中，将低渗溶液加入到无溶液的细胞样品中，例如在将细胞离心成沉淀并弃去上清液后或收集在过滤膜上的细胞后获得的无溶液的细胞样品。或者，可将无溶液的细胞样品(或其部分)加入到低渗溶液中。在上述两种情况中，可将所述低渗溶液与细胞混合以产生低渗细胞悬液，其中细胞在低渗条件下是悬浮的。在一些实施方案中，将预定体积的低渗溶液添加到悬浮在标准生理渗透压溶液(例如标准细胞培养基或缓冲液)中的细胞以形成低渗细胞悬液。在这样的实施方案中，将预定体积的具有预定渗透压的低渗溶液被分配到细胞悬液中，例如与细胞悬液混合，(或者，等效地，可将细胞悬液分配或混合到低渗溶液中)，以产生与初始细胞悬液的渗透压相比渗透压降低的低渗细胞悬液。

在一些实施方案中，所述低渗溶液是可以与细胞或细胞悬液混合以影响细胞中渗透压变化的任何液体。在一些实施方案中，所述低渗溶液可包括但不限于含有在溶剂或溶剂混合物中的一种或多种溶质的溶液，溶剂通常为纯溶剂(例如蒸馏的去离子水)或基本上纯的溶剂的混合物，只要低渗溶液的渗透压不同于与其接触、混合或悬浮的细胞的渗透压。通常，所述低渗溶液是当与细胞或细胞悬浮液接触、混合或悬浮时，可形成具有低渗的溶液渗透压的细胞悬液的低渗溶液。

在一些实施方案中，所述低渗溶液是无溶质的。在一些实施方案中，所述低渗溶液可以是注射用无菌水，例如蒸馏/去离子水(DDI水)。

在一些实施方案中，所述低渗溶液存在溶质或可配制成存在溶质。在一些实施方案中，存在于所述低渗溶液中的溶质的浓度使得所述低渗溶液的渗透压或所得的低渗细胞悬液的渗透压低于生理渗透压，例如通常低于270mOsm/L。在一些情况中，可存在的一种或多种溶质包括可存在于标准试剂(例如标准细胞培养基或缓冲液)中的任何溶质。在一些实施方案中，低渗溶液中的溶质可包括盐，例如氯化钠(NaCl)、氯化铵、氯化钾、柠檬酸钠和糖(例如右旋糖、葡萄糖和蔗糖)。在一些实施方案中，溶质可以是提供于或存在于标准培养基中的溶质，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Iscove's改良的杜氏培养基(IMDM)和其他标准细胞培养基，其通常具有约300mOsm/L的标准生理渗透压。在一些实施方案中，可通过用溶剂稀释提供溶质的培养基或缓冲液(例如PBS或IMDM)来获得低渗溶液。在某些情况中，蒸馏/去离子水可用作用于这种稀释的溶剂。可根据需要调节低渗溶液的pH，通常调节至不损伤本文所述颗粒的pH。

在一些实施方案中，所述低渗溶液包含介于或介于约0mM和140mM之间的溶质浓度。在一些实施方案中，所述低渗溶液包含小于或约小于140mM、100mM、50mM或10mM的溶质浓度。

在本文的一些实施方案中，所述低渗溶液包含介于约0％和约0.8％之间或介于约0％和约0.5％之间的溶质的重量百分比(％w/v)。在一些实施方案中，低渗溶液包含小于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4％、小于约0.3％或小于约0.2％的溶质的重量百分比(％w/v)。

在一些所述的实施方案中，所述低渗溶液或所得的低渗细胞悬液具有介于约0mOsm/L和约270mOsm/L之间的渗透压，例如介于约0mOsm/L和200mOsm/L之间、0mOsm/L和140mOsm/L之间、0mOsm/L和100mOsm/L之间、10mOsm/L和200mOsm/L之间、10mOsm/L和140mOsm/L之间、10mOsm/L和100mOsm/L之间、50mOsm/L和200mOsm/L之间、50mOsm/L和140mOsm/L之间、50mOsm/L和100mOsm/L之间、100mOsm/L和200mOsm/L之间、100mOsm/L和140mOsm/L之间或140mOsm/L和200mOsm/L之间。在一些实施方案中，所述低渗溶液或所得的低渗细胞悬液具有小于约270mOsm/L、小于约250mOsm/L、小于约225mOsm/L、小于约200mOsm/L、小于约175mOsm/L、小于约150mOsm/L、小于约140mOsm/L、小于约125mOsm/L、小于约100mOsm/L、小于约75mOsm/L、小于约50mOsm/L、小于约25mOsm/L或小于约10mOsm/L的渗透压。

在一些实施方案中，由于渗透压裂解是由跨越细胞膜的溶质浓度差异驱动的，因此裂解程度可能与高渗条件下温育细胞的时间有关。在一些实施方案中，所提供的方法涉及一次或多次温育(例如，一次、两次、三次等温育)低渗细胞悬液持续足够的时间，其中基本上所有细胞被裂解，例如通常大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或至多100％的细胞被裂解。在一些实施方案中，在使细胞或细胞悬液与低渗溶液混合、合并或悬浮后，将所得的低渗细胞悬液温育或温育约30秒至5小时，例如30秒至30分钟、1分钟至20分钟、1分钟至10分钟、1分钟至5分钟、15分钟至3小时、15分钟至2小时、15分钟至1小时、15分钟至30分钟、30分钟至3小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、1小时至3小时、1小时至2小时或2小时至3小时。在一些实施方案中，在使所述细胞或细胞悬液与低渗溶液混合、合并或悬浮后，将所得的低渗细胞悬液温育至少或至少约30秒、至少或至少约1分钟、至少或至少约2分钟、至少或至少约3分钟、至少或至少约4分钟、至少或至少约5分钟、至少或至少约10分钟、至少或至少约15分钟、至少或至少约20分钟、至少或至少约30分钟、至少或至少约1小时、至少或至少约2小时或至少或至少约3小时。在一些实施方案中，在一次或多次温育期间，可将所述细胞混合或轻轻摇动，以使细胞保持悬浮或与所述低渗溶液混合。

在一些实施方案中，所述裂解(例如渗透压裂解)，例如在一次或多次温育低渗细胞悬液期间，在0℃至50℃或约0℃至50℃的温度进行。在一些实施方案中，细胞或细胞悬液或裂解的细胞组合物(例如，在低渗溶液和/或高渗溶液存在下预先裂解的)与低渗溶液的一次或多次温育在0℃至50℃或约0℃至50℃的温度进行。在一些实施方案中，所述温度可以为与冷藏温度(例如2℃至8℃)、环境温度(例如16℃至25℃)或生理温度(例如35℃至38℃)相关的特定范围或在该特定范围内。在一些实施方案中，所述温度为约15℃至约30℃、约18℃至约28℃、或约20℃至约25℃。在一些实施方案中，所述温度为至少或至少约或为或为约4℃±2℃、23℃±0.2℃、25℃±2℃或37℃±2℃。

在一些实施方案中，导致裂解的细胞膨胀可导致细胞的细胞内成分(例如DNA、细胞质)的释放，其可改变低渗细胞悬液的有效渗透压，特别是在温育的整个时长内。在一些情况中，如果细胞密度很高，则这些细胞内种类的释放可改变所述低渗细胞悬液的有效渗透压。在一些实施方案中，合并、混合或使用所述低渗溶液以重悬所述样品中的细胞，以形成低渗细胞悬液，其中细胞密度小于或小于约2x 10⁷个细胞/mL、小于或小于约1x 10⁷个细胞/mL、小于或小于约5x 10⁶个细胞/mL、小于或小于约1x 10⁶个细胞/mL、小于或小于约5x10⁵个细胞/mL、或小于或小于约1x 10⁵个细胞/mL。在一些实施方案中，所述低渗细胞悬液具有介于或介于约1x 10²个细胞/mL和2x 10⁷个细胞/mL之间的密度，例如1x 10⁴个细胞/mL至1x 10⁷个细胞/mL、1x 10⁴个细胞/mL至1x 10⁶个细胞/mL、或1x 10⁶个细胞/mL至2x 10⁷个细胞/mL。

在一些实施方案中，被温育的低渗细胞悬液的体积为1mL至1000mL，例如1mL至500mL、1mL至250mL、1mL至100mL、1mL至50mL、1mL至10mL、1mL至5mL、5mL至500mL、5mL至250mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至250mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至250mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至250mL或250mL至500mL。在一些实施方案中，所述低渗细胞悬液的体积为至少或约至少1mL、5mL、10mL、25mL、50mL、75mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL。在一些实施方案中，可根据需要调整试剂(如低渗溶液)的体积以根据需要优化细胞裂解。例如，当使用更多的细胞数量时，可相应地按比例放大试剂体积和总体积。

在一些实施方案中，此外或可替代地，诱导样品中细胞裂解的所述一种或多种条件包括诱导或导致所述样品中细胞的质壁分离的任何条件，和/或涉及使细胞或细胞悬液与高渗溶液混合、温育、暴露、接触或重悬。在一些实施方案中，高渗溶液可通过导致细胞因异常渗透而膨胀并对细胞内壁施加过大压力(然后细胞破裂并因此死亡)，而导致一个或多个细胞裂解(通过内部破裂而死亡)。在一些实施方案中，所述方法包括使样品(例如包含细胞悬液的样品)置于高渗溶液中，所述高渗溶液具有比在与高渗溶液温育或接触之前的细胞或细胞悬液的内部更大或更高的渗透压，从而导致细胞因异常渗透而膨胀，引起内部破裂。通常，可以根据经验确定实现所得的高渗细胞悬液的渗透压增加的高渗溶液的具体渗透压，例如基于在与高渗溶液接触或温育之前细胞或细胞悬液的渗透压(例如，如果细胞或者细胞悬液先前已与低渗溶液温育或接触)、样品中的特定细胞类型或细胞类型、样品中细胞的密度、所得高渗细胞悬液的体积、温育时长、温育温度和技术人员已知的其它因素。

在一些实施方案中，诱导细胞裂解的一次或多次温育(例如通过与低渗溶液温育)产生裂解的细胞组合物，其可以直接被评估作为输出组合物用于测量、测定或评估所述样品中颗粒的存在、不存在、数量或浓度。在其他实施方案中，在获得用于测量、测定或评估样品中颗粒的存在、不存在、数量或浓度的得到的输出组合物之前，通过一次或多次额外的温育、冲洗和/或洗涤进一步处理所述裂解的细胞组合物。例如，在一些情况中，将细胞样品与低渗溶液温育可导致低渗裂解，其可产生细胞碎片，该细胞碎片可干扰测定裂解的细胞组合物中颗粒的存在或数量。在一些实施方案中，低渗裂解后，所述方法可进一步包括在测定存在于裂解的样品中的颗粒(例如珠粒或微球)的存在、不存在、数量和/或浓度之前，减少、降低或去除所述低渗裂解的细胞组合物中的细胞碎片。

在一些实施方案中，在所提供的方法的背景下，可采用与高渗溶液温育，以减少、降低或去除本文所述的裂解的细胞组合物中的细胞碎片。在一些实施方案中，减少或去除裂解的细胞组合物中的细胞碎片可包括：i)在高渗溶液存在下接触或温育所述裂解的细胞组合物(例如低渗裂解的细胞组合物)，从而产生输出组合物；且ii)冲洗或洗涤所述输出组合物，其中细胞碎片被减少或去除。在一些实施方案中，本文提供了检测细胞组合物的样品中颗粒(例如珠粒或微球)的存在或不存在的方法，例如以计数所述细胞组合物中的颗粒，所述方法包括：i)使样品与低渗溶液温育或接触，从而产生裂解的细胞组合物(或低渗裂解的细胞组合物)；ii)使所述裂解的细胞组合物与高渗溶液温育或接触，从而产生输出组合物；iii)任选地冲洗或洗涤所述输出组合物；并测定所述输出组合物或所述经洗涤/冲洗的输出组合物中颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。

在一些实施方案中，将高渗溶液添加到无溶液的细胞样品中，例如在将细胞离心称沉淀并弃去上清液后或收集在过滤膜上的细胞后获得的样品。可替换地，可将无溶液的细胞样品(或其部分)添加至高渗溶液中。在上述两种情况中，可将所述高渗溶液与细胞混合以产生高渗细胞悬液，其中在高渗条件下使所述细胞悬浮。在一些实施方案中，所述高渗细胞悬液是通过向具有较低渗透压的细胞悬液中加入预定体积的高渗溶液形成的，所述具有较低渗透压的细胞悬液例如悬浮在标准生理渗透压溶液(例如标准细胞培养基或缓冲液)中的细胞或悬浮在低渗溶液中的细胞(例如低渗裂解的细胞组合物)。在这样的实施方案中，将预定体积的具有预定渗透压的高渗溶液分配(例如混合)到所述细胞悬液中(或者，等效地，可将所述细胞悬液分配或混合到所述高渗溶液中)，以形成与添加所述高渗溶液之前的初始细胞悬液的渗透压相比渗透压增加或更大的高渗细胞悬液。

在一些实施方案中，高渗溶液的渗透压大于细胞的生理渗透压，例如通常大于或大于约300mOsm/L。在一些实施方案中，所述高渗溶液可以是与细胞内部相比具有更高溶质浓度的任何溶液。在一些实施方案中，高渗溶液具有适当的溶质浓度，该溶质浓度可有效地减少或去除裂解的细胞组合物中的细胞碎片。

在一些实施方案中，用于在高渗溶液中使用的溶质包括但不限于盐(例如氯化钠(NaCl)、氯化铵、氯化钾、柠檬酸钠)和糖(例如右旋糖、葡萄糖和蔗糖)。在一些实施方案中，用于在本文所述方法中使用的高渗溶液可包含氯化钠、氯化铵、氯化钾或柠檬酸钠中的一个或多个。在一些实施方案中，所述高渗溶液包含氯化钠。在一些实施方案中，所述高渗溶液包含蔗糖。高渗溶液可包含其他试剂，例如但不限于缓冲剂(例如HEPES)和蛋白酶抑制剂。可根据需要调节高渗溶液的pH，优选调节至不损伤本文所述的非细胞颗粒(例如微球或珠粒)的pH。

在一些实施方案中，所述高渗溶液包含介于约1.5％和约15％之间或介于约2.5％和约12％之间的溶质的重量百分比(％w/v)。在一些实施方案中，所述高渗溶液包含大于约1.5％、大于约2.5％、大于约3.0％、大于约3.5％、大于约4.0％、大于约4.5％、大于约5.0％、大于约5.5％、大于约6.0％、大于约6.5％、大于约7.0％、大于约7.5％、大于约8.0％、大于约8.5％、大于约9.0％或大于约9.5％但不超过约10.0％的溶质的重量百分比(％w/v)。

