ES2540770T3 - Composición inmunógena para uso en vacunación contra estafilococos - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena que comprende: - ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; - SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; - polisacárido u oligosacárido capsular de tipo V de S. aureus; y - polisacárido u oligosacárido capsular de tipo VIII de S. aureus.

Description

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(continuación)

En la tabla siguiente se exponen los números de SEC. ID de las secuencias proteicas preferidas y secuencias de ADN que se encuentran en la Figura 1 y en la Figura 2, respectivamente. SA indica una secuencia de S. aureus y SE indica una secuencia de S. epidermidis.

Nombre

Secuencia de proteínas Secuencia de ADN

Transportador de ABC inmunodominante SA SE

SEC. ID 1

SEC. ID 34

SEC. ID 2

SEC. ID 35

Receptor de laminina SA SE

SEC. ID 3

SEC. ID 36

SEC. ID 4

SEC. ID 37

Antígeno secretor A SsaA SA 1 SA 2 SE

SEC. ID 5

SEC. ID 38

SEC. ID 6

SEC. ID 39

SEC. ID 7

SEC. ID 40

SitC SA SE

SEC. ID 8

SEC. ID 41

SEC. ID 9

SEC. ID 42

saA / PisA (IssA) SA SE

SEC. ID 10

SEC. ID 43

SEC. ID 11

SEC. ID 44

EbhA / B SA EbhA SA EbhB SE EbhA SE EbhB

SEC. ID 12

SEC. ID 45

SEC. ID 13

SEC. ID 46

SEC. ID 14

SEC. ID 47

SEC. ID 15

SEC. ID 48

Pro Aap asociado con acumulación SA SE

SEC. ID 16

SEC. ID 49

SEC. ID 17

SEC. ID 50

6

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(continuación)

En la tabla siguiente se exponen los números de SEC. ID de las secuencias proteicas preferidas y secuencias de ADN que se encuentran en la Figura 1 y en la Figura 2, respectivamente. SA indica una secuencia de S. aureus y SE indica una secuencia de S. epidermidis.

Nombre

Secuencia de proteínas Secuencia de ADN

Proteína de activación de ARN III RAP SA SE

SEC. ID 18

SEC. ID 51

SEC. ID 19

SEC. ID 52

FIG / SdrG SA SE

SEC. ID 20

SEC. ID 53

SEC. ID 21

SEC. ID 54

Proteína de unión a elastina EbpS SA SE

SEC. ID 22

SEC. ID 55

SEC. ID 23

SEC. ID 56

Proteína extracelular EFB SA

SEC. ID 24 SEC. ID 57

Toxina alfa SA

SEC. ID 25 SEC. ID 58

SBI SA

SEC. ID 26 SEC. ID 59

IsdA SA

SEC. ID 27 SEC. ID 60

IsdB SA

SEC. ID 28 SEC. ID 61

SdrC SA

SEC. ID 29 SEC. ID 62

ClfA SA

SEC. ID 30 SEC. ID 63

FnbA SA

SEC. ID 31 SEC. ID 64

ClfB SA

SEC. ID 32 SEC. ID 65

Coagulasa SA

SEC. ID 33 SEC. ID 66

FnbB SA

SEC. ID 67 SEC. ID 71

MAP SA

SEC. ID 68 SEC. ID 72

SdrC SA

SEC. ID 69 SEC. ID 73

SdrG SA

SEC. ID 70 SEC. ID 74

Proteínas de unión al componente extracelular

Las proteínas de unión al componente extracelular son proteínas que se unen a los componentes extracelulares del huésped. El término incluye, entre otros, adhesinas. Ejemplos de proteínas de unión al componente extracelular incluyen el receptor de laminina (Naidu et al. J. Med. 7

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Microbiol. 1992, 36; 177), la proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5801234, Wiltshire y Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al. Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, proteína de unión a la elastina (EbpS) (Park et al. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang et al. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), autolisina (Rupp et al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (documento US6008341, McDevitt et al. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al. Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al. Microbiology 2000, 146; 1535), Lipasa GehD (documento US2002/0169288), SasA, FnbA (Flock et al. Mol Microbiol. 1994, 12; 599, documento US6054572), FnbB (documento WO 97/14799, Booth et al. 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína de unión al colágeno Cna (Visai et al. 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (documento WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al. 1988 J. Gen Microbiol.134; 75), Npasa (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz et al. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain y Hermann symposium on Staph Denmark 14 – 17ª 2000), SSP-1 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178; 537), proteína de unión a la heparina de 17 kDa HBP (Fallgren et al. 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), proteína de unión a la vitronectina (Li et al. 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), proteína de unión al fibrinógeno, coagulasa, Fig (documento WO 97/48727) y MAP (documento US5648240).

