PL210849B1

PL210849B1 - Sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej

Info

Publication number: PL210849B1
Application number: PL368049A
Authority: PL
Inventors: Sergio Pichuantes; Venkatakrishna Shyamala
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2012-03-30
Also published as: CA2451756A1; WO2003002753A3; US6936442B2; KR100888377B1; EP1537235A4; US20050221300A1; PL368049A1; JP6026401B2; CN1636071A; HU230244B1; NO20035732L; BR0211191A; AU2002318450B2; JP2016182149A; WO2003002753A2; JP2009011324A; BG108526A; MXPA03011802A; SK15752003A3; NO337901B1

Abstract

Wynalazek ujawnia startery i sondy ludzkiego parwowirusa B19, pochodzące z konserwowanych regionów genomu parwowirusa B19. Omawia się także, oparte o kwas nukleinowy, próby z zastosowaniem tych starterów i sond.

Description

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej. Wynalazek należy do dziedziny diagnostyki wirusów, a zwłaszcza odnosi się do testów opartych na kwasach nukleinowych do dokładnego diagnozowania infekcji parwowirusem B19 oraz starterów i sond do użycia w tych testach.

Stan techniki

Ludzki parwowirus B19 należy do rodziny Parvoviridae, gatunku Erythrovirus i jest małym 22-nm ikozahedralnym bezotoczkowym wirusem zawierającym liniową jednoniciową cząsteczkę DNA o wielkoś ci okoł o 5600 nukleotydów. Genom wirusa koduje trzy gł ówne biał ka, VP1, VP2 i NS1. Patrz, Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936 i fig. 1. Białka VP1 (83kDa) i VP2 (58 kDa) są białkami strukturalnymi kapsydu. Oba białka kodowane są przez nakładające się ramki odczytu, odpowiednio przez nukleotydy od 2444 do 4789 i od 3125 do 4789. VP2 stanowi 95% kapsydu a większe białko VP1 tylko 5% kapsydu. Białko VP1 niezbędne jest dla osiągnięcia przez wirusa konformacji dojrzałej. Białko NS1 (77 kDa), jest białkiem niestrukturalnym i jest obecne tylko we frakcji jądrowej zainfekowanych komórek, a nie występuje w cytoplazmie i w nienaruszonych wirionach w surowicy.

Parwowirus B19 był pierwszym wirusem wykrytym w surowicy normalnych dawców krwi i jest jedynym przedstawicielem rodziny Parvoviridae, o którym wiadomo, że jest patogenem człowieka. Wirus ten powoduje występowanie różnych objawów chorobowych. Ludzki parwowirus B19 normalnie powoduje bezobjawowe lub słabe samoograniczające się infekcje u dzieci. U dorosłych, parwowirus B19 może powodować wysypkę, przejściowy, symetryczny ból stawów i zapalenie stawów. Parwowirusa B19 wiąże się z występowaniem przejściowego przełomu aplastycznego, (TAG) u pacjentów cierpiących na zaburzenia hemolityczne. U mających obniżoną odporność pacjentów chorych na ostre białaczki, wrodzone niedobory immunologiczne, AIDS i u pacjentów poddanych przeszczepowi szpiku obserwowano chroniczne infekcje parwowirusem B19 i przewlekłe anemie. Parwowirusa B19 wiąże się z występowaniem śmierci płodów u ciężarnych kobiet.

W większości krajów, infekcje wirusem B19 występują głównie w wieku dziecięcym, a około 50% dzieci ma przeciwciała przeciw parwowirusowi B19 zanim osiągnie wiek 15 lat. Występowanie przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 może się nawet zwiększyć w czasie życia i mogą one występować u ponad 90% ludzi starych.

W przypadku ludzkich infekcji parwowirusem B19, uważ a się że pocz ą tkowa replikacja wirusa następuje w drogach oddechowych. Następnie wirus przenosi się do komórek szpiku kostnego. Powoduje to masowe namnażanie się wirusa i stwierdza się wiremię od 10² do 10¹⁴ cząsteczek/ml, występującą 7-10 dni po zakażeniu, ale przed wystąpieniem objawów. Ustąpienie wiremii skorelowane jest z pojawieniem się specyficznych przeciwciał IgM, których poziom pozostaje podwyższony przez dwa do trzech miesięcy. Przeciwciała IgG przeciw parwowirusowi B19 wykrywa się kilka dni po pojawieniu się przeciwciał IgM i pozostają przez całe życie.

Brak otoczki lipidowej i ograniczona zawartość DNA czyni parwowirusa B19 wyjątkowo opornym na inaktywację fizykochemiczną. Parwowirus B19, szczególnie w wyższych stężeniach może wytrzymać tradycyjne traktowanie ciepłem produktów krwiopochodnych. Udokumentowane jest przenoszenie parwowirusa B19 przez podawanie czynnika VII traktowanego rozpuszczalnikiem-detergentem i preparatów czynnika VIII i czynnika IX traktowanego parą lub suchym gorącem.

Ludzki parwowirus B19 nie rośnie w tradycyjnych hodowlach komórkowych, co powoduje że jego wykrycie i wyizolowanie w laboratorium jest wyjątkowo trudne. Przez wiele lat jedynym źródłem zawierającym antygen była surowica pacjentów z wiremią. Żeby obejść te problemy wytwarzano także rekombinowane antygeny do użycia w testach serologicznych. Patrz, na przykład, Sisk i Berman, Biotechnology (1987) 5:1077-1080; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 6204044. Immunoenzymatyczne testy wychwytu IgM były używane do wykrywania przeciwciał IgM przeciw parwowirusowi B19, a także do diagnozowania niedawnych infekcji parwowirusem. B19. Zdolności diagnostyczne wielu dostępnych w handlu testów, nie są jednakże homogenne. Ponadto, testy diagnostyczne oparte na przeciwciałach IgM nie są w stanie wykryć wirusa w czasie infekcji na poziomie wiremii, a jeż eli przeciwciał a IgM zostaną zsyntetyzowane to pozostają w obiegu przez kilka miesięcy po zakończeniu wiremii.

Duża prewalencja przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 w normalnej populacji razem z faktem, że wysoka wiremia przeważnie trwa tylko jeden tydzień, czyni używanie testów opartych na seroPL 210 849 B1 logii niepraktycznym. Ponadto, u pacjentów z obniżoną odpornością immunologiczną diagnozy oparte na serologii mogą być nie mało wiarygodne.

Do wykrywania parwowirusa B19 używano testów opartych na hybrydyzacji kwasów nukleinowych, takich jak hybrydyzacja dot blot i hybrydyzacja in situ. Testy takie mają wykrywalność na poziomie 1 do 0,1 pg wirusowego DNA (~ 10⁴-10⁵ cząsteczek wirusa). PCR ma większą czułość (~100 kopii genu). Jednakże techniki hybrydyzacji DNA są czasochłonne, a ich użycie jest ograniczone, a PCR nie nadaje się do badań przesiewowych dużej liczby próbek.

W celu zapobieżenia przenoszeniu wirusa przez pochodne krwi lub surowicy lub przez bliski kontakt osobisty istnieje więc potrzeba rozwinięcia wiarygodnych prób diagnostycznych do wykrywania parwowirusa B19 w próbkach z wiremią.

Podsumowanie wynalazku

Sposób według wynalazku oparty jest na odkryciu unikatowych starterów i sond, których można użyć w próbach opartych na kwasach nukleinowych, a także na opracowaniu czułego i wiarygodnego testu diagnostycznego opartego na kwasach nukleinowych do wykrywania DNA parwowirusa B19 w próbkach biologicznych od potencjalnie zakażonych osobników.

Przedmiotem wynalazku jest zatem, sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej przy zastosowaniu próby Taqman polegający na tym, że:

(a) izoluje się kwasy nukleinowe z próbki biologicznej przeznaczonej do określania ludzkiego parwowirusa B19 przez kontaktowanie magnetycznych kulek podłoża zawierających związane z nimi wychwytujące kwasy nukleinowe z próbką biologiczną w warunkach hybrydyzacji, przy czym nici docelowego kwasu nukleinowego ludzkiego parwowirusa B19 jeśli są obecne w próbce biologicznej, hybrydyzują z wychwytującymi kwasami nukleinowymi, przy czym związane, kwasy nukleinowe zawierają jeden lub więcej oligonukleotydów wybranych z grupy składającej się z SEQ ID nr 49-55 i oddziela się kulki magnetyczne od tej próbki;

(b) amplifikuje się izolowane kwasy nukleinowe i wewnętrzną sekwencję kontrolną stosując próbę Taqman z sensownym i antysensownym starterem, przy czym każdy ze starterów jest nie większy niż długość 60 nukleotydów i jest wystarczająco komplementarny do części nici sensownych i antysensownych docelowego kwasu nukleinowego dla hybrydyzacji z nim, przy czym starter sensowny składa się z sekwencji SEQ ID nr 60 i starter antysensowny składa się z sekwencji SEQ ID nr 59; przy czym wewnętrzna sekwencja kontrolna zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 90, i (c) wykrywa się obecność amplifikowanych kwasów nukleinowych ludzkiego parwowirusa B19 stosując sondę nie większą niż 50 nukleotydów długości, która zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 61 jako wskazanie obecności ludzkiego parwowirusa B19 w próbce; i (d) wykrywa się obecność amplifikowanej wewnętrznej sekwencji kontrolnej stosując sondę Taqman.

W sposobie według wynalazku korzystnie wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają oligonukleotydy o sekwencji SEQ ID nr 55 i jeden lub więcej oligonukleotydów o sekwencji SEQ ID nr 49-54.

Bardziej korzystnie, wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają oligonukleotydy o sekwencji

SEQ ID nr 49, 52, 53 i 55.

Opisana tu technika wykorzystuje wyekstrahowaną próbkę DNA jako matrycę do amplifikacji konserwowanych regionów sekwencji DNA parwowirusa B19 przy użyciu metody amplifikacji wspomaganej przez transkrypcję, a także testu 5'-nukleazy, takiej jak technika TaqMan™. Sposób według wynalazku pozwala na wykrycie DNA parwowirusa B19 w próbkach od pacjentów z wiremią mających miano wirusa na poziomie 10³ cząsteczek/ml. Podobnie zainfekowane próbki można wykryć i wykluczyć z transfuzji, a także z przygotowywania preparatów krwiopochodnych. Sondy i startery opisane w wynalazku są także użyteczne na przykład w standardowych metodach hybrydyzacji, a także technikach opartych na PCR, amplifikacji w oparciu o sekwencję kwasów nukleinowych (NASBA) i w próbach wykorzystujących rozgałęzione cząsteczki DNA.

W jednym przykładzie wykonania, sposób według wynalazku obejmuje metodę wykrywania infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych. Metoda taka obejmuje:

(a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19, przy czym taki kwas nukleinowy zawiera sekwencję docelową RNA;

(b) doprowadzenie do reakcji wyizolowanego kwasu nukleinowego parwowirusa B19 z pierwszym oligonukleotydem, który zawiera pierwszy starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części docelowej sekwencji RNA, żeby utworzyć z nią kompleks, przy czym pierwszy starter zawiera także promotor dla zależnej od DNA polimerazy 5' RNA

PL 210 849 B1 połączony funkcjonalnie z sekwencją kompleksującą, tak że taka reakcja przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA.

(c) wydłużenie pierwszego startera w reakcji wydłużania przy użyciu docelowej sekwencji RNA jako matrycy i otrzymanie pierwszego produktu wydłużania startera DNA komplementarnego do docelowej sekwencji RNA;

(d) oddzielenie pierwszego produktu wydłużania startera DNA od docelowej sekwencji RNA przy użyciu enzymu, który selektywnie degraduje docelową sekwencję RNA;

(e) traktowanie produktu wydłużania startera DNA drugim oligonukleotydem, który zawiera drugi starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części produktu wydłużania startera DNA, żeby utworzyć z nią kompleks w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA;

(f) wydłużenie 3'-końca drugiego startera w reakcji wydłużania DNA i otrzymanie drugiego produktu wydłużania startera DNA, otrzymując w ten sposób matrycę dla zależnej od DNA polimerazy RNA;

(g) użycie tej matrycy do wytworzenia wielu kopii RNA sekwencji docelowej przy użyciu zależnej od DNA polimerazy RNA rozpoznającej sekwencję promotorową; i (h) użycie kopii RNA otrzymanych w etapie (g) do autokatalitycznego powtarzania etapów (b) do (g) w celu namnoż enia sekwencji docelowej.

W pewnych przykł adach wykonania, sposób wedł ug wynalazku obejmuje takż e etap:

(i) dodania znakowanej sondy oligonukleotydowej do produktu otrzymanego w etapie (h), tak że taka sonda oligonukleotydowa jest komplementarna do części sekwencji docelowej w warunkach, które umożliwiają hybrydyzację sondy z sekwencją docelową i utworzenie kompleksu sonda:sekwencja docelowa; i (j) wykrycie obecności lub braku znacznika jako wskazania obecności lub braku sekwencji docelowej.

W dodatkowych przykł adach wykonania sposobu wedł ug wynalazku, znacznikiem jest ester akrydynowy.

W jeszcze innych przykładach wykonania sposobu według wynalazku, pierwszy i drugi primer i sondy używane sposobem wedł ug wynalazku pochodzą z regionu VP1 genomu ludzkiego parwowirusa B19, takiego jak sekwencja polinukleotydowa pokazana na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, wykrywanie infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych obejmuje:

(a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19 tak, że taki kwas nukleinowy zawiera RNA sekwencji docelowej;

(b) doprowadzenie do reakcji wyizolowanego kwasu nukleinowego parwowirusa B19 z pierwszym oligonukleotydem, który zawiera pierwszy starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części docelowej sekwencji RNA, żeby utworzyć z nią kompleks, przy czym pierwszy starter zawiera także promotor dla zależnej od DNA polimerazy 5' RNA połączony funkcjonalnie z sekwencją kompleksującą, oraz przy czym pierwszy starter zawiera sekwencję pochodzącą od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z i tym, że taka reakcja przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA.

(e) traktowanie produktu wydłużania startera DNA drugim oligonukleotydem, który zawiera drugi starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części produktu wydłużania startera DNA, żeby utworzyć z nią kompleks, a ten drugi starter pochodzi od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z i traktowanie przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczę cie syntezy DNA w warunkach umoż liwiają cych utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA;

PL 210 849 B1 (f) wydłużenie 3'-końca drugiego startera w reakcji wydłużania DNA i otrzymanie drugiego produktu wydłużania startera DNA, otrzymując w ten sposób matrycę dla zależnej od DNA polimerazy RNA;

(i) dodania znakowanej estrem akrydynowym sondy oligonukleotydowej do produktu otrzymanego w etapie (h) w warunkach, które umożliwiają hybrydyzację sondy z sekwencją docelową i utworzenie kompleksu sonda:sekwencja docelowa, przy czym taka sonda oligonukleotydowa jest komplementarna do części sekwencji docelowej i sonda pochodzi od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z; i (j) wykrycie obecności lub braku znacznika jako wskazania obecności lub braku sekwencji docelowej.

Wynalazek opisuje też metodę namnażania docelowej sekwencji nukleotydowej parwowirusa B19. Metoda taka obejmuje:

(b) dodanie jednego lub więcej starterów zdolnych do hybrydyzacji z sekwencją docelową RNA, przy czym jeden lub więcej starterów pochodzi od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z;

(c) dodanie sondy oligonukleotydowej zdolnej do hybrydyzacji z 3' sekwencją docelową RNA pokrewną jednemu lub więcej starterom;

(d) wydłużenie jednego lub więcej starterów przy użyciu polimerazy.

W pewnych przykł adach wykonania sposobu wedł ug wynalazku, sekwencja docelowa RNA z etapu (a) jest odwrotnie transkrybowana w celu otrzymania cDNA i sposób obejmuje takż e namnożenie cDNA przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) lub reakcji łańcuchowej ligazy z asymetrycznym wypełnieniem przerw DNA (RT-AGLCR). W innych przykładach wykonania sposobu według wynalazku polimerazą jest polimeraza termostabilna, taka jak na przykład ale bez ograniczania polimeraza Taq lub polimeraza Vent. W dodatkowych przykładach wykonania sposobu według wynalazku polimerazą jest polimeraza I DNA E. coli, fragment Klenowa polimerazy I DNA E. coli i/lub polimeraza DNA faga T4.

W pewnych przykł adach wykonania róż nych sposobów wedł ug wynalazku zapewnia się wewnętrzną kontrolę. Kontrola wewnętrzna może pochodzić z sekwencji pokazanej na fig. 12 (SEQ ID NO: 92). W dodatkowych przykładach wykonania sposobu według wynalazku kontrola wewnętrzna obejmuje sekwencję SEQ ID NO: 90.

W dodatkowych przykł adach wykonania sposobu wedł ug wynalazku przedmiotem wynalazku jest metoda wykrywania infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych. Metoda taka obejmuje:

(a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19, znamienne tym, że taki kwas nukleinowy zawiera RNA sekwencji docelowej;

(b) doprowadzenie do reakcji wyizolowanego kwasu nukleinowego parwowirusa B19 z możliwą do wykrycia znakowaną sondą wystarczająco komplementarną i zdolną do hybrydyzacji z sekwencją docelową, przy czym sonda pochodzi od sekwencji polinukleotydowych pokazanych na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z i tym, że taka reakcja przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA.

(c) wykrycie obecności lub braku znacznika jako wskazania obecności lub braku sekwencji docelowej.

W wynalazku opisuje się także polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową zawierającą jedną z sekwencji polinukleotydowych pokazanych na fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z.

Powyższy polinukleotyd charakteryzuje się tym, że sekwencję nukleotydową stanowi sekwencja nukleotydowa pokazana na fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2J, 2K, 2L, 2M, 2N, 20, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2T, 2U, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G, 11H, 11I, 11J, 11K, 11L, 11M, 11N, 11O, 11P, 11Q, 11R, 11Z, 11T, 11U, 11V, 11W, 11X, 11Y lub fig. 11Z.

PL 210 849 B1

Polinukleotyd zawiera także sekwencję nukleotydową zawierającą jedną z sekwencji polinukleotydowych pokazanych na fig. 3A - 30 lub fig. 4A - 4C.

Powyższy polinukleotyd może też mieć sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja nukleotydowa pokazana na fig. 3A-3C lub fig. 4A-4C.

Wynalazek przedstawia także starter polinukleotydowy zawierający region promotorowy rozpoznawany przez zależną od DNA polimerazę RNA funkcjonalnie połączony z sekwencją o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19. W pewnych przykładach wykonania wynalazku, region promotorowy jest promotorem faga T7 a polimeraza jest polimerazą RNA faga T7. Ponadto, sekwencje specyficzne do ludzkiego parwowirusa B19 mogą pochodzić z regionu VP1 genomu ludzkiego parwowirusa B19, tak jak sekwencje polinukleotydowe pokazane na jednej z fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z.

W jeszcze innych przykł adach wykonania wynalazku starter polinukleotydowy zawiera region promotorowy faga T7 funkcjonalnie połączony z sekwencją o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19, przy czym sekwencja kompleksująca specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 pochodzi od jednej z sekwencji polinukleotydowych pokazanych na fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z.

W jeszcze innych przykładach wykonania wynalazku sonda oligonukleotydowa zawiera sekwencję o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 połączoną z estrem akrydynowym jako znacznikiem. Sekwencja kompleksująca specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 może pochodzić z regionu VP1 genomu ludzkiego parwowirusa B19, tak jak sekwencje polinukleotydowe pokazane na jednej z fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z.

W oparciu o sposób wykrywania według wynalazku można utworzyć diagnostyczny zestaw testowy zawierający jeden lub więcej opisanych tu starterów oligonukleotydowych i instrukcję prowadzenia testów diagnostycznych. Taki zestaw testowy zawiera także sondę oligonukleotydową zawierającą sekwencję o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 połączoną z estrem akrydynowym jako znacznikiem.

Wynalazek jest zilustrowany w załączonych rysunkach na których poszczególne figury oznaczają:

Figura 1 jest diagramem prezentującym genom ludzkiego parwowirusa B19, pokazującym różne regiony kodujące wirusa. Pokazane są trzy fragmenty, jeden o wielkości około 700 par zasad, odpowiadający pozycjom nukleotydowym 2936 - 3635 genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936; jeden o wielkości około 370 par zasad we fragmencie o wielkości 700 par zasad, odpowiadający pozycjom nukleotydowym 3073 - 3442 genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936 i jeden o wielkości około 214 par zasad odpowiadający pozycjom nukleotydowym 4728 - 4941 genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936.

Figury 2A do 2U (SEQ ID NO: 1 - 21) pokazują sekwencje DNA różnych izolatów parwowirusa B19, które obejmują odpowiadające pozycjom nukleotydowym 2936 - 3635 genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: 921 - 936 (fragment o wielkości 700 par zasad pokazany na fig. 1). Figura 2A (SEQ ID NO:1) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH47-26; fig. 2B (SEQ ID NO:2) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH48-29; fig. 2C (SEQ ID NO:3) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH33-2; fig. 2D (SEQ ID NO:4) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH33-3; fig. 2E (SEQ ID NO:5) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH33-4; fig. 2F (SEQ ID NO:6) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH42-7; fig. 2G (SEQ ID NO:7) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH42-18; fig. 2H (SEQ ID NO:8) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH42-19; fig. 21 (SEQ ID NO:9) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH46-23; fig. 2J (SEQ ID NO: 10) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH1-1; fig. 2K (SEQ ED NO:11) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH1-6; fig. 2L (SEQ ID NO: 12) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH2-8; fig. 2M (SEQ ID NO: 13) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH2-10; fig. 2N (SEQ ED NO: 14) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH2-11C; fig. 20 (SEQ ID NO: 15) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CHS-13; fig. 2P (SEQ ID NO: 16) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH7-22; fig. 2Q (SEQ ID NO: 17) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH13-27; fig. 2R (SEQ ID NO: 18) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH14-33; fig. 2S (SEQ ED NO: 19) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH62-2; fig. 2T (SEQ ID NO:20) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH64-2; i fig. 2U (SEQ ID NO:21) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH67-2.

Figury 3A - 3C (SEQ ID NO: 22) pokazują sekwencję fragmentu PCR o wielkości około 4,7 kilopar zasad pokazanego na fig. 1 pochodzącą z klonu 2-B1 parwowirusa B19. Sekwencja jest fragPL 210 849 B1 mentem o wielkości 4677 nukleotydów i odpowiada pozycjom nukleotydowym 217-4893 opisanym w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: 921-936. Pokazane sekwencje obejmują pełnej długości ramkę odczytu parwowirusa B19, która koduje NS1, VP1 i VP2, oraz dodatkowe 5' i 3' sekwencje nie ulegające translacji.

Figury 4A - 4C (SEQ ID NO: 23) pokazują sekwencję fragmentu PCR o wielkości około 4,7 kilopar zasad pokazanego na fig. 1 pochodzącą z klonu 2-B6 parwowirusa B19. Sekwencja jest fragmentem o wielkości 4677 nukleotydów i odpowiada pozycjom nukleotydowym 217-4893 opisanym w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: 921-936. Pokazane sekwencje obejmują pełnej długości ramkę odczytu parwowirusa B19, która koduje NS1, VP1 i VP2, oraz dodatkowe 5' i 3' sekwencje nie ulegające translacji.

Figury 5A (SEQ ED NO:24) i 5B (SEQ ED NO:25) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową NS1 klonu 2-B1 parwowirusa B19

Figury 6A (SEQ ID NO: 26) i 6B (SEQ ID NO: 27) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP1 klonu 2-B1 parwowirusa B19.

Figury 7A (SEQ ID NO: 28) i 7B (SEQ ID NO: 29) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP2 klonu 2-B1 parwowirusa B19.

Figury 8A (SEQ ED NO: 30) i 8B (SEQ ED NO: 31) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową NS1 klonu 2-B6 parwowirusa B19.

Figury 6A (SEQ ID NO: 32) i 6B (SEQ ID NO: 33) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP1 klonu 2-B6 parwowirusa B19.

Figury 7A (SEQ ID NO: 34) i 7B (SEQ ID NO: 35) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP2 klonu 2-B6 parwowirusa B19.

Figury 11A do 11Z (SEQ ID NO: 62 - 87) pokazują sekwencje DNA różnych izolatów parwowirusa B19, które obejmują odpowiadające pozycjom nukleotydowym 2936 - 3635 genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: 921 - 936 (fragment o wielkości 700 par zasad pokazany na fig. 1). Figura 11A (SEQ ID NO:62) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH80-1; fig. 11B (SEQ ID NO:63) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH81-3; fig. 11C (SEQ ID NO:64) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCLI-4; fig. 11D (SEQ ID NO:65) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL2-1; fig. 11E (SEQ ID NO:66) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL3-1; fig. 11F (SEQ ID NO:67) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL4-3; fig. 11G (SEQ ID NO:68) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL5-2; fig. 11H (SEQ ID NO:69) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL6-2; fig. 11I (SEQ ID NO:70) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL7-3; fig. 11J (SEQ ID NO:71) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL8-2; fig. 11K (SEQ ID NO:72) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL9-1; fig. 11L (SEQ ID NO:73) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL9-9; fig. 11M (SEQ ID NO:74) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL10-2; fig. 11N (SEQ ID NO:75) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL11-1; fig. 11O (SEQ ID NO:76) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL12-1; fig. 11P (SEQ ID NO:77) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SGL13-3; fig. 11Q (SEQ ID NO:78) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL14-1; fig. 11R (SEQ ID NO:79) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL15-3; fig. 11S (SEQ ID NO:80) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL16-2; fig. 11T (SEQ ID NO:81) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL17-1; fig. 11U (SEQ ID NO:82) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL18-1; fig. 11V (SEQ ID NO:83) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL19-1; fig. 11W (SEQ ID NO:84) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL20-3; fig. 11X (SEQ ID NO:85) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL21-3; fig. 11Y (SEQ ID NO:86) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL22-11; fig. 11Z (SEQ ID NO:87) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL2-14.

Figura 12 (SEQ ID NO:92) pokazuje przykładową sekwencję, z której można otrzymać kontrolę wewnętrzną (IC) do wychwytu sekwencji docelowych i ich namnażania.

Szczegółowy opis sposobu według wynalazku

W praktycznym wykonaniu sposobu według wynalazku wykorzystuje się, jeśli nie wyszczególniono inaczej, tradycyjne metody chemiczne, biochemiczne, techniki rekombinacji DNA i wirologii, znane biegłym w sztuce. Techniki takie wyjaśnione są całkowicie w literaturze. Patrz, na przykład. Fundamental Virology, Wydanie 2, Tom I i II (edytorzy B.N. Fields i D.M. Knipe); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., ostatnie wydanie); Sambrook i wsp.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Wydanie 2, 1989); Methods In Enzymology (edytorzy S. Colowick i N. Kaplan, Academic

PL 210 849 B1

Press, Inc.); Oligonukleotyd Synthesis (edytor N. Gait, 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

W tym tekście używa się następujących skrótów aminokwasów.

Arginina: Arg ®

Kwas asparaginowy: Asp (D) Glutamina: Gln (Q)

Glicyna: Gly (G)

Izoleucyna: Ile (I)

Lizyna: Lys (K)

Fenyloalanina: Phe (F) Seryna: Ser (S)

Tryptofan: Trp (W)

Walina: Val (V)

Alanina: Ala (A)

Asparagina: Asn (N)

Cysteina: Cys (C)

Kwas glutaminowy: Glu (E)

Histydyna: His (H)

Leucyna: Leu (L)

Metionina: Met (M)

Prolina: Pro (P)

Treonina: Thr (T)

Tyrozyna: Tyr (Y)

1. Definicje

W opisie sposobu wedł ug wynalazku uż yto nastę pują cych terminów, których definicje są podane poniżej.

Terminy polipeptyd, proteina i białko oznaczają polimer reszt aminokwasowych i nie są ograniczone przez minimalną wielkość produktu. Definicja ta obejmuje peptydy, oligopeptydy, dimery, multimery. Definicja ta obejmuje zarówno białka pełnej długości jak i ich fragmenty. Termin obejmuje także modyfikacje polipeptydu po jego ekspresji, na przykład, glikozylację, acetylację, fosforylację. Ponadto, do celów sposobu według wynalazku termin polipeptyd oznacza białko, które w stosunku do sekwencji natywnej posiada modyfikacje, takie jak delecje, addycje lub podstawienia (w naturze przeważnie konserwowane), tak długo jak białko takie zachowuje pożądaną aktywność. Takie modyfikacje można robić umyślnie, na przykład metodą mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, lub przypadkowo, na przykład w wyniku mutacji szczepu gospodarza wytwarzającego białko lub błędów w czasie amplifikacji metodą PCR.

Polipeptyd parwowirusa B19 jest polipeptydem, tak jak zdefiniowano powyżej, pochodzącym od białka kodowanego przez genom B19, takiego jak białka niestrukturalne, NS1 i NS2, a także od białek tworzących kapsyd wirusa, VP1 (około 781 aminokwasów długości) lub VP2 (około 554 aminokwasów długości). Reprezentatywne sekwencje NS1, VP1 i VP2 pokazane są na fig. 5-10. Polipeptyd nie musi fizycznie pochodzić z parwowirusa B19, ale może być stworzony syntetycznie lub metodami rekombinacji. Ponadto, polipeptyd może pochodzić z każdego z różnych szczepów i izolatów parwowirusa B19. Wśród tych szczepów i izolatów znanych jest kilka konserwowanych i zmiennych regionów i jeżeli porównuje się dwie sekwencje, sekwencje aminokwasowe, na przykład epitopów, pochodzących z tych regionów wykazują one duży stopień homologii sekwencji, na przykład homologię sekwencji aminokwasowej większą niż 30%, korzystnie większą niż 40%. Tak więc, na przykład polipeptyd określony terminem VP1 oznacza natywną formę VP1 każdego z różnych szczepów i izolatów parwowirusa B19. Kompletne genotypy i sekwencje powyższych protein wielu szczepów i izolatów parwowirusa B19 są znane. Patrz, na przykład. Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936; Gallinella i wsp., J. Virol. Methods (1993) 41:203-211. Ponadto, znane są także epitopy pochodzące z tych regionów parwowirusa B19. Patrz, na przykład. Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 5436127; i Międzynarodowa Publikacja Patentowa Nr WO 91/12269.

