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ES2761260T3 - Biomarcadores y procedimientos de tratamiento de afecciones relacionadas con PD-1 y PD-L1 - Google Patents

Biomarcadores y procedimientos de tratamiento de afecciones relacionadas con PD-1 y PD-L1 Download PDF

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ES2761260T3
ES2761260T3 ES14714119T ES14714119T ES2761260T3 ES 2761260 T3 ES2761260 T3 ES 2761260T3 ES 14714119 T ES14714119 T ES 14714119T ES 14714119 T ES14714119 T ES 14714119T ES 2761260 T3 ES2761260 T3 ES 2761260T3
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cancer
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Daniel Shin-Yu Chen
Priti Hegde
Hartmut Koeppen
Marcin Kowanetz
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

Un procedimiento para identificar a un individuo con un cáncer que es más probable que responda a un tratamiento con un antagonista de unión a ligando de muerte programada 1 (PD-L1), comprendiendo el procedimiento: (a) determinar en una muestra del individuo la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en la muestra en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1; y determinar además en la muestra la presencia o nivel de: (i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2; (ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9; (iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MICA, MIC-B y CTLA-4; y/o (iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9; y (b) proporcionar una recomendación de que será más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1, en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1.

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores y procedimientos de tratamiento de afecciones relacionadas con PD-1 y PD-L1
CAMPO
En el presente documento se describen biomarcadores para el tratamiento de afecciones patológicas, tales como cáncer, y procedimientos de uso de antagonistas de la vía PD-L1/PD-1. En particular, se describen biomarcadores para la selección y el pronóstico de pacientes en cáncer, así como procedimientos de tratamiento terapéutico, artículos de fabricación y procedimientos para prepararlos, kits de diagnóstico, procedimientos de detección y procedimientos de propaganda relacionada con los mismos. La invención proporciona un procedimiento para identificar a un individuo con un cáncer que es más probable que responda a un tratamiento con un anticuerpo antagonista de unión a PD-L1, un anticuerpo antagonista de unión a PD-L1 para su uso en el tratamiento de un cáncer y un uso de un kit de diagnóstico como se define en las reivindicaciones adjuntas.
ANTECEDENTES
El cáncer sigue siendo una de las amenazas más mortales para la salud humana. En EE. UU. , el cáncer afecta a casi 1,3 millones de pacientes nuevos cada año, y es la segunda causa principal de muerte después de cardiopatía, representando aproximadamente 1 de cada 4 muertes. Por ejemplo, el cáncer de pulmón es la forma más común de cáncer y el principal cáncer mortífero entre las mujeres estadounidenses. También se predice que el cáncer puede superar a las cardiovasculopatías como la principal causa de muerte en 5 años. Los tumores sólidos son responsables de la mayoría de esas muertes. Aunque han existido avances significativos en el tratamiento médico de determinados cánceres, la tasa de supervivencia global de 5 años para todos los cánceres ha mejorado solo aproximadamente en un 10 % en los últimos 20 años. Los cánceres o tumores malignos metastatizan y crecen rápidamente de manera incontrolada, lo que hace que la detección y tratamiento oportunos sean extremadamente difíciles.
A pesar del avance significativo en el tratamiento del cáncer, todavía se están buscando tratamientos mejorados. Chen DS et al., Clin Cancer Res. (2012) 15;18(24):6580-7 divulga que la expresión tumoral de PD-L1 puede ser un biomarcador para la respuesta a la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 general, e invita a los estudios clínicos a abordar esta asociación.
SUMARIO
La invención proporciona un procedimiento para identificar a un individuo con un cáncer que es más probable que responda a un tratamiento con un antagonista de unión a ligando de muerte programada 1 (PD-L1), comprendiendo el procedimiento:
(a) determinar en una muestra del individuo la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en la muestra en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1;
y determinar además en la muestra la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, ID01, galectina 9, MIC-A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9; y
(b) proporcionar una recomendación de que será más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1,
en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1.
La invención también proporciona un antagonista de unión a PD-L1 para su uso en un tratamiento de un cáncer en un individuo, comprendiendo el tratamiento
(a) determinar en una muestra del individuo la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1;
y determinar además en la muestra la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, ID01, galectina 9, MIC-A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9; y
(b) administrar una cantidad eficaz del antagonista de unión a PD-L1 al individuo, en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1, y en el que el tratamiento se basa en la presencia o nivel incrementado de PD-L1 y la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, ID01, galectina 9, MIC-A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9, en la muestra. La invención proporciona además el uso de un kit de diagnóstico en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el kit de diagnóstico:
(a) uno o más reactivos adecuados para determinar en una muestra de un individuo con un cáncer la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en la muestra en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1,
en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1; y
(b) uno o más reactivos adecuados para determinar en la muestra del individuo la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, ID01, galectina 9, MIC-A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9.
En el presente documento se proporcionan procedimientos que identifican a un individuo con una enfermedad o trastorno que es más probable que responda al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, en el que la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1, y proporcionar una recomendación de que será más probable que el individuo que responda al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para predecir la reactividad de un individuo con una enfermedad o trastorno al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, en el que la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra indica que es más probable que el individuo sea sensible al tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1, y proporcionar una recomendación de que el individuo tendrá una probabilidad incrementada de ser sensible al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para determinar la probabilidad de que un individuo con una enfermedad o trastorno muestre beneficios del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, en el que la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra indica que el individuo tiene una probabilidad incrementada de beneficio del tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1, y proporciona una recomendación de que el individuo tendrá una probabilidad incrementada de beneficio del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para seleccionar un tratamiento para un individuo con una enfermedad o trastorno, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, y proporcionar una recomendación de que el tratamiento seleccionado para el individuo comprende el tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1 en base a la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra.
En algunas divulgaciones, los procedimientos comprenden además administrar una cantidad eficaz del antagonista de unión al eje PD-L1 al individuo.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para tratar una enfermedad o trastorno en un individuo, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo y administrar una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-L1 al individuo.
En el presente documento se proporcionan procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-L1, en el que el tratamiento se basa en la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para anunciar un antagonista de unión al eje PD-L1 que comprenden promover, a un público destinatario, el uso del antagonista de unión al eje PD-L1 para tratar a un individuo con una enfermedad o trastorno en base a la presencia de un biomarcador PD-L1.
En el presente documento se proporcionan ensayos para identificar a un individuo con una enfermedad o trastorno para recibir un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo y recomendar un antagonista de unión al eje PD-L1 en base a la presencia de un biomarcador PD-L1.
En el presente documento se proporcionan kits de diagnóstico que comprenden uno o más reactivos para determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra de un individuo con una enfermedad o trastorno, en los que la presencia de un biomarcador PD-L1 quiere decir una mayor probabilidad de eficacia cuando el individuo se trata con un antagonista de unión al eje PD-L1, y en los que la ausencia de un biomarcador PD-L1 quiere decir una menor probabilidad de eficacia cuando el individuo con la enfermedad se trata con el antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento también se proporcionan artículos de fabricación que comprenden, empaquetados juntos, un antagonista de unión al eje PD-L1, en un vehículo farmacéuticamente aceptable y un prospecto del envase que indica que el antagonista de unión al eje PD-L1 es para tratar a un paciente con una enfermedad o trastorno en base a la expresión de un biomarcador PD-L1. Los procedimientos de tratamiento incluyen cualquiera de los procedimientos de tratamiento divulgados en el presente documento. Se proporcionan además procedimientos para fabricar un artículo de fabricación que comprende combinar en un envase una composición farmacéutica que comprende un antagonista de unión al eje PD-L1 y un prospecto del envase que indica que la composición farmacéutica es para tratar a un paciente con una enfermedad o trastorno en base a la expresión de un biomarcador PD-L1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 es un marcador inmunomediado. En algunas divulgaciones, el marcador inmunomediado es un marcador relacionado con linfocitos T. En algunas divulgaciones, el marcador relacionado con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A, CXCL9 y cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, el marcador inmunomediado se selecciona del grupo que consiste en CX3CL1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno proliferativo. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inmunomediado. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la enfermedad o trastorno es cáncer. En algunas divulgaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, mesotelioma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, sarcoma, cáncer de próstata, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel y otras neoplasias hemáticas.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, en los que la muestra obtenida del individuo se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre completa, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es una muestra de tejido tumoral. En algunas divulgaciones, la muestra de tejido tumoral comprende células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales y cualquier combinación de las mismas. En algunas divulgaciones, la muestra tisular se fija con formol y se incluye en parafina, se archiva, fresca o congelada. En algunas divulgaciones, la muestra es sangre completa. En algunas divulgaciones, la sangre completa comprende células inmunitarias, células tumorales circulantes y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la muestra se obtiene antes del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la presencia de un biomarcador PD-L1 indica que es probable que el individuo tenga un incremento en el beneficio clínico cuando se trata al individuo con el antagonista de unión al eje PD-L1. En algunas divulgaciones, el incremento en el beneficio clínico comprende un incremento relativo en uno o más de los siguientes: supervivencia global (SG), supervivencia sin progresión (SSP), respuesta completa (RC), respuesta parcial (RP) y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 está ausente de la muestra cuando comprende un 0 % de la muestra.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 está presente en la muestra cuando comprende más de un 0 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 1 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 5 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 10 % de la muestra.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en FACS, inmunoelectrotransferencia, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, inmunotransferencia por puntos, procedimientos de inmunodetección, HPLC, resonancia de plasmón superficial, espectroscopia óptica, espectrometría de masas, HPLC, qPCR, RT-qPCR, RT-qPCR o qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY y FISH, y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de proteína. En algunas divulgaciones, la expresión de proteína se determina por inmunohistoquímica (IHQ). En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta usando un anticuerpo anti-pD-L1. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción débil por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción moderada por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción fuerte por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales y cualquier combinación de las mismas. En algunas divulgaciones, la tinción es tinción de membrana, tinción citoplásmica o combinaciones de las mismas.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la ausencia del biomarcador PD-L1 se detecta como ausente o sin tinción en la muestra. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la presencia del biomarcador PD-L1 se detecta como cualquier tinción en la muestra.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico. En algunas divulgaciones, la expresión de ácido nucleico se determina usando qPCR, RT-qPCR, RT-qPCR o qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY o FISH. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-L1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión a ligando. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a ambos PD-1 y B7-1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión a ligando. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L2. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a ambos PD-L1 y PD-L2.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, que comprenden además una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente citotóxico, un agente quimioterápico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente radioterápico y agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para evaluar una respuesta al tratamiento de un individuo con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: (a) determinar el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en una muestra biológica derivada del individuo en un punto temporal durante o después de la administración del antagonista de unión al eje PD-L1; y (b) mantener, ajustar o detener el tratamiento del individuo en base a una comparación del/de los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica con los niveles de referencia, en el que un cambio en el/los nivel(es) de uno o más más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta al tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan procedimientos para realizar un seguimiento de la respuesta de un individuo tratado con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo dicho procedimiento: (a) determinar el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en una muestra biológica derivada del individuo en un punto temporal durante o después de la administración del antagonista de unión al eje PD-L1; y (b) comparar el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica con los niveles de referencia para realizar el seguimiento de la respuesta en los individuos sometidos a tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1.
En algunas divulgaciones, los niveles de referencia del uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en (1) el nivel del uno o más biomarcadores del individuo antes de la administración del antagonista de unión al eje PD-L1; (2) el nivel del uno o más biomarcadores de una población de referencia; (3) un nivel preasignado para el uno o más biomarcadores; y (4) el nivel del uno o más biomarcadores del individuo en un segundo punto temporal antes del primer punto temporal.
En algunas divulgaciones, el cambio en el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es un incremento en los niveles.
En algunas divulgaciones, el cambio en el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es una disminución en los niveles.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia. En algunas divulgaciones, un incremento en uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta positiva al tratamiento.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un marcador inmunomediado. En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un marcador relacionado con linfocitos T.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un marcador de activación de linfocitos T.
En algunas divulgaciones, el marcador de activación de linfocitos T se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia.
En algunas divulgaciones, el marcador de activación de linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en un CD8, IFN-g, granzima-A, TNF-a, perforina y cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, un incremento en el marcador de activación de linfocitos T seleccionado del grupo que consiste en CD8, IFN-g, granzima-A, TNF-a, perforina y cualquier combinación de los mismos en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta positiva al tratamiento.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un linfocito T en proliferación activado.
En algunas divulgaciones, el linfocito T en proliferación activado se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia.
En algunas divulgaciones, el linfocito T en proliferación activado es una célula CD8+/Ki67+, una célula CD8+/HLA-DR+/Ki67+ y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es IL-6. En algunas divulgaciones, el nivel de IL-6 disminuye en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia. En algunas divulgaciones, una disminución en el nivel de IL-6 en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta positiva al tratamiento. En algunas divulgaciones, el nivel de IL-6 se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia. En algunas divulgaciones, un incremento en el nivel de IL-6 en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta negativa al tratamiento.
En algunas divulgaciones, la muestra biológica derivada del individuo se selecciona del grupo que consiste en una célula, un tejido, un cultivo de tejido, un tumor, un líquido biológico y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el líquido biológico se selecciona del grupo que consiste en plasma, suero, sangre completa, PBMC y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el tejido es un tejido tumoral. En algunas divulgaciones, el tejido tumoral se selecciona del grupo que consiste en células tumorales, células infiltrantes de tumor, células estromales y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones, la célula es un célula tumoral circulante (CTC).
En algunas divulgaciones, el individuo padece una enfermedad o trastorno proliferativo.
En algunas divulgaciones, el individuo padece cáncer o neoplasia maligna. En algunas divulgaciones, el cáncer o neoplasia maligna se selecciona entre carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, mesotelioma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, sarcoma, cáncer de próstata, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel y otras neoplasias hemáticas.
En algunas divulgaciones, el individuo padece una enfermedad o trastorno inmunomediado.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-L1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión a ligando.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a ambos PD-1 y B7-1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión a ligando.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L2. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a ambos PD-L1 y PD-L2.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
El documento de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujo(s) en color se proporcionarán por la Oficina bajo petición y pago de la tasa necesaria.
La figura 1 muestra un análisis IHQ ejemplar de muestras celulares de control. (A) tinción IHQ de control negativo de células HEK-293 originales; (B) tinción IHQ de células HEK-293 transfectadas con PD-L1 humano recombinante con intensidad de tinción débil; (C) tinción IHQ de células HEK-293 transfectadas con PD-L1 humano recombinante con intensidad de tinción moderada; (D) tinción IHQ de células HEK-293 transfectadas con PD-L1 humano recombinante con intensidad de tinción fuerte; (E) tinción IHQ de control de tejido positivo de muestra de tejido placentario; (F) tinción IHQ de control de tejido positivo de muestra de tejido de amígdala. Todas las tinciones IHQ se realizaron usando un anticuerpo anti-PD-L1 patentado.
La figura 2 muestra una tinción IHQ positiva para PD-L1 ejemplar de muestras tumorales de (A) cáncer de mama triple negativo; (B) melanoma maligno; (C) CPNm , adenocarcinoma.
La figura 3 muestra la correlación de la expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor con respuesta de EP o bien RP/RC al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa. (A) % de células inmunitarias infiltrantes de tumor PD-L1+ dentro de un área de muestra tumoral, usando análisis IHQ PD-L1. (B) % de PD-L1+ CI dentro de los infiltrados inmunitarios totales dentro de una muestra tumoral, usando análisis IHQ PD-L1.
La figura 4 muestra la correlación de la expresión génica de PD-L1 en muestras tumorales con respuesta de EP o bien RP/RC al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer, usando análisis qPCR PD-L1. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa.
La figura 5 muestra la correlación de la expresión génica de PD-1 en muestras tumorales con respuesta de EP o bien RP/RC al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa.
La figura 6 muestra la correlación de varias expresiones de genes inmunitarios en muestras tumorales con respuesta de EP o bien RP al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial.
La figura 7 muestra un esquema de biopsias tumorales antes/durante el tratamiento en serie de pacientes tratados con anticuerpo anti-PD-L1. Valor de referencia emparejado (que incluye pretratamiento o tejido tumoral de archivo) y biopsias tumorales en tratamiento de pacientes tratados con anticuerpo anti-PD-L1 (n = 26) que padecen diversas indicaciones incluyendo melanoma, carcinoma de células renales (CCR), carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de cabeza y cuello (CyC), cáncer colorrectal (CCR), cáncer gástrico y de mama.
La figura 8 muestra (a) un incremento en la infiltración de linfocitos T CD8+ se asoció con un incremento en la expresión de PD-L1 en muestras tumorales de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1; y (b) un incremento en los marcadores de activación de linfocitos T, incluyendo granzima A, perforina, IFN-g, TNFa y CD8, después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 9 resume los cambios en la expresión de PD-L1 en pacientes sometidos a tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 10 muestra (a) un incremento en la frecuencia de linfocitos T en proliferación en sangre, identificados como células CD8+/Ki67+; y (b) un incremento en la frecuencia de linfocitos T en proliferación activados, identificados como células CD8+/HLA-DR+/Ki67+, en pacientes sometidos a tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 11 muestra que una disminución en los niveles de IL-6 en el plasma se asoció con pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 y que un incremento en los niveles de IL-6 en el plasma se asoció con pacientes que progresan bajo el tratamiento con anticuerpos anti-PD-L1.
La figura 12 muestra la correlación de diversas expresiones de genes inmunitarios en muestras tumorales con respuesta de EP o bien RP/RC al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa.
La figura 13 muestra la correlación de expresiones génicas de IDO1 en muestras tumorales de melanoma o bien CPNM con respuesta de EP o bien RP/RC al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa.
La figura 14 muestra un incremento en la expresión de PD-L1 en los linfocitos T circulantes en sangre obtenida de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa.
La figura 15 muestra la correlación de la expresión génica de linfocitos Th1 citotóxicos, IFN-g y marcadores de transporte de linfocitos T en muestras tumorales con respuesta de EP o bien RP/RC al tratamiento anti-PD-L1 en pacientes con cáncer. EP = enfermedad progresiva; RP = respuesta parcial; RC = respuesta completa.
La figura 16 muestra un incremento en los marcadores de activación de linfocitos T en un paciente con melanoma que responde al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 17 muestra una frecuencia baja de linfocitos T intratumorales y falta de activación de linfocitos T en marcadores de activación de linfocitos T en un paciente con melanoma que no responde al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 18 muestra un incremento transitorio en la frecuencia de linfocitos T activados CD8+/HLA-DR+/Ki-67+ en la sangre de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 19 muestra fluctuaciones en linfocitos T CD4+/ICOS+, con incrementos retardados en esta población de linfocitos T que se correlacionan con la respuesta y disminuciones con la progresión de la enfermedad (que se produce después del ciclo 3).
La figura 20 muestra que el incremento adaptativo en la expresión de PD-L1 es prominente en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 21 muestra la correlación de la expresión de CTLA4 con la respuesta al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, mientras que la expresión de fractalquina/CX3CL1 se correlacionó con progresión.
La figura 22 muestra la correlación de firmas génicas asociadas con linfocitos Tef (T-efectores), linfocitos Treg (T-reguladores) y linfocitos Th17 en seis indicaciones de cáncer.
La figura 23 muestra una tendencia hacia una mayor expresión génica tumoral de IL17F en pacientes que no responden al tratamiento anti-PD-L1. R = pacientes que responden al tratamiento; nR = pacientes que no responden al tratamiento.
La figura 24 muestra que la expresión génica tumoral de IL-17F es mayor en pacientes con una respuesta tardía al tratamiento anti-PD-L1.
La figura 25 muestra un incremento transitorio en células CD8+/HLA-DR+/Ki67+ circulantes en pacientes sometidos a tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, (a) en pacientes con CVU, (b) en todos los pacientes.
La figura 26 muestra un incremento transitorio en IL-18 en plasma en pacientes sometidos a tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Además, MCP-1 en plasma de referencia fue menor en pacientes con respuesta parcial/respuesta completa (RP/RC) al tratamiento anti-PD-L1. Tanto IL-18 como MCP-1 también se expresaron predominantemente en monocitos.
La figura 27 muestra que los tumores de pretratamiento de pacientes que progresaron después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 presentaron una firma génica mieloide proporcionalmente mayor (IL-8, CCL2 e IL1B) que se expresaron predominantemente en células mieloides (por ejemplo, monocitos, células dendríticas).
La figura 28 muestra la correlación de PD-L1 soluble en la sangre de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
La figura 29 muestra la asociación entre la expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI) y la respuesta al tratamiento anti-PD-L1. (a) en CPNM, (b) en todos los tumores.
La figura 30 muestra la asociación entre la expresión de PD-L1 en células tumorales y la respuesta al tratamiento anti-PD-L1, (a) en CPNM, (b) en todos los tumores.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Definiciones
El término "antagonista de unión al eje PD-L1" es una molécula que inhibe la interacción de un compañero de unión al eje PD-L1 con uno cualquiera o más de sus compañeros de unión, para retirar la disfunción de linfocitos T que resulta de la señalización en el eje de señalización de PD-1, siendo un resultado la restauración o potenciación de la función de linfocitos T. Como se usa en el presente documento, un antagonista de unión al eje PD-L1 incluye un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión PD-1 así como moléculas que interfieren con la interacción entre PD-L1 y PD-1 (por ejemplo, fusión PD-L2-Fc).
El término "antagonistas de unión a PD-L1" es una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno cualquiera o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En algunas divulgaciones, un antagonista de unión a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 y/o B7-1. En algunas divulgaciones, los antagonistas de unión a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En una divulgación, un antagonista de unión a PD-L1 reduce la señal negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T y otras células, la señalización mediada a través de PD-L1 o PD-1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos no disfuncional.
El término "antagonistas de unión a PD-1" es una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. En una divulgación, un antagonista de unión a PD-1 reduce la señal negativa mediada por o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T y otras células, la señalización mediada a través de PD-1 o PD-L1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos no disfuncional.
Los términos "ligando de muerte programada 1" y "PD-L1" se refieren en el presente documento a un polipéptido PD-L1 de secuencia natural, variantes del polipéptido y fragmentos de un polipéptido de secuencia natural y variantes del polipéptido (que se definen además en el presente documento). El polipéptido PD-L1 descrito en el presente documento puede ser el que se aísla de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o se prepara por procedimientos recombinantes o sintéticos.
Un "polipéptido PD-L1 de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PD-L1 correspondiente derivado de la naturaleza.
"Variante del polipéptido PD-L1", o variaciones del mismo, quiere decir un polipéptido PD-L1, en general un polipéptido PD-L1 activo, como se define en el presente documento que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias del polipéptido PD-L1 de secuencia natural como se divulga en el presente documento. Dichas variantes del polipéptido PD-L1 incluyen, por ejemplo, polipéptidos PD-L1 en los que uno o más residuos aminoacídicos se añaden o se delecionan, en el extremo N o C de una secuencia de aminoácidos natural. Habitualmente, una variante del polipéptido PD-L1 tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, a una secuencia del polipéptido PD-L1 de secuencia natural como se divulga en el presente documento. Habitualmente, los polipéptidos variantes PD-L1 tienen al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, de forma alternativa al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 aminoácidos de longitud, o más. Opcionalmente, los polipéptidos variantes PD-L1 no tendrán más de una sustitución aminoacídica conservadora en comparación con una secuencia del polipéptido PD-L1 natural, de forma alternativa no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas conservadoras en comparación con la secuencia del polipéptido PD-L1 natural.
