ES2564044T3 - Células posparto derivadas de tejido del cordón umbilical y métodos de preparación y uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Una célula aislada obtenible de tejido del cordón umbilical humano, en la que dicho tejido del cordón umbilical humano está sustancialmente libre de sangre, dicha célula es capaz de auto-renovación y expansión en cultivo y tiene el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, dicha célula es capaz de expandirse en presencia de oxígeno de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 20 %, dicha célula requiere L-valina para el crecimiento, y en la que dicha célula tiene las siguientes características: a. potencial de experimentar al menos 40 duplicaciones en cultivo; b. unión y expansión sobre un recipiente de cultivo de tejido recubierto o sin recubrir, en la que el recipiente de cultivo de tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; c. producción de vimentina y alfa-actina de músculo liso; d. producción de los marcadores de la superficie celular CD10, CD13, CD44, CD73, HLA-A,B,C, CD90 y PDGFr-alfa, como se detecta por citometría de flujo; e. elevada expresión de genes endógenos que codifican interleucina 8, reticulón 1, ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocinas (motivo CX- C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); proteína 3 inducida por factor de necrosis tumoral alfa, con respecto a la expresión endógena de interleucina 8, reticulón 1, ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-XC); proteína 3 inducida por factor de necrosis tumoral alfa en una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, como se caracteriza por matriz de oligonucleótidos; f. ausencia de producción de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR,DP,DQ, como se detecta por citometría de flujo; g. secreción de MCP-1, IL-6, GCP-2, IL-8, TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF e IL-8, como se detecta por ELISA; h. ausencia de secreción de SDF-1alfa, VEGF, TGF-beta2, ANG2 y PDGFbb, como se detecta por ELISA; i. ausencia de expresión de CD80, CD86, B7-H2, HLA-G y CD178, como se detecta por citometría de flujo; j. expresión de PD-L2, como se detecta por citometría de flujo; y k. una disminución en la expresión de los siguientes genes con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una cresta ilíaca, como se caracteriza por matriz de oligonucleótidos: homeocaja 2 de baja estatura; proteína 2 de 27 kDa de choque térmico; ligando 12 de quimiocinas (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células del estroma); elastina; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeocaja 2 del mesénquima; homólogo 1 de la homeocaja del seno ocular; cristalina, alfa B; activador asociado a dishevelled de la morfogénesis 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina; dominio de homología tres con src (SH3) y rico en cisteína; gen 1 de translocalización de linfocitos B, antiproliferativo; 25-hidroxilasa del colesterol; factor de transcripción 3 relacionado con runt; proteína hipotética FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de la procolágeno C-endopeptidasa; homólogo 7 de frizzled; gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C; proteína 5 de la homeocaja de iroquois; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína 2 de las vesículas sinápticas; ADNc FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 de tipo receptor de citocinas; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/pequeña, subfamilia N, miembro 4; integrina, alfa 7; proteína DKFZP586L151; coactivador transcripcional con motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo 2 de la homeocaja del seno ocular; proteína KIAA1034; respuesta 3 de crecimiento temprano; homeocaja 5 distal-less; proteína hipotética FLJ20373; familia 1 de la aldo-ceto reductasa, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, 1 similar a beta (con dominios de repetición similares a EGF); clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; proteína KIAA0367; receptor C del péptido natriurético/guanilato ciclasa C (receptor C del péptido atrionatriurético); proteína hipotética FLJ14054; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); proteína 5 de la membrana asociada a vesícula; proteína de la matriz extracelular 1 similar a fibulina que contiene EGF; tipo 3 de proteína de 19 kDa de interacción BCL2/adenovirus E1B; proteína 1 de unión de AE; polipéptido 1 de la subunidad VIIa de la citocromo c oxidasa (músculo); neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; y factor de crecimiento similar a la proteína de unión a la insulina 2, 36 kDa.

Description

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CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR,DP,DQ, como se detecta por citometría de flujo, son actualmente las células preferidas de la divulgación. También se prefieren células que carecen de la producción de al menos cinco, seis, siete u ocho o más de estos marcadores. Son más preferidas las células que carecen de la producción de al menos nueve o diez de los marcadores de la superficie celular. Las células de la invención carecen de la producción de las once de las anteriores proteínas identificadoras.

Las células de la invención producen cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, y no producen ninguno de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 o HLA-DR,DP,DQ, como se detecta por citometría de flujo.

Presentemente, se prefiere que las células derivadas del posparto de la divulgación expresen al menos uno, dos o tres de interleucina 8; reticulón 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); y factor de necrosis tumoral, proteína 3 inducida por alfa. Son más preferidas aquellas células que expresan cuatro o cinco de los genes anteriores. La célula de la invención es capaz de expresar seis de los genes anteriores.