Termin analog i muteina oznacza biologicznie aktywne pochodne cząsteczki odniesienia, lub fragmenty takich pochodnych, które zachowują pożądaną aktywność, taką jak immunoreaktywność w testach diagnostycznych. Ogólnie, termin analog oznacza związek mający sekwencję i strukturę natywnego polipeptydu i mający w stosunku do natywnej cząsteczki jeden lub dwa aminokwasy dodane, podstawione (w naturze przeważnie konserwowane) i/lub usunięte, tak długo jak modyfikacje takie nie zniszczą jej aktywności immunogenicznej. Termin muteina oznacza peptydy, które mają jednego lub więcej peptydowych naśladowców (peptoidy), takie jak te opisane w Międzynarodowej Publikacji Patentowej Nr WO 91/04282. Korzystnie, analogi lub muteiny mają przynajmniej taką samą aktywność immunologiczną, jak natywne cząsteczki. Metody wytwarzania analogów polipeptydów i mutein są znane w sztuce i opisane poniżej.

Szczególnie korzystne analogi obejmują podstawienia o charakterze konserwatywnym, to znaczy takie podstawienia, które zachodzą w obrębie rodziny aminokwasów o zbliżonych łańcuchach bocznych. Szczegółowo, aminokwasy podzielone są na cztery rodziny: (1) kwasowe - asparaginian i glutaminian; (2) zasadowe - lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne - alanina, walina, leucyna,

PL 210 849 B1 izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; i (4) nienaładowane polarne - glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są czasami klasyfikowane jako aminokwasy aromatyczne. Na przykład, można zasadnie przewidywać, że pojedyncze zastąpienie leucyny przez izoleucynę lub walinę, asparaginianu przez glutaminian, treoniny przez serynę lub podobne konserwatywne podstawienia aminokwasów przez strukturalnie zbliżone aminokwasy, nie będą miały wielkiego wpływu na aktywność biologiczną. Na przykład, interesujący polipeptyd może zawierać do około 5-10 konserwatywnych i niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych, lub nawet do około 15-25 konserwatywnych i niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych, lub każdą całkowitą pomiędzy 5-25, tak długo jak nienaruszona pozostaje pożądana funkcja cząsteczki. Biegli w sztuce łatwo mogą określić regiony interesującej cząsteczki, które tolerują zmiany poprzez odniesienie do dobrze znanych w sztuce rysunków Hopp/Woodsa i Kyte-Doolittle'a.

Wyizolowany oznacza, w odniesieniu do polipeptydu, że wskazana cząsteczka jest wydzielona i oddzielona od całego organizmu, w którym znajduje się w naturze, lub występuje bez innych biologicznych makrocząsteczek tego samego typu.

Termin wyizolowany w odniesieniu do polinukleotydu oznacza pochodną cząsteczki kwasu nukleinowego w całości lub część sekwencji normalnie powiązanych z nią w naturze lub sekwencję, która istnieje w naturze, ale ma heterogenne sekwencje ze sobą powiązane, lub cząsteczkę wydzieloną z chromosomu.

Polinukleotyd pochodzący od lub specyficzny dla określonej sekwencji oznacza sekwencję polinukleotydową zawierającą ciągłą sekwencję o wielkości przynajmniej 6 nukleotydów, korzystnie o wielko ś ci przynajmniej 8 nukleotydów, bardziej korzystnie o wielkoś ci przynajmniej 10-12 nukleotydów, jeszcze bardziej korzystnie o wielkości przynajmniej 15-20 nukleotydów, odpowiadającą, to znaczy identyczną lub komplementarną do, regionowi określonej sekwencji polinukleotydowej. Polinukleotyd pochodzący od niej musi koniecznie fizycznie pochodzić od interesującej sekwencji nukleotydowej, ale można go wytworzyć każdym sposobem, włączając, ale bez ograniczania, syntezę chemiczną, replikację, odwrotną transkrypcję lub transkrypcję, które są oparte na informacji dostarczonej przez sekwencję zasad regionu, z którego pochodzi ten polinukleotyd. Może więc reprezentować orientację sensowną i antysensowną oryginalnego polinukleotydu.

Homologia oznacza procent podobieństwa pomiędzy dwoma polinukleotydami lub dwoma domenami polipeptydów. Dwa DNA lub dwie sekwencje polipeptydowe są znacząco homologiczne jedna do drugiej, jeżeli sekwencje takie wykazują przynajmniej około 50%, korzystnie przynajmniej około 75%, bardziej korzystnie przynajmniej około 80%-85%, korzystnie przynajmniej około 90%, i najbardziej korzystnie przynajmniej około 95%-98% podobieństwa sekwencji w obrębie zdefiniowanej długości cząsteczki. Użyty tu termin, znacząco homologiczne oznacza także sekwencje wykazujące całkowitą identyczność z określonym DNA lub sekwencją polipeptydową.

Ogólnie, identyczny odnosi się dokładnie do relacji nukleotyd do nukleotydu lub aminokwas do aminokwasu w odniesieniu odpowiednio do sekwencji dwóch polinukleotydów lub polipeptydów. Procent identyczności określa się przez bezpośrednie porównanie informacji niesionych przez sekwencje obu cząsteczek przez dopasowanie sekwencji, policzenie dokładnej liczby tożsamości pomiędzy obydwoma dopasowanymi sekwencjami, podzielenie przez długość krótszej sekwencji i pomnożenie wyniku przez 100.

Do analizy homologii i identyczności można użyć łatwo dostępnych programów komputerowych, takich jak ALIGN, Dayhoff, M.O. w Atlas of Protein Sequence and Structure, edytor M.O. Dayhoff., 5 Suplement 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, w którym wykorzystano algorytm do wyznaczania homologii miejscowej autorstwa Smitha i Watermana Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 dla analizy peptydów. Programy umożliwiające określenie homologii sekwencji nukleotydowych dostępne są na przykład, jako Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 8 (dostępne od Genetics Computer Group, Madison, WI), programy BESTFIT, FASTA i GAP, które także wykorzystują algorytm Smitha i Watermana. Programów tych używa się bez problemów z wejściowymi nastawami parametrów zalecanymi przez producenta tak jak opisano we wspomnianym powyżej Wisconsin Sequence Analysis Package. Na przykład, procent homologii określonej sekwencji nukleotydowej w stosunku do sekwencji odniesienia określa się używając algorytmu homologii Smitha i Watermana z wejściową tablicą wyników i karą za przerwę w sześciu pozycjach nukleotydowych.

Inną metodą określenia procentu homologii w kontekście sposobu według wynalazku jest użycie pakietu oprogramowania MPSRCH, do którego prawa autorskie ma Uniwersytet w Edynburgu,

PL 210 849 B1 opracowanego przez Johna F. Collins i Shane S. Sturrok, i rozprowadzanego przez IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Ten pakiet oprogramowania umożliwia użycie algorytmu Smitha-Watermana z wejściowymi nastawami parametrów dla tablicy wyników (na przykład, kara za otwartą przerwę 12, kara za rozszerzoną przerwę jeden i przerwa wielkości sześć). Wśród otrzymanych wyników wartość Match oznacza homologię sekwencji. Inne odpowiednie programy do obliczania procentu identyczności lub podobieństwa pomiędzy sekwencjami są dobrze znane w sztuce, na przykład, innym programem do dopasowywania sekwencji jest BLAST, używany z wejściowymi nastawami parametrów. Na przykład, programów BLASTN i BLASTP można używać stosując następujące wejściowe nastawy parametrów: kod genetyczny = standardowy; filtr = brak; łańcuch = oba; odcięcie = 60; spodziewane = 10; Matryca = BLOSUM62; Opis = 50 sekwencji; sortuj według = HIGH SCORE; Bazy danych = bez redundancji, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Szczegóły o tych programach można znaleźć pod następującym adresem internetowym: http://www.ncbi.nlm.gov/cgibin/BLAST.

Ewentualnie, homologię można określić przez hybrydyzację polinukleotydów w warunkach, w których tworzą się stabilne dupleksy pomiędzy regionami homologii, a następnie trawienie nukleazą specyficzną do jednoniciowego kwasu nukleinowego, i określenie wielkości otrzymanych fragmentów. Sekwencje DNA wykazujące znaczącą homologię można zidentyfikować metodą hybrydyzacji Southerna, na przykład w ostrych warunkach, określonych dla konkretnych systemów. Biegli w sztuce mogą określić odpowiednie warunki hybrydyzacji. Patrz, na przykład, Sambrook i wsp., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Funkcjonalnie połączony oznacza położenie elementów, znamienne tym, że opisane tak składniki są tak położone, że wypełniają swoje funkcje. Jeżeli określony promotor jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kwasu nukleinowego wpływa na transkrypcję, a w przypadku sekwencji kodującej, na ekspresję kodowanej sekwencji, jeżeli obecne są odpowiednie czynniki transkrypcyjne. Promotor nie musi przylegać do sekwencji kwasu nukleinowego, jeżeli zachowana jest jego zdolność do prowadzenia jej transkrypcji i/lub ekspresji. Sekwencja promotora wciąż uważana jest za funkcjonalnie połączoną z sekwencją kodującą, jeżeli pomiędzy sekwencją promotora i sekwencją kodującą występują, na przykład, rozdzielające sekwencje transkrybowane, ale nie ulegające translacji, a także transkrybowane introny.

Użyty tu termin rekombinowany w odniesieniu do cząsteczki kwasu nukleinowego oznacza polinukleotyd genomowego DNA, cDNA, wirusowego, półsyntetycznego lub syntetycznego pochodzenia który, w wyniku swojego pochodzenia lub obróbki nie jest związany z całym lub częścią polinukleotydu, z którym związany jest w naturze. Termin rekombinowany użyty w odniesieniu do proteiny lub polipeptydu oznacza polipeptyd wytworzony przez ekspresję rekombinowanego polinukleotydu. Ogólnie, interesujący gen klonuje się i eksprymuje w transformowanych organizmach, tak jak opisano poniżej. Organizm gospodarza eksprymuje obcy gen i wytwarza białko w warunkach odpowiednich do ekspresji.

Termin element kontrolny oznacza sekwencję polinukleotydową, która wspomaga transkrypcję i/lub translację sekwencji nukleotydowej, z którą jest połączona. Termin obejmuje promotory, sekwencje terminacji transkrypcji, domeny regulatorowe powyżej sekwencji kodowanej, sygnały poliadenylacji, regiony nie ulegające translacji, włączając 5'-UTR i 3'-UTR u, i w odpowiednich przypadkach sekwencje wiodące i wzmacniające. Takie sekwencje razem zapewniają transkrypcję i translację sekwencji kodującej w komórkach gospodarza.

Użyty tu termin „promotor oznacza region regulatorowy zdolny do wiązania polimerazy i rozpoczynania transkrypcji położonej poniżej (w kierunku 3') i funkcjonalnie z nim połączonej sekwencji nukleotydowej. Do celów sposobu według wynalazku sekwencja promotora obejmuje minimalną liczbę zasad lub elementów koniecznych do zapoczątkowania transkrypcji interesującej sekwencji na wykrywalnym poziomie powyżej tła. W obrębie sekwencji promotorowej znajduje się miejsce początku transkrypcji, a także domeny wiążące białka (sekwencje uzgodnione) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA lub DNA. Na przykład, promotorem może być sekwencja kwasu nukleinowego, która jest rozpoznawana przez zależną od DNA polimerazę RNA (transkryptazę) jako sygnał do wiązania się z kwasem nukleinowym i rozpoczęcia w specyficznym miejscu transkrypcji RNA. Z reguły takie transkryptazy do wiązania wymagają DNA, który jest dwuniciowy w części zawierającej sekwencję promotorową i jej składniki; część matrycowa (sekwencja, która ma być transkrybowana) nie musi być dwuniciowa. Pojedyncza zależna od DNA polimeraza RNA rozpoznaje różne sekwencje promotorowe, które mogą się znacznie różnić wydajnością wspomagania transkrypcji. Kiedy polimeraza RNA wiąże

PL 210 849 B1 się z sekwencją promotorową żeby rozpocząć transkrypcję, taka sekwencja promotorowa nie jest częścią transkrybowanej sekwencji. Wytworzony transkrypt RNA nie zawiera więc tej sekwencji.

Sekwencja kontrolna kieruje transkrypcją sekwencji nukleotydowej, kiedy polimeraza RNA lub DNA zwiąże się z sekwencją promotorową i transkrybuje sąsiednią sekwencję.

Zależna od DNA polimeraza DNA jest enzymem, który syntetyzuje komplementarną kopię DNA matrycy DNA. Przykładem są polimeraza I DNA E. coli i polimeraza DNA bakteriofaga T7. Wszystkie znane zależne od DNA polimerazy DNA wymagają komplementarnego startera do rozpoczęcia syntezy. W odpowiednich warunkach, zależna od DNA polimeraza DNA syntetyzuje także komplementarną kopię DNA matrycy RNA.

Zależ na od DNA polimeraza RNA lub transkryptaza jest enzymem, który syntetyzuje wiele kopi RNA z dwuniciowej lub częściowo dwuniciowej cząsteczki DNA mającej (z reguły dwuniciową) sekwencję promotorową. Synteza cząsteczek RNA (transkryptów) rozpoczyna się od specyficznego miejsca poniżej promiotora i zachodzi w kierunku 5' do 3'. Przykładem transkryptazy są zależna od DNA polimeraza RNA E. coli i zależna od DNA polimeraza RNA bakteriofagów T7, T3 i SP6.

Zależna od RNA polimeraza DNA lub odwrotna transkryptaza jest enzymem, który syntetyzuje komplementarną kopię DNA matrycy RNA. Wszystkie znane odwrotne transkryptazy mają także zdolność tworzenia komplementarnych kopii DNA na matrycy DNA; są więc one polimerazami DNA zależnymi zarówno od RNA jak i od DNA. Do rozpoczęcia syntezy na matrycy RNA i DNA niezbędny jest starter.

RNAza H jest enzymem, który degraduje RNA w dupleksach RNA:DNA. Takie enzymy mogą być endonukleazami lub egzonukleazami. Większość odwrotnych transkryptaz, oprócz swojej aktywności polimerazowej, zwykle posiada aktywność RNAzy H. Jednakże dostępne są także inne źródła RNAzy H, która nie posiada aktywności polimerazowej. Degradacja powoduje oddzielenie RNA z dupleksów RNA:DNA. Ewentualnie, RNAza H może po prostu przecinać RNA w różnych miejscach, takich jak część RNA stopionego lub pozwalać enzymom rozwijać część RNA.

Użyte tu terminy polinukleotyd, oligonukleotyd, kwas nukleinowy i cząsteczka kwasu nukleinowego obejmują polimeryczne formy nukleotydów każdej długości, zarówno rybonukleotydów jak i deoksyrybonukleotydów. Termin ten odnosi się tylko do pierwszorzędowej struktury cząsteczki. Termin ten obejmuje trzy-, dwu- i jednoniciowy DNA, a także trzy-, dwu- i jednoniciowy RNA. Termin ten obejmuje formy niezmodyfikowane polinukleotydu, a także modyfikacje, takie jak metylacja i/lub kap polinukleotydu. Bardziej szczegółowo, terminy polinukleotyd, oligonukleotyd, kwas nukleinowy i cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje polideoksyrybonukleotydy (zawierające 2-deoksy-D-rybozę), polirybonukleotydy (zawierające D-rybozę), i inne typy polinukleotydów, takie jak N- lub C-glikozydy zasad purynowych lub pirymidynowych, i inne polimery zawierające szkielet nienukleotydowy, na przykład, polimery poliamidowe (na przykład, peptydowe kwasy nukleinowe (PNA)) i polimery polimorfolinowe (dostępne w handlu od Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, jako Neugene), i inne syntetyczne sekwencje polimerów kwasów nukleinowych, pod warunkiem, ż e polimery takie zawierają zasady nukleinowe w konfiguracji, która pozwala na parowanie zasad i oddziaływania warstwowe zasad, takie jak te, które stwierdza się w DNA i RNA. Nie zamierza się stosować żadnego rozróżnienia długości pomiędzy terminami „polinukleotyd, oligonukleotyd, kwas nukleinowy i cząsteczka kwasu nukleinowego i terminy te używane są wymiennie. Terminy te odnoszą się tylko do pierwszorzędowej struktury cząsteczki. Terminy te obejmują na przykład, 3'-deoksy-2', 5'-DNA, N3' P5' fosforynoamidy oligodeoksyrybonukleotydów, 2'-O-alkilo-podstawiony RNA, dwu i jednoniciowy DNA, taki jak także dwu- i jednoniciowy RNA, hybrydy DNA:RNA, hybryd pomiędzy PNA i DNA lub RNA.

Terminy te obejmują także znane typy modyfikacji, na przykład znane w sztuce znaczniki, metylację, „kapy, podstawienie jednego lub więcej występujących w naturze nukleotydów przez analogi, modyfikacje internukleotydowe, takie jak na przykład modyfikacje w postaci połączeń bez ładunku (na przykład, metylofosfonaty, fosfotriestery, fosforynoamidy, karbaminiany), w postaci połączeń naładowanych ujemnie (na przykład, fosforotionaty, fosforoditionaty), i w postaci połączeń naładowanych dodatnio (aminoalkilofosforynoamidy, aminoalkilofosfotriestery), oraz w postaci połączeń, które zawierają grupy boczne, takie jak na przykład, białka (włączając nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnałowe, poli-L-lizynę), takie, które zawierają interkalatory (na przykład, akrydynę, psoralen), takie, które zawierają chelatory (na przykład, metale radioaktywne metale, bor, metale utleniające), takie, które zawierają związki alkilujące, takie, które mają zmodyfikowane połączenia (na przykład, alfa anomeryczne kwasy nukleinowe), takie jak także niezmodyfikowane formy polinukleotydów lub oligonukleotydów. Szczególnie, DNA jest kwasem deoksyrybonukleinowym.

PL 210 849 B1

Użyty tu termin docelowy region kwasu nukleinowego lub docelowy kwas nukleinowy oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą docelową sekwencję, która ma być namnożona. Docelowy kwas nukleinowy może być zarówno jednoniciowy jak i dwuniciowy i może zawierać obok sekwencji docelowej także inne sekwencje, które nie muszą ulegać amplifikacji. Termin sekwencja docelowa oznacza określoną sekwencję nukleotydową docelowego kwasu nukleinowego, która ma być namnożona. Sekwencja docelowa może obejmować region hybrydyzujący z sondą, zawarty w czą steczce docelowej, z którym sonda tworzy w odpowiednich warunkach stabilną hybrydę . Sekwencja docelowa może także obejmować sekwencje kompleksujące, z którymi łączą się startery oligonukleotydowe i mogą być wydłużane przy użyciu sekwencji docelowej jako matrycy. Jeżeli docelowy kwas nukleinowy jest oryginalnie jednoniciowy termin sekwencja docelowa odnosi się także do sekwencji komplementarnej do sekwencji docelowej, takiej jak obecna w docelowym kwasie nukleinowym. Jeżeli docelowy kwas nukleinowy jest oryginalnie dwuniciowy termin sekwencja docelowa odnosi się zarówno do nici plus (+) i minus (-).

Użyty tu termin primer lub „starter lub oligonukleotyd starterowy oznacza oligonukleotyd, którego działanie polega na rozpoczęciu syntezy komplementarnej nici DNA, jeżeli znajduje się w warunkach, w których moż e zachodzić synteza produktów wydł u ż ania startera, to znaczy w obecności nukleotydów i związków wywołujących polimeryzację, takich jak polimeraza DNA lub RNA i odpowiednia temperatura, pH, stężenie jonów metalu, i stężenie soli. Dla osiągnięcia maksymalnej wydajności sposobem według wynalazku starter korzystnie jest jednoniciowy, ale ewentualnie może być dwuniciowy. Jeżeli starter jest dwuniciowy, starter taki najpierw traktuje się tak, żeby rozdzielić jego nici, tak jak potem używa się go do otrzymania produktów wydłużania. Taki etap denaturacji typowo osiąga się przez traktowanie ciepłem, ale ewentualnie można zastosować zasadę, i późniejszą neutralizację. Starter jest komplementarny do matrycy, i tworzy kompleksy dzięki wiązaniom wodorowym lub hybrydyzuje z matrycą tworząc kompleks starter/matryca, który rozpoczyna syntezę przez polimerazę, tak jak proces syntezy DNA rozprzestrzenia się przez dodawanie związanych kowalencyjnie zasad połączonych poprzez ich 3' końce komplementarnie do matrycy.

Użyty tu termin sonda lub sonda oligonukleotydowa oznacza strukturę zawierającą polinukleotyd, taki jak zdefiniowano powyżej, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego komplementarną do sekwencji kwasu nukleinowego, obecnej w analizowanym docelowym kwasie nukleinowym. Regiony polinukleotydowe sond mogą być DNA i/lub RNA, i/lub syntetycznymi analogami nukleotydów. Jeżeli sonda nukleotydowa ma być użyta w teście 5' nukleazy, takim jak technika Taq-Man™, sonda powinna zawierać przynajmniej jeden związek fluorescencyjny i przynajmniej jeden związek gaszący. Który jest trawiony przez aktywność 5' endonukleazową polimerazy użytej w reakcji, w celu wykrycia jakiejkolwiek namnożonej docelowej sekwencji oligonukleotydowej. W tym kontekście sonda oligonukleotydowa ma wystarczającą liczbę wiązań fosfodiestrowych przylegających do jej 5' końca, żeby zastosowana aktywność 5' do 3' nukleazy mogła wydajnie zdegradować związaną sondę do pojedynczych barwników fluorescencyjnych i wygaszaczy. Jeżeli sonda oligonukleotydowa używana jest zgodna z techniką TMA, należy ją odpowiednio wyznakować, tak jak jest to opisane poniżej.

Przyjmuje się, że hybrydyzujące sekwencje nie muszą wykazywać całkowitej komplementarności, żeby tworzyć stabilne hybrydy. W wielu przypadkach, stabilne hybrydy tworzą się jeżeli mniej niż 10% zasad jest błędnie sparowanych, ignorując pętle wielkości czterech lub więcej nukleotydów. Użyty tu termin komplementarny oznacza, że oligonukleotyd tworzy stabilny dupleks ze swoim odpowiednikiem” w warunkach testowych, ogólnie jeżeli występuje około 90% lub więcej homologii.

Terminy hybrydyzuje i hybrydyzacja oznacza tworzenie kompleksów pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi, które są wystarczająco komplementarne, żeby tworzyć kompleksy, według zasad parowania zasad podanych przez Watsona i Cricka. Jeżeli primer hybrydyzuje z sekwencją docelową (matrycą), takie kompleksy (lub hybrydy) są wystarczająco stabilne, żeby pełnić funkcję starterów wymaganą, na przykład do rozpoczęcia syntezy DNA przez polimerazę DNA.

Użyty tu termin para wiążąca oznacza pierwszą i drugą cząsteczkę, które specyficznie wiążą się ze sobą, tak jak komplementarne pary polinukleotydów zdolne do tworzenia dupleksów kwasów nukleinowych. Specyficzne wiązanie pierwszego składnika pary wiążącej z drugim składnikiem pary wiążącej w próbce jest uwidocznione przez wiązanie pierwszego składnika z drugim składnikiem, lub odwrotnie, z większym powinowactwem i specyficznością niż z innymi składnikami próbki. Wiązanie pomiędzy składnikami pary wiążącej typowo jest niekowalencyjne. Jeżeli nie wynika inaczej z kontekstu, użyte tu terminy „cząsteczka powinowata i cząsteczka docelowa odnoszą się odpowiednio, do pierwszego i drugiego składnika pary wiążącej.

PL 210 849 B1

Terminy cząsteczka wiążąca specyficznie i cząsteczka powinowata są tu użyte specyficznie i oznaczają cząsteczkę, która dzięki chemicznym lub fizycznym oddziaływaniom selektywnie wiąże się z wykrywalną substancją obecną w próbce. Przez selektywne wiązanie uważa się, że cząsteczka wiąże się preferencyjnie z interesującą cząsteczką docelową lub wiąże się z interesującą cząsteczką docelową z większym powinowactwem niż z innymi cząsteczkami. Na przykład, cząsteczka DNA wiąże się ze znacząco komplementarną sekwencją, a nie z sekwencjami niespokrewnionymi.

Termin temperatura topnienia lub Tm dwuniciowego DNA oznacza temperaturę, w której w wyniku ogrzewania lub innych oddziaływań rozrywających wiązania wodorowe pomiędzy parami zasad, na przykład traktowania kwasem lub zasadą, zanika połowa helikalnej struktury DNA. Tm cząsteczki DNA zależy od jej długości i składu zasad. Cząsteczki DNA bogate w pary zasad GC mają wyższą temperaturę Tm niż te, które mają przewagę par zasad AT. Jeżeli obniży się temperaturę poniżej Tm, rozdzielone komplementarne nici DNA spontanicznie łączą się ponownie lub przylegają tworząc dupleks DNA. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych zachodzi najszybciej około 25°C poniżej Tm. Tm można określić wykorzystując następujące zależności: Tm = 69,3 + 0,41(GC)% (Marmur i wsp. (1962) J. Mol. Biol. 5:109-118).

Użyty tu termin próbka biologiczna oznacza próbkę tkanki lub płynu wyizolowaną z pacjenta, który często zawiera przeciwciała wytworzone przez pacjenta. Typowo próbki, które zawierają takie przeciwciała znane są biegłym w sztuce i obejmują, ale bez ograniczania, krew, plazmę, osocze, fekalia, mocz, szpik kostny, żółć, płyn mózgowo-rdzeniowy, limfę, próbki skóry, wydzieliny skóry, przewody oddechowe, układ pokarmowy i moczowo-płciowy, ślinę, mleko, komórki krwi, organy, biopsje jak również próbki składników hodowli komórkowych włączając, ale bez ograniczania, zużyte podłoże powstające w wyniku wzrostu komórek i tkanek w podłożu do hodowli, na przykład komórek rekombinowanych i składników komórek.

Użyte tu terminy znacznik i wykrywalny znacznik oznaczają cząsteczkę możliwą do wykrycia, włączając, ale bez ograniczania, izotopy radioaktywne, znaczniki fluorescencyjne, znaczniki chemiluminescencyjne, chromofory, enzymy, substraty enzymów, kofaktory enzymów, inhibitory enzymów, chromofory, barwniki, koloidy metali, Ugandy (na przykład, biotynę, awidynę, streptawidynę lub hapteny). Termin znaczniki fluorescencyjne oznacza substancję lub jej część, która jest zdolna do wytwarzania fluorescencji w wykrywalnym zakresie.

II. Przykłady wykonania sposobu według wynalazku

Przed szczegółowym opisaniem sposobu według wynalazku, zrozumiałe jest, że sposób według wynalazku nie jest ograniczony do określonych form lub parametrów procesowych, które oczywiście mogą się zmieniać. Zrozumiałe jest także, że terminologia tu użyta, jest tylko do celów opisania określonych przykładów wykonania sposobu według wynalazku, a nie ich ograniczania.

Chociaż w praktyce wykonania sposobu według wynalazku można użyć wielu kompozycji i metod podobnych lub równoważnych do tych opisanych sposobem według wynalazku, tu opisano korzystne materiały i metody.

Jak napisano powyżej, sposób według wynalazku oparty jest na odkryciu nowych starterów i sond i metod diagnostycznych do dokładnego wykrywania infekcji parwowirusem B19 w próbkach biologicznych. Metody polegają na czułych opartych na kwasach nukleinowych technikach wykrywania, które pozwalają na identyfikację docelowych sekwencji kwasu nukleinowego parwowirusa B19 w próbkach zawierających małe ilości wirusa.

Szczególnie, wynalazcy scharakteryzowali regiony genomu parwowirusa B19, które są pożądanymi celami dla testów diagnostycznych. Startery i sondy pochodzące z tych regionów są wyjątkowo użyteczne do wykrywania infekcji parwowirusem B19 w próbkach biologicznych.

Opisane powyżej startery i sondy parwowirusa B19 są użyte w opartych na kwasie nukleinowym testach do wykrywania infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych.

Szczególnie, startery i sondy do użycia w tych testach korzystnie pochodzą z fragmentu o wielkości około 4,7 kilopar zasad genomu parwowirusa B19, odpowiadającego pozycjom nukleotydowym 217-4678 według Shade i wsp., J. Virol. (1986)58:921-936. Sekwencja nukleotydowa tego regionu z dwóch różnych izolatów parwowirusa B19 pokazana jest na fig. 3A-3C i 4A-4C. Jak wyjaśniono powyżej, fragment ten zawiera regiony kodujące NS1, VP1 i VP2.

Szczególnie korzystne startery i sondy do użycia sposobem według wynalazku w opisanych testach zaprojektowano w oparciu o silnie konserwowane regiony genomu parwowirusa B19, żeby umożliwić wykrycie infekcji spowodowanych przez różne izolaty parwowirusa B19. Jak tu opisano, silnie konserwowane regiony genomu parwowirusa B19 znajdują się w regionie o wielkości 700 par

PL 210 849 B1 zasad, rozciągającym się pomiędzy pozycjami nukleotydowymi 2936-3635, numerowanymi w odniesieniu do genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936. Region ten znajduje się w obrębie regionu VP1 genomu. Sekwencja tego regionu z 21 różnych izolatów parwowirusa B19 pokazana jest na fig. 2A-2U. Sekwencje z dodatkowych 26 izolatów pokazane są na fig. 11A-11Z. Porównanie sekwencji wykazało, że pomiędzy izolatami region ten wykazuje od około 98% do 99,5% homologii sekwencji, co czyni go szczególnie pożądaną sekwencją docelową. Do projektowania starterów i sond pożądany jest także region o wielkości 370 par zasad znajdujący się w obrę bie regionu VP1, który rozci ą ga się pomiędzy pozycjami nukleotydowymi 3073-3442, numerowanymi w odniesieniu do genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936, jak także fragment o wielkości 214 par zasad pokazany na fig. 1, który występuje w obrębie 3' części fragmentu o wielkości 4,7 kilopar zasad i rozciąga się pomiędzy pozycjami nukleotydowymi 4728-4941, numerowanymi w odniesieniu do Shade i wsp., J. Virol. (1986)58:921-936.

