ES2870538T3 - Antagonistas de gastrina (EG YF476, netazepida) para el tratamiento y la prevención de la osteoporosis - Google Patents

Abstract

Un agente dirigido a los receptores de gastrina para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un sujeto que lo necesita, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es YF476 y es para administrar al sujeto en por lo menos una dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz.

Description

DESCRIPCIÓN

Antagonistas de gastrina (EG YF476, netazepida) para el tratamiento y la prevención de la osteoporosis

CAMPO TÉCNICO

Las realizaciones provistas se basan, en algunos aspectos, en la demostración de este documento de una función de la gastrina en la regulación del eje intestino-ovario de sujetos de edad avanzada, y de los efectos de dirigirse a la actividad de la gastrina para revertir la pérdida ósea mediada por la gastrina. Se dan a conocer métodos, composiciones y agentes para el tratamiento de la osteoporosis.

ANTECEDENTES

La osteoporosis, caracterizada por pérdida ósea y alto riesgo de fracturas, es una de las enfermedades más frecuentes, particularmente en personas de edad avanzada, y se estima que afecta a aproximadamente 100 millones de personas de todo el mundo. A pesar de que la incidencia de las fracturas óseas en los ancianos en general está aumentando, las opciones son limitadas. Actualmente, los antirresortivos (p. ej., bisfosfonatos, denosumab, terapia hormonal) son los tratamientos más frecuentemente utilizados para la osteoporosis. Estos agentes están diseñados para ralentizar el remodelado óseo y aumentar la densidad ósea. No obstante, se han asociado con importantes efectos colaterales, entre ellos osteonecrosis de la mandíbula, fracturas atípicas, fibrilación auricular y aumento del riesgo de accidentes cerebrovasculares o cáncer. Se pueden usar agentes anabólicos para generar hueso nuevo en pacientes con osteoporosis. Sin embargo, ha sido un reto encontrar factores anabólicos que aumenten la masa ósea y regulen el equilibrio entre la formación mediada por osteoblastos y la adiposidad de la médula ósea. Además, el único agente anabólico comercial (teriparatida) no solamente es muy costoso y difícil de administrar, sino que además se asocia con efectos colaterales como hipotensión, náuseas, dolor, debilidad y depresión. Asimismo, se ha descubierto que en ratas el uso de teriparatida causa tumores malignos (carcinoma osteogénico). En general, las opciones terapéuticas para osteoporosis son limitadas, y es una prioridad el desarrollo de nuevos planteamientos terapéuticos que estimulen la formación ósea.

Si bien la insuficiencia ovárica y la desmineralización ósea están bien reconocidas como elementos clave en la osteoporosis, la etiología precisa sigue resuelta de manera parcial. Una mejor comprensión de la etiología de la osteoporosis y las enfermedades o afecciones óseas relacionadas puede promover nuevos métodos alternativos y composiciones para el tratamiento de la osteoporosis y otras enfermedades y afecciones óseas.

Existe la necesidad de métodos y composiciones para el tratamiento de la osteoporosis y otras enfermedades y afecciones óseas. La presente solicitud supera los problemas anteriormente mencionados y da a conocer un nuevo método para el tratamiento, la estabilización y/o la prevención de la progresión de una enfermedad o afección ósea, regulando los efectos de la gastrina.

COMPENDIO

La presente solicitud da a conocer métodos, usos, compuestos y composiciones para el tratamiento, p. ej., estabilización y/o prevención, p. ej., prevención de la progresión de una enfermedad o trastorno óseo a través de la administración de un agente a un sujeto que lo necesita. La enfermedad o el trastorno óseo se caracteriza por osteoporosis. En otras realizaciones, el agente administrado al sujeto que lo necesita se dirige a, p. ej., inhibe o antagoniza, la gastrina y/o los receptores de gastrina, como los antagonistas de gastrina o de los receptores de gastrina. De acuerdo con una realización, el agente administrado se dirige al receptor CCK2.

Las realizaciones provistas se refieren en algunos aspectos a la demostración de este documento de que la hormona gastrina regula directa o indirectamente la formación ósea, promoviendo así la pérdida ósea con una consecuente patofisiología consistente con alteraciones osteoporóticas (véase la Figura 57). Las realizaciones provistas se refieren en algunos aspectos a la demostración de este documento de que el bloqueo de dichos efectos de la gastrina, por ejemplo, usando un antagonista de gastrina que se dirija al receptor CCK2, tiene un efecto beneficioso en modelos animales de osteoporosis y por lo tanto es útil en el tratamiento, la prevención y la mejoría de la osteoporosis y otras enfermedades y afecciones óseas.

Por consiguiente, en algunas realizaciones se dan a conocer métodos, compuestos y usos de antagonistas de gastrina, p. ej., agentes que antagonizan la actividad de la gastrina, en enfermedades y afecciones, como aquellas clínicas, patológica o radiológicamente caracterizadas como osteoporosis. En algunos aspectos, los métodos y usos implican tratamiento, mejoría y/o prevención de enfermedades o afecciones, incluidas enfermedades y afecciones. Se dan a conocer métodos y composiciones para el tratamiento, la mejoría de enfermedades/afecciones óseas, p. ej., aquellas caracterizadas como osteoporosis, usando agentes que se dirigen a la gastrina y/o a los receptores de gastrina, p. ej., antagonistas de gastrina, por ejemplo, en i) personas mayores (hombres o mujeres), p. ej., pacientes geriátricos; ii) mujeres con disminución de la función ovárica o la insuficiencia de ésta, iii) personas con hipergastrinemia, incluidas aquellas con hipergastrinemia natural (p. ej., neoplásica o asociada con atrofia de la mucosa gástrica) y/o hipergastrinemia que ocurre como consecuencia del uso de farmacoterapia de supresores de ácido (p. ej., las clases de agentes como todos los inhibidores de bombas de protones o todos los antagonistas de dos receptores de histamina de corta o larga acción) y/o iv) individuos con gastrectomía parcial. En algunas realizaciones, el tratamiento, la mejoría y/o la prevención se lleva a cabo usando un agente dirigido a la gastrina, p. ej., un antagonista de gastrina, como un agente dirigido a la gastrina o a los receptores de gastrina, p. ej., un antagonista de gastrina o de los receptores de gastrina. El agente se dirige al receptor CCK2.

La presente invención da a conocer un agente dirigido a los receptores de gastrina para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un sujeto que lo necesita, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es el antagonista del receptor CCK2 selectivo YF476, y es para administración al sujeto en por lo menos una dosis en una cantidad terapéuticamente eficaz.

El agente es para uso en el tratamiento de la osteoporosis, p. ej., osteoporosis que se ha caracterizado clínica, patológica o radiológicamente. En algunos aspectos, el sujeto es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica. En otros aspectos, el sujeto: (a) es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica, y (b) presenta hipergastrinemia. En algunos aspectos, el sujeto: (a) es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica, (b) presenta hipergastrinemia, (c) se ha sometido a gastrectomía parcial. En algunos aspectos, el sujeto presenta hipergastrinemia natural, como hipergastrinemia que es hipergastrinemia neoplásica o hipergastrinemia asociada con farmacología supresora, como administración con un inhibidor de la bomba de protones o un antagonista de los receptores de histamina 2. En algunos aspectos, el tratamiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor de la bomba de protones o un antagonista de los receptores de histamina 2, simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, con el agente dirigido a gastrina o a los receptores de gastrina. En algunos aspectos, el tratamiento comprende además administrar otro tratamiento de la osteoporosis simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, con el agente.

En algunas realizaciones, el tratamiento comprende administrar al sujeto por lo menos una dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz del agente dirigido a los receptores de gastrina, tratando así la osteoporosis.

En otras realizaciones, el tratamiento incluye administrar dosis del agente dirigido a los receptores de gastrina por vía intravenosa.

En realizaciones adicionales, el tratamiento incluye administrar dosis del agente dirigido a los receptores de gastrina por vía oral.

En algunas realizaciones, el sujeto es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica. En otras realizaciones, el sujeto (a) es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica y (b) presenta hipergastrinemia. Se describe también un sujeto que (a) es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica, (b) presenta hipergastrinemia, (c) se ha sometido a gastrectomía parcial.

Incluso en otra realización, la hipergastrinemia es hipergastrinemia neoplásica o hipergastrinemia asociada con farmacología supresora de ácidos.

Otras descripciones incluyen administrar el agente dirigido a los receptores de gastrina selectivo con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la bomba de protones (PPI) o un antagonista de los receptores de histamina 2 (H2R), simultánea o secuencialmente, en cualquier orden.

En otras descripciones, el PPI es omeprazol y el antagonista de H2R es loxtidina.

En otras realizaciones, los métodos incluyen además administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente dirigido a los receptores de gastrina a 0,2-14 pg/kg de peso corporal del sujeto.

En realizaciones adicionales, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente dirigido a los receptores de gastrina es 10-25 nanomolares.

En algunas realizaciones, el agente dirigido a los receptores de gastrina se administra al sujeto por inyección subcutánea.

En realizaciones adicionales, el agente dirigido a los receptores de gastrina se administra al sujeto por inyección intravenosa.

En algunas realizaciones, el agente dirigido a los receptores de gastrina se administra por vía oral al sujeto en una dosis de comprimidos diaria de 20-100 mg.

Se dan a conocer también agentes y composiciones, p. ej., composiciones farmacéuticas, y kits para uso en los métodos provistos, como agentes y composiciones que comprenden los agentes dirigidos a gastrina y al receptor de gastrina, p. ej., antagonistas, y kits que contienen las mismas instrucciones para administración a dichos sujetos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un diagrama que muestra reguladores de remodelado óseo. La función ovárica (y la segregación de estrógeno) se asocia positivamente con mantenimiento óseo. Se cree que la vitamina D suplementa esto, pero si bien la baja vitamina D se asocia con osteoporosis, éste puede ser un epifenómeno, ya que las mutaciones del receptor de vitamina D no se asocian con aumento del riesgo de fracturas. La PTH, producida por las glándulas paratiroideas, regula negativamente la fisiología ósea, un efecto ampliado por niveles bajos de calcio circulante. El estrógeno antagoniza el efecto negativo de la PTH. La función de las hormonas gástricas no se ha esclarecido, pero se sabe que la eliminación del estómago aumenta la pérdida ósea. Se cree que esto refleja la pérdida de ácido y la disminución resultante en la absorción de calcio.

La Figura 2 es una ilustración que muestra la fisiología ósea y las mediciones estructurales y de fuerza. Se usaron tomografía microcomputada (MicroCT) y flexión ósea, además de absorción de osmio y PCR para evaluar la dinámica ósea y los rasgos osteoporóticos en los distintos modelos animales. La MicroCT evalúa la densidad y el volumen tanto del hueso trabecular como cortical. Se pueden realizar mediciones del radio y la circunferencia del hueso cortical. Se pueden efectuar cálculos de la densidad de conectividad, el índice de modelo estructural (SMI) así como la rigidez (todas las mediciones de estructura) del hueso. El momento polar de inercia (pMOI) así como la fractura y las cargas de trabajo identifican la fuerza ósea subyacente. La absorción de osmio identifica alteraciones en los fenotipos adipogénicos, mientras que el análisis PCR puede evaluar la activación de transcripciones implicadas en la ósteoactivación.

La Figura 3 es una serie de gráficos (3A-3D) que demuestran que las células G actúan como sensores de calcio. El CaCl² (4 mM) estimuló el flujo de calcio (desplazamiento FITC: >5 veces hacia la derecha - medido usando citometría de flujo) que no se observó en ausencia de CaCl² (3A). El CaCl² estimuló, en un modo dependiente de la dosis, la liberación de gastrina (CE⁵⁰=4,1 mM, 8 veces) y se inhibió por pre-incubación (10 min) con el antagonista de los canales de calcio, nifedipina (1 pm) (3B). Esta segregación de gastrina mediada por calcio no se asoció con la producción de cAMP (3C) y no pudo inhibirse con el inhibidor de PKA H-89 (10 pM) ni con el inhibidor de MAPK PD98059 (0,1 pM), ambos asociados con segregación de gastrina mediada por cAMP/MAPK (3D). En contraste, wortmannin (1 nM), un inhibidor de la señalización de PI3K, inhibió significativamente la liberación de gastrina mediada por CaCl². Estos resultados demuestran que la segregación de gastrina se acopla a un mecanismo sensor del calcio regulado por los canales de calcio que es transducido mediante la señalización de PI³K. Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a células no estimuladas, WORT: Wortmannin.

La Figura 4 es una serie de gráficos (4A-4D) que demuestran la estimulación de PTH de la función de las células G. La PTH estimuló la liberación de gastrina ~8 veces con una CE⁵⁰=60 nM estimada (4A), un efecto que podría inhibirse mediante la pre-incubación con el inhibidor de PKA, H-89 (10 pM) durante 10 min (4B). La PTH también estimuló, en un modo dependiente de la dosis, la producción de cAMP (E⁵⁰=4 nM, 250%) (4C), una respuesta que fue revertida por H-89 (pre-incubación: 10 min - 10 pM) (4D). Estos resultados demuestran que la segregación de gastrina está acoplada con la activación de PKA mediada por el receptor de PTH y la señalización de cAMP. Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a células no estimuladas o frente a PTH sola.

La Figura 5 consta de dos gráficos (5A-5B) que demuestran que la calcitonina inhibe la función de las células G. La calcitonina inhibió la liberación de gastrina con una CI⁵⁰=1,9 nM estimada (~20%, 5A), un efecto que se revirtió por pre-incubación con el inhibidor de PKA, H-89 (10 pM). La calcitonina inhibió, en un modo dependiente de la dosis, la producción de cAMP (I⁵⁰=3,8 nM, 20%) (5B). Estos resultados demuestran que la segregación de gastrina se acopla con una inhibición de PKA mediada por el receptor de calcitonina y la señalización de cAMP. Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a no estimuladas, #p<0,05 frente a inhibición mediada por calcitonina.

La Figura 6 es una serie de gráficos (6A-6C) que demuestran la inhibición de estrógenos de la función de las células G. Las células G expresan transcritos de ESRa (6A), y el 17p-estradiol inhibe tanto la síntesis de cAMP (CI⁵⁰=1,1x10^-12M, -15%) como la liberación de gastrina (CI⁵⁰=4,6x10^-12M, ~20%) (6B). Además, la pre-incubación con este agonista de ESRa inhibió la fosforilación de MAPK (75%, 6C). Estos resultados identifican que la segregación de gastrina es inhibida por la inhibición de la producción de PKA/cAMP y la señalización de MAPK mediadas por el receptor de estrógenos a. Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a 17p-estradiol (1 nM) solo.

La Figura 7 es un modelo de regulación de las células G. Los agentes luminales, incluido el calcio dietario, inducen, o bien directa o indirectamente, la fosforilación de ERK a través de la activación de adenilato ciclasa (AC) mediante el acoplamiento a Gas que resulta en la segregación de gastrina. La PTH, a través del receptor PTH1 acoplado a la proteína G, también estimula la liberación de gastrina a través de esta vía. La fosforilación de ERK puede afectar positivamente el flujo de Ca2+ que aumenta directamente con la dieta. Los canales de calcio de tipo L regulan de forma similar la segregación mediante la activación de PKC. Los inhibidores de segregación de gastrina incluyen calcitonina (mediante la inhibición de cAMP) y estrógenos que activan ERa para inhibir la vía de cAMP y MAPK. AC: adenilato ciclasa; GAS: gastrina; PDK: cinasa dependiente de fosfoinositida; PKA: proteína cinasa A; las líneas discontinuas reflejan la inhibición, las líneas continuas reflejan la estimulación.

La Figura 8 consiste en dos gráficos (8A-8B) que muestran la estimulación de gastrina de segregación de PTH humana. Los receptores para gastrina (CCK2) e histamina (HI) se expresan en células principales de PTH aisladas de extirpaciones quirúrgicas clínicas (8A). Estas células expresan altos niveles (triples) de PTH (5A). La gastrina estimuló la síntesis (CE⁵⁰=10^-9M, 40%) y la liberación (CE⁵⁰=4,2x10^-10M, 50%) de PTH (8B). Estos resultados demuestran que la síntesis y la segregación de PTH se acoplan a una activación mediada por el receptor de gastrina (CCK2). Media±SEM (n=4 experimentos).

La Figura 9 es una serie de gráficos (9A-9D) que muestran que la gastrina estimula la función de las células C tiroideas (MTC-SK). La producción de cAMP estimulada por gastrina (CE⁵⁰=6,7x10^-13M, ~5 veces) se revirtió con el antagonista del receptor CCK² selectivo, YF476 (9A). YF476 solo no tuvo ningún efecto significativo. El efecto estimulador de la gastrina sobre cAMP podría inhibirse mediante la pre-incubación con el inhibidor de PKA, H-89 (10 gM) (9B). La segregación de calcitonina fue afectada en un modo dependiente de la dosis por la gastrina, un efecto revertido por YF476 (9C). La gastrina (0,1 nM) estimuló (~3 veces) la transcripción del gen de calcitonina, un efecto revertido por la pre-incubación con H-89 (10 gM) (9D). La expresión del receptor CCK2 no fue inhibida por H-89 (9D). Estos resultados identifican que la síntesis y liberación de calcitonina es regulada por la activación de PKA y la señalización de cAMP mediada por el receptor de gastrina (CCK2). Media±SEM (n=4 experimentos). #p<0,05 frente a sin estimulación, *p<0,05 frente a gastrina (0,1 nM) sola.

La Figura 10 es una ilustración (10A), una fotomicrografía (10B) y una serie de gráficos (10C-10F) que muestran un efecto de la gastrina sobre la síntesis y segregación de PTH y MTC-SK, un sistema modelo de co-cultivo. Células de PTH humanas aisladas de muestras quirúrgicas se co-cultivaron con la línea celular MTC-SK. Se incluye un diagrama que detalla las ubicaciones de las células y el sitio de ubicación diana en 10A mientras que las fotomicrografías demuestran el crecimiento de cada uno de estos tipos de células (10B). La adición de gastrina al sistema de co-cultivo estimuló de manera significativa la transcripción (~75%, 10C) y segregación (~60%, 10D) de PHT. Estos efectos podrían revertirse por pre-incubación (10 min) con el antagonista del receptor CCK² selectivo, YF476 (10nM). En contraste, la gastrina inhibió tanto la transcripción (hasta el nivel basal - 10E) como la liberación (~70% - 10F) de calcitonina. Estos resultados identifican que el efecto principal de la gastrina en un sistema modelo es estimular la PTH e inhibir la calcitonina. Este último efecto se contrapone con el efecto estimulador de la gastrina en experimentos de un solo cultivo (células MTC-SK solas). CON = control, GAS = gastrina (10^-10M), G+INH = gastrina YF476 (10^-11M). PET = membrana de poliéster (0,4 mm). Media±SEM, n=3. *p<0,05 frente a control (sin estimulación), **p<0,05 frente a gastrina (10^-10M).

