JP2016036327A - プロテアーゼ含有洗浄組成物及びプロテアーゼの安定化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】放線菌由来の新規プロテアーゼの失活を抑制する安定化剤を見出し、前記プロテアーゼ及び安定化剤を含む新規酵素組成物、該酵素組成物を含有する新規プロテアーゼ含有洗浄組成物、これらの組成物を用いる新規洗浄方法、及び前記プロテアーゼの安定化方法を提供する【解決手段】プロテアーゼ安定化剤として、スキムミルク又はカルシウムイオンを使用する。【選択図】なし

Description

本発明は、プロテアーゼ含有洗浄組成物、及びプロテアーゼの安定化方法に関する。

従来、医療器具の洗浄剤として、非イオン界面活性剤、プロテアーゼ、金属イオン封鎖剤及びベンゾトリアゾール等からなる洗浄剤組成物が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、プロテアーゼ、ノニオン界面活性剤、酵素安定剤を含有する洗浄剤組成物も知られている（例えば、特許文献２参照）。

特開平５−２７９７００号公報 特開２００１−３１９９９号公報

現状ではアルカリ洗浄剤が最も広く用いられているが、以下のような問題点が指摘されている。
１．アルミ製品を腐食し、また、ステンレス製品も黒色に変色してしまう。
２．洗浄過程で洗浄器を痛める可能性があり、また、配管を腐食する可能性がある。
３．人体や環境に対して危険である。

このような問題点を解決するために、タンパク質を分解する能力が強く、特に血液等のタンパク質汚れに対して高い洗浄力を有する新規プロテアーゼ、該プロテアーゼ含有する洗浄剤、及びその製造方法が、既に特許出願されている（ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０００７２４）。本プロテアーゼは、高温域（５０〜９５℃）に活性を示し、通常の器具除染用洗浄器（washer disinfector; ＷＤ）等の殺菌・消毒工程の実施温度である９３℃でも利用が可能である。
しかしながら、タンパク質であるプロテアーゼは、高温域では失活が早く、また、プロテアーゼであるため、酵素自体が自己消化を起こし、更に失活が促進される問題がある。

従って、本発明の課題は、前記プロテアーゼの失活を抑制する安定化剤を見出し、前記プロテアーゼ及び安定化剤を含む新規酵素組成物、該酵素組成物を含有する新規プロテアーゼ含有洗浄組成物、これらの組成物を用いる新規洗浄方法、及び前記プロテアーゼの安定化方法を提供することにある。

本発明は、
［１］下記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼと、
スキムミルク及びカルシウムイオンからなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼ安定化剤と
を含む、酵素組成物、
［２］前記プロテアーゼが、
放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６７）を培養して得られたプロテアーゼ、
放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６８）を培養して得られたプロテアーゼ、並びに
放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株及び放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株を混合培養して得られたプロテアーゼ
からなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼである、［１］の酵素組成物、
［３］更に界面活性剤を含む、［２］又は［３］の酵素組成物、
［４］［１］〜［３］のいずれかの酵素組成物を含む、プロテアーゼ含有洗浄組成物、
［５］［１］〜［３］のいずれかの酵素組成物、又は、［４］のプロテアーゼ含有洗浄組成物を用いる、洗浄方法、
［６］下記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼに、
スキムミルク及びカルシウムイオンからなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼ安定化剤を共存させる、前記プロテアーゼを安定化する方法
に関する。

本発明によれば、血液等のタンパク質汚れに対して高い洗浄力を有する新規プロテアーゼの失活を抑制することができる。より具体的には、例えば、酵素組成物の保管時および洗浄組成物として保管した場合のプロテアーゼ活性の維持、洗浄時の反応温度（特に高温域）におけるプロテアーゼ分解抑制およびプロテアーゼ活性維持を行うことにより、前記プロテアーゼの安定化を達成することができる。

ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）についての比活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）についての比活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素についての相対活性の温度依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素についての相対活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素について、溶液として保管した場合のスキムミルクの安定化効果を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素について、８０℃でインキュベータした場合のスキムミルクの安定化効果を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素について、８０℃でインキュベータした場合のカルシウムイオンの安定化効果を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素について、カルシウムイオン濃度を変えて８０℃でインキュベータした場合のカルシウムイオンの安定化効果を示すグラフである。 ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株の混合培養液から得られた粗酵素について、高温域でインキュベータした場合のカルシウムイオンの安定化効果を示すグラフである。

