ES2642844T3

ES2642844T3 - Composiciones y métodos para inhibir una respuesta inmune adversa en el trasplante de histocompatibilidad que no coinciden

Info

Publication number: ES2642844T3
Application number: ES06840281.7T
Authority: ES
Inventors: Alexander M. Harmon; Janet E. Davis
Original assignee: DePuy Synthes Products Inc
Current assignee: DePuy Synthes Products Inc
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2017-11-20
Anticipated expiration: 2026-12-15
Also published as: CN101374946B; AU2006325710B2; EP1971681A1; CN101374946A; PL1971681T3; JP5289970B2; US9175261B2; US20070264269A1; EP1971681B1; JP2009519978A; WO2007070870A1; AU2006325710A1

Abstract

Una composición celular que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y las células derivadas de ombligo derivadas de cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, para su uso en la inhibición de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, en que dichas células se derivan de tejido del cordón umbilical sustancialmente libre de sangre, son capaces de auto-renovación y expansión en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de al menos un fenotipo neural, en el que las células requieren L-valina para el crecimiento, no producen CD45 y CD 117 y pueden crecer en al menos aproximadamente 5% de oxígeno, y en el que las células comprenden las siguientes características: a) potencial para al menos 40 duplicaciones en cultivo; b) unión y expansión en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina; c) producción de vimentina y actina de músculo liso-alfa; d) producción de CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90; e) expresión de un gen, que, en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal, o una célula de médula ósea de cresta ilíaca, se incrementa para un gen que codifica la interleucina 8 y reticulon 1.

Description

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Composiciones y metodos para inhibir una respuesta inmune adversa en el trasplante de histocompatibilidad que no coinciden

Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

Esta invencion se refiere al campo de la imriunologfa del trasplante. En particular, la invencion se refiere a celulas derivadas de tejido postparto que tiene la capacidad para inhibir una respuesta inmune adversa en el trasplante de tejido entre un donante y el receptor de histocompatibilidad que no coinciden, y metodos para el uso de celulas derivadas de tejido de posparto para evitar el rechazo y evitar injerto contra huesped en un receptor de trasplante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Varias publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artfculos tecnicos y artfculos academicos se citan a lo largo de la memoria descriptiva.

El trasplante de tejido esta indicado para el tratamiento de diversas enfermedades, patologfas y lesiones traumaticas. Aunque miles de trasplantes se realizan cada ano, cerca de 90.000 personas en los Estados Unidos solamente se encuentran en varias listas de espera de trasplante de tejidos y organos. La contribucion a la escasez de tejido para trasplante disponible es la necesidad de sobre-arqueo para la compatibilidad entre el donante y el trasplante al receptor del trasplante.

La compatibilidad de donantes y receptores de trasplantes se deriva principalmente de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que codifica las glucoprotemas que se expresan en la superficie celular. Estas glicoprotemas, denominadas en los seres humanos como antigenos leucocitarios humanos (HLA), desempenan un papel central en la capacidad del sistema inmune para distinguir entre lo propio y no propio. (Thorsby E et al (2004) Transplant Proc 36 (2Suppl): 16S-21S). Hay tres clasificaciones principales de moleculas de HLA, HLA-A, HLA-B y HLA-Dr, un conjunto de las cuales se conoce como un haplotipo. (Bradley B (1991) Immunol Lett 29: 55-59; y, Schreuder GM et al (1999) Tissue Antigens., 54: 490-437). En los seres humanos, un haplotipo se hereda de cada padre.

Cada grupo de moleculas de HLA es altamente polimorfico. (D Turner (2004) Vox Sang 87 Suppll: 87-90). Como tal, existe una gran variabilidad de la expresion de HLA, incluso entre hermanos. (Jeras M (2002) Transpl Immunol. 10: 205-14). Esta alta variabilidad de la expresion de HLA es problematica para fines de trasplante, como cualquier desfase de HLA entre el donante y el receptor de transplante facilitara el rechazo del tejido trasplantado. (Petersdorf EW (2004) Curr Op Hematol 11: 386-391).

Otro problema derivado de HLA no coincidente es la enfermedad de injerto contra huesped (EICH). GVHD se presenta tfpicamente en casos en que el tejido injertado contiene celulas inmunocompetentes que pueden atacar los tejidos del huesped trasplante. El trasplante de medula osea (BMT) y el trasplante de celulas madre hematopoyeticas (HSCT) son particularmente problematicas a este respecto, ya que tfpicamente comprenden y pueden generar celulas inmunocompetentes. (Iwasaki T (2004) Clin Med Res 2: 243-252).

BMT y TPH estan indicados para diversas enfermedades de la sangre y trastornos del sistema inmune, aunque TPH es cada vez mas el metodo preferido. Sin embargo, uno de los impedimentos para la supervivencia y la salud general de los pacientes TPH es EICH y las complicaciones relacionadas. (Morishima Y et al (2002) Blood 99: 4200-4206). la compatibilidad HLA desempena un papel importante en el fracaso del injerto o la supervivencia, y si el receptor del trasplante esta en riesgo de desarrollar EICH. (Davies SM (2000) Blood 96: 4096-41002, y, Dickinson AM et al (2005) Curr Opin Immunol 17: 517-525).

Le Blanc et al. (2004) Lancet 363 (9419): 1439-1441 describe el tratamiento de la grave enfermedad aguda de injerto contra huesped con celulas madre mesenquimales haploidentico de terceros.

Carter et al. (2005) Blood 106 (11; parte 2): 160B describe la caracterizacion de celulas madre mesenquimales potenciales (MSC) para tratar GVHD utilizando marcadores moleculares ligados a la inmunosupresion mediada por MSC in vitro.

Li et al. (2005) Cell Research 15 (7): 539-547, describe celulas madre mesenquimales derivadas de placenta humana que suprimen la proliferacion de linfocitos de sangre de cordon umbilical alogenico.

WO 2005/001078 describe la regeneracion y reparacion de tejido neural utilizando celulas posparto derivadas.

Romanov y col. (2003) Stem Cells 21 (1): 105-110, describe la busqueda de fuentes alternativas de

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celulas madre mesenquimatosas humanas postnatales.

Zhang et al. (2004) Chinese Medical Journal 117 (6): 882-887, describe una comparacion de las celulas madre mesenquimales de la placenta humana y la medula osea.

Panepucci et al. (2004) Stem Cells 22 (7): 1263-1278 describe una comparacion de la expresion genica de la vena del cordon umbilical y las celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea.

Para evitar la EICH y rechazo de los tejidos trasplantados, los receptores de trasplante deben soportar una vida de regfmenes de tratamiento inmunosupresor. Muchos medicamentos anti-rechazo causan efectos secundarios graves en el paciente trasplantado, y sus efectos inmunosupresores pueden dejar al paciente vulnerable a las infecciones oportunistas y ciertos tipos de cancer. Por lo tanto, un avance significativo en el trasplante de tejido sena el de proporcionar un medio para inhibir las respuestas inmunes adversas en el receptor del trasplante como GVHD y el rechazo del tejido trasplantado con efectos secundarios menos graves y complicaciones, y sin la inmunosupresion sistemica de los metodos tradicionales.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invencion proporciona una composicion de celulas que comprende un vehuculo farmaceuticamente aceptable y celulas derivadas del ombligo derivadas de cordon umbilical humano sustancialmente libre de sangre, para uso en la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es no coincidente por histocompatibilidad para el donante del trasplante, en el que dicha celulas se derivan de tejido del cordon umbilical sustancialmente libre de sangre, son capaces de auto-renovacion y expansion en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo neural, en el que las celulas requieren L-valina para el crecimiento, no producen CD45 y CD117 y pueden crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno, y en el que las celulas comprenden las siguientes caractensticas:

a) potencial de por lo menos 40 duplicaciones en cultivo;

b) union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina;

c) produccion de vimentina y actina de musculo alfa liso;

d) la produccion de CD10, CD 13, CD44, CD73 y CD90;

e) expresion de un gen, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o celulas de medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para un gen que codifica la interleucina 8 y reticulon 1.

La invencion proporciona ademas una composicion que comprende una matriz extracelular que contiene celulas derivadas de ombligo, para el uso en la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante, en donde las celulas derivadas de ombligo se derivan de cordon umbilical humano tejido sustancialmente libre de sangre y son capaces de auto- renovacion y expansion en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo neural, en el que las celulas requieren L-valina para el crecimiento, no producen CD45 y CD117 y pueden crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno, y en el que las celulas comprenden las siguientes caractensticas:

a) potencial de por lo menos 40 duplicaciones en cultivo;

b) union y la expansion en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina;

c) produccion de vimentina y actina de musculo alfa liso;

d) produccion de CD10, CD 13, CD44, CD73 y CD90;

e) expresion de un gen, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o celulas de medula osea de cresta ilfaca, se incrementan para un gen que codifica la interleucina 8 y reticulon 1.

La invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante, que comprende un vehfculo capaz farmaceuticamente aceptable y una cantidad de las celulas derivadas de ombligo de la invencion o una composicion de la invencion eficaz para inhibir la respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante.

Un aspecto de la divulgacion presenta el metodo para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante. El metodo comprende la administracion de una composicion celular para el receptor del trasplante en una cantidad eficaz para inhibir la respuesta inmune adversa, en el que la composicion celular comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y

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las celulas derivadas posparto derivadas de tejido despues del parto humano sustancialmente libre de sangre, dichas celulas siendo capaces de dicha de auto-renovacion y expansion en cultivo, en las que las celulas requieren L-valina para el crecimiento y son capaces de crecer en una atmosfera que contiene oxfgeno de aproximadamente 5% a al menos aproximadamente 20%, y en el que las celulas comprenden al menos una de las siguientes caractensticas: (a) potencial de por lo menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo; (b) de union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina; (c) produccion de al menos uno de factor tisular, vimentina y actina de musculo liso-alfa; (d) produccion de al menos uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, C; (e) la falta de produccion de al menos uno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, y HLA-DR, DP, DQ, detectada por citometna de flujo; (f) la expresion de al menos uno de interleucina 8; reticulon 1; quimiocina (motivo C-X-C) ligando 1 (actividad estimuladora de crecimiento de melanoma, alfa); quimiocina (motivo C-X-C) ligando 6 (granulocitos de protema quimiotactica 2); quimiocina (motivo C-X-C) ligando 3; y el factor de necrosis tumoral, protema inducida por alfa 3; (g) la expresion de al menos uno de tipo C (dependientes de calcio, dominio de reconocimiento de hidratos de carbono) lectina, miembro de la superfamilia 2 (inducida por activacion); tumor de Wilms 1; familia de deshidrogenasa de aldehudo 1, miembro A2; y renina; receptor de lipoprotemas de baja densidad oxidadas (lectina) 1; Homo sapiens, clon IMAGEN: 4179671, ARNm, cds parcial; quinasa de protema C, zeta; protema hipotetica DKFZp564F013; cancer de ovario 1 regulado hacia abajo; ARNm de homo sapiens; y ADNc DKFZp547K1113 (del clon DKFZp547K1113); (h) la expresion de un gen, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se reduce para al menos uno de: homeobox de estatura corta 2; protema de choque termico 27 kDa 2; quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 12 (estroma por celulas derivadas del factor 1); elastina (estenosis aortica supravalvular, smdrome de Williams-Beuren); ARNm de homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (a partir del clon DKFZp586M2022); homeobox de mesenquima 2 (homeobox espedfico de detencion de crecimiento); homologo de homeobox sine oculis 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado de la morfogenesis 2; protema DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (protema de union del plasminogeno); homologfa src tres (SH3) y dominio rico en cistema; gen de translocacion de celulas B 1, anti-proliferativa; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripcion relacionado con runt-3; protema hipotetica FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de procolageno C- endopeptidasa; homologo rizado 7 (Drosophila); gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabrachion); protema homeobox Iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoprotema de vesmula sinaptica 2; ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor de receptor de citoquina 1; canales de calcio activados/pequena conductancia intermedia de potasio, subfamilia N, miembro 4; integrina, alfa 7; protema DKFZP586L151; co-activador transcripcional con motivo de union a PDZ-(TAZ); homeobox de homologo sine oculis 2 (Drosophila); protema KIAA1034; respuesta de crecimiento temprano 3; homeobox distal 5; protema hipotetica FLJ20373; familia de reductasa de aldo-ceto 1, miembro de C3 (deshidrogenasa de hidroxiesteroide 3-alfa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, similar a beta 1 (con dominios de repeticion similar a EGF); ARNm de homo sapiens de longitud completa de ADNc inserto del clon Euroimage 1968422; EphA3; protema KIAA0367; receptor del peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (receptor de peptido atrionatriuretico C); protema hipotetica FLJ14054; ARNm de homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (a partir del clon DKFZp564B222); protema asociada a vesmulas de membrana 5 (miobrevina); EGF que contiene protema de la matriz extracelular de tipo fibulina 1; BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protema de interaccion 3; AE protema de union 1; citocromo c oxidasa subunidad VIIa polipeptido 1 (musculo); neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protema de union del factor de crecimiento similar a la insulina 2, 36 kDa; (I) la secrecion de al menos una de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB- EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES, y TIMP1; y (j) la falta de secrecion de al menos una de TGF-beta2, ANG2, PDGFBB, MIP1b, I309, MDC, y VEGF, como se detecta por ELISA.

En algunas realizaciones, la respuesta inmune adversa es injerto contra enfermedad de huesped, mientras que en otras realizaciones, la respuesta inmune adversa es el rechazo del tejido trasplantado. Las celulas derivadas tras del parto podran ser celulas derivadas de placenta, celulas derivadas de ombligo, o una combinacion de celulas derivadas de la placenta y celulas derivadas del ombligo. En diversas realizaciones, la composicion de celulas se administra por inyeccion o infusion, o se puede administrar por implantacion de un dispositivo, andamio o matriz implantada en el receptor del trasplante.

En algunas realizaciones, la composicion de celulas comprende al menos aproximadamente 50% de celulas derivadas posparto. En otras realizaciones, la composicion de celulas comprende una poblacion sustancialmente homogenea de celulas derivadas posparto. En ciertas realizaciones, las celulas se administran con al menos otro tipo de celula. El otro tipo de celula se puede administrar simultaneamente con, o antes, o despues de las celulas derivadas posparto. En ciertas realizaciones, las celulas se administran con al menos otro agente para el tratamiento de la respuesta inmune adversa. El otro agente se puede administrar simultaneamente con, o antes, o despues de las celulas derivadas posparto. El otro agente puede incluir uno o mas de un agente antitrombogenico, un agente anti-inflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador o un agente antiapoptotico.

Otro aspecto de la invencion presenta una composicion farmaceutica para la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante, que comprende un vehmulo farmaceuticamente aceptable y una cantidad de las celulas derivadas posparto descritas anteriormente eficaces para inhibir la respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que

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es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante.

En algunas realizaciones, la respuesta immune adversa es injerto contra enfermedad de huesped, mientras que en otras realizaciones, la respuesta immune adversa es el rechazo del tejido trasplantado. Las celulas derivadas pospartos podran ser celulas derivadas de placenta, celulas derivadas de ombligo, o una combinacion de celulas derivadas de la placenta y celulas derivadas del ombligo. En diversas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula para administracion por inyeccion o infusion, o se puede formular para la administracion por implantacion de un dispositivo, andamio o matriz implantada en el receptor del trasplante.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende al menos aproximadamente 50% de celulas derivadas posparto. En otras formas de realizacion, que comprende una poblacion sustancialmente homogenea de celulas derivadas posparto. En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende al menos otro tipo de celula o al menos otro agente para el tratamiento de la respuesta inmune adversa. El otro agente puede incluir mas de un agente antitrombogenico, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador o un agente antiapoptotico.

Otro aspecto de la invencion presenta un kit para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad-coincidente para el donante del trasplante, que comprende un vehnculo farmaceuticamente aceptable, una poblacion emergente de las celulas posparto derivadas descritas anteriormente, y las instrucciones para el uso del kit en un metodo para inhibir la respuesta inmune adversa. El kit tambien puede incluir uno o mas de al menos un reactivo e instrucciones para el cultivo de las celulas derivadas posparto, o al menos otro tipo de celula, o al menos otro agente para inhibir la respuesta inmune adversa.

Otro aspecto de la divulgacion presenta un metodo para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, que comprende administrar al paciente una composicion que comprende uno o mas de un medio acondicionado generado por las celulas derivadas posparto descritas anteriormente, un lisado celular generado a partir de las celulas derivadas posparto descritas anteriormente, una fraccion celular soluble generada a partir de las se ha celulas derivadas posparto descritas anteriormente, o una matriz extracelular que contiene las celulas derivadas posparto anteriormente descritas.

Aun otro aspecto de la invencion caracteriza la composicion farmaceutica para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, que comprende un vehnculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad de la matriz extracelular antes mencionada eficaz para inhibir la respuesta inmunitaria adversa en un receptor de trasplante que es histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante.

Todavfa otro aspecto de la invencion presenta un kit para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, que comprende un vehnculo farmaceuticamente aceptable, composicion descrita anteriormente que comprende una matriz extracelular de las celulas derivadas posparto, e instrucciones para usar el kit en un metodo para inhibir la respuesta inmune adversa.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion se entenderan a partir de los dibujos, descripcion detallada y ejemplos que siguen.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Grafico de barras que muestra los resultados de reaccion mixta de linfocitos de dos vfas (MLR) con

celulas derivadas de placenta tratadas con IFN© de terceros en placas de fondo redondo.

Figura 2. Grafico de barras que muestra resultados de reaccion mixta de linfocitos de dos vfas (MLR) con celulas derivadas de la placenta no tratadas en placas de fondo redondo.

Figura 3. Grafico de barras que muestra los resultados de reaccion mixta de linfocitos de dos vfas (MLR) con

celulas derivadas de ombligo tratadas con IFN© de terceros en placas de fondo redondo.

Figura 4. Grafico de barras que muestra resultados de reaccion mixta de linfocitos de dos vfas (MLR) con celulas derivadas de ombligo no tratadas en placas de fondo redondo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Varios terminos relacionados con los metodos y otros aspectos de la presente invencion se utilizan en toda la memoria y las reivindicaciones. Tales terminos deben ser dados su significado ordinario en la tecnica a menos que se indique lo contrario. Otros terminos definidos espedficamente deben interpretarse de un modo consistente con la definicion proporcionada en este documento.

Las siguientes abreviaturas se pueden usar en la memoria descriptiva y los ejemplos: ppdc, celulas derivadas posparto; UDC, celulas derivadas de ombligo; PDC, celulas derivadas de placenta; MHC, complejo

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principal de histocompatibilidad; HLA, antigeno de leucocitos humanos; BMT, trasplante de medula osea; TPH, trasplante hematopoyetico de celulas madre; GVHD, enfermedad de injerto contra huesped;

Las celulas madre son celulas indiferenciadas definidas por la capacidad de una sola celula tanto de auto- renovacion como para diferenciar para producir celulas de la progenie, incluyendo progenitores de auto-renovacion, progenitores de no renovacion, y celulas diferenciadas terminalmente. Las celulas madre tambien se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en celulas funcionales de diversos linajes celulares de multiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), asf como para dar lugar a tejidos de multiples capas germinales tras el trasplante, y de contribuir sustancialmente para la mayona, si no todos, los tejidos despues de la inyeccion en blastocistos.

Las celulas madre se clasifican de acuerdo con su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes; (2) pluripotentes; (3) tienda de campana multipolar; (4) oligopotentes; y (5) unipotentes. Celulas totipotentes son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias y extraembrionarias. Celulas pluripotentes son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias. Celulas multipotentes incluyen aquellas capaces de dar lugar a un subconjunto de los linajes de celulas, pero todos dentro de un tejido, organo o sistema fisiologico particular (por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas (HSC) pueden producir una progenie que incluyen HSC (auto-renovacion), progenitores oligopotentes de celulas sangumeas restringidas, y todos los tipos de celulas y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre). Las celulas que son oligopotentes pueden dar lugar a un subconjunto mas restringido de linajes de celulas que las celulas madre multipotentes; y las celulas que son unipotentes son capaces de dar lugar a un unico linaje celular (por ejemplo, celulas madre de espermatogenesis).

Las celulas madre tambien se clasifican sobre la base de la fuente de la que se pueden obtener. Una celula madre adulta es generalmente una celula indiferenciada multipotente que se encuentra en el tejido que comprende multiples tipos de celulas diferenciadas. La celula madre adulta puede renovarse. En circunstancias normales, tambien puede diferenciarse para obtener los tipos de celulas especializadas del tejido del que se origino, y posiblemente otros tipos de tejidos. Una celula madre embrionaria es una celula pluripotente de la masa celular interna de un embrion en fase de blastocisto. Una celula madre fetal es una que se origina a partir de tejidos o membranas fetales. Una celula madre despues del parto es una celula multipotente o pluripotente que se origina sustancialmente a partir de tejido extraembrionario disponible despues del nacimiento, a saber, la placenta y el cordon umbilical. Han encontrado que estas celulas poseen rasgos caractensticos de las celulas madre pluripotentes, incluyendo la rapida proliferacion y el potencial de diferenciacion en muchos linajes celulares. Celulas madre posparto pueden ser derivadas de sangre (por ejemplo, como lo son las obtenidos a partir de sangre de cordon umbilical) o derivadas no de sangre (por ejemplo, tal como se obtiene a partir de los tejidos no de sangre del cordon umbilical y la placenta).

Tejido embrionario se define tfpicamente como tejido originario del embrion (que en los seres humanos se refiere al penodo desde la fertilizacion hasta alrededor de seis semanas de desarrollo. Tejido fetal se refiere al tejido procedente del feto, que en los seres humanos se refiere al penodo de aproximadamente seis semanas de desarrollo a parto. El tejido extraembrionario es tejido asociado con, pero no se origina en, el embrion o el feto. Tejidos extraembrionarios incluyen membranas extraembrionarias (corion, amnios, saco vitelino y alantoides), cordon umbilical y la placenta (que en sf se forma a partir del corion y la basalis decidua materna).

Diferenciacion es el proceso por el cual una celula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las caractensticas de una celula especializada, como por ejemplo una celula nerviosa o una celula muscular, por ejemplo. Una celula diferenciada es una que se ha llevado en una posicion mas especializada ("comprometida") dentro del linaje de una celula. El termino cometido, cuando se aplica al proceso de diferenciacion, se refiere a una celula que ha procedido en la via de diferenciacion a un punto en el que, en circunstancias normales, continuara para diferenciarse en un tipo celular espedfico o un subconjunto de tipos de celulas, y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de celula diferente o volver a un tipo de celulas menos diferenciadas. De-diferenciacion se refiere al proceso por el cual una celula vuelve a una posicion menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una celula. Tal como se usa en el presente documento, el linaje de una celula define la herencia de la celula, es decir, de cuales celulas vema y a que celulas puede dar lugar. El linaje de una celula coloca la celula dentro de un esquema hereditario del desarrollo y la diferenciacion.

En un sentido amplio, una celula progenitora es una celula que tiene la capacidad de crear una progenie que esta mas diferenciada, y sin embargo, conserva la capacidad para reponer el deposito de los progenitores. Segun esta definicion, las celulas progenitoras mismas tambien son celulas madre, que son los precursores mas inmediatos a las celulas terminalmente diferenciadas. Cuando se hace referencia a las celulas de la presente invencion, como se describe en mayor detalle a continuacion, esta amplia definicion de celulas progenitoras se puede utilizar. En un sentido mas estricto, una celula progenitora se define a menudo como una celula que es intermedia en la via de diferenciacion, es decir, que surge de una celula madre y es intermedia en la produccion de un tipo de celula madura o subconjunto de tipos de celulas. Este tipo de celulas progenitoras en general, no es capaz de auto-renovacion. Por consiguiente, si este tipo de celula se denomina en el presente documento, se refiere como una celula progenitora no renovadora o como un progenitor intermedio o celula precursora.

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El termino inhibicion se refiere a una reduccion de los eventos inmunologicos adversos observados en la respuesta inmune adaptativa de tejido trasplantado donante contra el receptor del trasplante, enfermedad de injerto contra huesped, asf como la respuesta inmune adaptativa del receptor del trasplante contra el tejido donante trasplantado.

Las celulas de la presente invencion se denominan generalmente como celulas posparto o celulas derivadas posparto (PPDCs). Tambien pueden a veces ser denominadas mas espedficamente como celulas derivadas del ombligo (UDC) de la invencion o celulas derivadas de la placenta (PDC) de la descripcion. El PPDC de la invencion son celulas derivadas del ombligo. Ademas, las celulas pueden ser descritas como celulas madre o progenitoras, este ultimo termino se utiliza en el sentido amplio. El termino derivado se usa para indicar que las celulas se han obtenido a partir de su fuente biologica y cultivadas o de otra manera manipulada in vitro (por ejemplo, se cultivan en un medio de crecimiento para expandir la poblacion y/o para producir una lmea celular). Las manipulaciones in vitro de celulas madre umbilicales y las caractensticas unicas de las celulas derivadas del ombligo de la presente invencion se describen en detalle a continuacion.

Varios terminos se utilizan para describir las celulas en cultivo. Cultivo celular generalmente se refiere a celulas extrafdas de un organismo vivo y cultivadas bajo condiciones controladas ("en cultivo" o "cultivado"). Un cultivo de celulas primarias es un cultivo de celulas, tejidos u organos tomados directamente de un organismo antes del primer subcultivo. Las celulas se expandieron en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o la division celular, lo que resulta en una mayor poblacion de las celulas. Cuando las celulas se expanden en cultivo, la tasa de proliferacion de las celulas a veces se mide por la cantidad de tiempo necesario para que las celulas se duplican en numero. Esto se conoce como tiempo de duplicacion.

Una lmea celular es una poblacion de celulas formadas por uno o mas subcultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de subcultivo se conoce como un pasaje. Cuando se subcultivan las celulas, se dice que se han pasajeado. Una poblacion espedfica de celulas, o una lmea celular, se refiere a veces o se caracteriza por el numero de veces que se ha pasajeado. Por ejemplo, una poblacion de celulas cultivadas que se han pasajeado diez veces puede ser denominada como un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo siguiendo el aislamiento de celulas a partir de tejido, se designa P0. Tras el primer subcultivo, las celulas se describen como un cultivo secundario (P1 o paso 1). Despues del segundo subcultivo, las celulas se vuelven un cultivo terciario (P2 o paso 2), y asf sucesivamente. Se entendera por los expertos en la tecnica que puede haber muchas duplicaciones de la poblacion durante el penodo de pases; por lo tanto el numero de duplicaciones de la poblacion de un cultivo es mayor que el numero de pases. La expansion de las celulas (es decir, el numero de duplicaciones de la poblacion) durante el penodo entre pases depende de muchos factores, incluyendo pero no limitada a la densidad de siembra, sustrato, medio, condiciones de crecimiento, y tiempo entre los pases.

Un medio acondicionado es un medio en el que una celula espedfica o poblacion de celulas se ha cultivado, y luego se retira. Cuando las celulas se cultivan en un medio, que pueden secretar factores celulares que pueden proporcionar soporte trofico a otras celulas. Tales factores troficos incluyen, pero no estan limitados a hormonas, citoquinas, matriz extracelular (ECM), protemas, vesmulas, anticuerpos, y granulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio condicionado.

Medio de crecimiento generalmente se refiere a un medio suficiente para el cultivo de PPDCs. En particular, un medio actualmente preferido para el cultivo de las celulas de la invencion comprende Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (tambien conocido como Medio Esencial Mmimo de Dulbecco) (DMEM). Particularmente preferido es DMEM-baja glucosa (tambien DMEM-LG en este documento) (Invitrogen, Carlsbad, CA). El DMEM-baja glucosa se complementa preferiblemente con 15% (v/v) de suero bovino fetal (por ejemplo, suero bovino fetal definido, Hyclone, Logan UT), antibioticos y antimicoticos (preferiblemente, 50-100 unidades/penicilina mililitro, 50-100 microgramos/mililitro de estreptomicina y 0-0,25 microgramos/mililitro de anfotericina B; Invitrogen, Carlsbad, CA), y 0,001% (v/v) 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis MO).

El termino condiciones de crecimiento estandar se refiere al cultivo de celulas a 37°C, en una atmosfera humidificada estandar que comprende 5% de CO2. Mientras que tales condiciones son utiles para el cultivo, es de entenderse que tales condiciones son capaces de ser variadas por el experto en la materia que apreciaran las opciones disponibles en la tecnica para el cultivo de celulas.