La Figura 11 es un gráfico (11A) y una serie de fotomicrografías (11B-11H) que demuestran la expresión del receptor CCK2 en células derivadas de hueso aisladas y en hueso. Los niveles de transcritos del receptor CCK2 se identificaron en osteoblastos de calvaria (OB), la línea celular hFOB (hFOB) y en células madre derivadas de médula ósea humana (BMMSC) (11A). Usando inmunohistoquímica, se identificó inmunotinción específica en la placa epifisiaria (EP) así como también en células de médula (flechas) (11B, 11C - 100x aumento). Las células implicadas en osificación endocondral expresan receptores (11D, E, F) como lo hacen los osteoblastos (11F). Hubo evidencia de células de osteoblastos CCK2R-positivas que recubren el endostio (11G) así como también en el hueso cicatrizante (11H). Interpretamos estos resultados para indicar que el CCK2R se expresa en condrocitos, osteoblastos y células de médula mesenquimales, y que el CCK2R está implicado en la regulación de la osificación y la cicatrización ósea. Dirigirse al receptor probablemente regule estos fenómenos. Inmunotinción de CCK2R = células de color pardo (DAB), contratinción = hematoxilina. 11D-H: aumento = 400x.

La Figura 12 es una fotografía (12A), análisis de secuencia (12B) y fotografía (12C) que muestra la expresión de gastrina/CCK2 en muestras de médula ósea humana. El análisis PCR estándar identificó una banda de ~320 pares de bases (flecha) en muestras de médula ósea cortical aisladas derivadas de la amputación para isquemia de miembros inducida por aterosclerosis (sin evidencia de osteomielitis) (12A). El análisis de secuencias (BioEdit) identificó 92% de homología con el gen CCK2 canónico (12B). La inmunotransferencia Western blot confirmó la expresión de CCK2 en las 10 muestras estudiadas (flecha - 50kD) (12C).

La Figura 13 es un conjunto de gráficos (13A y 13B) que demuestran el efecto de la gastrina y de dirigirse al CCK2 sobre la proliferación de células derivadas de hueso. La gastrina estimuló, en un modo dependiente de la dosis, la absorción de BrdU en todos los tipos de células con una CE⁵⁰=1-2x10^-11M (13A). Esto no se revirtió con el antagonista del receptor CCK2 selectivo, YF476, que pareció aumentar la proliferación, particularmente en BMMSC (13B). Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a sin estimulación, #p<0,05 frente a gastrina (0,1 nM).

La Figura 14 es un conjunto de gráficos (14A y 14B) que demuestran el efecto de la gastrina y de dirigirse al CCK2 sobre la mineralización de células derivadas de hueso. La gastrina inhibió, en un modo dependiente de la dosis, la mineralización ósea (se midió usando Ostemalge) en todos los tipos de células con una Cl⁵⁰=3,2x10^-11 - 1,3x10^-10M (14A). Esto no se revirtió con el antagonista del receptor CCK2 selectivo, YF476, que aumentó la mineralización, particularmente en osteoblastos de calvaria (14B). Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a sin estimulación, #p<0,05 frente a gastrina (0,1 nM).

La Figura 15 es un conjunto de gráficos que demuestran el efecto de la gastrina y de dirigirse al CCK2 sobre la expresión génica de células derivadas de hueso. La gastrina (1 nM) inhibió la expresión del gen de diferenciación de osteoblastos, fosfatasa alcalina (ALKP), en todos los tipos de células (hilera superior). Esto se revirtió con el antagonista del receptor CCK2 selectivo, YF476 (1 nM). La gastrina también inhibió M-CSH y RANKL en osteoblastos, que se normalizó con YF476 (hilera inferior). Media±SEM (n=4 experimentos). *p<0,05 frente a sin estimulación, #p<0,05 frente a gastrina (1 nM).

La Figura 16 demuestra los efectos de la hipergastrinemia crónica y a corto plazo sobre los niveles de hormonas circulantes en modelos de Mastomys. Los niveles de gastrina se elevaron significativamente en las semanas 8 (~2 veces) y 16 (~3,5 veces) de tratamiento. El estrógeno (estradiol) se redujo (~50%) en los animales hipergastrinémicos a corto y a largo plazo. La PTH se elevó significativamente a las 8 semanas (~75%) pero se redujo significativamente a las 16 semanas (~3 veces). Estos resultados demuestran que la hipergastrinemia a corto plazo en un modelo in vivo inhibe la liberación de estrógenos con activación recíproca de la segregación de PTH. La hipergastrinemia a largo plazo también se asocia con una reducción del estradiol, pero esto no produce PTH elevada. Se desconoce el mecanismo para esto último, pero puede reflejar una disminución del receptor CCK2 o sus respuestas de señalización en la glándula PTH expuesta a la estimulación con gastrina a largo plazo. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales control. #p<0,05 frente a animales tratados por 8 semanas. CON = animales control, 8 wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16 wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 17 es un par de gráficos (17A y 17B) y fotografías (17C) que muestran la expresión de receptores relacionados con el eje de calcio, PTH1R, ERa y CaSR en el estómago de los modelos de Mastomys. Resultados de los análisis de PCR y western blot de la mucosa gástrica de animales normales (n=4) en comparación con animales tratados con loxtidina durante 8 (n=4) y 16 (n=5) semanas, respectivamente. En el fondo gástrico, la hipergastrinemia tanto a corto plazo (8 semanas) como a largo plazo (16 semanas) aumentó significativamente la expresión de HDC pero redujo la expresión de PTH1R y Era, respectivamente (17A). En el antro, la hipergastrinemia se asoció con aumentos significativos de los transcritos de gastrina, así como también con elevaciones de la expresión de PTH1R, Era y CaSR (17B). Estos efectos fueron más pronunciados en la hipergastrinemia a largo plazo. Los efectos del ARN se recapitularon a nivel de la proteína (Western blot - 17C). Concretamente, se redujo la expresión de PTH1R en el fondo (F) pero aumentó en el antro (A) - panel superior. La expresión de ERa en el antro se elevó a las 16 semanas (panel del centro) al igual que CaSR (panel inferior). Estos resultados demuestran que el fondo y el antro responden a la hipergastrinemia a corto plazo y a largo plazo con síntesis y expresión diferencial de los receptores relacionados con el eje calcio:hueso. Concretamente, los receptores funcionales disminuyen en la porción de sintetización de histamina del estómago (fondo) pero estos aumentan en el estómago segregador de gastrina (antral). En algunos aspectos, esto refleja la sensibilización del antro y las células G sensoras de calcio. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales control (no tratados). CON =animales control, 8wk = hipergastrinemia, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 18 demuestra la expresión del receptor CCK2 en las glándulas paratiroideas y tiroideas. La inmunotinción del receptor CCK2 identificó que la mayoría de las células paratiroideas dentro de una glándula paratiroidea son CCK2 positivas (distintas tinciones reflejan expresión unida a membrana [flechas] y núcleos celulares] 18A). Dentro de la glándula tiroidea, se pueden identificar células C individuales teñidas por anticuerpos CCK2 (la tinción refleja la expresión unida a la membrana [flechas] - 18B, 18C (las dos flechas inferiores)). En contraste, las células inmunes infiltrantes dentro de la glándula tiroidea Mastomys son CCK2 negativas (las tres flechas superiores, núcleos azules solamente) (18C). Estos resultados demuestran la expresión en la membrana del receptor CCK2 tanto en células PTH como tiroideas. Esto concuerda con los resultados in vitro que muestran los efectos de la gastrina sobre las células aisladas de estas estructuras. Tinción de núcleos = DAPI, otra tinción = CCK2 marcado con FITC. Anticuerpo de Abeam (ab14439, policlonal de conejo, dilución 1:100).

La Figura 19 muestra cambios en el hueso trabecular en modelos animales hipergastrinémicos a corto plazo y crónicos, medidos usando tomografía microcomputada (microCT). El volumen óseo (19A) y la relación de volumen óseo a volumen trabecular (19B) se redujeron tanto en los animales hipergastrinémicos a corto como a largo plazo, pero esto se pronunció más en los animales tratados a corto plazo (50% frente a 30%). Dos medidas de densidad, la densidad aparente (19C) y la densidad del tejido (19D) se redujeron significativamente en ambos grupos de gastrina (~100%). La densidad de conectividad (una medida del número de trabéculas por unidad de volumen) se redujo significativamente (~60%) en el grupo hipergastrinémico a largo plazo (19E). La gastrina a corto plazo se asoció con la conversión del hueso de una estructura más tipo placa (SMI cercano a 0) a una estructura más tipo varilla (aumento de SMI >1) (19F). Esto no fue tan obvio en los animales hipergastrinémicos a largo plazo. Estos resultados demuestran que la gastrina altera significativamente el fenotipo óseo en el modelo de Mastomys. Las alteraciones concuerdan con un fenotipo "osteoporótico". BV=volumen óseo, TV = volumen trabecular, ConnDens = densidad de conectividad, SMI = índice de modelo estructural (medida de geometría varilla:placa). Media±SEM, *p<0,05 frente a animales control. CON =animales control, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 20 es una serie de fotografías que muestran la tinción basada en osmio para activación de tejido adiposo óseo. Los adipocitos absorben osmio y se identifican fácilmente en el hueso. Los animales control (fémur derecho, n=5, panel superior) exhibieron predominantemente absorción de osmio en la epífisis tibial. Los animales hipergastrinémicos a corto plazo también exhibieron absorción de osmio en la epífisis pero se observó también una captación importante en la metáfisis (n=5, panel inferior). Estos resultados concuerdan con una activación de gastrina del tejido adiposo y un fenotipo "envejecido".

La Figura 21 es una serie de fotomicrografías que muestran fémures teñidos con TRAP y azul de toluidina de Mastomys control, tratados con loxitidina, 8 semanas y 16 semanas, demostrando patrones de mineralización ósea y cavidades de resorción. En un aspecto, los cambios en los animales tratados con loxtidina reflejan la pérdida de mineralización ósea y el aumento de resorción - rasgos concordantes con fenotipos osteoporóticos. BM = mineralización ósea, RC = cavidad de resorción.

La Figura 22 es una serie de gráficos (22A-22C) que muestran una comparación entre quiebre óseo en los modelos de Mastomys. Los fémures se cargaron hasta falla (flexión en cuatro puntos) usando una máquina de pruebas servohidráulica (modelo Instron 8874). Se observó una correlación significativa (R2=0,86, p<0,01) entre la rigidez del hueso y la carga de la fractura (22A) demostrando que aumentar la rigidez del hueso requeriría una carga de fractura mayor. Evaluamos la relación entre la flexión del hueso y las mediciones de microCT para densidad tanto trabecular como cortical. Ésta identificó que la densidad trabecular estaba inversamente correlacionada (R2=-0,54) a la fuerza requerida para fracturar el hueso (22B), mientras que el incremento de la densidad cortical se relacionó con cargas de fractura superiores (R2=0,71,22C). Estos resultados demuestran que la fuerza mecánica requerida para quebrar el hueso se relaciona con la estructura y la densidad ósea, y que una combinación de estos dos planteamientos ofrece información relevante en este modelo. N=7 animales, uCT = microCT.

La Figura 23 es un cuadro que resume alteraciones mediadas por gastrina en el modelo de Mastomys. En comparación con el control (animales no tratados, normo-gastrinémicos), el tratamiento con loxtidina a corto plazo elevó la gastrina y la PTH circulantes, pero disminuyó el estradiol. Esto se asoció con una reducción de la densidad ósea y el fenotipo osteoporótico. En el estómago, la expresión de PTH1R aumentó, mientras que ERa se redujo. No se observaron cambios detectables en el receptor sensor de calcio (CaSR). En comparación con el control, el tratamiento con loxtidina a largo plazo elevó la gastrina circulante, pero disminuyó la PTH y el estradiol. Esto se asoció con una reducción de la densidad ósea y el fenotipo osteoporótico. En el estómago, la expresión de PTH1R, ERa y CaSR aumentó de manera concordante con la activación de un fenotipo metabólico de calcio. 8 wk = tratamiento con loxtidina durante 8 semanas, 16 wk = tratamiento con loxtidina durante 16 semanas, Hueso d = mediciones de densidad ósea, Osteo = fenotipo osteoporótico.

La Figura 24 es un cuadro que muestra un panorama de las alteraciones del fenotipo óseo mediado por gastrina en el modelo de Mastomys. En comparación con el control (animales no tratados, normo-gastrinémicos), los animales tratados a corto plazo exhibieron gastrina y PTH circulantes elevadas, pero estradiol reducido. Esto se asoció con una reducción de la densidad ósea y un fenotipo osteoporótico (incluida la debilidad del hueso con poca fuerza de torsión). En los animales tratados a largo plazo, se observó gastrina circulante elevada, pero tanto la PTH como el estradiol disminuyeron. Esto se asoció con una reducción de la densidad ósea y el fenotipo osteoporótico que se caracterizó por un hueso débil pero rígido. pMOI = momento polar de inercia, PTH = paratohormona

La Figura 25 es un gráfico que muestra los efectos de la ovariectomía en los niveles de PTH circulante mediados por hipergastrinemia a corto plazo y crónica en el modelo de Mastomys. La ovariectomía aumentó los niveles de PTH ~ 100%. La hipergastrinemia a corto plazo elevó los niveles de PTH en un modo similar. Esto aumentó (300% encima del control) en los animales tratados con OVX/8 semanas. El tratamiento con gastrina a largo plazo redujo en forma significativa los niveles por ~60%. La ovariectomía revirtió esto, normalizando los niveles de PTH. Estos resultados confirman la activación mediada por ovariectomía de la liberación de PTH (concordante con pérdida de estrógeno) y que esto se amplía con hipergastrinemia a corto plazo en un modelo in vivo. La hipergastrinemia a largo plazo parece reducir la liberación de PTH, un efecto que también se observa en animales sometidos a ovariectomía. El mecanismo puede reflejar la disminución del receptor CCK2 o sus respuestas de señalización en la glándula PTH expuesta a estimulación con gastrina a largo plazo. Dicho efecto anula la pérdida de estrógeno, indicando que la gastrina puede cumplir una función en el funcionamiento de la glándula PTH. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales control, #p<0,05 vs. OVX solo. CON =animales control, OVX = animales con ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 26 es una serie de gráficos (26A-26D) que muestran la expresión de transcritos neuroendocrinos en el estómago de modelos de Mastomys.con ovariectomía normo- e hipergastrinémicos. Resultados del análisis PCR de la mucosa gástrica de Mastomys (TOP) normales (n=11) comparados con aquellos sometidos a ovariectomía (OVX; n=8) y entre animales OVX hipergastrinémicos OVX y a corto plazo (n=4) y a largo plazo (n=4) (PARTE INFERIOR). La ovariectomía aumentó significativamente la expresión de CgA de la mucosa gástrica (4 veces) y HDC (~6 veces) (26A). Ni la hipergastrinemia a corto o a largo plazo tuvo ningún otro efecto sobre la síntesis de CgA mediada por OVX (2,8-4,2 veces en comparación con 4,3 veces) (26B). La hipergastrinemia a corto plazo elevó la expresión de gastrina (~40 veces - 26C) y HDC (~40 veces - 26D). La hipergastrinemia a largo plazo elevó tanto la gastrina como la HDC, pero el efecto fue el más pronunciado para expresión de HDC derivada de células ECL (~45 veces - 26D). Estos resultados confirman que el estrógeno regula la transcripción de células ECL de HDC (y de este modo la síntesis de histamina) y que la síntesis de gastrina es regulada de modo similar por el estrógeno. La gastrina circulante aumenta además la expresión. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales no sometidos a ovariectomía. #p<0,05 frente a OVX. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 27 es un gráfico que muestra la expresión de receptores relacionados con el eje de calcio, PTH1R, ERa y CaSR en el estómago del modelo de ovariectomía de Mastomys normo-gastrinémicos. Resultados del análisis PCR de la mucosa gástrica de animales normales comparados con Mastomys sometidos a ovariectomía (OVX). La ovariectomía aumentó la expresión en la mucosa gástrica del receptor de andrógenos (~6 veces) así como también los receptores de estrógenos (ESR1 y ESR2, ambos ~4 veces). CaSR y PTH1R también aumentaron con la pérdida de estrógeno (5 y 4 veces, respectivamente). Estos resultados confirman que la pérdida de estrógeno se asocia con el aumento de transcritos relacionados con el eje sensor de calcio y el eje paratiroides:ovario. La gastrina circulante aumenta además la expresión. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales no sometidos a ovariectomía. CON = animales control quirúrgicos (n=11), OVX=ovariectomía (n=8). AR = receptor de andrógenos, ESR = receptor de estrógenos, CaSR = receptor sensor de calcio, PTH1R = receptor de paratiroidea de tipo 1.

La Figura 28 es una serie de gráficos (28A-E) que muestran la expresión de los receptores relacionados con el eje de calcio, PTH1R, AR, ERa y CaSR en el estómago de los modelos de ovariectomía de Mastomys hipergastrinémicos. Resultados de la PCR de la mucosa gástrica de animales OVX y animales OVX hipergastrinémicos a corto plazo (n=4) y a largo plazo (n=4). Las elevaciones inducidas por la ovariectomía en los receptores de andrógenos se normalizaron tanto en animales hipergastrinémicos a corto plazo como a largo plazo, con un efecto más pronunciado en los animales a corto plazo (28A). Se observó un resultado similar para ambos receptores de estrógenos (28B, C). Tanto CaSR (28D) como PTH1R (28E) se redujeron significativamente por la hipergastrinemia. Estos resultados identifican que la expresión de receptores relacionados con el eje calcio:hueso, que son aumentados por la ovariectomía en la mucosa gástrica, se "normaliza" por hipergastrinemia a corto plazo y a largo plazo. Esto refleja un intento fisiológico de regular o recalibrar el sensor de calcio en un entorno de gastrina alta. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales sometidos a ovariectomía, #p<0,05 frente a animales hipergastrinémicos. CON = animales control, OVX =animales con ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo. AR = receptor de andrógenos, ESR = receptor de estrógenos, CaSR = receptor sensor de calcio, PTH1 R=receptor paratiroideo de tipo 1.

