ES2550267T3 - Células derivadas de cordón umbilical post-parto para su uso en el tratamiento de enfermedad del corazón y el sistema circulatorio - Google Patents

Abstract

Una población homogénea de células humanas derivadas del tejido del cordón umbilical, para su uso en el tratamiento de una enfermedad del corazón o del sistema circulatorio, en la que dicha población de células se puede obtener aislando el tejido del cordón umbilical humano libre de sangre en presencia de metaloproteasa, proteasa neutra y actividades enzimáticas mucolíticas, y en la que dicha población de células es capaz de auto-renovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse en células u otros fenotipos y en la que la población de células: a) produce cada uno de CD 10, CD 13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, como se detectan por citometría de flujo; y b) no produce ninguno de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, o HLA-DR,DP,DQ, como se detectan por citometría de flujo.

Description

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de células que se diferencian en el linaje endodérmico incluyen, pero no están limitadas a, células pleuigénicas, células hepatogénicas, células que dan lugar al revestimiento del intestino, y células que dan lugar a células pancreogénicas y esplancogénicas.

Las células de la presente invención son generalmente denominadas como células derivadas de tejido del cordón umbilical o (UDCs). También pueden ser algunas veces denominadas de forma más general en la presente como células derivadas del postparto o células postparto (PPDCs). El término derivada se usa para indicar que las células han sido obtenidas de su fuente biológica y cultivadas o manipuladas de otra manera in vitro (por ejemplo, cultivadas en un Medio de Cultivo para expandir la población y/o producir una línea celular). Las manipulaciones in vitro de células madre umbilicales y los rasgos únicos de las células derivadas del tejido del cordón umbilical de la presente invención se describen en detalle a continuación.

Se usan varios términos para describir las células en el cultivo. Cultivo celular se refiere generalmente a células tomadas de un organismo vivo y cultivadas bajo condición controlada ("en cultivo" o "cultivada"). Un cultivo celular primario es un cultivo de células, tejidos u órganos tomado directamente de un organismo antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se colocan en un Medio de Cultivo bajo condiciones que facilitan el crecimiento y/o división celular, resultando en una población mayor de las células. Cuando las células se expanden en un cultivo, la tasa de proliferación celular se mide algunas veces por la cantidad de tiempo necesario para que las células se dupliquen en número. Esto se refiere como tiempo de duplicación.

Una línea celular es una población de células formada por uno o más subcultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de subcultivo se denomina como un pase. Cuando las células se subcultivan, se hace referencia a ellas como que han sido pasadas. Una población específica de células, o una línea celular, se denomina

o se caracteriza por el número de veces que ha sido pasada. Por ejemplo, una población de células cultivadas que ha sido pasada diez veces puede denominarse como un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo después del aislamiento de las células del tejido, se designa P0. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pase 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (P2 o pase 2), y así. Se entenderá por los expertos en la técnica que puede haber muchas duplicaciones de población durante el periodo de pase; por lo tanto el número de duplicaciones de la población de un cultivo es mayor que el número de pases. La expansión de las células (es decir, el número de duplicaciones de población) durante el periodo entre el pase depende de muchos factores, incluyendo pero no limitado a densidad del sembrado, sustrato, medio, condiciones de crecimiento y el tiempo entre el pase.

Un medio acondicionado es un medio en el que una célula específica o células se han cultivado, y después retirado. Cuando las células se cultivan en un medio, pueden secretar factores celulares que pueden proporcionar soporte trópico a otras células. Dichos factores tróficos incluyen, pero no están limitados a, hormonas, citoquinas, matriz extracelular /ECM), proteínas, vesículas, anticuerpos y gránulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio acondicionado.

Generalmente, un factor trófico se define como una sustancia que promueve la supervivencia, crecimiento, proliferación y/o maduración de una célula, o estimula el aumento de actividad de una célula.

Cuando se hace referencia a células vertebradas cultivadas, el término senectud (también senectud replicativa o senectud celular) se refiere a una propiedad atribuible a cultivos celulares finitos; concretamente a su incapacidad de crecer más allá de un número finito de duplicaciones de población (algunas veces denominado límite de Haoflick). Aunque la senectud celular se describió primero usando células tipo fibroblastos, tipos de células humanas más normales que se pueden cultivar en el cultivo experimentan senectud celular. La esperanza de vida in vitro de diferentes tipos de células varía, pero la esperanza de vida máxima es típicamente menor de 100 duplicaciones de población (este es el número de duplicaciones para todas las células en el cultivo para volverse senescentes y por lo tanto volver al cultivo incapaz de dividirse). La senectud no depende del tiempo cronológico, sino que se mide por el número de divisiones celulares, o duplicaciones de población, que ha experimentado el cultivo. Por lo tanto, las células hechas quiescentes eliminado los factores de crecimiento esenciales son capaces de reanudar el crecimiento y la división cuando se re-introducen los factores de crecimiento, y después de eso llevar a cabo el mismo número de duplicaciones que las células equivalentes cultivadas continuamente. De manera similar, cuando las células se congelan en nitrógeno líquido después de varios números de duplicaciones de población y después se descongelan y cultivan, experimentan sustancialmente el mismo número de duplicaciones que las células mantenidas sin congelar en el cultivo. Las células senescentes no son células muertas o moribundas; son realmente resistentes a la muerte celular programada (apoptosis) y se han mantenido en su estado de no división tanto como tres años. Estas células están muy vivas y metabólicamente activas, pero no se dividen. No se ha descubierto todavía que el estado de no división de las células senescentes sea reversible por cualquier agente biológico, químico o vírico.

Como se usa en la presente, el término Medio de Crecimiento se refiere generalmente a un medio suficiente para el cultivo de células derivadas del tejido del cordón umbilical. En particular, un medio actualmente preferido para el cultivo de células de la invención comprende el Medio Esencial Modificado de Dulbecco (también

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También se prefieren actualmente las células que producen al menos dos de factor tisular, vimentina y actina de músculo liso alfa. Se prefieren más las células que producen las tres de las proteínas factor tisular, vimentina y actina de músculo liso alfa.

El experto en la técnica apreciará que los marcadores celulares están sujetos a variar algo bajo condiciones de crecimiento muy diferentes, y que generalmente en al presente se describen caracterizaciones en Medio de Crecimiento, o variaciones de los mismos. Las células derivadas del postparto que producen al menos uno, dos, tres

o cuatro de CD 10, CD 13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C son las células preferidas de la divulgación. Se prefieren más aquellas células que producen cinco, seis o siete de estos marcadores de superficie celulares. Todavía son más preferidas las células postparto que pueden producir las ocho proteínas de marcadores de superficie celulares anteriores.

De manera similar, las células postparto que carecen de producción de al menos uno, dos, tres o cuatro de las proteínas CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR,DP,DQ, detectadas por citometría de flujo son actualmente las células preferidas de la divulgación. Las células que carecen de al menos cinco, seis, siete u ocho o más de estos marcadores también se prefieren. Se prefieren más las células que carecen de producción de al menos nueve o diez de los marcadores de superficie celulares. Las células más preferidas son aquellas que carecen de producción de las once proteínas de identificación anteriores.

Las células de la invención producen cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, y no producen ninguno de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 o HLA-DR,DP,DQ detectadas por citometría de flujo.

