ES2842236T3 - Polipéptido que tiene una actividad degradante del poliéster y sus usos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene una actividad degradante de poliéster.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido que tiene una actividad degradante del poliéster y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que tiene una actividad enzimática y a los usos del mismo. La invención también se refiere a métodos para producir ese polipéptido, una molécula de ácido nucleico codificante, células recombinantes y a métodos para degradar material que contiene poliéster eon el uso de ese polipéptido. El polipéptido de la invención es particularmente adecuado para degradar el poli(ácido láctico) y el material que contiene poli(ácido láctico), tal como material de plástico.

Antecedentes de la invención

Los poliésteres se utilizan en una gran cantidad de campos técnicos, en particular en forma de material plástico, desde el envasado de alimentos hasta el campo médico, pasando por la ropa, la industria del automóvil, etc. Por ejemplo, ciertos poliésteres (por ejemplo, poli(tereftalato de etileno) - PET, poli(ácido láctico) - PLA, etc.) se utilizan en la fabricación de ropa y envases, pero también en forma de resina termoendurecible para la fabricación de piezas de automóvil u otras piezas.

Como consecuencia, la producción de plásticos que contienen poliéster ha aumentado drásticamente en las últimas décadas. Más del 50% de esos plásticos se utilizan para aplicaciones desechables de un solo uso, tales como envases, películas para agricultura, artículos de consumo desechables o para productos perecederos que se desechan al cabo de un año de la fabricación. Lamentablemente, los plásticos pueden persistir durante décadas dependiendo de factores ambientales locales, como los niveles de exposición a luz ultravioleta, la temperatura, la presencia de microorganismos adecuados, etc. Como consecuencia, cantidades sustanciales de plástico se acumulan en los vertederos y en los hábitats naturales de todo el mundo, generando un incremento de los problemas ambientales.

Una solución para reducir los impactos ambientales y económicos relacionados con la acumulación de plástico es el reciclaje, en donde el material de plástico se reprocesa mecánicamente para fabricar nuevos productos. Sin embargo, los procesos de reciclaje reales utilizan grandes cantidades de electricidad, especialmente durante la etapa de extrusión, y el equipamiento utilizado también es costoso, lo que genera precios elevados que pueden no ser competitivos en comparación con el plástico virgen.

Otro procedimiento potencial para el reciclaje del plástico consiste en el reciclaje químico que permite recuperar los componentes químicos del polímero. Los monómeros resultantes se pueden usar entonces para volver a fabricar plástico o para fabricar otros productos químicos sintéticos. Sin embargo, hasta la fecha, ese procedimiento de reciclaje solo se ha realizado con polímeros purificados y no es eficaz en productos plásticos en bruto, constituidos por una mezcla de polímeros cristalizados y amorfos, y aditivos. Además, ese procedimiento de reciclaje es costoso y conduce a monómeros no competitivos en comparación con los monómeros vírgenes.

Por otro lado, la degradación enzimática se considera un método ideal para el tratamiento de residuos porque las enzimas pueden acelerar la hidrólisis de los plásticos y se pueden incorporar a un ciclo natural de materiales orgánicos. Además, el material hidrolizado (es decir, los monómeros y oligómeros) se puede reciclar como material para polímeros. Por tanto, la despolimerización de polímeros contenidos en un producto de plástico a través de enzimas es de gran interés, como alternativa a los procedimientos existentes e insatisfactorios.

Sin embargo, este enfoque no ha conducido hasta ahora a la implementación de un método enzimático industrial y eficaz para degradar un material que contiene poliéster.

De hecho, se sabe que muchas bacterias tienen la capacidad de degradar poliésteres. Por ejemplo, con respecto al poli(ácido láctico), hay un informe de enzimas degradantes obtenidas a partir de Actinomycetes tales como Amycolatopsis sp. (cepa K104-1) y Paenibacillus amylolyticus (cepa TB-13). Sin embargo, hasta la fecha, los polipéptidos identificados tienen poca capacidad degradante y solo permiten una degradación del polímero en forma de emulsión. Existe un número limitado de informes sobre microorganismos capaces de degradar un material que contiene poliéster en forma de película o gránulos y, además, sus enzimas son poco conocidas.

Sukhumaporn Sukkhum et al. ("Poly(L-Lactide)-Degrading Enzyme Production by Actinomadura keratinilytica T16-1 in 3 L Airlift Bioreactor and Its Degradation Ability for Biological Recycle" Journal of microbiology and biotechnology, vol. 22, n° 1, 28 de enero de 2012, páginas 92-99) describen que la cepa T16-1 de Actinomadura keratinilytica produce enzimas que degradan PLLA. Sin embargo, no se describen enzimas aisladas.

El documento US 8476056 describe que las películas de PHB pueden ser degradadas por diferentes actinomicetos. En vista de lo anterior, existe una necesidad de nuevas enzimas activas en la degradación del poliéster y más particularmente en la degradación de poliésteres contenidos en productos de plástico.

Compendio de la invención

El trabajo realizado por la solicitante ha conducido a la identificación de un nuevo polipéptido obtenido a partir de Actinomadura sp. y que tiene actividad degradante de poliéster. Ese polipéptido nunca se había descrito o aislado en la técnica y aporta unas mejoras sustanciales para el desarrollo de procesos industriales de degradación de material que contiene poliéster.

La invención proviene, entre otras cosas, de la identificación de este nuevo polipéptido, que tiene la propiedad destacada de degradar el poliéster. La invención se refiere a una solución para obtener a escala industrial la degradación de poliésteres contenidos en un producto de plástico, cuyos productos de degradación (monómeros y oligómeros) se pueden reutilizar para producir nuevos poliésteres de forma económica y fiable.

Por tanto, la presente invención se refiere a nuevos polipéptidos que tienen actividad enzimática, a su producción y sus usos. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican esos polipéptidos, a vectores, a células recombinantes que expresan esos polipéptidos y a sus usos. La invención se refiere además a composiciones que comprenden al menos un polipéptido de la invención y a métodos para producir oligómeros y/o monómeros de interés a partir de un material que contiene poliéster, tal como un producto de plástico hecho a base de poliéster. La invención también se refiere a compuestos de plástico biodegradables o a artículos de plástico que contienen al menos uno de esos polipéptidos y/o a células recombinantes que expresan esos polipéptidos.

Por tanto, un objeto de esta invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 99% o 100%, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene una actividad degradante de poliéster.

En una realización particular, la secuencia de residuos de aminoácidos del polipéptido difiere de SEQ ID N° 1 por una sustitución de residuos de aminoácidos de un residuo de aminoácido en una o varias posiciones. En una realización preferida, la sustitución de residuos de aminoácidos introduce cisteína(s) o puentes extra salinos en la secuencia de residuos de aminoácidos y, por lo tanto, aumenta la termoestabilidad del polipéptido en comparación con la termoestabilidad del polipéptido natural (es decir, el polipéptido que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1).

Es un objeto adicional de la invención proporcionar un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 5.

En una realización particular, el polipéptido comprende uno o varios residuos de aminoácidos glicosilados.

Otro objeto de esta invención es un ácido nucleico que codifica un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente. La invención también se refiere a una casete de expresión que comprende un ácido nucleico tal y como se ha definido anteriormente y a un vector que comprende una casete de expresión o un ácido nucleico tal y como se ha definido anteriormente.

La invención también se refiere a una célula recombinante, o célula hospedadora, preferiblemente un microorganismo recombinante, que contiene al menos un ácido nucleico o una casete de expresión o un vector tal y como se ha definido anteriormente, y a extractos de los mismos que muestran preferiblemente la actividad enzimática.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para producir el polipéptido de la invención, que comprende (i) cultivar una célula recombinante tal y como se ha definido anteriormente, (ii) recuperar el material sobrenadante del cultivo y opcionalmente (iii) aislar o purificar el polipéptido.

La invención también describe una composición que comprende un polipéptido o una célula recombinante que expresa el polipéptido o un extracto de la misma, tal y como se ha definido anteriormente.

La invención se refiere además al uso de un polipéptido, al ácido nucleico correspondiente, la casete de expresión, el vector, la célula recombinante, el extracto celular recombinante o la composición tal y como se ha definido anteriormente, para la degradación enzimática de un material que contiene poliéster, preferiblemente un material que contiene PLA, incluso más preferiblemente un material que contiene PLLA.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para degradar un material que contiene poliéster, en donde un material que contiene poliéster se pone en contacto con un polipéptido, un ácido nucleico correspondiente, una casete de expresión, un vector, una célula recombinante o un extracto celular recombinante, o una composición tal y como se ha definido anteriormente. El método comprende además ventajosamente una etapa de recogida de los monómeros y/u oligómeros resultantes.

La invención también se refiere a un método para producir monómeros y/u oligómeros a partir de un material que contiene poliéster, que comprende exponer un material que contiene poliéster a un polipéptido, un ácido nucleico correspondiente, una casete de expresión, un vector, una célula recombinante o un extracto de células recombinantes, o una composición tal y como se ha definido anteriormente, y opcionalmente recuperar los monómeros y/u oligómeros.

Otro objeto de la invención es proporcionar un material que contiene poliéster que comprende un polipéptido y/o una célula recombinante que expresa el polipéptido tal y como se ha definido anteriormente.

La invención también proporciona un procedimiento para producir ese material que contiene poliéster que comprende una etapa de mezclar un poliéster y un polipéptido y/o una célula recombinante que expresa el polipéptido tal y como se ha definido anteriormente, en donde la etapa de mezclado se lleva a cabo a una temperatura a la cual el poliéster está en un estado parcial o totalmente fundido, preferiblemente durante un proceso de extrusión.

La invención se refiere adicionalmente al uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene una actividad degradante de poliéster para degradar un material que contiene poliéster.

Leyendas de las Figuras

Figura 1. Una imagen de un gel de SDS-Page de un flujo a través a pH 10 procedente de una purificación aniónica, que muestra que el peso molecular del polipéptido de la invención es de 27 kDa;

Figura 2. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención (SEQ ID N° 1), en donde se resaltan los residuos más significativos;

Figura 3: Un gráfico que muestra la hidrólisis catalizada por poliesterasa de un polvo de PLLA NaturePlast (33 g/L) y la producción de ácido láctico, en función del tamaño de partícula del PLLA;

Figura 4: Un gráfico que muestra la hidrólisis catalizada por poliesterasa de un polvo de PLA Ingeo® 7001D (33 g/L) y la producción de ácido láctico, en función del tamaño de partícula del PLA;

Figura 5: Un gráfico que muestra la hidrólisis catalizada por poliesterasa de una película de PLA (17 g/L) y la producción de ácido láctico;

Figura 6: Un gráfico que muestra la hidrólisis catalizada por poliesterasa de objetos comerciales de PLA (vasos, bandejas, películas y cubiertos de PLA) (33 g/L) y la producción de ácido láctico.

Figura 7: Un gráfico que muestra la hidrólisis de PLA en un medio que comprende CaCO3 y Ca(OH)2.

Figura 8: Un gráfico que muestra la hidrólisis de materiales que contienen PLA que contienen 96% de PLA y 4% del polipéptido de la invención y la hidrólisis de controles que contienen 100% de PLA, a 28°C, 37°C y 45°C en tampón Tris a pH 9,5.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere, en general, a un polipéptido aislado que comprende al menos una parte biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1, que es capaz de despolimerizar poliésteres, más preferiblemente poli(ácido láctico). Este polipéptido, que es preferiblemente activo a un intervalo de temperatura de 20°C a 90°C, y de al menos de 20°C a 60°C, se puede emplear para degradar un material plástico de poliéster. Este polipéptido, o su secuencia de ácido nucleico codificante, se puede usar también para crear un microorganismo recombinante, que puede servir para provocar la degradación de material que contiene poliéster. Ese microorganismo recombinante puede mostrar además una actividad de síntesis polimérica natural o recombinante, de manera que dicho microorganismo es capaz de reutilizar los monómeros y/u oligómeros resultantes de la degradación de poliéster.

