ES2267094T3 - Conjunto de sondas de vih para su uso en ensayos de hibridacion en sandwich en fase de disolucion. - Google Patents
Conjunto de sondas de vih para su uso en ensayos de hibridacion en sandwich en fase de disolucion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2267094T3 ES2267094T3 ES93902721T ES93902721T ES2267094T3 ES 2267094 T3 ES2267094 T3 ES 2267094T3 ES 93902721 T ES93902721 T ES 93902721T ES 93902721 T ES93902721 T ES 93902721T ES 2267094 T3 ES2267094 T3 ES 2267094T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- baselineskip
- hiv
- segment
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 157
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 12
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 title description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 108
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 107
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 107
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 88
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 62
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 23
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- -1 β-cyanoethyl Chemical group 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NERWJJDOEYIOPM-UHFFFAOYSA-N 3-[[di(propan-2-yl)amino]-ethyl-dihydroxy-lambda5-phosphanyl]propanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(O)(O)(CC)CCC#N NERWJJDOEYIOPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical compound C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 125000005524 levulinyl group Chemical group 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Treatment Of Water By Ion Exchange (AREA)
Abstract
SE PRESENTAN NUEVAS SECUENCIAS DE SONDAS DE ADN PARA LA DETECCION DEL VIH EN UNA MUESTRA EN UNA PRUEBA DE HIBRIDACION DE ESTRATIFICACION DE FASE DE SOLUCION. SE EJEMPLARIZAN PRUEBAS DE HIBRIDIZACION DE ACIDO NUCLEICO AMPLIFICADO UTILIZANDO LAS SONDAS.
Description
Conjunto de sondas de VIH para su uso en ensayos
de hibridación en sándwich en fase de disolución.
Esta invención está en el campo de ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos. Más específicamente, se refiere a
nuevas sondas de ácidos nucleicos para detectar el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (VIH).
El agente etiológico del SIDA y el CRS se ha
denominado de distintas formas: a LAV, HTLV-III,VIH,
ARV y VIH. En lo sucesivo se denominará VIH. La detección del ARN o
el ADN de este virus es posible a través de una variedad de
secuencias de sondas y formatos de hibridación.
El documento PCT WO88/01302, presentado el 11 de
agosto de 1987, describe trece oligonucleótidos del VIH para su uso
como sondas en la detección del ADN o el ARN del VIH. El documento
PCT WO87/07906, presentado el 22 de junio de 1987, describe
variantes del VIH y el uso de su ADN para diagnosticar el SIDA. El
documento EP0326395 A2, presentado el 27 de enero de 1989, describe
una sonda de ADN del VIH que abarca los nucleótidos
2438-2457 para detectar secuencias asociadas con la
esclerosis múltiple.
El advenimiento de la reacción en cadena de la
polimerasa ha estimulado un intervalo de ensayos que usan sondas
procedentes principalmente de regiones de los genes pol y gag.
Spector y col. (Clin. Chem. 35/8: 1581-1587,
1989) y Kellog y col. (Analytical Biochem 189:
202-208, 1990) describen un ensayo cuantitativo para
el ADN provírico del VIH que usa la reacción en cadena de la
polimerasa usando un cebador del gen gag del VIH. Lomell y col.
(Clin. Chem. 35/9: 1826-1831) describen una
sonda de ARN amplificable complementaria de una región conservada
del ARNm del gen pol del VIH. Coutlee y col. (Anal. Biochem.
181: 96-105, 1989) describen la inmunodetección de
ADN del VIH usando la reacción en cadena de la polimerasa con un
conjunto de cebadores complementarios de las secuencias de los genes
pol y gag del VIH. El documento EP0272098, presentado el 15 de
diciembre de 1987, describe la amplificación y la detección mediante
PCR de secuencias de ARN del VIH usando sondas oligonucleotídicas
que abarcan los nucleótidos 8538-8547 y
8658-8677. El documento EP0229701, presentado el 9
de enero de 1987 describe la detección del VIH mediante la
amplificación del ADN de la región gag del VIH. El documento PCT
WO89/10979 describe un ensayo con una sonda de ácido nucleico que
combina la amplificación y la hibridación en disolución usando
sondas capturadoras e indicadoras, seguido de una inmovilización
sobre un soporte sólido. Con ésta técnica se amplificó una región
dentro de la región p 17 del gag del VIH.
Una estrategia alternativa se denomina
"captura reversible del objetivo". Por ejemplo, Thompson y col.
(Clin. Chem. 35/9: 178-1881, 1989) describen
la "captura reversible del objetivo" del ARN del VIH, en la que
un oligonucleótido con cola dA sintético disponible comercialmente
proporcionó la purificación selectiva del ácido nucleico analito, y
una sonda de ARN antisentido marcada complementaria del gen pol del
VIH proporcionó la señal. Gillespie y col. (Molecular and
Cellular Probes 3: 73-86, 1989) describen sondas
para la captura reversible del objetivo de ARN del VIH, en las que
las sondas son complementarias de los nucleótidos
2094-4682 del gen pol del VIH.
Kumar y col. describen un ensayo de
"desplazamiento de sonda" para el ADN del VIH, usando
secuencias de ADN complementarias de los genes gag y pol del VIH.
Los ensayos de desplazamiento de sonda dependen de la hibridación de
un oligonucleótido marcado con un segmento amplificado mediante PCR
en disolución. El hemidúplex así formado se detecta tras su
fraccionamiento en geles no desnaturalizantes.
Keller y col. (Anal. Biochem. 177:
27-32, 1989) describen un ensayo en sándwich basado
en microtitulación para detectar el ADN del VIH que abarca el sitio
Pst I de la región codificante de gag.
Viscidi y col. (J. Clin. Micro. 27:
120-125, 1989) describen un ensayo de hibridación
para el ARN del VIH que usa un anticuerpo
anti-biotina en fase sólida y un anticuerpo
monoclonal marcado con enzima específico para híbridos de
ADN-ARN, en el que la sonda abarcaba prácticamente
todo el gen de la polimerasa y el extremo 3' del gen gag.
La solicitud de patente europea (EPA) 89311862,
presentada el 16 de noviembre de 1989 describe un kit de diagnóstico
y un procedimiento que usa un medio de captura sólido para detectar
un ácido nucleico, y describe el uso de secuencias de ADN
complementarias del gen gag del VIH para detectar el ADN del
VIH.
El documento U.S. 4.868.105 del solicitante,
describe un ensayo de hibridación en sándwich de un ácido nucleico
en fase de disolución en el que el ácido nucleico analito es en
primer lugar hibridado en disolución con un conjunto de sondas
marcadoras y un conjunto de sondas capturadoras en un primer
recipiente. El complejo sonda-analito se transfiere
entonces a un segundo recipiente que contiene una sonda inmovilizada
en fase sólida que es complementaria de un segmento de las sondas
capturadoras. Los segmentos hibridan con la sonda inmovilizada,
eliminando así el complejo de la disolución. El tener el analito en
forma de un complejo inmovilizado facilita las posteriores etapas de
separación del ensayo. Finalmente, se hibridan segmentos
monocatenarios del conjunto de sondas marcadoras con las sondas
marcadas, permitiendo así que el complejo que contiene el analito
sea detectado a través de una señal producida directa o
indirectamente por el marcaje.
La solicitud de patente europea del solicitante
(EPA) 883096976 describe una variación del ensayo descrito en el
documento U.S. 4.868.105 en el que se amplifica la señal producida
por las sondas marcadas. La amplificación implica el uso de
multímeros de ácidos nucleicos. Estos multímeros son polinucleótidos
ramificados que están construidos para tener un segmento que hibrida
específicamente con el ácido nucleico analito o con un ácido
nucleico (ramificado o lineal) que está unido al analito y
repeticiones de un segundo segmento que hibrida específicamente con
la sonda marcada. En el ensayo que emplea el multímero, siguen las
etapas iniciales de hibridación del analito con conjuntos de sondas
marcadoras o amplificadoras y conjuntos de sondas capturadoras en un
primer recipiente, y la transferencia del complejo a otro recipiente
que contiene un ácido nucleico inmovilizado que hibridará con un
segmento de las sondas capturadoras. Entonces el multímero es
hibridado con el complejo inmovilizado y las sondas marcadas, a su
vez hibridados con las repeticiones del segundo segmento del
multímero. Dado que los multímeros proporcionan un gran número de
sitios para la fijación de la sonda marcadora, la señal es
amplificada. Las secuencias de las sondas amplificadoras y
capturadoras están descritas para el virus de la hepatitis B,
Neisseria gonorrhoeae, resistencia a penicilina y
tetraciclina en N. gonorrhoeae y Chlamydia
trachomatis.
La solicitud pendiente de tramitación comúnmente
ostentada con el nº de serie 558.897, presentada el 27 de julio de
1990, describe la preparación de grandes multímeros de
polinucleótidos en peine ramificados para su uso en el anteriormente
descrito ensayo en fase de disolución. Los peines proporcionan un
aumento mayor de la señal en los ensayos que los multímeros más
pequeños.
El documento U.S. 5.030.557, presentado el 24 de
noviembre de 1987, describe un oligonucleótido "ayudante"
elegido para que se una al ácido nucleico analito e imponga una
diferente estructura secundaria y terciaria en el objetivo para
facilitar la unión de la sonda al objetivo.
Un aspecto de la invención es un conjunto de
oligonucleótidos sintéticos según se define en las reivindicaciones
1 y 3, útiles como sonda amplificadora en un ensayo de hibridación
en sándwich para el VIH que comprende un primer segmento con una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de un
segmento del ácido nucleico del VIH; y un segundo segmento con una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de una
unidad de oligonucleótido de un multímero de ácido nucleico.
Otro aspecto de la invención es un conjunto de
oligonucleótidos sintéticos según se define en las reivindicaciones
2 y 4, útil como sonda capturadora en un ensayo de hibridación en
sándwich para el VIH que comprende un primer segmento con una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de un
segmento del ácido nucleico del VIH; y un segundo segmento con una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de un
oligonucleótido unido a una fase sólida.
Otro aspecto de la invención es un conjunto de
oligonucleótidos separadores según se define en la reivindicación 5,
para su uso en hibridaciones en sándwich para detectar el VIH.
Otro aspecto de la invención es un ensayo de
hibridación en sándwich en disolución según se define en las
reivindicaciones 6 y 7, para detectar la presencia del VIH en una
muestra, que comprende:
(a) poner en contacto la muestra en condiciones
de hibridación con un exceso de (i) un oligonucleótido de sonda
amplificadora que comprende un primer segmento con una secuencia de
nucleótidos sustancialmente complementaria de un segmento del ácido
nucleico del VIH y un segundo segmento con una secuencia de
nucleótidos sustancialmente complementaria de una unidad de
oligonucleótido de un multímero de ácido nucleico y (ii) un
oligonucleótido de sonda capturadora que comprende un primer
segmento con una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente
complementaria de un segmento del ácido nucleico del VIH y un
segundo segmento que es sustancialmente complementario de un
oligonucleótido unido a una fase sólida;
(b) poner en contacto el producto de la etapa
(a) en condiciones de hibridación con dicho oligonucleótido unido a
la fase sólida;
(c) a continuación separar los materiales no
unidos a la fase sólida;
(d) poner en contacto el producto unido de la
etapa (c) en condiciones de hibridación con el multímero de ácido
nucleico, comprendiendo dicho multímero al menos una unidad de
oligonucleótido que es sustancialmente complementaria del segundo
segmento del polinucleótido de la sonda amplificadora y una
multiplicidad de unidades del segundo oligonucleótido que son
sustancialmente complementarias de un oligonucleótido marcado;
(e) eliminar el multímero desunido;
(f) poner en contacto en condiciones de
hibridación el producto del complejo en fase sólida de la etapa (e)
con el oligonucleótido marcado;
(g) eliminar el oligonucleótido marcado
desunido; y
(h) detectar la presencia del marcaje en el
producto del complejo en fase sólida de la etapa (g).