本発明では、プロテアーゼとして、例えば、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）
を用いることができる。

配列番号２で表されるアミノ酸配列は、例えば、配列番号１で表される塩基配列（１１６１ｂｐ）によってコードされる配列であり、３８６残基のアミノ酸からなるプロテアーゼをコードする。配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１位〜２６位のアミノ酸配列はシグナル配列であり、２７位〜１１０位のアミノ酸配列はプロ配列であり、１１１位〜３８６位のアミノ酸配列は成熟型（活性型）の配列である。

配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２７位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができ、更には、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、プロテアーゼ活性を低下させることのない配列、例えば、シグナル配列、検出用マーカー、精製用タグ配列（６残基からなるヒスチジン、ＧＳＴなどのポリペプチド）を付加したポリペプチドを挙げることができる。

プロテアーゼ活性は、タンパク質を分解する酵素活性を意味する。前記プロテアーゼ活性は、例えば、以下に示すアゾカゼイン法、又はカゼイン法により確認することができる。
アゾカゼイン法では、まず、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、終濃度８０ｍＭ）１９８μＬに３％アゾカゼイン（終濃度０．６％）５０μＬを混合させる。そして、酵素活性を確認する試料２μＬを添加し、６５℃で５分間又は１０分間反応させる。酵素反応後、２０％トリクロロ酢酸５０μＬを加えて反応を停止させる。反応停止後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定する。酵素量１Ｕ（ユニット）は、１μｍｏｌ相当のアゾ色素を１分間に生成する量とする。

カゼイン法では、トリス−塩酸緩衝液４５μＬに、酵素活性を確認する試料５μＬ、２％カゼイン溶液５０μＬを添加する。６５℃で５分間反応させ、酵素反応後、３５％トリクロロ酢酸２５μＬを加えて反応を停止させる。反応停止後、反応液を遠心分離して、上清２０μＬを取り、０．１Ｎ ＮａＯＨ１８０μＬを加えて、２８０ｎｍの吸光度を測定する。

「相同ポリペプチド」は、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、プロテアーゼ活性を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。

なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２

「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び／又は挿入可能なアミノ酸数は、１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個である。

本発明において、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
中性アミノ酸：Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis

本発明で用いることのできる、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６７）、アクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６８）を培養することにより調製することができる。これらの微生物は、それぞれ、単独で培養することもできるし、あるいは、混合培養することもできる。

また、本発明で用いることのできるポリペプチド、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、遺伝子組み換え技術を利用して調製することもできる。例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、この発明ベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、所望のポリペプチドを調製することができる。

本発明では、これらの培養で得られた培養液から菌体を除去した培養上清を、そのままプロテアーゼ含有画分として用いることもできるし、あるいは、前記培養上清を出発材料として、各種のタンパク質精製方法により得られる粗精製画分または精製酵素を、プロテアーゼとして用いることもできる。

本発明では、プロテアーゼ安定化剤として、スキムミルク又はカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）を使用する。これらのプロテアーゼ安定化剤は、いずれか一方を単独で、あるいは、両方を併用することができる。
本発明では、前記安定化剤を添加することにより、例えば、酵素組成物の保管時および洗浄組成物として保管した場合のプロテアーゼ活性の維持、洗浄時の反応温度（特に高温域）におけるプロテアーゼ分解抑制およびプロテアーゼ活性維持を達成することができる。

プロテアーゼ安定化剤としてスキムミルクを使用する場合、反応系での最終濃度として、例えば、０．０４〜４％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０４〜１．２％（Ｗ／Ｖ）、更に好ましくは０．５〜１．２％（Ｗ／Ｖ）で添加することができる。また、酵素組成物または洗浄組成物として、例えば、０．０４〜５％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０４〜４％（Ｗ／Ｖ）、更に好ましくは０．５〜３％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有することができる。

プロテアーゼ安定化剤としてカルシウムイオンを使用する場合、反応系での最終濃度として、例えば、０．０１〜５ｍＭ、好ましくは０．０５〜１ｍＭ、更に好ましくは０．１〜０．３ｍＭで添加することができる。また、酵素組成物または洗浄組成物として、例えば、０．０１〜２００ｍＭ、好ましくは０．０５〜５０ｍＭ、更に好ましくは０．１〜３０ｍＭの濃度で含有することができる。

