ES2730275T3 - Composición inmunógena para uso en vacunación contra estafilococos - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena que comprende: - ClfA estafiloc ócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; y - SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición inmunógena para uso en vacunación contra estafilococos

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al campo de las composiciones inmunógenas y vacunas contra estafilococos, a su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una combinación de antígenos para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos. También se proporcionan procedimientos de uso de dichas vacunas en medicina y procedimientos para su preparación.

Antecedentes

El número de infecciones adquiridas en la comunidad y adquiridas en el hospital ha aumentado en los últimos años con el creciente uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones adquiridas en el hospital (nosocomiales) son una causa principal de morbididad y mortalidad, más particularmente en E^e .UU., donde afecta a más de 2 millones de pacientes anualmente. Siguiendo varios estudios, aproximadamente el 6 por ciento de los pacientes de EE.UU. adquirirá una infección durante su estancia en el hospital. La carga económica en EE.UU. se estimó en más de 4,5 billones de dólares americanos en 1992 (Emori and Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Las infecciones más frecuentes son infecciones del tracto urinario (ITU, 33 % de las infecciones), seguidas de neumonía (15,5 %), infecciones en el área quirúrgica (14,8 %) e infecciones primarias en la circulación sanguínea (13 %) Emori y Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).

Los patógenos nosocomiales pricipales son Staphylococcus aureus, estafilococos negativos a la coagulasa (principalmente Staphylococcus epidermidis), Enterococcus spp, Esherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque dichos patógenos casi producen el mismo número de infecciones, la gravedad de los trastornos que pueden producir junto con la frecuencia de los aislados resistentes a antibióticos cuadran esta clasificación hacia S. aureus y S. epidermidis como los patógenos nosocomiales más significativos.

Staphylococcus aureus es la causa más frecuente de infecciones nosocomiales con una morbididad y mortalidad significativa (Romero-Vivas et al. 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abscesos y síndrome del shock tóxico.

S. epidermidis es un comensal normal de la piel que también es un patógeno oportunista importante responsable de infecciones de dispositivos médicos implantados y de infecciones en las zonas de cirugía. Los dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluyen marcapasos cardíacos, derivaciones de líquido cefalorraquídeo, catéteres para diálisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y válvulas cardíacas protésicas.

Las infecciones producidas por S. aureus y S. epidermidis se tratan con antobióticos con la penicilina siendo el fármaco de elección, mientras que la vancomicina se usa para los aislados resistentes a meticilina. El porcentaje de cepas de estafilococos que exhiben resistencia de amplio espectro a los antibióticos se ha convertido en cada vez más prevalente desde la década de 1980 (Panlilo et al. 1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), suponiendo una amenaza para la terapia antimicrobiana eficaz. Además, la reciente aparición de la cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha aumentado el miedo de aparición y avance de cepas de S. aureus resistentes a meticilina para las que no se dispone de un tratamiento eficaz.

Se ha investigado un enfoque alternativo del uso de anticuerpos contra antígenos de estafilococos en la inmunoterapia pasiva. Se esta desarrollando una terapia que implica la administración de antisueros policlonales (documentos WO 00/15238, WO 00/12132) así como el tratamiento con un anticuerpo monoclonal contra el ácido lipoteicoico (documento WO 98/57994).

Un enfoque alternativo sería el uso de la vacunación activa para generar una respuesta inmunitaria contra estafilococos. Se han identificado varios candidatos para incluir como componentes de la vacuna. Estos incluyen proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), análogo del MHC II (documento US5648240), proteína de unión a fibrinógeno (documento US6008341), GehD (documento US 2002/0169288), proteína de unión a colágeno (documento US6288214), SdrF, SdrG y SdrH (documento WO 00/12689), SEA mutante y exotoxinas de SEB (documento WO 00/02523) y la proteína de unión a vitronectina de 52 kDa (documento WO 01/60852). También se han desarrollado vacunas de múltiples componentes que comprenden determinadas combinaciones de proteínas de unión bacterianas ("MSCRAMM") (documento US6703025). Entre las realizaciones divulgadas en el documento US6703025 se encuentran las composiciones que comprenden el factor de agrupamiento A ("CIfA") o el factor de agrupamiento B ("CLfB").

Se ha secuenciado el genoma de S. aureus y se han identificado muchas de las secuencias de codificación (documentos EP786519, WO02/094868). Lo mismo es cierto para S. epidermidis (documento WO 01/34809). Como un perfeccionamiento de este abordaje, otros han identificado proteínas que son reconocidas por suero hiperinmunitario de pacientes que han sufrido una infección por estafilococos (documentos WO01/98499, WO 02/059148).

La primera generación de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoproteínas que produce ha tenido un éxito limitado (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Existe la necesidad de desarrollar vacunas eficaces contra infecciones producidas por estafilococos.

De acuerdo con ello la presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende:

- ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; y

- SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo.

Descripción de las figuras

Figura 1 - Secuencias polipeptídicas de proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína está representada por cada SEC ID.

Figura 2 - Secuencias nucleotídicas que codifican proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína está codificada por cada SEC ID.

Figura 3. Purificación de la toxina alfa en condiciones nativas. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de las muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Calle 1- marcadores de peso molecular, calle 2 - fracción soluble que contiene la toxina alfa sobreexpresada, calle 3 - flujo que atraviesa la columna de Ni-NTA, calle 4 - fracciones eluidas con 10 % de tampón B, calle 5 - fracciones eluidas con 20 % de tampón B, calle 6 - fracciones eluidas con 30 % de tampón B, calle 7 - fracciones eluidas con 50 % de tampón B, calle 8 - fracciones eluidas con 75 % de tampón B, calle 9 y calle 10 fracciones eluidas con 100 % de tampón B, calle 11 bacterias a T= 0 antes de la inducción, calle 12 - bacterias a T= 4 horas tras la inducción, calle 13 -lisado celular, calle 14 - fracción soluble, calle 15 - fracción insoluble.