El término "antagonista de PD-L1" tal como se define en el presente documento es cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica y/o función mediada por un PD-L1 de secuencia natural. En determinadas divulgaciones, dicho antagonista se une a PD-L1. De acuerdo con una divulgación, el antagonista es un polipéptido. De acuerdo con otra divulgación, el antagonista es un anticuerpo anti-PD-L1. De acuerdo con otra divulgación, el antagonista es un antagonista de molécula pequeña. De acuerdo con otra divulgación, el antagonista es un antagonista polinucleotídico.
"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, bases o nucleótidos modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero por ADN o ARN polimerasa, o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, se puede conferir una modificación a la estructura nucleotídica antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar además después de la síntesis, tal como por conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, alfa ácidos nucleicos anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del/de los polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los glúcidos se puede reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, proteger por grupos protectores estándar o activar para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o se puede conjugar a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos del grupo de caperuza orgánico de desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivatizar a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de los glúcidos ribosa o desoxirribosa que en general son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2'-acido-ribosa, análogos de glúcidos carbocíclicos, glúcidos alfa anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, glúcidos de piranosa, glúcidos de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleosídicos abásicos, tales como metil-ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster se pueden reemplazar por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, divulgaciones en las que fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.
"Oligonucleótido", como se usa en el presente documento, en general se refiere a polinucleótidos monocatenarios cortos que tienen, pero no necesariamente, menos de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos.
El término "cebador" se refiere a un polinucleótido monocatenario que se puede hibridar a un ácido nucleico y seguir la polimerización de un ácido nucleico complementario, en general proporcionando un grupo 3'-OH libre.
El término "molécula pequeña" se refiere a cualquier molécula con un peso molecular de aproximadamente 2000 daltons o menos, preferentemente de aproximadamente 500 daltons o menos.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pasos. La descendencia puede que no sea completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan funcionalmente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas divulgaciones, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.
Los términos "anticuerpo anti-PD-L1" y "un anticuerpo que se une a PD-L1" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a PD-L1 con una afinidad suficiente de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a PD-L1. En una divulgación, el grado de unión de un anticuerpo anti-PD-L1 a una proteína distinta de PD-L1 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a PD-L1 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinadas divulgaciones, un anticuerpo anti-PD-L1 se une a un epítopo de PD-L1 que está conservado entre PD-L1 de diferentes especies.
Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas preferentes inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Las divulgaciones ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, p, £, y y M, respectivamente.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; estando descritos dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales en el presente documento.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) se corresponden con las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR se corresponden con las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
El término "detección" incluye cualquier medio de detección, incluyendo detección directa e indirecta.
El término "biomarcador" como se usa en el presente documento se refiere a un indicador, por ejemplo, predictivo, diagnóstico y/o pronóstico, que se puede detectar en una muestra. El biomarcador puede servir como indicador de un subtipo particular de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) caracterizado por determinados rasgos moleculares, patológicos, histológicos y/o clínicos. En algunas divulgaciones, un biomarcador es un gen. Los biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos (por ejemplo, ADN y/o ARN), alteraciones del número de copias de polinucleótidos (por ejemplo, números de copias de ADN), polipéptidos, modificaciones de polipéptidos y polinucleótidos (por ejemplo, modificaciones postraduccionales), marcadores moleculares a base de glucolípidos y/o carbohidratos.
Los términos "firma de biomarcador", "firma", "firma de expresión de biomarcador" o "firma de expresión" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a uno o una combinación de biomarcadores con una expresión que es un indicador, por ejemplo, predictivo, diagnóstico y/o pronóstico. La firma de biomarcador puede servir como indicador de un subtipo particular de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) caracterizado por determinados rasgos moleculares, patológicos, histológicos y/o clínicos. En algunas divulgaciones, la firma de biomarcador es una "firma génica". El término "firma génica" se usa de manera intercambiable con "firma de expresión génica" y se refiere a uno o una combinación de polinucleótidos con una expresión que es un indicador, por ejemplo, predictivo, diagnóstico y/o pronóstico. En algunas divulgaciones, la firma de biomarcador es una "firma de proteína". El término "firma de proteína" se usa de manera intercambiable con "firma de expresión de proteína" y se refiere a uno o una combinación de polipéptidos con una expresión que es un indicador, por ejemplo, predictivo, diagnóstico y/o pronóstico.
La "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un incremento en el beneficio clínico para un individuo es un nivel detectable en una muestra biológica. Estos se pueden medir por procedimientos conocidos para un experto en la técnica y también divulgados en el presente documento. La cantidad o nivel de expresión de biomarcador evaluado se puede usar para determinar la respuesta al tratamiento.
El término "nivel de expresión" en general se refiere a la cantidad de un biomarcador en una muestra biológica. "Expresión" en general se refiere al procedimiento por el que la información (por ejemplo, codificada por genes y/o epigenética) se convierte en las estructuras presentes y en funcionamiento en la célula. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, "expresión" se puede referir a transcripción en un polinucleótido, traducción en un polipéptido, o incluso modificaciones en polinucleótido y/o polipéptido (por ejemplo, modificación postraduccional de un polipéptido). Los fragmentos del polinucleótido transcrito, el polipéptido traducido, o las modificaciones de polinucleótidos y/o polipéptidos (por ejemplo, la modificación postraduccional de un polipéptido) también se considerarán expresados si se originan a partir de un transcrito generado por empalme alternativo o un transcrito degradado, o de un procesamiento postraduccional del polipéptido, por ejemplo, por proteólisis. Los "genes expresados" incluyen los que se transcriben en un polinucleótido como ARNm y a continuación se traducen en un polipéptido, y también los que se transcriben en ARN pero no se traducen en un polipéptido (por ejemplo, ARN de transferencia y ribosómicos).
"Expresión elevada", "niveles de expresión elevados" o "niveles elevados" se refiere a un incremento en la expresión o incremento en los niveles de un biomarcador en un individuo en relación con un control, tal como un individuo o individuos que no padecen la enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) o un control interno (por ejemplo, biomarcador constitutivo).
"Expresión reducida", "niveles de expresión reducidos" o "niveles reducidos" se refiere a una expresión disminuida o niveles disminuidos de un biomarcador en un individuo en relación con un control, tal como un individuo o individuos que no padecen la enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) o un control interno (por ejemplo, biomarcador constitutivo). En algunas divulgaciones, la expresión reducida es poca o ninguna expresión.
El término "biomarcador constitutivo" se refiere a un biomarcador o grupo de biomarcadores (por ejemplo, polinucleótidos y/o polipéptidos) que típicamente están presentes de forma similar en todos los tipos de células. En algunas divulgaciones, el biomarcador constitutivo es un "gen constitutivo". Un "gen de mantenimiento" se refiere en el presente documento a un gen o grupo de genes que codifican proteínas con actividades que son esenciales para el mantenimiento de la función celular y que típicamente están presentes de forma similar en todos los tipos de células.
"Amplificación", como se usa en el presente documento, en general se refiere al procedimiento de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" quiere decir al menos dos copias. Una "copia" no quiere decir necesariamente una complementariedad o identidad de secuencia perfecta respecto a la secuencia molde. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos nucleotídicos tales como desoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionadas (tales como alteraciones de secuencia introducidas a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridable, pero no complementaria, al molde) y/o errores de secuencia que se producen durante la amplificación.
El término "PCR múltiple" se refiere a una única reacción de PCR llevada a cabo en ácido nucleico obtenido de una única fuente (por ejemplo, un individuo) usando más de un conjunto de cebadores con el propósito de amplificar dos o más secuencias de ADN en una única reacción.
La "restricción" de reacciones de hibridación es determinable fácilmente por un experto ordinario en la técnica y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para una hibridación apropiada, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende en general de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las hebras complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas mayores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas menores lo harían menos. Para detalles adicionales y explicación de la restricción de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta restricción", como se define en el presente documento, se pueden identificar como aquellas que: (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 0C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con seroalbúmina bovina al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 0C; o (3) hibridación durante la noche en una solución que emplea formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 0C, con un lavado de 10 minutos a 42 0C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido de un lavado de alta restricción de 10 minutos que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 0C.
Las "condiciones moderadamente rigurosas" se pueden identificar como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37 0C en una solución que comprende: formamida al 20 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 ‘C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y similares.
La técnica de "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" como se usa en el presente documento en general se refiere a un procedimiento en el que se amplifican pequeñas cantidades de una porción específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.683.195 otorgada el 28 de julio de 1987. En general, es necesario que la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá esté disponible, de modo que se puedan diseñar cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a hebras opuestas del molde que se va a amplificar. Los nucleótidos 5' terminales de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede usar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas de ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de secuencias de ARN, bacteriófagos o plásmidos celulares totales, etc. Véase en general Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Como se usa en el presente documento, se considera que la PCR es uno, pero no el único, ejemplo de un procedimiento de reacción de la ácido nucleico polimerasa para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido (ADN o ARN) como cebador y utiliza una ácido nucleico polimerasa para amplificar o generar una porción específica de ácido nucleico o para amplificar o generar una porción específica de ácido nucleico que es complementaria a un ácido nucleico particular.
"Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa" o "qRT-PCR" se refiere a una forma de PCR en la que la cantidad de producto de PCR se mide en cada etapa en una reacción de PCR. Esta técnica se ha descrito en varias publicaciones, incluyendo Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004); y Ma et al., Cancer Cell 5:607-616 (2004).
El término "micromatriz" se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridables, preferentemente sondas de polinucleótidos, en un sustrato.
El término "polinucleótido", cuando se usa en singular o plural, en general se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por tanto, por ejemplo, los polinucleótidos como se define en el presente documento incluyen, sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que incluye regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que incluye regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o que incluyen regiones mono y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las hebras en dichas regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente implican solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región triple helicoidal a menudo es un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente ADNc. El término incluye ADN (incluyendo ADNc) y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para su estabilidad o por otros motivos son "polinucleótidos" tal como se preveé ese término en el presente documento. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas, se incluyen dentro del término "polinucleótidos" como se define en el presente documento. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas modificadas química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo las células simples y complejas.
El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono o bicatenarios, híbridos ARN:ADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos de sonda de ADN monocatenario, a menudo se sintetizan por procedimientos químicos, por ejemplo, usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están disponibles comercialmente. Sin embargo, los oligonucleótidos se pueden preparar por una variedad de otros procedimientos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y por la expresión de ADN en células y organismos.
El término "diagnóstico" se usa en el presente documento para referirse a la identificación o clasificación de un estado, enfermedad o afección molecular o patológico (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, "diagnóstico" se puede referir a la identificación de un tipo particular de cáncer. El "diagnóstico" también se puede referir a la clasificación de un subtipo particular de cáncer, por ejemplo, por criterios histopatológicos o por rasgos moleculares (por ejemplo, un subtipo caracterizado por la expresión de uno o una combinación de biomarcadores (por ejemplo, genes o proteínas particulares codificado por dichos genes).
El término "diagnóstico de ayuda" se usa en el presente documento para referirse a procedimientos que ayudan a realizar una determinación clínica con respecto a la presencia, o naturaleza, de un tipo particular de síntoma o afección de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, un procedimiento de ayuda al diagnóstico de una enfermedad o afección (por ejemplo, cáncer) puede comprender medir determinados biomarcadores en una muestra biológica de un individuo.
El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto y/o individuo de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que se debe caracterizar y/o identificar, por ejemplo en base a características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de enfermedad" y variaciones de la misma se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto de interés que se esperaría o se sabe que contiene la entidad celular y/o molecular que se va a caracterizar. Las muestras incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares o células primarias o cultivadas, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, humor vítreo, líquido linfático, líquido sinovial, líquido folicular, semen, líquido amniótico, leche, sangre completa, células derivadas de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, esputo, lágrimas, sudor, moco, lisados tumorales y medio de cultivo tisular, extractos tisulares tales como tejido homogeneizado, tejido tumoral, extractos celulares y combinaciones de los mismos.
Por "muestra tisular" o "muestra celular" se quiere decir una obtención de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o individuo. La fuente de la muestra tisular o celular puede ser tejido sólido como el de un órgano fresco, congelado y/o preservado, muestra tisular, biopsia y/o aspirado; sangre o cualquier constituyente sanguíneo tal como plasma; líquidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; células de cualquier momento en gestación o desarrollo del sujeto. La muestra tisular también puede ser líneas celulares o células primarias o cultivadas. Opcionalmente, la muestra tisular o celular se obtiene de un tejido/órgano de enfermedad. La muestra tisular puede contener compuestos que no se entremezclan de forma natural con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares.
Una "muestra de referencia", "célula de referencia", "tejido de referencia", "muestra de control", "célula de control" o "tejido de control", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra, célula, tejido, estándar o nivel que se usa para propósitos de comparación. En una divulgación, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o células) del mismo sujeto o individuo. Por ejemplo, células o tejido sanos y/o no enfermos adyacentes a células o tejido enfermos (por ejemplo, células o tejido adyacentes a un tumor). En otra divulgación, se obtiene una muestra de referencia de un tejido y/o célula no tratados del cuerpo del mismo sujeto o individuo. Aún en otra divulgación, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o individuo. Incluso en otra divulgación, una muestra de referencia, una célula de referencia, un tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de un tejido y/o célula no tratados del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o individuo.
Para los propósitos en el presente documento, una "sección" de una muestra tisular quiere decir una única parte o porción de una muestra tisular, por ejemplo, un corte delgado de tejido o células cortadas de una muestra tisular. Se entiende que se pueden tomar múltiples secciones de muestras tisulares y someterlas a análisis, siempre que se entienda que la misma sección de muestra tisular se puede analizar a nivel tanto morfológico como molecular, o analizar con respecto a ambos polipéptidos y polinucleótidos.
Por "correlacionar" o "correlación" se quiere decir comparar, de cualquier forma, el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis o protocolo con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si se debe realizar un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la divulgación del protocolo o análisis polipeptídico, se pueden usar los resultados del protocolo o análisis de expresión polipeptídica para determinar si se debe realizar un régimen terapéutico específico. Con respecto a la divulgación del protocolo o análisis polinucleotídico, se pueden usar los resultados del protocolo o análisis de expresión polinucleotídica para determinar si se debe realizar un régimen terapéutico específico.
La "respuesta individual" o "respuesta" se puede evaluar usando cualquier criterio de valoración que indique un beneficio para el individuo, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, en cierto grado, de la progresión de la enfermedad (por ejemplo, progresión del cáncer), incluyendo ralentización e interrupción completa; (2) una reducción en el tamaño tumoral; (3) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración de células cancerosas en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de metástasis; (5) alivio, en cierto grado, de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer); (6) incremento o prolongación en la duración de la supervivencia, incluyendo supervivencia global y supervivencia sin progresión; y/o (9) disminución en la mortalidad en un momento dado después del tratamiento.
Una "respuesta eficaz" de un paciente o la "reactividad" de un paciente al tratamiento con un medicamento y redacción similar se refiere al beneficio clínico o terapéutico impartido a un paciente en riesgo de o que padece una enfermedad 0 trastorno, tal como cáncer. En una divulgación, dicho beneficio incluye uno cualquiera o más de: prolongación de la supervivencia (incluyendo supervivencia global y supervivencia sin progresión); dando como resultado una respuesta objetiva (incluyendo una respuesta completa o una respuesta parcial); o mejorar los signos o síntomas de cáncer. En una divulgación, el biomarcador (por ejemplo, expresión de PD-L1, por ejemplo, como se determina usando IHQ) se usa para identificar al paciente que se predice que tiene un incremento en la probabilidad de ser sensible al tratamiento con un medicamento (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1), en relación con un paciente que no expresa el biomarcador. En una divulgación, el biomarcador (por ejemplo, expresión de PD-L1, por ejemplo, como se determina usando IHQ) se usa para identificar al paciente que se predice que tiene un incremento en la probabilidad de ser sensible al tratamiento con un medicamento (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1), en relación con un paciente que no expresa el biomarcador al mismo nivel. En una divulgación, la presencia del biomarcador se usa para identificar a un paciente que es más probable que responda al tratamiento con un medicamento en relación con un paciente que no tiene la presencia del biomarcador. En otra divulgación, la presencia del biomarcador se usa para determinar que un paciente tendrá un incremento en la probabilidad de beneficio del tratamiento con un medicamento, en relación con un paciente que no tiene la presencia del biomarcador.
"Supervivencia" se refiere a que el paciente permanezca con vida e incluye la supervivencia global así como la supervivencia sin progresión.
Supervivencia global se refiere a que el paciente permanezca con vida durante un período de tiempo definido, tal como 1 año, 5 años, etc., desde el momento del diagnóstico o tratamiento.
Supervivencia sin progresión se refiere a que el paciente permanezca con vida, sin que el cáncer progrese o empeore.
Por "prolongación de la supervivencia" se quiere decir el incremento de la supervivencia global o sin progresión en un paciente tratado en relación con un paciente no tratado (es decir, en relación con un paciente no tratado con el medicamento), o en relación con un paciente que no expresa un biomarcador en el nivel designado y/o en relación con un paciente tratado con un agente antitumoral aprobado. Una respuesta objetiva se refiere a una respuesta medible, incluyendo respuesta completa (RC) o respuesta parcial (RP).
Por respuesta completa o "RC" se entiende la desaparición de todos los signos de cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre quiere decir que el cáncer se haya curado.
Respuesta parcial o "RP" se refiere a una disminución en el tamaño de uno o más tumores o lesiones, o en el grado del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento.
El término "sustancialmente el mismo", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos, de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd o expresión). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, menor que aproximadamente un 50 %, menor que aproximadamente un 40 %, menor que aproximadamente un 30 %, menor que aproximadamente un 20 % y/o menor que aproximadamente un 10 % en función del valor del anticuerpo de referencia/comparador.
La frase "sustancialmente diferente", como se usa en el presente documento, indica un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos, de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de significación estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, mayor que aproximadamente un 10 %, mayor que aproximadamente un 20 %, mayor que aproximadamente un 30 %, mayor que aproximadamente un 40 % y/o mayor que aproximadamente un 50 % en función del valor para la molécula de referencia/comparadora.
La palabra "marcador" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable. Típicamente, el marcador se conjuga o se fusiona directa o indirectamente a un reactivo, tal como una sonda polinucleotídica o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al que se conjuga o fusiona. El marcador en sí mismo puede ser detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que da como resultado un producto detectable.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cánceres, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para el tratamiento del cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, evaluando la duración de la supervivencia, tiempo transcurrido hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (TR), duración de la respuesta y/o calidad de vida.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. En esta definición se incluyen cánceres benignos y malignos. Por "cáncer en estadio precoz" o "tumor en estadio precoz" se quiere decir un cáncer que no es invasivo ni metastásico o se clasifica como un cáncer en estadio 0, I o II. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma), sarcoma (incluyendo liposarcoma y sarcoma de células sinoviales), tumores neuroendocrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma e insulinoma), mesotelioma, schwannoma (incluyendo neurinoma del acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen carcinoma de células escamosas (por ejemplo, carcinoma de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, incluyendo carcinoma de pulmón microcítico (CPM), carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (incluyendo cáncer de mama metastásico), cáncer de colón, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer renal o de riñón, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer de células de Merkel, micosis fungoide, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores de las vías biliares, así como cáncer de cabeza y cuello y neoplasias hemáticas. En algunas divulgaciones, el cáncer es cáncer de mama metastásico triple negativo, incluyendo cualquier adenocarcinoma triple negativo (ER-, PR-, HER2-) histológicamente confirmado de la mama con enfermedad localmente recidivante o metastásica (donde la enfermedad localmente recidivante no es susceptible a resección con intención curativa).
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunas divulgaciones, se usan anticuerpos para retrasar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "tratamiento antineoplásico" se refiere a un tratamiento útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos antineoplásicos incluyen, pero se limitan a, por ejemplo, agentes quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes antitubulínicos y otros agentes para tratar el cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (mesilato de imatinib)), un inhibidor de la COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a una o más de las siguientes dianas: PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptor(es) BCMA, TRAIL/Apo2 y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. Las combinaciones de los mismos también se incluyen en la divulgación.
El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterápicos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca la destrucción de células tumorales.
Un "agente quimioterápico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquilo, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aciridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán) (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uramustina; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, en especial calicheamicina gamma 1I y calicheamicina omega I1 (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de integrina alfa-4; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteínas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyección de liposoma de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de elliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbacina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas genomanipulada con albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de la tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VEl BAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometillornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano-citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como vacuna THERATOPE® y las vacunas de tratamiento génico, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de Co X-2 (por ejemplo celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR (véase la definición a continuación); inhibidores de tirosina cinasa (véase la definición a continuación); inhibidores de serina-treonina cinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una politerapia de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.
Los agentes quimioterápicos como se define en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "tratamientos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas por sí mismos, incluyendo, pero sin limitarse a: antiestrógenos con perfil agonista/antagonista mixto, incluyendo tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, keoxifeno y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM), tales como SERM3; antiestrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®) y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización de receptores de estrógenos (RE), inhibir la unión a ADN, incrementar el recambio de RE y/o suprimir los niveles de RE); inhibidores de aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroideos, tales como formestano y exemestano (AROMASIN®), e inhibidores de aromatasa no esteroideos, tales como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol y 4(5)-imidazoles; agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, incluyendo leuprorelina (LUPRON® y ELIGARD®), goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas, tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos, tales como dietilestilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides, tales como fluoximesterona, todo el ácido transretinoico y fenretinida; onapristona; antiprogesteronas; reguladores por disminución de los receptores de estrógenos (DRE); antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
El término "profármaco" como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células tumorales en comparación con el fármaco original y se puede activar o convertir enzimáticamente en la forma original más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615° Meeting Belfast (1986) y Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con aminoácidos D, profármacos glucosilados, profármacos que contienen p-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterápicos descritos anteriormente.
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (por ejemplo, una célula con crecimiento que depende de la expresión de PD-L1 in vitro o in vivo). Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Los bloqueantes de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que interrumpen la G1 también actúan sobre la interrupción de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbacina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluoruracilo y Ara-C. Se puede encontrar información adicional en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), en especial p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos antineoplásicos derivados ambos del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos previniendo la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de mitosis en células.
Por "radioterapia" se quiere decir el uso de rayos beta o rayos gamma dirigidos para inducir suficiente daño a una célula como para limitar su capacidad de funcionar normalmente o destruir la célula por completo. Se apreciará que existen muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración en una sola dosis y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (Gy) por día.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas divulgaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
La expresión "de forma concurrente" se usa en el presente documento para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde al menos parte de la administración se solapa en el tiempo. En consecuencia, la administración concurrente incluye una pauta posológica cuando la administración de uno o más agentes continúa después de suspender la administración de uno o más de otros agentes.