Generalmente, un factor trofico se define como una sustancia que promueve la supervivencia, el crecimiento, la proliferacion y/o la maduracion de una celula, o estimula el aumento de la actividad de una celula.

Cuando se hace referencia a las celulas de vertebrados en cultivo, el termino senescencia (tambien senescencia replicativa o senescencia celular) se refiere a una propiedad atribuible a los cultivos celulares finitos; a saber, su incapacidad para crecer mas alla de un numero finito de duplicaciones de la poblacion (a veces conocido como lfmite de Hayflick). Aunque la senescencia celular fue descrita por primera vez el uso de celulas similares a fibroblastos, la mayona de tipos de celulas humanas normales que se pueden cultivar con exito en el cultivo se someten a la senescencia celular. La vida util in vitro de diferentes tipos de celulas vana, pero la vida util maxima es tfpicamente menos de 100 duplicaciones de la poblacion (este es el numero de duplicaciones para todas las celulas

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en el cultivo para convertirse en senescente y por lo tanto hacer que el cultivo sea incapaz de dividirse). Senescencia no depende de tiempo cronologico, sino que se mide por el numero de divisiones celulares o duplicaciones de la poblacion, de las que el cultivo ha sido objeto. Asf, las celulas se hicieron quiescentes mediante la eliminacion de los factores de crecimiento esenciales capaces de reanudar el crecimiento y la division cuando se reintroducen los factores de crecimiento, y despues de ello llevar a cabo el mismo numero de duplicaciones como celulas equivalentes cultivadas continuamente. Del mismo modo, cuando las celulas se congelan en nitrogeno lfquido despues de varios numeros de duplicaciones de la poblacion y luego se descongelan y se cultivan, se someten a sustancialmente el mismo numero de duplicaciones como celulas mantenidas sin congelar en cultivo. Las celulas senescentes no son celulas muertas o moribundas; en realidad son resistentes a la muerte celular programada (apoptosis), y se han mantenido en su estado no se dividen durante hasta tres anos. Estas celulas son muy vivas y metabolicamente activas, pero no se dividen. El estado que no divide de celulas senescentes todavfa no se han mostrado reversibles por cualquier agente biologico, qmmico, o viral.

La cantidad eficaz se refiere a una concentracion o cantidad de un compuesto, material o composicion, tal como se describe en el presente documento que es eficaz para lograr un resultado biologico particular. Tales resultados incluyen, pero no se limitan a, la inhibicion de la respuesta adaptativa inmune del tejido del donante trasplantado contra el receptor del trasplante, asf como la respuesta inmune adaptativa del receptor del trasplante contra el tejido donante trasplantado, la inhibicion del injerto contra enfermedad de huesped, y la inhibicion del rechazo del trasplante. Dicha actividad eficaz puede conseguirse, por ejemplo, mediante la administracion de las celulas y/o composiciones de la presente invencion para el receptor. Con respecto a PPDCs como se administran a un paciente in vivo, una cantidad eficaz puede variar desde tan pocos como varios cientos o menos de varios millones o mas. En realizaciones espedficas, una cantidad eficaz puede variar de 103-1011, Mas concretamente al menos aproximadamente 104 celulas. Se apreciara que el numero de celulas a administrar variara dependiendo de las caractensticas espedficas del trastorno a tratar, incluyendo, pero no limitado al tamano o area total de volumen/superficie a tratar, asf como la proximidad del sitio de administracion a la localizacion de la region a tratar, entre otros factores familiares para el experto en la materia.

Los terminos penodo efectivo (o tiempo) y condiciones eficaces se refieren a un penodo de tiempo o de otras condiciones controlables (por ejemplo, temperatura, humedad para metodos in vitro), necesario o preferido para un agente o composicion farmaceutica para lograr su resultado deseado.

Inmunidad adaptativa o respuesta inmune adaptativa se utilizan intercambiablemente y en un sentido amplio en el presente documento, y se refieren a la respuesta inmune a la exposicion al antfgeno, incluyendo el desarrollo de memoria inmunologica. La respuesta inmune adaptativa incluye, sin limitacion, humoral y la inmunidad celular.

Inmunidad humoral o respuesta inmune humoral se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a la produccion de moleculas de inmunoglobulina en respuesta a un desaffo de antfgeno.

Inmunidad celular o respuesta inmune celular o inmunidad mediada por celulas se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a la produccion, la activacion y/o proliferacion de linfocitos T citotoxicos o auxiliares, celulas mononucleares y citoquinas en respuesta a un desaffo de antfgeno. El termino abarca toda inmunidad adaptativa que no puede ser transferida a un destinatario naive con anticuerpos.

Inmunidad innata se refiere a los mecanismos no espedficos del cuerpo para la resistencia a la exposicion al antfgeno que no se ha mejorado tras el reto posterior con un antfgeno particular.

El termino paciente o sujeto se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a animales, incluyendo mairnferos, y preferiblemente seres humanos, que son tratados con las composiciones farmaceuticas o de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento.

Los terminos donante o donante de trasplante se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a un organismo cualquier que es la fuente de celulas o tejidos a ser trasplantados en otro organismo. El termino destinatario o receptor del trasplante o paciente del trasplante se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a cualquier organismo que recibe tejido trasplantado de un donante.

Desajuste de histocompatibilidad se refiere a las diferencias en los antfgenos de histocompatibilidad entre el donante de trasplante y receptor de trasplante que pueden provocar una respuesta inmune por las celulas o tejido contra los tejidos del receptor del trasplante trasplantado, pueden provocar una respuesta inmune por el receptor del trasplante contra las celulas o tejidos trasplantados, y/o puede resultar en el rechazo de tejido trasplantado o injerto contra enfermedad de huesped.

Rechazo se refiere a cualquier respuesta inmune contra las celulas trasplantadas o tejidos que pueden resultar en un crecimiento disminuido o vitalidad del trasplante, o el fracaso del transplante para sobrevivir.

Enfermedad de injerto contra huesped (GVHD) se utiliza en un sentido amplio en el presente documento, y

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se refiere a cualquier respuesta immune por las celulas o tejidos de un donante de trasplante contra las celulas o tejidos del receptor de trasplante, independientemente de la gravedad o duracion de la respuesta e independientemente de si el trasplante destinatario manifiesta smtomas clmicos de la EICH reconocidos en la tecnica.

El termino velmculo farmaceuticamente aceptable (o medio), que puede ser utilizado indistintamente con el termino portador o medio biologicamente compatible, que se refiere a las formas reactivas, celulas, compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificacion que no solo son compatibles con las celulas y otros agentes que se administran terapeuticamente, sino tambien son, dentro del alcance del juicio medico, adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otra complicacion acorde con una relacion razonable de beneficio/radio de riesgo. Como se describe en mayor detalle en el presente documento, los vehfculos farmaceuticamente aceptables adecuados para su uso en la presente invencion incluyen lfquidos, materiales semi-solidos (por ejemplo, geles) y solidos (por ejemplo, andamios celulares y matrices, hojas, tubos y otros materiales tales como conocidos en la tecnica y se describen en mayor detalle en este documento). Estos materiales semi-solidos y solidos pueden ser disenados para resistir la degradacion dentro del cuerpo (no biodegradable) o pueden ser disenados para degradarse dentro del cuerpo (biodegradable, bioerosionable). Un material biodegradable puede ser ademas biorreabsorbible o bioabsorbible, es decir, se puede disolver y se absorbe en los fluidos corporales (implantes solubles en agua son un ejemplo), o degradados y, finalmente, eliminados del cuerpo, ya sea por conversion en otros materiales o descomposicion y eliminacion a traves de vfas naturales.

Varios terminos se utilizan aqu con respecto a la celula o tejido. Los terminos de transferencia de autologo, trasplante autologo, de autoinjerto y similares se refieren al trasplante en el que el donante de trasplante es tambien el receptor del trasplante. Los terminos de transferencia alogenica, el trasplante alogenico, aloinjertos y similares se refieren al trasplante en el que el donante de trasplante es de la misma especie que el receptor del trasplante, pero no es el mismo individuo. Un trasplante de celulas en la que celulas y del donante han sido histocompatibilidad emparejada con un receptor se refiere a veces como una transferencia singenica. Los terminos transferencia xenogenica, trasplante xenogenico, xenoinjerto y similares se refieren al trasplante en el que el donante de trasplante es de una especie diferente que el receptor del trasplante.

De acuerdo con los metodos descritos en el presente documento, una placenta de mairnferos y el cordon umbilical se recuperan en o poco despues de la terminacion de cualquiera de un plazo completo o el embarazo antes de termino, por ejemplo, despues de la expulsion despues del nacimiento. El tejido despues del parto puede ser transportado desde el sitio a luz a un laboratorio en un recipiente esteril, tal como un frasco, vaso de precipitados, placa de cultivo, o un bolso. El recipiente puede tener una solucion o medio, incluyendo, pero no limitado a una solucion de sal, tal como, por ejemplo, de Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, tambien denominado como medio esencial mmimo de Dulbecco) o tampon de fosfato salino (PBS), o cualquier solucion utilizada para el transporte de organos utilizados para trasplantes, tales como solucion de la Universidad de Wisconsin o solucion perfluoroqmmica. Uno o mas agentes antibioticos y/o antimicoticos, tales como pero no limitados a la penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, pueden anadirse al medio o tampon. El tejido despues del parto se puede enjuagar con una solucion anticoagulante tal como una solucion que contiene heparina. Es preferible mantener el tejido en alrededor de 4-10°C antes de la extraccion de PPDCs. Es aun mas preferible que el tejido no se congelara antes de la extraccion de PPDCs.

El aislamiento de PPDC tiene lugar preferiblemente en un ambiente aseptico. El cordon umbilical se puede separar de la placenta por medios conocidos en la tecnica. Alternativamente, el cordon umbilical y la placenta se utilizan sin separacion. La sangre y los desechos se eliminan preferiblemente del tejido despues del parto antes de PPDC de aislamiento. Por ejemplo, el tejido despues del parto se puede lavar con una solucion de tampon, tal como pero no limitado a salina tamponada con fosfato. El tampon de lavado puede comprender tambien uno o mas agentes antimicoticos y/o antibioticos, tales como, pero no limitado a la penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina.

Tejido postparto que comprende toda una placenta o un fragmento o seccion del mismo se desglosa por fuerza mecanica (fuerzas de picado o cizallamiento). En una realizacion actualmente preferida, el procedimiento de aislamiento tambien utiliza un proceso de digestion enzimatica. Muchas enzimas son conocidas en la tecnica por ser utiles para el aislamiento de celulas individuales a partir de matrices de tejidos complejos para facilitar el crecimiento en cultivo. Van desde debilmente digestivos (por ejemplo, desoxirribonucleasas y la proteasa neutra, dispasa) fuertemente digestivos (por ejemplo, papama y tripsina), tales enzimas estan disponibles comercialmente. Una lista no exhaustiva de enzimas compatibles adjuntas incluye actividades mucoltticas enzimaticas, metaloproteasas, proteasas neutras, proteasas de serina (tales como tripsina, quimotripsina, o elastasa), y desoxirribonucleasas. Actualmente se prefieren las actividades enzimaticas seleccionadas de metaloproteasas, proteasas neutras y actividades mucolfticas. Por ejemplo, colagenasas son conocidas por ser utiles para aislar diversas celulas de los tejidos. Desoxirribonucleasas pueden digerir el ADN de una sola hebra y pueden minimizar celula-aglutinacion durante el aislamiento. Los metodos preferidos implican el tratamiento enzimatico con, por ejemplo, colagenasa y dispasa, o colagenasa, dispasa, y la hialuronidasa, y se proporcionan tales metodos en los que en ciertas realizaciones preferidas, una mezcla de colagenasa y la proteasa neutra dispasa se utilizan en la etapa de

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disociacion. Mas preferidos son aquellos metodos que emplean la digestion en presencia de al menos una colagenasa de Clostridium histolyticum, y, o bien de la actividad de la proteasa, dispasa y termolisina. Aun mas preferidos son los metodos que emplean la digestion con actividades enzimaticas tanto de dispasa como de colagenasa. Tambien se prefieren los metodos que incluyen digestion con una actividad de hialuronidasa ademas de actividades de colagenasa y dispasa. El experto en la tecnica apreciara que muchos de tales tratamientos enzimaticos son conocidos en la tecnica para el aislamiento de celulas de diversas fuentes de tejido. Por ejemplo, la serie LIBERASE Blendzyme (Roche) de combinaciones de enzimas son adecuadas para uso en los presentes procedimientos. Otras fuentes de enzimas son conocidas, y el experto en la tecnica tambien puede obtener tales enzimas directamente desde sus fuentes naturales. El experto en la tecnica tambien esta bien equipado para evaluar enzimas nuevas, o combinaciones de enzimas adicionales para su utilidad en el aislamiento de las celulas de la invencion. Tratamientos enzimaticos preferidos son 0,5, 1, 1,5, o 2 horas de duracion o mas. En otras realizaciones preferidas, se incuba el tejido a 37°C durante el tratamiento enzimatico de la etapa de disociacion.

En algunas realizaciones de la invencion, el tejido despues del parto se separa en secciones que comprenden diversos aspectos del tejido, tales como aspectos neonatales, neonatales/maternos, y maternos de la placenta, por ejemplo. Las secciones separadas a continuacion se disocian por disociacion mecanica y/o enzimatica de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento. Celulas de linaje neonatal o materno pueden identificarse por cualquier medio conocido en la tecnica, por ejemplo, por analisis de cariotipo o hibridacion in situ para un cromosoma Y.

Las celulas aisladas o tejidos posparto de las que PPDC crecen hacia fuera puede utilizarse para iniciar, o sembrar cultivos celulares. Las celulas aisladas se transfirieron a recipientes de cultivo de tejidos esteriles o bien no recubiertos o recubiertos de matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (nativo, desnaturalizado o reticulado), gelatina, fibronectina y otras protemas de la matriz extracelular. PPDC se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de sostener el crecimiento de las celulas tales como, pero no limitados a, DMEM (glucosa alta o baja), DMEM avanzado, DMEM/MCDB 201, medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F12 de Ham (F12), medio de Hayflick, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de celulas madre mesenquimales (MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640, y CELL-GRO-FREE. El medio de cultivo puede complementarse con uno o mas componentes incluyendo, por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), preferiblemente alrededor de 2-15% (v/v); suero equino (ES); suero humano (HS); suero de ternera fetal; beta-mercaptoetanol (BME o 2-ME), preferiblemente de aproximadamente 0,001% (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), similar al factor de crecimiento de insulina 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucocitos (LIF) y eritropoyetina; aminoacidos, incluyendo L-valina; y uno o mas agentes antibioticos/antimicoticos para controlar la contaminacion microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea solo o en combinacion. El medio de cultivo comprende preferiblemente Medio de Crecimiento como se define para los Ejemplos.

Las celulas se sembraron en recipientes de cultivo a una densidad para permitir el crecimiento celular. En una realizacion preferida, las celulas se cultivaron a aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en aire. En algunas realizaciones preferidas, las celulas se cultivan a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento O2 en el aire, preferentemente aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento O2 en aire. Las celulas preferiblemente se cultivan a aproximadamente 25 a aproximadamente 40°C y mas preferiblemente se cultivan a 37°C. Las celulas se cultivan preferiblemente en una incubadora. El medio en el recipiente de cultivo puede ser estatico o agitado, por ejemplo, usando un biorreactor. PPDC se cultivan preferiblemente bajo estres oxidativo (por ejemplo, con la adicion de glutation, vitamina C, catalasa, vitamina E, N- acetilcistema). "Estres oxidativo bajo", como se usa en el presente documento, se refiere a condiciones de dano del radical libre ausente o mmimo para las celulas cultivadas.

Los metodos para la seleccion del medio de cultivo mas apropiado, preparacion del medio, y tecnicas de cultivo celular son bien conocidas en la tecnica y se describen en una variedad de fuentes, incluyendo Doyle et al., (Eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester; y Ho y Wang (eds.), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Boston.

Despues de cultivar las celulas aisladas o fragmentos de tejido durante un periodo de tiempo suficiente, PPDC se habran cultivado, ya sea como resultado de la migracion del tejido despues del parto o la division celular, o ambos. En algunas realizaciones de la invencion, PPDCs se pasan o se eliminan a un recipiente de cultivo separado que contiene medio fresco del mismo tipo o un tipo diferente que el utilizado inicialmente, donde la poblacion de celulas se puede expandir mitoticamente. Las celulas de la invencion se pueden usar en cualquier punto entre el paso 0 y la senescencia. Las celulas preferiblemente se pasan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, se pasan mas preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces, y preferiblemente se pasan 10 o 11 veces. La clonacion y/o subclonacion se pueden realizar para confirmar que una poblacion clonal de las celulas ha sido aislada.

En algunos aspectos de la invencion, los diferentes tipos de celulas presentes en el tejido despues del parto se fraccionan en subpoblaciones de las que los PPDCs se pueden aislar. Esto puede conseguirse usando tecnicas

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estandar para la separacion celular, incluyendo, pero no limitado a, tratamiento enzimatico para disociar el tejido despues del parto en sus celulas componentes, seguido por la clonacion y seleccion de tipos celulares espedficos, por ejemplo pero no limitado a la seleccion basada en morfologica y/o marcadores bioqmmicos; el crecimiento selectivo de las celulas deseadas (seleccion positiva), destruccion selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa); separacion basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la poblacion mixta como, por ejemplo, con la aglutinina de soja; procedimientos de congelacion-descongelacion; propiedades diferenciales de adherencia de las celulas en la poblacion mixta; filtracion; centrifugacion convencional y zonal; elutriacion centnfuga (centrifugacion contra-corriente); separacion de gravedad de unidad; distribucion en contracorriente; electroforesis; y la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Para una revision de tecnicas de seleccion clonal y separacion de celulas, vease Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIS TECHNIQUES, 3a edicion, Wiley-Liss, Inc., Nueva York.

Se cambia el medio de cultivo segun sea necesario, por ejemplo, mediante la aspiracion cuidadosa del medio de la placa, por ejemplo, con una pipeta, y la reposicion con medio fresco. La incubacion se continua hasta que un numero suficiente o densidad de celulas se acumulan en el plato. Las secciones de tejido explantadas originales pueden ser quitadas y las celulas restantes se tripsinizaron utilizando tecnicas estandar o utilizando un rascador de celulas. Despues de tripsinizacion, se recogen las celulas, se retiran a un medio fresco y se incubaron como anteriormente. En algunas realizaciones, el medio se cambia al menos una vez en aproximadamente 24 horas despues de la tripsinizacion para eliminar cualquier celula flotante. Se considera que las celulas restantes en el cultivo son PPDCs.

PPDCs pueden ser criopreservados. Por consiguiente, en una realizacion preferida descrita con mayor detalle a continuacion, PPDCs para la transferencia autologa (ya sea para la madre o el nino) se pueden derivar de tejidos posparto apropiados despues del nacimiento de un nino, entonces criopreservados de manera que esten disponibles en caso de que se necesiten mas adelante para el trasplante.

PPDCs pueden caracterizarse, por ejemplo, por las caractensticas de crecimiento (por ejemplo, capacidad de duplicacion de la poblacion, tiempo de duplicacion, pasajes a la senescencia), analisis de cariotipo (por ejemplo, cariotipo normal; linaje materno o neonatal), citometna de flujo (por ejemplo, analisis FACS), inmunohistoqmmica y/o inmunocitoqmmica (por ejemplo, para la deteccion de epttopos), perfiles de expresion genica (por ejemplo, ensayos de chips de genes; reaccion en cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, y PCR convencional)), matrices de protemas, la secrecion de protemas (por ejemplo, por ensayo de coagulacion de plasma o el analisis de medio acondicionado PDC, por ejemplo, mediante analisis de inmunoabsorcion enzimatica (ELISA)), reaccion mixta de linfocitos (por ejemplo, como medida de la estimulacion de PBMCs), y/u otros metodos conocidos en la tecnica.

Ejemplos de PPDCs de la descripcion derivada de tejido de la placenta se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se asignaron numeros de acceso ATCC como sigue: (1) la designacion de la cepa PLA 071003 (P8) se deposito el 15 junio de 2004 y fue asignado el N° de Acceso PTA-6074; (2) la designacion de la cepa pLa 071003 (P11) se deposito el 15 junio de 2004 y se le asigno el N° de Acceso PTA-6075; y (3) la designacion de la cepa PLA 071003 (P16) se deposito el 16 junio de 2004 y se le asigno el N° de Acceso PTA-6079. Ejemplos de PPDCs de la invencion derivados de tejido de ombligo se depositaron en la American Type Culture Collection el 10 de junio de 2004, y se asignaron numeros de acceso ATCC como sigue: (1) la designacion de la cepa UMB 022803 (p7) fue asignada el N° de Acceso PTA-6067; y (2) la designacion de la cepa UMB 022803 (P17) fue asignada el N° de Acceso PTA-6068.

En diversas realizaciones, los PPDCs poseen una o mas de las siguientes caractensticas de crecimiento (1) que requieren L-valina para el crecimiento en cultivo; (2) que son capaces de crecimiento en atmosferas que contengan oxfgeno de aproximadamente 5% a al menos aproximadamente 20% (3) que tienen el potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de llegar a la senescencia; y (4) que conceden y se expanden en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que el recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina.

En ciertas realizaciones los PPDCs poseen un cariotipo normal, que se mantiene cuando se pasan las celulas. El cariotipo es particularmente util para identificar y distinguir celulas neonatales de maternas derivadas de placenta. Los metodos para la determinacion del cariotipo estan disponibles y conocidos por los expertos en la tecnica.

En otras realizaciones, los PPDCs pueden caracterizarse por la produccion de ciertas protemas, incluyendo (1) la produccion de al menos uno de factor tisular, vimentina y actina de musculo liso-alfa; y (2) la produccion de al menos uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, PD-L2 y HLA-A, B, marcadores de superficie celular de C, como se detecta por citometna de flujo. En otras realizaciones, los PPDCs se pueden caracterizar por la falta de produccion de al menos uno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, y marcadores de superficie celular HLA-DR, DP, DQ, tal como se detecta por citometna de flujo. Particularmente preferidas son las celulas que producen al menos dos de factor tisular, vimentina y actina de musculo liso-alfa. Mas preferidas son aquellos celulas que producen los tres del factor de protemas del tejido, vimentina y actina de

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musculo liso-alfa.

En otras realizaciones, los PPDCs pueden caracterizarse por la expresion de genes, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta daca, se incrementa para un gen que codifica al menos una de la interleucina 8; reticulon 1; quimiocina (motivo C-X- C) ligando 1 (actividad estimuladora de crecimiento de melonoma, alfa); quimiocina (motivo C-X-C) ligando 6 (granulocitos de protema quimiotactica 2); quimiocina (motivo C-X-C) ligando 3; factor de necrosis tumoral, protema inducida por alfa 3; miembro de la superfamilia de lectina tipo C 2; Tumor de Wilms 1; deshidrogenasa aldetuda 1 miembro de la familia A2; renina; lipoprotema de receptor de baja densidad oxidada 1; Homo sapiens clon IMAGEN: 4179671; quinasa de protema C zeta; protema hipotetica DKFZp564F013; cancer de ovario regulado hacia abajo 1; y el gen de Homo sapiens a partir del clon DKFZp547k1113.

En aun otras realizaciones, los PPDCs pueden caracterizarse por la expresion de genes, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se reduce para un gen que codifica al menos uno de: homeobox de estatura corta 2; choque termico 27 kDa protema 2; quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 12 (estroma por celulas derivadas del factor 1); elastina (estenosis aortica supravalvular, smdrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (a partir del clon DKFZp586M2022); homeobox de mesenquima 2 (homeobox espedfico a detencion de crecimiento); homeobox homologo sine oculis 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado de la morfogenesis 2; protema DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (protema de union del plasminogeno); homologfa src tres (SH3) y dominio rico en cistema; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripcion relacionada con runt-3; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de C-endopeptidasa de procolageno; homologo rizado 7 (Drosophila); gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabrachion); homeobox de protema Iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoprotema de vesmula sinaptica 2; neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protema de union del factor de crecimiento de tipo insulina 2, 36 kDa; ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; citoquina factor de receptor 1; canal activado por calcio de conductancia del potasio intermedio/pequeno, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; co-activador transcripcional con PDZ motivo de union (TAZ); homeobox homologo sine oculis 2 (Drosophila); protema KIAA1034; protema asociada a vesmulas de membrana 5 (miobrevina); EGF que contienen protema de la matriz extracelular de tipo fibulina 1; respuesta de crecimiento temprano 3; homeobox no distal 5; protema hipotetica FLJ20373; familia de reductasa aldo-ceto 1, miembro de C3 (deshidrogenasa de hidroxiesteroide 3-alfa, tipo II); biglicano; co-activador transcripcional con motivo de union a PDZ-(TAZ); fibronectina 1; proencefalina; integrina, similar a beta 1 (con dominios de repeticion similar a EGF); ARNm de Homo sapiens inserto de longitud completa del clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; protema KIAA0367; receptor del peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (peptido atrionatriuretico receptor C); protema hipotetica FLJ14054; ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (a partir del clon DKFZp564B222); BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protema de interaccion 3; AE protema de union 1; y el citocromo c oxidasa subunidad VIIa polipeptfdica 1 (musculo).

En otras realizaciones, los PPDCs se pueden caracterizar por la secrecion de al menos una de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES, y TIMP1. En realizaciones alternativas, los PPDCs se pueden caracterizar por la falta de secrecion de al menos una de TGF-beta2, ANG2, PDGFBB, MIP1b, 1309, MDC, y VEGF, como se detecta por ELISA.

En realizaciones preferidas, la celula comprende dos o mas del crecimiento, la produccion de marcador de protema/superficie, la expresion de gen anteriormente enumerado o caractensticas de la sustancia-secrecion. Mas preferidos son aquellos que comprenden celulas, tres, cuatro, o cinco o mas de las caractensticas. Aun mas preferidos son PPDCs que comprenden seis, siete, u ocho o mas de las caractensticas. Aun mas preferidas actualmente son aquellas celulas que comprenden la totalidad de las caractensticas anteriores.

En algunas realizaciones preferidas, las PPDCs se derivan de tejido del cordon umbilical sustancialmente libre de sangre, son capaces de auto-renovacion y expansion en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo neural, requieren L-valina para el crecimiento, pueden crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno, y comprenden al menos una de las siguientes caractensticas: potencial de por lo menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo; union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido recubierto o no recubierto que comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina; produccion de vimentina y actina de musculo liso-alfa; produccion de CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90; y, la expresion de un gen, que en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para un gen que codifica la interleucina 8 y reticulon 1. En algunas realizaciones, tales PPDCs no producen CD45 y CD117. Los PPDCs como se describe en este parrafo pueden ser utilizados en metodos para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, se pueden utilizar en composiciones farmaceuticas para la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, por ejemplo, en el que tales composiciones comprenden las celulas que tienen estas caractensticas y un vehmulo farmaceuticamente aceptable, y se pueden utilizar en kits para hacer, usar, y practicar tales metodos y composiciones farmaceuticas como se ha descrito y ejemplificado aqrn. Ademas, los PPDCs como se describe en este parrafo pueden ser utilizados para generar los

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medios de cultivo celular condicionado que pueden ser utilizados para hacer, usar, y practicar tales metodos y composiciones farmaceuticas como se describe y ejemplifica en este documento.

Entre las celulas que se prefieren actualmente para su uso con la invencion en varios de sus aspectos son celulas posparto que tienen las caractensticas descritas anteriormente y mas particularmente aquellas en las que las celulas tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales con pases, y ademas en las que las celulas expresan cada uno de las marcadores CD10, CD13, cD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, y HLA-a, B, C, en el que las celulas producen las protemas inmunologicamente detectables que corresponden a los marcadores enumerados. Aun mas preferidas son aquellas celulas que ademas de lo anterior no producen protemas correspondientes a cualquiera de los marcadores CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, o HLA-DR, Dp, DQ, como se detecta por citometna de flujo.

En otro de sus varios aspectos, la invencion proporciona poblaciones de celulas que comprenden las celulas descritas anteriormente. Las poblaciones de celulas son utiles en conexion con los metodos de la invencion, asf como en relacion con la fabricacion de la composiciones de celulas y lisados celulares farmaceuticos en cantidades mayores que las que se puede proporcionar celulas aisladas.

