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JP6043371B2 - プロテアーゼ、プロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法 - Google Patents

プロテアーゼ、プロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法 Download PDF

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JP6043371B2 JP2014560535A JP2014560535A JP6043371B2 JP 6043371 B2 JP6043371 B2 JP 6043371B2 JP 2014560535 A JP2014560535 A JP 2014560535A JP 2014560535 A JP2014560535 A JP 2014560535A JP 6043371 B2 JP6043371 B2 JP 6043371B2
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Description

本発明は、新規なプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）、このプロテアーゼを含有するプロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法に関する。
従来、医療器具の洗浄剤として、非イオン界面活性剤、プロテアーゼ、金属イオン封鎖剤及びベンゾトリアゾール等からなる洗浄剤組成物が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、プロテアーゼ、ノニオン界面活性剤、酵素安定剤を含有する洗浄剤組成物も知られている（例えば、特許文献２参照）。
特開平５−２７９７００号公報 特開２００１−３１９９９号公報
現状ではアルカリ洗浄剤の洗浄力が最も高いとされるが、それでも医療器具の汚れを完全に洗浄するには至っていない。汚れの主な成分は、手術時に付着した血液や体液からなる細胞やタンパク質であり、この中には感染性プリオンも含まれる。特に医療器具の中でも剪刀やピンセット等の鋼製小物は頻繁に再利用されるため、これらの鋼製小物に付着した血液及びタンパク質性の汚れは、滅菌工程の前に洗浄することが必須工程になっている。また、これらの鋼製小物に感染性プリオン等の有害物質が除去されないまま残存していると、多数の手術患者に感染が広がるおそれがある。そのため、このような汚れを完全に洗い落とすことができる強力な洗浄剤の開発が望まれている。
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、タンパク質を分解する能力が強く、特に血液等のタンパク質汚れに対して高い洗浄力を有するプロテアーゼ、プロテアーゼ含有洗浄剤及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
本発明に係るプロテアーゼは、放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株）を培養して得られたプロテアーゼである。
本発明に係るプロテアーゼは、放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株）を培養して得られたプロテアーゼである。
本発明に係るプロテアーゼは、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を混合培養して得られたプロテアーゼである。
前記プロテアーゼが、以下の（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）に記載のポリペプチドであることが好ましい。
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の相同性を有するポリペプチド。
前記プロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約３１，０００Ｄａ（３１ｋＤａ）であることが好ましい。
前記プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）に記載のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｂ１）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ２）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｂ３）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
本発明に係るプロテアーゼは、前記プロテアーゼを含有する。
本発明に係るプロテアーゼ含有洗浄剤の製造方法は、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株を培養して製造する。
本発明に係るプロテアーゼ含有洗浄剤の製造方法は、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を培養して製造する。
本発明に係るプロテアーゼ含有洗浄剤の製造方法は、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を混合培養して製造する。
本発明に係るプロテアーゼは、安全性の高い２種類の微生物（同属株）から得ることができ、いずれもタンパク質を分解する能力が強く、特に血液等のタンパク質汚れに対して高い洗浄力を有する。特にこれらのプロテアーゼ含有洗浄剤は、従来のアルカリ洗浄剤では洗浄が困難であった変性固着した血液汚れを低温かつ短時間で洗浄することができる。また２種類の微生物をそれぞれ単独培養して得られるプロテアーゼ含有洗浄剤は洗浄効果が高いが、２種類の微生物を混合培養して得られるプロテアーゼ含有洗浄剤はさらに洗浄効果が高い。またこれらのプロテアーゼ含有洗浄剤は、簡便かつ安価に大量生産することができ、液状のほか粉剤化又は錠剤化することもでき、長期保存も可能である。
さらに本発明に係るプロテアーゼは、洗浄剤以外の様々な分野に応用することも可能である。例えば、食肉加工やイカの皮むき、皮なめしなどである。
放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株の培養液から得られた精製画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示す電気泳動写真である。 放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株の培養液から得られた精製画分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示す電気泳動写真である。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）についての相対活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）についての比活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）についての相対活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）についての比活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素）についての相対活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素）についての相対活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素）についての相対活性のＣａＣｌ２終濃度依存性を示すグラフである。 ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）についての相対活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）についての相対活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）についての相対活性のＣａＣｌ２終濃度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素についての相対活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素についての相対活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素についての相対活性のＣａＣｌ２依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素についての残存活性の経日変化を示すグラフである。
［プロテアーゼ］
本発明に係るプロテアーゼは、放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株）を培養して得られたプロテアーゼである。ＲＤ００１９３３株の菌株の帰属分類群は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析結果から、Actinomadura miaoliensisに近縁なActinomadura sp.であると推定される。
また本発明に係るプロテアーゼは、放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株）を培養して得られたプロテアーゼである。ＲＤ０００９２０株の菌株の帰属分類群は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析結果から、Actinomadura miaoliensisであると推定される。
また本発明に係るプロテアーゼは、放線菌のアクチノマジュラエスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株）及び放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株）を混合培養して得られたプロテアーゼである。