在一些实施方案中，所述高渗溶液具有介于约300mOsm/L和约5000mOsm/L之间、介于约300mOsm/L和约4000mOsm/L之间、介于约300mOsm/L和约3000mOsm/L之间、介于约300mOsm/L和约2000mOsm/L、介于约300mOsm/L和约1000mOsm/L、介于约1000mOsm/L和约5000mOsm/L、介于约1500mOsm/L和约5000mOsm/L之间、介于约2000mOsm/L和约5000mOsm/L、介于约2500mOsm/L和约5000mOsm/L之间、介于约3000mOsm/L和约5000mOsm/L之间、介于约3500mOsm/L和约5000mOsm/L之间、介于约4000mOsm/L和约5000mOsm/L之间、介于约1000mOsm/L和约3000mOsm/L之间或介于约1000mOsm/L和约2000mOsm/L之间、或介于约1800mM和约2000mM之间的渗透压。

在一些实施方案中，所述高渗溶液具有大于约300mOsm/L、大于约400mOsm/L、大于约500mOsm/L、大于约600mOsm/L、大于约700mOsm/L、大于约800mOsm/L、大于约900mOsm/L、大于约1000mOsm/L、大于约1200mOsm/L、大于约1400mOsm/L、大于约1500mOsm/L、大于约1600mOsm/L、大于约1800mOsm/L、大于约2000mOsm/L、大于约2500mOsm/L、大于约3000mOsm/L、或大于约4000mOsm/L的渗透压。

在一些实施方案中，在使所述细胞或细胞悬液或裂解的细胞组合物(例如先前在低渗溶液存在下裂解的细胞组合物)与高渗溶液混合、合并或悬浮后，将所得到的高渗细胞悬液组合物温育30秒至5小时或约30秒至5小时，例如30秒至30分钟、1分钟至20分钟、1分钟至10分钟、1分钟至5分钟、15分钟至3小时、15分钟至2小时、15分钟至1小时、15分钟至30分钟、30分钟至3小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、1小时至3小时、1小时至2小时或2小时至3小时。在一些实施方案中，在使所述细胞或细胞悬浮液或裂解的组合物(例如先前在低渗溶液存在下裂解的细胞组合物)与高渗溶液混合、合并或悬浮后，将所得到的高渗细胞悬浮液组合物温育至少或至少约30秒、至少或至少约1分钟、至少或至少约2分钟、至少或至少约3分钟、至少或至少约4分钟、至少或至少约5分钟、至少或至少约10分钟、至少或至少约15分钟、至少或至少约20分钟、至少或至少约30分钟、至少或至少约1小时、至少或至少约2小时或至少或至少约3小时。在一些实施方案中，在温育期间，可将所述细胞混合或轻轻摇动，以使所述细胞保持悬浮或与高渗溶液混合。

在一些实施方案中，使细胞或细胞悬浮液或裂解的细胞组合物(例如先前在低渗溶液存在下裂解的细胞组合物)与高渗细胞溶液接触或温育在0℃至50℃或约0℃至50℃的温度进行。在一些实施方案中，所述温度可以为与冷藏温度(例如2℃至8℃)、环境温度(例如16℃至25℃)或生理温度(例如35℃至38℃)相关的特定范围或在该特定范围内。在一些实施方案中，所述温度为约15℃至约30℃、约18℃至约28℃或约20℃至约25℃。在一些实施方案中，所述温度为至少或至少约或为或为约4℃±2℃、23℃±0.2℃、25℃±2℃或37℃±2℃。

在一些实施方案中，可根据需要选择或调节所述高渗溶液的体积，以优化细胞裂解和/或从本文所述的裂解的细胞组合物中去除细胞碎片。例如，当使用更高的细胞数时，可相应地按比例扩大试剂体积和总体积。在一些实施方案中，被温育的高渗细胞悬液的体积为1mL至1000mL，例如1mL至500mL、1mL至250mL、1mL至100mL、1mL至50mL、1mL至10mL、1mL至5mL、5mL至500mL、5mL至250mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至250mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至250mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至250mL、或250mL至500mL。在一些实施方案中，所述高渗细胞悬液的体积为至少或约至少1mL、5mL、10mL、25mL、50mL、75mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL。

在本文的一些实施方案中，在进行所述裂解(例如低渗和/或高渗裂解)后，处理输出组合物以洗涤、冲洗颗粒(例如微球或珠粒)和/或从可能存在于细胞组合物中的其他材料或碎片中分离颗粒(例如微球或珠粒)。在一些实施方案中，在进行所述裂解(例如低渗和/或高渗裂解)后，处理所述输出组合物以使所述输出组合物中的任何颗粒(例如微球或珠粒)(如果存在的话)沉淀。用于使组合物中颗粒沉淀的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，可以在离心机中以足以沉淀任何颗粒(如果存在的话)的离心速度旋转输出组合物。在一些实施方案中，离心速度足以使所述颗粒(例如微球或珠粒)沉淀而不损伤这类颗粒。在一些实施方案中，可考虑离心机的模型和/或离心机转子半径以调节离心速度。在一些实施方案中，离心的速度为200x g至1000x g或约200x g至1000x g，例如通常为至少或约至少400x g、450x g、500x g或600x g。离心可以进行足以沉淀所述颗粒的时间。在一些实施方案中，离心所述输出组合物1分钟至60分钟，例如通常为1分钟至30分钟、1分钟至15分钟、或1分钟至5分钟，例如，至少或至少约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟或30分钟。

在一些实施方案中，沉淀后，可根据需要调整所述输出组合物的体积，例如通过完全或部分地去除上清溶液。在一些实施方案中，沉淀后，可将所有或基本上所有的上清液去除，并用新鲜的缓冲液或培养基替换至所需的体积。通常，所述缓冲液或培养基可以是与颗粒相兼容和/或不干扰后续的颗粒的可视化或检测的任何缓冲液或培养基。在其他实施方案中，沉淀后，在测定颗粒(例如微球或珠粒)的存在或数量之前，可将所述输出组合物的体积减少至所需的体积(例如，通过去除经离心的输出组合物中的一定体积的上清液或减少体积或总的离心的输出组合物)。在一些实施方案中，与沉淀(例如离心)前的输出组合物的体积相比，输出组合物的体积可减少小于约100％但大于约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。

在一些实施方案中，在测定颗粒(例如珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度之前，替换、减少或去除来自输出组合物的上清液可实现对输出组合物的冲洗或洗涤的效果。在一些实施方案中，在测定颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度之前，替换、减少或去除来自输出组合物的上清液可实现对输出组合物的浓缩或稀释(视情况而定)的效果。在一些实施方案中，沉淀(例如通过离心)和替换、洗涤或去除输出组合物的上清液的步骤可重复多次。

在一些实施方案中，在替换、减少或去除上清液后，所述输出组合物的总体积是允许检测所述样品(例如，不太浓缩的样品)中颗粒的体积。在一些实施方案中，所需体积与所述方法的一次或多次温育之前的样品的体积大致相同或相同。在一些实施方案中，所述体积为或约为0.25mL至50mL，例如为或约为0.5mL至50mL、0.5mL至25mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、0.5mL至1mL、1mL至50mL、1mL至25mL、1mL至10mL、1mL至5mL、5mL至50mL、5mL至25mL、5mL至10mL、10mL至50mL、10mL至25mL或25mL至50mL。在一些实施方案中，所述体积为至少或至少约0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL或50mL。

B.计数颗粒的方法

在一些实施方案中，测定存在于输出组合物中的颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。可使用本领域公知的技术进行用于测定输出组合物(例如，在已实施所述裂解方法后的样品)中颗粒的存在(例如浓度或数量)和/或检测输出组合物中的颗粒的方法。在一些实施方案中，用于测定输出组合物中颗粒(例如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度的方法可包括手动计数、电子计数、显微镜检查(如荧光显微镜检查)、基于亲和力的检测或分选术(例如磁珠分选)。用于在这样的方法中使用的技术包括但不限于流式细胞术(例如荧光激活细胞分选术(FACS))、分光光度法、显微镜检查(例如，亮视野显微镜检查(如使用血细胞计数器)、相差显微镜检查、荧光显微镜检查和电子显微镜检查)以及生物传感器阵列。参见Giouroudi等,Int J Mol Sci.,2013,14(9):18535-18556。

在一些实施方案中，所述技术可以是手动的或自动化的。

在一些情况中，使用这样的技术可获得颗粒计数(例如，珠子计数)，且颗粒计数可重复。在重复颗粒计数之后，可对所获得的颗粒计数进行平均，并且可以确定标准偏差。

在一些实施方案中，在本文所述的方法的步骤b)中测定颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度之前，可通过一个或多个处理步骤制备输出组合物，例如本文所述方法的步骤a)中产生的输出组合物。在一些情况中，所述输出组合物的一个或多个处理步骤包括分离、离心、洗涤和/或温育。

在一些实施方案中，将所述输出组合物与检测颗粒的试剂一起温育。在一些实施方案中，在本文所述方法的步骤b)中，基于亲和力的方法或技术可用于检测和/或计数颗粒。在一些方面，所提供的方法不改变或基本上不改变与所述颗粒附接、存在于所述颗粒或以其他方式与所述颗粒相关联的任何材料、部分或分子，从而允许使用特异性结合或识别这类材料、部分或分子的结合剂(如抗体、配体或其他结合分子)直接或间接检测这类材料、部分或分子。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。例如，所述结合剂可以是识别所述颗粒上的材料(例如颗粒包衣上的多糖(葡聚糖、氨基葡聚糖等)、附接至颗粒的生物分子(如抗体)或存在所述颗粒上和/或与所述颗粒相关联的其他材料或部分)的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，输出组合物中颗粒上或与颗粒相关联的材料和/或附接至输出组合物中颗粒的生物分子的结合剂的平均检测程度或水平为参考组合物中通过所述结合剂检测相同材料或生物分子的平均程度或水平的至少或约至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多，所述参考组合物包含基本上相同或相同的颗粒，但未暴露于或经受根据所提供的方法的一次或多次温育。在一些实施方案中，通过在颗粒上或与颗粒相关联的材料和/或与输出组合物中的颗粒中的颗粒附接的生物分子的结合剂检测的平均程度或水平约为或至少约为参考组合物中通过所述结合剂检测相同材料或生物分子的平均程度或水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍，所述参考组合物包含基本上相同或相同的颗粒，但该颗粒已经漂白剂处理而非按照所提供的方法进行一次或多次温育。

在一些实施方案中，所述结合剂结合颗粒上(例如颗粒上的包衣上)的聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸和/或碳。在一些实施方案中，所述结合剂可以是与颗粒包衣上存在的多糖结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述多糖可以是葡聚糖或氨基葡聚糖，且所述结合剂可以是抗葡聚糖抗体或抗氨基葡聚糖抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述结合剂与缀合、连接和/或偶联至所述颗粒的生物分子结合，例如与缀合、连接和/或偶联至所述颗粒包衣的生物分子结合。在一些实施方案中，所述生物分子是核酸(DNA)、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、抗原或本文所述的任何其他生物分子。

在一些实施方案中，所述结合剂可以是检测附接至所述颗粒的生物分子的结合剂。在一些实施方案中，所述生物分子是抗体(例如抗CD3和/或抗CD28抗体或本文所述的或本领域已知的其他抗体)。在一些实施方案中，用于检测生物分子(如抗体)的结合剂是针对颗粒表面上的抗体的抗独特型抗体。在一些实施方案中，用于检测所述生物分子(如抗体)的结合剂是针对该抗体的重链或轻链的一个类、亚类、型或亚型的抗同种型抗体。在一些实施方案中，所述结合剂是识别或特异性结合IgG类(例如针对IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)的抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是抗体，所述抗体是小鼠、兔、大鼠、山羊、绵羊、驴或人抗体的抗体，且所述结合剂识别这样的物种(例如，所述生物分子是小鼠抗体，且所述亲和试剂是抗小鼠IgG1、抗小鼠IgG2a等)。

在一些实施方案中，可以用例如荧光染料、荧光蛋白、金颗粒、银颗粒、与输出组合物中的颗粒相比具有不同散射光谱的颗粒、多肽(例如，FLAG^TM标签、人流感血凝素(HA)标签等)、酶、链霉亲和素、生物素、化学发光底物和本领域公知的用于可视化或检测与其靶标结合的亲和试剂的其他标签来标记所述结合剂。

在一些实施方案中，提供了计数或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，其中所述方法包括下列步骤：a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括i)在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件下温育包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品，其中所述颗粒包含包衣和/或附接至所述包衣或颗粒的一种或多种生物分子，且b)使用与颗粒表面上的材料和/或附接至颗粒的生物分子特异性结合的结合剂来测定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/浓度，从而计数所述细胞组合物中颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述颗粒包含含有葡聚糖的包衣，且所述结合剂是抗葡聚糖抗体。在一些实施方案中，所述颗粒包含含有抗体(如鼠抗体)的包衣，且所述结合剂是抗体(如抗鼠抗体)。在一些实施方案中，所述颗粒包含含有链霉亲和素的包衣，且所述结合剂是抗链霉亲和素抗体或生物素化分子。

作为一个或多个处理步骤的实例，所述输出组合物可包含颗粒，其中一个或多个颗粒进一步包含含有多糖(如葡聚糖)的包衣和/或一个或多个针对细胞表面蛋白的抗体生物分子(如抗CD3、抗CD28或其他抗体生物分子)。在一些实施方案中，洗涤和/或离心所述输出组合物以去除或减少细胞碎片。随后在足以允许所述结合剂结合所述多糖或生物分子的条件下，可将所述输出组合物与识别多糖(如葡聚糖)的结合剂(如荧光标记的抗葡聚糖抗体)和/或识别抗体生物分子(如抗CD3或抗CD28)的结合剂(如荧光标记的抗同种型抗体)温育。所述输出组合物可与封闭溶液(例如包含蛋白质(如人血清白蛋白)的溶液)温育。在一些情况中，所述封闭溶液帮助防止结合剂与细胞组合物的其他组分非特异性结合。在一些实施方案中，所述输出组合物在与结合剂温育之前、同时或之后，可与所述封闭溶液温育。可进一步洗涤和/或离心所述输出组合物以去除过量的结合剂和/或与颗粒上的多糖或生物分子非特异性结合的结合剂。

在一些实施方案中，所述结合剂允许通过基于亲和力的方法或技术(例如Western印记、流式细胞术(如FACS)或显微镜检查(如荧光显微镜检查))检测颗粒的不存在或存在。在一些实施方案中，所述结合剂允许通过基于亲和力的方法或技术(例如Western印记、流式细胞术(FACS)或显微镜检查(如荧光显微镜检查))计数或测定颗粒的数量和/或浓度。

在一些实施方案中，本文提供的方法涉及通过使用流式细胞术装置(如BeckmanCoulter Z2库尔特计数器,Beckman Coulter有限公司)的荧光激活细胞分选术(FACS)计数颗粒(如珠粒)来测定输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度。在本文的一些实施方案中，FACS允许通过检测存在于颗粒表面上的材料或分子(例如多糖(如葡聚糖)或生物分子)来检测颗粒。在一些实施方案中，基于FACS的方法包含以下步骤：在可测定颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度之前，制备用于通过流式细胞术检测的输出组合物。例如，可将输出组合物与特异性针对颗粒表面上存在的一个或多个标记物(如葡聚糖)的荧光标记的结合剂温育，然后可使用流式细胞分析仪分析所述样品。在流式细胞术中，在流体流中携带由荧光标记的亲和试剂结合的细胞和/或颗粒，并基于大小和/或荧光信号将其分离，随后使用FACS软件程序(例如，FlowJo软件)分析和计数。可通过检测荧光信号来测定颗粒的数量或近似数量，所述荧光信号可任选地由FACS软件程序测定或处理，以提供所述输出组合物中颗粒的总数或近似数量。

