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ES2537549T3 - Ensayos de diagnóstico para parvovirus B19 - Google Patents

Ensayos de diagnóstico para parvovirus B19 Download PDF

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ES2537549T3
ES2537549T3 ES02748013.6T ES02748013T ES2537549T3 ES 2537549 T3 ES2537549 T3 ES 2537549T3 ES 02748013 T ES02748013 T ES 02748013T ES 2537549 T3 ES2537549 T3 ES 2537549T3
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Spain
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probe
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nucleic acid
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Sergio Pichuantes
Venkatakrishna Shyamala
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Grifols Worldwide Operations Ltd
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Abstract

Método para detectar infección por parvovirus B19 humano en una muestra biológica, comprendiendo dicho método: (a) aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica sospechosa de comprender ADN de parvovirus B19 humano, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia diana; (b) amplificar la secuencia diana utilizando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa de 5' a 3', un par de cebadores capaces de hibridarse a la secuencia diana, y una sonda de oligonucleótidos diseñada para hibridar en 3' en relación a uno de los cebadores dentro de la secuencia amplificada, en la que (i) dicho par de cebadores comprende un cebador sentido de SEQ ID NO:88 y un cebador antisentido de SEQ ID NO:89; (ii) el extremo 5' de la sonda comprende un colorante informador fluorescente, y el extremo 3' de la sonda está bloqueado para evitar la extensión de la sonda y comprende un colorante que desactiva la fluorescencia del fluoróforo en 5'. (iii) durante la amplificación la polimerasa digiere la sonda de oligonucleótidos cuando se hibrida a la secuencia diana, separando de este modo la molécula informadora de la molécula desactivadora; y (iv) a medida que tiene lugar la amplificación, se monitoriza la fluorescencia de la molécula informadora, correspondiendo la fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico.