Poblaciones preferidas comprenden de aproximadamente 1% de celulas derivadas posparto a las celulas posparto aproximadamente 10%. Mas poblaciones preferidas comprenden al menos aproximadamente 10% de celulas derivadas posparto. Mas poblaciones preferidas comprenden al menos aproximadamente 25% de celulas derivadas posparto. Tambien, algunas poblaciones preferidas comprenden de aproximadamente 50% de celulas derivadas posparto. Tales poblaciones pueden ser utiles para el cocultivo u otros cultivos en donde las celulas son igualmente pobladas y se dividen a la misma velocidad, o donde la poblacion se ajusta a aproximadamente 50% de cada cultivo despues de la expansion de los cultivos en cocultivo o por separado. Mas preferidas para algunas aplicaciones son las poblaciones que comprenden al menos aproximadamente 65% de celulas derivadas posparto. Las poblaciones que comprenden al menos 90% de celulas derivadas posparto son muy preferidas para ciertos aspectos de la invencion. Poblaciones mas preferidas comprenden sustancialmente solo las celulas derivadas posparto.

Las poblaciones pueden comprender una lmea celular clonal de las celulas derivadas posparto. Tales poblaciones son particularmente utiles en las que se afsla un clon de celulas con funcionalidad altamente deseable. Ambos clones neotal y maternos son utiles y se proporcionan en este documento. Metodos de aislamiento de lmeas celulares clonales de las celulas cultivadas son conocidas en la tecnica.

En diversas realizaciones, los metodos de la descripcion pueden utilizar lisados celulares, fracciones celulares solubles y fracciones de celulas enriquecidas por membrana preparadas a partir de las poblaciones de las celulas despues del parto. Tales lisados y fracciones tienen muchas utilidades. El uso de lisados celulares, fracciones celulares y, mas particularmente, solubles, in vivo permite que se usara el medio intracelular beneficioso en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante sin estimular linfocitos o la generacion de otras respuestas inmunologicas adversas, sin facilitar el rechazo del tejido trasplantado, y sin provocar rechazo.

Los metodos de lisis de celulas son bien conocidos en la tecnica e incluyen diversos medios de disrupcion mecanica, perturbacion enzimatica, o alteracion qmmica, o combinaciones de los mismos. Tales lisados celulares se pueden preparar a partir de celulas directamente en su medio de crecimiento y contienen por lo tanto factores de crecimiento secretados y similares, o se pueden preparar a partir de celulas lavadas libres de medio en, por ejemplo, PBS u otra solucion. Para hacer lisados de celulas directamente en el medio de crecimiento, se prefiere que las celulas se cultivan en suero de las especies en las que los lisados se van a utilizar, en algunas realizaciones, pueden ser preferidas las celulas lavadas. Las celulas lavadas se pueden resuspender a concentraciones mayores que la densidad de poblacion original si se prefiere.

Los lisados celulares preparados a partir de poblaciones de celulas derivadas posparto se pueden usar como son, concentradas aun mas, por ejemplo, por ultrafiltracion o liofilizacion, o incluso secadas, enriquecidas, parcialmente purificadas, en combinacion con vehmulos o diluyentes aceptables farmaceuticamente como son conocidas en la tecnica, o en combinacion con otros compuestos tales como productos biologicos, composiciones de protemas farmaceuticamente utiles, por ejemplo. Los lisados celulares se pueden usar in vitro o in vivo, solo o, por ejemplo, con celulas vivas singenicas o autologas. Los lisados, si se introducen in vivo, pueden introducirse de forma local en un sitio de tratamiento, o de manera remota para proporcionar, por ejemplo, factores de crecimiento celular necesarios a un paciente. Preferiblemente, los lisados no son inmunogenicos, y mas preferiblemente son tolerados inmunologicamente en una amplia poblacion de receptores singenicos y alogenicos sin consecuencias inmunologicas adversas o de reaccion. Los lisados celulares son utiles a partir de celulas en cualquier etapa o edad que han sido cultivadas bajo condiciones de crecimiento y de expansion, por ejemplo, en Medio de Crecimiento. Incluso las celulas senescentes son utiles para la preparacion de lisado y pueden proporcionar ciertos factores que son biologicamente utiles. Celulas no viables o incluso muertas tienen utilidad para la preparacion de lisados y fracciones celulares.

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Los metodos de la invencion tambien pueden utilizar composiciones farmaceuticas que comprenden una celula derivada posparto y otro agente terapeutico, factor, o el agente bioactivo, tal como un compuesto farmaceutico. Tales agentes bioactivos incluyen, pero no se limitan a, IGF, LIF, PDGF, EGF, FGF, asf como, agentes anti-apoptoticos antitrombogenicos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, y antioxidantes. Tales composiciones pueden comprender ademas uno o mas tipos de celulas adicionales, ademas de los PPDCs y el componente bioactivo.

Por lo tanto, en conjuncion con celulas derivadas posparto, otras moleculas biologicamente activas, tales como agentes antitrombogenicos, agentes anti-apoptoticos, y agentes anti-inflamatorios pueden ser utiles y se pueden administrar en secuencia con, o coadministrados con las celulas, de forma individual o en combinaciones, o dos o mas de tales compuestos o agentes. Por ejemplo, agentes anti-apoptoticos pueden ser utiles para minimizar la muerte celular programada. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a EPO, derivados y analogos de EPO, y sus sales, TPO, IGF-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y los inhibidores de caspasas. Los agentes antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a inhibidores de la quinasa p38 MAP, estatinas, IL-6 y los inhibidores de IL-1, pemirolast, tranilast, Remicade®, sirolimus, compuestos anti-inflamatorios no esteroideos, por ejemplo, tepoxalina, tolmetina, y suprofen .

Otros factores bioactivos o agentes terapeuticos que pueden coadministrarse con las celulas derivadas posparto incluyen, por ejemplo, factores de agentes antitrombogenicos, inmunosupresores o inmunomoduladores, y antioxidantes. Uno de los propositos para co-administracion o la terapia de combinacion de las celulas derivadas posparto con inmunosupresores consiste en complementar la eficacia inmunosupresora. En una realizacion, la terapia de combinacion de las celulas derivadas posparto con inmunosupresores puede alcanzar el mismo nivel de eficacia biologica al tiempo que permite una reduccion en la dosis del inmunosupresor administrado y de esta manera aliviar los efectos secundarios indeseables como se encuentra con el uso del inmunosupresor solo. En otra realizacion, la terapia de combinacion de las celulas derivadas posparto con inmunosupresores puede permitir un aumento en la eficacia biologica en general sin un aumento en la dosis del inmunosupresor administrado en oposicion a la terapia con el inmunosupresor solo. Los ejemplos de agentes inmunosupresores e inmunomoduladores incluyen inhibidores de la calcineurina, por ejemplo ciclosporina, tacrolimus, inhibidores de mTOR como sirolimus o everolimus; antiproliferativos tales como azatioprina y micofenolato mofetilo; corticosteroides, por ejemplo, prednisolona o hidrocortisona; anticuerpos tales como anticuerpos anti-monoclonales IL-2R( anticuerpos del receptor, basiliximab, daclizumab; anticuerpos anti-celulas T policlonales tales como anti- timocitos globulina (ATG), anti-linfocitos globulina (ALG), y el anticuerpo monoclonal OKT3 de celulas anti-T. Compuestos antitrombogenicos que se pueden proporcionar terapeuticamente conjuntamente con las celulas de la invencion incluyen, por ejemplo, heparina, derivados de heparina, uroquinasa, y PPack (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona); compuestos de antitrombina, antagonistas del receptor plaquetario, anticuerpos de antitrombina, anticuerpos del receptor anti-plaquetas, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandina, e inhibidores de plaquetas. Los antioxidantes son bien conocidos en la tecnica, por supuesto, y cualquier antioxidante farmaceuticamente aceptable se puede administrar en conjuncion con las celulas de la invencion incluyendo probucol; vitaminas A, C, y E, coenzima Q-10, glutation, cistema L, N-acetilcistema, o derivado antioxidante, analogos o sales de los anteriores.

Ademas de lo anterior, las composiciones derivadas de las celulas se pueden usar de acuerdo con los metodos de la invencion. Los lisados celulares, fracciones celulares solubles y fracciones de celulas de membrana enriquecida se proporcionan en el presente documento, como se describe anteriormente en detalle. Matrices extracelulares derivadas de las celulas, por ejemplo, que comprenden las membranas basales son tambien utiles y se proporcionan en este documento. Los lisados celulares, fracciones celulares solubles, fracciones de celulas de membrana enriquecida y matriz extracelular derivada de las celulas pueden administrarse a pacientes segun proceda, o coadministrarse con las celulas de la invencion, con o sin celulas adicionales o tipos de celulas.

Los metodos de la descripcion tambien pueden incluir el uso de medios de cultivo condicionado de la manera proporcionada en este documento. Tales medios primero se han utilizado para cultivar celulas o cultivos, que durante el crecimiento secretan uno o mas productos utiles en el medio. Medios condicionados de estas celulas novedosas son utiles para muchos propositos, incluyendo, por ejemplo, el apoyo del crecimiento de otras celulas de mairnfero en necesidad de factores de crecimiento o factores troficos secretados en los medios por las celulas y cultivos, y promover, por ejemplo, la angiogenesis. Los procedimientos de preparacion y el almacenamiento de medios acondicionados se conocen en la tecnica y principalmente implican la eliminacion de las celulas, por ejemplo por centrifugacion.

La invencion proporciona en otra de sus composiciones celulares aspectos para su uso en el trasplante, que comprende un vehuculo farmaceuticamente aceptable y las celulas derivadas posparto derivadas de tejido posparto de marnffero de forma sustancial libre de sangre. Las celulas son capaces de auto-renovacion y expansion en cultivo y tienen el potencial para inhibir cualquier respuesta inmune mediante las celulas injertadas o tejido contra el receptor y/o para inhibir cualquier respuesta inmune por el receptor contra el tejido trasplantado con el fin de inhibir el rechazo.

Las celulas derivadas posparto son capaces de cultivarse en una atmosfera que contiene oxfgeno de

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aproximadamente 5% a al menos aproximadamente 20%. Las celulas tambien requieren L-valina para el crecimiento, tienen el potencial de al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo, adjuntarse y expandirse en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido recubierto se recubre con gelatina, laminina, o fibronectina; producir el factor de tejido, vimentina y actina de musculo liso-alfa; producir cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR-alfa, y HLA-A, B, C; y no producen ninguna de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, o HLA-DR, DP, DQ, como se detecta por citometna de flujo. En realizaciones preferidas, las celulas se derivan de tejido humano.

Las composiciones de celulas se pueden administrar terapeuticamente a un receptor del trasplante. Las composiciones de celulas pueden comprender celulas o productos de celulas que inhiben una respuesta inmune adversa en el receptor de trasplante que es histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante como el injerto contra enfermedad de huesped y/o rechazo de las celulas o tejido trasplantado.

Las composiciones de celulas se pueden administrar al receptor del trasplante, por ejemplo, mediante inyeccion. En ciertas realizaciones, las composiciones de celulas se inyectan en o cerca del sitio del trasplante. En otras realizaciones, la inyeccion puede ser sobre la superficie del tejido trasplantado, en una zona adyacente, o incluso a una zona mas remota. En realizaciones preferidas, las celulas pueden estar en la zona del trasplante. Particularmente preferidas son celulas que se pueden inyectar por via intravenosa y localizarse apropiadamente al sitio de accion deseado.

Las composiciones de celulas tambien se pueden proporcionar en la forma de un complejo de celulas de la matriz. Matrices incluyen andamios biocompatibles, celosfas, estructuras de autoensamblaje y similares, ya sea bioabsorbibles o no, lfquido, gel o solido. Tales matrices se conocen en el arte de tratamiento terapeutico de celulas, la reparacion quirurgica, la ingeniena de tejidos y curacion de heridas. Preferiblemente, las matrices se tratan previamente con las celulas. Mas preferiblemente, las matrices estan pobladas con celulas en estrecha asociacion con la matriz o sus espacios. Las celulas pueden adherirse a la matriz en algunas realizaciones; en otras, las celulas se atrapan o se contienen dentro de los espacios de la matriz. Mas preferidos son los complejos de celulas de matriz en los que las celulas estan creciendo en estrecha asociacion con la matriz y cuando se utiliza terapeuticamente, el crecimiento y la supervivencia del tejido trasplantado se estimula y se apoya, y la angiogenesis adecuada es estimulada de manera similar o compatible, y se inhibe cualquier respuesta inmune por el receptor del trasplante contra el tejido trasplantado o por el tejido injertado contra el receptor. Las composiciones de celulas de la matriz pueden ser introducidas en el cuerpo de un paciente de cualquier modo conocido en la tecnica, incluyendo, pero no limitandose a la implantacion, inyeccion, fijacion quirurgica, trasplante con otro tejido, la inyeccion, y similares. En algunas realizaciones, las matrices se forman in vivo, o incluso mas preferiblemente in situ, por ejemplo geles polimerizables in situ se pueden usar de acuerdo con la invencion. Ejemplos de tales geles son conocidos en la tecnica.

En algunas realizaciones, las celulas derivadas posparto, o co-cultivos de las mismas, pueden ser sembradas en tales matrices tridimensionales, tales como andamios y se implantan in vivo, donde las celulas sembradas pueden proliferar sobre o en el marco o ayudar a establecer tejido trasplantado e inhibir una respuesta de injerto contra huesped in vivo con o sin la cooperacion de otras celulas.

Crecimiento de PPDCs o co-cultivos de los mismos sobre el marco tridimensional resulta preferentemente en la formacion de un tejido tridimensional, o bases para tal tejido, que puede ser utilizado in vivo, por ejemplo, para inhibir cualquier respuesta inmune mediante celulas injertadas o tejido contra el receptor, y/o para inhibir el rechazo de las celulas o tejido injertado. En una realizacion, los armazones tridimensionales se pueden preparar como estructuras tubulares, por ejemplo, para su uso en trasplantes de los vasos sangumeos o conductos.

De acuerdo con un aspecto de la invencion, PPDCs o co-cultivos de los mismos se inoculan, o se siembran en un marco tridimensional o matriz, tal como un andamio, una espuma o de hidrogel. El marco puede estar configurado en varias formas, tales como generalmente plana, o tubular generalmente cilmdrica, o puede ser completamente de forma libre como puede ser requerido o deseado para la estructura correctiva bajo consideracion. En algunas realizaciones, los PPDCs crecen en la estructura de tres dimensiones, mientras que en otras formas de realizacion, las celulas solo sobreviven, o incluso mueren, sin embargo, al hacerlo, que inhiben cualquier respuesta inmune mediante las celulas injertadas o tejido contra el receptor, y/o para inhibir el rechazo de las celulas o tejido injertado. En algunas realizaciones, los PPDCs facilitan la vascularizacion, el crecimiento y la vitalidad de las celulas o tejido trasplantado.

La matriz puede ser disenada de tal manera que la estructura de la matriz soporta los PPDCs o co-cultivos de los mismos sin degradacion subsiguiente o permite que el trasplante se vascularice y se apoye, en cuyo punto, la matriz se degrada. Una revision de diseno de matriz es proporcionada por Hutmacher, J. Biomat. Sci. Polymer Edn, 12 (1): 107-124 (2001).

Las matrices, andamios, espumas y sistemas de auto-montaje contemplados para uso en esta invencion pueden ser implantados en combinacion con una o mas celulas, factores de crecimiento, farmacos, o de otros componentes, tales como agentes bioactivos que promueven la curacion, o en el crecimiento de tejido, o estimulan

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la vascularizacion o la inervacion de la misma o de otra manera aumentar o mejorar el resultado terapeutico o la practica de la invencion, ademas de las celulas de la invencion.

Las celulas de la invencion pueden ser cultivadas libremente en cultivo o eliminadas del cultivo e inoculadas en un marco tridimensional. La inoculacion de la estructura de tres dimensiones con una concentracion de celulas, por ejemplo, aproximadamente 106 a 5 x 107 celulas por mililitro, resulta preferiblemente en el establecimiento del soporte de tres dimensiones en periodos relativamente cortos de tiempo. Ademas, en algunas aplicaciones puede ser preferible utilizar un numero mayor o menor de celulas dependiendo del resultado deseado.

En algunas realizaciones, es util volver a crear en cultivo el microambiente celular encontrado in vivo, de tal manera que el grado en que las celulas se cultivan antes de la implantacion in vivo o el uso in vitro puede variar. PPDCs o co-cultivos de los mismos pueden ser inoculados en el marco antes o despues de la implantacion. Para la inoculacion de las celulas en el marco antes de la implantacion, el marco se incuba preferiblemente en un medio de crecimiento apropiado. Durante el penodo de incubacion, las celulas inoculadas creceran y envolveran el marco y pueden, por ejemplo, salvar o parcialmente salvar los espacios intersticiales en el mismo.

Ejemplos de matrices, por ejemplo andamios que pueden ser utilizados para los aspectos de la invencion incluyen esteras (tejidas, de punto, y mas preferiblemente no tejidas) espumas porosas o semiporosas, peptidos automontados y similares. esterillas no tejidas pueden, por ejemplo, formarse usando fibras compuestas de polfmeros naturales o sinteticos. En una realizacion preferida, los copolfmeros absorbibles de acidos glicolico y lactico (PGA/PLA), comercializado con el nombre comercial VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) se utilizan para formar una estera. Espumas, compuestas de, por ejemplo, poli(epsilon-caprolactona)/acido poli(glicolico) copolfmero (PCL/PGA), formado por procesos tales como liofilizacion, o liofilizacion, como se discute en la patente de Estados Unidos N° 6.355.699, pueden tambien servir como andamios. Los geles tambien forman matrices adecuadas, como se usa en el presente documento. Los ejemplos incluyen geles polimerizables in situ, e hidrogeles, por ejemplo compuestos de peptidos de autoensamblaje. Estos materiales se utilizan frecuentemente como soportes para el crecimiento de tejido. Redes degradables formadas in situ tambien son adecuadas para uso en la invencion (vease, por ejemplo, Anseth, KS et al, 2002, J. Controlled Release 78: 199-209; Wang, D. et al, 2003, Biomaterials 24: 39693980; publicacion de Patente de Estados Unidos 2002/0022676 de He et al). Estos materiales se formulan como fluidos adecuados para inyeccion, a continuacion, pueden ser inducidos por una variedad de medios (por ejemplo, cambio en la temperatura, pH, exposicion a la luz) para formar redes de hidrogel degradables in situ o in vivo.

De acuerdo con una realizacion, el marco es un fieltro, que puede estar compuesto de un hilo multifilamento hecho de un material bioabsorbible, por ejemplo, PGA, PLA, copolfmeros de PCL o mezclas, o acido hialuronico. El hilo se convierte en un fieltro utilizando tecnicas de procesamiento textil estandar que consta de engaste, corte, cardado y puncion. En otra realizacion, las celulas de la invencion se siembran sobre andamios de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Ademas, el marco tridimensional puede ser moldeado en una forma util, tal como una estructura espedfica en el cuerpo a reparar, reemplazar, o aumentar a traves del trasplante.

El marco se puede tratar antes de la inoculacion de las celulas de la invencion con el fin de mejorar la union celular. Por ejemplo, antes de la inoculacion con las celulas de la invencion, las matrices de nylon pueden ser tratadas con acido acetico 0,1 molar y se incubaron en polilisina, PBS, y/o colageno para recubrir el nylon. El poliestireno puede ser tratado de forma similar utilizando acido sulfurico.

Ademas, las superficies externas de la estructura de tres dimensiones pueden ser modificadas para mejorar la union o el crecimiento de las celulas y la diferenciacion del tejido, tales como por revestimiento del marco con plasma (por ejemplo, colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotemas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina), una matriz celular, y/u otros materiales tales como, pero no limitado a, gelatina, alginatos, agar, agarosa, y gomas vegetales, entre otros.

En algunas realizaciones, el armazon se compone de o se trata con materiales que lo hacen no trombogenico. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y mantener el crecimiento endotelial, la migracion y la deposicion de matriz extracelular. Ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero no se limitan a los materiales naturales tales como protemas de la membrana basal, tales como laminina y colageno de tipo IV, materiales sinteticos tales como ePTFE, y siliconas de poliuretaneurea segmentadas, tales como PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, CA). Estos materiales pueden ser tratados adicionalmente para hacer el andamio no trombogenico. Tales tratamientos incluyen agentes anti-tromboticos tales como la heparina, y los tratamientos que alteran la carga superficial del material tal como recubrimiento por plasma.

Diferentes proporciones de los diferentes tipos de colageno, por ejemplo, depositados sobre el marco pueden afectar el crecimiento de celulas espedficas de tejido o de otro tipo que pueden mas tarde inocularse en el marco o que pueden crecer sobre la estructura in vivo. Por ejemplo, para sistemas de cultivo de piel en tres dimensiones, tipos de colageno I y III se depositan preferentemente en la matriz inicial. Alternativamente, el marco puede ser inoculado con una mezcla de celulas que sintetizan los tipos de colageno adecuados deseados. Por lo tanto, dependiendo del tejido a cultivar, el tipo de colageno apropiado para ser inoculado en el marco o producido

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por las celulas sembradas sobre el mismo se pueden seleccionar. Por ejemplo, las cantidades relativas de las fibras colagenas y elasticas presentes en el marco pueden ser moduladas mediante el control de la proporcion de celulas productoras de colageno a las celulas de elastina productoras en el inoculo inicial. Por ejemplo, ya que las paredes internas de las arterias son ricas en elastina, un andamio arterial debe contener un co-cultivo de celulas de musculo liso que secretan elastina.

El marco tridimensional sembrado o inoculado de la invencion se puede utilizar en una variedad de aplicaciones. Estas incluyen, pero no se limitan al trasplante o la implantacion de cualquiera de las celulas cultivadas obtenidas a partir de la matriz o la propia matriz cultivada in vivo.

PPDCs pueden ser inoculadas en un andamio plano. El andamio se incuba preferiblemente en medio de cultivo antes de la implantacion. Dos o mas marcos planos se pueden colocar encima de otro y se suturan juntos para generar un marco de multiples capas.

Un andamio puede ser cortado en una tira (por ejemplo, de forma rectangular) de la cual la anchura es aproximadamente igual a la circunferencia interior de un organo tubular, por ejemplo, un conducto, como el conducto hepatico, en la que en ultima instancia sera insertado. Las celulas pueden ser inoculadas en el andamio y se incubaron por flotante o de suspension en medios lfquidos. En la etapa apropiada de la confluencia, el andamio puede ser enrollado en un tubo uniendo los bordes largos juntos. La costura se puede cerrar por sutura de los dos bordes juntos utilizando fibras de un material adecuado de un diametro apropiado.

Segun la invencion, un andamio puede estar formado como un tubo, inoculado con PPDCs, y se suspendio en los medios en una camara de incubacion. Con el fin de evitar que las celulas realicen oclusion del lumen, uno de los extremos abiertos del marco tubular puede fijarse a una boquilla. Los medios lfquidos pueden ser forzados a traves de esta boquilla de una camara de fuente conectada a la camara de incubacion para crear una corriente a traves del interior del marco tubular. El otro extremo abierto puede ser fijado a una abertura de salida que conduce a una camara de recogida desde el que los medios pueden ser recirculados a traves de la camara fuente. El tubo se puede extraer de la boquilla y la salida de abertura cuando la incubacion se ha completado. Este metodo se describe por Ballermann, B.J., et al., Solicitud Int. N°. WO 94/25584 y en el N° de Ser. de solicitud 08/430.768.

En general, los dos marcos tridimensionales se pueden combinar en un tubo de acuerdo con la invencion usando cualquiera de los metodos siguientes.

Dos o mas marcos planos se pueden colocar encima de otro y se suturan juntos. Esta hoja de dos capas puede entonces ser enrollada, y, como se ha descrito anteriormente, unida y asegurada.

Un andamio tubular que se dirige a servir como la capa interior puede ser inoculado con PPDCs y se incuba. Un segundo andamio se puede cultivar como una tira plana con anchura ligeramente mayor que la circunferencia externa de la estructura tubular. Despues de que se alcanza el crecimiento apropiado, el marco plano puede ser envuelto alrededor del exterior del andamio tubular seguido del cierre de la costura de los dos bordes del marco plano y, preferiblemente, asegurando el marco plano al tubo interior.

Dos o mas mallas tubulares de diametros ligeramente diferentes pueden ser cultivadas por separado. El marco con el diametro mas pequeno puede ser insertado dentro del mas grande y asegurado.

Para cada uno de estos metodos, mas capas pueden ser agregadas por volver a aplicar el metodo para el tubo de doble capa. Los andamios se pueden combinar en cualquier etapa de crecimiento de los PPDCs, y la incubacion de los andamios combinados pueden continuarse cuando sea deseable.

El aspecto luminal de la construccion tubular puede estar compuesto de o tratado con materiales que hacen la superficie luminal del andamio tubular no trombogenica. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y mantener el crecimiento endotelial, la migracion y la deposicion de matriz extracelular. Ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero no se limitan a los materiales naturales tales como protemas de la membrana basal, tales como laminina y colageno de tipo IV, materiales sinteticos tales como ePTFE, y siliconas de poliuretanourea segmentadas, tales como PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, CA). Estos materiales pueden ser tratados adicionalmente para hacer la superficie luminal del andamio tubular no trombogenica. Tales tratamientos incluyen agentes anti-tromboticos tales como la heparina, y los tratamientos que alteran la carga superficial del material tal como recubrimiento por plasma.

Las composiciones de celulas terapeuticas, en ciertas realizaciones tambien comprenden celulas que expresan al menos uno de interleucina 8, reticulon 1, quimiocinas (motivo C-X-C) ligando (actividad estimuladora del crecimiento de melanoma, alfa) 1, quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando de protema quimiotactica 6 (granulocitos 2), quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 3, y el factor de necrosis tumoral, protema inducida por alfa 3, o que han reducido la expresion, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, para al menos uno de homeobox de estatura corta 2, el calor de choque 27 kDa protema 2, quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 12 (factor derivado de celulas estromales 1), elastina

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(estenosis aortica supravalvular, smdrome de Williams-Beuren), ARNm de Homo sapiens, ADNc DKFZp586M2022 (a partir del clon DKFZp586M2022), homeobox de mesenquima 2 (homeobox espedfico a detencion del crecimiento), homeobox homologo sine oculis 1 (Drosophila), cristalina, alfa B, activador asociado de la morfogenesis 2, protema DKFZP586B2420, similar a neuralina 1, tetranectina (protema de union del plasminogeno), homologfa src tres (SH3) y dominio rico en cistema, gen de translocacion de celulas B 1, anti-proliferativa, colesterol 25-hidroxilasa, factor de transcripcion relacionado con runt 3, protema hipotetica FLJ23191, interleuquina 11 receptor alfa, potenciador de procolageno C-endopeptidasa, homologo rizado 7 (Drosophila), gen hipotetico BC008967, colageno, tipo VIII alpha 1, tenascina C (hexabrachion), protema homeobox iroquois 5, hefaestina, integrina, beta 8, glicoprotema de vesmula sinaptica 2, ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744, citoquina de tipo receptor factor 1, canal activado por calcio de intermedio de potasio/pequena conductancia, subfamilia N, miembro 4, integrina, alfa 7, protema DKFZP586L151, co-activador transcripcional con motivo de union a PDZ-(TAZ), homeobox homologo sine oculis 2 (Drosophila), protema KIAA1034, respuesta temprana de crecimiento 3, homeobox no distal 5, protema hipotetica FLJ20373, familia de reductasa aldo-ceto 1, miembro de C3 (deshidrogenasa de hidroxiesteroide 3-alfa, tipo II), biglicano; fibronectina 1, proencefalina, integrina, similar a beta 1 (con dominios de repeticion similar a EGF), ARNm de ADNc de Homo sapiens de longitud completa inserto del clon Euroimage 1.968.422, EphA3; protema KIAA0367, peptido natriuretico receptor C/guanilato ciclasa C (receptor atrionatriuretico del peptido C), protema hipotetica fLj14054, ARNm de Homo sapiens, ADNc DKFZp564B222 (a partir del clon DKFZp564B222), protema de membrana asociada a vesmulas 5 (miobrevina), protema de matriz extracelular tipo fibulina que contienen EGF 1, protema interactuante BCL2/adenovirus E1B 19 kDa 3, protema de union a AE 1, citocromo c oxidasa subunidad VIIa polipeptfdica 1 (musculo), neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1, factor de crecimiento similar a la insulina protema 2 de union, 36 kDa.