Por "reducir o inhibir" se quiere decir la capacidad de provocar una disminución global de un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o mayor. Reducir o inhibir se puede referir a los síntomas del trastorno que se está tratando, la presencia o tamaño de las metástasis o el tamaño del tumor primario.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
Un "artículo de fabricación" es cualquier fabricación (por ejemplo, un envase o recipiente) o kit que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer), o una sonda para detectar específicamente un biomarcador descrito en el presente documento. En determinadas divulgaciones, la fabricación o kit se promociona, distribuye o vende como una unidad para realizar los procedimientos descritos en el presente documento.
Un "público destinatario" es un grupo de personas o una institución a los que o para la que se está promocionando o se pretende promocionar un medicamento particular, como por comercialización o propaganda, en especial para usos, tratamientos o indicaciones particulares, tales como individuos, poblaciones, lectores de periódicos, literatura médica y revistas, espectadores de televisión o internet, oyentes de radio o internet, médicos, empresas farmacéuticas, etc.
La expresión "basado en" cuando se usa en el presente documento quiere decir que la información sobre uno o más biomarcadores se usa para informar una decisión de tratamiento, información proporcionada en un prospecto del envase, u orientación de comercialización/promoción, etc.
Como se entiende por un experto en la técnica, la referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) divulgaciones que se refieren a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción en referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Se entiende que el aspecto y las divulgaciones descritas en el presente documento incluyen aspectos y divulgaciones "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en". Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluye las referencias en plural a menos que se indique de otro modo.
I. Procedimientos y usos
En el presente documento se proporcionan procedimientos que utilizan biomarcadores PD-L1. En particular, se proporcionan procedimientos que utilizan un antagonista de unión al eje PD-L1 y un biomarcador PD-L1.
PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO
En el presente documento se proporcionan procedimientos para identificar a un individuo con una enfermedad o trastorno que es más probable que responda al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, en el que la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1, y proporcionar una recomendación de que será más probable que el individuo que responda al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan además procedimientos para predecir la reactividad de un individuo con una enfermedad o trastorno al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, en el que la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra indica que es más probable que el individuo sea sensible al tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1, y proporcionar una recomendación de que el individuo tendrá una probabilidad incrementada de ser sensible al tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan además procedimientos para determinar la probabilidad de que un individuo con una enfermedad o trastorno muestre beneficios del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, en el que la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra indica que el individuo tiene una probabilidad incrementada de beneficio del tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1, y proporciona una recomendación de que el individuo tendrá un incremento en la probabilidad de beneficio del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1.
Se proporcionan además procedimientos para seleccionar un tratamiento para un individuo con una enfermedad o trastorno, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo, y proporcionar una recomendación de que el tratamiento seleccionado para el individuo comprende el tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1 en base a la presencia de un biomarcador PD-L1 en la muestra.
En algunas divulgaciones, los procedimientos comprenden además administrar una cantidad eficaz del antagonista de unión al eje PD-L1 al individuo.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 es un marcador inmunomediado. Un marcador inmunomediado se refiere a un marcador que se expresa por células inmunitarias o por otras células (por ejemplo, células tumorales, células endoteliales, fibroblastos u otras células estromales). Si se expresa por células distintas de las inmunitarias, el marcador puede estar implicado en la regulación de la biología y función de las células inmunitarias, tal como activación, cebado, reconocimiento y presentación de antígenos, producción de citocinas y quimiocinas, proliferación, migración, supervivencia, producción de anticuerpos y otras. En algunas divulgaciones, el marcador inmunomediado es un marcador relacionado con linfocitos T. En algunas divulgaciones, el marcador relacionado con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A, CXCL9 y cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, el marcador inmunomediado se selecciona del grupo que consiste en CX3CL1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones, la presencia de un biomarcador PD-L1 indica que es probable que el individuo tenga un incremento en el beneficio clínico cuando se trata al individuo con el antagonista de unión al eje PD-L1. En algunas divulgaciones, el incremento en el beneficio clínico comprende un incremento relativo en uno o más de los siguientes: supervivencia global (SG), supervivencia sin progresión (SSP), respuesta completa (RC), respuesta parcial (RP) y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está ausente de la muestra cuando comprende un 0 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en la muestra cuando comprende más de un 0 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 1 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 5 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 10 % de la muestra.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en FACS, inmunoelectrotransferencia, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, inmunotransferencia por puntos, procedimientos de inmunodetección, HPLC, resonancia de plasmón superficial, espectroscopía óptica, espectrometría de masas, HPLC, qPCR, RT-qPCR, RT-qPCR o qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY y FISH, y combinaciones de los mismos. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de proteína. En algunas divulgaciones, la expresión de proteína se determina por inmunohistoquímica (IHQ). En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta usando un anticuerpo anti-PD-L1.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción débil por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción moderada por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción fuerte por IHQ.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor o combinaciones de las mismas usando análisis de expresión de proteína, tal como análisis IHQ. Las células inmunitarias infiltrantes de tumor incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias intratumorales, células inmunitarias peritumorales o cualquier combinación de las mismas, otras células estromales tumorales (por ejemplo, fibroblastos). Dichas células inmunitarias infiltrantes de tumor pueden ser linfocitos T (tales como linfocitos T CD8+ y/o linfocitos T CD4+), linfocitos B u otras células de linaje de médula ósea, incluyendo granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos), monocitos, macrófagos, células dendríticas (es decir, células dendríticas interdigitantes), histiocitos y linfocitos citolíticos naturales.
En algunas divulgaciones, la tinción para el biomarcador PD-L1 se detecta como tinción de membrana, tinción citoplásmica y combinaciones de las mismas. En otras divulgaciones, la ausencia del biomarcador PD-L1 se detecta como ausente o sin tinción en la muestra.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico. En algunas divulgaciones, la expresión de ácido nucleico se determina usando qPCR, rtPCR, sec-ARN, RT-qPCR o qPCR múltiple, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY o FISH.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales y combinaciones de las mismas usando expresión de ácido nucleico tal como análisis de qPCR.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-L1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión a ligando. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a ambos PD-1 y B7-1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión a ligando. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L2. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a ambos PD-L1 y PD-L2.
En algunas divulgaciones, la muestra obtenida del individuo se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre completa, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas divulgaciones, la muestra es una muestra tisular. En algunas divulgaciones, la muestra es una muestra de tejido tumoral. En algunas divulgaciones, la muestra de tejido tumoral comprende células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales o cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones, la muestra se obtiene antes del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1. En algunas divulgaciones, la muestra tisular se fija con formol y se incluye en parafina, se archiva, fresca o congelada.
En algunas divulgaciones, la muestra es sangre completa. En algunas divulgaciones, la sangre completa comprende células inmunitarias, células tumorales circulantes y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno proliferativo. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inmunomediado. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es cáncer. En algunas divulgaciones, el cáncer es carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, mesotelioma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, sarcoma, cáncer de próstata, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel y otras neoplasias hemáticas.
La presencia y/o cantidad/niveles de expresión de un biomarcador (por ejemplo, PD-L1) se pueden determinar cualitativa y/o cuantitativamente en base a cualquier criterio adecuado conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a ADN, ARNm, ADNc, proteínas, fragmentos de proteínas y/o número de copias génicas. En determinadas divulgaciones, la presencia y/o la cantidad/niveles de expresión de un biomarcador en una primera muestra se incrementan o se elevan en comparación con la presencia/ausencia y/o cantidad/niveles de expresión en una segunda muestra. En determinadas divulgaciones, la presencia/ausencia y/o la cantidad/niveles de expresión de un biomarcador en una primera muestra disminuyen o se reducen en comparación con la presencia y/o cantidad/niveles de expresión en una segunda muestra. En determinadas divulgaciones, la segunda muestra es una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. Las divulgaciones adicionales para determinar la presencia/ausencia y/o la cantidad/niveles de expresión de un gen se describen en el presente documento.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, la expresión elevada se refiere a un incremento global de aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor, a nivel de biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o ARNm)), detectado por procedimientos conocidos de la técnica estándar como los descritos en el presente documento, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En determinadas divulgaciones, la expresión elevada se refiere al incremento en la cantidad/nivel de expresión de un biomarcador en la muestra en el que el incremento es al menos aproximadamente cualquiera de 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X la cantidad/nivel de expresión del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En algunas divulgaciones, la expresión elevada se refiere a un incremento global mayor de aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,75 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,25 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 2,75 veces, aproximadamente 3,0 veces o aproximadamente 3,25 veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, tejido de control o control interno (por ejemplo, gen de mantenimiento).
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, la expresión reducida se refiere a una reducción global de aproximadamente cualquiera de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor, a nivel de biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o ARNm)), detectado por procedimientos conocidos de la técnica estándar como los descritos en el presente documento, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En determinadas divulgaciones, la expresión reducida se refiere a la disminución en la cantidad/nivel de expresión de un biomarcador en la muestra en el que la disminución es al menos aproximadamente cualquiera de 0,9X, 0,8X, 0,7X, 0,6X, 0,5X, 0,4X, 0,3X, 0,2X, 0,1X, 0,05X o 0,01X la cantidad/nivel de expresión del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control.
La presencia y/o la cantidad/nivel de expresión de diversos biomarcadores en una muestra se pueden analizarse por una serie de metodologías, de las que muchas son conocidas en la técnica y se entienden por el experto en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, inmunohistoquímica ("IHQ"), análisis de inmunoelectrotransferencia, inmunoprecipitación, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA, separación celular activada por fluorescencia ("FACS"), MassARRAY, proteómica, ensayos cuantitativos a base de sangre (como por ejemplo ELISA en suero), ensayos de actividad enzimática bioquímica, hibridación in situ, Análisis de Southern, análisis Northern, secuenciación del genoma completo, reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") incluyendo PCR cuantitativa en tiempo real (''qRT-PCR'') y otros procedimientos de detección de tipo de amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares), sec-ARN, FISH, análisis de micromatrices, perfil de expresión génica y/o análisis en serie de expresión génica ("SAGE"), así como uno cualquiera de la amplia variedad de ensayos que puede realizar por análisis de matrices de proteínas, genes y/o tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de genes y productos génicos se encuentran, por ejemplo, en Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia de Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis de PCR). También se pueden usar inmunoensayos multiplexados tales como los disponibles de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery ("MSD").
En algunas divulgaciones, la presencia y/o la cantidad/nivel de expresión de un biomarcador se determina usando un procedimiento que comprende: (a) realizar perfiles de expresión génica, PCR (tal como rtPCR o qRT-PCR), sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY o FISH en una muestra (tal como una muestra de cáncer del sujeto); y b) determinar la presencia y/o la cantidad/nivel de expresión de un biomarcador en la muestra. En algunas divulgaciones, el procedimiento de micromatrices comprende el uso de una micromatriz que tiene una o más moléculas de ácido nucleico que se pueden hibridar en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que codifica un gen mencionado anteriormente o que tiene uno o más polipéptidos (tales como péptidos o anticuerpos) que se pueden unir a una o más de las proteínas codificadas por los genes mencionados anteriormente. En una divulgación, el procedimiento de PCR es qRT-PCR. En una divulgación, el procedimiento de PCR es PCR múltiple. En algunas divulgaciones, la expresión génica se mide por micromatrices. En algunas divulgaciones, la expresión génica se mide por qRT-PCR. En algunas divulgaciones, la expresión se mide por PCR múltiple.
Los procedimientos para la evaluación de ARNm en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementarias (tales como hibridación in situ usando ribosondas marcadas específicas para el uno o más genes, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para uno o más de los genes, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares).
Las muestras de mamíferos se pueden someter a ensayo convenientemente para determinar los ARNm usando análisis Northern, de inmunotransferencia por puntos o de PCR. Además, dichos procedimientos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de ARNm diana en una muestra biológica (por ejemplo, examinando simultáneamente los niveles de una secuencia de ARNm de control comparativo de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de la actina). Opcionalmente, se puede determinar la secuencia del ADNc diana amplificado.
Los procedimientos opcionales incluyen protocolos que examinan o detectan ARNm, tales como ARNm diana, en una muestra tisular o celular por tecnologías de micromatrices. Usando micromatrices de ácido nucleico, las muestras de ARNm de prueba y control de las muestras tisulares de prueba y control se transcriben inversamente y se marcan para generar sondas de ADNc. A continuación las sondas se hibridan con una matriz de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. La matriz se configura de modo que la secuencia y la posición de cada miembro de la matriz son conocidas. Por ejemplo, una selección de genes con expresión que se correlaciona con un incremento o reducción en el beneficio clínico del tratamiento antiangiogénico se puede disponer en una matriz en un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro de matriz particular indica que la muestra de la que se derivó la sonda expresa ese gen.
De acuerdo con algunas divulgaciones, la presencia y/o la cantidad/nivel de expresión se mide observando los niveles de expresión de proteína de un gen mencionado anteriormente. En determinadas divulgaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con anticuerpos con un biomarcador (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-L1) descrito en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del biomarcador, y detectar si se forma un complejo entre los anticuerpos y el biomarcador. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En una divulgación, se usa un anticuerpo para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con antagonista de unión al eje PD-L1, por ejemplo, un biomarcador para la selección de individuos.
En determinadas divulgaciones, la presencia y/o la cantidad/nivel de expresión de proteínas biomarcadoras en una muestra se examina usando IHQ y protocolos de tinción. Se ha demostrado que la tinción IHQ de secciones tisulares es un procedimiento fiable de determinación o detección de la presencia de proteínas en una muestra. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el biomarcador PD-L1 es PD-L1. En algunas divulgaciones, PD-L1 se detecta por inmunohistoquímica. En algunas divulgaciones, la expresión elevada de un biomarcador PD-L1 en una muestra de un individuo es expresión de proteína elevada y, en otras divulgaciones, se determina usando IHQ. En una divulgación, el nivel de expresión del biomarcador se determina usando un procedimiento que comprende: (a) realizar un análisis IHQ de una muestra (tal como una muestra de cáncer del sujeto) con un anticuerpo; y b) determinar el nivel de expresión de un biomarcador en la muestra. En algunas divulgaciones, la intensidad de tinción IHQ se determina en relación con una referencia. En algunas divulgaciones, la referencia es un valor de referencia. En algunas divulgaciones, la referencia es una muestra de referencia (por ejemplo, muestra de tinción de línea celular de control o muestra tisular de paciente no canceroso).
La IHQ se puede realizar en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridación in situ con fluorescencia. Están disponibles dos procedimientos generales de IHQ; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, la unión del anticuerpo al antígeno diana se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado, tal como una marca fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzima, que se puede visualizar sin interacción de anticuerpo adicional. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y a continuación un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga con un marcador enzimático, se añade un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. La amplificación de señal se produce porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario.
El anticuerpo primario y/o secundario usado para IHQ típicamente se marcará con un resto detectable. Están disponibles numerosos marcadores que se pueden agrupar en general en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I; (b) partículas de oro coloidales; (c) marcadores fluorescentes incluyendo, pero sin limitarse a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio), Texas Red, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficoeritina, ficocianina o fluoróforos disponibles comercialmente tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de uno cualquiera o más de los anteriores; (d) están disponibles diversos marcadores enzima-sustrato y la patente de EE. UU. n.° 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de ellos. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares.
Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato; fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromogénico; y p-D-galactosidasa (p-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil-p-D-galactosidasa). Para una revisión general de estos, véanse las patentes de EE. UU. n.° 4.275.149 y 4.318.980.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, PD-L1 se detecta por inmunohistoquímica usando un anticuerpo de diagnóstico anti-PD-L1 (es decir, anticuerpo primario). En algunas divulgaciones, el anticuerpo de diagnóstico PD-L1 se une específicamente a PD-L1 humano. En algunas divulgaciones, el anticuerpo de diagnóstico PD-L1 es un anticuerpo no humano. En algunas divulgaciones, el anticuerpo de diagnóstico PD-L1 es un anticuerpo de rata, ratón o conejo. En algunas divulgaciones, el anticuerpo de diagnóstico PD-L1 es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones, el anticuerpo de diagnóstico PD-L1 se marca directamente.
Las muestras así preparadas se pueden montar y cubrir. A continuación se determina la evaluación del portaobjetos, por ejemplo, usando un microscopio, y se pueden emplear criterios de intensidad de tinción, usados habitualmente en la técnica. En una divulgación, se entiende que cuando se examinan células y/o tejidos de un tumor usando IHQ, la tinción en general se determina o evalúa en células y/o tejidos tumorales (a diferencia del tejido estromal o circundante que puede estar presente en la muestra). En algunas divulgaciones, se entiende que cuando se examinan células y/o tejido de un tumor usando IHQ, la tinción incluye la determinación o evaluación en células inmunitarias infiltrantes de tumor, incluyendo células inmunitarias intratumorales o peritumorales. En algunas divulgaciones, la presencia de un biomarcador PD-L1 se detecta por IHQ en un >0 % de la muestra, en al menos un 1 % de la muestra, en al menos un 5 % de la muestra, en al menos un 10 % de la muestra.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, la presencia de un biomarcador PD-L1 se detecta por IHQ con tinción PD-L1 de cualquier intensidad. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta por IHQ como una intensidad de tinción débil. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta por IHQ como una intensidad de tinción moderada. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta por IHQ como una intensidad de tinción fuerte.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta por IHQ en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor y combinaciones de las mismas.
Los anticuerpos anti-PD-L1 adecuados para su uso en IHQ son bien conocidos en la técnica. Un experto en la técnica entiende que los anticuerpos anti-PD-L1 adicionales adecuados se pueden identificar y caracterizar comparándolos con los anticuerpos anti-PD-L1 usando el protocolo IHQ divulgado en el presente documento, por ejemplo.
Los controles de tejido positivo se ejemplifican usando placenta y tejidos de amígdala (intensidad de tinción PD-L1 fuerte); células HEK-293 transfectadas con PD-L1 humano recombinante (grados variables de intensidad de tinción PD-L1 de intensidad débil, moderada y fuerte). Se puede hacer referencia a lo siguiente para criterios IHQ de PD-L1 ejemplares.
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En algunas divulgaciones, los criterios para la evaluación diagnóstica IHQ de PD-L1 se proporcionan como sigue:
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En procedimientos alternativos, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador en condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-biomarcador, y a continuación detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador se puede detectar de varias formas, tales como por inmunoelectrotransferencia y procedimientos ELISA para someter a ensayo una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Está disponible una amplia gama de técnicas de inmunoensayo que usan un formato de ensayo de este tipo, véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Estas incluyen ensayos tanto de un solo sitio como de dos sitios o "sandwich" de los tipos no competitivos, así como en los ensayos de unión competitiva tradicionales. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un anticuerpo marcado a un biomarcador diana.
La presencia y/o cantidad/nivel de expresión de un biomarcador seleccionado en una muestra tisular o celular también se puede examinar por medio de ensayos funcionales o basados en actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden realizar ensayos conocidos en la técnica para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra tisular o celular.
En determinadas divulgaciones, las muestras se normalizan tanto para las diferencias en la cantidad del biomarcador analizado como para la variabilidad en la calidad de las muestras usadas, y la variabilidad entre los ciclos de ensayo. Dicha normalización se puede lograr detectando e incorporando la expresión de determinados biomarcadores de normalización, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos. De forma alternativa, la normalización se puede basar en la señal media o mediana de todos los genes sometidos a ensayo o en un gran subconjunto de los mismos (enfoque de normalización global). En una base de gen por gen, la cantidad normalizada medida de un ARNm o proteína tumoral del sujeto se compara con la cantidad encontrada en un conjunto de referencia. Los niveles de expresión normalizados para cada ARNm o proteína por tumor sometido a prueba por sujeto se pueden expresar como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. La presencia y/o cantidad/nivel de expresión medido en una muestra de sujeto particular que se va a analizar caerá en algún percentil dentro de este intervalo, que se puede determinar por procedimientos bien conocidos en la técnica.
En una divulgación, la muestra es una muestra clínica. En otra divulgación, la muestra se usa en un ensayo de diagnóstico. En algunas divulgaciones, la muestra se obtiene de un tumor primario o metastásico. La biopsia de tejido se usa a menudo para obtener una porción representativa de tejido tumoral. De forma alternativa, se pueden obtener células tumorales indirectamente en forma de tejidos o líquidos que se sabe o se cree que contienen las células tumorales de interés. Por ejemplo, se pueden obtener muestras de lesiones de cáncer de pulmón por resección, broncoscopia, aspiración con aguja fina, cepillado bronquial o de esputo, líquido pleural o sangre. Se pueden detectar genes o productos génicos de cáncer o tejido tumoral o de otras muestras corporales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas analizadas anteriormente para la detección de genes o productos génicos diana en muestras cancerosas se pueden aplicar a otras muestras corporales. Las células cancerosas se pueden desprender de lesiones cancerosas y aparecer en dichas muestras corporales. Al cribar dichas muestras corporales, se puede lograr un diagnóstico precoz simple para estos cánceres. Además, el progreso del tratamiento se puede seguir más fácilmente sometiendo a prueba dichas muestras corporales para detectar genes o productos génicos diana.
En determinadas divulgaciones, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control es una única muestra o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o individuo que se obtienen en uno o más puntos temporales diferentes a cuando se obtiene una muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene en un punto temporal temprano del mismo sujeto o individuo a cuando se obtiene la muestra de prueba. Dicha muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control puede ser útil si la muestra de referencia se obtiene durante el diagnóstico inicial de cáncer y la muestra de prueba se obtiene más tarde cuando el cáncer se vuelve metastásico.
En determinadas divulgaciones, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control son muestras múltiples combinadas de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o individuo. En determinadas divulgaciones, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control son muestras múltiples combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o individuo. En determinadas divulgaciones, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control son muestras de ARN agrupadas de tejidos normales o muestras de plasma o suero agrupadas de uno o más individuos que no son el sujeto o individuo. En determinadas divulgaciones, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control son muestras de ARN agrupadas de tejidos tumorales o muestras de plasma o suero agrupadas de uno o más individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o individuo.