Otro aspecto de la invención es un kit según se
define en las reivindicaciones 8-10 para la
detección del VIH en una muestra que comprende, en combinación:
(i) un conjunto de oligonucleótidos de sonda
amplificadora en el que el oligonucleótido de sonda amplificadora
comprende un primer segmento con una secuencia de nucleótidos
sustancialmente complementaria de un segmento del ácido nucleico del
VIH y un segundo segmento con una secuencia de nucleótidos
sustancialmente complementaria de una unidad de oligonucleótido de
un multímero de ácido nucleico;
(ii) un conjunto de oligonucleótidos de sonda
capturadora en el que el oligonucleótido de sonda capturadora
comprende un primer segmento con una secuencia de nucleótidos que es
sustancialmente complementaria de un segmento del ácido nucleico del
VIH y un segundo segmento que es sustancialmente complementario de
un oligonucleótido unido a una fase sólida;
(iii) un multímero de ácido nucleico,
comprendiendo dicho multímero al menos una unidad de oligonucleótido
que es sustancialmente complementaria del segundo segmento del
polinucleótido de la sonda amplificadora y una multiplicidad de
unidades del segundo oligonucleótido que son sustancialmente
complementarias de un oligonucleótido marcado; y
(iv) un oligonucleótido marcado.
"Ensayo de hibridación de ácido nucleico en
fase de disolución" significa las técnicas de ensayos descritas y
reivindicadas en los documentos patente de EE.UU. nº 4.868.105, EPA
883096976 y nº de serie de EE.UU. 558.897 del solicitante.
Un "nucleótido modificado" significa un
monómero de nucleótido que puede ser incorporado de forma estable en
un polinucleótido y que tiene un grupo funcional adicional.
Preferiblemente, el nucleótido modificado es una
5'-citidina en la que la posición N^{4} está
modificada para proporcionar un grupo funcional hidroxi.
Un "multímero amplificador" significa un
polinucleótido ramificado que es capaz de hibridar simultáneamente
directa o indirectamente con el ácido nucleico analito y con una
multiplicidad de repeticiones de polinucleótido (es decir, bien
repeticiones de otro multímero o bien repeticiones de una sonda
marcada). La ramificación de los multímeros se efectúa mediante
enlaces covalentes, y los multímeros están formados por dos tipos de
unidades de oligonucleótido que son capaces de hibridar,
respectivamente, con el ácido nucleico analito o con un ácido
nucleico hibridado con el ácido nucleico analito y con una
multiplicidad de sondas marcadas. La composición y la preparación de
dichos multímeros se describen en el documento EPA 883096976 y el nº
de serie de EE.UU. 558.897 presentado el 27 de julio de 1990, cuyas
descripciones se incorporan al presente documento por
referencia.
Un "oligonucleótido separador" significa un
oligonucleótido que se une al ARN analito pero que no contiene
ninguna secuencia para su fijación a una fase sólida ni ningún medio
para su detección mediante una sonda amplificadora.
El término "sonda amplificadora" significa
un polinucleótido ramificado o lineal que es construido para que
tenga un segmento que hibride específicamente con el ácido nucleico
analito y un segmento o repeticiones de un segmento que hibriden
específicamente con un multímero amplificador.
El término "sonda capturadora" significa un
oligonucleótido con un segmento sustancialmente complementario de
una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico analito y un
segmento que es sustancialmente complementario de una secuencia de
nucleótidos de una sonda inmovilizada en fase sólida.
"Grande", según se usa en este documento
para describir los polinucleótidos en peine ramificados de la
invención, significa una molécula con al menos aproximadamente 15
sitios de ramificación y al menos aproximadamente 20 repeticiones de
la secuencia de unión a la sonda marcada.
"En peine", según se usa en este documento
para describir la estructura de los polinucleótidos ramificados de
la invención, significa un polinucleótido con un esqueleto lineal
con una multiplicidad de cadenas laterales que se extienden desde el
esqueleto.
Una "molécula conectora escindible"
significa una molécula que puede ser incorporada de forma estable en
una cadena de polinucleótido y que incluye un enlace covalente que
puede ser roto o escindido mediante un tratamiento químico o un
tratamiento físico tal como mediante radiación.
\newpage
Todas las secuencias de ácidos nucleicos
descritas en este documento se escriben en dirección 5' a 3'. Los
nucleótidos se designan de acuerdo a los símbolos de nucleótidos
recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica
IUPAC-IUB.
El protocolo general para las hibridaciones en
sándwich en fase de disolución es como sigue. El ácido nucleico
analito se coloca en un pocillo de microtitulación con un exceso de
dos conjuntos de sondas de ácido nucleico monocatenario: (1) un
conjunto de sondas capturadoras, cada una con una primera secuencia
de unión sustancialmente complementaria del analito y una segunda
secuencia de unión que es sustancialmente complementaria del ácido
nucleico unido a un soporte sólido, por ejemplo, la superficie del
pocillo o una microesfera, y (2) un conjunto de sondas
amplificadoras (ramificadas o lineales), cada una con una primera
secuencia de unión que es capaz de unirse específicamente al analito
y una segunda secuencia de unión que es capaz de unirse
específicamente a un segmento del multímero. El producto resultante
es un complejo de ácido nucleico tricomponente de las dos sondas
hibridadas con el analito a través de sus primeras secuencias de
unión. Las segundas secuencias de unión de las sondas permanecen
como segmentos monocatenarios ya que no son sustancialmente
complementarias del analito. Este complejo hibrida con la sonda
inmovilizada sobre la superficie sólida a través de la segunda
secuencia de unión de la sonda capturadora. El producto resultante
comprende el complejo unido a la superficie sólida a través del
dúplex formado por el oligonucleótido unido a la superficie sólida y
la segunda secuencia de unión de la sonda capturadora. Entonces los
materiales desunidos son eliminados de la superficie tal como
mediante un lavado.
Entonces se añade el multímero de amplificación
al complejo unido en condiciones de hibridación para permitir que el
multímero hibride con la(s) segunda(s)
secuencia(s) de unión disponible(s) de la sonda
amplificadora del complejo. El complejo resultante se separa
entonces de cualquier multímero desunido mediante un lavado.
Entonces se añade el oligonucleótido marcado en condiciones que le
permitan hibridar con las unidades de oligonucleótido
sustancialmente complementarias del multímero. El complejo de ácido
nucleico marcado inmovilizado resultante se lava entonces para
eliminar el oligonucleótido marcado desunido, y se lee.
Los ácidos nucleicos analitos pueden proceder de
diversas fuentes, por ejemplo, fluidos o sólidos biológicos, y
pueden prepararse para el análisis de hibridación mediante varios
medios, por ejemplo, proteinasa K/SDS, sales caotrópicas, etc.
También puede ser ventajoso disminuir el tamaño medio de los ácidos
nucleicos analitos mediante un medio enzimático, físico o químico,
por ejemplo, enzimas de restricción, ultrasonidos, degradación
química (por ejemplo, iones metálicos), etc.. El fragmento puede ser
tan pequeño como de 0,1 kb, siendo habitualmente de al menos
aproximadamente 0,5 kb, y puede ser de 1 kb o mayor. La secuencia
del analito se proporciona en forma monocatenaria para su análisis.
Cuando la secuencia está presente de forma natural en forma
monocatenaria, la desnaturalización no será necesaria. Sin embargo,
cuando la secuencia pueda estar presente en forma bicatenaria, la
secuencia debería ser desnaturalizada. La desnaturalización puede
llevarse a cabo mediante varias técnicas, tales como álcalis,
generalmente desde
aproximadamente 0,05 hasta 0,2 M de hidróxido, formamida, sales, calor, enzimas o combinaciones de los mismos.
aproximadamente 0,05 hasta 0,2 M de hidróxido, formamida, sales, calor, enzimas o combinaciones de los mismos.
Las primeras secuencias de unión de la sonda
capturadora y de la sonda amplificadora que son sustancialmente
complementarias de la secuencia del analito tendrán cada una al
menos 15 nucleótidos, habitualmente al menos 25 nucleótidos, y no
más de aproximadamente 5 kb, habitualmente no más de aproximadamente
1 kb, preferiblemente no más de aproximadamente 100 nucleótidos.
Típicamente tendrán aproximadamente 30 nucleótidos.
Normalmente se elegirán para que se unan a
diferentes secuencias del analito. Las primeras secuencias de unión
pueden elegirse según varias consideraciones. Dependiendo de la
naturaleza del analito, se puede estar interesado en una secuencia
consenso, una secuencia asociada con polimorfismos, un fenotipo o
genotipo en particular, una cepa en particular o similares.
El número de diferentes sondas amplificadoras y
capturadoras usado influye en la sensibilidad del ensayo, porque
cuantas más secuencias de sondas se usen mayor es la señal
proporcionada por el sistema de ensayo. Adicionalmente, el uso de
más secuencias de sondas permite el uso de unas condiciones de
hibridación más rigurosas, reduciendo así la incidencia de
resultados falsos positivos. Por lo tanto, el número de sondas en un
conjunto será de al menos una sonda capturadora y al menos una sonda
amplificadora, más preferiblemente dos sondas capturadoras y dos
amplificadoras, y muy preferiblemente 5-100 sondas
capturadoras y 5-100 sondas amplificadoras. Las
secuencias de la sonda oligonucleotídica para el VIH fueron
diseñadas alineando las secuencias de ADN de 18 cepas de VIH del
GenBank. Las regiones de mayor homología con el gen pol fueron
seleccionadas como sondas capturadoras, mientras que las regiones de
menor homología fueron seleccionadas como sondas amplificadoras. Las
regiones muy heterogéneas fueron seleccionadas como sondas
separadoras. Por lo tanto, según se identifiquen y secuencien más
cepas del VIH, pueden diseñarse sondas adicionales, o puede
modificarse el conjunto actualmente preferible de sondas alineando
la secuencia de la nueva cepa o cepa clínica con las 18 cepas usadas
anteriormente, e identificar de forma similar las regiones de mayor
homología y de menor homología.
Los oligonucleótidos separadores se diseñaron
para ser añadidos al cóctel de hibridación para proteger el ARN de
una posible degradación. Las secuencias de la sonda capturadora y
las secuencias de la sonda marcadora se diseñaron de forma que las
secuencias de la sonda capturadora estuvieran entremezcladas con las
secuencias de la sonda marcadora, o de forma que las secuencias de
la sonda capturadora estuvieran agrupadas entre sí con respecto a
las secuencias de la sonda marcadora.
Los conjuntos de sondas actualmente preferibles
y sus regiones capturadoras o amplificadoras que hibridan
específicamente con el ácido nucleico del VIH se enumeran en el
Ejemplo 2.
Las segundas secuencias de unión de la sonda
capturadora y de la sonda amplificadora se eligen para que sean
sustancialmente complementarias, respectivamente, del
oligonucleótido unido a la superficie sólida y de un segmento del
multímero, y de forma que no sean encontradas por las secuencias
endógenas de la muestra/analito. La segunda secuencia de unión puede
ser contigua a la primera secuencia de unión o estar separada de la
misma por una secuencia intermedia no complementaria. Si se desea,
las sondas pueden incluir otras secuencias no complementarias. Estas
secuencias no complementarias no deben obstaculizar la unión de las
secuencias de unión ni provocar que se produzca una unión no
especifica.
La sonda capturadora y la sonda amplificadora
pueden prepararse mediante procedimientos de síntesis de
oligonucleótidos o mediante clonación, preferiblemente el
primero.
Se apreciará que no es necesario que las
secuencias de unión tengan una complementariedad perfecta para
proporcionar homodúplex. En muchas situaciones los heterodúplex
serán suficientes cuando menos de aproximadamente el 10% de las
bases están incorrectamente emparejadas, ignorando los bucles de
cinco o más nucleótidos. Consecuentemente, según se usa en este
documento, el término "complementaria" significa una
complementariedad exacta en la que cada base de la región de unión
se corresponde exactamente, y "sustancialmente complementaria"
significa una homología del 90% o mayor.
El oligonucleótido marcado incluirá una
secuencia sustancialmente complementaria de las unidades de
oligonucleótido repetitivas del multímero. El oligonucleótido
marcado incluirá una o más moléculas ("marcajes"), que
proporcionan directa o indirectamente una señal detectable. Los
marcajes pueden estar unidos a miembros individuales de la secuencia
sustancialmente complementaria o pueden estar presentes como un
miembro terminal o una cola terminal con una pluralidad de marcajes.
En la literatura científica se ha informado de varios medios para
proporcionar marcajes unidos a las secuencias de oligonucleótidos.
Véanse, por ejemplo, Leary y col., Proc. Natl. Acad, Sci.
EE.UU. (1983) 80: 4045; Renz y Kurz, Nucl. Acids
Res. (1984) 12: 3435; Richardson y Gumport, Nucl.
Acids Res. (1983) 11: 6167; Smith y col., Nucl. Acids.
Res. (1985) 13: 2399; Meinkoth y Wahl, Anal.