Description

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secuencias y son sintetizados fácilmente por técnicas estándares, por ejemplo, síntesis en fase sólida por medio de la química de fosforamidita, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos Nos. 4.458.066 y 4.415.732; Beaucage y otros (1992) Tetrahedron 48:2223-2311, y Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (1 abril 1987). Otros métodos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el método de fosfotriéster descrito por Narang y otros, Meth. Enzymol. (1979) 68:90 y el método de fosfodiéster descrito por Brown y otros, Meth. Enzymol. (1979) 68:109. Poli(a)
o poli(C), u otras extensiones de nucleótidos no complementarias pueden ser incorporadas en las sondas utilizando estos mismos métodos. Las extensiones de óxido de hexaetileno pueden ser unidas a las sondas por métodos conocidos en la técnica. Cload y otros, (1991) J. Am. Chem. Soc.113:6324-6326; patente de Estados Unidos No.
4.914.210 de Levenson y otros; Durand y otros (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359; y Horn y otros (1986) Tet. Lett. 27:4705-4708. Típicamente, las secuencias cebadoras están en el intervalo de entre 10-75 nucleótidos de longitud, tales como 15-60, 20-40 y etcétera, más típicamente en el intervalo de entre 18-40 nucleótidos de longitud, y cualquier longitud entre los intervalos establecidos. La sonda típica está en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de longitud, tales como 15-40, 18-30, y etcétera, y cualquier longitud entre los intervalos establecidos.
Además, las sondas pueden ser unidas a las etiquetas para la detección. Existen varios medios conocidos para la derivación de los oligonucleótidos con funcionalidades reactivas que permiten la adición de una etiqueta. Por ejemplo, varios enfoques están disponibles para biotinilar las sondas de modo que las etiquetas densas radioactivas, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimáticas o electrónicas pueden ser fijadas con avidina. Véase, por ejemplo, Broken y otros, Nucl. Acids. Res. (1978) 5:363-384 el cual describe la utilización de etiquetas de ferritina-avidinabiotina, y Chollet y otros Nucl. Acid. Res. (1985) 13:1529-1541 la cual describe la biotinilación de las terminaciones 5’ de los oligonucleótidos por medio de un brazo enlazador de aminoalquilfosforamida. También están disponibles varios métodos para la síntesis de oligonucleótidos derivados de amino los cuales son etiquetados fácilmente por el agente fluorescente u otros tipos de compuestos derivados por grupos reactivos de amino, tales como isotiocianato, N-hidroxisuccinimida o similares, véase, por ejemplo, Connolly (1987) Nucl. Acis. Res. 15:3131-3139, Gibson y otros (1987) Nucl. Acids Res. 15:6455-6467 y la patente de Estados Unidos No. 4.605.735 de Miyoshi y otros También están disponibles métodos para sintetizar oligonucleótidos derivados de sulfhidrilo los cuales se pueden hacer reaccionar con etiquetas específicas para el tiol, véase por ejemplo la patente de Estados Unidos No. 4.757.141 de Fung y otros, Conolly y otros (1985) Nucl. Acids Res. 13:4485-4502 y Spoat y otros (1987) Nucl. Acids. Res. 15:4837-4848. Una revisión comprensiva de metodologías para etiquetar los fragmentos de ADN se proporciona en Matthews y otros, Anal. Biochem. (1988) 169:1-25.
Por ejemplo, las sondas se pueden etiquetar de forma fluorescente mediante el enlace de una molécula fluorescente a los extremos no ligantes de la sonda. La guía para seleccionar las etiquetas fluorescentes apropiadas puede ser encontrada en Smith y otros, Meth. Enzymol. (1987) 155:260-301; Karger y otros, Nucl. Acids. Res. (1991) 19:49554962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Las etiquetas fluorescentes preferentes incluyen fluoresceína y los derivados de la misma, tales como las descritas en la patente de Estados Unidos No. 4.318.846 y Lee y otros, Cytometry (1989) 10:151-164, y 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 o NAN-2, y similares.
Adicionalmente, las sondas pueden ser etiquetadas con un éster de acridinio (AE) utilizando las técnicas descritas anteriormente. Las tecnologías habituales permiten a la etiqueta de AE que sea colocada en cualquier localización dentro de la sonda. Véase, por ejemplo, Nelson y otros, (1995) “Detection of Acridinium Esters by Chemiluminiscence” en Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, CA; Nelson y otros (1994) “Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR” en The Polymerase Chain Reaction, Mullis y otros (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks y otros, Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry y otros, Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090. Una molécula de AE puede ser fijada directamente a la sonda utilizando la química del brazo enlazador basado en un elemento diferente de nucleótido que permite la colocación de la etiqueta en cualquier localización dentro de la sonda. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.585.481 y 5.185.439.