プロテアーゼは、タンパク質に対して加水分解活性を示すものであり、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。プロテアーゼの精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の方法を用いて行うことができる。これにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られる。
微生物は、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、あるいは、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているような技術を用いて容易に作成される。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液及び遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。さらに菌体内に含まれるプロテアーゼであってもよい。
プロテアーゼ含有洗浄剤を製造するにあたっては、特に以下に説明するＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼの少なくとも一方を酵素として用いることが好ましい。
プロテアーゼは、以下の（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）に記載のポリペプチドを含むことが好ましい。
（ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド。
またプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドは、以下の（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）に記載のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｂ１）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ２）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｂ３）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
配列番号１に記載の塩基配列のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のポリペプチド（アミノ酸配列）をコードし得る。
プロテアーゼの酵素活性は、以下の方法で確認することができる。まず、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、終濃度８０ｍＭ）１９８μＬに３％アゾカゼイン（終濃度０．６％）５０μＬを混合させる。そして、酵素活性を確認する試料２μＬを添加し、６５℃で５分間又は１０分間反応させる。酵素反応後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させる。反応停止後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定する。酵素量１Ｕ（ユニット）は、１μｍｏｌ相当のアゾ色素を１分間に生成する量とする。
プロテアーゼは、例えば、２０〜８０℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは６０〜９０℃の範囲内にあり、より好ましくは７０〜８０℃の範囲内にあり、さらにより好ましくは約７５℃である。
プロテアーゼは、例えば、ｐＨ４．０〜９．５で作用し得る。至適ｐＨは、この範囲内にあり得る。好ましくはｐＨ７．５付近であるが、ｐＨ６．０〜８．８で５０％以上の活性を示す。
プロテアーゼは、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約３１，０００Ｄａ（３１ｋＤａ）であることが好ましい。例えば、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約３１，０００Ｄａである。
プロテアーゼの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。プロテアーゼは、好ましくは配列番号２の１１１位から３８６位までのアミノ酸配列（以下「配列番号２に記載内のアミノ酸配列」ともいう）を有する。配列番号２の１位から２６位までのアミノ酸配列はシグナル配列であり、配列番号２の２７位から１１０位までのアミノ酸配列はプロ配列である。
プロテアーゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を有する酵素でもよい。例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入及び／又は付加変異を導入することにより、酵素（タンパク質）の構造を改変することができる。置換、欠失、挿入及び／又は付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、人工的にアミノ酸残基を変異させた酵素のみならず、自然界においてアミノ酸残基が変異した酵素もプロテアーゼに含まれる。
配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、相同性を有するアミノ酸配列を有する酵素もプロテアーゼに含まれる。プロテアーゼは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列番号２に記載内のアミノ酸配列と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行うことができる。
プロテアーゼの供給源は、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）、及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）から得ることができる。これらは、配列番号１に記載の塩基配列で示されるポリヌクレオチドをＤＮＡ中に有している。
例えば、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）、及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）はいずれも、適当な栄養培地で液体培養することにより、プロテアーゼを菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したもの、あるいはこの処理物を固定化するなどしたものを酵素製剤として製造することができる。
さらに具体的に説明すると、まず上記の菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、プロテアーゼを分泌させる。このとき、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株を単独で培養してもよいし、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を単独で培養してもよいし、これらを混合培養してもよい。
ここで、炭素源としては、澱粉及び澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類及び有機酸（例えば、酢酸及びクエン酸）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。
窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物が挙げられる。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。
無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第一鉄などが挙げられる。
培養温度は、プロテアーゼが安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２５〜５０℃であることが好ましい。培養時間は、プロテアーゼが十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは好気的な条件下で、例えば、通気撹拌又は振とうしながら行うことができる。
プロテアーゼに含まれるポリペプチドは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記の微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、プロテアーゼを構成するポリペプチドは、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定することができる。
［微生物］
プロテアーゼは、微生物によって産生し得るものである。プロテアーゼについては、配列番号２に記載のアミノ酸配列情報や、配列番号１に記載の塩基配列情報から、人工的にポリペプチドを生成することができ、プロテアーゼ含有洗浄剤の製造に人工合成によって得た酵素（ポリペプチド）を用いてもよい。しかしながら、微生物により酵素を産生する場合、容易に上記の酵素を得ることができる。
微生物としては、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株、及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を利用することができるが、上記のポリヌクレオチドが導入された微生物を用いてもよい。すなわち、その微生物とは、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドの中から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドが導入された微生物である。上記のポリヌクレオチドが導入された微生物は、ベクターを用いたり形質転換体を作製したりして得ることができる。例えば、上記のポリヌクレオチドをベクターに導入し、このベクターを大腸菌等の宿主に導入することにより、プロテアーゼを産生する能力を保有する形質転換体を作製することができる。
形質転換体の作製のための手順及び宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。
微生物中で、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。