Composiciones celulares preferidas tambien comprenden celulas que secretan al menos uno de MCP-1, IL- 6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES, y TIMP1, y no secretan al menos una de TGF-beta2, ANG2, PDGFBB, MIP1b, 1309, MDC, y VEGF, como se detecta por ELISA.

En todavfa otro de sus aspectos, el presente documento describe metodos para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, que comprende la administracion de una composicion de celulas derivadas postparto al receptor del trasplante en una cantidad eficaz para inhibir la respuesta inmune adversa.

En algunas realizaciones, la respuesta inmune adversa es una respuesta inmune adaptativa. En una realizacion detallada, la respuesta inmune adversa es una respuesta inmune por el tejido injertado contra el paciente de trasplante y puede resultar en injerto contra enfermedad de huesped. En otra realizacion detallada, la respuesta inmune adversa es el rechazo del tejido trasplantado. En algunas realizaciones, los metodos son eficaces para inhibir tanto el injerto contra enfermedad de huesped y el rechazo del tejido trasplantado. En todas las realizaciones, es preferible que las celulas derivadas posparto que comprenden la composicion sean celulas derivadas de ombligo, celulas derivadas de la placenta, o una combinacion de celulas derivadas del ombligo y de la placenta.

Las composiciones de celulas derivadas posparto pueden proporcionar apoyo para el crecimiento, la estimulacion o la vitalidad del tejido transplantado. Las celulas derivadas posparto pueden coadministrarse con partes de las celulas, lisados celulares, o con otras celulas alogenicas, singenicas o autologas, aunque la inhibicion exitosa de una respuesta inmune adversa podna comprender la administracion de PPDCs para el paciente de trasplante en ausencia de otras celulas, de partes de celulas, o lisados celulares. Las celulas no necesitan integrarse en el tejido trasplantado, aunque se prefiere que los PPDCs se integren al menos parcialmente, se multipliquen, o sobrevivan en el paciente. En otras realizaciones preferidas, el paciente experimenta beneficios adicionales de la administracion de los PPDCs, por ejemplo, la capacidad de los PPDCs para apoyar el crecimiento de otras celulas, incluyendo las celulas madre o celulas progenitoras presentes en o alrededor del tejido trasplantado, el crecimiento o la vascularizacion del tejido trasplantado, y la produccion de factores beneficiosos celulares, quimiocinas, citocinas y similares. En algunas realizaciones, el receptor del trasplante se beneficia del tratamiento terapeutico con los PPDCs, pero los PPDCs no sobreviven durante un penodo prolongado en el paciente. En una realizacion, las celulas disminuyen gradualmente en numero, viabilidad o actividad bioqmmica, en otras realizaciones, la disminucion de las celulas puede ser precedida por un periodo de actividad, por ejemplo el crecimiento, division o actividad bioqmmica. En otras realizaciones, celulas senescentes, no viables o incluso muertas son capaces de tener un efecto beneficioso.

Los metodos pueden comprender ademas la administracion de uno o mas agentes, ademas de la composicion de celulas. Tales agentes pueden administrarse antes, despues, o al mismo tiempo que se administra la composicion de celulas. Los ejemplos no limitantes de agentes adecuados incluyen agentes antitrombogenicos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores, agentes inmunomodulatorios, y agentes antiapoptoticos u otros agentes adecuados en la tecnica. La eleccion del agente apropiado esta dentro de la experiencia de la tecnica, y puede variar dependiendo de las caractensticas ffsicas o de salud general o el bienestar del receptor del trasplante.

La administracion de PPDCs se lleva a cabo preferiblemente in vivo mediante el trasplante, la implantacion, la inyeccion, la fusion, la administracion a traves de cateter, la administracion a traves del dispositivo implantado en

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el receptor del trasplante, o proporcionar un complejo de celulas de la matriz, o cualquier otro medio conocido en la tecnica para proporcionar terapia celular.

En algunas realizaciones de los metodos de la invencion, la composicion de celulas comprende aproximadamente 50% de celulas derivadas posparto. En realizaciones preferidas, la composicion de celulas comprende sustancialmente solo las celulas derivadas posparto. En realizaciones mas preferidas, la composicion terapeutica comprende celulas de una poblacion sustancialmente homogenea de celulas derivadas posparto.

Tambien se incluyen de acuerdo con la presente invencion metodos para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, en el que el metodo comprende administrar al paciente una composicion que comprende un medio acondicionado generado por las celulas derivadas posparto, un lisado celular generado a partir de las celulas derivadas posparto, una fraccion celular soluble se genera a partir de las celulas derivadas posparto, o una matriz extracelular de las celulas derivadas posparto. La respuesta inmune adversa puede ser enfermedad de injerto contra huesped o rechazo del tejido trasplantado. En estas realizaciones las celulas posparto utilizadas para hacer las composiciones pueden ser celulas derivadas de ombligo, celulas derivadas de la placenta o una combinacion de ambos derivados. Ademas de la composicion, tipos de celulas adicionales o agentes adicionales tales como agentes antitrombogenicos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores, agentes inmunomoduladores, agentes antiapoptoticos se pueden administrar al receptor del trasplante.

Tambien se proporcionan en este documento procedimientos para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, que comprende la administracion de una composicion de celulas derivadas posparto al paciente en una cantidad eficaz para inhibir la respuesta inmune adversa, en la que la composicion de celulas derivadas posparto se administra como un complejo de celulas de la matriz. En ciertas realizaciones, la matriz es un andamio, preferiblemente bioabsorbible, que comprende al menos las celulas derivadas posparto.

Tambien se proporcionan kits para la practica de los metodos de la invencion. Cuando se usa para inhibir una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, los kits incluyen una composicion PPDC, con o sin una matriz, y con o sin un co-cultivo presente. Los kits tambien incluyen opcionalmente un medio de administracion de las celulas, por ejemplo por inyeccion, y un vehnculo farmaceuticamente aceptable para las celulas, si se requiere. Los kits incluyen instrucciones para el uso de las celulas.

Descritos en este documento son bancos de tejidos, celulas, poblaciones y composiciones celulares. Como se discutio anteriormente, los PPDCs son facilmente criopreservados. Por lo tanto en el presente documento se describen metodos para criopreservar las celulas en un banco, en el que las celulas se almacenaron congeladas y se asociaron con una caracterizacion completa de las celulas basadas en propiedades inmunologicas, bioqmmicas y geneticas de las celulas. Las celulas asf congeladas se pueden usar terapeuticamente para trasplantes autologos, singenicos, o alogenicos, dependiendo de los requisitos del procedimiento y de las necesidades del paciente. Preferiblemente, la informacion sobre cada muestra criopreservada se almacena en un ordenador que se puede buscar en base a los requisitos del cirujano, del procedimiento y del paciente con coincidencias que se realizan en base a la caracterizacion de las celulas o poblaciones. Preferiblemente, las celulas se cultivaron y se expandieron a la cantidad deseada de celulas y composiciones celulares se prepararon ya sea por separado o como co-cultivos, en presencia o ausencia de una matriz o soporte. Mientras que para algunas aplicaciones, puede ser preferible usar celulas recien preparadas, el resto puede ser criopreservado y las celulas congeladas y de introducir la informacion en el ordenador para asociar la entrada de ordenador con las muestras. Incluso cuando no es necesario para que coincida con una fuente de trasplante o de un donante con un receptor de dichas celulas con fines inmunologicos, el sistema de banco hace que sea facil de combinar, por ejemplo, propiedades deseables bioqmmicos o geneticos de las celulas almacenadas a las necesidades terapeuticas. Tras la adecuacion de las propiedades deseadas con una muestra de partfculas almacenadas, la muestra se recupera y se preparo para uso terapeutico. Los lisados celulares preparados como se describe en este documento tambien pueden ser criopreservados y almacenados.

En otro aspecto de la descripcion, se proporcionan kits para el aislamiento, el crecimiento y mantenimiento, y el uso de PPDCs. Las celulas, lisados celulares, fracciones celulares solubles, fracciones de membrana y matrices convenientemente se pueden emplear como partes de kits, por ejemplo, para un kit para el cultivo o la implantacion. La invencion proporciona un kit que incluye las celulas derivadas posparto y componentes adicionales, incluyendo instrucciones para el aislamiento, el crecimiento o mantenimiento, o el uso de las celulas o fracciones de celulas, junto con, por ejemplo, la matriz (por ejemplo, un andamio) de material, agentes hidratantes (por ejemplo, soluciones salinas fisiologicamente compatibles, medios de cultivo celular preparado), sustratos de cultivo celular (por ejemplo, platos de cultivo, placas, viales, etc.), medios de cultivo celular (ya sea en forma lfquida o deshidratada), compuestos antibioticos, hormonas, y similares. Los kits para el crecimiento, por ejemplo, incluyen todos los componentes del medio de crecimiento tal como se utiliza en este documento, incluyendo suero, por ejemplo suero bovino fetal. Mientras que el kit puede incluir cualquiera de tales componentes, preferiblemente que incluye todos los ingredientes necesarios para el uso deseado. Si se desea, el kit tambien puede incluir celulas (tfpicamente criopreservadas), que pueden ser sembradas en la red como se describe aqrn. Kits para el aislamiento contendran todo lo necesario para

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practicar los metodos de aislamiento como se proporciona aqm, excepto por el tejido ombligo que debe obtenerse fresco o congelado de un banco de tejidos en el momento de aislamiento. Se proporciona el equipo quirurgico para disociar el tejido, enzimas preferidas, u opciones de enzimas en forma estable, como lo son los tampones y medio, coladores celulares y similares, segun sea necesario o preferido para el metodo como se describe anteriormente. Las instrucciones detalladas con pasos y listas de proveedores de materiales opcionales o alternativos opcionales tambien se proporcionan convenientemente. Las celulas de control pueden ser incluidas para comparacion de las celulas aisladas a, por ejemplo los cultivos de UDC depositados en la ATCC.

Kits para la utilizacion de los PPDCs contienen preferiblemente poblaciones de las celulas, o las composiciones que comprenden las celulas, componentes y productos, o fracciones o medios condicionados derivados de las celulas como se describio anteriormente. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir una o mas poblaciones de celulas, incluyendo al menos PDC y/o UDC y un vehmulo farmaceuticamente aceptable (lfquido, semi-solido o solido). Las poblaciones en algunas realizaciones son lmeas celulares homogeneas o incluso clonales de UDC o PDC. En otras realizaciones, los kits incluyen otras lmeas celulares para su uso en cocultivo. Los kits incluyen preferiblemente agentes bioactivos adicionales segun se desee, por ejemplo, agentes anti-trombogenicos, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-apoptoticos, y inmunosupresores o compuestos inmunomoduladores. Los kits tambien pueden incluir opcionalmente un medio de administracion de las celulas, por ejemplo por inyeccion. Los kits pueden incluir ademas instrucciones para el uso de las celulas. Kits preparados para uso hospitalario, como para uso militar, pueden incluir suministros de procedimiento completo incluyendo de andamiaje de tejido, suturas quirurgicas, y similares, donde las celulas se van a utilizar en conjuncion con la reparacion de lesiones agudas. Kits para ensayos y metodos in vitro tal como se describe en el presente documento pueden contener uno o mas de (1) UDC o fracciones, componentes o productos de UDC, (2) los reactivos para la practica del metodo in vitro, (3) otras celulas o poblaciones de celulas, como apropiadas, por ejemplo para cocultivos e (4) instrucciones para realizar el metodo in vitro. Los kits para la preparacion de componentes derivados de celulas pueden incluir tanto los componentes requeridos para el crecimiento de las celulas y los componentes necesarios para la preparacion de la fraccion de celulas de interes, junto con las instrucciones para obtener la fraccion deseada de las celulas. Kits para la produccion de y recogida de medio acondicionado tambien se proporcionan en el presente documento e incluyen celulas, medio, recipientes de recogida, instrucciones, normas para ensayar las moleculas secretadas de interes y similares.

Los siguientes ejemplos describen varios aspectos de formas de realizacion de la invencion con mayor detalle. Estos ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente, no para limitar, aspectos de la invencion descritos en este documento.

EJEMPLO 1

Derivacion de celulas de tejido posparto

Este ejemplo describe la preparacion de celulas derivadas posparto de tejidos del cordon placentario y umbilicales. Cordones umbilicales del posparto y placentas fueron obtenidos despues del nacimiento ya sea de un termino o un embarazo prematuro. Las celulas se recogieron a partir de 5 donantes separados de ombligo y tejido placentario. Diferentes metodos de aislamiento de celulas se ensayaron para determinar su capacidad para producir celulas con: 1) el potencial de diferenciarse en celulas con diferentes fenotipos, una caractenstica comun a las celulas madre, o 2) el potencial de proporcionar factores troficos utiles para otras celulas y tejidos.

Metodos y materiales

Aislamiento de celulas umbilicales. Los cordones umbilicales se obtuvieron de National Disease Research Interchange (ISRND, Filadelfia, PA). Se obtuvieron los tejidos despues de partos normales. El protocolo de aislamiento de celulas se realizo asepticamente en una campana de flujo laminar. Para eliminar la sangre y los residuos, el cable se lavo en tampon fosfato salino (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) en presencia de antimicoticos y antibioticos (100 unidades/mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina, 0,25 microgramos/mililitro de anfotericina B). Los tejidos fueron entonces disociados mecanicamente en 150 cm2 de placas de cultivo de tejido en presencia de 50 mililitros de medio (DMEM de baja glucosa o DMEM de alta glucosa; Invitrogen), hasta que el tejido se troceo en una pulpa fina. Los tejidos picados se transfirieron a tubos de 50 ml conicos (aproximadamente 5 gramos de tejido por tubo). El tejido se digiere en medio de glucosa o bien un medio de DMEM-glucosa baja o DMEM-glucosa alta, conteniendo cada uno antimicoticos y antibioticos como se describe anteriormente. En algunos experimentos, se uso una mezcla de enzimas de colagenasa y dispasa ("C: D;" colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 500 unidades/mililitro; y dispasa (Invitrogen), 50 unidades/mililitro en medio DMEM-Baja glucosa). En otros experimentos una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa ("C: D: H") se utilizo (colagenasa, 500 unidades/mililitro; dispasa, 50 unidades/mililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 unidades/mililitro, en DMEM: Baja glucosa). Los tubos conicos que contienen las enzimas de tejido, medio y de digestion se incubaron a 37°C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm durante 2 horas.

Despues de la digestion, los tejidos se centrifugaron a 150 xg durante 5 minutos, el sobrenadante se aspiro. El sedimento se resuspendio en 20 mililitros de medio de crecimiento (DMEM: Baja glucosa (Invitrogen), 15 por

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ciento (v) de suero v/bovino fetal (FBS; suero bovino definido; Lote # AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) 2-mercaptoetanol (Sigma), 1 mililitro por 100 mililitros de antibiotico/antimicotico como se describe anteriormente. La suspension celular se filtro a traves de un filtro de celulas de nylon de 70 micrometros (BD Biosciences). Un enjuague adicional de 5 mililitros que comprende medio de crecimiento se paso a traves del tamiz. La suspension celular se paso despues a traves de un filtro de celulas de nylon de 40 micrometros (BD Biosciences) y se extrajo con un enjuague de 5 mililitros adicionales de medio de crecimiento.

El filtrado se volvio a suspender en medio de crecimiento (volumen total 50 mililitros) y se centrifugo a 150 xg durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiro y las celulas se resuspendieron en 50 mililitros de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitio dos veces mas.

Tras la centrifugacion final, el sobrenadante se aspiro y el sedimento celular se resuspendio en 5 mililitros de medio de crecimiento fresco. Se determino el numero de celulas viables mediante tincion con azul tripan. Las celulas se cultivaron a continuacion bajo condiciones estandar.

Las celulas aisladas a partir de cordones umbilicales se sembraron a 5.000 celulas/cm2 en frascos recubiertos de gelatina de T-75 cm2 (Corning Inc., Corning, NY) en medio de crecimiento con antibioticos/antimicoticos como se describio anteriormente. Despues de 2 dfas (en varios experimentos, las celulas se incubaron a partir de 2-4 dfas), el medio gastado se aspiro de los matraces. Las celulas se lavaron con PBS tres veces para eliminar los residuos y las celulas derivadas de la sangre. Las celulas fueron entonces rellenadas con medio de crecimiento y se dejaron crecer hasta la confluencia (aproximadamente 10 dfas desde el paso 0) para el paso 1. En pasajes posteriores (del paso 1 a 2 y asf sucesivamente), las celulas alcanzaron sub-confluencia (confluencia del 75-85 por ciento) en 4-5 dfas. Para estos pasajes posteriores, las celulas se sembraron a 5000 celulas/cm2. Las celulas se cultivaron en un incubador humidificado con 5 por ciento de dioxido de carbono y oxfgeno del aire, a 37°C.

El aislamiento de la celula placentaria. El tejido placentario se obtuvo de NDRI (Filadelfia, PA). Los tejidos eran de un embarazo y se obtuvieron en el momento de una administracion quirurgica normal. Se aislaron celulas de la placenta como se describe para el aislamiento de celulas umbilicales.

El siguiente ejemplo se aplica al aislamiento de poblaciones separadas de celulas derivadas de la madre y celulas derivadas de neonatales de tejido placentario.

El protocolo de aislamiento de celulas se realizo asepticamente en una campana de flujo laminar. El tejido de la placenta se lavo en solucion salina tamponada con fosfato (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) en presencia de antimicoticos y antibioticos (como se describe mas arriba) para eliminar la sangre y los residuos. A continuacion, el tejido de la placenta se diseco en tres secciones: la primera lmea (aspecto o lado neonatal), lmea media (aislamiento de celulas mixtas neonatal y materna) y la lmea inferior (lado materno o aspecto).

Las secciones separadas fueron lavadas individualmente varias veces en PBS con antibiotico/antimicotico para eliminar adicionalmente la sangre y los residuos. A continuacion, cada seccion se disocio mecanicamente en 150 cm2 de placas de cultivo de tejido en presencia de 50 mililitros de DMEM/baja glucosa, a una pasta fina. La pulpa se transfirio a tubos de 50 ml conicos. Cada tubo contema aproximadamente 5 gramos de tejido. El tejido fue digerido ya sea en glucosa DMEM-Baja o DMEM media de alta glucosa que contema (100 U de penicilina/mililitro, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina, 0,25 microgramos/mililitro de anfotericina B) y enzimas de digestion. En algunos experimentos una mezcla de enzimas de colagenasa y dispasa ("C: D") se utilizo que contiene colagenasa (Sigma, St Louis, MO) a 500 unidades/mililitro y dispasa (Invitrogen) a 50 unidades/mililitro en medio DMEM-Baja glucosa. En otros experimentos se utilizo una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa (C: H: D) (colagenasa, 500 unidades/mililitro; dispasa, 50 unidades/mililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 unidades/mililitro en DMEM-Baja glucosa). Los tubos conicos que contienen el tejido, medio, y las enzimas de digestion se incubaron durante 2 h a 37°C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm.

Despues de la digestion, los tejidos se centrifugaron a 150 xg durante 5 minutos, el sobrenadante resultante se aspiro. El sedimento se resuspendio en 20 mililitros de medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina/anfotericina B. La suspension celular se filtro a traves de un filtro de celulas de nylon de 70 micrometros (BD Biosciences), y luego por un enjuague con un 5 mililitros adicionales de medio de crecimiento. La suspension total de celulas se paso por un filtro de celulas de nylon de 40 micrometros (BD Biosciences) seguido por 5 mililitros adicionales de medio de crecimiento como un enjuague.

El filtrado se volvio a suspender en medio de crecimiento (volumen total de 50 mililitros) y se centrifugo a 150 xg durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiro y el sedimento celular se resuspendio en 50 mililitros de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitio dos veces mas. Despues de la centrifugacion final, el sobrenadante se aspiro y el sedimento celular se resuspendio en 5 mililitros de medio de crecimiento fresco. Un recuento de celulas se determino mediante la prueba de exclusion de azul de tripano. Las celulas se cultivaron luego en condiciones estandar.

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Aislamiento de celulas LIBERASE. Las celulas fueron aisladas de tejidos de ombligo en medio de DMEM- Baja glucosa con LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) (2,5 miligramos por mililitro, Blendzyme 3®; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) y hialuronidasa (5 unidades/mililitro, Sigma). La digestion del tejido y aislamiento de las celulas era como se describe para otras digestiones de proteasa anteriormente, utilizando la mezcla de LIBERASE/hialuronidasa en lugar de la mezcla de enzimas C: D o C: D: H. la digestion del tejido con LIBERASE resulto en el aislamiento de poblaciones de celulas de los tejidos posparto que se expandieron facilmente.

Aislamiento de celulas usando otras combinaciones de enzimas. Los procedimientos se compararon para el aislamiento de celulas del cordon umbilical utilizando diferentes combinaciones de enzimas. Las enzimas para la digestion en comparacion incluyen: i) colagenasa; ii) dispasa; iii) hialuronidasa; iv) mezcla de colagenasa:dispasa (C; D); v) mezcla de colagenasa: hialuronidasa (C: H); vi) mezcla dispasa: hialuronidasa (D: H); y vii) mezcla de colagenasa: dispasa: hialuronidasa (C: D: H). Las diferencias en el aislamiento de celulas que utilizan estas diferentes condiciones de digestion de la enzima se observaron (Tabla 1-1).

Tabla 1-1: Aislamiento de celulas de tejido del cordon umbilical utilizando diferentes combinaciones de enzimas

Digestion con enzimas: Celulas aisladas Expansion de celulas

Colagenasa: x x

Dispasa: + (> 10 h) +

Hialuronidasa: x x

Colagenasa: dispasa: ++ (<3 h) ++

Colagenasa: hialuronidasa: ++ (<3 h) +

Dispasa: hialuronidasa: + (> 10 h) +

Colagenasa: dispasa: hialuronidasa: +++ (<3 h) +++

Clave: + = bueno, ++ = muy bueno, +++ = excelente, X = sin exito bajo condiciones ensayadas

Aislamiento de celulas de la sangre residual en las cuerdas. Se hicieron otros intentos de aislar grupos de celulas de cordon umbilical por diferentes enfoques. En un caso, el cordon umbilical se corto y se lavo con medio de crecimiento para desalojar a los coagulos de sangre y material gelatinoso. Se recogio la mezcla de sangre, material gelatinoso y el medio de crecimiento y se centrifugo a 150 x g. El sedimento se resuspendio y se sembro en matraces recubiertos con gelatina en medio de crecimiento. A partir de estos experimentos, se aislo una poblacion de celulas que se expandio rapidamente.

Aislamiento de celulas de sangre de cordon. Las celulas tambien se han aislado de muestras de sangre de cordon alcanzado desde NDRI. El protocolo de aislamiento utilizado aqrn fue el de la solicitud de patente internacional PCT/US2002/029971 por Ho et al (Ho, T.W. et al., WO2003025149 A2). Las muestras (50 mililitros y 10,5 mililitros, respectivamente) de la sangre del cordon umbilical (NDRI, Philadelphia PA) se mezclaron con tampon de lisis (155 mM de cloruro de amonio esterilizado por filtracion, bicarbonato de potasio de 10 milimolares, 0,1 milimolar de EDTA tamponada a pH 7,2 (todos los componentes de Sigma, St. Louis, MO)). Las celulas se lisaron en una proporcion de sangre 1:20 espinal a tampon de lisis. La suspension celular resultante se agito con vortex durante 5 segundos y se incubo durante 2 minutos a temperatura ambiente. El lisado se centrifugo (10 minutos a 200 xg). El sedimento celular se resuspendio en medio esencial mmimo completo (Gibco, Carlsbad CA) que contiene 10 por ciento de suero fetal bovino (Hyclone, Logan UT), glutamina de 4 milimolares (Mediatech Herndon, VA), 100 unidades de penicilina por 100 mililitros y 100 microgramos de estreptomicina por cada 100 mililitros (Gibco, Carlsbad, CA). Se centrifugaron las celulas resuspendidas (10 minutos a 200 xg), se aspiro el sobrenadante, y el sedimento celular se lavo en medio completo. Las celulas se sembraron directamente en cualquiera de matraces T75 (Corning, NY), frascos recubiertos con laminina de T75, o matraces recubiertos de fibronectina de T175 (ambos de Becton Dickinson, Bedford, MA).

El aislamiento de las celulas utilizando diferentes combinaciones de enzimas y condiciones de crecimiento. Para determinar si las poblaciones de celulas podnan ser aisladas en diferentes condiciones y expandidas bajo una variedad de condiciones inmediatamente despues del aislamiento, se digirieron las celulas en medio de crecimiento con o sin el 0,001 por ciento (v/v) 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), utilizando la combinacion de enzimas de C: D: H, de acuerdo con los procedimientos previstos anteriormente. celulas derivadas de placenta asf aisladas se sembraron bajo una variedad de condiciones. Todas las celulas se cultivaron en presencia de penicilina/estreptomicina. (Tabla 1-2).

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Tabla 1-2: Aislamiento y expansion de cultivo de las celulas posparto en condiciones variables:

Condicion: Medio 15% de FBS BME Gelatina 20% de O2 Factores de crecimiento

1: DMEM-Lg Y Y Y Y N

2: DMEM-Lg Y Y Y N (5%) N

3: DMEM-Lg Y Y norte Y N

4: DMEM-Lg Y Y norte N (5%) N

5: DMEM-Lg N (2%) Y N (laminina) Y EGF/FGF (20 ng/ml)

6: DMEM-Lg N (2%) Y N (laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/ml)

7: DMEM-Lg N (2%) Y N (fibrona) Y PDGF/VEGF

8: DMEM-Lg N (2%) Y N (fibrona) N (5%) PDGF/VEGF

9: DMEM-Lg Y N Y Y N

10: DMEM-Lg Y N Y N (5%) N

11: DMEM-Lg Y N N Y N

12: DMEM-Lg Y N N N (5%) N

13: DMEM-Lg N (2%) N N (laminina) Y EGF/FGF (20 ng/ml)

14: DMEM-Lg N (2%) N N (laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/ml)

15: DMEM-Lg N (2%) N N (fibrona) Y PDGF/VEGF

16: DMEM-Lg N (2%) N N (fibrona) N (5%) PDGF/VEGF

El aislamiento de las celulas utilizando diferentes combinaciones de enzimas y condiciones de crecimiento. En todas las condiciones de las celulas unidas y expandidas bien entre el paso 0 y 1 (Tabla 1-2). Las celulas en condiciones 5-8 y 13-16 se demostraron a proliferar bien hasta 4 pasajes despues de la siembra momento en el que se crioconservaron y se almacenaron.

Resultados

El aislamiento celular usando diferentes combinaciones de enzimas. La combinacion de C: D: H,

proporciono el mejor rendimiento de celulas despues del aislamiento, y genero celulas que se expandieron para muchas mas generaciones en cultivo que las otras condiciones (Tabla 1-1). Una poblacion de celulas expandibles no se alcanzo usando colagenasa o hialuronidasa sola. No se hizo ningun intento para determinar si este resultado es espedfico para el colageno que fue examinado.

El aislamiento de las celulas utilizando diferentes combinaciones de enzimas y condiciones de crecimiento. Celulas unidas y expandidas bien entre el paso 0 y 1 en todas las condiciones ensayadas para la digestion enzimatica y el crecimiento (Tabla 1-2). Las celulas en condiciones experimentales 5-8 y 13-16 se proliferaron bien hasta 4 pasajes despues de la siembra, momento en el que eran criopreservadas. Todas las celulas se almacenaron para una mayor investigacion.

El aislamiento de celulas de la sangre residual en las cuerdas. Celulas nucleadas se unieron y crecieron rapidamente. Estas celulas se analizaron por citometna de flujo y fueron similares a las celulas obtenidas por digestion enzimatica.

El aislamiento de las celulas de sangre de cordon. Las preparaciones conteman celulas de sangre rojas y plaquetas. Ninguna celula nucleada se unio ni se dividio durante las primeras 3 semanas. El medio se cambio 3 semanas despues de la siembra y no se observo union ni crecimiento de las celulas.

Resumen. Las poblaciones de celulas pueden ser derivadas de cordon umbilical y tejido placentario eficientemente usando la combinacion de enzimas de colagenasa (una metaloproteasa de matriz), dispasa (una proteasa neutra) y hialuronidasa (una enzima mucolftica que rompe el acido hialuronico). LIBERASE, que es un Blendzyme®, tambien puede ser utilizado. Espedficamente, Blendzyme 3®, que es colagenasa (4 Wunsch unidades/g) y la termolisina (1.714 casema Unidades/g) tambien se utilizo junto con hialuronidasa para aislar celulas. Estas celulas se expandieron facilmente sobre muchos pasajes cuando se cultivaron en medio de crecimiento en plastico recubierto de gelatina.