Proteína de unión a Sitc/MntC/saliva

Esta es una proteína transportadora de ABC que es un homólogo de la adhesina PsaA en S. pneumoniae. Es una lipoproteína de 32 kDa altamente inmunógena que está distribuida por la pared celular bacteriana (Cockayne et al. Infect. Immun. 1998 66; 3767). Se expresa en S. aureus y S. epidermidis como lipoproteína de 32 kDa y está presente un homólogo de 40 kDa en S. hominis. En S. epidermidis, es un componente de un operón regulado por hierro. Muestra una homología considerable con ambas adhesinas, incluyendo FimA de Streptococcus parasanguis y con lipoproteínas de una familia de transportadores de ABC con funciones de transporte de hierro metálico probado o teórico. Por tanto SitC está incluido como una proteína de unión extracelular y como transportador de iones metálicos.

La proteína de unión a saliva divulgada en el documento US5.801.234 también es una forma de SitC y se puede incluir en una composición inmunógena de la invención.

ClfA y ClfB

Estas dos proteínas tienen actividad de unión a fibrinógeno y desencadenan que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Contienen un motivo LPXTG a las proteínas asociadas con la pared.

ClfA se describe en el documento US6008341 y ClfB se describe en el documento WO 99/27109.

Coagulasa (FbpA)

Esta es una proteína de unión al fibrinógeno que desencadena que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Se describe en las referencias relacionadas con la coagulasa: Phonimdaeng et al. (J. Gen. Microbio. 1988,

134:75 -83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393 -404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914 1920) y Shopsin et al. (J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453 -3456).

Fragmentos preferidos para la inclusión en la composición inmunógena de la invención incluyen la proteína madura en la que el péptido señal se ha eliminado (los aminoácidos 27 al extremo C).

La coagulasa tiene tres dominios distintos. Los aminoácidos 59 – 297, que es una región de hélice superenrollada, los aminoácidos 326 – 505, que es una ´región rica en prolina y glicina y el domino en el extremo C desde el aminoácido 506 al 645, que tiene una conformación en lámina beta. Cada uno de estos dominios es un fragmento preferido de la invención

SdrG-Fbe -EfB/FIG

Fbe es una proteína de unión a fibrinógeno que se encuentra en muchos aislados de S. epidermidis y tiene un peso molecular deducido de 119 kDa (Nilsson et al. 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Su secuencia está relacionada con la del factor de agrupamiento de S. aureus (ClfA). Los anticuerpos contra Fbe pueden bloquear la unión de S. epidermidis a placas revestidas con fibrinógeno y a catéteres (Pei y Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). Esta proteína también se describe como SdrG en el documento WO 00/12689. SdrG se encuentra en los estafilococos negativos a la coagulasa y es una proteína asociada a la pared celular que contiene una secuencia LPXTG.

SdrG contiene un péptido señal (aminoácidos 1 -51), una región que contiene sitios de unión a fibrinógeno y sitios de unión a colágeno (aminoácidos 627 -698 y 738 -809), una región de repetición SD (aminoácidos 825 -1000) y un dominio de unión (aminoácidos 1009 -1056).

Fbe tiene una secuencia señal teórica con un sitio de escisión entre los aminoácidos 51 y 52. Por tanto un fragmento preferido de Fbe contiene la forma madura de Fbe que se extiende desde el aminoácido 52 al extremo C (aminoácido 1.092).

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L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A

Preferentemente

.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12}

Más preferentemente

5 .....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V.. V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N /D.......

Donde '.' significa cualquier aminoácido y '.{10}' significa 10 aminoácidos cualesquiera y I/V indica elecciones alternativas de aminoácidos.

Por referencia a la secuencia divulgada en Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225 -1240 y la Tabla 2, las secuencias 10 de repetición dentro de las proteínas Ebh se deducen fácilmente.