Lo siguiente es una descripción de la presente invención que incluye realizaciones preferidas de la misma proporcionadas en términos generales. La presente invención se ejemplifica adicionalmente en la descripción proporcionada bajo el encabezamiento "Ejemplos" en esta memoria a continuación, que proporciona datos experimentales que confirman la invención y medios para realizar la invención.

Definiciones

La presente descripción se entenderá mejor haciendo referencia a las siguientes definiciones.

El término “aislado” o “aislamiento” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural). Por ejemplo, un polipéptido aislado normalmente está desprovisto de al menos algunos polipéptidos u otros constituyentes de las células con las que está asociado generalmente o con las que se mezcla normalmente por adición o en solución. Un polipéptido aislado incluye dicho polipéptido producido de manera natural en una forma purificada o parcialmente purificada, el polipéptido recombinante, el polipéptido que se expresa o se secreta a través de una célula hospedadora, así como el polipéptido en una célula hospedadora o un cultivo o un extracto de la misma. En un aspecto preferido, el polipéptido tiene una pureza de al menos el 10%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60%, 70%, 80%, 90%, según se determina por SDS-PAGE. Una pureza menor del 100% indica en esta memoria una preparación de polipéptido que contiene otro material polipeptídico con el que está asociado de manera natural o recombinante. En relación con un ácido nucleico, el término aislado o purificado indica, por ejemplo, que el ácido nucleico no está en su contexto genómico natural (por ejemplo, en un vector, una casete de expresión, unido a un promotor o introducido artificialmente en una célula hospedadora heteróloga).

El término "modificación" significa en esta memoria cualquier modificación química del polipéptido que consiste en SEQ ID N° 1 o una secuencia homóloga de la misma, así como una manipulación genética del ADN que codifica ese polipéptido. La modificación puede ser una sustitución, una deleción y/o una inserción de uno o varios aminoácidos. En consecuencia, los términos "mutante" y "variante" se pueden utilizar de manera intercambiable para referirse a polipéptidos que consisten en SEQ ID N° 1 con una o varias sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos identificadas en el o los residuos determinados.

El término "glicosilado" significa que el material comprende uno o varios glicanos fijados a uno o varios residuos de aminoácidos del polipéptido. En el contexto de la invención, la glicosilación incluye glicanos ligados a N, fijados al nitrógeno de la amida de un residuo de asparagina, glicanos ligados a O fijados al oxígeno de un hidroxilo de residuos de serina o tirosina, glicanos ligados a C fijados a un carbono de un residuo de triptófano.

El término "recombinante" se refiere a una estructura artificial de ácido nucleico, a un vector, a un polipéptido o a una célula producida por ingeniería genética.

Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "identidad de secuencia" o "identidad" se refiere a la cantidad (%) de coincidencias (residuos de aminoácidos idénticos) en las posiciones de un alineamiento de dos secuencias polipeptídicas. La identidad de la secuencia se determina comparando las secuencias cuando se alinean para maximizar el solapamiento y la identidad, mientras que se minimizan los huecos de la secuencia. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar utilizando cualquiera entre una serie de algoritmos matemáticos de alineamiento global o local, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias con longitudes similares se alinean preferentemente utilizando algoritmos de alineamiento global (por ejemplo, el algoritmo de Needleman y Wunsch; Needleman y Wunsch, 1970) que alinea las secuencias de forma óptima a lo largo de toda la longitud, mientras que las secuencias con longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferentemente utilizando un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo, el algoritmo de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981) o el algoritmo de Altschul (Altschul et al. 1997; Altschul et al. 2005)). El alineamiento con la finalidad de determinar el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando un programa informático disponible públicamente en sitios de la red de internet, tales como http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr un alineamiento máximo a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Para los fines de la presente invención, el % de los valores de identidad de la secuencia de aminoácidos se refiere a los valores generados utilizando el programa de alineamiento de secuencias por parejas EMBOSS Needle que crea un alineamiento global óptimo de dos secuencias, utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch, en donde todos los parámetros de búsqueda se fijan a valores por defecto, es decir, matriz de puntuación = BLOSUM62, apertura de hueco = 10, extensión de hueco = 0,5, penalización por hueco final = falso, apertura de hueco final = 10 y extensión de hueco final = 0,5.

El término "expresión", tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a cualquier etapa involucrada en la producción de un polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional y secreción.

En la presente memoria, los términos "péptido", "polipéptidd', "proteína" y "enzima" se emplean de manera intercambiable y se refieren a una cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, independientemente del número de aminoácidos que forman dicha cadena. Los aminoácidos se representan en la presente memoria por su código de una letra o de tres letras, de acuerdo con la siguiente nomenclatura: A: alanina (Ala); C: cisteína (Cys); D: ácido aspártico (Asp); E: ácido glutámico (Glu); F: fenilalanina (Phe); G: glicina (Gly); H: histidina (His); I: isoleucina (Ile); K: lisina (Lys); L: leucina (Leu); M: metionina (Met); N: asparagina (Asn); P: prolina (Pro); Q: glutamina (Gln); R: arginina (Arg); S: serina (Ser); T: treonina (Thr); V: valina (Val); W: triptófano (Trp) e Y: tirosina (Tyr).

En el contexto de la invención, un "material que contiene poliéster" se refiere a un producto, tal como un producto de plástico, que comprende al menos un poliéster en forma cristalina, semicristalina o totalmente amorfa. En una realización particular, el material que contiene poliéster se refiere a cualquier artículo formado por al menos un material de plástico, tal como lámina, tubo, varilla, perfil, forma, película, bloque compacto de plástico, etc., que contiene al menos un poliéster, y posiblemente otras sustancias o aditivos, tales como agentes plastificantes, minerales o cargas orgánicas. En una realización particular, el material que contiene poliéster eontiene poliéster y al menos un polímero adicional, tal como una poliolefina, dispuestos uno en relación con el otro de tal manera que no se pueden separar fácilmente. Preferiblemente, el material que contiene poliéster está constituido por una mezcla de poliésteres cristalizados y amorfos, y/o poliésteres semicristalizados, y aditivos. Más preferiblemente, el material que contiene poliéster es un producto de plástico fabricado como un envase, películas para agricultura, artículos desechables o similares. En otra realización particular, el material que contiene poliéster se refiere a un compuesto de plástico, o una formulación de plástico, en estado fundido o sólido, adecuado para producir un producto de plástico. En el contexto de la invención, el compuesto de plástico incluye mezclas homogéneas de al menos un poliéster y al menos un polipéptido y/o una célula recombinante que expresa el polipéptido de la invención, en donde dicho polipéptido y/o célula recombinante es capaz de degradar dicho poliéster. Preferiblemente, el compuesto de plástico está constituido por una mezcla de polímeros semicristalinos y/o amorfos, o polímeros semicristalinos y aditivos.

En la presente descripción, los "poliésteres" incluyen poli(tereftalato de etileno) (PET), poli(tereftalato de trimetileno) (PTT) poli(tereftalato de butileno) (PBT), poli(tereftalato de etileno-isosorbida) (PEIT), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido L-láctico) (PLLA), poli(ácido D-láctico) (PDLA), poli(ácido D,L-láctico) (PDLLA), estereocomplejo de PLA (scPLA), polihidroxialcanoato (P^hA), poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)/PHB), poli(3-hidroxivalerato) (P(3HV)/PHV), poli(3-hidroxihexanoato) (P(3HHx)), poli(3-hidroxioctanoato) (p (3HO)), poli(3-hidroxidecanoato) (P(3Hd)), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)) (P(3HB-co-3HV)/PHBV), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (P(3HB-co-3HHx)/(PHBHHx)), poli(3-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato) (PHB5HV), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato) (PHB3HP), poli(hidroxibutirato-co-hidroxioctonoato) (PHBO), poli(hidroxibutirato-cohidroxioctadecanoato) (PHBOd), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxibutirato) (P(3HB-co-3HV-co-4HB)), poli(succinato de butileno) (PBS), poli(adipato succinato de butileno) (PBSA), poli(tereftalato adipato de butileno) (PBAT), poli(furanoato de etileno) (PEF), policaprolactona (PCL), poli(adipato de etileno) (PEA) y combinaciones/mezclas de esos polímeros.

Un “polímero" se refiere a un compuesto químico o una mezcla de compuestos cuya estructura está constituida por múltiples unidades repetitivas unidas por enlaces químicos covalentes. Dentro del contexto de la invención, el término polímero incluye polímeros naturales o sintéticos, que constituyen un único tipo de unidad repetida (es decir, homopolímeros) o una mezcla de diferentes unidades repetitivas (es decir, copolímeros).

De acuerdo con la invención, “oligómeros" se refiere a moléculas que contienen de 2 a 20 unidades de monómeros.

Nuevo polipéptido aislado

La presente invención está dirigida a un nuevo polipéptido que tiene la capacidad de degradar plásticos que tienen enlaces éster en su estructura molecular. Más particularmente, la presente invención describe un polipéptido recién identificado y aislado que muestra actividad poliesterasa. Dicho polipéptido se aisló originalmente a partir de cepas bacterianas naturales de Actinomadura keratinilytica T16-1 o DSMZ 45195. Curiosamente, el polipéptido de la invención es capaz de hidrolizar enlaces éster en poliésteres naturales y artificiales.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 94%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, proporcionada a continuación, y que tiene una actividad degradante de poliéster.

Ventajosamente, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1

SEQ ID N ° l :

ATQNNPPSW GLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTG AGVNAYIIDTG IYTAHSDFGG RATNVYDALGGNGQ DCN

G HG THVAG TVG G AAYG VAKAVNLRG VRVLNCSG SG TTSG VIAG M NW VASNHVKPAVANM SLG G G YS

SSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSI

TSAW LNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSW LVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRS

L

Tal y como se emplea en esta memoria, el polipéptido de la invención también se puede denominar un polipéptido que tiene una actividad poliesterasa o, de manera intercambiable, una poliesterasa.

Un objeto particular de la invención es proporcionar un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 94%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene una actividad degradante de poli(ácido láctico), y más preferiblemente, una actividad degradante de poli(ácido L-láctico). En una realización particular, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1.

En una realización particular, el polipéptido aislado comprende toda o una parte biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1. Una "parte biológicamente activa" del polipéptido indica más específicamente una porción de ese polipéptido que confiere o muestra la actividad poliesterasa del polipéptido completo. La parte activa, por ejemplo, puede conferir especificidad o afinidad de sustrato, puede contener el sitio catalítico. Una parte activa del polipéptido también indica una forma madura del polipéptido (es decir, que no contiene un péptido señal en el extremo N-terminal del polipéptido). En una realización, la parte biológicamente activa comprende al menos una porción de la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1, que incluye los aminoácidos His 71, Asp 40 y Ser 221 que forman el sitio catalítico del polipéptido. Alternativamente, o además, la parte activa comprende ventajosamente los aminoácidos Ala 172, Ala 174 y His 197 y/o los aminoácidos Asp 12, Asp 15 y Gln 16 que forman sitios de unión de calcio y/o los aminoácidos Cys 68 - Cys 100 y Cys 164 - Cys 195 que forman enlaces disulfuro y/o aminoácidos que forman el sitio de unión al poliéster. En una realización particular, la parte biológicamente activa comprende o está constituida por los aminoácidos 12 a 221 de SEQ ID N° 1. En otra realización, la parte biológicamente activa comprende o está constituida por los aminoácidos 40 a 221 de SEQ ID N° 1.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 5. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un péptido que comprende o está constituido por los aminoácidos 1 a 29 de SEQ ID N° 5, que se corresponden con el péptido señal del polipéptido.