本発明では、前記安定化剤に加え、通常の洗浄組成物に添加することのできる任意の添加剤を含有させることができる。前記添加剤としては、例えば、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、防錆剤、色素、キレート化剤、泡調整剤、香料、脱塩素剤、抗菌剤、粘度調整剤を挙げることができる。

前記界面活性剤としては、例えば、非イオン界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は両性界面活性剤を用いることができる。

非イオン界面活性剤として、具体的には、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル［例えば、ポリエチレングリコール モノ−パラ−イソ−オクチルフェニルエステル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）］、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル［例えば、ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）］、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、又はアルキルアルカノールアミド等を挙げることができる。

陰イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩［例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、アルキルナフタレンスルフォン酸塩、又はアルキルスルホコハク酸塩等を挙げることができる。

陽イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルアミン塩、又は第４級アンモニウム塩［例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）］等を挙げることができる。

両性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルベタイン、アミンオキサイド、又はジメチルアンモニオプロパンスルホン酸等を挙げることができる。

前記添加剤として界面活性剤を添加する場合には、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＤＳ、ＣＴＡＢを用いることが好ましい。これらの界面活性剤は、本来の洗浄効果を有するだけでなく、本発明で用いるプロテアーゼの酵素活性を上昇させる効果を有することを確認している。
また、キレート化剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いることができ、ＥＤＴＡも、本発明で用いるプロテアーゼの酵素活性を上昇させる効果を有することを確認している。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：プロテアーゼ（ＲＤ００１９３３株）の精製、酵素学的性質の評価、及び配列決定》
（１）微生物（ＲＤ００１９３３株）の単独培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６７）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）４９０ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに７０ｍＬずつ分注した。これにスプリングコイルを１個入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク３０ｍＬを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体を５０μＬとり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍＬずつ植菌し、４５℃で９６時間程度振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。

（２）プロテアーゼの精製
（ａ）アセトン沈殿及び硫安分画
上記（１）で回収した培養上清に、６０％（ｖ／ｖ）以上となるようにアセトンを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を、終濃度１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。

（ｂ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
上記（ａ）で得られた粗酵素液を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ３８ｍｍ、東ソー株式会社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。

（ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて透析を行うことによって脱塩した。２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（５ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。

（ｄ）ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて透析を行うことによって脱塩した。これを２０ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ（１ｍＬ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、タンパク質を溶出させた。

以上のようにして、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株より、精製酵素を得た。
なお、プロテアーゼの酵素活性は、次のようにして測定した。まず表１に示す反応液を６５℃、ｐＨ７．５で５分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定した。酵素量１Ｕ（ユニット）は、１μｍｏｌ相当のアゾ色素を１分間に生成する量とした。以下、アゾカゼインを用いた活性測定をアゾカゼイン法と称することがある。

上記（ｄ）で溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析した。活性画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素（ポリペプチド）の分子量は約３１ｋＤａであった。

（３）精製プロテアーゼの酵素学的性質の検討
ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）の酵素学的性質について検討した。

（ａ）作用温度
表１に示す反応液を各温度、ｐＨ７．５で５分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
図１は、種々の反応温度での酵素活性を、比活性で示したグラフである。図１のグラフに示されるように、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、５０〜９０℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６０〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０〜７５℃付近であった。

（ｂ）作用ｐＨ
表２に示す反応液を各ｐＨ、７５℃で５分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液：ｐＨ５．５、ｐＨ６
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．２
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８、ｐＨ８．８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９、ｐＨ９．５

図２は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、比活性で示したグラフである。図２のグラフから分かるように、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、ｐＨ５．５〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．２付近（例えばｐＨ６．０〜８．８）であった。

（４）プロテアーゼ遺伝子の塩基配列決定
上記のＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）について、Ｎ末端アミノ酸配列解析、及びトリプシン消化により得られたペプチドサンプルの内部アミノ酸配列解析を行い、それらの情報に基づいて、ＰＣＲ法で遺伝子をクローニングし、塩基配列決定を行ったところ、配列番号１で表される塩基配列（１１６１ｂｐ）を取得した。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、この配列（配列番号１）のコドンに対応するアミノ酸配列である。
配列解析の結果から、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼをコードする遺伝子は１１６１ｂｐのヌクレオチドからなり、３８６残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１位〜２６位のアミノ酸配列はシグナル配列であり、２７位〜１１０位のアミノ酸配列はプロ配列であり、１１１位〜３８６位のアミノ酸配列は成熟型（活性型）の配列である。