Los fragmentos preferidos a incluir en la composición inmunógena de la invención incluyen polipéptidos que contienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de 10 de las 127 unidades de repetición de aminoácidos. Dichos fragmentos pueden consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones de la región de repetición de 127 aminoácidos o puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones con residuos de

15 aminoácidos adicionales presentes en cualquiera o ambos extremos del fragmento. Un fragmento preferido adicional es el polipéptido H2 de aproximadamente 44 kDa que abarca tres repeticiones (3202 – 3595 aminoácidos) como se describe en Clarke et al. Infection and Immunity 70, 6680 -6687, 2002. Dichos fragmentos podrán preferentemente unirse a fibronectina y/o lograr anticuerpos que son reactivos contra la proteína Ebh entera.

Los polipéptidos Ebh son capaces de unirse a la fibronectina. Los fragmentos preferidos de estas secuencias

20 polipeptídicas conservan la capacidad para unirse a la fibronectina. La unión a la fibronectina se puede evaluar mediante ELISA, como describen Clarke et al. (Infection and Immunity 70; 6680 -6687 2002).

Otros fragmentos preferidos adicionales son aquellos que comprenden un epítopo para linfocitos B o linfocitos T colaboradores, por ejemplo los fragmentos/péptidos descritos en las Tablas 3 y 4.

TABLA 2. Secuencias de repetición en la secuencia de longitud completa de Ebh.

La secuencia completa de Ebh se divulga en Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225 -1240. La siguiente tabla muestra los residuos de aminoácidos en los que las repeticiones de 127 aminoácidos comienzan y terminan dentro de la secuencia de longitud completa.

Comienzo

Fin

1

3204 3330

2

3331 3457

3

3457 3583

4

3583 3709

5

3709 3835

6

3835 3961

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3961 4087

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4200 4326

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4326 4452

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4452 4578

11

4578 4704

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(continuación)

La secuencia completa de Ebh se divulga en Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225 -1240. La siguiente tabla muestra los residuos de aminoácidos en los que las repeticiones de 127 aminoácidos comienzan y terminan dentro de la secuencia de longitud completa.

Comienzo

Fin

12

4704 4830

13

4830 4956

14

4956 5082

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5082 5208

16

5208 5334

17

5334 5460

18

5460 5586

19

5585 5711

20

5711 5837

21

5837 5963

22

5963 6089

23

6089 6215

24

6215 6341

25

6341 6467

26

6467 6593

27

6593 6719

28

6719 6845

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6845 6971

30

6971 7097

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7097 7223

32

7223 7349

33

7349 7475

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7475 7601

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7601 7727

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7727 7853

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(continuación)

La secuencia completa de Ebh se divulga en Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225 -1240. La siguiente tabla muestra los residuos de aminoácidos en los que las repeticiones de 127 aminoácidos comienzan y terminan dentro de la secuencia de longitud completa.

37

7852 7978

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7978 8104

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8104 8230

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8230 8356

41

8356 8482

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8482 8608

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8604 8730

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-Las columnas “Comienzo" y "Fin" presentan la posición de los epítopos de linfocitos B previstos en la repetición de 127 aminoácidos

-Las columnas “Inicio" y "Terminación" presentan la posición de los epítopos de linfocitos B previstos en la secuencia de longitud completa Ebh

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una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o mayor, la identidad de secuencia comparada con una secuencia de polinucleótidos en el presente documento usando los procedimientos descritos en el presente documento (p. ej., análisis BLAST usando parámetros convencionales). En un caso relacionado, el polinucleótido aislado comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de un 95 % o superior, con la secuencia de aminoácidos de la figura 1, sobre la longitud completa de una secuencia de la Figura 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

También se hace referencia al uso de polinucleótidos que son complementarios con todos los polinucleótidos descritos anteriormente.

También se hace referencia al uso de un fragmento de un polinucleótido de la invención que cuando se administra a un sujeto tiene las mismas propiedades inmunógenas que un polinucleótido de la Figura 1.

También se hace referencia al uso de un polinucleótido que codifica un fragmento inmunológico de una proteína de la Figura 1 como se ha definido anteriormente en el presente documento. También se contempla el uso de fragmentos que tienen un nivel de actividad inmunógeno de al menos aproximadamente un 50 %, preferentemente de al menos aproximadamente un 70 % y más preferentemente, de al menos aproximadamente un 90 % del nivel de actividad inmunógena de una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia de polinucleótidos expuesta en la Figura 2.

Los fragmentos polipeptídicos para dicho uso comprenden preferentemente al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, o 100 aminoácidos contiguos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, de una composición polipeptídica expuesta en el presente documento, tal como las expuestas anteriormente.