El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de 10, 5, 2 y 1 pl de la toxina alfa purificada. Figura 4. Purificación de SdrC en condiciones desnaturalizantes. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Calle M- marcadores de peso molecular, calle Inicio- sobrenadante formado a partir de la fracción insoluble que contiene SdrC sobreexpresado, calle FT1- caudal a través de la columna de Ni-NTA, calle C- fracciones eluidas con tampón de lavado C, calle D- fracciones eluidas con tampón D, calle E - fracciones eluidas con tampón E. El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de 1, 2, 5 y 10 pl del SdrC purificado.

Figura 5 - Resultados de ELISA de antisueros contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con proteínas purificadas.

Conjunto de ratones pre - resultado usando sueros combinados extraídos de ratones antes de la inoculación. Conjunto de ratones Post III - resultado usando sueros de ratón combinados extraídos después de la inmunización. Conjunto de conejos pre - resultado usando sueros combinados extraídos de conejos antes de la inoculación. Conjunto de conejos Post III - resultado usando sueros de conejo combinados extraídos después de la inmunización. Blc- Control negativo.

Figura 6 - Resultados de ELISA de antisueros de ratón producidos contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con estafilococos muertos.

El panel A usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 5. El panel B usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 8. El panel C usa placas revestidas con células enteras muertas de S. epidermidis.

La línea marcada con signos cuadrados muestra el resultado de ELISA usando antisueros de ratones inmunizados tres veces con la proteína de estafilococos indicada. La línea marcada con los signos en rombo muestra el resultado de ELISA para los sueros de ratón antes de la inmunización.

Figura 7 - Resultados de ELISA de antisueros de conejo producidos contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con estafilococos muertos.

El panel A usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 5. El panel B usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 8. El panel C usa placas revestidas con células enteras muertas de S. epidermidis.

La línea marcada con cuadrados muestra el resultado de ELISA usando antisueros de conejos inmunizados tres veces con la proteína de estafilococos indicada (a excepción de HarA, en los que solo se administró una inmunización). La línea marcada con los signos en rombo muestra el resultado de ELISA para los sueros de conejo antes de la inmunización.

Descripción detallada

La presente invención divulga combinaciones concretas de antígenos de estafilococos que cuando se combinan conducen a la producción de una composición inmunógena que es eficaz en tratar o impedir infecciones producidas por estafilococos. Las composiciones inmunógenas de la invención incorporan adecuadamente antígenos que están implicados en diferentes funciones de los estafilococos. Dichas composiciones inmunógenas están dirigidas a la respuesta inmunitaria hacia diferentes aspectos de la función estafilocócica y por tanto son capaces de inducir una respuesta inmunitaria particularmente eficaz.

Las infecciones por estafilococos progresan por diferentes estadios. Por ejemplo, el ciclo de vida de los estafilococos implica colonización de comensales, inicio de infección mediante el acceso a los tejidos adyacentes o la circulación sanguínea, multiplicación anaerobia en la sangre, interacción entre los determinantes de la virulencia de S. aureus y los mecanismos de defensa del huésped e inducción de complicaciones, incluyendo endocarditis, formación de abscesos metastásicos y síndrome séptico. Diferentes moléculas sobre la superficie de las bacterias estarán implicadas en diferentes etapas del ciclo de infección. Al dirigir la respuesta inmunitaria contra una cantidad eficaz de una combinación de antígenos concretos implicados en diferentes procesos de infección por estafilococos, se puede lograr una composición inmunógena o vacuna con una mayor eficacia.

En particular, combinaciones de determinados antígenos de diferentes clases, algunos de los cuales están implicados en la adhesión a células huésped, algunas de las cuales están implicadas en la adquisición de hierro u otras funciones de transporte, algunas de las cuales son toxinas o reguladores de la virulencia y antígenos inmunodominantes pueden lograr una respuesta inmunitaria que proteja contra múltiples estadios de infección. Más específicamente, las composiciones inmunógenas de la invención comprenden:

- ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; y

- SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo.

La eficacia de la respuesta inmunitaria se puede medir bien en ensayos de modelos animales como se ha descrito en los ejemplos y/o bien usando un ensayo opsonofagocítico como se describe en los ejemplos.

Una ventaja adicional de la invención es que a la combinación de antígenos de la invención de diferentes familias de proteínas en una composición inmunógena permitirá protección contra una gama más amplia de cepas.

Por tanto, la invención se refiere a composiciones inmunógenas que comprenden una pluralidad de proteínas seleccionadas de al menos dos categorías diferentes de proteínas que tienen diferentes funciones en los estafilococos. Ejemplos de dichas categorías de proteínas son las proteínas de unión extracelular, proteínas transportadoras tales como proteínas de adquisición de Fe, toxinas o reguladores de la virulencia y otras proteínas inmunodominantes. Las combinaciones de vacuna de la divulgación son eficaces contra cepas de estafilococos homólogas (cepas de las que derivan los antígenos) y preferentemente también contra cepas de estafilococos heterólogas.

Una composición inmunógena de la invención puede comprender una serie de proteínas igual o mayor de 2, 3, 4, 5 o 6 seleccionadas de 2 o 3 de los grupos siguientes:

• grupo a) al menos una proteína de unión al componente extracelular de estafilococos o fragmento inmunógeno del mismo, seleccionada del grupo que consiste en el receptor de laminina, la proteína de unión a SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteínas de unión a elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, proteína de unión a fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP;

• grupo b) al menos una proteína transportadora de estafilococos o fragmento inmunógeno del mismo seleccionada del grupo que consiste en el transportador de ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg2+, SitC y transportador de Ni ABC; y

• grupo c) al menos un regulador estafilocócico de la virulencia, toxina o fragmento inmunógeno del mismo seleccionado del grupo que consiste en la toxina alfa (Hia), mutante H35R de toxina alfa, proteína activadora de ARN III (RAP).