La Figura 29 es una serie de capturas de pantalla (29A-H) que muestran rasgos de tomografía microcomputada (microCT) del hueso trabecular y cortical. El hueso trabecular de animales con ovariectomía exhibió una pérdida significativa (29B) en comparación con el hueso control (29A). Tanto la hipergastrinemia a corto plazo (29C) como a largo plazo (29D) redujeron esto - los efectos fueron más evidentes en animales hipergastrinémicos a largo plazo. En el hueso cortical, la ovariectomía se asoció con imágenes de hueso trabecular y cortical de animales normales sometidos a ovariectomía (OVX) y OVX tratados con loxtidina durante 8 y 16 semanas, respectivamente. Se observa pérdida ósea, particularmente en la región trabecular del fémur, después de OVX. Esto puede, en algunos aspectos, aumentar con las elevaciones de gastrina. CON =animales control, OVX = animales con ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 30 es una serie de gráficos (30A-D) que muestran mediciones MicroCT en hueso trabecular y cortical en modelos de ovariectomía de Mastomys. La densidad trabecular se redujo significativamente por ovariectomía (~50%) en comparación con animales normales (30A). Esto se amplió por hipergastrinemia a largo plazo (85%). El volumen trabecular también se redujo significativamente por ovariectomía (~50%) (30B). Esto se amplió por hipergastrinemia a largo plazo (~70%). La densidad del hueso cortical no se redujo por ovariectomía, pero fue significativamente inferior en los animales hipergastrinémicos a largo plazo (~5%, 30C). El volumen cortical se redujo significativamente por ovariectomía (~30%) (30D). Esto se amplió por hipergastrinemia a corto plazo (~30%). Estos resultados demuestran que la gastrina amplía la pérdida ósea en el modelo de ovariectomía y resulta en rasgos de microCT concordantes con un fenotipo osteoporótico. Los efectos de la hipergastrinemia a largo plazo se reflejan principalmente en las alteraciones trabeculares. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 31 es una serie de gráficos (31A-D) que muestran mediciones MicroCT de las dimensiones endósticas y periósticas en el hueso cortical en los modelos de ovariectomía de Mastomys normo e hipergastrinémicos. El radio endóstico se redujo significativamente por ovariectomía (~20%) en comparación con los animales normales (31A). Esto se amplió significativamente por hipergastrinemia a corto plazo (30%). La circunferencia endóstica también se redujo significativamente por ovariectomía (~18%) (31B). Esto se amplió significativamente por hipergastrinemia a corto plazo (~27%). El radio perióstico, asimismo, se redujo en animales sometidos a ovariectomía (~20%, 31C), un efecto significativamente ampliado por hipergastrinemia a corto plazo (~30%). La circunferencia perióstica también se redujo por ovariectomía (~20%), un efecto ampliado por hipergastrinemia a corto plazo (~30%) (31D). Estos resultados demuestran que la gastrina amplía las dimensiones del hueso cortical, efectos principalmente acentuados por hipergastrinemia a corto plazo. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 32 es un par de fotomicrografías que muestran fémures teñidos con azul de Toluidina, TRAP, de Mastomys sometidos a ovariectomía, que identifican patrones de mineralización ósea y cavidades de resorción, además del número y la posición de los osteoclastos. La tinción TRAP se indica con glóbulos rojos; los osteoclastos son las células multinucleares teñidas de rojo (flecha amarilla). Panel izquierdo (ampl 100x), panel derecho (ampl 400x). RC = cavidad de resorción.

La Figura 33 es una serie de gráficos (33A-D) que muestran los resultados de la flexión en 4 puntos de apoyo Instron de fémures de modelos de ovariectomía de Mastomys normo e hipergastrinémicos. La rigidez aumentó por ovariectomía (~15%), un efecto que fue significativamente ampliado por la hipergastrinemia a largo plazo (33A). La hipergastrinemia a corto plazo se asoció con una reducción en la rigidez a niveles normales. La carga máxima para fracturar el hueso fue significativamente inferior en los animales con ovariectomía (~20% ~ 33B). La hipergastrinemia no alteró esto, pero los animales hipergastrinémicos a largo plazo requirieron una mayor carga para la fractura del hueso en comparación con los animales a corto plazo. La carga de fractura disminuyó de manera similar en animales con ovariectomía (~25%) y no se alteró con la gastrina (33C). Los animales hipergastrinémicos a largo plazo, no obstante, requirieron una carga mayor para la fractura que los animales hipergastrinémicos a corto plazo. El esfuerzo total requerido para fracturar el hueso aumentó en animales sometidos a ovariectomía (~20%) (33D). Si bien la hipergastrinemia a largo plazo no alteró el esfuerzo, los huesos de los animales hipergastrinémicos a corto plazo requirieron 50% menos de fuerzo para fracturarse. Estos resultados demuestran que la fuerza de los huesos después de la ovariectomía se ve afectada de manera diferente por la gastrina a corto plazo (que resulta en huesos débiles) y la gastrina a largo plazo (huesos rígidos). CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 34 es una serie de gráficos (34A-E) que muestran toda la fuerza del hueso en modelos de ovariectomía de Mastomys normo e hipergastrinémicos. El momento polar de inercia (pMOI) se redujo significativamente en animales sometidos a ovariectomía (25%, 34A). Esta medida de falla en la carga torsional se amplió específicamente por hipergastrinemia a corto plazo (~50%). El pMOI se correlaciona significativamente con rigidez (R2=0,23 - 34B), carga máxima (R2=0,33 - 34C) y carga de la fractura (R2=0,3 - 34D). El esfuerzo total no se correlacionó con el pMOI (34E). Estos resultados confirman que la fuerza torsional de los huesos después de la ovariectomía disminuye y que la gastrina a corto plazo amplía específicamente este parámetro. La correlación total con la rigidez y la carga máxima/fractura es un reflejo de los efectos de la ovariectomía sobre los Mastomys. CON =animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo.

La Figura 35 es una serie de gráficos (35A-I) que muestran la expresión de transcritos relacionados con remodelado óseo en médula ósea derivada de hueso cortical en la ovariectomía de Mastomys normo-gastrinémicos. Resultados del análisis PCR de células de médula ósea de Mastomys normales comparados con aquellos sometidos a ovariectomía (OVX). La ovariectomía redujo significativamente la expresión de ALOX5 (35A - inflamación: ~20%) y RUNX2 (29B - diferenciación de osteoblastos: ~ 100% - 35B) pero no de TCF4 (35C - implicados en la formación ósea mediada por TGFp), IGF-1 (35D - formación ósea), PTGS2 (35E - inflamación) o RANKL (35F - pérdida ósea). Se observaron incrementos en CXCL12 (35G - activación de osteoblastos: ~20%), PPARg (35H - diferenciación de adipocitos: ~60%) y HIF-1a (35I - daño óseo mediado por hipoxia: ~250%). Estos resultados confirman que la pérdida de estrógenos se asocia con aumento de transcritos derivados de médula ósea relacionados con remodelado y pérdida ósea. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales no sometidos a ovariectomía. CON = animales control quirúrgicos (n=11), OVX=ovariectomía (n=8).

La Figura 36 es un cuadro que muestra un panorama de las alteraciones fenotípicas óseas mediadas por gastrina en el modelo de Mastomys sometidos a ovariectomía. En comparación con la ovariectomía sola (animales normogastrinémicos, con disminución de estrógenos, PTH elevada y rasgos osteoporóticos, p. ej., hueso rígido, débil), los animales hipergastrinémicos a corto plazo exhibieron disminución de los rasgos del hueso cortical que se asoció con un hueso más débil con fuerza torsional inferior. Este fenotipo fue más pronunciado que en la ovariectomía sola. En los animales hipergastrinémicos a largo plazo (exhiben PTH normal), se observó daño al hueso trabecular que resulta en un hueso significativamente rígido. Este fenotipo fue más pronunciado que en la ovariectomía sola. pMOI = momento polar de inercia, PTH = hormona paratiroidea.

La Figura 37 es una serie de gráficos que muestran los efectos de la genomanipulación con gastrina, la genomanipulación con histidina descarboxilasa o la doble genomanipulación en los niveles de hormonas circulantes en modelos de ratones con ovariectomía. Los niveles de estrógenos se redujeron significativamente en todos los animales ~50% por ovariectomía. Los niveles de gastrina no se vieron afectados por la ovariectomía, pero los animales HDC KO expresaron aumento -trip le de los niveles en comparación con los animales KO con gastrina o doble KO. La PTH se redujo significativamente (~80%) en los animales KO con gastrina. Los niveles en contraste aumentaron de manera significativa después de la ovariectomía en los animales HDC y doble KO (~100%). Estos resultados demuestran que la pérdida de estrógenos no activa la liberación de PTH en los animales KO con gastrina. Esto sugiere que la gastrina modifica la función del estrógeno en la glándula paratiroidea. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales no sometidos a ovariectomía. G = genomanipulación con gastrina KO, GH = doble genomanipulación gastrina/HDC, KO, H = genomanipulación con HDC, KO, KO = genomanipulados, N = sin ovariectomía, O = ovariectomía.

La Figura 38 es una serie de gráficos que muestran la expresión de receptores sensores neuroendocrinos y de calcio en el estómago de los modelos de ratones genomanipulados sometidos a ovariectomía. En el fondo, una combinación de gastrina y ovariectomía redujo significativamente el CCK2 (sensibilidad a la gastrina de células ECL: ~3 veces) y HDC (síntesis de histamina ECL: ~20 veces). En contraste, no se observaron cambios en el fondo de ratones HDC KO sometidos a ovariectomía. En el antro, CaSR se redujo significativamente en los animales KO sometidos a ovariectomía (~60%), mientras que tanto la expresión de CaSR (~60%) como la de gastrina propiamente dicha (~70%) se redujeron en el antro de ratones HDC KO sometidos a ovariectomía. En un aspecto, esto refleja que la ovariectomía y la pérdida de estrógeno activan significativamente la célula ECL y reducen las respuestas de los sensores de calcio de las células G en animales KO con gastrina. En los animales h Dc KO, los efectos de la ovariectomía se limitan al antro. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales no sometidos a ovariectomía. G = genomanipulados con gastrina, H = genomanipulados con HDC, KO, KO = genomanipulados, N = sin ovariectomía, O = ovariectomía

La Figura 39 es una serie de gráficos (39A-F) que muestran mediciones de MicroCT en mediciones corticales y trabeculares en los modelos de ratones sometidos a ovariectomía. En los animales KO con gastrina, tanto el radio (39A) como la circunferencia endóstica (39B) aumentaron significativamente (~30%) después de la ovariectomía. Esto refleja que la combinación de pérdida de estrógenos y ausencia de gastrina aumentaron el espesor del hueso cortical. La pérdida de gastrina, en estas circunstancias, no afecta negativamente el hueso. En los animales HDC KO, la ovariectomía redujo significativamente el volumen del hueso cortical (~25% - 39C) pero resultó en un hueso con una fuerza de torsión superior (39D). Esto identifica que la pérdida de histamina exacerba los efectos del estrógeno en el hueso. La doble KO también se asoció con disminución del volumen del hueso trabecular (~50% - 39E) y cortical (~15% - 39F) pero esto no se tradujo en una debilidad ósea importante. Esto identifica que, aunque hay algunos cambios en el fenotipo del hueso, la combinación de pérdida de gastrina e histamina no altera significativamente la biología del hueso. G = genomanipulación con gastrina, GH = doble genomanipulación con gastrina/HDC, KO, H = genomanipulación con HDC, KO, N = sin ovariectomía, O = ovariectomía.

La Figura 40 es una serie de gráficos (40A-D) que muestran la expresión de transcritos relacionados con remodelado óseo en la médula ósea derivada de hueso cortical en los modelos de ovariectomía de ratones genomanipulados. Resultados del análisis PCR de células de médula ósea de ratones no sometidos a ovariectomía en comparación con ratones sometidos a ovariectomía. La ovariectomía aumentó significativamente la expresión de ALOX5 (40A-inflamación: ~100%), CXCL12 (40B- activación de osteoblastos: ~70%), HIF-1a (40C - daño óseo mediado por hipoxia: ~5 veces) e IGF-1 (40D - formación ósea: ~100%), solamente en los animales KO con gastrina. Estos resultados sugieren que una combinación de una pérdida de estrógeno y gastrina se asocia con un aumento de transcritos derivados de médula ósea relacionados con remodelado. Los valores se normalizaron a animales no sometidos a ovariectomía. Media±SEM, *p<0,05 frente a animales no sometidos a ovariectomía. G = genomanipulación con gastrina, KO, GH = doble genomanipulación con gastrina/HDC, H = genomanipulación con HDC, N = sin ovariectomía, O = ovariectomía

La Figura 41 es un cuadro que muestra un panorama de alteraciones del fenotipo óseo en los modelos genomanipulados de ratones sometidos a ovariectomía. El animal genomanipulado con gastrina, después de la ovariectomía, exhibió un incremento en los rasgos endósticos y un fenotipo óseo relativamente normal a pesar de los rasgos y un fenotipo óseo relativamente normal a pesar del entorno hormonal "pro-osteopénico" (pérdida de estrógeno, PTH elevada). El ratón HDC KO exhibió una reducción del volumen cortical, pero el hueso estuvo más fuerte. La doble genomanipulación también exhibió algunos cambios en los rasgos trabecular y cortical - estos no resultaron en una alteración de la fuerza ósea. La pérdida combinatoria (gastrina e histamina), a pesar de la pérdida de la función ovárica y la PTH elevada, no produjo un fenotipo óseo anormal. Una reducción de la gastrina parece ser protectora para el fenotipo óseo. GAS = gastrina, pMOI = momento polar de inercia, PTH = hormona paratiroidea.

La Figura 42 es una serie de gráficos que muestran mediciones MicroCT en el hueso trabecular en ratones CD-1 control, sometidos a ovariectomía y con ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. La relación BV/TV, la densidad de conectividad (Conn-Dens), el número trabecular (TB.N), la superficie y la densidad ósea, se redujeron todos de manera significativa con la ovariectomía. El índice de modelo estructural (SMI), el espesor trabecular (Tb.Th) y el espaciado trabecular (Tb.Sp) aumentaron todos. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió la mayoría de estos efectos, excepto el espesor y el espaciado trabecular. Estos resultados demuestran que inhibir selectivamente el receptor de gastrina mitiga la pérdida ósea en el modelo de ovariectomía y resulta en rasgos microCT concordantes con un fenotipo normal. CON =animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 43 es una serie de gráficos que muestran mediciones MicroCT en hueso cortical en ratones CD-1 control, sometidos a ovariectomía y con ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. La densidad cortical y la superficie ósea (BS) se redujeron todas significativamente con la ovariectomía. El espesor cortical (Ct.TH) aumentó. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió los efectos en la densidad, pero no alteró el espesor. Estos resultados demuestran que inhibir selectivamente el receptor de gastrina revierte la pérdida de densidad cortical en el modelo de ovariectomía. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 44 es una serie de gráficos que muestran la fuerza total del hueso en ratones control, no tratados y tratados con el antagonista de gastrina. La ovariectomía redujo significativamente la fuerza ósea, incluida la rigidez, el límite de rigidez, la carga máxima (máx), la carga de fractura hasta el quiebre y el aumento del esfuerzo total requerido para quebrar el hueso. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos efectos, excepto por la carga. Estos resultados confirman que la fuerza de los huesos después de la ovariectomía disminuye y que dirigirse al receptor de gastrina mitigó el efecto mediado por la pérdida de estrógenos. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia a corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX sola.

La Figura 45 es una serie de fotomicrografías que muestran fémures teñidos con azul de toluidina, TRAP, de ratones CD-1 control y sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina (OVX+GA) o vehículo (OVX). Los patrones de mineralización ósea (BM: reducida), cavidades de resorción (RC: aumentada) y osteoclastos (células multinucleares teñidas (dos flechas): aumentadas) se vieron afectados por la OVX. Estos efectos se revirtieron con el tratamiento con fármacos. En un aspecto, esto significa que dirigirse a los receptores CCK2 normaliza la morfología ósea independientemente de los bajos niveles de estrógenos.

La Figura 46 es una serie de gráficos que muestran los efectos del tratamiento con el antagonista de gastrina sobre los niveles de hormonas circulantes en el modelo de ratón sometido a ovariectomía. El estrógeno disminuyó significativamente mientras que la PTH y la gastrina se elevaron con la ovariectomía. El tratamiento con el antagonista de gastrina no tuvo ningún efecto sobre la PTH pero normalizó los niveles de gastrina. La ovariectomía incrementó los tres marcadores óseos, PINP, CTX1 y osteocalcina. El antagonista de gastrina inhibió cada uno de estos efectos. Interpretamos estos resultados para reflejar que los marcadores de actividad ósea producidos por la ovariectomía se normalizan dirigiéndose al receptor de gastrina. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 47 es una serie de gráficos que muestran mediciones MicroCT en el hueso trabecular de ratas CD control, sometidas a ovariectomía y con ovariectomía tratadas con el antagonista de gastrina. La relación BV/TV, el número trabecular (TB.N), el espesor trabecular (Tb.Th), la superficie y la densidad ósea se redujeron significativamente con la ovariectomía. El índice de modelo estructural (SMI) y el espaciado trabecular (Tb.Sp) aumentaron. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió la mayoría de estos efectos excepto SMI. Estos resultados demuestran que inhibir selectivamente el receptor de gastrina mitiga la pérdida ósea en el modelo de ovariectomía y resulta en rasgos microCT concordantes con un fenotipo normal en ratas CD. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 48 es una serie de gráficos que muestran mediciones MicroCT en el hueso cortical en ratas CD control, sometidas a ovariectomía y con ovariectomía tratadas con el antagonista de gastrina. La densidad cortical y la superficie ósea (BS) y el momento polar de inercia (pMOI) se redujeron todos significativamente con la ovariectomía. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió los efectos sobre la densidad y se asoció con un aumento de la relación BV/TV, así como también con el espesor cortical (Ct.TH). Estos resultados demuestran que la selectividad que inhibe el receptor de gastrina revierte la pérdida de densidad cortical en el modelo de ovariectomía. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 49 es una serie de gráficos que muestran la fuerza total del hueso en ratas control, no tratadas y tratadas con el antagonista de gastrina. La ovariectomía redujo significativamente la fuerza ósea, incluida la rigidez, el límite de rigidez, además de la carga de factura para el quiebre. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos efectos. Estos resultados confirman que la fuerza de los huesos después de la ovariectomía se reduce y que dirigirse al receptor de gastrina mitigó estos efectos mediados por estrógenos. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia de corto plazo, 16wk = hipergastrinemia a largo plazo. Media±SEM. *p<0,05 vs. CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 50 es una serie de fotomicrografías que muestra fémures teñidos con azul de toluidina, TRAP, de ratas CD control y sometidas a ovariectomía tratadas con el antagonista de gastrina (OVX+GA) o vehículo (OVX). Los patrones de mineralización ósea (disminuida variablemente), cavidades de resorción (RC) (aumentadas) y osteoclastos (células multinucleares teñidas (dos flechas): aumentados) se vieron afectados por OVX. Estos efectos se revirtieron con el tratamiento con fármacos. En un aspecto, esto refleja que dirigirse a los receptores CCK2 normaliza la morfología ósea más allá de los bajos niveles de estrógenos.

La Figura 51 es una serie de fotomicrografías que muestran los efectos del tratamiento con el antagonista de gastrina sobre los niveles de hormonas circulantes en el modelo de rata sometida a ovariectomía. El estrógeno disminuyó significativamente mientras que la gastrina se elevó con la ovariectomía. El tratamiento con el antagonista de gastrina no tuvo ningún efecto importante. La ovariectomía incrementó PINP y osteocalcina. El antagonista de gastrina inhibió estos efectos. En un aspecto, estos resultados demuestran que los marcadores de actividad ósea producidos por la ovariectomía se normalizan dirigiéndose al receptor de gastrina. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX sola.

La Figura 52 es una serie de gráficos que muestran mediciones MicroCT en hueso trabecular en Mastomys control, sometidos a ovariectomía y con ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. La relación BV/TV, el número trabecular (TB.N), la densidad y la superficie ósea se redujeron todos significativamente con la ovariectomía, mientras que el índice de modelo estructural (SMI) y el espaciado trabecular (Tb.Sp) aumentaron. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos efectos y se asoció con un incremento del espesor trabecular (Tb.Th). Estos resultados demuestran que inhibir selectivamente el receptor de gastrina mitiga la pérdida ósea en el modelo de ovariectomía y resulta en rasgos de microCT concordantes con un fenotipo normal en Mastomys. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 53 es un conjunto de gráficos que muestran mediciones MicroCT en hueso cortical en Mastomys control, sometidos a ovariectomía y con ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Ninguna de las categorías medidas se vieron significativamente afectadas por la ovariectomía o alteradas por el tratamiento con el antagonista de gastrina. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM.