形質転換の対象となる宿主は、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
得られた形質転換体は、上記のように酵素の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したポリペプチドを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理して酵素を製造することができる。
宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、通常の条件下で行うことができる。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いることができる。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製することができる。
［プロテアーゼ含有洗浄剤］
本発明に係るプロテアーゼ含有洗浄剤は、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株、及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株をそれぞれ単独培養又は混合培養した後、塩析（硫安沈殿、アセトン沈殿、エタノール沈殿など）により粗酵素として得ることができる。すなわち、目的に応じて単独培養液又は混合培養液を濾紙やフィルターにより濾過して粗酵素液としてプロテアーゼ含有洗浄剤を得たり、遠心分離にかけて上澄み液（培養上清）としてプロテアーゼ含有洗浄剤を得たりすることもできる。濾過は、濁りの原因となる不純物を除去するために行う。濁りが気にならない程度であれば濾過は不要であり、遠心分離により十分に透明度のあるプロテアーゼ含有洗浄剤を得ることができる。必要に応じてさらに精製し、精製酵素として得てもよい。
上記のようにして得られたプロテアーゼは、安全性の高い２種類の微生物（同属株）から得ることができ、いずれもタンパク質を分解する能力が強く、特に血液等のタンパク質汚れに対して高い洗浄力を有する。特にこれらのプロテアーゼを含有するプロテアーゼ含有洗浄剤は、従来のアルカリ洗浄剤では洗浄が困難であった変性固着した血液汚れを低温かつ短時間で洗浄することができる。また２種類の微生物をそれぞれ単独培養して得られるプロテアーゼ含有洗浄剤はタンパク質分解能力が強く洗浄効果が高いが、２種類の微生物を混合培養して得られるプロテアーゼ含有洗浄剤はさらにタンパク質分解能力が強く洗浄効果が高い。またこれらのプロテアーゼ含有洗浄剤は、簡便かつ安価に大量生産することができ、液状のほか粉剤化又は錠剤化することもでき、長期保存も可能である。
さらに上記のプロテアーゼは、洗浄剤以外の様々な分野に応用することも可能である。例えば、食肉加工やイカの皮むき、皮なめしなどである。
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼの精製］
放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株を培養し、その培養上清について、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼを精製した。以下に詳細を示す。
（ａ）微生物の培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）４９０ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに７０ｍＬずつ分注した。これにスプリングコイルを１個入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク３０ｍＬを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体を５０μＬとり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍＬずつ植菌し、４５℃で９６時間程度振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
（ｂ）アセトン分画（アセトン沈殿）
上記（ａ）で回収した培養上清に、６０％（ｖ／ｖ）以上となるようにアセトンを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を、終濃度１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。
（ｃ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ３８ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて透析を行うことによって脱塩した。２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（５ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。
（ｅ）ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて透析を行うことによって脱塩した。これを２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ（１ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。
以上のようにして、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株より、精製酵素を得た。なお、精製酵素が単一であることは、以下の（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で確認した。
（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析した。図１は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。図１の左側のレーンは、タンパク質分子量マーカー（Ｍ）であり、図１の右側のレーンは、（ｅ）で得られた精製酵素（ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ）のバンドを示す。図１に示すように、活性画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素（ポリペプチド）の分子量は約３１，０００であった。なお、分子量の単位はＤａ（ダルトン）である。よって、ｋＤａ表記では、この酵素の分子量は約３１ｋＤａとなる。
表１にＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ精製における収量、収率等を示す。
Figure 0006043371
なお、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼの酵素活性は、次のようにして測定した。まず表２に示す反応液を６５℃、ｐＨ７．５で５分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定した。酵素量１Ｕ（ユニット）は、１μｍｏｌ相当のアゾ色素を１分間に生成する量とした。
Figure 0006043371
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼの性質］
ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）の酵素学的性質について検討した。
（１）作用温度
表２に示す反応液を各温度、ｐＨ７．５で５分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が７５℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図３のグラフに示されるように、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、５０〜９０℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６０〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０〜７５℃付近であった。なお、図４は、種々の反応温度での比活性を示すグラフである。
（２）作用ｐＨ
表３に示す反応液を各ｐＨ、７５℃で５分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液：ｐＨ５．５、ｐＨ６
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．２
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８、ｐＨ８．８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９、ｐＨ９．５
Figure 0006043371
図５は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが７．２である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図５のグラフから分かるように、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、ｐＨ５．５〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．２付近（例えばｐＨ６．０〜８．８）であった。なお、図６は、種々の反応ｐＨでの比活性を示すグラフである。
（３）添加試薬の影響
まず添加試薬を加えた酵素液を３０分間、室温でインキュベートした後、表４に示す反応液（ただし、添加試薬、酵素液を除く）を加えて７５℃、ｐＨ７．５で５分間静置して反応させた。その後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。そして、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した添加試薬は、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（終濃度５ｍＭ）、ＺｎＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｇＣｌ２（終濃度１ｍＭ）である。