Las celulas tambien se aislaron de sangre residual en las cuerdas, pero no la sangre del cordon. La presencia de celulas en los coagulos de sangre lavados del tejido, que se adhieren y crecen bajo las condiciones usadas, puede deberse a que las celulas se liberen durante el proceso de diseccion.

EJEMPLO2

Caracteristicas de crecimiento de celulas derivadas del posparto

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El potencial de expansion celular de las celulas derivadas posparto (PPDCs) se comparo con otras poblaciones de celulas madre aisladas. El proceso de expansion de las celulas a la senescencia se denomina lfmite de Hayflick (Hayflick L. 1974a, 1974b). Celulas derivadas posparto son altamente adecuadas para uso terapeutico ya que pueden ser facilmente expandidas a los numeros de celulas suficientes.

Materiales y metodos

Matraces recubiertos de gelatina. Matraces de plastico de cultivo de tejidos se recubrieron mediante la adicion de 20 mililitros 2% (p/v) de gelatina porcina (tipo B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, MO) a un matraz T75 (Corning, Corning, NY) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Despues de retirar la solucion de gelatina, la solucion salina tamponada con fosfato 10 mililitros (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) se anadio y luego se aspiro.

Comparacion de la expansion potencial de PPDCs con otras poblaciones de celulas. Para la comparacion de potencial extension del crecimiento se utilizaron las siguientes poblaciones de celulas; i) Las celulas madre mesenquimales (MSC; Cambrex, Walkersville, MD); ii) celulas derivadas de tejido adiposo (Patente de EE.UU. N° 6.555.374 B1; solicitud de patente US US200400584l2); iii) los fibroblastos de piel dermica normal (CC- 2509 Lote # 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD); iv) celulas derivadas del ombligo; y v) celulas derivadas de placenta. Las celulas se sembraron inicialmente a 5.000 celulas/cm2 en matraces T75 recubiertos con gelatina en medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina/anfotericina B. Para pasajes posteriores, los cultivos celulares se trataron como sigue. Despues de tripsinizacion, las celulas viables se contaron despues de la tincion de azul de tripano. La suspension celular (50 microlitros) se combino con azul de tripano (50 mililitros, Sigma, St. Louis MO). el numero de celulas viables se estimo utilizando un hemocitometro.

Tras el recuento, las celulas se sembraron a 5.000 celulas/cm2 en matraces recubiertos de gelatina de T 75 en 25 mililitros de medio de crecimiento fresco. Las celulas se cultivaron en condiciones estandar a 37°C. El medio de crecimiento se cambio dos veces por semana. Cuando las celulas alcanzaron aproximadamente el 85 por ciento de confluencia fueron pasados; este proceso se repitio hasta que las celulas alcanzaron la senectud.

En cada paso, se tripsinizaron y se contaron las celulas. El rendimiento de celulas viables, duplicacion de la poblacion [ln (celula final/celula inicial)/ln 2] y el tiempo de duplicacion (tiempo en cultivo (h)/duplicacion de la poblacion) se calcularon. Para los fines de la determinacion de la expansion celular optima, el rendimiento total de celulas por paso se determino multiplicando el rendimiento total para el paso anterior por el factor de expansion para cada paso (es decir, la expansion = factor de celula inicial/celula final).

Potencial de expansion de bancos de celulas a baja densidad. El potencial de expansion de las celulas en bancos en el paso 10 se ensayo tambien, utilizando un conjunto diferente de condiciones. Se ensayaron celulas derivadas de ombligo, y celulas derivadas de la placenta; fibroblastos normales de la piel dermica (Cambrex, Walkersville, MD cc-2509 Lote # 9F0844). Estas poblaciones celulares se habfan depositado en el paso 10 anteriormente, habiendo sido cultivadas a 5.000 celulas/cm2 y cultivadas hasta la confluencia en cada paso a ese punto. Se determino el efecto de la densidad celular en las poblaciones de celulas tras descongelacion de celulas en el paso 10. Las celulas se descongelaron en condiciones estandar y se contaron usando coloracion de azul de tripano. Las celulas descongeladas eran entonces sembradas a 1.000 celulas/cm2 en DMEM: Baja glucosa de medio de crecimiento con antibiotico/antimicotico como se describe anteriormente. Las celulas se cultivaron en condiciones atmosfericas estandar a 37°C. El crecimiento medio se cambio dos veces a la semana y se pasaron las celulas cuando alcanzaron aproximadamente el 85% de confluencia. Las celulas se pasaron posteriormente hasta la senescencia, es decir, hasta que no pudieron ser ex expandidas mas. Las celulas se trataron con tripsina y se contaron en cada pase. El rendimiento celular, duplicacion de la poblacion (In (celula final/celula inicial)/ln 2) y tiempo de duplicacion (tiempo en cultivo (h)/duplicacion de poblacion). El rendimiento total de celulas por paso se determino multiplicando el rendimiento total para el paso anterior por el factor de expansion para cada paso (es decir, factor de expansion = celula inicial/celula final).

Expansion de PPDCs a baja densidad de la siembra de celulas iniciales. Se ensayo el potencial de expansion de PPDCs recien aisladas en condiciones de baja siembra de celulas. PPDDs se prepararon como se describe en este documento. Las celulas se sembraron a 1000 celulas/cm2 y se pasaron como se describio anteriormente hasta la senescencia. Las celulas se cultivaron en condiciones atmosfericas estandar a 37°C. El crecimiento medio se cambio dos veces por semana. Las celulas se pasaron cuando alcanzaron aproximadamente el 85% de confluencia. En cada paso, las celulas se tripsinizaron y se contaron mediante tincion con azul de tripano. El rendimiento celular, duplicacion de la poblacion (In (celula final/celula inicial)/ln 2) y tiempo de duplicacion (tiempo en cultivo (h)/duplicacion de la poblacion) se calcularon para cada pasaje. El rendimiento total de celulas por paso se determino multiplicando el rendimiento total para el paso anterior por el factor de expansion para cada paso (es decir, expansion = factor de celula inicial/celula final). Las celulas se cultivaron en matraces recubiertos de gelatina y no con gelatina.

La expansion de celulas derivadas de la placenta neonatal clonal. La clonacion se utilizo con el fin de

expandir una poblacion de celulas neonatales de tejido placentario. Tras el aislamiento de tres poblaciones de celulas diferenciales a partir de la placenta (segun lo estipulado en el presente documento), estas poblaciones de

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celulas se expandieron en condiciones de crecimiento estandar y luego se cariotiparon para revelar la identidad de las poblaciones de celulas aisladas. Debido a que las celulas fueron aisladas de una madre que pario un nino, que era facil de distinguir entre los cromosomas masculinos y femeninos mediante la realizacion de metafase para untar. Estos experimented demostraron que las celulas de aspecto fetal eran de cariotipo positivo para fenotipo neonatal, las celulas de capa intermedia eran de cariotipo positivo para fenotipos tanto neonatal como materno y celulas de aspecto materno fueron de cariotipo positivo para celulas maternas.

Expansion de las celulas en condiciones de cultivo de bajo oxigeno. Se ha demostrado que las condiciones de cultivo de celulas de bajo oxfgeno pueden mejorar la expansion de celulas en determinadas circunstancias (US20040005704). Para determinar si la expansion de celulas de PPDCs podna mejorarse mediante la alteracion de las condiciones de cultivo de celulas, cultivos de celulas umbilicales derivados se cultivaron en condiciones de bajo oxfgeno. Las celulas se sembraron a 5000 celulas/cm2 en medio de crecimiento en matraces recubiertos con gelatina. Las celulas se cultivaron inicialmente en condiciones atmosfericas estandar a traves de paso 5, momento en el que se transfirieron a condiciones de cultivo de bajo oxfgeno (5% O2).

Otras condiciones de crecimiento. En otros protocolos, las celulas se expandieron en placas recubiertas de protema no recubierta, recubiertas con colageno, recubiertas con fibronectina, recubiertas con laminina y de la matriz extracelular. Los cultivos se han demostrado para expandir bien en estos diferentes matrices.

Resultados

Comparacion de la expansion potencial de PPDCs con otras celulas madre y poblaciones de celulas no madre. Tanto las celulas derivadas umbilicales y derivadas de la placenta expandidas para mas de 40 pasajes generando rendimientos de celulas de > 1E17 celulas en 60 dfas. Por el contrario, las MSC y los fibroblastos a senectud despues de <25 dfas y <60 dfas, respectivamente. Aunque las celulas derivadas de tejido adiposo se expandieron durante casi 60 dfas, generaron los rendimientos celulares totales de 4.5E12. Por lo tanto, cuando se sembraron a 5000 celulas/cm2 en las condiciones experimentales utilizadas, las celulas derivadas posparto se expandieron mucho mejor que los otros tipos de celulas cultivadas bajo las mismas condiciones (Tabla 2-1).

Tabla 2-1: caractensticas de crecimiento para diferentes poblaciones de celulas cultivadas a la senescencia

Tipo de celula: Senectud Poblacion total duplicaciones El rendimiento total de la celula

MSC: 24 d 8 4,72 E7

Adiposo: 57 d 24 4,5 E12

Fibroblastos: 53 d 26 2,82 E13

Ombligo: 65 d 42 6,15 E17

Placenta: 80 d 46 2,49 E19

Potencial de expansion de los bancos de celulas a baja densidad. Celulas derivadas del ombligo, derivadas de la placenta y de fibroblastos ampliadas para mas de 10 pasajes que generan rendimientos de celulas de > 1E11 celulas en 60 dfas (Tabla 2-2). Despues de 60 dfas en estas condiciones, los fibroblastos se volvieron senescentes mientras que poblaciones de celulas derivadas de ombligo y las de la placenta senescentes despues de 80 dfas, completando > 50 y > 40 duplicaciones de poblacion, respectivamente.

Tabla 2-2: Caractensticas de crecimiento para las diferentes poblaciones celulares utilizando expansion de crecimiento de baja densidad de paso 10 hasta la senescencia

Tipo de celula: Senectud Duplicaciones de poblacion totales Rendimiento total de la celula

Fibroblastos (P10): 80 d 43,68 2,59 E11

Ombligo (P10): 80 d 53,6 1,25 E14

Placenta (P10): 60 d 32,96 6,09 E12

La expansion de PPDCs a baja densidad de la siembra de celulas inicial. PPDCs se ampliaron a baja densidad (1000 celulas/cm2) en placas o matraces recubiertos de gelatina y no recubiertos. El potencial de crecimiento de estas celulas en estas condiciones era bueno. Las celulas expandidas facilmente en una fase de crecimiento logantmico. La tasa de expansion de celulas fue similar a la observada cuando se sembraron celulas derivadas de la placenta a 5000 celulas/cm2 en matraces recubiertos con gelatina en medio de crecimiento. No se observaron diferencias en el potencial de la expansion celular entre el cultivo en cualquiera de los frascos no recubiertos o matraces recubiertos de gelatina. Sin embargo, las celulas paredan fenotfpicamente mucho mas pequenas en matraces recubiertos de gelatina y se observaron mas fenotipos de celulas mas grandes en frascos no recubiertos.

Expansion de celulas neonatales clonales o derivadas de la placenta materna. Una poblacion de

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celulas clonales neonatales o maternas se puede ampliar a partir de celulas derivadas de placenta aisladas del aspecto neonatal o del aspecto maternal, respectivamente, de la placenta. Las celulas se diluyeron en serie y despues se sembraron en placas recubiertas con gelatina en medio de crecimiento para la expansion a 1 celula/pocillo en placas recubiertas de gelatina de 96 pocillos. A partir de esta clonacion inicial, se identifican clones expansivos, se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en placas revestidas de gelatina de 12 pocillos en medio de crecimiento y luego se pasaron posteriormente en matraces recubiertos de gelatina T25 a 5.000 celulas/cm2 en medio de crecimiento. La subclonacion se lleva a cabo para asegurar que una poblacion clonal de celulas ha sido identificada. Para subclonar los experimentos, las celulas se tripsinizaron y se volvieron a sembrar a 0,5 celulas/pocillo. Los subclones que crecen bien se expandieron en matraces T25 recubiertos con gelatina a 5.000 celulas cm2 /matraz. Las celulas se pasaron a 5.000 celulas cm2/matraz T75. Las caractensticas de crecimiento de un clon se pueden trazar para demostrar la expansion celular. El analisis de cariotipo puede confirmar que el clon es neonatal o materno.

La expansion de las celulas en condiciones de bajo cultivo de oxigeno. Celulas expandidas bien bajo las condiciones de oxfgeno reducido, sin embargo, el cultivo en condiciones de bajo oxfgeno no parecen tener un efecto significativo en la expansion de celulas de PPDCs en las condiciones utilizadas.

Resumen. Condiciones de expansion celular que comprenden el cultivo de celulas derivadas del parto aisladas a densidades de aproximadamente 5.000 celulas/cm2, en medio de crecimiento en matraces recubiertos de gelatina o no revestidos, bajo ,oxfgeno atmosferico estandar, son suficientes para generar grandes numeros de celulas en el paso 11. Ademas, los datos sugieren que las celulas pueden expandirse facilmente utilizando condiciones de cultivo de menor densidad (por ejemplo, 1000 celulas/cm2). La expansion de celulas derivadas postparto en condiciones de bajo oxfgeno tambien facilita la expansion de las celulas, aunque todavfa no se ha observado mejora incremental en el potencial de la expansion de celulas cuando se utilizan estas condiciones para el crecimiento. Actualmente, el cultivo de las celulas derivadas posparto bajo condiciones atmosfericas estandares se prefiere para la generacion de grandes grupos de celulas. Sin embargo, cuando se alteran las condiciones de cultivo, la expansion de celulas derivadas posparto puede igualmente ser alterada. Esta estrategia se puede utilizar para mejorar la capacidad proliferativa y de diferenciacion de estas poblaciones de celulas. Bajo las condiciones utilizadas, mientras que el potencial de expansion de MSC y celulas derivadas de tejido adiposo es limitado, las celulas derivadas posparto expanden facilmente a un gran numero.

Referencias para el Ejemplo 2

1) Hayflick L. 1974a. J Am Soc Geriatr. 22: 1-12.

2) Hayflick L. 1974b. Gerontologist. 14: 37-45.

3) Publicacion de patente de EE.UU. US20040058412

4) Publicacion de patente de EE.UU. US20040048372

5) Publicacion de patente de EE.UU. US20040005704.

EJEMPLO 3

Evaluacion de Medios de Crecimiento de celulas derivadas del Placenta

Se evaluaron varios medios de cultivo celular por su capacidad para apoyar el crecimiento de celulas derivadas de la placenta. El crecimiento de las celulas derivadas de la placenta en oxfgeno normal (20%) y bajo (5%) se evaluo despues de 3 dfas utilizando el ensayo colorimetrico MTS.

Metodos y materiales

Celulas derivadas de placenta en el paso 8 (P8) se sembraron a 1 x 103 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina. Despues de 8 horas el medio se cambio como se describe a continuacion y las celulas se incubaron en oxfgeno normal (atmosferico) (5% v/v) o bajo a 37°C, 5% de CO2 durante 48 horas. MTS se anadio al medio de cultivo (CELLTITER 96 AZueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI) durante 3 horas y la absorbancia medida a 490 nanometros (Molecular Devices, Sunnyvale CA).

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Tabla 3-1. Medios de cultivo

Medio de cultivo: Proveedor Suero bovino fetal anadido% (v/v)

DMEM baja glucosa: Gibco Carlsbad CA 0,2 10

DMEM alta glucosa: Gibco 0,2 10

RPMI 1640: Mediatech, Inc. Herndon, VA 0,2 10

Celula libre gro (libre de suero, libre de protemas: Mediatech, Inc. -

F10 de Ham: Mediatech, Inc. 0,2 10

MSCGM (con suero): Cambrex, Walkersville, MD 0,2 10

Completo libre de suero w/albumina: Mediatech, Inc. -

Medio de crecimiento: N/A -

F12 de Ham: Mediatech, Inc. 0,2 10

Iscove: Mediatech, Inc. 0,2 10

Medio Basal de Eagle: Mediatech, Inc.

DMEM/F12 (1: 1): Mediatech, Inc. 0,2 10

Resultados

Las curvas de calibracion para el ensayo de MTS establecieron una correlacion lineal entre un aumento en la absorbancia y un aumento en el numero de celulas. Los valores de absorbancia obtenidos se convirtieron en el numero de celulas estimado y se calculo el cambio (%) con respecto a la siembra inicial.

El efecto del suero. La adicion de suero a medios de comunicacion en condiciones normales de oxfgeno resulto en un incremento dependiente de la dosis reproducible en la absorbancia y por lo tanto el numero de celulas viables. La adicion de suero para completar MSCGm resulto en una disminucion dependiente de la dosis en la absorbancia. En los medios sin suero anadido, celulas solo crecieron apreciablemente en, CELLGRO-FREE, F10 de Ham y DMEM.

El efecto del oxigeno. oxfgeno reducido parecio aumentar la tasa de crecimiento de las celulas en medio de crecimiento, F10 de Ham, y MSCGM. Con el fin de crecimiento decreciente, los medios de comunicacion que resultan en el mejor crecimiento de las celulas eran Medio de Crecimiento> MSCGM> + 10% FBS = DMEM-H + l0% FBS = F12 de Ham + 10% FBS = RPMI 1640 + 10% de FBS de Iscove.

Resumen. celulas derivadas de placenta pueden cultivarse en una variedad de medios de cultivo en oxfgeno normal o bajo. El crecimiento a corto plazo de celulas derivadas de la placenta se determino en doce medios basales con suero de 0, 2 y 10% (v/v) en 5% o el oxfgeno atmosferico. En general, las celulas derivadas de la placenta no crecieron tan bien en condiciones libres de suero con la excepcion de F10 de Ham y CELLGRO-Free, que son tambien libres de protemas. El crecimiento en estos medios libres de suero fue de aproximadamente 2533% del crecimiento maximo observado con medios que contienen 15% de suero.

EJEMPLO 4

Crecimiento de celulas derivadas posparto en D-valina que contiene medio

Se ha informado de que el medio que contiene D-valina en lugar de la isoforma normal de L-valina se puede utilizar para inhibir selectivamente el crecimiento de celulas similares a fibroblastos en cultivo (Hongpaisan, 2000; Sordillo et al., 1988). No se sabfa previamente si las celulas derivadas posparto podnan crecer en medio que contiene D-valina.

Metodos y materiales

Celulas derivadas de placenta (P3), fibroblastos (P9) y celulas derivadas del ombligo (P5) se sembraron a 5 x 103 celulas/cm2 en matraces T75 recubiertos con gelatina (Corning, Corning, NY). Despues de 24 horas se retiro el medio y las celulas se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) para eliminar el medio residual. El medio se reemplazo con un medio de crecimiento modificado (DMEM con D-valina (orden de Gibco especial), 15% (v/v) de suero fetal bovino dializado (Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) beta-mercaptoetanol (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)).

Resultados

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Celulas derivadas de placenta, derivadas del ombligo, y de fibroblastos sembradas en el medio que contiene D-valina no proliferaron, a diferencia de las celulas sembradas en medio de crecimiento que contema suero dializado. Celulas de fibroblastos cambiaron morfologicamente, se aumentaron en tamano y se cambiaron de forma. Todas las celulas murieron y eventualmente se separaron de la superficie del matraz despues de 4 semanas. Estos resultados indican que el medio que contiene D-valina no es adecuado para celulas derivadas posparto de crecimiento selectivo.

Referencias para el Ejemplo 4

1) Hongpaisan J. 2000. Cell Biol Int. 24: 1-7,

2) Sordillo LM, Oliver SP, Akers RM. 1988). Cell Biol Int Rep. 12: 355-64.

EJEMPLO5

Medios de crioconservacion para celulas derivadas de placenta

Se evaluaron los medios de crioconservacion para la criopreservacion de celulas derivadas de la placenta. Metodos y materiales

Celulas derivadas de placenta cultivadas en Medio de Crecimiento en un matraz T75 recubierto de gelatina se lavaron con PBS y se tripsinizaron usando 1 mililitro de tripsina/EDTA (Gibco). La tripsinizacion se detuvo anadiendo 10 mililitros de Medio de Crecimiento. Las celulas se centrifugaron a 150 xg, el sobrenadante eliminado, y el sedimento celular se resuspendio en 1 mililitro de Medio de Crecimiento. Una parte alfcuota de suspension celular, 60 microlitros, se retiro y se anadio a 60 microlitros de azul de tripano (Sigma). El numero de celulas viables se estimo usando un hemocitometro. La suspension celular se dividio en cuatro alfcuotas iguales que contienen cada una 88 x 104 celulas cada una. La suspension celular se centrifugo y se resuspendio en 1 mililitro de cada medio a continuacion y se transfirio en crioviales (Nalgene).

1. ) Medio de Crecimiento + 10% (v/v) DMSO (Hybrimax, Sigma, St. Louis, MO)

2. ) Medio de congelacion de celulas w/DMSO, c/celulosa de metilo, libre de suero (C6295, Sigma, St. Louis, MO)

3. ) Medio de congelacion de celulas libre de suero (C2639, Sigma, St. Louis, MO)

4. ) Medio de congelacion de celulas c/glicerol (C6039, Sigma, St. Louis, MO)

Las celulas se enfriaron a aproximadamente -1°C/min durante la noche en un congelador a -80°C usando un contenedor de congelacion "Mr Frosty" de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Nalgene, Rochester, NY). Los viales de celulas se transfirieron a nitrogeno lfquido durante 2 dfas antes de descongelarse rapidamente en un bano de agua a 37°C. Las celulas se anadieron a 10 mililitros de Medio de Crecimiento y se centrifugaron antes de que se estima el numero de celulas y la viabilidad. Las celulas se sembraron en matraces recubiertos de gelatina a 5.000 celulas/cm2 para determinar si las celulas se conectan y proliferan.

Resultados

La viabilidad inicial de las celulas a criopreservarse se evaluo mediante tincion con azul de tripano para ser 100%. La viabilidad inicial de las celulas a ser criopreservada se evaluo mediante tincion con azul de tripano para ser 100%.

Hubo una reduccion proporcional en el numero de celulas con la viabilidad de las celulas C6295 debido a la lisis. Las celulas viables crioconservadas en las cuatro soluciones conectaron, dividieron, y produjeron una monocapa confluente dentro de los 3 dfas. No hubo diferencia discernible en la tasa de crecimiento estimada.

Resumen. La criopreservacion de celulas es un procedimiento disponible para la preparacion de un banco de celulas o un producto celular. Cuatro mezclas de crioconservacion se compararon por su capacidad para proteger las celulas de la placenta humanas derivadas de dano por congelacion. El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y 10% (v/v) de dimetilsulfoxido (DMSO) es el medio preferido de los comparados para la crioconservacion de celulas derivadas de la placenta.

EJEMPLO 6

Analisis del cariotipo de las celulas derivadas posparto

Las lmeas celulares utilizadas en la terapia de celulas son preferiblemente homogeneas y libres de cualquier tipo de celula contaminante. Las celulas utilizadas en la terapia celular deben tener un numero normal de cromosomas (46) y la estructura. Para identificar lmeas celulares derivadas de placenta y del ombligo que son homogeneas y libres de celulas de origen de tejido no posparto, se analizaron cariotipos de muestras de celulas.

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Materiales y metodos

PPDCs de tejido posparto de un neonato masculino se cultivaron en Medio de Crecimiento que contema penicilina/estreptomicina. Tejido posparto de un neonato macho (X, Y) se selecciona para permitir la distincion entre las celulas derivadas neonatales y celulas derivadas maternas (X, X). Las celulas se sembraron a 5.000 celulas por centfmetro cuadrado en Medio de Crecimiento en un matraz T25 (Corning, Corning, NY) y se expandieron a 80% de confluencia. Un matraz T25 que contiene celulas se lleno hasta el cuello con Medio de Crecimiento. Las muestras fueron entregadas a un laboratorio de citogenetica clmica por mensajena (se estima que el tiempo de transporte de laboratorio a laboratorio es de una hora). Las celulas se analizaron durante la metafase cuando los cromosomas se visualizan mejor. De veinte celulas en metafase contadas, cinco fueron analizadas para numero de cariotipo homogeneo normal (dos). Una muestra de celulas fue caracterizada como homogenea si se observaron dos cariotipos. Una muestra de celulas se caracterizo como heterogenea si se observo mas de dos cariotipos. Las celulas en metafase adicionales se contaron y se analizaron cuando se identifico un numero de cariotipo heterogeneo (cuatro).

Resultados

Todas las muestras de celulas enviadas para el analisis cromosomico se interpretaron por presentar una apariencia normal. Tres de las lmeas celulares de dieciseis analizadas exhibieron un fenotipo heterogeneo (XX y XY) que indica la presencia de celulas derivadas de ambos ongenes neonatal y materno (Tabla 6-1). Las celulas derivadas de tejido de la placenta-N se aislaron del aspecto neonatal de placenta. Al paso por cero, esta lmea celular aparecio XY homogenea. Sin embargo, en el paso nueve, la lmea celular fue heterogenea (XX/XY), lo que indica una presencia no detectada previamente de las celulas de origen materno.

Tabla 6-1. Resultados del analisis de cariotipo PPDC

Tejido: paso Celulas en metafase contadas Celulas en metafase analizadas Numero de Cariotipo Cariotipo ISCN

Placenta: 22 20 5 2 46, XX

Umbilical: 23 20 5 2 46, XX

Umbilical: 6 20 5 2 46, XY

Placenta: 2 20 5 2 46, XX

Umbilical: 3 20 5 2 46, XX

Placenta-N: 0 20 5 2 46, XY

Placenta-V: 0 20 5 2 46, XY

Placenta-M: 0 21 5 4 46, XY [18]/46, XX [3]

Placenta-M: 4 20 5 2 46, XX

Placenta-N: 9 25 5 4 46, XY [5]/46, XX [20]

Placenta-N C1: 1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C3: 1 20 6 4 46, XY [2]/46, XX [18]

Placenta-N C4: 1 20 5 2 46, XY

Placenta- NC15: 1 20 5 2 46, XY

Placenta- NC20: 1 20 5 2 46, XY

Clave: N- aspecto Neonatal; V- region vellosa; M- aspecto maternal; C- clon

Resumen. El analisis cromosomico identifico celulas derivadas de placenta y del ombligo cuyos cariotipos paredan normales tal como se interpreta por un laboratorio de citogenetica clmica. El analisis de cariotipo tambien identifico lmeas celulares libres de celulas maternas, como se determina por cariotipo homogeneo.

Ejemplo 7

Evaluacion de marcadores de superficie de celulas humanas derivadas posparto por citometria de flujo

Caracterizacion de protemas de superficie celular o "marcadores" por citometna de flujo se puede utilizar

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para determinar la identidad de una lmea celular. La consistencia de la expresion se puede determinar a partir de multiples donantes, y en las celulas expuestas a diferentes condiciones de cultivo y procesamiento. Lmeas celulares derivadas posparto (ppdc) aisladas de la placenta y del ombligo se caracterizaron (por citometna de flujo), proporcionando un perfil para la identificacion de estas lmeas celulares.

Materiales y metodos

Recipientes de medios y cultivos. Las celulas fueron cultivadas en Medio de Crecimiento (Gibco Carlsbad, CA) con penicilina/estreptomicina. Las celulas fueron cultivadas en T75 tratada con plasma, T150, T225 y matraces de cultivo tisular (Corning, Corning, NY) hasta la confluencia. Las superficies de crecimiento de los frascos se recubrieron con gelatina mediante incubacion de 2% (p/v) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Tincion de anticuerpos y analisis de citometna de flujo. Las celulas adherentes en matraces se lavaron en PBS y se desprendieron con tripsina/EDTA. Las celulas se recogieron, se centrifugaron, y se resuspendieron en 3% (v/v) de FBS en PBS a una concentracion celular de 1x107 por mililitro. De acuerdo a las especificaciones del fabricante, el anticuerpo para el marcador de superficie celular de interes (vease mas adelante) se anadio a un centenar de microlitros de suspension de celulas y la mezcla se incubo en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las celulas se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se analizaron por citometna de flujo. El analisis de citometna de flujo se realizo con un instrumento citometro (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Se utilizaron los siguientes anticuerpos frente a marcadores de superficie celular.