在一些实施方案中，可使用用于测定或评估样品中颗粒的不基于亲和力的方法。在一些实施方案中，本文提供的方法涉及通过使用自动细胞计数器(如TC10自动细胞计数器，Bio-Rad Laboratories有限公司)检测颗粒来测定输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度。这种方法可进一步包括以下步骤：在可以确定颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度之前制备用于通过自动细胞计数器检测的输出组合物。

在一些实施方案中，本文提供的方法涉及通过使用(例如安装到显微镜(如Olympus IX70倒置显微镜))的血细胞计数器(如HausserNageotte Bright-Line^TM血细胞计数器，Fischer Scientific)检测颗粒来测定输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/浓度。在一些实施方案中，这种方法可进一步包括以下步骤：在可以确定颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度之前制备用于检测的输出组合物。在一些实施方案中，可视化和/或计数存在于血细胞计数器视场的栅格或区域中的颗粒，在一些情况中，其可以手动进行。例如，示例性血细胞计数器是HausserNageotte Bright-LineTM血细胞计数器，其含有大约40个矩形并且容纳大约总共50μL或总共约50μL的液体。可以计数在血细胞计数器栅格的颗粒以获得颗粒(包括接触矩形线的颗粒)计数，所述颗粒在40个矩形中被可视化。

在一些实施方案中，可从相同样品(例如输出组合物)的等分试样体积重复多次计数，例如两次、三次、四次、五次或更多次，且可以对多次计数进行平均，且可以确定标准偏差。在一些实施方案中，每μL输出组合物的颗粒数可通过将平均颗粒数除以加入血细胞计数器的样品总体积(例如50μL)来计算。在一些实施方案中，每份细胞组合物的总颗粒(例如珠粒)的平均值、标准偏差和变异系数(100x(标准偏差/平均值))可以从至少三个重复样品计算。在一些实施方案中，每μL输出组合物的颗粒数可如实施例1所述的计算。

在一些实施方案中，从所述输出组合物中确定的颗粒的数量或浓度，所述方法进一步包括计算裂解前的样品所源自或获自的细胞组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度。在一些实施方案中，为了计算样品所源自或获自的细胞组合物中的总颗粒(例如珠粒)数，可以使被测定存在于输出组合物中的颗粒浓度(例如，每μL的颗粒数)乘以在进行裂解方法之前的样品所源自或获自的细胞组合物的体积。

III.在颗粒和含有颗粒的细胞组合物的存在下处理细胞的方法

在一些实施方案中，所提供的方法可用于测定源自或获自细胞组合物的样品中颗粒(如微球或珠粒)的存在、不存在、数量和/或浓度。在一些实施方案中，所述细胞组合物可以是药物组合物和/或可被配制以施用于受试者。在一些实施方案中，所述样品含有所述细胞组合物的至少一部分。在一些实施方案中，被评估颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度的样品包括或是所述细胞组合物的一部分。在一些实施方案中，所述样品代表细胞组合物的不超过0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％、2.5％、5.0％、10.0％、20.0％、30.0％、40.0％或50.0％。

在一些实施方案中，所述细胞组合物可以是在一个或多个颗粒(例如一个或多个微球或珠粒)存在下已经被处理的细胞制备物，例如用于富集、分离、选择、离析、刺激、激活和/或扩增细胞群中一个或多个细胞。在一些实施方案中，例如通过使颗粒与细胞群温育或接触，将一个或多个颗粒(例如微球或珠粒)与细胞混合，从而产生细胞组合物。在一些实施方案中，所述一个或多个颗粒能够结合该群中的一个或多个细胞。在一些实施方案中，所述处理产生细胞组合物，该细胞组合物包含或可能包含与一个或多个颗粒(如微球或珠粒)特异性相关联的一个或多个细胞。

在一些实施方案中，颗粒(如微球或珠粒)与细胞群的混合(例如温育或接触)促使或导致该群中细胞的富集、分离、选择、离析、激活、刺激和/或扩增。在一些实施方案中，通常，由于存在于颗粒(例如微球或珠粒)表面上的一种或多种生物分子(例如蛋白质，如抗体)的存在而实现所述富集、分离、选择、离析、激活、刺激和/或扩增，所述生物分子与细胞群中一个或多个细胞表面上的一个或多个大分子(例如细胞表面受体)特异性相互作用，例如结合或接合(engage)。在一些实施方案中，所述颗粒上生物分子的呈递可以产生多价配体，其中一个或多个细胞上的若干大分子可以与存在于颗粒上的生物分子结合或接合。在一些实施方案中，所述处理产生细胞组合物，该细胞组合物含有或可能含有与一个或多个颗粒特异性相关联的一个或多个细胞，例如，经由颗粒(例如微球或珠粒)上的生物分子与细胞表面上的大分子之间的特异性相互作用。

在一些实施方案中，所述细胞组合物来源于从输入组合物中去除一个或多个颗粒。在一些情况中，从细胞群与一个或多个颗粒的混合产生所述输入组合物。在一些实施方案中，所述细胞组合物通过以下方法产生，该方法包括使细胞群与一个或多个颗粒混合以产生输入组合物，通过从所述细胞中去除一个或多个颗粒而进一步处理该输入组合物。

在一些实施方案中，所述细胞组合物是已经在一个或多个颗粒存在下被处理并进一步进行用于从该细胞制备物中除去颗粒的一个或多个步骤的细胞制备物。在某些情况中，颗粒的去除是不完全的，且所得的细胞组合物含有残留颗粒。在一些实施方案中，本文提供的细胞组合物包含或被怀疑包含残留颗粒。

在一些实施方案中，本文提供的细胞组合物(例如用于细胞或细胞群的激活和/或扩增的细胞组合物)中的颗粒(例如珠粒)与细胞的比率是约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:14；1:16、1:18、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、2:1、2:2、2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、2:9、2:10、3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:9、3:10、4:1、4:2、4:3、4:4、4:5、4:6、4:7、4:8、4:9、4:10、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5、5:6、5:7、5:8、5:9、5:10、6:1、6:2、6:3、6:4、6:5、6:6、6:7、6:8、6:9、6:10、7:1、7:2、7:3、7:4、7:5、7:6、7:7、7:8、7:9、7:10、8:1、8:2、8:3、8:4、8:5、8:6、8:7、8:8、8:9、8:10、9:1、9:2、9:3、9:4、9:5、9:6、9:7、9:8、9:9、9:10、10:1、10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、0:8、10:9或10:10中的任一个。在一些实施方案中，本文提供的细胞组合物(例如用于细胞或细胞群的激活和/或扩增的细胞组合物)中的颗粒(例如珠粒)与细胞的比例为约1:1、约1:2、约1:10、约4:1或约3:1。

在一些实施方案中，所述细胞组合物包含具有相同大小(如相同直径)的多个颗粒。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含具有至少两种不同大小的多个颗粒。例如，所述细胞组合物可包含一个或多个直径为约3μm的颗粒、一个或多个直径为4μm的颗粒、一个或多个直径为约5μm的颗粒、一个或多个直径为约6μm的颗粒、一个或多个直径为约7μm的颗粒、一个或多个直径为约8μm的颗粒、一个或多个直径为约9μm的颗粒、一个或多个直径为约10μm的颗粒、一个或多个直径为约11μm的颗粒、一个或多个直径为约12μm的颗粒、一个或多个直径为约13μm的颗粒、一个或多个直径为约14μm的颗粒和/或一个或多个直径为约15μm的颗粒。

在一些实施方案中，所述细胞组合物中细胞的大小为约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约25μm、约1.0μm至约20μm、约1.0μm至约15μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约10μm至约15μm、约6μm至约12μm、或约7μm至约8μm。在一些实施方案中，所述至少一个细胞的大小为约至少或为至少1μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm。

在一些实施方案中，细胞组合物的浓度或者获自或源自本文所述细胞组合物的样品的浓度为至少约2x 10⁵个细胞/mL、至少约5x 10⁵个细胞/mL,至少约1x 10⁶个细胞/mL、至少约2.5x 10⁶个细胞/mL、至少约5x 10⁶个细胞/mL、至少约1x 10⁷个细胞/mL、至少约5x 10⁷个细胞/mL、至少约1x 10⁸个细胞/mL或至少约5x 10⁸个细胞/mL。在一些实施方案中，所述细胞组合物的体积或者获自或源自本文所述的细胞组合物的样品的体积为约0.2mL至50mL、0.2mL至20mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、或0.75mL至1.5mL中任一个。在一些实施方案中，所述细胞组合物的体积或者获自或源自本文所述的细胞组合物的样品的体积为至少约或为至少0.2mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1.0mL、约1.1mL、约1.2mL、约1.3mL、约1.4mL、约1.5mL、约1.6mL、约1.7mL、约1.8mL、约1.9mL、约2.0mL、约5.0mL、约10.0mL、约20mL或约50mL，但不超过100mL。

A.非细胞颗粒例如珠粒

在一些实施方案中，可将所述细胞与颗粒温育或接触，所述颗粒通常与能够特异性结合细胞表面上的大分子的生物分子缀合或连接。在一些实施方案中，所述颗粒是或包含固体表面。在一些实施方案中，所述颗粒是珠粒。

在一些实施方案中，所述颗粒可以是含有内芯的复合颗粒。在一些实施方案中，所述内芯是磁芯、顺磁芯或超顺磁芯。在一些实施方案中，所述内芯(如磁芯)是或含有任何合适的金属。在一些实施方案中，所述金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌，锆或其任何组合。可包括在本文所述的内芯(如磁芯)中的合适物质包括但不限于金属氧化物(如铁氧化物)、铁氧体(如锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(如CoTaZr)。在一些实施方案中，所述内芯包含铁氧体、金属、金属合金、铁氧化物或二氧化铬中的一种或多种。在一些实施方案中，所述内芯包含铁元素或其化合物。在一些实施方案中，所述内芯包含磁铁矿(Fe₃O₄)、磁赤铁矿(γFe₂O₃)或硫复铁矿(Fe₃S₄)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述内芯包含铁氧化物(如Fe₃O₄)。在一些实施方案中，所述内芯包含胶体铁(如胶体铁氧化物)。

在一些实施方案中，所述颗粒(例如珠粒)在磁场中反应。在一些实施方案中，所述颗粒是磁性颗粒(例如，磁性珠粒)。

在一些实施方案中，所述内芯可进一步含有聚合物(如可生物降解的聚合物)、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳或其组合。在一些实施方案中，所述聚合物是选自下组中的一种或多种：聚乙二醇、聚(乳酸-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯和聚乙烯醇。在一些实施方案中，所述聚合物是聚苯乙烯。在一些实施方案中，所述聚合物是聚戊二醛。在一些实施方案中，所述聚合物是可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，所述多糖可以是壳聚糖、琼脂糖、淀粉、葡聚糖或葡聚糖衍生物。在一些实施方案中，所述多糖是葡聚糖或其衍生物(如氨基葡聚糖)。在一些实施方案中，二氧化硅(silica)是硅氧化物(silica oxide)。在一些实施方案中，蛋白质是白蛋白(如人血清白蛋白)。在一些实施方案中，碳是选自由丙烯酰胺和马来酸组成的组中的一种或多种。在一些实施方案中，所述内芯包含金属氧化物(如铁氧化物)和多糖(例如葡聚糖)。在一些实施方案中，所述内芯包含胶体铁(如胶体铁氧化物)和多糖(如葡聚糖)。

在一些实施方案中，所述内芯包含纳米颗粒。在一些实施方案中，所述内芯包含微珠(例如包含葡聚糖的微珠)。这类纳米颗粒或微珠可各自具有其自身的内芯，所述内芯包含本文所述的金属和/或聚合物，并且任选地进一步包含包衣，例如本文所述的包衣。在一些实施方案中，本文所述的内芯包含纳米颗粒和聚合物(如二氧化硅)。在一些实施方案中，本文所述的内芯包含微珠和聚合物(如二氧化硅)。

在一些实施方案中，本文所述的内芯具有小于约3000nm、约2000nm、约1000nm、约900nm、约800nm、约700nm、约600nm、约500nm、约400nm、约300nm、约200nm、约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm或约10nm的直径。在一些实施方案中，所述内芯具有约3000nm、约2000nm、约1000nm、约900nm、约800nm、约700nm、约600nm、约500nm、约400nm、约300nm、约200nm、约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm或约10nm中任一个的直径。在一些实施方案中，所述内芯具有约100nm或更小的直径。在一些实施方案中，所述内芯具有约50nm或更小的直径。

在一些实施方案中，所述颗粒可以进一步包含一种或多种包衣或涂层，例如颗粒的表面上的一种或多种包衣或涂层(例如，表面涂层)。在一些实施方案中，一种或多种包衣或涂层保护内芯、提供用于缀合或偶联至生物分子的材料和/或提供可生物降解的表面。

在一些实施方案中，本文所述的包衣或涂层(例如表面涂层)提供保护性包衣。在一些实施方案中，所述包衣(例如保护性包衣)或涂层(例如保护性涂层)防护、减少或防止内芯(例如磁芯)的氧化。例如，所述包衣可以防护、减少或防止磁芯氧化。在一些实施方案中，所述包衣或涂层将内芯保留在颗粒(例如珠粒)中。在一些实施方案中，所述包衣或涂层可防止内芯变质(deterioration)。

在一些实施方案中，包衣含有至少一种可以与生物分子偶联、连接或缀合的材料。在一些实施方案中，所述材料可以以针对所需靶标(例如T细胞)的亲和力(例如亲和试剂)与一种或多种生物分子(例如核酸(例如DNA)、蛋白质、抗体、抗原或任何其他生物分子)偶联、连接或缀合。

在一些实施方案中，所述包衣含有可包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳或其组合的材料。在一些实施方案中，所述聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯和聚乙烯醇。在一些实施方案中，所述聚合物是聚氨酯。在一些实施方案中，所述聚合物是可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，所述包衣含有或包括材料，该材料是或包括多糖，所述多糖可以是壳聚糖、琼脂糖、淀粉、葡聚糖和/或葡聚糖衍生物。在一些实施方案中，所述多糖可以是葡聚糖或葡聚糖衍生物(如氨基葡聚糖)。在一些实施方案中，所述二氧化硅是硅氧化物。产生用于涂覆内芯的氧化硅的方法是本领域公知的。参见美国专利号8,398,741。在一些实施方案中，所述包衣含有或包括材料，该材料为或包括蛋白质，所述蛋白质为白蛋白(例如人血清白蛋白)、蛋白A和蛋白G。在一些实施方案中，所述碳是丙烯酰胺或马来酸。在一些实施方案中，所述材料与本文所述的生物分子偶联、连接或缀合。

在一些实施方案中，本文所述的包衣或涂层(如保护性包衣)具有小于约500nm、小于约450nm、小于约400nm、小于约350nm、小于约300nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、小于约75nm、小于约50nm或小于约25nm的厚度。在一些实施方案中，本文所述的包衣或涂层(如保护性包衣)具有约500nm、约450nm、约400nm、约350nm、约300nm、约250nm、约200nm、约150nm、约100nm、约75nm、约50nm或约25nm的厚度。