Figure 0006043371
表５は、添加試薬を添加した場合の酵素活性を、添加試薬を添加していない場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したものである。ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋の存在下では、６０％程度の活性を示した。また、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦの存在下では、活性が大きく低下し、活性阻害が見られた。
Figure 0006043371
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）のＮ末端アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、エレクトロブロッティングを行い、目的とする酵素をＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜に転写した。これをプロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。解析から、この精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列番号３に示すものであることが確認された。
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）の内部アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、目的とする酵素を切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。そして、得られたペプチドサンプルについて質量分析計（ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。これにより、内部アミノ酸配列は、配列番号４、５、６、７に示すものであることが確認された。
ここで、配列番号４は、配列番号２の２７７位からに示される配列となっている。また、配列番号５は、配列番号２の３３１位からに示される配列となっている。また、配列番号６は、配列番号２の３４８位からに示される配列となっている。また、配列番号７は、配列番号２の３６４位からに示される配列となっている。なお、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるデノボアミノ酸配列解析ではＬｅｕとＩｌｅとが判別できないため、これらのアミノ酸が一部一致していない箇所があり得る。
［ＲＤ００１９３３株の染色体ＤＮＡの分離］
ＲＤ００１９３３株をＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）５０ｍＬを用いて４５℃で３日間培養し、集菌した。
次いで、この菌体を７５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び１ｍｇ／ｍＬリゾチームからなる溶液２．５ｍＬに懸濁し、３７℃で１時間処理した。これに１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを９００μＬ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを３．７５ｍｇ添加し、５５℃で２時間処理した。この溶液に５Ｍ ＮａＣｌ２ｍＬとクロロホルム５ｍＬを加えて撹拌し、遠心分離により水相を５ｍＬ分取した。
この水相に３ｍＬのイソプロパノールを添加混合してＤＮＡ画分を回収し、７０％エタノール１ｍＬでリンスした後、遠心分離を行った。この沈殿を回収し、減圧乾燥した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μＬに溶解し５５℃で一晩放置した。これにＲＮａｓｅＡを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０分間処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μＬ加え撹拌し、４℃、１時間静置後、遠心分離により沈殿を回収した。この沈殿を１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）５００μＬで溶解した。これにフェノール／クロロホルム混合液５００μＬを加えて撹拌し、遠心分離により、水相を５００μＬ分取した。
この水相に３Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）５０μＬ及び１００％エタノール１ｍＬを添加混合し、ＲＤ００１９３３株の染色体ＤＮＡを回収した。
このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールでリンスした後、遠心分離を行って沈殿を回収した。回収した沈殿を減圧乾燥した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液２００μＬに溶解した。
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ遺伝子のコア領域のクローニング］
アクチノマジュラ由来プロテアーゼに高く保存されているＮ末端及び内部配列をもとにプライマーを設計した。
プライマー（primer）の作製にあたっては、上記のＮ末端配列（配列番号３）及び上記の２つの内部アミノ酸配列（配列番号４及び配列番号５）をピックアップした。プライマー設計にあたっては、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列中の適宜の配列を利用した。
Ｎ末端アミノ酸配列情報を「Sense primer」とし、内部アミノ酸配列情報を「Antisense primer」とした。縮重コドンに関しては、アクチノマジュラ属におけるコドン使用頻度が高いコドンを選択し、プライマー設計を行った。また、コドン使用頻度が同等のものに関しては、混合塩基プライマーとした。また、質量分析では分別が難しいＬｅｕとＩｌｅを除外した。これにより、センスプライマー（Sense primer）として、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１（配列番号８）を設計した。また、２種のアンチセンスプライマー（Antisense primer）として、配列番号４から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−１」（配列番号９）と、配列番号５から設計した「ｐｒｉｍｅｒ Ａ１−２」（配列番号１０）とを設計した。ここで、配列中のｓはｃ又はｇを表し、ｗはａ又はｔを表している。
次に上記のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
上記［ＲＤ００１９３３株の染色体ＤＮＡの分離］で得た鋳型染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、２×ＭｉｇｈｔＡｍｐ Ｂｕｆｆｅｒ ２５μＬ、プライマー各３００ｎＭ、及びＭｉｇｈｔＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５ユニットに、滅菌水を全量５０μＬとなるように添加した。
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
ステップ１：９８℃、２分；
ステップ２：９８℃、１０秒；
ステップ３：８０℃、１５秒；
ステップ４：６８℃、１分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５：６８℃、２分。
上記のプライマーを用いたＰＣＲによって、約７００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
このＰＣＲ反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の約７００ｂｐのバンド部分を切り出し、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ｐＭＤ２０−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒに結合させ、大腸菌を形質転換した。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．５）で培養し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ法（ミニプレップ法）又はＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。
続いて、ベクター（ｐＭＤ２０−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ）に由来するＴ７プライマー及びＳＰ６プライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列（６９２ｂｐ）を、配列番号１１に示す。
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ遺伝子のコア領域の上流側及び下流側のクローニング］
上記［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ遺伝子のコア領域のクローニング］で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、上記で得た染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ又はＳｍａＩで完全消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて消化断片を自己閉環させた。これを鋳型にして、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製した２つのインバースＰＣＲプライマー（配列番号１２及び配列番号１３）を用いて、ＰＣＲを行うことでＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼの上流側又は下流側におけるＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