Los polinucleótidos para usar se pueden obtener usando técnicas de clonación y detección selectiva estándar, de una biblioteca de ADNc derivada de ARNm en células de tejido tumoral o preneoplásico humano (por ejemplo, pulmón), (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1989)). Los polinucleótidos también se pueden obtener de fuentes naturales tales como bibliotecas de ADN genómico o se pueden sintetizar usando técnicas bien conocidas y disponibles comercialmente.

Existen varios procedimientos disponibles y muy conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADNc de longitud completa, o extender ADN cortos, por ejemplo los basados en los procedimientos de amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998 -9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología MarathonTM, se preparan ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y se liga en cada extremo una secuencia "adaptadora". A continuación se lleva a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADNc usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. Después se repite la reacción de PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse con el producto amplificado (normalmente un cebador específico del adaptador que se hibrida más allá de 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que se hibrtida más allá de 5' en la secuencia del gen conocida). Después los productos de esta reacción se pueden analizar mediante secuenciación del ADN y se puede construir un ADNc de longitud completa uniendo directamente el producto al ADNc existente para dar una secuencia completa o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de la secuencia para el diseño del cebador 5'.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria vivo recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo darán lugar a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunitarias.

Por tanto, en ciertos casos, los polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos para usar como se ha tratado en el presente documento se introducen en células huésped de mamífero para expresión usando cualquiera de una serie de sistemas virales conocidos. En un caso ilustrativo, los retrovirus proporcionan una plataforma cómoda y eficaz para sistemas de liberación génica. Una secuencia de nucleótidos seleccionada que codifica un polipéptido para uso como se ha descrito se puede insertar en un vector y empaquetar como partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la materia. A continuación, se puede aislar el virus recombinante y se puede liberar en un sujeto. Se ha descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (p. ej., la Patente de EE.UU. N.º: 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980 -990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5 -14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849 -852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 -8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102 – 109).

Además, también se han descrito numerosos sistemas ilustrativos basados en adenovirus. Al contrario que los retrovirus que se integran en el genoma huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente, de modo que se minimizan los riesgos asociados con mutagénesis de inserción (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57:267

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274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911 -5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717 -729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933 -940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51 -58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616 629; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461 -476).

También se han desarrollado diversos sistemas de vectores víricos adenoasociados (AAV) para liberación de polinucleótidos. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.ºs: 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionales N.ºs: WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988 -3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533 -539; Muzyczka,

N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97 -129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793 801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165 -169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867 -1875.

Vectores virales adicionales útiles para liberar las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos para usar por transferencia génica incluyen los derivados de la familia de poxvíridos, tales como el virus variolovacunal y los poxvirus aviares. A modo de ejemplo, los recombinantes del virus variolovacunal que expresan las moléculas de interés se pueden construir del siguiente modo. El ADN que codifica un polipéptido se inserta primero en un vector adecuado de modo que esté adyacente a un promotor variolovacunal y que flanquee las secuencias de ADN variolovacunales, tal como la secuencia que codifica la timidina cinasa (TK). Después, este vector se usa para transfectar células que se infectan de forma simultánea con el virus variolovacunal. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor variolovacunal más el gen que codifica el polipéptido de interés en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante se puede seleccionar cultivando de las células en presencia de 5bromodesoxiuridina y escogiendo las placas virales resistentes en el mismo.

Un sistema de infección/transfección basado en el virus variolovacunal se puede usar de forma conveniente para proporcionar expresión o coexpresión inducible, transitoria de uno o más polipéptidos descritos en el presente documento en las células huésped de un organismo. En este sistema concreto, las células se infectaron primero in vitro con un virus variolovacunal recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta polimerasa exhibe una especificidad exquisita en cuanto a que solo transcribe moldes que llevan promotores de T7. Tras la infección, las células se transfectan el polinucleótido o los polinucleótidos de interés dirigido(s) por un promotor de T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus variolovacunal recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que después es traducido al polipéptido por la maquinaria de traducción del huésped. El procedimiento proporciona una producción citoplásmica transitoria y de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véanse, por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743 -6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122 -8126.