La Figura 54 es un conjunto de gráficos que muestran la fuerza total del hueso en Mastomys control, no tratados y tratados con el antagonista de gastrina. La ovariectomía redujo significativamente la fuerza del hueso incluida rigidez, límite de rigidez, además de la carga máxima y la carga de fractura para el quiebre. El esfuerzo total aumentó. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos efectos. Estos resultados confirman que la fuerza de los huesos después de la ovariectomía disminuye y que dirigirse al receptor de gastrina mitigó estos efectos mediados por estrógenos. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, 8wk = hipergastrinemia de corto plazo, 16wk = hipergastrinemia de largo plazo. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX sola.

La Figura 55 es un conjunto de fotomicrografías que muestran fémures teñidos con azul de toluidina, TRAP, de Mastomys control y sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina (OVX+GA) o vehículo (OVX). Los patrones de mineralización ósea (BM: disminuida), cavidades de resorción (RC: aumentadas) y osteoclastos (células multinucleares teñidas (dos flechas): aumentados) se vieron afectados por OVX. Estos efectos se revirtieron con tratamiento con fármacos. Interpretamos que esto refleja que dirigirse a los receptores CCK2 normaliza la morfología ósea independientemente de los bajos niveles de estrógeno y la activación del receptor de gastrina constitutivo.

La Figura 56 es un conjunto de gráficos que muestran los efectos del tratamiento con el antagonista de gastrina en los niveles de hormonas circulantes en el modelo de Mastomys sometidos a ovariectomía. El estrógeno disminuyó significativamente mientras que la PTH y la gastrina se elevaron con la ovariectomía. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió los efectos sobre la PTH y la gastrina. La ovariectomía aumentó significativamente PINP, CTX-1 y osteocalcina. El antagonista de gastrina inhibió estos efectos. Interpretamos que estos resultados reflejan que los marcadores de la actividad ósea producidos por la ovariectomía se normalizan dirigiéndose al receptor de gastrina. CON = animales control, OVX = animales sometidos a ovariectomía, OVX+GA = animales sometidos a ovariectomía tratados con el antagonista de gastrina. Media±SEM. *p<0,05 frente a CON, **p<0,05 frente a OVX solo.

La Figura 57 muestra un modelo integrado para la regulación de remodelado óseo en función de los resultados demostrados en este documento. Los efectos de la función ovárica (y la segregación de estrógeno) y la segregación de la glándula paratiroidea PTH se muestran en este documento y son modulados por la célula G secretora de gastrina antral. Como la célula sensora de calcio principal en el estómago y un nexo para la señalización de PTH y estrógenos dentro del estómago, la gastrina, a través de su efecto negativo sobre el remodelado óseo (activación de osteoclastos), es un regulador central para el fenotipo óseo. Estas funciones pueden modificarse con calcitonina y tiroides y ampliarse con liberación de histamina de las células ECL. Líneas grises más oscuras = estimuladoras, líneas grises más claras = efectos inhibidores.

La Figura 58 es un diagrama que muestra la distribución de dianas del receptor de gastrina/CCK2 en el cuerpo. El receptor se expresa en las glándulas tiroideas (incluida la paratiroidea), dentro del estómago además del hueso. En las glándulas tiroideas, CCK2 se expresa tanto en células C segregadoras de calcitonina como en células segregadoras de PTH en la paratiroidea. En el intestino, CCK2 se expresa en las células ECL segregadoras de histamina mientras que, en el hueso, la expresión del receptor puede estar presente en múltiples células, incluidos los osteoblastos y las células ósteo-progenitoras. Dirigirse al receptor de gastrina/CCK2 con antagonistas específicos inhibirá enfermedades óseas, p. ej., osteoporosis o bien directa (hueso) o indirectamente a través del estómago y el eje tiroideo/paratiroideo. PTH = paratiroideo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

De acuerdo con una realización, la presente solicitud da a conocer un nuevo método de tratamiento, estabilización y/o prevención de la progresión de una enfermedad o afección ósea. Este nuevo método es respaldado por el hallazgo de que la hormona gastrina regula directa o indirectamente la formación ósea, promoviendo así la pérdida ósea con una consecuente patofisiología ósea concordante con alteraciones osteoporóticas (véase la Figura 57).

De acuerdo con un aspecto de la presente solicitud, se ha descubierto que el bloqueo de estos efectos de la gastrina, usando un antagonista de gastrina que se dirige al receptor CCK2, tiene un efecto beneficioso en modelos animales que exhiben una enfermedad o afección ósea caracterizada por osteoporosis.

Por consiguiente, la presente solicitud se refiere al uso de agentes dirigidos a la gastrina, como antagonistas de gastrina, o agentes que antagonizan la actividad de la gastrina, para tratar enfermedades o afecciones óseas (véase la Figura 58).

A. Definiciones

El término "afección", tal como se emplea en este documento, se refiere en general a una enfermedad, evento o cambio en el estado de salud.

La expresión "enfermedad o afección ósea", tal como se emplea en este documento, se refiere a una enfermedad o afección asociada con anomalías del hueso que se pueden tratar aumentando la masa ósea y/o el crecimiento óseo. Por ejemplo, la enfermedad o afección ósea puede incluir: osteoporosis primaria; osteoporosis secundaria; osteogénesis imperfecta; osteodistrofia; osteopenia; enfermedad de Paget; lesiones osteolíticas producidas por metástasis ósea, radioterapia o quimioterapia; enfermedad periodontal; pérdida ósea alveolar; pérdida ósea debida a inmovilización o deficiencia de la hormona sexual; pérdida ósea debida a cáncer metastásico; pérdida de hueso y cartílago causada por una enfermedad inflamatoria; artrosis; pérdida ósea por osteotomía; pérdida ósea idiopática infantil; curvatura de la columna vertebral; y fracturas óseas. La enfermedad o afección ósea puede ser una enfermedad o afección ósea asociada con hipergastrinemia. La enfermedad o afección ósea puede también ser exhibida por sujetos con circunstancias específicas, como se describe en el siguiente párrafo.

El término "sujeto", tal como se emplea en este documento, se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano. Por ejemplo, este sujeto puede incluir sujetos que son i) personas mayores (de sexo masculino o femenino); ii) mujeres con la función ovárica disminuida o insuficiencia de ésta, iii) cualquier individuo con hipergastrinemia- o bien natural (neoplásica o asociada con atrofia de la mucosa gástrica) o iv) como consecuencia del uso de farmacoterapia supresora de ácidos (las clases de agentes que incluyen todos los inhibidores de la bomba de protones o todos los antagonistas de los dos receptores de histamina de corta o larga acción) o v) individuos con gastrectomía parcial. En todos los casos, la enfermedad o afección ósea se puede mejorar en estos sujetos con el uso de una clase de agente dirigido a la gastrina. Por ejemplo, la clase de agente dirigido a la gastrina es un antagonista de gastrina dirigido al receptor CCK2.

La expresión "agente dirigido a la gastrina", tal como se emplea en este documento, significa un antagonista de gastrina, como un agente dirigido a la gastrina o un agente dirigido al receptor de gastrina, además de un antagonista de gastrina o del receptor de gastrina, por ejemplo, un agente que se dirige al receptor CCK2.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se emplea en este documento, significa la cantidad de agente dirigido a gastrina descrito en la presente solicitud que logrará la meta de tratar, mitigar los efectos o prevenir la enfermedad o afección ósea, o que mejorará la intensidad de la enfermedad o afección y la frecuencia de su incidencia. La mejoría de la intensidad de la enfermedad o afección incluye la reversión de la enfermedad o afección, además de la ralentización de la progresión de la enfermedad o afección.

El término "tratar" o "tratamiento", tal como se emplea en este documento, significa aliviar, inducir la estasis o posponer o reducir la progresión, el desarrollo, el inicio o la intensidad de la enfermedad o afección o uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno o afección descrito en este documento, o mitigar los síntomas descontrolados o indeseados existentes, o aliviar o prevenir causas metabólicas o subyacentes de los síntomas. Por consiguiente, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso en un sujeto con una enfermedad o síntoma, o con el potencial de desarrollar dicha enfermedad o síntoma. Se logra una respuesta cuando el sujeto experimenta el alivio parcial o total, o la reducción de uno o más signos o síntomas de la enfermedad o afección como, entre otros, reversión o prevención de pérdida ósea, reversión o prevención de pérdida de masa ósea, reversión o prevención de fractura ósea o riesgo de ésta, aumento de densidad ósea o prevención de su disminución, aumento del remodelado óseo, reducción de la resorción ósea y/o regeneración ósea.

Se ha de entender que el uso del término "aproximadamente" en este documento en referencia a un valor numérico enunciado incluye el valor numérico enunciado y valores numéricos dentro de más o menos diez por ciento del valor enunciado.

Se ha de entender que el uso del término "entre" en este documento cuando hace referencia a un intervalo de valores numéricos abarca los valores numéricos en cada valor extremo del intervalo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de 10 pares de bases a 20 pares de bases de longitud es inclusiva de una secuencia de ácido nucleico de 10 pares de bases de longitud y una secuencia de ácido nucleico de 20 pares de bases de longitud.

B. Función de las células G y la gastrina en la detección del calcio y la enfermedad ósea

La osteoporosis, caracterizada por pérdida ósea y alto riesgo de fracturas, es una de las enfermedades más frecuentes, particularmente en la tercera edad, y se estima que afecta a aproximadamente 100 millones de personas de todo el mundo. Si bien la insuficiencia ovárica y la desmineralización ósea están bien reconocidas como elementos clave en esta enfermedad, la etiología precisa sigue sin resolverse por completo. Con referencia a la Figura 1, se muestran los reguladores hormonales y minerales conocidos del remodelado óseo.

Bajo circunstancias normales, el remodelado óseo ocurre como respuestas fisiológicas y mecánicas para mantener la fuerza y la homeostasis mineral (particularmente el calcio). Estas implican fenómenos interrelacionados de formación y resorción efectuados por la actividad de los osteoblastos y los osteoclastos. Típicamente, esto implica cuatro etapas que incluyen la activación del precursor de osteoclastos, la resorción activa, la reversión de la resorción y la formación de hueso nuevo. Las primeras dos etapas toman 2-4 semanas, la última etapa toma 4-6 meses.

El remodelado óseo aumenta en mujeres peri-menopáusicas y post-menopáusicas tempranas y luego se ralentiza con la edad, pero sigue a una velocidad mayor que en mujeres pre-menopáusicas. Se cree también que el remodelado óseo aumenta en hombres de edad avanzada.

Con referencia a la Figura 2, el hueso cortical es denso y sólido, y rodea el espacio de la médula. Tiene una superficie perióstica exterior y una superficie endóstica interior. Típicamente es metabólicamente menos activo que el hueso trabecular. La actividad de la superficie perióstica es importante para el crecimiento aposicional y la reparación de fracturas. La superficie endóstica tiene una mayor actividad de remodelado que la superficie perióstica, probablemente como resultado de una mayor sobrecarga mecánica o mayor exposición a la señalización del compartimiento de la médula ósea adyacente.

El aumento del remodelado cortical causa un incremento en la porosidad cortical y una reducción de la masa ósea cortical. La resorción ósea típicamente excede la formación ósea en la superficie endóstica, mientras que la formación ósea típicamente excede la resorción ósea en la superficie perióstica.

El hueso trabecular está compuesto por una red de tipo panal de abeja de placas y varillas trabeculares intercaladas en el compartimiento de la médula ósea. Es más metabólicamente activo que el hueso cortical. El recambio en este tipo de hueso parece ser el más importante para el metabolismo mineral y el mantenimiento de la fuerza mecánica.

La biología del remodelado óseo es compleja e implica una gama de factores de activación, p. ej., PTH, estrógeno, factores de crecimiento y citocinas inflamatorias, además de ingesta dietaria, p. ej., calcio y vitamina D. Esto ha llevado al desarrollo de un amplio espectro de terapias que están ahora disponibles. Éstas incluyen terapia de reemplazo hormonal, bisfosfonatos, dietas ricas en calcio y vitamina D, hasta el uso de estatinas, factor de crecimiento de fibroblastos 1, o la paratohormona (PTH) propiamente dicha.

La PTH se considera el regulador pivotal del metabolismo óseo, ya que potencia la liberación de Ca2+ del reservorio del hueso a través del proceso de resorción. El efecto de la PTH es, no obstante, indirecto, ya que los osteoclastos no tienen un receptor de PTH. La PTH en cambio se une a los osteoblastos y resulta en la expresión de RANKL. RANKL activa las células precursoras de osteoclastos mediante el receptor de RANK, para condensar, formando nuevos osteoclastos que son responsables de la resorción ósea.

Las pruebas que respaldan la función de la PTH en la osteoporosis provienen de diversos estudios que describen que los valores de PTH son mayores en las personas mayores que en adultos jóvenes. Se han propuesto una serie de factores que contribuyen a valores mayores de PTH, incluida una disminución de la función renal, absorción intestinal del calcio (Ca2+) menos eficiente, quizás debido a una pérdida de motivación para comer, resistencia a la acción calcémica de la PTH, una mayor prevalencia de insuficiencia de vitamina D y, más particularmente, aumento del pH gástrico en personas de edad avanzada.

Esto último refleja tanto la pérdida de masa de células parietales (atrofia mucosa) con elevaciones concomitantes en el pH gástrico como un aumento de la segregación de gastrina de la célula G neuroendocrina del antro.

Las alteraciones relacionadas con la edad en la integridad y la función de la mucosa gástrica se consideran un problema importante en las dolencias gastroenterológicas de la tercera edad, además de ser responsables de un aumento de susceptibilidad a los fármacos, hemorragia e imposibilidad de absorber Ca2+ y hierro adecuadamente.

Se cree que un eje Ca2+/PTH/vitamina D mantiene la homeostasis del Ca2+ sistémica coordinando las funciones de la glándula paratiroidea, el riñón y el tubo digestivo para aumentar el Ca2+ en el suero sin aumentos concomitantes en los niveles de fósforo en el suero. Este eje está principalmente diseñado para proteger contra hipocalcemia, movilizando el Ca2+ del esqueleto, conservando el Ca2+ por los riñones y aumentando la absorción de Ca2+ gastrointestinal.

En respuesta a una reducción en la concentración de Ca2+ en el suero, el receptor sensor de calcio (CaSR) en la glándula paratiroidea aumenta la segregación de PTH, mientras que el CasR en el riñón reduce la excreción de Ca2+ renal. El sensor de calcio no se limita, sin embargo, a las glándulas paratiroideas, y el CaSR está presente en una diversidad de otros tipos de células, incluida la célula G productora de la gastrina del antro. Esta célula neuroendocrina, dada su ubicación gástrica, está posicionada exclusivamente para detectar y responder a la ingesta dietaria de Ca2+.

Los CaSR detectan cambios en la concentración de Ca2+ extracelular e inician respuestas hormonales adaptativas y al transporte de iones para mantener la homeostasis de calcio sistémica. Se considera actualmente que la glándula paratiroidea, las células C tiroideas y el riñón representan los sitios fisiológicamente relevantes de expresión de CaSR. En general, el Ca2+ extracelular circulante bajo (<1 mM) es el estímulo principal para la segregación de PTH de las células paratiroideas. En concentraciones superiores, el Ca2+ inhibe la síntesis de PTH y la segregación a través de la fosforilación de CaSR y la subsiguiente inactivación.

Se ha identificado también un CaSR en células C parafoliculares ovinas y en la línea celular de carcinoma tiroideo medular (MTC), TT. Esta última responde al Ca2+ con segregación de calcitonina.

Si bien se ha identificado un CaSR en osteoblastos y osteoclastos, no está clara la función fisiológica del sensor de Ca2+, ya que éstos se expresan en niveles muy bajos en estas células. En contraste con las células óseas, se ha identificado un CaSR fisiológicamente relevante en el estómago. Recientemente, se ha clonado y secuenciado un CaSR de células G de antro humano, y funciona a concentraciones de Ca2+ > 2mM.

Las siguientes subsecciones (1-8) proporcionan un breve panorama y análisis de los estudios demostrados en este documento en los Ejemplos. Estas subsecciones se exponen para ilustrar en más detalle los Ejemplos y no están destinadas a limitar los resultados y conclusiones contenidos en ellas.

1. Estudios de células G aisladas

Se demuestra aquí una función fisiológica de las células G como sensores de Ca2+ (véase el Ejemplo 1, Figura 3). En general, el calcio ingerido durante una comida (1-10 mM) estimula la liberación de gastrina. A nivel mecánico, el Ca2+ extracelular es absorbido por el CaSR gástrico que activa la liberación de gastrina a través de vías inducidas por calcio. Los resultados expuestos en este documento identifican en más detalle la célula G como la célula neuroendocrina pivotal en la homeostasis del calcio intestinal/paratiroideo.

Se efectuaron investigaciones para confirmar la presencia de un receptor de PTH en la liberación de gastrina medida por PTH y células G después de la activación de cAMP (véase la Figura 4). Estas investigaciones son respaldadas por otros estudios. Por ejemplo, la infusión de PTH (40 unidades/20 min) aumentó los niveles de gastrina en la sangre antral y venosa mixta sin inducir hipercalcemia sistémica en cerdos anestesiados. Asimismo, la PTH bovina nativa y la 1-34 PTH humana sintética (0,02-4 U/min) produjeron incrementos rápidos (dentro de 10-30 min) y pronunciados (aproximadamente 10 veces) en la liberación de gastrina en cerdos anestesiados jóvenes.

También se efectuaron estudios en células de gastrina aisladas para demostrar que el 17p-estradiol (agonista de ESRa) inhibió la liberación de gastrina (véase la Figura 6). Los efectos de no dirigirse al genoma del estrógeno han estado bien definidos en otros tipos de células tales como tejido de mama. Estos efectos, la señalización de MAPK mediada por ERa, son también demostrables en la célula G, en donde el estrógeno es un potente inhibidor de la segregación de gastrina.

Esta información indica que alterar el entorno de estrógenos concordante con el estado menopáusico alterará/estimulará profundamente la función de las células G (señalización y segregación). Esto es concordante con informes anteriores en ratas de edad avanzada de la existencia de un entorno que incluye aumento de la función de las células G y una PTH elevada. Esta combinación es bien aceptada como relacionada con el desarrollo de la osteoporosis.

Otros estudios in vitro han identificado que la segregación de gastrina puede ser modulada por la producción intestinal de histamina y serotonina. La propuesta de una función de la histamina en la modulación del sistema esquelético se asocia con información equívoca. La liberación excesiva de histamina en mastocitosis y enfermedades alérgicas puede conducir al desarrollo de la osteoporosis. En contraste, la histamina puede incrementar la resorción ósea tanto directamente a través de los precursores de osteoclastos y los osteoclastos, como indirectamente, aumentando la expresión de RANKL (el receptor activador de los osteoclastos) en osteoblastos. Además, en estudios in vivo, los antagonistas de los receptores H1 y H2 pueden ejercer efectos protectores sobre el tejido óseo, aunque esto no se reproduce de manera uniforme en todos los modelos experimentales. No obstante, la histamina regla la liberación de gastrina tanto ex vivo como in vitro.