Actualmente, se prefiere que las células derivadas del cordón umbilical humanas expresen al menos uno, dos o tres de interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimioquinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanomas, alfa); ligando 6 de quimioquinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de granulocitos); ligando 3 de quimioquinas motivo (C-X-C); y factor de necrosis tumoral, proteína inducida por alfa 3. Se prefieren más las células que expresan cuatro o cinco, y todavía se prefieren más las células capaces de expresar los seis genes anteriores.

En algunas realizaciones, las células preferiblemente también expresan dos, tres cuatro o más de lectina de tipo C (dependiente del calcio, dominio de reconocimiento de carbohidratos), miembro de la superfamilia 2 (inducida por activación); Tumor de Wilms 1; familia de aldehído deshidrogenasa 1, miembro A2; y renina; receptor 1 de lipoproteína de baja densidad oxidada (tipo lectina); Homo sapiens, clon IMAGE:4179671, ARNm, cds parciales; proteína quinasa C, zeta; proteína hipotética DKFZp564F013; reguladas hacia abajo en el cáncer de ovario 1; ARNm Homo sapiens; ADNc DKFZp547K1113 (del clon DKFZp547K1113). En otras realizaciones, se prefiere que las células expresen cinco, seis, siete u ocho de los anteriores. También se prefieren las células que expresan genes correspondientes a nueve, diez o incluso todas las secuencias anteriores.

Para algunas realizaciones, se prefieren las células que con relación a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal, o una célula de cresta ilíaca, está reducida para al menos uno de: homeobox 2 de estatura corta; proteína 2 de shock cardiaco de 27kDA; ligando 12 de quimioquinas (motivo C-X-C (factor 1 derivado de células estromales); elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARnm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeobox 2 de mesénquima (homeobox específico de la detención del crecimiento); homólogo 1 del homeobox de sine oculis (Drosophila); alfa B, cristalina; activador asociado enredado de morfogénesis 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (proteína de enlace del plasminógeno); homología src tres (SH3) y dominio rico en cisteína; gen de translocación de células B 1, anti-proliferativo; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción enanismo-relacionado 3; proteína hipotética FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de C-endopeptidasa de pro-colágeno; homólogo rizado 7 (Drosophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabrachion); proteína homeobox iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína 2 de vesículas sinápticas; ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 tipo receptor de citoquinas; canal activado por calcio de conductancia intermedia/pequeña de potasio,, subfamilia N, miembro 4; integrina, alfa 7; proteína DKFZP586L151; co-activador transcripcional con motivo de enlace con PDZ (TAZ); homólogo 2 de homeobox de sine oculis (Drosophila); proteína KIAA1034; respuesta de crecimiento temprana 3; homeobox menos distal 5; proteína hipotética FLJ20373; familia aldo-ceto reductasa 1; miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, tipo beta 1 (con dominios de repetición tipo EGF); inserto de longitud completa de ARNm de Homo sapiens; clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; proteína KIAA0367; receptor C de péptido natriurético/guanilato ciclasa C (receptor C del péptido atrionatriurético); proteína hipotética FLJ14054; ARNm de Homo Sapiens; ADNc DKFZp564B222 del clon DKFZp564B222); proteína de la membrana asociada a vesículas 5 (miobrevina); proteína de la matriz extracelular tipo fibulina que contiene EGF 1; tipo proteína 3 de interacción de 19kDa BCL2/adenovirus E1B; proteína 1 de enlace con AE; polipéptido VIIa de la subunidad de citocromo c oxidasa 1 (músculo); neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; proteína de enlace con el factor de crecimiento tipo insulina 1, 36kDa. S prefieren más las células que tienen, en relación a fibroblastos, células madre

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cuando se usan terapéuticamente, el crecimiento de las células del paciente se estimula y soporta, y la angiogénesis apropiada se estimula o soporta de manera similar. Las composiciones matriz-célula pueden introducirse en el cuerpo de paciente por cualquier modo conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado a implante, inyección, unión quirúrgica, trasplante con otro tejido, inyección y similares. En algunas realizaciones, las matrices se forman in vivo, o incluso más preferiblemente in situ, por ejemplo se pueden usar de acuerdo con la invención geles polimerizables in situ. Ejemplos de dichos geles se conocen en la técnica.

En algunas realizaciones, las células de la invención, o co-cultivos de las mismas, pueden sembrarse en dichas matrices tridimensionales, como supercóntigos e implantarse in vivo, donde las células sembradas pueden proliferar sobre o en la estructura o ayudar a establecer tejido de reemplazo in vivo con o sin cooperación con otras células.

El crecimiento de PPDCs o co-cultivos de las mismas en la estructura tridimensional resulta preferiblemente en la formación de un tejido tridimensional, o fundamento para el mismo, que puede utilizarse in vivo, por ejemplo para reparar tejido dañado o enfermo. Por ejemplo, los supercóntigos tridimensionales pueden usarse para formar estructuras tubulares, por ejemplo para su uso en la reparación de vasos sanguíneos; o aspectos del sistema circulatorio o estructuras coronarias.

De acuerdo con un aspecto de la invención, las PPDCs o co-cultivos de las mismas se inoculan, o siembran sobre una estructura o matriz tridimensional, como un supercóntigo, una espuma o hidrogel. La estructura puede configurarse de varias formas como generalmente plano, generalmente cilíndrico o tubular, o puede ser completamente de forma libre como se pueda requerir o desear para la estructura correctora bajo consideración. En algunas realizaciones, las PPDCs crecen sobre la estructura tridimensional, mientras que en otras realizaciones, las células solo sobreviven, o incluso mueren, sin embargo al hacerlo estimulan o promueven el crecimiento interno de nuevo tejido, por ejemplo, y preferiblemente la vascularización. Las PPDCs pueden co-administrarse con miocitos, mioblastos, células endoteliales vasculares, fibroblastos dérmicos, queratinocitos, y otros progenitores tipo tejido blando. Cuando crecen en este sistema tridimensional, las células que proliferan maduran y secretan adecuadamente para formar componentes de tejidos adultos análogos a las contrapartidas encontradas de forma natural in vivo.

Por ejemplo, pero no a modo de limitación, la matriz puede diseñarse de tal manera que la estructura de la matriz: (1) soporte las PPDCs o co-cultivos de las mismas sin degradación posterior; (2) soporte las PPDCs o cocultivos de las mismas desde el momento de la siembra hasta que el trasplante de tejido es remodelado por el tejido huésped; (3) permite a las células sembradas unirse, proliferar y desarrollarse en una estructura de tejido que tiene suficiente integridad mecánica para soportarse a sí mismo in vitro, en cuyo punto, la matriz se degrada. Una revisión del diseño de la matriz se proporciona por Hutmacher, J. Biotttat. Sci. Polymer Edn., 12(1):107-124 (2001).

Las matrices, supercóntigos, espumas y sistemas de auto-ensamblaje contemplados para el uso en la presente pueden implementarse en combinación con cualquiera o más células, factores de crecimiento, fármacos u otros componentes, como agentes bioactivos que promueven la curación, o el crecimiento interno de tejido, o estimulan la vascularización o inervación de los mismos o potencian de otra manera o mejoran la producción terapéutica o la práctica de la invención, además de las células de la invención.