En algunas divulgaciones, la muestra es una muestra tisular del individuo. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es una muestra de tejido tumoral (por ejemplo, tejido de biopsia). En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido pulmonar. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido renal. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido cutáneo. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido pancreático. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido gástrico. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido vesical. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido esofágico. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido mesotelial. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido mamario. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido tiroideo. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido colorrectal. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido de cabeza y cuello. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido de osteosarcoma. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido prostático. En algunas divulgaciones, la muestra tisular es tejido ovárico, CHC (hígado), glóbulos sanguíneos, ganglios linfáticos, hueso/médula ósea.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, la enfermedad o trastorno es un tumor. En algunas divulgaciones, el tumor es un tumor canceroso maligno (es decir, cáncer). En algunas divulgaciones, el tumor y/o cáncer es un tumor sólido o un tumor de tejido blando o no sólido. Los ejemplos de tumores de tejido blando incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica aguda de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica, leucemia prolinfocítica o tricoleucemia) o linfoma (por ejemplo, linfoma no hodgkiniano, linfoma cutáneo de linfocitos T o enfermedad de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de tejidos corporales distintos de sangre, médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos se pueden dividir además en los de origen en células epiteliales y los de origen en células no epiteliales. Los ejemplos de tumores sólidos de células epiteliales incluyen tumores del tubo gastrointestinal, colon, colorrectal (por ejemplo, carcinoma colorrectal basaloide), mama, próstata, pulmón, riñón, hígado, páncreas, ovario (por ejemplo, carcinoma ovárico endometrioide), cabeza y cuello, cavidad bucal, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órgano genital masculino, órganos urinarios (por ejemplo, carcinoma de urotelio, carcinoma de urotelio displásico, carcinoma de células de transición), vejiga y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores óseos. En algunas divulgaciones, el cáncer es carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM). En algunas divulgaciones, el cáncer es carcinoma de pulmón no microcítico localmente avanzado o metastásico de segunda línea o tercera línea. En algunas divulgaciones, el cáncer es el adenocarcinoma. En algunas divulgaciones, el cáncer es el carcinoma de células escamosas.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en FACS, inmunoelectrotransferencia, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, inmunotransferencia por puntos, procedimientos de inmunodetección, HPLC, resonancia de plasmón superficial, espectroscopía óptica, espectrometría de masas, HPLC, qPCR, RT-qPCR, RT-qPCR o qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY y FISH, y combinaciones de los mismos. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta por análisis FACS. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 es PD-L1. En algunas divulgaciones, la expresión de PD-L1 se detecta en muestras de sangre. En algunas divulgaciones, la expresión de PD-L1 se detecta en células inmunitarias circulantes en muestras de sangre. En algunas divulgaciones, la célula inmunitaria circulante es un linfocito T CD3+/CD8+. En algunas divulgaciones, antes del análisis, las células inmunitarias se aíslan de las muestras de sangre. Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para aislar/enriquecer dicha población de células incluyendo, pero sin limitarse a, separación celular. En algunas divulgaciones, la expresión de PD-L1 se eleva en muestras de individuos que responden al tratamiento con un inhibidor de la vía del eje PD-L1/PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas divulgaciones, la expresión de PD-L1 se eleva en las células inmunitarias circulantes, tales como los linfocitos T CD3+/CD8+, en muestras de sangre.
PROCEDIMIENTOS TERAPÉUTICOS
Se proporcionan procedimientos para tratar una enfermedad o trastorno en un individuo, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo y administrar una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-L1 al individuo.
En el presente documento se proporciona además tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-L1, en el que el tratamiento se basa en la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 es un marcador inmunomediado. Un marcador inmunomediado se refiere a un marcador que se expresa por células inmunitarias o por otras células (por ejemplo, células tumorales, células endoteliales, fibroblastos u otras células estromales). Si se expresa por células distintas de las inmunitarias, el marcador puede estar implicado en la regulación de la biología y función de las células inmunitarias, tal como activación, cebado, reconocimiento y presentación de antígenos, producción de citocinas y quimiocinas, proliferación, migración, supervivencia, producción de anticuerpos y otras. En algunas divulgaciones, el marcador inmunomediado es un marcador relacionado con linfocitos T. En algunas divulgaciones, el marcador relacionado con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A, CXCL9 y cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, el marcador inmunomediado se selecciona del grupo que consiste en CX3CL1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC-A, MIC-B, CTLA-4 y cualquier combinación de los mismos.
En algunas divulgaciones, la presencia de un biomarcador PD-L1 indica que es probable que el individuo tenga un incremento en el beneficio clínico cuando se trata al individuo con el antagonista de unión al eje PD-L1. En algunas divulgaciones, el incremento en el beneficio clínico comprende un incremento relativo en uno o más de los siguientes: supervivencia global (SG), supervivencia sin progresión (SSP), respuesta completa (RC), respuesta parcial (RP) y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está ausente de la muestra cuando comprende un 0 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en la muestra cuando comprende más de un 0 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 1 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 5 % de la muestra. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 está presente en al menos un 10 % de la muestra.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en FACS, inmunoelectrotransferencia, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, inmunotransferencia por puntos, procedimientos de inmunodetección, HPLC, resonancia de plasmón superficial, espectroscopía óptica, espectrometría de masas, HPLC, qPCR, RT-qPCR, RT-qPCR o qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY y FISH, y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de proteína. En algunas divulgaciones, la expresión de proteína se determina por inmunohistoquímica (IHQ). En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta usando un anticuerpo anti-PD-L1.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción débil por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción moderada por IHQ. En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta como una intensidad de tinción fuerte por IHQ.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor o combinaciones de las mismas usando análisis de expresión de proteína, tal como análisis IHQ. Las células inmunitarias infiltrantes de tumor incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias intratumorales, células inmunitarias peritumorales o cualquier combinación de las mismas, otras células estromales tumorales (por ejemplo, fibroblastos). Dichas células inmunitarias infiltrantes de tumor pueden ser linfocitos T (tales como linfocitos T CD8+ y/o linfocitos T CD4+), linfocitos B u otras células de linaje de médula ósea, incluyendo granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos), monocitos, macrófagos, células dendríticas (es decir, células dendríticas interdigitantes), histiocitos y linfocitos citolíticos naturales.
En algunas divulgaciones, la tinción para el biomarcador PD-L1 se detecta como tinción de membrana, tinción citoplásmica y combinaciones de las mismas. En otras divulgaciones, la ausencia del biomarcador PD-L1 se detecta como ausente o sin tinción en la muestra.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico. En algunas divulgaciones, la expresión de ácido nucleico se determina usando qPCR, rtPCR, sec-ARN, RT-qPCR o qPCR múltiple, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY o FISH.
En algunas divulgaciones, el biomarcador PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales y combinaciones de las mismas usando expresión de ácido nucleico tal como análisis de qPCR.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-L1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión a ligando. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a ambos PD-1 y B7-1.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión a ligando. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L2. En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, ensayos y/o kits, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a ambos PD-L1 y PD-L2.
Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-LI útiles para los procedimientos de la presente invención y los procedimientos para preparar los mismos se describen en la solicitud de patente PCT WO 2010/077634 A1.
En algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 puede inhibir la unión entre PD-L1 y PD-1 y/o entre PD-L1 y B7-1. En algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal. En algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humanizado. En algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humano.
En una divulgación, el anticuerpo anti-PD-L1 contiene un polipéptido de región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en la que:
(a) la secuencia de HVR-H1 es trL’ li 'S X IS W lii (SEQ ID NO:1)
(b) la secuencia de HVR-H2 es IX2P’t ( j(.jSX3'í "t ÁDSVKG (SEQ ID NO:2)
(c) la secuencia de HVR-H3 es l( HWI’flG H ■> • (SEQ ID NO:3)
en la que además: X1 es D o G; X2 es S o L; X3 es T o S.
En un aspecto específico, X1 es D; X2 es S y X3 es T. En otro aspecto, el polipéptido comprende además secuencias estructurales de cadena pesada de región variable yuxtapuestas entre las HVR de acuerdo con la fórmula: (HC-FR1 )-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. En otro aspecto, las secuencias estructurales son la secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, al menos una de las secuencias estructurales es la siguiente:
HC-FR1 es EVQLVESGCICLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:4)
HC-FR2 es W V RQ A PCi KGLEWV (SEQ ID NO:5)
HC-FR3 es RFTIS ADTSKNTA YLQAtNSLRAEDTAVYY(LAR (SEQ ID NO:6)
HC-FR4 es WGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:7).
Todavía en otro aspecto, el polipéptido de cadena pesada se combina además con una cadena ligera de la región variable que comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en la que:
(a) la secuencia de HVR-L1 es
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(SEQ ID NO.8),
(b) la secuencia de HVR-L2 es SASX9T.X10S, (SEQ ID NO:9);
(c) la secuencia de HVR-L3 es QQXI I X 11 \ I JtX 14PX151 (SEQ ID NO: 10);
en la que además: X4 es D o V; X5 es V o I; X6 es S o N; X7 es A o F; X8 es V o L; X9 es F o T; X10 es Y o A; X11 es Y, G, F, o S; X12 es L, Y, F o W; X13 es Y, N, A, T, G, F o I; X14 es H, V, P, T o I; X15 es A, W, R, P o T.
Todavía en otro aspecto, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H; X15 es A. Todavía en otro aspecto, la cadena ligera comprende además secuencias estructurales de la cadena ligera de la región variable yuxtapuestas entre las HVR de acuerdo con la fórmula: (LC-FR1 )-(HVR-L1 )-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales son una estructura consenso de kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, al menos una de las secuencias estructurales es la siguiente:
LC-FR1 es mQMTQSPSST.SASVGDRVTTTC (SEQ ID NO:11)
LC-FR2 es WX QQKPGKAPKLL i Y (SEQ ID NO:12)
LC-FR3 es f*VPSRFSC5SíiSC5TDFTLTISSLQPLDFATYYC: (SEQ ID NO:13)
LC-FR4 es FOQGTKVE1KR (SEQ ID NO:14).
En otra divulgación, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en la que:
(a) la cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en la que además:
(i) la secuencia de HVR-H1 es CFTFSX.1SWIH; (SEQ ID NO:1) (¡i) la secuencia de HVR-H2 es AWIX2i’ VCiüSX3Vl ADSy k G (SEQ ID NO:2)
(iii) la secuencia de HVR-H3 es RHWI’ GGEIYY y (SEQ ID NO:3)
(b) la cadena ligera comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en la que además:
(i) la secuencia de HVR-L1 es RASQX4X í X íiTX7XbA (SEQ ID NO:8)
(¡i) la secuencia de HVR-L2 es SASXDLX1 OS; y (SEQ ID NO:9)
(¡II) la secuencia de HVR-L3 es P IXJ2XJ3XI-IPXI5T: (SEQ ID NO:10)
en la que además: X1 es D o G; X2 es S o L; X3 es T o S; X4 es D o V; X5 es V o I; X6 es S o N; X7 es A o F; X8 es V o L; X9 es F o T; X10 es Y o A; X11 es Y, G, F, o S; X12 es L, Y, F o W; X13 es Y, N, A, T, G, F o I; X14 es H, V, P, T o I; X15 es A, W, R, P o T.
En un aspecto específico, X1 es D; X2 es S y X3 es T. En otro aspecto, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H; X15 es A. Aún en otro aspecto, X1 es D; X2 es S y X3 es T, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es Y; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y;X12 es L; X13 es Y; X14 es H y X15 es A.
En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada es la siguiente:
HC-FR1 E VQL VESGGGL VQPCGSLRLSC AAS (SEQ ID NO:4)
HC-FR2 WVR.QAPGKGLEWV (SEQ ID NO:5)
HC-FR3 Rt-IESAÜlSKNl AYLQMXfiLRALDTAVYYf A li (SEQ ID NO:6)
FIC-FR4 WCqüTLVTVSA (SEQ ID NO:7).
Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la secuencia estructural consenso kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera es la siguiente:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:11)
LC-FR2 WYQQKPGKAi’KDUY (SEQ ID NO:12)
LC- FR3 G VP£K h'SGS GSG' l D KTLTJ $ S LQJ ’E D KATY YC (SEQ ID NO:13)
LC-FR4 FGQGIKVEJKR (SEQ ID NO:14).
Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo comprende además una región constante humana o murina. Todavía en otro aspecto, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Todavía en otro aspecto específico, la región constante humana es IgG1. Todavía en otro aspecto, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Todavía en otro aspecto, la región constante murina es IgG2A. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc sin efector" o aglucosilación. Todavía en otra divulgación, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.
Aún en otra divulgación, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en la que:
(a) la cadena pesada comprende además una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y una HVR-H3 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con O t i-'SljSw ih (SEQ ID NO:15), a w íSf y GGS'í 'YYADSv k g (SEQ ID NO:16) y rh WPGüH'UY (SEQ ID NO:3), respectivamente, o
(b) la cadena ligera comprende además una secuencia de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con RASQüVSTAVA (SEQ ID NO:17), SASFLYS (SEQ ID NO:18) y QQvlyhl-at (SEQ |D NO: 19), respectivamente.
En un aspecto específico, la identidad de secuencia es de un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada es la siguiente:
H C- F R1 EVQT .VEÍüCtGCtT.YQFGG&I BRESCA AS (SEQ ID NO:4)
HC-FR2 WVR' Q A PGK GT. EW V (SEQ ID NO:5)
HC- FR3 R FTTS ÁTJTS KTNTAyi .Qfvf'JS T .R AET>TAVYYC A R (SEQ ID NO:6)
HC-FR4 WGQGTLYTYSA (SEQ ID NO:7).
Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la secuencia estructural consenso kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera es la siguiente:
LC- FR1 D SQV1TQSPS 5 í S VGFi R YT1TO (SEQ ID NO:11)
LC- FR2 \VY QQKPGK A PK [ .T JY (SEQ ID NO:12)
LC-FR3 G VTSK.KSG3ÜSÜUJKL LTJSSUiíPEUhA I'Y YC (SEQ ID NO:13)
LC-FR4 t'GQft'l kVtJKK. (SEQ ID NO:14).
Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo comprende además una región constante humana o murina. Todavía en otro aspecto, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Todavía en otro aspecto específico, la región constante humana es IgG1. Todavía en otro aspecto, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Todavía en otro aspecto, la región constante murina es IgG2A. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc sin efector" o aglucosilación. Todavía en otra divulgación, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.
Todavía en otra divulgación, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en la que:
(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada: EVQL YESGOOLVC)PG<?$IIU.SCAa SG FTFSDSWlH\\VRQ-\rGKGLEWVAWls PYGGSTYYADSVKGRFT1SADTSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCARRTIWPGGFDYWGQGT [.VTVSA (SEQ ID NO:20), o
(b) la secuencia de la cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera: DTQMTQSPSST.SASVGDRVT1TCRAS QDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASF L YSGVTSRFSGSGSGI DK1L11SSL QPEDt'A'l'YIfCQQY'■vHFA'IF'GQÍjTKV tiKR (SEQ ID NO:21).
En un aspecto específico, la identidad de secuencia es de un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. En otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada es la siguiente:
HC-FR1 RVQi.VhíitKKtLA-'gPfKíSUil.SÍ'AAS (SEQ ID NO:4)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:5) H C -FR 3 RFTIKA DTSJCNTAY LQM N S L R A E D T A V Y Y C A R (SEQ ID NO:6)
H C -FR 4 W G Q G T L V T V S A (SEQ ID NO:7).
Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la secuencia estructural consenso kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera es la siguiente:
L C - F R 1 D T Q M T Q S P S S L S A 5 V G D R V T T T C (SEQ ID NO:11)
LC- FR2 W YQQ K.PGKAPKL 1,FY (SEQ ID NO:12)
LC-FR3 G YPSRF.SG £G SGTDFTLTI55 LQPEDF ATYYC (SEQ ID NO:13)
LC-FR4 FGQGTKVEHCR (SEQ ID NO:14).
Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo comprende además una región constante humana o murina. Todavía en otro aspecto, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Todavía en otro aspecto específico, la región constante humana es IgG1. Todavía en otro aspecto, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Todavía en otro aspecto, la región constante murina es IgG2A. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de la producción en células procariotas. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc sin efector" o aglucosilación. Todavía en otra divulgación, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.
Todavía en otra divulgación, la divulgación proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos anteriormente en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Todavía en otra divulgación, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de la región variable de la cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-L1, en la que:
(a) la cadena pesada comprende además una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y una HVR-H3 que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con GFTFSDSWíh (SEQ ID NO:15), A w J 811Y íitiSTY Y A ds v K £í (SEQ ID NO:16) y (SEQ ID NO:3), respectivamente, y
(b) la cadena ligera comprende además una secuencia de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con KASQDVSTAV A (SEQ ID NO:17), SASFLYS (SEQ ID NO:18) y W V LY ílPA T (SEQ ID NO:19), respectivamente.
En un aspecto específico, la identidad de secuencia es de un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En un aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. En otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada es la siguiente:
HC-FR1 E VQL VESG G GL VQPG G SLRLSÜAAS (SEQ ID NO:4)
HC-FR2 WVE.QAPGKGLEWV (SEQ ID NO:5)
HC-FR3 RFTIS ADTS lOJTAYLQMN'SLEAEDT AVYY CAR (SEQ ID NO:6)
HC-FR4 WGQGTLVTV5A (SEQ ID NO:7).
Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son la secuencia estructural consenso kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera es la siguiente:
LC- FR 1 DIQMTQSP S 5 LS A S VGDRVTTTC (SEQ ID NO:11)
LC-FR2 ÍV YQQKPC K AP KL LIY (SEQ ID NO:12) LC-FR3 C¡ Y PÍS^TSE! SCi SÜTD FTLTlSbLQPEDFAT Y Y C (SEQ ID NO:13)
LC-FR4 t QQG i'K:V H1KÜ (SEQ ID NO:14).
Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo comprende además una región constante humana o murina. Todavía en otro aspecto, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Todavía en otro aspecto específico, la región constante humana es IgG1. Todavía en otro aspecto, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Todavía en otro aspecto, la región constante murina es IgG2A. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de la producción en células procariotas. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc sin efector" o aglucosilación. Todavía en otro aspecto, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.
Todavía en otro aspecto, el ácido nucleico comprende además un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos previamente. Todavía en otro aspecto específico, el vector comprende además una célula huésped adecuada para la expresión del ácido nucleico. Todavía en otro aspecto específico, la célula huésped es una célula eucariota o una célula procariota. Todavía en otro aspecto específico, la célula eucariota es una célula de mamífero, tal como de ovario de hámster chino (CHO).
El anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede preparar usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped que contiene ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno descritos previamente en una forma adecuada para la expresión, en condiciones adecuadas para producir dicho anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento. Todavía en otra divulgación, la divulgación proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno del mismo como se proporciona en el presente documento y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
A. Anticuerpos
1. Afinidad de anticuerpos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM. En una divulgación, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fabs por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoración de antígeno no marcado, a continuación capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 0C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezclan [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (Tw Ee N-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se hayan secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™, Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra divulgación, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 0C con micromatrices CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan micromatrices de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc) con clorhidrato de N-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie en dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 0C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación excede 106 M-1s-1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 0C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medida en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 , Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión a receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas incluyendo pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase respecto de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenia en seres humanos, mientras se mantienen la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas divulgaciones, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.25.821.337, 7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe "rebarnizado"); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "reordenamiento de f R"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones marco seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Cárter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras humanas (somáticamente mutadas) o regiones estructurales de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas de cribado de colecciones de f R (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Anticuerpos humanos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan a los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429, que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humanos-humanos). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.
5. Anticuerpos derivados de colecciones
Se pueden aislar anticuerpos cribando colecciones combinatorias para determinar los anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para determinar los fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad por el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
6. Anticuerpos multiespecíficos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinadas divulgaciones, una de las especificidades de unión es por PD-L1 y la otra es por cualquier otro antígeno. En determinadas divulgaciones, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de PD-L1. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expresan PD-L1. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véanse Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodímeras de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véanse, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a PD-L1 así como otro antígeno diferente.
7. Variantes de anticuerpo
a) Variantes de glucosilación
En determinadas divulgaciones, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo se puede conseguir convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se creen o eliminen uno o más sitios de glucosilación.
Si el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que en general se fija por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TlBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunas divulgaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.
En una divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura carbohidratada que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración Eu de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "carentes de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A 1 , Presta, L; y documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., en especial el ejemplo 11), y líneas celulares con genes inactivados, tales como células CHO con el gen FUT8, de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, inactivado (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y documento WO2003/085107).
Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
b) Variantes de la región Fc
En determinadas divulgaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
En determinadas divulgaciones, la divulgación contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (que carece por tanto probablemente de actividad ADCC), pero mantiene su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et a l, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (véanse Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicional, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y carece por tanto de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). La unión a FcRn y determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo también se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a los FcR. (Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.26.737.056; WO 2004/056312, y Shields et a l, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En determinadas divulgaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos). En algunas divulgaciones, se realizan las alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o reducidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con un incremento en las semividas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311,312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo de la región Fc 434 (patente de EE. UU. n.° 7.371.826). Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de EE. UU. n.° 5.648.260; la patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
c) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína
En determinadas divulgaciones, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En divulgaciones particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinadas divulgaciones, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se pueden sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.27.521.541.
d) Inmunoconjugados
Además, se proporcionan en el presente documento inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-PD-L1 conjugado en el presente documento con uno o más agentes citotóxicos, tales como fármacos o agentes quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radiactivos.
En una divulgación, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) en el que un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a un maitansinoide (véanse las patentes de e E. UU. n.° 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como los restos de fármaco monometilauristatina DE y d F (MMAE y Mm AF) (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701,5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otra divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Están disponibles una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc99 o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Se pueden preparar conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-acido (tales como bis(p-acidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
C. Polipéptidos de unión
Los polipéptidos de unión son polipéptidos que se unen, preferentemente de forma específica, a PD-L1 como se describe en el presente documento. En algunas divulgaciones, los polipéptidos de unión son antagonistas de unión al eje PD-L1. Los polipéptidos de unión se pueden sintetizar químicamente usando una metodología de síntesis de polipéptidos conocida o se pueden preparar y purificar usando tecnología recombinante. Los polipéptidos de unión tienen normalmente al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, de forma alternativa al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud o más, en los que dichos polipéptidos de unión se pueden unir, preferentemente de forma específica, a una diana, PD-L1, como se describe en el presente documento. Los polipéptidos de unión se pueden identificar sin experimentación excesiva usando técnicas bien conocidas. A este respecto, cabe señalar que las técnicas para cribar colecciones de polipéptidos para la unión de polipéptidos que se pueden unir específicamente a una diana polipeptídica son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.25.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; publicaciones PCT n.° WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130­ 149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunoí, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
A este respecto, la presentación en bacteriófagos (fagos) es una técnica bien conocida que permite cribar grandes colecciones de polipéptidos para identificar el/los miembro(s) de esas colecciones que se pueden unir específicamente a un polipéptido diana, PD-L1. La presentación en fagos es una técnica por la que se presentan polipéptidos variantes como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento en la superficie de las partículas de bacteriófagos (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). La utilidad de la presentación en fagos reside en el hecho de que grandes colecciones de variantes de proteínas aleatorizadas selectivamente (o ADNc clonados aleatoriamente) se pueden separar rápida y eficazmente en las secuencias que se unen a una molécula diana con alta afinidad. Se ha usado la presentación de colecciones de péptidos (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) o proteínas (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fagos para cribar millones de polipéptidos u oligopéptidos para detectar los que tienen las propiedades de unión específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). La separación en colecciones de fagos de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad usando el receptor diana y un medio de evaluación de los resultados de los enriquecimientos de unión. Patentes de EE. UU. n.25.223.409, 5.403.484, 5.571.689 y 5.663.143.
Aunque la mayoría de los procedimientos de presentación en fagos han usado fagos filamentosos, también son conocidos los sistemas de presentación en fagos lambdoides (documentos WO 95/34683; US 5.627.024), sistemas de presentación en fagos T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de presentación en fagos T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); documento u S 5.766.905).