SEQ ID N°5:

MRRRTLPIAVLAAVPLAVAGALPAGAAPAAPAVPVAMAAAGQGVAGQYIVTLKKGVSVDSTVAKRGIRTQHRFGK

VLNGFSAKLTDDQLSKLRTTPGVASIEQDAVITVDATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGI

YTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMN

WVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARAS

YSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSG

TPNLLLNKRSL

Otro objeto de la invención es proporcionar una variante del polipéptido tal y como se indica en SEQ ID N° 1, que comprende una sustitución, una deleción y/o una inserción de uno o varios residuos de aminoácidos del polipéptido de SEQ ID N° 1, que tiene una actividad degradante de poliéster.

En una realización particular, la variante muestra una termoestabilidad superior, en comparación con el polipéptido natural. Por ejemplo, los enlaces disulfuro se introducen mediante sustituciones y/o inserciones de residuos de aminoácidos, lo que conduce a residuos de cisteína adicionales en la secuencia de aminoácidos, en comparación con la natural. Alternativamente o además, se pueden introducir puentes salinos extra en la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

En una realización particular, la variante comprende una o varias sustituciones con relación a SEQ ID N° 1, seleccionadas a partir de T175C, R247C, N139D, S170R, N143R, N173E, S194P, H197D, L210P, G212N, I217K, R166K, T160A, L138A o combinaciones de las mismas, y tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA.

En una realización particular, la variante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 1 con las sustituciones T175C y R247C, y tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA.

En una realización particular adicional, la variante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 1 con las sustituciones N139D y S170R, y tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA.

En una realización particular adicional, la variante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 1 con las sustituciones N143R y N173E, y tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA.

En una realización particular, la variante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 1 con las sustituciones T175C, R247C, N139D, S170R, N143R, N173E, S194P, H197D, L210P, G212N, I217K, R166K, T160A y L138A, y tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA.

En una realización particular, la variante comprende por lo menos 14 sustituciones de residuos de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1, y tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA. En otra realización, la variante comprende por lo menos 17 sustituciones de residuos de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1.

De manera ventajosa, la variante tiene una actividad degradante de poliéster mejor que el polipéptido natural de SEQ ID N° 1. Más preferiblemente, el polipéptido variante tiene una estabilidad a temperaturas elevadas mayor que el polipéptido natural de SEQ ID N° 1.

En otra realización, el polipéptido comprende una o varias glicosilaciones. Por ejemplo, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1, en la que al menos un residuo de aminoácido está glicosilado. Ventajosamente, ese polipéptido glicosilado muestra una mayor estabilidad que en comparación con el polipéptido natural (polipéptido no glicosilado de SEQ ID N° 1), específicamente una mayor termoestabilidad. Por ejemplo, al menos un residuo de asparagina de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 1 está glicosilado y un oligosacárido está unido al nitrógeno amídico de dicho residuo de asparagina. Más particularmente, la SEQ ID N° 1 comprende al menos una glicosilación de un residuo de aminoácido seleccionado entre: N28, N99, N127, N158, N165, N173, N253, N262 o combinaciones de los mismos. En una realización preferida, la SEQ ID N° 1 comprende al menos una glicosilación de un residuo de aminoácido seleccionado entre: N28, N158, N165.

El polipéptido de la invención es particularmente activo en un intervalo de temperaturas de 20°C a 90°C, preferiblemente de 20°C a 60°C, más preferiblemente de 30°C a 55°C, incluso más preferiblemente de 40°C a 50°C, incluso más preferiblemente a 45°C. En una realización particular, el polipéptido todavía está activo a una temperatura entre 60°C y 90°C, preferiblemente a 80°C.

De manera similar, el polipéptido de la invención es particularmente activo en un intervalo de pH de 5 a 11, preferiblemente en un intervalo de pH de 7 a 10, más preferiblemente en un intervalo de pH de 8,5 a 9,5, incluso más preferiblemente en un intervalo de pH de 8 a 9.

El polipéptido aislado de la invención tiene ventajosamente una productividad de al menos 0,02 g.mg-1.h-1, 0,05 g.mg-1.h-1, 0,1 g.mg-1.h-1, 0,15 g.mg-1.h-1, 0,2 g.mg-1.h-1, 0,5 g.mg-1.h-1, 1 g.mg- 1.h-1, 1,5 g.mg-1.h-1 o 2 g.mg-1.h-1. Por "productividad" se entiende la cantidad de producto de degradación (es decir, monómeros) formada por unidad de polipéptido y por unidad de tiempo, a un pH comprendido entre 8 y 9 y a una temperatura de 45°C /- 5°C.

El polipéptido de la invención es particularmente útil para degradar poli(ácido láctico) (PLA) y más particularmente poli(ácido L-láctico) (PLLA).

En una realización particular, el polipéptido de la invención es enantioespecífico. Esto significa que el polipéptido es capaz de actuar sobre el enantiómero L en un poliéster mientras que no es eficaz sobre el enantiómero D, o al revés.

El polipéptido de la invención se puede producir mediante técnicas recombinantes, o se puede aislar o purificar a partir de fuentes naturales (es decir, microorganismos y más particularmente bacterias, levaduras u hongos), o se puede producir artificialmente. En el contexto de la invención, la expresión "obtenido a partir de un microorganismo" en relación con un polipéptido, indica que el polipéptido se ha aislado a partir de ese microorganismo, o que el polipéptido comprende toda o una parte biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido aislado o caracterizado a partir de ese microorganismo. Más particularmente, el polipéptido de la invención se puede producir mediante Bacillus recombinante, E. coli recombinante o Yarrowia lipolytica recombinante.

El polipéptido de la invención se puede purificar mediante métodos conocidos por sí mismos en la técnica, tales como cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, exclusión por tamaño, fase inversa, etc.) y precipitación (por ejemplo, salina, punto isoeléctrico, disolventes orgánicos, polímeros hidrófilos no iónicos, etc.) y almacenar mediante técnicas convencionales. El polipéptido se puede modificar adicionalmente para mejorar, por ejemplo, su estabilidad o actividad. Se puede emplear como tal, en forma purificada, ya sea solo o en combinación con enzimas adicionales, para catalizar reacciones enzimáticas implicadas en la degradación y/o el reciclado de un material que contiene poliéster. El polipéptido puede estar en forma soluble o en fase sólida. En particular, se puede unir a membranas celulares o a vesículas lipídicas, o a soportes sintéticos tales como vidrio, plástico, polímeros, filtros, membranas, por ejemplo, en forma de perlas, columnas, placas y similares.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar una composición que comprende el polipéptido aislado de la invención y/o el correspondiente ácido nucleico, casete de expresión, vector, célula recombinante o extracto de célula recombinante, y opcionalmente aditivos, excipientes, etc. En el contexto de la invención, el término "composición" incluye todo tipo de composiciones que comprenden el polipéptido de la invención en forma aislada o al menos parcialmente purificada. La composición puede estar en estado líquido o seco, por ejemplo, en forma de polvo. En algunas realizaciones, la composición es un material liofilizado. Por ejemplo, la composición puede comprender el polipéptido y/o las células recombinantes que codifican el polipéptido de la invención o un extracto de las mismas, y opcionalmente excipientes y/o reactivos, etc. Los excipientes apropiados incluyen tampones comúnmente utilizados en bioquímica, agentes para ajustar el pH, agentes preservadores tales como benzoato de sodio, sorbato de sodio o ascorbato de sodio, conservantes, agentes protectores o estabilizantes tales como almidón, dextrina, goma arábiga, sales, azúcares, p. ej., sorbitol, trehalosa o lactosa, glicerol, polietilenglicol, polietenglicol, polipropilenglicol, propilenglicol, agente secuestrante tal como EDTA, aminoácidos, un vehículo tal como un disolvente o una solución acuosa, y similares. La composición de la invención se puede obtener mezclando el polipéptido con uno o varios excipientes.

La composición de la invención puede comprender de 0,1% a 90%, preferiblemente de 0,1% a 50%, más preferiblemente de 0,1% a 30%, incluso más preferiblemente de 0,1% a 5% en peso del polipéptido de la invención y de 10% a 99,9%, preferiblemente de 50% a 99,9%, más preferiblemente de 30% a 99,9%, incluso más preferiblemente de 95% a 99,9% en peso de excipiente(s). Una composición preferida comprende entre 0,1 y 5% en peso del polipéptido de la invención.

En una realización particular, la composición puede comprender además polipéptido(s) adicional(es) que muestran una actividad enzimática. Los expertos en la técnica adaptarán fácilmente las cantidades de polipéptido de la invención, dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del material que contiene poliéster que se va a degradar y/o de las enzimas/polipéptidos adicionales contenidos en la composición.

En una realización particular, el polipéptido aislado de la invención se solubiliza en un medio acuoso junto con uno o varios excipientes, especialmente excipientes que son capaces de estabilizar o proteger el polipéptido frente a una degradación. Por ejemplo, el polipéptido de la invención se puede solubilizar en agua, eventualmente con componentes adicionales, tales como glicerol, sorbitol, dextrina, almidón, glicol tal como propanodiol, sal, etc. La mezcla resultante se puede secar luego para obtener un polvo. Los métodos para secar esa mezcla son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación, liofilización, secado por congelación, secado por aspersión, secado supercrítico, evaporación descendente, evaporación en capa fina, evaporación centrífuga, secado por transportador, secado en lecho fluidizado, secado en tambor o cualquier combinación de los mismos.

En una realización particular adicional, la composición de la invención comprende al menos una célula recombinante que expresa el polipéptido de la invención, o un extracto de la misma. Un "extracto de una célula” indica cualquier fracción obtenida a partir de una célula, tal como un material sobrenadante celular, restos celulares, paredes celulares, extracto de ADN, enzimas o una preparación enzimática o cualquier preparación obtenida a partir de las células mediante un tratamiento químico, físico y/o enzimático, que está esencialmente exento de células vivas. Los extractos preferidos son extractos enzimáticamente activos. La composición de la invención puede comprender una o varias células recombinantes de la invención o un extracto de las mismas, y opcionalmente una o varias células adicionales.

En una realización particular, la composición consiste o comprende un medio de cultivo liofilizado de un microorganismo recombinante que expresa y excreta el polipéptido de la invención. En una realización particular, el polvo comprende el polipéptido de la invención y una cantidad estabilizante/solubilizante de glicerol, sorbitol o dextrina, tal como maltodextrina y/o ciclodextrina, almidón, glicol tal como propanodiol y/o una sal.

En una realización adicional, el polipéptido de la invención está inmovilizado sobre un soporte sólido. El polipéptido se puede inmovilizar mediante cualquier método apropiado descrito en el estado de la técnica, por ejemplo, unión covalente, adsorción, atrapamiento o confinamiento en una membrana. Se puede usar una amplia variedad de soportes para inmovilizar el polipéptido de la invención. El soporte que se va a seleccionar depende de su uso específico. Los soportes convenientes incluyen, sin limitación, plástico, metal, soporte inorgánico tal como vidrio, sílice, alúmina, bentonita, hidroxiapatita, níquel/óxido de níquel, titanio, zirconia, soportes poliméricos y similares. El soporte puede estar en forma de una superficie, un polvo, micro o nanoperlas, un gel, un gel o una matriz que se hincha con un disolvente o que se hincha con agua, una matriz o un gel reticulado, una membrana, un soporte fibroso, un soporte poroso y similares. Los métodos para inmovilizar el polipéptido son bien conocidos por el experto en la materia (véase, por ejemplo, Tischer y Wedekind, Topics in Current Chemistry, 1999, 200, 95-126 y Alloue et al., Biotechnol Agron Soc Environ 2008, 12, 57-68).