Por ejemplo, una primera proteína se selecciona de los grupos a), b) o c) y una segunda proteína se selecciona de un grupo seleccionado de los grupos a), b) y c) que no incluya la segunda proteína. En una realización preferida, la composición inmunógena de la invención contiene al menos una proteína seleccionada del grupo a) y una proteína adicional seleccionada del grupo b) y/o del grupo c). En una realización adicional, la composición inmunógena de la invención contiene al menos un antígeno seleccionado del grupo b) y una proteína adicional seleccionada del grupo c) y/o del grupo a). En una realización adicional, la composición inmunógena de la invención contiene al menos un antígeno seleccionado del grupo c) y una proteína adicional seleccionada del grupo a) y/o del grupo b). No obstante, las composiciones inmunógenas deben comprender:

- ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; y

- SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo.

La composición inmunógena de la invención contiene adecuadamente proteínas de S. aureus, y/o S. epidermidis. Proteínas

Las composiciones inmunógenas de la divulgación comprenden una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, preferentemente identidad de al menos un 90 %, más preferentemente una identidad de al menos un 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos un 97 - 99 % o exacta, con cualquier secuencia de la figura 1.

Cuando una proteína se menciona específicamente en el presente documento, preferentemente es una referencia a una proteína de longitud completa, nativa o recombinante, u opcionalmente una proteína madura en la que se ha eliminado toda secuencia señal. La proteína se puede aislar directamente de la cepa de estafilococos o producirse mediante técnicas de ADN recombinante. Los fragmentos inmunógenos de la proteína se pueden incorporar en la composición inmunógena de la invención. Estos son fragmentos que comprenden al menos 10 aminoácidos, preferentemente 20 aminoácidos, más preferentemente 30 aminoácidos, más preferentemente 40 aminoácidos o 50 aminoácidos, lo más preferentemente 100 aminoácidos, tomados de forma contigua a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, dichos fragmentos inmunógenos son inmunológicamente reactivos con los anticuerpos generados contra las proteínas de estafilococos o con los anticuerpos generados mediante la infección de un huésped mamífero con estafilococos. Los fragmentos inmunógenos también incluyen fragmentos que, cuando se administran a una dosis eficaz (solos o como un hapteno unido a un vehículo), producen una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por estafilococos, más preferentemente es protectora contra la infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Dicho fragmento inmunógeno puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia líder en N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de unión en C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunógeno de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene una identidad de al menos un 85 %, preferentemente una identidad de al menos un 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos un 97 - 99 % %, con la de una secuencia seleccionada de la Figura 1 sobre la longitud completa de la secuencia del fragmento.

En las composiciones inmunógenas de la invención también se incluyen proteínas de fusión compuestas por proteínas de estafilococos, o fragmentos inmunógenos de proteínas de estafilococos. Dichas proteínas de fusión se pueden preparar de forma recombinante y pueden comprender una porción de al menos 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas de estafilococos. Como alternativa, una proteína de fusión puede comprender múltiples porciones de al menos 2, 3, 4 o 5 proteínas de estafilococos. Estas pueden combinar diferentes proteínas de estafilococos o fragmentos inmunógenos de las mismas en la misma proteína. Como alternativa, la invención también incluye proteínas de fusión individuales de proteínas de estafilococos o fragmentos inmunógenos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas, tales como un proveedor de epítopos de linfocitos T o marcadores de purificación, por ejemplo. p-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, proteínas fluorescentes verdes (GFP), marcadores de epítopos tales como FLAG, myc tag, poli histidina o proteínas de la superficie vírica, tales como la hemaglutinina del virus de la gripe, o proteínas bacterianas, tales como el toxoide del tétanos, el toxoide diftérico, CRM197.

Tabla 1

continuación

Proteínas de unión al componente extracelular

Las proteínas de unión al componente extracelular son proteínas que se unen a los componentes extracelulares del huésped. El término incluye, entre otros, adhesinas.

Ejemplos de proteínas de unión al componente extracelular incluyen el receptor de laminina (Naidu et al. J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), la proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5801234, Wiltshire y Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al. Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, proteína de unión a la elastina (EbpS) (Park et al. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang et al. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), autolisina (Rupp et al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (documento US6008341, McDevitt et al. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al. Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al. Microbiology 2000, 146; 1535), Lipasa GehD (documento US2002/0169288), SasA, FnbA (Flock et al. Mol Microbiol. 1994, 12; 599, documento US6054572), FnbB (documento WO 97/14799, Booth et al. 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína de unión al colágeno Cna (Visai et al.

2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (documento WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al. 1988 J. Gen Microbiol.134; 75), Npasa (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz et al. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain y Hermann symposium on Staph Denmark 14 - 17a 2000), SSP-1 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178; 537), proteína de unión a la heparina de 17 kDa HBP (Fallgren et al. 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), proteína de unión a la vitronectina (Li et al. 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), proteína de unión al fibrinógeno, coagulasa, Fig (documento WO 97/48727) y MAP (documento US5648240).

Proteína de unión a Sitc/MntC/saliva

Esta es una proteína transportadora de ABC que es un homólogo de la adhesina PsaA en S. pneumoniae. Es una lipoproteína de 32 kDa altamente inmunógena que está distribuida por la pared celular bacteriana (Cockayne et al. Infect. Immun. 1998 66; 3767). Se expresa en S. aureus y S. epidermidis como lipoproteína de 32 kDa y está presente un homólogo de 40 kDa en S. hominis. En S. epidermidis, es un componente de un operón regulado por hierro. Muestra una homología considerable con ambas adhesinas, incluyendo FimA de Streptococcus parasanguis y con lipoproteínas de una familia de transportadores de ABC con funciones de transporte de hierro metálico probado o teórico. Por tanto SitC está incluido como una proteína de unión extracelular y como transportador de iones metálicos.