Para algunas realizaciones de la divulgación se prefieren células, que con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, tienen expresión reducida para al menos uno de los genes correspondientes a: homeocaja 2 de baja estatura; proteína 2 de 27 kDa de choque térmico; ligando 12 de quimiocinas (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células del estroma); elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeocaja 2 del mesénquima (homeocaja específica de la detención del crecimiento); homólogo 1 de la homeocaja del seno ocular (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado a dishevelled de la morfogénesis 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (proteína de unión al plasminógeno); dominio de homología tres con src (SH3) y rico en cisteína; gen 1 de translocalización de linfocitos B, antiproliferativo; 25-hidroxilasa del colesterol; factor de transcripción 3 relacionado con runt; proteína hipotética FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de la procolágeno C-endopeptidasa; homólogo 7 de frizzled (Drosophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabraquiona); proteína 5 de la homeocaja de iroquois; hefaestina; integrina, beta 8; glucoproteína 2 de las vesículas sinápticas; ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 de tipo receptor de citocinas; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/pequeña, subfamilia N, miembro 4; integrina, alfa 7; proteína DKFZP586L151; coactivador transcripcional con motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo 2 de la homeocaja del seno ocular (Drosophila); proteína KIAA1034; respuesta 3 de crecimiento precoz; homeocaja 5 de distal-less; proteína hipotética FLJ20373; familia 1 de la aldo-ceto reductasa, miembro C3 (3-alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, 1 similar a beta (con dominios de repetición similares a EGF); inserto de longitud completa de ARNm de Homo sapiens; clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; proteína KIAA0367; receptor C del péptido natriurético/guanilato ciclasa C (receptor C del péptido atrionatriurético); proteína hipotética FLJ14054; ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); proteína 5 de la membrana asociada a vesículas (miobrevina); proteína de la matriz extracelular 1 similar a fibulina que contiene EGF; tipo 3 de proteína de 19 kDa de interacción BCL2/adenovirus E1B; proteína 1 de unión a AE; polipéptido 1 de la subunidad VIIa de la citocromo c oxidasa (músculo); neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; factor de crecimiento similar a la proteína de unión a la insulina 2, 36 kDa. Son más preferidas las células que tienen, con respecto a fibroblastos humanos, citoblastos mesenquimatosos, o células de la médula ósea de las crestas ilíacas, expresión reducida de al menos 5, 10, 15 o 20 genes correspondientes a aquellos enumerados anteriormente. Presentemente son más preferidas células con expresión reducida de al menos 25, 30 o 35 de los genes correspondientes a las secuencias enumeradas. También son más preferidas aquellas células derivadas del posparto que tienen expresión que se reduce, con respecto a la de un fibroblasto humano, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, de genes correspondientes a 35 o más, 40 o más de las secuencias enumeradas. Las células más preferidas de la invención son aquellas que tienen expresión que es reducida, con respecto a la de un fibroblasto humano, un citoblasto mesenquimatoso, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, de genes correspondientes a todas las secuencias enumeradas.

La secreción de ciertos factores de crecimiento y otras proteínas celulares pueden hacer las células de la invención particularmente útiles. Aunque la secreción de tales factores es útil, las células también pueden caracterizarse por su ausencia de secreción de factores en el medio. En otro aspecto de la invención se proporcionan cultivos celulares terapéuticos, comprendiendo los cultivos celulares las células aisladas como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de pacientes en necesidad de factores tróficos estimulantes de la angiogénesis. Tales cultivos celulares terapéuticos también se proporcionan para su uso en el tratamiento de un paciente en necesidad de factores tróficos estimulantes del crecimiento neural.

Se proporcionan métodos de derivación de UDC del tejido del cordón umbilical humano. Las células son capaces de auto-renovación y expansión en cultivo, y tienen el potencial de proliferar en células de otros fenotipos. El método comprende (a) obtener tejido del cordón umbilical humano; (b) eliminar sustancialmente toda la sangre para dar un tejido del cordón umbilical sustancialmente libre de sangre, (c) disociar el tejido por tratamiento mecánico o enzimático, o ambos, (d) resuspender el tejido en un medio de cultivo, y (e) proporcionar condiciones de crecimiento

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células se unieron y se expandieron bien entre el pase 0 y 1 (Tabla 1-2). Se demostró que las células en las condiciones 5-8 y 13-16 proliferaron bien hasta 4 pases después de sembrarse, momento en el que se criopreservaron.

5 Resultados

Aislamiento de células usando combinaciones de enzimas diferentes. La combinación de C:D:H proporcionó el mejor rendimiento de células tras el aislamiento y generó células que se expandieron durante muchas más generaciones en cultivo que las otras condiciones (Tabla 1-1). No se obtuvo una población de células expandible

10 usando colagenasa o hialuronidasa solas. No se hizo intento por determinar si este resultado era específico para la colagenasa que se probó.