Las células de la invención pueden cultivarse libremente en cultivo, retirarse del cultivo e inocularse en una estructura tridimensional. La inoculación de la estructura tridimensional con una concentración de células, por ejemplo, aproximadamente 106 a 5 x 107 células por milímetro, resulta preferiblemente en el establecimiento del soporte tridimensional en periodos relativamente más cortos. Además en alguna aplicación puede ser preferible usar un mayor o un menor número de células dependiendo del resultado deseado.

En algunas realizaciones, es útil el recrear en cultivo el microambiente celular encontrado in vivo, de tal manera que puede variar la extensión a las que las células se cultivan antes del implante in vivo o in vitro. Las PPDCs o co-cultivos de las mismas pueden inocularse en la estructura antes o después de formar la forma deseada para el implante, por ejemplo, cuerdas, tubos, filamentos y similares. Después de la inoculación de las células en la estructura, la estructura se incuba preferiblemente en un medio de crecimiento apropiado. Durante el periodo de incubación, las células inoculadas crecerán y envolverán la estructura y pueden por ejemplo, puentear, o puentear parcialmente cualquier espacio intersticial en la misma. Es preferible, pero no requerido cultivar las células a un grado apropiado que refleje la densidad celular in vivo del tejido que está siendo reparado o regenerado. En otras realizaciones, la presencia de las PPDCs, incluso en números relativamente bajos en la estructura fomenta el crecimiento interno de otras células sanas para facilitar la curación por ejemplo de un tejido herido o necrótico.

Ejemplos de matrices, por ejemplo supercóntigos que se pueden usar para aspectos de la invención incluyen esteras (tejidas, de punto, y más preferiblemente no tejidas) espumas porosas o semipororosas, péptidos de auto ensamblaje y similares. Las esteras no tejidas pueden, por ejemplo, formarse usando fibras comprendidas de polímeros naturales o sintéticos. En una realización preferida, se usan copolímeros absorbibles de ácidos glicólicos y lácticos (PGA/PLA) vendidos bajo el nombre comercial VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, NJ) para

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se proporcionan en la presente kits para su uso en el tratamiento de infarto de miocardio. Los kits proporcionan la composición de células terapéutica de la invención que pueden prepararse en una forma farmacéuticamente aceptable, por ejemplo mezclándola con un portador farmacéuticamente aceptable, y un aplicador, junto con instrucciones para el uso. Idealmente el kit puede usarse en el campo, por ejemplo en una oficina de un facultativo, o por un proveedor de atención de emergencia para ser aplicado a un paciente al que se le ha diagnosticado haber tenido un infarto de miocardio o evento cardiaco similar.

La invención también proporciona en otro aspecto, las células de la invención para su uso en métodos para tratar a un paciente con una enfermedad del corazón o el sistema circulatorio, en el que los métodos comprenden administrar una composición de células derivadas del cordón umbilical humanas a un paciente con una enfermedad del corazón o el sistema circulatorio; y evaluar al paciente para mejoras en la función cardiaca, en el que la administración es con una población de otro tipo de células. Se prefiere la administración de co-cultivos, poblaciones mixtas u otras poblaciones no clonales. Otros tipos de células que pueden coadministrarse son mioblastos, miocitos, cardiomiocitos, cardiomioblastos, o progenitores de mioblastos, miocitos, cardiomiocitos, o cardiomioblastos.

También se proporcionan en la presente las células de la invención para su uso en métodos para tratar a un paciente con una enfermedad del corazón o el sistema circulatorio, en el que los métodos comprenden administrar una composición e células derivadas del cordón umbilical humanas derivadas del postparto a un paciente con una enfermedad del corazón o el sistema circulatorio; y evaluar al paciente para mejoras en la función cardiaca, en el que la composición de células terapéuticas se administra como un complejo matriz-célula. En ciertas realizaciones, la matriz es un supercóntigo, preferiblemente bioabsorbible, que comprende al menos las células derivadas del postparto.

También se proporcionan kits para la aplicación terapéutica de las poblaciones y cocultivos de la invención. Cuando se usan para el tratamiento de cardiomiopatías, u otro tratamiento programado, los kits incluyen una composición de células terapéutica, como o sin una matriz, y con o sin un cocultivo presente. Los kits también incluyen opcionalmente un medio para administrar las células, por ejemplo por inyección, y un portador farmacéuticamente aceptable para las células, si se requiere. Los kits incluyen instrucciones para el uso de las células. Los kits preparados para el uso en hospitales de campaña, como para uso militar pueden incluir suministros de procedimiento completo incluyendo supercóntigos de tejido, suturas quirúrgicas y similares, cuando las células se van a usar en conjunción con reparación de lesiones cardiacas agudas.

La invención también proporciona depósitos de tejidos, células, poblaciones y composiciones de células terapéuticas de la invención. Como se ha tratado con anterioridad las células se criopreservan fácilmente. La divulgación por lo tanto proporciona métodos para criopreservar las células en un banco, en donde las células se almacenan congeladas y asociadas con una caracterización completa de las células en base a las propiedades inmunológicas, bioquímicas y genéticas de las células. Las células así congeladas pueden usarse para terapia autóloga, singénica o alogénica, dependiendo de los requisitos del procedimiento y las necesidades del paciente. Preferiblemente, la información de cada muestra criopreservada se almacena en un ordenador en el que se puede buscar en base a los requisitos del cirujano, procedimiento y paciente con las concordancias adecuadas hechas en base a la caracterización de las células o poblaciones. Preferiblemente, las células de la invención se cultivan y expanden a la cantidad deseada de células y las composiciones de células terapéuticas se preparan o de manera separada o como cocultivos, en presencia o ausencia de una matriz o soporte. Aunque para algunas aplicaciones puede ser preferible usar células recién preparadas, el resto se puede criopreservar y depositar congelando las células e introduciendo la información en el ordenador para asociar la entrada informática con las muestras. Incluso cuando no es necesario emparejar una fuente o donante con un recipiente de dichas células, para propósitos inmunológicos, el sistema de banco hace fácil emparejar, por ejemplo, propiedades bioquímicas o genéticas deseables de las células depositadas con las necesidades terapéuticas. Una vez emparejadas las propiedades deseadas con una muestra almacenada de partículas, la muestra se retira y prepara para el uso terapéutico. Los lisados celulares preparados como se describe en la presente pueden también criopreservarse y depositarse de acuerdo con la presente divulgación.