Una vez preparado, el soporte de la invención se puede utilizar directamente en un medio de reacción. En otras palabras, el soporte de la invención se puede añadir simplemente al medio de reacción. Cuando el soporte se hincha con un disolvente, el disolvente de la reacción se puede seleccionar de modo que proporciona un hinchamiento apropiado del soporte para hacer accesible el polipéptido inmovilizado sin perjudicar la actividad catalítica del polipéptido. A modo de alternativa, el soporte se puede utilizar para preparar un reactor, que puede ser, por ejemplo, un reactor enzimático, un reactor de membrana, un reactor de flujo continuo tal como un reactor de tanque agitado, un reactor de lecho compacto de funcionamiento continuo o un reactor de lecho fluidizado de funcionamiento continuo, o un reactor de lecho compacto. En algunas realizaciones, el soporte de la invención es reciclable y se puede usar varias veces seguidas.

Ácidos nucleicos

Un objeto adicional de la invención es un ácido nucleico que codifica un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente.

Tal y como se usa en este documento, la expresión "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "polinucleótido", "oligonucleótido" y "secuencia de nucleótidos" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN (ADNc o ADNg), ARN o una mezcla de los dos. Puede estar en forma monocatenaria o en forma bicatenaria o una mezcla de las dos. Puede tener un origen recombinante, artificial y/o sintético y puede comprender nucleótidos modificados, que comprenden, por ejemplo, un enlace modificado, una base de purina o pirimidina modificada, o un azúcar modificado.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar en forma aislada o purificada y se pueden preparar, aislar y/o manipular mediante técnicas conocidas de por sí en la técnica, por ejemplo, clonación y expresión de genotecas de ADNc, amplificación, síntesis enzimática o tecnología recombinante. Los ácidos nucleicos también se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, tal y como se describen, por ejemplo, en Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444.

La invención también incluye ácidos nucleicos que se hibridan, en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica el polipéptido tal y como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, esas condiciones rigurosas incluyen incubaciones de los filtros de hibridación a aproximadamente 42°C durante aproximadamente 2,5 horas en 2 X SSC/SDS al 0,1%, seguidas de un lavado de los filtros, cuatro veces durante 15 minutos en 1 X SSC/SDS al 0,1% a 65°C. Los protocolos utilizados se describen en referencias tales como Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) y Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989)).

La invención también incluye ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de la invención, en donde la secuencia de dichos ácidos nucleicos, o al menos una porción de dicha secuencia, se ha modificado genéticamente empleando el uso optimizado de codones.

Una realización específica de esta invención reside en un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente, que comprende la secuencia establecida en SEQ ID N° 2, tal y como se describe a continuación.

SEQ ID N°2:

5'gccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaattccaccggcgcgggcgt gaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcggcaacggccaggactgc aacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcgtgctcaactgcagcggca gcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggcggcggctactcctcctcc ctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccgctcgccggccagcgccg ccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcgcccggctcgtccatcacc tccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaaggcgacctacggcgacg cctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgctgctgaacaagcgctccc tg 3 '

Alternativamente, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se pueden deducir a partir de la secuencia del polipéptido de acuerdo con la invención y el uso de codones se puede adaptar según la célula hospedadora en la que se van a transcribir los ácidos nucleicos. Esas etapas se pueden llevar a cabo de acuerdo con métodos bien conocidos por un experto en la técnica y algunos de los cuales se describen en el manual de referencia Sambrook. et al. (Sambrook et al., 2001).

Los ácidos nucleicos de esta invención pueden comprender además secuencias de nucleótidos adicionales, tales como regiones reguladoras, es decir, promotores, potenciadores, silenciadores, terminadores, péptidos señal y similares que se pueden usar para causar o regular una expresión del polipéptido en una célula hospedadora o un sistema seleccionados.

La presente invención se refiere además a una casete de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención ligado funcionalmente a una o a varias secuencias de control que dirigen la expresión de dicho ácido nucleico en una célula hospedadora adecuada. Normalmente, la casete de expresión comprende, o consiste en, un ácido nucleico de acuerdo con la invención ligado funcionalmente a un promotor de la transcripción y un terminador de la transcripción.

La invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico o una casete de expresión tal y como se ha definido anteriormente.

El término "vector" se refiere a una molécula de ADN utilizada como vehículo para transferir material genético recombinante a una célula hospedadora. Los principales tipos de vectores son plásmidos, bacteriófagos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. El vector mismo es generalmente una secuencia de ADN que consiste en un inserto (una secuencia de ácido nucleico heteróloga, transgén) y una secuencia más grande que sirve como la "columna vertebral" del vector. La finalidad de un vector que transfiere información genética al hospedador es típicamente aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula diana. Los vectores denominados vectores de expresión (estructuras artificiales de expresión) están adaptados específicamente para la expresión de las secuencias heterólogas en la célula diana y generalmente tienen una secuencia promotora que dirige la expresión de las secuencias heterólogas que codifican un polipéptido. Generalmente, los elementos reguladores que están presentes en un vector de expresión incluyen un promotor transcripcional, un sitio de unión al ribosoma, un terminador y, opcionalmente, un operador presente. Preferiblemente, un vector de expresión también contiene un origen de replicación para la replicación autónoma en una célula hospedadora, un marcador seleccionable, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles y un potencial para un número de copias elevado. Ejemplos de vectores de expresión son vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos y virus diseñados específicamente. Los vectores de expresión que proporcionan niveles adecuados de expresión de polipéptidos en diferentes hospedadores son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión bacterianos bien conocidos en la técnica incluyen pET11a (Novagen), lamda gt11 (Invitrogen).

La presente invención se refiere además al uso de un ácido nucleico, una casete de expresión o un vector de acuerdo con la invención para transformar, transfectar o transducir una célula hospedadora. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se va a introducir el vector.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora, o una célula recombinante, que comprende un ácido nucleico, una casete o un vector de acuerdo con la invención. La célula hospedadora se puede transformar, transfectar o transducir de forma transitoria o estable. La casete de expresión o el vector de la invención se introduce en una célula hospedadora de modo que la casete o el vector se conserva como un elemento integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. La casete o el vector de expresión se pueden introducir en las células hospedadoras usando técnicas convencionales. Ejemplos de tales técnicas incluyen transformación, transfección, lipotransfección, fusión de protoplastos y electroporación.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula que se puede modificar genéticamente y, preferiblemente, cultivar. La célula puede ser eucariota o procariota, tal como una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal, un microorganismo tal como una levadura, un hongo o una célula bacteriana, etc. En una realización particular, la célula hospedadora se selecciona a partir del grupo de Escherichia coli, Bacillus, bacterias de ácido láctico, Streptomyces, Trichoderma, Aspergillus, Pichia or Yarrowia. Debe entenderse que la invención no está limitada con respecto a ningún tipo de célula en particular, y se puede aplicar a todo tipo de células, siguiendo el conocimiento general común. La expresión "célula hospedadora” también incluye cualquier progenie de una célula hospedadora parental que no es idéntica a la célula hospedadora parental debido a mutaciones que tienen lugar durante la replicación.

En una realización particular, la célula hospedadora es una levadura, preferiblemente Yarrowia, y el polipéptido producido es un polipéptido glicosilado que muestra una gran termoestabilidad. En una realización preferida, el polipéptido consiste en SEQ ID N° 1 que comprende al menos una glicosilación de un residuo de aminoácido seleccionado entre N28, N158 o N165.

En una realización particular, la presente invención proporciona una célula hospedadora modificada genéticamente para expresar los ácidos nucleicos mostrados en SEQ ID N° 2 o una casete de expresión de la misma.

En una realización particular, la invención proporciona un Bacillus subtilis recombinante, modificado genéticamente para expresar los ácidos nucleicos mostrados en SEQ ID N° 2 o una casete de expresión de los mismos.

En otra realización particular, la invención proporciona una E. coli recombinante, modificada genéticamente para expresar los ácidos nucleicos mostrados en SEQ ID N° 2 o una casete de expresión los mismos.

En una realización particular adicional, la invención proporciona una Yarrowia lipolytica recombinante, modificada genéticamente para expresar los ácidos nucleicos mostrados en SEQ ID N° 2 o una casete de expresión los mismos.

En una realización adicional, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende y expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene actividad degradante de poliéster.

En otra realización, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende y expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene actividad degradante de PLA, más preferiblemente, actividad degradante de PLLA.

En una realización particular, la célula hospedadora es un microorganismo recombinante. De hecho, la invención permite la modificación genética de microorganismos con una capacidad mejorada para degradar material que contiene poliéster. Por ejemplo, la secuencia de la invención se puede usar para complementar una cepa de tipo silvestre de un hongo o una bacteria que ya se sabe que es capaz de degradar el poliéster, con el fin de mejorar y/o aumentar la capacidad de la cepa.

En una realización particular, la invención proporciona un Bacillus subtilis recombinante que comprende y expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en SEQ ID N° 1, y que tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente, actividad degradante de PLA, más preferiblemente, actividad degradante de PLLA.

En otra realización particular, la invención proporciona una E. coli recombinante que comprende y expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en SEQ ID N° 1, y que tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA, más preferiblemente, actividad degradante de PLLA.

En una realización particular adicional, la invención proporciona una Yarrowia lipolytica recombinante que comprende y expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en SEQ ID N° 1, y que tiene actividad degradante de poliéster, preferiblemente actividad degradante de PLA, más preferiblemente, actividad degradante de PLLA. De manera ventajosa, uno o varios residuos de aminoácidos del polipéptido están glicosilados. Más preferiblemente, el polipéptido consiste en SEQ ID N° 1 que comprende al menos una glicosilación de un residuo de aminoácido seleccionado entre N28, N158 o N165, preferiblemente al menos N158.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para producir un polipéptido de la invención, que comprende (i) cultivar una célula recombinante tal y como se ha definido anteriormente, (ii) recuperar el material sobrenadante del cultivo y, opcionalmente, (iii) aislar o purificar el polipéptido. La invención se refiere además a un polipéptido de ese tipo obtenido mediante este método de producción.

Alternativamente, el polipéptido de la invención se puede producir mediante métodos exentos de células (Kim et al. J Biosci. Bioeng. Julio 2009; Spirin et al. (2007) Front Matter in Cell-Free Protein Synthesis: Methods and Protocols) o se puede sintetizar químicamente.

Degradación del material que contiene poliéster

La presente invención proporciona métodos que utilizan el polipéptido de la invención para la degradación en condiciones aeróbicas o anaeróbicas y/o reciclar el material que contiene poliéster, como productos de plástico producido con o que contienen poliésteres. De hecho, debido a su alta eficacia para despolimerizar el poliéster, el polipéptido de la invención es mucho más ventajoso en comparación con otros medios químicos o microbianos conocidos para la degradación de poliéster. El polipéptido de la invención tiene una tasa de despolimerización incrementada, en particular para la despolimerización de PLA.

Por lo tanto, un objeto de la invención es utilizar el polipéptido de la invención, o la correspondiente célula recombinante o un extracto de la misma, o la composición, para la degradación enzimática de un material que contiene poliéster. En una realización preferida, el polipéptido, o la célula recombinante correspondiente, su extracto o la composición, se usa para la degradación enzimática de un material que contiene PLA, y más preferiblemente para la degradación enzimática de un material que contiene PLLA.

Otro objeto de la invención es usar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en SEQ ID N° 1, y que tiene actividad degradante del poliéster para degradar un material que contiene poliéster.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para degradar un material que contiene poliéster, en donde un material que contiene poliéster se pone en contacto con el polipéptido de la invención, o la correspondiente célula recombinante o su extracto, o la composición. Ventajosamente, el o los poliésteres del material que contiene poliéster se despolimerizan hasta monómeros y/u oligómeros. En una realización particular, todos los poliésteres seleccionados se despolimerizan hasta los monómeros que formaban los poliésteres originales del material.