Tabla 1-1: Aislamiento de células de tejido del cordón umbilical usando combinaciones de enzimas variables

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Digestión con enzimas

Celulas aisladas Expansión células

Colagenasa

X X

Dispasa

+ (> 10 h) +

Hialuronidasa

X X

Colagenasa:Dispasa

++ (< 3 h) ++

Colagenasa:Hialuronidasa

++ (< 3 h) +

Dispasa:Hialuronidasa

+ (> 10 h) +

Colagenasa:Dispasa:Hialuronidasa

+++ (< 3 h) +++

Clave: + = buena, ++ = muy buena, +++ = excelente, X = no existosa

Aislamiento de células usando combinaciones de enzimas y condiciones de crecimiento diferentes. Las

30 células se unieron y se expandieron bien entre el pase 0 y 1 bajo todas las condiciones probadas para la digestión y crecimiento de enzimas (Tabla 1-2). Las células en las condiciones experimentales 5-8 y 13-16 proliferaron bien hasta 4 pases después de la siembra, momento en el que se criopreservaron. Todas las células se criopreservaron para análisis posterior.

35 Tabla 1-2: Aislamiento y expansión del cultivo de células posparto bajo condiciones variables:

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Condición

Medio 15% FBS BME Gelatina 20% O2 Factores de crecimiento

1

DMEM-Lg Y Y Y Y N

2

DMEM-Lg Y Y Y N (5%) N

3

DMEM-Lg Y Y N Y N

4

DMEM-Lg Y Y N N (5%) N

5

DMEM-Lg N (2%) Y N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/ml)

6

DMEM-Lg N (2%) Y N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/ml)

7

DMEM-Lg N (2%) Y N (Fibronectina) Y PDGF/VEGF

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DMEM-Lg N (2%) Y N (Fibronectina) N (5%) PDGF/VEGF

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DMEM-Lg Y N Y Y N

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DMEM-Lg Y N Y N (5%) N

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DMEM-Lg Y N N Y N

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DMEM-Lg Y N N N (5%) N

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DMEM-Lg N (2%) N N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/ml)

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DMEM-Lg N (2%) N N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/ml)

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DMEM-Lg N (2%) N N (Fibronectina) Y PDGF/VEGF

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DMEM-Lg N (2%) N N (Fibronectina) N (5%) PDGF/VEGF

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Lote números 2F1655, 2F1656 y 2F1657) y se cultivaron según las especificaciones del fabricante en medio MSCGM (Cambrex). Las células se cultivaron sobre plástico estándar cultivado con tejido a 37 ºC con 5 % de CO2.

Células de médula ósea de las crestas ilíacas humanas (ICBM). Se recibió médula ósea de las crestas ilíacas

5 humana de NDRI con consentimiento del paciente. La médula ósea se procesó según el método brevemente explicado por Ho, et al. (documento WO03/025149). La médula ósea se mezcló con tampón de lisis (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM y EDTA 0,1 mM, pH 7,2) a una relación de 1 parte de médula ósea con respecto a 20 partes de tampón de lisis. La suspensión de células se agitó con vórtex, se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó durante 10 minutos a 500 x g. El sobrenadante se desechó y el sedimento de células se resuspendió

10 en medio esencial mínimo alfa (Invitrogen) enriquecido con 10 % (v/v) de suero bovino fetal y glutamina 4 mM. Las células se centrifugaron de nuevo y el sedimento de células se resuspendió en medio fresco. Se contaron las células mononucleares viables usando exclusión con azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO). Las células mononucleares se sembraron en matraces de plástico de tejido cultivado a 5 x 104 células/cm2. Las células se incubaron a 37 ºC con 5 % de CO2 a tanto O2 atmosférico estándar como a 5 % de O2. Las células se cultivaron durante 5 días sin un

15 cambio de medio. Se eliminó el medio y las células no adherentes después de 5 días de cultivo. Las células adherentes se mantuvieron en cultivo.

Aislamiento de ARNm y análisis de GeneChip. Se eliminaron cultivos de células activamente en crecimiento de los matraces con un raspador de células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría. Las células se 20 centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron en PBS fresco y se centrifugaron de nuevo. El sobrenadante se eliminó y el sedimento de células se congeló inmediatamente y se guardó a -80 ºC. Se extrajo ARNm celular y se transcribió en ADNc. Entonces, el ADNc se transcribió en ARNc y se marcó con biotina. El ARNc marcado con biotina se hibridó con matrices de oligonucleótidos GeneChip HG-U133A de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara CA). Las hibridaciones y la recogida de datos se realizaron según las 25 especificaciones del fabricante. Las hibridación y la recogida de datos se realizaron según las especificaciones del fabricante. Los análisis de datos se realizaron usando el software informático “Significance Analysis of Microarrays” (SAM) versión 1.21 (Tusher, V.G. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116-5121). Las licencias para el software de análisis están disponibles mediante la Office of Technology Licensing, Universidad de Stanford, y más información está disponible en la red mundial en el sitio web del Profesor Tibshirani en el Departamento de

30 estadística, Universidad de Stanford (www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/).