鋳型ＤＮＡ２５ｎｇ、２×ＭｉｇｈｔＡｍｐ Ｂｕｆｆｅｒ ２５μＬ、プライマー各３００ｎＭ、及びＭｉｇｈｔＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５ユニットに、滅菌水を全量５０μＬとなるように添加した。
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
ステップ１：９８℃、２分；
ステップ２：９８℃、１０秒；
ステップ３：６２℃、１５秒；
ステップ４：６８℃、３分；
ステップ２からステップ４を２５サイクル繰り返す；
ステップ５：６８℃、３分。
上記のプライマーを用いたＰＣＲによって、約３０００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
このＰＣＲ反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の約３０００ｂｐのバンド部分を切り出し、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ｐＭＤ２０−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒに結合させ、大腸菌を形質転換した。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．５）で培養し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ法（ミニプレップ法）又はＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。
続いて、ベクター（ｐＭＤ２０−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ）に由来するＳＰ６プライマー及びＭ１３Ｍ４プライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。このシーケンスによって、Ｎ末端側（上流側）の塩基配列として、配列番号１４に示す塩基配列（３３０ｂｐ）が得られた。この配列は、Ｎ末端側からシグナル配列（７８ｂｐ）及びプロ配列（２５２ｂｐ）である。また、Ｃ末端側（下流側）の塩基配列として、配列番号１５に示す塩基配列（１３９ｂｐ）が得られた。
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の決定］
上記で決定した塩基配列に基づいて、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列（１１６１ｂｐ）を決定した（配列番号１）。配列番号２は、この配列（配列番号１）のコドンに対応するアミノ酸配列である。
配列解析の結果から、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼをコードする遺伝子は１１６１ｂｐのヌクレオチドからなり、３８６残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。
上記にて決定したＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）のＮ末端及び内部アミノ酸配列が、上記の推定アミノ酸配列中に存在し、ほぼ完全に一致していた。
［ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素）］
放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株を培養し、その培養上清から３種の沈殿方法により、粗酵素液を得た。以下に詳細を示す。
（ａ）微生物の培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）７００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに７０ｍＬずつ分注した。これにスプリングコイルを１個入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク３０ｍＬを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体を５０μＬとり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍＬずつ植菌し、４５℃で９６時間程度振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
（ｂ１）アセトン沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるように−２０℃アセトンを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）３０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表６に酵素の回収率を示す。
（ｂ２）エタノール沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるように−２０℃エタノールを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表６に酵素の回収率を示す。
（ｂ３）硫安沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％飽和量となるように硫酸アンモニウム粉末を添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）３０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表６に酵素の回収率を示す。
Figure 0006043371
このように、酵素を濃縮回収する場合には３種の沈殿方法を適宜利用することができる。
次に、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素液）の酵素学的性質について検討した。
（１）作用温度
表２に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各温度、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図７は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が８０℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図７のグラフに示されるように、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素液）は、５０〜９５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は７０〜８５℃の範囲内であり、好ましくは７５〜８５℃付近であった。
（２）作用ｐＨ
表３に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各ｐＨ、６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液：ｐＨ５
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９
図８は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが８．０である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図８のグラフから分かるように、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（粗酵素液）は、ｐＨ５．０〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．５付近（例えばｐＨ７．０〜８．０）であった。
（３）添加試薬の影響
表４に示す反応液（酵素液は８０％エタノール沈殿により得たもの）を６５℃、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた。その後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。そして、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した添加試薬は、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＥＤＴＡである。
表７は、添加試薬を添加した場合の酵素活性を、添加試薬を添加していない場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したものである。
Figure 0006043371
（４）ＣａＣｌ２濃度の依存性
表８に示す反応液（酵素液は８０％エタノール沈殿により得たもの）を６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
Figure 0006043371
図９は、種々のＣａＣｌ２終濃度での酵素活性を、ＣａＣｌ２終濃度が０．５ｍＭである場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。
［ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼの精製］
放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を培養し、その培養上清について、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼを精製した。以下に詳細を示す。
（ａ）微生物の培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）５６０ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに７０ｍＬずつ分注した。これにスプリングコイルを１個入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク３０ｍＬを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体を５０μＬとり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍＬずつ植菌し、４５℃で９６時間程度振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