En otro aspecto de la invención se proporcionan kits para el crecimiento y mantenimiento, el aislamiento y el uso de células derivadas del tejido del cordón umbilical. Las células de la invención y de acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, lisados celulares, fracciones celulares solubles, fracciones de membrana y matrices pueden ser empleadas convenientemente como partes de kits, por ejemplo, para un kit para el cultivo o implante. La invención proporciona un kit que incluye los UDCs y componentes adicionales, que incluyen instrucciones para el crecimiento o mantenimiento, aislamiento o use de las células o fracciones celulares, junto con por ejemplo, material de la matriz (por ejemplo supercóntigo), agentes hidratantes (por ejemplo, soluciones salinas fisiológicamente compatibles, medios de cultivo celulares preparados), sustratos de cultivos celulares (por ejemplo platos, placas recipientes, etc. de cultivo), medios de cultivo celulares (ya sea en forma líquida o deshidratada), compuestos antibióticos, hormonas y similares. Los kits para el crecimiento pueden por ejemplo incluir todos los componentes del Medio de Crecimiento como se usan en la presente, incluyendo suero, por ejemplo suero bovino fetal. Aunque el kit puede incluir cualquiera de dichos componentes, preferiblemente incluye todos los ingredientes necesarios para su uso pretendido. Si se desea, el kit también puede incluir células (típicamente criopreservadas), que pueden

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mecánicamente en placas de cultivo de tejido de 150 cm2 en presencia de 50 mililitros de medio (DMEM-glucosa baja o DMEME-glucosa alta; Invitrogen), hasta que el tejido se hubo desmenuzado en una pasta fina. Los tejidos picados se transfirieron a tubos cónicos de 50 mililitros (aproximadamente 5 gramos de tejido por tubo). El tejido fue después digerido o en medio DMEM-glucosa baja o en medio DMEM-glucosa alta, conteniendo cada uno 10.000 Unidades de antimicótico o antibiótico por 100 mililitros de PBS y enzimas de digestión. En algunos experimentos se usó una mezcla de enzimas de colagenasa y dispasa ("C:D;" colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 500 Unidades/mililitro, y dispasa (Invitrogen), 50 Unidades/mililitro en medio DMEM-glucosa baja). En otros experimentos se usó una mezcla de colagenasa, dispasa e hialuronidasa ("C:D:H") (colagenasa, 500 Unidades/mililitro; dispasa, 50 Unidades/mililitro, e hialuronidasa (sigma), 5 Unidades/mililitro, en DMEM:-glucosa baja). Los tubos cónicos que contenían el tejido, medio y enzimas de digestión se incubaron a 37º C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm durante 2 horas.

Después de la digestión, los tejidos se centrifugaron a 150 x g durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 20 mililitros de Medio de Crecimiento (DMEM: glucosa baja (Invitrogen), 15 por ciento (v/v) de suero bovino fetal (FBS; suero bovino definido; Lot#AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma), 1 mililitro por 100 mililitros de antibiótico/antimicótico (10.000 Unidades por mililitro de penicilina, 10.000 microgramos por mililitro de estreptomicina, 25 microgramos por milímetro de anfotericina B; Invitrogen, Carlsbad, CA)). La suspensión celular se filtró a través de un colador células de nylon de 70 micrómetros (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Se pasaron 5 mililitros adicionales de enjuague que comprendía Medio de Crecimiento a través del colador. La suspensión celular se pasó después a través de un colador celular de nylon de 40 micrómetros (Nalge Nunc International) y se persiguió con 5 mililitros adicionales de Medio de Crecimiento.

El filtrado se resuspendió en Medio de Crecimiento (volumen total 50 mililitros) y se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resupendieron en 50 mililitros de Medio de Crecimiento nuevo. Este proceso se repitió dos veces más.

Una vez se hubo aspirado el sobrenadante de la centrifugación final y el pellet celular se hubo resupendido en 5 mililitros de Medio de Crecimiento nuevo. El número de células viables se determino usando tinción con azul de tripano. Las células se cultivaron bajo condiciones estándar.

Las células aisladas de las células del cordón umbilical se sembraron a 5.000 células/cm2 sobre matraces T-75 cm2 recubiertos de gelatina (Corning Inc., Corning, NY) en Medio de Crecimiento. Después de 2 días, el medio gastado se aspiro de los matraces. Las células se lavaron con PBS tres veces para eliminar los desechos y las células derivadas de la sangre. Las células fueron después respuestas con Medio de Crecimiento y se permitió que crecieran a confluencia (alrededor de 10 días desde el pase) al pase 1. En pases posteriores (desde el pase 1 al 2, etc.) las células alcanzaron la sub-confluencia (75-85 por ciento de confluencia) en 4-5 días. Para estos pases posteriores, las células se sembraron a 5000 células/cm2. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada con un 5 por ciento de dióxido de carbono y un 20 por ciento de oxígeno a 37º C.

Aislamiento de Células de la Placenta

El tejido de la placenta se obtuvo de NDRI (Philadelphia, PA). Los tejidos eran de un embarazo y se obtuvieron en el momento de un parto quirúrgico normal. Las células de la placenta se aislaron como se describe para el aislamiento de células umbilicales.

La siguiente descripción se aplica al aislamiento de poblaciones separadas de células derivadas de la madre y células derivadas neonatales del tejido de la placenta.

El protocolo de aislamiento celular se realizó asépticamente en una campana de flujo laminar. El tejido de la placenta se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) en presencia de antimicótico y antibiótico(penicilina, 10.000 Unidades/mililitro; estreptomicina, 10.000 microgramos/mililitro; anfotericina B, 25 microgramos/mililitro; Invitrogen) para eliminar tanta sangre y desecho como sea posible. El tejido de la placenta se diseccionó después en tres secciones; aspecto neonatal, la región vellosa, el aspecto maternal.

Las secciones separadas se lavaron individualmente varias veces en PBS con antibiótico/antimicótico para eliminar sangre y desecho adicionales. De esta manera se eliminó sustancialmente toda la sangre. Cada sección fue después disociada mecánicamente en placas de cultivo de tejido de 150 cm2 en presencia de 50 mililitros de DMEM: glucosa baja (Invitrogen), a una pasta fina. La pasta se transfirió a tubos cónicos de 50 mililitros. cada tubo contenía aproximadamente 5 gramos de tejido. El tejido se digirió en medio DMEM-glucosa baja o DMEM-glucosa alta que contenía 10.000 Unidades de antimicótico y antibiótico por 100 mililitros de PBS y enzimas de digestión. En algunos experimentos se usó una mezcla de enzimas de colagenasa y dispasa ("C:D") que contenía colagenasa (Sigma, St Louis, MO) a 500 Unidades/mililitro y dispasa (Invitrogen) a 50 Unidades/mililitro en medio DMEM:-glucosa baja. En otros experimentos se usó una mezcla de colagenasa, dispasa e hialuronidasa (C:D:H) (colagenasa, 500 Unidades/mililitro; dispasa, 50 Unidades/mililitro e hialuronidasa (Sigma), 5 Unidades/mililitro en DMEM:-glucosa

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Publicada 20030327, A3 Publicada 20031218

Tabla 1-1: Aislamiento de células de tejido del cordón umbilical usando diferentes combinaciones de enzimas

Digestión Enzimática

Aislado de Células Expansión Celular

Colagenasa

X X

Dispasa

+ (> 10 h) +

Hialuronidasa

X X

Colagenasa :Dispasa

++ (< 3 h) ++

Colagenasa:Hialuronidasa

++ (< 3 h) +

Dispasa:Hialuronidasa

+ (> 10 h) +

Colagenasa:Dispasa:Hialuronidasa

+++ (< 3 h) +++

Clave: + = buena, ++ = muy buena, +++ = excelente X = sin éxito

Tabla 1-2: Aislamiento y expansión del cultivo de células postparto bajo diferentes condiciones

25

35

45

Condición

Medio 15% FBS BME Gelatina 20% O2 Factores de Crecimiento

1

DMEM-Lg Y Y Y Y N

2

DMEM-Lg Y Y Y N (5%) N

3

DMEM-Lg Y Y N Y N

4

DMEM-Lg Y Y N N (5%) N

5

DMEM-Lg N (2%) Y N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/mililitro)

6

DMEM-Lg N (2%) Y N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/mililitro)