在一些实施方案中，本文所述的颗粒(如珠粒)可具有内芯和包衣(如保护性包衣)，其中所述包衣含有一种或多种本文所述的材料。在一些实施方案中，本文所述的颗粒(如珠粒)包含金属氧化物芯(如铁氧化物内芯)和包衣(如保护性包衣)，其中所述包衣包含至少一个多糖(如氨基葡聚糖)。在一些实施方案中，本文所述的颗粒(如珠粒)包含金属氧化物芯(如铁氧化物内芯)和包衣(如保护性包衣)，其中所述包衣包含至少一种多糖(如氨基葡聚糖)和至少一种聚合物(如聚氨酯)。在一些实施方案中，本文所述的颗粒(如珠粒)具有金属氧化物芯(如铁氧化物芯)和包衣(如保护性包衣)，其中所述包衣包含至少一种多糖(如氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(如聚氨酯)和二氧化硅(silica)。在本文中一些任何此类的实施方案中，所述金属氧化物是包含胶体铁(如胶体铁氧化物内芯)的铁氧化物芯。在本文中一些任何此类的实施方案中，所述金属氧化物芯包含多糖(如葡聚糖)和胶体金。在一些任何此类的实施方案中，所述包衣具有约400nm的厚度。

在本文的一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)具有大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm或大于约1000μm且不超过约1500μm的直径。在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)具有约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm,约1.0μm至约30μm,约1.0μm至约10μm,约1.0μm至约5.0μm,约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm的直径。在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)具有约3μm至约5μm的直径。在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)具有至少或至少约或约0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm或20μm的的直径。

在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)具有的直径大于本文所述的细胞组合物或样品中的细胞的直径的约1.5倍、大于约2倍、大于约3倍、大于约4倍或大于约5倍，且不超过本文所述的细胞组合物或样品中的细胞的直径的10倍。在一些实施方案中，所述珠粒(如珠粒)具有的直径小于本文所述细胞组合物或样品中的细胞的直径的1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)的大小与本文所述的细胞组合物或样品中的细胞基本相同或大约相同，例如在所述细胞大小的1.5倍内(大于或小于不超过所述细胞的大小的1.5倍)。

在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)可进一步含有一种或多种生物分子，例如一个或多个(直接地或间接地)与颗粒的包衣或涂层偶联、缀合或连接的生物分子。在一些实施方案中，本文预期的生物分子可包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质凝集素或具有针对所需靶标的亲和力(例如亲和试剂)的任何其他生物分子(例如链霉亲和素)。可通过本领域已知和可获得的各种方法使所述一种或多种生物分子直接或间接附接至所述颗粒(例如珠粒)。附接可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，且可通过各种附接手段来实现，包括例如化学手段、机械手段或酶手段。在一些实施方案中，生物分子(如生物素化抗CD3抗体)可经由直接附接至所述颗粒的另一个生物分子(例如抗生物素抗体)间接地附接至所述颗粒。

在一些实施方案中，所述生物分子是抗体。所述抗体可包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双抗体和单链分子，以及抗体片段(例如Fab、F(ab')₂和Fv)。在一些实施方案中，所述生物分子是抗体片段(包括抗原结合片段)，如Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)₂片段。应当理解，任何同种型的恒定区可用于本文预期的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这种恒定区可以从任何人或动物物种(例如小鼠种)获得。

在一些实施方案中，所述抗体是抗生物素抗体或抗IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是生物素化的(如生物素化的抗CD3抗体)。

在一些实施方案中，所述生物分子特异性结合至靶标。在一些实施方案中，所述靶标是细胞表面上的一个或多个大分子。本文所预期的细胞包括但不限于T细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞等)、B细胞(如记忆B细胞、血浆B细胞等)、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。

在一些情况中，本文所述的颗粒(例如珠粒)提供生物分子(例如本文所述的生物分子(例如抗体))可结合的固体支持物或基质，从而基于细胞表面上的一种或多种大分子(如细胞表面蛋白)的表达或表达水平促进细胞群中的一种或多种细胞类型的分离、富集、选择、分离、激活、刺激和/或扩增。可利用的生物分子包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(如酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质凝集素或能够特异性结合细胞表面上的一个或多个大分子的任何其他生物分子(如链霉亲和素)。在某些实施方案中，所述颗粒(如磁性珠粒)包含直接或间接地结合至细胞表面上的一个或多个大分子的一个或多个细胞生物分子(如抗体)。

在一些实施方案中，所述颗粒包含直接与细胞表面上大分子相互作用的一种或多种生物分子。在某些实施方案中，所述颗粒(如磁性珠粒)经由对细胞上的一个或多个大分子特异的一种或多种生物分子(如抗体)而与细胞相互作用。在某些实施方案中，所述颗粒(如磁性珠粒)用本文所述的第一生物分子标记，例如一抗(例如抗生物素抗体)或其他第一生物分子，然后加入第二生物分子(例如二抗(例如生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如链霉亲和素))，由此所述二抗或其他第二生物分子特异性结合至颗粒上的这些一抗或其他第一生物分子。

在一些实施方案中，所述颗粒包含间接地与细胞表面上的大分子相互作用的生物分子。在某些实施方案中，所述细胞(而非本文所述的颗粒(如磁性珠粒))用本文所述的一种或多种生物分子标记。在某些实施方案中，所述细胞是用本文所述的第一生物分子标记的，所述第一生物分子例如一抗(如生物素化的抗CD3抗体)或其其他第一生物分子(如链霉亲和素)，然后加入携带第二生物分子(例如二抗(如抗生物素抗体)或其他第二生物分子)的颗粒，由此所述二抗或其他第二生物分子特异性结合至这些一抗或其他第一生物分子。在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子是抗体。在一些实施方案中，所述第一或第二生物分子是抗生物素抗体。

在一些实施方案中，附接于颗粒(如珠粒)的生物分子特异性结合至细胞(如T细胞)上的下列大分子中的一个或多个：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII,CTLA-4,ICOS,PD-1,OX40,CD27L(CD70),4-1BB(CD137),4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(如Delta-样1/4,锯齿状1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，其包括这些大分子或其片段的相应配体。在一些实施方案中，附接于颗粒(如珠粒)的生物分子(例如抗体)特异性结合至细胞(如T细胞)上的下列大分子中的一个或多个：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。

在一些实施方案中，所述生物分子向细胞传递信号或充当刺激剂。例如，附接于颗粒(如珠粒)的抗体或其抗原结合片段(如Fab)可向细胞(如T细胞)提供激活信号并诱导细胞激活和/或细胞扩增。本文预期的这些抗体包括但不限于抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD137抗体、抗CD134抗体或其组合，包括其抗原结合片段。在一些实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段是生物素化的(如生物素化的抗CD3抗体)。

在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子是选自下组的一个或多个抗体：抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD137抗体和抗CD134抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子是抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子是抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子是抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子是抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。

在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒)包含金属氧化物芯(如铁氧化物芯)和包衣，其中所述金属氧化物芯包含至少一种多糖(如葡聚糖)，且其中所述包衣包含至少一种多糖(如氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(如聚氨酯)和二氧化硅。在本文的一些实施方案中，所述金属氧化物芯是胶体铁氧化物芯。在进一步的实施方案中，所述颗粒包含与细胞表面上大分子(如蛋白质)结合的一种或多种生物分子，从而引起所述颗粒与细胞组合物中的细胞或细胞组合物的样品中的细胞相关联或结合。在一些实施方案中，所述一种或多种生物分子选自下组：RNA、DNA、蛋白质、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、碳水化合物、脂质或具有针对所需靶标的亲和力(例如亲和试剂)的任何其他生物分子(如链霉亲和素)。在一些实施方案中，所述生物分子是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述颗粒包含抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述颗粒包含抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述颗粒包含抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，所述颗粒包含抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，所述颗粒包含抗生物素抗体。在一些实施方案中，所述珠粒具有约3μm至约10μm的直径。在一些实施方案中，所述珠粒具有约3μm至约5μm的直径。

用于本文所述的方法中的颗粒(如珠粒)可以商业生产或获得。颗粒，包括产生颗粒的方法，是本领域公知的。参见例如美国专利号6,074,884；5,834,121；5,395,688；5,356,713；5,318,797；5,283,079；5,232,782；5,091,206；4,774,265；4,654,267；4,554,088；4,490,436；4,452,773；美国专利申请公开号20100207051；和Sharpe,Pau T.,Methodsof Cell Separation,Elsevier,1988。商购可得的颗粒(如珠粒)包括但不限于ProMag^TM(PolySciences,Inc.)；COMPEL^TM(PolySciences,Inc.)；

(PolySciences,Inc.)，包括

Plus(PolySciences,Inc.)和

Maxi(Bang Laboratories,Inc.)；M-PVA(Cehmagen Biopolymer Technologie AG)；SiMAG(Chemicell GmbH)；beadMAG(Chemicell GmbH)；

(Cortex Biochem)；

(Invitrogen)，包括

M-280Sheep Anti-rabbit IgG(Invitrogen)、

FlowComp^TM(如

FlowComp^TMHuman CD3,Invitrogen)、

M-450(如

M-450Tosylactivated,Invitrogen)、

Untouched^TM(如

Untouched^TM人CD8 T细胞,Invitrogen)和结合、扩增和/或激活T细胞的

(如用于T细胞扩增或激活的

人T-激活剂CD3/CD28，Invitrogen)；

M(MerkChimie SAS)；

EM(MerkChimie SAS)；MACSiBeads^TM颗粒(如抗生物素MACSi珠粒,MiltenyiBiotec,目录#130-091-147)；

磁珠(IBABioTAGnology)；

磁珠(IBA BioTAGnology)；

(MicormodPartikeltechnologieGmbH)

(MicromodPartikeltechnologie)；MagneSil^TM(Promega GmbH)；MGP(Roche Applied Science Inc.)；Pierce^TM蛋白G磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Pierce^TM蛋白A磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Pierce^TM蛋白A/G磁珠(ThermoFisher Scientific Inc.)；Pierce^TMNHS-激活的磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Pierce^TM蛋白L磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Pierce^TM抗HA磁珠(ThermoFisher Scientific Inc.)；Pierce^TM抗c-Myc磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Pierce^TM谷胱甘肽磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；Pierce^TM链霉亲和素磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；MagnaBind^TM磁珠(Thermo Fisher ScientificInc.)；Sera-Mag^TM磁珠(Thermo Fisher Scientific Inc.)；抗

M2磁珠(Sigma-Aldrich)；SPHERO^TM磁珠(Spherotech Inc.)；和HisPur^TMNi-NTA磁珠(Thermo FisherScientific Inc.)。

B.细胞和在颗粒存在下细胞的处理

在一些实施方案中，细胞组合物中的细胞或被处理用于制备本文所述的细胞组合物的细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，且通常为人细胞。在一些实施方案中，所述细胞为或包括免疫系统的细胞，例如先天免疫或适应性免疫细胞，如骨髓或淋巴细胞，其包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。在一些实施方案中，免疫系统的细胞(如免疫细胞)为T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含免疫系统的一种或多种细胞，例如CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是或所述细胞组合物包含单核细胞或粒细胞，如骨髓细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。其他示例性细胞包括干细胞，例如多能干细胞(multipotent)和多潜能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。所述细胞通常是原代细胞，例如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。

在一些实施方案中，所述细胞组合物中的细胞获自生物样品。生物样品包括组织样品、液体样品和直接从受试者获取的其他生物样品，以及由一个或多个处理步骤(例如分离、离心、基因工程改造(例如，用病毒载体转导))、洗涤和/或温育)产生的生物样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的处理的样品。在一些方面中，所述细胞源自、获自或分离自的生物样品是血液或血液衍生的样品，或源自单采血液成分术或白细胞去除术的产物。在一些实施方案中，来自受试者的循环血液的细胞(例如)通过单采血液成分术或白细胞去除术获得。在一些实施方案中，所述细胞是获自或源自血液、骨髓、淋巴液和淋巴器官的免疫细胞(如骨髓或淋巴的细胞，其包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞)。示例性生物样品还包括但不限于全血、外周血单核细胞(PBMCs)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或源自其的细胞。在一些实施方案中，所述生物样品包含淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白血球、红血球和/或血小板，且在一些方面中包含除红血球和血小板之外的细胞。

在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血液样品中的细胞例如以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，用半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)根据制造商的说明书完成洗涤步骤。在一些方面，通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后用将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，所述生物相容性缓冲液例如不含Ca++/Mg++的PBS。在某些实施方案中，去除血液样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红血球并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血中制备白血球。

在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系(如T细胞系)。在一些实施方案中，所述细胞获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。

在一些实施方案中，所述细胞组合物中的细胞是或包括用于在细胞治疗(如过继细胞治疗)背景中使用的细胞。在一些情况中，所述生物样品来自自体同源来源。在一些情况中，所述生物样品来自同种异体来源。在一些实施方案中，本文所述的方法包括从受试者中分离细胞、制备、处理、培养和/或工程改造细胞，并在冷冻保存之前或之后将细胞重新引入同一受试者。

在一些实施方案中，所述细胞组合物中的细胞是或包括从已经历一个或多个制备和/或不基于亲和力的细胞分离步骤的生物样品中获得的细胞。在一些实例中，所述细胞或细胞群已经在一种或多种试剂的存在下被洗涤、离心和/或温育例如以除去不想要的组分、富集所需组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质(例如密度、粘附性质、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性)制备或获得所述细胞或细胞群。

在一些实施方案中，包含本文所述的生物分子的颗粒(如珠粒)可用于基于亲和力或基于免疫亲和力的分离方法，例如在处理细胞组合物的过程中。通常，所述生物分子(如抗体)对在细胞表面表达或存在的一种或多种大分子(例如细胞表面受体)具有特异性。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含相同细胞类型的一种或多种细胞(如1、2、3、4或更多种细胞)。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含不同细胞类型的一种或多种细胞(如1、2、3、4或更多种细胞)。通常，所述颗粒直接地或间接地附接至所述生物分子(如抗体)。在一些实施方案中，可以使用任何已知的用于使用这类颗粒(例如珠粒)进行分离的方法。例如，在一些方面，所述分离包括通过以下来分离细胞群中的细胞：通过与至少一个颗粒温育，所述颗粒在其表面上携带特异性结合细胞上的一种或多种大分子的生物分子(例如抗体)，然后通常通过洗涤步骤且将已结合所述生物分子(例如抗体)的细胞与未结合至所述生物分子(例如抗体)结合的细胞分离。

在一些实施方案中，分离方法中的这些分离步骤可基于通过阳性选择富集特定的细胞群，其中保留结合了所述试剂的细胞用于进一步使用。在一些方面，进行多轮分离步骤，其中可进行一次或多次阳性选择。在一些情况中，通过将所述细胞与多种生物分子(例如与多种细胞类型上表达的一种或多种大分子结合的抗体)温育，可以同时阳性选择多种细胞类型。