La función de la serotonina en el metabolismo óseo no se ha esclarecido por completo. La inyección de serotonina aumenta la densidad mineral ósea en ratas mediante la proliferación de osteoblastos mediada por serotonina (estas células expresan receptores 5 -HT²). En un modelo animal, la serotonina pareció inhibir la formación de hueso en un modo dependiente de Lrp5. Lrp5 limita la producción de serotonina mediante la inhibición de la enzima de síntesis de serotonina limitante de la velocidad, triptófano hidroxilasa 1 (Tph1). En estudios clínicos, no obstante, las mutaciones de LRP5 no se asocian con ningún cambio en la serotonina circulante, y los pacientes exhiben masa ósea elevada. Los inhibidores de absorción de serotonina (SSRI) se han asociado con proliferación de osteoblastos, pero en mujeres de mediana edad, el uso de los SSRI no se asoció con un incremento de la tasa de pérdida ósea. Además, los altos niveles de serotonina circulante en el síndrome carcinoide no se asociaron con densidad ósea inferior importante, estructura ósea más deficiente o marcadores de formación ósea inferiores. Cualquier efecto de la serotonina puede ser alternativamente mediante la célula G; la liberación de gastrina es estimulada por los receptores de 5 -HT³. La amina puede por lo tanto modular la formación ósea a través de la actividad en la célula G.

Al evaluarse colectivamente, los datos y observaciones presentados en este documento, p. ej., la existencia de un receptor sensor de calcio luminal, la expresión selectiva de receptores para la regulación funcional paratiroidea y tiroidea, además de la vitamina D, y la expresión del receptor aminérgico (positivamente regulado por histamina y serotonina), identifican la célula G como la célula neuroendocrina pivotal en el eje de homeostasis de calcio intestinal/paratiroidea.

2. Estudios de diana de gastrina ( in vitro)

Los estudios demostrados en este documento exploran qué células pueden ser dianas de gastrina potenciales. A su vez, estos estudios examinaron si la célula de gastrina podría regular el eje de homeostasis de calcio a través de la liberación de gastrina (véase el Ejemplo 2).

La presencia de los receptores CCK² en las células principales (chief cells) de PTH no se ha esclarecido, pero se ha sugerido en una serie de estudios fisiológicos. En células paratiroideas bovinas aisladas, la gastrina en altas concentraciones (>1 pM) aumentó la acumulación de cAMP (40-60% en ~50% de los experimentos), un prerrequisito necesario para la liberación de PTH.

Modelos aviares también han respaldado esta observación. La inducción de hipergastrinemia (usando el inhibidor de la bomba de protones (PPI), omeprazol (400 pM/kg/día) durante 5 semanas) en pollos produjo un incremento en el tamaño de la glándula PTH, así como también en la transcripción de PTH. Estos efectos se recapitularon por inyección de gastrina (continua, 5 nmol/kg/hora, durante 3 semanas).

Los estudios descritos en este documento demuestran la expresión de los receptores de gastrina/CCK² en células principales de PTH humanas aisladas (de muestras quirúrgicas humanas), y que la gastrina posee un efecto estimulador sobre la síntesis y liberación de PTH humana (véase la Figura 8). Por consiguiente, se demuestra en este documento que las células paratiroideas son dianas de gastrina. Ya que la PTH estimula la liberación de gastrina (véase la Figura 4), la activación de la segregación paratiroidea (PTH) indica un bucle estimulador proactivo (célula G a PTH). La expresión del receptor de histamina H¹ estimulador también se identificó en estas células en estudios presentados en este documento.

La expresión del receptor de histamina H¹ estimulador también se identificó en células G. Se sabe que la histamina es un activador conocido de la producción de cAMP y la segregación de PTH en glándulas PTH hiperplásicas y normales. Las células C y los tumores derivados de células C (carcinomas tiroideos medulares) expresan los receptores de gastrina/CCK². Además, la gastrina induce la producción de cAMP y la liberación de calcitonina en cortes tiroideos humanos.

3. Identificación de dianas de gastrina funcionales en el hueso

Con el fin de evaluar los efectos directos de la gastrina sobre el hueso propiamente dicho, se evaluó la presencia de receptores de gastrina en las células óseas, y si la gastrina tenía un efecto en células derivadas de hueso (Véase el Ejemplo 3).

Los efectos de la gastrina se examinaron en tres modelos distintos, 1) osteoblastos de calvaria de ratón; 2) la línea de osteoblastos fetales humanos hFOB 1.19; 3) células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana (BMMSC). Los osteoblastos de calvaria son modelos conocidos para estudiar la función de los osteoblastos, incluidas proliferación, mineralización y señalización celular. hFOB es una línea celular humana transfectada de antígenos T grandes SV40 utilizada como modelo para estudiar la diferenciación de osteoblastos humanos normales, la fisiología de los osteoblastos y el factor de crecimiento hormonal, y otros efectos de las citocinas sobre la función y la diferenciación de los osteoblastos. BMMSC son células estromales de médula multipotenciales que se pueden diferenciar en una diversidad de tipos celulares requeridos para la regeneración del tejido, incluidos osteoblastos y condrocitos, y parecen cumplir una función patológica en artrosis relacionada con la edad.

Los resultados demostrados en este documento muestran que múltiples tipos de células dentro del hueso pueden ser activados/regulados por la gastrina. Ya que la sangre circulante que contiene gastrina se filtra a través de la médula ósea, las alteraciones en los niveles de gastrina circulante son biológicamente relevantes para cualquier célula derivada de hueso que exprese el receptor CCK2.

Puesto que la gastrina es un regulador proliferativo conocido, también se estudió el efecto de la gastrina en la proliferación (absorción de BrdU) en los tres modelos de células distintos. Los resultados demostrados en la presente memoria muestran, entre otras cosas, que la gastrina estimula la proliferación de osteoblastos y BMMSC que no se revierte con un antagonista de gastrina (GA) selectivo. Estos resultados también indican que la gastrina causa la no diferenciación de los osteoblastos con pérdida de mineralización. El antagonista GA no reduce la proliferación, pero permanece el fenotipo óseo. Se demuestra mediante los resultados expuestos en este documento que la gastrina afecta directamente la función de las células óseas en dos niveles: los osteoblastos y las células derivadas de médula ósea, y que probablemente tenga un efecto en la placa de crecimiento a través de la regulación del comportamiento de los condrocitos.

4. Estudios de gastrina: efectos de los inhibidores de la bomba de protones sobre la función de las células G

La segregación de gastrina es una respuesta fisiológica dinámica regulada por dos aspectos del envejecimiento que se asocian con osteoporosis - envejecimiento y atrofia de la mucosa gástrica - que se asocia con pH gástrico elevado prolongado debido a pérdida de células parietales que segregan ácido. Las elevaciones sostenidas en el pH gástrico que resulta en niveles elevados de gastrina circulante también se asocian con PPI a largo plazo o con el uso del antagonista del receptor H2. Estos agentes a menudo se utilizan para tratar síntomas gástricos dispépticos o reflujo gastroesofágico, los cuales son particularmente relevantes en la población de mujeres de edad avanzada.

Un entorno gástrico ácido (bajo pH gástrico) es también importante para facilitar la producción de calcio ionizado que es óptimamente absorbido por el tubo digestivo.

En seres humanos, tanto la gastrectomía (falta de ácido) como la anemia perniciosa (pérdida de células parietales que culmina en un estado de poco ácido) están bien documentadas como asociadas con incremento del riesgo de osteopenia y fractura. La gastrectomía usualmente implica extracción de las células que segregan ácido con disminución significativa del ácido gástrico, la anemia perniciosa se asocia con pérdida de células parietales (que producen ácido), pH gástrico elevado (>4), pero el estómago retiene las células neuroendocrinas funcionales tanto en el fondo (células ECL) como en el antro (células de gastrina).

Los niveles de pH gástrico elevado y de gastrina elevada también ocurren en estómago de sujetos de edad avanzada y con el uso de PPI a largo plazo. Los PPI se han implicado en un incremento de la resorción ósea y riesgo de fractura. Las funciones de inhibición de ácido (pH gástrico elevado) sobre la función de las células G y la segregación de gastrina se demuestran en este documento (véase el Ejemplo 4). Los resultados muestran, entre otras indicaciones, que aumentar el pH gástrico de manera significativa afecta la función de las células G. En particular, la actividad del sensor de Ca2+ de las células G y la respuesta a la regulación fisiológica se ven afectadas.

5. Efectos del bloqueo de ácido sobre la dinámica del hueso: Modelo hipergastrinémico de Mastomys

El advenimiento de medicamentos supresores de ácido potentes como los PPI ha revolucionado el manejo de las enfermedades relacionadas con ácido. Muchos millones de individuos usan estos medicamentos de manera continua o a largo plazo.

Se sabe que la hipoclorhidria importante (pH gástrico alto), particularmente entre la población de la tercera edad que también exhibe una disminución del aclaramiento de los PPI y una mayor prevalencia de la infección por Helicobacter pylori, resulta en una absorción deficiente del calcio. Esto es respaldado por una serie de estudios que han demostrado que la terapia con PPI reduce la absorción de calcio insoluble, así como también la densidad ósea. Por lo tanto, un aumento significativo del riesgo de fractura de cadera se asocia con la terapia de PPI a largo plazo, particularmente entre usuarios a largo plazo de altas dosis de PPI.

Teniendo en cuenta los problemas anteriormente expuestos con los PPI, los resultados demostrados en este documento investigan el efecto de la supresión de ácidos en el estómago, hormonas circulantes, paratohormonas, además de la fisiología ósea en el modelo de Mastomys (véase el Ejemplo 5). Los resultados confirman, entre otras indicaciones, que la hipergastrinemia inducida por medicamentos supresores de ácido se asocia con alteraciones óseas similares a los aspectos morfológicos identificados con la osteoporosis.

6. Efectos del bloqueo de ácido sobre la dinámica del hueso en Mastomys sometidos a ovariectomía

Se realizó una ovariectomía en el modelo de Mastomys para generar un fenotipo "post-menopáusico" para estudios del hueso. Ya que se ha demostrado en este documento que la pérdida de estrógenos regula las células G, se evaluó la función específica de la pérdida de estrógenos en el fenotipo óseo (véase el Ejemplo 6). Los resultados respaldan, entre otras indicaciones, que los niveles de gastrina circulante amplían los cambios óseos mediados por la pérdida de estrógeno.

7. Efectos de la función neuroendocrina gástrica y la dinámica del hueso: modelos de ratones genomanipulados (con y sin ovariectomía)

En ratas, la gastrectomía (extirpación de todo el estómago, incluidas las células G del antro y la célula ECL segregadora de histamina) o el uso de PPI, p. ej., omeprazol, lleva a la absorción deficiente de fosfato de calcio y a una densidad mineral ósea obstaculizada y a osteopenia. Una observación adicional es que la infusión de Gastrina-17 induce hipocalcemia en ratas.

En animales experimentales, la gastrectomía parcial y total, y la vagotomía gástrica (truncal/selectiva, etc.) (que alteran la segregación de células neuroendocrinas), repercuten en la homeostasis mineral extracelular y producen osteopenia como una secuela tardía.

Se desconocen los mecanismos que subyacen a la osteopenia post-vagotomía o post-gastrectomía. Posiblemente, reflejen o bien efectos directos de la gastrina sobre el eje PTH/Ca²⁺ o sobre la función ósea, o un efecto indirecto, p. ej., por histamina. Cabe destacar la observación de que la vagotomía ipsilateral es curativa para osteoartropatía pulmonar hipertrófica (HPOA) asociada con cáncer de pulmón. De modo similar, la vagotomía inducida por lesiones pulmonares neoplásicas apicales invasivas (síndrome Pancoast) se asocia con cambios óseos ipsilaterales en el brazo.

La histamina es segregada por la célula de tipo enterocromafina (ECL) del fondo gástrico y es un regulador importante de la segregación de ácido, ya que su segregación es principalmente promovida por la gastrina circulante. La célula ECL de la mucosa oxíntica (fondo gástrico) es una célula endocrina "cerrada" localizada - es decir, no tiene acceso al lumen gástrico, y por lo tanto no responde directamente al calcio dietario.

Los productos segregadores de la célula ECL incluyen histamina, cromogranina A y pancreastatina, y la proteína de unión al calcio, calbindina. Las células ECL expresan receptores de gastrina e histamina y funcionan principalmente para transducir la señal de gastrina (por segregación de histamina) para regular la segregación de ácido mediado por las células parietales (HCL) adyacentes.

Se ha demostrado que la histamina propiamente dicha exhibe una influencia independiente sobre la función de las células óseas. Los estudios, no obstante, son equívocos con respecto a si la histamina es protectora u osteopénica. Se ha observado que el exceso de liberación de histamina en mastocitosis y enfermedades alérgicas se asocia con el desarrollo de osteoporosis. Esto sugiere que la histamina cumple una función en el remodelado óseo. Otro soporte de esta sugerencia es la observación de que la extirpación quirúrgica de la parte productora de ácido del estómago (mucosa oxíntica/fúndica) que contiene la célula ECL reduce la masa ósea en la rata. Estas observaciones son además respaldadas por estudios in vitro. Por lo tanto, en células MC3T3-E1 (E1) osteoblásticas que expresan los receptores de histamina H^1-3, la histamina incrementa la expresión del transcrito RANKL y la producción de proteínas. Estos efectos son inhibidos por los antagonistas del receptor H¹. En co-cultivos, con células de médula ósea (MC3T3-E1 (E1) derivadas de calvaria de ratón), la histamina estimuló la osteoclastogénesis en presencia de vitamina D³. Este efecto es bloqueado por la pre-incubación con el anticuerpo neutralizante contra ODF/RANKL. Usando un planteamiento de micromatriz para investigar la diferenciación de células precursoras hematopoyéticas de médula ósea en osteoclastos de resorción ósea, se observó que RANKL estimuló 70 genes diana, incluido el receptor H¹. Los estudios con el antagonista del receptor H² , famotidina, en ratas sometidas a ovariectomía, demostraron la inhibición de la masa ósea vertebral a través de la reducción de la actividad de los osteoclastos. Estos efectos fueron a corto plazo y se perdieron aproximadamente a los 6 meses. Una sumatoria de estos datos indica que la histamina tiene una función activa en la regulación de la resorción ósea. Esta observación es respaldada por los datos de un estudio de caso:control grande registrado que demuestra que el uso a largo plazo de antagonistas del receptor de histamina H1 redujo el riesgo de fractura ósea.

En células ECL, la enzima crítica responsable de la regulación de la segregación de histamina es histidina descarboxilasa (HDC). Los ratones deficientes de HDC se caracterizan por una carencia absoluta de síntesis de histamina, además de una resistencia a la gastrina y segregación de ácido gástrico basal disminuida. Estos animales exhiben espesor femoral y espesor de las vértebras torácicas significativamente aumentados asociados con contenido mineral óseo elevado y reducción de la resorción ósea. Los osteoclastos disminuyeron tanto en número como en actividad. Cuando los ratones deficientes de HDC se someten a ovariectomía, la pérdida de hueso cortical y trabecular se reduce en 50%, lo que indica que la deficiencia de histamina protege el esqueleto contra osteoporosis promovida por estrógenos. La inferencia es por lo tanto que la histamina actúa para aumentar el remodelado óseo mediado por estrógenos.

Si bien es convincente considerar que la célula ECL produce una amina osteotrópica o péptido alternativo, no se ha identificado dicha hormona. Por consiguiente, parece probable que la función de la histamina sea como factor de enlace entre la gastrina, la célula ECL y la patofisiología ósea, ya que la síntesis y segregación de esta amina está muy inextricablemente enlazada a la gastrina.

Los estudios del presente documento demuestran una relación entre la histamina y la gastrina en la mediación del metabolismo (integridad) óseo usando modelos genomanipulados de gastrina e histamina (véase el Ejemplo 7).

Dirigirse al receptor de gastrina/CCK2 se ha estudiado a nivel farmacológico en enfermedades como cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos gástricos y úlcera péptica. La génesis de esta última se relaciona con la función estimuladora de ácido de las células ECL a través de la síntesis y la liberación de histamina, y el concepto de que la supresión de la segregación de histamina por bloqueo de los receptores de gastrina reduciría la segregación de ácido. Uno de dichos antagonistas es YF476, un antagonista del receptor de gastrina/CCK2 basado en 1,4-benzodiazepin-2-ona-y relacionado con el análogo arquetípico L365,260. YF476 ha demostrado eficacia en la síntesis y liberación de histamina de las células ECL tanto in vitro como in vivo. Ya que la segregación de histamina se activa con la estimulación del receptor CCK2 mediado por gastrina, un evento fisiológico separado de los efectos de segregación de ácido implicaría la capacidad de un antagonista del receptor CCK2 para bloquear no solamente los efectos relacionados con la liberación de histamina sobre el hueso sino también cualquier efecto directo de la gastrina sobre el hueso propiamente dicho.

8. Estudios demostrativos prelim inares: Efectos de un antagonista de gastrina sobre el fenotipo óseo mediado por ovariectomía en tres modelos de roedores

Los estudios descritos en este documento evaluaron los efectos del antagonista de gastrina, YF476, sobre la pérdida de densidad ósea/alteraciones óseas mediadas por OVX en tres modelos de roedores con un foco en los estudios de fuerza ósea, morfología y biomarcadores circulantes (véase el Ejemplo 8).

C. Tratamiento de una enfermedad o afección ósea con el uso de agentes d irig idos a la gastrina

Los estudios presentados en este documento demuestran, entre otras indicaciones, la presencia de receptores CCK2 en hueso, y la eficacia de los agentes dirigidos a la gastrina en el tratamiento de enfermedades óseas. Se dan a conocer métodos y composiciones para uso de dichos agentes dirigidos a la gastrina para el tratamiento y la prevención de enfermedades o afecciones óseas, incluidas aquellas caracterizadas como osteoporosis.

En algunas realizaciones, los agentes dirigidos a la gastrina adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ello, reguladores de gastrina como: péptido liberador de gastrina (GRP) (bombesina), somatostatina y análogos de somatostatina incluidos octreótido (OCTR) y RC-160. En otras realizaciones, los agentes dirigidos a la gastrina adecuados incluyen antagonistas del receptor CCK2 como netazepida (YF476) y otros agonistas del receptor de gastrina/CCK21,4-benzodiazepin-2-ona-bastin. En algunas realizaciones, el agente dirigido a la gastrina se selecciona entre agonistas del receptor c Ck 2: Z-360, L-740093, YM022, RP73870, JB93182, AG041R, proglumida (y análogos), JNJ-2607109 (y derivados), CI-988, PD-135158, L-365260, LY-288513, L-364718, GW-5823, Lorglumida, CR 2194 (Espiroglumida), PD-149164, PD-135666, CI-1015, RP-69758, TP-680, PD-140548 e Itriglumida (y derivados).

El agente dirigido a la gastrina se puede administrar a un sujeto por cualquier vía subcutánea. En algunas realizaciones, el agente dirigido a la gastrina se administra con una inyección intramuscular superficial. En otras realizaciones, el agente dirigido a la gastrina se administra por vía intravenosa u oral.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para ilustrar mejor la invención reivindicada y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. En la medida en que se mencionen materiales específicos, será exclusivamente para fines de ilustración y no para limitar la invención. El experto en la técnica puede desarrollar medios o reaccionantes equivalentes sin el ejercicio de la capacidad inventiva y sin desviarse del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Estudios de células G aisladas

Con referencia a la Figura 3, se llevaron a cabo estudios que demuestran una función fisiológica para la célula G como un sensor de Ca²⁺-. Aumentar la concentración de Ca²⁺ externa estimuló la liberación de gastrina de células G aisladas por mecanismos que implican la vía de PKC y el flujo de Ca²⁺ mediante canales de calcio sensibles a dihidropiridina. La CE⁵⁰ fue 4,1 mM, y esto ocurrió principalmente mediante una vía regulada por PKC. Estos resultados son concordantes con el funcionamiento de las células G como un sensor de calcio dietario (luminal).