7

DMEM-Lg N (2%) Y N (Fibrona) Y PDGF/VEGF

8

DMEM-Lg N (2%) Y N (Fibrona) N (5%) PDGF/VEGF

9

DMEM-Lg Y N Y Y N

10

DMEM-Lg Y N Y N (5%) N

11

DMEM-Lg Y N N Y N

12

DMEM-Lg Y N N N (5%) N

13

DMEM-Lg N (2%) N N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/mililitro)

14

DMEM-Lg N (2%) N N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/mililitro)

15

DMEM-Lg N (2%) N N (Fibrona) Y PDGF/VEGF

16

DMEM-Lg N (2%) N N (Fibrona) N (5%) PDGF/VEGF

EJEMPLO 2 55 Características de Crecimiento de Células Postparto

Resumen

Los productos de células comercialmente viables deben ser capaces de ser producidos en suficientes cantidades para proporcionar tratamiento terapéutico a pacientes con necesidad de tratamiento. Las células postparto pueden expandirse en cultivo para dichos propósitos. Se hicieron comparaciones del crecimiento de células postparto en cultivo con las de otras poblaciones de células incluyendo células madre mesenquimales. Los datos demuestran que las líneas celulares postparto como se desarrollan en la presente pueden expandirse durante más de 40 duplicaciones para proporcionar suficientes números de células, por ejemplo, para bancos pre-clínicos.

65 Además, estas poblaciones de células postparto pueden expandirse bien de sembrados de baja-o alta densidad.

27

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5

15

25

35

Tabla 4-1. Resultados de cariotipos de PPDCs

Tejido

pase Células de Metafase contadas Células de Metafase analizadas número de cariotipo Cariotipo ISCN

Placenta

22 20 5 2 46,XX

Umbilical

23 20 5 2 46, XX

Umbilical

6 20 5 2 46, XY

Placenta

2 20 5 2 46, XX

Umbilical

3 20 5 2 46,XX

Placenta-N

0 20 5 2 46, XY

Placenta-V

0 20 5 2 46, XY

Placenta-M

0 21 5 4 46, XY[18]/46,XX[3]

Placenta-M

4 20 5 2 46,XX

Placenta-N

9 25 5 4 46, XY[5]/46,XX[20]

Placenta-N C1

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C3

1 20 6 4 46, XY[2]/46,XX[18]

Placenta-N C4

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C15

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C20

1 20 5 2 46, XY

Clave: N-aspecto neonatal; V-región vellosa; M-aspecto materno; C-clon

Resumen. El análisis cromosómico identificó PPDCs derivadas de la placenta y el cordón umbilical cuyos cariotipos parecen normales como se interpretaron por un laboratorio citogenético clínico. El análisis de cariotipos 45 también identificó líneas celulares libres de células maternas, como se determina por cariotipo homogéneo.

EJEMPLO 5

Evaluación de Marcadores de Superficie de Células Derivadas del Postparto por Citometría de Flujo

Resumen

La caracterización de la expresión de proteínas de la superficie celular, o "marcadores" por citometría de flujo de líneas celulares cultivadas etiquetadas con anticuerpos monoclonales fluorescentes permite la determinación

55 de la identidad de una línea celular. Se caracterizaron células postparto derivadas de la placenta y del cordón umbilical por citometría de flujo para la expresión de los marcadores de superficie celular CD10, CD13, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD117, CD141, PDGFr-alfa, HLA-A,B,C y HLA-DR, DP,DQ. Tanto las células postparto derivadas del placenta y del cordón umbilical son positivas para la expresión de CD10, CD 13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLA-A, B, C y negativas para la expresión de CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD 117, CD141 y HLADR, DP, DQ. este patrón de expresión fue consistente entre variables como donante de células, pase, recubrimiento de la superficie del recipiente de cultivo, y enzimas de digestión usados en el aislamiento. Este patrón de expresión también era consistente en células aisladas del aspecto materno, aspecto neonatal y región vellosa de la placenta.

65 Introducción

33

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5

15

25

Tabla 6-3. Genes que han sido específicamente aumentados en expresión en células derivadas de la placenta en comparación con las otras líneas celulares ensayadas

Genes Aumentados en Células Derivadas de la Placenta

ID del Conjunto de Sondas

Nombre del Gen Número de Entrada del NCBI

209732_at

lectina de tipo C (dependiente del calcio, dominio de reconocimiento de carbohidratos), miembro de la superfamilia 2 (inducida por activación) AF070642

206067_s_at

Tumor de Wilms 1 NM_024426

207016_s_at

familia de aldehído deshidrogenasa 1, miembro A2 AB015228

206367_at

Renina NM_000537

210004_at

receptor 1 de lipoproteína de baja densidad oxidada (tipo lectina) AF035776

214993_at

Homo sapiens, clon IMAGE:4179671, ARNm, cds parciales AF070642

202178_at

proteína quinasa C, zeta NM_002744

209780_at

proteína hipotética DKFZp564F013 AL136883

204135_at

reguladas hacia abajo en el cáncer de ovario 1 NM_014890

213542_at

ARNm Homo sapiens; ADNc DKFZp547K1113 (del clon DKFZp547K1113) AI246730

Tabla 6-4. Genes que han aumentado específicamente en expresión en células derivadas del cordón umbilical en

comparación con las otras líneas celulares ensayadas

35

45

55

Genes Aumentados en Células Derivadas del Cordón Umbilical

ID del Conjunto de Sondas

Nombre del Gen Número de Entrada del NCBI

202859_x_at

Interleucina 8 NM_000584

211506_s_at

Interleucina 8 AF043337

210222_s_at

reticulon 1 BC000314

204470_at

ligando 1 de quimioquinas (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanomas NM_001511

206336_at

ligando 6 de quimioquinas (motivo C-X-C) (proteína 2 quimiotáctica de l i ) NM_002993

207850_at

ligando 3 de quimioquinas motivo (C-X C-) NM_002090

203485_at

reticulon 1 NM_021136

202644_s_at

factor de necrosis tumoral, proteína inducida por alfa 3 NM_006290

39

E10183053

15-10-2015

5

15

25

35

45

55

Tabla 6-5. Gens que disminuyeron en expresión en células del cordón umbilical y la placenta en comparación con las otras líneas celulares ensayadas

Genes Disminuidos en Células Derivadas del Cordón Umbilical y la Placenta

ID del Conjunto de Sondas

Nombre del Gen Número de Entrada del NCBI

210135_s_at

homeobox 2 de estatura corta AF022654.1

205824_at

proteína 2 de shock cardiaco de 27kDA NM_001541.1

209687_at

ligando 12 de quimioquinas (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales) U19495.1

203666_at

ligando 12 de quimioquinas (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales) NM_000609.1

212670_at

elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren) AA479278

213381_at

ARnm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022) N91149

206201_s_at

homeobox 2 de mesénquima (homeobox específico de la detención del crecimiento) NM_005924.1