La proteína de unión a saliva divulgada en el documento US5.801.234 también es una forma de SitC y se puede incluir en una composición inmunógena de la invención.

ClfA y ClfB

Estas dos proteínas tienen actividad de unión a fibrinógeno y desencadenan que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Contienen un motivo LPXTG a las proteínas asociadas con la pared.

ClfA se describe en el documento US6008341 y ClfB se describe en el documento WO 99/27109.

Coagulasa (FbpA)

Esta es una proteína de unión al fibrinógeno que desencadena que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Se describe en las referencias relacionadas con la coagulasa: Phonimdaeng et al. (J. Gen. Microbio. 1988, 134:75 - 83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393 - 404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914 -1920) y Shopsin et al. (J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453 - 3456).

Fragmentos preferidos para la inclusión en la composición inmunógena de la invención incluyen la proteína madura en la que el péptido señal se ha eliminado (los aminoácidos 27 al extremo C).

La coagulasa tiene tres dominios distintos. Los aminoácidos 59 - 297, que es una región de hélice superenrollada, los aminoácidos 326 - 505, que es una 'región rica en prolina y glicina y el domino en el extremo C desde el aminoácido 506 al 645, que tiene una conformación en lámina beta. Cada uno de estos dominios es un fragmento preferido de la invención.

SdrG- Fbe - EfB/FIG

Fbe es una proteína de unión a fibrinógeno que se encuentra en muchos aislados de S. epidermidis y tiene un peso molecular deducido de 119 kDa (Nilsson et al. 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Su secuencia está relacionada con la del factor de agrupamiento de S. aureus (ClfA). Los anticuerpos contra Fbe pueden bloquear la unión de S. epidermidis a placas revestidas con fibrinógeno y a catéteres (Pei y Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). Esta proteína también se describe como SdrG en el documento WO 00/12689. SdrG se encuentra en los estafilococos negativos a la coagulasa y es una proteína asociada a la pared celular que contiene una secuencia LPXTG.

SdrG contiene un péptido señal (aminoácidos 1 - 51), una región que contiene sitios de unión a fibrinógeno y sitios de unión a colágeno (aminoácidos 627 - 698 y 738 - 809), una región de repetición SD (aminoácidos 825 - 1000) y un dominio de unión (aminoácidos 1009 - 1056).

Fbe tiene una secuencia señal teórica con un sitio de escisión entre los aminoácidos 51 y 52. Por tanto un fragmento preferido de Fbe contiene la forma madura de Fbe que se extiende desde el aminoácido 52 al extremo C (aminoácido 1.092).

El dominio de Fbe desde el aminoácido 52 al aminoácido 825 es responsable de la unión al fibrinógeno. Por consiguiente un fragmento preferido de Fbe consiste en o contiene los aminoácidos 52 - 825.

La región entre los aminoácidos 373 y 516 de Feb muestra la mayor conservación entre Fbe y ClfA. El fragmento preferido contendrá por tanto los aminoácidos 373 - 516 de Fbe.

Los aminoácidos 825 -1041 de Fbe contienen una región altamente repetitiva compuesta por residuos de ácido aspártico y serina repetidos en tándem.

Los fragmentos preferidos de SdrG incluyen los polipéptidos en los que el péptido señal y/o las repeticiones SD y el dominio de unión se han eliminado. Estos incluyen polipéptidos que comprenden o consisten en los aminoácidos 50 - 825, los aminoácidos 50 - 633, los aminoácidos 50 - 597 (SeC. ID N.°: 2 del documento WO 03/76470), los aminoácidos 273 - 597 (SEC. ID N.°: 4 del documento WO 03/76470), los aminoácidos 273 - 577 (SEC. ID N.°: 6 del documento WO 03/76470), los aminoácidos 1 - 549, los aminoácidos 219 - 549, los aminoácidos 225 - 549, los aminoácidos 219 - 528, los aminoácidos 225 - 528 de SEC. ID N.°: 70.

Preferentemente, un polipéptido SdrG que tiene una secuencia con una homología de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la secuencia SEC. ID 70, 20 o 21 se incorpora en la composición inmunógena de la invención.

Las composiciones de la invención comprenden opcionalmente un fragmento de los polipéptidos SdrG descritos anteriormente.

Los fragmentos preferidos tienen el péptido señal y/o el dominio de repetición SD y/o el dominio de unión delecionado. Por ejemplo las secuencias correspondientes a los aminoácidos 1 - 713 , 1 - 549, 225 - 549, 225 - 529, 24 - 717, 1 - 707, 1 - 690, 1 - 680, 1 - 670, 1 - 660, 1 - 650, 1 - 640, 1 - 630, 1 - 620, 1 - 610, 1 - 600, 34 - 707, 44 -697, 36 - 689 de SEC. ID 76 o secuencias que tienen una identidad del 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEC. ID 70 o 20 o 21.

El fragmento preferido con el péptido señal delecionado tienen un residuo de metionina en el extremo N del fragmento para garantizar la traducción correcta.

Un fragmento más preferido tiene la secuencia siguiente:-MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTN VDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKI KESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIY DVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIK AHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINP LRYSAKETNVNISGNGDEGST

11DDST11KVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPY11KVISKYDPNKDD YTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKP LSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTING QDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGD DDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDE

EbhA y EbhB

EbhA y EbhB son proteínas que se expresan en S. aureus y S. epidermidis (Clarke y Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680, Williams et al. Infect. Immun. 2002, 20; 6805) y que se unen a la fibronectina. Dado que la fibronectina es un componente importante de la matriz extracelular, EbhA y EbhB tienen una función importante en la adhesión de los estafilococos a la matriz extracelular del huésped.