Regiony o wielkości 4,7 kilopar zasad, 700 par zasad i 370 par zasad łatwo otrzymać z dodatkowych izolatów, wykorzystując jako startery reakcji PCR części sekwencji parwowirusa B19 znalezione w obrębie tych określonych regionów, takich jak te tu opisane, oraz takie jak także opisane w Dokumentach Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 4683195, 4683202 i 4889818, i w oparciu o sekwencje dostarczone sposobem wedł ug wynalazku. Inną metodą otrzymania sekwencji nukleotydowych z pożądanej sekwencji jest przyłączanie komplementarnego zestawu nakładających się syntetycznych oligonukleotydów wytworzonych w tradycyjnym, zautomatyzowanym sentetyzerze polinukleotydów, i łączenie przy użyciu odpowiedniej ligazy DNA i amplifikację otrzymanej sekwencji nukleotydowej przy użyciu metody PCR. Patrz, na przykład Jayaraman i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88-4084-4088. Po otrzymaniu i wyizolowaniu sekwencji, można je klonować do dowolnego odpowiedniego wektora lub replikonu. Biegłym w sztuce znanych jest wiele wektorów do klonowania i wybranie odpowiedniego wektora do klonowania zależ y od upodobania. Odpowiednie wektory obejmują, ale bez ograniczania, plazmidy, fagi, transpozony, kosmidy, chromozomy lub wirusy, które zdolne są do replikacji jeżeli związane są w odpowiednimi elementami kontrolnymi.

Rekombinowane klony łatwo jest zidentyfikować metodą analizy przy użyciu enzymów restrykcyjnych i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym lub agarozowym, przy użyciu technik dobrze znanych w sztuce i opisanych w przykładach poniżej.

Startery i sondy używane sposobem według wynalazku pochodzą od tych sekwencji i łatwo je zsyntetyzować standardowymi technikami, na przykład, syntezą na podłożu stałym wykorzystując chemię fosforynoamidów, tak jak opisano w Dokumentach Patentowych Nr 4458066 i 4,415,732; Beaucage i wsp. (1992) Tatrahedron 4 8:222 3-2311; i Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (1 April 1987). Inne metody syntezy chemicznej obejmują na przykład, metodę fosfotriesterów opisaną przez Narang i wsp., Meth. Enzymol. (1979) 68:90 i metodę fosfodiesterów opisaną przez Brown i wsp., Meth. Enzymol. (1979) 68:109. Używając tych samych metod w sondy można włączyć poli(A) lub poli (C), lub inne niekomplementarne rozszerzenia nukleotydów. Rozszerzenia tlenku heksaetylenu można sprzęgnąć z sondami metodami znanymi biegłym w sztuce. Cload i wsp. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 4914210 dla Levenson i wsp.; Durand i wsp. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359; i Horn i wsp. (1986) Tet. Lett. 27:4705-4708.

Typowo, sekwencje startera mają długość w zakresie pomiędzy 10-75 nukleotydów, na przykład 15-60, 20-40, bardziej typowo mają długość w zakresie pomiędzy 18-40 nukleotydów, i każdą długość pomiędzy wymienionymi zakresami. Typowa sonda ma długość w zakresie pomiędzy 10-50 nukleotydów, na przykład 15-40, 18-30, i każdą długość pomiędzy wymienionymi zakresami.

Ponadto, do celów wykrywania, sondy można sprzęgać ze znacznikami. Znanych jest kilka sposobów derywatyzacji oligonukleotydów z reaktywnymi związkami, które pozwalają na dodanie znacznika. Na przykład, dostępnych jest kilka sposobów biotynylacji sond, dzięki czemu radioaktywne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, enzymatyczne lub gęste elektronowo znaczniki mogą być przyłączone przez awidynę. Patrz, na przykład, Broken i wsp., Nucl. Acids Res. (1978) 5:363-384, który opisuje użycie znaczników ferytynaawidyna-biotyna; i Chollet i wsp. Nucl. Acids Res. (1985) 13:1529-1541, który opisuje biotynylację 5' końców oligonukleotydów przez łącznik aminoalkilofosforoamidowy. Dostępnych jest także kilka metod syntezy pochodnych aminowych oligonukleotydów, które łatwo znakuje się związkami fluorescencyjnymi lub związkami innych typów tworzącymi pochodne z grupami amino-reaktywnymi, takimi jak izotiocyjanian, N-hydroksybursztynian, patrz, na przykład, Connolly (1987) Nucl. Acids Res. 11:3131-3139, Gibson i wsp. (1987) Nucl. Acids Res. 15:6455-6467 i Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 4605735 dla Miyoshi

PL 210 849 B1 i wsp. Dostępne są także metody syntezy sulfhydrylowych pochodnych oligonukleotydów, które reagują ze znacznikami specyficznymi dla tioli, patrz, na przykład, Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 4757141 dla Fung i wsp., Connolly i wsp. (1985) Nucl. Acids Res. 13:4485-4502 i Spoat i wsp. (1987) Nucl. Acids Res. 15:4837-4848. Obszerny przegląd metodyki znakowania fragmentów DNA zawarty jest w Matthews i wsp., Anal. Biochem. (1988) 169:1-25.

Na przykład, sondy można znakować fluorescencyjnie przez przyłączenie cząsteczki fluorescencyjnej do końca sondy, która nie bierze udziału w reakcji ligacji. Przewodnik do wybierania odpowiednich znaczników fluorescencyjnych można znaleźć w Smith i wsp., Meth. Enzymol. (1987) 155:260-301; Karger i wsp., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Korzystne znaczniki obejmują fluoresceinę i jej pochodne, takie jak opisane w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Nr 4318846 i Lee i wsp., Cytometry (1989) 10:151-164, i 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 lub NAN-2.

Ponadto, sondy można znakować estrami akrydynowymi (AE) przy użyciu opisanych poniżej technik. Obecne technologie pozwalają na umieszczenie znaczników AE w dowolnym miejscu sondy. Patrz na przykład. Nelson i wsp. (1995) Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence w Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L.J. (edytor) Academic Press, San Diego, CA; Nelson i wsp. (1994) Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PGR w The Polymerase Chain Reaction, Mullis i wsp. (edytorzy) Birkhauser, Boston, MA; Weeks i wsp., Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry i wsp., Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090. Cząsteczkę AE można przyłączyć bezpośrednio do sondy przy użyciu technik chemicznych z wykorzystaniem nienukleotydowego łącznika, co pozwala na umieszczenie znacznika w dowolnym miejscu sondy. Patrz na przykład, Dokumenty Patentowe Stanów Zjednoczonych Nr 5585481 i 5185439.

W pewnych przykładach wykonania sposobu według wynalazku dodaje się kontrolę wewnętrzną (IC) lub standard wewnętrzny, które służą jako kontrola wychwytu sekwencji docelowej i amplifikacji. Korzystnie, IC obejmuje sekwencję, która różni się od sekwencji docelowej, i jest zdolna do hybrydyzacji z sondą użytą do oddzielenia oligonukleotydów specyficznych dla organizmu z próbki, i jest zdolna do amplifikacji. Użycie IC pozwala na kontrolę procesu rozdzielania, procesu amplifikacji i systemu wykrywania, oraz pozwala na monitorowanie wydajności testu i ilości próbki. Reprezentatywna sekwencja z której można otrzymać IC pokazana jest na fig. 12. IC można włączyć w dowolnym odpowiednim momencie, na przykład, w bufor do lizy. W jednym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku IC stanowi M13 ssDNA zawierający sekwencję nukleotydową parwowirusa B19 i unikatową sekwencję, która hybrydyzuje z sondą, na przykład, zawierającą sekwencje regionu VP1, znamienną tym, że sekwencja docelowa jest zmodyfikowana przez podstawienie lub usuniecie 5-20 lub więcej zasad, korzystnie 5-15 zasad, na przykład 5, 10 lub 15 zasad lub dowolnej liczby z tego zakresu. Podstawione lub usunięte zasady korzystnie występują na całej długości sekwencji docelowej, tak że tylko 2 lub 3 kolejne sekwencje są zastąpione. Na przykład, jeżeli sekwencją docelową jest CTACTTGCTGCGGGAGAAAAACACCT (SEQ ID NO:91), to w IC taka sekwencja może być zastąpiona przez, na przykład, AGCTAGACCTGCATGTCACTG (SEQ ID NO:90).

Podłoże stałe może dodatkowo zawierać sondy specyficzne do standardu wewnętrznego (sondy IC), ułatwiając w ten sposób wychwyt, jeżeli używa się sondy IC. Sondę IC można ewentualnie sprzęgnąć z wykrywalnym znacznikiem, który różni się od wykrywalnego znacznika użytego dla sekwencji docelowej. W przykładach wykonania sposobu według wynalazku, w których wykrywalnym znacznikiem jest fluorofor, ilość IC określa się spektrofotometrycznie w oparciu o badania poziomu wykrywalności. Typowo, Liczbę kopii IC, która nie przeszkadza w wykrywaniu sekwencji docelowej określa się przez miareczkowanie IC stałą lU sekwencji docelowej, korzystnie na niższym końcu, i wykreśla się krzywą standardową rozcieńczając próbkę zaakceptowanymi międzynarodowo lU. Dla oznaczania parwowirusa B19, używa się panelu ośmiu rozcieńczeń 8000 lU - 125 lU.

W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, opisaną tu IC łączy się z RNA wyizolowanym z próbki według standardowych technik znanych biegłym w sztuce i opisanych sposobem według wynalazku. RNA poddaje się następnie odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy i otrzymuje kopię DNA. Ewentualnie sekwencję cDNA amplifikuje się (na przykład metodą PCR) przy użyciu znakowanych starterów. Produkt amplifikacji rozdziela się, typowo przez elektroforezę i określa ilość radioaktywności (proporcjonalną do ilości zamplifikowanego produktu). Ilość mRNA w próbce określa się obliczając przez porównanie z sygnałem wytworzonym przez znane standardy.

PL 210 849 B1

Startery i sondy opisane powyżej używa się w technikach opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do wykrywania infekcji parwowirusem B19 w próbkach biologicznych. PCR jest techniką namnażania pożądanej docelowej sekwencji kwasu nukleinowego zawartej w cząsteczce kwasu nukleinowego lub mieszaninie cząsteczek. W technice PCR używa się namiaru pary starterów w celu umożliwienia hybrydyzacji z komplementarną nicią docelowego kwasu nukleinowego. Startery są wydłużane przez polimerazę przy użyciu jako matrycy docelowego kwasu nukleinowego. Produkty wydłużania, po oddysocjowaniu od oryginalnej nici docelowej, same stają się sekwencjami docelowymi. Następnie hybrydyzują nowe startery i są wydłużane przez polimerazę, i cykl powtarza się powodując przyrost liczby cząsteczek docelowego kwasu nukleinowego w postępie geometrycznym. Amplifikacja docelowej sekwencji kwasu nukleinowego w próbce metodą PCR jest dobrze znana w sztuce i jest opisana w na przykład, Innis i wsp. (edytorzy) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: basic principles and automation, w PCR: A Practical Approach, McPherson i wsp. (edytorzy) IRL Press, Oxford; Saiki i wsp. (1986) Nature 324:163; a także w Dokumentach Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 4683195, 4683202 i 4889818.

Szczególnie, w PCR wykorzystuje się stosunkowo krótkie startery oligonukleotydowe, komplementarne do końców docelowej sekwencji nukleotydowej, która ma być namnożona, i zorientowane tak, że ich końce 3' są zwrócone ku sobie, także każdy ze starterów wydłuża się w kierunku drugiego. Próbkę polinukleotydową ekstrahuje się i denaturuje, korzystnie przy użyciu ciepła, a następnie poddaje hybrydyzacji z pierwszym i drugim starterem, które są obecne w nadmiarze molarnym. Polimeryzacja DNA katalizowana jest w obecności czterech trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTPs dATP, dGTP, dCTP i dTTP) przez zależny od starterów i matrycy czynnik polimeryzujący polinukleotyd, taki jak każdy enzym zdolny do wytwarzania produktów wydłużania starterów, na przykład, polimerazę I DNA E. coli, fragment Klenowa polimerazy I DNA, polimerazę DNA faga T4, termostabilną polimerazę DNA wyizolowaną z Thermus aquaticus (Tag), dostępną z różnych źródeł (na przykład, Perkin Elmer), z Thermus thermophilus (United States Biochemicals), z Bacillus stereothermophilus (Bio-Rad), lub z Thermococcus litoralis (polimerazę Vent, New England Biolabs). Reakcja daje dwa długie produkty, które zawierają odpowiednie startery na swoich 5' końcach połączone kowalencyjnie z nowozsyntetyzowanym DNA, komplementarnym do oryginalnych nici DNA. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się następnie w warunkach umożliwiających polimeryzację, na przykład obniżając temperaturę, inaktywując związek denaturujący lub dodając więcej polimerazy i rozpoczyna się drugi cykl. W drugim cyklu otrzymuje się dwie oryginalne nici DNA, dwa długie produkty z pierwszego cyklu, dwa nowe długie produkty zamplifikowane z oryginalnych nici DNA, i dwa krótkie produkty zamplifikowane z długich produktów. Krótkie produkty mają sekwencję sekwencji docelowej ze starterem na każdym końcu. W każdym następnym cyklu, wytwarzane są dodatkowe dwa długie produkty i pewna liczba krótkich produktów, równa liczbie długich i krótkich produktów jakie powstały w poprzednim cyklu. Liczba krótkich produktów zawierających sekwencję docelową rośnie ekspotencjalnie z każdym cyklem. Korzystnie, reakcję PCR prowadzi się w dostępnych w handlu termocyklerach, na przykład, firmy Perkin Elmer.

RNA amplifikuje się przez odwrotną transkrypcję mRNA do cDNA, i następnie prowadzi się reakcję PCR (RT-PCR), tak jak opisano powyżej. Ewentualnie, w obu etapach można użyć pojedynczego enzymu tak jak opisano w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Nr 5322770. mRNA można także poddać odwrotnej transkrypcji do cDNA, następnie reakcji łańcuchowej ligazy z asymetrycznym wypełnieniem przerw (RTAGLCR) tak jak opisał Marshall i wsp. (1994) PCR Meth. App. 4:80-84.

Fluorescencyjny test 5' nukleazy, znany jako test Taq-Man™ (Perkin-Elmer), jest mocnym i uniwersalnym opartym na PCR systemem wykrywania docelowych kwasów nukleinowych.

Opisanych sposobem według wynalazku starterów i sond pochodzących z regionów genomu parwowirusa B19 używa się do analizy metodą TaqMan™ do wykrywania infekcji w próbkach biologicznych. Analizę prowadzi się z wykorzystaniem reakcji PGR monitorując wytwarzanie fluorescencyjnego sygnału. Taki system testowy nie wymaga użycia analizy elektroforetycznej na żelu, i zdolny jest do generowania ilościowych wyników pozwalających na określenie liczby kopii docelowego DNA.

Fluorescencyjny test 5' nukleazy wygodnie prowadzi się przy użyciu na przykład, AmpliTaq Gold™ polimerazy DNA, która ma endogenną aktywność 5' nukleazy, i trawi wewnętrzną sondę oligonukleotydową znakowaną fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym i związkiem gaszącym (patrz Holland i wsp.. Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1991) 8 8:727 6-728 0; i Lee i wsp., Nucl. Acids Res. (1993) 21:37 61-37 66). Wyniki testu otrzymuje się mierząc zmiany fluorescencji, jakie występują w czasie

PL 210 849 B1 cyklu amplifikacji kiedy trawiona jest sonda fluorescencyjna, oddzielenie barwnika i związku gaszącego powoduje wzrost sygnału fluorescencyjnego, który jest proporcjonalny do amplifikacji docelowego DNA.

Produkty amplifikacji można też wykrywać w roztworze lub na podłożu stałym. W tym sposobie, sonda TaqMan™ jest tak zaprojektowana, żeby hybrydyzować z sekwencją docelową w obrębie pożądanego produktu PCR. 5' koniec sondy TaqMan™ zawiera fluorescencyjny barwnik reporterowy. 3' koniec sondy jest zablokowany w celu uniemożliwienia wydłużenia sondy i zawiera barwnik, który gasi fluorescencję barwnika na 5' końcu sondy. W czasie następującej amplifikacji, znacznik fluorescencyjny na 5' końcu jest odcinany, jeżeli mieszanina reakcyjna zawiera polimerazę o aktywności 5' egzonukleazy. Odcięcie 5' fluoroforu powoduje wzrost fluorescencji, który można wykryć.

Szczególnie, sondę oligonukleotydową konstruuje się tak, że w stanie niezhybrydyzowanym sonda występuje przynajmniej w jednej konformacji jednoniciowej, w której cząsteczka związku gaszącego położona jest wystarczająco blisko cząsteczki reporterowej, żeby zgasić fluorescencję cząsteczki reporterowej. Po hybrydyzacji z polinukleotydem docelowym sonda oligonukleotydowa występuje przynajmniej w jednej konformacji, w której cząsteczka związku gaszącego nie jest położna wystarczająco blisko cząsteczki reporterowej, żeby zgasić fluorescencję cząsteczki reporterowej. Przyjmując takie stany konformacyjne bez hybrydyzacji i po hybrydyzacji, cząsteczka reporterowa i cząsteczka związku gaszącego sondy mają różną intensywność sygnału fluorescencyjnego, kiedy sonda jest zhybrydyzowana lub nie jest zhybrydyzowana. Powoduje to, że możliwe jest określenie czy sonda uległa hybrydyzacji czy nie uległa hybrydyzacji w oparciu o zmiany fluorescencji cząsteczki reporterowej, cząsteczki związku gaszącego lub ich połączenia. Ponadto, ponieważ sondę można zaprojektować tak, że cząsteczka związku gaszącego gasi fluorescencję cząsteczki reporterowej, jeżeli sonda nie uległa hybrydyzacji, sondę można zaprojektować tak, że cząsteczka reportera wykazuje ograniczoną fluorescencję, jeżeli sonda nie uległa hybrydyzacji lub strawieniu.

Przedmiotem wynalazku jest metoda namnażania docelowej sekwencji nukleotydowej parwowirusa B19 przy użyciu polimerazy kwasu nukleinowego mającej aktywność 5' do 3' nukleazy, jednego lub więcej starterów zdolnych do hybrydyzacji z docelową sekwencją B19, i sondy oligonukleotydowej zdolnej do hybrydyzacji z docelową sekwencją B19 po stronie 3' w stosunku do startera. W czasie amplifikacji, polimeraza trawi sondę oligonukleotydową, jeżeli tworzy ona hybrydę z sekwencją docelową, w ten sposób oddzielając cząsteczkę reporterową od cząsteczki związku gaszącego. W czasie amplifikacji, monitoruje się fluorescencję cząsteczki reporterowej, przy czym fluorescencja świadczy o przebiegu amplifikacji kwasu nukleinowego. Cząsteczka reporterowa korzystnie jest fluoresceiną a czą steczka związku gaszącego korzystnie jest rodaminą.

Chociaż długość starterów i sond może być różna, sekwencje sond wybiera się tak, żeby miały one niższą temperaturę topnienia niż sekwencje starterów, sekwencje starterów są przeważnie dłuższe niż sekwencje sond. Typowo, sekwencje starterów mają długość w zakresie pomiędzy 10-75 nukleotydów, bardziej typowo w zakresie 20-45 nukleotydów. Typowo, sondy mają długość w zakresie pomiędzy 10-50 nukleotydów, bardziej typowo w zakresie 15-40 nukleotydów.

Jeżeli używa się podłoża stałego, sondę oligonukleotydową można przyłączyć do podłoża stałego różnymi sposobami. Na przykład, sondę można przyłączyć do podłoża stałego przez przyłączenie 3' lub 5' końcowego nukleotydu sondy do podłoża stałego. Bardziej korzystnie, sondę przyłącza się do podłoża stałego za pomocą łącznika, który służy jako dystans pomiędzy sondą a podłożem stałym. Łącznik zwykle ma przynajmniej 15-30 atomów długości, bardziej korzystnie przynajmniej 15-50 atomów długości. Pożądana długość łącznika zależy od użytego podłoża stałego. Na przykład, jeżeli jako podłoże stałe używany jest wysokousieciowany polistyren, zwykle wystarczający jest łącznik o długości sześciu atomów.

W sztuce znanych jest wiele łączników, które mogą być użyte do przyłączenia sondy oligonukleotydowej do podłoża stałego. Łącznik mogą tworzyć jakiekolwiek związki, które nie wpływają w znaczący sposób na hybrydyzację sekwencji docelowej z sondą przyłączoną do podłoża stałego. Łącznik może zawierać homopolimeryczny oligonukleotyd, który łatwo dodać do linkera w czasie automatycznej syntezy. Ewentualnie jako łączników można użyć polimerów, takich jak podstawiony glikol polietylenowy. Takie polimery są korzystniejsze niż homopolimeryczne oligonukleotydy ponieważ nie wpływają w znaczący sposób na hybrydyzację sondy z docelowym oligonukleotydem. Szczególnie korzystny jest glikol polietylenowy.

PL 210 849 B1

Połączenia pomiędzy podłożem stałym, łącznikiem i sondą korzystnie nie są przecinane w czasie usuwania grup blokujących zasadę w warunkach zasadowych w wysokiej temperaturze. Przykłady korzystnych połączeń obejmują połączenia karbaminianowe i amidowe.

Przykłady korzystnych typów stałego podłoża do immobilizacji sondy oligonukleotydowej obejmują szkło o kontrolowanej wielkości porów, płytki szklane, polistyren, powlekane awidyną kulki polistyrenowe, celulozę, nylon, żel akrylamidowy i aktywowany dekstran.

Szczegółowy opis odczynników i warunków prowadzenia testu TaqMan™, sposobem według wynalazku opisany jest w Holland i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276-7280; Dokumentach Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 5538848, 5723591 i 5876930.

Opisane sposobem według wynalazku sekwencje parwowirusa B19 można także użyć w testach amplifikacji opartej na transkrypcji (TMA). TMA jest metodą umożliwiającą identyfikację docelowej sekwencji kwasu nukleinowego obecnej w bardzo małej ilości w próbkach biologicznych. Takie sekwencje mogą być trudne lub nawet niemożliwe do wykrycia przy pomocy metod bezpośrednich. TMA jest izotermicznym, autokatalitycznym systemem amplifikacji docelowego kwasu nukleinowego, który umożliwia otrzymanie ponad miliard kopii RNA sekwencji docelowej. W celu dokładnego wykrycia obecności lub braku sekwencji docelowej w próbce biologicznej, test można wykonać jakościowo. Test zapewnia także ilościowy pomiar obecności sekwencji docelowej w zakresie stężeń wynoszącym kilka rzędów wielkości. TMA dostarcza metody autokatalitycznej syntezy wielu kopii docelowej sekwencji kwasu nukleinowego bez potrzeby ciągłych zmian warunków reakcji, takich jak temperatura, siła jonowa i pH.

TMA obejmuje następujące etapy: a) wyizolowanie kwasu nukleinowego włączając RNA, z interesującej próbki biologicznej podejrzanej o to, że jest zainfekowana przez parwowirusa B19; i (b) połączenie w mieszaninę reakcyjną (i) wyizolowanego kwasu nukleinowego, (ii) pierwszego i drugiego startera oligonukleotydowego, znamiennych tym, że pierwszy starter ma sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3' końcowej części docelowej sekwencji RNA, żeby stworzyć z nią kompleks, jeżeli sekwencja taka jest obecna w badanej próbce (na przykład nić (+)), i tym, że drugi starter ma sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3' końcowej części sekwencji komplementarnej do docelowej sekwencji RNA (na przykład nić (-)), żeby stworzyć z nią kompleks, znamienne tym, że pierwszy oligonukleotyd zawiera także sekwencję obejmującą promotor położoną w pozycji 5' w stosunku do sekwencji kompleksują cej, (iii) odwrotną transkryptazę lub polimerazy DNA zależne od RNA i DNA, (iv) aktywność enzymatyczną, która selektywnie degraduje nić RNA kompleksu RNA-DNA (taką jak RNAza H) i (v) polimerazę RNA, która rozpoznaje ten promotor.

Składniki takiej mieszaniny reakcyjnej dodaje się po kolei lub jednocześnie. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się w warunkach, w których tworzy się oligonukleotyd/sekwencja docelowa, włączając warunki przyłączania starterów DNA i syntezy kwasów nukleinowych (dodając trójfosforany rybonukleotydów i trójfosforany deoksyrybonukleotydów) przez okres czasu wystarczający do zapewnienia powstania wielu kopii sekwencji docelowej. Reakcja korzystnie zachodzi w warunkach odpowiednich do utrzymania stabilności składników reakcji, takich jak enzymy, bez konieczności modyfikacji lub manipulacji warunkami reakcji w czasie reakcji amplifikacji. Reakcję prowadzi się w warunkach, które są w znacznym stopniu izotermiczne i stałe pod względem siły jonowej i pH. Korzystnie reakcja nie wymaga etapu denaturacji w celu rozdzielenia kompleksów RNA-DNA tworzonych przez pierwszą reakcję wydłużania DNA.

Odpowiednie polimerazy DNA obejmują odwrotne transkryptazy, takie jak odwrotna transkryptaza wirusa ptasiej białaczki mieloblastycznej (AMV) (dostępna od na przykład Seikagaku America, Inc.) i odwrotna transkryptaza mysiego wirusa białaczki Moloneya (MMLV) (dostępna od na przykład Bethesda Research Laboratories).

Promotory lub sekwencje promotorowe odpowiednie do włączenia w startery są sekwencjami kwasów nukleinowych (występującymi w naturze, wytworzonymi syntetycznie lub wytworzonymi przez trawienie enzymami restrykcyjnymi), które są specyficznie rozpoznawane przez polimerazę RNA, która rozpoznaje i wiąże się z tą sekwencją i zapoczątkowuje proces transkrypcji, dzięki czemu powstają transkrypty RNA. Sekwencje takie mogą ewentualnie zawierać zasady nukleotydowe wystające poza rzeczywiste miejsce rozpoznawane przez polimerazę RNA, dzięki którym zmienia się stabilność lub podatność na procesy degradacji lub zwiększają one wydajność transkrypcji. Przykłady użytecznych promotorów obejmują te, które są rozpoznawane przez polimerazy pewnych bakteriofagów, takie jak promotory T3, T7 lub SP6, lub promotor E. coli. Takie polimerazy RNA są łatwo dostępne w handlu, od New England Biolabs i Epicentre.

PL 210 849 B1

Niektóre z odwrotnych transkryptaz korzystnych do użycia sposobem według wynalazku mają aktywność RNAzy H, na przykład, odwrotna transkryptaza. Jednakże korzystne może być dodanie egzogennej RNAzy H takiej jak E. coli RNAza H, nawet jeżeli używa się odwrotnej transkryptazy AMV. RNAza H dostępna jest w handlu od, na przykład Bethesda Research Laboratories.

Transkrypty RNA wytworzone tymi metodami służą jako matryce do wytwarzania dodatkowych kopii sekwencji docelowej metodami opisanymi powyżej. Jest to autokatalityczny system i amplifikacja zachodzi autokatalitycznie bez potrzeby powtarzalnego modyfikowania lub zmiany warunków reakcji, takich jak temperatura, pH, siłą jonową.

Do detekcji używa się różnych metod włączając, bezpośrednie sekwencjonowanie, hybrydyzację z oligomerami specyficznymi do sekwencji, elektroforezy na żelu i spektrometrii masowej. Metod tych używa się w układach heterogennych lub homogennych, wykorzystując izotopowe lub nieizotopowe znaczniki lub wcale nie znakując.

Korzystną metodą detekcji jest użycie sond oligonukleotydowych specyficznych do sekwencji docelowych, pochodzących z opisanych powyżej fragmentów o wielkości 4,7 kilopar zasad, 700 par zasad, 370 par zasad i 214 par zasad. Sond używa się w testach ochrony przez hybrydyzację (HPA). W tym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku sondy wygodnie znakuje się estrem akrydyny (AE), cząsteczką o dużej chemiluminescencji. Patrz, na przykład Nelson i wsp. (1995) Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence w Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L.J. (edytor) Academic Press, San Diego, CA; Nelson i wsp. (1994) Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR w The Polymerase Chain Reaction, Mullis i wsp. (edytorzy) Birkhauser, Boston, MA; Weeks i wsp., Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry i wsp., Clin. Chem. (1988) 34;2087-2090. Jedną cząsteczkę AE przyłącza się bezpośrednio do sondy za pomocą nienukleotydowego łącznika, który pozwala na przyłączenie znacznika w dowolnym miejscu sondy. Patrz na przykład, Dokumenty Patentowe Stanów Zjednoczonych Nr 5585481 i 5185439. Chemiluminescencja jest wzbudzana przez reakcję z zasadowym nadtlenkiem wodoru, która powoduje powstanie wzbudzonego N-metyloakrydonu, który następnie powraca do stanu podstawowego emitując foton. Ponadto, AE powoduje hydrolizę estru i powstanie nie wykazującego chemiluminescencji kwasu metyloakrydynokarboksylowego.

Jeżeli cząsteczka AE jest związana kowalencyjnie z kwasem nukleinowym tworzącym sondę, hydroliza zachodzi gwałtownie w warunkach słabo alkalicznych. Jeżeli sonda znakowana AE jest dokładnie komplementarna do docelowego kwasu nukleinowego, tempo hydrolizy znacząco zmniejsza się. Tak więc, bez potrzeby jakiegokolwiek dodatkowego fizycznego rozdzielania, bezpośrednio w roztworze można wykryć wyznakowaną AE sondę, która uległa hybrydyzacji lub która nie uległa hybrydyzacji.