Anticuerpo: Fabricante Numero de catalogo

CD10: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555375

CD 13: BD Pharmingen 555394

CD31: BD Pharmingen 555446

CD34: BD Pharmingen 555821

CD44: BD Pharmingen 555478

CD45RA: BD Pharmingen 555489

CD73: BD Pharmingen 550257

CD90: BD Pharmingen 555596

CD117: BD Pharmingen 340529

CD141: BD Pharmingen 559781

PDGFr-alfa: BD Pharmingen 556002

HLA-A, B, C: BD Pharmingen 555553

HLA-DR, DP, DQ: BD Pharmingen 555558

IgG-FITC: Sigma (St. Louis, MO) F-6522

IgG PE: Sigma P-4685

Comparacion de placenta y ombligo. Celulas derivadas de placenta se compararon con celulas derivadas del ombligo en el paso 8.

Comparacion de pasaje a pasaje. Celulas derivadas de placenta y de ombligo se analizaron en los pasajes 8, 15, y 20.

Donantes para la comparacion de los donantes. Para comparar las diferencias entre los donantes, celulas derivadas de placenta de diferentes donantes se compararon entre sf, y las celulas derivadas de ombligo de diferentes donantes se compararon entre sf

Comparacion de recubrimiento de superficie. Celulas derivadas de placenta cultivadas en matraces recubiertos de gelatina se compararon con celulas derivadas de placenta cultivadas en frascos no recubiertos. Celulas derivadas de ombligo cultivadas en matraces recubiertos de gelatina se compararon con celulas derivadas de ombligo cultivadas en frascos no recubiertos.

Comparacion de enzima de digestion. Se compararon cuatro tratamientos utilizados para el aislamiento y preparacion de celulas. Las celulas aisladas de placenta mediante tratamiento con 1) colagenasa; 2) colagenasa/dispasa; 3) colagenasa/hialuronidasa; y 4) colagenasa/hialuronidasa/dispasa se compararon.

Comparacion de capa placentaria. Las celulas derivadas desde el aspecto maternal de tejido placentario se compararon con las celulas derivadas de la region de las vellosidades de tejido de la placenta y celulas derivadas del aspecto fetal neonatal de placenta.

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Resultados

Comparacion de placenta vs ombligo. Celulas derivadas de placenta y del ombligo analizadas por citometna de flujo mostraron expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, indicada por el aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion detectable de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, indicada por los valores de fluorescencia comparable a la de control de IgG. Las variaciones en los valores de fluorescencia de las curvas positivas se representaron. La media (es decir, CD 13) y rango (es decir, CD90) de las curvas positivas mostro alguna variacion, pero las curvas paredan normales, lo que confirma una poblacion emergente homogenea. Ambas curvas exhibieron individualmente valores mayores que el control de IgG expuesto.

Comparacion pasaje a pasaje - celulas derivadas de la placenta. Celulas derivadas de placenta en los pasajes 8, 15, y 20 se analizaron por citometna de flujo y fueron positivas para la expresion de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, como se refleja en el valor aumentado de la fluorescencia con respecto al control IgG. Las celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-Dr, DP, DQ teniendo valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

Comparacion pasaje a pasaje - celulas derivadas de ombligo. Celulas derivadas de ombligo en el paso 8, 15, y 20 se analizaron por citometna de flujo y expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA- A, B, C, se indicaron por el aumento de fluorescencia con respecto al control IgG. Estas celulas fueron negativas para CD31, CD34, Cd45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, indicadas por los valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

Comparacion donante a donante - celulas derivadas de placenta. Celulas derivadas de placenta aisladas de donantes independientes analizadas por citometna de flujo expresaron cada una CD10, CDl3, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, con aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control IgG. Las celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ como se indica por valor de fluorescencia consistente con el control de IgG.

Comparacion donante a donante - celulas derivadas de ombligo. Celulas derivadas de ombligo aisladas de donantes independientes analizadas por citometna de flujo mostraron cada una expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, que se refleja en el aumento de los valores de la fluorescencia relativa al control de IgG. Estas celulas fueron negativos para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ con valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

El efecto de recubrimiento de la superficie con la gelatina en las celulas derivadas de la placenta.

Celulas derivadas de placenta expandieron en cualquiera de matraces recubiertos de gelatina o no revestidos analizados por citometna de flujo expresaron CD10, CDl3, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, que se refleja en el aumento de los valores de fluorescencia en relacion con el control de IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ lo que se indica por los valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

El efecto de recubrimiento de la superficie con la gelatina en las celulas derivadas de ombligo.

Celulas derivadas de ombligo se expandidas en gelatina y matraces sin revestir analizadas por citometna de flujo fueron positivas para la expresion de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, con aumento de los valores de la fluorescencia relativos al control de IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, con valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

Efecto de procedimiento de digestion enzimatica usada para la preparacion de las celulas sobre el perfil de marcador de superficie celular. Las celulas derivadas de placenta aisladas usando diversas enzimas de digestion analizadas por citometna de flujo expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFR-alfa y HLA-A, B, C, como se indica por el aumento de los valores de fluorescencia con respecto al control de IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ como se indica por los valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

Comparacion de capa placentaria. Las celulas aisladas de las capas maternas, las vellosidades, y capas neonatales de la placenta, respectivamente, analizadas por citometna de flujo mostraron expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, cD 90, alfa PDGFR y HLA-A, B, C, como se indica por el aumento del valor de la fluorescencia con respecto al control de IgG. Estas celulas fueron negativas para la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ como se indica por los valores de fluorescencia consistentes con el control de IgG.

Resumen. Analisis de celulas derivadas de placenta y ombligo por citometna de flujo ha establecido una identidad de estas lmeas celulares. Celulas derivadas de placenta y de ombligo son positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFR alfa, HLA-A, B, C y negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP,

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DQ. Esta identidad fue consistente entre las variaciones de variables que incluyen el donante, paso, revestimiento de la superficie recipiente de cultivo, las enzimas de digestion, y la capa de la placenta. Se observo alguna variacion en los medios y rangos de curva de histograma de valor de fluorescencia individual, pero todas las curvas positivas bajo todas las condiciones ensayadas fueron normales y expresaron valores de fluorescencia mayores que el control de IgG, lo que confirma que las celulas comprenden una poblacion homogenea que tiene la expresion positiva de los marcadores.

EJEMPLO8

Caracterizacion inmunohistoqmmica de los fenotipos de tejido posparto

Los fenotipos de celulas que se encuentran dentro de los tejidos posparto humanos, a saber, el cordon umbilical y la placenta, se analizaron por inmunohistoqmmica.

Materiales y Metodos

Preparacion de tejidos. Cordon umbilical humano y tejido de placenta se cosecho y la inmersion se fijo en 4% (p/v) de paraformaldehndo durante la noche a 4°C. La inmunohistoqmmica se realizo utilizando anticuerpos dirigidos contra los siguientes epftopos: vimentina (1: 500; Sigma, St. Louis, MO), desmina (1: 150, generado contra conejo; Sigma; o 1: 300, generado contra raton; Chemicon, Temecula, CA), alfa-actina de musculo liso (SMA; 1: 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1: 400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1: 200; Sigma), y CD34 (Clase CD34 humana III; 1: 100; Dako, Carpinteria, CA). Ademas, se ensayaron los siguientes marcadores: GROalpha anti- humano - PE (1: 100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCp-2 anti-humano (1: 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), LDL oxidada anti-humana receptor 1 (ox-LDL R1; 1: 100; Santa Cruz Biotech), y NOGO-A anti-humana (1: 100; Santa Cruz Biotech). muestras fijadas se recortaron con un bistun y se colocaron dentro del compuesto de incrustacion de OCT (Tejido-Tek PTU; Sakura, Torrance, CA) en un bano de hielo seco que contiene etanol. Los bloques congelados fueron entonces seccionados (10 micrometres de espesor) utilizando un criostato estandar (Leica Microsystems) y se montaron en portaobjetos de vidrio para tincion.

Inmunohistoquimica. La inmunohistoqmmica se realizo similarmente a los estudios anteriores (por ejemplo, Messina, et al, 2003, Exper Neurol 184: 816-829). Las secciones de tejido se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solucion de bloqueo de protema que contiene PBS, 4% (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0,3% (v/v) de Triton (Triton X-100; Sigma) durante 1 hora para acceder a antfgenos intracelulares. En casos en los que se encuentra el epftopo de interes en la superficie celular (CD34, ox- LDL R1), Triton se omitio en todos los pasos del procedimiento con el fin de evitar la perdida de epftopo. Ademas, en los casos en que el anticuerpo primario se planteo en contra de cabra se utilizo (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), 3% (v/v) de suero de burro en lugar de suero de cabra durante todo el procedimiento. Los anticuerpos primarios, se diluyo en solucion de bloqueo, se aplicaron a las secciones durante un perredo de 4 horas a temperatura ambiente. Soluciones de anticuerpos primarios fueron removidos, y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicacion de las soluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contiene el bloque, junto con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton - Texas Red (1: 250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o de cabra anti-conejo IgG - Alexa 488 (1: 250; Molecular Probes) o IgG anti-cabra de burro - FITC (1: 150; Santa Cruz Biotech). Los cultivos se lavaron, y se aplico 10 DAPI micromolar (Molecular Probes) durante 10 minutos para visualizar los nucleos celulares.

Despues de la inmunotincion, la fluorescencia se visualizo usando el filtro de fluorescencia correspondiente en un microscopio epi-fluorescencia invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). La tincion positiva fue representada por la senal de fluorescencia por encima de la tincion de control. Imagenes representativas fueron capturadas utilizando una camara de video digital en color y software ImagePro® (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para las muestras de triple manchado, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emision a la vez. Montajes en capas se prepararon a continuacion, utilizando el software Adobe Photoshop® (Adobe, San Jose, CA).

Resultados

Caracterizacion del cordon umbilical. Vimentina, desmina, marcadores SMA, CK18, vWF, y CD34 se expresaron en un subconjunto de las celulas que se encuentran dentro de cordon umbilical. En particular, vWF y la expresion CD34 estaban restringidos a los vasos sangurneos contenidos en el cable. CD34 + celulas estaban en la capa mas interna (lado lumen). La expresion de vimentina se encontro en toda la matriz y los vasos sangurneos de la cuerda. SMA se limita a la matriz y las paredes exteriores de la arteria y la vena, pero no se contema con los propios vasos. CK18 y desmina fueron observados dentro de los vasos solamente, limitandose la desmina a las capas media y exterior.

Caracterizacion de placenta. Vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF, y CD34 se observaron dentro de la placenta y fueron regionalmente espedficos.

Expresion en tejidos GROalpha, GCP-2, ox-LDL R1, y NOGO-A. Ninguno de estos marcadores se

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observaron dentro de cordon umbilical o tejido placentario.

Resumen. Vimentina, desmina, actina de musculo liso-alfa, citoqueratina 18, factor von Willebrand, y CD 34 se expresan en celulas dentro de cordon umbilical humano y placenta.

EJEMPLO 9

Analisis de las celulas derivadas de tejido posparto utilizando ensayos de oligonucleotido

Ensayos de Affymetrix® GENECHIP se utilizaron para comparar los perfiles de expresion genica de celulas derivadas de ombligo y de placenta con fibroblastos, celulas madre mesenquimatosas humanas, y otra lmea celular derivada de la medula osea humana. Este analisis proporciona una caracterizacion de las celulas derivadas posparto y se identificaron los marcadores moleculares unicos para estas celulas.

Materiales y metodos

Aislamiento y cultivo de celulas. Cordones umbilicales y placentas humanas se obtuvieron a partir de National Disease Research Interchange (ISRND, Filadelfia, PA) a partir de un parto normal a termino con el consentimiento del paciente. Se recibieron los tejidos y las celulas fueron aisladas como se describe en el Ejemplo 1. Las celulas se cultivaron en Medio de Crecimiento (usando DMEM-LG) en matraces de plastico de cultivo de tejido recubiertos de gelatina. Los cultivos se incubaron a 37°C con 5% de CO2.

Fibroblastos dermicos humanos fueron adquiridos de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Numero de lote 9F0844) y ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Ambas lmeas se cultivaron en medio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 10% (v/v) de suero bovino fetal (Hyclone) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Las celulas fueron cultivadas en plastico tratado de tejido estandar.

Las celulas madre mesenquimales humanas (hMSC) fueron adquiridas de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; numeros de lote, 2F1655, 2F1656, y 2F1657) y se cultivaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante en MSCGM Media (Cambrex). Las celulas se cultivaron sobre plastico cultivadas de tejidos estandar a 37°C con 5% de CO2.

La medula osea de cresta ilfaca humana se recibio de NDRI con el consentimiento del paciente. La medula se proceso de acuerdo con el metodo descrito por Ho, et al. (WO03/025149). La medula se mezclo con tampon de lisis (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, y 0,1 mM EDTA, pH 7,2) en una proporcion de medula osea de 1 parte a 20 partes de tampon de lisis. La suspension de celulas se sometio a vortice, se incubo durante 2 minutos a temperatura ambiente, y se centrifugo durante 10 minutos a 500 x g. El sobrenadante se descarto y el sedimento celular se resuspendio en medio esencial mmimo alfa (Invitrogen) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal y 4 mM glutamina. Las celulas se centrifugaron de nuevo y el sedimento celular se resuspendio en medio fresco. Las celulas mononucleares viables se contaron usando exclusion con azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO). Las celulas mononucleares se siembran en matraces de plastico tratados con tejido a 5 x 104 celulas/cm2. Las celulas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 en cualquiera de O2 atmosferica estandar o al 5% O2. Las celulas se cultivaron durante 5 dfas sin un cambio de medio. Medios y celulas no adherentes se retiraron despues de 5 dfas de cultivo. Las celulas adherentes se mantuvieron en cultivo.

Aislamiento de analisis ARNm y GeneChip. Cultivos activamente crecientes de celulas se retiraron de los frascos con un raspador de celulas en PBS frio. Las celulas se centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante se retiro y las celulas se resuspendieron en PBS fresco y se centrifugaron de nuevo. Se elimino el sobrenadante y el sedimento celular se congelo inmediatamente y se almaceno a -80°C. ARNm celular se extrajo y se transcribio en ADNc, que despues se transcribe en ARNc y marcado con biotina. El ARNc marcado con biotina se hibrido con conjunto de oligonucleotidos HG-U133A GENECHIP (Affymetrix, Santa Clara CA). La hibridacion y coleccion de datos se realizo de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Los analisis se realizaron usando "Significance Analysis of Micromatrices" (SAM) version 1,21 software de ordenador (Universidad de Stanford; Tusher, V.G. et al, 2001, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 98: 5116-5121).

Resultados

Se analizaron catorce poblaciones diferentes de celulas. Las celulas junto con informacion de pasaje, sustrato de cultivo, y medios de cultivo se enumeran en la Tabla 9-1.

Tabla 9-1. Las celulas analizadas por el estudio de micromatrices. Las lmeas celulares se enumeran por codigo de identificacion junto con el paso en el momento de analisis, sustrato de crecimiento celular y medio de crecimiento.

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Poblacion celular: Paso Sustrato Medio

Ombligo (022803): 2 Gelatina DMEM, FBS al 15%, 2-ME

Ombligo (042103): 3 Gelatina DMEM, FBS al 15%, 2-ME

Ombligo (071003): 4 Gelatina DMEM, FBS al 15%, 2-ME

Placenta (042203): 12 Gelatina DMEM, FBS al 15%, 2-ME

Placenta (042903): 4 Gelatina DMEM, FBS al 15%, 2-ME

Placenta (071003): 3 Gelatina DMEM, FBS al 15%, 2-ME

ICBM (070,203) (5% 02): 3 Plastico MEM, 10% FBS

ICBM (062.703) (std. 02): 5 Plastico MEM, 10% FBS

ICBM (062,703) (5% 02): 5 Plastico MEM, 10% FBS

hMSC (Lote 2F1655): 3 Plastico MSCGM

hMSC (Lote 2F1656): 3 Plastico MSCGM

hMSC (Lote 2F1657): 3 Plastico MSCGM

hFibroblasto (9F0844): 9 Plastico DMEM-F12, 10% de FBS

hFibroblasto (CCD39SK): 4 Plastico DMEM-F12, 10% de FBS

Los datos fueron evaluados por un analisis de componentes principales, analizando los 290 genes que son expresados diferencialmente en las celulas. Este analisis permite una comparacion relativa de las similitudes entre las poblaciones. Tabla 9-2 muestra las distancias euclidianas que se calcularon para la comparacion de las parejas de celulas. Las distancias euclidianas se basan en la comparacion de las celulas a partir de los 290 genes que son expresadas diferencialmente entre los tipos de celulas. La distancia euclidiana es inversamente proporcional a la similitud entre la expresion de los 290 genes (es decir, cuanto mayor sea la distancia, menos similitud existira).

Tabla 9-2. Distancias euclidianas para los pares de celdas

ICBM-hMSC: 24,71

Placentario-umbilical: 25,52

ICBM-fibroblastos: 36,44

ICBM-fibroblastos-placenta: 37,09

Fibroblasto-MSC: 39,63

ICBM-umbilical: 40,15

Fibroblasto-umbilical: 41,59

MSC-placenta: 42,84

MSC-umbilical: 46,86

ICBM-placenta: 48,41

Tablas 9-3, 9-4, y 9-5 muestran la expresion de genes incrementada en las celulas derivadas de la placenta (Tabla 9-3), incrementada en las celulas derivadas de ombligo (Tabla 9-4), y reducidas en celulas derivadas de ombligo y placenta (Tabla 9-5). La columna titulada "Conjunto de Sonda ID" se refiere a codigo de identificacion del fabricante para los conjuntos de varias sondas de oligonucleotidos localizados en un sitio en particular en el chip, que se hibridan con el gen llamado (columna "Gen"), que comprende una secuencia que se pueden encontrar dentro de la base de datos NCBI (GenBank) en el numero de acceso especificado (columna "Numero de Acceso de NCBI").

Tabla 9-3. Los genes que se muestran haber aumentado espedficamente la expresion en las celulas derivadas de la placenta en comparacion con otras lmeas celulares ensayadas

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Genes aumentados en celulas derivadas de placenta

Conjunto de sondas de Identificacion: Nombre del gen Numero de acceso NCBI

209732_at: C-tipo (calcio dependiente, dominio de reconocimiento de carbohidratos) lectina, miembro de superfamilia 2 (inducido por activacion) AF070642

206067 s at: Tumor de Wilms 1 NM 024426

207016 s at: deshidrogenasa aldedda 1 familia, miembro A2 AB015228

206367 at: Renina NM 000537

210004_at: lipoprotema oxidada de baja densidad (lectina) receptor 1 AF035776

214993_at: Homo sapiens, clon IMAGEN: 4179671, ARNm, cds parcial AF070642

202178 at: quinasa de protema C, zeta NM 002744

209780 at: protema hipotetica DKFZp564F013 AL136883

204135 at: regulado hacia abajo en cancer de ovario 1 NM 014890

213542 at: ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp547K1113 (clon DKFZp547K1113) AI246730

Tabla 9-4. Los genes que han mostrado tener expresion espedficamente aumentada en las celulas derivadas del ombligo en comparacion con otras lmeas celulares ensayadas

Genes incrementados en celulas derivadas del ombligo

Conjunto de sondas de Identificacion: Nombre del gen Numero de acceso NCBI

202859_x_at: interleucina 8 NM_000584

211506_s_at: interleucina 8 AF043337

210222_s_at: reticulon 1 BC000314

204470_at: quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 1 (actividad estimuladora del crecimiento del melanoma NM_001511

206336_at: quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 6 (protema quimiotactica de granulocitos 2) NM_002993

207850_at: Quimiocina (motivo C-X-C) ligando 3 NM_002090

203485_at: reticulon 1 NM_021136

202644_s_at: factor de necrosis tumoral, protema alfa inducida por 3 NM_006290

Tabla 9-5. Los genes muestran una expresion disminuida en celulas derivadas del ombligo y de la placenta en comparacion con otras lmeas celulares ensayadas

Genes disminuidos en celulas derivadas del ombligo y placenta

Conjunto de sondas de Identificacion: Nombre de gen Numero de acceso NCBI

210135_s_at: homeobox baja estatura 2 AF022654.1

205824_at: choque termico 27 kDa protema 2 NM_001541.1

209687_at: quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 12 (factor derivado de celulas del estroma 1) U19495.1

203666_at: quimiocinas (Motivo C-X-C) ligando 12 (factor derivado de celulas del estroma 1) NM_000609.1

212670_at: elastina (estenosis aortica supravalvular, smdrome de Williams-Beuren) AA479278

213381_at: ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (a partir del clon DKFZp586M2022) N91149

206201_s_at: homeobox de mesenquima 2 (homeobox espedfico de detencion de crecimiento) NM_005924.1

205817_at: homeobox homologo sine oculis 1 (Drosophila) NM_005982.1

209283_at: cristalina, alfa B AF007162.1

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(continua)

Genes disminuidos en celulas derivadas del ombligo y placenta

Conjunto de sondas de Identificacion: Nombre de gen Numero de acceso NCBI

212793_at: activador asociado de la morfogenesis 2 BF513244

213488_at: protema DKFZP586B2420 AL050143.1

209763_at: similar a neuralina 1 AL049176

205200_at: tetranectina (protema de union a plasminogeno) NM_003278.1

205743_at: src homologfa tres (SH3) y dominio rico en cistema NM_003149.1

200921_s_at: gen de translocacion de celulas B 1, anti-proliferativa NM_001731.1

206932_at: colesterol 25-hidroxilasa NM_003956.1

204198_s_at: factor de transcripcion relacionados con runt-3 AA541630

219747_at: protema hipotetica FLJ23191 NM_024574.1

204773_at: interleucina 11 receptor, alfa NM_004512.1

202465_at: potenciador procolageno C-endopeptidasa NM_002593.2

203706_s_at: homologo rizado 7 (Drosophila) NM_003507.1

212736_at: gen hipotetico BC008967 BE299456

214587_at: colageno, tipo VIII, alfa 1 BE877796

201645_at: tenascina C (hexabrachion) NM_002160.1

210239_at: homeobox protema Iroquois 5 U90304.1

203903_s_at: hefaestina NM_014799.1

205816_at: integrina, beta 8 NM_002214.1

203069_at: Glicoprotema de vesmula sinaptica 2 NM_014849.1

213909_at: ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744 AU147799

206315_at: Citoquinas tipo receptor factor 1 NM_004750.1

204401_at: potasio intermedio/canal activado por calcio de pequena conductancia, subfamilia N, miembro 4 NM_002250.1

216331_at: integrina, alfa 7 AK022548.1

209663_s_at: integrina, alfa 7 AF072132.1

213125_at: protema DKFZP586L151 AW007573

202133_at: co-activador transcripcional con motivo de union a PDZ-(TAZ) AA081084

206511_s_at: homeobox homologo sine oculis 2 (Drosophila) NM_016932.1

213435_at: protema KIAA1034 AB028957.1

206115_at: respuesta de crecimiento temprano 3 NM_004430.1

213707_s_at: homeobox no distal 5 NM_005221.3

218181_s_at: protema hipotetica FLJ20373 NM_017792.1

209160_at: familia de reductasa aldo-ceto 1, miembro de C3 (deshidrogenasa de hidroxiesteroide 3-alfa, tipo II) AB018580.1

213905_x_at: biglicano AA845258

201261_x_at: biglicano BC002416.1

202132_at: co-activador transcripcional con motivo de union a PDZ-(TAZ) AA081084

214701_s_at: fibronectina 1 AJ276395.1

213791_at: proencefalina NM_006211.1

205422_s_at: integrina, similar a beta 1 (con dominios de repeticion similar a EGF) NM_004791.1

214927_at: ARNm de Homo sapiens de longitud completa inserto de ADNc del clon Euroimage 1968422 AL359052.1

206070_s_at: EphA3 AF213459.1

212805_at: protema KIAA0367 AB002365.1

219789_at: receptor del peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (receptor de peptido atrionatriuretico C) AI628360

219054_at: protema hipotetica FLJ14054 NM_024563.1

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(continua)

Genes disminuidos en celulas derivadas del ombligo y placenta

Conjunto de sondas de Identificacion: Nombre de gen Numero de acceso NCBI

213429_at: ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (a partir del clon DKFZp564B222) AW025579

204929_s_at: proteina de membrana asociada a vesmulas 5 (miobrevina) NM_006634.1

201843_s_at: EGF que contienen proteina de la matriz extracelular fibulina 1 NM_004105.2

221478_at: proteina de interaccion BCL2/adenovirus E1B 19 kDa 3 AL132665.1

201792 at: proteina de union a AE 1 NM 001129.2

204570_at: citocromo c oxidasa subunidad polipeptfdica VIIa 1 (musculo) NM_001864.1

201621 at: neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1 NM 005380.1

202718_at: protema de union a factor de crecimiento similar a la insulina 2, 36 kDa NM_000597.1

Tablas 9-6, 9-7, y 9-8 muestran la expresion de genes incrementados en fibroblastos humanos (Tabla 9-6), celulas ICBM (Tabla 9-7), y MSCs (Tabla 9-8).

Tabla 9-6. Los genes que se han demostrado tener expresion en fibroblastos en comparacion con las otras lmeas

celulares ensayadas.

Genes incrementados en fibroblastos

Fosfatasa de doble especificidad 2 Protema KIAA0527

ADNc de Homo sapiens: FLJ23224 fis, clon ADSU02206

dinema, citoplasmatica, polipeptido intermedio 1

anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G)

inhibina, beta A (activina A, activina AB polipeptido alfa)

ectonucleotido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 4 (funcion putativa)

proteina KIAA1053

protema asociada a microtubulos 1A

protema con dedos de zinc 41

proteina HSPC019

ADNc de Homo sapiens: FLJ23564 fis, clon LNG10773

ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564A072 (del clon DKFZp564A072)

protema LIM (similar al enigma de union C de quinasa de proteina de rata)

inhibidor de potenciador del gen polipeptido ligero kappa en celulas B, proteina asociada a complejo de quinasa

proteina hipotetica FLJ22004

(Clon CTG-A4) secuencia de ARNm humano

ESTs, moderadamente similar a la citoquina de tipo receptor factor 2; precursor del receptor CRL2 de

citoquinas [Homo sapiens]

factor de crecimiento transformante, beta 2

proteina hipotetica MGC29643

antfgeno identificado por el anticuerpo monoclonal MRC OX-2 proteina de retinopatfa putativa ligada al cromosoma X

Tabla 9-7. Los genes que mostraron tener una mayor expresion en las celulas ICBM derivado en comparacion con las otras lmeas celulares ensayadas.

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a) Genes incrementados en celulas ICBM

• anquirina cardiaca repeticion protema

• MHC de clase I region ORF

• integrina, alfa 10

• protema hipotetica FLJ22362

• UDP-N-acetilo-alfa-D-galactosamina: polipeptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GalNAc-T3)

• protema inducida por interferon 44

• SRY (region determinante del sexo Y)-caja 9 (displasia campomelica, reversion sexual autosomica)

• protema asociada a queratina 1-1

• hippocalcina 1

• dentado 1 (smdrome de Alagille)

• proteoglicano 1, granulo secretor

Tabla 9-8. Los genes que mostraron tener una mayor expresion en las celulas MSC en comparacion con las otras lmeas celulares ensayadas.

b) Genes incrementados en las celulas MSC

• interleucina 26

• maltasa-glucoamilasa (alfa-glucosidasa)

• subfamilia del receptor nuclear 4, grupo A, miembro 2

• v-fos FBJ osteosarcoma murino subfamilia homologo de oncogen viral

• protema hipotetica DC42

• receptor nuclear 4, grupo A, miembro 2

• osteosarcoma viral murino FBJ protema de oncogen homologo B

• protema 1 de via de senalizacion inducible WNT1

• imea celular MCF.2 derivada de secuencia transformante

• canal de potasio, subfamilia K, miembro 15

• homeoprotema de clase emparejada de cartflago 1

• ADNc de Homo sapiens fis FLJ12232, clon MAMMA1001206

• ADNc de Homo sapiens fis FLJ34668, clon LIVER2000775

• jun B proto-oncogen

• celulas B CLL/linfoma 6 (protema de dedo de cinc 51)

• protema con dedos de zinc 36, tipo C3H, homologo (raton)

Resumen. La presente examen se realizo para proporcionar una caracterizacion molecular de las celulas derivadas posparto de cordon umbilical y la placenta. Este analisis incluyo celulas derivadas de tres cordones umbilicales diferentes y tres placentas diferentes. El examen incluyo tambien dos lmeas diferentes de fibroblastos dermicos, tres lmeas de celulas madre mesenquimales, y tres lmeas de celulas de medula osea de la cresta ilfaca. El ARNm que fue expresado por estas celulas se analizo utilizando una matriz de oligonucleotidos que contema sondas para 22.000 genes. Los resultados mostraron que 290 genes se expresan diferencialmente en estos cinco tipos de celulas diferentes. Estos genes incluyen diez genes que se incrementan espedficamente en las celulas derivadas de la placenta y siete genes incrementados espedficamente en las celulas derivadas del cordon umbilical. Se han encontrado que cincuenta y cuatro genes tienen espedficamente mas bajos niveles de expresion en placenta y del cordon umbilical, en comparacion con los otros tipos de celulas. La expresion de genes seleccionados ha sido confirmada por PCR (vease el ejemplo siguiente). Estos resultados demuestran que las celulas derivadas posparto tienen un perfil de expresion de genes distintos, por ejemplo, en comparacion con celulas y fibroblastos derivados de medula osea.