Biochem. (1984) 138: 267. Los marcajes pueden estar
unidos covalentemente o no covalentemente a la secuencia
sustancialmente complementaria. Los marcajes que pueden emplearse
incluyen radionúclidos, fluorescedores, quimioluminescedores,
colorantes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas,
inhibidores de enzimas, subunidades de enzimas, iones metálicos y
similares. Algunos marcajes ilustrativos específicos incluyen
fluoresceína, rodamina, rojo de Texas, ficoeritrina, umbeliferona,
luminol, NADPH,
\alpha-\beta-galactosidasa,
peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.
La proporción entre la sonda capturadora y la
sonda amplificadora y los moles previstos de analito será al menos
estequiométrica, y preferiblemente estará en exceso. Esta proporción
es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5:1, y más
preferiblemente de al menos 2:1. Normalmente estará en el intervalo
de 2:1 a 10.000:1. Las concentraciones de cada una de las sondas
variarán generalmente entre aproximadamente 10^{-5} y 10^{-9} M,
variando las concentraciones de la muestra de ácido nucleico desde
10^{-21} hasta 10^{-12} M. Las etapas de hibridación del ensayo
durarán generalmente desde aproximadamente 10 minutos hasta 20
horas, estando completadas frecuentemente en aproximadamente 1
hora. La hibridación puede llevarse a cabo a una temperatura
moderadamente elevada, generalmente en el intervalo de desde
aproximadamente 20°C hasta 80°C, más habitualmente desde
aproximadamente 35°C hasta 70°C, particularmente 65°C.
Las reacciones de hibridación se realizan
habitualmente en un medio acuoso, particularmente un medio acuoso
tamponado, que puede incluir varios aditivos. Los aditivos que
pueden emplearse incluyen bajas concentraciones de detergente (del
0,1 a 1%), sales, por ejemplo, citrato sódico (de 0,017 a 0,17 M),
Ficoll, polivinilpirrolidona, ácidos nucleicos vehiculares,
proteínas vehiculares, etc. Pueden añadirse disolventes no acuosos
al medio acuoso, tales como dimetilformamida, dimetilsulfóxido,
alcoholes y formamida. Estos otros disolventes están presentes
generalmente en unas cantidades que varían del 2 al 50%.
La rigurosidad del medio de hibridación puede
ser controlada mediante la temperatura, la concentración salina, el
sistema disolvente y similares. Por lo tanto, dependiendo de la
longitud y la naturaleza de la secuencia de interés, la rigurosidad
variará.
Dependiendo de la naturaleza del marcaje pueden
emplearse varias técnicas para detectar la presencia del marcaje.
Para los fluorescedores hay disponible un gran número de diferentes
fluorómetros. Para los quimioluminescedores hay disponible
luminómetros o películas. Con las enzimas puede proporcionarse un
producto fluorescente, quimioluminiscente o coloreado, y
determinarse fluorométricamente, luminométricamente,
espectrofotométricamente o visualmente. Los diversos marcajes que se
han empleado en inmunoensayos y las técnicas aplicables a los
inmunoensayos pueden emplearse en los presentes ensayos.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la invención. Estos ejemplos no pretenden limitar la invención en
modo alguno.
Este ejemplo ilustra la síntesis de un
polinucleótido en peine ramificado con 15 sitios de ramificación y
extensiones de la cadena lateral con tres sitios de unión de la
sonda marcada. Este polinucleótido se diseñó para ser usado en una
hibridación en fase de disolución según se describe en el documento
EPA 883096976.
Todas las síntesis químicas de los
oligonucleótidos se realizaron en un sintetizador automático de ADN
(Applied Biosystems, Inc., (ABI) modelo 380 B). Se usó una química
de fosforamidito del tipo \beta-cianoetilo,
incluyendo una fosforilación en 5' que empleó un reactivo
Phostel^{TM} (ABN). Se usaron los protocolos estándar de ABI,
excepto según se indique. Cuando se indica que se usó un múltiplo de
un ciclo (por ejemplo, 1,2 ciclos), se empleó el múltiplo de la
cantidad estándar de amidito recomendada por ABI en el ciclo
especificado. En este documento están anexos los programas para
llevar a cabo por los ciclos 1,2 y 6,4 según se realizaron en el
sintetizador de ADN de Applied Biosystems Modelo 380 B.
En primer lugar se preparó un cuerpo en peine
con la siguiente estructura:
en la que X' es un monómero de
ramificación, y R es un conector escindible de
peryodato.
En primer lugar se sintetiza la porción del
cuerpo en peine a través de las 15 repeticiones (TTX') usando un
vidrio de poro controlado (VPC) con 33,8 mg de timidina derivatizada
con aminopropilo (2000 \ring{A}, 7,4 micromoles de timidina por
gramo de soporte) con un protocolo de 1,2 ciclos. El nucleótido del
sitio de ramificación tenía la fórmula:
en la que R^{2} representa
3
\vskip1.000000\baselineskip
Para la síntesis del cuerpo en peine (sin
incluir las cadenas laterales), la concentración de los monómeros de
\beta-cianoetilfosforamidito era de 0,1 M para A,
C, G y T, 0,15 M para el monómero E del sitio de ramificación, y 0,2
M para el reactivo Phostel^{TM}. La destritilación se realizó con
ácido tricloroacético al 3% en cloruro de metileno, usando un flujo
a través escalonado durante la duración de la desprotección. Al
finalizar, la DMT 5' fue sustituida por un grupo acetilo.
Se sintetizaron como sigue el conector
escindible R y seis extensiones de la cadena lateral de base de la
fórmula 3'-RGTCAGTp (ID. SEC. Nº: 1) en cada
monómero del sitio de ramificación.
La eliminación del grupo protector de base
(R^{2} en la fórmula anterior) se realizó manualmente conservando
el soporte de VPC en la misma columna usada para sintetizar el
cuerpo en peine. En el caso de que R^{2} = levulinilo, se
introdujo una disolución 0,5 M de hidrato de hidracina en
piridina/ácido acético glacial (1:1 v/v) y se mantuvo en contacto
con el soporte de VPC durante 90 eliminando el líquido cada 15 min,
seguido de un lavado extensivo con piridina/ácido acético glacial
(1:1 v/v) y después con acetonitrilo. Tras la desprotección se
añadieron el conector escindible R y seis extensiones de la cadena
lateral usando un ciclo de 6,4.
En estas síntesis la concentración de
fosforamiditos era de 0,1 M (excepto 0,2 M para R y reactivo
Phostel^{TM}; R era
2-(4-(4-(2-dimetoxitritiloxi)etil-)fenoxi-2,3-di(benzoiloxi)-butiloxi)fenil)etil-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidito).
La destritilación se efectúa con una disolución
de ácido tricloroacético al 3% en cloruro de metileno usando un
flujo a través escalonado, seguido de una disolución de aclarado de
tolueno/clorometano (1:1 v/v). Las cadenas del polinucleótido
ramificado fueron eliminadas de los soportes sólidos automáticamente
en el 380E usando el ciclo "CE NH_{3-}". La disolución de
hidróxido amónico se recogió en viales Wheaton con tapón de rosca de
4 ml y se calentó a 60°C durante 12 h para eliminar todos los grupos
protectores de la base. Después de enfriar hasta la temperatura
ambiente, el disolvente se extrajo con un evaporador
Speed-Vac y el residuo se disolvió en 100 \mul de
agua.
También se usaron extensiones del esqueleto en
3' (segmento A), extensiones de la cadena lateral y plantillas de
ligación/conectores de las siguientes estructuras, usando el
sintetizador automático:
extensión del esqueleto en 3'
- 3'-TCCGTATCCTGGGCACAGAGGTGCp-5, (ID. SEC. Nº:2)
extensión de la cadena lateral
- 3'-GATGCG(TTCATGCTGTTGGTGTAG)_{3}-5' (ID. SEC. Nº: 3)
plantilla de ligación para conectar la extensión
del esqueleto en 3'
- 3'-AAAAAAAAAAGCACCTp-5' (ID. SEC. Nº: 4)
plantilla de ligación para conectar la extensión
de la cadena lateral
- 3'-CGCATCACTOAC-5' (ID. SEC. Nº: 5)
El cuerpo en peine bruto se purificó mediante un
procedimiento en gel de poliacrilamida estándar (7% con urea 7 M y 1
X de tampón de ejecución TBE).
La extensión del esqueleto en 3' y las
extensiones de la cadena lateral se ligaron al cuerpo en peine como
sigue. El cuerpo en peine (4 pmol/\mul), la extensión del
esqueleto en 3' (6,25 pmol/\mul), la extensión de la cadena
lateral (93,75 pmol/\mul) y la plantilla de conexión (5
pmol/\mul) se combinaron en ATP 1 mM/DTT 5
mM/Tris-HCl 50 mM, pH 8,0/MgCl_{2} 10
mM/espermidina 2 mM, con 0,5 unidades/\mul de cinasa T4 de
polinucleótido. La mezcla se incubó a 37°C durante 2 h, después se
calentó en un baño de agua hasta 95°C, y después se enfrió hasta
menos de 35°C durante aproximadamente 1 h. Se añadieron ATP 2 mM,
DTT 10 mM, polietilenglicol al 14% y 0,21 unidades/\mul de ligasa
T4, y la mezcla se incubó durante 16-24 h a 23°C. El
ADN se precipitó en NaCl/etanol, se resuspendió en agua y se sometió
a una segunda ligación como sigue. La mezcla se ajustó a ATP 1 mM,
DTT 5 mM, polietilenglicol al 14%, Tris-HCl 50 mM,
pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, espermidina 2 mM, 0,5 unidades/\mul de
cinasa T4 de polinucleótido y se añadieron 0,21 unidades/\mul de
ligasa T4, y la mezcla se incubó a 23°C durante
16-24 h. Los productos de ligación se purificaron
entonces mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida.
Después de la ligación y la purificación, una
porción del producto se marcó con ^{32}P y se sometió a una
escisión en el sitio de R conseguida mediante una oxidación con
NaIO_{4} acuoso durante 1 h. Entonces la muestra se analizó
mediante PAGE para determinar el número de extensiones de la cadena
lateral incorporadas cuantificando el marcaje radioactivo en las
bandas del gel. Se encontró que el producto tenía un total de 45
sitios de unión de la sonda marcados.
Este ejemplo ilustra el uso de la invención en
un ensayo de ADN del VIH.
En este ejemplo se empleó un ensayo de
hibridación en sándwich de ácido nucleico en fase de disolución
amplificado "15 X 3". La designación "15 x 3" deriva del
hecho de que el formato emplea dos multímeros: (1) una sonda
amplificadora con un primer segmento (A) que se une al ácido
nucleico del VIH y un segundo segmento (B) que hibrida con (2) un
multímero amplificador con un primer segmento (B*) que hibrida con
el segmento (B) y quince repeticiones de un segmento (C), en el que
el segmento C hibrida con tres oligonucleótidos marcados.
Los segmentos específicos del VIH de la sonda
amplificadora y capturadora, y sus respectivos nombres, según se usó
en este ensayo, fueron como sigue.