HPA ogólnie obejmuje następujące etapy: (a) sondę znakowaną AE poddaje się hybrydyzacji z docelowym kwasem nukleinowym w roztworze przez około 15 do około 30 minut. Następnie dodaje się do roztworu o słabo zasadowym pH i hydrolizuje się sondę, która nie uległa hybrydyzacji. Reakcja taka trwa około 5 do 10 minut. Sondę pozostającą, związana z hybrydą AE przyjmuje się jako miarę ilości obecnego docelowego kwasu nukleinowego. Etap ten zajmuje około 2 do 5 sekund. Korzystnie, różnicujący etap hydrolizy prowadzi się w tej samej temperaturze co etap hybrydyzacji, typowo w temperaturze 50 do 70°C. Ewentualnie, można wprowadzić drugi różnicujący etap hydrolizy w temperaturze pokojowej. Pozwala to na podniesienie pH reakcji, na przykład do poziomu 10-11, który powoduje wystąpienie większych różnic w szybkości hydrolizy, pomiędzy wyznakowaną AE sondą, która uległa hybrydyzacji i która nie uległa hybrydyzacji. HPA opisany jest szczegółowo w, na przykład Dokumentach Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 6004745; 5948899 i 5283174.

TMA opisany jest szczegółowo w, na przykład Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Nr 5399491. W jednym przykładzie wykonania typowego testu, próbkę wyizolowanego kwasu nukleinowego, podejrzaną o to, że zawiera sekwencje docelowe parwowirusa B19 miesza się ze stężonym buforem zawierającym bufor, sole, magnez, trójfosforany nukleotydów, startery, ditiotreitol i spermidynę. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się ewentualnie w temperaturze 100°C przez około dwie minuty żeby zdenaturować wszystkie struktury drugorzędowe. Po oziębieniu do temperatury pokojowej dodaje się odwrotnej transkryptazy, polimerazy RNA i RNAzy H i mieszaninę reakcyjną inkubuje się przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37°C. Wynik reakcji sprawdza się denaturując produkt, dodając roztwór sondy, inkubując przez 20 minut w temperaturze 60°C, dodając roztworu, który wybiórczo zhydrolizuje sondę, która nie uległa hybrydyzacji, inkubując mieszaninę reakcyjną przez sześć minut w temperaturze 60°C, i mierząc pozostałą chemiluminescencję za pomocą luminometru.

PL 210 849 B1

Cząsteczki oligonukleotydowe wytworzone sposobem według wynalazku mogą być użyte także do opartej na sekwencji amplifikacji kwasów nukleinowych (NASBA). Metoda ta jest kierowanym przez promotor procesem enzymatycznym, który wywołuje in vitro ciągłą, homogenną, izotermiczną amplifikację specyficznych kwasów nukleinowych i dostarcza kopii RNA kwasów nukleinowych. Odczynniki do prowadzenia NASBA obejmują pierwszy starter DNA z 5' końcem zawierającym promotor, drugi starter DNA, odwrotną transkryptazę, RNAzę-H, T7 polimerazę RNA, NTP i dNTP. Używając NASBA wytwarza się duże ilości jednoniciowego RNA z jednoniciowego RNA lub DNA, lub dwuniciowego DNA. Jeżeli namnożony ma być RNA, ssRNA służy jako matryca do syntezy pierwszej nici DNA w reakcji wydłużania pierwszego startera zawierającego miejsce rozpoznawane przez polimerazę RNA. Ta nić DNA z kolei służy jako matryca do syntezy drugiej komplementarnej nici DNA w reakcji wydłużania drugiego startera, dzięki czemu powstaje dwuniciowe aktywne miejsce promotorowe polimerazy RNA, a druga nić DNA, służy jako matryca do syntezy dużej ilości pierwszej matrycy, ssRNA, przy pomocy polimerazy RNA. Metoda NASBA znana jest w sztuce i opisana w na przykład. Europejskim Dokumencie Patentowym 329822, Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym Nr WO 91/02814 i Dokumentach Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 6063603, 5554517 i 5409818.

Sekwencje parwowirusa B19 opisane sposobem według wynalazku są przydatne w technikach hybrydyzacji i amplifikacji kwasów nukleinowych, w których wykorzystuje się rozgałęzione cząsteczki. W prostych testach hybrydyzacji kwasów nukleinowych badany jednoniciowy kwas nukleinowy poddaje się hybrydyzacji ze znakowaną jednoniciową sondą kwasu nukleinowego i wykrywa się powstający znakowany dupleks. Opracowano odmiany tego prostego schematu, które ułatwiają rozdzielenie dupleksów, które mają być wykryte, od nadmiarowego materiału i/lub amplifikują wykrywany sygnał. Jedna z metod amplifikacji sygnału, wykorzystuje amplifikację multimerów, którymi są polinukleotydy z pierwszym segmentem hybrydyzującym specyficznie z analizowanym kwasem nukleinowym lub nicią kwasu nukleinowego związaną z analizowanym kwasem nukleinowym i powtarzającym się drugim segmentem hybrydyzującym specyficznie ze znakowaną sondą. Amplifikacja teoretycznie jest proporcjonalna do liczby powtórzeń drugiego segmentu. Multimery takie mogą być liniowe lub rozgałęzione. Dwa typy rozgałęzionych multimerów są przydatne do użycia tą techniką: widełkowe i kombinowane. Sposoby wytwarzania i używania rozgałęzionych cząsteczek kwasów nukleinowych znane są w sztuce i opisane na przykład w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Nr 5849481.

W innym aspekcie sposobu według wynalazku, w celu stwierdzenia obecności organizmu wykonuje się dwa lub więcej opisanych powyżej testów. Na przykład, jeżeli do amplifikacji kwasu nukleinowego w celu jego wykrycia pierwszym użytym testem jest amplifikacja dzięki transkrypcji (TMA), to wykonuje się alternatywny test kwasów nukleinowych (NAT), na przykład, za pomocą opisanych tu metod amplifikacji PCR, RT PCR. Dzięki temu specyficznie i selektywnie wykrywa się parwowirusa B19, nawet jeżeli próbka zawiera inne organizmy, takie jak na przykład HIV, i wirus zapalenia wątroby typu B.

Jasne jest, że projektowanie opisanych tu testów może podlegać dużym zmianom i w sztuce znanych jest wiele ich form. Powyższe opisy zamieszczone są jedynie jako informacja i biegli w sztuce łatwo mogą zmodyfikować opisane protokoły, używając znanych w sztuce technik.

Żeby wykonać opisane powyżej testy, opisane powyżej odczynniki do testów, obejmujące startery, sondy, podłoża stałe ze związanymi sondami, a także inne odczynniki do wykrywania można dostarczać w zestawach z odpowiednią instrukcją i innymi niezbędnymi odczynnikami. Zestaw zawiera zwykle w oddzielnych pojemnikach kombinację starterów i sond (albo od razu związane z podłożem stałym lub razem z oddzielnymi odczynnikami umożliwiającymi związanie ich z podłożem), kontrolne formuły (dodatnie i/lub negatywne), znakowane odczynniki, jeżeli forma testu ich wymaga i związki wytwarzające sygnał (na przykład substraty enzymów), jeśli same sondy nie wytwarzają sygnału bezpośrednio. W zestawie zwykle zawarte są instrukcje wykonania testu (na przykład pisane, taśma, VCR, CD-ROM). Zestaw zwykle zawiera także, w zależności od typu użytego testu, zapakowane inne materiały i odczynniki (takie jak bufory do przemywania). Standardowe testy, takie jak te opisane powyżej, prowadzone są przy użyciu tych testów.

III. Doświadczenia

Poniżej znajdują się przykłady specyficznych przykładów wykonania sposobu według wynalazku. Przykłady zamieszczone są tylko w celu zilustrowania sposobu według wynalazku, i w żaden sposób nie ograniczają zakresu sposobu według wynalazku.

Włożono dużo wysiłku, żeby zapewnić dokładność użytych liczb (na przykład, ilości, temperatur), ale należy się liczyć z tym, że mogą występować pewne błędy doświadczalne i odstępstwa.

PL 210 849 B1

W nastę pują cych przykł adach enzymy kupuje się ze ź ródeł komercyjnych i uż ywa się ich zgodnie z zaleceniami producenta. Filtry nitrocelulozowe i inne produkty także kupuje się ze źródeł komercyjnych.

Izolację fragmentów DNA, jeśli nie zaznaczono inaczej i wszystkie manipulacje DNA wykonuje się według standardowych procedur. Patrz, Sambrook i wsp., supra. Enzymy restrykcyjne, T4 ligazę DNA, E. coli, polimerazę I DNA, fragment Klenowa polimerazy DNA, i inne odczynniki biologiczne kupuje się od komercyjnych dostawców używa się ich zgodnie z zaleceniami producenta. Dwuniciowe fragmenty DNA rozdziela się na żelu agarozowym.

P r z y k ł a d 1. Ekstrakcja kwasu nukleinowego parwowirusa B19 Nucleic Acid dla PCR

Próbki ludzkiej surowicy, które wcześniej badano testami na obecność IgM lub PCR i stwierdzono, że zawierają ludzkiego parwowirusa B19 uzyskuje się ze źródeł komercyjnych i używa do izolacji DNA użytego w późniejszych eksperymentach. Do czasu wykorzystania próbki przechowuje się w temperaturze -80°C.

DNA ekstrahuje się 0,2 ml surowicy przy użyciu zestawu QLAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) stosując zalecenia producenta z następującymi modyfikacjami. Do buforu lizującego dodaje się nośnikowego DNA w celu zwiększenia wiązania kwasu nukleinowego i wydajności.

Bardziej szczegółowo, na próbkę dodaje się 5,6 μg poliadenylowanego kwasu 5' (Sigma, St. Louis, MO) lub poli-dA (Roche, Indianapolis, IN). Ponadto, DNA parwowirusa B19 DNA wymywa się 200 μL buforu AE (Qiagen) zamiast wodą.

P r z y k ł a d 2. Wykrywanie próbek zawierających kwas nukleinowy parwowirusa B19 metodą PCR

Do amplifikacji fragmentów parwowirusa B19 używa się dwóch różnych procedur PCR. Jednej metody opisanej poniżej szczegółowo używa się do amplifikacji fragmentów o wielkości około 700 par zasad, 370 par zasad i 214 par zasad (patrz fig. 1). Do amplifikacji fragmentów o wielkości około 4,7 kilopar zasad używa się High Fidelity Expand PCR (Roche). Fragment o wielkości około 700 par zasad odpowiada pozycjom nukleotydowym 2936-3635 genomu parwowirusa B19 opisanego przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936. Fragment o wielkości około 370 par zasad występuje we fragmencie o wielkości około 700 par zasad w pozycji nukleotydowej 3073-3442. Fragment o wielkości około 4,7 kilopar zasad jest 4677 nukleotydowym fragmentem odpowiadającym pozycjom nukleotydowym 217-4893 genomu parwowirusa B19 opisanego przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936.

W celu namnożenia fragmentów B19 o wielkości około 700 par zasad, 370 par zasad i 214 par zasad, używa się starterów pokazanych w tabeli 1.

Tabela 1

Sekwencja startera

VP-5 AGGAAGTTTGCCGGAAGTTC (SEQ ID NO:36)

VP-3 GTGCTGAAACTCTAAAGGTG (SEQ ID NO:37)

VP2-5 GACATGGATATGAAAAGCCTGAAG (SEQ ID NO:38)

VP2-3 GTTGTTCATATCTGGTTAAGTACT (SEQ ID NO:39)

K-1sp ATAAATCCATATACTCATT (SEQIDNO:40)

K-2sp CTAAAGTATCCTGACCTTG {SEQIDN0:41)

Produkt PCR Region genomu

370 par zasad 370 par zasad 214 par zasad 214 par zasad 700 par zasad 700 par zasad

VP1

VP1/VP2

W tym doświadczeniu reakcję PCR prowadzi się w objętości końcowej 100 μl używając 2 μl oczyszczonego DNA parwowirusa B19 (oczyszczonego tak jak opisano powyżej), 0,2 mM każdego trójfosforanu deoksynukleotydu i 1,25 jednostki Pfu polimerazy DNA (Stratagene, La Jolla, CA). Amplifikację prowadzi się w następujących warunkach, denaturacja w temperaturze 94°C przez 2 minuty, przyłączanie starterów w temperaturze 37°C przez 3 minuty i wydłużanie w temperaturze 72°C przez 3 minuty przez 35 cykli. Te 35 cykli PCR poprzedzone jest 3 minutową preinkubacją w temperaturze 94°C w celu zapewnienia wstępnej denaturacji i zakończone 7 minutową inkubacją w temperaturze 72°C w celu zapewnienia pełnego wydłużania fragmentów. Produkty PCR poddaje się elektroforezie na 7% żelu poliakrylamidowym, barwi bromkiem etydyny i ogląda w świetle uv. Oczyszczanie namnożonych fragmentów prowadzi się przy użyciu zestawu do oczyszczania QiaQuick PCR (QIAGEN).

Jeżeli na żelu poliakrylamidowym nie pojawia się prążek wielkości 700 par zasad, to w celu namnożenia fragmentu B19 o wielkości 370 par zasad robi się zagnieżdżony PCR. Materiału DNA o wielkości 700 par zasad używa się do wykonania zagnieżdżonego PCR przy użyciu starterów pokazanych w tabeli 1.

Do amplifikacji fragmentu parwowirusa B19 o wielkości 4,7 kilopar zasad używa się High Fidelity Expand PCR (Roche) w sposób opisany poniżej. Zestawu High Fidelity Expand PCR (Roche) i starterów Hicks-5 (5'CCCGCCTTATGCAAATGGGGAG3') (SEQ ID NO:42) i Hicks-3

PL 210 849 B1 (5TTGTGTTAGGCTGTCTTATAGG3') (SEQ ID NO:43) używa się według zaleceń producenta. Stosuje się następujące warunki amplifikacji 35 lub 45 cykli temperatura 94°G przez 1 minutę, temperatura 50°G przez 2 minuty i temperatura 68°C przez 4 minuty. Stosuje się także preinkubację w temperaturze 94°C przez 2 minuty i inkubacje końcową w temperaturze 75°G przez 7 minut. Produkty PCR rozdziela się na 1% żelu agarozowym i oczyszcza przy użyciu zestawu PCR Purification (Promega, Madison, WI).

P r z y k ł a d 3. Klonowanie fragmentów DNA parwowirusa B19

Fragmenty PCR klonuje się do wektorów TOPO-TA (Invitrogen, Garlsbad, CA). Klonowanie do tych wektorów jest bardzo ułatwione jeżeli namnożony DNA zawiera pojedynczą deoksyadenozynę (A) na swoim 3' końcu. Dlatego w celu dodania wystającego końca 3' (A) stosuje się reakcję katalityczną. Mieszanina reakcyjna zawiera 1,25 mM dATP, 0,5 jednostki Taq polimerazy (Perkin Elmer, Boston, MA) i prowadzi się ją przez 15 minut w temperaturze 72°C.

Fragmenty PGR klonuje się do wektora pCR2.1-TOPO przy użyciu zestawu do klonowania TA firmy Invitrogen (TOPO™ TA Cloning^R Kit i One Shot TOP10 Electrocompetent Cells) stosując się do zaleceń producenta. Komórki bakteryjne inkubuje się w temperaturze 37°C na płytkach z podłożem Luria Broth zawierającym ampicylinę w stężeniu 100 (μ/ml, 0,66 mM IPTG i 0,033% X-Gal. Pewną liczbą białych kolonii szczepi się 4 ml podłoża Luria-Broth z ampicyliną (100 gg/ml) i inkubuje przez noc w temperaturze 37°C wytrząsając. Z trzech ml całonocnych hodowli otrzymuje się plazmidowy DNA przy użyciu zestawu QIAprep Miniprep (QIAGEN). Rekombinowane klony identyfikuje się przy użyciu enzymu restrykcyjnego EcoR1 (New England Biolabs) za pomocą elektroforezy na 7% żelu poliakrylamidowym lub 1% żelu agarozowym, tak jak opisano powyżej.

W celu określenia sekwencji DNA wyizolowanych klonów, tak jak opisano powyżej przygotowuje się duże ilości plazmidów z rekombinowanych klonów i DNA zawiesza się w buforze TE (10 mM TrisHCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) w stężeniu 0,2 mg/ml. Sekwencję nukleotydową fragmentów parwowirusa B19 określa się przy użyciu systemu do sekwencjonowania DNA Applied Biosystems Model 373 (lub Model 377).

Figury 2A do 2U (SEQ ID NOS:1-21) pokazują sekwencje DNA 21 izolatów parwowirusa B19, oczyszczonych, namnożonych i zsekwencjonowanych tak jak opisano powyżej, które odpowiadają pozycjom nukleotydowym 2936-3635 genomu parwowirusa B19 opisanego przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936 (fragment o wielkości 700 par zasad z fig. 1 i opisany powyżej). Figura 2A (SEQ ID NO:1) pokazuje sekwencję z izolatu CH47-26; Figura 2B (SEQ ID NO:2) pokazuje sekwencję izolatu CH48-29; Figura 20 (SEQ ID NO:3) pokazuje sekwencję izolatu CH33-2; Figura 2D (SEQ ID NO:4) pokazuje sekwencję izolatu CH33-3; Figura 2E (SEQ ED NO:5) pokazuje sekwencję izolatu CH33-4; Figura 2F (SEQ ID NO:6) pokazuje sekwencję izolatu CH42-7; Figura 2G (SEQ ID NO:7) pokazuje sekwencję izolatu GH42-18; Figura 2H (SEQ ED NO:8) pokazuje sekwencję izolatu CH42-19; Figura 21 (SEQ ED NO:9) pokazuje sekwencję izolatu CH46-23; Figura 2J (SEQ ID NO:10) pokazuje sekwencję izolatu CH1-1; Figura 2K (SEQ ID NO:11) pokazuje sekwencję izolatu CH1-6; Figura 2L (SEQ ID NO: 12) pokazuje sekwencję izolatu GH2-8; Figura 2M (SEQ ID NO: 13) pokazuje sekwencję izolatu GH2-10; Figura 2N (SEQ ED NO: 14) pokazuje sekwencję izolatu GH2-11C; Figura 20 (SEQ ID NO: 15) pokazuje sekwencję izolatu CH5-13; Figura 2P (SEQ ED NO: 16) pokazuje sekwencję izolatu CH7-22; Figura 2Q (SEQ ID NO: 17) pokazuje sekwencję izolatu CH13-27; Figura 2R (SEQ ID NO:18) pokazuje sekwencję izolatu CH14-33; Figura 2S (SEQ ID NO:19) pokazuje sekwencję izolatu CH52-2; Figura 2T (SEQ ID NO:20) pokazuje sekwencję izolatu CH64-2; i Figura 2U (SEQ ID NO:21) pokazuje sekwencję izolatu CH67-2.

Figury 11A do 11Z (SEQ ED NOS:62-87) pokazują sekwencje DNA dodatkowych 26 izolatów parwowirusa B19, oczyszczonych, namnożonych i zsekwencjonowanych tak jak opisano powyżej, które odpowiadają pozycjom nukleotydowym 2936-3635 genomu parwowirusa 819 opisanego przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936 (fragment o wielkości 700 par zasad z Figury 1 i opisany powyżej). Figura 11A (SEQ ID NO:62) pokazuje sekwencję izolatu CH80-1; Figura 11B (SEQ ID NO:63) pokazuje sekwencję izolatu CHS 1-3; Figura 11C (SEQ ID NO:64) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL1-4; Figura 11D (SEQ ID NO:65) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL2-1; Figura 11E (SEQ ID NO:66) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL3-1; Figura 11F (SEQ ID NO:67) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL4-3; Figura 11G (SEQ ID NO:68) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL5-2; Figura 11H (SEQ ID NO:69) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL6-2; Figura 11I (SEQ ID NO:70) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL7-3; Figura 11J (SEQ ED N0:71) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL8-2; Figura 11K (SEQ ID NO:72) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL9-1; Figura 11L (SEQ ID NO:73)

PL 210 849 B1 pokazuje sekwencję izolatu B19SCL9-9; Figura 11M (SEQ ID NO:74) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL10-2; Figura 11N (SEQ ED NO:75) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL11-1; Figura 11O (SEQ ID NO:76) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL12-1; Figura 11P (SEQ ID NO:77) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL13-3; Figura 11Q (SEQ ID NO:78) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL14-1; Figura 11R (SEQ ID NO:79) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL15-3; Figura 11S (SEQ ID NO:80) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL16-2; Figura 11T (SEQ ID NO:81) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL17-1; Figura 11U (SEQ ID NO:82) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL18-1; Figura 11V (SEQ ID NO:83) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL19-1; Figura 11W (SEQ ID NO:84) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL20-3; Figura 11X (SEQ ID NO:85) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL21-3; Figura 11Y (SEQ ID NO:86) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL22-11; Figura 11Z (SEQ ID NO:87) pokazuje sekwencję izolatu B19SCL2-14.

Porównanie sekwencji ujawniło około 98% do 99,5% homologii sekwencji pomiędzy tymi sekwencjami o wielkości 700 par zasad uzyskanymi z różnych izolatów.

Figury 3A-3C (SEQ ID NO:22) pokazują sekwencje fragmentu PCR o wielkości około 4,7 kilopar zasad przedstawionego na fig. 1 i opisanego powyżej z klonu parwowirusa B19 2-B1. Sekwencja pokazana na tych figurach jest 4677 nukleotydowym fragmentem odpowiadającym pozycjom nukleotydowym 217-4893 w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936. Pokazana sekwencja obejmuje pełnej długości otwartą ramkę odczytu parwowirusa B19, która koduje NS1, VP1 i VP2, oraz dodatkowe 5' i 3' sekwencje nieulegające translacji. Zsekwencjonowany fragment zawiera dodatkowy nukleotyd w 5' regionie niekodującym, pomiędzy pozycjami nukleotydowymi 367 i 368 sekwencji B19 opisanej przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936.

Figury 4A-4C (SEQ ID NO:23) pokazują sekwencje fragmentu PCR o wielkości około 4,7 kilopar zasad przedstawionego na fig. 1 i opisanego powyżej z klonu parwowirusa B19 2-B6. Sekwencja ta jest 4677 nukleotydowym fragmentem odpowiadającym pozycjom nukleotydowym 217-4893 w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936. Pokazana sekwencja obejmuje pełnej długości otwartą ramkę odczytu parwowirusa B19, która koduje NS1, VP1 i VP2, oraz dodatkowe 5' i 13' sekwencje nieulegające translacji. Zsekwencjonowany fragment zawiera dodatkowy nukleotyd w 5' regionie niekodującym, pomiędzy pozycjami nukleotydowymi 367 i 368 sekwencji B19 opisanej przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936.

P r z y k ł a d 4. Klonowanie i ekspresja rekombinowanych białek NS1, VP1 i VP2 parwowirusa B19

Fragmenty kodujące NS1, VP1 i VP2 (patrz fig. 1) amplifikuje się wykorzystując fragment o wielkości 4,7 par zasad parwowirusa B19 wstawiony w pCR2.1-TOPO (opisany powyżej). Startery PCR (patrz poniżej) zaprojektowano tak, żeby w reakcji PCR pozwoliły namnożyć regiony NS1, VP1 i VP2 parwowirusa B19. W celu ułatwienia wstawienia tych regionów do drożdżowych wektorów do ekspresji, tam gdzie to konieczne do starterów wstawiono miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Xbal, Hindlll i SalI.

Startery użyte do klonowania i namnażania fragmentów parwowirusa B19 służących do ekspresji rekombinowanych białek NS1, VP1 i VP2 w drożdżach oparte są na sekwencjach uzyskanych powyżej i są następujące: NS1-5 (starter sensowny)

5' ATACTCTCTAGACAAAACAAAATGGAGCTATTTAGAGGGGTGCTTCAAGTTTCT3' (SEQ ID NO:44)

NS1-3 (starter antysensowny)

5' GAGTATGTCGACTTACTCATAATCTACAAAGCTTTGCAATCCAGAGAG3' (SEQ ID NO:45)

VP1-5SN (starter sensowny)

5' ATACTCAAGCTTAGAAAACAAAATGAGTAAAGAAAGTGGCAAATGGTGGGAAAGT3' (SEQ ID NO:46)

VPALL-3 (starter antysensowny)

5' GAGTATGTCGACTTACAATGGGTGCACACGGCTTTTGGCTGTCCACAATTC3' (SEQ ID NO:47)

VP2-5SN (starter sensowny)

5' ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGACTTCAGTTAATTCTGCAGAAGCCAGCACT3' (SEQ ID NO:48)

Startery PCR syntetyzuje się, oczyszcza i zawiesza w 300 μL dH₂O i mierzy ich gęstość optyczną przy długości fali 260 nm. Mieszanina reakcyjna zawiera 0,25 ng matrycy, 100 pmol każdego startera, 10 μL 1,25 mM każdego dNTP i 1 jednostkę Taq polimerazy (Perkin Elmer, Boston, MA) w objętości końcowej 50 μL. Warunki amplifikacji są następujące, 35 cykli temperatura 94°C przez 1 minutę,

PL 210 849 B1 temperatura 50°C przez 2 min. i temperatura 68°C przez 4 min. Te 35 cykli i PCR kończy 7 minutową inkubacją w temperaturze 75°C, w celu zapewnienia pełnego wydłużania fragmentów. Produkty PCR poddaje się elektroforezie na 7% żelu poliakrylamidowym, barwi bromkiem etydyny i ogląda w świetle UV. Oczyszczanie namnożonych fragmentów prowadzi się przy użyciu zestawu do oczyszczania QiaQuick PCR (QIAGEN).

Do heterogennej ekspresji rekombinowanych białek parwowirusa B19 używa się plazmidu pBS24.1. Ten drożdżowy wektor do ekspresji zawiera sekwencje 2 μ i odwrotne sekwencje powtarzające się (IR) zapewniające autonomiczną replikację w drożdżach, terminator czynnika α gwarantujący zakończenie transkrypcji i drożdżowe geny leu2-d i URA3 umożliwiające selekcję. Plazmid ten zawiera także umożliwiające namnażanie i selekcję w E. coli miejsce początku replikacji ColE1 i gen β-laktamazy (Pichuantes i wsp. (1996) Expression of Heterologous Gene Products in Yeast W: Protein Engineering: A Guide to Design and Production, Chapter 5. J. L. Cleland i C. Craik, edytorzy, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. strony 129-161. Plazmid pBS24.1 trawi się enzymem restrykcyjnym BamHI/Sall i defosforyluje przy użyciu 10 jednostek fosfatazy alkalicznej z jelita cielęcego (Boheringer Manheim, Indianapolis, IN) stosując warunki zalecane przez producenta. Strawione i oczyszczone fragmenty PCR miesza się z pBS24.1 trawionym enzymami restrykcyjnymi BamHI/Sall i z fragmentem DNA zawierającym drożdżowy hybrydowy promotor ADH2/GAPDH (Cousens i wsp.. Gene (1987) 61:265-275) trawionym, w zależności od miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne występujących we fragmentach PCR, które mają być wstawione, albo enzymami restrykcyjnymi BamHI/Sall lub enzymami restrykcyjnymi BamHI/HindIII. Ligację prowadzi się przy użyciu zestawu Rapid Ligation kit firmy Roche i zalecanego przez producenta protokołu. Mieszaniny po ligacji używa się następnie do transformowania kompetentnych komórek E. coli HB101, a otrzymane transformanty selekcjonuje się na płytkach z podłożem Luria-Broth, zawierających ampicylinę w stężeniu 100 pg/ml po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C. Pobiera się po kilka klonów z każdej transformacji, szczepi nimi 3 mL podłoża Luria-Broth zawierającego ampicylinę w stężeniu 100 pg/ml i inkubuje przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.

Plazmidowe DNA otrzymuje się z 1,5 mL hodowli przy użyciu zestawu QIAprep Miniprep kit (QIAGEN). Rekombinowane klony identyfikuje się metodą analizy przy użyciu enzymów restrykcyjnych BamHI-Sall. W celu potwierdzenia sekwencji nukleotydowej sklonowanych fragmentów parwowirusa B19 metodą sekwencjonowania wykonuje się preparaty rekombinowanych plazmidów na dużą skalę.

Drożdżowych plazmidów do ekspresji mających spodziewaną dla NS1, VP1 i VP2 sekwencję używa się do transformacji drożdży. Kompetentne komórki Saccharomyces cerevisiae AD3 [Mat a, trp1+, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, prc1-407, [cir°],::pDM15 (pGAP/ADR1: :G418^R)], leu2 (MD)] transformuje się plazmidowym DNA kodującym NS1, VP1 lub VP2, sklonowanym tak jak opisano powyżej. Rekombinanty drożdży selekcjonuje się stosując dwie zmiany płytek bez uracylu i jedną zmianę płytek bez leucyny po inkubacji w temperaturze 30°C przez 48-72 godziny. Przed sprawdzeniem ekspresji rekombinowanych białek hodowle hoduje się w podłożu nie zawierającym leucyny i potem na podłożu YEP wzbogaconym 2% glukozy (Pichuantes i wsp., Proteins: Struct. Fund. Genet. (1989) 6:324-337) przez 48 godzin.

Sekwencje różnych białek z dwóch różnych izolatów pokazane są na fig. 5-10. Figury 5A (SEQ ID NO:24) i 5B (SEQ ID NO:25) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową NS1 z klonu 2-B1 parwowirusa B19. Figury 6A (SEQ ID NO:26) i 6B (SEQ ID NO:27) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową VP1 klonu 2-B1 parwowirusa B19. Figury 7A (SEQ ID NO:28) i 7B (SEQ ID NO:29) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową VP2 klonu 2-B1 parwowirusa B19. Figury BA (SEQ ID NO:30) i 8B (SEQ ID NO:31) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową NS1 z klonu 2-B6 parwowirusa B19. Figury 9A (SEQ ID NO:32) i 9B (SEQ ID NO:33) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową VP1 klonu 2-B6 parwowirusa B19. Figury 10B (SEQ ID NO: 34) i 10B (SEQ ID NO:35) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową VP2 klonu 2-B6 parwowirusa B19.