En ciertas realizaciones, se añade un control interno (CI) o un estándar interno para servir como un control para la captura y amplificación de la diana. Preferentemente, el CI incluye una secuencia que difiere de la secuencia diana, es capaz de hibridación con las secuencias de la sonda utilizadas para separar los oligonucleótidos específicos para el organismo de la muestra, y es capaz de amplificación. La utilización del CI permite el control del proceso de cribado, el proceso de amplificación, y el sistema de detección, y permite la monitorización del funcionamiento del ensayo y la cuantificación para la muestra o muestras. Una secuencia representativa para la cual el CI puede ser obtenido se muestra en la figura 12. El CI puede ser incluido en cualquier punto adecuado, por ejemplo, en el tampón de lisis. En una realización, el CI comprende el ADNss de M13 que contiene una secuencia de nucleótidos de un parvovirus B19 y una secuencia única que se hibrida con la sonda, por ejemplo, que comprende las secuencias de la región VP1, en la que la secuencia diana es modificada por la substitución o supresión de 5-20 bases o más, preferentemente 5-15 bases, tales como 5, 10 ó 15 bases o cualquier número dentro de estos intervalos. Las bases substituidas o suprimidas preferentemente están presentes sobre la longitud total de la secuencia diana de tal modo que solamente 2 ó 3 secuencias consecutivas sean reemplazadas. Así, por ejemplo, si la secuencia diana es CTACTTGCTGCGGGAGAAAAACACCT (SEC ID NO:91), entonces la secuencia puede ser substituida con, por ejemplo, AGCTAGACCTGCATGTCACTG (SEC ID NO:90) en el CI.
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329.822, la solicitud de patente internacional No. WO91/02814, y las patentes de Estados Unidos Nos. 6.063.603, 5.554.517 y 5.409.818.
Las secuencias de parvovirus B19 descritas en el presente documento también son útiles en las técnicas de hibridación y de amplificación de ácidos nucleicos que utilizan moléculas de ADN ramificadas. En un ensayo de hibridación de ácido nucleico básico, el ácido nucleico del analito de una sola hebra se hibrida a una sonda de ácido nucleico de una sola hebra, etiquetada, y los dúplex etiquetados resultantes son detectados. Se han desarrollado variaciones de este esquema básico para facilitar la separación de los dúplex que van a ser detectados de los materiales extraños y/o para amplificar la señal que es detectada. Un método para amplificar la señal utiliza multímeros de amplificación que son polinucleótidos con un primer segmento que se hibrida específicamente al ácido nucleico del analito o una hebra del ácido nucleico unido al analito e iteraciones de un segundo segmento que se hibrida específicamente a una sonda etiquetada. La amplificación es teóricamente proporcional al número de iteraciones del segundo segmento. Los multímeros pueden ser lineales o bien ramificados. Dos tipos generales de multímeros ramificados son útiles en estas técnicas: con horquillas y con peines. Los métodos para fabricar y utilizar moléculas de ácido nucleico ramificadas ya son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la patente de Estados Unidos No. 5.849.481.
Se pueden llevar a cabo dos o más de las pruebas descritas anteriormente para confirmar la presencia del organismo. Por ejemplo, si la primera prueba utilizó la amplificación mediada por transcripción (TMA) para amplificar los ácidos nucleicos para la detección, entonces se realiza un ensayo de prueba del ácido nucleico (NAT) alternativo, por ejemplo, utilizando la amplificación por PCR, RT PCR, y similares, tal como se describe en el presente documento. Así, el parvovirus B19 puede ser detectado de manera específica y selectiva aun cuando la muestra contenga otros organismos, tales como VIH, y virus de la Hepatitis B, por ejemplo.
Tal como es evidente de forma fácil, el diseño de los ensayos descritos en el presente documento es sometido a una gran cantidad de variación, y se conocen muchos formatos en la técnica. Las descripciones anteriores se dan a conocer solamente como una guía y una persona con experiencia en la técnica puede modificar fácilmente los protocolos descritos, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.
Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, incluyendo los cebadores, sondas, el soporte sólido con sondas unidas, así como otros reactivos de detección, pueden ser provistos en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, para llevar a cabo los ensayos tal como se describió anteriormente. El kit normalmente contendrá en recipientes separados la combinación de cebadores y sondas (ya sea unidos a una matriz sólida o separados con reactivos para unirlos a la matriz), formulaciones de control (negativa y/o positiva), reactivos etiquetados cuando el formato de ensayo requiere las mismas y reactivos de generación de la señal (por ejemplo, el sustrato de la enzima) si la etiqueta no genera una señal directamente. Las instrucciones (por ejemplo, escritas, en forma de cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo habitualmente serán incluidas en el kit. El kit también puede contener, dependiendo del ensayo particular utilizado, otros reactivos y materiales empacados (es decir tampones de lavado y similares). Los ensayos estándares, tales como aquellos descritos anteriormente, pueden ser llevados a cabo utilizando los kits.
III. Experimental
A continuación, se encuentran ejemplos de las realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, las cantidades, temperatura, etc.), pero debe ser permitido, por supuesto, algo de desviación y error experimental.
En los siguientes ejemplos, las enzimas fueron compradas de varias fuentes comerciales, y utilizadas de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los filtros de nitrocelulosa y similares también pueden ser comprados de fuentes comerciales.
En el aislamiento de los fragmentos de ADN, excepto en los casos en los que se indique, todas las manipulaciones de ADN se hicieron de acuerdo con los procedimientos estándares. Véase, Sambrook y otros, supra. Las enzimas de restricción, ADN ligasa de T4, E. coli, ADN polimerasa I, fragmento de Klenow, y otros reactivos biológicos pueden ser comprados de los proveedores comerciales y utilizados de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los fragmentos de ADN de doble hebra fueron separados sobre geles de agarosa.
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