Resultados

Se analizaron catorce poblaciones diferentes de células en este estudio. Las células junto con la información de los 35 pases, sustrato de cultivo y medios de cultivo se enumeran en la Tabla 6-1.

Tabla 6-1. Células analizadas por el estudio de micromatrices. Las líneas de células se enumeran por su código de

identificación junto con el pase en el momento del análisis, sustrato de crecimiento celular y medio de crecimiento.

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Populación células

Paso Substrato Media

Umbilical (022803)

2 Gelatina DMEM,15%FBS,βME

Umbilical (042103)

3 Gelatina DMEM,15%FBS,βME

Umbilical (071003)

4 Gelatina DMEM,15%FBS,βME

Placenta (042203)

12 Gelatina DMEM,15%FBS,βME

Placenta (042903)

4 Gelatina DMEM,15%FBS,βME

Placenta (071003)

3 Plástico DMEM,15%FBS,βME

ICBM (070203) (5% O2)

3 Plástico MEM 10% FBS

ICBM (062703) (std O2)

5 Plástico MEM 10% FBS

ICBM (062703)(5% O2)

5 Plástico MEM 10% FBS

hMSC (Lot 2F1655)

3 Plástico MSCGM

hMSC (Lot 2F1656)

3 Plástico MSCGM

hMSC (Lot 2F1657)

3 Plástico MSCGM

hFibroblasto (9F0844)

9 Plástico DMEM-F12, 10% FBS

hFibroblasto (CCD39SK)

4 Plástico FBS DMEM-F12, 10% FBS

31

Los datos se evaluaron por Análisis de Componentes Principales con el software SAM como se ha descrito anteriormente. Los análisis revelaron 290 genes que se expresaron en diferentes cantidades relativas en las células probadas. Este análisis proporcionó comparaciones relativas entre las poblaciones.

5 La Tabla 6-2 muestra las distancias euclídeas que se calcularon para la comparación de los pares de células. Las distancias euclídeas se basaron en la comparación de las células basándose en los 290 genes que se expresaron diferencialmente entre los tipos de células. La distancia euclídea es inversamente proporcional a la similitud entre la expresión de los 290 genes.

10 Tabla 6-2. Distancias euclídeas para los pares de células. La distancia euclídea se calculó para los tipos de células usando los 290 genes que se expresaron diferencialmente entre los tipos de células. La similitud entre las células es inversamente proporcional a la distancia euclídea.

Par de células

15

ICBM-hMSC

Placenta-umbilical

ICBM-Fibroblasto

20

ICBM-placenta

Fibroblasto-MSC

ICBM-Umbilical

25

Fibroblasto-Umbilical

MSC-Placenta

MSC-Umbilical

30

ICBM-placenta

Distancia Euclidea

24.71

25.52

36.44

37.09

39.63

40.15

41.59

42.84

46.86

48.41

Las Tablas 6-3, 6-4 y 6-5 muestran la expresión de genes elevada en células derivadas de la placenta (Tabla 6-3), elevada en células derivadas del cordón umbilical (Tabla 6-4) y reducida en células derivadas del cordón umbilical y 35 de la placenta (Tabla 6-5).

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Tabla 6-3. Genes que tienen específicamente expresión elevada en las células derivadas de la placenta en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

Genes incrementados en células derivadas de Placenta

ID conjunto pruebas

Nombre de Gen NCBI Número de acceso

209732_at

C-type (calcium dependent, carbohydrate-recognition domain) lectin, superfamily member 2 (activationinduced) AF070642

206067_s_at

Wilms tumor 1 NM_024426

207016_s_at

aldehyde dehydrogenase 1 family, member A2 AB015228

206367_at

Renin NM_000537

210004_at

oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor 1 AF035776

214993_at

Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, partial cds AF070642

202178_at

protein kinase C, zeta NM_002744

209780_at

hypothetical protein DKFZp564F013 AL136883

204135_at

downregulated in ovarian cancer 1 NM_014890

213542_at

Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp547K1113 (from clone DKFZp547K1113) AI246730

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Tabla 6-5. Genes que tienen expresión reducida en células del cordón umbilical y de la placenta en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

Genes incrementados en células derivadas de Placenta y de Umbilical

ID conjunto pruebas

Nombre de Gen NCBI Número de acceso

210135_s_at

short stature homeobox 2 AF022654.1

205824_at

heat shock 27kDa protein 2 NM_001541.1

209687_at

chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1) U19495.1

203666_at

chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stromal cell-derived factor 1) NM_000609.1

212670_at

elastin (supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome) AA479278

213381_at

Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586M2022 (from clone DKFZp586M2022) N91149