P r z y k ł a d 5

Wykrywanie i ilościowe oznaczanie DNA parwowirusa B19 metodą TaqMan™

Czułą metodę diagnostyczną wykrywania infekcji parwowirusa B19 opracowano jak następuje. Do wykrywania i ilościowego oznaczanie DNA parwowirusa B19 używa się metody PCR TaqMan™. Ilościowe oznaczanie DNA metodą PCR wymaga wydajnej ekstrakcji kwasu nukleinowego. Objętość osocza/surowicy użytych do ekstrakcji DNA wpływa także na czułość reakcji wykrywania. Do izolowaPL 210 849 B1 nia kwasu nukleinowego z 0,5 ml osocza/surowicy użyto dwóch podejść doświadczalnych. DNA ekstrahuje się przez (a) wiązanie z żelem krzemionkowym i (b) przyłączanie do oligonukleotydów specyficznych dla sekwencji docelowej.

(a) Izolacja kwasu nukleinowego przez wiązanie z żelem krzemionkowym

W obecności dużych stężeń soli chaotropowych, takich jak izotiocyjanian guanidyny kwasy nukleinowe wiążą się z krzemionką. Cząsteczki kwasu nukleinowego o małej wielkości wiążą się z większą wydajnością do krzemionki w warunkach kwaśnego pH. W wysokiej temperaturze związane kwasy nukleinowe wydajnie wymywa się zasadowym buforem o niskiej zawartości soli. Zastąpienie zwykłego żelu krzemionkowego namagnesowanym żelem krzemionkowym znacznie ułatwia etapy przemywania i wymywania w czasie izolacji kwasu nukleinowego. Magnetyczne podłoże używane jest do wychwytywania związanych z kwasem nukleinowym cząsteczek żelu krzemionkowego, eliminując w ten sposób etap wirowania konieczny do wytrą cenia czą steczek normalnego ż elu krzemionkowego. Używa się buforu do lizy firmy Organon-Teknika (Durham, NC). Ten bufor do lizy zawiera izotiocyjanian guanidyny, który rozpuszcza białka i inaktywuje RNazy i DNazy. Obecność detergentu Triton X-100 jeszcze bardziej ułatwia proces rozpuszczania i dezintegracji struktur komórkowych i białek jądrowych, co uwalnia kwas nukleinowy. Odczynnik do lizy zakwasza się w celu zwiększenia wiązania kwasu nukleinowego. Do wymycia związanego kwasu nukleinowego używa się 50 μΙ, zasadowego buforu do elucji. Po izolacji kwasu nukleinowego obecność DNA parwowirusa określa się metodą TaqMan™ PCR, tak jak opisano poniżej.

(b) Izolacja kwasu nukleinowego przez przyłączanie do oligonukleotydów specyficznych dla sekwencji docelowej

Chociaż użycie namagnesowanego żelu krzemionkowego znacznie ułatwia szybką i łatwą obróbkę w czasie etapów przemywania i elucji, izolowanie kwasów nukleinowych tą metodą jest wciąż pracochłonne i zajmuje dużo czasu. Dlatego używa się jednoetapowego wychwytywania specyficznego docelowego kwasu nukleinowego z surowicy lub osocza przy użyciu magnetycznych kulek. Żeby ta metoda mogła być stosowana w różnych testach wychwytywania wirusowych kwasów nukleinowych, stosuje się podstawowe kulki magnetyczne sprzężone z oligo-dT. Używa się kulek magnetycznych Sera-Mag oligo (dT) (Seradyn, Indianapolis, IN) sprzężonych z oligo dT o długości 14 merów w połączeniu z oligonukleotydami wychwytującymi, zawierającymi 20 poli A na końcu 3' przylegające do specyficznych sekwencji parwowirusa (oznaczonych na końcu sekwencji pokazanych poniżej).

Użyte tu antysensowne oligonukleotydy wychwytujące pochodzą z fragmentu o wielkości 700 par zasad i są następujące:

VSPC1 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCTTAACAGCAATTTCTGATA (nukleotydy 3492-3514) (*) (SEQ ID NO:49)

VSPC2 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCCCTGTAGTGCTGTCAG (nukleotydy 3549-3568) (SEQ ID NO:50)

VSPC3 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATACCCAAATAGGAAGTTCTG (nukleotydy 3639-3660) (SEQIDNO:51)

VSPC4 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAATGCTGATTCTTCACTTGC (nukleotydy 3737-3759) (SEQ ID NO:52)

VSPC5 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCTGTACCTCCTGTACCTA (nukleotydy 3789-3808) (SEQ ID NO:53)

VSPC6 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCCTCTAAATTTTCTGGG (nukleotydy 3838-3857) (SEQ ID NO:54)

VSPC7 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCCTAATGTGTCAGGAACC (nukleotydy 3910-3929) (SEQ ID NO:55) (*) Numery nukleotydów według Shade i wsp., J. Virol (1986) 58 : 921-936.

Kulki magnetyczne zawiesza się w buforze do lizy Novagen (Madison, WI) i testuje się zdolność siedmiu opisanych powyżej oligonukleotydów wychwytujących (VSPC1-VSPG7) pojedynczo lub w różnych kombinacjach, do wychwytywania DNA parwowirusa B19 z panelu otrzymanego z PDA Center for Biologie Evaluation and Research, U.S. Department of Health and Human Services (FDA-CBER).

(c) Przemywanie kulek i bufor do przemywania

Po wychwyceniu kulki przemywa się buforem zawierającym 0,3 M NaCl i 0,5% NP-40 w 10 mM Hepes doprowadzonym do pH 7,5. Po traktowaniu surowicy buforem do lizy, hybrydyzacji, magnetycznej adsorpcji kulek i usunięciu buforu do lizy, do kulek dodaje się 1,5 ml buforu do przemywania. Po zwykłym wytrząsaniu, magnetycznej adsorpcji kulek i usunięciu buforu do przemywania, kulki

PL 210 849 B1 przemywa się drugi raz 0,5 ml tego samego buforu, dzięki czemu kulki magnetyczne można zagęścić i umieś cić w 100 ml buforu Universal PCR, zawierającego wszystkie odczynniki do wykonania badania Taqman. W celu wykonania badania metodą TaqMan™ PCR, tak jak opisano poniżej, kulki ze związanym DNA przenosi się na płytkę TaqMan™. Badanie metodą TaqMan™ wykazało, że kilka kombinacji oligonukleotydów wydajnie wychwytuje B19.

Metodą TaqMan™ amplifikuje się wychwycony docelowy kwas nukleinowy jako amplikon DNA. Ewentualnie można amplifikować wychwyconą sekwencję docelową jako RNA. W celu wytworzenia amplikonów RNA przy użyciu T7 polymerazy RNA, oligonukleotydy użyte do amplifikacji zawierają startery specyficzne dla parwowirusa B19 z sekwencją promotorową T7. Trzy startery do amplifikacji (VSA1-A3, opisane poniżej), wyprowadzone z sekwencji o wielkości 700 par zasad, odpowiadającej nukleotydom 2936-3635 genomu parwowirusa B19 opisanemu przez Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58:921-936 sprawdzono pod kątem ich zdolności do amplifikacji. Startery miały następujące sekwencje:

Startery amplifikujące nić sensowną

VSA1 - AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCATATACTCATTGGACTGT (nukleotydy 2942-2961)(SEQIDNO:56)

VSA2 - AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAGAGCACCATTATAA (nukleotydy 3272-3288)(SEQIDNO:57)

VSA3-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACAATGCCAGTGGAAA (nukleotydy 33IT-3333) (SEQ ID NO:58)

VSP2-GTGCTGAAACTCTAAAGGT (Starter antysensowny, nukleotydy 3424-3442) (SEQ ID NO:59)

Odczynników zestawu RNamplifire (Qiagen) używa się do badania wydajności amplifikacji 50 kopii DNA parwowirusa jako sekwencji docelowej w objętości końcowej 20 mL. Startery do amplifikacji bada się pojedynczo lub w kombinacji używając VSP2 jako drugiego startera. W celu określenia wydajności amplifikacji przez te startery, po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze 42°C, tak jak zaleca producent, namnożony materiał rozcieńcza się 100 razy i wykrywa badaniem TaqMan™.

Kombinacja starterów do amplifikacji VSA2 i VSA3 z VSP2 była bardzo wydajna w wytwarzaniu amplikonów RNA.

Czułość testu TaqMan™, przydatność starterów PCR i optymalne warunki reakcji ustala się przy użyciu plazmidowego DNA zawierającego opisany powyżej fragment o wielkości 4,7 kilopar zasad. Fragment ten zawiera region VP1, a także regiony NS1 i VP2 (patrz fig. 1). Używa się starterów do amplifikacji PCR wyprowadzonych z regionu VP1, takich jak szczegółowo pokazano poniżej. Numeracja podana jest w odniesieniu do Shade i wsp., J. Virol. (1986)58:921-936. X oznacza 5'-fosforynoamid fluoresceiny, a Z oznacza DABCYL-dT, oba otrzymane z Glen Research Corporation, Sterling, VA. Numery umieszczone z prawej strony sekwencji oznaczają nukleotydy starterów w sekwencji parwowirusa B19.

VSP1 - GGAGGCAAAGGTTTGCA (starter sensowny nukleotydy 3334-3350) (SEQ ID NO:60)

VSP2 - GTGCTGAAACTCTAAAGGT (starter antysensowny nukleotydy 3424-3442) (SEQ ID NO:59)

VSPPR1 - XCCCATGGAGATATTTAGATTZ (Sonda nukleotydy 3379-3398) (SEQ ID NO:61)

Vpara 8: TCCATATGACCCAGAGCACCA (nt3262-3460) (SEQ ID NO: 88)

Vpara 9: TTTCCACTGGCATTGTGGC (Sonda antysensowna nukleotydy 3313-3331)(SEQ ID NO: 89)

VparalO: X AGCTAGACCTGCATGTCACTG Z, w którym X oznacza Fam i Z oznacza Tamra (nukleotydy 3286-3310) (SEQ ID NO: 90)

Stężenie plazmidowego DNA oznacza się spektrofotometrycznie i wykonuje się seryjne rozcieńczenia do uzyskania 5000-10 kopii/20 μ|. Mieszanina reakcyjna o objętości końcowej 50 μΐ zawiera 20 μl próbki, 1X Gold Taq bufor do amplifikacji (Perkin Elmer) z 3,2 mM MgCl₂, 300 μM każdego dNTP, 1 pmo| każdego startera do amp|ifikacji, 0,4 pmo| sondy i 1 jednostkę enzymu Amp|iTaq. Warunki reakcji obejmują 10 min w temperaturze 95°C w celu aktywacji enzymu, a następnie 45 cykli po 30 sekund w temperaturze 95°C, zmienianej na 60°C w ABI 7700 Sequence Detector.

Przez użycie pary starterów VSP1 i VSP2, które wytwarzają produkt PCR o wielkości 109 par zasad i sondy VSPPR1, wykrywa się 10 kopii na badanie. Ponieważ objętość próbki wynosi 20 μL w końcowej objętości mieszaniny 50 μL, to wynika z tego, że z próbki surowicy zawierającej tak niewiele, jak 50 kopii/ml DNA parwowirusa B19 można wyizolować i wykryć metodą TaqMan™. Ponieważ parwowirus jest wirusem występującym w dużej ilości, do analizy można ekstrahować i użyć objętości osocza/surowicy wielkości 50 μL.

PL 210 849 B1

Używając próbki FDA-CBER zawierającej DNA parwowirusa B19 (10⁶ kopii/ml) i metody TaqMan™ wykrywa się 50 kopii na badanie. W celu skorelowania kwasu nukleinowego i miana immunologicznego, zawartość wirusowego DNA oznacza się ilościowo w kilku próbkach zawierających przeciwciała. Opisane zostały nowe sekwencje ludzkiego parwowirusa B19 i testy do wykrywania wykorzystujące te sekwencje.

Lista	sekwencji (wersja poprawiona)
<110>	N07ARTIS VACCINES and DIAGNOSTICS,	INC.
<120>	PRÓBY DIAGNOSTYCZNE DLA PARWOWIRUSA	B19
<130>	2301-17194.40/PP17194.004
<140>	10/187,253
<141>	202-06-28
<150>	60/365,956
<151>	2002-03-29
<160>	93
<170>	Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH47-26 <400> 1

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaatttg	4 80
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcattta	attgaaaact	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggagtacaag	ttactgacag	cactaccggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 2

PL 210 849 B1 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH48-29 <400> 2

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	tacaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaacaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	agggggtggc	240
agtaatcctg	ccaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttactgccaa	cLctgtaact	300
tgtacatL tt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	3 60
tctcccgcag	ctagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agt cccataa	tgggatactc	aactccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcaccta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gatttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgcc	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 3 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

<220>
<223> Opi	s sztucznej sekwencji: izolat CH33-2
<400> 3
ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaacaa	180
tacccaagca	tgacttcagc	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	Lagggggtggc	240
aqtaatcctq	ccaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttactgccaa	cccrgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	ctagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccat t	420
agtcccataa	tgggatactc	aactccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcaccta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gatttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgct	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

PL 210 849 B1 <210> 4 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <2 2 0 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat C.H33-3 <400> 4

ataaatc-at.	atactcat tg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagt t Lgccg	gaagttcccg	cttaaaacgc	ctcagaaaca	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	agggggtggc	24 0
agtaatcctg	c c a a a a g c a t	gtggagtgag	ggggccactt	ttactgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccat ta	Laaggtgttt	360
tctcccgcag	ctagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
agtcccataa	tgggatactc	aactccatgg	agatat1 tag	attttaatgc	tttaaatcta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcaccta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	3 4 0
gatttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	t tacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgcc	tgttagtaga	ccatgaatac	6 60
a a g t a c c c a t	a t g t g 11 a g g	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 5 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH33-4 <400> 5

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	agggggtggc	2 4 0
agtaatcctg	ccaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttactgccaa	ctctgtaact	30 0
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	ctagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggat actc	aactccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	4 8 0-
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcaccta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gatttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgcc	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttacg	gcaaggtcag	gatactttag			700

PL 210 849 B1 <210> 6 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH42-7 <4 00> 6

ataaatcca;	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	11.11 a a a a a a	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	atcttcaaqq	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcccg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tg tacattt t	ccaggcagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaa Lgcc	agtggaaagg	aggcaaa.ggt	ttgaaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatt '^ag	attttaatgc	t tt aaattta	480
tttttttcac	ctttagaqtt	rcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agcLcctgat	84 0
gett Laactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	acgLgttagg	gcaaggtcag	gataetttag			700

<2.1 0> 7 <211> 700 <212> DNA <2i3> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH42-18 <4 00> /

ataaa'_ccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	cataaaaaat	60
gaaactgggt	t Lcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccac L L	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
Lgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	caaggtgttt	3 60
Lctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccat L	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attt taatąc	cttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660

PL 210 849 B1 aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gacactttag 700 <210> 8 <211> 700 <21 2> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH42-19 <400 8

ataaatccat	atactcat tg	gactg Lagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	50
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aag L Ltgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	t tagtgccaa	ctccgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	3 60
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ctgcaccat L	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attt.taacgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaacc	atggaagtaa	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactgęaggg	600
ggggtacaąg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 9 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <2 2 0>

<221> różne własności <222> (76) <223> gdzie Ό oznacza A, T, C, lub G <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH46-23 <4 00 9

attaat ccat	atactcattg	gactgtacca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaancaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagt ttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	130
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240

PL 210 849 B1

agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctct gtiiact	300
tgtacatttt	ccaggcagtt	tttaattcca.	tacgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tcccccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agaggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
a g t c c t' a 1? aa	cgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	ttcaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agct cc l.ga t	54 0
gctttaactg	taaccatatc	acaaat tgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	60 0
gggg-acagg	taactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatacttl ag			700

<210 10 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

<220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH1-1
<4003' 10
a t a a a 1. c c a c	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggc	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctqc.c	120
cctgtggccc	att 1 Ucaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgac.t Lcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccacta	taaggtgttt	360
tct.cccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	Lgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagLL	t c.agcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaa t tgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	Lgt t agtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 11 <210 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

<2 2 0
<223> Opi	s sztucznej sekwen	cji: i zol	at CH1-6
<4 0 0 n
ataaatccat	atactcattg gaccgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180

PL 210 849 B1

tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24C
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	t tagtgccaa	ctctgtaact	30 C
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tct cccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctaLgca	tgttag Laga	c c a t q a a t a c	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 12 <211> 700 <212> DNA <21 3> Sztuczna sekwencja

<220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH2-8
< 4 0 0 > 12
ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	18C
tacccaagca	Lgact tcagt	t aaLLctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gct L taactg	taaccatatc	agaaattgct	g L Laaggatg	t tacagacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			7 00

<210> 13 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

<220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH2-10
<400> 13
ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg	t gcagct gcc	120

PL 210 849 B1

c c t g t g q c c c	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	130
tacccaagca	cgactccagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aqqgqggqqc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	3 00
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatca	taaggtgctt	360
tctcecgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtccca taa	tgggatactc	aaccceatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	430
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcact ta	attgaaaatc	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacag	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgtcagtaga	ccatgaatat	660
aay tacccat	atgcgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			300

<210> 14 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <2 2 0>

<223> Opis szcucznej sekwencji: izolac CH2-11C <4 00> 14

ataaatccat	atactcattg	gac.tgtagca	gatgaagagc	t tttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactact tta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	a 1111caagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	•aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agt cccataa	tgggatactc	aaccceatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	4 80
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcac.tta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcccgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggacg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgrtagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			300

<210> 15 <211> 699 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH5-13 <400> 15

PL 210 849 B1

ctaaatccat	atactcattg	gaccgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	1 30
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	2 4 0
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaaag	aggcaaaggt	ttgcactatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	430
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgcc	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccaa	tgtgttaggg	caaggtcagg	atactttag			699

<210> 16 <211> 700 <212> DNA

Sztuczna sekwencja

<220>
<223> Opi	S SZtUCZZ	iej sekwencji: izolat CH7-22
<400> 16
ataaatccat	gtactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cccgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcag L	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
LgLacatttt.	ccagacagtt	tttaatccca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatattcag	attttaatgc	tttaaatttg	480
tttttttcac	ctt tagagtt	tcagcattta	attgaaaact	atggaagtat	agctcctgat	54 0
gctttaactg	taaccstatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggagtacaag	ttactgacag	cactaccggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatacttcag			700

<210> 17 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <2 2 0>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH13-27 <400> 17

PL 210 849 B1

araaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	t gcagctgcc	120
cctgtggccc	actttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
aętaattctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgctaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagaca qt t	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	cgagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	trgcaccatc	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tctaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	ccagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctccLgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaaccgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
a a g t a c c c a t	atgtgttagg	gcaaggtcag	gacactttag			700

<210> 18 <211> 699 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22ϋ>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH14-33 <400> 18

ataaatccat	atactcattg	gactgtggca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	ta Laaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactac Ltta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	at t t tcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	agggggggga	24 0
gtaatcctgt	taaaagca tg	tggagtgagg	gggccacttc	tagtgccaac	tctgtaac;t	30C-
gtacattttc	cagacagttt	ttaattccat	atgacccaga	gcaccattat	aaggtgttct	36C
ctcccgcagc	aagtagccgc	cacaatgcca	gtggaaaaga	ggcaaagg tt	tgcaccatta	420
gtcccacaat	gggatactca	a c c c c a t g g a	gatatttaga	ttttaatgct	ttaaatttat	480
l 111 L L c a c c	tttagagtct	cagcacttaa	ttgaaaatta	tggtagtata	gctcctgatg	54 0
ctttaactgt	aaccatatca	gaaattgctg	ttaaagatgt	iacagacaaa	actggagggg	600
gggtacaggt	tactgacagc	actacagggc	gcctatgcat	gttagtggac	catgaataca	660'
agtacccata	tgtgttaggg	caaggtcagg	atactttag			699

<210> 19 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> Opis sztucznej seewencji: izolat CH62-2 <400> 19

PL 210 849 B1

ataaatccat	atactcattg	gactg tagea	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	50
gaaactgggt	L L. c a a gca ca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ct cagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcaat	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccaLLa	taaggtgttt	360
tctcccgcag	ccaytagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	111 a a a 111 a	4 8 0
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcact La	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gett taactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	ttactgacag	cactacaggc	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 20 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

<220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH64-2
<400> 20
a La a a t ccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	6 0
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	a 111 L caagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tcgcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agataettag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	t i. a c g g a c a a	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 21 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH67-2 <4 00> 21

PL 210 849 B1

stdaat na L	acactcattg	gactgtggca	gatgaagagc	ttctaaaaaa	tataaaaaa L	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cccgtggccc	atcttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	L g a c 1.1 c a q t	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggg	2 4 0
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	l aaggtgttt	360
t c t cccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaaag	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tggga tacte	aaccccatgg	agacatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
ttttcttcac	ctttagagtt	tcagcactta	at l_ g a a a a 11	at ggaagtat	agctcctgat	540
cctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaagatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtacagg	t tactgacag	caccacaggg	cgcctatgca	tgttagtgca	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	g a t a c L11 a q			700

<210> 22 <211> 4670 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223?> Opis sztucznej sekwencji: fragment PCR o wielkość 4,7 kilopar zasad z parwcwirusa B19 klcn 2-B1 <400> 22

eccgccttat	gcaaatgggc	agccatctta	agtgttttac	tataatttta	ttggtcagtt	60
ttgtaacgg c	Laaa at gggc	ggagcgtagg	caaggactac	agtatatata	gcacagcact	120
gccgcagctc	tttctttctg	ggctgctttt	ttcctggact	cacttgctgt	tttttgagag	130
ctaactaaca	ggtatttata	etaettgtta	acatactaac	atggagctat	ttagagggg t	24 0
gcttcaagtt	tcttctaatg	ttctggactg	tgctaacgat	aactggtggt	gctctttact	300
ggatttagac	acttctgact.	gggaaccact	aactcatact	aacagactaa	tggcaatata	360
cttaagcagt	gtggcttcta	agettgaett	tactgggggg	ccactaącag	ggtgcctgta	420
cttttttcaa	gtagaacgta	acaaatttga	agaaggctat	catattcatg	tggttattgg	480
ggggccaggg	Ltaaacccca	gaaacctcac	agtgtgtgta	gaggggttat	ttaataatgt	540
accttatcac	cttgtaactg	aaaatctgaa	gctaaaatt.t	Ltgccaggaa	tcactacaaa	600
aggcaaatac	tttagagatg	gagageagtt	tatagaaaac	tatttaatga	aaaaaatacc	660
tc Laaat gtt	gtatggtątg	ttactaatat	tgatggacat	atagatacct	gtatttctgc	720
tacttttaga	aagggagc t L	gccatgccaa	gaaaccccgc	atcaccacag	ccataaatga	780
taccagtact	gatgctgggg	agtctagcęg	cacaggggca	gaggttgtgc	cattcaatgg	840
gaagggaact	aaggctagca	taaagtttca	aactatggta	aactggtrgt	gtgaaaacag	300
agtgtttaca	gaggataagt	cgaaactagt	tgactttaac	cagtacactt	tactaagcag	3 60
tagtcacagt	ggaagttttc	aaattcaaag	tgcactaaaa	ctaccaattt.	ataaagcaac	1020
taatccagtg	cctactagca	catrtttatt	gcatacagac	ttteagcaag	11atgtg ta t	1 OSO
taaaaacaat	aaaattgtta	aattgttact	ttgtcaaaac	tatgaccccc	tattagtggg	1140
gcagcatgtg	ttaaagtgga	ttgataaaaa	at qt ggcaag	aaasńcacdc	tgtggtttta	1200

PL 210 849 B1

tgggccgcca	ag Lacaggga	aaacaaactt	ggcaatggcc	attgctaaaa	gcgttccaąt	Ί 2 b 0
atatggcatg	gttaactgga	ataatgaaaa	ctttccactt	a a t g a t q t a q	caggaaaaag	1320
cttggtggtc	tgggatgaag	gtattattaa	gtctacaat L	gtagaagctg	caaaagccat	1380
tttaggcggg	caacccacca	gggcagaLca	aaaaatgcgt	ggaagtgtag	ctgtgcctgg	1440
agtacctgtg	gttataacca	gcaatggtga	cattactttt	gttgtaagcg	ggaacactac	1500
aacaactgta	catgctaaag	cctcaaaaga	gcgcatggta	aagttaaact	ttactgtaag	1560
atgcagccct	gacatggggt	tactaacaga	ggc Lgatgta	caacagtggc	ttacatggtg	1620
t a a t g c a c a a	agctgggacc	actatgaaaa	ctgggcaata	aactacactt	ttgacttccc	1680
tggaattaat	gcagatgccc	tccacccaga	cctccaaacc	accccaattg	tcacaga cac	1/4 0
cagcatcagc	agcagtggtg	gtgaaagctc	tgaagaact.c	act g a a a c c a	gctttttcaa	1800
cctcatcacc	ccaggcgcct	gga a cacc qa	aaccccgcgc	tctagtacgc	ccatccccgg	1860
gaccaąttca	ggagaatcat	ctgtcggaag	cccagtttcc	tccgaagttg	tagctgcatc	1920
gtgggaagaa	gccttctaca	cacctttggc	agaccagttt	cgtgaactgt	Lagttggggt	1980
tgattatgtg	tgggacggcg	taaggggctt	acctgtctgt	tgtgtgcaac	atattaacaa	2040
L.agtggggga	ggcttgggac	tttgtcccca	ttgcattaat	gtaggggctt	ggtataatgg	21 CO
atggaaactt	cgagaattca	ccccagactt	ggtgcgacgt	a g c t g c c a t. g	tgggagcttc	2160
taatcccctt	tctgtgctaa	cctgc.aaaaa	at qtgct cac	ctgtctggat	tgcaaagctt	2220
tgtagatta t	ga gta aagaa	agtggcaaat	ggtgggaaag	tgatgataaa	tttgctaaag	2280
ctgtgtacca	gcaatttgtg	gaattttatg	aaaaggttac	tggaacagac	ttagagctts	234 0
ttcaaatatt	aaaagatcat	t a t a a t a z 11	ctttagataa	tcccccagaa	aacccatcct	2400
ctttgtttga	cttagttgct	cgtattaaaa	ataaccttaa	aaactctcca	gacctatata	2 4 60
gtcaccattt	tcaaagtcat	ggacagttat	ctgaccaccc	ccatgcctta	c c a c c c a g t a	2520
gcagccatgc	agaacctaga	ggagaagatg	cagtattatc	t ag L gaagac	ttacacaagc	2580
ctgggcaagt	tagcgtacaa	ct acccgg ta	ctaactatgt	tgggcctggc	aatgagctac	264 0
a a g c c g g g c c	cccgcaaagt	gctgttgaca	gtgctgcaag	gattcatgac	tttaggtata	2700
gccaactggc	taagtcggga	ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	2760
ctttaaaaaa	tataaaaaat	gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	2820
cL L Laaaagg	tgcagctgcc	cctgtggccc	attttcaagg	aagtctgccg	gaagttcccg	2880
cttacaacgc	ctcagaaaaa	cacccaagca	tgacttcagc	taattctgca	gaagccagca	2 94 0
ctggtgcagg	aggggggggc	agtaatcctg	tgaaaagcac.	gcggagtgag	ggggccactc	3000
ttagtgccaa	ctc t g L a a c 1	cgtacatttt	ccagacaatt	tctaattcca	tatgacccag	3060
a g c a c c a 11 a	taaggtgttt	tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	3120
aggcaaaggt	ttgcaccatt	agtcccataa	tgggatactc	aaccccacgg	agatat11ag	3180
actttaatgc	111 a a a L L U a	tttttttcac	ctttagagtt	tcagcaccta	attgaaaatt	3240
atggaagtat	agctcctgat	gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	3300
ttacggacaa	aactggaggg	ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcct atgca	3 3 60
tgttagtaga	ccatgaatat	aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggt caa	gataetttag	34 20
ccccaąaact	Lcctatttgg	gtatactttc	cccctcaata	cgcttactta	acagtaggag	34 30'
atgttaacac	acaaggaatt	tctggagaca	gcaaaaaatt	ggcaagtgaa	gaateageat	3 5 4 0
ttcatgttct	ggaacacagt	tcttttcagc	ttttaggtac	aqqaggtaca	g c a a c L a t g t	3600
ct tataagt c	t cctccag tg	cccccagaaa	atttagaggg	ctgcagtcaa	cactcttatg	3660
aaatgtacaa	ccccttatac	ggatcccgct	tagcggttcc	tgacacatta	ggaggtgacc	3720

PL 210 849 B1

caaaatttag	atctttaaca catgaagacc	atgcaactca	gccccaaaac	ttcaagccag	3780
ggccactag*	aaactcagtg	tctacaaagg	agggagacag	ctctagtact	ggagctggaa	384 0
aagccttaac	aggccttagc	acaggtacct	ctcaaaacar.	tagaatatcc	ttacgccctg	3000
ggccagtgtc	tcagccgtac	caccactggg	acacagataa	atatgtcaca	ggaacaaatg	3960
ccatttctca	tggtcagaoc	actcatggta	acgctgaaga	caaagagtat	cagcaaggag	4020
tgggtagatt	tccaaatgaa	aaagaacagc	taaaacagtt	acagggtt La	aacat.gca ca	4 08 0
cctactttcc	caataaagga	acccagcaat	at a ca g aLca	aattgagcgc	cccctaatgg	4 140
tgggctctgt	atggaacaga	agagccct t c	actatgaaag	ccagctgtgg	agcaaaattc	4200
caaatttaga	tgacagtttt	aaaactcagt	ttgcagcctt	aggaggatgg	ggrt rgcaLc	4 2 60
agccacctcc	tcaaatattt	ttaaaaatat	taccacaaag	t g g g c c a a t L	ggaggtatta	4 320
aatcaatggg	aattactacc	L L a g t1 c. a g t	atgccgtgcg	aattatgaca	gtaaccatga	4 380
catttaaa Lt	ggggccccgt	aaagctacgg	gacggtggaa	tcctcaacct	ggagtgtatc	4 4 4 0
ccccgcacgc	agcaggtcat	ttaccatatg	tactatatga	c cc ca cagc t	acagatgcaa	4 500
aacaacacca	cagacatgga	tatgaaaaga	ctgaagaatt	gtggacagcc	aaaagccgtg	4 560
tgcacccaLt	gtaaacactc	cccaccgtgc	cctcagccag	gatgtgtaac	taaacgccca	4 62 0
ccagtaccac	ccagactgta	cctgccccat	ccaataccta	taagacagcc	taacacaa	4 678