EJEMPLO 10

Marcadores de celulas en celulas derivadas posparto

En el ejemplo anterior, similitudes y diferencias en las celulas derivadas de la placenta humana y el cordon umbilical humano se evaluaron mediante la comparacion de sus perfiles de expresion de genes con los de las celulas derivadas de otras fuentes (usando una matriz de oligonucleotidos). Se identificaron seis genes "firma": LDL oxidada receptor 1, interleucina-8, renina, reticulon, ligando del receptor de quimioquinas 3 (C-X-C ligando 3), y la protema de granulocitos quimiotactica 2 (GCP-2). Estos genes "firma" se expresaron en niveles relativamente altos en celulas derivadas posparto.

Los procedimientos descritos en este ejemplo se llevaron a cabo para verificar los datos de micromatrices y encontrar concordancia/discordancia entre el gen y la expresion de protemas, asf como para establecer una serie de ensayo fiable para la deteccion de identificadores unicos para las celulas derivadas de placenta y ombligo.

Metodos y materiales

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Celulas. celulas derivadas de placenta (tres aislamientos, incluyendo un aislado predominantemente neonatal como se identifica por analisis de cariotipo), celulas derivadas de ombligo (cuatro aislados), y fibroblastos dermicos humanos normales (NHDF; neonatal y adulto) cultivados en Medio de Crecimiento con penicilina/estreptomicina en un matraz T75 recubierto de gelatina. Celulas Madre Mesequimales (MSCs) se cultivaron en kit de bala de medio de crecimiento de celulas madre mesenquimales (MSCGM; Cambrex, Walkerville, MD).

Para el protocolo de IL-8, las celulas se descongelaron a partir de nitrogeno lfquido y se sembraron en matraces recubiertos de gelatina a 5.000 celulas/cm2, que se cultiva durante 48 horas en medio de crecimiento y luego se cultiva durante 8 horas en 10 mililitros de medio de privacion de suero [DMEM-baja glucosa (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina/estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA) y 0,1% (p/v) albumina de suero bovino (BSA; Sigma, St. Louis, MO)]. Despues de este tratamiento, ARN se extrajo y se centrifugaron los sobrenadantes a 150 x g durante 5 minutos para eliminar los desechos celulares. Los sobrenadantes se congelaron a -80°C para el analisis.

Cultivo de celulas para el ensayo ELISA. Celulas posparto derivadas de placenta y el ombligo, asf como fibroblasto humano derivado de prepucio neonatal humano se cultivaron en medio de crecimiento en matraces T75 recubiertos de gelatina. Las celulas se congelaron a paso 11 en nitrogeno lfquido. Las celulas se descongelaron y se transfirieron a tubos de centnfuga de 15 mililitros. Despues de centrifugacion a 150 x g durante 5 minutos, se descarto el sobrenadante. Las celulas se resuspendieron en 4 mililitros de medio de cultivo y se contaron. Las celulas se cultivaron en un matraz de 75 cm2 que contema 15 ml de medio de crecimiento a 375.000 celulas/matraz durante 24 horas. El medio se cambio a un medio de privacion de suero durante 8 horas. El medio de privacion de suero se recogio al final de la incubacion, se centrifugo a 14.000 x g durante 5 minutos (y se almacena a -20°C).

Para estimar el numero de celulas en cada frasco, 2 mililitros de tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA) se anadio cada matraz. Despues de desprenderse celulas del matraz, la actividad de tripsina se neutralizo con 8 mililitros de medio de crecimiento. Las celulas se transfirieron a un tubo de centnfuga de 15 mililitros y se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos. Se elimino el sobrenadante y 1 mililitro de Medio de Crecimiento se anadio a cada tubo para resuspender las celulas. El numero de celulas se estimo usando un hemocitometro.

Ensayo ELISA. La cantidad de IL-8 secretada por las celulas en el medio de privacion de suero se analizo utilizando ensayos ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se ensayaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Aislamiento de ARN total. Se extrajo ARN de celulas derivadas posparto confluentes y fibroblastos o para expresion IL-8 a partir de celulas tratadas como se describe anteriormente. Las celulas se lisaron con 350 microlitros de tampon RLT que contiene mercaptoetanol beta (Sigma, St. Louis, MO) segun las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA). Se extrajo el ARN segun las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA) y se sometio a tratamiento con ADNasa (2,7 U/muestra) (Sigma St. Louis, MO). El ARN se eluye con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se guardo a -80°C.

Transcripcion inversa. ARN tambien se extrajo a partir de placenta humana y el ombligo. El tejido (30 miligramos) se suspendio en 700 microlitros de tampon de RLT que contiene 2-mercaptoetanol. Las muestras fueron mecanicamente homogeneizadas y la extraccion de RNA se procedio segun la especificacion del fabricante. El ARN se extrajo con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se guardo a -80°C. ARN se transcribio a la inversa usando hexameros aleatorios con los reactivos de transcripcion inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos, y 95°C durante 10 minutos. Las muestras se almacenaron a - 20°C.

Los genes identificados por micromatriz ADNc como regulados unicamente en las celulas posparto (genes firma - incluyendo receptor de LDL oxidada, interleucina-8, renina y reticulon), se investigaron adicionalmente usando PCR en tiempo real y convencional.

PCR en tiempo real. PCR se realizo en muestras de ADNc utilizando productos de expresion de genes Assays-on-DemandTM: receptor de LDL oxidada (Hs00234028); renina (Hs00166915); reticulon (Hs00382515); ligando C-X-C 3 (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); y GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA) se mezclaron con ADNc y mezcla maestra TaqMan Universal de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando un sistema de deteccion de secuencia 7000 con ABI Prism 7000 software SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA). Condiciones del ciclo termico fueron inicialmente 50°C durante 2 min y 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 min. Datos de PCR se analizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Boletm del usuario n° 2 de Applied Biosystems para ABI Prism 7700 Sequence Detection System).

PCR convencional. PCR convencional se realizo utilizando un ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Massachusetts, EE.UU.) para confirmar los resultados de PCR en tiempo real. PCR se realizo usando 2 microlitros de solucion de ADNc, 1 X mezcla universal de tampon de reaccion PCR AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) y desnaturalizacion inicial a 94°C durante 5 minutos. La amplificacion se

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optimiza para cada conjunto de cebadores. Para IL-8, C-X-C ligando 3, y reticulon (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos y 72°C durante 30 segundos durante 30 ciclos); para renina (94°C durante 15 segundos, 53°C durante 15 segundos y 72°C durante 30 segundos durante 38 ciclos); para el receptor de LDL oxidada y GAPDH (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos y 72°C durante 30 segundos durante 33 ciclos). Los cebadores usados para la amplificacion se enumeran en la Tabla 1. La concentracion de cebador en la reaccion de PCR final fue de 1 micromolar a excepcion de GAPDH, que fue de 0,5 micromolar. Cebadores GAPDH fueron los mismos que en tiempo real PCR, excepto que la sonda TaqMan por el fabricante no se agrego a la reaccion de PCR final. Las muestras se corrieron en 2% (p/v) en gel de agarosa y se tineron con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO). Las imagenes fueron capturadas utilizando una pelfcula de 667 Twinpack universal (VWR International, South Plainfield, NJ) utilizando una camara de longitud focal Polaroid® (VWR International, South Plainfield, Nueva Jersey).

Tabla 10-1: Cebadores usados

c) Nombre de cebador: Cebadores

Receptor de LDL oxidada: S: 5'-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG- (SEQ ID NO: 1)

: 3' (SEQ ID NO: 2)

: A: 5'-AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3'

Renina: S: 5'-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3' (SEQ ID NO: 3)

: A: 5'-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 4)

Reticulon: S: 5'-TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3' (SEQ ID NO: 5)

: A: 5'-AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3' (SEQ ID NO: 6)

Interleucina-8: S: 5'-TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3' (SEQ ID NO: 7)

: 5'-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC-3' (SEQ ID NO: 8)

Quimocina (C-X-C) ligando: S: 5'- CCCACGCCACGCTCTCC-3' (SEQ ID NO: 9)

3: A: 5'-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC -3' (SEQ ID NO: 10)

Inmunofluorescencia. PPDCs se fijaron con paraformaldetndo frio 4% (p/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Un aislado de cada una de las celulas derivadas del ombligo y de la placenta en el pase 0 (P0) (directamente despues del aislamiento) y el paso 11 (P11) (dos aislados de derivados de la placenta, dos aislados de ombligo derivados de celulas) y fibroblastos (P11) se utilizaron. La inmunocitoqmmica se realizo utilizando anticuerpos dirigidos contra los siguientes epttopos: vimentina (1: 500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1: 150; Sigma - alzado contra conejo; o 1: 300; Chemicon, Temecula, CA - alzado contra raton), actina de musculo alfa-liso (SMA; 1: 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1: 400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1: 200; Sigma), y CD34 (CD34 humana Clase III; 1: 100; Dako, Carpinteria, CA). Ademas, los siguientes marcadores fueron probados en celulas posparto de paso 11: GRO anti-humano alfa-PE (1: 100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), anti-humana GCP-2 (1: 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), LDL anti-humana oxidada receptor 1 (ox-LDL R1; 1: 100; Santa Cruz Biotech), y NOGA-A anti-humana (1: 100; Santa Cruz, Biotech).

Los cultivos se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solucion de bloqueo protema que contiene PBS, 4% (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0,3% (v/v) Triton® (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutos para acceder a antfgenos intracelulares. Cuando el epttopo de interes se encuentra en la superficie celular (CD34, ox-LDL R1), Triton X-100 se omitio en todos los pasos del procedimiento con el fin de evitar la perdida de epftopo. Ademas, en los casos en que el anticuerpo primario se planteo en contra de cabra se utilizo (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), 3% (v/v) de suero de burro en lugar de suero de cabra. Los anticuerpos primarios, se diluyeron en solucion de bloqueo, se aplicaron a los cultivos durante un penodo de 1 hora a temperatura ambiente. Las soluciones de anticuerpos primarios se retiraron y se lavaron los cultivos con PBS antes de la aplicacion de las soluciones de anticuerpo secundario (1 hora a temperatura ambiente) que contiene el bloque, junto con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton - Texas Red (1: 250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o IgG de cabra anti-conejo - Alexa 488 (1: 250; Molecular Probes) o IgG de burro anti-cabra - FITC (1: 150, Santa Cruz Biotech). Despues, los cultivos se lavaron y 10 micromolares de DAPI (Molecular Probes) aplicados durante 10 minutos para visualizar los nucleos celulares.

Despues de la inmunotincion, la fluorescencia se visualizo usando un filtro de fluorescencia correspondiente en un microscopio de epi-fluorescencia invertido Olympus® (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tincion positiva represento la senal de fluorescencia por encima de la tincion de control donde todo el procedimiento descrito anteriormente fue seguido con la excepcion de la aplicacion de una solucion de anticuerpo primario. Imagenes representativas fueron capturadas utilizando una camara de video digital en color y software ImagePro® (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para las muestras de triple manchado, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emision a la vez. Montajes en capas se prepararon a continuacion, utilizando el software Adobe Photoshop® (Adobe, San Jose, CA).

Preparacion de celulas para el analisis FACS. Las celulas adherentes en matraces se lavaron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y separadas con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). Las celulas se recogieron, se centrifugaron, y re-suspendieron a 3% (v/v) de FBS en PBS a una

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concentracion celular de 1x107 por mililitro. Cien microlitros almuotas fueron administrados a tubos conicos. Las celulas tenidas para antfgenos intracelulares se permeabilizaron con Perm/Tampon de lavado (BD Pharmingen, San Diego, CA). El anticuerpo se anadio a almuotas segun las especificaciones del fabricante y las celulas se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo. Las celulas que requieren un anticuerpo secundario se resuspendieron en 100 microlitros de 3% de FBS. Se anadio el anticuerpo secundario segun las especificaciones del fabricante y las celulas se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el exceso de anticuerpo secundario. Las celulas lavadas se resuspendieron en 0,5 mililitros de PBS y se analizaron por citometna de flujo. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: LDL oxidada receptor 1 (sc-58l3; Santa Cruz, Biotech), GROa (555 042; BD Pharmingen, Bedford, MA), IgGl de raton kappa, (P-4685 y M-5284; Sigma), IgG Burro contra Cabra (sc-3743;. Santa Cruz, Biotech). Citometna de flujo se realizo con FACScalibur® (Becton Dickinson San Jose, CA).

Resultados

Resultados de PCR en tiempo real para genes seleccionados de "firma" realizados en ADNc a partir de celulas derivadas de placenta humana, adulta y fibroblastos neonatales y celulas madre mesenquimales (MSCs) indican que tanto el receptor de LDL oxidada como la renina se expresaron en mayor nivel en las celulas derivadas de la placenta en comparacion con otras celulas. Los datos obtenidos de PCR en tiempo real se analizaron por el metodo ®®CT y se expresaron en una escala logantmica. Los niveles de reticulon y expresion del receptor de LDL oxidada fueron mas altos en las celulas derivadas del ombligo en comparacion con otras celulas. No hay diferencia significativa en los niveles de expresion de C-X-C ligando 3 y GCP-2 entre las celulas derivadas posparto y los controles. Los resultados de PCR en tiempo real fueron confirmados por PCR convencional. La secuenciacion de los productos de PCR validadaron aun mas estas observaciones. No se encontro diferencia significativa en el nivel de expresion de C-X-C ligando 3 entre las celulas derivadas posparto y controles utilizando PCR C-X-C ligando 3 cebadores convencionales mencionados anteriormente.

La produccion de la citoquina, IL-8 en postparto fue elevada tanto en las celulas derivadas posparto privadas de suero y cultivadas en Medio de Crecimiento. Todos los datos en tiempo real PCR se validaron con PCR convencional y mediante la secuenciacion de productos de PCR.

Cuando los sobrenadantes de las celulas cultivadas en medio libre de suero se examinaron para la presencia de IL-8, se detectaron las cantidades mas altas en medios derivados de las celulas derivadas umbilicales y algunos aislados de celulas de la placenta (Tabla 10-1). No se detecto IL-8 en un medio derivado de fibroblastos dermicos humanos.

Tabla 10-1: cantidad de protema IL-8 medida por ELISA

Tipo de celula: IL-8

hFibro: ND

Aislado de Placenta 1: ND

Aislado Umb 1: 2058.42 + 144,67

Aislar de Placenta 2: ND

Aislado UMB 2: 2368.86 + 22,73

Aislado de Placenta 3 (O2 normal): 17.27 + 8,63

Aislado de Placenta 3 (O2 bajo, W/O BME): 264,92 + 9,88

Los resultados del ensayo ELISA para la interleucina-8 (IL-8) realizada en placenta y celulas derivadas de ombligo, asi como fibroblastos de piel humana. Los valores presentados aquf son picogramos/millon de celulas, n = 2, sem.

ND: No detectado

Tambien se examinaron las celulas derivadas de placenta para la produccion de receptor de LDL oxidada, GCP-2 y GROalfa por analisis FACS. Las celulas fueron positivas para GCP-2. LDL oxidada del receptor y GRO no fueron detectadas por este metodo.

Tambien se ensayaron celulas derivadas de la placenta para la produccion de protemas seleccionadas mediante analisis inmunocitoqmmico. Inmediatamente despues del aislamiento (paso 0), celulas derivadas de la placenta humana se fijaron con paraformaldehudo al 4% y se expusieron a anticuerpos para seis protemas: Factor de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina de musculo liso-alfa, y vimentina. Las celulas se tineron positivas tanto para alfa-actina de musculo liso como vimentina. Este patron se conservo a traves del paso 11. Solo unas pocas celulas (<5%) en el pase 0 tineron positivas para citoqueratina 18.

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Las celulas derivadas del cordon umbilical humano en el pase 0 se probaron para la produccion de protemas seleccionadas mediante analisis inmunocitoqmmico. Inmediatamente despues del aislamiento (paso 0), las celulas se fijaron con paraformaldetudo al 4% y se expusieron a anticuerpos para seis protemas: Factor de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina de musculo liso-alfa, y vimentina. Celulas derivadas de ombligo fueron positivas para actina de musculo liso-alfa y vimentina, con el patron de tincion consistente a traves del paso 11.

Resumen. La concordancia entre los niveles de expresion de genes medidos por micromatriz y PCR (tanto en tiempo real como convencional) se ha establecido para cuatro genes: LDL oxidada del receptor 1, renina, reticulon, e IL-8. La expresion de estos genes se regula diferencialmente en el nivel de ARNm en PpDCs, con IL-8 tambien regulados diferencialmente a nivel de protemas. La presencia de receptor de LDL oxidada no se detecto a nivel de protemas por analisis FACS en celulas derivadas de la placenta. Expresion diferencial de GCP-2 y C-X-C ligando 3 no se confirmo en el nivel de ARNm, no se detecto sin embargo GCP-2 a nivel de protemas por analisis FACS en las celulas derivadas de la placenta. Aunque este resultado no se refleja por los datos obtenidos originalmente a partir del experimento de micromatrices, esto puede ser debido a una diferencia en la sensibilidad de las metodologfas.

Inmediatamente despues del aislamiento (paso 0), celulas derivadas de la placenta humana tineron positivas tanto para alfa actina de musculo liso como vimentina. Este patron tambien se observo en las celulas en el paso 11. Estos resultados sugieren que la vimentina y la expresion de actina del musculo liso alfa pueden conservarse en las celulas con pases, en el medio de crecimiento y en las condiciones utilizadas en estos procedimientos. Las celulas derivadas del cordon umbilical humano en el pase 0 se probaron para la expresion de actina de musculo liso-alfa y vimentina, y fueron positivas para ambas. El patron de tincion fue preservado a traves del paso 11.

EJEMPLO 11

Secrecion de factores troficos por celulas derivadas posparto

Se midio la secrecion de factores troficos seleccionados a partir de celulas derivadas de placenta y el ombligo. Factores seleccionados para la deteccion incluyen: (1) los conocidos por tener actividad angiogenica, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Rosen et al (1997) Ciba Found Symp 212: 215-26), protema quimiotactica de monocitos 1 (MCP-1) (Salcedo et al (2000). Blood 96; 34-40), interleucina-8 (IL-8) (Li et al (2003). J. Immunol. 170: 3369-76), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Hughes et al (2004). Ann Thorac Surg 77: 812-8), metaloproteinasa de matriz 1 (TIMP1), angiopoyetina 2 (ANG2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF- BB), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento epidermico de union a heparina (HB-EGF), factor derivado del estroma 1 alfa (SDF-1 alfa); (2) los conocidos por tener actividad neurotrofica/neuroprotectora, tal como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) (Cheng et al (2003) Dev Biol 258; 319-33), interleucina-6 (IL-6), protema quimiotactica de granulocitos-2 (GCP-2), factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFbeta2); y (3) los conocidos por tener actividad de quimioquinas, tales como macrofagos de protema inflamatoria 1 alfa (MIP1a), macrofagos de protema inflamatoria 1 beta (MIP1b), quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), Rantes (regulado en la activacion, celula T normal expresada y secretada), 1309, timo y quimiocina regulada por activacion (TARC), Eotaxina, quimiocina derivada de macrofagos (MDC), IL-8).

Metodos y materiales

Cultivo celular. PPDCs de placenta y el ombligo, asf como fibroblastos humanos derivados de prepucio neonatal humano se cultivaron en Medio de Crecimiento con penicilina/estreptomicina en matraces T75 recubiertos de gelatina. Las celulas se criopreservaron en el paso 11 y se almacenaron en nitrogeno lfquido. Despues de la descongelacion de las celulas, el medio de crecimiento se anadio a las celulas, seguido de la transferencia a un tubo de centnfuga de 15 ml y centrifugacion de las celulas a 150 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se descarto. El sedimento celular se resuspendio en 4 mililitros medio de crecimiento, y se contaron las celulas. Las celulas se sembraron a 375.000 celulas/75 cm2 matraz que contema 15 ml de medio de crecimiento y se cultivaron durante 24 horas. El medio se cambio a un medio libre de suero (DMEM de baja glucosa (Gibco), 0,1% (p/v) de albumina de suero bovino (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)) durante 8 horas. El medio libre de suero acondicionado se recogio al final de la incubacion por centrifugacion a 14.000 x g durante 5 minutos y se almaceno a -20°C. Para estimar el numero de celulas en cada matraz, las celulas se lavaron con PBS y se separaron por medio de 2 mililitros de tripsina/EDTA. La actividad de la tripsina fue inhibida por adicion de 8 mililitros de Medio de Crecimiento. Las celulas se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos. Se elimino el sobrenadante, y las celulas se resuspendieron en 1 mililitro de Medio de Crecimiento. El numero de celulas se estimo usando un hemocitometro.

Ensayo ELISA. Las celulas fueron cultivadas a 37°C en dioxido de carbono 5% y oxfgeno atmosferico. Celulas derivadas de placenta (lote 101503) tambien se cultivaron en 5% de oxfgeno o beta-mercaptoetanol (BME). La cantidad de MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1 alfa, GCP-2, IL-8, y TGF-beta 2 producida por cada muestra de celulas

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se midio mediante un ensayo ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo ELISA multiplexado SearchLight. Las quimiocinas (MIP1a, MIP1b, MCP-1, RANTES, 1309, TARC, eotaxina, MDC, IL8), BDNF, y los factores angiogenicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, Ang2, PDGF-BB, TPO, HB-EGF se midieron utilizando ensayos de proteoma SearchLight® (Pierce Biotechnology Inc.). Los ensayos de proteoma son ELISA de sandwich multiplexado para la medicion cuantitativa de dos a 16 protemas por pocillo. las matrices se producen mediante la deteccion de un patron 2 x 2, 3 x 3, o 4 x 4 de cuatro a l6 anticuerpos de captura diferentes en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Despues de un procedimiento sandwich ELISA, toda la placa se forma para capturar la senal quimioluminiscente generada en cada punto dentro de cada pocillo de la placa. la cantidad de senal generada en cada punto es proporcional a la cantidad de protema diana en el estandar o muestra original.

Resultados

Ensayo de ELISA. MCP-1 e IL-6 fueron secretadas por celulas derivadas de placenta y de ombligo y fibroblastos dermicos (Tabla 11-1). SDF-1 alfa fue secretado por celulas derivadas de la placenta cultivadas en 5% O2 y por los fibroblastos. GCP-2 e IL-8 fueron secretadas por celulas derivadas de ombligo y por celulas derivadas de la placenta cultivadas en presencia de BME o 5% de O2. GCP-2 tambien se secreto por los fibroblastos humanos. TGF-beta2 no era detectable por el ensayo ELISA.

Tabla 11-1. Los resultados del ensayo de ELISA

(Valores presentados son picogramos/millon de celulas/mililitro (n =: 2, sem)

: MCP-1 IL-6 VEGF SDF-1( GCP-2 IL-8 TGF®2

fibroblastos: 17+1 61+3 29+2 19+1 21 + 1 ND ND

Placenta (042303): 60+3 41+2 ND ND ND ND ND

Ombligo (022803): 1150+74 4234+289 ND ND 160+11 2058+145 ND

Placenta (071003): 125+16 10+1 ND ND ND ND ND

Ombligo (071003): 2794+84 1356+43 ND ND 2184+98 2369+23 ND

Placenta (101503) BME: 21 + 10 67+3 ND ND 44+9 17+9 ND

Placenta (101503) 5% O2, W/O: 77+16 339+21 ND 1149+137 54+2 265+10 ND

BME

Clave: ND: No detectado.

Ensayo ELISA multiplexado SearchLight®. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC, y la IL-8 se secretaron a partir de celulas derivadas de ombligo (Tablas 11-2 y 11-3). TIMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MIP1a, MCP-1, RANTES, TARC, eotaxina, y la IL-8 se secretaron a partir de celulas derivadas de la placenta (Tablas 12-2 y 12-3). No se detectaron Ang2, VEgF, o PDGF-BB.

Tabla 11-2. Resultados del ensayo de ELISA SearchLight® Multiplexado

: TIMP1 ANG2 PDGFBB TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF BDNF

HFB: 19306,3 ND ND 230,5 5,0 ND ND 27,9 1,3 ND

P1: 24299,5 ND ND 546,6 8,8 16,4 ND ND 3,81,3 ND

U1: 57718,4 ND ND 1240,0 5,8 559,3 148,7 ND 9,3 165,7

P3: 14176,8 ND ND 568,7 5,2 10,2 ND ND 1,9 33,6

U3: 21850,0 ND ND 1134,5 9,0 195,6 30,8 ND 5,4 388,6

Clave: HFB (fibroblastos humanos), P1 (celulas derivadas de la placenta (042303)), U1 (celulas derivadas de ombligo (022803)), P3 (celulas derivadas de la placenta (071003)), U3 (celulas derivadas de ombligo (071003)). ND: No detectado.______________________________________

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Tabla 11-3. Resultados del ensayo de ELISA SearchLight® Multiplexado

: MIP1a MIP1b MCP1 RANTES 1309 TARC eotaxina MDC IL-8

HFB: ND ND 39,6 ND ND 0,1 ND ND 204,9

P1: 79,5 ND 228,4 4,1 ND 3,8 12,2 ND 413,5

U1: ND 8,0 1694,2 ND 22,4 37,6 ND 18,9 51930,1

P3: ND ND 102,7 ND ND 0,4 ND ND 63,8

U3: ND 5,2 2018,7 41,5 11,6 21,4 ND 4,8 10515,9

Clave: HFB (fibroblastos humanos), P1 (derivado de placenta PPDC (042303)), U1 (PPDC derivados de ombligo (022803)), P3 (PPDC derivada de placenta (071003)), U3 (PPdC derivada de ombligo (071003)). ND: No detectado._________________________________________________________

Resumen. Celulas derivadas del ombligo y de la placenta secretan una serie de factores troficos. Algunos de estos factores troficos, tales como HGF, bFGF, MCP-1 y IL-8, desempenan papeles importantes en la angiogenesis. Otros factores troficos, tales como BDNF y IL-6, tienen un papel importante en la regeneracion neural.

Ejemplo 12

Evaluacion inmunologica In Vitro de las celulas derivadas de posparto

Se evaluaron celulas derivadas posparto (PPDCs) in vitro por sus caractensticas inmunologicas en un esfuerzo para predecir la respuesta inmunologica, en su caso, estas celulas se provocanan en el trasplante in vivo. PPDCs se analizaron por citometna de flujo para determinar la presencia de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, y B7-H2. Estas protemas se expresan por las celulas presentadoras de antfgeno (APC) y son necesarias para la estimulacion directa de celulas T ingenuas CD4+ (Abbas y Lichtman, Celular y Molecular Immunology, 5a Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171). Las lmeas celulares tambien se analizaron por citometna de flujo para la expresion de HLA-G (Abbas y Lichtman, 2003, supra), CD 178 (Coumans, et al., (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196), y PD-L2 (Abbas y Lichtman, 2003, supra; Brown, et al (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266). La expresion de estas protemas por las celulas que residen en tejidos de la placenta se cree que median el estado inmuno-privilegiado de tejidos de la placenta en el utero. Para predecir el grado en que las lmeas celulares derivadas de placenta y del ombligo provocan una respuesta inmunitaria in vivo, las lmeas de celulas se ensayaron en una reaccion mixta de linfocitos de una via (MLR).