206201_s_at

mesenchyme homeobox 2 (growth arrest-specific homeobox) NM_005924.1

205817_at

Sine oculis homeobox homolog 1 (Drosophila) NM_005982.1

209283_at

crystallin, alpha B AF007162.1

212793_at

dishevelled associated activator of morphogenesis 2 BF513244

213488_at

DKFZP586B2420 protein AL050143.1

209763_at

similar to neuralin 1 AL049176

205200_at

Tetranectin (plasminogen binding protein) NM_003278.1

205743_at

src homology three (SH3) and cysteine rich domain NM_003149.1

200921_s_at

B-cell translocation gene 1, anti-proliferative NM_001731.1

206932_at

cholesterol 25-hydroxylase NM_003956.1

204198_s_at

runt-related transcription factor 3 AA541630

219747_at

hypothetical protein FLJ23191 NM_024574.1

204773_at

Interleukin 11 receptor, alpha NM_004512.1

202465_at

Procollagen C-endopeptidase enhancer NM_002593.2

203706_s_at

Frizzled homolog 7 (Drosophila) NM_003507.1

212736_at

hypothetical gene BC008967 BE299456

214587_at

Collagen, type VIII, alpha 1 BE877796

201645_at

Tenascin C (hexabrachion) NM_002160.1

210239_at

iroquois homeobox protein 5 U90304.1

203903_s_at

Hephaestin NM_014799.1

205816_at

integrin, beta 8 NM_002214.1

203069_at

synaptic vesicle glycoprotein 2 NM_014849.1

213909_at

Homo sapiens cDNA FLJ12280 fis, clone MAMMA1001744 AU147799

206315_at

cytokine receptor-like factor 1 NM_004750.1

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Genes incrementados en células derivadas de Placenta y de Umbilical

ID conjunto pruebas

Nombre de Gen NCBI Número de acceso

204401_at

potassium intermediate/small conductance calciumactivated channel, subfamily N, member 4 NM_002250.1

216331_at

integrin, alpha 7 AK022548.1

209663_s_at

integrin, alpha 7 AF072132.1

213125_at

DKFZP586L151 protein AWO07573

202133_at

transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ) AA081084

206511_s_at

Sine oculis homeobox homolog 2 (Drosophila) NM_016932.1

213435_at

KIAA1034 protein AB028957.1

206115_at

early growth response 3 NM_004430.1

213707_s_at

distal-less homeobox 5 NM_005221.3

218181_s_at

hypothetical protein FLJ20373 NM_017792.1

209160_at

aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II) AB018580.1

213905_x_at

Biglycan AA845258

201261_x_at

Biglycan BC002416.1

202132_at

transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ) AA081084

214701_s_at

fibronectin 1 AJ276395.1

213791_at

Proenkephalin NM_006211.1

205422_s_at

Integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains) NM_004791.1

214927_at

Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1968422 AL359052.1

206070_s_at

EphA3 AF213459.1

212805_at

KIAA0367 protein AB002365.1

219789_at

natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C (atrionatriuretic peptide receptor C) AI628360

219054_at

hypothetical protein FLJ14054 NM_024563.1

213429_at

Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564B222 (from clone DKFZp564B222) AWO25579

204929_s_at

vesicle-associated membrane protein 5 (myobrevin) NM_006634.1

201843_s_at

EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 NM_004105.2

221478_at

BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like AL132665.1

201792_at

AE binding protein 1 NM_001129.2

204570_at

cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 1 (muscle) NM_001864.1

201621_at

neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1 NM_005380.1

202718_at

Insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa NM_000597.1

35

Las Tablas 6-6, 6-7 y 6-8 muestran la elevada expresión de genes en fibroblastos humanos (Tabla 6-6), células ICBM (Tabla 6-7) y MSC (Tabla 6-8).

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 6-6. Genes que tienen expresión elevada en fibroblastos en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.

Genes incrementados en Fibroblastos

dual specificity phosphatase 2

KIAA0527 protein

Homo sapiens cDNA: FLJ23224 fis, clone ADSU02206

dynein, cytoplasmic, intermediate polypeptide 1

ankyrin 3, node of Ranvier (ankyrin G)

inhibin, beta A (activin A, activin AB alpha polypeptide)

ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4 (putative function)

KIAA1053 protein

microtubule-associated protein 1A

zinc finger protein 41

HSPC019 protein

Hobo sapiens cDNA: FLJ23564 fis, clone LNG10773

Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564A072 (from clone DKFZp564A072)

LIM protein (similar to rat protein kinase C-binding enigma)

inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase complex-associated protein

hypothetical protein FLJ22004

Human (clone CTG-A4) mRNA sequence

ESTs, Moderately similar to cytokine receptor-like factor 2; cytokine receptor CRL2 precursor [Homo sapiens]

transforming growth factor, beta 2

hypothetical protein MGC29643

antigen identified by monoclonal antibody MRC OX-2

putative X-linked retinopathy protein

45 Tabla 6-7. Genes que tienen expresión elevada en las células derivadas de ICBM en comparación con las otras líneas celulares ensayadas. 50 Genes Incrementados en Células ICBM