在一些实施方案中，分离方法还可采用一个或多个阴性选择步骤，其中未与所述生物分子结合的细胞是富集的细胞群。在一些方面，将一个或多个阳性选择步骤与一个或多个阴性选择步骤组合，例如，其中阳性和/或阴性级分被保留，并进一步被处理或进行进一步分离阳性和/或阴性级分的步骤。例如，可对来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分进行另一个分离步骤，例如随后的阳性或阴性选择。在一些方面中，在没有生物分子(例如，抗体)可用于特异性鉴定异质群体中的一个细胞类型的情况下，阴性选择可能特别有用，使得基于由除所需要的群之外的细胞表达的标志物(如大分子)进行最佳分离。通常，这些方法采用至少一个阳性选择步骤，由此所述颗粒(例如，包含生物分子的颗粒)可保持与所述细胞相关联。

确定特定颗粒(例如，包含生物分子的颗粒)以用于从群体中富集或分离特定细胞类型或细胞亚组在本领域技术人员的水平内。例如，对附接至颗粒(如珠粒)的生物分子的特定选择将取决于待分离或富集的细胞的特定细胞类型或细胞亚组、生物分子对特定细胞类型或细胞亚组的可用性、一次或多次阳性选择或阳性和阴性选择方法的组合的选择以及技术人员水平内的其他因素。

在一个示例性的方面，可通过阳性和/或阴性选择技术分离T细胞的特定亚群，例如，针对一种或多种表面标志物(例如，一个或多个大分子)阳性或表达高水平的一个或多个表面标志物(例如，一个或多个大分子)的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD3+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些方面，这些富集和分离方法可用于获得适用于处理、制备和/或工程化用于过继细胞治疗方法的细胞的T细胞群。

在一些实施方案中，通过对非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其他白血球(例如NK细胞))上表达的标志物的阴性选择，从PBMC样品中分离T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+阳性选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或相对较高程度地表达的标志物的阳性或阴性选择，可将这些CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。

在一些实施方案中，CD8+细胞可被进一步富集或耗尽幼稚、中央记忆性、效应记忆性和/或中央记忆性干细胞，例如通过基于与各自亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，进行中央记忆性T(TCM)细胞的富集以增加功效，例如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，在一些方面，这在这样的亚群中尤为强效。参见Terakura等(2012)Blood.1:72–82；Wang等(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，T_CM-富集的CD8+T细胞和CD4+T细胞的组合进一步增强功效。

在实施方案中，记忆性T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L亚组二者中。PBMC样品可被富集或耗尽CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗体。

在一些实施方案中，中央记忆性T(T_CM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它基于对表达或高表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞和对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富集T_CM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面中，富集中央记忆性T(TCM)细胞的执行开始于基于CD4表达而选择的阴性细胞级分，所述基于CD4表达选择的阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择，且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面，这种选择是同时进行的，在其他方面，以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分都被保留且用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个另外的阳性或阴性选择步骤之后。

在一个具体的实例中，PBMC样品或其他白血球样品进行CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性级分。然后使该阴性级分进行基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择，以及进行基于中央记忆性T细胞的标记物特征(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。在一些情况中，通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，阳性和阴性选择的组合可用于将CD4+T辅助细胞分为幼稚细胞、中央记忆性细胞和效应细胞。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+和CD4+T细胞。在一些实施方案中，中央记忆性CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。

在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和力磁性)分离技术分离(separate或isolate)所述细胞和/或细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine，第58卷：Metastasis Research Protocols,第2卷：Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页由S.A.Brooks and U.Schumacher编辑

Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。细胞分离的免疫磁性方法可利用包含磁芯(如铁氧化物芯)的顺磁性珠粒，例如上述中的任一种(例如诸如

或MACSiBeadsTM颗粒)。在一些实施方案中，磁性珠粒包含与特定生物分子(例如抗体或其他生物分子)结合的磁响应材料。存在许多公知的在磁分离方法中使用的磁响应材料。合适的磁性珠粒包括本文以及Molday,美国专利号4,522,587和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些。胶体尺寸的颗粒(例如Owen美国专利号4,795,698和Liberti等的美国专利号5,200,084所述的那些)是合适的磁性珠粒的其他实例。

在一些方面，将待分离的本文所述的细胞组合物或获自本文所述细胞组合物的样品与至少一种本文所述的磁性珠粒温育。通常，温育在一定条件下进行，由此附接至磁性珠粒的生物分子(如抗体)特异性结合至细胞表面大分子(如果该细胞表面大分子存在于样品或细胞组合物中的细胞上的话)。在一些方面，将所述样品或细胞组合物置于磁场中，且附接有磁响应或可产生磁性的珠粒的那些细胞将会被吸引到磁体上，并与不附接有这样的珠粒的细胞分离。

在一些实施方案中，基于亲和力的选择通过磁激活细胞分选术(MACS)(MiltenyiBiotech,Auburn,CA)。MACS系统能够高纯度选择附接有磁性珠粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶细胞和靶细胞。即，附接至磁性珠粒的细胞(如靶细胞)位置固定，而未附接的细胞(如非靶细胞)被洗脱。然后，在完成该第一洗脱步骤之后，被限制在磁场中并防止被洗脱的靶细胞以某种方式被释放，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞是标记的并从异质细胞群中耗尽。

对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引至磁体的细胞(未标记的细胞)。

在某些实施方案中，在集成的或独立的系统、装置或设备中进行分离(isolate或separate)，例如以提供封闭或无菌环境，例如以最小化误差、用户处理和/或污染。在一些情况中，还可以在所述系统中进行一个或多个其他进一步的处理步骤，例如一个或多个其他处理、温育、培养和/或配制步骤。在一个实施例中，所述系统是国际专利申请公开号WO2009/072003或US20110003380所述的系统。在一些实施方案中，分离(isolate或separate)以自动或可编程的方式进行。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备联通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估离析或分离或所述过程的一个或多个其他步骤的结果和/或调整分离(isolate或separate)或所述过程的一个或多个其他步骤的各个方面。

在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotic)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭且无菌系统中自动分离临床规模水平的细胞。组件可包括集成的微型计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成的计算机控制仪器的所有组件并指导系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管道组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液受控地流过系统和细胞的连续悬液。

在一些方面，CliniMACS系统使用抗体偶联的磁性珠粒，所述磁性珠粒被提供于无菌的无热原溶液中。在一些实施方案中，在用磁性珠粒标记细胞后，洗涤细胞以去除过量的磁性珠粒。然后将细胞制备袋连接到管组，管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组包括预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)，且仅供一次性使用。在一些实施方案中，管组不包括预柱。在启动分离程序后，系统自动将细胞样品应用到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤被去除。在一些实施方案中，用于本文所述方法的细胞群用磁性珠粒标记(例如本文所述的那些磁性珠粒)，并保留在柱中。在一些实施方案中，在去除磁场后，用于本文所述方法的细胞群从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋中。

在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(MiltenyiBiotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理单元，该单元允许通过离心自动洗涤和分级细胞。CliniMACS Prodigy系统还可包括机载相机和图像识别软件，该图像识别软件通过辨别源细胞产物的肉眼可见层来确定最佳的细胞分级终点。例如，将外周血自动分离成红细胞、白血球和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可包括整合的细胞培养室，该细胞培养室实现细胞培养方案，例如细胞分化和扩增、抗原负载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可使用集成的显微镜监测细胞。参见如Klebanoff等(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等(2012)Blood.1:72–82和Wang等(2012)J Immunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，包含生物分子的颗粒可用于与一种或多种细胞类型的刺激、激活和/或扩增相关联。在一些实施方案中，所述生物分子提供刺激剂，该刺激剂诱导细胞群中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，例如以模拟抗原暴露和/或通过一个或多个细胞表面受体诱导细胞信号传导。

在一些实施方案中，包被或结合于本文所述颗粒的生物分子(如抗体或配体)提供能够激活TCR复合物的胞内信号传导结构域的刺激条件。在一些方面，所述生物分子开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号级联。在一些实施方案中，可在共刺激信号的存在下加强或增强信号传导。在一些实施方案中，可促进刺激或激活的生物分子可包括抗体，例如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体(例如抗CD3、抗CD28的抗体)。在一些实施方案中，当抗CD3抗体固定在表面(例如颗粒(如微球或珠粒))上时，它可以通过交联T细胞表面上的T细胞受体复合物来传递激活和增殖诱导信号。在一些情况中，通过固定抗CD3和抗CD28以同时递送信号和共刺激信号，可增强增殖。用抗CD3和抗CD28珠固定的各种固相表面颗粒(包括微球和珠粒)是已知的(WO09429436；EP01257632；US2008/0317724和美国专利号8,012,750)。在一些情况中，所述颗粒可包括纳米颗粒或微米颗粒(microparticle)。

通常，已经表明，与纳米颗粒相比，当使用微米颗粒产生效果时，抗CD3/抗CD28颗粒的刺激或激活通常更强。例如，已经表明，与T细胞大小接近的微米级颗粒提供了最佳的T细胞刺激(参见如Steenbloc和Fahmy,(2008)Molecular Therapy,16:765-772；Mescher等(1992)J.Immunol.,149:2402-2405)。用于评估颗粒存在的现有方法的问题在于许多方法不能区分与细胞基本上相同大小的颗粒。在一些实施方案中，提供的方法克服了这些问题，因为细胞被裂解的同时颗粒(例如珠粒)保持完整。在一些实施方案中，抗CD3/抗CD28微米颗粒(如珠粒)具有的大小为或约为1μm至24μm，例如2μm至10μm、或3μm至5μm，例如约或至少约或为3μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm或5.0μm。

任选地，刺激、激活或扩增还可包括加入一种或多种刺激条件例如至培养基中。在一些实施方案中，刺激条件包括添加刺激性细胞因子，例如IL-2和/或IL-15，例如以至少约10个单位/mL的IL-2浓度。在一些实施方案中，所述条件可包括一种或多种特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体以及被设计成激活细胞的任何其它试剂))。

在一些方面中，根据例如Riddell等的美国专利号6,040,1 77、Klebanoff等(2012)J Immunother.35(9):651–660、Terakura等(2012)Blood.1:72–82和/或Wang等(2012)J Immunother.35(9):689-701中所述的技术进行温育。

在这样的方面，一个或多个颗粒(例如珠粒)可以与一个或多个细胞保持在一起。在一些实施方案中，所述颗粒(例如珠粒，包括可产生磁性的颗粒)保持附接于随后待被温育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面，所述颗粒保持附接于用于施用至患者的细胞。

在一些实施方案中，所述颗粒(例如珠粒，包括可产生磁性的或磁响应颗粒)被从细胞组合物中去除。在一些实施方案中，所述颗粒(例如珠粒，包括可产生磁性的或磁响应颗粒)不能完全从细胞组合物中去除，从而产生残留的珠子细胞组合物。用于从细胞去除颗粒的方法(如珠粒或可产生磁性的颗粒)是已知的。在一些实施方案中，可利用竞争性非标记抗体的用途，所述抗体例如结合一抗并改变其对细胞上抗原的亲和力从而允许温和分离。在一些情况中，分离后，所述竞争性抗体可保持与所述颗粒(如珠粒)相关联，而未反应的抗体被洗掉或可能被洗掉，且所述细胞没有分离、选择、富集和/或激活性抗体。此试剂的示例是DETACaBEAD(Friedl等1995；Entschladen等1997)。在一些实施方案中，可在可切割接头(例如DNA接头)的存在下可以去除颗粒(如珠粒)，由此颗粒结合的抗体与接头缀合(例如CELLection，Dynal)。在一些情况中，接头区域提供可切割位点以在分离后(例如)通过添加DNase或其他释放性缓冲液从所述细胞中去除颗粒(如珠粒)。在一些实施方案中，其他酶方法也可用于从细胞释放颗粒(如珠粒)。在一些实施方案中，所述颗粒(如珠粒或可产生磁性的颗粒)是可生物降解的。

在一些实施方案中，制备方法包括在分离、温育和/或工程改造之前或之后冷冻(例如冷冻保存)细胞组合物中的细胞或细胞群的步骤。在一些实施方案中，冷冻和随后的解冻步骤去除细胞组合物中的粒细胞和一定水平的单核细胞。在一些实施方案中，(例如)在洗涤步骤后，将细胞组合物中的细胞或细胞群悬浮在冷冻溶液中，以去除血浆和血小板。在一些方面中，可以使用各种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个实施涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基以1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后，通常将细胞以1°每分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的蒸汽相中。

C.药物组合物和制剂

在一些实施方案中，所述细胞组合物是药物组合物或制剂，其包含用于施用的治疗有效量的细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物或制剂可以是单位剂量形式组合物，其包括以给定剂量或其部分施用的细胞数量。所述药物组合物和制剂通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种额外的治疗剂。

术语“药物制剂”或“药物组合物”是指这样的制剂：以允许其中包含的活性成分的生物活性有效，且不含有对将会被施用所述制剂或组合物的受试者具有不可接受的毒性的其他成分的形式的制剂。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面，载体的选择在某种程度上由具体的细胞和/或施用方法决定。因此，存在多种合适的制剂。例如，所述药物组合物可含有防腐剂。合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体由例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)描述。药学上可接受的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面，在所述药物组合物中包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细地描述。

所述药物组合物可包括水溶液。

所述制剂或组合物可以单独使用或与治疗中的其他药剂组合使用。例如，所述组合物可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。在一些实施方案中，所述制剂或组合物可含有可用于正在用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分(如治疗剂)，优选具有与所述细胞互补活性的那些活性成分，其中各种活性不会不利地互相影响。这样的活性成分(如治疗剂)适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括其他药物活性剂或药物，例如化学治疗剂，如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱和/或长春新碱。在一些实施方案中，本发明的组合物在与额外的治疗剂分开的制剂中。在一些实施方案中，本发明的组合物的施用可在施用所述额外的治疗剂之前、同时和/或之后发生。

在一些实施方案中，所述药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量的细胞，例如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方案中，通过定期评估治疗的受试者来监测治疗或预防功效。所需剂量可以通过单次推注施用所述细胞，通过多次推注施用所述细胞，或通过连续输注施用所述细胞来递送。在一些实施方案中，将所述细胞配制成用于以单个药物组合物(例如以单剂量形式)施用。在一些实施方案中，将所述细胞配制成以多剂量形式施用。在一些情况中，例如，在过继细胞疗法的背景下，给定“剂量”的施用包括施用给定量或数量的细胞作为单个组合物和/或以单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)，且还包括在特定的时间段内(例如通常不超过3天)，施用给定量或数量的细胞作为分剂量，所述分剂量以多个单独的组合物或输液剂提供。因此，在一些情况中，剂量是在单个时间点给予或开始的单次或连续施用的细胞的指定数量。然而，在一些情况中，剂量在不超过三天的时间内以多次注射或输注施用，例如每天一次，持续三天或持续两天，或单日内的多次输注。因此，在一些方面中，所述细胞以单个药物组合物施用。在一些实施方案中，所述细胞以总共含有单剂量的细胞的多个组合物施用。