Las mejoras adicionales potencian la capacidad de los sistemas de presentación para cribar colecciones de péptidos para la unión a moléculas diana seleccionadas y para presentar proteínas funcionales con el potencial de cribar estas proteínas para las detectar las propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de presentación en fagos (documento WO 98/14277) y se han usado colecciones de presentación en fagos para analizar y controlar las interacciones bimoleculares (documentos WO 98/20169; WO 98/20159) y las propiedades de péptidos helicoidales restringidos (documento WO 98/20036). El documento WO 97/35196 describe un procedimiento para aislar un ligando de afinidad en el que una colección de presentación en fagos se pone en contacto con una solución en la que el ligando se unirá a una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no se unirá a la molécula diana, para aislar selectivamente ligandos de unión. El documento WO 97/46251 describe un procedimiento de biofijación de una colección de presentación en fagos aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y a continuación aislamiento del fago de unión, seguido de un procedimiento de microfijación usando pocillos de microplacas para aislar el fago de unión de alta afinidad. También se ha informado del uso de la proteína A de Staphlylococcus aureus como marca de afinidad (Li etal. (1998) Mol Biotech., 9:187). El documento WO 97/47314 describe el uso de colecciones de sustracción de sustrato para distinguir especificidades enzimáticas usando una colección combinatoria que puede ser una colección de presentación en fagos. Un procedimiento para seleccionar enzimas adecuadas para su uso en detergentes usando presentación en fagos se describe en el documento WO 97/09446. Los procedimientos adicionales para seleccionar proteínas de unión específicas se describen en las patentes de EE. UU. n.25.498.538, 5.432.018 y WO 98/15833.
Los procedimientos de generación de colecciones de péptidos y cribado de estas colecciones también se divulgan en las patentes de EE. UU. n.25.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426, 5.763.192 y 5.723.323.
D. Moléculas pequeñas de unión
En el presente documento se proporcionan moléculas pequeñas de unión para su uso como antagonista de molécula pequeña PD-L1.
Las moléculas pequeñas de unión son preferentemente moléculas orgánicas distintas de anticuerpos o polipéptidos de unión como se define en el presente documento que se unen, preferentemente de forma específica, a PD-L1 como se describe en el presente documento. Las moléculas pequeñas orgánicas de unión se pueden identificar y sintetizar químicamente usando metodología conocida (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT n.° WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas de unión tienen en general menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, de forma alternativa menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons de tamaño, en las que dichas moléculas pequeñas orgánicas que se pueden unir, preferentemente de forma específica, a un polipéptido como se describe en el presente documento, se pueden identificar sin experimentación excesiva usando técnicas bien conocidas. A este respecto, cabe señalar que las técnicas para cribar colecciones de moléculas pequeñas orgánicas para detectar moléculas que se pueden unir a un polipéptido diana son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT n.° WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas de unión pueden ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbacidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidracinas N-sustituidas, hidracidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos., ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aciridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, diazocompuestos, cloruros de ácidos o similares.
E. Polinucleótidos antagonistas
En el presente documento se proporcionan antagonistas polinucleotídicos. El polinucleótido puede ser un ácido nucleico antisentido y/o una ribozima. Los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia complementaria a al menos una porción de una transcripción de ARN de un gen PD-L1. Sin embargo, la complementariedad absoluta, aunque preferente, no se requiere.
Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN", a la que se hace referencia en el presente documento, quiere decir una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridarse al ARN, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido PD-L1 bicatenarios, se puede someter a prueba una hebra sencilla del ADN bicatenario o se puede analizar la formación de triplex. La capacidad para hibridar dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, cuanto mayor sea el ácido nucleico hibridante, más emparejamientos erróneos de bases con un ARN de PD-L1 puede contener y todavía formar un dúplex estable (o triplex, según sea el caso). Un experto en la técnica puede determinar un grado tolerable de emparejamiento erróneo por el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.
Los polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia no traducida 5' hasta e incluyendo el codón de iniciación AUG, deberían funcionar más eficazmente para inhibir la traducción. Sin embargo, también se ha demostrado que las secuencias complementarias a las secuencias no traducidas 3' de ARNm son eficaces para inhibir la traducción de ARNm además. Véase, en general, Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335. Por tanto, los oligonucleótidos complementarios a cualquiera de las regiones no codificantes no traducidas 5' o 3' del gen PD-L1, se podrían usar en un enfoque antisentido para inhibir la traducción del ARNm de PD-L1 endógeno. Los polinucleótidos complementarios a la región no traducida 5' del ARNm deben incluir el complemento del codón de inicio AUG.
Los polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones codificantes de ARNm son inhibidores menos eficaces de la traducción, pero se podrían usar de acuerdo con la divulgación. Ya sea si están diseñados para hibridarse con la región 5', 3' o codificante del ARNm de PD-L1, los ácidos nucleicos antisentido deben tener al menos seis nucleótidos de longitud, y preferentemente son oligonucleótidos que varían de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En divulgaciones específicas, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.
En una divulgación, el ácido nucleico antisentido PD-L1 se produce intracelularmente por transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una porción del mismo, se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) del gen PD-L1. Dicho vector contendría una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido PD-L1. Dicho vector puede permanecer episómico o integrarse cromosómicamente, siempre que se pueda transcribir para producir el ARN antisentido deseado. Dichos vectores se pueden construir por procedimientos de tecnología de ADN recombinante estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, víricos u otros conocidos en la técnica, usados para replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica PD-L1, o fragmentos de la misma, puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica que actúe en vertebrados, preferentemente células humanas. Dichos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambon, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor de timidina herpética (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:1441-1445 (1981), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)), etc.
F. Variantes de anticuerpos y polipéptidos de unión
En determinadas divulgaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptidos de unión se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de unión, o por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a diana.
En determinadas divulgaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos y/o variantes de polipéptidos de unión que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones conservadoras". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo y/o polipéptido de unión de interés y cribar los productos para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión de antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorados.
TABLA 1
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en “puntos calientes” de HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), sometiéndose a prueba la variante resultante VH o VL para determinar la afinidad de unión. La maduración de afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas divulgaciones de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se dirigen en particular CDR-H3 y CDR-L3.
En determinadas divulgaciones, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En determinadas divulgaciones de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones del anticuerpo y/o el polipéptido de unión que pueden ser dianas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" de acuerdo como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicional, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden dirigir o eliminar como candidatos para la sustitución. Se pueden cribar las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.
G. Derivados de anticuerpos y polipéptidos de unión
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo y/o polipéptido de unión proporcionado en el presente documento se pueden modificar además para contener restos no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo y/o polipéptido de unión incluyen pero no se limitan a polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(nvinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo y/o al polipéptido de unión puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo y/o polipéptido de unión que se van a mejorar, ya sea si el derivado del anticuerpo y/o derivado de polipéptido de unión se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otra divulgación, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y/o polipéptido de unión a un resto no proteico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En una divulgación, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que se destruyen células proximales al resto no proteico del polipéptido de unión y/o anticuerpo.
En algunas divulgaciones, la muestra es una muestra tisular. En algunas divulgaciones, la muestra es una muestra de tejido tumoral. En algunas divulgaciones, la muestra de tejido tumoral comprende células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células inmunitarias intratumorales, células inmunitarias peritumorales o cualquier combinación de las mismas, células estromales tumorales (por ejemplo, fibroblastos). En algunas divulgaciones, la muestra es de cáncer de un paciente. En algunas divulgaciones, la muestra se obtiene antes del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1. En algunas divulgaciones, la muestra se fija con formol y se incluye en parafina.
En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno proliferativo. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inmunomediado. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es cáncer. En algunas divulgaciones, el cáncer es carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer de células renales, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, mesotelioma, melanoma, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, osteosarcoma, cáncer de próstata o glioblastoma. En algunas divulgaciones, el cáncer es carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM). En algunas divulgaciones, el CPNM es CPNM localmente avanzado o metastásico de segunda o tercera línea. En algunas divulgaciones, el CPNM es adenocarcinoma. En algunas divulgaciones, el CPNM es carcinoma de células escamosas.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, el individuo de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores puede ser un ser humano.
En otra divulgación, se proporcionan en el presente documento procedimientos para tratar un cáncer. En una divulgación, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicho cáncer una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-L1. En una de dichas divulgaciones, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. En algunas divulgaciones, el individuo puede ser un ser humano.
El antagonista de unión al eje PD-L1 descrito en el presente documento se puede usar solo o en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un antagonista de unión al eje PD-L1 descrito en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. En determinadas divulgaciones, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterápico.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del antagonista se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de, la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional. El antagonista de unión al eje PD-L1 descrito en el presente documento también se puede usar en combinación con radioterapia.
Un antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo, polipéptido de unión y/o molécula pequeña) descrito en el presente documento (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación incluyendo pero sin limitarse a administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración intravenosa rápida, e infusión pulsada.
Los antagonistas de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo, polipéptido de unión y/o molécula pequeña) descritos en el presente documento se pueden formular, dosificar y administrar de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El antagonista del eje PD-L1 no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad del antagonista de unión al eje PD-L1 presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier ruta que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un antagonista de unión al eje PD-L1 descrito en el presente documento (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el antagonista de unión al eje PD-L1 se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previa, la anamnesis del paciente y la respuesta al antagonista de unión al eje PD-L1, y el criterio del médico especialista. El antagonista de unión al eje PD-L1 se administra adecuadamente al paciente al mismo tiempo o durante una serie de tratamientos. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Dichas dosis se pueden administrar de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del antagonista de unión al eje PD-L1). Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguido de una o más dosis menores. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas dosificación. La evolución de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los procedimientos, el antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) se administra a una dosificación de aproximadamente 0,3-30 mg/kg. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) se administra a una dosificación de aproximadamente cualquiera de 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg o 30 mg/kg. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1) se administra a una dosificación de aproximadamente cualquiera de 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 15 mg/kg, o 30 mg/kg en ciclos de 21 días. Se entiende que cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado en lugar de o además del antagonista de unión al eje PD-L1.
Las formulaciones farmacéuticas de un antagonista de unión al eje PD-L1 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de soluciones acuosas o formulaciones liofilizadas. En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 es una molécula pequeña de unión, un anticuerpo, polipéptido de unión y/o polinucleótido. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En una divulgación, se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Las formulaciones liofilizadas ejemplares se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de Ee . UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista de unión al eje PD-L1, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son, en general, estériles. Se puede lograr fácilmente la esterilidad, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado descrito en el presente documento en lugar de o además de un antagonista de PD-L1.
IDENTIFICACIÓN Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE BIOMARCADORES
En el presente documento se proporcionan procedimientos para identificar biomarcadores sensibles al tratamiento.
En algunas divulgaciones, se pueden identificar biomarcadores farmacodinámicos en base a una correlación o la relación definida entre los niveles de expresión de analito y los cambios positivos o negativos en la respuesta de un sujeto en relación con una o más respuestas de referencia pretratamiento. En algunas divulgaciones, se pueden medir niveles de expresión de analito en muestras recogidas de un sujeto antes, durante y después del tratamiento o intervención terapéutica.
Se pueden usar biomarcadores farmacodinámicos para, sin limitación, seguimiento del tratamiento y evaluación de la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, se pueden proporcionar niveles de biomarcadores farmacodinámicos a un médico para su uso para establecer o alterar un curso de tratamiento para un sujeto. Cuando se selecciona un tratamiento y se inicia el tratamiento, se puede realizar el seguimiento del sujeto periódicamente recogiendo muestras biológicas en dos o más intervalos, determinando una respuesta clínica correspondiente a un intervalo de tiempo dado pre, durante y postratamiento, y comparando la respuesta clínica con el tiempo. En base a estas respuestas y de cualquier tendencia observada con respecto al incremento, disminución o estabilización de las respuestas clínicas o cambios en los niveles de biomarcadores farmacodinámicos, un médico, terapeuta u otro profesional sanitario puede elegir continuar el tratamiento tal cual, retirar el tratamiento o ajustar el plan de tratamiento con el objetivo de ver mejoras con el tiempo.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan procedimientos para evaluar una respuesta al tratamiento de un individuo con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: (a) determinar el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en una muestra biológica derivada del individuo en un punto temporal durante o después de la administración del antagonista de unión al eje PD-L1; y (b) mantener, ajustar o detener el tratamiento del individuo en base a una comparación del/de los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica con los niveles de referencia, en el que un cambio en el/los nivel(es) de uno o más más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta al tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1.
En el presente documento se proporcionan además procedimientos para realizar un seguimiento de la respuesta de un individuo tratado con un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo dicho procedimiento: (a) determinar el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en una muestra biológica derivada del individuo en un punto temporal durante o después de la administración del antagonista de unión al eje PD-L1; y (b) comparar el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica con los niveles de referencia para realizar el seguimiento de la respuesta en los individuos sometidos a tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1.
En algunas divulgaciones, los niveles de referencia del uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en (1) el nivel del uno o más biomarcadores del individuo antes de la administración del antagonista de unión al eje PD-L1; (2) el nivel del uno o más biomarcadores de una población de referencia; (3) un nivel preasignado para el uno o más biomarcadores; y (4) el nivel del uno o más biomarcadores del individuo en un segundo punto temporal antes del primer punto temporal.
Para correlacionar y comparar la muestra biológica de un individuo con una población de referencia, es necesario obtener datos sobre las respuestas clínicas mostradas por una población de individuos que recibieron el tratamiento, es decir, una población clínica, antes y/o después del tratamiento con el antagonista de unión al eje PD-L1. Estos datos clínicos se pueden obtener por análisis retrospectivo de los resultados de un ensayo(s) clínico(s). De forma alternativa, los datos clínicos se pueden obtener diseñando y llevando a cabo uno o más ensayos clínicos nuevos. El análisis de los datos de población clínicos es útil para definir una población de referencia estándar que, a su vez, es útil para clasificar a los sujetos para la selección del tratamiento terapéutico, y/o clasificar a los sujetos como que muestran una respuesta positiva al tratamiento con un agonista de unión al eje PD-L1.
En algunas divulgaciones, el cambio en el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es un incremento en los niveles.
En algunas divulgaciones, el cambio en el/los nivel(es) de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es una disminución en los niveles.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, un incremento en uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en PD-L1, PD-1, PD-L2 y cualquier combinación de los mismos en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta positiva al tratamiento.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un marcador inmunomediado.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un marcador relacionado con linfocitos T.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un marcador de activación de linfocitos T.
En algunas divulgaciones, el marcador de activación de linfocitos T se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia.
En algunas divulgaciones, el marcador de activación de linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en un CD8, IFN-g, granzima-A, TNF-a, perforina y cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, un incremento en el marcador de activación de linfocitos T seleccionado del grupo que consiste en CD8, IFN-g, granzima-A, TNF-a, perforina y cualquier combinación de los mismos en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta positiva al tratamiento.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es un linfocito T en proliferación activado.
En algunas divulgaciones, el linfocito T en proliferación activado se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia.
En algunas divulgaciones, el linfocito T en proliferación activado es una célula CD8+/Ki67+, una célula CD8+/HLA-DR+/Ki67+ y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones, el uno o más biomarcadores es IL-6.
En algunas divulgaciones, el nivel de IL-6 disminuye en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia. En algunas divulgaciones, una disminución en el nivel de IL-6 en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia es indicativo de una respuesta positiva al tratamiento. En algunas divulgaciones, el nivel de IL-6 se incrementa en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia. En algunas divulgaciones, un incremento en el nivel de IL-6 en la muestra biológica en comparación con los niveles de referencia indica que no existe respuesta al tratamiento.
En algunas divulgaciones, la muestra biológica derivada del individuo se selecciona del grupo que consiste en una célula, un tejido, un cultivo de tejido, un tumor, un líquido biológico y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el líquido biológico se selecciona del grupo que consiste en plasma, suero, sangre completa, PBMC y combinaciones de los mismos.
En algunas divulgaciones, el tejido es un tejido tumoral.
En algunas divulgaciones, el tejido tumoral se selecciona del grupo que consiste en células tumorales, células infiltrantes de tumor, células estromales y cualquier combinación de las mismas.
En algunas divulgaciones, la célula es un célula tumoral circulante (CTC).
En algunas divulgaciones, el individuo padece una enfermedad o trastorno proliferativo.
En algunas divulgaciones, el individuo padece cáncer o neoplasia maligna.
En algunas divulgaciones, el cáncer o neoplasia maligna se selecciona entre carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón microcítico, cáncer de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, mesotelioma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, sarcoma, cáncer de próstata, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel y otras neoplasias hemáticas. En algunas divulgaciones, el individuo padece una enfermedad o trastorno inmunomediado.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-L1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión a ligando.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a ambos PD-1 y B7-1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo.
En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión al eje PD-L1 es un antagonista de unión a PD-1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión a ligando.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L2.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a ambos PD-L1 y PD-L2.
En algunas divulgaciones, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo.
En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
PROCEDIMIENTOS DE PROPAGANDA
En el presente documento se proporcionan además procedimientos para anunciar un antagonista de unión al eje PD-L1 que comprenden promover, a un público destinatario, el uso del antagonista de unión al eje PD-L1 para tratar a un individuo con una enfermedad o trastorno en base a la presencia y/o niveles de un biomarcador PD-L1. En algunas divulgaciones, el uso del antagonista de unión al eje PD-L1 se basa en niveles elevados del biomarcador PD-L1.
La propaganda es en general una comunicación pagada a través de un medio no personal en el que se identifica el patrocinador y se controla el mensaje. La propaganda para los propósitos en el presente documento incluye publicidad, relaciones públicas, emplazamiento del producto, patrocinio, financiación y promoción de ventas. Este término también incluye anuncios públicos informativos patrocinados que aparecen en cualquiera de los medios de comunicación impresos diseñados para atraer a un público masivo para persuadir, informar, promover, motivar o modificar de otro modo el comportamiento hacia un patrón favorable de compra, soporte o aprobación de la divulgación en el presente documento.
La propaganda y la promoción del procedimiento de diagnóstico en el presente documento se puede lograr por cualquier medio. Los ejemplos de medios de propaganda usados para emitir estos mensajes incluyen televisión, radio, películas, revistas, periódicos, internet y vallas publicitarias, incluyendo anuncios publicitarios, que son mensajes que aparecen en los medios de difusión. Las propagandas también incluyen aquellas en los asientos de los carritos de supermercado, en las paredes de un pasillo de aeropuerto y en los laterales de los autobuses, o las escuchadas en mensajes telefónicos de espera o sistemas AP en tiendas, o cualquier sitio donde se pueda colocar una comunicación visual o audible.
Ejemplos más específicos de medios de promoción o propaganda incluyen televisión, radio, películas, internet tal como transmisiones por internet y seminarios por internet, redes informáticas interactivas destinadas a llegar a usuarios de forma simultánea, vallas publicitarias fijas o electrónicas y otros letreros públicos, carteles, literatura tradicional o electrónica tal como revistas y periódicos, otros medios de comunicación, presentaciones o contactos del individuo por, por ejemplo, correo electrónico, teléfono, mensaje instantáneo, postal, mensajería, correo masivo o de mensajería, visitas en persona, etc.
El tipo de propaganda usado dependerá de muchos factores, por ejemplo, de la naturaleza del público destinatario al que se quiere llegar, por ejemplo, hospitales, compañías de seguros, clínicas, médicos, enfermeras y pacientes, así como consideraciones de costes y las leyes y reglamentos jurisdiccionales pertinentes que regulan la propaganda de medicamentos y diagnósticos. La propaganda se puede adaptar al paciente o personalizar en base a las caracterizaciones del usuario definidas por la interacción del servicio y/u otros datos tales como datos demográficos y localización geográfica del usuario.
KITS DE DIAGNÓSTICO, ENSAYOS Y ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN
En el presente documento se proporcionan kits de diagnóstico que comprenden uno o más reactivos para determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra de un individuo con una enfermedad o trastorno, en los que la presencia de un biomarcador PD-L1 quiere decir una mayor probabilidad de eficacia cuando el individuo se trata con un antagonista de unión al eje PD-L1, y en los que la ausencia de un biomarcador PD-L1 quiere decir una menor probabilidad de eficacia cuando el individuo con la enfermedad se trata con el antagonista de unión al eje PD-L1. Opcionalmente, el kit comprende además instrucciones de uso del kit para seleccionar un medicamento (por ejemplo, un antagonista de unión al eje PD-L1, tal como un anticuerpo anti-PD-L1) para tratar la enfermedad o trastorno si el individuo expresa el biomarcador PD-L1. En otra divulgación, las instrucciones son de uso del kit para seleccionar un medicamento distinto del antagonista de unión al eje PD-L1 si el individuo no expresa el biomarcador PD-L1.
En el presente documento se proporcionan además ensayos para identificar a un individuo con una enfermedad o trastorno para recibir un antagonista de unión al eje PD-L1, comprendiendo el procedimiento: determinar la presencia de un biomarcador PD-L1 en una muestra del individuo y recomendar un antagonista de unión al eje PD-L1 en base a la presencia de un biomarcador PD-L1.
En el presente documento también se proporcionan artículos de fabricación que comprenden, empaquetados juntos, un antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-L1) en un vehículo farmacéuticamente aceptable y un prospecto del envase que indica que el antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-L1) es para tratar a un paciente con una enfermedad o trastorno en base a la expresión de un biomarcador PD-L1. Los procedimientos de tratamiento incluyen cualquiera de los procedimientos de tratamiento divulgados en el presente documento. Se proporciona además un procedimiento para fabricar un artículo de fabricación que comprende combinar en un envase una composición farmacéutica que comprende un antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-L1) y un prospecto del envase que indica que la composición farmacéutica es para tratar a un paciente con una enfermedad o trastorno en base a la expresión del biomarcador PD-L1.
El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que comprende el medicamento contra el cáncer como agente activo y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica).
El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
El artículo de fabricación de la presente divulgación también incluye información, por ejemplo en forma de un prospecto del envase, que indica que la composición se usa para tratar el cáncer en base al nivel de expresión del/de los biomarcador(es) en el presente documento. El prospecto o ficha técnica puede adoptar cualquier forma, tal como papel o en un medio electrónico tal como un medio grabado magnéticamente (por ejemplo, un disquete) o un CD-ROM. La ficha técnica o prospecto también puede incluir otra información respecto a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación en el kit o artículo de fabricación.
La divulgación también se refiere a un procedimiento para fabricar un artículo de fabricación que comprende combinar en un envase una composición farmacéutica que comprende un antagonista de unión al eje PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1) y un prospecto del envase que indica que la composición farmacéutica es para tratar a un paciente con cáncer (tal como CPNM) en base a la expresión de un biomarcador PD-L1.
El artículo de fabricación puede comprender además un recipiente adicional que comprende un tampón diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
EJEMPLOS
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones. Se entiende que se pueden poner en práctica otras divulgaciones diversas, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Materiales y procedimientos para los ejemplos
Muestras: Se analizaron secciones fijadas con formol e incluidas en parafina (FFPE) de una muestra tumoral o línea celular de cáncer.