Las proteínas Ebh son grandes y tienen un peso molecular de 1,1 megadalton. Supone una ventaja usar un fragmento de la proteína Ebh en lugar de la secuencia completa debido a la facilidad de producción y formulación. La región central de la proteína contiene repeticiones imperfectas que contienen sitios de unión a la fibronectina. Los fragmentos que contienen uno o más de los dominios de repetición descritos más adelante son fragmentos preferidos para incorporar en la composición inmunógena de la invención.

Las proteínas Ebh contienen unidades de repetición imperfectas de 127 aminoácidos de longitud que se caracterizan porque contienen la secuencia consenso:-L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A

Preferentemente

.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12}

Más preferentemente

....I/V.AJ/V..AK.ALN/DG..NL.AK.A{6}L.LN.AQK..L.QI/V.A.V..

V.{6}A.LN/DAM..LJ/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K.AY/F.AV.AJ/V.N /D......

Donde '.' significa cualquier aminoácido y '.{10}' significa 10 aminoácidos cualesquiera y I/V indica elecciones alternativas de aminoácidos.

Por referencia a la secuencia divulgada en Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225 - 1240 y la Tabla 2, las secuencias de repetición dentro de las proteínas Ebh se deducen fácilmente.

Los fragmentos preferidos a incluir en la composición inmunógena de la invención incluyen polipéptidos que contienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de 10 de las 127 unidades de repetición de aminoácidos. Dichos fragmentos pueden consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones de la región de repetición de 127 aminoácidos o puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones con residuos de aminoácidos adicionales presentes en cualquiera o ambos extremos del fragmento. Un fragmento preferido adicional es el polipéptido H2 de aproximadamente 44 kDa que abarca tres repeticiones (3202 - 3595 aminoácidos) como se describe en Clarke et al. Infection and Immunity 70, 6680 - 6687, 2002. Dichos fragmentos podrán preferentemente unirse a fibronectina y/o lograr anticuerpos que son reactivos contra la proteína Ebh entera.

Los polipéptidos Ebh son capaces de unirse a la fibronectina. Los fragmentos preferidos de estas secuencias polipeptídicas conservan la capacidad para unirse a la fibronectina. La unión a la fibronectina se puede evaluar mediante ELISA, como describen Clarke et al. (Infection and Immunity 70; 6680 - 66872002).

Otros fragmentos preferidos adicionales son aquellos que comprenden un epítopo para linfocitos B o linfocitos T colaboradores, por ejemplo los fragmentos/péptidos descritos en las Tablas 3 y 4.

^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^

continuación

- Las columnas “Comienzo" y "Fin" presentan la posición de los epítopos de linfocitos B previstos en la repetición de 127 aminoácidos

- Las columnas “Inicio" y "Terminación" presentan la posición de los epítopos de linfocitos B previstos en la secuencia de longitud completa Ebh

Tabla 4- Predicción de epltopos de linfocitos T colaboradores en Ebh

- La columna “Posición de la repetición" presenta la posición de los epítopos de linfocitos T previstos en la repetición

- La columna “Posición de la secuencia" presenta la posición de los epítopos de linfocitos T previstos en la secuencia de longitud completa de Ebh

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis peptídica; por tanto, estos fragmentos se pueden emplear como productos intermedios para la producción de los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Particularmente preferidas son las variantes en las que varios, 5 - 10, 1 - 5, 1 - 3, 1 - 2 o 1 aminoácidos se sustituyen, eliminan, o añaden en cualquier combinación.

Proteína de unión a elastina (EbpS)

EbpS es una proteína que contiene 486 aminoácidos con un peso molecular de 83 kDa. Se asocia con la membrana citoplásmica de S. aureus y tiene tres regiones hidrófobas que mantienen a la proteína en la membrana (Downer et al. 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park et al. 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803).

Dos regiones entre los aminoácidos 1 - 205 y 343 - 486 se exponen en la superficie en la cara externa de la membrana citoplasmática. El dominio de unión al ligando de EbpS se localiza entre los residuos 14 - 34 en el extremo N (Park et al. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).

Un fragmento preferido a incorporarse en la composición inmunógena de la invención sería el fragmento expuesto en la superficie que contiene la región de unión a elastina (aminoácidos 1 - 205). Algunos ejemplos preferidos no contienen el bucle entero expuesto pero deberían contener la región de unión a elastina (aminoácidos 14 - 34). Un fragmento alternativo que podría usarse consiste en aminoácidos que forman el segundo bucle expuesto en la superficie (aminoácidos 343 - 486). Los fragmentos alternativos que contienen hasta 1, 2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menos en uno o los dos extremos también son posibles.

Receptores de laminina

El receptor de laminina de S. aureus desempeña un importante papel en la patogenicidad. Un rasgo característico de la infección es la invasión de la corriente sanguínea que permite la formación de abscesos metastásicos extendida. La invasión de la corriente sanguínea requiere la capacidad para extravasarse a través de la membrana basal vascular. Esto se consigue mediante la unión a la laminina a través del receptor de la laminina (Lopes et al. Science 1985, 229; 275).

Los receptores de laminina se exponen en la superficie y están presentes en muchas cepas de estafilococos, incluidos S. aureus y S. epidermidis.

SBI

Sbi es una proteína que tiene una región de unión a IgG y un dominio de unión a la apolipoproteína H y se expresa en la mayoría de las cepas de S. aureus (Zhang et al. 1998, Microbiology 144; 985).