《実施例２：プロテアーゼ（ＲＤ０００９２０株）の精製、酵素学的性質の評価、及び配列決定》
（１）微生物の培養とプロテアーゼの精製
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６８）を使用したこと以外は、実施例１（１）及び実施例１（２）に記載の手順を繰り返し、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）を得た。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析したところ、活性画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素（ポリペプチド）の分子量は約３１ｋＤａであった。
また、実施例１（４）と同様の方法で、塩基配列を決定したところ、配列番号１で表される塩基配列とほぼ１００％一致し、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列とは１００％一致した。

（２）精製プロテアーゼの酵素学的性質の検討
実施例１（３）に記載の手順により、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）の酵素学的性質について検討した。
作用温度および作用ｐＨに関する結果を、図１及び図２に示す。

（ａ）作用温度
ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、５０〜９０℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６０〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０〜７５℃付近であった。

（ｂ）作用ｐＨ
ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）は、ｐＨ５．５〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．２付近（例えばｐＨ６．０〜８．８）であった。

《実施例３：プロテアーゼ（二株の混合培養）の精製および酵素学的性質の評価》
（１）微生物（ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株）の混合培養
菌体として、放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura sp.）属に属するＲＤ００１９３３株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６７）及び放線菌のアクチノマジュラ（Actinomadura miaoliensis）属に属するＲＤ０００９２０株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６８）を使用した。
まず、ＩＳＰ２培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス１．４％、グルコース０．６％）４．２Ｌを調製し、１０Ｌ容卓上型培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。さらに別滅菌した２．５％スキムミルク１．８Ｌを添加して終濃度を０．７５％とした。
そして、グリセロールストックの菌体２種類を５００μＬとり、ＩＳＰ２培地５０ｍＬを入れた５００ｍＬ容三角フラスコにそれぞれ植菌し、４５℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。先の滅菌した培地６Ｌにこの２種類の培養液を３０ｍＬずつ植菌し、４５℃、５００ｒｐｍ、１ｖｖｍで１〜７日間培養した。培養開始時において２種類の培養液の比率は１：１であることが好ましいが、別段の定めはない。また、培養期間は、１〜７日間が好ましく、３〜５日間がさらに好ましい。遠心分離機を用いて、この培養液から上清を回収した。

（２）プロテアーゼの精製
（ａ）アセトン沈殿
上記（１）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるように−２０℃アセトンを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表３に酵素の回収率を示す。

（ｂ）エタノール沈殿
上記（１）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表３に酵素の回収率を示す。

（ｃ）硫安沈殿
上記（１）で回収した培養上清に、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％飽和量となるように硫酸アンモニウム粉末を添加し、各濃度で生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬで溶解し、粗酵素液を得た。表３に酵素の回収率を示す。

（２）粗酵素液の酵素学的性質の検討
ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）の酵素学的性質について検討した。

（ａ）作用温度
表２に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各温度、ｐＨ７．５で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。

図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が７０℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図３のグラフに示されるように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は、５５〜８５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６５〜８０℃の範囲内であり、好ましくは７０℃付近であった。

（ｂ）作用ｐＨ
表３に示す反応液（酵素液は８０％飽和硫安沈殿により得たもの）を各ｐＨ、６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって酵素活性を求めた。
使用した緩衝液は次のとおりである。
酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液：ｐＨ５
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ６
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９
図４は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが８．０である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図４のグラフから分かるように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は、ｐＨ５．０〜９．０という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは７．５付近（例えばｐＨ７．０〜８．０）であった。

《実施例４：洗浄試験》
（１）滴下試験
プロテアーゼ含有洗浄剤として、ＲＤ００１９３３株由来プロテアーゼ（精製酵素）、ＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（精製酵素）、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）をそれぞれ、疑似血液で汚染された試験片（洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」、（株）ニチオン）上に滴下し、所定時間ごとに疑似血液を拭き取って洗浄を行った。この洗浄は、６５℃で各酵素量を５μＬ（濃度：約５Ｕ／ｍＬ）に調製して行った。試験片の洗浄結果は、次の基準で目視により判定した。その結果を表４に示す。
「◎」：完全に洗浄された状態
「○」：ほとんど洗浄されている状態
「△」：ごくわずかな残留物（疑似血液汚れ）がある状態
「×」：残留物（疑似血液汚れ）が残っている状態