•

cardiac ankyrin repeat protein

•

MHC class I region ORF

•

integrin, alpha 10 55 •hypothetical protein FLJ22362

•

UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 (GalNAc-T3)

•

interferon-induced protein 44

•

SRY (sex determining region Y)-box 9 (campomelic dysplasia, autosomal sex-reversal)

•

keratin associated protein 1-1 60 •hippocalcin-like 1

•

jagged 1 (Alagille syndrome)

•

proteoglycan 1, secretory granule

36

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5

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60

Tabla 10-2. Datos de la reacción de linfocitos mixtos -Línea celular A (cordón umbilical)

Número Analítico

Sistema de Cultura Proliferación de línea de base de receptor Control de la Replicas 1 2 3 Media SD CV

1074 406 391

623.7 390.07 62.5

autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas)

672 510 1402 861.3 475.19 55.2

IM04-2478

MLR alogénico IM04-2477

donante (mitomicina C tratada) MLR con la línea celular

43777 48391 38231 43466.3 5087.12 11.7

(mitomicina C tratada tipo de célula A)

2914 5622 6109 4881.7 1721.36 35.3

SI (donante) SI (línea de célula)

70 8

Proliferación de línea de base de receptor Control de la

530 508 527 521.7 11.93 2.3

autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas)

701 567 1111 793.0 283.43 35.7

IM04-2479

MLR alogénico IM04-2477

donante (mitomicina C tratada) MLR con la línea celular

25593 24732 22707 24344.0 1481.61 6.1

(mitomicina C tratada tipo de célula A)

5086 3932 1497 3505.0 1832.21 52.3

SI (donante) SI (línea de célula)

47 7

Proliferación de línea de base de receptor Control de la

1192 854 1330 1125.3 244.90 21.8

autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas)

2963 993 2197 2051.0 993.08 48.4

IM04-2480

MLR alogénico IM04-2477

donante (mitomicina C tratada) MLR con la línea celular

25416 29721 23757 26298.0 3078.27 11.7

(mitomicina C tratada tipo de célula A)

2596 5076 3426 3699.3 1262.39 34.1

SI (donante) SI (línea de célula)

23 3

45

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Número Analítico

Sistema de Cultura Proliferación de línea de base de receptor Control de la autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas) MLR alogénico IM04-2477 donante (mitomicina C tratada) MLR con la línea celular (mitomicina C tratada tipo de célula A) Réplicas 1 2 3 Media SD CV

IM04-2481

695 451 738 1252 13177 24885 4495 3671 555 464 15444 4674 567.0 818.0 17835.3 4280.0 122.44 400.04 6209.52 534.95 21.6 48.9 34.8 12.5

SI (donante) SI (línea de célula)

31 8

ID Plato: Plato 2

Número Analítico

Sistema de Cultura Proliferación de línea de base de receptor Control de la autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas) MLR alogénico IM04-2477 donante (mitomicina C tratada) MLR con la línea celular (mitomicina C tratada tipo de célula A) Réplicas 1 2 3 Media SD CV

IM04-2482

432 533 1459 633 24286 30823 2762 1502 274 598 31346 6723 413.0 896.7 28818.3 3662.3 130.54 487.31 3933.82 2724.46 31.6 54.3 13.7 74.4

SI (donante) SI (línea de célula)

70 9

IM04-2477 (donante alogénico)

Proliferación de línea de base de receptor Control de la autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas) 312 419 567 604 349 374 360.0 515.0 54.34 123.50 15.1 24.0

Linea de célula tipo A

Proliferación de línea de base de receptor Control de la autoestimulación (mitomicina C tratada células autólogas) 5101 3735 1924 4570 2973 2153 3936.3 2882.3 1078.19 1466.04 27.4 50.9

46

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anticuerpo anti-factor de tejido, las células se incubaron con 20 microgramos/mililitro de CNTO 859 (Centocor, Malvern, PA) durante 30 minutos. Se añadió cloruro de calcio (30 microlitros) a cada pocillo. La placa se sembró inmediatamente en un lector de microplacas de temperatura controlada y se midió la absorbancia a 405 nanómetros a intervalos de 40 segundos durante 30 minutos.

5 Tinción de anticuerpos. Las células se lavaron en PBS y se desprendieron del matraz con tripsina/EDTA (Gibco Carlsbad, CA). Las células se recogieron, se centrifugaron y se resuspendieron en 3 % (v/v) de FBS en PBS a una concentración de células de 1x107 por mililitro. Se añadió anticuerpo a 100 microlitros de suspensión de células según las especificaciones del fabricante. Las células se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4 ºC.