El extremo N de la secuencia de Sbi tiene una secuencia señal típica con un sitio de escisión tras el aminoácido 29. Por tanto, un fragmento preferido de Sbi a incorporarse en una composición inmunógena de la invención comienza en el residuo de aminoácidos 30, 31, 32 o 33 y sigue hasta el extremo C de Sbi, por ejemplo de SEC. ID N.°: 26. El dominio de unión a IgG de Sbi se ha identificado como una región hacia el extremo N de la proteína desde los aminoácidos 41 - 92. Este dominio es homólogo a los dominios de unión a IgG de la proteína A.

El dominio de unión a IgG de Sbi contiene la secuencia siguiente:-

QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK

* * * * ★ * * * * * * * * * * - indica los aminoácidos que son similares entre dominios de unión a IgG

El fragmento preferido de Sbi a incluir en la composición inmunógena de la invención contiene un dominio de unión a IgG. Este fragmento contiene la secuencia consenso para un dominio de unión a IgG como se designa con * como se muestra en la secuencia anterior. Preferentemente el fragmento contiene o consiste en la secuencia completa mostrada anteriormente. Más preferentemente, el fragmento contiene o consiste en los aminoácidos 30 - 92, 33 - 92, 30 - 94, 33 - 94, 30 - 146, 33 - 146, 30 - 150, 33 - 150, 30 - 160, 33 - 160, 33 - 170, 33 - 180, 33 - 190, 33 - 200, 33 -205 o 33 - 210 de Sbi, por ejemplo de SEC. ID N.°: 26.

El fragmento preferido puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de aminoácidos de las secuencias indicadas.

Fragmentos preferidos pueden contener múltiples repeticiones (2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 o 10) del dominio de unión a IgG. EFB - FIB

Fib es una proteína de unión a fibrinógeno de 19 kDa que S. aureus secreta al medio extracelular. Es producida por todos los aislados de S. aureus analizados (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347).

S. aureus se agrupa en presencia de fibrinógeno y se une a las superficies recubiertas con fibrinógeno. Esta capacidad facilita la colonización por estafilococos de los catéteres y células endoteliales.

Fib contiene una secuencia señal en el extremo N de la proteína con un sitio de escisión teórico aproximadamente en el aminoácido 30. Por tanto un fragmento preferido que se va a introducir en la composición inmunógena de la invención contendría la secuencia de la proteína madura (desde aproximadamente el aminoácido 30 al extremo C de la proteína).

IsaA/PisA

IsaA es una proteína de 29 kDa, también conocida como PisA, que se ha demostrado que es una proteína estafilocócica inmunodominante durante la sepsis en pacientes hospitalizados (Lorenz et al. 2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145).

Se piensa que los primeros 29 aminoácidos de la secuencia de IsaA son una secuencia señal. Por tanto, un fragmento preferido de IsaA que se va a incluir en una composición inmunógena de la invención contendría los residuos de aminoácidos desde el 30 hacia adelante, hasta el final de la secuencia codificada.

Proteínas de unión a fibronectina

La proteína A de unión a fibronectina (FnbA) se describe en el documento US5320951 y Schennings et al. (1993, Microb. Pathog. 15; 227). La proteína A de unión a fibronectina contiene varios dominios que están implicados en la unión a fibronectina (documento WO 94/18327). Estos se denominan D1, D2, D3 y D4. Fragmentos preferidos de la proteína A o B de unión a fibronectina comprenden o consisten en D1, D2, D3, D4, D1-D2, D2-D3, D3-D4, D1-D3, D2-D4 o D1-D4 (como se describe en el documento WO 94/18327).

La proteína de unión a fibronectina contiene una secuencia señal de 36 aminoácidos. Por ejemplo:

VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA

Opcionalmente, la proteína madura sin esta secuencia señal está incluida en la composición inmunógena de la invención.

Proteínas transportadoras

La pared celular de las bacterias grampositivas actúa como barrera que impide la difusión libre de metabolitos al interior de la bacteria. Una familia de proteínas orquesta el paso de nutrientes esenciales a la bacteria y por tanto, son esenciales para la viabilidad de la bacteria. La expresión proteína transportadora abarca las proteínas implicadas en la etapa inicial de unión a metabolitos, tales como hierro, así como las implicadas en el transporte real del metabolito al interior de la bacteria.

El hierro molecular es un cofactor esencial para el crecimiento bacteriano. Se secretan sideróforos que se unen al hierro libre y después se capturan por receptores de la superficie bacteriana que liberan hierro para su transporte a través de la membrana citoplasmática. La adquisición de hierro es crítica para el establecimiento de infecciones humanas de modo que la generación de una respuesta inmunitaria contra esta clase de proteínas conduce a una pérdida de la viabilidad de los estafilococos.

Ejemplos de proteínas transportadoras incluyen el transportador de ABC inmunodominante (Burnie et al. 2000 Infect. Imun. 68; 3200), IsdA (Mazmanian et al. 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian et al. 2002 PNAS 99; 2293), transportador de Mg2+, SitC (Wiltshire y Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) y transportador de Ni ABC.

T ransportador de ABC inmunodominante

El transportador de ABC inmunodominante es una proteína bien conservada que puede ser capaz de generar una respuesta inmunitaria que ofrece protección cruzada contra diferentes cepas de estafilococos (Mei et al. 1997, Mol. Microbiol. 26; 399). Los anticuerpos contra esta proteína se han hallado en pacientes con septicemia (Burnie et al.

2000, Infect. Immun. 68; 3200).

Los fragmentos preferidos del transportador de ABC inmunodominante incluirán los péptidos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS, VDWLR, RGFL, más preferentemente KIKVYVGNYDFWYQS, TVIVVSHDRHFLYNNV y/o TETFLRGFLGRMLFS, ya que estas secuencias contienen epítopos que son reconocidos por el sistema inmunológico humano.