（２）フラスコ試験
洗浄剤として、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）、市販酵素ナットウキナーゼ（和光純薬工業（株）「１４７−０８８０１」）、市販ストレプトキナーゼ（和光純薬工業（株）「５９３−２０５８１」）、市販酵素ウロキナーゼ（田辺三菱製薬（株）「８７３９５４」）、市販衣類洗剤（花王（株）「アタックＮｅｏ」）、市販酵素サーモリシン（シグマ−アルドリッチ「Ｐ１５１２−１Ｇ」）を用いた。
上記の洗浄剤をそれぞれ２００ｍＬ容フラスコに３０ｍＬずつ入れ、さらに試験片（Ｎ洗浄評価インジケーター「ＴＯＳＩ−Ｇｏｌｄ」、（株）ニチオン）を入れて浸漬させた。そして、表５に示す温度及び時間の条件で攪拌子により上記のフラスコ内を攪拌した。その後、上記の試験片を取り出して軽く水洗した後、上記と同じ基準で洗浄結果を判定した。その結果を表５に示す。

表５から明らかなように、ＲＤ００１９３３株及びＲＤ０００９２０株由来プロテアーゼ（粗酵素）は最も洗浄効果が高いと考えられ、次いで市販酵素サーモリシンの洗浄効果が高いことが確認された。

《実施例５：スキムミルクの安定化効果の評価》
（１）粗酵素液として保管した場合の保存安定性
プロテアーゼを溶液として保管した場合のスキムミルクの添加効果を評価した。
実施例３（１）で培養液から回収した上清に、６０％飽和量となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で９０倍に濃縮されるよう溶解し、粗酵素液を得た。得られた粗酵素液に、スキムミルクを０．０４％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように添加した。保管は４０℃で行い、スキムミルクの有無による保存安定性を評価した。なお、前記温度は、酵素の保存性試験における加速試験で用いられる温度であり、およそ６倍加速の指標となっている。また、スキムミルクを添加しないものについては、一般的な冷蔵温度である４℃での保管も行った。

所定日数経過した後、各粗酵素の酵素活性を次のようにして測定した。まず表１に示す反応液（粗酵素液は水道水により２００倍に希釈したもの）を６５℃で１０分間静置して反応させた後、２０％トリクロロ酢酸を５０μＬ加えて反応を停止させた。その後、反応液を遠心分離して上清の３４０ｎｍの吸光度を測定した。初日の活性を基準（１００％）とした。
結果を図５に示す。横軸は、保存性試験開始からの経過日数であり、縦軸は、試験開始時のプロテアーゼ活性（アゾカゼイン法による）を基準（１００％）とする相対活性である。
スキムミルクを添加することにより、溶液での保存性が大幅に向上することが確認された。

（２）酵素反応の反応温度における安定性
本発明で用いるプロテアーゼは至適反応温度が高温域にあり、高温での洗浄が可能である。酵素反応の反応温度（温度：８０℃）におけるスキムミルクの添加効果を評価した。
プロテアーゼ溶液として実施例５（２）と同様の方法で粗酵素液を得、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、スキムミルクを０．０４％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるように添加した。この所定濃度に希釈した粗酵素液（５０μＬ）を８０℃まで加温した後、所定時間（３分、５分、１３分、２０分）経過後に、以下の手順でプロテアーゼ活性を測定した。各試料（５０μＬ）を６５℃で３分間インキュベートした後、２％カゼイン溶液５０μＬを添加し、６５℃で５分間インキュベートした。酵素反応後、３５％トリクロロ酢酸２５μＬを加えて反応を停止させた後、反応液を遠心分離して、上清２０μＬを取り、０．１Ｎ ＮａＯＨ１８０μＬを加えて、２８０ｎｍの吸光度を測定した（以下、カゼイン法と称することがある）。

結果を図６に示す。横軸は、８０℃での放置時間であり、縦軸は、波長２８０ｎｍの吸光度で示すプロテアーゼ活性（残存活性）である。
スキムミルクを添加することにより、スキムミルク無添加と比較して、酵素溶液としての活性が向上しており、高温での酵素安定性が向上することが確認された。