Asimismo, se identificó la presencia de un receptor de PTH en la célula G. Con referencia a la Figura 4, se demostró la liberación de gastrina mediada por PTH después de la activación de cAMP. La PTH estimuló significativamente la liberación de gastrina (CE⁵⁰=60 nM) a través de la activación de PKA y la producción de cAMP intracelular, demostrando que el receptor de PTH en las células G es funcional y que la segregación de gastrina por esta célula antral sensora de calcio luminal puede ser regulada por PTH.

También se identificó el receptor de calcitonina en las células G. Con referencia a la Figura 5, se demostró que la calcitonina (de células C tiroideas), en contraste con la PTH, inhibió la liberación de gastrina a través de la inhibición de la producción de cAMP.

Esto demuestra que la célula G, al igual que otras dianas de PTH/calcitonina (p. ej., osteoblastos), puede ser estimulada (PTH) o inhibida (calcitonina) por sistemas de células neuroendocrinas que no están presentes en el estómago.

Estas observaciones proporcionan pruebas de que los reguladores conocidos de homeostasis de calcio (a través de la detección de niveles de Ca²⁺ en el plasma - PTH/células tiroideas) pueden afectar directamente una célula sensora de calcio luminal del estómago - la célula G productora de gastrina - y modificar su perfil secretor.

Se evaluó el efecto de la hormona ovárica, el estrógeno en la función de las células G. Con referencia a la Figura 6, la presencia del transcrito del receptor de estrógenos (ESRa) en la célula de gastrina se identificó usando PCR en tiempo real. Se demostró además en células de gastrina aisladas que el 17-estradiol (agonista de ESRa) inhibió la liberación de gastrina (CÍ⁵⁰=4,6x10^-12M), la producción de cAMP (CI^so=1,1x10^-12M) y la actividad de MAPK (Figura 6).

Esta información indica que alterar el entorno del estrógeno de manera concordante con el estado menopáusico alterará/estimulará profundamente la función de las células G (señalización y segregación). Esto concuerda con los informes previos en ratas de edad avanzada de la existencia de un entorno que incluye una función aumentada de las células G y una PTH elevada. Esta combinación es bien aceptada como relacionada con el desarrollo de osteoporosis.

Con referencia a la TABLA 1, una comparación de transcritos con preparaciones aisladas de células EC y ECL neuroendocrinas demuestra que la célula G es la única célula que puede detectar calcio luminal, ya que es la única célula neuroendocrina que expresa CaSR pero no calbindina. Con referencia a la Figura 7, esto indica que la segregación de gastrina de las células G puede estar directamente regulada por la PTH segregada por las células principales paratiroideas, calcitonina de las células C tiroideas y estrógeno de células ováricas.

TABLA 1. Comparación de la presencia de transcritos y receptores neuroendocrinos asociados con el metabolismo de calcio en células G, células EC y células ECL según lo medido por análisis del transcriptoma (micromatrices U133A)

Los resultados identifican la célula G como la célula neuroendocrina pivotal en el eje de homeostasis intestinal/paratiroideo.

Ejemplo 2: Estudios de diana de gastrina (in vitro)

Se evaluaron los tipos de células como potenciales dianas de gastrina. Se determinó la regulación por la célula de gastrina del eje de homeostasis de calcio a través de la liberación de gastrina.

Se demostró la expresión de los receptores de gastrina/CCK² en células principales de PTH humanas aisladas (de muestras quirúrgicas humanas). Con referencia a la Figura 8, se demostró también que la gastrina posee un efecto estimulador sobre la síntesis y liberación de PTH humana. Estos resultados indican que las células paratiroideas son una diana de gastrina. Ya que la PTH estimula la liberación de gastrina (véase la Figura 4), la activación de la segregación paratiroidea (PTH) indica un bucle estimulador proactivo (célula G a PTH). La expresión del receptor de histamina H¹ estimulador también se identificó en estas células.

Con referencia a la Figura 9, la gastrina estimuló la liberación tanto de cAMP como de calcitonina de la línea celular MTC humana bien diferenciada, MTC-SK, efectos que se revirtieron con el antagonista de CCK² selectivo, YF476 (CI⁵⁰ = 8,6x10^-13M). Estos resultados indican que las células C tiroideas representan una diana de gastrina. Ya que la calcitonina inhibe la liberación de gastrina (véase la Figura 5), la activación de células C proporcionaría un bucle inhibidor de retroalimentación.

Con el fin de evaluar la sensibilidad general (estimuladora o inhibidora) del sistema tiroideo/paratiroideo a la gastrina, se evaluaron los efectos de la gastrina sobre sistemas de co-cultivo paratiroideo/MTC-SK. Se evaluó si la gastrina fue un estimulador de resorción ósea (a través del incremento de la síntesis y liberación de PTH) o un inhibidor de este proceso a través de la liberación de calcitonina.

Con referencia a la Figura 10, la estimulación del receptor CCK² (expresado en células C tanto paratiroideas como tiroideas), produjo una elevación importante en la transcripción y segregación de PTH de células de PTH cultivadas. En contraste, la gastrina produjo una inhibición importante de la síntesis y liberación de calcitonina. Estos efectos se revirtieron con la pre-incubación con el antagonista de CCK² selectivo, YF476.

Estos resultados indican que la estimulación de gastrina de las células C tiroideas se revierte con la PTH liberada de las células paratiroideas. Esto comprueba que dentro de este sistema de co-cultivo modelo, los efectos de la gastrina consisten en un efecto predominantemente mediado por PTH. En voluntarios sanos, el efecto de la infusión de gastrina consiste en aumentar la segregación de PTH en lugar de calcitonina (liberación significativamente inferior). Esto sugiere que cualquier efecto in vivo de la gastrina en la glándula tiroidea se relaciona principalmente con la paratiroides y la liberación de PTH.

Estos resultados respaldan que la liberación de una hormona del intestino (gástrica) por una célula sensora luminal (la célula G) regula directamente la segregación de calcitonina de la célula C paratiroidea e indirectamente de la célula C tiroidea-.

Ejemplo 3: Identificación de dianas de gastrina funcionales en hueso

Con el fin de evaluar los efectos directos de la gastrina en el hueso propiamente dicho, se evaluó la presencia de receptores de gastrina en las células óseas, y si la gastrina tenía un efecto sobre las células derivadas de hueso. Se emplearon técnicas de QPCR, western blot e inmunohistoquímica para identificar la expresión de los receptores en el hueso. De allí en más, se examinaron los efectos de la gastrina en tres modelos distintos, 1) osteoblastos de calvaria de ratón; 2) línea celular de osteoblastos fetal humana, hFOB 1.19; 3) células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana (BMMSC).

Receptor CCK2: usando qRT-PCR, se identificó la expresión del receptor CCK2 en osteoblastos de calvaria, en la línea celular hFOB y en BMMSC humanas (Figura 11 A). Se identificó la expresión en todos los modelos, con valores CQ en el intervalo de 31,2-34. La inmunohistoquímica (IHC) identificó receptores de gastrina en el hueso de ratones - se identificó la inmunotinción específica en condrocitos en la placa de crecimiento. Se identificó cierta expresión en osteoblastos, así como también en células que recubrían el endostio (Figura 11B-C). Se efectuaron PCR estándar e inmunotransferencia western en muestras de médula ósea cortical humanas derivadas de 10 médulas óseas (recogidas después de la amputación por isquemia de miembros inducida por aterosclerosis (sin evidencia de osteomielitis). El análisis PCR identificó una banda del tamaño correspondiente al receptor CCK2 (Figura 12A). Ésta se secuenció (Sanger) y se identificó que exhibía 92% homología con CCK2R (Figura 12B). El análisis western blot confirmó la expresión de la proteína del receptor CCK2 en todas las muestras humanas (Figura 12C).

Resumen: fue identificable una diana de gastrina en osteoblastos de calvaria de ratón, en las líneas celulares hFOB y BMMSC, y en hueso que incluía la placa de crecimiento (condrocitos) y en médula ósea humana (conjuntos endósticos), indicando que la gastrina puede activar/regular múltiples tipos de células dentro del hueso. Ya que la sangre circulante que contiene gastrina se filtra a través de la médula ósea, las alteraciones en los niveles de gastrina circulantes son biológicamente relevantes para cualquier célula derivada de hueso que exprese el receptor CCK2.

Efectos de la gastrina in vitro: la gastrina es un regulador proliferativo conocido, de modo que el efecto de la gastrina sobre la proliferación (absorción de BrdU) se estudió inicialmente en los tres modelos celulares diferentes. La gastrina estimuló la proliferación en los tres tipos de células con una CE⁵⁰ de 1-2x10^-11M (Figura 13A) y un efecto máximo de ~50% (1 nM). Estos efectos estimuladores sobre la proliferación no se inhibieron con la pre-incubación con el antagonista de gastrina selectivo, YF476 (Figura 13B). Este compuesto pareció aumentar la proliferación en células BMMSC. Con el fin de evaluar la implicancia biológica de la activación de gastrina de los osteoblastos y las BMMSC, se efectuaron estudios para evaluar si estos efectos mediados por la gastrina resultaban en mineralización ósea. Se midió la unión de Osteomalge fluorescente a la porción de hidroxiapatita de nódulos mineralizados. La gastrina inhibió la mineralización ósea en los tres tipos de células con una CI⁵⁰ de 3,2x10^-11 - 1,3x10^-10M (Figura 14A) y un efecto inhibidor máximo de ~30-50% (1 nM). Estos efectos inhibidores sobre la mineralización se inhibieron con la pre­ incubación con el antagonista de gastrina selectivo, YF476 (Figura 14B). Este compuesto pareció aumentar específicamente la mineralización en osteoblastos de calvaria de ratón.

Resumen: la gastrina estimula la proliferación de osteoblastos y BMMSC que no se revierte con el antagonista de gastrina. La proliferación mediada por gastrina se asocia con una pérdida de mineralización, indicando una reversión del fenotipo de los osteoblastos. GA revirtió el efecto inhibidor de la gastrina. Estos resultados indican que la gastrina causa la no diferenciación de los osteoblastos con pérdida de mineralización. El antagonista no reduce la proliferación, sino que el ósteo-fenotipo permanece. Este efecto fue el más marcado en osteoblastos de calvaria.

Con el propósito de evaluar en más detalle la implicancia biológica de la activación de gastrina, se realizaron estudios para evaluar si estos efectos mediados por la gastrina aumentaban la expresión de la proteína morfogenética 2 ósea (BMP2 - implicada en la diferenciación de los osteoblastos), RANKL (el receptor activador de los osteoclastos expresado en osteoblastos) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF - implicado en la regulación de las células progenitoras de médula ósea y activador de la actividad de los osteoclastos).

En cultivos de calvaria de ratón, la gastrina (1 nM) inhibió completamente la expresión del gen MSCF-1, además de inhibir la transcripción de RANKL (0,8 veces) y ALKP (Figura 15). En hFOB, la gastrina también inhibió estos transcritos. La pre-incubación con YF476 revirtió y normalizó estos efectos. Ninguno de estos genes se identificó en BMMSC, pero se observaron los efectos de la gastrina para ALKP, mientras que no se identificó BMP2 en ningún tipo de célula. Esto identifica que los efectos de la gastrina son catabólicos y que inhibirlos con YF476 resulta en la normalización de la función de los osteoblastos y produce un fenotipo anabólico.

Estos datos indican que la gastrina regula no solamente la proliferación y diferenciación de los osteoblastos, sino que además está implicada en la regulación de células progenitoras. Además, la gastrina hace que las BMMSC proliferen. El compuesto YF revirtió los efectos fenotípicos sin inhibir la proliferación. La gastrina afecta por lo tanto directamente la función de las células óseas en dos niveles: los osteoblastos y las células madre derivadas de médula ósea, y probablemente tenga un efecto en la placa de crecimiento a través de la regulación del comportamiento de los condrocitos.

Ejemplo 4: Estudios de gastrina: Efectos de los inhibidores de la bomba de protones sobre la función de las células G

Puesto que los PPI han sido implicados en un incremento de la resorción ósea y el riesgo de fractura, se evaluó la función de la inhibición de ácido (pH gástrico elevado) sobre la función de las células G y la segregación de gastrina. Se aislaron células G de la mucosa antral de ratones (Mastomys - Praomys natalensis) que habían sido tratados con el antagonista del receptor H2 irreversible - Loxtidina 1 mg/l - en agua potable para generar hipergastrinemia sostenida. Este animal ha sido ampliamente estudiado como modelo de patofisiología del ácido gástrico relevante para la inhibición farmacológica a largo plazo de segregación de ácido (patobiología de estado de ácido bajo).

Mastomys (6-9 meses) tratados durante 30 días con supresión de ácido gástrico irreversible exhibieron niveles elevados de gastrina en el plasma (104±23 pg/ml frente a 28±13 pg/ml en animales no tratados, p<0,05). Esto refleja la pérdida de liberación de gastrina inhibida por pH bajo (consecuentes niveles de pH gástrico elevados). Dicho tratamiento produce por lo tanto un modelo animal aclorhídrico e hipergastrinémico.

El contenido de gastrina, los niveles de transcritos de gastrina y la liberación de gastrina basal se elevaron significativamente (p<0,05) en células G aisladas de animales aclorhídricos (estómagos con alto pH - células G de exposición a bajo ácido) en comparación con células G aisladas de animales no tratados (TABLA 2).

TABLA 2. Resumen de diferencias entre pH gástrico normal y pH gástrico elevado

(poco ácido) en células G de roedores aisladas

Con referencia a la TABLA 2, el pH gástrico elevado (estados de ácido bajo) estimula el contenido de gastrina de las células G (>2 veces), la transcripción (>4 veces) y la segregación (>8 veces). La respuesta fisiológica de estas células a los ligandos estimuladores, p. ej., GRP y calcio, se reduce - las CE⁵⁰ aumentan. De manera similar, estas células son menos sensibles a los inhibidores, p. ej., Octreótido (OCTR), la CI⁵⁰ aumenta ~5 veces.

Los reguladores de liberación de gastrina, GRP (bombesina) y somatostatina (OCTR), exhibieron una mayor eficacia (GRP: CE⁵⁰ : 1,1 pM frente a InM respectivamente) y una menor eficacia (análogo de somatostatina, octreótido: 28 pM a 140 pM), respectivamente (TABLA 2). A su vez, las células G "hipergastrinémicas" fueron ~100% menos sensibles para detectar calcio (CE⁵⁰ = 10 mM frente a 4 mM en células normogastrinémicas).

Estos datos demuestran que aumentar el entorno gástrico (pH) in vivo afecta de manera significativa la función de las células G. Aumentar el pH gástrico (que estaría presente en individuos de edad avanzada o pacientes que reciben PPI) alteró concretamente la sensibilidad del sensor de Ca² de las células G y la respuesta a la regulación fisiológica. Esto demuestra que la inhibición a largo plazo de la función de las células parietales y la reducción de la segregación de ácido alteran en gran medida la respuesta de las células G antrales al entorno luminal.

Esta observación es de relevancia clínica, ya que bajo condiciones de pH luminal alto se produce más gastrina. La hipergastrinemia es importante, dado que la gastrina estimula la liberación de PTH y tiene un efecto directo sobre las células óseas (véanse las Figuras 8, 10, 11).

Ejemplo 5: Efectos del bloqueo de ácido sobre la dinámica del hueso:

Modelo hipergastrinémico de Mastomys

Se examinaron los efectos de la supresión de ácido sobre el estómago, las hormonas circulantes, las paratiroideas, además de la fisiología ósea, en el modelo de Mastomys.

Se sabe muy poco sobre la biología ósea en estos animales. Un estudio identificó degeneración de los discos intervertebrales en la mayoría (~80%) de los animales >9 meses y cambios artrósicos severos en las articulaciones diartrodiales (codos, rodillas).

Entre los roedores de laboratorio, los Mastomys, con la excepción de una sola cepa de ratones endogámicos (STR/lN), parecen ser los más susceptibles a la artrosis.

Animales (hembras) de 4-6 meses de vida se trataron con Loxtidina durante 60 o 120 días. Animales no tratados de la misma edad y sexo conformaron un grupo control.

Hormonas circulantes: el análisis hormonal (ELISA) confirmó alteraciones de gastrina/PTH y estradiol como una función del bloqueo del receptor H². Concretamente, una elevación a corto plazo de la segregación de gastrina (8 semanas de tratamiento con Loxtidina) se asoció con una segregación elevada de PTH e inhibición de estradiol/estrógeno (Figura 16). La hipergastrinemia crónica a más largo plazo (16 semanas) se asoció con inhibición de PTH y estradiol.

Estómago: se demostró la activación de ECL histamina (histidina descarboxilasa-HDC) (Figura 17A) y gastrina de las células G (a nivel del ARNm) durante la hipergastrinemia (Figura 17B). Ésta se asoció con activación de PTH1R (a nivel de ARNm y proteína), y disminuciones selectivas en ERa gástrico (a nivel de ARNm y proteína) durante la hipergastrinemia a corto plazo; esto luego se incrementó a las 16 semanas y se asoció con activación de CaSR (a nivel de ARNm y proteína) durante la hipergastrinemia (Figura 17A-C).

Paratiroides: usando inmunohistoquímica, se demostró la expresión del receptor CCK2 en las hormonas paratiroideas y tiroideas de Mastomys (Figura 18). Los resultados identifican que tanto las células paratiroideas como las células C tiroideas expresan el receptor de gastrina. El receptor CCK2 en las paratiroides proporciona la base para un eje célula G:PTH mediante el cual se puede regular la segregación paratiroidea (p. ej., de PTH) por parte de la gastrina.

Morfología y dinámica del hueso: se usó evaluación Micro CT para desarrollar análisis morfométricos del hueso (Figura 19) de fémures de roedores en animales hipergastrinémicos. Éstos exhibieron volúmenes óseos inferiores y una reducción de la densidad y la fuerza de tracción. Estos datos demuestran que los niveles de gastrina elevados estimulan la resorción ósea.

El índice de modelo estructural (SMI) identificó un desplazamiento en la relación de placas/varillas, que demuestra una alteración en la geometría del fémur. Por consiguiente, la gastrina incrementó el SMI indicando un cambio en el fenotipo óseo, a través de remodelado, hacia una formación más de tipo varilla. Esta última se asocia con huesos más débiles y más rígidos, y con la fragilidad ósea observada en mujeres osteoporóticas.

En contraste con Mastomys normales, los animales hipergastrinémicos crónicos exhibieron un fenotipo ósteo-artrítico con las siguientes características: engrosamiento de la placa epifisaria, fragilidad del hueso (reconstitución ósea anormal debido al incremento de la formación de adipocitos) e identificación de rasgos inmunogénicos anormales.

Se aísla médula de fémures y se evalúa para osteoclastogénesis. Se pudieron cultivar tanto osteoclastos como osteoblastos en un periodo de tiempo anormalmente temprano en comparación con células aisladas de ratones sometidos a ovariectomía. Esto evidencia la activación de estas dos poblaciones de células en el modelo hipergastrinémico. Esto concuerda con la activación de un evento inducido por el receptor CCK2.