（ｂ）アセトン分画（アセトン沈殿）
上記（ａ）で回収した培養上清に、６０％（ｖ／ｖ）以上となるように−２０℃アセトンを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を、終濃度１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。
（ｃ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ３８ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて透析を行うことによって脱塩した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（５ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。
（ｅ）ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて透析を行うことによって脱塩した。これに２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加えた。これを２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ（１ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。
以上のようにして、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株より、精製酵素を得た。なお、精製酵素が単一であることは、以下の（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で確認した。
（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記（ｅ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析した。図２は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。図２の左側のレーンは、タンパク質分子量マーカー（Ｍ）であり、図２の右側のレーンは、（ｅ）で得られた精製酵素（ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ）のバンドを示す。図２に示すように、活性画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素（ポリペプチド）の分子量は約３１，０００であった。なお、分子量の単位はＤａ（ダルトン）である。よって、ｋＤａ表記では、この酵素の分子量は約３１ｋＤａとなる。
表９にＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ精製における収量、収率等を示す。
Figure 0006043371
なお、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼの酵素活性は、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼの酵素活性と同様にして測定した。
［ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼの性質］
ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）の酵素学的性質について検討した。
（１）作用温度
表２に示す反応液を各温度、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が７５℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図３のグラフに示されるように、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、５０〜９０℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６０〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０〜７５℃付近であった。なお、図４は、種々の反応温度での比活性を示すグラフである。
（２）作用ｐＨ
表３に示す反応液を各ｐＨ、６５℃で１０分間撹拌して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液：ｐＨ５．５、ｐＨ６
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．２
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８、ｐＨ８．８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９、ｐＨ９．５
図５は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが７．２である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図５のグラフから分かるように、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、ｐＨ５．５〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．２付近（例えばｐＨ６．０〜８．８）であった。なお、図６は、種々の反応ｐＨでの比活性を示すグラフである。
（３）添加試薬の影響
まず添加試薬を加えた酵素液を３０分間、室温でインキュベートした後、表４に示す反応液（ただし、添加試薬、酵素液を除く）を加えて７５℃、ｐＨ７．５で５分間静置して反応させた。その後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。そして、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した添加試薬は、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）（終濃度５ｍＭ）、ＺｎＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｇＣｌ２（終濃度１ｍＭ）である。
表１０は、添加試薬を添加した場合の酵素活性を、添加試薬を添加していない場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したものである。ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋の存在下では、６０％程度の活性を示した。また、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦの存在下では、活性が大きく低下し、活性阻害が見られた。
Figure 0006043371
［ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）のアミノ酸配列の解析］
ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）のアミノ酸配列の解析をＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）の場合と同様に行った。その結果、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）のアミノ酸配列は、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）のアミノ酸配列とほぼ１００％一致したので、両方の酵素は同一のアミノ酸配列からなるものと考えられる。また、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ遺伝子の塩基配列も、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ遺伝子の塩基配列とほぼ１００％一致したので、両方の遺伝子は同一の塩基配列からなるものと考えられる。
しかし、図３〜図６に示すように、両方の酵素は、作用温度及び作用ｐＨ等の酵素学的性質にわずかな違いが見られた。
［ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）］
放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を培養し、その培養上清から３種の沈殿方法により、粗酵素液を得た。以下に詳細を示す。
（ａ）微生物の培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）７００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに７０ｍＬずつ分注した。これにスプリングコイルを１個入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク３０ｍＬを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体を５０μＬとり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍＬずつ植菌し、４５℃で９６時間程度振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
（ｂ１）アセトン沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるように−２０℃アセトンを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表１１に酵素の回収率を示す。
（ｂ２）エタノール沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるように−２０℃エタノールを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表１１に酵素の回収率を示す。
（ｂ３）硫安沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％飽和量となるように硫酸アンモニウム粉末を添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表１１に酵素の回収率を示す。