En una realización del procedimiento de degradación, al menos un poliéster se degrada para producir monómeros y/u oligómeros repolimerizables, los cuales se recuperan ventajosamente con el fin de ser utilizados de nuevo. En otra realización, el (los) poliéster(es) del material que contiene poliéster están completamente degradados.

En una realización preferida, el material que contiene poliéster comprende PLA, más preferiblemente PLLA, y se recuperan al menos los monómeros y/u oligómeros de ácido láctico para reciclar o metanizar, por ejemplo.

En una realización adicional, el material que contiene poliéster comprende PLA y al menos un poliéster adicional, preferiblemente seleccionado a partir de poli(tereftalato de trimetileno) (PTT), poli(tereftalato de butileno) (PBT), poli(tereftalato de etileno) (PET), poli(tereftalato adipato de butileno (PBAT), polihidroxialcanoato (PHA), poli(succinato de butileno) (PBS), policaprolactona (PCL), poli(adipato de etileno) (PEA) y combinaciones/mezclas de esos poliésteres.

Alternativamente o además, el material que contiene poliéster puede contener adicionalmente al menos una poliamida (también denominada nailon) y/o al menos una poliolefina, preferiblemente seleccionada a partir del grupo que consiste en polietileno (PE), polipropileno (PP) y combinaciones/mezclas de esos polímeros, y/o al menos un polímero vinílico elaborado a partir de monómeros vinílicos, pequeñas moléculas que contienen dobles enlaces de carbono-carbono.

Alternativamente o además, el material que contiene poliéster puede contener adicionalmente al menos un polímero natural (es decir, no derivado petroquímicamente), preferiblemente seleccionado a partir de almidón, harina, celulosa y combinaciones/mezclas de los mismos.

En una realización particular, el material que contiene poliéster comprende polihidroxialcanoato (PHA) y/o poli(tereftalato de etileno) (PET) y/o poli(tereftalato adipato de butileno) (PBAT), o combinaciones/mezclas de esos poliésteres.

De acuerdo con la invención, el material que contiene poliéster también puede contener compuestos metálicos, compuestos minerales, compuestos de vidrio, fibras naturales o sintéticas, papel, madera, compuestos de madera tales como lignina, celulosa o hemicelulosa, almidón y derivados de los mismos.

La invención también se refiere a un método para producir monómeros y/u oligómeros a partir de un material que contiene poliéster, que comprende exponer un material que contiene poliéster al polipéptido de la invención, o la correspondiente célula recombinante o extracto de la misma, o la composición, y opcionalmente recuperar los monómeros y/u oligómeros. El método de la invención es particularmente útil para producir monómeros de ácido láctico.

Cuando se usa un microorganismo recombinante, ese microorganismo muestra ventajosamente un metabolismo modificado para evitar el consumo de los monómeros y/u oligómeros obtenidos a partir del poliéster degradado. Por ejemplo, las enzimas que degradan dichos monómeros y/u oligómeros se han eliminado o desactivado en el microorganismo. Alternativamente, el método de la invención se puede realizar en un medio de cultivo que contiene al menos una fuente de carbono utilizable por el microorganismo recombinante, de modo que dicho microorganismo consume preferentemente esa fuente de carbono en lugar de los monómeros y/u oligómeros. Ventajosamente, el material que contiene poliéster se pone en contacto con un medio de cultivo que contiene los microorganismos recombinantes, glucosa o similares como fuente de carbono, así como una fuente de nitrógeno disponible, que incluye una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, líquido de maceración de maíz) o una fuente de nitrógeno inorgánico (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio). Si es necesario, el medio de cultivo puede contener además sales inorgánicas (por ejemplo, ion sodio, ion potasio, ion calcio, ion magnesio, ion sulfato, ion cloro, ion fosfato). Además, el medio también se puede complementar con componentes traza como vitaminas, oligoelementos y aminoácidos.

En una realización particular, el material que contiene poliéster se puede tratar previamente antes de entrar en contacto con la poliesterasa de la invención, con el fin de cambiar físicamente su estructura, de modo que se incrementa la superficie de contacto entre los poliésteres y la poliesterasa. Por ejemplo, el material que contiene poliéster se puede transformar en una emulsión o un polvo, que se añade a un medio líquido que contiene el polipéptido de la invención y/o un microorganismo recombinante o un extracto del mismo. Alternativamente, el material que contiene poliéster se puede triturar mecánicamente, granular, peletizar, etc., mediante corte, impacto, trituración, machacamiento, fraccionamiento, trituración criogénica o similares, para reducir la forma y el tamaño del material antes de añadirlo a un medio líquido que contiene el microorganismo recombinante, el extracto del mismo y/o el polipéptido. El pretratamiento mecánico también puede ser someter a ultrasonidos, centrifugar, cizallamiento, choque, un homogeneizador de alta presión, maceración o licuefacción con un tambor rotatorio, una prensa de tornillo, una trituradora de pantalla de disco o una prensa de pistón. Alternativa o adicionalmente, se puede aplicar un pretratamiento térmico. Esto se puede conseguir con microondas. Un pretratamiento térmico de ese tipo puede proporcionar una desinfección, pasteurización o esterilización. En otra realización, el material que contiene poliéster se trata previamente de forma química para modificar su estructura y aumentar la superficie de contacto entre los poliésteres y el polipéptido de la invención. Se puede utilizar una base, un ácido, un disolvente o un líquido iónico. También se puede implementar una ozonización. En una realización particular, el material que contiene poliéster también se puede clasificar, lavar, desinfectar, esterilizar y/o limpiar biológicamente antes de la degradación. De acuerdo con la invención, se pueden combinar varios pretratamientos.

El tiempo requerido para la degradación de un material que contiene poliéster puede variar dependiendo del propio material que contiene poliéster (es decir, la naturaleza y el origen del producto de plástico, su composición, forma, etc.), el tipo y la cantidad de polipéptido utilizado, así como varios parámetros del procedimiento (es decir, temperatura, pH, agentes adicionales, etc.). Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los parámetros del procedimiento al material que contiene poliéster.

Ventajosamente, el procedimiento se implementa a una temperatura comprendida entre 20°C y 90°C, preferiblemente entre 20°C y 60°C, más preferiblemente entre 30°C y 55°C, más preferiblemente entre 40°C y 50°C, incluso más preferiblemente a 45°C. Más generalmente, la temperatura se mantiene por debajo de una temperatura de inactivación, que corresponde a la temperatura a la cual se inactiva el polipéptido y/o el microorganismo recombinante ya no sintetiza el polipéptido.

El pH del medio puede estar en un intervalo de pH de 5 a 11, preferiblemente en un intervalo de pH de 7 a 10, más preferiblemente en un intervalo de pH de 8,5 a 9,5, incluso más preferiblemente en un intervalo de pH de 8 a 9. De manera ventajosa, el pH se ajusta de acuerdo con el poliéster deseado y la solubilidad de los monómeros/oligómeros deseados, para mejorar la eficiencia del procedimiento. Preferiblemente, el pH se ajusta para que se mantenga en el pH óptimo del polipéptido. De hecho, la despolimerización de poliésteres produce monómeros y oligómeros ácidos que inducen una disminución del pH. Se puede emplear una adición de un álcali diluido o un álcali saturado, tal como hidróxido de calcio, para compensar esa acidificación y mantener el pH en el más óptimo.

Ventajosamente, la cantidad añadida de polipéptido está en un intervalo de 0,001% a 5% en peso de material que contiene poliéster, preferiblemente en un intervalo de 0,001% a 1%, más preferiblemente en un intervalo de 0,001% a 0,1%, incluso más preferiblemente en un intervalo de 0,001% a 0,05%.

En una realización particular, el procedimiento se realiza con agitación, preferiblemente comprendida entre 30 rpm y 2000 rpm, para favorecer el contacto entre el polipéptido y el material que contiene poliéster.

En una realización particular, se añade al medio al menos un agente lipófilo y/o un agente hidrófilo para mejorar la etapa de despolimerización. Se puede añadir un agente inductor tal como oligómeros de poliésteres o derivados de los mismos, al medio que comprende un microorganismo recombinante para mejorar la producción de polipéptidos. Se puede añadir al medio un tensioactivo tal como Tween o una proteína pequeña tal como hidrofobina, para modificar la energía de la interfaz entre el poliéster y el polipéptido o el microorganismo recombinante y mejorar la eficacia de la degradación. Se podría emplear una sustancia orgánica o un líquido iónico para hinchar el poliéster y aumentar la accesibilidad del microorganismo o del polipéptido.

El tiempo de reacción para la despolimerización de al menos un poliéster del material de plástico hasta los monómeros/oligómeros está comprendido ventajosamente entre 5 o menos y 110 horas, más preferiblemente entre 24 y 72 horas. Ese tiempo de reacción puede permitir que la despolimerización avance suficientemente y no será perjudicial económicamente. El tiempo de reacción puede ser más largo para la biodegradación anaeróbica en un sitio de metanización o para la biodegradación aeróbica en un entorno natural.

Opcionalmente, los monómeros y/u oligómeros resultantes de la despolimerización se pueden recuperar de forma secuencial o continua. Se puede recuperar un solo tipo de monómeros y/u oligómeros o varios tipos diferentes de monómeros y/u oligómeros, dependiendo del material que contiene poliéster de partida.

Los monómeros y/u oligómeros recuperados se pueden purificar adicionalmente, usando todos los métodos de purificación adecuados y condicionados en una forma repolimerizable. Ejemplos de métodos de purificación incluyen un proceso de extracción, separación mediante solución acuosa, condensación selectiva con vapor, filtración y concentración del medio después de un bioproceso, separación, destilación, evaporación al vacío, extracción, electrodiálisis, adsorción, intercambio iónico, precipitación, cristalización, concentración y deshidratación y precipitación por adición de ácido, nanofiltración, tratamiento con catalizador ácido, destilación en modo semicontinuo o destilación en modo continuo, extracción con disolvente, concentración evaporativa, cristalización evaporativa, extracción líquido/líquido, hidrogenación, proceso de destilación azeotrópica, adsorción, cromatografía en columna, destilación simple al vacío y microfiltración, combinados o no.

Los monómeros y/u oligómeros repolimerizables se pueden reutilizar después, por ejemplo, para sintetizar poliésteres. Ventajosamente, los poliésteres con la misma naturaleza se repolimerizan. Sin embargo, es posible mezclar los monómeros y/u oligómeros recuperados con otros monómeros y/u oligómeros, para, por ejemplo, sintetizar nuevos copolímeros. Alternativamente, los monómeros recuperados se pueden utilizar como productos químicos intermedios para producir nuevos compuestos químicos de interés.

En una realización particular, la repolimerización se lleva a cabo usando una hidrolasa en condiciones apropiadas para permitir una reacción de polimerización. Se pueden añadir agentes iniciadores a la solución de monómeros/oligómeros para favorecer la reacción de polimerización. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los parámetros del procedimiento a los monómeros/oligómeros y los polímeros que se van a sintetizar. En una realización particular, los métodos de la invención se realizan en un reactor. "Reactor" designa cualquier dispositivo o instalación o centro adecuado para mantener y transformar artículos de plástico. Un reactor puede comprender dispositivos de entrada y salida para suministrar/recoger medio, nutrientes, gas, etc. El reactor puede estar cerrado o abierto, como un tanque.

Compuesto y artículo de plástico

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un material que contiene poliéster en el que se incluye el polipéptido de la invención y/o un microorganismo recombinante que expresa y excreta dicho polipéptido. En una realización particular, ese material que contiene poliéster puede ser un compuesto de plástico.

Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar un compuesto de plástico que contiene el polipéptido de la invención y/o una célula recombinante y/o una composición o un extracto de la misma; y al menos un poliéster. En una realización preferida, el poliéster se selecciona a partir de poli(ácido láctico), preferiblemente a partir de PLLA. Particularmente, el compuesto de plástico puede contener un polímero adicional, preferiblemente seleccionado a partir de poliésteres tales como PDLA, PBAT, PHA, PCL, PET; poliolefinas tales como polietileno, polipropileno o polímeros naturales tales como almidón, celulosa o harina; y combinaciones/mezclas de los mismos. Más particularmente, el compuesto de plástico puede contener polímeros adicionales seleccionados a partir de PBAT y harina o almidón.

En una realización particular, el polipéptido usado para preparar el compuesto de plástico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en SEQ ID N° 1.

En particular, la invención se refiere a un procedimiento que comprende una etapa de mezclar un poliéster y un polipéptido y/o la célula recombinante de la invención que degrada dicho poliéster, a una temperatura a la que el poliéster se encuentra en un estado parcial o totalmente fundido, de manera que el polipéptido y/o la célula recombinante se integran en la estructura misma del material que contiene poliéster. En una realización particular, se incluyen esporas de un microorganismo recombinante en el material que contiene poliéster.

Por ejemplo, el polipéptido y/o el microorganismo recombinante de la invención y el poliéster se pueden mezclar a una temperatura entre la temperatura de transición vítrea y el punto de fusión del poliéster. Alternativamente, la entidad biológica y la poliolefina se pueden mezclar a una temperatura correspondiente al punto de fusión de dicho poliéster, o superior. En una realización particular, el polipéptido/microorganismo y el poliéster se mezclan a una temperatura entre 80°C y 250°C, preferiblemente entre 100°C y 200°C. Alternativamente, el polipéptido/microorganismo y el poliéster se mezclan a una temperatura superior a 80°C, preferiblemente superior a 100°C, incluso más preferiblemente superior a 130°C. Más generalmente, el polipéptido y/o el microorganismo recombinante resiste ventajosamente al menos a la temperatura de extrusión del poliéster.

Más preferiblemente, la etapa de mezcla se realiza empleando una extrusión, extrusión de doble husillo, extrusión de un solo husillo, moldeo por inyección, fundición, termoformado, moldeo rotativo, compresión, calandrado, planchado, revestimiento, estratificación, expansión, pultrusión, extrusión por soplado, extrusión por hinchamiento, granulación por compresión, evaporación con emulsión doble de agua en aceite en agua o cualquier técnica conocida por el experto en la materia.

El compuesto de plástico resultante integra el polipéptido/microorganismo de la invención incluido en la masa del compuesto.

De manera ventajosa, ese compuesto de plástico se puede usar para la fabricación de un artículo de plástico en el que también se incluye el polipéptido/microorganismo de la invención.

En una realización particular, el compuesto de plástico o artículo de plástico resultante es un compuesto de plástico o un artículo de plástico biodegradable que cumple al menos una de las normas y/o etiquetas relevantes conocidas por el experto en la materia, tales como la norma EN 13432, la norma ASTM D6400, OK Biodegradation Soil (etiqueta Vingotte), OK Biodegradation Water (etiqueta Vingotte), OK Compost (etiqueta Vingotte), OK Compost Home (etiqueta Vingotte).

Un compuesto de plástico biodegradable o un artículo de plástico se refiere a un compuesto de plástico o un artículo de plástico que se transforma al menos parcialmente en condiciones ambientales en agua, dióxido de carbono o metano y biomasa. Tal y como se ilustra en los ejemplos, los compuestos de plástico o artículos de plástico preferidos de la invención son biodegradables en agua. Preferiblemente, aproximadamente el 90% en peso del compuesto de plástico o del artículo de plástico se biodegrada en agua en menos de 90 días, más preferiblemente en menos de 60 días, incluso más preferiblemente en menos de 30 días. Alternativamente o además, el compuesto de plástico o el artículo de plástico se puede biodegradar cuando se expone a condiciones de humedad y temperatura que se producen en un entorno. Preferiblemente, aproximadamente el 90% en peso del compuesto de plástico o del artículo de plástico se biodegrada en menos de 3 años en el medio ambiente, más preferiblemente en menos de 2 años, incluso más preferiblemente en menos de 1 año. Alternativamente, el compuesto de plástico o el artículo de plástico se puede biodegradar en condiciones de compostaje industrial, en las que la temperatura se mantiene por encima de 50°C.

En los siguientes ejemplos se darán a conocer otros aspectos y ventajas de la invención, que deben considerarse ilustrativos y no que limitan el alcance de esta solicitud.

Ejemplos

Ejemplo 1: Purificación e identificación de una poliesterasa procedente de Actinomadura keratinilytica T16-1 La cepa de A. keratinilytica NBRC 104111, T16-1 (Sukkum et al. 2009), aislada a partir de suelos forestales tailandeses, fue seleccionada por la elevada actividad degradante de PLA de su material sobrenadante.

Producción de enzimas en un termentador

El experimento por lotes se realizó en un fermentador de 10 L (Sartorius^® Biostat Cplus). Se utilizaron 500 mL de un precultivo de “Yeast Malt Broth” (YM, Sigma-Aldrich) para inocular 4,5 L de medio basal (gelatina, 2,4 g/L; (NH⁴)²SO⁴, 4 g/L; MgSO⁴7H²O, 0,2 g/L; extracto de levadura, 0,5 g/L; K²HPO⁴, 4 g/L; KH² PO⁴ , 2 g/L ajustado a pH 6,8 con NaOH). La temperatura se reguló a 46°C y el pH se mantuvo en 6,8 con la adición de una solución de H³ PO⁴ al 10% (v/v). La tasa de agitación se fijó a 70 rpm para permitir una mezcla suave y la tasa de aireación (0,6 a 1,6 vvm) se reguló para proporcionar al reactor un nivel de oxígeno disuelto superior al 20% de saturación de aire, con el fin de evitar cualquier limitación de oxígeno en el cultivo. El fermentador se conectó a un ordenador y el programa informático MFCS/DA realizó la adquisición en línea de los parámetros controlados (pH, temperatura, presión parcial de oxígeno disuelto y adición de H³ PO⁴) y permitió el seguimiento y la regulación de esos parámetros en línea. La duración del cultivo fue de 50 horas. El material sobrenadante, que contenía la enzima extracelular, se recuperó mediante centrifugación (13000 g - 10 min) y se conservó a 4°C.

Purificación de la poliesterasa

El material sobrenadante del cultivo se concentró 40 veces usando 500 ml de Amicon Cell (Merck Millipore) y una membrana regenerada de celulosa con un tamaño de poro de 10 KDa (GE Healthcare Life Science). La solución resultante se dializó frente a tampón de glicina-NaOH 50 mM a pH 10.

Se usó un aparato AKTA Purifier (GE Healthcare Life Science) para llevar a cabo la purificación del polipéptido, usando una columna de purificación por intercambio aniónico HiTrap Q FF de 1 mL (GE Healthcare Life Science) con glicina-NaOH 50 mM pH 10 como tampón de carga. La elución se llevó a cabo con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M en tampón de glicina-NaOH 50 mM a pH 10.

La presencia de la poliesterasa de la invención en las diferentes fracciones que comprendían la fracción de flujo a través, se dilucidó después de una precipitación con TCA (v/v) mediante un gel de SDS-PAGE sin tinción (Bio-Rad) y sometiendo a ensayo la capacidad de la enzima para producir un halo en una placa que contenía una mezcla de agarosa (1%) y emulsión de pLLA (0,5%, NaturePlast).

Determinación de la secuencia N-terminal del polipéptido

La secuenciación N-terminal del polipéptido contenido en la banda deseada, se llevó a cabo después de la extracción pasiva desde el gel, mediante la técnica de microsecuenciación de Edman, utilizando un aparato microsecuenciador 494 (Perkin Elmer Applied Biosystems) en la plataforma Pissaro de Rouen (Francia).

Técnicas de biología molecular

Los procedimientos generales utilizados para la manipulación del ADN se han descrito previamente (Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) a menos que se especifique lo contrario. Las enzimas de restricción y la ADN ligasa T4 se obtuvieron de New England Biolabs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las PCRs se realizaron utilizando la mezcla CloneAmp HiFi PCR Premix (Takara-Clontech). Eurogentec sintetizó los oligonucleótidos sintéticos. Los productos de la PCR se purificaron usando el kit GenElute PCR Clean-Up (Sigma-Aldrich). El ADN plasmídico se introdujo en la cepa de Escherichia coli DH5a (Invitrogen) utilizando el método de choque térmico. El ADN plasmídico se obtuvo a partir de E. coli utilizando el kit de minipreparación de plásmido por giro QIAprep (Qiagen). Las muestras de ARN total se obtuvieron utilizando el kit RNeasy^® Plus Mini Kit (Qiagen) y, posteriormente, los ARNs ribosómicos se agotaron utilizando el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero™ (Epicenter).

Secuenciación del ARN

Dos genotecas de ARN, correspondientes a los perfiles de expresión de A. keratinilytica T16-1 en presencia/ausencia de PLLA (NaturePlast, 500 pm), se construyeron utilizando el kit de ARNm Illumina TruSeq Stranded mRNA y el sistema de secuenciación de rendimiento ultra alto Ilumina HiSeq 2500. Se obtuvieron lecturas de extremos emparejados (2x100 ob) utilizando la química v3 del kit TruSeq SBS (Ilumina).

Bioinformática

Las búsquedas en bases de datos se realizaron utilizando la base de datos de secuencias no redundantes, accesible en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando TBLASTN, BLASTX y BLASTP (Altschul SF et al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of polypeptide database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El análisis de la secuencia se realizó con el programa informático Vector NTI (Life Technologies) y se realizaron múltiples alineamientos locales con el programa informático ClustalW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids. Res. 22:4673-4680).

Resultados

Purificación de polipéptidos

La purificación de polipéptidos se realizó usando una columna de intercambio aniónico a pH 10. Se analizó la actividad de las diferentes fracciones sobre placas de agarosa que contenían PLA. La formación de un halo, que indicaba la hidrólisis de PLA, solo se obtuvo con la fracción de flujo a través. Un SDS-PAGE, con p-mercaptoetanol, demostró que la fracción de flujo a través contiene una banda única (Figura 1). Este procedimiento de purificación permitió obtener un polipéptido puro, que mostraba que se había obtenido la actividad de hidrólisis de ^p L^a . El peso molecular del polipéptido se evaluó en 27 kDa.

La secuenciación N-terminal de la proteína madura contenida en la banda mostraba una secuencia única de 28 aminoácidos:

ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYN (SEQ ID N° 3)

El polipéptido purificado en el flujo a través mostraba una actividad de despolimerización sobre polvo de PLA. La actividad específica del polipéptido es de 4,8 g de ácido láctico producidos por mg de enzima y por hora (según el protocolo que se describe a continuación).

Los resultados de la secuenciación del ARN permitieron identificar una secuencia de ADN, que codificaba un polipéptido cuya secuencia mostraba 100% de identidad con los 28 aminoácidos previamente identificados mediante una secuenciación N-terminal.