205817_at

homólogo 1 del homeobox de sine oculis (Drosophila) NM_005982.1

209283_at

cristalina, alfa B AF007162.1

212793_at

activador asociado enredado de la morfogénesis 2 BF513244

213488_at

proteína DKFZP586B2420 AL050143.1

209763_at

similar a neuralina 1 AL049176

205200_at

tetranectina (proteína de enlace del plasminógeno) NM_003278.1

205743_at

homología src tres (SH3) y dominio rico en cisteína NM_003149.1

200921_s_at

gen de translocación de células B 1, antiproliferativo NM_001731.1

206932_at

colesterol 25-hidroxilasa NM_003956.1

204198_s_at

factor de transcripción enanismo-relacionado 3 AA541630

219747_at

proteína hipotética FLJ23191 NM_024574.1

204773_at

receptor de interleucina 11, alfa NM_004512.1

202465_at

potenciador de C-endopeptidasa de pro-colágeno NM_002593.2

203706_s_at

homólogo rizado 7 (Drosophila) NM_003507.1

212736_at

gen hipotético BC008967 BE299456

214587_at

colágeno, tipo VIII, alfa 1 BE877796

201645_at

tenascina C (hexabrachion) NM_002160.1

210239_at

proteína homeobox iroquois 5 U90304.1

203903_s_at

hefaestina NM_014799.1

205816_at

integrina, beta 8 NM_002214.1

203069_at

glicoproteína 2 de vesículas sinápticas NM_014849.1

213909_at

ADNc de Homo sapiens FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744 AU147799

206315_at

factor 1 tipo receptor de citoquinas NM_004750.1

40

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15-10-2015

15

25

35

45

55

(continuación)

Genes Disminuidos en Células Derivadas del Cordón Umbilical y la Placenta

ID del Conjunto de Sondas

Nombre del Gen Número de Entrada del NCBI

204401_at

canal activado por calcio de conductancia intermedia/pequeña de potasio, subfamilia N, NM_002250.1

216331_at

integrina, alfa 7 AK022548.1

209663_s_at

integrina, alfa 7 AF072132.1

213125_at

proteína DKFZP586L151 AW007573

202133_at

co-activador transcripcional con motivo de enlace con PDZ (TAZ) AA081084

206511_s_at

homólogo 2 de homeobox de sine oculis (Drosophila) NM_016932.1

213435_at

proteína KIAA1034 AB028957.1

206115_at

respuesta de crecimiento temprana 3 NM_004430.1

213707_s_at

homeobox menos distal 5 NM_005221.3

218181_s_at

proteína hipotética FLJ20373 NM_017792.1

209160_at

familia aldo-ceto reductasa 1; miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II) AB018580.1

213905_x_at

biglicano AA845258

201261_x_at

biglicano BC002416.1

202132_at

co-activador transcripcional con motivo de enlace con PDZ (TAZ) AA081084

214701_s_at

fibronectina 1 AJ276395.1

213791_at

proencefalina NM_006211.1

205422_s_at

integrina, tipo beta 1 (con dominios de repetición tipo EGF) NM_004791.1

214927_at

inserto de longitud completa de ARNm de Homo sapiens; clon de ADNc EUROIMAGE 1968422 AL359052.1

206070_s_at

EphA3 AF213459.1

212805_at

proteína KIAA0367 AB002365.1

219789_at

receptor C de péptido natriurético/guanilato ciclasa C (receptor C del péptido atrionatriurético) AI628360

219054_at

proteína hipotética FLJ14054 NM_024563.1

213429_at

ARNm de Homo Sapiens; ADNc DKFZp564B222 del clon DKFZp564B222) AW025579

204929_s_at

proteína de la membrana asociada a vesículas 5 (miobrevina) NM_006634.1

201843_s_at

proteína de la matriz extracelular tipo fibulina que contiene EGF 1 NM_004105.2

221478_at

tipo proteína 3 de interacción de 19kDa BCL2/adenovirus E1B AL132665.1

201792_at

proteína 1 de enlace con AE NM_001129.2

204570_at

polipéptido VIIa de la subunidad de citocromo c oxidasa 1 (músculo) NM_001864.1

201621_at

neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1 NM_005380.1

202718_at

proteína de enlace con el factor de crecimiento tipo insulina 1, 36kDa NM_000597.1

41

E10183053

15-10-2015

Las Tablas 6-6, 6-7 y 6-8 muestran la expresión de genes aumentada en fibroblastos humanos (Tabla 6-6), células ICBM (Tabla 6-7) y MSCs (Tabla 6-8).

5

celulares ensayadas

15

25

35

45

Tabla 6-6. Genes que han aumentado en expresión en fibroblastos en comparación con las otras líneas

Genes aumentados en fibroblastos

fosfatasa de especificidad dual 2

proteína KIAA0527

ADNc de Homo sapiens cDNA: FLJ23224 fis, clon ADSU02206

dineína, citoplasmática, polipéptido intermedio 1

anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G)

inhibina, beta A (activina A, polipéptido alfa de activina AB)

pirofosfatasa/fosfodiesterasa de ectonucleotidos 4 (función putativa)

proteína KIAA1053

proteína asociada a microtúbulos 1A

proteína con dedos de zinc 41

proteína HSPC019 protein

ADNc de Homo sapiens: FLJ23564 fis, clon LNG10773

ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564A072 (del clon DKFZp564A072)

Proteína LIM (similar al enigma de enlace C de proteína quinasa de rata)

inhibidor del potenciador de genes de polipéptidos ligeros kappa en células B; quinasa proteína asociada al complejo

proteína hipotética FLJ22004

secuencia de ARNm Humana (clon CTG-A4)

ESTs, Moderadamente similares al factor tipo receptor de citoquinas 2; precursor CRL2 de receptores de citoquinas [Homo sapiens]

factor de crecimiento transformante, beta 2

proteína hipotética MGC29643

antígeno identificado por anticuerpo monoclonal MRC OX-2

proteína de retinopatía ligada al cromosoma X putativa

Tabla 6-7. Genes que aumentaron en expresión en las células derivadas de ICBM en comparación con otras líneas celulares ensayadas

Genes Aumentados en Células ICBM

•

proteína de repetición de anquirina cardiaca

•

región ORF de MHC clase I

•

integrina, alfa 10

•

proteína hipotética FLJ22362

•

UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina: polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GalNAc-T3)

•

proteína inducida por interferones 44

•

SRY región determinante del sexo Y)-caja 9 (displasia campomélica, reversión sexual autosómica)

•

proteína asociada a la queratina 1-1

•

tipo hippocalcina 1

•

dentado 1 (síndrome de Alagille)

•

proteoglicano 1, gránulo secretor

42

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E10183053

15-10-2015

5

15

25

35

45

55

Tabla 10-2. Datos de Reacción de linfocitos Mixta -Línea Celular B (Placenta)

DPM para Ensayo de Proliferación

ID de la Placa ID: Placa1

Analítico

Cultivo Réplicas

número

Sistema 1 2 3 Media SD CV

IM03-7769

Línea de base de proliferación del receptor 79 119 138 112.0 30.12 26.9

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

241 272 175 229.3 49.54 21.6

Donante alogénico MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C)

23971 22352 20921 22414.7 1525.97 6.8

MLR con línea celular (célula tipo B tratada con Mitomicina C)

664 559 1090 771.0 281.21 36.5

SI (donante)

200

SI (línea celular)

7

IM03-7770

Línea de base de proliferación del receptor 206 134 262 200.7 64.17 32.0

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

1091 602 524 739.0 307.33 41.6

Donante alogénico MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C)

45005 43729 44071 44268.3 660.49 1.5

MLR con línea celular (célula tipo B tratada con Mitomicina C)