<210> 23 <211> 4678 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: fragment PCR o wielkości 4,7 kilopar zasad z parwowirusa BIS klon 2-B6 <400> 23

cccgccttat	gcaaatgggc	agccatctta	agigctttac	Lataatttta	ttggtcagtt	60
ttgtaacggt	taaaatgggc	ggaccgtagg	caaggactac	agtatatata	gcacagcact	120
gccgcagctc	cttctttctg	ggctgctttt	ttcccggact	tacttgctgt	tttttgtgag	180
ctaactaaca	ggtatttata	ctacttgtta	acatactaac	atggagctat	ttagaggggt	24 0
gcttcaagtt	tcttctaatg	ttctggac Lg	Lgctaacgat	a a c t. g g t g g t	gctctctact	300
ggatttagac	acltctgact	gggaaccact	aactcatact	aacagactaa	tggcaatata	360
cttaagcagt	gtggcttcta	agcttgactt	tactgggggg	ccactagcag	ggtgcttgta	4 20
ctttrttcaa	gtagaatgta	acaaattLga	agaaggc tat	catattcatg	tggttattgg	4S0
ggggccaggg	L taaacccca	gaaacctcac	agtgtgtgta	gaggggttat	ttaataatgt	540
actcta tca c	cttgtaactg	aaaatctgaa	gctaaaattt	ttgccaggaa	tgactacaaa	600
aggcaaatac	tttagagatg	gagagcagtt	tatagaaaac	tatttaaLga	aaaaaatacc	660
tttaaatgtt	gtatggtgtę	ttactaatat	tgatggacat	atagatacct	gtatttctgc	720
tact t L Laga	aagggagctt	gccatgccaa	gaaaccccgc	atcaccacag	ccataaatga	780
tactagtact	gatgctgggg	agtctagcgg	cacaggggca	gaggttgtgc	catttaatgg	840
gaagggaact	aaggctagca	taaagtttca	aacLatggt.a	aactggttgt	gtgaaaacag	900

PL 210 849 B1

agtgtttaca	gaggataagt	ggaaac.tagt	tgac L 11aac	cagtacactt	tactaagcag	960
cagtcacagt	ggaagtt t l.c	aaattcaaag	tgcactaaaa	ctagcaattt	ataaagcaac	102 0
t a a t c t a q t q	cctactagca	cacttttatt	gcatacagac	tctgagcaag	ttatgtgtat	108 0
taaagacaat	aaaattgtta	aattgttact	ttgtcaaaac	tatgaccccc	Lattagtggg	1140
gcagcatgtg	ttaaagtgga	ttgataaaaa	atgtggcaag	33333C3C3C	tgtggtttta	1200
tggaccgcca	agt a ca g g g a	aaacaaactt	ggcaatggcc	attgctaaaa	gtgttccagt	1 2 60
a ŁaLggcatg	gttaactgga	ataatgaaaa	ctttccattt	a a t g a t g t a g	caggaaaaag	1320
cttggtggtc	tgggatgaag	gtattactaa	gtctacaatL	gtagaagctg	caaaagccat	1300
tctaggcggg	O 3 3 C (J C’. 3 C C 3	gggtagatca	aaaaatgcgt	ggaagtgtag	ctgtgcctgg	1440
a g t a c c c g t g	gttataacca	gcaatggtga	cattactttt	gttgtaagcg	gga a cac t ac	1500
aacaactgta	catgctaaag	ccttaaaaga	gcgcatggt.a	a a g11 aaact	ttactgtaag	1560
atgcagecct	gacatggggt	tactaacaga	ggctgatgta	caacagtggc	ttacatggtg	1620
taaluaaaaa	agctgggacc	actatgaaaa	ctgggcaata	aactacactt	11 g a 111 c c c	1680
tggaattaat	gcagatgccc	tccacccaga	cctccaaacc	accccaattg	tcacagacac	17 4 0
cagtatcagc	agcagtggtg	gtgaaagctc	tgaagaactc	agtgaaagca	gcttttttaa	18 00
c c t cat cacc	ccaggcgcct	ggaacactga	aaccccgcgc	tctagtacgc	ccatccccgg	18 60
gaccagttca	ggagaatcat	ctgcccgaag	cccagttt cc	t ccgaagttg	tagctgcatc	1920
gtgggaagaa	gc.cttctaca	cacctttggc	agaccagttt	cgtgaactgt	tagttggggt	1980
L g a a t a t g t g	tgggacggtg	taaggggttt	acccgtctgt	tgtgtgcaac.	atattaacaa	2 0 4 0
tagtggggga	ggcttgggac	tttgtc.ccca	ttgca1t aac	g '-aggggctt	ggtataatgg	2100
atggaaattt	c.gagaatt La	ccccagattt	ggtgcgatgt	agctgccatg	tgggagcttc	2160
Laatcccttt	tctgtgctaa	cctgcaaaaa	atgtgcttac	cagtctggat	t q c a a a g c 11	2220
tgtagattat	gagtaaagaa	agtggcaaat	ggt ggga aa g	tgalgataaa	ttcgctaaag	2280
ctgtgtatca	gcaat L tgtg	gaattttatg	aaaaggttac	tggaacagac	ttagagctta	234C
“tcaaatatt	aaaugatcat	tataatattt	ctttagataa	tcccctagaa	aacccatcct.	2400
ctttgttcga	cttagttgct	cgtattaaaa	ataaccttaa	aaactctcca	gacttatata	2 4 60
gtcatcattt	tcaaagtcat	gga cag t Lat	ctgaccaccc	ccatgcctta	tcatccagta	2520
gcagLcatgc	agaacctaga	ggagaagatg	cagtattatc	tagtgaagac	ttacacaagc	2 5 8 0
ctgggcaagt	tagcgtacaa	ctacccggta	c t a a c t a t g t	tgggcctggc	aatgagctac	2 64 0
aagctgggcc	cccgcaaagt	gctg t-1 gaca.	gtgctgcaag	gattcatgac	tttaggtata	2700
gc c a a c tq g c	Laagtcggga	ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	2760
ttttaaaaaa	tataaaaaat	gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactactt ta	2820
ctttaaaagg	tgcagctgcc	cctgtggccc	at 111 caagg	aag 111 gccg	gaagttcccg	2880
cttacaacgc	ctcagaaaaa	tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	2 94 0
ctggtgcagg	aggggggggc	agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagcgag	ggggccactt	3000
ttagtgccaa	ctctgtaact	t g t a c a 1.111	ccagacaa t	tttaatccca	tatgacccag	3060
agcaccatta	taaggtgttt	tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	3120
aggcaaaggt	ttgcaccatt	agtcccataa	tgggataccc	aaccccatgg	agatatttag	3180
attttaatgc	tttaaattta	tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	a 11 g a a a a 11	3240
atggaagtat	agctcctgat	g c 1.11 a a c t g	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	3300
ttacaaacaa	aactggaggg	ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	33 60
tgttagtaga	ccatgaatat	aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggt.c.aa	gatactttag	3420

PL 210 849 B1

ccccagaact	tcctatttgg	gtatactttc	cccctcaata	cgcttactta	acagtaggag	3 4 8 0
atgttaacac	acaaggaatt	.ctggagaca	gcaaaaaatt	ggcaagtgaa	gaatcagcat	3540
111 a t g t 5 L L	ggaacacagt	tcttttcagc	ttttaggtac	aggaggtaca	gcaactatgt	360C
cttataagtt	tcctccagtg	cccccagaaa	atttagaggg	ctgcagtcaa	cacttttatg	366C
aaatgtacaa	ccccttatac	ggatcccgct	taggggttcc	tgacacatta	ggaggtgacc	3320
caaaatttag	atctttaaca	catgaagacc	atgcaattca	gccccaaaac	ttca tgccag	33 8 0
ggccactagt	aaactcagtg	tctacaaagg	agggagacag	ctctagtact	ggagctggaa	384 0
aagcctcaac	aggccttagc	acaągtacct	ctcaaaacac	aagaatatcc	ttacgccctg	3 90 0
ggccagtgtc	tcagccgtac	caccactggg	acacagataa	atatgtcaca	ggaataaatc	3960
ccatttctca	tggtcagacc	acttatggta	acgctgaaga	caaagagtat	cagcaaggag	4020
tgggtagatt	tccaaatgaa	aaagaacagc	taaaacagLL	acagggttta	aaaatgcaaa	4 080
cctactttcc	caaLaaagga	acccagc.a at	atacagatca	aattgagcgc	ccectaa:gq	4140
tgggttctgt	atggaacaga	agagcccttc	actatgaaag	ccagctgtgg	agtaaaaitc	4200
caaatctaga	tgacagtttt	aaasctcagt	ctgcagcctt	aggaggatgg	ggtttgca tc	4260
agccacctcc	tcaaatattt	LtaaaaaŁaL	LdCCdCdddCJ	tgggccaatt	ggaggtatta	4 320
aatcaalggg	aattactzacc	ttagttcagt	atgccgtggg	aactatgaca	gtaaccatga	4 38 0
catttaaatt	ggggccccgt	aaagctacgg	gacggtggaa	tcctcaacct	cgagtgtatc	4 4 4 0
ccccgcacgc	agcaggtcat	ctaccatatg	tactatatga	ccccacagct	acagatgcaa	4 500
aacaacacca	cagacatgga	tatgaaaagc	ctgaagaatt	gtggacagcc	aaaagccgtg	4560
tgcacccatt	gtaaaaactc	cccaccgtgc	cctcagccag	gatgtgcaac	taaacgccca	4620
ccagtaccac	ccagactgta	cctgccccct	cctataccta	taagacagcc	taacacaa	4638
<210> 24
<211> 2049
<21 2> DNA
<213> Sztuczna sekwencja

<220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: NS1 parwowirusa B19 klon 2-R1 <4 00> 2 4

atactcttcg	aacaaaacaa	aatggagcta	tttagagggg	tgcttcaagt	11 c c L c L a a t	60
gtLc tggact	gtgctaacga	taactggtgg	tgctctttac	tggatttaga	cacttctgac	120
t gggaaccac	taaatcatac	taacagacta	atggcaatat	acttaagcag	tgtggcttct	18C
aagcttgact	ttactggggg	gccactagca	gggtgcttgt	acttttttca	agtagaatęt	240
aacaaatttg	aagaaggcta	tcatattcat	gtggttattg	gggggccagg	gttaaacccc	30 0
agaaacctca	cagtgtgtgt	agaggggtta	tttaataatg	tactttatca	ccttgtaact	360
gaaaatctga	agctaaaatt	tttgccagga	atgactacaa	aaggcaaata	ctttagagat	420
ggagagcagt	ttatagaaaa	ctatctaatg	aaaaaaatac	ccttaaatgt	tgtatggtgt	480
gctactaata	ttgatggaca	tatagatacc	tgtatttctg	ccacttttac	aaagggagct	54 0
tgccatgcca	agaaaciccug	caLcaccaca	gcca LaaaLg	a □ a c k a g t a c	tgatgctggg	600
gagtctagcg	gcacaggggc	agaggctgtg	ccatttaatg	ggaagggaac	taaggctagc	660

PL 210 849 B1

a t a a a g 1.11. c	aaactatggt	aaactgąttg	tgtgaaaaca	gagtgtttac	a g a g g ataag	720
tggaaacrag	ttgactttaa	ccagtacact	ttactaagca	gtagtcacag	tggaagttt t	780
caaattcaaa	gtgcactaaa	actagcaatt	tataaagcaa	ctaattt agt	gcctac tage	340
acattttt.ar	tgcatacaga	ctttgagcaa	gttatgtgta	ttaaaaacaa	taaaattg L L	900
aaattgttac	tttgtcaaaa	ctatgacccc	ctattagtgg	ggcagcatgt	gttaaagtgg	960
attgataaaa	aatgtggcaa	gaaaaacaca	ctgtggtttt	atqgqccgcc	aagtacaggg	1020
aaaacaaact	tggcaatggc	cattgctaaa	agtgttccag	tatatgącat	ggttaactgg	10 8 0
aataatgaaa	actttccatt	taatgatgta	cjc9cjc(3ćiaa.a	gcttqqtgqt	ctgggatgaa	1140
ggtattatta	agtetacaat	tgtagaagct	gcaaaagcca	ttttaggcgg	gcaacccacc	1200
agggtagatc	aaaaaatgc.g	tggaagtgta	gctgtgcctg	qaqtacctqt	ggttataacc	1260
agcaatggtg	acattacttt	tgttgtaagc	gggaacacta	caacaactgt	acatgctaaa	102 0
gccttaaaag	agcgcatggt	aaagttaaac	tttactgt aa	gatgcagccc	tgacatgggg	1380
tcactaacag	aggctgatgt	acaacagtgg	cttacatggt	gtaatgcaca	aagctgggac	14 4 0
cactatgaaa	actgggcaat	aaactacact	tttgatttcc	ctggaattaa	tgeagatgee	1500
ctccacccag	acctccaaac	caccccaatt	gtcacagaca	ccagtatcag	cagcagtggt	1560
ggtgaaagct	ctgaagaact	cagtgaaagc	agctttttta	acctcatcac	cccaggcgcc	1620
tggaacactg	aaaccccgcg	ctctagtacg	cccatccccg	ggaccaqttc	aggagaatca	1680
tctgtcggaa	gcccagtttc.	ctccgaagtt	gtagctgcat	cgt gggaaga	acccttctac	1740
acacctttgg	cagaccagtt	t cgtgaactg	ttagttgggg	ttgattatqt	gt gęgacggt	1800
gtaaggggtt	tacctgtct g	ttgtgtgcaa	catattaaca	ataqtgqggg	aggcttggga	1860
ct ttgtc.ccc	attgeattaa	tgtagggqct	tggtataatg	gatggaaatt	tcgagaattt	192 0
accccagatt	tggtgcgatg	tagctgccat	gtgggagctt	ctaarcccct	ttctgtgcta	198 0
acctgcaaaa	aatgtgct t a	cctgtctgga	tcgcaaagct	ttgtagatca	tgagtaagtc	204 0

gacatactc 2049 <2±0> 25 <2il> 671 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223>	Opis	sztucznej	se kwencji	: aminokwasy	NS1	parwowirusa
B19 klon 2	-31
<400>	25
Met Glu	Leu	Phe Arg Gly	Val Leu Gin	Val Ser Ser Asn	Val	Leu Asp
1		5		10		15
Cys Ala	Asn	Asp Asn Trp	Trp Cys Ser	Leu Leu Asp Leu	Asp	Thr Ser
		20	25		30
Asp Trp	Glu	Pro Leu Thr	His Thr Asn	Arg Len Met Ala	ile	Tyr Leu
	35		40	4 5

PL 210 849 B1

Ser

Ser 50

Val

Ala

Ser

Lys

Leu 55

Asp

Phe

Thr

Gly

Gly 60

Pro

Leu

Ala

Gly

Cys

Leu

Tyr

Phe

Gin

Val

Glu

Cys

Asn

Lys

Phe

Glu

Gly

Tyr

65

70

7 5

80

His

Ile

His

Val

Ile

Gly

Pro

Gly

Leu

Asn

Pro

Arg

Asn

Leu

85

90

95

Tm

Val

Cys

Val

Glu

Gly

Leu

Phe

Asn

Val

Leu

Tyr

His

Leu

Val

100

105

11C

Thr

Glu

Asn

Leu

Lys

Leu

Lys

Phe

Leu

Pro

Gly

Met

Thr

Lys

Gly

115

120

125

Lys

Tyr

Phe

Arg

Asp

Gly

Glu

Gin

Phe

Ile

Glu

Asn

Tyr

Leu

Met

Lys

130

135

140

Lys

Ile

Pro

Leu

Asn

Val

Trp

Cys

Val

Thr

Asn

Ile

Aspj

Gly

His

145

150

15 5

160

Ile

Asp

Thr

Cys

Ile

Ser

Ala

Thr

Phe

Arg

Lys

Gly

Ala

Cys

His

Ala

165

170

17 5

Lys

Pro

Arg

11 e

Thr

Ala

Ile

Asn

Asp

Thr

Ser

Thr

Asp

Ala

180

185

190

Gly

Glu

Ser

Gly

Thr

Gly

Ala

Glu

Val

Pro

Phe

Asn

Gly

Lys

: 95

2C0

2 05

Gly

Thr

Lys

Ala

Ser

Ile

Lys

Phe

Gin

Thr

Met

Vai

Asn

Trp

Leu

Cys

210

215

220

Glu

Asn

Arg

Val

Phe

Thr

Glu

Asp

Lys

Trp

Lys

Leu

Val

Asp

Phe

Asn

225

230

235

240

Gin

Tyr

Thr

Leu

Ser

His

Ser

Gly

Ser

Phe

G1. π

Ile

Gin

245

250

255

Ser

Ala

Leu

Lys

Leu

Ala

Ile

Tyr

Lys

Ala

Thr

Asn

Leu

Val

Pro

Thr

260

265

270

Ser

Thr

Phe

Leu

His

Thr

Asp

Phe

Glu

Gin

Val

Met

Cys

Ile

Lys

2 75

280

285

Asn

Lys

Ile

Val

Lys

Leu

Cys

Gin

Asn

Tyr

Asp

Pro

Leu

290

295

300

Leu

Val

Gly

Gin

His

Val

Leu

Lys

Trp

Ile

Asp

Lys

Cys

Gly

Lys

305

310

315

320

Lys

Asn

Thr

Leu

Trp

Phe

Tyr

Gly

Pro

Ser

Thr

C-ly

Lys

T h r

Asn

325

330

335

Leu

Ala

Met

Ala

Ile

Ala

Lys

Ser

Val

Pro

Val

Tyr

Gly

Met

Val

Asn

340

34 5

350

Trp

Asn

Glu

Asn

Phe

Pro

Phe

Asn

Asp

Val

Ala

Gly

Lys

Ser

Leu

355

360

365

Tal

Va 1

Trp

Asp

Glu

Gly

Ile

Lys

Ser

Thr

Ile

Val

Glu

Ala

57 0

375

380

PL 210 849 B1

Lys

Ala

Ile

Leu

Gly

Gir.

Pro

Thr

Arg

tal

Asp

Gin

Lys

Met

Arg

385

390

395

400

Gly

Ser

Val

Ala

tal

Pro

Gly

Val

Pro

tal

Va 1

Tle

Thr

Ser

Asn

Gly

405

410

415

Asp

Ile

Thr

Phe

tal

Val

Ser

Gly

Asn

Tar

Thr

tal

His

Ala

420

425

4 30

Lys

Ala

Leu

Lys

Glu

Arg

Met

tal

Lys

Leu

Asn

Phe

Thr

tal

Arg

Cys

435

440

445

Ser

Pro

Asp

Met

Gly

Leu

Thr

Glu

Ala

Asp

tal

Gin

Trp

Leu

450

455

460

Thr

Trp

Cys

Asr.

Ala

Gin

Ser

Trp

Asp

His

Tyr

Glu

Asn

Trp

Ala

Ile

4 6 5

4 70

475

480

Asr.

Tyr

Thr

Phe

Asp

Phe

Pro

Gly

Ile

Asn

Ala

Asp

Ala

Leu

His

Pro

485

4 90

495

Asp

Leu

Cln

Thr

Pro

Ile

tal

Thr

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

500

505

510

Gly

Glu

Ser

Glu

Leu

Ser

Glu

Ser

Phe

Asn

Leu

515

520

525

Ile

Thr

Pro

Gly

Al a

Trp

Asri

Thr

G1 u

Thr

Pro

Arg

Ser

Thr

Pro

530

535

540

ile

Pro

Gly

Thr

Ser

Gly

Glu

Ser

tal

Gly

Ser

Pro

tal

Ser

545

550

555

5 60

Ser

Glu

Val

Ala

Ser

Trp

Glu

Ala

Phe

Tyr

Thr

Pro

Leu

5 6 5

570

575

Ala

Asp

Gin

Phe

Arg

Glu

Leu

Val

Gly

tal

Asp

Tyr

tal

Trp

Asp

580

585

590

Gly

tal

Arg

Gly

Leu

Pro

tal

Cys

tal

Gin

Plis

Ile

Asn

Ser

595

600

605

Gly

Leu

Gly

Leu

Cys

Pro

His

Cys

I_e

Asn

tal

Gly

Ala

Trp

610

615

620

Tyr

Asn

Gly

Trp

Lys

Phe

Arg

Glu

Phe

Thr

Pro

Asp

Leu

tal

Arg

Cys

625

630

635

64 0

Ser

Cys

His

Val

Gly

Ala

Ser

Asn

Pro

Phe

Ser

tal

Leu

Thr

Cys

Lys

645

650

65 5

Lya

Cys

Ala

Tyr

Leu

Ser

Gly

Leu

Gin

Ser

Phe

tal

Asp

Tyr

G1 u

660

665

670

<210>

2 6

<211>

2380

<212>

DNA

<213>

Sztuczna se kwencή

a

PL 210 849 B1 <22 0>

<223> Opis szruczr.ej sekwencji: VP1 parwowirusa BI 9 klon 2-B1 <400> 26

atacrcaagc	ttacaaaaca	aaatgagtsa	agaaagtggc	aaatggtggg	aaagtgatga	60
t a a a 111 g c t	aaagctgtgt	ateageaatt	tgtggaattt	t atgaaaagg	ttactggaac	120
agacttagag	cttattcaaa	tactaaaaga	t. c a 11 a t a a t	atttctttag	ataatcccct	130
agaaaaccca	tcctctttgt	ttgacttagt	tgctcgtatt	aaaaataacc	ttaaaaactc	24 0
tccagactta	tatagtcatc	attttcaaag	t c a t g g a c a g	ttatctqe.cc	acccccatgc	300
cttatcatcc	agtagcagtc	atgcagaacc	tagaggagaa	gatgeagtat	tatctagtga	360
agacttacac	aagcctgggc	aagttagcgt	acaactacc c	ggta ctaact	atgccgggcc	4 20
tcjgcaatgag	ctacaagctg	ggcccccgca	aagtgctgtt	gacagtgctg	caaggattca	480
tgactttagg	tatagccaac	tggctaagtt	cggaataaat	CC5.tctc.CtC	a L Lggactgt.	5 4 0
agcagatgaa	gagcL tttaa	aaaatataaa	aaatgaaact	gggtttcaag	cacaagtagt	600
aaaagactac	tttactttaa	aaggtgcagc	tgcccctgtc	gcccattttc	a a gga ag tt. t	660
gccggaag L L	cccgcttsca	acgcctcaga	aaaataccca	ageatgaett	cagttaattc	7 20
tgcagaagcc	agcactggtg	caggaggggg	ggccagtaat	cctgtgaaaa	gcatgtggag	780
tgagggggcc	act tttagt.g	ccssctctgt	aacttgtaca	ttttccagac	aatttttaat	840
tccatatcac	ccagagcacc	attataaggt	gttttctccc	gcagcaagta	gctgccacaa	900
tgccagtcga	aaggaggcaa	aggtttgcac	cattagtccc	ataatgggat	actcaacccc	960
atggagatat	ttagatttta	stgctttaaa	tttatttttt	tcacctttag	agtttcagca	10 2 0
cttaattgaa	aa L t a t gga a	gtatagctcc	tgatgcttta	actgtaacca	tatcagaaat	1080
tgctgttaag	gatgttacgg	acaaaactgg	agggggggtg	caggttactg	acagcacLac	1140
agggcgccta	tgcatgt Lag	tagaccatga	a t. a t a a gt a c	ccatatgtgt	tagggcaagg	1200
tcaagatact	ttagccccag	aacttcctat	ttgggtatac	tctccccctc	aatacgctta	1260
cttaacagta	ggagatgtta	acacacaagg	aat LLctgga	gacagcaaaa	aattggcaag	1320
tgaagaatca	gcattttatg	ttttggaaca	cagttctttt	cagcctttag	gtacaggagg	1380
tacagcaact	atgtcttata	agtttcctcc	agtgccccca	gaaaatttag	agggctgcag	14 4 0
L c a a c a c 1.11	tatgaaatgt	acaacccctt	atacggatcc	cgcctagggg	ttcctgacac	1500
attaggaggt	gacccaaaat	ttagatcttt	aacacatgaa	gaccatgcaa	11 c a g c c c c a	1560
aaacttcatg	ccagggecac	tagtaaactc	aqtqtctaca	aaggagggag	acagctctag	1620
tactggagct	ggaaaagcct	taacaggcct	tagcacaggc	acctctcaaa	acactaga a L.	1680
atccttacgc	cctgggceag	tgLcLcagcc	gtaccaccac	tgggacacag	ataaatatgt	1740
caeaggaata	aatgccattt	ctcatggtca	gaccacttat	ggtaacgctg	aagacaaaga	1800
gtatcagcaa	ggagtgęgta	gat LLccaaa	t. gaa aa aga a	caqctaaaac	agttacaggg	1860
tttaaacatg	cacacctact	ttcccaataa	aggaacccag	caatatacag	atcaaattga	1920
gcgcccccta	atggtgggtt	ctg La Lggaa	cagaagagcc	cttcactatg	aaagccagct	1980
gtggagtaaa	attccaaatt	tagatgacag	ttttaaaact	cagtttgcac	ccttaggagg	2040
acggggtttg	catcagccac	ctcctcaaac	attcttaaaa	atattaccac	aaagtgggcc	2100
aa L cgguggt.	a 11 aaatcaa	tgggaattac	taccttagtt	cagtatgccg	tgggaattat	2150
gacagtaacc	atgacattta	aattggggcc	ccgcaaagct	acgggacggt:	qqaatcctc.a	2220
acc Lggagcg	tatcecccgc	acgcagcagg	tcacttacca	tatgtactat	atgaccccac	2280

PL 210 849 B1 agctacaęat gcaaaacaac accacagaca tggatatgaa aagcctgaag aaLtgtggac 2340 agccaaaagc cgtgtgcacc cattgtaagt cgacatactc 2380 <210> 27 <211> 781 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223>	Opis sztucznej	sekwencj i	: aminokwasy	VP1	parwowirusa
B19 klon 2-B1
<400>	27
Met Ser	rys Glu Ser Gly	Lys Trp Trp	Glu Ser Asp Asp	Lys	Phe Ala
1	5		10		15
Lys Ala	Val Tyr Gin Gin	Phe Val Glu	Phe Tyr Glu Lys	Val	Thr Gly
	20	25		30
Thr Asp	Leu Glu Leu Ile	Gin Ile Leu	Lys Asp His Tyr	Asn	Ile Ser
	35	40	45
Leu Asp	Asn Pro Leu Glu	Asn Pro Ser	Ser Leu Phe Asp	Leu	Va1 Ala
50		55	60
Arg Ile	Lys Asn Asn Leu	Lys Asn Ser	Pro Asp Leu Tyr	Ser	His His
65	7 0		75		8 0
Phe Gin	Ser His Gly Gin	Leu Ser Asp	His Pro His Ala	Leu	Ser Ser
	85		90		95
Ser Ser	Ser His Ala Glu	Pro Arg Gly	Glu Asp Ala Val	Leu	Ser Ser
	100	105		110
Glu Asp	Leu His Lys Pro	Gly Gin Val	Ser Val Gin Leu	Pro	Gly Thr
	115	120	125
Asn Tyr	Val Gly Pro Gly	Asn Glu Leu	Gin Ala Gly Pro	Pro	Gin Ser
130		135	140
Ala Val	Asp Ser Ala Ala	Arg Ile His	Asp Phe Arg Tyr	Ser	Gin Leu
145	150		155		160
Ala Lys	Leu Gly Ile Asn	Pro Tyr Thr	His Trp Thr Val	Ala	Asp Glu
	165		170		175
Glu Leu	Leu Lys Asn Ile	Lys Asn Glu	Thr Gly Phe Gin	Ala	Gin Val
	180	185		190
Val Lys	Asp Tyr Phe Thr	Leu Lys Gly	Ala Ala A.la Pro	Val	Ala His
	195	200	205
Phe Gin	Gly Ser Leu Pro	Glu Val Pro	Ala Tyr Asn Ala	Ser	Glu Lys
210		215	220

PL 210 849 B1

Tyr

Pro

Ser

Met

Thr

Ser

Val

Asn

Ser

Ala

Glu

Ala

Ser

Thr

Gly

Ala

225

230

2 35

24 0

Gly

Ser

Asn

Pro

Va 1

Lys

Ser

Met

Trp

Ser

Glu

Gly

Ala

24 5

250

255

Thr

Phe

Ser

Al a

Asn

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

260

265

270

Ile

Pro

Tyr

Asp

Pro

Glu

His

Tyr

Lys

Val

Phe

Ser

Pro

Ala

275

280

285

Ser

Cys

His

Asn

Ala

Ser

Gly

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Cys

Thr

Tle

290

295

300

Ser

Pro

Ile

Met

Gly

Tyr

Ser

Thr

Pro

Trp

Arg

Tyr

Leu

Asp

Phe

Asn

305

310

315

320

Ala

Leu

Asn

Leu

Phe

Ser

Pro

Leu

Glu

Phe

Gin

His

Leu

Ile

Glu

325

330

335

Asn

Tyr

Gly

Ser

Ile

Ala

Pro

Asp

Ala

Leu

Thr

Val

Thr

Ile

Ser

Glu

340

345

350

Ile

Ala

Pa 1

Lys

Asp

Val

Thr

Asp

Lys

Thr

Gly

Val

Gin

Val

'35 5

360

365

Thr

Asp

Ser

Thr

Gly

Arg

Leu

Cys

Met

Leu

Val

Asp

His

Glu

Tyr

370

375

380

Lys

Tyr

Pro

Tyr

Va 1

Leu

Gly

Gin

Giy

Gin

Asp

Thr

Leu

Ala

Pro

Glu

38 5

390

395

400

Leu

Pro

Ile

Trp

Val

Tyr

Phe

Pro

Gin

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Thr

Val

405

410

415

Giy

Asp

Val

Asn

Thr

Gin

Gly

Ile

Ser

Gly

Asp

Ser

Lys

Leu

Ala

420

425

430

Ser

Glu

Ser

Ala

Ρπθ

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Ser

Phe

Gin

Leu

435

440

445

Leu

Gly

Thr

Gly

Thr

Ala

Thr

Met

Ser

Tyr

Lys

Phe

Pro

Val

4 50

455

4 60

Pro

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Cys

Ser

Gin

His

Phe

Tyr

Glu

Met

Tyr

4 65

470

475

4 80

Asr.