La secuencia de ADN determinada se reproduce a continuación (SEQ ID N° 4), en donde la secuencia subrayada corresponde al péptido señal hipotético y al propéptido:

5 'ateaeaceacetaccctecccatceccetcctcecceccettccccteeccetegceggceccctecccecceeaeccecccccecceccccceccetccceg tcgccatggcggccgccggacagggcgtcgccggacagtacatcgtgacgctgaagaagggcgtctcggtcgactcgaccgtcgccaagcgcggaatccgcac ccagcaccgtttcggcaaggtgctgaacggcttctccgccaagctcaccgatgaccaactgtccaagctgcgcaccacgcccggtgtcgcgtccatcgagcagg acgccgtcatcacggtggacgccacgcagaacaacccgccgtcgtggggcctggaccgcatcgaccagacgaacctgccgctgtcgcgcagctacacctacaa ttccaccggcgcgggcgtgaacgcctacatcatcgacaccggcatctacaccgcgcactccgacttcggcggccgcgccaccaacgtctacgacgccctcggcg gcaacggccaggactgcaacggccacggcacccacgtcgcgggcaccgtcggcggcgccgcctacggcgtggccaaggcggtcaacctgcgcggcgtgcgcg tgctcaactgcagcggcagcggcaccacctccggtgtcatcgccggcatgaactgggtggccagcaaccacgtcaagcccgccgtggcgaacatgtcgctgggc ggcggctactcctcctccctgaacacggccgccaacaacctggccagctccggcgtgttcctggccgtcgccgcgggcaacgagaccaccaacgcctgcaaccg ctcgccggccagcgccgccaacgccaccacggtcgccgcgagcaccagcaccgacgcccgggcctcctacagcaactacggctcgtgcgtccacctgtacgcg cccggctcgtccatcacctccgcctggctgaacggcggcaccaacaccatcagcggcacgtcgatggccacgccgcacgtggccgggaccgccgccctctacaa ggcgacctacggcgacgcctcgttcagcaccatccgcagctggctggtcagcaacgccacctccggcgtcatcaccggcaacgtgtcgggcaccccgaacctgc tgctgaacaagcgctccctgtaa 3' (SEQ. ID N°4)

El polipéptido codificado presenta una secuencia de 386 aminoácidos (SEQ ID N° 5 a continuación), en donde - los residuos 1 a 29 corresponden al péptido señal,

- los residuos 30 a 110 corresponden al propéptido hipotético y

- los residuos 111 a 386 corresponden al polipéptido maduro.

SEQ ID N° 5 (secuencia del propéptido subrayada; péptido señal subrayado dos veces): MRRRTLPIAVLAAVPLAVAGALPAGAAPAAPAVPVAMAAAGQGVAGQYIVTLKKGVSVDSTVAKRGIRTQHRFGK VLNGFSAKLTDDQLSKLRTTPGVASIEQDAVITVDATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGI YTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTHVAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMN WVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLASSGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARAS YSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMATPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSG TPNLLLNKRSL

Secuencia del polipéptido maduro (SEQ ID N° 1):

ATQNNPPSWGLDRIDQTNLPLSRSYTYNSTGAGVNAYIIDTGIYTAHSDFGGRATNVYDALGGNGQDCNGHGTH VAGTVGGAAYGVAKAVNLRGVRVLNCSGSGTTSGVIAGMNWVASNHVKPAVANMSLGGGYSSSLNTAANNLAS SGVFLAVAAGNETTNACNRSPASAANATTVAASTSTDARASYSNYGSCVHLYAPGSSITSAWLNGGTNTISGTSMA TPHVAGTAALYKATYGDASFSTIRSWLVSNATSGVITGNVSGTPNLLLNKRSL

El peso molecular teórico calculado para este polipéptido maduro de 276 aminoácidos era de 27,7 kDa, que se corresponde con el peso molecular observado después de la purificación de la poliesterasa a partir del material sobrenadante de A. keratinilytica T16-1.

De acuerdo con la homología con polipéptidos conocidos, el polipéptido que tenía actividad poliesterasa reveló la presencia de dos sitios de unión putativos de calcio, con los residuos Ala 172, Ala 174 e His 197 para el primero y los residuos Asp 12, Asp 15 y Gln 16 para el segundo. El sitio catalítico del polipéptido está compuesto por los aminoácidos His 71, Asp 40 y Ser 221. Además, también se han identificado dos enlaces disulfuro putativos en la secuencia polipeptídica entre los residuos Cys 68 - Cys 100 y Cys 164 - Cys 195 (Figura 2).

Ejemplo 2: Caracterización de la poliesterasa procedente de A. keratinilytica T16-1.

Se determinaron el pH y la temperatura óptimos de la enzima y se estudió la termoestabilidad de la enzima. pH y temperatura óptimos del polipéptido

El pH óptimo de la enzima es 8,5. Las pruebas de despolimerización en tubos agitados magnéticamente se realizaron a 50°C en un intervalo de pH entre 7 y 9, con 600 pg de enzima en 2 mL de tampón y 20 mg de película de PLA Goodfellow. A pH 7, la enzima muestra poca actividad.

Las pruebas de despolimerización se realizaron a 37°C, 45°C y 50°C a pH 8,5, con 600 pg de enzima en 2 mL de tampón Tris-HCl pH 8,5 y 20 mg de película de PLA Goodfellow. La temperatura óptima de la enzima es de 50°C. Termoestabilidad de la poliesterasa

Los ensayos de estabilidad de la poliesterasa se realizaron en el intervalo de temperatura de 4°C a 60°C. La poliesterasa es estable durante meses a 4°C. Un compromiso entre la estabilidad y la actividad de la enzima se corresponde con una temperatura de 45°C. A 45°C, la semivida de la enzima es de 2,5 semanas. Además, no hay pérdida de la actividad degradante del poliéster después de un procedimiento de liofilización.

Ejemplo 3: Desarrollo de un procedimiento de degradación de PLA

El objetivo de estos experimentos era resolver el problema de producir ácido láctico de cara tanto al inhibidor potencial como a la reducción drástica del pH durante la reacción. La enzima y el PLA se introdujeron y se confinaron en un tubo de diálisis de 10 kDa. Ese tubo es permeable al ácido láctico y se colocó en un volumen de tampón, permitiendo trabajar a pH constante y diluir el ácido láctico, limitando de este modo su efecto inhibidor potencial.

Degradación enzimática de PLA

La capacidad de degradación del polipéptido de interés (SEQ ID N° 1) se estudió durante la cinética de la hidrólisis de PLA. La conversión de PLA en ácido láctico se controló mediante un análisis con HPLC.

Los ensayos de degradación de PLA se llevaron a cabo en un tubo de diálisis de 10 kDa (membrana de celulosa, 25 mm de ancho, Sigma-Aldrich D9777-100FT). Se introdujeron 90 pg de enzima en 3 ml de tampón Tris HCl 100 mM, pH 8,5, polvo de PLLA (Natureplast 500 pm), películas de PLA (Goodfellow, 50 pm de espesor) u objetos de PLA y se confinaron en el tubo de diálisis. El tubo se colocó en 50 ml (a menos que se especifique lo contrario) de tampón Tris-HCl 100 mM para controlar el pH a 8,5. El tampón se complementó con kanamicina (40 pg/ml) para evitar cualquier contaminación. La reacción se incubó a 45°C con agitación (150 rpm). El objetivo de este procedimiento era controlar el pH de la reacción y evitar una posible inhibición enzimática debida al ácido láctico.

Los productos de degradación (ácido láctico y oligómeros solubles) se cuantificaron mediante un análisis con HPLC del tampón fuera del tubo (columna Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm), fase móvi1H²SO⁴ 5 mM, temperatura 50°C, caudal 0,5 mL.min^-1, volumen inyectado 20 pL). Se utilizaron patrones de ácido láctico (Sigma-Aldrich L1750-10G), de dímero y trímero (hechos en el laboratorio) para una calibración externa.

Para cuantificar el interés de este procedimiento, la hidrólisis de PLA se realizó con un sistema de diálisis: en un tubo agitado magnéticamente a 45°C que contenía 50 mg de una película de PLA (Goodfellow, 50 pm de espesor, 2% de ácido D-láctico), 90 pg de enzima en 3 mL de tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,5, introducido en un tubo. Después de 24 horas de reacción, se obtuvo una conversión del 55% en el reactor propuesto.

Ejemplo 4: Evaluación de la actividad poliesterasa sobre PLA/PLLA con diferente granulometría

La actividad enzimática se evaluó durante la hidrólisis de polvos de PLA (PLLA NaturePlast, PLA Ingeo 7001D que contenía 4% de ácido D-láctico). Se obtuvieron diferentes tamaños de partícula (100-250 pm, 250-500 pm, 500 pm-1 mm y 1-2 mm) mediante micronización y trituración de los gránulos comerciales (Tabla 1).

Tabla 1: Características de los polvos de PLA (Ingeo 7001D) y PLLA (Natureplast): tamaño de partícula y cristalinidad.

Se utilizaron pruebas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la temperatura de transición vítrea (Tg) y la cristalinidad del PLA, utilizando un instrumento Q100 TA-RCS 90 en atmósfera de nitrógeno (50 ml/min), con una tasa de barrido de 10°C/min desde -50°C a 300°C en recipientes de aluminio sobre muestras de alrededor de 8 mg.

Los rendimientos de la hidrólisis de los dos polvos de PLA diferentes con los diferentes tamaños de partícula se determinaron en el procedimiento del reactor descrito en el ejemplo 3, con 100 mg de polvo de PLA, 60 pg de enzima en 2 ml de tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,5. Las hidrólisis del polvo de PLA y de PLLA del mismo tamaño eran idénticas, lo que indicaba que la presencia de un 4% de ácido D-láctico no era perjudicial para el rendimiento de la hidrólisis. La cristalinidad del PLA en el intervalo de 5 a 24% tiene poca influencia sobre el rendimiento de la hidrólisis. Por el contrario, existe una fuerte influencia del tamaño de partícula sobre la tasa de la hidrólisis de los polvos de PLA y PLLA: cuanto más finos son los polvos, más eficaz es la tasa de hidrólisis. Esto se puede explicar por un aumento de la superficie de intercambio entre las fases sólida y líquida. (Figuras 3 y 4).

Un tamaño de partícula en el intervalo de 100-250 pm permite obtener un 68% de conversión en 24 horas.

Si se añaden 10 mM de CaCl² al reactor, se obtiene un 95% de conversión de polvo de PLLA NaturePlast de 500 pm después de 80 horas de reacción.

Ejemplo 5: Impacto de la concentración de PLA sobre la actividad enzimática

La actividad enzimática se evaluó durante la hidrólisis de polvos de PLLA con diferentes concentraciones (33 a 300 g/L), con el mismo protocolo que el que se ha descrito en el ejemplo 3, 90 pg de enzima en 3 ml de tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,5. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Cuanto mayor es la concentración de PLLA, mayor es la productividad de la formación de ácido láctico que tiende a 0,2 g de ácido láctico/mg de enzima/h con una concentración de 300 g/L de PLLA.

Tabla 2: Productividad obtenida a las 10 h de reacción durante la hidrólisis catalizada con poliesterasa de diferentes concentraciones de PLLA.

Ejemplo 6: Hidrólisis catalizada con poliesterasa de una película de PLA hasta ácido láctico

Se utilizó el mismo protocolo experimental presentado en el ejemplo 3 durante la hidrólisis de una película de PLA (Goodfellow, 50 pm de espesor, ácido D-láctico al 2%). La cinética se llevó a cabo a 45°C pH 8,5 con 90 pg de poliesterasa en 3 ml de tampón T ris-HCl 100 mM pH 8,5 y 50 mg de película (17 g/L).

La poliesterasa es capaz de hidrolizar una película hasta ácido láctico. El 76% de conversión se obtuvo en 48 h, el 82% en 72 h (Figura 5).

Ejemplo 7: Hidrólisis catalizada con poliesterasa de objetos comerciales de PLA hasta ácido láctico

Se utilizó el mismo protocolo experimental presentado en el ejemplo 3 durante la hidrólisis catalizada con poliesterasa, de objetos comerciales (vasos, bandejas, películas y cubiertos de PLA). Se realizaron pruebas de hidrólisis sobre polvos (250-500 pm) de esos objetos. Se utilizaron 100 mg de polvos del objeto comercial, 90 pg de enzima en 3 ml de tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,5.