在一些实施方案中，将所述细胞配制成在从每千克受试者体重约10⁵至约10⁶个这类细胞的范围内和/或以每千克受试者体重不超过约10⁵或约10⁶个这类细胞的这类细胞的数量用于施用。例如，在一些实施方案中，将所述细胞配制成施用剂量，所述剂量包括每千克受试者体重小于或不超过或小于约或不超过约1x 10⁵、2x 10⁵、5x 10⁵、1x 10⁶个这类细胞。在一些实施方案中，将所述细胞配制成施用剂量，所述剂量包括每千克受试者体重1x10⁵或约1x 10⁵、2x 10⁵或约2x 10⁵、5x 10⁵或约5x 10⁵、1x 10⁶或约1x 10⁶个这类细胞，或在以上数值中的任意两个之间的范围内的数值。在特定的实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指表达重组受体(如CAR)的细胞的数量。在其他的实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。

在一些实施方案中，将所述细胞配制在组合物中，其量提供一个或多个单位剂量的细胞，该量可以是以单剂量或以一个或多个分剂量施用至受试者的细胞的数量或量。在一些实施方案中，所述单位剂量包括每千克待治疗的受试者和/或所述细胞已源自的受试者小于约1x 10⁸、小于约5x 10⁷、小于约1x 10⁶或小于约5x 10⁵个工程化的细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少或约或2x 10⁶、5x 10⁶、1x10⁷、5x 10⁷或1x 10⁸个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。

在一些实施方案中，使用标准施用技术、剂型和/或装置配制所述细胞和组合物用于施用。所述细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可从一个受试者中获得，并施用至相同受试者或不同的相容的受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射施用(包括导管施用)、全身施用、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗组合物(如含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量的可注射形式(溶液剂、悬剂、乳剂)。

制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用的制剂。在一些实施方案中，所述细胞群经肠胃外施用。如本文所述的术语“胃肠外的”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送将所述细胞施用至所述受试者。

在一些实施方案中，组合物以无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬液、乳剂、分散体或粘性组合物，其在一些方面可被缓冲至选定的pH。通常液体制剂比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物稍微更便于施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制成在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。

无菌可注射溶液可通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖或类似物)混合。所述组合物可含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(如甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶化作用或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。

可以加入增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可以确保阻止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现延长可注射药物形式的吸收。

用于体内施用的剂型通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌性。

IV.制品和试剂盒

还提供了用于实施所提供方法的包含所述试剂或成分的制品或试剂盒。所述制品包括一个或多个容器(通常是多个容器)、包装材料以及在所述一个或多个容器和/或包装上或与所述一个或多个容器和/或包装相关联的标签或包装插页，通常包括用于实施所提供的方法的说明书。

在一些实施方案中，所述制品包括用于实施所述方法的一种或多种裂解溶液(如高渗溶液和/或低渗溶液)，其被包装为含有包装材料和(任选地)用于实施所述方法的说明书的制品。在一些实施方案中，所述制品和试剂盒可进一步含有用于计数细胞组合物中颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的试剂和/或仪器。试剂包括但不限于用于检测颗粒表面上的生物分子(例如抗葡聚糖抗体)的亲和力或检测试剂、冲洗或洗涤缓冲液或溶液，其各自可任选地包含在包装材料中。在一些实施例中，所述制品包括用于实施所述方法的一个或多个仪器。仪器包括但不限于计数装置(如血细胞计数器)、磁体和移液管(如自动移液管)。

在一些实施方案中，所述制品还可包括一种或多种用于检测、选择、富集、分离、激活和/或刺激细胞的试剂。在一些实施方案中，这些试剂可包括颗粒(例如珠粒)，所述颗粒(例如珠粒)特异性结合细胞表面上的大分子以实现检测、选择、富集、分离、激活和/或刺激细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述颗粒与抗CD3和/或抗CD28抗体缀合。在一些实施方案中，所述颗粒可包括本文所述或本领域已知的任何颗粒。

包装材料的实例可包括例如瓶子、管子、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶子或适于携带或容纳一种或多种裂解溶液的任何包装材料。通常，所述包装是与裂解溶液或缓冲液不反应的包装。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。在一些实施方案中，所述容器具有无菌入口。

所述制品或试剂盒可进一步包括包装插页，其具有用于计数胞组合物中非细胞颗粒或检测细胞组合物中非细胞颗粒的存在或不存在的说明书。在容器上或与容器相关联的标签或包装插页可指示用于重构和/或使用根据本公开的试剂、裂解溶液、材料和/或仪器的用法说明。所述标签或包装插页可进一步指示所述裂解溶液、试剂和/或材料可用于(例如)根据本公开计数供治疗(如过继细胞疗法)使用的细胞组合物中非细胞颗粒或检测供治疗(如过继细胞疗法)使用的细胞组合物中非细胞颗粒的存在或不存在。

V.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有术语、符号和其他技术和科学术语或术语旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，本文定义了具有通常理解的含义的术语，包括下文，为了清楚和/或为了便于参考，并且本文中包含的这些定义不应被解释为代表与本领域通常理解的实质性差异。

贯穿本公开内容，所要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对要求保护的主题的范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，且还包括在要求保护的主题内，受所规定范围内的任何特别排除的限制。在所规定范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题中。无论所述范围的幅度如何，这都适用

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述了)涉及该值或参数本身的实施方案。在一些实施方案中，“约”是指所述值或参数的±50％、±40％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％的范围。

如本文所述，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“(the)所述”包括复数指示物。例如，“一(a)”或“一(an)”表示“至少一个”或“一个或多个”。应理解，本文所述的方面、实施方案和变化包括“包含”方面、实施方案和变化，“由和/或基本上由方面、实施方案和变化组成”。

如本文所用，“细胞组合物”是指两个或以上产物的任何混合物，包括细胞。在一些情况下，这种组合物中还可包括非细胞颗粒(如珠粒)。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性溶液、非水性溶液或其任何组合物。

术语“包装插页”指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、组合治疗、禁忌症和/或涉及使用此类治疗产品的警告的信息。

本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)，出于所有目的通过提述以其整体并入，其程度如同每个单独的出版物通过提述单独并入。如果本文所述的定义与通过提述并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中所述的定义相反或不一致，则本文所述的定义优先于通过提述并入本文的定义。

本文使用的章节标题仅用于编制的目的，不应解释为限制所述的主题。

VI.示例性实施方案

本文提供的实施方案中包括：

1.一种用于计数细胞组合物中的颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中所述一次或多次温育包括在足以诱导渗透压裂解样品中的一个或多个细胞的条件下温育包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品；和

b)确定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。

2.实施方案1的方法，其中所述足以诱导渗透压裂解的条件包括使所述样品与低渗溶液接触。

3.实施方案1或实施方案2的方法，其中在足以诱导渗透压裂解的条件下的温育产生裂解的细胞组合物，且步骤a)中的一次或多次温育进一步包括使所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的组合物与高渗溶液温育。

4.一种用于计数细胞组合物中的颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括：

i)在足以诱导渗透压裂解样品中的一个或多个细胞的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液或高渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物，和

ii)使至少一部分的所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与所述低渗溶液或所述高渗溶液中的另一个温育；和

b)确定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。

5.一种计数细胞组合物中的颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的一次或多次温育包括：

i)在足以诱导裂解样品中一个或多个细胞的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物，和

ii)使至少一部分裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与高渗溶液温育；和

b)确定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。

6.实施方案1-5中任一项的方法，其中：

所述细胞组合物包含或被怀疑包含一个或多个与所述细胞组合物中一个或多个细胞表面结合的颗粒；

所述细胞组合物包含或被怀疑包含残留颗粒；

所述细胞组合物源自含有与一个或多个所述颗粒结合的细胞的组合物；和/或

所述细胞组合物源自从输入组合物中去除颗粒。

7.实施方案中1-6中任一项的方法，其中所述细胞组合物由包括以下的方法产生：

(1)使细胞群与一个或多个所述颗粒混合，从而产生输入组合物；和

(2)从所述输入组合物中的细胞中去除一个或多个所述颗粒，从而产生所述细胞组合物。

8.实施方案7的方法，其中所述一个或多个所述颗粒能够结合所述群中的一个或多个细胞。

9.实施方案1-8中任一项的方法，其中所述颗粒是珠粒。

10.实施方案1-9中任一项的方法，其中步骤a)中的一次或多次温育从所述输出组合物中减少或去除细胞碎片。

11.实施方案1-10中任一项的方法，其中步骤a)进一步包含冲洗或洗涤所述输出组合物。

12.实施方案11的方法，其中冲洗或洗涤所述输出组合物包括使所述颗粒沉淀并去除一定体积的所述输出组合物或减少所述输出组合物的体积。

13.实施方案12的方法，其包括减少所述输出组合物的体积至在步骤a)的一次或多次温育之前的所述样品的大约相同体积。

14.实施方案12的方法，其包括将所述输出组合物的体积减少小于100％但大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。

15.实施方案中1-14中任一项的方法，其中一个或多个所述颗粒包含能够与所述细胞组合物中细胞的表面上的大分子结合的生物分子。

16.实施方案15的方法，其中所述生物分子是抗体或其抗原结合片段。

17.实施方案2-16中任一项的方法，其中所述低渗溶液具有小于270mOsm/L的渗透压。

18.实施方案2-17中任一项的方法，其中：

所述低渗溶液具有介于或介于约0mOsm/L和270mOsm/L之间、50mOsm/L和200mOsm/L之间或10mOsm/L和100mOsm/L之间的渗透压；或

所述低渗溶液具有小于或小于约250mOsm/L、200mOsm/L、150mOsm/L、100mOsm/L、50mOsm/L、10mOsm/L或更低的渗透压。

19.实施方案2-18中任一项的方法，其中：

所述低渗溶液包含介于或介于约0mM和140mM之间的溶质浓度；或

所述低渗溶液包含小于或约小于140mM、小于或约小于100mM、小于或约小于50mM或者小于或约小于10mM的溶质浓度。

20.实施方案2-19中任一项的方法，其中：

所述低渗溶液包含介于或介于约0％和0.8％之间或0％和0.5％之间的溶质的重量对体积百分比(％w/v)；或

所述低渗溶液包含小于或约小于0.8％、小于或约小于0.6％、小于或约小于0.4％、或者小于或约小于0.2％的溶质的％w/v。

21.实施方案2-20中任一项的方法，其中所述低渗溶液无溶质。

22.实施方案2-21中任一项的方法，其中所述低渗溶液是注射用无菌水。

23.实施方案3-22中任一项的方法，其中所述高渗溶液具有大于300mOsm/L的渗透压。

24.实施方案3-23中任一项的方法，其中：

所述高渗溶液具有大于或约300mOsm/L、大于或约400mOsm/L、大于或约800mOsm/L、大于或约1200mOsm/L、大于或约1500mOsm/L、大于或约2000mOsm/L、大于或约2500mOsm/L、大于或约3000mOsm/L、或者大于或约4000mOsm/L的渗透压；或

所述高渗溶液具有介于或约介于300mOsm/L和5000mOsm/L之间、1000和5000mOsm/L之间、或1000和3000mOsm/L之间的渗透压。

25.实施方案3-24中任一项的方法，其中：

所述高渗溶液具有大于或约200mM、大于或大于约400mM、大于或大于约600mM、大于或大于约800mM、大于或大于约1000mM、大于或大于约2000mM；或大于或大于约5000mM的溶质浓度；或

所述高渗溶液具有介于或介于约200mM和5000mM之间、500mM和2000mM之间、或1000mM和2000mM之间的溶质浓度。

26.实施方案3-25中任一项的方法，其中：

所述高渗溶液包含介于或介于约1.5％和15％之间、或2.5％和12％之间的溶质的重量对体积百分比(％w/v)；或

所述高渗溶液包含大于或约大于1.5％、大于或约大于3.0％、大于或约大于6.0％或大于或约大于8.0％、或者大于或约大于10.0％的溶质的％w/v。

27.实施方案3-26中任一项的方法，其中所述高渗溶液包含溶质，所述溶质为NaCl。

28.实施方案1-27中任一项的方法，其中所述细胞组合物的浓度为至少或至少约2x 10⁵个细胞/mL、至少或至少约5x 10⁵个细胞/mL、至少或至少约1x 10⁶个细胞/mL、至少或至少约5x 10⁶个细胞/mL、或者至少或至少约1x 10⁷个细胞/mL。

29.实施方案1-28中任一项的方法，其中：

所述细胞组合物的体积为或约为0.2mL至50mL、0.2mL至20mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、或者0.75mL至1.5mL；或

所述细胞组合物的体积为至少或至少约0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL或20mL、50mL或更多。

30.实施方案1-29中任一项的方法，其中一个或多个所述颗粒具有或包含直径大于0.001μm、大于0.01μm、大于0.1μm、大于1.0μm、大于10μm、大于50μm、大于100μm或大于1000μm的颗粒。

31.实施方案1-30中任一项的方法，其中一个或多个所述颗粒具有或包含直径为1.0μm至500μm、1.0μm至150μm、1.0μm至30μm、1.0μm至10μm、或1.0μm至5.0μm的颗粒。

32.实施方案1-31中任一项的方法，其中一个或多个所述颗粒具有或包含具有与所述细胞组合物中的细胞的平均直径基本相同或者大于或小于所述细胞组合物中的细胞的平均直径的1.5倍以内的直径的颗粒。

33.实施方案1-32中任一项的方法，其中一个或多个颗粒是磁性的和/或一个或多个所述颗粒包含磁芯、顺磁芯或超顺磁芯。

34.实施方案33的方法，其中所述磁芯选自金属氧化物、铁氧体、金属、赤铁矿、金属合金及其组合之中。

35.实施方案1-34中任一项的方法，其中一个或多个所述颗粒包含铁氧化物芯。

36.实施方案33-35中任一项的方法，其中所述磁芯包含包衣。

37.实施方案36的方法，其中所述包衣防护、减少或防止磁芯氧化。

38.实施方案36或实施方案37的方法，其中所述包衣包含聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、碳或其组合。

39.实施方案36-37中任一项的方法，其中所述聚合物、所述多糖、所述二氧化硅、所述脂肪酸、所述碳或其组合是可生物降解的。

40.实施方案38或实施方案39的方法，其中所述多糖是壳聚糖、琼脂糖、淀粉、葡聚糖、葡聚糖衍生物或其组合。

41.实施方案38或实施方案39的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇、聚(乳酸-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯和聚乙烯醇或其组合。

42.实施方案1-41中任一项的方法，其中所述细胞具有介于或约介于10μm和30μm之间的直径。

43.实施方案1-42中任一项的方法，其中所述细胞是动物细胞或所述细胞组合物包含动物细胞。

44.实施方案1-43中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞或所述细胞组合物包含人细胞。

45.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述细胞是干细胞或所述细胞组合物包含干细胞。

46.实施方案45的方法，其中所述干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。

47.实施方案1-46中任一项的方法，其中所述细胞是免疫细胞或所述细胞组合物包含免疫细胞。

48.实施方案47的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。

49.实施方案1-48中任一项的方法，其中所述细胞组合物已与一个或多个所述颗粒混合，其中所述颗粒包含刺激剂，以在步骤a)中的一次或多次温育之前实现刺激和/或激活所述细胞组合物中的细胞。

50.实施方案49的方法，其中所述细胞是T细胞，且所述刺激剂是抗CD3抗体和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段。