Pro

Leu

Tyr

Gly

Ser

Arg

Leu

Gly

Val

Pro

Asp

Thr

Leu

Gly

4 85

490

4 95

Asp

Pro

Lys

Phe

Arg

Ser

Leu

Thr

His

Glu

Asp

His

Ala

Ile

Gin

Pro

500

505

510

Gin

Asn

Phe

Met

Pro

Gly

Pro

Leu

Val

Asn

Ser

Val

Ser

Thr

Lys

Glu

515

520

525

Gly

Asp

Ser

Thr

Gly

Ala

Gly

Lys

Ala

Leu

Thr

Gly

Leu

Ser

5 30

535

540

Thr

Gly

Thr

Ser

Gin

Asn

Thr

Arg

Ile

Ser

Leu

Arg

Pro

Gly

Pro

Pa 1

545

550

555

560

PL 210 849 B1

Ser Gin Pro Tyr

Asn Ala Ile Ser

0

Glu Tyr Gin Gin 595

Lys Gin Leu Gin 610

Thr Gin Gin Tyr 625

Val Trp Asn Arę

Ile Pro Asn Leu

660

Gly Trp Gly Leu 675

Pro Gin Ser Gly 690

Leu Val Gin Tyr 7 05

Leu Gly Pro Arg

Tyr Pro Pro His 740

Thr Ala Thr Asp 755

Glu Glu Leu Trp 770

His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr GLy Ile 565 570 575

His Gly Gin Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys

585 590

Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gin Leu 600 605

Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly 615 620

Thr Asp Gin Ile Glu Arg Pro Leu Met Va^ Gly Ser 630 635 64C

Arg Ala ^eu His Tyr Glu Ser Gin Leu Trp Ser Lys 645 650 655

Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gin Phe Ala Ala Leu Gly

665 670

His Gin Pro Pro Pro Gin Ile Phe Leu Lys Ile Leu 680 635

Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly l.e Thr Thr 695 700

Ala Val Gly Ile Mec Thr Val Thr Met Thr Phe Lys 710 715 720

Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gin Pro Gly Val 725 730 735

Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Ty' Asp Pro

745 750

Ala Lys Gin His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro 760 765

Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu 775 780 <21u> 28 <211> 1699 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: VP2 parwewirusa B19 klon 2-B1 <400> 28

atactcaagc	ttacaaaaca	aaatgaette	agttaattct	gcagaagcca	gcactggtgc	60
aggagggggg	ggcagtaatc	ctgtgaaaag	catgtggagt	gagggggcca	cttttagtgc	120
caactctgta	acttgtacat	tttccagaca	atttttaatt	ccatatgacc	cagagcacca	180
tcataaggtg	ttttctcccg	cagcaagtag	ctgccacaat	gccagtggaa	aggaggcaaa	240

PL 210 849 B1

ggtttgcacc	attagtccca	taatgggaca	ctcaacccca	tggagatatt	tagattttaa	300
tgctttaaat	ttattttttL	cacctrtaga	gttt cagcac	c c aat t gaaa	attatggaag	36C
tatagctcct	gatgctttaa	ctgtaaccac	atcagaaacc	gctgttaagg	atgttacgga	Ί 2 0
caaaactgga	gggggggtgc	aggtcactga	cagcact a ca	gggcgcctat	gcatgttagt	4 80
agacca t.gaa	cacaagtacc	cataćgtgcc	agggcaaggt	caagatactt	t a g c c c c a g a	5 4C¹
acttcctac;	cgggtatact	ttccccccca	atacgctcac	ttaacagtag	gagatgt t.aa	600
cacacaagga	acc.tctggag	acagcaaaaa	attggcaagt	gaagaatcag	cattttatgt	660
tttggaacac	agrtcttttc	agcttttagg	tacaggaggt	acagcaacta	t g L c t1 a t a a	7 2 0
grttcctcca	grgcccccag	aaaatttaga	gggctgcagt	caacactttt	atgaaatgta	780
caaccccUa	cacggatccc	gcttaggggt	tcctgacaca	ttaggaggtg	acccaaaatt	840
t a g ta t. c 11 z a	acacatgaag	accatgcaat	tcagccccaa	aacttcatgc	cagggccact	900
agcaaactca	gcgtctacaa	aggagggaga	cagctctagt	actggagctg	gaaaagcctt	9 60
aacaggccit	agcacaggta	cctctcaaaa	cactaąaata	t ccttacgcc	ctgggccagt	1020
g~ctcagccg	caccaccact	gggacacaga	taaatatgtc	acaggaataa	atgccaLtlc	1080
tcarggtcag	accacttatg	gtaacgctga	agacaaagag	tatcagcaag	gagtgggtag	1140
a::cccaaac	gaaaaagaac	agctaaaaca	gttacagggt	ttaaacatgc	acacctactt	12 00
ς cccaataaa	ggaacccagc	aatatacaga	tcaaattgag	cgccccctaa	tggtgggttc	12 60
cgcatggaac	agaagagccc	ttcactatga	aagccagctg	tggagtaaaa	ttccaaattt	132 0
agat gacagr	Cttaaaactc	aqtttqcagc	cttaggagga	tggggtttgc	atcagccacc	1330
cccccaaata	tttttaaaaa	tattaccaca	aagtgggcca	attggagcta	ttaaatcaat	1440
gggaattact	accttagttc	agtatgccgt	gggaattatg	acagtaacca	tgacatttaa	1500
arcggggccc	cgtaaagcta	cgggacggtg	gaatcctcaa	cctggagtgt	atcccccgca	1360
cgcagcaggt	catttaccat	atgtactata	tgaccccaca	gctacagatg	caaaacaaca	1620
ccacagacat	ggatatgaaa	agcctgaaga	attgtggaca	gccaaaagcc	gtgtgcaccc	168C
a 11 g t. a a g t c	gacatact. c					1699

<210>	29
<211>	554
<212>	PRT
<21 3>	Sztuczna sekwencja
<220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: aminokwasy VP2 parwowirusa 319 klon 2-B1 <4 00> 29

Mec

Thr

Ser

Val

Asn

Ser

Ala

Glu

Ala

Ser

Thr

Gly

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Asn

Pro

Val

Lys

Ser

Met

Trp

Ser

Glu

Gly

Ala

Thr

Phe

20

25

30

cal a

Asn

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

Ile

Pro

35

40

45

PL 210 849 B1

Asp

His

6b

Met

Leu

Ser

Lys

Thr

5 Tyr

Trp

Asn

Ser

Gly

225

Asn

Tyr

Phe

Me L

Ser

305

Ser

Tyr

Ser

Pro ulu His His

Asn Ala Ser Gly

Gly Tyr Ser Thr 8 5

Phe Phe Ser Pro

100

Ile Ala Pro Asp 1 15

Asp Val Thr Asp 130

Thr Gly Arg Leu

Val Leu Gly Gin 165

Val Tyr Phe Pro 1 80

Thr Gin Gly Ile 195

Ala Phe Tyr Val 210

Gly Thr Ala Thr

Leu Glu Gly Cys 245

Gly Ser Arg Leu 260

Arg Ser Leu Thr 275

Pro Gly Pro Leu 290

Ser Thr Gly Ala

Gin Asn Thr Arg 325

His His Trp Asp 340

His Gly Gin Thr

Ala Ala Ser Ser Cys 60

Thr Ile Ser Pro Ile

Phe Asn Ala Leu Asn

Ile Glu Asn Tyr Gly 110

Ser Glu Ile Ala Pal

5

Gin Pal Thr Asp Ser 140

Glu Tyr Lys Tyr Pro 160

Pro Glu Leu Pro Ile

175

Thr Val Gly Asp Pal 199

Leu Ala Ser Glu Gin

205

Gin Leu Leu Gly Thr

220

Pro Pal Pro Pro Glu

240

Met Tyr Asn Pro Leu 2 55

Gly Gly Asp Pro Lys 270

Gin Pro Gin Asn Phe 285

Lys Glu Gly Asp Ser 300

Leu Ser Thr Gly Thr 320

Pro Pal Ser Gin Pro

335

Gly Ile Asn Ala Ile 350

Asp Lys Glu Tyr Gin

Tyr Lys Val Phe Ser Pro 55

Lys Glu Ala Lys Val Cys 70 75

Pro Trp Arg Tyr Leu Asp 90

Leu Glu Phe Gin. His Leu

105

Ala Leu Thr Val Thr Ile

120

Lys Thr Gly Gly Gly Val 135

Cys Met Leu Vai Asp His 150 155

Gly Gin Asp Thr Leu Ala 170

Pro Gin Tyr Ala Tyr Leu 185

Ser Gly Asp Ser Lys Lys 200

Leu Glu His Ser Ser Phe

215

Met Ser Tyr Lys Phe Pro 230 235

Ser Gin His Phe Tyr Glu 2 50

Gly Val Pro Asp Thr Leu 265

His Glu Asp His Ala Ile 280

Pal Asn Ser Val Ser Thr

295

Gly Lys Ala Leu Thr Gly 310 315

Ile Ser Leu Arg Pro Gly 330

Thr Asp Lys Tyr Val Thr 34 5

Thr Tyr Gly Asn Ala Glu

PL 210 849 B1

Gin

Gly

Leu

Asn

Met

His

Thr

Tyr

Phe

Pro

Asn

Lys

Gly

Thr

Gin

385

3 90

395

4 00

Tyr

Thr

Asp

Gin

Ile

Glu

Arg

Pro

Leu

Met

Val

Gly

Ser

Val

Trp

Asn

405

410

4 15

Arg

Ala

Leu

His

Tyr

Glu

Ser

Gin

Leu

Trp

Ser

Lys

Ile

Pro

Asn

420

425

4 30

Lec

Asp

Ser

Phe

Lys

Thr

Gin

Phe

Ala

Leu

Gly

Trp

Gly

4 3 5

440

445

Leu

His

Gin

Pro

Gin

Ile

Phe

Leu

Lys

Ile

Leu

Pro

Gin

Ser

450

455

460

Gly

Pro

Ile

Giy

Gly

Ile

Lys

Ser

Mer

Gly

Tle

Thr

Leu

Val

Gin

4 65

470

4 75

480

Tyr

Ala

Val

Gly

Ile

Met

Thr

Val

Thr

Met

Thr

Phe

Lys

neu

Gly

Pro

4 85

490

4 95

Arg

Lys

Ala

Thr

Gly

Arg

Trp

Asn

Pro

Gin

Pro

Gly

Val

Tyr

Pro

500

505

51C

His

Ala

Gly

His

Leu

Pro

Tyr

Val

Leu

Tyr

Asp

Pro

Thr

Ala

Thr

515

520

52 5

Asp

Ala

Lys

Gin

His

Arg

His

Gly

Tyr

Glu

Lys

Pro

Glu

Leu

530

535

540

Trp

Thr

Ala

Lys

Ser

Arg

Val

His

Pro

Leu

545 550 <210> 30 <211> 2049 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: NS1 parwowirusa B19 klon 2-36 <400> 30

atactcttcg	aacaaaacaa	aatggagcta	tttagagggg	tgctrcaagt	ttcttctaat	60
gttctggact	gtgctaacga	taactggrgę	tgctctttac	tggatttaga	cacttctgao	120
tggoaaccac	taactcatac	taacagacta	atggcaatat	acttaaccag	tgtggcttct	130
aagcttgact	ttacrggggg	gccactagca	gggtgcttgt	acttttttca	agtagaatgt	240
aacaaatttg	aagaaggcta	tcatattcat	gtggttattg	gggggccagg	g t taaacccc	300
agaaacctca	cagtgtgtgt	agaggggtta	tttaataatg	tactttatca	ccttgtaact	360
gaaaatctqa	agctaaaatt	tttgccagga	atgactaoaa	aaggcaaata	ctttagagat	420
ggagagoagt	ttatagaaaa	ctatttaatg	aaaaaaatac	ctttaaatgt	cgtatggtgt	480
gttactaata	ttgatggaca	ratagatacc	tgtatttctg	ctacttttag	aaagggagct	540
tgccatgcca	agaaaccccg	catcaccaca	gccataaatg	atactagtac	tgatgctgcg	600

PL 210 849 B1

gagtctagcg	gcacaggggc	agaggttgtg	ccatttaatg	ggaagggaac	taaggctagc	660
ataaagtttc	aaactatggt	aaactggttg	tgtgaaaaca	gagtgtttac	agaggataag	720
t g g a a a c t a g	ttgactttaa	ccagtacact	ttaccaagca	gtagtcacag	tggaagtttt	780
caaattcaaa	gtgcactaaa	actagcaatt	tataaagcaa	ctaatttagt	gcctactagc	840
acatttttat	tgcatacaga	ctttgagcaa	gttatgtgta	ttaaagacaa	taaaattgtt	900
aaattgttac	tćtgtcdaac	ctatgacccc	ctattagtgg	ggcagcatgt	gttaaagtgg	960
attgataaaa	aatgtggcaa	gaaaaacaca	ctgtggtttt	atggaccgcc	aagtacaggg	1020
aaaacaaact	tggcaatggc	cattęcLaaa	agtg L Lccag	tauaLggcaL	gg L Laactgg	1080
aataatgaaa	actttccatt	taatgatgta	gcaggaaaaa	gcurggtggc	ctgggatgaa	1140
ggtattatta	agtctacaat	tgtagaagct	gcaaaagcca	ttttaggcgg	gcaacccacc	1200
agggtagatc:	a a a a a a L g c g	LggaagtgLa	gcLgtgcctg	g a g t a c c c g t	g g 11 a t a a c c.	1260
agcaatggtg	acatcacttt	tgttgtaagc	gggaaeacta	caacaactgt	acatgctaaa	1320
gccttaaaag	agcgcatggc	aaagttaaac	tttactgtaa	gatgcagccc	tgacatgggg	1380
tt a ctaacag	aggcsgasgc	acaacagtgg	cttacatggt	gtaatgcaca	aagctgggac	14 4 0
cactatgaaa	actgggcaac	aaactacact	tttgatttcc	ctggaattaa	tgcagatgcc	1500
c t c ca c cc a g	accaccaaac	caccccaatt	gtcacagaca	ccagtatcag	cagcagt ggt	1560
ggtgaaagct	ctgaagaact	cagtgaaagc	agctttttta	acctcatcac	cccaggcgcc	1620
tggaacactg	aaaccccgcg	ctctagtacg	cccatccccg	ggaccagttc	aggagaatca	1680
tc.tgtcggaa	gcccagtttc	ctccgaagtt	gt.agc.tgcat	c.gtgggaaga	agccttctac	1740
acacctttgg	cagaccagtt	tcgtgaactg	ttagttgggg	ttgattatgt	gtgggacggu	1800
gtaaggggtt	LacctgtcLg	L tg tg tgcaa	catattaaca	atagtggggg	aggcttggga	18 60
ctttgtcccc	attgcattaa	tgtaggggct	tggtataatg	gatggaaatt	tcgagaattt	1920
accccagatt	tggtgcgatg	tagctgccat	gtgggagctt	ctaatccctt	ttctgtgcta	1980
acctgcaaaa	aatqtgct t a	cctgt ctgga	ttgcaaagct	ttgtagatta	tgagtaagtc	204 0
gacatactc						204 9

<210> 31 <211> 671 <212> PRT <?13> Sztuczna sekwencja <220>

<?23>	Opi S	s z t. u c z n e j	sekwencj i	: aminokwasy	NS1	parwowirusa
B19 klon 2	-B6
<4 00>	31
Met Glu	Leu	Phe Arg Gly	Val Leu Gir.	Val Ser Ser Asn	Val	Leu Asp
1		5		10		15
Cys Ala	Asr.	Asp Asn Trp	Trp Cys Ser	Leu Leu Asp Leu	Asp	Thr Ser
		20	25		30
Asp Trp	Glu	Pro Leu Thr	His Thr Asn	Arg Leu Met Ala	Ile	Tyr Leu
	35		40	45

PL 210 849 B1

Ser Ser Val Ala

Cys Leu Tyr Phe 65

His Ile His Val

Thr Val Cys Val 100

Thr Glu Asn Leu

115

Lys Tyr Phe Arg 130

Lys Ile Pro Leu 145

Ile Asp Thr Cys

Lys Lys Pro Arg 180

Gly Glu Ser Ser 195

Giy Thr Lys Ala 210

Glu Asn Arg Val 2 25

Gin Tyr Thr Leu

Ser Ala Leu Lys 260

Ser Thr Phe Leu

275

Asp Asn Lys Ile 290

-1 e u 5 a 1 a 1 y Gin 305

Lys Asn Thr Leu

Leu Ala Met Ala

340

Trp Asn Asn Glu 355

Val Val Trp Asp 370

Ser Lys Leu Asp 55

Phe Gin Val Glu

Val Ile Gly Gly 85

Glu Gly Leu Phe

Lys Leu Lys Phe 120

Asp Gly Glu Gin 135

A.sn Val Val Trp 150

Ile Ser Ala Thr

165

Ile Thr Thr Ala

Gly Thr Gly Ala 200

Ser Tle Lys Phe 215

Phe Thr Glu Asp 230

Leu Ser Ser Ser

245

Leu Ala TLe Tyr

Leu His Thr Asp 280

Val Lys Leu Leu

295

His Val Leu Lys 310

Trp Phe Tyr Gly 325

Ile Ala Lys Ser

Asn Phe Pro Phe

360

Glu Gly Ile Ile 375

Phe Thr Gly Gly 60

Cys Asn Lys Phe 75

Pro Gly Leu Asn 90

Asn Asn Val Leu

105

Leu Pro Gly Met

Phe Ile Glu Asn

140

Cys Val Thr Asn 155

Phe Arg Lys Gly 170

Ile Asn Asp Thr 185

Glu Val Val Pro

Gin Thr Me; Val

220

Lys Trp Lys Leu 235

His Ser Gly Ser 250

Lys Ala Thr Asn 265

Phe Glu Gin Val

Leu Cys Gin Asn 300

Trp Ile Asp Lys 315

Pro Pro Ser Thr

330

Val Pro Val Tyr 345

Asn Asp Val Ala

Lys Ser Thr Ile 380

Pro Leu Ala Gly

Glu Glu Gly Tyr 80

Pro Arg Asn Leu 95

Tyr His Leu Val 110'

Thr Thr 1,γ^Ξ G1 y 125

Tyr Leu Met Lys

Ile Asp Gly His 160

Ala Cys His Ala 175

Ser- Thr Asp Ala 190

Phe Asn Gly Lys 2 05

Asn Trp Leu Cys

Val Asp Phe Asn 240

Phe Gin Ile Gin

255

Leu Val Pro Thr

270

Met Cys Ile Lys 285

Tyr Asp Pro Leu

Lys Cys Gly Lys 320

Gly Lys Thr Asn 335

Gly Met Val Asn 35C

Gly Lys Ser Leu 365

Val Glu Ala Ala

PL 210 849 B1

Lys

Ala

Ile

Leu

Gly

Gin

Pro

Thr

Arg

Val

Asp

Gin

Lys

Met

Arg

385

3 90

3 95

400

Gly

Ser

Val

Ala

Val

Pro

Gly

Val

Pro

Val

Ile

Thr

Ser

Asr.

Gly

4 05

41 0

4 15

Asp

Ile

Thr

Phe

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

Val

His

Ala

420

425

430

Lys

Ala

Leu

Lys

Glu

Arg

Met

Val

Lys

Leu

Asn

Phe

Thr

Val

Arg

Cys

435

440

445

Ser

Pro

Asp

Met

Gly

Leu

Thr

Glu

Ala

Asp

Val

Gin

Trp

Leu

450

455

460

Thr

Trp

Cys

Asn

Ala

Gin

Ser

Trp

Asp

His

Tyr

Glu

Asn

Trp

Ala

Ile

4 65

470

475

480

Asn

Tyr

Thr

Phe

Asp

Phe

Pro

Gly

Ile

Asn

Ala

Asp

Ala

J,e u

Hi s

Pro

485

490

4 95

Asp

Len

Gin

Thr

Pro

Ile

Val

Thr

Asp

Thr

Ser

Ile

Ser

500

505

510

Gly

Glu

Ser

Glu

Leu

Ser

Glu

Ser

Phe

Asn

Leu

515

520

52 5

Ile

Thr

Fro

Gly

Ala

Trp

Asn

Thr

Glu

Thr

Pro

Arg

Ser

Thr

Pro

5 30

5 3 5

54 0

Ile

Pro

Gly

Thr

Ser

Gly

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

545

550

555

560

Ser

Glu

Val

Ala

Ser

Trp

Glu

Ala

Phe

Tyr

Thr

Pro

Leu

565

570

575

Ala

Asp

Gin

Phe

Arg

Glu

Leu

Val

Gly

Val

Asp

Tyr

Val

Trp

Asp

580

585

590

Gly

Val

Arg

Gly

Leu

Pro

Val

Cys

Val

Gin

His

Ile

Asn

Ser

595

600

605

Gly

Leu

Gly

Leu

Cys

Pro

His

Cys

Ile

Asn

tal

Gly

Ala

Trp

610

615

620

Tyr

Asn

Gly

Trp

Lys

Phe

Arg

Glu

Phe

Thr

Pro

Asp

Leu

Val

Arg

Cys

62 5

630

635

64 0

Ser

Cys

His

Val

Gly

Ala

Ser

Asn

Pro

Phe

Ser

Val

Leu

Thr

Cys

Lys

645

650

65 5

Lys

Cys

Ala

Tyr

Leu

Ser

Gly

Leu

Gin

Ser

Phe

Val

Asp

Tyr

Glu

660

6 65

670

<210>	32
<211>	2380
<212>	DNA
<21 3>	Sztuczna sekwenc

PL 210 849 B1 <22 0>

<2 2 3> Opi	s sztucznej sekwencji: VP1 parwowirusa B19 klon	2-t
<4C0> 32
atactcaagc	ttacaaaaca	asatgagtaa	agaaagtggc	a a a t c c t g g y	i-i a a g t g a t g a	60
taaatttgct	aaagctqt gt	ateageaatt	tgtggaattt	tatgaaaagg	ttactggaac	120
agacttagag	cttattcsaa	tattaaaaga	tcattataat	atttett Lag	a t a a t c c c c t	180
agadaaccca	tcctctttgt	ttgacttagt	tgctcgtatt	aaaaataacc	ttaaaaactc	240
tccacactta	tatagtcstc	attttcaaag	tcatggacag	ttatctgacc	acccccatgc	300
q: tt a t cat cc	agtagcagtc	atgcagaacc	tagaggagaa	gatgeagtat	tacctagcga	360
agacttacac	aagcctgggc	aagttagcgt	acaactaccc	ggtactaact	atgtcgggcc	420
t q g c a a t g a g	etacaagctg	ggcccccgca	aagtgctgtt	gacagtgctg	caaggactca	480
tgactttagg	tatagccaac	tggctaagtt	gggaataaat	ccatatactc	attggactgt	54 0
agcagatgaa	gagcttttaa	aaaatataaa	aaatgaaact	gggtttcaag	cacaagtagt	600
aaaagactac	tttactttaa	aaggtgcagc	tgcccctgtg	gcccatttuc	aaggaag tLt	6 60
gccggaagtt	cccccttaca	acgcctcaga	aaaataccca	agcatgacct	cagttaattc	720
tgcagaagcc	agcactggtg	caggaggggg	gggcagtaat	cctgtgaaaa	gca tg Lggag	780
Lyagyyyycc	acttttcgtg	ccaa et ctgt	aacttgtaca	ttttccagac	aatttttaac	840
tccatatgac	ccagagcacc	attataaggt	gttttctccc	gcagcaagta	gctgccacaa	900
t g c c a g t g g a	aaggaggcaa	aggtttgcac	cattagtccc	ataatgggat	actcaacccc	960'
atggagatat	ttagatttta	atgctttaaa	tttatttttt	tcaccattag	agtttcagca	1020
cttaattgaa	aattatggaa	gtatagctcc	tgatgcttta	actgcaacca	tatcagaaat	1080
tgctgttaag	gatgttacaa	acaaaactgg	agggggggtg	caggttactg	acagcactac	114 0
ayggcgccta	tgcatgttag	tagaccatga	atataagtac	ccacatgtgt	tagggcaagg	1200
tcaagatact	ttagccccag	aacttcctat	ttgggtatac	cttccccctc	aatacgetta	12 60
cttaacagta	ggagatgtta	acaeaeaagg	aatrtctgga	g a c a g c a a a a	aattągcaag	1320
tgaagaatca	gcattttatg	ttttggaaca	cagacccttt	cagcttttag	gtacaggagg	1380
tacagcaact	atgtcttata	a g 111 c c L c c	ag Lgccccea	g a a a a 1.11 a g	agggctgcag	1440
tcaacacttt	tatgaaatgt	acaacccctt	atacggatcc	cgcttagggg	ttcctgacac	1500
a 11 a g g a g g t	gaceeaaaad	U Laga Lc t L L	aacaca t yaa	gaccat gcaa	ttcagcccca	15 60
aaacttcatg	ccagggccac	tagtaaactc	agtgtctaca	aaggagggag	acagctctag	162 0
t a c t g g a g c t	ggaaaagcct	taacaggcct	tageacagg L	aectcteaaa	acactagaat	1680
a t c c 1.1 a c q c	cctgggccag	tgtctcagcc	gtaccaccac	tgggacacag	ataaatatgt	1740
cacaggaata	aatgccattt	ctcatggtca	gaccacttat	ggtaacgctg	a a y a c a a a q a	3 00
gtatcagcaa	ggagtgggta	gatttccaaa	tgaaaaagaa	cagctaaaac	agttacaggg	1860
tttaaacatg	cacacctacu	ttcccaataa	aggaacecag	caa tatacag	atcaaattga	192 0
gcgcccccta	atggtgggtt	ctgtatggaa	eagaagagcc	cttcactatg	aaagccagct	198 0
gtggagtaaa	attccaaatt	tagatgacag	ttttaaaact	cagtttgcag	cc t.taygagg	2040
acggggtttg	catcagccac	ctcctcaaat	attcttaaaa	atattaccac	aaagtgggcc	2100
aattggaggt	attaaatcaa	tgggaattac	taccttagtt	cagtatgccg	tgggaa ttat	21 60
g n c a q t a a c c	atgacattta	aattggggcc	ccgtaaagct	acgggacggt	ggaatcctca	2220
acctggagtg	tatcccccgc	acgcagcagg	tcatttacca	tatgtactat	a agaccccac	2280

PL 210 849 B1 agctacagat gcaaaacaac accacagaca tggataLgaa aagcctgaag aattgtggac 2340 agccaaaagc cgtgtgcacc cattgtaag- cgacatactc 2380 <210 33 <211> 781 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: aminokwasy VP1 parwowirusa B19 klon 2-B6

<400>

33

Met

Ser

Lys

Glu

Ser

Gly

Lys

Trp

Glu

Ser

Asp

Lys

Phe

Ala

1

5

10

15

Lys

Ala

Va 1

Tyr

Gin

Phe

Val

Glu

Phe

Tyr

Glu

Lys

tal

Tnr

Gly

20

2 5

30

Thr

Asp

Leu

Glu

Leu

Ile

Gin

Ile

Leu

Lys

Asp

His

Tyr

Asn

Ile

Ser

35

40

45

Leu

Asp

Asn

Pro

Leu

Glu

Asn

Pro

Ser

Leu

Phe

Asp

Leu

Val

Ala

50

55

60

Arg

Ile

Lys

Asn

Leu

Lys

Asn

Ser

Pro

Asp

Leu

Tyr

Ser

His

65

70

75

80

Phe

Gin

Ser

His

Gly

GLn

Leu

Ser

Asp

His

Prc

His

Ala

Leu

Ser

85

90

95

Ser

His

Ala

Glu

Pro

Arg

Gly

Glu

Asp

Ala

Val

Leu

Ser

100

105

110

Glu

Asp

Leu

His

Lys

Pro

Gly

Gin

Val

Ser

Val

Gin

Leu

Pro

Gry

Thr

115

120

125

Asn

Tyr

Val

Gly

Pro

Gly

Asn

Glu

Leu

Gin

Ala

Gly

Pro

Gin

Ser

130

135

140

Ala

Val

Asp

Ser

Ala

Arg

Ile

His

Asp

Phe

Arg

Tyr

Ser

Gin

Leu

145

150

155

160

Ala

Lys

Leu

Gly

Ile

Asn

Pro

Tyr

Thr

His

Trp

Thr

Val

Ala

Asp

Glu

165

170

175

a 1 u

Leu

Lys

Asn

Tle

Lys

Asn

Glu

Thr

Gly

Phe

Gin

Ala

Gin

tal

180

185

190

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Pro

tal

Ala

His

195

200

205

Phe

Gin

Gly

Ser

Leu

Pro

Glu

tal

Pro

Ala

Tyr

Asn

Ala

Ser

Glu

Lys

210

215

220

PL 210 849 B1

Tyr

Pro

Ser

Met

Thr

Ser

Val

Asn

Ser

Ala

Glu

Ala

Ser

Thr

Gl y

Ala

225

230

235

240

Gly

Ser

Asn

Pro

Val

Lys

Ser

Met

Trp

Ser

Glu

Gly

Ala

24 5

250

2 55

Thr

Phe

Ser

Ala

Asn

Ser

Val

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Arg

Gin

Phe

Leu

2 60

265

270

Ile

Pro

Tyr

Asp

Pro

Glu

His

Tyr

Lys

Val

Phe

Ser

Pro

Ala

27 5

280

285

Ser

Cys

His

Asn

Ala

Ser

Gly

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Cys

Thr

Ile

290

295

300

Ser

Pro

Ile

Met

Gly

Tyr

Ser

Thr

Pro

Trp

Arg

Tyr

Leu

Asp

Phe

Asn

50 5

310

315

320

Ala

Leu

Asn

Len

Phe

Glu

Ser

Pro

Leu

Glu

Phe

Gin

His

Leu

Ile

Glu

325

330

335

Asn

Tyr

Gly

Ser

Ile

Ala

Pro

Asp

Ala

Leu

Thr

tal

Thr

Ile

Ser

Glu

31 o

34 5

35C¹

Ile

Al a

Val

Lys

Asp

Val

Thr

Asn

Lys

Thr

Gly

tal

Gin

tal

355

360

365

Thr

Asp

Ser

Thr

Gly

Arg

Leu

Cys

Met

Leu

tal

Asp

His

Glu

Tyr

370

375

380

Lys

Tyr

Pro

Tyr

tal

Leu

Gly

G1 n

Gly

Gin

Asp

Thr

I.eu

Al a

Pro

Glu

385

390

395

400

Leu

Pro

Ile

Trp

tal

Tyr

Phe

Pro

Gin

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Thr

tal

405

4 10

4 1 5

Gly

Asp

tal

Asn

Thr

Gin

Gly

Ile

Ser

Gly

Asp

Ser

Lys

Leu

Ara

420

425

430

Ser

Glu

Ser

Ala

Phe

T yr

Val

Leu

Glu

His

Ser

Phe

Gin

Leu

435

440

445

Leu

Gly

Thr

Gly

Thr

Ala

Thr

Met

Ser

Tyr

Lys

Phe

Prc

Pro

Val

450

455

4 60

Pro

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Cys

Ser

Gin

His

Phe

Tyr

Glu

Met

Tyr

4 65

470

475

480

Asr.