VIH.104 (ID. SEC. Nº: 5)
- TTCCTGGCAAAYYYATKTCTYCTAMTACTGTAT
VIH.105 (ID. SEC. Nº: 6)
- CTCCAATTCCYCCTATCATTTTTGGYTTCCATY
VIH.106 (ID. SEC. Nº: 7)
- KTATYTGATCRTAYTGTCYYACTTTGATAAAAC
VIH.109 (ID. SEC. Nº: 8)
- GTTGACAGGYGTAGGTCCTACYAATAYTGTACC
VIH.110 (ID. SEC. Nº: 9)
- YTCAATAGGRCTAATKGGRAAATTTAAAGTRCA
VIH.112 (ID. SEC. Nº: 10)
- YTCTGTCAATGGCCATTGYTTRACYYTTGGGCC
VIH.113 (ID. SEC. Nº: 11)
- TKTACAWATYTCTRYTAATGCTTTTATTTTYTC
VIH.114 (ID. SEC. Nº: 12)
- AAYTYTTGAAATYTTYCCTTCCTTTTCCATHTC
VIH.115 (ID. SEC. Nº: 13)
- AAATAYKGGAGTATTRTATGGATTYTCAGGCCC
VIH.116 (ID. SEC. Nº: 14)
- TCTCCAYTTRGTRCTGTCYTTTTTCTTTATRGC
VIH.117 (ID. SEC. Nº: 15)
- TYTYYTATTAAGYTCYCTGAAATCTACTARTTT
VIH.120 (ID. SEC. Nº: 16)
- TKTTYTAAARGGYTCYAAGATTTTTGTCATRCT
VIH.121 (ID. SEC. Nº: 17)
- CATGTATTGATADATRAYYATKTCTGGATTTTG
VIH.122 (ID. SEC. Nº: 18)
- TATYTCTAARTCAGAYCCTACATACAAATCATC
VIH.123 (ID. SEC. Nº: 19)
- TCTYARYTCCTCTATTTTTGYTCTATGCTGYYC
VIH.125 (ID. SEC. Nº: 20)
- AAGRAATGGRGGTTCTTTCTGATGYTTYTTRTC
VIH.128 (ID. SEC. Nº: 21)
- TRGCTGCYCCATCTACATAGAAVGTTTCTGCWC
VIH.130 (ID. SEC. Nº: 22)
- GACAACYTTYTGTCTTCCAYTGTYAGTWASATA
VIH.132 (ID. SEC. Nº: 23)
- YGAATCCTGYAAVGCTARRTDAATTGCTTGTAA
VIH.133 (ID. SEC. Nº: 24)
- YTGTGARTCTGTYACTATRTTTACTTCTRRTCC
VIH.135 (ID. SEC. Nº: 25)
- TATTATTTGAYTRACWAWCTCTGATTCACTYTK
VIH. 136 (ID. SEC. Nº: 26)
- CAGRTARACYTTTTCCTTTTTTATTARYTGYTC
VIH.137 (ID. SEC. Nº: 27)
- TCCTCCAATYCCTTTRTGTGCTGGTACCCATGM
VIH.138 (ID. SEC. Nº: 28)
- TCCHBBACTGACTAATYTATCTACTTGTTCATT
VIH.139 (ID. SEC. Nº: 29)
- ATCTATTCCATYYAAAAATAGYAYYTTYCTGAT
VIH.141 (ID. SEC. Nº: 30)
- GTGGYAGRTTAAARTCAYTAGCCATTGCTYTCC
VIH.142 (ID. SEC. Nº: 31)
- CACAGCTRGCTACTATTTCYTTYGCTACYAYRG
VIH.144 (ID. SEC. Nº: 32)
- RYTGCCATATYCCKGGRCTACARTCTACTTGTC
VIH.145 (ID. SEC. Nº: 33)
- DGATWAYTTTTCCTTCYARATGTGTACAATCTA
VIH.145 (ID. SEC. Nº: 34)
- CTATRTAKCCACTRGCYACATGRACTGCTACYA
VIH-147 (ID. SEC. Nº: 35)
- CYTGYCCTGTYTCTGCTGGRATDACTTCTGCTT
VIH.149 (ID. SEC. Nº: 36)
- TGSKGCCATTGTCTGTATGTAYTRYTKTTACTG
VIH.151 (ID. SEC. Nº: 37)
- GAATKCCAAATTCCTGYTTRATHCCHGCCCACC
VIH.152 (ID. SEC. Nº: 38)
- ATTCYAYTACYCCTTGACTTTGGGGRTTGTAGG
VIH.153 (ID. SEC. Nº: 39)
- GBCCTATRATTTKCTTTAATTCHTTATTCATAG
VIH.154 (ID. SEC. Nº: 40)
- CTSTCTTAAGRTGYTCAGCYTGMTCTCTTACYT
VIH.155 (ID. SEC. Nº: 41)
- TAAAATTGTGRATRAAYACTGCCATTTGTACWG
VIH.156 (ID. SEC. Nº: 42)
- CTGCACTGTAYCCCCCAATCCCCCYTYTTCTTT
VIH.157 (ID. SEC. Nº: 43)
- TGTCTGTWGCTATYATRYCTAYTATTCTYTCCC
VIH.158 (ID. SEC. Nº: 44)
- TTRTRATTTGYTTTTGTARTTCTYTARTTTGTA
\vskip1.000000\baselineskip
VIH.103 (ID. SEC. Nº: 45)
- CATCTGCTCCTGTRTCTAATAGAGCTTCYTTTA
VIH.111 (ID. SEC. Nº: 46)
- ATCCATYCCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAGT
VIH.118 (ID. SEC. Nº: 47)
- TATTCCTAAYTGRACTTCCCARAARTCYTGAGT
VIH.119 (ID. SEC. Nº: 48)
- ACWYTGGAATATYGCYGGTGATCCTTTCCAYCC
VIH.126 (ID. SEC. Nº: 49)
- CCATTTRTCAGGRTGGAGTTCATAMCCCATCCA
VIH.127 (ID. SEC. Nº: 50)
- CTAYTATGGGKTCYKTYTCTAACTGGTACCAYA
VIH.134 (ID. SEC. Nº: 51)
- ATCTGGTTGTGCTTGAATRATYCCYARTGCATA
VIH.143 (ID. SEC. Nº: 52)
- CATGCATGGCTTCYCCTTTTAGYTGRCATTTAT
VIH.150 (ID. SEC. Nº: 53)
- AACAGGCDGCYTTAACYGYAGYACTGGTGAAAT
\newpage
VIH.159 (ID. SEC. Nº: 54)
- TGTCYCTGTAATAAACCCGAAAATTTTGAATTT
Cada sonda amplificadora contenía, además de las
secuencias sustancialmente complementarias de las secuencias del
VIH, la siguiente extensión 5' complementaria de un segmento del
multímero amplificador,
- AGGCATAGGACCCGTGTCTT (ID. SEC. Nº: 55)
Cada sonda capturadora contenía, además de las
secuencias sustancialmente complementarias de las secuencias del ADN
del VIH, la siguiente secuencia, secuencia abajo, complementaria del
ADN unido a la fase sólida (XT1*),
- CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG (ID. SEC. Nº: 56).
Además de las sondas amplificadora y
capturadora, se incluyó el siguiente conjunto de oligonucleótidos
separadores del VIH en la mezcla de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
VIH.NOX107 (ID. SEC. Nº: 57)
- TATAGCTTTHTDTCCRCAGATTTCTAYRR,
VIH.NOX109 (ID. SEC. Nº: 58)
- VCCAAKCTGRGTCAACADATTTCKTCCRATTAT,
VIH.NOX124 (ID. SEC. Nº: 59)
- TGGTGTGGTAARYCCCCACYTYAAYAGATGYYS,
VIH.NOX129 (ID. SEC. Nº: 60)
- TCCTGCTTTTCCYWDTYTAGTYTCYCTRY,
VIH.NOX131 (ID. SEC. Nº: 61)
- YTCAGTYTTCTGATTTGTYGTDTBHKTNADRGD,
VIH.NOX140 (ID. SEC. Nº: 62)
- AATTRYTGTGATATTTYTCATGDTCHTCTTGRGCCTT,
VIH.NOX148 (ID. SEC. Nº: 63)
- GCCATCTKCCTGCTAATTTTARDAKRAARTATGCTGTYT.
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas de microtitulación se prepararon como
sigue. Se adquirieron tiras White Microlite 1 Removawell (placas de
microtitulación de poliestireno, 96 pocillos/placa) en Dynatech Inc.
Cada pocillo se llenó con 200 \mul de HCl 1 N y se incubaron a
temperatura ambiente durante 15-20 min. Entonces las
placas se lavaron 4 veces con 1 X PBS y los pocillos se aspiraron
para eliminar el líquido. Entonces los pocillos se llenaron con 200
\mul de NaOH 1 N y se incubaron a temperatura ambiente durante
15-20 min. Las placas se lavaron de nuevo 4 veces
con 1 X PBS y los pocillos se aspiraron para eliminar el
líquido.
Se adquirió poli(phe-lys)
en Sigma Chemicals, Inc.. Este polipéptido tiene una proporción
molar 1:1 de phe:lys y un p. m. medio de 47.900 g/mol. Tiene una
longitud media de 309 aminoácidos y contiene 155 aminas/mol. Se
mezcló una disolución de 1 mg/ml del polipéptido con NaCl 2 M/1 X
PBS hasta una concentración final de 0,1 mg/ml (pH 6,0). Se
añadieron 200 \muL de esta disolución a cada pocillo. La zona se
envolvió en plástico para evitar su secado y se incubó a 30°C hasta
el día siguiente. Entonces la placa se lavó 4 veces con 1 X PBS y
los pocillos se aspiraron para eliminar el líquido.
Se usó el siguiente procedimiento para acoplar
el oligonucleótido XT1* a las placas. La síntesis de XT1* se
describió en el documento EPA 883096976. Se disolvieron 20 mg de
suberato de disuccinimidilo en 300 \mul de dimetilformamida (DMF).
Se añadieron 26 unidades OD_{260} de XT1* a 100 \mul de tampón
de acoplamiento (fosfato sódico 50 mM, pH 7,8). Entonces la mezcla
de acoplamiento se añadió a la disolución de DSS-DMP
y se agitó con un agitador magnético durante 30 min. Se equilibró
una columna NAP-25 con fosfato sódico 10 mM, pH 6,5.
La disolución de DSS-DMF de la mezcla de
acoplamiento se añadió a 2 ml de fosfato sódico 10 mM, pH 6,5, a
4°C. La mezcla se mezcló en vórtex y se cargó en la columna
NAP-25 equilibrada. El ADN de XT1* activado con DSS
se eluyó desde la columna con 3,5 ml de fosfato sódico 10 mM, pH
6,5. Se añadieron 5,6 unidades OD_{260} del ADN de XT1* activado
con DSS eluido a 1500 ml de fosfato sódico 50 mM, pH 7,8. Se
añadieron 50 \mul de esta disolución a cada pocillo y las placas
se incubaron hasta el día siguiente. Entonces la placa se lavó 4
veces con 1 X PBS y los pocillos se aspiraron para eliminar el
líquido.
El lavado final de las placas se realizó como
sigue. Se añadieron 200 \mul de NaOH 0,2 N que contenía SDS al
0,5% (p/v) a cada pocillo. La placa se envolvió con plástico y se
incubó a 65°C durante 60 min. Entonces la placa se lavó 4 veces con
1 X PBS y los pocillos se aspiraron para eliminar el líquido. La
placa lavada se almacenó con microesferas desecantes a
2-8°C.
Se preparó una curva estándar del ADN del VIH
diluyendo el ADN del HMV clonado en suero humano negativo para el
VIH y aportando alícuotas de diluciones correspondientes a un
intervalo de 10 a 200 tmol (1 tmol = 602 moléculas o 10^{-21} mol)
a los pocillos de las placas de microtitulación preparadas según se
describió anteriormen-
te.
te.
La preparación de la muestra consistió en
aportar 12,5 ml de tampón P-K (2 mg/ml de proteinasa
K en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0/NaCl 0,15 M/EDTA 10 mM,
pH 8,0/SDS al 1%/40 \mug/ml de ADN de esperma de salmón tratado
con ultrasonidos) a cada pocillo. Las placas se cubrieron y se
agitaron para mezclar las muestras, se incubaron a 65°C para liberar
los ácidos nucleicos, y después se enfriaron encima de la mesa
durante 5 min.
A cada pocillo se añadió un cóctel de las sondas
amplificadoras y capturadoras específicas del VIH enumeradas
anteriormente (50 fmol de las sondas capturadoras, 50 fmol de las
sondas amplificadoras/pocillo). Las placas se cubrieron y se
agitaron suavemente para mezclar los reactivos, y después se
incubaron a 65°C durante 30
min.
min.
Entonces se añadió a cada pocillo tampón de
neutralización (ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico 0,77 M/NaCl
1,845 M/citrato sódico 0,195 M). Las placas se cubrieron y se
incubaron durante 12-18 h a 65°C.
El contenido de cada pocillo se aspiró para
eliminar todos los fluidos, y los pocillos se lavaron 2 X con tampón
de lavado (SDS al 0,1%/NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M).
Entonces se añadió el multímero amplificador a
cada pocillo (40 \mul de una disolución de 2,5 fmol/\mul en
suero equino al 50%/NaCl 0,06 M/citrato sódico 0,06 M/SDS al %
mezclado 1:1 con 4 X de SSC/SDS al 0,1%/"reactivo de bloqueo"
al 0,5% (Boehringer Mannheim, nº de catálogo 1096 176). Después de
cubrir las placas y de agitar para mezclar el contenido de los
pocillos, las placas se incubaron durante 15 min a 55°C.
Después de un período de 5 min adicionales a
temperatura ambiente, los pocillos se lavaron según se describió
anteriormente.
Entonces se añadió a cada pocillo una sonda
marcada con fosfatasa alcalina, descrita en el documento EP
883096976 (40 \mul/pocillo de 2,5 fmol/\mul). Después de una incubación a 55°C durante 15 min, y de 5 min a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron dos veces como anteriormente, y después 3 X con NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M.