10 Después de la incubación, las células se lavaron con PBS, a continuación se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo sin unir. Las células se resuspendieron en 100 microlitros de 3 % de FBS y se añadió anticuerpo secundario según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4 ºC. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo secundario no unido. Las células lavadas se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se

15 analizaron por citometría de flujo.

Análisis de citometría de flujo. El análisis de citometría de flujo se realizó con un instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

20 Resultados

El análisis de citometría de flujo reveló que las células posparto derivadas del cordón umbilical son menos activas en promover la coagulación del plasma que las células J82. Aunque un ensayo de coagulación del plasma demostró que el factor de tejido presente en las células derivadas del cordón umbilical era activo, la coagulación duró más que

25 con las células J-82, como se prueba por el mayor tiempo hasta la absorbancia al 50 % (T½ hasta el máx; Tabla 111). El T ½ hasta el máx es inversamente proporcional al número de células J-82. Las células derivadas del cordón umbilical disminuyeron la tasa de coagulación como se indica por el T ½ hasta el máx. La coagulación se observó con tanto células sometidas a pases tempranos (P5) como tardíos (P18). La preincubación de células umbilicales con CNTO 859, un anticuerpo para factor de tejido, inhibió la reacción de coagulación estableciendo que el factor de

30 tejido era responsable de la coagulación.

35

40

45

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65

Tabla 11-1. El efecto del factor de tejido humano (Simplastin®) y las células derivadas del cordón umbilical (Umb) sobre la coagulación del plasma. El tiempo hasta la absorbancia al 50 % (T½ hasta el máx.) en la meseta en segundos se usó como unidad de medición.

Estandar (Disolución Simplastin®)

T ½ a máx. (segundos)

1:2

61

1:4

107

1:8

147

1:16

174

1:32

266

1:64

317

1:128

378

0 (control negativo)

1188

Células J-82

100,000

122

50,000

172

25,000

275

Umb P5

50,000

833

Umb P18

50,000

443

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5

15

25

A

B

COND. #

PRE-DIFERENCIACIÓN 2ª ETAPA DIF.

1

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + SHH (200 ng/ml) + F8 (100 ng/ml)

2

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + SHH (200 ng/ml) + F8 (100 ng/ml) + RA (1 micromolar)

3

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + RA (1 micromolar)

4

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml)

5

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Crecimiento Medio

6

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 1B + rhGDF-5 (20 ng/ml)

7

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 1B + BMP7 (20 ng/ml)

8

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 1B + GDNF (20 ng/ml)

9

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 2B + rhGDF-5 (20 ng/ml)

10

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 2B + BMP7 (20 ng/ml)

11

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 2B + GDNF (20 ng/ml)

12

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 3B + rhGDF-5 (20 ng/ml)

13

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 3B + BMP7 (20 ng/ml)

14

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) Condición 3B + GDNF (20 ng/ml)

15

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + rhGDF-5 (20 ng/ml)

16

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + BMP7 (20 ng/ml)

17

NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + GDNF (20 ng/ml)

35 Protocolo de inducción de múltiples factores de crecimiento. Se descongelaron PPDC derivadas del cordón umbilical (P11) y el cultivo se expandió en medio de crecimiento a 5.000 células/cm2 hasta que se alcanzó la subconfluencia (75 %). A continuación, las células se tripsinaron y se sembraron a 2.000 células/cm2, sobre placas de 24 pocillos recubiertas de laminina (BD Biosciences) en presencia de NPE + F (20 nanogramos/mililitro) + E (20 nanogramos/mililitro). Además, algunos pocillos contuvieron NPE + F + E + 2 % de FBS o 10 % de FBS. Después de cuatro días de condiciones de “pre-diferenciación”, se extrajeron todos los medios y las muestras se cambiaron a medio NPE enriquecido con erizo sónico (SHH; 200 nanogramos/mililitro; Sigma, St. Louis, MO), FGF8 (100 nanogramos/mililitro; Peprotech), BDNF (40 nanogramos/mililitro; Sigma), GDNF (20 nanogramos/mililitro; Sigma) y ácido retinoico (1 micromolar; Sigma). Siete días después del cambio de medio, los cultivos se fijaron con 4 %

45 (peso/volumen) de paraformaldehído frío en hielo (4 ºC) (Sigma) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se tiñeron para la expresión de nestina humana, GFAP, TuJ1, desmina y alfa-actina de músculo liso.

Protocolo de co-cultivo de progenitores neurales. Se sembraron progenitores hipocámpicos de rata adulta (062603) como neuroesferas o células individuales (10.000 células/pocillo) sobre placas de 24 pocillos recubiertas de laminina (BD Biosciences) en NPE + F (20 nanogramos/mililitro) + E (20 nanogramos/mililitro).