En comparación con ratones sometidos a ovariectomía, los Mastomys hipergastrinémicos exhiben remodelado óseo morfológico exagerado. La presencia de un fenotipo de médula ósea anormal se confirmó además por identificación basada en qPCR de la activación de la vía en los animales hipergastrinémicos. Esto incluyó la disminución de ALOX5 y PTGS2 (inflamación), una reducción de PPARy (activación de adipocitos) y aumento de TNFSR11 (RANKL) (actividad de osteocitos). Los resultados del análisis PCR son concordantes, particularmente la activación de la actividad de los osteocitos, con las alteraciones de la médula ósea macroscópicas observadas (crecimiento epifisario, friabilidad ósea).

Con el fin de evaluar el fenotipo de la médula ósea y si se activó el tejido adiposo óseo (un parámetro del metabolismo y la integridad ósea) se usó un protocolo de tinción basado en osmio en animales control y animales hipergastrinémicos a corto plazo del mismo sexo y edad. Se observó un incremento significativo en la absorción de los animales tratados (Figura 20). Esto concuerda con un fenotipo óseo/osteoporótico "envejecido".

Estos resultados confirman que la hipergastrinemia a corto plazo se asocia con alteraciones óseas similares a los aspectos morfológicos identificados con osteoporosis.

Luego se examinó la histomorfometría ósea. Estos estudios identificaron reducción de la mineralización ósea con un incremento en las cavidades de resorción, además de números significativamente aumentados (p<0,05) de osteoclastos TRAP-positivos (15±6 p<0,05 y 16±4,5 p<0,05, frente a 9±3 en controles) en los Mastomys tratados durante 8 semanas y 16 semanas. También se observaron signos de costuras osteoides y osteomalacia (Figura 21).

Finalmente, se examinó la fuerza ósea en Mastomys usando un dispositivo Instron. Se cargaron fémures hasta el fallo en flexión de cuatro puntos. Las pruebas se realizaron con una velocidad de deformación de 0,05 mm/seg. usando una máquina de ensayos servohidráulica (modelo Instron 8874; Instron Corp., Norwood, MA, EE. UU.).

Finalmente se examinó la fuerza ósea en Mastomys usando un dispositivo Instron. Se cargaron los fémures hasta el fallo en flexión de cuatro puntos. Las pruebas se realizaron con una velocidad de deformación de 0,05 mm/seg. usando una máquina de ensayos servohidráulica (modelo Instron 8874; Instron Corp., Norwood, MA, EE. UU.).

La rigidez osciló entre 158-173 N/mm. La carga máxima requerida para la fractura del hueso osciló entre 32,8-45,7 N/mm. Estos valores se correlacionaron fuertemente entre sí (Figura 17A, R2=0,86, p<0,003, análisis de regresión lineal).

Las comparaciones de la densidad ósea (micro CT) y la fuerza de fractura identificaron correlaciones para los huesos trabecular (R2=0,54, 22B) y cortical (R2=0,71, 22C).

Por lo tanto, las mediciones de la fuerza ósea usando el dispositivo Instron proporcionan información adicional concordante con el desarrollo de un fenotipo óseo anormal y frágil durante la hipergastrinemia. Estos datos mecánicos respaldan la evidencia del fundamento biológico de un fenotipo "osteoporótico" promovido por la gastrina en el modelo hipergastrinémico.

Resumen (Figura 23, 24): la hipergastrinemia a corto plazo (8 semanas) causa cambios osteoporóticos demostrables y mensurables en el fémur. En el antro gástrico, la hipergastrinemia a corto plazo se asoció con las células G activo (transcrito), aumento de sensibilidad a PTH1R y disminución de la sensibilidad a estrógenos (ERa/p and AR) sin cambios en la expresión de CaSR. Las observaciones del análisis óseo son análogas a aquellas evidentes en la condición post-menopáusica humana.

La prolongación de la hipergastrinemia a 16 semanas (modelo crónico) produjo cambios osteoporóticos mensurables en el fémur, y se asoció con un aumento de CaSR y ERa antral, además de expresión de PTH1R (Figura 17).

La combinación de gastrina circulante elevada y aumento de la expresión de PTH1R en las células G fue la característica concordante asociada con un fenotipo osteoporótico.

Estos resultados indican que el Mastomys hipergastrinémico es adecuado para evaluar los efectos de la gastrina en la patofisiología ósea y demuestran los efectos pro-osteoporóticos significativos de la hipergastrinemia sobre el hueso.

Ejemplo 6: Efectos del bloqueo de ácido sobre la dinámica del hueso en Mastomys sometidos a ovariectomía

La ovariectomía es un procedimiento estándar para generar un fenotipo "post-menopáusico" para estudios del hueso. Dado que el estrógeno exhibe un efecto regulador de las células G (véase la Figura 6), se evaluó luego la función específica de la pérdida de estrógenos en el fenotipo óseo en animales no tratados, en animales sometidos a ovariectomía y en animales sometidos a ovariectomía con hipergastrinemia a corto plazo (8 semanas) y a largo plazo (16 semanas). Se realizó una ovariectomía bilateral (OVX) y ligadura de trompas usando un planteamiento posterior en los Mastomys. Los animales fueron estudiados después de 8 semanas.

Hormonas circulantes: después de 8 semanas, el estrógeno se redujo por la ovariectomía. La PTH sérica, no obstante, aumentó ~2 veces (Figura 25).

Estómago: la ovariectomía se asoció con un incremento significativo en cromogranina A (CgA) y transcripción de HDC, pero la expresión de gastrina no se alteró (Figura 26). Esto demuestra que un efecto del estrógeno en el estómago es reducir la síntesis de histamina de las células ECL.

La ovariectomía aumentó la transcripción de la mucosa gástrica de los receptores de andrógeno (6 veces) y estrógeno (ESRa/p: 4-7 veces) además de CaSR (5 veces) y PTH1R (4 veces) (Figura 27). Por ende, la eliminación de estrógeno provocó alteraciones detectables en los receptores de células gástricas implicados en detectar y responder al calcio dietario, es decir CaSR y al eje paratiroideo (PTH1R).

Modelo de hipergastrinemia a corto plazo/OVX: la hipergastrinemia a corto plazo en el modelo de ovariectomía aumento la PTH circulante (Figura 25). En el estómago, los transcritos tanto de gastrina como de HDC fueron elevados por una combinación de supresión de ácido (Loxtidina 8 semanas) y OVX (Figura 26B-D). El aumento de la expresión de receptores viz. AR/ESRa/p, CaSR y PTH1R, que ocurrió después de la OVX, (viz. Figura 27) no se identificó en animales hipergastrinémicos. Se redujeron los niveles y ya no fueron diferentes a los del control (Figura 28). Esto indica que la supresión farmacológica de segregación de ácido (con elevaciones en pH gástrico y gastrina) normaliza la expresión gástrica de los receptores implicados en la detección de calcio, incluso cuando se eliminó el estrógeno.

Modelo de hipergastrinemia a largo plazo/OVX: La hipergastrinemia de 16 semanas se asoció con normalización de los niveles plasmáticos de PTH (Figura 30). En el estómago, se elevó la HDC (Figura 26). Los niveles de AR/ESRa/, CaSR y PTH1R en animales tratados durante 16 semanas no fueron diferentes a los del control (Figura 28). La expresión gástrica de los receptores implicados en la detección de calcio en el modelo a largo plazo, al igual que en el modelo a corto plazo, fue normal durante la eliminación de estrógeno.

Morfología y dinámica del hueso en el modelo de OVX y OVX hipergastrinémica:

Análisis Micro CT: la topografía trabecular se representa en la Figura 29. Las mediciones óseas identificaron que la densidad y el volumen disminuyeron ~50% después de la ovariectomía. Esto es concordante con informes previos en modelos de ovariectomía en roedores (Figura 30A, C). Las reducciones mediadas por gastrina fueron las más significativas (p<0,005) en los animales hipergastrinémicos a largo plazo (80-85% de reducción). Estos últimos animales también exhibieron descensos (~5%, p<0,05) de la densidad cortical (Figura 30B). El volumen óseo cortical disminuyó en todos los animales OVX (~15%) pero de la manera más significativa (p<0,005, ~30%) en los animales hipergastrinémicos a corto plazo (Figura 30D).

Otras mediciones del hueso cortical identificaron reducciones significativas en el endostio y el periostio. La OVX redujo el radio (20%) y la circunferencia (18%) (Figura 31A-D). Se identificaron reducciones más significativas en animales hipergastrinémicos a corto plazo (radio: 25-30%; circunferencia 27%). Estas fueron menos que las reducciones medidas durante la OVX sola (p<0,02). Las mediciones en los animales hipergastrinémicos a largo plazo no fueron diferentes a las de la OVX sola.

Estos resultados identifican que los niveles de gastrina circulante elevados amplían los cambios óseos mediados por la pérdida de estrógenos. Los efectos más significativos de la hipergastrinemia a corto plazo fueron a nivel del hueso cortical y el endostio/periostio, mientras que los efectos hipergastrinémicos a largo plazo fueron predominantes en el hueso trabecular, identificando una función para esto último también en la regulación del metabolismo y la fuerza ósea. Para evaluar esto último, se llevaron a cabo estudios que miden la fuerza.

Histomorfometría ósea: la ovariectomía se asoció con una reducción de la mineralización ósea con un aumento de las cavidades de resorción y un incremento significativo (p<0,05) en los números de osteoclastos TRAP-positivos (26,8±11 vs 9±3 en controles, p<0,05) (Figura 32).

Pruebas de la fuerza mecánica ósea: el análisis de flexión en cuatro puntos de apoyo del fémur identificó un incremento en la rigidez de los animales OVX (Figura 33A). La OVX también redujo la carga máxima y la carga de la fractura (Figura 33B, C). Esto indica que la pérdida de estrógenos, por sí misma, redujo la fuerza del hueso (un efecto cortical) mientras que aumentó la rigidez (un efecto trabecular relacionado con alteraciones en las varillas/placas). La hipergastrinemia a corto plazo redujo la cantidad de esfuerzo requerido para fracturar el hueso (Figura 33D). Estos parámetros representan un efecto concordante con hueso cortical débil y dañado (Figura 30-31). La rigidez ósea generada por OVX se revirtió con hipergastrinemia a corto plazo, sugiriendo que estos efectos de la gastrina están limitados por las fases de activación y resorción de remodelado óseo. La hipergastrinemia a largo plazo revirtió la carga y el esfuerzo requeridos para fracturar el hueso. No obstante, la rigidez ósea aumentó en estos animales de manera concordante con las alteraciones trabeculares (Figura 30). Esto coincide con el fenotipo de remodelado óseo que incluye las fases de reversión y formación del hueso, pero esto es anormal en el sentido que el hueso está rígido y por lo tanto débil.

Evaluación de la fuerza mecánica: el pMOI (momento polar de inercia) es una medida de la fuerza total (y la rigidez) del hueso y es proporcional a la carga de la fractura (en torsión). Aumenta en cicatrización anormal. Este parámetro se evaluó para proporcionar una medida adicional de la fuerza ósea, ya que representa concretamente una medida de la debilidad ósea. La OVX redujo el pMOI que se redujo además significativamente con la hipergastrinemia a corto plazo (Figura 34A). Esto confirma que la ovariectomía debilita el hueso y demuestra que un incremento de la gastrina exacerba la debilidad ósea. La hipergastrinemia a largo plazo se asoció con una reducción del pMOI (en comparación con los controles) pero no fue diferente a la OVX sola. Esto concuerda con los datos de la flexión con 4 puntos de apoyo (véase más arriba) y enfatiza los efectos de la gastrina durante la exposición a corto plazo (activación y remodelado anormal) y a largo plazo (reversión y formación ósea anormales.

Análisis PCR en tiempo real de la médula ósea: se produjo una alteración importante en cinco genes asociados con remodelado óseo (dos disminuyeron y tres aumentaron) con la OVX. Concretamente, ALOX5 derivado de médula ósea de hueso cortical (inflamación) y RUNX2 (diferenciación de osteoblastos) disminuyeron significativamente (Figura 35). La expresión de CXCL12, PPARy y HIF-1a aumentó. CXCL12 se asocia con activación de osteoblastos mediada por PTH, PPARy con diferenciación de adipocitos (mecanismo de protección ósea) y HIF-1a con daño óseo mediado por hipoxia (regula negativamente la expresión de RUNX2, relacionado con la activación del ósteo-progenitor perióstico). Esto es concordante con la inhibición de la diferenciación de osteoblastos y la activación de osteoclastos.

Ni la hipergastrinemia a corto plazo (8 semanas) ni a largo plazo (16 semanas) alteraron de forma significativa (ampliaron o inhibieron) las alteraciones de la expresión del gen mediado por OVX en remodelado óseo. Sin embargo, PTGS2 (o COX2 inducible) se redujo significativamente con la gastrina. Ésta es una respuesta a una lesión ósea y concuerda con una respuesta biológica asociada con protección.

Resumen (Figura 36): las anomalías del hueso asociadas con ovariectomía (trabecular y cortical) en el modelo de Mastomys se asociaron con alteraciones en la fisiología del hueso (inhibición de la función de los osteoblastos) y expresión génica a nivel de las células de médula ósea derivadas del hueso cortical. Esto se asoció con un incremento de los marcadores neuroendocrinos de la mucosa gástrica, incluidas HDC y respuestas de los sensores de calcio/PTHIR.

La hipergastrinemia a corto plazo después de la ovariectomía debilitó además el hueso con alteraciones similares en los fenotipos óseos (disminución de las densidades y los volúmenes trabeculares y corticales) y los perfiles de expresión génica de la médula ósea (p. ej., activación de HIF-1a) al igual que la ovariectomía sola. El incremento de la transcripción de gastrina fue la alteración más significativa en el estómago con normalización de la expresión de CaSR/PTH1 R.

La hipergastrinemia a largo plazo resultó en un hueso débil y muy rígido. Se observaron alteraciones similares en fenotipos (reducción de densidades y volúmenes trabeculares y corticales) así como también en la expresión génica de la médula ósea (activación de HIF-1a) para la ovariectomía sola. La alteración gástrica más importante fue la activación de HDC con normalización de la expresión de CaSR/PTH1 R.

En términos generales, la pérdida ósea/anomalías óseas se asocian con alteraciones en la activación de la médula ósea y cambios en la transcripción de células neuroendocrinas de la mucosa gástrica

Ejemplo 7: Efectos sobre la función neuroendocrina gástrica y la dinámica del hueso: modelos de ratones genomanipulados - con y sin ovariectomía

Los estudios que usan modelos genomanipulados de gastrina e histamina demostraron una relación entre la histamina y la gastrina en la mediación del metabolismo óseo (integridad) y evaluaron la función de la gastrina y la histamina en un modelo de una especie diferente al Mastomys. Estos estudios evaluaron los efectos de la segregación de histamina mediada por gastrina en la biología del hueso (así como también nuestras observaciones de que las células G son reguladas por los estrógenos). Se emplearon tres combinaciones de ratones genomanipulados: ratones genomanipulados HDC además de animales genomanipulados con gastrina y con una combinación dual (HDC/GAS).

Hormonas circulantes: a) Se redujo el estradiol (80-90%) hasta niveles similares (~2 pg/ml) en los tres modelos KO genomanipulados después de la ovariectomía (Figura 37). b) La gastrina estuvo en un nivel bajo tanto en ratones genomanipulados con gastrina como en aquellos con doble genomanipulación (10-20 pg/ml); en los animales HDC KO, los niveles de gastrina fueron 5x superiores a aquellos en animales GAS o GAS/HDC KO. Estos niveles no se vieron afectados por la ovariectomía y fueron similares a los de Mastomys normogastrinémicos.

Los niveles de PTH fueron similares en los tres modelos KO (Figura 37) pero fueron -50% de Mastomys normogastrinémicos. La ovariectomía incrementó los niveles de PTH en animales HDC y HDC/GAS KO, concordantes con la pérdida del efecto inhibidor de estrógeno en la segregación paratiroidea. Esto sugiere que la ausencia de histamina no tiene ningún efecto sobre la segregación paratiroidea. En cambio, la PTH disminuyó después de la ovariectomía en los animales GAS KO. En los Mastomys, la hipergastrinemia a las 8 semanas aumentó la liberación de PTH, y los experimentos in vitro confirmaron una liberación de PTH mediada por gastrina. Esto sugiere que la gastrina se requiere para liberación de PTH fisiológica. La combinación de pérdida de estrógenos y gastrina provoca una glándula paratiroidea segregadora de PTH "baja". Ya que la PTH se asocia con la activación de osteoclastos mediante RANK-osteoblastos (resorción ósea)102, la ausencia de gastrina en este escenario podría interpretarse como "protectora".

Estómago: en animales KO con gastrina, la OVX aumentó en forma significativa el receptor CCK2 en el fondo (3 veces) (Figura 38) e incrementó la HDC 10 veces, indicando que el estrógeno ejerce un efecto inhibidor sobre la célula ECL. En las células G del antro, la OVX redujo el CaSR en 60%, indicando que el sensor de calcio de la célula G es regulado por los estrógenos. En los animales HDC KO, la OVX redujo la mayoría de los genes diana, incluidos CaSR, PTH1R y CCK2, en comparación con el control (sin ovariectomía). La gastrina también disminuyó significativamente. En el animal con doble KO, el CCK2 aumentó con la ovariectomía. Estos datos indican que el estrógeno regula la expresión de transcritos implicados en la detección de calcio y en consecuencia el metabolismo de calcio. En particular, la célula ECL y la célula G del estómago son sensibles a los estrógenos, especialmente en términos de la fisiología del calcio.

Morfología y dinámica del hueso:

Micro CT del hueso: en los ratones KO con gastrina, la ovariectomía no tuvo ningún efecto significativo sobre la densidad y el volumen del fémur, pero aumentó el espesor del endostio y el periostio (Figura 39A). Esto fue directamente opuesto a los efectos observados en la hipergastrinemia a corto y a largo plazo (disminución de la densidad y el volumen del hueso trabecular y cortical, además de mediciones endósticas y periósticas - véase la Figura 24). Esto produjo hueso no rígido ni debilitado en comparación con huesos no sometidos a ovariectomía. Esto demuestra que la ausencia de gastrina (en un entorno de pocos estrógenos) fue protectora y puede reflejar los bajos niveles de PTH circulante en estos animales.

Ratones HDC KO: la ovariectomía en ratones HDC KO no tuvo ningún efecto significativo sobre la densidad y el volumen del fémur ni sobre el espesor del endostio/periostio. El hueso, no obstante, estuvo rígido, requirió una carga mayor para la fractura y exhibió un incremento de pMOI (p<0,03) comparado con huesos no sometidos a ovariectomía (Figura 39B). Nuestras investigaciones confirman, por consiguiente, estudios 99 anteriores de que una combinación de una pérdida de estrógeno e histamina aumenta la fuerza ósea.