《実施例６：カルシウムイオンの安定化効果の評価》
（１）酵素反応の反応温度における安定性
添加剤としてカルシウムイオンを用いること、８０℃の放置を５分、１０分、２０分、３０分としたこと以外は、実施例５（２）の手順を繰り返した。なお、カルシウムイオンの添加濃度は２ｍＭとした。
結果を図７に示す。横軸は、８０℃での放置時間であり、縦軸は、試験開始時のプロテアーゼ活性（カゼイン法による）を基準（１００％）とする相対活性である。
カルシウムイオンを添加することにより、カルシウムイオン無添加と比較して、酵素溶液としての活性が向上しており、高温での酵素安定性が向上することが確認された。

（２）酵素反応の反応温度における安定性（カルシウムイオンの濃度の影響）
酵素安定化効果に対して、カルシウムイオンの濃度が与える影響を検討するために、８０℃での放置時間を１５分間とし、カルシウムイオンの濃度を変えて、実施例６（１）の手順を繰り返した。
結果を図８に示す。横軸は、カルシウムイオンの濃度であり、縦軸は、波長２８０ｎｍの吸光度で示すプロテアーゼ活性（カゼイン法による）である。
カルシウムイオンは、低濃度でも、高い安定化効果を示すことが確認された。

（３）酵素反応の反応温度における安定性（高温域での効果）
酵素安定化効果に関して、高温域での効果を検討するために、カルシウムイオンの添加濃度を２ｍＭとし、所定温度（７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、１００℃）での放置時間を５分間又は１５分間として、実施例６（１）の手順を繰り返した。
結果を図９に示す。横軸は、５分間又は１５分間の放置を行うインキュベーション温度であり、縦軸は、所定温度にて放置する前のプロテアーゼ活性（カゼイン法による）を基準（１００％）とする相対活性である。
図９に示すように、カルシウムイオンを添加しない場合、８０℃１５分間でも活性はほぼ消失し、９０℃では５分間で活性がほぼ消失した。一方、カルシウムイオンを添加した場合、９０℃５分間では、ほぼ１００％の活性を保持しており、９０℃１５分間で３５％程度まで消失することが確認された。特に１００℃でも、５分間であればまだ３０％の活性を保持することが確認された。
通常、器具除染用洗浄器（washer disinfector; ＷＤ）等の殺菌・消毒工程は９３℃１０分で行われることが多いが、本発明で用いるプロテアーゼにカルシウムイオンを添加することで、洗浄と殺菌・消毒とを同時に行うことができる。

本発明は、洗浄剤、特に医療器具の洗浄剤として利用することができる。

放線菌アクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株は、２０１２年１１月２２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４６７として寄託され、２０１３年４月１９日に国際寄託（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６７）へ移管されている。
放線菌アクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株は、２０１２年１１月２２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４６８として寄託され、２０１３年４月１９日に国際寄託（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６８）へ移管されている。

Claims (6)

1. 下記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
   （ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、並びに
   （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
   からなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼと、
   スキムミルク及びカルシウムイオンからなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼ安定化剤と
   を含む、酵素組成物。
2. 前記プロテアーゼが、
   放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６７）を培養して得られたプロテアーゼ、
   放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４６８）を培養して得られたプロテアーゼ、並びに
   放線菌のアクチノマジュラ・エスピー（Actinomadura sp.）ＲＤ００１９３３株及び放線菌のアクチノマジュラ・マイアオリエンシス（Actinomadura miaoliensis）ＲＤ０００９２０株を混合培養して得られたプロテアーゼ
   からなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼである、請求項１に記載の酵素組成物。
3. 更に界面活性剤を含む、請求項１又は２に記載の酵素組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素組成物を含む、プロテアーゼ含有洗浄組成物。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素組成物、又は、請求項４に記載のプロテアーゼ含有洗浄組成物を用いる、洗浄方法。
6. 下記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
   （ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、並びに
   （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１１１位〜３８６位のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかもプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
   からなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼに、
   スキムミルク及びカルシウムイオンからなる群から選んだ、少なくとも１つのプロテアーゼ安定化剤を共存させる、前記プロテアーゼを安定化する方法。