Inmunohistoquímica (IHQ): Se desparafinaron secciones tisulares fijadas con formol e incluidas en parafina antes de la recuperación, bloqueo e incubación del antígeno con anticuerpos anti-PD-L1 primarios. Después de la incubación con anticuerpo secundario y desarrollo de color enzimático, se contratiñeron las secciones y se deshidrataron en series de alcoholes y xilenos antes de la cobertura.
Se usó el siguiente protocolo para IHQ. Se usó el sistema Ventana Benchmark XT o Benchmark Ultra para realizar la tinción IHQ de PD-L1 usando los siguientes reactivos y materiales:
Anticuerpo primario: anticuerpo primario monoclonal de conejo anti-PD-L1
Tipo de muestra: sección fijada con formol e incluida en parafina (FFPE) de muestras tisulares y sedimentos celulares de control de intensidades de tinción variables
Especie de procedimiento: ser humano
Instrumento: BenchMark XT o Benchmark Ultra
Condiciones de recuperación de epítopo: acondicionamiento celular, estándar 1 (CC1, Ventana, cat n.° 950-124)
Condiciones de anticuerpo primario: 1/100, 6,5 pg/ml/16 minutos a 36 0C
Diluyente: tampón de dilución de anticuerpo (solución salina tamponada con Tris que contiene proteína transportadora y Brig-35)
Control negativo: IgG de conejo sin exposición previa a 6,5 pg/ml (Cell Signaling) o diluyente solo
Detección: se usaron el kit Optiview o Ultraview Universal DAB Detection Kit (Ventana) y el kit de amplificación (si es aplicable) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ventana).
Contratinción: Ventana hematoxilina II (cat n.° 790-2208)/ con reactivo Bluing (Cat n.° 760-2037) (4 minutos y 4 minutos, respectivamente)
El protocolo Benchmark fue como sigue:
1. Parafina (seleccionado)
2. Desparafinación (seleccionado)
3. Acondicionamiento celular (seleccionado)
4. Acondicionador n.° 1 (seleccionado)
5. CC1 estándar (seleccionado)
6. Temperaturas de incubación de Ab (seleccionado)
7. 36C Ab Inc. (seleccionado)
8. Valoración (seleccionado)
9. Autosuministro (anticuerpo primario) e incubación durante (16 minutos)
10. Contratinción (seleccionado)
11. Aplicar una gota de (hematoxilina II) (contratinción), aplicar cubreobjetos e incubar durante (4 minutos)
12. Poscontratinción (seleccionado)
13. Aplicar una gota de (reactivo Bluing) (poscontratinción), aplicar cubreobjetos e incubar durante (4 minutos) 14. Lavar los portaobjetos con agua jabonosa para retirar el aceite
15. Aclarar los portaobjetos con agua
16. Deshidratar los portaobjetos a través de 95 % de etanol, 100 % de etanol a xileno (programa de autoteñidor Leica n.° 9)
17. Cubreobjetos.
Ejemplo 1- Puntuación de expresión de PD-L1 por IHQ
La presencia o ausencia de expresión de PD-L1 en muestras tumorales se evaluó usando un anticuerpo específico anti-PD-L1 que puede detectar PD-L1 en tejidos fijados con formol e incluidos en parafina (FFPE) humanos por IHQ. Para medir y cuantificar la expresión relativa de PD-L1 en muestras tumorales, se desarrolló un sistema de puntuación IHQ de PD-L1 para medir la señal específica de PD-L1 en células tumorales y células inmunitarias infiltrantes de tumor. Las células inmunitarias se definen como células con morfología linfática y/o macrófaga/histiocito.
La tinción de células tumorales se expresa como el porcentaje de todas las células tumorales que muestran tinción membranosa de cualquier intensidad. La tinción de células inmunitarias infiltrantes se define como el porcentaje del área tumoral total ocupada por células inmunitarias que muestran tinción de cualquier intensidad. El área tumoral total engloba las células malignas así como estroma asociado al tumor, incluyendo áreas de infiltrados inmunitarios inmediatamente adyacentes y contiguas a la masa tumoral principal. Además, la tinción de células inmunitarias infiltrantes se define como el porcentaje de todas las células inmunitarias infiltrantes tumorales.
Existió un amplio intervalo dinámico de intensidades de tinción de PD-L1 en tejidos tumorales. Independientemente de la localización subcelular, la señal también se clasificó como tinción fuerte, moderada, débil o negativa.
Como se muestra en la figura 1, la intensidad de señal negativa se caracteriza por la ausencia de cualquier señal detectable, como se ilustra usando células HEK-293. Por el contrario, la intensidad de señal positiva se caracteriza por una tinción de membrana de dorado a marrón oscuro, como se ilustra usando células HEK-293 transfectadas con PD-L1 humano recombinante. Finalmente, la intensidad de señal positiva también se ilustra por tinción de trofoblastos placentarios y una fuerte tinción en el área de las criptas amigdalinas y, a menudo, en un patrón membranoso que se caracteriza por una tinción de dorado a marrón oscuro. En tejidos tumorales, las muestras negativas para PD-L1 se califican como que no tienen señal detectable o solo una tinción de fondo citoplásmica débil cuando se evalúan usando un objetivo 20x. Por el contrario, las muestras positivas para PD-L1 demuestran principalmente tinción membranosa en células tumorales y/o células inmunitarias infiltrantes. La tinción de PD-L1 se observa con intensidad variable, de débil con membranas marrón claro finas a fuerte con membranas gruesas marrón oscuro fácilmente reconocibles a bajo aumento. Como se ilustra en la figura 2 , se muestran tres muestras tumorales positivas para PD-L1 representativas: (A) cáncer de mama triple negativo, en el que la mayoría de las células tumorales son fuertemente positivas para PD-L1 mostrando una combinación de tinción membranosa y citoplásmica (aumento de 100x); (B) melanoma maligno, en el que se muestra un grupo de células inmunitarias, algunas de ellas con tinción membranosa para PD-L1; células tumorales raras (flechas) con tinción membranosa para PD-L1 (aumento de 400x); (C) CPNM, adenocarcinoma, en los que se muestra un grupo de células inmunitarias con fuerte tinción para PD-L1; varias células tumorales (flechas) con tinción membranosa y/o citoplásmica para PD-L1 (aumento de 400x).
La tinción en casos positivos tiende a ser focal con respecto a la distribución espacial y la intensidad. Los porcentajes de células tumorales o inmunitarias que muestran tinción de cualquier intensidad se estimaron visualmente y se usaron para determinar el estado de PD-L1. Se usó un control negativo de isotipo para evaluar la presencia de fondo en muestras de prueba.
La tinción requirió una sección tisular en serie para HyE, una segunda sección tisular en serie para anti-PD-L1 y una tercera sección tisular en serie para el control negativo de isotipo. Los portaobjetos con control de línea celular HEK-293 transfectada con PD-L1 o con amígdalas se usaron como controles de ciclo y una referencia para la especificidad de ensayo.
Criterios de estado de PDL-1
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En algunos casos, el estado positivo de PD-L1 puede comprender la presencia de tinción de PD-L1 discernible de cualquier intensidad en células tumorales o bien células inmunitarias infiltrantes de tumor en hasta un 50 % del área tumoral ocupada por células tumorales, estroma desmoplásico peritumoral contiguo e intratumoral asociado. Por tanto, la tinción positiva para PD-L1 incluye hasta un 50 % de células tumorales o células inmunitarias infiltrantes de tumor que muestran tinción de cualquier intensidad.
Los portaobjetos evaluables teñidos con anti-PD-L1 se evaluaron como se describe anteriormente. La intensidad de tinción negativa se caracterizó por una ausencia de cualquier señal detectable o una señal que se caracterizó como gris pálido a azul (en lugar de marrón o tostado) y ausencia de potenciación de membrana. El caso fue negativo si no existió tinción de membrana (por ejemplo, ausente).
Ejemplo 2 - Tratamiento usando anticuerpo anti-PD-L1
Un diseño de estudio de fase I evaluó específicamente la correlación entre el estado tumoral de PD-L1 evaluado por (a) un reactivo IHQ anti-PD-L1 (b) expresión génica de PD-L1 medida por un reactivo qPCR de PD-L1 (c) firma génica inmunitaria medida por una "inmunomatriz" de qPCR múltiple y beneficio clínico de la inhibición de monoterapia de la vía PD-L1/PD-1 medida por (i) respuestas basadas en RECIST 1.1 (ii) criterios de respuesta inmunomediados (iii) SSP (iv) SG (v) tasa de respuesta completa (vi) durabilidad de respuesta (vii) EP a las 6 semanas. Se les requirió a los pacientes en las cohortes de expansión que proporcionaran tejido tumoral para la evaluación del estado tumoral de PD-L1, y se incluyeron en cualquier cohorte de expansión, independientemente del estado tumoral de PD-L1, o se incluyeron en cohortes de expansión que seleccionaron prospectivamente a pacientes en base al estado tumoral de PD-L1 medido por un ensayo IHQ para PD-L1. Los tipos tumorales incluidos incluyeron específicamente CPNM (histología escamosa y no escamosa), melanoma, CCR (renal), CCR (colorrectal), cáncer gástrico, cáncer de mama, SCCHN, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga y neoplasias hemáticas. Adicionalmente, también se han incluido pacientes con linfoma, mieloma, sarcoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer esofágico, carcinoma de pulmón microcítico, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel, cáncer de cuello uterino, VPH o EBV+ SCCHN y carcinoma tímico.
Además de evaluar la correlación con el estado tumoral de PD-L1 de referencia con el beneficio clínico de la inhibición en monoterapia de la vía PD-L1/PD-1, el estudio también evaluó el beneficio de: (a) medir del estado de PD-L1 en muestras tumorales de archivo frente a muestras de biopsia tumoral recientes o frescas (b) evaluar la infiltración de linfocitos T CD8+ en tumores con un reactivo IHQ anti-CD8 (c) evaluar la tinción de PD-L1 en diferentes tipos celulares en %, compartimentos o intensidad de tinción (d) impacto de la tinción peritumoral frente a intratumoral de PD-L1 o CD8 (e) impacto de la amplificación de la tinción de PD-L1 (f) impacto de la macrodisección del tumor antes de la qPCR o evaluación de la inmunomatriz (g) impacto de la edad de la muestra tisular y fijación sobre la evaluación del estado de PD-L1 y correlación con el beneficio (h) valor de la biopsia tumoral en tratamiento para evaluar el beneficio clínico o la toxicidad usando los procedimientos de caracterización tumoral descritos anteriormente (i) valor de la imagen FDG-PET y potenciación del contraste TC para evaluar el beneficio en tratamiento o para la selección del paciente (j) valor del estado de mutación/oncogén del tumor (por ejemplo, KRAS, bRAF, estado de mutación de la vía P13K, estado de Met, estado de Her2neu, estado de PTEN) para predecir el beneficio para el tratamiento anterior (k) número de CTC y caracterización de PD-L1 (l) tipo celular circulante, subconjunto y número (m) biomarcadores de plasma/suero circulantes (n) diferencias étnicas (o) estado de fumador (p) estado de polimorfismo FcgRIII (q) estado de polimorfismo inmunomediado.
Diseño de estudio. Este estudio fue un ensayo multicéntrico de fase I diseñado para evaluar la actividad preliminar y la seguridad del tratamiento con la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un anticuerpo anti-PD-L1 (MPDL3280A) en tumores sólidos y líquidos. Se incluyeron más de 250 pacientes en más de 17 centros multinacionales. El tratamiento con MPDL3280A se continuó hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable dependiendo del estado clínico del paciente (es decir, se permitió que los pacientes con pruebas de progresión de la enfermedad continuaran con el tratamiento del estudio si mantenían su ECOG PS y existía potencial de beneficio clínico evaluado por el investigador. Se realizó un análisis intermedio de datos de este estudio en múltiples veces después del inicio del estudio, incluyendo el 10 de enero de 2013, para los pacientes incluidos en el estudio, incluyendo pacientes que se incluyeron antes del 1 de julio de 2012 (n=122). Estos datos sugieren que los pacientes con tumores que expresaron niveles menores de PD-L1 obtuvieron un beneficio mínimo de la inhibición de la vía PD-L1/PD-1, pero los pacientes que tuvieron niveles mayores de PD-L1 en su tumor, en particular medido en células inmunitarias infiltrantes de tumor, obtuvieron la mayoría del beneficio, medido por respuestas duraderas, en el estudio.
Durante el estudio, se recopilaron datos sobre la medición tumoral y el estado de supervivencia para la evaluación de SSP, supervivencia global (SG) y tasa de respuesta global (TRG) y otras medidas como se indica anteriormente. Se obtuvieron TAC al inicio del estudio y aproximadamente cada 6 semanas. Las imágenes en algunos pacientes incluyeron imágenes FDG-PET. Se evaluaron biomarcadores sanguíneos al inicio y en el estudio para detectar biomarcadores basados en sangre y en subconjuntos celulares. La correlación de estos y otros biomarcadores tumorales con los resultados clínicos ayudará a identificar biomarcadores predictivos, por ejemplo, marcadores en circulación que pueden reflejar la actividad del fármaco o la respuesta al tratamiento. Se extrajo sangre para suero y plasma de pacientes que dieron su consentimiento en momentos preespecificados y se evaluaron para detectar los niveles de estos marcadores exploratorios.
Ejemplo 3- La puntuación por IHQ de muestras de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 muestra correlación entre la expresión de PD-L1 con la respuesta al tratamiento
Como se ilustra en la figura 3A, las muestras tumorales se analizaron para detectar la expresión de PD-L1 de pacientes en fase I tratados con el anticuerpo anti-PD-L1 MPDL3280A. El conjunto de datos incluye pacientes incluidos antes del 1 de julio de 2012. La tinción para detectar el estado de PD-L1 en muestras tumorales se realizó usando el protocolo IHQ descrito anteriormente.
Los resultados preliminares muestran que existe una correlación entre la expresión de PD-L1 en células infiltrantes de tumor (CI) y la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento anti-PD-L1. En particular, los pacientes presentaron una respuesta parcial (RP) o bien una respuesta completa (RC) al tratamiento anti-PD-L1 se correlacionaron con la tinción de células infiltrantes de tumor que expresan PD-L1 dentro del área de muestra tumoral, detectado por IHQ. El área de muestra tumoral engloba las células malignas así como estroma asociado al tumor, incluyendo áreas de infiltrados inmunitarios inmediatamente adyacentes y contiguas a la masa tumoral principal. Por el contrario, los tumores de pacientes que no presentaron respuesta clínica al tratamiento anti-PD-L1 (por ejemplo, que mostraron enfermedad progresiva (EP)) mostraron menor expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor dentro del área de muestra tumoral. p < 0,0001.
También se observó una correlación entre la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento anti-PD-L1 y la tinción de células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI) que expresan PD-L1 dentro de las células inmunitarias totales. Como se muestra en la figura 3B, los pacientes que mostraron reactividad al tratamiento con tratamiento anti-PD-L1 se correlacionaron con la tinción de células infiltrantes de tumor que expresan PD-L1 dentro de los infiltrados inmunitarios totales dentro de una muestra de tumor. El número total de infiltrados inmunitarios dentro de una muestra tumoral se determinó por tinción HyE. Los pacientes presentaron una respuesta parcial (RP) o bien una respuesta completa (RC) al tratamiento anti-PD-L1 correlacionada con la tinción de células infiltrantes de tumor que expresan PD-L1 dentro de los infiltrados inmunitarios totales. Por el contrario, los tumores de pacientes que no presentaron respuesta clínica al tratamiento anti-PD-LI (por ejemplo, que mostraron enfermedad progresiva (EP)) mostraron menor expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor dentro del área de muestra tumoral. p < 0,0005.
Los datos preliminares sugieren que el estado tumoral de PD-L1 puede ser un marcador predictivo para identificar a pacientes que es más probable que respondan a tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. El beneficio clínico inicial observado hasta el momento incluye RP y/o RC, pero el seguimiento continuo puede reflejar beneficios adicionales incluyendo durabilidad de respuesta, evaluación de SSP, supervivencia global (SG) y tasa de respuesta global (TRG). Estos datos preliminares proporcionan un apoyo a que la expresión de PD-L1 en muestras tumorales, incluyendo la expresión en células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI), puede predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpos anti-PD-L1. Los datos apoyan además que el estado tumoral de PD-L1 puede determinar la probabilidad de que un paciente muestre beneficios del tratamiento con un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 4- La puntuación por pPCR de muestras de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 muestra correlación entre la expresión de PD-L1 con la respuesta al tratamiento
Para evaluar si el estado de expresión génica de PD-L1 se correlacionaba con la respuesta del paciente al tratamiento anti-PD-L1, el nivel de expresión génica de PD-L1 en muestras tumorales se determinó por qPCR. El tejido de los pacientes en fase 1 se macrodiseccionó para enriquecer el contenido tumoral. Se aisló el ARN de las secciones de FFPE y se midió la expresión génica de PD-L1 usando una metodología basada en PCR (Fluidigm). La expresión de PD-L1 se normalizó al gen de mantenimiento (GusB).
Aislamiento de ARN FFPE
Los lados HyE de las muestras tumorales FFPE se verificaron por un anatomopatólogo para el diagnóstico tisular y la evaluación del contenido tumoral. Si el contenido tumoral global era inferior a un 70-75 %, se aisló el ARN del tejido macrodiseccionado para enriquecer el contenido tumoral.
La sección tisular FFPE se desparafinó usando reactivo Envirene (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, EE. UU.) antes de preparar el lisado tisular. El aislamiento de ARN se realizó usando el kit de ARN FFPET LC Pertuzumab (Roche Diagnostic parte n.° 06474 969 001). La concentración de ARN y la proporción 260/280 se determinaron por un espectrofotómetro NanoDrop® ND-2000/8000 UV-Vis. Para cada muestra, se usaron 20 ng-200 ng de ARN (2 pl en volumen) para el análisis de la expresión génica usando la plataforma BioMark Real-Time PCR Platform (panel de Immune Fluidigm). Se usaron 110 ng - 115 ng de ARN para el ensayo qPCR de PDL1.
Ensayo qPCR de PD-L1
Se realizó qPCR de PD-L1 usando el ensayo qRT-PCR de ARNm de PDL1 desarrollado por Roche Molecular Science (RMS). El ARNm de PDL1 y genes de referencia (GusB o TMEM55B) se transcribió de forma inversa, se amplificó y se detectó usando la mezcla de reacción y la Oligo Mix proporcionadas por RMS y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones del ciclo térmico fueron como sigue: 1 ciclo de 50 0C durante 5 min, 1 ciclo de 95 0C durante 1 min, 1 ciclo de 61 °C durante 30 min, a continuación 2 ciclos de 95 0C durante 15s y 61 0C durante 30 s, a continuación 53 ciclos de 92 °C durante 15 s y 61 0C durante 30 s, seguido de 1 ciclo de 40 0C durante 30 s y 25 0C durante 10 s. La reacción se realizó en el analizador Cobas z480 (Roche). Los niveles de expresión de PD-L1 se determinaron usando el procedimiento delta Ct (dCt) como sigue: Ct(PD-L1) - Ct(gen de referencia). El conjunto de datos incluye pacientes con muestras disponibles antes del 1 de noviembre de 2012.
Como se ilustra en la figura 4 , los resultados preliminares muestran que existe una correlación entre la expresión génica de PD-L1 elevada en muestras tumorales y la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento anti-PD-L1. Los pacientes que presentaron una respuesta parcial (RP) o bien una respuesta completa (RC) al tratamiento anti-PD-L1 se correlacionaron con la expresión génica de PD-L1 dentro de la muestra tumoral. Por el contrario, los tumores de pacientes que no presentaron respuesta clínica al tratamiento anti-PD-L1 (por ejemplo, que presentaron enfermedad progresiva (EP)) mostraron menor expresión génica de PD-L1 dentro de la muestra tumoral. p = 0,0037.
Estos datos preliminares sugieren que el estado de expresión génica tumoral de PD-L1 puede ser un biomarcador útil para predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un anticuerpo anti-PD-L1. El perfil de expresión génica tumoral de PD-L1 se puede derivar de las células tumorales, células infiltrantes de tumor o una combinación de ambas.
Ejemplo 5- La puntuación por pPCR de muestras de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 muestra correlación entre la expresión de PD-1 con la respuesta al tratamiento
Además de la correlación observada entre la expresión génica de PD-L1 en muestras tumorales y la respuesta clínica del paciente, el estado de expresión génica de PD-1 también se correlacionó con la respuesta clínica. Como se muestra en la figura 5 , se observó una correlación entre la expresión génica de PD-1 en muestras tumorales y la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento anti-PD-L1. Los pacientes que presentaron una respuesta parcial (RP) al tratamiento anti-PD-L1 se correlacionaron con la expresión génica de PD-1 dentro de la muestra tumoral. Por el contrario, existió menos correlación del estado de expresión génica de PD-1 con los pacientes que no presentaron respuesta clínica al tratamiento anti-PD-L1 (por ejemplo, EP), p = 0,0206. El conjunto de datos incluye pacientes con muestras disponibles antes del 1 de noviembre de 2012.
Estos datos preliminares sugieren que el estado tumoral de PD-1 puede ser otro marcador predictivo para identificar a pacientes que es más probable que respondan a tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. La expresión génica de PD-1 en muestras tumorales, incluyendo la expresión en células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI), células tumorales o una combinación de ambas, puede predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
Estos datos preliminares sugieren que el estado tumoral de PD-1 puede ser otro marcador predictivo para identificar a pacientes que es más probable que respondan a tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. La expresión génica de PD-1 en muestras tumorales, incluyendo la expresión en células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI), células tumorales o una combinación de ambas, puede predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 6 - La firma génica inmunitaria tumoral de muestras de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 muestra correlación con la respuesta al tratamiento
Para determinar si existe una correlación entre determinadas firmas génicas inmunitarias y la sensibilidad de un paciente al tratamiento con el anticuerpo anti-PD-L1, se realizó el siguiente protocolo.
Análisis de expresión génica Fluidigm
El análisis de expresión génica se realizó usando la plataforma BioMark Real-Time PCR Platform (Immune Fluidigm). Se transcribieron de forma inversa 2 pl de ARN total a ADNc y se preamplificaron en una única reacción usando Superscript 11I/Platinum Taq y una mezcla de reacción 2X (Invitrogen). Se incluyeron 96 conjuntos de cebadores/sondas Taqman en la reacción de preamplificación a una dilución final de concentración de ensayo Taqman 0,2X (Applied Biosystems). Las condiciones del ciclo térmico fueron como sigue: 1 ciclo de 50 0C durante 15 min, 1 ciclo de 70 0C durante 2 min, a continuación 18 ciclos de 95 0C durante 15 s y 60 0C durante 4 min.