Pro

Leu

Tyr

Gly

Ser

Arg

Leu

Gly

Va 1

Pro

Asp

hr

Leu

Gly

485

490

495

Asp

Pro

Lys

Phe

Arg

Ser

Leu

Thr

His

Glu

Asp

His

Ala

Ile

Gin

Pro

500

505

510

Gir.

Asn

Phe

Met

Pro

Gly

Pro

Leu

Val

Asn

Ser

Val

Ser

Thr

Lys

Glu

515

520

525

Gly

Asp

Ser

Thr

Gly

Ala

Gly

Lys

Ala

Leu

Thr

Gly

Leu

Ser

530

535

540

Thr

G i y

Thr

Ser

Gir,

Asn

Thr

Arg

Ile

Ser

Leu

Arg

Pro

Gly

Pro

tal

54 5

550

555

560

PL 210 849 B1

Ser Gin Pro Tyr

Asn Ala Ile Ser

580

Glu 1yr Gin Gin 595

Lys, Gin Leu Gin 610

Thr Gin Gin Tyr 625

Va1 Trp Asn Arg

Ile Pro Asn Leu

660

Gly Trp Gly Leu 675

Pro Gin Ser Gly 690

Leu Val Gin Tyr 705

Leu Gly Pro Arg

His His

565

His Gly

Gly V a1

Gly Leu

Thr Asp

630 Arg Ala 64 5

Asp Asp

His Gin

Pro Ile

Ala Val

710 Lys Ala 725

Tyr Pro Pro His Ala Ala 740

Thr Ala Thr Asp Ala Lys 755

Glu Glu Leu Trp Thr Ala 770

Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile 570 575

Win Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys 585 590

Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gin Leu

600 605

Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly 615 620

Gin Ile Glu Arg Pro Leu Met Va 1 Gly Ser 635 640

Leu His Tyr Glu Ser Gin Leu Trp Ser Lys 650 655

Ser Phe Lys Thr Gin Phe Ala Ala Leu Gly 665 670

Pro Pro Pro Gin Ile Phe Leu Lys Ile Leu

680 635

Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr 695 700

Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys 715 720

Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gin Pro Gly Val 7 3 0 '7 35

Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro 745 750

Gin His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro

760 765

Lys Ser Arg Val His Pro Leu 775 780 <210> 34 <212> 1699 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> Opis sztucznej sekwencji: VP2 parwowirusa B19 klon 2-B62-B6 <400> 34 atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcactggtgc 60 aggagggggg ggcagtaatc ctgtgaaaag catgtggagt gagggggcca cttttagtgc 120 caactctgta acttgtacat tttccagaca atttttaart ccatatgacc cagagcacca 180 ttataaggtg ttttctcccg cagcaagtag ctgccacaat gccagLggaa aggaggcaaa 240

PL 210 849 B1

cgtttgcacc	attagtccca	taatgggata	ctcaacccca	tggagatatt	tagattLLaa	30 0
tgctttaaat	ttattttttt	cacctttaga	gtttcagcac	tLaattgaaa	attatggaaą	360
tatagcrcct	gatgctttaa	cLgLaaccat	atcagaaatt	gctgttaagg	atgttacaaa	420
caaaactgga	gggggggtgc	aggctactga	cagcactaca	gggcgcctat	gcatgttagt	480
agaccatgaa	tataagtacc	catatgtgtt	agggcaaggt	caagatactt	tagcccaaga	540
acttcctatt	tgggtatact	ttccccctca	atacgcttac	ttaacagtag	gagatgttaa	600
cacacaagga	a 111 c t. g g a g	acagcaaaaa	attggcaagt	caagaatcag	cattttatgt	660
tttggaacac	agttcttttc	agcttttagg	tacaggaggt	acagcaacta	tgtcttataa	720
gttccctcca	gtgcccccag	aaaatttaga	gggctgcagt	caacactttt	atgaaatgta	780
caacccctta	t a c g g a t c c c	gcttaggggt	tcctgacaca	ttaggaggtg	acacaaaatt	840
tagatcttta	acacatgaag	accatgcaat	tcagccccaa	aacttcatgc	cagggccac t.	900
agtaaactca	gtgtctacaa	aggagggaga	cagctctagt	actggagct q	gaaaagcctt	960
aacacccctt	a g c a c a g g t a	cctctcaaaa	cactagaata	tccttacgcc	ctgggccagc	1020
gcctcagccg	taccaacact	gggacacaga	taaatatgtc	acaggaataa	a L g c c a 1tt c	1 080
tcatcgtcag	accacttatg	g taacgctga	agacaaagag	tatcagcaag	gagtgggtag	1140
atttccaaat	gaaaaagaac	agctaaaaca	gttacagggr	ttaaacatgc	acacctactt	1200
tcccaataaa	ggaacccagc	aatatacaga	tcaaattgag	cgccccctaa	Lggtgggttc	1260
tgtatggaac	agaagagccc	ttcactatga	aagccagctg	tggagtaaaa	ttccaaattt	1320
agatgacagt	tttaaaactc	agtrtgcagc	cttaggagga	tggggtttgc	atcagccacc	1380
ccctcaaata	tttttaaaaa	tattaccaca	aagtgggcca	attggaggta	t L a a a t c: a a t	1440
gguaaLLact	a a c 11 a g 1.1 c	agratgccgt	gggaattatg	acaątaacca	tgacatttaa	1500
attggggccc	cgtaaagcta	cgggacggtg	gaatcctcaa	cctggagtgt	atcccccgca	156C
cgcagcaggt	catttaccat	atgtactata	tgaccccaca	gcracagatg	caaaacaaca	1 62 0
c c a 12 a g a ca a t	g g a t a t g a a a	agcctgaaga	attgtggaca	gccaaaagcc	gtgtgcaccc	168 0
attgtaagtc	gacatactc					1699
<210> 35
<211> 554
<212> PRT

<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis	sztucznej	sekwencj i	: aminokwasy	VP2 parwow
B19 klon 2	-36
<400> 35
MeL Thr Ser	Val Asn Ser	Ala Glu Ala	Ser Thr Gly Ala	Gly Gly Gly
1	5		10	15
Gly Ser Asn	Pro Val Lys	Ser Met Trp	Ser Glu Gly Ala	Thr Phe Ser
	20	2 5		3C
Ala Asn Ser	Val Thr Cys	Thr Phe Ser	Arg Gin Phe Leu	Ile Pro Tyr
35		4 0	45

PL 210 849 B1

Asp

Pro 50

Glu

His

Tyr

Lys 5 5

Val

Phe

Ser

Pro

Ala 60

Ala

Ser

Cys

His

Asn

Ala

Ser

Gly

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Cys

Thr

Ile

Ser

Pro

Ile

65

70

75

8 0

Met

Gly

Tyr

Ser

Thr

Pro

Trp

Arg

Tyr

Leu

Asp

Phe

Asn

Ala

Leu

Asn

85

90

95

Leu

Phe

Ser

Pro

Leu

Glu

Phe

C-ln

His

Leu

Ile

Glu

Asn

Tyr

G1 y

100

105

110

Ser

Ile

Al a

Pro

Asp

Pila

Leu

Thr

Val

Thr

Ile

Ser

Glu

Ile

Ala

Val

115

120

125

Lys

Asp

Val

Thr

Asn

Lys

Thr

Gly

Val

Gin

Vai

Thr

Asp

Ser

130

135

140

Thr

Gly

Arg

Leu

Cys

Met

Leu

Val

Asp

His

Glu

Tyt

Lys

Tyr

Pro

145

150

155

160

Tyr

Val

Leu

Gly

Gin

Gly

Gin

Asp

Thr

Leu

Ala

Pro

Glu

Leu

Pro

He

165

170

17 5

Trp

Val

Tyr

Phe

Pro

Gin

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Thr

Val

Gly

Asp

Val

180

185

190

Asn

Thr

Gin

Gly

Ile

Ser

Gly

Asp

Ser

Lys

Leu

Al a

Ser

Glu

195

200

205

Ser

Ala

Phe

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Ser

Phe

Gin

Leu

o 1 y

Thr

210

215

220

Gly

Thr

Ala

Thr

Met

Ser

Tyr

Lys

Phe

Pro

Val

Pro

Glu

225

230

2 3 5

240

Asn

Leu

Glu

Gly

Cys

Ser

Gin

His

Phe

Tyr

Glu

Met

Tyr

Asn

Pro

Leu

245

250

255

Tyr

Glv

Ser

Arg

Leu

Gly

Val

Pro

Asp

Thr

Leu

Gly

Asp

Pro

Lys

2 60

2 55

270

Phe

Arg

Ser

Leu

Thr

His

Glu

Asp

His

Ala

Ile

Gin

Pro

Gin

Asn

Phe

275

280

285

Met

Pro

Gly

Pro

Leu

tal

Asn

Ser

Val

Ser

Thr

Lys

Glu

Gly

Asp

Ser

290

295

300

Ser

Thr

Gly

Ala

Gly

Lys

Ala

Leu

Thr

Gly

Leu

Ser

T h r

Gly

Thr

305

310

315

320

Ser

Gin

Asn

Thr

Arg

Ile

Ser

Leu

Arg

Pro

Gly

Pro

va 1

Ser

Gin

Pro

325

330

335

Tyr

His

Trp

Asp

Thr

Asp

Lys

Tyr

Val

Thr

Gly

Ile

Asn

Ala

Ile

340

345

350

Ser

Kis

Gly

Gin

Thr

Tyr

Gly

Asn

Ala

Glu

Asp

Lys

Glu

Tyr

Gin

355

360

365

Gin

Gly

Val

Gly

Arg

Phe

Pro

Asn

Glu

Lys

Glu

Gin

Leu

Lys

Gin

Leu

37 0

375

380

PL 210 849 B1

Gin

Gly

Leu

Asn

Met

His

Thr

Tyr

Phe

Pro

Asn

Lys

Gly

Thr

Gin

38 5

390

395

400

Tyr

Thr

Asp

Gin

Tle

Glu

Arg

Pro

Leu

Met

Val

Gly

Ser

Val

Trp

Asn

4 05

410

415

Arg

Ala

Leu

His

Tyr

Glu

Ser

Gin

Leu

Trp

Ser

Lys

Ile

Pro

Asn

420

425

430

Leu

Asp

Ser

Phe

Lys

Thr

Gin

Phe

Ala

Leu

Gly

Trp

Gly

435

440

445

Leu

His

Gin

Pro

Gin

Ile

Phe

Leu

Lys

Ile

Leu

Pro

Gin

Ser

450

455

460

Gly

Pro

Ile

Gly

Ile

Lys

Ser

Met

Gly

Ile

Thr

Leu

Val

Gin

465

470

475

480

Ty r

Ala

Val

G1 y

Ile

Met

Thr

Val

Thr

Met

Thr

Phe

Lys

Leu

Gly

Pro

485

4 90

495

Arg

Lys

Al 3

Thr

Gly

Arg

Trp

Asn

Pro

Gin

Pro

Gly

Val

Tyr

Pro

500

505

510

H i s

Ala

Gly

His

Leu

Pro

Tyr

Val

Leu

Tyr

Asp

Pro

Thr

Ala

Tnr

515

520

525

Asp

Ala

Lys

Gin

His

Arg

His

Gly

Tyr

Glu

Lys

Pro

Glu

Leu

530

535

540

Trp

Thr

Ala

Lys

Ser

Arg

Val

Hrs

Pro

Leu

545 550 <210> 36 <2il> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223>	Opis sztucznej sekwencji:	starter	VP-5
<400>	36
aggaagtttg ccggaagtte			20
<210>	37
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji:	starter	V?Y
<400>	37

PL 210 849 B1 gtgctgaaac tctaaaggtg <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter VP2-5 <400> 38 gacatggata tgaaaagcct gaag <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter VP2-3 <400> 39 gttgttcata tctggttaag tact <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter K-lsp <400> 40 ataaatccat atactcatt <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji <400> 41 starter K-2sp

PL 210 849 B1 otaaagtatc ctgaccccg 19

<210>	42
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter Hicks-5
<400>	42

cccgccttat gcaaatgggc ag 22

<210>	43 <211> 22
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter Hicks-3
<400>	43

ttgtgttagg ctgtcttata gg 22

<210>	44
<211>	54
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter NS1-5
<400>	44

atactctcta gacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt tlct 54

<210>	45
<211>	48
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter NS1-3
<400>	45

gagtatgtcg acttactcat aatctacaaa gctttgcaat ccagacag 48

PL 210 849 B1 <210> 46 ' <211> 55 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter VP1-5SN <400> 46 atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagt <210> 47 <211> 51 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter VPALL-3 <400> 47 gagtatgtcg acttacaatg ggtgcacacg gcttttggct gtccacaatt c <210> 48 <211> 55 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter VP2-5SN <400> 48 atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcact 55 <210> 49 <211> 43 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: VSPC1 <400> 49 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atccttaaca gcaatttctg ata

PL 210 849 B1

<210>	50
<211>	39
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: VSPC2 <400> 50

3933333333 3333333333 cgccctgtag tgccgtcag 39

<210>	51
<211>	42
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: VSPC3
<400>	51

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tatacccaaa taggaagttc tg 42

<210>	52
<211>	43
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: VSPC4
<4C'0>	52

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taaaatgctg attcttcact tgc 43

<210>	53
<211>	40
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: VSPC5
<400>	53

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tgctgtacct cctgtaccta 40

PL 210 849 B1

<210>	54
<211>	40
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: VSPC6 <400> 54 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agccctctaa attttctggg 40

<2i0>	55
<211>	40
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: VSPC7
<400>	5 5

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctcctaaagt gtcaggaacc 40

<210>	56
<211>.	, 51
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<2.23>	Opis sztucznej sekwencji: starter VSA1
<400>	56

aattctaata cgactcacta tagggagaag gccataLact cattggactg t 51

<210>	57
<211>	48
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter V3A2 <400> 57 aattctaata cgactcacta tagggagaag gccagagcac cattataa 48

PL 210 849 B1

<210>	58
<211>	48
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter VSA3
<400>	58

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacaatgcc agtggaaa 48

<210>	59
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter VSP2
<400>	59

gtgctgaaac tctaaaggt 19

<210>	60
<211>	17
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<22 0>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: starter VSP1
<400>	60

ggaggcaaag gtttgca 17

<210>	61
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<221>	różne własności
<222>	(1)

PL 210 849 B1 <223> w której 'c' oznacza zmodyfikowany 5' z fosioryncamidem fluoresceiny <220>

<221> różne własności <222> (20) <223> w któreg 'f' oznacza zmodyfikowany 3' z DABCYT, <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter VSPPR1 <400> 61 cccatggaga tattuagatt 20 <210> 62 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CK80-1 <400> 62

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aag 11Lgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttc	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaatttg	4 8 0
t LI: L111 c a c	ctttagagtt	tcagcattta	attgaaaact	atggaagtac	agctcctgat	540
gctttaactg	tsaccacatc	agaaa t tgct	g 11 a za g g a t g	t tacagacaa	aactggaggg	600
ggagtacaag	ttactgacag	cactaccggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	6 60
a a gta cccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gataetttag			700

<210> 63 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat CH81-3

PL 210 849 B1

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	La Laaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	ttaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttaqtqccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagL L	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tcgcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	ag-ggaaagg	aggcaaaggc	ttgcaccatt	420
agucccazaa	tgggatactc	aaccccatgg	agatactt ag	atcttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gccttaactg	taaccataLc	agaaattgct	gtcaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	tcactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	acgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			7 00

<210 64 <211> 700 <212> DNA <21 3> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL1-4 <400> 64

ataaatccat	a Lactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	L tcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ct 11 aaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ct cagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttag l g c ca a	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
cctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttctcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 65 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

PL 210 849 B1 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL2-1 <400> 65

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ct r t aaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	ctcac.aacgc	ctcagaaaaa	100
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	2 4 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccac L t	t tagtgccaa	ctctgcaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	dttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggcgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
11-111tcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	LLaccgacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	650
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatacttcag			700

< 2 1Q > 66 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL3-1.

< 4 0 0 > 6 6

ataaatccat	atactcat Lg	gactgtagca	gatgaagaąc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactactcta	ctctaaaagg	tgcagctgcc	.20
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	ctcacaacgc	ctcagaaaaa	130
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggt gcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	catgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	atcttaatgc	tttaaattta	430
tttttttcac	ctttagagt L	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaat tgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 67 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

PL 210 849 B1 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL4-3 <400 67

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 68 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL5-2 <400 68

<210> 69 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

PL 210 849 B1 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL6-2 <-<00> 69

ataaatccat	acact.cattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttctaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	a g L a g t a a a a	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagt t cccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacacttt	c c a g a c a a 11	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatacttag	attttaatgc	tttaaattta	4 80
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaat.t	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtg 11 agg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 7C <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat. B19SCL7-3 <400> 70

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	t ttcaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	11_ c a a g c a c a	agtagtaaaa	gactacctta	cttcaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	c t. c L q t a a c t	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggagtt t	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	42 0
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaat. t	atggaagtat	agctcctgat	540
g ctttaactg	taaccatatc	agaaattgcc	gttaaggatg	ttacggacaa	aac L. ggaggg	60 0
ggggtgcagg	t tactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgctagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	a tg t gttagg	gcaaggtcag	gataccttag			7 00

<210> 71 <211> 700 <212> DNA <21.3> Sztuczna sekwencja <220>

PL 210 849 B1 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL8-2 <400> 71

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	gttttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 72 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL9-1 <400> 72

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcaat	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	ccagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210>	73
<211>	700
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>

PL 210 849 B1 <223> Opis sztuczne] sekwencji: izolat B19SCL9-9 <4C0> 73

a t 53 3_ cca t	atactcattg	gactgtagca	g a t g a a g a g c	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacctta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cc Lg tggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	ctcacaacgc	c t c a g a a a a a	18 0
tacccaagca	tgacttcagL	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatctt	ccagacaatt	111 a a LLccd	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	a gg c a aac: g t.	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	11 L a a a 111 a	480
111L L 11 cac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	Laa ccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	ca c Lacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gataetttag			700

<21Q> 74 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL10-2 < 4 0 0 > 7 4

a r. a a a L c c a 1:	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaag t tcccg	ct. ta ca aege	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	3 4 0
agcaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	30C
tgcacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
a g c c c c a 1 a za	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaatcta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt.	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gataetttag			700

<210 75 <210 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL11-1

PL 210 849 B1

<4C'0> 75
ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	LLcaagcaca	agtagtaaaa	gactac t tta	c L L Laaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaaąca	rqacttcaqt	taattctgca	gaagccagca	ccqqtqcagg	aggggqgqgc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
a g t c c c a t a a	tgggatactc	aaccceatgg	agatatttag	a111 Laalgc	t L LaaaLtta	480
tttttttcac	ccttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	5 4 C
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttageaga	ccatgaatat	660
aagLacccat	aLgtgLtagg	cjcaaęcjtcaę	gataetttat			700

<210> 76 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <2 2 0>

<223> Opis sztucznej sekwencja: izolat B19SCL12-1 <400> 76

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaacg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	a L 11 tcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	yaaęccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tcaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtgact	300
tgtacatttt	ccagacagtt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaqqtgtrt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtccgataa	tgggatactc	aaccceatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	4 80
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaa 11gct	gL taaggatg	ttacagacaa	aactggaggg	600
ggggtgcaag	ttactgacag	cagtacaggg	cgcctatgca	tąttagtaga	ccatgaatac	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210>	77
<211>	700
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<22 0>

PL 210 849 B1 <223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SC^13-3 <400> 77

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	CO
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	g a c t a c 111 a	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	cgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagca t	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtgcatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaaLgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
t ttt tt tcac	ctt Lagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	60 0
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgctagtaga	ccatgaacat	660
aagtacccaL	acgtgttagg	gcaaggtcag	qat actttag			700

< 210 > 7 8 <211> 700 <212> DNA <?13> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL14-1 <400> 78

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagtccccg	cttacaacgc	cl.cagaaaaa	1.80
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
aglaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	3 60
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggaLactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	L11 a a a 111 a	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	actgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
g c 111 a a c t g	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 79 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 210 849 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL15-3 <400> 79

ataaacccat	acactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tacaaaaaat	60
gaaaccgggt	LLcaagcacs	agtagtaaaa	g a o t a o L L t. a	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	c t g g t g c a g g	aggggggggc	2 4 0
agtaatcctg	tąaaaagcat	gtggag tgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatctt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	.3 6 0
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	a g t. g g a a a g g	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
ii y L C C C 3 t 3 3	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtc	tcagcactta	attgaaaatt	a t geja ag Lali	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaacat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	ga ta eter, ag			700

<210> 80 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL16-2 <4 00> 8 0'

ataaatcca-	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	111.1. a a a a a a	tacaaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	: 80
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	eteg Lgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	30C¹
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taagg tgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaar.tt.a	4 80
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attqaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	5 4 0
gctttaactg	taaccatatc	aqaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	tcactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	t g 1.1. a g t a g a	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gataetttat			700

<210> 81 <211> 700 <212> DNA

PL 210 849 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL17-1 <400> 81

ataaatccat	atacttattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagctcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	t g c 1.1 c.a q t	taattetgca	qaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	240
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	48C
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtj: t	agct cctgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	g 11 a a g g a i g	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcct.a tg ca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	a tg tgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 82 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL18 <400 82

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	cttcaaaagg	tgcagccgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	t tagtgccaa	ctctgtaact	3 00
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	ta tgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
aq t. cc ca taa	tqggatactc	aaccccatgg	agatacttag	attttaatgc	tttaaattta	480
11111 ttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaat t	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	6C0
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	c c a t q a a c a t	6 60
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactt tag			700

<210> 83 <211> 700 <212> DN.A

PL 210 849 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL19-1 <4C0> 83

ataaatccat	a t a c t c a l L q	gac Lgtagca	gacgaagagc	Ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gaccacctta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaag l icccg	cttacaacgc	ct cagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	g Lggagtgag	ggggccactt.	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	3 60
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	4 30
tttttttcac	ctttagag t L	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	54 0
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggcę t.g cac q	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			7 00

<210> 84 <211> 700 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztuczne] sekwencji: izolat B19SCL20-3 <400> 84

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacttta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aągcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aaccccacgg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	60C
ggggtgcagg	ctactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 85 <211> 700 <212> DNA

PL 210 849 B1 <213> Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL21-3 <4 00> 85

ataaacccat	atactcattg	gactgcagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat.	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactact t La	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggcc c	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	180
tacccaagca	tgact z c a g t	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	24 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctccgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	420
agtcccataa	tgggatactc	aacccca t gg	agatatttag	attttaatgc	tttaaattta	4 80
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcccgat	54 0
gctttaactg	L aaccatacc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	600
ggggtgcagg	11 a c L g a c a g	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	6 60
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			7 00

<210>	86
<21 1>	7 00
<212>	DNA
<21 3>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji:	.zoiat B19SCL22-11
<400>	86

ataaatccat	atactcattg	gactgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactacc t ta	ctttaaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	280
tacccaagca	tgacttcagt	taattccgca	gaagccagca	ctggtgcggg	aggggggggc	240
agtaaccctg	t g a a a a g c a t	gtggagcgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaatccca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	360
t ct cccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatttag	attttaatgc	tctaaattta	480
tttttttcac	ctttagagtt	tcagcactta	attgaaaat L	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	60 0
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	qa t acc 11 ag			700

<210> 87 <211> 700 <212> DNA

PL 210 849 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: izolat B19SCL2-14 <400> 67

ataaatccat	atactcattg	gaccgtagca	gatgaagagc	ttttaaaaaa	tataaaaaat	60
gaaactgggt	ttcaagcaca	agtagtaaaa	gactact LLa	ct L taaaagg	tgcagctgcc	120
cctgtggccc	attttcaagg	aagtttgccg	gaagttcccg	cttacaacgc	ctcagaaaaa	18 C
tacccaagca	tgacttcagt	taattctgca	gaagccagca	ctggtgcagg	aggggggggc	2 4 0
agtaatcctg	tgaaaagcat	gtggagtgag	ggggccactt	ttagtgccaa	ctctgtaact	300
tgtacatttt	ccagacaatt	tttaattcca	tatgacccag	agcaccatta	taaggtgttt	3 60'
tctcccgcag	caagtagctg	ccacaatgcc	agtggaaagg	aggcaaaggt	ttgcaccatt	4 20
agtcccataa	tgggatactc	aaccccatgg	agatatctag	attttaatgc	t L Laaattta	4 80
tttttttcac	ctttagagt t	tcagcactta	attgaaaatt	atggaagtat	agctcctgat	540
gctttaactg	taaccatatc	agaaattgct	gttaaggatg	ttacggacaa	aactggaggg	500
ggggtgcagg	ttactgacag	cactacaggg	cgcctatgca	tgttagtaga	ccatgaatat	660
aagtacccat	atgtgttagg	gcaaggtcag	gatactttag			700

<210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter Vpara <400> 88 tccatatgac ccagagcacc a <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter Vpara <400> 89 tttccactgg cattgtggc.

PL 210 849 B1

<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<221>	różne własności
<222>	(1)
<2 2 3>	w której 'a' oznacza	zmodyf i kowany	5 '	z Fam
<220>
<221>	różne własności
<222>	(21)
<223>	w której 'g¹ oznacza	zmodyf i kowany	3 ¹	z Tamra
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwen	.cji : starter	Vpa	ralO
<400>	90

agctagacct gcatgtcact g <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja docelowa <400> 91 ctactLgcty cgggagaaaa acacct <210> 92 <211> 681 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kontroli wewnętrznej

<400> 92
gaactcactt	gtacattttc	cagacaattt	ttaattccat	atgacccaga	gcaccattat	60
acagtgacat	gcaggtctag	ctctgccaca	atgccagtgg	aaaggaggca	aaggtttgca	120
ccattagtcc	cataatggga	tactcaaccc	catggagata	tttagatttt	aatgctttaa	180
atttattttt	ttcaccttta	gagttteage	acttaattga	aaattatgga	agtatagctc	240
ctgatgcttt	aactgtaacc	atatcagaaa	ttgctgttaa	ggatgttacg	gacaaaactg	300
gagggggggt	gcaggttact	gacagcacta	cagggcgcct	atgcatgtta	gtagaccatg	3 60
aaLataagta	cccatatgtg	ttagggcaag	gtcaagatac	tttagcccca	gaacttccta	4 20

PL 210 849 B1

tttgggtata	ctttccccct	caatacgctt	acttaacagt	aggagatgtt	aacacacaag	480
gaatttctgg	agacagcaaa	aaattggcaa	gtgaagaatc	agcattttat	gttttggaac	540
acagttcttt	tcagctttta	ggtacaggag	gtacagcaac	tatgtcttat	aagtttcctc	600
cagtgccccc	agaaaattta	gagggctgca	gtcaacactt	ttatgaaatg	tacaacccct	660
tatacggatc	ccgctgtcga	c				681

<210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:sonda VparalO <400> 93 taaggtgtt ttctcccgca gcgagt

Claims

1. Sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej przy zastosowaniu próby Taqman, znamienny tym, że:

(a) izoluje się kwasy nukleinowe z próbki biologicznej przeznaczonej do określania ludzkiego parwowirusa B19 przez kontaktowanie magnetycznych kulek podłoża zawierających związane z nimi wychwytujące kwasy nukleinowe z próbką biologiczną w warunkach hybrydyzacji przy czym nici docelowego kwasu nukleinowego ludzkiego parwowirusa B19 jeśli są obecne w próbce biologicznej, hybrydyzują z wychwytującymi kwa-sami nukleinowymi, przy czym te związane wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają jeden lub więcej oligonukleotydów wybranych z grupy składającej się z SEQ ID nr 49-55 i oddziela się kulki magnetyczne od tej próbki;

(b) amplifikuje się izolowane kwasy nukleinowe i wewnętrzną sekwencję kontrolną stosując próbę Taqman z sensownym i antysensownym starterem, przy czym każdy ze starterów jest nie większy niż długość 60 nukleotydów i jest wystarczająco komplementarny do części nici sensownych i antysensownych docelowego kwasu nukleinowego dla hybrydyzacji Z nim, przy czym starter sensowny składa się z sekwencji SEQ ID nr 60 i starter antysensowny składa się z sekwencji SEQ ID nr 59; przy czym wewnętrzna sekwencja kontrolna zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 90, i (c) wykrywa się obecność amplifikowanych kwasów nukleinowych ludzkiego parwowirusa B19 stosując sondę nie większą niż 50 nukleotydów długości, która zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 61 jako wskazanie obecności ludzkiego parwowirusa B19 w próbce; i (d) wykrywa się obecność amplifikowanej wewnętrznej sekwencji kontrolnej stosując sondę Taąman.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają oligonukleotydy o sekwencji SEQ ID nr 55 i jeden lub więcej oligonukleotydów o sekwencji SEQ ID nr 49-54.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają oligonukleotydy o sekwencji SEQ ID nr 49, 52, 53 i 55.