51.实施方案50的方法，其中所述细胞是抗原递呈细胞，且所述刺激剂是抗CD8抗体和/或抗CD86抗体或其抗原结合片段。

52.实施方案1-51中任一项的方法，其中所述细胞组合物已与一个或多个所述颗粒混合，其中所述颗粒包含亲和试剂，以在步骤a)中的一次或多次温育之前实现分离或富集所述细胞组合物中的细胞。

53.实施方案52的方法，其中所述亲和试剂包含与所述细胞组合物中一个或多个细胞上的细胞表面蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

54.实施方案53的方法，其中所述细胞表面蛋白选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(如Delta-样1/4、锯齿状1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3之中。

55.实施方案1-54中任一项的方法，其中：

所述一次或多次温育持续至少或至少约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟或30分钟；或

所述一次或多次温育为或约为30秒至30分钟、1分钟至20分钟、1分钟至10分钟、或1分钟至5分钟。

56.实施方案2-55中任一项的方法，其中：

所述低渗和/或高渗溶液的体积为至少或至少约1mL、3mL、9mL、12mL、15mL、18mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL或更多；或

所述低渗和/或高渗溶液的体积为或约为1mL至50mL、2mL至30mL、5mL至25mL或10mL至20mL。

57.实施方案1-56中任一项的方法，其中所述方法不破坏所述颗粒的表面或所述颗粒表面上的包衣或不去除附接至所述颗粒表面的生物分子。

58.实施方案1-57中任一项的方法，其中步骤b)中的确定包括手动计数、电子粒子计数、基于亲和力的检测、显微镜检查、流式细胞术或磁性细胞分选。

59.实施方案1-58中任一项的方法，其中步骤b)中的确定包括检测存在于所述颗粒的表面、与所述颗粒的表面相关联或附接的一种或多种材料或生物分子，任选地使用与所述材料或生物分子特异性结合的结合剂。

60.实施方案59的方法，其中所述颗粒包含包衣，并且所述包衣包含所述材料。

61.实施方案59或实施方案60的方法，其中所述材料是多糖。

62.实施方案61的方法，其中所述材料是葡聚糖和/或所述结合剂是抗葡聚糖抗体。

63.实施方案59的方法，其中所述生物分子是附接至所述颗粒表面的针对细胞表面蛋白的抗体或抗原结合片段，其任选是抗CD3或抗CD28抗体。

64.一种计数细胞组合物中的颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)进行一次或多次温育，从而产生输出组合物，其中所述一次或多次温育包括在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件下温育包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品；且

b)使用与存在于所述颗粒上、与所述颗粒相关联或附接的材料、部分或生物分子特异性结合的结合剂确定所述输出组合物中颗粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的颗粒或检测所述细胞组合物中颗粒的存在或不存在。

65.实施方案64的方法，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。

66.实施方案64或实施方案65的方法，其中所述颗粒包含包含所述材料的包衣。

67.实施方案64-66中任一项的方法，其中所述材料是多糖。

68.实施方案64-67中任一项的方法，其中所述材料是葡聚糖，并且/或所述结合剂是抗葡聚糖抗体。

69.实施方案64或实施方案65的方法，其中所述生物分子是附接至所述颗粒表面的抗细胞表面蛋白的抗体或抗原结合片段，其任选是抗CD3抗体或抗CD28抗体。

70.实施方案69的方法，其中所述结合剂是抗所述生物分子的抗独特型抗体或抗同种型抗体。

71.实施方案64-70中任一项的方法，其中所述一次或多次温育诱导所述样品中一个或多个细胞的渗透压细胞裂解。

72.实施方案62-71中任一项的方法，其中所述一次或多次温育包含使所述样品与低渗溶液温育。

73.实施方案72的方法，其中所述一次或多次温育进一步包括使所述样品与高渗溶液温育。

74.实施方案64-73中任一项的方法，其中所述确定包括用于检测一个或多个包含所述包衣的颗粒的荧光激活细胞分选术(FACS)。

75.实施方案1-74中任一项的方法，其中步骤a)中的一次或多次温育在约15℃至30℃、18℃至28℃或20℃至25℃的温度进行。

76.实施方案1-75中任一项的方法，其中步骤a)中的一次或多次温育在约23℃的温度进行。

77.一种制品，其包含：

容器，其包含用于实现渗透压细胞裂解的溶液；

包装材料；和

标签或包装插页，其包含用于计数细胞组合物中的颗粒或检测细胞组合物中颗粒的存在或不存在的说明书。

78.实施方案77的制品，其中所述用于实现渗透压细胞裂解的溶液是低渗溶液。

79.实施方案77或实施方案78的制品，其进一步包含包含高渗溶液的容器。

80.实施方案77-79中任一项的制品，其进一步包含用于检测或鉴定颗粒的仪器或试剂。

81.实施方案80的制品，其中所述仪器或试剂包含血细胞计数器。

82.实施方案80的制品，其中所述仪器或试剂包含对所述颗粒的表面上的材料、部分或生物分子特异的结合剂。

83.实施方案82的制品，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。

84.实施方案82或实施方案83的制品，其中所述颗粒包含包含所述材料的包衣。

85.实施方案84的制品，其中所述材料是多糖。

86.实施方案82-85中任一项的制品，其中所述材料是葡聚糖，并且/或所述结合剂是抗葡聚糖抗体。

87.实施方案82或实施方案83的制品，其中所述生物分子是附接至所述颗粒表面的针对细胞表面蛋白的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段任选是抗CD3抗体或抗CD28抗体。

88.实施方案87的制品，其中所述结合剂是针对所述生物分子的抗独特性抗体或抗同种型抗体。

89.实施方案82-88中任一项的制品，其中所述结合剂是荧光标记的。

VII.实施例

本文包括以下实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例1：使用漂白剂的细胞裂解和残留珠子的计数

在本实施例中，使用流式细胞术从组合物中的T细胞检测珠粒的存在。通过基于亲和力的选择从获自健康供体的人PBMC样品中分离原代人T细胞。将所述T细胞与偶联有抗体试剂(例如不同比例的抗CD28抗体(同种型小鼠IgG1)、抗CD3抗体(同种型小鼠IgG2a)和抗生物素抗体(如

GMP ExpAct珠))的珠粒(如MACSiBeadTM；MiltenyiBiotec)混合。示例性珠粒是直径约为3.5μm的二氧化硅色谱微珠，并含有胶体铁和葡聚糖微珠的顺磁内芯，其中所述内芯用二氧化硅、聚氨酯和氨基-葡聚糖层包被。所述包衣与抗CD28和抗生物素抗体连接，且通过生物素和抗生物素抗体之间的相互作用，所述颗粒进一步负载生物素化的抗CD3抗体。

含有与所述珠粒混合的细胞的组合物用漂白剂处理或不经处理。为了检测组合物中的颗粒，用荧光标记的抗小鼠IgG1抗体、荧光标记的抗小鼠IgG2a抗体和荧光标记的抗葡聚糖抗体对样品染色，以通过流式细胞术进行评估。结果显示检测到未经漂白剂处理的组合物中葡聚糖(图1B)、IgG1(图1C)和IgG2a(图1C)阳性的颗粒(图1A)。然而，经漂白剂处理的组合物中，观察到颗粒计数事件数量的显著减少(图1D)。与未漂白的样品(图1B)相比，在漂白的样品中观察到的葡聚糖阳性的事件数量显著降低(图1E)，并且IgG1和IgG2a染色(图1F)几乎未检测到。这些结果显示漂白剂损伤颗粒和/或使所述颗粒表面上的抗CD3抗体(IgG2a同种型)和抗CD28抗体(IgG1同种型)变性。

实施例2：用于细胞样品中残留珠子计数的细胞裂解的方法

再进一步的示例性方法中，实施细胞裂解方法以从不损伤珠粒的这类溶液中去除细胞，从而允许精确的珠子计数。所述方法涉及使用低渗和高渗溶液以渗透压诱导裂解已在珠粒的存在下经温育的细胞组合物，从混合了珠子和细胞的溶液中去除残留细胞碎片以及对所述存在于样品中的珠粒计数。

制备含有已与珠粒温育或混合的细胞的细胞组合物(在一些情况中，其称为混合珠子的细胞组合物)。在示例性实施方案中，通过使细胞(例如T细胞)与偶联有抗体试剂(例如抗CD28抗体和抗CD3抗体)的珠粒(如

GMP ExpAct beads；MiltenyiBiotec)温育或混合来制备所述混合珠子的细胞组合物。在示例性方法中，珠粒含有胶体铁的顺磁内芯和葡聚糖微珠，其中该内芯由二氧化硅、聚氨酯和氨基葡聚糖层包被。温育后，使用磁性去除步骤从所述群中的细胞中去除所述珠粒。来自所得的混合珠子的细胞组合物(其可能含有与所述细胞表面结合的残留珠粒)中的样品被保留用于珠粒计数(在一些情况中，称为“测试细胞组合物”，其可以是“残留珠子的细胞”)。在一些情况中，任选地，在计数珠粒之前，保留的测试细胞组合物在含有二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保藏溶液中冷冻保藏。

保留1mL测试细胞组合物的样品并评估样品中珠粒的存在或数量。在保留的测试细胞组合物被冷冻保藏的实施方案中，在细胞裂解之前，洗涤所述样品以去除含有DMSO的冷冻保藏溶液。在保留的测试细胞组合物未被冷冻保藏的实施方案中，在细胞裂解之前，洗涤所述样品。关于洗涤，通过向50mL管添加45mL含有0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸缓冲盐的封闭溶液并在旋转器上以每分钟10转的速度在37℃温育该管32分钟来制备样品管。将1mL保留的测试细胞组合物加入到含有所述封闭溶液的管中，并通过倒置五次将所得溶液混合。随后将该溶液以500x g离心5分钟，吸出上清液直至仅剩下1mL样品。将样品涡旋三次约5秒，每次以3000rpm的速度，在每个涡旋步骤之间具有约2秒的静止时间。

对于低渗溶液中的细胞裂解，将约18mL注射用水加入到1mL体积的经洗涤或不含冷冻剂的测试细胞组合物中。为了混合所述细胞和低渗溶液，将所述样品涡旋约5次约10秒，每次以3000rpm的速度，在每个涡旋步骤之间具有约2秒的静止时间。混合的低渗细胞样品在室温温育约5分钟以诱导细胞裂解。

低渗温育后，向低渗细胞样品中加入约12mL的5M NaCl以得到高渗溶液。通过涡旋5次约10秒，每次以约3000rpm的速度，在每个涡旋步骤之间具有约2秒的静止时间来混合高渗细胞样品，然后在室温温育高渗细胞样品约5分钟。温育后，将样品以约500x g离心5分钟，吸出上清液使得剩下约1mL至2mL样品的体积。将所述样品再次以约500x g离心1分钟，去除上清液直至仅剩下约1mL样品(本文也称为“最终样品体积”)。高渗温育和冲洗用于去除和洗去低渗裂解期间产生的细胞碎片。

对于残留珠子的计数，将制备的样品以约3000rpm的速度涡旋约20秒。涡旋后，通过带有移液枪头的移液器从管底部收集的液体中收集大约115μL样品，所述移液枪头已经用封闭溶液(0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸缓冲盐)预洗涤。将115μL样品加载到HausserNageotte Bright-Line^TM血细胞计数器室上。将经上样的细胞计数器置于有盖的培养皿中，并允许其在室温温育约25分钟。温育后，用Nikon Eclipse Ci-L显微镜上的20倍物镜和相差聚光环观察该血球计数器。对在血细胞计数器网格的40个矩形中可见的珠粒(包括接触矩形线的珠粒)计数以获得“珠粒计数”。观察到的珠粒是均匀球形的，具有光滑的没有锯齿状边缘或角落的黑色轮廓，和/或具有明亮的白色中心。总共对115μL样品三次重复计数。

鉴于HausserNageotte Bright-Line^TM血细胞计数器的40个矩形总共容纳50μL液体，所以依照以下计算残留珠细胞组合物中的珠粒的数量：

计算每μL测试细胞组合物的珠粒数量(珠子/μL)：珠子数量÷50μL；

计算测试细胞组合物中总珠粒的数量(珠子/样品)：珠子/μL x最终剩下的样品体积(如1ml)。

假设剩下的测试组合物具有1mL的体积，则珠子/样品与珠子/mL的原始混合的珠子-细胞组合物相同。

在一些实施方案中，可以根据至少三个重复样品计算每个测试细胞组合物的总珠粒的平均值、标准偏差和变异系数(100x(标准偏差/平均值))。

本方法得到从裂解的细胞中分离的未损坏的珠粒的计数，从而得到用于精确评估混合细胞和珠子的组合物中残留珠粒的数量的改进方法。

实施例3：细胞裂解方法和通过血细胞计数器的残留珠子的计数

评估了经受细胞裂解方法的样品中珠粒的数量对精确珠粒计数的影响。

材料和方法

样品

将一系列样品以一式三份制备，其含有约10x 10⁶个表达CAR的T细胞，所述T细胞预先用包含与抗CD3和抗CD28抗体(例如，MACP GMP ExpAct珠子；MiltenyiBiotec)连接的珠子的试剂刺激并且去珠以去除残留的珠粒。以每mL样品中250、500、1000或2000个与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠粒掺入所述去珠样品。

使用50mL聚丙烯管的细胞裂解方法

通常使用如实施例2中所述的细胞裂解方法处理各样品。简而言之，通过向50mL聚丙烯管加入含有0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐的封闭溶液来制备样品管，并将该管在旋转器上以每分钟10转的速度在37℃温育32分钟。将1mL上述制备的样品加入到含有所述封闭溶液的管中，并通过倒置五次将所得溶液混合。如实施例2中所述进行其余步骤。

通过血细胞计数器的珠子计数

对于珠子计数，将最终样品体积以约3000rpm的速度涡旋约20秒。涡旋后，通过带有移液枪头的移液器从管底部收集的液体中收集大约115μL样品，所述移液枪头已经用封闭溶液(0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸缓冲盐)预洗涤。将115μL样品加载到HausserNageotte Bright-Line^TM血细胞计数器室上。将经上样的细胞计数器置于有盖的培养皿中，并允许其在室温温育约25分钟。温育后，用Nikon Eclipse Ci-L显微镜上的20倍物镜和相差聚光环观察该血球计数器。对在血细胞计数器网格的40个矩形中可见的珠粒(包括接触矩形线的珠粒)计数以获得“珠粒计数”。观察到的珠粒是均匀球形的，具有光滑的没有锯齿状边缘或角落的黑色轮廓，和/或具有明亮的白色中心。总共对115μL样品三次重复计数。

鉴于HausserNageotte Bright-Line^TM血细胞计数器的40个矩形总共容纳50μL液体，所以依照以下计算所述样品中珠粒的数量：

计算每μL所述样品的珠粒数量(珠子/μL)：珠子数量÷50μL；

计算所述样品中总珠粒的数量(珠子/样品)：珠子/μL x最终剩下的样品体积(如1ml)。

计算每份样品的总珠粒数量的平均值、标准偏差和变异系数(100x(标准偏差/平均值))。

结果

通过如上所述的血细胞计数器计算的样品中珠粒的数量与样品中相应的预期珠粒数量进行比较。这些数据显示，测试的掺入数量为每mL中250和2000个珠子之间的珠子计数是线性的(图2)。