El ADNc preamplificado se diluyó 1,94 veces y a continuación se amplificó usando Taqman Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) en la plataforma BioMark BMK-M-96.96 (Fluidigm) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se sometieron a ensayo por triplicado. Todos los ensayos Taqman en el panel de expresión fueron FAM-MGB y se ordenaron a través de Life Technologies por encargo o bien diseñados a medida, incluyendo cinco genes de referencia, GusB, SDHA, SP2, TMEM55B y VPS-33B. Se calculó una mediana de los valores de Ct para los genes de referencia para cada muestra, y los niveles de expresión se determinaron usando el procedimiento delta Ct (dCt) como sigue: Ct(gen diana) - Mediana de Ct(genes de referencia). De forma alternativa, cuando se indique, los niveles de expresión se determinaron después de normalizar los valores de Ct de cada gen diana al valor de mediana de Ct de todos los genes.
Como se ilustra en la figura 6 , existe una correlación entre determinadas firmas génicas inmunitarias y la respuesta de los pacientes al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Los resultados muestran que la expresión de determinados genes inmunitarios se correlacionó con la respuesta del paciente al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Por ejemplo, se descubrió que los genes inmunitarios de activación de linfocitos T, incluyendo IFN-g, CD8A, EOMES, granzima A y CXCL9, se correlacionan con la respuesta parcial del paciente al tratamiento con anti-PD-L1. El conjunto de datos incluye pacientes con muestras disponibles antes del 1 de noviembre de 2012.
Estos datos preliminares sugieren que se han identificado biomarcadores predictivos adicionales que pueden ayudar a identificar a pacientes que es más probable que respondan a tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando un tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. La firma génica inmunitaria incluye, pero no se limita a, IFN-g, CD8A, EOMES, granzima A y CXCL9, y se asocia con la activación de células inmunitarias.
Ejemplo 7- Correlación de la expresión de PD-L1 y PD-L2 con la respuesta al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1
Actividad clínica, seguridad y biomarcadores de pacientes con tumores localmente avanzados o metastásicos tratados con un antagonista de unión al eje PD-L1, como un anticuerpo anti-PD-L1.
Se ha informado de que PD-L1 y PD-L2 regulan las respuestas inmunitarias de Th1 y Th2. PD-L1 expresado por tumor, cuando se une a PD-1 o B7.1 en linfocitos T activados, puede mediar en la evasión inmunitaria del cáncer. La inhibición de la unión de PD-L1 a sus receptores representa una estrategia atractiva para restaurar la inmunidad de linfocitos T específicos de tumor. Sin embargo, PD-L2 expresado en el microentorno tumoral también se puede unir a linfocitos T que expresan PD-1, amortiguando su función. MPDL3280A (anticuerpo anti-PD-L1), un anticuerpo monoclonal humano que contiene un dominio Fc genomanipulado diseñado para promover una respuesta provocada por Th1 para optimizar la eficacia y la seguridad, se describe en el presente documento junto con los resultados de la fase I.
Materiales y procedimientos: Se realizó un estudio con MPDL3280A administrado i.v. cada 3 semanas en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados o metastásicos, incluyendo cohortes de expansión y aumento escalado de dosis 3+3. Se evaluó TRG por RECIST v1.1 e incluye u/cCR y u/cPR. Se midió PD-L1 por IHQ (pos. frente a neg), y se midió PD-L2 por qPCR (alto frente a bajo) en muestras tumorales de archivo.
Resultados: A partir del 1 de febrero de 2013, 171 pacientes fueron evaluables para determinar su seguridad. Las dosis administradas incluyen <1 (n=9), 3 (n=3), 10 (n=35), 15 (n=57) y 20 mg/kg (n=67). Los pacientes en las cohortes de aumento escalado de la dosis no experimentaron toxicidades limitantes de la dosis (DLT). No se identificó la dosis tolerada máxima (MTD). Los pacientes habían recibido MPDL3280A durante una duración mediana de 147 días (intervalo 1-450). Un 41 % de los pacientes informaron de EA G3/4, independientemente de la atribución. No se observó neumonitis aguda. 122 pacientes incluidos antes del 1 de julio de 2012 fueron evaluables para determinar su eficacia. Se observaron respuestas RECIST en múltiples tipos tumorales, incluyendo CPNM (9/37), CCR (renal) (5/39), melanoma (9/35), CRC (1/4) y cáncer gástrico (1/1). Se observó una TRG de un 21 % (25/122) en tumores sólidos no seleccionados con una duración del intervalo de respuesta de 1+ a 253+ días. Otros pacientes tuvieron respuestas retardadas después de una progresión radiográfica aparente (no incluidos en la TRG). La SSP de 24 semanas fue de un 42 %. 94 pacientes tenían tumores evaluables para el estado de PD-L1, y 81 pacientes tenían tumores evaluables para PD-L2. La mediana de la expresión de PD-L2 fue =2x mayor en tumores positivos para PD-L1 frente a tumores negativos para PD-L1. La TRG fue de un 39 % (13/33) para pacientes con tumores positivos para PD-L1 frente a un 13 % (8/61) para pacientes con tumores negativos para PD-L1. Los pacientes con tumores PD-L2High mostraron una TRG de un 27 % (11/41), frente a un 13 % (5/40) para los pacientes con tumores PD-L2Low.
MPDL3280A se toleró bien, sin muertes relacionadas con neumonitis. Se observaron respuestas duraderas en una variedad de tumores. El estado tumoral de PD-L1 y PD-L2 parece correlacionarse con las respuestas a MPDL3280A. Estos datos preliminares proporcionan un apoyo adicional a que la expresión de PD-L1 así como de PD-L2 en muestras tumorales, incluyendo expresión en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI) y/o dentro del microentorno tumoral tal como células estromales y cualquier combinación de las mismas, puede predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1. Los datos apoyan además que el estado tumoral de PD-L1 y PD-L2 puede determinar la probabilidad de que un paciente muestre beneficios del tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-L1 tal como un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 8 - El tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 da lugar a un incremento en la activación de linfocitos T en pacientes con PD-L1+ que responden al tratamiento
Se evaluó el valor de la biopsia tumoral en tratamiento para evaluar el beneficio clínico para pacientes que responden al anticuerpo anti-PD-L1 y la identificación de biomarcadores farmacodinámicos (FD) asociados con la eficacia del tratamiento.
Como se ilustra en la figura 7 , se evaluaron las biopsias tumorales pre/en tratamiento en serie de pacientes tratados con anticuerpo anti-PD-L1 del estudio de fase I en curso. Se analizaron biopsias tumorales de referencia emparejadas (que incluye pretratamiento o bien tejido tumoral de archivo) y en tratamiento de pacientes tratados con anticuerpo anti-PD-L1 (n=26) que padecen diversas indicaciones, incluyendo melanoma, CCR (renal), CPNM, CyC, c Cr (colorrectal), cáncer gástrico y de mama, para detectar infiltración de linfocitos T CD8+ usando un reactivo IHQ anti-CD8 así como biomarcadores farmacodinámicos por medio de análisis de expresión génica.
Como se ilustra en la figura 8(a), un incremento en la infiltración de linfocitos T CD8+ se asoció con un incremento en la expresión de PD-L1 en muestras tumorales de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. En condiciones de referencia, los linfocitos T y las células tumorales PD-L1+ se pueden colocalizar y la expresión de PD-L1 focal puede representar una interfase entre células cancerosas y células inmunitarias (el ataque de linfocitos T antitumorales se puede controlar por expresión de PD-L1 de células inmunitarias o tumoral). En la semana 4 postratamiento de ciclo 1, día 1 (C1D1) con anticuerpo anti-PD-L1, se detectó un incremento en la expresión de PD-L1 dentro de la muestra tumoral junto con infiltración linfocítica densa, en particular infiltración de linfocitos T CD8+. Este incremento en linfocitos T CD8+ puede dar lugar a muerte mediada por linfocitos T de células tumorales, lo que a su vez puede dar lugar a proliferación y activación de linfocitos T. Dichos linfocitos T activados pueden liberar IFN-g y también pueden inducir la expresión de PD-L1 en células inmunitarias y/o células tumorales vecinas.
Como se ilustra en la figura 8(b), se descubrió que varios marcadores de activación de linfocitos T se incrementaron en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Se descubrió que los niveles de expresión génica de los marcadores de activación de linfocitos T, incluyendo granzima A, perforina, IFN-g, TNFa y CD8, se incrementaron después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 en comparación con los niveles de referencia pretratamiento.
Estos datos sugieren que un incremento en la infiltración de linfocitos T CD8+ se correlacionó con un incremento en la expresión de PDL-1 en muestras tumorales de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Además, se observó que la expresión de una serie de marcadores de activación de linfocitos T, incluyendo pero sin limitarse a, granzima A, perforina, IFN-g, TNFa y CD8, se incrementó en muestras tumorales de pacientes que responden al anticuerpo con anticuerpo anti-PD-L1. Estos marcadores pueden ser biomarcadores farmacodinámicos útiles para evaluar el beneficio clínico y la eficacia del tratamiento que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 que incluye el uso de un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 9 - El incremento adaptativo en la expresión de PD-L1 es prominente en pacientes que responden al tratamiento
Además del incremento en la infiltración de linfocitos T CD8+ y la expresión de marcadores de activación de linfocitos T en muestras tumorales de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, también se observó un incremento en la expresión tumoral de PD-L1 en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1.
Como se ilustra en la figura 9 , se presenta un resumen de respuestas al anticuerpo anti-PD-L1 en biopsias tumorales emparejadas. En todos los casos (4/4 pacientes; 100 %) donde existió una reducción>30 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana (SLD) en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, también existió un incremento en la expresión tumoral de PD-L1 medida por IHQ PD-L1. Incluso con una reducción de un 0­ 30 % en SLD en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, un 33 % de los pacientes (2/6 pacientes) presentaron un incremento en la expresión de PD-L1 tumoral después del tratamiento.
Por el contrario, en pacientes que no respondieron al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 y que presentaron un incremento de un 0-20 % en SLD, solo 1/10 pacientes presentaron un incremento en la expresión de PD-L1 tumoral. Además, para pacientes que presentaron un incremento de un >20 % en SLD, ninguno (0/4 pacientes) presentó un incremento medible en la expresión de PD-L1 tumoral.
Estos datos preliminares sugieren que la expresión de PD-L1 en tumores puede incrementar en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 y que dicho incremento puede ser un incremento adaptativo que puede servir como biomarcadores farmacodinámicos, un indicador de leucocitos infiltrantes de tumor locales (TIL) que atacan el tumor y también como un marcador para evaluar el beneficio clínico y la eficacia de la tratamiento que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 que incluye el uso de un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 10 - El tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 da lugar a un incremento en la frecuencia de linfocitos T activados en la sangre
También se evaluó la identificación de biomarcadores farmacodinámicos (FD) del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 en la sangre.
Análisis de citometría de flujo (FACS):
Se extrajo sangre completa en tubos de extracción de sangre con heparina de sodio (NaHep). Se mezcló la sangre invirtiendo lentamente el tubo de extracción. Se tiñeron las células con las combinaciones de anticuerpos apropiadas y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, se añadió FACSLyse a todos los tubos. Se agitaron con vórtex los tubos y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. Se lavaron las células con PBS con BSA al 1 %. Después del lavado, se añadió FACSPerm2 a todos los tubos y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. Después de la incubación, se lavaron las células con PBS con BSA al 1 % y se incubaron con anticuerpo, si es aplicable. Después de la incubación, se lavaron las células con PBS con BSA al 1 % y se resuspendieron en paraformaldehído al 1 %. Se almacenaron los tubos a 2-8 0C hasta que se adquirieron en el citómetro de flujo FACSCantoII.
Como se ilustra en la figura 10 (a), los linfocitos T en proliferación en sangre, identificados como CD8+/Ki67+, se incrementan durante el curso del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 con un incremento de ~2 veces en C2D1 (ciclo 2 día 1) en comparación con C1D1 (ciclo 1 día 1). Además, como se ilustra en la figura 10 (b), los linfocitos T en proliferación que también se activan en la sangre, identificados como CD8+/HLA-DR+/Ki67+, se incrementan durante el curso del tratamiento anti-PD-L1 y son más frecuentes en C2D1 (incremento de ~2 veces).
Estos datos preliminares sugieren que la proliferación de linfocitos T activados en sangre se puede incrementar durante el curso del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 y puede servir como un biomarcador farmacodinámico del tratamiento que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 que incluye el uso un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 11 - Una disminución en la expresión de IL-6 en plasma se puede asociar con pacientes que responden al tratamiento
También se evaluó la identificación de biomarcadores farmacodinámicos (FD) del tratamiento con anticuerpo anti-PD L1 en el plasma.
Análisis de plasma
Se extrajo sangre en tubos de extracción con heparina de sodio. Se mezcló el tubo completamente invirtiendo lentamente el tubo de extracción. Posteriormente, se centrifugaron los tubos de extracción en una centrífuga refrigerada a un mínimo de 1500-2000xg durante 15 minutos. Se transfirió el plasma a crioviales de polipropileno y se mantuvo congelado hasta el análisis. Se analizó el plasma para detectar IL-6 y otras citocinas usando ELISA modificado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Como se ilustra en la figura 11, una disminución en los niveles de IL-6 en el plasma se asoció con pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Específicamente, los pacientes que mostraron respuestas RP/RC (respuesta parcial/respuesta completa) beneficiosas durante el curso del tratamiento también mostraron una disminución medible en los niveles de IL-6.
Por el contrario, los pacientes que no se beneficiaron del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-L1 se asociaron con un incremento en los niveles de IL-6 en el plasma durante el curso del tratamiento. Como se ilustra en la figura 11, los pacientes que mostraron respuestas de EP (enfermedad progresiva) durante el curso del tratamiento mostraron un incremento medible en los niveles de IL-6.
Estos datos preliminares sugieren que los niveles de IL-6 en plasma pueden servir como un biomarcador farmacodinámico para evaluar el beneficio clínico y la eficacia de la tratamiento que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 que incluye el uso de un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 12: la expresión de genes inmunitarios tumorales en muestras de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 muestra correlación con la respuesta al tratamiento
Para evaluar además las firmas génicas inmunitarias adicionales y la reactividad de los pacientes al tratamiento con protocolo, se realizó un análisis de expresión génica como se describe previamente en el ejemplo 6 usando el análisis de expresión génica Fluidigm.
Como se ilustra en la figura 12, existe una correlación entre varios genes inmunomediados adicionales y la respuesta de los pacientes al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1. Específicamente, se observó que los niveles de expresión génica de CTLA4 y CD45RO fueron mayores en pacientes que presentaron respuesta parcial (RP) o bien respuesta completa (RC) después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, en comparación con pacientes con enfermedad progresiva (EP). La figura 12 también ilustra que se observó que los niveles de expresión génica de CX3CL1 (una quimiocina), LGLS9 (galectina-9), MIC-A y MIC-B fueron menores en pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 (RP/RC), en comparación con pacientes con PD. HK. Estos datos representan niveles de expresión génica agrupados de muestras recogidas de pacientes que padecen las siguientes indicaciones de cáncer: melanoma, CCR (renal), CPNM, CCR (colorrectal), cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, sarcoma, cáncer esofágico, CPM, mieloma múltiple, NHL y cáncer de endometrio.
De forma interesante, determinados genes inmunomediados presentan diferentes patrones de correlación con la respuesta de los pacientes al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 dependiendo de la indicación de la enfermedad. Como se ilustra en la figura 13, el nivel de expresión génica de IDO1 (indolamina-pirrol-2,3-dioxigenasa) fue mayor en pacientes con melanoma que presentaron respuesta parcial (RP) o bien respuesta completa (RC) después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, en comparación con los pacientes con enfermedad progresiva (EP). Sin embargo, en pacientes con CPNM, el nivel de expresión génica de IDO1 fue menor en pacientes que presentaron RP o RC después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, en comparación con los pacientes con EP. Por tanto, es posible que estos biomarcadores puedan mostrar perfiles de correlación diferentes dependiendo de la indicación de la enfermedad.
Estos resultados sugieren que se han identificado biomarcadores predictivos adicionales que pueden ayudar a identificar a pacientes que es más probable que respondan a tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1, tal como usando un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 13 - La expresión de PD-L1 en linfocitos T circulantes en sangre se correlaciona con la respuesta al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1
Para evaluar si la expresión de PD-L1 en los linfocitos T circulantes se correlacionaba con la respuesta del paciente al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, se extrajeron muestras de sangre dentro de los 60 días previos al tratamiento y se realizó un análisis FACS para determinar el nivel de expresión de PD-L1 en linfocitos T en la muestra.
En resumen, se extrajeron muestras de sangre de pacientes pretratamiento en tubos que contenían anticoagulantes (por ejemplo, heparina de sodio, EDTA o citrato). Se mezcló la sangre recogida en los tubos de extracción completamente invirtiendo lentamente el tubo de extracción al menos 3 veces. Se pipetearon aproximadamente 100 pl de una sangre completa anticoagulada en tubos de ensayo debidamente etiquetados. Se tiñó la sangre con los siguientes anticuerpos primarios y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad: anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD8 y anticuerpo anti-PD-LI. Después de la tinción con anticuerpos primarios, a continuación se lisaron los glóbulos rojos usando, por ejemplo, solución de lisis de cloruro de amonio, y a continuación se lavaron las células con 2 ml de PBS con BSA al 1 %. A continuación se tiñeron los glóbulos sanguíneos con anticuerpo secundario o una cantidad apropiada de estreptavidina-(tinte) (si se usaron anticuerpos primarios biotinilados) durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se lavaron las células de nuevo con PBS que contenía BSA al 1 %, se resuspendieron en paraformaldehído al 1 % y se almacenaron a 2-8 0C hasta que se adquirieron en el citómetro de flujo.
Como se muestra en la figura 14, existe una correlación entre la expresión de PD-L1 elevada en linfocitos T circulantes (CD3+/CD8+) y la respuesta clínica de los pacientes al tratamiento anti-PD-L1. Los pacientes que presentaron una respuesta parcial (RP) o bien una respuesta completa (RC) después del tratamiento anti-PD-L1 se correlacionaron con niveles elevados de expresión de PD-L1 en sus linfocitos T circulantes. Por el contrario, los pacientes que no presentaron respuesta clínica al tratamiento anti-PD-L1 (por ejemplo, que tuvieron enfermedad progresiva (EP)) mostraron menor expresión de PD-L1 en sus linfocitos T circulantes.
Estos resultados sugieren que la expresión de PD-L1 en linfocitos T circulantes puede ser un biomarcador valioso y útil para predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1 usando, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 14 - Un estudio de fase Ia de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 y la correlación con la respuesta al tratamiento en individuos seleccionados de diagnóstico
El estudio PCD4989g es un ensayo en fase la en curso en pacientes con tumores sólidos avanzados y neoplasias malignas hemáticas para evaluar la seguridad y la tolerabilidad de un anticuerpo anti-PD-L1 (MPDL3280A) administrado por infusión intravenosa cada 3 semanas. El estudio contiene una gran cohorte de pacientes con CPNM (n = 79, incluyendo 53 con un mínimo de 6 meses de seguimiento).
Estos resultados preliminares del estudio PCD4989g sugieren que la expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor está asociada con la respuesta a MPDL3280A. La positividad de PD-L1 en CPNM se define como la tinción de PD-L1 discernible de cualquier intensidad en células inmunitarias infiltrantes de tumor que cubren >5 % del área tumoral ocupada por células tumorales, estroma desmoplásico peritumoral contiguo e intratumoral asociado. Los criterios propuestos para la evaluación de diagnóstico PD-L1 en CPNM se proporcionan a continuación:
Figure imgf000059_0001
A partir de la fecha límite para inclusión de datos del 30 de abril de 2013, existieron 53 pacientes con CPNM localmente avanzado o metastásico dosificados antes del 1 de octubre de 2012 con un mínimo de 6 meses de seguimiento. La mediana de edad de este grupo era de 62 años (intervalo, 24-84 años), y el grupo representaba una población de pacientes altamente pretratados: Un 84,9 % tenía >2 tratamientos sistémicos previos y un 52,8 % tenía >4 tratamientos sistémicos previos. Se han observado respuestas considerables en CPNM, incluso en pacientes que fallaron en múltiples tratamientos sistémicos y/o que habían sido sintomáticos antes de iniciar el tratamiento. La mediana de tiempo de respuesta es de 11,7 semanas, con aproximadamente un 90 % de las respuestas observadas a las 24 semanas (6 meses). La tasa de respuesta objetiva (TRG) en todos los pacientes con CPNM con un mínimo de 6 meses de seguimiento es de un 22,6 % (iC de un 95 %: 12,3 %-35,1 %).
La positividad para PD-L1 de células inmunitarias infiltrantes de tumor pareció predecir una mayor respuesta en pacientes con CPNM tratados con MPDL3280A. Los pacientes con CPNM con >5 % de células inmunitarias infiltrantes de tumor positivas para PD-L1 (IHQ 2/3) tuvieron una TRG de un 46,2 % (IC 95 %: 22,4 %-74,0 %) en comparación con un 18,2 % (IC 95 %: 8,2 %-33,8 %) en pacientes con perfiles de diagnóstico de IHQ 0/1. Cuando se usó un umbral de diagnóstico mayor de > 10 % de células inmunitarias infiltrantes de tumor positivas para PD-L1 (IHQ 3), los pacientes positivos para PD-L1 tuvieron una TRG de un 83,3 % (IC 95 % 40,2 %-99,1 %) en comparación con un 17,5 % (IC 95 %: 7,8 %-31,5 %) en pacientes con perfiles de diagnóstico de IHQ 0/1. La experiencia preliminar muestra que la fecha límite de diagnóstico de IHQ 2/3 se asocia con un beneficio clínico significativo para los pacientes con CPNM tratados con MPDL3280A. Los pacientes que respondieron parecían haber desarrollado una inmunidad antitumoral duradera, y continuando todas las respuestas de CPNM con de 170 a 534 días en estudio en el momento de la fecha límite para inclusión de datos
Ejemplo 15 - La firma génica inmunitaria tumoral de muestras de individuos tratados con anticuerpo anti-PD-L1 muestra correlación con la respuesta al tratamiento
Se evaluaron los efectos farmacodinámicos inmunológicos en tumores y sangre de pacientes tratados con MPDL3280A. En tratamiento, los tumores que respondieron mostraron un incremento en la expresión de PD-L1 de células inmunitarias infiltrantes de tumor y células tumorales, infiltración de linfocitos T CD8+ y un infiltrado inmunitario dominante de Th1, proporcionando pruebas de una regulación por incremento de PD-L1 adaptativa. Los que no respondieron al tratamiento mostraron una infiltración de linfocitos T CD8+ tumorales mínima y una ausencia de activación de linfocitos T (medida por expresión de granzimas, perforina y EOMES).
Como se ilustra en la figura 15, la respuesta antitumoral a MPDL3280A se asoció con marcadores relacionados con la biología de linfocitos T. Específicamente, se detectaron mayor expresión génica de linfocitos Th1 citotóxicos, IFN-g y marcadores de transporte de linfocitos T en tejido tumoral al inicio del estudio y esto se asoció con actividad MPDL3280A. Por ejemplo, se descubrió que los genes inmunitarios de activación de linfocitos T, incluyendo IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9, se correlacionan con la respuesta parcial/respuesta completa del paciente al tratamiento con MPDL3280A. El conjunto de datos incluye pacientes con muestras disponibles a partir del 1 de junio de 2013.