Figure 0006043371
このように、酵素を濃縮回収する場合には３種の沈殿方法を適宜利用することができる。
次に、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素液）の酵素学的性質について検討した。
（１）作用温度
表２に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各温度、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図１０は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が７０℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図１０のグラフに示されるように、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素液）は、５０〜８５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６５〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０〜８０℃付近であった。
（２）作用ｐＨ
表３に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各ｐＨ、６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液：ｐＨ５
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９
図１１は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが８．０である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図１１のグラフから分かるように、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素液）は、ｐＨ５．０〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．５付近（例えばｐＨ７．０〜８．０）であった。
（３）添加試薬の影響
表４に示す反応液（酵素液は８０％エタノール沈殿により得たもの）を６５℃、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた。その後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。そして、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した添加試薬は、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＥＤＴＡである。
表１２は、添加試薬を添加した場合の酵素活性を、添加試薬を添加していない場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したものである。
Figure 0006043371
（４）ＣａＣｌ２濃度の依存性
表８に示す反応液（酵素液は８０％エタノール沈殿により得たもの）を６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図１２は、種々のＣａＣｌ２終濃度での酵素活性を、ＣａＣｌ２終濃度が０．５ｍＭである場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。
［ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）］
放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株を混合培養し、その培養上清から３種の沈殿方法により、粗酵素液を得た。以下に詳細を示す。
（ａ）微生物の培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）４．２Ｌを調製し、１０Ｌ容卓上型培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク１．８Ｌを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体２種類を５００μＬとり、ＩＳＰ２培地５０ｍＬを入れた５００ｍＬ容三角フラスコにそれぞれ植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。先の滅菌した培地６Ｌにこの２種類の培養液を３０ｍＬずつ植菌し、４５℃、５００ｒｐｍ、１ｖｖｍで１〜７日間、好ましくは１〜３日間培養した。培養開始時において２種類の培養液の比率は１：１であることが好ましいが、別段の定めはない。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。
（ｂ１）アセトン沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるように−２０℃アセトンを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表１３に酵素の回収率を示す。
（ｂ２）エタノール沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表１３に酵素の回収率を示す。
（ｂ３）硫安沈殿
上記（ａ）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％飽和量となるように硫酸アンモニウム粉末を添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表１３に酵素の回収率を示す。
Figure 0006043371
このように、酵素を濃縮回収する場合には３種の沈殿方法を適宜利用することができる。
次に、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）の酵素学的性質について検討した。
（１）作用温度
表２に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各温度、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図１３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が７０℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図１３のグラフに示されるように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は、５５〜８５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６５〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０℃付近であった。
（２）作用ｐＨ
表３に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各ｐＨ、６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液：ｐＨ５
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９
図１４は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが８．０である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図１４のグラフから分かるように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は、ｐＨ５．０〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．５付近（例えばｐＨ７．０〜８．０）であった。
（３）添加試薬の影響
表４に示す反応液（酵素液は８０％エタノール沈殿により得たもの）を６５℃、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた。その後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。そして、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した添加試薬は、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＥＤＴＡである。
表１４は、添加試薬を添加した場合の酵素活性を、添加試薬を添加していない場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したものである。
Figure 0006043371
（４）ＣａＣｌ２濃度の依存性
表８に示す反応液（酵素液は８０％エタノール沈殿により得たもの）を６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図１５は、種々のＣａＣｌ２終濃度での酵素活性を、ＣａＣｌ２終濃度が０．５ｍＭである場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。
（５）保存安定性
上記（ａ）で回収した培養上清に６０％飽和量となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で９０倍又は１８倍に濃縮されるよう溶解し、粗酵素液を得た。９０倍に濃縮した粗酵素液は４℃、室温（平均２６．０℃）、４０℃で静置し、１８倍に濃縮した粗酵素液は真空凍結乾燥して凍結乾燥品とし、４℃、４０℃で静置した。所定日数経過した後、各粗酵素の酵素活性を次のようにして測定した。まず表２に示す反応液（粗酵素液は水道水により２００倍に希釈したものであり、凍結乾燥品は水道水に溶かして１ｍｇ／ｍＬとしたもの）を６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定した。初日の活性を基準（１００％）とした。
図１６は、各粗酵素についての残存活性の経日変化を示すグラフである。図１６から凍結乾燥品を４０℃で保存しても活性が低下しにくいことが分かる。