La tasa inicial de la hidrólisis es relativamente similar independientemente del objeto de PLA (desde 27% para la película hasta 44% para la copa a las 10 horas). Está en el mismo intervalo que el resultado obtenido con el polvo de PLLA NaturePlast (37%). Sin embargo, es curioso que una taza de PLA se convierta más fácilmente en ácido láctico que un polvo de PLLA. El 98% de la conversión de la copa de PLA se obtiene después de 48 horas. El 93% y el 84% de la conversión en ácido láctico se obtienen en 72 h para la película y las bandejas respectivamente. La cubertería es el objeto más difícil de degradar, con un máximo del 60% del objeto convertido en ácido láctico. Contiene alrededor de un 1% de TiÜ2 y se mostró que la presencia de TiÜ2 no es responsable de ese fenómeno.

La poliesterasa es capaz de hidrolizar todos los objetos comerciales hasta ácido láctico (Figura 6).

Ejemplo 8: Procedimiento de reciclaje utilizando la enzima de SEQ ID N° 1

El objetivo de estos experimentos era validar la aplicabilidad industrial de la solución degradante de PLA de la invención, en donde la enzima de SEQ ID N° 1 y el PLA se introducen en un reactor sin ningún sistema de diálisis. Los ensayos de degradación de PLA se llevaron a cabo directamente con el medio de producción de enzima obtenido por fermentación como se ha descrito en el Ejemplo 1. El material sobrenadante, que contenía la enzima extracelular, se recuperó mediante centrifugación (13000 g - 10 min) y se conservó a 4°C.

Se añadieron 400 mg de polvo de PLA Natureplast (tamaño de partícula <500 pm) directamente a 25 ml de material sobrenadante. Se añadieron 300 mg de carbonato cálcico y 100 mg de hidróxido cálcico con el fin de neutralizar el ácido láctico liberado durante la hidrólisis y mantener el pH de la solución por encima de 7. Al inicio de la reacción, el pH estaba incluido entre 9,0 y 9,8. La mezcla de reacción se incubó durante 140 horas con agitación (300 rpm) a 45°C.

Durante la reacción, se recogieron diversas muestras de la mezcla (1 ml) y se filtraron en un filtro de 0,22 pm. Se analizaron 20 pl del material filtrado mediante HPLC para cuantificar el ácido láctico y los oligómeros solubles (DP2) tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2. Después de 144 horas de reacción, se obtuvieron 17,5 g/l de ácido láctico y 0,52 g/l de oligómero DP2. El rendimiento de conversión de PLA en ácido láctico era superior al 77% (Figura 7). Ejemplo 9: Comparación de la degradación de PLA mediante diferentes polipéptidos particulares de la invención La secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 1 ha sido modificada con el fin de mejorar su termoestabilidad.

Una primera estrategia era introducir un enlace disulfuro adicional en la estructura del polipéptido, realizando dos sustituciones de residuos de aminoácidos en la secuencia de residuos de aminoácidos de SEQ ID N° 1 mediante la introducción de dos residuos de cisteína en las posiciones de los residuos 175 y 247 de SEQ ID N° 1 (T175C y R247C).

Una segunda estrategia era introducir puentes salinos adicionales entre los residuos de aminoácidos 139 y 170 o entre los residuos de aminoácidos 143 y 173 de SEQ ID N° 1. Por consiguiente, la primera variante resultante contenía las sustituciones de los residuos de aminoácidos N139D y S170R, y la segunda variante resultante contenía las sustituciones de los residuos de aminoácidos N143R y N173E.

Una tercera estrategia era realizar una mutagénesis dirigida al sitio en la secuencia nucleica indicada en SEQ ID N° 2 para producir 5 variantes, en donde cada una contenía una sustitución de un residuo de aminoácido, seleccionadas entre S194P, H197D, L210P, G212N e I217K.

Se han sometido a ensayo variantes adicionales de SEQ ID N° 1, cada una de las cuales contenía una sustitución de un residuo de aminoácido, seleccionadas entre R166K, T160A y L138A, y en donde se había medido una actividad comparable a la del polipéptido natural de SEQ ID N° 1.

Ejemplo 10: Expresión recombinante y purificación de una poliesterasa de SEQ ID N° 1

Las poliesterasas de SEQ ID N° 1 se expresaron en tres hospedadores diferentes: Yarrowia lipolytica, Bacillus subtilis, y E. coli.

10A - Expresión recombinante de la poliesterasa en Yarrowia lipolytica

La poliesterasa de SEQ ID N° 1 se expresó en la levadura Yarrowia lipolytica, más precisamente en la cepa JMY1212, bajo el control del promotor constitutivo TEF, como han descrito previamente Bordes et al., 2007 (F. Bordes, F. Fudalej, V. Dossat, J.M. Nicaud, et A. Marty (2007) A new recombinant protein expression system for high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. J. of Mibrob. Meth., 70, 3, 493-502). La secuencia correspondiente al propéptido seguida por la secuencia del gen que expresaba la poliesterasa madura, se optimizó para el uso de codones de Yarrowia lipolytica. Esta secuencia se integró aguas abajo de la secuencia señal de secreción del gen que codificaba la lipasa lip2 de Y. lipolytica.

A continuación, la poliesterasa se expresaba con éxito en matraces Erlenmeyer (500 ml) que contenían medio Y1T2O3 (50 mL en total) preparado con extracto de levadura (10 g/L), bactotriptona (20 g/L) y glucosa (30 g/L), tamponado con tampón fosfato (100 mM, pH 6,8). Las células se incubaron a 28°C durante 24 h hasta consumir completamente la glucosa. Las células se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 min y el material sobrenadante se utilizó directamente en las reacciones.

El nivel de expresión era similar al obtenido en A. keratinilytica T16-1 pero su termoestabilidad era mayor. Mientras que la enzima producida en A. keratinilytica T16-1 perdía el 78% de la actividad después de 5 horas a 60°C, la enzima expresada en Y. lipolytica era completamente activa después del mismo tratamiento.

10B - Expresión recombinante de la poliesterasa de SEQ ID N° 1 en Bacillus subtilis

La poliesterasa de SEQ ID N° 1 se clonó y se expresó en Bacillus subtilis tal y como se ha descrito en el kit comercial de Takara. La secuencia correspondiente al propéptido seguida por la secuencia del gen que expresaba la poliesterasa madura, se optimizó para el uso de codones de Bacillus subtilis. Esa secuencia se integró aguas abajo de una secuencia señal de secreción de B. subtilis.

El nivel de expresión era similar al obtenido en A. keratinilytica T16-1.

10C - Expresión recombinante de la poliesterasa de SEQ ID N° 1 en Escherichia coli

La poliesterasa de SEQ ID N° 1 se clonó y se expresó en E. coli, y más precisamente en las cepas BL21, Origami y Rosetta. La secuencia correspondiente al propéptido seguida por la secuencia del gen que expresaba la poliesterasa madura, se optimizó para el uso de codones de E. coli. Esa secuencia se integró aguas abajo de una secuencia señal PelB para la expresión en el periplasma o el gen que codificaba la proteína de unión a maltosa, con o sin un marcador de histidina.

El nivel de expresión era de dos a tres veces superior al obtenido en A. keratinilytica T16-1.

Usando el marcador de histidina, la proteína se purificó y se sometió a ensayo la despolimerización de PLA usando un polvo de 250-500 gm de PLA (Ingeo 7001D). La enzima producida en E. coli presenta la misma actividad específica que la enzima expresada en A. keratinilytica T16-1.

Ejemplo 11: Producción de un compuesto de plástico biodegradable que contiene el polipéptido de SEQ ID N° 1 11A - Procedimiento de producción de compuestos de plástico

Se prepara un compuesto de plástico, que comprende polímero de PLA (poli(ácido láctico) PLE 003 de Natureplast) en forma granulada, que previamente se había secado a 65°C durante 4 horas, y una formulación sólida del polipéptido de SEQ ID N° 1.

La formulación sólida del polipéptido se prepara previamente de acuerdo con las siguientes etapas: cultivar un microorganismo productor de ese polipéptido, filtración de ese cultivo seguida de ultrafiltración y diafiltración con una membrana de 3 kD, adición de 10 g.l de maltodextrina y atomización de la mezcla para obtener el polipéptido en forma de polvo seco.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene una actividad degradante de poliéster.

2. El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en un residuo correspondiente a un residuo de SEQ ID N° 1 seleccionado a partir de: T175C, R247C, N139D, S170R, N143R, N173E, S194P, H197D, L210P, G212N, I217K, R166K, T160A, L138A o combinaciones de los mismos.

3. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 o 2, que es activo en un intervalo de temperaturas de 20°C a 60°C, preferiblemente de 30°C a 55°C, más preferiblemente de 40°C a 50°C, incluso más preferiblemente a 45°C y/o en un intervalo de pH de 5-11, preferiblemente en un intervalo de pH de 7-10, más preferiblemente en un intervalo de pH de 8,5-9,5.

4. El polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es capaz de degradar poli(ácido láctico) (PLA), preferiblemente poli(ácido L-láctico) (PLLA).

5. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 5.

6. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.

7. Una casete de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 6.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 6 o la casete de expresión según la reivindicación 7.

9. Una célula recombinante que contiene un ácido nucleotídico según la reivindicación 6, una casete de expresión según la reivindicación 7 o un vector según la reivindicación 8.

10. Un método para producir un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende (i) cultivar una célula recombinante según la reivindicación 9, (ii) recuperar el material sobrenadante del cultivo y opcionalmente (iii) aislar o purificar el polipéptido.

11. Una composición que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una célula recombinante según la reivindicación 9, o un extracto de la misma que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha composición comprende opcionalmente además al menos una enzima adicional y/o un microorganismo o un extracto del mismo y/o aditivos, seleccionándose dicha composición preferiblemente a partir de una solución líquida, una composición sólida o liofilizada, preferiblemente un polvo liofilizado.

12. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, de una célula recombinante según la reivindicación 9 o un extracto de la misma que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o de una composición según la reivindicación 11, para la degradación enzimática de un material que contiene poliéster, preferiblemente un material que contiene PLA, incluso más preferiblemente un material que contiene PLLA.

13. Un método para degradar un material que contiene poliéster, en donde un material que contiene poliéster se pone en contacto con un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, una célula recombinante según la reivindicación 9 o un extracto de la misma que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, o una composición según la reivindicación 11.

14. El método según la reivindicación 13, en el que

- al menos un poliéster del material que contiene poliéster se despolimeriza en monómeros y/u oligómeros, y el método comprende opcionalmente la etapa adicional de recuperar los monómeros y/u oligómeros resultantes de la despolimerización, y/o

- el método comprende además una etapa de pretratamiento del material que contiene poliéster para modificar mecánica y/o físicamente el material que contiene poliéster y/o química y/o biológicamente; y/o

- el material que contiene poliéster comprende PLA, más preferiblemente PLLA, y en donde se recuperan al menos monómeros y/u oligómeros de ácido láctico.

15. Un método para producir monómeros y/u oligómeros a partir de un material que contiene poliéster, que comprende exponer un material que contiene poliéster a un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, una célula recombinante según la reivindicación 9 o un extracto de la misma que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una composición según la reivindicación 11, y opcionalmente recuperar los monómeros y/u oligómeros.

16. Un material que contiene poliéster que comprende al menos un poliéster y un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o una célula recombinante según la reivindicación 9.

17. Un procedimiento para preparar un material que contiene poliéster según la reivindicación 16, que comprende una etapa de mezclar un poliéster con un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o un microorganismo recombinante según la reivindicación 9, en donde la etapa de mezclar se realiza a una temperatura a la cual el poliéster se encuentra en un estado parcial o totalmente fundido, preferiblemente durante un procedimiento de extrusión.

18. Un uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de longitud completa indicada en SEQ ID N° 1, y que tiene una actividad degradante de poliéster para degradar un material que contiene poliéster.