883096976 (40 \mul/pocillo de 2,5 fmol/\mul). Después de una incubación a 55°C durante 15 min, y de 5 min a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron dos veces como anteriormente, y después 3 X con NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M.
Se empleó un dioxetano desencadenado por enzimas
(Schaap y col., Tet. Lett. (1987) 28: 1159-1162 y
Pub. EPA nº 0254051), obtenido en Lumigen, Inc.. A cada pocillo se
añadieron 20 \mul de Lumiphos 530 (Lumigen). Los pocillos se
golpearon suavemente para que el reactivo cayera al fondo y se
agitaron cuidadosamente para distribuir uniformemente el reactivo
por el fondo. Los pocillos se cubrieron y se incubaron a 37°C
durante 40 min.
Entonces las placas se leyeron con un
luminómetro Dynatech ML 1000. El resultado se dio como la integral
completa de la luz producida durante la reacción.
Los resultados se muestran en la Tabla, a
continuación. Los resultados de cada muestra estándar se expresaron
como la diferencia entre la media de control negativo más dos
desviaciones típicas y la media de la muestra menos dos desviaciones
típicas (\delta). Si la \delta es mayor de cero, la muestra se
considera positiva.
Los resultados de la curva estándar de las
sondas del VIH se muestran en la Tabla I. Estos resultados indican
la capacidad de estos conjuntos de sondas para detectar 50 tmol del
ADN del VIH estándar.
| tmol/pocillo de VIH analito | \delta |
| 0 | - - - |
| 10 | -0,56 |
| 20 | -0,51 |
| 50 | 0,39 |
| 100 | 1,93 |
| 200 | 5,48 |
El ARN del VIH se detectó usando esencialmente
el mismo procedimiento que anteriormente, con las siguientes
modificaciones.
Se preparó una curva estándar del ARN del VIH
diluyendo seriadamente una estirpe de VIH en suero humano normal
hasta un intervalo de entre 125 y 5000 TCID_{50}/ml (la
TCID_{50} es el 50% del punto final de la dosis infecciosa en
cultivo tisular). Se preparó una disolución de proteinasa K
añadiendo 10 mg de proteinasa K a 5 ml de diluyente de captura del
VIH (Tris-HCl 53 mM, pH 8/EDTA 10,6 mM/SDS al
1,3%/16 \mug/ml de ADN de esperma de salmón tratado con
ultrasonidos/5,3 X SSC/1 mg/ml de proteinasa K) hasta el 7% en
formamida almacenada a -20°C. Se añadieron mezclas equimolares de
las sondas capturadoras, las sondas marcadoras y los
oligonucleótidos separadores a la disolución de proteinasa K, de
forma que la concentración final de cada sonda fuera de 1670
fmol/ml. Tras la adición de 30 \mul de la disolución de
sonda/proteinasa K a cada pocillo de las placas de microtitulación
preparadas como anteriormente, se añadieron10 \mul de las
diluciones de virus apropiadas a cada pocillo. Las placas se
cubrieron, se agitaron para mezclar y después se incubaron a 65ºC
durante 16 h.
Las placas se retiraron del incubador y se
enfriaron encima de la mesa durante 10 min. Los pocillos se lavaron
2 X según se describió en el Ejemplo 2 anterior. El multímero 15 X 3
se diluyó hasta 1 fmol/\mul en diluyente Amp/Label (preparado
mezclando 2,22 ml de H_{2}O tratada con DEPC (DEPC es
pirocarbonato de dietilo), 1,35 ml de SDS al 10%, 240 \mul de Tris
1 M de pH 8,0, 20 \mul de suero equino, ajustado a 2 mg/ml en
proteinasa K y se calentó hasta 65°C durante 2 h, después se añadió
a 240 \mul de PMSF 0,1 M y se calentó a 37°C durante 1 h, tras lo
cual se añadieron 4 ml de H_{2}O tratada con DEPC, 4 ml de SDS al
10% y 6 ml de SSC 20 X). El multímero 15 X 3 diluido se añadió a 40
\mul/pocillo, las placas se precintaron, se agitaron y se
incubaron a 55°C durante 30 min.
Entonces las placas se enfriaron a temperatura
ambiente durante 10 minutos y se lavaron según se describió
anteriormente. La sonda marcada con fosfatasa alcalina se diluyó
hasta 2,5 fmol/\mul en diluyente Amp/Label y se añadieron 40
\mul a cada pocillo. Las placas se cubrieron, se agitaron y se
incubaron a 55°C durante 15 min.
Las placas se enfriaron 10 min a temperatura
ambiente, se lavaron 2 X como anteriormente y después 3 X con NaCl
0,15 M/citrato sódico 0,015 M. Se añadió el sustrato y se midió la
luminiscencia como anteriormente. La sensibilidad del ensayo fue de
aproximadamente el 1,25 de la TCID_{50}, según se muestra en la
Tabla, a continuación.
| TCID_{50} | \delta |
| 0,00 | - - |
| 1,25 | 0,11 |
| 2,50 | 2,60 |
| 5,00 | 6,37 |
| 10,00 | 14,10 |
| 50,00 | 90,70 |
El ARN del VIH se detectó usando esencialmente
el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3, excepto por las
siguientes modificaciones. El ARN estándar se preparó mediante
transcripción de un transcrito de VIH de 9,0 KB del plásmido
pBHBK10S (Chang, P. S., y col., Clin. Biotech. 2: 23, 1990)
usando polimerasa T7 de ARN. Este ARN del VIH se cuantificó mediante
hibridación con sondas gag y pol capturadas mediante cromatografía
HAP. El ARN estándar se diluyó seriadamente en el diluyente de
proteinasa K descrito anteriormente hasta un intervalo de entre 2,5
y 100 atomol por ml, y se añadieron las mezclas equimolares de las
sondas capturadoras, las sondas marcadoras y los oligonucleótidos
separadores de forma que la concentración de cada sonda fuera de
1670 fmol/ml. Se probaron dos disposiciones de las sondas
capturadoras y marcadoras: sondas capturadoras dispersas, de forma
que las sondas capturadoras están entremezcladas con las sondas
marcadoras, sondas capturadoras agrupadas, de forma que las sondas
capturadoras están dispuestas en agrupamientos contiguos con
respecto a las sondas marcadoras. Los conjuntos de sondas agrupadas
se muestran a continuación.
VIH.116 (ID. SEC. Nº: 14)
- TCTCCAYTTRGTRCTGTCYTTTTTCTTTATRGC
VIH.117 (ID. SEC. Nº: 15)
- TYTYYTATTAAGYTCYCTGAAATCTACTARTTT
VIH.118 (ID. SEC. Nº: 47)
- TATTCCTAAYTGRACTTCCCARAARTCYTGAGT
VIH.119 (ID. SEC. Nº: 48)
- ACWYTGGAATATYGCYGGTGATCCTTTCCAYCC
VIH.120 (ID. SEC. Nº: 16)
- TKTTYTAAARGGYTCYAAGATTTTTGTCATRCT
VIH.155 (ID. SEC. Nº: 41)
- TAAAATTGTGRATRAAYACTGCCATTTGTACWG
VIH.156 (ID. SEC. Nº: 42)
- CTGCACTGTAYCCCCCAATCCCCCYTYTTCTTT
VIH.157 (ID. SEC. Nº: 43)
- TGTCTGTWGCTATYATRYCTAYTATTCTYTCCC
VIH.158 (ID. SEC. Nº: 44)
- TTRTRATTTGYTTTTGTARTTCTYTARTTTGTA
VIH.159 (ID. SEC. Nº: 54)
- TGTCYCTGTAATAAACCCGAAAATTTTGAATTT
VIH.103 (ID. SEC. Nº: 45)
- CATCTGCTCCTGTRTCTAATAGAGCTTCYTTTA
VIH.104 (ID. SEC. Nº: 5)
- TTCCTGGCAAAYYYATKCTYCTAMTACTGTAT
VIH.105 (ID. SEC. Nº: 6)
- CTCCAATTCCYCCTATCATTTTTGGYTTCCATY
VIH.106 (ID. SEC. Nº: 7)
- KTATYTGATCRTAYTGTCYYACTTTGATAAAAC
VIH.108 (ID. SEC. Nº: 8)
- GTTGACAGGYGTAGGTCCTACYAATAYTGTACC
VIH.110 (ID. SEC. Nº: 9)
- YTCAATAGGRCTAATKGGRAAATTTAAAGTRCA
VIH.111 (ID. SEC. Nº: 46)
- ATCCATYCCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAGT
VIH.112 (ID. SEC. Nº: 10)
- YTCTGTCAATGGCCATTGYTTRACYYTTGGGCC
VIH.113 (ID. SEC. Nº: 11)
- TKTACAWATYTCTRYTAATGCTTTTATTTTYTC
VIH.114 (ID. SEC. Nº: 12)
- AAYTYTTGAAATYTTYCCTTCCTTTTCCATHTC
VIH.115 (ID. SEC. Nº: 13)
- AAATAYKGGAGTATTRTATGGATTYTCAGGCCC
VIH.121 (ID. SEC. Nº: 17)
- CATGTATTGATADATRAYYATKTCTGGATTTTG
VIH.122 (ID. SEC. Nº: 18)
- TATYTCTAARTCAGAYCCTACATACAAATCATC
VIH.123 (ID. SEC. Nº: 19)
- TCTYARYTCCTCTATTTTTGYTCTATGCTGYYC
VIH.125 (ID. SEC. Nº: 20)
- AAGRAATGGRGGTTCTTTCTGATGYTTYTTRTC
VIH.126 (ID. SEC. Nº: 49)
- CCATTTRTCAGGRTGGAGTTCATAMCCCATCCA
VIH.127 (ID. SEC. Nº: 50)
- CTAYTATGGGKTCYKTYTCTAACTGGTACCAYA
VIH.128 (ID. SEC. Nº: 21)
- TRGCTGCYCCATCTACATAGAAVGTTTCTGCWC
VIH.130 (ID. SEC. Nº: 22)
- GACAACYTTYTGTCTTCCAYTGTYAGTWASATA
VIH.132 (ID. SEC. Nº: 23)
- YGAATCCTGYAAVGCTARRTDAATTGCTTGTAA
VIH.133 (ID. SEC. Nº: 24)
- YTGTGARTCTGTYACTATRTTTACTTCTRRTCC
VIH.134 (ID. SEC. Nº: 51)
- ATCTGGTTGTGCTTGAATRATYCCYARTGCATA
VIH.135 (ID. SEC. Nº: 25)
- TATTATTTGAYTRACWAWCTCTGATTCACTYTK
VIH.136 (ID. SEC. Nº: 26)
- CAGRTARACYTTTTCCTTTTTTATTARYTGYTC
VIH.137 (ID. SEC. Nº: 27)
- TCCTCCAATYCCTTTRTGTGCTGGTACCCATGM
VIH.138 (ID. SEC. Nº: 28)
- TCCHBBACTGACTAATYTATCTACTTGTTCATT
VIH.139 (ID. SEC. Nº: 29)
- ATCTATTCCATYYAAAAATAGYAYYTTYCTGAT
VIH.141 (ID. SEC. Nº: 30)
- GTGGYAGRTTAAARTCAYTAGCCATTGCTYTCC
VIH.142 (ID. SEC. Nº: 31)
- CACAGCTRGCTACTATTTCYTTYGCTACYAYRG
VIH.143 (ID. SEC. Nº: 52)
- CATGCATGGCTTCYCCTTTTAGYTGRCATTTAT
VIH.144 (ID. SEC. Nº: 32)
- RYTGCCATATYCCKGGRCTACARTCTACTTGTC
VIH.145 (ID. SEC. Nº: 33)
- DGATWAYTTTTCCTTCYARATGTGTACAATCTA
VIH.146 (ID. SEC. Nº: 34)
- CTATRTAKCCACTRGCYACATGRACTGCTACYA
VIH.147 (ID. SEC. Nº: 35)
- CYTGYCCTGTYTCTGCTGGRATDACTTCTGCTT
VIH.149 (ID. SEC. Nº: 36)
- TGSKGCCATTGTCTGTATGTAYTRYTKTTACTG
VIH.150 (ID. SEC. Nº: 53)
- AACAGGCDGCYTTAACYGYAGYACTGGTGAAAT
VIH.151 (ID. SEC. Nº: 37)
- GAATKCCAAATTCCTGYTTRATHCCHGCCCACC
VIH.152 (ID. SEC. Nº: 38)
- ATTCYAYTACYCCTTGACTTTGGGGRTTGTAGG
VIH.153 (ID. SEC. Nº: 39)
- GBCCTATRATTTKCTTTAATTCHTTATTCATAG
VIH.154 (ID. SEC. Nº: 40)
- CTSTCTTAAGRTGYTCAGCYTGMTCTCTTACYT
Tras la adición de 30 \mul de la disolución de
analito/sonda/proteinasa K a cada pocillo, se añadieron 10 \mul de
suero humano normal y el ensayo se llevó a cabo según se describe en
el Ejemplo 3. Según se muestra en la Tabla III, la sensibilidad del
ensayo con una disposición de captura dispersa con respecto a la
agrupada era similar. Usando los extendedores de captura agrupados,
la sensibilidad era de a 50 a 100 tmol, mientras que usando los
extendedores de captura dispersos, la sensibilidad era de 100 a 500
tmol.
| Disposición de la sonda | tmol de analito | \delta |
| 0 | - - - | |
| 25 | -0,16 | |
| 50 | 0,36 | |
| Agrupadas | 100 | 0,65 |
| 500 | 4,45 | |
| 1000 | 6,24 | |
| 0 | - - - | |
| 25 | -0,24 | |
| 50 | 0,25 | |
| Dispersas | 100 | -0,11 |
| 500 | 2,52 | |
| 1000 | 4,79 |
Se pretende que las modificaciones de los modos
de llevar a cabo la invención descritos anteriormente que son obvias
para los expertos en bioquímica, los ensayos de hibridación de
ácidos nucleicos y los campos relacionados, estén en el ámbito de
las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Irvine, Bruce D.