［洗浄効果確認試験］
（１）滴下試験
プロテアーゼ含有洗浄剤として、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）をそれぞれ、疑似血液で汚染された試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」）上に滴下し、所定時間ごとに疑似血液を拭き取って洗浄を行った。この洗浄は、６５℃で各酵素量を５μＬ（濃度：約５Ｕ／ｍＬ）に調製して行った。試験片の洗浄結果は、次の基準で目視により判定した。その結果を表１５に示す。
「◎」：完全に洗浄された状態
「○」：ほとんど洗浄されている状態
「△」：ごくわずかな残留物（疑似血液汚れ）がある状態
「×」：残留物（疑似血液汚れ）が残っている状態
Figure 0006043371
（２）フラスコ試験
洗浄剤として、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）、市販酵素ナットウキナーゼ（和光純薬工業（株）「１４７−０８８０１」）、市販ストレプトキナーゼ（和光純薬工業（株）「５９３−２０５８１」）、市販酵素ウロキナーゼ（田辺三菱製薬（株）「８７３９５４」）、市販衣類洗剤（花王（株）「アタックＮｅｏ」）、市販酵素サーモリシン（シグマ−アルドリッチ「Ｐ１５１２−１Ｇ」）を用いた。
上記の洗浄剤をそれぞれ２００ｍＬ容フラスコに３０ｍＬずつ入れ、さらに試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」）を入れて浸漬させた。そして、表１７に示す温度及び時間の条件で攪拌子により上記のフラスコ内を攪拌した。その後、上記の試験片を取り出して軽く水洗した後、上記と同じ基準で洗浄結果を判定した。その結果を表１６に示す。
Figure 0006043371
表１６から明らかなように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は最も洗浄効果が高いと考えられ、次いで市販酵素サーモリシンの洗浄効果が高いことが確認された。
（３）洗浄器試験その１
市販されている洗浄剤の中では最も洗浄効果が高いと考えられるサーモリシン（シグマ−アルドリッチ「Ｐ１５１２−１Ｇ」）と、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）との洗浄効果を次のようにして確認した。
ｓｍｅｇ社（イタリア）製器具除染用洗浄器「ＷＤ３０６０」に、試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」）をセットした。さらにプロテアーゼ含有洗浄剤として、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）又はサーモリシン（シグマ−アルドリッチ「Ｐ１５１２−１Ｇ」）をセットし、次の工程１〜５で表１７に示す温度Ｘ（℃）及び時間Ｙ（ｍｉｎ）の条件で試験片の洗浄を行った。試験片の洗浄結果は、上記と同じ基準で目視により判定した。その結果を表１７に示す。
工程１：水道水による予備洗浄、３分；
工程２：洗浄、温度Ｘ（℃）、時間Ｙ（ｍｉｎ）；
工程３：すすぎ１回目、４０℃、１分；
工程４：すすぎ２回目、水道水、１分；
工程５：殺菌、９０℃、５分。
Figure 0006043371
表１７から、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）の方が、市販酵素サーモリシンに比べて少ない酵素量で同等の洗浄効果を示すことから、より洗浄効果が高いと考えられる。
（４）洗浄器試験その２
ヨーロッパ等の硬水を想定したＣａ２＋濃度と洗浄力との関係について次のように調べた。
ｓｍｅｇ社（イタリア）製器具除染用洗浄器「ＷＤ３０６０」に、試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」）をセットした。さらにプロテアーゼ含有洗浄剤として、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）をセットして、上記と同じ工程１〜５で試験片の洗浄を行った。その結果を表１８に示す。試験片の洗浄結果は、上記と同じ基準で目視により判定した。
Figure 0006043371
表１８から明らかなように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は、Ｃａ２＋濃度の低い軟水（例えば日本国内の水道水）下に比べてＣａ２＋濃度の高い硬水（ヨーロッパ等の水）下の方がさらに洗浄力が向上することが確認された。
（５）洗浄器試験その３
現在広く使用されているアルカリ洗浄剤の洗浄効果を次のようにして確認した。
ｓｍｅｇ社（イタリア）製器具除染用洗浄器「ＷＤ３０６０」に、試験片（ＮＩＴＩ−ＯＮ、洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」）をセットした。さらに既存洗剤Ａ（アルカリ洗浄剤、Ｂｏｒｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ社製「ｄｅｃｏｎｅｘ（Ｒ）２８ＡＬＫＡＯＮＥ−Ｘ」）、既存洗剤Ｂ（多酵素洗浄剤、Ｂｏｒｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ社製「ｄｅｃｏｎｅｘ（Ｒ）ＰＯＷＥＲ ＺＹＭＥ」）をセットして、上記と同じ工程１〜５で試験片の洗浄を行った。その結果を表１９に示す。試験片の洗浄結果は、上記と同じ基準で目視により判定した。
Figure 0006043371
表１７及び表１８に示すＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）の洗浄結果と、表１９に示す既存のアルカリ洗浄剤の洗浄結果とを対比すると、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）の方が、既存のアルカリ洗浄剤に比べて洗浄効果が高いことが確認された。
［Actinomadura sp. ＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）］
受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１２年１１月２２日。
［Actinomadura miaoliensis ＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）］
受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８
寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
寄託機関のあて名：日本国 〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
寄託の日付：２０１２年１１月２２日。
配列番号１：プロテアーゼ発現遺伝子
配列番号２：プロテアーゼ（ポリペプチド）
配列番号３：プロテアーゼのＮ末端配列
配列番号４：プロテアーゼの内部配列
配列番号５：プロテアーゼの内部配列
配列番号６：プロテアーゼの内部配列
配列番号７：プロテアーゼの内部配列
配列番号８：プライマーＳ１
配列番号９：プライマーＡ１−１
配列番号１０：プライマーＡ１−２
配列番号１１：プロテアーゼ発現遺伝子断片（解析結果）
配列番号１２：プライマー（インバースＰＣＲ）
配列番号１３：プライマー（インバースＰＣＲ）
配列番号１４：プロテアーゼ発現遺伝子断片（解析結果、５’末端配列）
配列番号１５：プロテアーゼ発現遺伝子断片（解析結果、３’末端配列）

Claims (10)

  1. 以下の（ａ１）又は（ａ２）に記載のポリペプチドを含むプロテアーゼ。
    （ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上３０以下のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）を培養して得られた請求項１に記載のプロテアーゼ。
  3. 放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を培養して得られた請求項１に記載のプロテアーゼ。
  4. 放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）及び放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を混合培養して得られた請求項１に記載のプロテアーゼ。
  5. 前記プロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約３１，０００Ｄａ（３１ｋＤａ）である請求項１乃至４のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
  6. 前記プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下の（ｂ１）又は（ｂ２）に記載のポリヌクレオチドを含む請求項１乃至５のいずれか一項に記載のプロテアーゼ。
    （ｂ１）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ｂ２）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  7. 請求項１乃至６のいずれか一項に記載のプロテアーゼを含有するプロテアーゼ含有洗浄剤。
  8. 放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）を培養して製造する請求項７に記載のプロテアーゼ含有洗浄剤の製造方法。
  9. 放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を培養して製造する請求項７に記載のプロテアーゼ含有洗浄剤の製造方法。
  10. 放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７）及び放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（ＮＢＲＣ国内分離ＲＤ株、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８）を混合培養して製造する請求項７に記載のプロテアーゼ含有洗浄剤の製造方法。
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