Como alternativa, los poxvirus aviares, tales como los virus de la viruela aviar y de la viruela de canario, también se pueden usar para liberar las secuencias de codificación de interés. Se sabe que los virus de la viruela aviar recombinantes, que expresan inmunogenes de patógenos de mamífero, confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector del virus de la viruela aviar es particularmente deseable en especies humanas y de otros mamíferos ya que los miembros del género Avipox solo se replican de forma productiva en especies de aves susceptibles y por tanto no son infectivos en células de mamífero. Los procedimientos para producir virus de la viruela aviar recombinante son conocidos en la técnica y emplean recombinación genética, como se ha descrito anteriormente con respecto a la producción de virus variolovacunales. Véase, por ejemplo, los documentos WO 91/12882, WO 89/03429 y WO 92/03545.

También se pueden usar cualquiera de una serie de vectores alfavirus para liberar composiciones de polinucleótidos para usar como se ha descrito en el presente documento, tales como los vectores descritos en las patentes de EE.UU. N.º: 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. Determinados vectores basados en la encefalitis equina venezolana (EEV) también se pueden usar y ejemplos ilustrativos de los mismos se pueden encontrar en las patentes de EE.UU. N.º: 5.505.947 y 5.643.576.

Además, también se pueden usar vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866 -6869 y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099 -6103, para la liberación génica conforme a la invención.

Información ilustrativa adicional sobre estos y otros sistemas de liberación basados en virus conocidos se pueden encontrar en, por ejemplo, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317 -321, 1989; Flexner et al., Ann.

N.Y. Acad. Sci. 569:86 -103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17 -21, 1990; las Patentes de EE.UU. N.ºs: 4.603.112,

4.769.330 y 5.017.487; el documento WO 89/01973; la patente de EE.UU. N.º: 4.777.127; el documento GB 2.200.651; el documento EP 0.345.242; el documento WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616 -627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431 -434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215 -219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498 -11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838 -2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202 -1207, 1993.

Los microorganismos vivos recombinantes descritos anteriormente pueden ser virulentos o pueden atenuarse de diversos modos para obtener vacunas con microorganismos vivos. Dichas vacunas con microorganismos vivos también forman parte de la invención.

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al 0,05 %, seguido de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después las muestras de ensayo se diluyeron dos veces en la microplaca en PBS al 0,05 % a partir de una dilución de partida a 1/10 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de lavar, el anticuerpo unido murino o de conejo se detectó usando IgG anti-ratón de cabra (H+L) affiniPure conjugada con peroxidadas de Jackson

5 ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115 -035 -003) o IgG anti-conejo de cabra (H+L) AffiniPure (ref: 11-035-003) diluida a 1:5000 en PBS-tween al 0,05 %. Estos anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El color se desarrolló usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5 µl de H2O2 por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1M durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 µl de HCl y la densidad óptica se leyó a 490 nm relativa a 650 nm.

10 Cabe destacar que los niveles de expresión de las proteínas en estafilococos variarán en función de las condiciones de cultivo. Por tanto, un resultado negativo puede reflejar la elección de condiciones de cultivo incorrectas en lugar de una falta de inmunogeneicidad.

Los resultados usando sueros de ratón se muestran en la Tabla 5 y algunos de los gráficos se muestran en la Figura

6. Se observa un débil reconocimiento de la cepa 5 de S. aureus con los sueros dirigidos contra SdrC, FnbpA, Ebh,

15 Sbi e IsaA. El reconocimiento de la cepa 8 de S. aureus solo se observa con el suero dirigido contra Sbi. El débil reconocimiento de S. epidermidis Hay se observa con los sueros dirigidos contra Atl amidasa, MRP, IsdA, IsaA, Ebh, Aaa y Sbi.

Una selección de los resultados generados usando sueros de conejo se muestra en la Figura 7 y se resume en la Tabla 6. Se observó un reconocimiento muy bueno de las tres cepas con IsaA e IsdB. Un débil reconocimiento de

20 las tres cepas se observó con HarA, aunque los animales solo recibieron una inyección en lugar de las tres inyecciones usadas para las otras proteínas.