IsdA-IsdB

Los genes isd (determinante de superficie regulado por hierro) de S. aureus codifican proteínas responsables de la unión a hemoglobina y el paso del hierro de hemo al citoplasma, donde actúa como un nutriente esencial. IsdA e IsdB se localizan en la pared celular de los estafilococos. Parece que IsdA está expuesta sobre la superficie de la bacteria ya que es susceptible a la digestión con proteinasa K. ISDb se digirió parcialmente, lo que sugiere que está parcialmente expuesta sobre la superficie de la bacteria (Mazmanian et al. 2003 Science 299; 906).

IsdA e IsdB son ambas proteínas de 29 kDa que se unen al grupo hemo. Su expresión está regulada por la disponibilidad del hierro a través del represor Fur. Su expresión será alta durante la infección en un huésped en el que la concentración será baja.

También se conocen como FrpA y FrpB (Morrissey et al. 2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA y FrpB son las proteínas de superficie principales con una carga elevada. Se ha demostrado que proporcionan una contribución fundamental a la adhesión a plástico.

En una realización, la composición inmunógena de la invención comprende un fragmento de IsdA y/o IsdB que se describe en el documento Wo 01/98499 o el documento WO 03/11899.

Toxinas y reguladores de virulencia

Los miembros de esta familia de proteínas incluyen toxinas, tales como la toxina alfa, hemolisina, enterotoxina B y TSST-1, así como las proteínas que regulan la producción de toxinas, tales como RAP.

Toxina alfa (Hla)

La toxina alfa es un determinante importante de la virulencia producida por la mayoría de las cepas de S. aureus. Es una toxina formadora de poros con actividad hemolítica. Se ha demostrado que los anticuerpos contra la toxina alfa neutralizan los efectos perjudiciales y letales de la toxina alfa en modelos animales (Adlam et al. 1977 Infect. Immun.

17; 250). Las plaquetas humanas, las células endoteliales y las células mononucleares son susceptibles a los efectos de la toxina alfa.

La elevada toxicidad de la toxina alfa requiere que se detoxifique antes de usar como un inmunógeno. Esto se puede conseguir por tratamiento químico, por ejemplo tratando con formaldehído, glutaraldehído de otros reactivos de reticulación o conjugándola químicamente a polisacáridos bacterianos, como se describe más adelante.

Un modo adicional de eliminar la toxicidad es introducir mutaciones puntuales que eliminen la toxicidad al tiempo que conservan la antigenicidad de la toxina. La introducción de una mutación puntual en el aminoácido 35 de la toxina alfa, en la que se sustituye un residuo de histidina por un residuo de leucina, tiene como resultado la eliminación de la toxicidad al tiempo que se conserva la inmunogenicidad (Menzies y Kernodle 1996; Infect. Immun.

64; 1839). La histidina 35 parece ser crítica para la adecuada oligomerización requerida para la formación de poros y la mutación de este residuo conduce a pérdida de toxicidad.

Cuando se incorpora en las composiciones inmnunogénicas de la invención, la toxina alfa se detoxifica, preferentemente, mediante la mutación de His 35 sustituyendo His 35 con Leu o Arg. En una realización alternativa, la toxina alfa se detoxifica mediante conjugación con otros componentes de la composición inmunógena, preferentemente polisacáridos capsulares, lo más preferentemente al polisacárido de tipo V de S. aureus y/o al polisacárido de tipo VIII de S. aureus y/o PNAG.

Proteína de activación de ARN III (RAP)

La RAP no es en sí misma una toxina, sino un regulador de la expresión de factores de virulencia. La RAP es producida y secretada por estafilococos. Activa el sistema regulador de agr de otros estafilococos y activa la expresión y la posterior liberación de factores de virulencia, tales como hemolisina, enterotoxina B y TSST-1.

Una respuesta inmunitaria generada contra RAP no mataría la bacteria pero interferiría en su patogenicidad. Esto tiene la ventaja de proporcionar menos presión selectiva para que aparezcan las nuevas cepas resistentes.

Tendría una segunda ventaja, la de producir una respuesta inmunitaria que sería instrumental en la reducción de la morbididad de la infección.

Es particularmente ventajoso combinar RAP con otros antígenos en una vacuna, en particular cuando el antígeno adicional proporcionaría una respuesta inmunitaria que fuera capaz de matar la bacteria.

Otras proteínas

Proteína asociada con la acumulación (Aap)

La Aap es una proteína de 140 kDa que es esencial para la acumulación de cepas de S. epidermidis sobre las superficies (Hussain et al. Infect. Immun. 1997, 65; 519). Las cepas que expresan esta proteína produjeron cantidades significativamente más grandes de biopelículas y la Aap parece estar implicada en la formación de biopelículas. Los anticuerpos contra la Aap son capaces de inhibir la formación de biopelículas y de inhibir la acumulación de S. epidermidis.

Un fragmento preferido de la Aap es un dominio conservado que comprende o que consiste en los aminoácidos 550 - 1069.

Antígeno secretor estafilocócico SsaA

El SsaA es una proteína fuertemente inmunógena de 30 kDa hallada tanto en S. aureus como en S. epidermidis (Lang et al. 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Su expresión durante la endocarditis sugirió un papel de virulencia específico de la patogenia de la enfermedad infecciosa.

SsaA contiene una secuencia líder en el extremo N y un sitio de escisión para la peptidasa señal. Al péptido líder le sigue una región hidrófila de aproximadamente 100 aminoácidos, desde el residuo 30 al residuo 130.

Un fragmento preferido de SsaA a incorporar en la composición inmunógena de la invención está formado por la proteína madura (los aminoácidos 27 al extremo C o los aminoácidos 30 al extremo C).

Fragmentos preferidos adicionales contienen el área hidrofílica de SsaA desde el aminoácido 30 al aminoácido 130. Composiciones inmunógenas preferidas de la invención no incluyen las secuencias proteicas divulgadas en el documento WO02/094868.