533 2582 2376 1830.3 1128.24 61.6

SI (donante)

221

SI (línea celular)

9

53

E10183053

15-10-2015

(continuación)

5

15

25

35

45

55

DPM para Ensayo de Proliferación

IM03-7771

Línea de base de proliferación del receptor 157 87 128 124.0 35.17 28.4

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

293 138 508 313.0 185.81 59.4

Donante alogénico MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C)

24497 34348 31388 30077.7 5054.53 16.8

MLR con línea celular (célula tipo B tratada con Mitomicina C)

601 643 a 622.0 29.70 4.8

SI(donante)

243

SI (línea celular)

5

IM03-7772

Línea de base de proliferación del receptor 56 98 51 68.3 25.81 37.8

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

133 120 213 155.3 50.36 32.4

Donante alogénico MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C)

14222 20076 22168 18822.0 4118.75 21.9

MLR con línea celular (célula tipo B tratada con Mitomicina C)

a a a a a a

SI (donante)

275

SI (línea celular)

a

IM03-7768 (donante alogénico)

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con 84 242 208 178.0 83.16 46.7

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina)

361 617 304 427.3 166.71 39.0

Línea celular tipo B

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con 126 124 143 131.0 10.44 8.0

Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina)

822 1075 487 794.7 294.95 37.1

54

E10183053

15-10-2015

(continuación)

5

15

25

35

45

55

ID de Placa: Placa 2

Número Analítico

Sistema de Cultivo 1 Réplicas 2 3 Media SD CV

Línea de base de proliferación del receptor Control de la

908 181 330 473.0 384.02 81.2

autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

269 405 572 415.3 151.76 36.5

IM03-7773

Donante alogénico MLR

IM03-7768 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular (célula

29151 28691 28315 28719.0 418.70 1.5

tipo B tratada con Mitomicina C)

567 732 905 734.7 169.02 23.0

SI (donante) SI (línea celular)

61 2

Línea de base de proliferación del receptor Control de la

893 1376 185 818.0 599.03 73.2

autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

261 381 568 403.3 154.71 38.4

IM03-7774

Donante alogénico

MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular

53101 42839 48283 48074.3 5134.18 10.7

(célula tipo B tratada con Mitomicina C)

515 789 294 532.7 247.97 46.6

SI (donante) SI (línea celular)

59 1

Línea de base de proliferación del receptor Control de la

1272 300 544 705.3 505.69 71.7

autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

232 199 484 305.0 155.89 51.1

IM03-7775

Donante alogénico

MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular

23554 10523 28965 21014.0 9479.74 45.1

(célula tipo B tratada con Mitomicina C)

768 924 563 751.7 181.05 24.1

SI (donante) SI (línea celular)

30 1

55

E10183053

15-10-2015

(continuación)

5

15

25

ID de Placa: Placa 2

Número Analítico

Sistema de Cultivo 1 2 Réplicas 3 Media SD CV

IM03-7776

Línea de base de proliferación del receptor Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C) Donante alogénico MLR IM03-7768 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular (célula tipo B tratada con Mitomicina C) 1530 137 420 218 28893 32493 a a 1046 394 34746 a 904.3 344.0 32044.0 a 707.22 109.89 2952.22 a 78.2 31.9 9.2 a

SI (donante) SI (línea celular)

35 a

Tabla 10-3. Índice de Estimulación medio de células de la placenta y un donante alogénico en una reacción de linfocitos mixta con seis receptores alogénicos individuales

Indice de Estimulación Media

Recipiente

Placenta

Placa 1 (receptores 1-3)

279 3

Placa 2 (receptores 4-6)

46.25 1.3

35

Reacción de Linfocitos Mixta -Cordón Umbilical. Se seleccionaron seis donantes de sangre voluntarios humanos para identificar un único donante alogénico que mostrase una respuesta de proliferación robusta en una reacción de linfocitos mixta con los otros cinco donantes de sangre. Este donante se seleccionó como el donante de control positivo alogénico. Los cincos donantes de sangre restantes se seleccionaron como recipientes. El donante de control positivo alogénico y las líneas celulares de la placenta se trataron con mitocina C y se cultivaron en una reacción de linfocitos mixta con los cinco receptores alogénicos individuales. Las reacciones se realizaron por triplicado usado dos placas de cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 10-4). El índice de estimulación media varió de 6,5 (placa 1) a 9 (placa 2) y los controles positivos de donantes alogénicos variaron de 42,75 (placa

45 1) a 70 (placa 2) (Tabla 10-5).

55

56

E10183053

15-10-2015

5

15

25

35

45

55

Tabla 10-4. Reacción de Linfocitos Mixta -Línea Celular A (Cordón umbilical)

DPM para ensayo de Proliferación Placa ID: Placa l

Número Analítico

Sistema de Cultivo 1 Réplicas 2 3 Media SD CV

Línea de base de proliferación del receptor Control de la

1074 406 391 623.7 390.07 62.5

autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

672 510 1402 861.3 475.19 55.2

IM04-2478

Donante alogénico MLR

IM04-2477 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular

43777 48391 38231 43466.3 5087.12 11.7

(célula tipo A tratada con Mitomicina C)

2914 5622 6109 4881.7 1721.36 35.3

SI (donante) SI (línea celular)

70 8

Línea de base de proliferación del receptor Control de la

530 508 527 521.7 11.93 2.3

autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

701 567 1111 793.0 283.43 35.7

IM04-2479

Donante alogénico MLR IM04

2477 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular

25593 24732 22707 24344.0 1481.61 6.1

(célula tipo A tratada con Mitomicina C)

5086 3932 1497 3505.0 1832.21 52.3

SI (donante) SI (línea celular)

47 7

Línea de base de proliferación del receptor Control de la

1192 854 1330 1125.3 244.90 21.8

autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C)

2963 993 2197 2051.0 993.08 48.4

IM04-2480

Donante alogénico MLR

IM04-2477 (tratado con Mitomicina C) MLR con línea celular (célula

25416 29721 23757 26298.0 3078.27 11.7

tipo A tratada con Mitomicina C)

2596 5076 3426 3699.3 1262.39 34.1

SI (donante) SI (línea celular)

23 3

57

E10183053

15-10-2015

(continuación)

5

15

25

35

45

55

DPM para ensayo de Proliferación Placa ID: Placa l

Número Analítico

Sistema de Cultivo 1 Réplicas 2 3 Media SD CV

IM04-2481

Línea de base de proliferación del receptor Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C) MLR allogenic donor IM04-2477 (Mitomycin C treated) MLR with cell line (Mitomycin C treated cell type A) 695 451 738 1252 13177 24885 4495 3671 555 464 15444 4674 567.0 818.0 17835.3 4280.0 122.44 400.04 6209.52 534.95 21.6 48.9 34.8 12.5

SI (donante) SI (línea celular)

31 8

Placa ID: Placa 2

Número Analítico

Sistema de Cultivo 1 Réplicas 2 3 Media SD CV

IM04-2482

Línea de base de proliferación del receptor Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C) MLR allogenic donor IM04-2477 (Mitomycin C treated) MLR with cell line (Mitomycin C treated cell type A) 432 533 1459 633 24286 30823 2762 1502 274 598 31346 6723 413.0 896.7 28818.3 3662.3 130.54 487.31 3933.82 2724.46 31.6 54.3 13.7 74.4