\hskip3.9cmHorn, Thomas
\hskip3.9cmChang, Chu-An
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SONDAS DE VIH PARA SU USO EN ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN EN SÁNDWICH EN FASE DE DISOLUCIÓN.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 63
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Morrison & Foerster
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 755 Page Mill Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE. UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 94304-1018
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/813.583
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-DIC-1991
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- NOTARIO / AGENTE DE INFORMACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Thomas E. Ciotti
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 21.013
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 22300-20150.00
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415-813-5600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415-494-0792
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 706141
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGGAGACA CGGGTCCTAT GCCT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGTGGTTG TCGTACTTGA TGTGGTTGTC GTACTTGATG TGGTTGTCGT ACTTGCGTAG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACGAAAA AAAAAA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCACTAC GC
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCTGGCAA AYYYATKTCT YCTAMTACTG TAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCAATTCC YCCTATCATT TTTGGYTTCC ATY
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipKTATYTGATC RTAYTGTCYY ACTTTGATAA AAC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGACAGGY GTAGGTCCTA CYAATAYTGT ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTCAATAGGR CTAATKGGRA AATTTAAAGT RCA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTCTGTCAAT GGCCATTGYT TRACYYTTGG GCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTKTACAWATY TCTRYTAATG CTTTTATTTT YTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAYTYTTGAA ATYTTYCCTT CCTTTTCCAT HTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAATAYKGGA GTATTRTATG GATTYTCAGG CCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCCAYTTR GTRCTGTCYT TTTTCTTTAT RGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTYTYYTATTA AGYTCYCTGA AATCTACTAR TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTKTTYTAAAR GGYTCYAAGA TTTTTGTCAT RCT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGTATTGA TADATRAYYA TKTCTGGATT TTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATYTCTAAR TCAGAYCCTA CATACAAATC ATC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTYARYTCC TCTATTTTTG YTCTATGCTG YYC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGRAATGGR GGTTCTTTCT GATGYTTYTT RTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTRGCTGCYCC ATCTACATAG AAVGTTTCTG CWC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACAACYTTY TGTCTTCCAY TGTYAGTWAS ATA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYGAATCCTGY AAVGCTARRT DAATTGCTTG TAA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTGTGARTCT GTYACTATRT TTACTTCTRR TCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTATTTGA YTRACWAWCT CTGATTCACT YTK
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGRTARACY TTTTCCTTTT TTATTARYTG YTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTCCAATY CCTTTRTGTG CTGGTACCCA TGM
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCHBBACTG ACTAATYTAT CTACTTGTTC ATT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTATTCCA TYYAAAAATA GYAYYTTYCT GAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGYAGRTT AAARTCAYTA GCCATTGCTT TCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGCTRGC TACTATTTCY TTYGCTACYA YRG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipRYTGCCATAT YCCKGGRCTA CARTCTACTT GTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipDGATWAYTTT TCCTTCYARA TGTGTACAAT CTA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATRTAKCC ACTRGCTACA TGRACTGCTA CYA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCYTGYCCTGT YTCTGCTGGR ATDACTTCTG CTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGSKGCCATT GTCTGTATGT AYTRYTKTTA CTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATKCCAAA TTCCTGYTTR ATHCCHGCCC ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTCYAYTAC YCCTTGACTT TGGGGRTTGT AGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGBCCTATRAT TTKCTTTAAT TCHTTATTCA TAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTSTCTTAAG RTGYTCAGCY TGMTCTCTTA CYT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAAATTGTG RATRAAYACT GCCATTTGTA CWG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCACTGTA YCCCCCAATC CCCCYTYTTC TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCTGTWGC TATYATRYCT AYTATTCTYT CCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTRTRATTTG YTTTTGTART TCTYTARTTT GTA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCTGCTCC TGTRTCTAAT AGAGCTTCYT TTA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCATYCCT GGCTTTAATT TTACTGGTAC AGT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTCCTAAY TGTACTTCCC ARAARTCYTG AGT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACWYTGGAAT ATYGCYGGTG ATCCTTTCCA YCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATTTRTCA GGRTGGAGTT CATAMCCCAT CCA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAYTATGGG KTCYKTYTCT AACTGGTACC AYA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTGGTTGT GCTTGAATRA TYCCYARTGC ATA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGCATGGC TTCYCCTTTT AGYTGRCATT TAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACAGGCDGC YTTAACYGYA GYACTGGTGA AAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCYCTGTA ATAAACCCGA AAATTTTGAA TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCATAGGA CCCGTGTCTT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCTTTGGA GAAAGTGGTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATAGCTTTH TDTCCRCAGA TTTCTAYRR
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipVCCAAKCTGR GTCAACADAT TTCKTCCRAT TAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTGTGGTA ARYCCCCACY TYAAYAGATG YYS
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGCTTTT CCYWDTYTAG TYTCYCTRY
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTCAGTYTTC TGATTTGTYG TDTBHKTNAD RGD
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTRYTGTG ATATTTYTCA TGDTCHTCTT GRGCCTT
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATCTKCC TGCTAATTTT ARDAKRAART ATGCTGTYY
\hfill39
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| SECUENCIA DE ADN | |
| VERSIÓN 2.00 | |
| NOMBRE DE LA SECUENCIA: | 15X-2 |
| LONGITUD DE LA SECUENCIA: | 10 |
| FECHA: | 27 de agosto de 199 |
| HORA: | 14:06 |
| COMENTARIO: |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.3cm
\newpage
Claims (10)
1. Un conjunto de oligonucleótidos sintéticos
útiles como sondas amplificadoras en un ensayo de hibridación en
sándwich para el VIH, en el que cada miembro del conjunto comprende
un primer segmento y un segundo segmento, en el que el primer
segmento comprende una secuencia de nucleótidos que (i) es
sustancialmente complementaria de un segmento del ácido nucleico del
VIH, y (ii) se elige del grupo formado por:
- CATCTGCTCCTGTRTCTAATAGAGCTTCYTTTA
- (ID. SEC. Nº: 45)
- TTCCTGGCAAAYYYATKCTYCTAMTACTGTAT
- (ID. SEC. Nº: 5)
- CTCCAATTCCYCCTATCATTTTTGGYTTCCATY
- (ID. SEC. Nº: 6)
- KTATYTGATCRTAYTGTCYYACTTTGATAAAAC
- (ID. SEC. Nº: 7)
- GTTGACAGGYGTAGGTCCTACYAATAYTGTACC
- (ID. SEC. Nº: 8)
- YTCAATAGGRCTAATKGGRAAATTTAAAGTRCA
- (ID. SEC. Nº: 9)
- ATCCATYCCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAGT
- (ID. SEC. Nº: 46)
- YTCTGTCAATGGCCATTGYTTRACYYTTGGGCC
- (ID. SEC. Nº: 10)
- TKTACAWATYTCTRYTAATGCTTTTATTTTYTC
- (ID. SEC. Nº: 11)
- AAYTYTTGAAATYTTYCCTTCCTTTTCCATHTC
- (ID. SEC. Nº: 12)
- AAATAYKGGAGTATTRTATGGATTYTCAGGCCC
- (ID. SEC. Nº: 13)
- CATGTATTGATADATRAYYATKTCTGGATTTTG
- (ID. SEC. Nº: 17)
- TATYTCTAARTCAGAYCCTACATACAAATCATC
- (ID. SEC. Nº: 18)
- TCTYARYTCCTCTATTTTTGYTCTATGCTGYYC
- (ID. SEC. Nº: 19)
- AAGRAATGGRGGTTCTTTCTGATGYTTYTTRTC
- (ID. SEC. Nº: 20)
- CCATTTRTCAGGRTGGAGTTCATAMCCCATCCA
- (ID. SEC. Nº: 49)
- CTAYTATGGGKTCYKTYTCTAACTGGTACCAYA
- (ID. SEC. Nº: 50)
- TRGCTGCYCCATCTACATAGAAVGTTTCTGCWC
- (ID. SEC. Nº: 21)
- GACAACYTTYTGTCTTCCAYTGTYAGTWASATA
- (ID. SEC. Nº: 22)
- YGAATCCTGYAAVGCTARRTDAATTGCTTGTAA
- (ID. SEC. Nº: 23)
- YTGTGARTCTGTYACTATRTTTACTTCTRRTCC
- (ID. SEC. Nº: 24)
- ATCTGGTTGTGCTTGAATRATYCCYARTGCATA
- (ID. SEC. Nº: 51)
- TATTATTTGAYTRACWAWCTCTGATTCACTYTK
- (ID. SEC. Nº: 25)
- CAGRTARACYTTTTCCTTTTTTATTARYTGYTC
- (ID. SEC. Nº: 26)
- TCCTCCAATYCCTTTRTGTGCTGGTACCCATGM
- (ID. SEC. Nº: 27)
- TCCHBBACTGACTAATYTATCTACTTGTTCATT
- (ID. SEC. Nº: 28)
- ATCTATTCCATYYAAAAATAGYAYYTTYCTGAT
- (ID. SEC. Nº: 29)
- GTGGYAGRTTAAARTCAYTAGCCATTGCTYTCC
- (ID. SEC. Nº: 30)
- CACAGCTRGCTACTATTTCYTTYGCTACYAYRG
- (ID. SEC. Nº: 31)
- CATGCATGGCTTCYCCTTTTAGYTGRCATTTAT
- (ID. SEC. Nº: 52)
- RYTGCCATATYCCKGGRCTACARTCTACTTGTC
- (ID. SEC. Nº: 32)
- DGATWAYTTTTCCTTCYARATGTGTACAATCTA
- (ID. SEC. Nº: 33)
- CTATRTAKCCACTRGCYACATGRACTGCTACYA
- (ID. SEC. Nº: 34)
- CYTGYCCTGTYTCTGCTGGRATDACTTCTGCTT
- (ID. SEC. Nº: 35)
- TGSKGCCATTGTCTGTATGTAYTRYTKTTACTG
- (ID. SEC. Nº: 36)
- AACAGGCDGCYTTAACYGYAGYACTGGTGAAAT
- (ID. SEC. Nº: 53)
- GAATKCCAAATTCCTGYTTRATHCCHGCCCACC
- (ID. SEC. Nº: 37)
- ATTCYAYTACYCCTTGACTTTGGGGRTTGTAGG
- (ID. SEC. Nº: 38)
- GBCCTATRATTTKCTTTAATTCHTTATTCATAG
- (ID. SEC. Nº: 39)
- CTSTCTTAAGRTGYTCAGCYTGMTCTCTTACYT
- (ID. SEC. Nº: 40),
y en el que cada una de dichas secuencias está
representada en el conjunto; y
el segundo segmento comprende una secuencia de
nucleótidos sustancialmente complementaria de una unidad de
oligonucleótido de un multímero de ácido nucleico, en el que dicho
segundo segmento comprende:
- AGGCATAGGACCCGTGTCTT
- (ID. SEC. Nº: 55).