Ratones Gas/HDC KO: la ovariectomía en ratones doble KO gastrina/HDC no tuvo ningún efecto significativo sobre la densidad del fémur, pero los volúmenes trabeculares y corticales se redujeron (p<0,03) (Figura 39C). No se observaron cambios en el espesor del endostio/periostio. Esto produjo hueso no debilitado en comparación con huesos no sometidos a ovariectomía.

qPCR de médula ósea: la ovariectomía en animales KO con gastrina se asoció con aumento de dos genes, ALOX5 y CXCL12 (Figura 40A-B). Éstos están implicados en la síntesis e inflamación de los leucotrienos y en la activación de osteoblastos a través de PTH, respectivamente. En el modelo de Mastomys, la ovariectomía redujo ALOX5 pero aumentó CXCL12, efectos no significativamente alterados por la hipergastrinemia. La ovariectomía en los animales HDC y HDC/GAS KO no tuvo ningún efecto significativo, lo que indica que la histamina no cumple una función en la regulación de estos dos genes.

El análisis PCR de médula ósea también identificó que la ovariectomía en los animales KO con gastrina se asoció con un aumento de HIF-1a y IGF1 (Figura 40C-D). Éstos están implicados, como se observó previamente, en la regulación de osteoprogenitores y el mantenimiento de la masa ósea, respectivamente.

Resumen (Figura 41): la pérdida de gastrina (en un entorno de pocos estrógenos) en el modelo de ratón alteró la fisiología ósea pero no se asoció con una diferencia significativa en la fuerza ósea. En contraste con la ovariectomía con hipergastrinemia a corto plazo y a largo plazo (en el modelo de Mastomys) produjo un hueso significativamente más débil. La gastrina parece tener, por lo tanto, un efecto desfavorable y "desprotector" sobre la médula ósea. HDC KO solo (en un entorno de pocos estrógenos) se asoció con un hueso significativamente más fuerte (y más rígido), lo que sugiere que la histamina, al igual que la gastrina, puede cumplir una función reguladora en la fisiología ósea. La eliminación de histamina (a través de HDC KO) revirtió este efecto y por ende concuerda con la aseveración de que la gastrina y la histamina en tándem son reguladores clave de la fisiología ósea.

Una combinación de pérdida de gastrina y HDC (p. ej., pérdida de histamina) en un entorno de pocos estrógenos no se asoció con un hueso significativamente más débil, y la dinámica del hueso no fue diferente a la normal. Esto sugiere que la histamina (al igual que la gastrina) puede activar un fenotipo óseo de tipo "osteoporótico". Por consiguiente, la disminución (eliminación) de histamina (a través de HDC KO) revirtió el efecto pro-osteoporótico inducido por la disminución de estrógenos.

Ejemplo 8: Estudios demostrativos prelim inares: Efectos de un antagonista de gastrina en el fenotipo óseo mediado por ovariectomía en tres modelos de roedores

Se evaluaron los efectos del antagonista de gastrina, YF476, sobre la pérdida de densidad ósea mediada por OVX/alteraciones óseas en tres modelos de roedores con un foco en estudios de fuerza ósea, morfología y biomarcadores circulantes. Se examinaron dos modelos de OVX "normales": a) ratón (cepa: CD-1 [cepa suiza] -Charles River) y b) rata (cepa: CD IGS [cepa Sprague Dawley] - Charles River), además del modelo de Mastomys (señalización del receptor de gastrina/CCK2 activado en forma endógena).

Los animales fueron sometidos a cirugía (OVX) a los 2 meses de vida, se les permitió recuperarse y luego se expusieron a inhibición de ácido oral, además del antagonista de gastrina (GA), YF476 (una sola inyección). Tanto los ratones como las ratas se expusieron al PPI, omeprazol, mientras que los Mastomys se expusieron al antagonista del receptor H2, loxitidina. La administración de GA fue una sola inyección subcutánea al inicio de la inhibición de ácido. A nivel de la farmacocinética, esta dosis osciló entre 15-20 nmol por un período de 8 semanas. Los detalles con respecto a la administración se incluyen en la TABLA 3.

TABLA 3: Administración en los estudios demostrativos preliminares

Se incluyeron tres grupos para cada modelo animal: a) Grupo A = tratados con placebo/disolución salina (sin OVX/Controles); b) Grupo B = OVX+terapia inhibidora de ácido (OVX); y c) Grupo C = animales sometidos a ovariectomía tratados con GA (OVX+GA). Al finalizar el estudio (2 meses), evaluamos si el GA revertía las alteraciones mediadas por OVX en ambos parámetros (microCT, fuerza ósea e histomorfometría, así como también marcadores circulantes).

Modelo 1: OVX de ratón: Al inicio del tratamiento con GA, los animales tenían 89 días (3,0 meses) y al finalizar el estudio tenían 146 días (4,8 meses) de vida. Un examen de datos del hueso trabecular identificó que la ovariectomía redujo significativamente BV/TV (0,05±0,02 frente a 0,18±0,04, p<0,05) y la densidad (37±5 frente a 173±18, p<0,05), y aumentó el SMI (1,8±1,2 frente a 1,1±0,4, p<0,05) y el espaciado trabecular (0,6±0,18 frente a 0,28±0,05, p<0,05) (TABLA 4, Figura 42). El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estas alteraciones óseas mediadas por la ovariectomía, excepto por el espaciado y el espesor trabecular, que permanecieron aumentados. Esto se asoció con un incremento significativo en la densidad ósea trabecular (70,7±19, p<0,05 frente a OVX).

TABLA 4. Resultados del hueso trabecular en el Modelo 1

Parámetro BV/TV Conns-Dens SMI Tb.N Tb.Th Tb.Sp Dens& BS

Control (n=6) 0,185 343,3 1,15 3,5 0,040 0,285 173 29,7

OVX (n=7)

0,054 56,4 1,8 1,75

0,049 0,627 37,2 9,7

Tratamiento GA (O+YF: n=8) 0,123 128,6 1,38 2,43 0,051 0,528

70,7 16,8

% Cambio (OVX) -70%* -84%*

56%*

-50%* 22%* 116%* -78%*

-77%*

% Cambio (tratado con GA) -33%*- **

-62%* ** 20%** -30%*- ** 28%* 82%* -60%*’** -32%* **

^Densidad aparente (trabecular); *p<0,05 frente a control; **p<0,05 frente a OVX sola (sin tratamiento)

Un análisis de los parámetros del hueso cortical identificó que la ovariectomía redujo significativamente la superficie ósea (11,6±0,9 frente a 13,4±1,4, p<0,05), aumentó el espesor cortical (0,2±0,01 frente a 0,15±0,01, p<0,05) y se asoció con una disminución (989±26 frente a 1153±39, p<0,05) en la densidad cortical (TABLA 5, Figura 43). El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió la disminución de la densidad mediada por OVX (1025±37, p<0,05 frente a OVX).

TABLA 5. Datos del hueso cortical en el Modelo 1

Las mediciones de la fuerza ósea usando un dispositivo Instron confirmaron la utilidad del antagonista de gastrina en revertir el fenotipo óseo mediado por OVX. La ovariectomía redujo de manera significativa (p<0,05) la fuerza ósea (rigidez [246±29 frente a 294±34], el límite de rigidez [221 ±28 frente a 271±33], la carga de la fractura hasta el quiebre [37±6 frente a 56±7]), y aumentó el esfuerzo total requerido para quebrar el hueso [28,3±9,7 frente a 20,4±2,3, p<0,05]. El tratamiento con el antagonista de gastrina normalizó estas alteraciones óseas mediadas por la ovariectomía, excepto por la carga de la fractura [43±6] que aumentó pero permaneció más baja que los controles (TAb La 6, Figura 44).

TABLA 6. Datos de fuerza ósea

La histomorfometría identificó una disminución de la mineralización ósea con un aumento en las cavidades de resorción, así como también números significativamente aumentados (p<0,05) de osteoclastos TRAP-positivos (29±5 frente a 16±3, p<0,05) en los ratones OVX. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos fenómenos (Figura 45).

La ovariectomía redujo significativamente (p<0,05) el estrógeno circulante (1,9±0,9 pg/ml frente a 5,1 ±1,9) y se asoció con un incremento en la PTH (123±74 pg/ml frente a 51 ±32) y la gastrina (3200±263 pg/ml frente a 2437±787). El tratamiento con el antagonista revirtió el incremento mediado por ovariectomía en la gastrina, pero no con PTH (TABLA 7, Figura 46). Los biomarcadores óseos circulantes también se alteraron con la OVX. Concretamente, PINP se incrementó (0.19±0.01 ng/ml frente a 0,1y±0,006, p<0,05) al igual que CTx-1 (0,60±0,14ng/ml frente a 0,29±0,13, p<0,05) y la osteocalcina se elevó (6,7±2,3ng/ml frente a 4,1 ±1,2, p<0,05). El tratamiento con el antagonista atenuó cada una de estas tres alteraciones mediadas por la ovariectomía.

TABLA 7. Niveles de marcadores de sangre circulante en cada uno de los tres grupos

Resumen (Modelo 1): una sola inyección de un antagonista de gastrina se asoció con reversión de los cambios óseos mediados por ovariectomía (examinados a las 8 semanas) en un modelo de ratón. Estos efectos ocurrieron a pesar de los bajos niveles de estrógeno circulante y los altos niveles de PTH, y se ejemplificaron por normalización de los parámetros histomorfométricos (mineralización, número de osteoclastos) y expresión de biomarcadores óseos circulantes concordantes con efectos anabólicos.

Modelo 2: Modelo OVX de rata: al inicio del tratamiento con el GA, los animales tenían 98 días (3,2 meses) y al finalizar el estudio tenían 163 días (5,4 meses). Un examen de los datos del hueso trabecular identificó que la ovariectomía redujo de forma significativa BV/TV (0,15±0,03 frente a 0,27±0,07, p<0,05) y la densidad (159±26 frente a 287±71, p<0,05). El espaciado trabecular (0,58±0,1 frente a 0,44±0,19, p<0,05), así como también el SMI (1,5±0,2 frente a 0,6±0,4, p<0,05) aumentaron (TABLA 8, Figura 47). El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estas alteraciones mediadas por la ovariectomía, excepto por el SMI (1,3±0,17), que permaneció aumentado. Esto se asoció con un incremento significativo en la densidad del hueso trabecular (204±27, p<0,05 frente a OVX).

TABLA 8. Resultados de los datos sobre el hueso trabecular del Modelo 2

% Cambio (tratado con GA) -30%** 8% 143%* -18%** -13%** 9%** -30%*-** -21% &Densidad aparente (trabecular); *p<0,05 frente a control; **p<0,05 frente a OVX sola (sin tratar)

Un análisis de los parámetros del hueso cortical identificó que la ovariectomía redujo significativamente la superficie ósea (42,7±2,5 frente a 49,9±3, p<0,05), aumentó el espesor cortical (0,66±0,03 frente a 0,61 ±0,07, p<0,05) y se asoció con una disminución (1067±22 frente a 1144±17, p<0,05) en la densidad cortical (TABLA 9, Figura 48). El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió la reducción de la densidad mediada por OVX (1098±24, p<0,05 frente a OVX).

TABLA 9. Resultados de los datos sobre el hueso cortical del Modelo 2

Las mediciones de la fuerza ósea usando el dispositivo Instron confirmaron la utilidad del antagonista de gastrina para revertir el fenotipo óseo mediado por OVX. La ovariectomía redujo de manera significativa (p<0,05) la fuerza ósea (rigidez [495±43 frente a 578±48], el límite de rigidez [445±39 frente a 526±66] y la carga de la fractura hasta el quiebre [265±29 frente a 300±17]). El tratamiento con el antagonista de gastrina normalizó estas alteraciones óseas mediadas por la ovariectomía (TABLA 10, Figura 49).

TABLA 10. Datos de fuerza ósea

La histomorfometría identificó alteración de la mineralización ósea con un incremento de las cavidades de resorción, además de aumentos significativos (p<0,05) de los números de osteoclastos TRAP-positivos (11 ±3 frente a 2±2, p<0,05) en las ratas OVX. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos fenómenos (Figura 50).

La ovariectomía redujo significativamente (p<0,05) el estrógeno circulante (2,1±0,3 pg/ml frente a 5,3±2,5) y se asoció con un incremento en la gastrina (3200±789pg/ml frente a 954±406). El tratamiento con el antagonista no tuvo ningún efecto significativo sobre el estrógeno o la gastrina (TABLA 11, Figura 51). Los biomarcadores óseos circulantes también se alteraron con la OVX. Concretamente, se elevaron tanto PINP (0,57±0,18ng/ml frente a 0,35±0,06, p<0,05) como osteocalcina (1,35±0,9 ng/ml frente a 0,43±0,07, p<0,05). El tratamiento con el antagonista atenuó cada una de estas alteraciones mediadas por la ovariectomía.

TABLA 11. Niveles de biomarcadores circulantes en cada uno de los tres grupos

Resumen (Modelo 2): una sola inyección de un antagonista de gastrina se asoció con reversión de los cambios óseos mediados por ovariectomía (examinados a las 8 semanas) en un modelo de rata. Estos efectos ocurrieron a pesar de los bajos niveles circulantes de estrógeno y los altos niveles de gastrina, y se ejemplificaron por normalización de los parámetros histomorfométricos (mineralización, número de osteoclastos) y expresión de biomarcadores circulantes concordantes con un efecto metabólico.

Modelo 3: Modelo OVX de Mastomys: al inicio del tratamiento con el GA, los animales tenían 121 días (4,0 meses) y al finalizar el estudio, 180 días (6,0 meses) de vida. La ovariectomía redujo significativamente la relación BV/TV (0,06±0,03 frente a 0,14±0,05, p<0,05), el número trabecular (1,4±0,3 frente a 2,0±0,6, p<0,05) y la superficie ósea (8,5±3,7 frente a 18,5±2,3, p<0,05), y aumentó el SMI (1,1 ±0,3 frente a 0,74±0,21, p<0,05), así como también el espaciado trabecular (0,82±0,15 frente a 0,57±0,17, p<0,05) (TABLA 12, Figura 52). Esto se asoció con una reducción significativa en la densidad del hueso trabecular (60,6±37 frente a 157±51, p<0,05). El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estas alteraciones mediadas por la ovariectomía, normalizando la densidad del hueso trabecular (187±66). El fármaco también se asoció con un incremento en el número (2,4±0,6, p<0,05 frente a control) y el espesor trabecular (0,08±0,01, p<0,05 frente a control).

TABLA 12. Resultados de los datos sobre el hueso trabecular del Modelo 3

Una evaluación de los parámetros del hueso cortical identificó que la ovariectomía no significativamente ningún parámetro del hueso cortical (TABLA 13, Figura 53). El tratamiento con el antagonista de gastrina no tuvo ningún efecto en animales sometidos a ovariectomía.

TABLA 13. Resultados de los datos del hueso cortical del Modelo 3

&Densidad aparente (cortical), *p<0,05 frente a control; **p<0,05 frente a OVX sola (sin tratar)

Las mediciones de la fuerza ósea usando el dispositivo Instron confirmaron la utilidad del antagonista de gastrina para revertir el fenotipo óseo mediado por OVX. La ovariectomía redujo significativamente (p<0,05) la fuerza ósea (rigidez [138±7 frente a 332±65], el límite de rigidez [125±6 frente a 299±59], la carga de la fractura hasta el quiebre [38±4 frente a 56±13]), y aumentó el esfuerzo total requerido para quebrar el hueso [51 ±7,7 frente a 34±11,6, p<0,05]. El tratamiento con el antagonista de gastrina normalizó estas alteraciones óseas mediadas por la ovariectomía (TABLA 14, Figura 54).

TABLA 14. Datos de fuerza ósea

*p<0,05 frente a control; **p<0,05 frente a OVX sola (sin tratar)

La histomorfometría identificó una reducción de la mineralización ósea con un incremento en las cavidades de resorción, además de un incremento significativo (p<0,05) en los números de osteoclastos TRAP-positivos (27±11 frente a 9±3, p<0,05) en OVX Mastomys. El tratamiento con el antagonista de gastrina revirtió estos fenómenos (Figura 55).

La ovariectomía redujo significativamente (p<0,05) el estrógeno circulante (1,9±0,6 pg/ml frente a 8,9±2,1) y se asoció con un incremento en PTH (523±308 pg/ml frente a 290±71) y gastrina (7265±3198 pg/ml frente a 3705±2015). El tratamiento con el antagonista revirtió el incremento mediado por ovariectomía en gastrina (2704±430) y PTH (150±37) (TABLA 15, Figura 56). Los biomarcadores óseos circulantes también se alteraron con la OVX. Concretamente, PINP aumentó (0,16±0,03 ng/ml frente a 0,13±0,01, p<0,05), al igual que CTx-1 (0,24±0,17ng/ml frente a 0,03±0,03, p<0,05), mientras que la osteocalcina se elevó (1,6±1.1ng/ml frente a 0,4±0,16, p<0,05). El tratamiento con el antagonista atenuó cada una de estas tres alteraciones mediadas por la ovariectomía.

TABLA 15. Niveles de marcadores de sangre circulante en cada uno de los tres grupos

Resumen (Modelo 3): una sola inyección de un antagonista de gastrina se asoció con reversión de los cambios óseos mediados por la ovariectomía (examinados a las 8 semanas) en el modelo de Mastomys. Estos efectos ocurrieron a pesar de los bajos niveles de estrógeno circulante, y se ejemplificaron por normalización de los parámetros histomorfométricos (mineralización, número de osteoclastos) y expresión de biomarcadores óseos circulantes concordantes con efectos anabólicos.

Resumen (Modelos 1, 2 y 3): una sola inyección del antagonista de gastrina (10-20 pMg peso corporal) revirtió la pérdida ósea y la fuerza mediadas por la ovariectomía, normalizando o tendiendo a normalizar tres de 3 modelos. Esto sucedió a pesar de los bajos niveles de estrógeno circulante y los altos niveles de PTH, y se asoció con modificación de señalización de la masa pro-ósea.

En toda la solicitud, se hace referencia a distintos contenidos de sitos web, publicaciones, solicitudes de patentes y patentes. (Se hace referencia a los sitios web por su Localizador de recursos uniforme, o URL, direcciones de la red informática mundial).

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un agente dirigido a los receptores de gastrina para uso en el tratamiento de la osteoporosis en un sujeto que lo necesita, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es YF476 y es para administrar al sujeto en por lo menos una dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz.

2. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es para administrar durante un período de tiempo de tratamiento a fin de resolver la osteoporosis.

3. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde el sujeto es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica.

4. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde el sujeto: (a) es una mujer con disminución de la función ovárica o insuficiencia ovárica, y (b) experimenta hipergastrinemia.

5. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, que además comprende administrar el agente dirigido a los receptores de gastrina con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la bomba de protones (PPI) o del antagonista de los receptores de histamina 2 (H2R), simultánea o secuencialmente, en cualquier orden.

6. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del agente dirigido a los receptores de gastrina es 10-25 nanomolares.

7. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 4, en donde la hipergastrinemia es hipergastrinemia neoplásica o hipergastrinemia asociada con farmacología supresora de ácidos.

8. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 6, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del agente dirigido a los receptores de gastrina oscila entre 0,2 y 14 pg / kg de peso corporal del sujeto.

9. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es para administrar al sujeto en una sola dosis por inyección subcutánea.

10. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es para administrar al sujeto por inyección intravenosa.

11. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 1, en donde el agente dirigido a los receptores de gastrina es para administrar al sujeto por vía oral en una dosis que oscila entre 20 y100 mg.

12. El agente dirigido a los receptores de gastrina para uso según la reivindicación 5, en donde el PPI o el antagonista de H2R se administra al sujeto por vía oral.