Tabla 5

Nombre de la proteína

Reacción en SA5 Reacción en SA8 Reacción en SE Hay

IsaA

(+) (+) (+)

ClfA

- (+) (+)

Atl amidasa

- - ++

SdrG

- - -

Glucosamidasa

- - -

IsdA

- - ++

Toxina alfa

- - -

SrdC

++ (+) -

Ebh

+ - +

AaA

- - ++

MRP

- - ++

Sbi

++ ++ +++

FnbpA

+ + (+)

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Tabla 6

Nombre de la proteína

Reacción en SA5 Reacción en SA8 Reacción en SE Hay

IsaA

+++ +++ +++

ClfA

+ ++ ++

Atl amidasa

- ++ +

IsdB

+++ +++ +++

SdrG

+ + +

Glucosamidasa

- - -

HarA (1 inyección)

+ + +

IsdA

- - -

Toxina alfa

- - +

SrdC

- - -

Ebh

- + -

AaA

- - -

MRP

- - ++

Sbi

- +++ -

FnbpA

- ++ ++

Ejemplo 9 Eficacia de las combinaciones de proteínas estafilocócicas en un modelo de colonización nasal

Quince grupos de tres ratas algodoneras se inocularon con combinaciones de ocho antígenos de estafilococos y 5 cinco ratas algodoneras que actuaron como controles se trataron sin antígeno. Estos dieciséis grupos son los siguientes: Grupo 1 -Atl-glucosamina, Atl-amidasa, AAA, toxina alfa, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Grupo 2 -Atl-glucosamina, Atl-amidasa, IsdA, IsdB, ClfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 3 -Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, IsdA, MRP, IsdB, AAA, toxina alfa 10 Grupo 4 -Atl-glucosamina, HarA, IsdA, AAA, ClfA, IsaA, Ebh, Sbi Grupo 5 -HarA, MRP, AAA, toxina alfa, ClfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 6 -IsdA, IsdB, AAA, toxina alfa, ClfA, SdrG, Sbi, FnbpA Grupo 7 -Atl-aminidasa, IsdA, MRP, AAA, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA Grupo 8 -Control 15 Grupo 9 -Atl-glucosamina, IsdA, MRP, toxina alfa, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA Grupo 10 -Atl-glucosamina, MRP, IsdB, AAA, ClfA, IsaA, SdrC, SdrG Grupo 11 -Atl-aminidasa, MRP, IsdB, toxina alfa, ClfA, IsaA, Ebh, Sbi

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Grupo 12 -Atl-glucosamina, HarA, IsdB, toxina alfa, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA

Grupo 13 -Atl-aminidasa, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA

Grupo 14 -Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, MRP, ClfA, SdrG, Sbi, FnbpA

Grupo 15 -Atl-aminidasa, HarA, IsdA, toxina alfa, ClfA, IsaA, SdfC, SdrG

5 Grupo 16 -HarA, IsdA, MRP, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi

Cada mezcla de antígenos contenía 3 µg de cada antígeno mezclados con un adyuvante formado por liposomas que contienen MPL y QS21. Se inoculó a las ratas algodoneras tres veces los días 1, 14 y 28 del experimento. Dos semanas después de las inmunizaciones se evaluó la eficacia de las inmunizaciones usando un ensayo de colonización nasal como se describe en Kokai-Kun et al. (2003) Antimicrob. Agents. Chemother. 47; 1589 -1597.

10 Se llevó a cabo un análisis de regresión lineal múltiple clásico con los datos usando el software "Design Expert 6". La presencia de un antígeno se codificó como +1 y la ausencia de un antígeno por -1. Usando la ecuación del modelo, fue posible determinar qué antígenos eran los antígenos fundamentales que produjeron una gran disminución del número de colonias por nariz.

Resultados

15 Los resultados del ensayo de colonización nasal se muestran en la Tabla 7. El grupo control tenía un log medio de UFC/nariz de 3,51335 y una disminución de la colonización nasal se pudo ver para todos los grupos de ratas algodoneras a las que se habían inoculado proteínas de estafilococos. Los grupos 4, 9 y 13 mostraron la mayor disminución en la colonización nasal con una disminución de más de 2 log en las UFC/nariz. Los grupos 12 y 16 también dieron buenos resultados, lo que muestra una disminución de aproximadamente 2 log en las UFC/nariz.

20 Tabla 7

Grupo

Log medio observado de UFC/nariz Log medio previsto de UFC/nariz

1

1,77527 2,03560

2

2,90435 2,52684

3

1,96556 2,23033

4

1,27748 1,21872

5

1,67304 1,93128

6

2,79745 2,98193

7

2,21481 2,30705

8

3,51355 3,47317

9

1,22480 1,44080

10

2,03085 1,93204

11

2,02522 1,81581

12

1,53402 1,70996

13

1,36063 1,49100

14

2,31201 1,73909

15

2,22979 1,98223

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Claims (1)

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