上述方法在多天内重复进行(例如2个样品一式三份，一个操作者在两天内进行，一天1个样品或1个操作者在3天内评估2个样品)，并且由多个操作员进行(例如3个操作员各评估2个样品)以评估所述方法的操作间、日间和组内变异性。当珠子量落入250个珠子/mL至2000个珠子/mL的线性范围内时，测定组内、操作间和日间变异性在可接受的限度内。

实施例4：细胞裂解方法和精确计数残留珠子

评估了经受细胞裂解方法的样品中珠粒的数量对精确珠粒计数的影响。

材料和方法

样品

一系列仅珠子的样品(称为“仅珠子”样品)以一式两份制备，其包含500、750、1000或1500个先前描述的与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠粒(例如

GMP ExpAct珠子；MiltenyiBiotec)。第二系列样品以一式三份制备，其包含约10x 10⁶个表达CAR的T细胞，所述T细胞预先用包含与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠子的试剂刺激并去珠以去除残留的珠粒。将所述去珠的样品掺入0、500、750、1000或1500个与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠粒。在制备所述系列期间，将所述样品稀释在0.2％人血清白蛋白溶液或2M NaCl中。

使用50mL聚丙烯管的细胞裂解方法

使用如实施例2中所述的细胞裂解方法处理各样品。简而言之，通过向50mL聚丙烯管加入45mL的含有0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐的封闭溶液来制备样品管，并将该管在旋转器上以每分钟10转的速度在37℃温育32分钟。将1mL上述制备的样品加入到含有所述封闭溶液的管中，并通过倒置五次将所得溶液混合。如实施例2中所述进行其余步骤。

通过血细胞计数器的珠子计数

如上文实施例3中所述的进行经由两个血细胞计数器的珠子计数。

通过流式细胞术的珠子计数

对于通过流式细胞术的珠子计数，将约140μL所述样品加入到TruCount^TM管(BDBiosciences)，所述TruCount^TM管含有已知数量的荧光的TruCount^TM珠子。将约20μL的含有12.5％标准小鼠血清的封闭溶液加入到所述TruCount^TM管中，且将该溶液在室温温育5分钟。在与封闭溶液温育后，将约40μL FITC标记的抗葡聚糖抗体加入到所述管中以达到1:40的最终稀释。然后，将该管在室温温育25分钟。在与所述抗葡聚糖抗体温育后，将约360μL的封闭溶液(0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸缓冲盐)加入到各个管中以达到约560μL的最终样品体积。然后，在流式细胞仪上获取所述样品，直至计数了约25至30,000个TruCount事件的目标。通过比较葡聚糖事件的数量与TruCount珠子事件来确定样品中葡聚糖染色的珠子的绝对数量(珠子/μL)。

结果

计数的珠粒相对于掺入样品中的珠粒的实际数量的百分比是在仅含珠粒的系列中和含有与珠粒混合的细胞的系列中计算的。

在仅含珠粒系列中，珠粒的计数在血细胞计数器和流式细胞术珠子检测方法之间是相当的(图3)。如通过血细胞计数器评估的，在0.2％人血清白蛋白(HSA)和2M NaCl中稀释的样品中珠子计数的精确度是一致的(图3)。总体而言，无论是通过血细胞计数器还是流式细胞术检测且无论样品稀释剂如何，来自仅含珠子样品中的珠粒的计数在整个系列中是相当的(图3)。

在与细胞混合的珠粒系列中，珠粒的计数在血细胞计数器和流式细胞术珠子检测方法之间是相当的(图4)。总体而言，无论是通过血细胞计数器还是流式细胞术检测且无论所述样品中珠粒的数量如何，来自含有与细胞混合的珠子的样品中的珠粒的计数在整个系列中是相当的(图4)。

总之，这些结果表明，含有或不含有细胞的样品中珠粒的数量或载荷不会影响通过血细胞计数器或流式细胞术一致地计数珠粒的能力。

实施例5：珠子类型、细胞裂解方法和残留珠子计数

测定经三个不同去珠过程的细胞样品中残留珠粒的数量。

材料和方法

样品

一式三份制备两个对照样品：1)具有4x 10⁶个表达CAR的T细胞的对照样品，所述T细胞预先用包含与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠粒的试剂刺激；和2)具有4x 10⁶个表达CAR的T细胞的对照样品，所述T细胞预先用包含与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠粒的试剂刺激，所述抗CD3和抗CD28抗体与500个前述珠粒混合。一式三份制备三个含有3.8x 10⁶个表达CAR的T细胞的测试样品，所述T细胞预先用包含与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠粒的试剂刺激：1)用

系统(MiltenyiBiotec)去珠的测试样品；2)用DynaMag^TM CTSTM磁体(Gibco)去珠的测试样品；和3)使用DynaMag^TM CTS^TM磁体(Gibco)用经改进的方案去珠的测试样品，其中通过在磁体上的来源袋和磁体板上的捕获袋之间放置管，将排出流速控制在每分钟10mL至20mL(本文中称为“经改进的DynaMag去珠过程”)。

使用50mL聚丙烯管的细胞裂解方法

使用如实施例2中所述的细胞裂解方法处理各样品。简而言之，通过向50mL聚丙烯管加入45mL的含有0.2％人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐的封闭溶液来制备样品管，并将该管在旋转器上以每分钟10转的速度在37℃温育32分钟。将1mL上述制备的样品加入到含有所述封闭溶液的管中，并通过倒置五次将所得溶液混合。如实施例2中所述进行其余步骤。

通过血细胞计数器的珠子计数

如上文实施例3中所述进行经由两个血细胞计数器的珠子计数。

结果

计算对照样品中每mL珠粒的数量，并确定了对照中珠子损失约为25％。去珠的测试样品中的珠粒的数量相对于对照样品中25％的珠粒损失归一化。与改进的DynaMag去珠工艺相比，使用DynaMag^TM CTS^TM磁体去珠的残留珠粒数量增加了3倍(表1)。与其他两种方法的去珠相比，使用

系统去珠产生更少的残留珠粒(表1)。

表1.残留珠子计数

本发明不旨在限制具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案(例如)用于说明本发明的各个方面。根据本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实践这些修改，并且这些修改旨在落入本公开的范围内。

Claims (83)

1.一种计数细胞组合物中的珠粒或检测细胞组合物中珠粒的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：

a)进行两次或更多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的所述两次或更多次温育包括：

i)在足以诱导裂解样品中的一个或多个细胞的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物，和

ii)使至少一部分所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与高渗溶液温育；和

b)测定所述输出组合物中珠粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的珠粒或检测所述细胞组合物中珠粒的存在或不存在。

2.一种用于计数细胞组合物中的珠粒或检测细胞组合物中珠粒的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步骤：

a)进行两次或更多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的所述两次或更多次温育包括：

i)在足以诱导裂解样品中的一个或多个细胞的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液或高渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物，和

ii)将至少一部分所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与所述低渗溶液或所述高渗溶液中的另一个温育；和

b)测定所述输出组合物中珠粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的珠粒或检测所述细胞组合物中珠粒的存在或不存在。

3.一种计数细胞组合物中的珠粒或检测细胞组合物中珠粒的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)进行两次或更多次温育，从而产生输出组合物，其中步骤a)中的所述两次或更多次温育包括：

i)在足以诱导样品中一个或多个细胞裂解的条件下使包含至少一部分细胞组合物的样品或源自所述细胞组合物的样品与低渗溶液温育，从而产生裂解的细胞组合物；和

ii)将至少一部分所述裂解的细胞组合物或源自所述裂解的细胞组合物的样品与高渗溶液温育；和

b)使用与存在于所述珠粒上或与所述珠粒相关联的材料特异性结合的结合剂测定所述输出组合物中珠粒的存在、不存在、数量和/或浓度，从而计数所述细胞组合物中的珠粒或检测所述细胞组合物中珠粒的存在或不存在。

4.权利要求3的方法，其中所述材料为生物分子。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物包含或被怀疑包含残留的珠粒。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物包含或被怀疑包含与所述细胞组合物中的一个或多个细胞的表面结合的一个或多个珠粒。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物源自含有与一个或多个所述珠粒结合的细胞的组合物。

8.权利要求5的方法，其中所述细胞组合物通过以下方法产生，所述方法包括：

(1)使细胞群与一个或多个所述珠粒混合，从而产生输入组合物；和

(2)从所述输入组合物中的细胞中去除一个或多个所述珠粒，从而产生所述细胞组合物。

9.权利要求8的方法，其中一个或多个所述珠粒能够结合所述群中的一个或多个细胞。

10.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a)中的两次或更多次温育从所述输出组合物中减少或去除细胞碎片。

11.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a)进一步包括冲洗或洗涤所述输出组合物。

12.权利要求11的方法，其中冲洗或洗涤所述输出组合物包括使所述珠粒沉淀并去除一定体积的所述输出组合物或减少所述输出组合物的体积。

13.权利要求12的方法，其包括减少所述输出组合物的体积至在步骤a)的两次或更多次温育之前的所述样品的相同体积。

14.权利要求13的方法，其进一步包括将所述输出组合物的体积减少了小于100％但大于50％。

15.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒包含能够与所述细胞组合物中细胞的表面上的大分子结合的生物分子。

16.权利要求15的方法，其中所述生物分子是抗体或其抗原结合片段。

17.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液具有小于270mOsm/L的渗透压。

18.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液具有介于0mOsm/L和270mOsm/L之间的渗透压。

19.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液包含介于0mM和140mM之间的溶质浓度。

20.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液包含介于0％和0.8％的每体积的重量百分比(w/v)之间。

21.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液是无溶质的。

22.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液是注射用无菌水。

23.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述高渗溶液具有大于300mOsm/L的渗透压。

24.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述高渗溶液具有大于或为300mOsm/L。

25.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述高渗溶液具有浓度大于200mM的溶质。

26.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述高渗溶液包含介于1.5％和15％的每体积的重量百分比(w/v)之间的溶质。

27.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述高渗溶液包含溶质，所述溶质为NaCl。

28.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物的浓度为至少2x 10⁵个细胞/mL。

29.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物的体积为至少0.2mL。

30.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒具有或包含直径大于0.001μm的珠粒。

31.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒具有或包含直径为1.0μm至500μm的珠粒。

32.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒具有或包含具有与所述细胞组合物中的细胞的平均直径相同或者大于或小于所述细胞组合物中的细胞的平均直径的1.5倍以内的直径的珠粒。

33.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒是磁性的。

34.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒包含磁芯。

35.权利要求34的方法，其中所述磁芯为顺磁芯。

36.权利要求34的方法，其中所述磁芯为超顺磁芯。

37.权利要求34的方法，其中所述磁芯选自金属氧化物和金属中的一者或二者。

38.权利要求37的方法，其中所述磁芯是铁氧体或金属合金。

39.权利要求38的方法，其中所述磁芯是赤铁矿。

40.权利要求1-4中任一项的方法，其中一个或多个所述珠粒包含铁氧化物磁芯。

41.权利要求40的方法，其中所述磁芯包含包衣。

42.权利要求41的方法，其中所述包衣防护或减少磁芯氧化。

43.权利要求41的方法，其中所述包衣包含聚合物、二氧化硅和碳之一或多者。

44.权利要求43的方法，其中所述聚合物为多糖或脂肪酸。

45.权利要求43的方法，其中所述聚合物、所述二氧化硅和所述碳之一或多者是可生物降解的。

46.权利要求44的方法，其中所述多糖是壳聚糖、琼脂糖、淀粉、葡聚糖和葡聚糖衍生物之一或多者。

47.权利要求43的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇、聚(乳酸-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯和聚乙烯醇之一或多者。

48.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞具有介于10μm和30μm之间的直径。

49.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞是动物细胞，或所述细胞组合物包含动物细胞。

50.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞是人细胞，或所述细胞组合物包含人细胞。

51.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞是干细胞，或所述细胞组合物包含干细胞。

52.权利要求51的方法，其中所述干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。

53.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞是免疫细胞，或所述细胞组合物包含免疫细胞。

54.权利要求53的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。

55.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物已与一个或多个所述珠粒混合，其中所述珠粒包含刺激剂，以在步骤a)中的两次或更多次温育之前实现刺激和/或激活所述细胞组合物中的细胞。

56.权利要求55的方法，其中所述细胞是T细胞，且所述刺激剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段。

57.权利要求55的方法，其中所述细胞是T细胞，且所述刺激剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段。

58.权利要求55的方法，其中所述细胞是抗原递呈细胞，且所述刺激剂是抗CD80抗体或其抗原结合片段。

59.权利要求55的方法，其中所述细胞是抗原递呈细胞，且所述刺激剂是抗CD86抗体或其抗原结合片段。

60.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞组合物已与一个或多个所述珠粒混合，其中所述珠粒包含亲和试剂，以在步骤a)中的两次或更多次温育之前实现分离或富集所述细胞组合物中的细胞。

61.权利要求60的方法，其中所述亲和试剂包含与所述细胞组合物中一个或多个细胞上的细胞表面蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

62.权利要求61的方法，其中所述细胞表面蛋白选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3之中。

63.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述两次或更多次中的每次温育达至少30秒。

64.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述低渗溶液和/或高渗溶液的体积为至少1mL。

65.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述珠粒包含包衣，并且所述方法不破坏所述珠粒的表面或所述珠粒的表面上的包衣，或不去除与所述珠粒的表面附接的生物分子。

66.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤b)中的测定包括手动计数、电子粒子计数、显微镜检查、流式细胞术或磁性细胞分选术。

67.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤b)中的测定包括检测存在于所述珠粒的表面或与所述珠粒的表面相关联的一种或多种材料。

68.权利要求67的方法，其中所述一种或多种材料与所述珠粒的表面附接。

69.权利要求67的方法，其中检测所述一种或多种材料包括使用与所述材料特异性结合的结合剂。

70.权利要求67的方法，其中所述材料为生物分子。

71.权利要求67的方法，其中所述珠粒包含包衣，并且所述包衣包含所述材料。

72.权利要求69的方法，其中所述材料是多糖。

73.权利要求72的方法，其中所述材料是葡聚糖，并且所述结合剂是抗葡聚糖抗体。

74.权利要求70的方法，其中所述生物分子是附接至所述珠粒表面的针对细胞表面蛋白的抗体或抗原结合片段。

75.权利要求74的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是抗CD3或抗CD28抗体。

76.权利要求69的方法，其中所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。

77.权利要求69的方法，其中所述结合剂是针对所述生物分子的抗独特型抗体或抗同种型抗体。

78.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述两次或更多次温育诱导所述样品中一个或多个细胞的渗透压细胞裂解。

79.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述测定包括用于检测一个或多个所述珠粒的荧光激活细胞分选术(FACS)。

80.权利要求79所述的方法，其中一个或多个所述珠粒包含包衣。

81.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a)中的两次或更多次温育在15℃至30℃的温度进行。

82.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a)中的两次或更多次温育在23℃的温度进行。

83.权利要求3的方法，其中所述材料附接至所述珠粒。

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