SI (donante) SI (línea celular)

70 9

IM04-2477 (donante alogénico)

Línea de base de proliferación del receptor Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina) 312 419 567 604 349 374 360.0 515.0 54.34 123.50 15.1 24.0

Línea celular tipo A

Línea de base de proliferación del receptor Control de la autoestimulación (Células autólogas tratadas con Mitomicina C) 5101 1924 3735 4570 2973 2153 3936.3 2882.3 1078.19 1466.04 27.4 50.9

58

imagen41

imagen42

E10183053

15-10-2015

5

15

25

35

Tabla 11-1. Se evaluó el efecto del factor tisular humano (SIMPLASTIN), células derivadas de la placenta (Pla), y células derivadas del cordón umbilical (Umb) en la coagulación de plasma. El tiempo a la media absorbancia máxima T½ a máxima en el aplanamiento en segundos se usó como una unidad de medida

Dilución de SIMPLASTIN

T½ a máxima (segundos)

1:2

61

1:4

107

1:8

147

1:16

174

1:32

266

1:64

317

1:128

378

0 (control negativo)

1188

Células J-82 cells

100,000

122

50,000

172

25,000

275

Pla P5

50,000

757

Umb P5

50,000

833

Umb P18

50,000

443

Resumen. Las PPDCs derivadas de la placenta y cordón umbilical expresan factor tisular. La adición de un

45 anticuerpo al factor tisular puede inhibir el factor tisular. El factor tisular se encuentra normalmente en células en una conformación que es inactiva pero se activa por tensión mecánica o química (por ejemplo LPS) (Sakariassen et al. (2001) Thromb. Res. 104:149-74; Engstad et al. (2002) Int. Immunopharmacol. 2:1585-97). Por lo tanto, la minimización de la tensión durante el proceso de preparación de las PPDCs puede evitar la activación del factor tisular. Además de la actividad trombogénica, el factor tisular se ha asociado con la actividad angiogénica. Por lo tanto, la actividad del factor tisular puede ser beneficiosa cuando las PPDCs derivadas del cordón umbilical o la placenta se trasplantan en tejido pero debería inhibirse cuando las PPDCs se inyectan por vía intravenosa.

Figura 11-1. La coagulación de plasma con células J82 y células del cordón umbilical sin (A) y con (B) CNTO 859, factor tisular anti-humano, 20 µg/mililitros. El tratamiento con anticuerpos mostró que la coagulación se 55 debió al factor tisular en células umbilicales.

EJEMPLO 12

Diferenciación de Células Postparto con el Fenotipo de Cardiomiocitos

Hay una necesidad tremenda para terapia que ralentice la progresión de y/o cure enfermedad del corazón, como enfermedad isquémica del corazón e insuficiencia cardiaca congestiva. Las células que pueden diferenciarse en cardiomiocitos que puedan integrarse completamente en el músculo cardiaco del paciente sin arritmias es altamente deseable. Se ha demostrado que las células madre mesenquimales de roedor tratadas con 5-azacitidina

65 expresan marcadores de cardiomiocitos (Fukuda et al. (2002) C. R. Biol. 325:1027-38). Lo mismo no se ha

61

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Tabla 13-2 Regímenes de Tratamiento

Gr. No.

No. of Machos Artículo de Prueba Nivel de Dosificación (células/animal) Conc. De Dosis (células/mililitros ) Vía / Régimen de Dosis Tiempo de Administración del Tratamiento Día de Necropsia

1

8 Vehículo 0 0 Inyecciones directas en la región isquémica del ventrículo izquierdo del corazón, consistentes de 3 a 10 inyecciones intramiocardiacas 100 µL en total. 15 minutos después del ligado de la arteria coronaria Día28(± 1 Día)

2

8 Placenta #4 (P10) (A) 1 millón 10 millones

3

8 Umbilical (P10) (B)

4

8 Placenta #3 (P10) (C)

5

8 Fibroblast os humanos 1F1853 (P10) (D)

Gr. = Grupo; No. = Número; Conc. = Concentración

Inmediatamente después de que cada rata e había sometido a tratamiento con artículo de prueba y la incisión se hubo suturado, el animal se sometió a un examen de (ECG). La anestesia se mantuvo hasta la finalización del examen de eco. Tras la finalización del examen de eco, la ventilación se suspendió, y la rata se retornó al área de recuperación para recuperarse en una jaula de recuperación oxigenada, climatizada.

Se completó un segundo examen de eco de cada animal sobreviviente al final del estudio (aproximadamente 28 días después del tratamiento), antes de la finalización. Durante el segundo examen, los animales se anestesiaron como se ha descrito anteriormente.

Para cada examen de eco, se afeitó el área torácica izquierda, y se calentó, se aplicó gel ultrasónico a la piel para potenciar el contacto con el transductor. Las almohadillas de electrodos se colocaron alrededor de las extremidades apropiadas para recibir una señal ECG. Las imágenes ecocardiográficas incluían vistas de eje corto y eje largo para permitir la determinación de las dimensiones de la cavidad ventricular, la contractilidad, el flujo sanguíneo a través de la vasculatura, y el grosor de la pared. Estas imágenes se guardaron en un disco óptico para análisis adicional. Después del examen, el medio de gel se retiro de la piel con gasa o toallita de papel. La rata se retiró del ventilador y se colocó en una jaula de recuperación calentada hasta la movilidad.

A la conclusión de los procedimientos quirúrgicos, se apagó la ventilación respiratoria. Se observó a los animales para reflejo de pedal. Posteriormente se retiraron la sonda rectal y los electrodos ECG, y se extubó al animal y se colocó en una jaula de recuperación oxigenada calentada. Después de la recuperación completa de la anestesia, se dio a los animales buprenorfina (0,05 miligramos/kilogramo, SC). Se hicieron observaciones regularmente hasta que los animales mostraron movilidad completa e interés en comida y agua. Los animales se colocaron entonces en una jaula de alojamiento limpia y se retornó al animal a la sala de alojamiento. Los animales se monitorizaron para la integridad de la incisión quirúrgica dos veces al día después de la cirugía.

Se dieron analgésicos (es decir buprenorfina, 0,05 miligramos/kilogramo SC.) dos veces al día durante 4 días después de la operación y posteriormente cuando fue necesario. Las indicaciones visuales del dolor postoperatorio incluyen falta de posturas y movimientos corporales normales (por ejemplo, el animal permanece en posición encogida, antipatía, falta de comer/beber, falta de aseo, etc.

Se registró el peso corporal para cada animal antes del tratamiento inicial, semanalmente después, y en el día de la necropsia. Los animales que se encontraron muertos se pesaron y se les practicó la autopsia.

Para recolectar el corazón, cada rata se anestesió como se hizo para la cirugía. Se canuló la vena yugular. El corazón fue detenido en diástole con KCl infundido a través de la cánula yugular. Se retiró después el corazón de la cavidad torácica. Se realizó después una necropsia limitada en el corazón después de lo cual el corazón se colocó en 10% de formalina tamponada neutra. El resto de cada cadáver fue después descartado sin evaluación adicional.

Los corazones de todos los animales que se encontraron muertos o fueron sacrificados moribundos se

65

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Claims (1)

1. imagen1