Materiales y metodos

Cultivo celular. Las celulas se cultivaron hasta la confluencia en Medio de Crecimiento que contema penicilina/estreptomicina en matraces T75 (Corning, Corning, NY) recubiertas con gelatina al 2% (Sigma, St. Louis, MO).

Anticuerpo de tincion. Las celulas se lavaron en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y separadas con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, MO). Se recogieron las celulas, se centrifugaron y se resuspendieron en 3% (v/v) de FBS en PBS a una concentracion celular de 1x107 por mililitro. Anticuerpo (Tabla 12-1) se anadio a un centenar de microlitros de suspension de celulas segun las especificaciones del fabricante y se incubo en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las celulas se re-suspendieron en quinientos microlitros de pBs y se analizaron por citometna de flujo utilizando un instrumento FACSCaliburTM (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Tabla 12-1. Anticuerpos

Anticuerpo: Fabricante Numero de catalogo

HLA-DRDPDQ: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558

CD80: BD Pharmingen (San Diego, CA) 557227

CD86: BD Pharmingen (San Diego, CA) 555665

B7-H2: BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502

HLA-G: Abcam (Cambridgeshire, Reino Unido) ab 7904-100

CD 178: Santa Cruz (San Cruz, CA) sc-19681

PD-L2: BD Pharmingen (San Diego, CA) 557846

IgG2a de raton: Sigma (St. Louis, MO) F-6522

IgG1kappa de raton: Sigma (St. Louis, MO) P-4685

La reaccion mixta de linfocitos. Viales criopreservados de celulas derivadas de ombligo de paso 10 etiquetadas como lmea celular A y celulas derivadas de la placenta de paso 11 etiquetadas como lmea de celulas B

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

fueron enviadas sobre hielo seco a CTBR (Senneville, Quebec) llevan a cabo una reaccion mixta de linfocitos usando CTBR SOP N° CAC-031. Se recogieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de donantes voluntarios masculinos y femeninoss multiples. PBMC estimulador alogenico (donante), PBMC autologas, y las lmeas celulares despues del parto se trataron con mitomicina C. Celulas estimuladoras autologas y mitomicina tratadas con C se anadieron a PBMCs respondedores (receptores) y se cultivaron durante 4 dfas. Despues de la incubacion, [3H] timidina se anadio a cada muestra y se cultivaron durante 18 horas. Despues de la cosecha de las celulas, se extrajo el ADN radiomarcado, y [3H]-timidina se midio utilizando un contador de centelleo.

El mdice de estimulacion para el donante alogenico (SIAD) se calculo cuando la proliferacion media de receptor mas donante alogenico tratado con C de mitomicina dividido por la proliferacion de lmea de base del receptor. El mdice de estimulacion de los PPDCs se calculo cuando la proliferacion media de la lmea celular de posparto tratada con C con receptor mas mitomicina dividido por la proliferacion de lmea de base del receptor.

Resultados

Reaccion mixta de linfocitos - celulas derivadas de la placenta. Siete donantes de sangre voluntario humano se examinaron para identificar un unico donante alogenico que exhiben una robusta respuesta de proliferacion en una reaccion mixta de linfocitos con los otros seis donantes de sangre. Este donante fue seleccionado como el donante control positivo alogenico. Los seis donantes de sangre restantes fueron seleccionados como receptores. Las lmeas positivas alogenicas de celulas donantes de control y derivadas de la placenta se trataron con mitomicina C y se cultivaron en una reaccion de linfocitos mezclados con los seis receptores alogenicos individuales. Las reacciones se realizaron por triplicado usando dos placas de cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 12-2). El mdice medio de estimulacion vario de 1,3 (placa de 2) a 3 (placa 1) y los controles positivos de donante alogenico variaron de 46,25 (placa de 2) a 279 (placa de 1) (Tabla 12-3).

Tabla 12-2. Reaccion mixta de linfocitos de datos - lmea de celulas B (placenta)

DPM para ensayo de proliferacion

: Identificacion de la placa: Placa1

Analttico: Cultivo Replicas

numero: Sistema 1 2 3 Media DE CV

IM03-7769: Proliferacion de lmea de base de receptor 79 119 138 112,0 30,12 26,9

Control de la autoestimulacion (celulas autologas de tratadas con mitomicina C): 241 272 175 229,3 49,54 21,6

MLR donante alogenico IM03-7768 (tratadas con mitomicina C): 23971 22352 20921 22414,7 1525,97 6,8

MLR con la lmea celular (Mitomicina C tipo celular tratado B): 664 559 1090 771,0 281,21 36,5

SI (donante): 200

SI (lmea celular): 7

IM03-7770: Proliferacion de lmea de base de receptor 206 134 262 200,7 64,17 32,0

Control de la autoestimulacion (celulas autologas tratada con mitomicina C): 1091 602 524 739,0 307,33 41,6

MLR alogenico IM03-7768 donante (tratadas con mitomicina C): 45005 43729 44071 44268,3 660,49 1,5

MLR con la lmea celular (celulas tratadas con mitomicina C tipo B): 533 2582 2376 1830,3 1128,24 61,6

SI (donante): 221

SI (lmea celular): 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

DPM para ^ ensayo de proliferacion

: Identificacion de la placa: Placal

Analttico: Cultivo Replicas

numero: Sistema 1 2 3 Media DE CV

IM03-7771: Proliferacion de lmea de base de receptor 157 87 128 124,0 35,17 28,4

Control de la autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C): 293 138 508 313,0 185,81 59,4

MLR alogenico IM03- 7768 donante (tratado con mitomicina C): 24497 34348 31388 30077,7 5054,53 16,8

MLR con la lmea celular (Mitomicina C tipo celular tratado B): 601 643 un 622,0 29,70 4,8

SI (donante): 243

SI (lmea celular): 5

IM03-7772: Proliferacion de lmea de base de receptor 56 98 51 68,3 25,81 37,8

Control de la autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C): 133 120 213 155,3 50,36 32,4

MLR alogenico IM03- 7768 donante (tratado con mitomicina C): 14222 20076 22168 18822,0 4118,75 21,9

MLR con la lmea celular (celulas tratadas con Mitomicina C tipo B): un un un un un un

SI (donante): 275

SI (lmea celular): un

IM03-7768 (donante alogenico): Proliferacion de lmea de base de receptor 84 242 208 178,0 83,16 46,7

Control de la autoestimulacion (celulas autologas tratadas con Mitomicina): 361 617 304 427,3 166,71 39,0

Lmea celular tipo B: Proliferacion de lmea de base de receptor 126 124 143 131,0 10,44 8,0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

DPM para ensayo de proliferacion

: Identificacion de la placa: Placal

Analttico: Cultivo replicas

numero: Sistema 1 2 3 Media DE CV

: Control de la autoestimulacion (celulas autologas tratadas con Mitomicina) 822 1075 487 794,7 294,95 37,1

ID Plate: Placa 2

Numero de: Sistema de Cultivo Replica Media DE CV

analisis

1: 2 3

: Proliferacion de lmea de base de receptor Control de autoestimulacion (celulas 908 181 330 473,0 384,02 81,2

: autologas tratadas mitomicina C) 269 405 572 415,3 151,76 36,5

IM03-7773: Donante alogenico MLR IM03-7768 (tratadas con mitomicina C) 29151 28691 28315 28719,0 418,70 1,5

: MLR con lmea de celulas (celulas tratadas con mitomicina C tipo B) 567 732 905 734,7 169,02 23,0

SI (donante) SI (lmea celular): 61 2

: Proliferacion de lmea de base de receptor 893 1376 185 818,0 599,03 73,2

IM03-7774: Control de autoestimulacion (celulas autologas tratada con mitomicina C) 261 381 568 403,3 154,71 38,4

MLR donante alogenico IM03-7768 (tratado con mitomicina C): 53101 42839 48283 48074,3 5134,18 10,7

: MLR con la lmea de celulas (celulas tratadas con mitomicina C tipo B) 515 789 294 532,7 247,97 46,6

SI (donante) SI (lmea celular): 59 1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ID Plate: Placa 2

numero de analisis

Sistema de Cultivo

replica 123

Media

DE

CV

Proliferacion de lmea de base de receptor

IM03-7775

Control de (mitomicina C autologas)

autoestimulacion tratada celulas

MLR donante alogenico IM03-7768 (tratadas con mitomicina C)

MLR con la lmea de celulas (celulas tratadas con mitomicina C tipo B)

imagen1

768 924 563

705,3

305,0

21014,0

751,7

505,69

155,89

9479,74

181,05

71,7

51,1

45,1

24,1

SI (donante)

SI (lmea celular)

30

1

IM03-7776

Proliferacion de lmea de base de receptor

Control de (mitomicina C autologas)

autoestimulacion tratada celulas

imagen2

MLR donante alogenico IM03-7768 (tratadas con mitomicina C)

MLR con la lmea de celulas (tratadas con mitomicina C tipo de celula B)

imagen3

904,3

344,0

32044,0

707,22

109,89

2952,22

78,2

31,9

9,2

SI (donante) SI (lmea celular)

35

a

Tabla 12-3. mdice de estimulacion promedia de celulas de la placenta y un donante alogenico en una reaccion mixta de linfocitos con seis receptores alogenicos individuales

Indice de estimulacion promedia

: Recipiente Placenta

Placa 1 (receptores 1-3): 279 3

Placa 2 (receptores 4-6): 46,25 1,3

Reaccion mixta de linfocitos - celulas derivadas de ombligo. Seis donantes de sangre voluntarios humanos fueron examinados para identificar un unico donante alogenico que exhibira una robusta respuesta de proliferacion en una reaccion de linfocitos mezclados con los otros cinco donantes de sangre. Este donante fue seleccionado como el donante control positivo alogenico. Los cinco donantes de sangre restantes fueron seleccionados como receptores. Los donantes de control positivo alogenicos y lmeas celulares derivadas del ombligo se trataron con mitomicina C y se cultivaron en una reaccion de linfocitos mezclados con los cinco receptores alogenicos individuales. Las reacciones se realizaron por triplicado utilizando dos placas de cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 12-4). El mdice medio de estimulacion vario de 6,5 (placa de 1) a 9 (placa de 2) y controles positivos de donante alogenico variaron de 42,75 (placa de 1) a 70 (placa de 2) (Tabla 12-5).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 12-4. Datos de reaccion mixta de linfocitos- Lmea celular A (ombligo)

DPM para Ensayo de proliferacion Plate ID: Placal

Numero

analttico

Sistema de Cultivo

Replica

1 2 3

Media

DE

CV

IM04-

2478

Proliferacion de lmea de base de receptor Control de

autoestimulacion (celulas autologas tratada con mitomicina C)

MLR donante

alogenico IM04-2477 (tratado con

mitomicina C)

MLR con lmea celular (celulas tratadas Mitomicina C tipo con

A)_________________

1074 406 391

672 510 1402

imagen4

2914 5622 6109

623,7

861,3

43466,3

4881,7

390,07

475,19

5,087,12

1,721,36

62,5

55,2

11,7

35,3

SI (donante)

SI (lmea celular)

70

8

IM04-

2479

Proliferacion de lmea de base de receptor Control de

autoestimulacion (celulas autologas

tratadas con

mitomicina C)

MLR donante

alogenico IM04-2477 (tratadas con

mitomicina C)

MLR con la lmea

celular (celulas

tratadas con

Mitomicina C tipo A)

530 508 527

701 567 1111

25593 24732 22707

5086 3932 1497

521,7

793,0

24344,0

3505,0

11,93

283,43

1,481,61

1,832,21

2,3

35,7

6,1

52,3

SI (donante)

SI (linea celular)

47

7

IM04-

2480

Proliferacion de lmea de base de receptor Control de

autoestimulacion (celulas autologas tratadas con

mitomicina C)

MLR donante

alogenico IM04-2477 (tratadas con

mitomicina C)

MLR con la lmea celular (Mitomicina C tipo celular tratado con

A)_________________

1192 854 1330

2963 993 2197

25416 29721 23757

2596 5076 3426

1,125,3

2,051,0

26298,0

3699,3

244,90

993,08

3,078,27

1,262,39

21,8

48,4

11,7

34,1

SI (donante)

SI (linea celular)

23

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DPM para ensayo de proliferacion Placa ID: Placal

Numero

analftico

Sistema de Cultivo

Replica 1 2

3

Media

DE

CV

IM04-2481

Proliferacion de lmea de base de receptor

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratada con mitomicina C)

MLR donante alogenico IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con la lmea celular (celula tratada con Mitomicina C tipo A)

695 451 555

738 1252 464

13177 24885 15444

4495 3671 4674

567,0

818,0

17835,3

4280,0

122,44

400,04

6,209,52

534,95

21,6

48,9

34,8

12,5

SI (donante)

SI (lmea celular)

31

8

ID Plate: Placa 2

Numero

analftico

Sistema de Cultivo

Replica

1

Media

DE

CV

IM04-2482

Proliferacion de lmea de base de receptor

Control de autoestimulacion (mitomicina C tratada celulas autologas)

MLR donante alogenico IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con la lmea celular (celulas tratadas con Mitomicina C tipo A)

1459 633 598

24286 30823 31346

2762 1502 6723

413,0

896,7

28818,3

3662,3

130,54

487,31

3,933,82

2,724,46

31,6

54,3

13,7

74,4

SI (donante)

SI (lmea celular)

70

9

IM04-2477

(Donante

alogenico)

Proliferacion de lmea de base de receptor

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con Mitomicina)

567 604 374

360,0

515,0

54,34

123,50

15,1

24,0

Lmea celular tipo A

Proliferacion de lmea de base de receptor Control de autoestimulacion (Mitomicina tratada celulas autologas)

5101 3735 2973

1924 4570 2153

3,936,3

2,882,3

1,078,19

1,466,04

27,4

50,9

2

3

imagen5

imagen6

Tabla 12-5. Indice de estimulacion promedia de celulas derivadas del ombligo y un donante alogenico en una reaccion mixta de linfocitos con cinco receptores alogenicos individuales.

Indice de estimulacion promedia

: Recipiente Ombligo

Placa 1 (receptores 1-4): 42,75 6,5

Placa 2 (receptor 5): 70 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El antigeno que presenta marcadores de celulas - celulas derivadas de la placenta. Los histogramas de celulas derivadas de la placenta analizadas por flujo muestran citometna de expresion negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, y B7-H2, como se ha senalado por valor de fluorescencia coherente con IgG de control, lo que indica que las lmeas celulares derivadas de placenta carecen de las moleculas de superficie celular necesarias para estimular directamente celulas T de CD4+.

Los marcadores de inmunomodulacion - celulas derivadas de la placenta. Los histogramas de celulas derivadas de la placenta analizadas por flujo muestran citometna de expresion positiva de PD-L2, como se ha indicado por el incremento del valor de la fluorescencia con respecto al control de IgG, y la expresion negativa de CD 178 y HLA-G, segun lo observado por valor de fluorescencia coherente con el control de IgG.

El antigeno que presenta marcadores de celulas - celulas derivadas de ombligo. Los histogramas de las celulas derivadas de ombligo analizadas por flujo muestran citometna de expresion negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, y B7-H2, como se ha senalado por valor de fluorescencia coherente con IgG de control, lo que indica que las lmeas celulares derivadas del ombligo carecen de moleculas de superficie celular necesarias para estimular directamente celulas T de CD4+.

Marcadores de celulas inmunomoduladores - celulas derivadas de ombligo. Los histogramas de las celulas derivadas de ombligo analizados por flujo muestran citometna de expresion positiva de PD-L2, como se ha indicado por el incremento del valor de la fluorescencia con respecto al control de IgG, y la expresion negativa de CD 178 y HLA-G, segun lo observado por valor de fluorescencia coherente con el control de IgG.

Resumen. En las reacciones de linfocitos mixtos realizados con lmeas de celulas derivadas de la placenta, el mdice estimulador promedio oscilo de 1,3 a 3, y los controles positivos alogenicas variaron de 46,25 a 279. En las reacciones de linfocitos mixtos realizados con lmeas de celulas derivadas de ombligo el mdice medio de estimulacion vario de 6,5 a 9, y la de los controles positivos alogenicos vario de 42,75 a 70. Lmeas celulares derivadas de placenta y del ombligo fueron negativas para la expresion de las protemas estimulantes de HLA-DR, HLA-DP, HLA- DQ, CD80, CD86, y B7-H2, tal como se mide por citometna de flujo. Lmeas celulares derivadas de ombligo y de la placenta y fueron negativas para la expresion de protemas de inmuno-modulacion de HLA-G y CD 178 y positivas para la expresion de PD-L2, medidas por citometna de flujo. PBMCs de donantes alogenicos contienen celulas presentadoras de antigeno que expresan HLA-DR, DQ, CD8, CD86, y B7-H2, permitiendo de este modo la estimulacion de celulas T ingenuos CD4+. La ausencia de moleculas de superficie celular presentadoras de antigeno en celulas derivadas de placenta y del ombligo requeridas para la estimulacion directa de las celulas T ingenuas CD4+ y la presencia de PD-L2, una protema inmunomoduladora, pueden explicar el bajo mdice de estimulacion exhibido por estas celulas en un MLR en comparacion con los controles alogenicos.

EJEMPLO 13

Evaluacion In Vitro de celulas humanas derivadas posparto como tercero para suprimir una respuesta inmunologica

Celulas derivadas de placenta y del ombligo (PDC, UDC) fueron evaluadas in vitro por su capacidad como un tercero para suprimir una respuesta inmunologica entre poblaciones de dos haplotipos no coincidentes perifericos de celulas mononucleares de la sangre (PBMC). Los informes recientes han sugerido que diversos tipos de celulas pueden resultar utiles para la supresion de una respuesta inmunologica entre las poblaciones de injerto y de los donantes de celulas (1,2). Una reaccion de linfocitos mixtos se utilizo para investigar la capacidad de PDC o UDC para actuar como un tercero para suprimir una respuesta inmune entre las poblaciones de dos haplotipos no coincidentes perifericos de celulas mononucleares de la sangre (PBMC) (3).

Materiales y metodos:

Aislamiento y Cultivo de PBMC. PBMC se aislaron inmediatamente de sangre completa obtenida tras consentimiento de donantes sanos por centrifugacion en gradiente y se re-suspendieron en RPMI 1640 con 10% de FBS.

Cultivo PDC y UDC. Las celulas derivadas de placenta y del ombligo se sembraron a 5,0E+03 celulas por cm/sq., ampliado a aproximadamente 70% de confluencia en medio de crecimiento (DMEM de baja glucosa, 15% de FBS, BME, y P/S), y se recogieron con tripsina. Las celulas se trataron con 500 U/ml de IFN© durante la expansion para inducir expresion HLA-DR, DP, DQ.

Desajuste de haplotipo. PBMC estimulador, respondedor PBMC, y PDC o UDC fueron 6 de 6 grandes desajustes de histocompatibilidad.

Inhibicion de la proliferacion de celulas estimuladoras. PDC o UDC y PBMC estimulador fueron tratados con 25 pg/ml mitomicina C durante 30 minutos en condiciones estandar para inhibir la proliferacion celular.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Despues, las celulas se lavaron con RPMI fresco 1640.

Mezcla de reaccion de linfocitos. La reaccion de linfocitos mixtos se llevo a cabo en placas de 96 pocillos de fondo redondo con las celulas cultivadas en RPMI 1640 que contienen 10% de FBS. PDC o UDC tratados con mitomicina C se sembraron en pocillos designados en 2,5E+04 o 1,25E+04 celulas por pocillo. Estimulador PBMC y respondedor PBMC tratado con mitomicina C se sembraron en pocillos designados cada uno a 1,0E + 05 celulas por pocillo.

Incorporacion de timidina. Despues de seis d^as de cultivo, 20|jl de una solucion de timidina 50|jCi/ml [3H] se anadio a cada pocillo. Despues de siete d^as de cultivo, se evaluaron celulas para timidina [3H] con un instrumento contador de centelleo TopCountl. La incorporacion de etiqueta se expreso como cuentas por minuto (cpm)

Resultados:

Resultados para celulas derivadas de la placenta se muestran en las Tablas 13-1, 13-2 y en las Figuras 1 y

2.

Condicion de prueba: Tratamiento 3H Incorporacion (cpm)

Control de proliferacion: Celulas respondedoras solas 2970

Control de proliferacion: Deposito estimulador (MitC) solo 67

Control de MLR unidireccional: Celulas respondedoras mas deposito estimulador (MitC) 20893

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 25.000 celulas de tercero 3459

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 12.500 celulas de tercero 10944

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 25.000 celulas de tercero 6714

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 12.500 celulas de tercero 7113

Control de proliferacion: 25.000 celulas de tercero 223

Control de proliferacion: 12.500 celulas de tercero 411

Tabla 13-2. Celulas derivadas de la placenta no tratadas

Condicion de prueba: Tratamiento 3H Incorporacion (cpm)

Control de proliferacion: Celulas respondedoras solas 2970

Control de proliferacion: Deposito estimulador (MitC) solo 67

Control de MLR unidireccional: Celulas respondedoras plus deposito estimulador (MitC) 20893

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 25.000 celulas de tercero 3250

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 12.500 celulas de tercero 6586

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 25.000 celulas de tercero 4915

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 12.500 celulas de tercero 6887

Control de proliferacion: 25.000 celulas de tercero 291

Control de proliferacion: 12.500 celulas de tercero 243

Resultados para celulas derivadas de ombligo se muestran en las Tablas 13-3, 13-4 y en las figuras 3 y 4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Condicion de prueba: Tratamiento 3H Incorporacion (cpm)

Control de proliferacion: Celulas respondedoras solas 4275

Control de proliferacion: Deposito estimulador (MitC) solo 79

Control de MLR unidireccional: Celulas respondedoras plus deposito estimulador (MitC) 29362

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 25.000 celulas de tercero 2105

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 12.500 celulas de tercero 13175

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 25.000 celulas de tercero 4496

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 12.500 celulas de tercero 4019

Control de proliferacion: 25.000 celulas de tercero 172

Control de proliferacion: 12.500 celulas de tercero 196

Tabla 13-4. Celulas derivadas del ombligo no tratadas

Condicion de prueba: Tratamiento 3H Incorporacion (cpm)

Control de proliferacion: Celulas respondedoras solas 4275

Control de proliferacion: Deposito estimulador (MitC) solo 79

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 25.000 celulas de tercero 16738

MLR bidireccional con tercero: MLC Plus 12.500 celulas de tercero 14709

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 25.000 celulas de tercero 4273

Control de MLR unidireccional: Celula respondedora Plus 12.500 celulas de tercero 4276

Control de proliferacion: 25.000 celulas de tercero 235

Control de proliferacion: 12.500 celulas de tercero 257

Como puede verse en las tablas y figuras, en el MLR unidireccional, las PBMC respondedoras mostraron timidina [3H] incrementada en comparacion con PBMC respondedora sola y PBMC estimuladora sola. Esto sugiere la proliferacion de estas celulas cuando se co-cultivaron con PBMCs estimuladoras tratadas con mitomicina C. Este nivel de proliferacion de PBMC respondedora sugiere una respuesta inmunologica de la PBMC respondedora a la PBMC estimuladora tratada con mitomicina C.

El nivel de incorporacion de timidina [3H] por PBMC respondedora se co-cultivaron con PDC tratada con mitomicina C de haplotipo desajustado era menor que el nivel de incorporacion de timidina [3H] por la PBMC respondedora co-cultivada con PBMCs estimuladoras tratadas con mitomicina C de haplotipo desajustado. Esto sugiere que la PDC provoca una respuesta inmunitaria disminuida a partir de PBMCs respondedoras de haplotipo desajustado en este ensayo.

La adicion de PDC tratada por mitomicina C (IFN-© tratado o no tratado) como una tercera parte en estos cultivos disminuye el nivel de incorporacion de timidina etiquetada con PBMC respondedora [3H]. Esto sugiere que la PDC de terceros suprime la respuesta inmunologica de PBMC respondedora a celulas estimuladoras tratadas con mitomicina C. Esta supresion parece ser dependiente de la dosis al ser la dosis de celulas directamente relacionada con la inhibicion de PBMC respondedora.

Referencias para el Ejemplo 13:

1) Bruder SP et. Alabama. USP 6.355.239 B1 (2002)

2) Blood. 2005 15 de Feb; 105 (4): 1815-22

3) Klein, Jan Inmunologfa: The Science of Self-Nonself Discrimination John Wiley & Sons, Nueva York p.453-8

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reivindicaciones

1. Una composicion celular que comprende un vehuculo farmaceuticamente aceptable y las celulas derivadas de ombligo derivadas de cordon umbilical humano sustancialmente libre de sangre, para su uso en la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, en que dichas celulas se derivan de tejido del cordon umbilical sustancialmente libre de sangre, son capaces de auto-renovacion y expansion en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo neural, en el que las celulas requieren L-valina para el crecimiento, no producen CD45 y CD 117 y pueden crecer en al menos aproximadamente 5% de oxfgeno, y en el que las celulas comprenden las siguientes caractensticas:

a) potencial para al menos 40 duplicaciones en cultivo;

b) union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina;

c) produccion de vimentina y actina de musculo liso-alfa;

d) produccion de CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90;

e) expresion de un gen, que, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para un gen que codifica la interleucina 8 y reticulon 1.
2. Una composicion que comprende una matriz extracelular que contiene celulas derivadas de ombligo, para el uso en la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, en donde las celulas derivadas de ombligo se derivan de tejido del cordon umbilical humano sustancialmente libre de sangre y son capaces de auto-renovacion y expansion en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en celulas de al menos un fenotipo neural, en el que las celulas requieren L-valina para el crecimiento, no producen CD45 y CD 117 y pueden crecer en al menos aproximadamente 5% oxfgeno, y en el que las celulas comprenden las siguientes caractensticas:

a) potencial para al menos 40 duplicaciones en cultivo;

b) union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido revestido o no revestido, en el que un recipiente de cultivo de tejido revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina;

c) produccion de vimentina y actina de musculo liso-alfa;

d) produccion de CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90;

e) expresion de un gen, que, en relacion con una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de medula osea de cresta ilfaca, se incrementa para un gen que codifica la interleucina 8 y reticulon 1.
3. Una composicion farmaceutica para uso en la inhibicion de una respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante, que comprende un vehfculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad de las celulas derivadas del ombligo como se define en la reivindicacion 1 o de la composicion como se define en la reivindicacion 2 eficaz para inhibir la respuesta inmune adversa en un receptor de trasplante que es de histocompatibilidad coincidente para el donante del trasplante.
4. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la respuesta inmune adversa es injerto contra enfermedad de huesped o rechazo del tejido trasplantado.
5. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se formula para la administracion por inyeccion, infusion o por implantacion de un marco tridimensional, matriz o andamio sembrado o inoculado con las celulas.
6. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos aproximadamente 50% de celulas derivadas del ombligo.
7. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una poblacion sustancialmente homogenea de celulas derivadas de ombligo.
8. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las celulas se administran con al menos otro tipo de celula.
9. La composicion para uso segun la reivindicacion 8, en el que el al menos otro tipo de celula se administra simultaneamente con, o antes, o despues de las celulas derivadas de ombligo.
10. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las celulas se administran con al menos otro agente para el tratamiento de la respuesta inmune adversa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65
11. La composicion para uso segun la reivindicacion 10, en el que el al menos otro agente se administra simultaneamente con, o antes, o despues de las celulas derivadas de ombligo.
12. La composicion para uso segun la reivindicacion 10, en el que el al menos un otro agente es uno o mas de un agente antitrombogenico, un agente anti-inflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador o un agente antiapoptotico.

WLE biJirecciafial ec n celulas de placenta I-at ad as con IF Mg de tercero en p a;as de fnmdn redondo

imagen1

Figura 1

CondiciAr

imagen2

Figura 2

Ificoroorsctin do Tim id In a (tpm>

MLC b dlreccioral con c&l jlas. umblllcales tratadas con IFN; ds tareeros en alacaa da fondo redoido

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Incorporation da Timadina (cpm)

MLE bidireccionai con caiulas umbilicales no tratadas de terceros en placas da fondo redondo

35000

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0

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(MitC)

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MLC Plua 2SK adl-tila* d* t*rc*ro

MLC Plu* 12 5K c4lulai da tarcaro

Ctlulai

raapond*dor*a pin* 2SK cilulat da tarcaro

CAIula* Plus 25K edliala*

responds do a. d# lerceros

plua 12 SK c Alulae de tercaro

Plus 12 5K calulas de tercaroaj

Condlcidn