Como se ilustra en la figura 16, MPDL3280A da lugar a un incremento en la activación de linfocitos T en un paciente con melanoma que responde al tratamiento. Específicamente, se descubrió que varios marcadores de activación de linfocitos T se incrementaron en pacientes que responden a MPDL3280A, incluyendo granzima A, granzima B, perforina, EOMES, IFN-g, TNF, CXCL9, CXCL10, CD8A e ICOS.
Por el contrario, en un paciente con melanoma que no responde a MPDL3280A se mostró baja frecuencia de linfocitos T intratumorales y carece de activación de linfocitos T, como se ilustra en la figura 17.
También se evaluaron los biomarcadores circulantes para detectar su asociación con los resultados clínicos. La frecuencia de los linfocitos T CD8+HLA-DR+Ki67+ en la sangre se incrementó poco después de la primera dosis de MPDL3280A y regresó a los niveles de referencia al final del ciclo 2 cuando se evaluó en todos los pacientes, lo que representa una medición farmacodinámica transitoria de inhibición de PD-L1. Como se ilustra en la figura 18, MPDL3280A da lugar a un incremento transitorio en la frecuencia de linfocitos T activados en sangre y sugiere que los linfocitos T CD8+HLA-DR+Ki67+ pueden ser un biomarcador farmacodinámico potencial del tratamiento con MPDL3280A.
Se observaron fluctuaciones significativas en los linfocitos T CD4+/ICOS+, con incrementos retardados en esta población de linfocitos T que se correlacionan con la respuesta y disminuyen con la progresión de la enfermedad (que se produce después del ciclo 3), como se ilustra en la figura 19. El incremento en los linfocitos T CD4+/ICOS+ podría reflejar la activación auxiliar de las respuestas de linfocitos T colaboradores en pacientes que montan fuertes respuestas de linfocitos T antitumorales CD8+ después del tratamiento con MPDL3280A.
Además, un incremento adaptativo en la expresión de PD-L1 fue prominente en pacientes que responden a MPDL3280A. Como se ilustra en la figura 20, se presenta un resumen de las respuestas a MPDL3280A en biopsias tumorales emparejadas. En pacientes que responden a MPDL3280A, existió un incremento tanto en la expresión de PD-L1 de células tumorales como en la expresión de PDL-1 de células inmunitarias infiltrantes de tumor, medido por un ensayo IHQ PD-L1.
Ejemplo 16 - Correlación de la expresión de CTLA4 y de fractalquina con la respuesta o progresión después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1
A través de múltiples tipos de cáncer, los tumores pretratamiento que muestran la presencia de expresión génica relacionada con Th1, CTLA4, y la ausencia de fractalquina/CX3CL1, se asociaron con la actividad. Específicamente, la expresión de CTLA4 se correlacionó fuertemente con la respuesta a MPDL3280A, mientras que la expresión de fractalquina/CX3CL1 en tumores pretratamiento se correlacionó fuertemente con la progresión a MPDL3280A, como se ilustra en la figura 21.
El papel de CTLA4 está bien establecido como un factor expresado por linfocitos T que puede dar lugar a inhibir además la activación de linfocitos T. La correlación de una mayor expresión de CTLA4 pretratamiento en pacientes que respondieron a MPDL3280A en los diferentes tipos tumorales sugiere que CTLA4 sirve como un mecanismo de retroalimentación importante en la respuesta inmunitaria antineoplásica, y representa un marcador de inmunidad de linfocitos T activa e inflamación. En la periferia, sin embargo, el papel funcional de CTLA4 como regulador negativo parece menos importante que el de PD-L1
La correlación de una mayor expresión de fractalquina pretratamiento (CX3CL1) en pacientes que experimentaron progresión de la enfermedad a MPDL3280A también fue inesperada, ya que esta quimiocina en general se asocia con el accionamiento de la infiltración de linfocitos T. Sin embargo, en su forma no escindida, la fractalquina induce la adhesión de linfocitos a células endoteliales y, por lo tanto, en realidad puede restringir la entrada de linfocitos T en el lecho tumoral. La asociación de la expresión de fractalquina en tumores y enfermedad progresiva para pacientes tratados con MPDL3280A sugiere que la expresión de fractalquina también podría representar un mecanismo de retroalimentación para tumores que carecen de una respuesta inmunitaria activa o representan un factor supresor de respuesta inmunitaria activa tumoral.
Estos resultados sugieren que CTLA4 y fractalquina pueden ser biomarcadores predictivos valiosos para ayudar a identificar a pacientes que es más probable que respondan a tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1, tal como el uso de un anticuerpo anti-PD-L1.
Ejemplo 17 - Firmas de linfocitos infiltrantes de tumor en seis tipos de cáncer y su asociación con factores pronósticos de enfermedad
Para evaluar y comprender mejor la complejidad de los factores que pueden modular o inhibir la inmunidad antitumoral y, por tanto, contribuir a la respuesta o resistencia al tratamiento inmunomodulador, se usaron varios ensayos de expresión de genes inmunitarios altamente sensibles (iCHIP) usando la plataforma Fluidigm Biomark para interrogar la calidad de la respuesta inmunitaria en seis indicaciones de cáncer incluyendo CCR (colorrectal) (n=48), BC (n=126), CPNM (n=51), melanoma (n=35), CCR (renal) (n=48) y cáncer de vejiga (n=42). La plataforma iCHIP consiste en 96 genes que representan firmas asociadas con la vía IFNg, linfocitos T citotóxicos, linfocitos Th2, células efectoras T, células efectoras T, células reguladoras T, linfocitos Th17, células mieloides, células dendríticas, células NK, linfocitos B y marcadores de punto de control inmunitario.
Se extrajo ARN de tejidos de archivo fijados con formol e incluidos en parafina que se derivaron de colecciones clínicas o se obtuvieron en el estudio de fase I en curso de MPDL3280A (anticuerpo anti-PD-L1). Se obtuvieron los consentimientos informados apropiados de los pacientes de las juntas de revisión institucional para la evaluación exploratoria de biomarcadores.
Como se muestra en la figura 22, se muestran las firmas génicas asociadas con Tef (linfocitos T efectores), Treg (linfocitos T reguladores) y Th17. Los linfocitos Tef se definen por el grupo de genes: CD8A, GZMB, IFNg, EOMES, GZMA, perforina; los linfocitos Treg se definen por el grupo de genes: FOXP3; y los linfocitos Th17 se definen por el grupo de genes: RORC, IL17F, IL17A.
El análisis de expresión de genes inmunitarios mostró un patrón único de factores inmunosupresores e inmunosensibles y tipos de células en las indicaciones. Aunque las indicaciones, incluyendo cáncer de mama triple negativo (TNBC), CPNM y cáncer de vejiga, representan la mayor prevalencia de firmas de IFN-g, el CCR (colorrectal) y el cáncer de mama positivo para receptores hormonales constituyen enfermedades con la expresión más baja. Además de una alta firma de IFN-g en TNBC, este subtipo de cáncer de mama también consiste en una alta firma de Treg en comparación con melanoma, que representa la proporción más alta de expresión génica IFN-g:Treg. Las firmas génicas de Th17 son más predominantes en CCR (colorrectal) en comparación con todas las demás indicaciones. La asociación de estas firmas génicas con el estadio de enfermedad, resultados (cuando estén disponibles) y otros factores pronósticos conocidos específicos de enfermedad, incluyendo subtipos moleculares y mutaciones en KRAS, BRAF, PIK3CA y EGFR, está actualmente en curso.
En particular, en una cohorte de pacientes con CCR (renal), se observó una tendencia hacia una mayor expresión génica tumoral de IL17F en pacientes que no responden al tratamiento anti-PD-L1 como se ilustra en la figura 23, a pesar de que la expresión génica tumoral de PD-L1 (CD274) es mayor en pacientes que responden al tratamiento anti-PD-L1.
Además, la expresión génica tumoral de IL-17F es mayor en pacientes con una respuesta tardía a anti-PD-L1 (respuesta después de 6 meses de tratamiento) en las indicaciones (melanoma, cáncer de pulmón, CCR (renal)), como se ilustra en la figura 24.
Por tanto, es posible que determinados biomarcadores puedan mostrar diferentes perfiles de correlación dependiendo del estadio de enfermedad y el momento del tratamiento que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1.
Ejemplo 18 - La inhibición de PD-L1 por MPDL3280A da lugar a la actividad clínica en pacientes con cáncer de vejiga urotelial metastásico (CVU)
El CVU metastásico se asocia con un mal pronóstico y opciones de tratamiento limitadas. La expresión de PD-L1 es predominante en esta enfermedad y puede proteger a las células cancerosas de la destrucción inmunomediada l uniéndose a sus receptores PD-1 y B7.1.
En un estudio de fase I, los pacientes con CVU recibieron MPDL3280A 15 mg/kg i.v. cada 3 semanas durante hasta 1 año. La tasa de respuesta objetiva (TRG; incluyendo respuestas no confirmadas) se evaluó por RECIST v1.1. En paralelo, se evaluaron los biomarcadores tumorales y circulantes para estudiar las correlaciones inmunitarias de MPDL3280A.
A partir del 19 de septiembre de 2013, se trataron 31 pacientes con PD-L1+ CVU con MPDL3280A. Los pacientes eran un 84 % hombres, tenían una mediana de edad de 66 años (42-86), un 57 % eran ECOG PS 1 y un 68 % tenían metástasis viscerales. Un 71 % recibió > 2 tratamientos previos; un 97 % recibió quimioterapia previa basada en platino. Los pacientes habían recibido MPDL3280A durante una duración mediana de 43 días (1-153) a partir de la fecha límite para inclusión de datos. Los AA relacionados con el tratamiento G1-4 que se produjeron en > 2 pacientes fueron pirexia, anemia, disminución del apetito, fatiga y náuseas. Se produjeron AA G3-4 relacionados en un 3,2 % de los pacientes. No hubo AA inmunomediados. Se evaluó a 20 pacientes para detectar su eficacia en el momento del análisis con una mediana de seguimiento de 2,8 m (1,4-5). La TRG fue de un 50 % (1 RC y 9 RP) con una mediana de tiempo de respuesta de 43 d (39-82), correspondiente a la primera evaluación radiográfica e incluyendo pacientes con metástasis en SNC, pulmón y huesos al inicio del estudio. Todos los pacientes que respondieron al tratamiento seguían respondiendo en el momento de la fecha límite clínica.
Se han observado asociaciones entre el estado de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor y la respuesta al tratamiento anti-PD-L1 y se están realizando evaluaciones adicionales para determinar la asociación del estado de PD-L1 en células tumorales y la respuesta al tratamiento anti-PD-L1.
El tratamiento dio como resultado incrementos transitorios en linfocitos T Ki-67+CD8+ circulantes, lo que representa un biomarcador farmacodinámico (FD) potencial de actividad para el tratamiento en pacientes con CVU con un inhibidor de la vía PD-1/PD-L1. Como se ilustra en la figura 25, los linfocitos T Ki-67+CD8+ circulantes demostraron un aumento transitorio durante el tratamiento con MPDL3280A.
El tratamiento también dio como resultado un incremento transitorio en proteínas plasmáticas, tales como la IL-18, que se encuentra antes de la señalización de IFN-g, representando otros biomarcadores de actividad FD, como se ilustra en la figura 26. Además, MCP-1 en plasma de referencia fue menor en pacientes con respuesta parcial/respuesta completa (RP/RC). Tanto IL-18 como MCP-1 se expresaron predominantemente en monocitos, un componente de las células mieloides (véase la figura 26).
Los datos de expresión génica de tumores pretratamiento mostraron que los pacientes que progresaron tenían una firma de genes mieloides proporcionalmente mayor. Como se ilustra en la figura 27, los pacientes que tuvieron enfermedad progresiva (EP) presentaron niveles elevados de IL-8, CCL2 e IL1B y se asociaron con estar presentes predominantemente en células de tipo mieloide (por ejemplo, monocitos, células dendríticas).
MPDL3280A fue bien tolerado en esta población PD-L1+ CVU pretratada. Un 50 % de los pacientes tratados respondieron al tratamiento. Las respuestas fueron rápidas y continuas. El análisis de biomarcadores reveló marcadores FD, así como marcadores de mecanismos potenciales de resistencia al tratamiento.
Ejemplo 19 - Los niveles elevados de PD-L1 soluble son prominentes en pacientes que responden al tratamiento
También se observaron niveles plasmáticos de referencia elevados de PD-L1 soluble en muestras de sangre de pacientes que responden al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 en el estudio de fase 1 en curso.
Se extrajo sangre en tubos de extracción con heparina de sodio. Se mezcló el tubo completamente invirtiendo lentamente el tubo de extracción. Posteriormente, se centrifugaron los tubos de extracción en una centrífuga refrigerada a un mínimo de 1500-2000xg durante 15 minutos. Se transfirió el plasma a crioviales de polipropileno y se mantuvo congelado hasta el análisis. Se analizó el plasma para detectar IL-6 y otras citocinas usando ELISA modificado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Como se ilustra en la figura 28, se descubrió que los pacientes con CCR (renal) que respondieron al tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 con una reducción>=30 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana (SLD) se correlacionaron con un mayor nivel de PD-L1 soluble (sPDL1) en sus muestras de plasma que los pacientes que solo presentaron una reducción >= 20 % en SLD.
Estos datos preliminares sugieren que la expresión de PD-L1 soluble en el plasma puede ser un biomarcador valioso y útil para predecir la reactividad de un paciente al tratamiento contra el cáncer que implica la inhibición de la vía PD-L1/PD-1.
Ejemplo 20 - Asociación de la expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor y células tumorales con la respuesta al tratamiento anti-PD-L1
En el estudio de fase 1 en curso, se observó una asociación clara de la respuesta al tratamiento anti-PD-L1 con la expresión de PD-L1 tanto en células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI) como en células tumorales. Como se ilustra en la figura 29, la asociación entre la expresión de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor (CI) y la respuesta al tratamiento anti-PD-L1 se observó en pacientes con CPNM (figura 29(a)), así como en todos los pacientes (figura 29(b)). De forma similar, la asociación entre la expresión de PD-L1 en células tumorales (CT) y la respuesta al tratamiento anti-PD-L1 se observó en pacientes con CPNM (figura 30(a)), así como en todos los pacientes (figura 30(b)).
Aunque la invención anterior se ha descrito con algo de detalle a modo de ilustración y ejemplo, para los propósitos de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance.

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para identificar a un individuo con un cáncer que es más probable que responda a un tratamiento con un antagonista de unión a ligando de muerte programada 1 (PD-L1), comprendiendo el procedimiento:
(a) determinar en una muestra del individuo la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en la muestra en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1; y
determinar además en la muestra la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC­ A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9; y (b) proporcionar una recomendación de que será más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1,
en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1.
2. Un antagonista de unión a PD-L1 para su uso en un tratamiento de un cáncer en un individuo, comprendiendo el tratamiento
(a) determinar en una muestra del individuo la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1; y
determinar además en la muestra la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC­ A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9; y (b) administrar una cantidad eficaz del antagonista de unión a PD-L1 al individuo, en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1, y en el que el tratamiento se basa en la presencia o nivel incrementado de PD-L1 y
la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC­ A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9, en la muestra.
3. Uso de un kit de diagnóstico en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el kit de diagnóstico:
(a) uno o más reactivos adecuados para determinar en una muestra de un individuo con un cáncer la presencia o nivel de PD-L1, en el que la presencia o un incremento en el nivel de PD-L1 en la muestra en relación con el de una muestra de referencia indica que es más probable que el individuo responda al tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1, en el que el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1; y
(b) uno o más reactivos adecuados para determinar en la muestra del individuo la presencia o nivel de:
(i) PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2;
(ii) uno o más marcadores relacionados con linfocitos T, en el que el uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD8A, IFN-g, EOMES, granzima-A y CXCL9;
(iii) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC­ A, MIC-B y CTLA-4; y/o
(iv) uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de la reivindicación 2 o el uso de la reivindicación 3, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, mesotelioma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, sarcoma, cáncer de próstata, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, carcinoma tímico, leucemia, linfomas, mielomas, micosis fungoide, cáncer de células de Merkel, y otras neoplasias hemáticas, en el que:
(a) el cáncer de pulmón es preferentemente un carcinoma de pulmón no microcítico;
(b) el cáncer de riñón es preferentemente un carcinoma de células renales;
(c) el cáncer de mama es preferentemente un cáncer de mama triple negativo; o
(d) el cáncer de vejiga es preferentemente un cáncer de vejiga urotelial.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 o 4, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de la reivindicación 2 o 4, o el uso de la reivindicación 3 o 4, en el que la muestra obtenida del individuo se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una muestra tisular, opcionalmente en la que la muestra tisular es una muestra de tejido tumoral, opcionalmente en la que (i) la muestra de tejido tumoral comprende células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales o combinaciones de las mismas y/o (ii) la muestra tisular se fija con formol y se incluye en parafina, se archiva, fresca o congelada;
(b) una muestra de sangre completa, opcionalmente en la que la sangre completa comprende células inmunitarias, células tumorales circulantes o combinaciones de las mismas;
(c) una muestra de plasma; y
(d) una muestra de suero, o combinaciones de las mismas.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1,4 y 5, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 y 5, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que la muestra se obtiene antes del tratamiento con el antagonista de unión a PD-L1.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-6, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-6, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que la presencia o un nivel incrementado de PD-L1 en la muestra en relación con el de una muestra de referencia indica que es probable que el individuo tenga un incremento en el beneficio clínico cuando el individuo se trata con el antagonista de unión a PD-L1, opcionalmente en el que el incremento en el beneficio clínico comprende un incremento relativo en uno o más de los siguientes: supervivencia global (SG), supervivencia sin progresión (SSP), respuesta completa (RC), respuesta parcial (RP) o combinaciones de los mismos.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-7, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-7, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en el que la presencia o nivel se detecta en la muestra usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en FACS, inmunoelectrotransferencia, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, inmunotransferencia por puntos, procedimientos de inmunodetección, HPLC, resonancia de plasmón superficial, espectroscopía óptica, espectrometría de masas, HPLC, qPCR, RT-qPCR, RT-qPCR o qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY y FISH, o combinaciones de los mismos.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-8, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que la presencia o nivel de PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-9, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-9, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en el que la presencia o nivel de PD-1, PD-L2 o ambos PD-1 y PD-L2 se detectan en la muestra por expresión de ácido nucleico.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-10, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-10, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-10, en el que la presencia o nivel del uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-11, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-11, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en el que la presencia o nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9 se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-12, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-12, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-12, en el que la presencia o nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC-A, MIC-B y CTLA-4 se detecta en la muestra por expresión de ácido nucleico.
14. El procedimiento, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en el que un nivel incrementado de expresión de ácido nucleico detectado en la muestra en comparación con el de una muestra de referencia indica una mayor probabilidad de eficacia cuando el individuo con el cáncer se trata con el antagonista de unión a PD-L1, y un nivel disminuido de expresión de ácido nucleico detectado en la muestra en comparación con el de una muestra de referencia indica una menor probabilidad de eficacia cuando el individuo con el cáncer se trata con el antagonista de unión a PD-L1.
15. El procedimiento, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en el que la expresión de ácido nucleico se determina usando qPCR, RT-qPCR, qPCR múltiple, RT-qPCR múltiple, sec-ARN, análisis de micromatrices, SAGE, técnica MassARRAY o FISH.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-8, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que la presencia o nivel de PD-L1 se detecta en la muestra por expresión de proteína, opcionalmente en el que la expresión de proteína se determina por inmunohistoquímica (IHQ) usando un anticuerpo anti-PD-L1.
17. El procedimiento, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso, o el uso de la reivindicación 16, en el que la expresión de proteína se determina por IHQ, y en el que:
(a) se determina que la muestra de tejido tumoral tiene un nivel de expresión detectable de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor que cubre > 1 % del área tumoral ocupada por células tumorales, estroma desmoplásico percutáneo intratumoral y contiguo asociado en la muestra tumoral;
(b) se determina que la muestra de tejido tumoral tiene un nivel de expresión detectable de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor que cubre entre > 1 % a <5 % del área tumoral ocupada por células tumorales, estroma desmoplásico percutáneo intratumoral y contiguo asociado en la muestra tumoral;
(c) se determina que la muestra de tejido tumoral tiene un nivel de expresión detectable de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor que cubre entre > 5 % a <10 % del área tumoral ocupada por células tumorales, estroma desmoplásico percutáneo intratumoral y contiguo asociado en la muestra tumoral; o
(d) se determina que la muestra de tejido tumoral tiene un nivel de expresión detectable de PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumor que cubre > 10 % del área tumoral ocupada por células tumorales, estroma desmoplásico percutáneo intratumoral y contiguo asociado en la muestra tumoral.
18. El procedimiento, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso, o el uso de la reivindicación 16, en el que PD-L1 se detecta como (a) una intensidad de tinción débil por IHQ; (b) una intensidad de tinción moderada por IHQ; o (c) una intensidad de tinción fuerte por IHQ, opcionalmente en el que la tinción es tinción de membrana, tinción citoplásmica, o combinaciones de las mismas.
19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1,4-8 y 16-18, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4-8 y 16-18, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 y 16-18, en el que la presencia o nivel de PD-1, PD-L2, o ambos PD-1 y PD-L2 se detectan en la muestra por expresión de proteína.
20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1,4-8 y 16-19, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4-8 y 16-19, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-8 y 16-19, en el que la presencia o nivel de uno o más marcadores relacionados con linfocitos T se detecta en la muestra por expresión de proteína.
21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1,4-8 y 16-20, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4-8 y 16-20, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3­ 8 y 16-20, en el que la presencia o nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CXC3L1, CD45RO, IDO1, galectina 9, MIC-A, MIC-B y CTLA-4 se detecta en la muestra por expresión de proteína.
22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1,4-8 y 16-21, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4-8 y 16-21, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3­ 8 y 16-21, en el que la presencia o nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en IFN-g, CD8A, granzima B y CXCL9 se detecta en la muestra por expresión de proteína.
23. El procedimiento, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16-22, en el que la ausencia de PD-L1 se detecta como ausente o sin tinción en la muestra o la presencia o nivel de PD-L1 se detecta como cualquier tinción en la muestra.
24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-23, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-23, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-23, en el que PD-L1 se detecta en células tumorales, células inmunitarias infiltrantes de tumor, células estromales o combinaciones de las mismas.
25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-24, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-24, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-24, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión a ligando, opcionalmente en el que el anticuerpo anti-PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1; la unión de PD-L1 a B7-1; o la unión de PD-L1 a ambos PD-1 y B7-1.
26. El procedimiento, el antagonista de unión a PD-L1 para su uso, o el uso de la reivindicación 25, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente en el que el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-26, el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-26, o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3-26, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 es atezolizumab (MPDL3280A).
28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-27 o el antagonista de unión a PD-L1 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4-27, en el que el tratamiento comprende además una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en agente citotóxico, un agente quimioterápico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente radioterápico y un agente antiangiogénico, o combinaciones de los mismos.
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