2. Un conjunto de oligonucleótidos sintéticos
útiles como sondas capturadoras en un ensayo de hibridación en
sándwich para el VIH, en el que cada miembro del conjunto comprende
un primer segmento y un segundo segmento, en el que el primer
segmento comprende una secuencia de nucleótidos que (i) es
sustancialmente complementaria de un segmento del ácido nucleico del
VIH, y (ii) se elige del grupo formado por:
- TCTCCAYTTRGTRCTGTCYTTTTTCTTTATRGC
- (ID. SEC. Nº: 14)
- TYTYYTATTAAGYTCYCTGAAATCTACTARTTT
- (ID. SEC. Nº: 15)
- TATTCCTAAYTGRACTTCCCARAARTCYTGAGT
- (ID. SEC. Nº: 47)
- ACWYTGGAATATYGCYGGTGATCCTTTCCAYCC
- (ID. SEC. Nº: 48)
- TKTTYTAAARGGYTCYAAGATTTTTGTCATRCT
- (ID. SEC. Nº: 16)
- TAAAATTGTGRATRAAYACTGCCATTTGTACWG
- (ID. SEC. Nº: 41)
- CTGCACTGTAYCCCCCAATCCCCCYTYTTCTTT
- (ID. SEC. Nº: 42)
- TGTCTGTWGCTATYATRYCTAYTATTCTYTCCC
- (ID. SEC. Nº: 43)
- TTRTRATTTGYTTTTGTARTTCTYTARTTTGTA
- (ID. SEC. Nº: 44)
- TGTCYCTGTAATAAACCCGAAAATTTTGAATTT
- (ID. SEC. Nº: 54),
y en el que cada una de dichas secuencias está
representada en el conjunto; y
en el que el segundo segmento comprende una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de un
oligonucleótido unido a una fase sólida, en el que dicho segundo
segmento comprende:
- CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG
- (ID. SEC. Nº: 56).
3. Un conjunto de oligonucleótidos sintéticos
útiles como sondas amplificadoras en un ensayo de hibridación en
sándwich para el VIH, en el que cada miembro del conjunto comprende
un primer segmento y un segundo segmento, en el que el primer
segmento comprende una secuencia de nucleótidos que (i) es
sustancialmente complementaria de un segmento del ácido nucleico del
VIH, y (ii) se elige del grupo formado por:
- TTCCTGGCAAAYYYATKTCTYCTAMTACTGTAT
- (ID. SEC. Nº: 5)
- CTCCAATTCCYCCTATCATTTTTGGYTTCCATY
- (ID. SEC. Nº: 6)
- KTATYTGATCRTAYTGTCYYACTTTGATAAAAC
- (ID. SEC. Nº: 7)
- GTTGACAGGYGTAGGTCCTACYAATAYTGTACC
- (ID. SEC. Nº: 8)
- YTCAATAGGRCTAATKGGRAAATTTAAAGTRCA
- (ID. SEC. Nº: 9)
- YTCTGTCAATGGCCATTGYTTRACYYTTGGGCC
- (ID. SEC. Nº: 10)
- TKTACAWATYTCTRYTAATGCTTTTATTTTYTC
- (ID. SEC. Nº: 11)
- AAYTYTTGAAATYTTYCCTTCCTTTTCCATHTC
- (ID. SEC. Nº: 12)
- AAATAYKGGAGTATTRTATGGATTYTCAGGCCC
- (ID. SEC. Nº: 13)
- TCTCCAYTTRGTRCTGTCYTTTTTCTTTATRGC
- (ID. SEC. Nº: 14)
- TYTYYTATTAAGYTCYCTGAAATCTACTARTTT
- (ID. SEC. Nº: 15)
- TKTTYTAAARGGYTCYAAGATTTTTGTCATRCT
- (ID. SEC. Nº: 16)
- CATGTATTGATADATRAYYATKTCTGGATTTTG
- (ID. SEC. Nº: 17)
- TATYTCTAARTCAGAYCCTACATACAAATCATC
- (ID. SEC. Nº: 18)
- TCTYARYTCCTCTATTTTTGYTCTATGCTGYYC
- (ID. SEC. Nº: 19)
- AAGRAATGGRGGTTCTTTCTGATGYTTYTTRTC
- (ID. SEC. Nº: 20)
- TRGCTGCYCCATCTACATAGAAVGTTTCTGCWC
- (ID. SEC. Nº: 21)
- GACAACYTTYTGTCTTCCAYTGTYAGTWASATA
- (ID. SEC. Nº: 22)
- YGAATCCTGYAAVGCTARRTDAATTGCTTGTAA
- (ID. SEC. Nº: 23)
- YTGTGARTCTGTYACTATRTTTACTTCTRRTCC
- (ID. SEC. Nº: 24)
- TATTATTTGAYTRACWAWCTCTGATTCACTYTK
- (ID. SEC. Nº: 25)
- CAGRTARACYTTTTCCTTTTTTATTARYTGYTC
- (ID. SEC. Nº: 26)
- TCCTCCAATYCCTTTRTGTGCTGGTACCCATGM
- (ID. SEC. Nº: 27)
- TCCHBBACTGACTAATYTATCTACTTGTTCATT
- (ID. SEC. Nº: 28)
- ATCTATTCCATYYAAAAATAGYAYYTTYCTGAT
- (ID. SEC. Nº: 29)
- GTGGYAGRTTAAARTCAYTAGCCATTGCTYTCC
- (ID. SEC. Nº: 30)
- CACAGCTRGCTACTATTTCYTTYGCTACYAYRG
- (ID. SEC. Nº: 31)
- RYTGCCATATYCCKGGRCTACARTCTACTTGTC
- (ID. SEC. Nº: 32)
- DGATWAYTTTTCCTTCYARATGTGTACAATCTA
- (ID. SEC. Nº: 33)
- CTATRTAKCCACTRGCYACATGRACTGCTACYA
- (ID. SEC. Nº: 34)
- CYTGYCCTGTYTCTGCTGGRATDACTTCTGCTT
- (ID. SEC. Nº: 35)
- TGSKGCCATTGTCTGTATGTAYTRYTKTTACTG
- (ID. SEC. Nº: 36)
- GAATKCCAAATTCCTGYTTRATHCCHGCCCACC
- (ID. SEC. Nº: 37)
- ATTCYAYTACYCCTTGACTTTGGGGRTTGTAGG
- (ID. SEC. Nº: 38)
- GBCCTATRATTTKCTTTAATTCHTTATTCATAG
- (ID. SEC. Nº: 39)
- CTSTCTTAAGRTGYTCAGCYTGMTCTCTTACYT
- (ID. SEC. Nº: 40)
- TAAAATTGTGRATRAAYACTGCCATTTGTACWG
- (ID. SEC. Nº: 41)
- CTGCACTGTAYCCCCCAATCCCCCYTYTTCTTT
- (ID. SEC. Nº: 42)
- TGTCTGTWGCTATYATRYCTAYTATTCTYTCCC
- (ID. SEC. Nº: 43)
- TTRTRATTTGYTTTTGTARTTCTYTARTTTGTA
- (ID. SEC. Nº: 44)
y en el que cada una de dichas secuencias está
representada en el conjunto; y
en el que el segundo segmento comprende una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de una
unidad de oligonucleótido de un multímero de ácido nucleico, en el
que dicho segundo segmento comprende:
- AGGCATAGGACCCGTGTCTT
- (ID. SEC. Nº: 55).
4. Un conjunto de oligonucleótidos sintéticos
útiles como sondas capturadoras en un ensayo de hibridación en
sándwich para el VIH, en el que cada miembro del conjunto comprende
un primer segmento y un segundo segmento, en el que el primer
segmento comprende una secuencia de nucleótidos que (i) es
sustancialmente complementaria de un segmento del ácido nucleico del
VIH, y (ii) se elige del grupo formado por:
- CATCTGCTCCTGTRTCTAATAGAGCTTCYTTTA
- (ID. SEC. Nº: 45)
- ATCCATYCCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAGT
- (ID. SEC. Nº: 46)
- TATTCCTAAYTGRACTTCCCARAARTCYTGAGT
- (ID. SEC. Nº: 47)
- ACWYTGGAATATYGCYGGTGATCCTTTCCAYCC
- (ID. SEC. Nº: 48)
- CCATTTRTCAGGRTGGAGTTCATAMCCCATCCA
- (ID. SEC. Nº: 49)
- CTAYTATGGGKTCYKTYTCTAACTGGTACCAYA
- (ID. SEC. Nº: 50)
- ATCTGGTTGTGCTTGAATRATYCCYARTGCATA
- (ID. SEC. Nº: 51)
- CATGCATGGCTTCYCCTTTTAGYTGRCATTTAT
- (ID. SEC. Nº: 52)
- AACAGGCDGCYTTAACYGYAGYACTGGTGAAAT
- (ID. SEC. Nº: 53)
- TGTCYCTGTAATAAACCCGAAAATTTTGAATTT
- (ID. SEC. Nº: 54)
y en el que cada una de dichas secuencias está
representada en el conjunto; y
en el que el segundo segmento comprende una
secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria de un
oligonucleótido unido a una fase sólida, en el que dicho segundo
segmento comprende:
- CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG
- (ID. SEC. Nº: 56).
5. Un conjunto de oligonucleótidos sintéticos
útiles como oligonucleótidos separadores en un ensayo de hibridación
en sándwich para el VIH, en el que los oligonucleótidos sintéticos
comprenden un segmento que (i) es sustancialmente complementario de
un segmento del ácido nucleico del VIH, y (ii) se elige del grupo
formado por:
- TATAGCTTTHTDTCCRCAGATTTCTAYRR
- (ID. SEC. Nº: 57)
- VCCAAKCTGRGTCAACADATTTCKTCCRATTAT
- (ID. SEC. Nº: 58)
- TGGTGTGGTAARYCCCCACYTYAAYAGATGYYS
- (ID. SEC. Nº: 59)
- TCCTGCTTTTCCYWDTYTAGTYTCYCTRY
- (ID. SEC. Nº: 60)
- YTCAGTYTTCTGATTTGTYGTDTBHKTNADRGD
- (ID. SEC. Nº: 61)
- AATTRYTGTGATATTTYTCATGDTCHTCTTGRGCCTT
- (ID. SEC. Nº: 62) y
- GCCATCTKCCTGCTAATTTTARDAKRAARTATGCTGTYT
- (ID. SEC. Nº: 63),
y en el que cada una de dichas secuencias está
representada en el conjunto.
6. Un ensayo de hibridación en sándwich en
disolución para detectar la presencia del VIH en una muestra, que
comprende
(a) poner en contacto la muestra en condiciones
de hibridación con un exceso de (i) un conjunto de sondas
amplificadoras según la reivindicación 1, (ii) un conjunto de sondas
capturadoras según la reivindicación 2, y (iii) un conjunto de
oligonucleótidos separadores según la reivindicación 5;
(b) poner en contacto el producto de la etapa
(a) en condiciones de hibridación con un oligonucleótido unido a una
fase sólida, en el que el oligonucleótido unido a la fase sólida
comprende una secuencia sustancialmente complementaria de
CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG (ID. SEC. Nº: 56);
(c) a continuación separar los materiales no
unidos a la fase sólida;
(d) poner en contacto el producto unido de la
etapa (c) en condiciones de hibridación con un multímero de ácido
nucleico, comprendiendo dicho multímero al menos una unidad de
oligonucleótido que es sustancialmente complementaria del segundo
segmento de las sondas amplificadoras y una multiplicidad de
unidades del segundo oligonucleótido que son sustancialmente
complementarias de un oligonucleótido marcado;
(e) eliminar el multímero desunido;
(f) poner en contacto en condiciones de
hibridación el producto del complejo en fase sólida de la etapa (e)
con el oligonucleótido marcado;
(g) eliminar el oligonucleótido marcado
desunido; y
(h) detectar la presencia del marcaje en el
producto del complejo en fase sólida de la etapa (g).
7. Un ensayo de hibridación en sándwich en
disolución para detectar la presencia del VIH en una muestra, que
comprende
(a) poner en contacto la muestra en condiciones
de hibridación con un exceso de (i) un conjunto de sondas
amplificadoras según la reivindicación 3, (ii) un conjunto de sondas
capturadoras según la reivindicación 4, y (iii) un conjunto de
oligonucleótidos separadores según la reivindicación 5;
(b) poner en contacto el producto de la etapa
(a) en condiciones de hibridación con un oligonucleótido unido a una
fase sólida, en el que el oligonucleótido unido a la fase sólida
comprende una secuencia sustancialmente complementaria de
CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG (ID. SEC. Nº: 56);
(c) a continuación separar los materiales no
unidos a la fase sólida;
(d) poner en contacto el producto unido de la
etapa (c) en condiciones de hibridación con un multímero de ácido
nucleico, comprendiendo dicho multímero al menos una unidad de
oligonucleótido que es sustancialmente complementaria del segundo
segmento de las sondas amplificadoras y una multiplicidad de
unidades del segundo oligonucleótido que son sustancialmente
complementarias de un oligonucleótido marcado;
(e) eliminar el multímero desunido;
(f) poner en contacto en condiciones de
hibridación el producto del complejo en fase sólida de la etapa (e)
con el oligonucleótido marcado;
(g) eliminar el oligonucleótido marcado
desunido; y
(h) detectar la presencia del marcaje en el
producto del complejo en fase sólida de la etapa (g).