Se descongelaron las PPDC derivadas del cordón umbilical (P11) y el cultivo se expandió en NPE + F (20 nanogramos/mililitro) + E (20 nanogramos/mililitro) a 5.000 células/cm2 durante un periodo de 48 horas. A continuación, las células se tripsinaron y se sembraron a 2.500 células/pocillo sobre cultivos existentes de

55 progenitores neurales. El medio existente se intercambió por medio fresco. Cuatro días después, los cultivos se fijaron con 4 % (peso/volumen) de paraformaldehído frío en hielo (4 ºC) (Sigma) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se tiñeron para proteína nuclear humana (hNuc, Chemicon) (Tabla 14-1 anteriormente) para identificar PPDC.

Inmunocitoquímica. Se realizó inmunocitoquímica usando los anticuerpos enumerados en la Tabla 14-1. Los cultivos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a una disolución de bloqueo de proteína que contenía PBS, 4 % (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA) y 0,3 % (v/v) de Triton (Triton X100; Sigma) durante 30 minutos para acceder a los antígenos intracelulares. Los anticuerpos primarios, diluidos en disolución de bloqueo, se aplicaron a continuación a los cultivos durante un periodo de 1 hora a temperatura

65 ambiente. Se eliminaron las disoluciones de anticuerpo primario y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de disoluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contenían disolución de

54

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35

Tabla 14-3. Resultados de la tinción para nestina humana, GFAP y TuJ1, respectivamente en el experimento de diferenciación de dos etapas. Obsérvese que + significa que al menos una porción (> 0 %) de las células fueron positivas para la tinción indicada. Nestina humana: citoblastos y células progenitoras neurales inmaduros; GFAP: astrocitos; TuJ1: neuronas inmaduras y maduras.

CONDICIÓN

Fibroblastos Umbilical PPDCs Progenitores Neurales

1

-/-/ -/-/ +/+/+

2

-/-/ -/-/ +/+/+

3

-/-/ -/-/ +/+/+

4

-/-/ -/-/ +/+/+

5

-/-/ -/-/ +/+/+

6

-/-/ -/-/ +/+/+

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-/-/ -/-/ +/+/+

8

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-/-/ -/-/ +/+/+

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-/-/ -/-/ +/+/+

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-/-/ -/-/ +/+/+

Resultados de la inducción de múltiples factores de crecimiento. Tras una exposición de una semana a una

40 variedad de agentes de diferenciación neural, las células se tiñeron para marcadores indicativos de progenitores neurales (nestina humana), neuronas (TuJ1) y astrocitos (GFAP). Las células cultivadas en la primera etapa en medio que no contenía suero tuvieron morfologías diferentes de aquellas células en medio que contenía suero (2 %

o 10 %), que indica posible diferenciación neural. Específicamente, tras un procedimiento de dos etapas de exposición de PPDC umbilicales a EGF y bFGF, seguido de SHH, FGF8, GDNF, BDNF y ácido retinoico, las células

45 mostraron procesos extendidos largos similares a las morfología de astrocitos cultivados. Cuando se incluyeron 2 % de FBS o 10 % de FBS en la primera etapa de diferenciación, aumentó el número de células y la morfología de la célula no cambió de cultivos de control a alta densidad. La posible diferenciación neural no se demostró por análisis inmunocitoquímico para nestina humana, TuJ1 o GFAP.

50 Procedimientos de co-cultivo de progenitores neurales y PPDC. Se sembraron células derivadas del cordón umbilical sobre cultivos de progenitores neurales de rata dos días antes en condiciones de expansión neural (NPE + F + E). Aunque la confirmación visual del cordón umbilical en placa demostró que estas células se sembraron como células individuales, la tinción nuclear específica de ser humano (hNuc) 4 días después de la siembra (duración total del experimento de 6 días) mostró que tendieron a formar una pelota y evitar el contacto con los progenitores

55 neurales. Además, si las células del cordón umbilical se unieron, estas células se extendieron y pareció que estaban inervadas por neuronas diferenciadas que fueron de origen de rata, sugiriendo que las células umbilicales pueden haberse diferenciado en células de músculo. Esta observación se basó en la morfología bajo microscopía de contraste de fases. Otra observación fue que cuerpos de células normalmente grandes (más grandes que los progenitores neurales) poseyeron morfologías que se parecieron a los progenitores neurales, con procesos delgados

60 que abarcaban múltiples direcciones. La tinción con HNuc (encontrada en la mitad del núcleo de la célula) sugirió que en algunos casos estas células humanas pueden haberse fusionado con progenitores de rata y asumido su fenotipo. Los pocillos de control que contenían progenitores neurales solo tuvieron menos progenitores totales y células diferenciadas evidentes que los pocillos de co-cultivo que contenían cordón umbilical, que indica adicionalmente que las células derivadas del cordón umbilical influyeron en la diferenciación y comportamiento de

65 progenitores neurales tanto por la liberación de quimiocinas y citocinas, como por efectos mediados por el contacto.

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Claims (1)

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