8. Un kit para la detección del VIH en una
muestra que comprende, en combinación,
(i) un conjunto de sondas amplificadoras según
la reivindicación 1;
(ii) un conjunto de sondas capturadoras según la
reivindicación 2;
(iii) un conjunto de oligonucleótidos
separadores según la reivindicación 5;
(iv) un multímero de ácido nucleico,
comprendiendo dicho multímero al menos una unidad de oligonucleótido
que es sustancialmente complementaria del segundo segmento de las
sondas amplificadoras y una multiplicidad de unidades del segundo
oligonucleótido que son sustancialmente complementarias de un
oligonucleótido marcado; y
(v) un oligonucleótido marcado.
9. Un kit para la detección del VIH en una
muestra que comprende, en combinación,
(i) un conjunto de sondas amplificadoras según
la reivindicación 3;
(ii) un conjunto de sondas capturadoras según la
reivindicación 4;
(iii) un conjunto de oligonucleótidos
separadores según la reivindicación 5;
(iv) un multímero de ácido nucleico,
comprendiendo dicho multímero al menos una unidad de oligonucleótido
que es sustancialmente complementaria del segundo segmento de las
sondas amplificadoras y una multiplicidad de unidades del segundo
oligonucleótido que son sustancialmente complementarias de un
oligonucleótido marcado; y
(v) un oligonucleótido marcado.
10. El kit de la reivindicación 8 o de la
reivindicación 9, que comprende además instrucciones para el uso del
mismo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81358391A | 1991-12-23 | 1991-12-23 | |
| US813583 | 1991-12-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2267094T3 true ES2267094T3 (es) | 2007-03-01 |
Family
ID=25212818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES93902721T Expired - Lifetime ES2267094T3 (es) | 1991-12-23 | 1992-12-22 | Conjunto de sondas de vih para su uso en ensayos de hibridacion en sandwich en fase de disolucion. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6300056B1 (es) |
| EP (2) | EP1752545A3 (es) |
| JP (5) | JP3907201B2 (es) |
| AT (1) | ATE329054T1 (es) |
| CA (1) | CA2124797C (es) |
| DE (1) | DE69233630T2 (es) |
| DK (1) | DK0726962T3 (es) |
| ES (1) | ES2267094T3 (es) |
| PT (1) | PT726962E (es) |
| TW (1) | TW294722B (es) |
| WO (1) | WO1993013223A1 (es) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856088A (en) * | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| US6589734B1 (en) | 1989-07-11 | 2003-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of HIV |
| CA2159103C (en) | 1993-03-26 | 2002-03-12 | Sherrol H. Mcdonough | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| US5681697A (en) * | 1993-12-08 | 1997-10-28 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor |
| USRE38442E1 (en) * | 1994-06-22 | 2004-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| US5942391A (en) | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US5876924A (en) * | 1994-06-22 | 1999-03-02 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| EP0717782A1 (en) * | 1994-06-22 | 1996-06-26 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Ligation-dependent amplification for the detection of infectious pathogens and abnormal genes |
| US5733781A (en) * | 1994-07-19 | 1998-03-31 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5780227A (en) * | 1995-06-07 | 1998-07-14 | Sheridan; Patrick J. | Oligonucleotide probe conjugated to a purified hydrophilic alkaline phosphatase and uses thereof |
| US5853974A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-29 | Chiron Corporation | Enhancement of alkaline phosphatase with SDS in chemiluminescent substrates |
| US6265152B1 (en) | 1995-12-22 | 2001-07-24 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for evaluation of HIV mutations |
| US6830887B2 (en) | 1997-03-18 | 2004-12-14 | Bayer Healthcare Llc | Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample |
| US5962665A (en) | 1997-06-16 | 1999-10-05 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2 |
| US6261781B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-07-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Direct detection and mutation analysis of low copy number nucleic acids |
| US6013442A (en) * | 1997-08-05 | 2000-01-11 | Wisconsin Alumni Res Found | Direct quantitation of low copy number RNA |
| JP2001518313A (ja) * | 1997-09-26 | 2001-10-16 | ビジブル ジェネティクス インコーポレイテッド | Ｈｉｖ突然変異の評価方法およびキット |
| US6365346B1 (en) * | 1998-02-18 | 2002-04-02 | Dade Behring Inc. | Quantitative determination of nucleic acid amplification products |
| AU3219400A (en) | 1999-02-03 | 2000-08-25 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Methods and reagents for molecular detection of hiv-1 groups m, n and |
| WO2001004361A2 (en) | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Gen-Probe Incorporated | Detection of hiv-1 by nucleic acid amplification |
| WO2001098537A2 (en) * | 2000-06-17 | 2001-12-27 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid accessible hybridization sites |
| US20090075256A1 (en) * | 2000-06-17 | 2009-03-19 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic Acid Accessible Hybridization Site Identification Using Mass Spectrometry |
| US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| CN101680027A (zh) * | 2007-03-16 | 2010-03-24 | 454生命科学公司 | 检测hiv耐药变异体的系统和方法 |
| US20100136516A1 (en) * | 2008-12-01 | 2010-06-03 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of HIV integrase variants |
| CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| LT2691530T (lt) | 2011-06-10 | 2018-08-10 | Oregon Health & Science University | Cmv glikoproteinai ir rekombinantiniai vektoriai |
| EP2568289A3 (en) | 2011-09-12 | 2013-04-03 | International AIDS Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
| BR112015004537A2 (pt) | 2012-08-31 | 2017-07-04 | Toray Industries | método para detecção de um ácido nucleico alvo por hibridização sanduíche |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| CA2999029A1 (en) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Reagents and methods for analysis of hiv |
| US10689689B2 (en) * | 2015-12-28 | 2020-06-23 | Roche Molecular Systems, Inc. | Generic method for the stabilization of specific RNA |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5008182A (en) * | 1986-01-10 | 1991-04-16 | Cetus Corporation | Detection of AIDS associated virus by polymerase chain reaction |
| AU606043B2 (en) | 1985-03-28 | 1991-01-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detection of viruses by amplification and hybridization |
| WO1987003621A1 (en) | 1985-12-03 | 1987-06-18 | El Gewely M Raafat | Method, kit and product for disease diagnosis |
| US4868105A (en) | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| FR2600342B1 (fr) | 1986-06-19 | 1989-11-17 | Eurobio Lab | Procede pour le depistage, chez les individus seropositifs, des sequences d'adn du retrovirus htlv iii-lav et coffret pour sa mise en oeuvre |
| US5030714A (en) | 1986-06-23 | 1991-07-09 | Institut Pasteur | Variant of LAV viruses |
| JP2641880B2 (ja) | 1986-08-11 | 1997-08-20 | シスカ・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド | 核酸プローブアッセイ法および組成物 |
| EP0272098A3 (en) | 1986-12-15 | 1990-06-06 | City Of Hope National Medical Center | Method for amplification and detection of rna sequences |
| AU608294B2 (en) | 1987-01-16 | 1991-03-28 | Institut Pasteur | Peptides having immunological properties 2-hiv-2 |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| US5030557A (en) * | 1987-11-24 | 1991-07-09 | Ml Technology Venture | Means and method for enhancing nucleic acid hybridization |
| EP0326395A2 (en) | 1988-01-29 | 1989-08-02 | City Of Hope | Method of detecting and identifying certain viral sequences |
| ATE114726T1 (de) | 1988-05-10 | 1994-12-15 | Du Pont | Verfahren zum schnellen nachweis von nukleinsäuren. |
| CA2002076A1 (en) | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Brent A. Burdick | Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids |
| JPH0638758B2 (ja) | 1989-02-03 | 1994-05-25 | イーストマン コダック カンパニー | 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 |
| SG47868A1 (en) * | 1989-06-02 | 1998-04-17 | Pasteur Institut | Nucleotide sequences erived from the genome of hiv-1 hiv-2 and siv type retroviruses and their applications especially for the amplification of the genomes of these (pls see pf1 for |
| DE69131596T2 (de) * | 1990-01-10 | 1999-12-23 | Chiron Diagnostics Corp., East Walpole | Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen |
| FR2663040B1 (fr) * | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
| US5229364A (en) * | 1991-03-15 | 1993-07-20 | Francesca Chiodi | Polypeptides derived from the human immunodeficiency virus endonuclease protein |
-
1992
- 1992-12-22 EP EP06076034A patent/EP1752545A3/en not_active Withdrawn
- 1992-12-22 DE DE69233630T patent/DE69233630T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-22 EP EP93902721A patent/EP0726962B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-22 ES ES93902721T patent/ES2267094T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-22 JP JP51187393A patent/JP3907201B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-22 PT PT93902721T patent/PT726962E/pt unknown
- 1992-12-22 WO PCT/US1992/011168 patent/WO1993013223A1/en active IP Right Grant
- 1992-12-22 AT AT93902721T patent/ATE329054T1/de active
- 1992-12-22 CA CA002124797A patent/CA2124797C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-22 DK DK93902721T patent/DK0726962T3/da active
-
1993
- 1993-01-20 TW TW082100463A patent/TW294722B/zh not_active IP Right Cessation
- 1993-12-17 US US08/169,715 patent/US6300056B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-08-02 JP JP2000235019A patent/JP2001069997A/ja active Pending
-
2002
- 2002-04-17 JP JP2002115427A patent/JP2003000286A/ja not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-07-28 JP JP2004220900A patent/JP2004298197A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-06-29 JP JP2006180511A patent/JP2006254924A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0726962A1 (en) | 1996-08-21 |
| CA2124797C (en) | 2004-03-30 |
| US6300056B1 (en) | 2001-10-09 |
| PT726962E (pt) | 2006-10-31 |
| CA2124797A1 (en) | 1993-07-08 |
| DE69233630T2 (de) | 2007-05-31 |
| WO1993013223A1 (en) | 1993-07-08 |
| EP1752545A3 (en) | 2007-12-26 |
| DE69233630D1 (de) | 2006-07-20 |
| EP0726962A4 (en) | 1998-05-13 |
| EP1752545A2 (en) | 2007-02-14 |
| ATE329054T1 (de) | 2006-06-15 |
| JP3907201B2 (ja) | 2007-04-18 |
| JP2006254924A (ja) | 2006-09-28 |
| TW294722B (es) | 1997-01-01 |
| JP2001069997A (ja) | 2001-03-21 |
| EP0726962B1 (en) | 2006-06-07 |
| JP2003000286A (ja) | 2003-01-07 |
| DK0726962T3 (da) | 2006-10-09 |
| JPH07502654A (ja) | 1995-03-23 |
| JP2004298197A (ja) | 2004-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2267094T3 (es) | Conjunto de sondas de vih para su uso en ensayos de hibridacion en sandwich en fase de disolucion. | |
| US5702891A (en) | HAV probes for use in solution phase sandwich hybridization and assays for detecting the presence of HAV | |
| EP0618924B1 (en) | Hbv amplifier probes for use in solution phase sandwich hybridization assays | |
| JP4131749B2 (ja) | 自己消光性蛍光プローブと方法 | |
| US5710264A (en) | Large comb type branched polynucleotides | |
| US6235465B1 (en) | HTLV-1 probes for use in solution phase sandwich hybridization assays | |
| ES2153807T3 (es) | Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1. | |
| US5407795A (en) | CMV probes for use in solution phase sandwich | |
| ES2370169T3 (es) | Composiciones y métodos para detectar el virus de la hepatitis b. | |
| ES2537549T3 (es) | Ensayos de diagnóstico para parvovirus B19 | |
| RU2142467C1 (ru) | Полинуклеотиды, способ их получения, гибридизационный анализ нуклеиновой кислоты | |
| BR0111992B1 (pt) | Métodos para detectar um ácido nucleico alvo por captura de híbrido de tipo específico | |
| US5618674A (en) | Chlamydiae probes for use in solution phase sandwich hybridization assays | |
| AU695561C (en) | Self-quenching fluorescence probe and method | |
| JPWO2005010181A1 (ja) | 核酸検出方法 |