Combinaciones de tres proteínas

Una composición inmunógena preferida de la invención contiene tres componentes proteicos en una combinación de toxina alfa, una proteína de unión al componente extracelular que es ClfA o un fragmento inmunógeno del mismo y una proteína transportadora que es SitC o un fragmento inmunógeno de la misma.

En una combinación tal, la toxina alfa puede destoxificarse químicamente o destoxificarse genéricamente mediante la introducción de mutación(es) puntual(es), preferentemente la mutación puntual His35Leu. La toxina alfa está presente como una proteína libre o como alternativa está conjugada a un polisacárido o componente LTA de la composición inmunógena.

Selección de antígenos expresados en diferentes linajes clonales

El análisis de la aparición de factores de virulencia en relación con la estructura de la población de Staphylococcus aureus mostró una presencia variable de genes de virulencia en las poblaciones naturales de S. aureus.

Entre los aislados clínicos de Staphylococcus aureus, se demostró que al menos cinco linajes clonales eran altamente prevalentes (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345 - 52). Se mostró que alfa-hemolisina (hla), proteína A de unión a fibronectina (fnba) y factor de agrupamiento A (cofa) estaban presentes en los aislados, con independencia de la identidad del linaje, lo que sugiere un papel importante de estas proteínas en la supervivencia de S. aureus (Booth et al., 2001 Infect lmmun. 69(1):345 - 52). Además, de acuerdo con Peacock et al. 2002 las distribuciones de fnba, clfa, coagulasa, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (toxina gamma), toxina alfa e ica parecieron no estar relacionadas con la estructura clonal subyacente lo que sugiere una transferencia horizontal considerable de estos genes.

Por el contrario, otros genes de virulencia, tal como la proteína B de unión a fibronectina ((fnbB), betahemolisina (hlb), proteína de unión al colágeno (cna), TSST-1 (tst) y gen de resistencia a meticilina (mecA) están fuertemente asociados con linajes específicos (Booth et al., 2001 Infect Immun 69(1):345 - 52). De un modo similar, Peacock et al. 2002 (Infect Immun. 70(9):4987 - 96) mostraron que las distribuciones de las enterotoxinas, tst, las exfolatinas (eta and etb), las toxinas beta y delta, los genes sdr (sdrD, sdrE and bbp), cna, ebpS y efb en la población están alta y significativamente relacionados con los complejos clonales derivados de MLST.

Los datos de MLST no proporcionan ninguna evidencia de que las cepas responsables de enfermedad nosocomial representen una subpoblación distinta de las cepas causantes de enfermedades adquiridas en la comunidad o cepas recuperadas de portadores asintomáticos (Feil et al., 2003 J Bacteriol. 185(11):3307 - 16).

Las composiciones inmunógenas preferidas de la invención son eficaces contra estafilococos de diferentes linajes clonales.

En una realización, esto se consigue incluyendo 1, 2, 3, 4, preferentemente al menos 1, proteínas que se expresan en la mayoría de los aislados de estafilococos. Ejemplos de dichas proteínas incluyen alfa-hemolisina (ha), proteína A de unión a fibronectina (fnba) y factor de agupamiento (clfa), coagulasa, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (toxina gamma) e ica. Los autores de la invención también han identificado el transportador de ABC inmunodominante, RAP, autolisina (Rupp et al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SPOIIIE (), SsaA, EbpS, SasF (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), EFB(FIB), SBI, ClfB, IsdA, IsdB, FnbB, Npasa, EBP, sialoproteína II de unión al hueso, IsaB/PisB (Lorenz et al. FEMS Immuno. Med. Microb.

2000, 29; 145), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 y nueva autolisina. En una realización alternativa, 2 o más proteínas que se expresan en diferentes conjuntos de cepas clonales están incluidas en la composición inmunógena de la invención. Preferentemente la combinación de antígenos permitirán la generación de una respuesta inmunitaria que es eficaz contra múltiples cepas clonales, lo más preferentemente contra todas las cepas clonales. Combinaciones preferidas incluyen FnbB y betahemolisina, FnbB y Cna, FnbB y TSST-1, FnbB y mecA, FnbB y SdrD, FnbB y SdrF, FnbB y EbpS, FnbB y Efb, beta-hemolisina y Cna, beta­ hemolisina y TSST-1, beta-hemolisina y mecA, beta-hemolisina y SdrD, beta-hemolisina y SdrF, beta-hemolisina y EbpS, beta-hemolisina y Efb, Cna y Ts St -1, Cna y mecA, Cna y SdrD, Cna y SdrF, Cna y EbpS, Cna y Efb, TSST-1 y mecA, TSST-1 y SdrD, TSST-1 y SdrF, TSST-1 y EbpS, TssT-1 y Efb, MecA y SdrD, MecA y SdrF, MecA y EbpS, MecA y Efb, SdrD y SdrF, SdrD y EbpS, SdeD y Efb, SdrF y EbpS, SdrF y Efb y EbpS y Efb.

Las combinaciones preferidas descritas con anterioridad se pueden combinar con componentes adicionales descritos más adelante.

Selección de antígenos expresados durante diferentes fases de crecimiento.

Los estafilococos atraviesan una fase de crecimiento exponencial durante la cual se expresarán un conjunto determinado de proteínas. Estas incluyen muchas de las proteínas de unión al componente extracelular y proteínas transportadoras. Después de un periodo de crecimiento exponencial, los estafilococos regresan a una fase post­ exponencial durante la cual el crecimiento es más lento y se modula la expresión de proteínas. Muchas de estas proteínas expresadas durante la fase de crecimiento exponencial están reguladas por disminución mientras que otras proteínas, tales como enzimas y la mayoría de las toxinas, incluyendo la toxina alfa, se expresan a niveles más altos.

Las composiciones inmunógenas preferidas de la invención comprenden una proteína expresada a niveles más altos durante la fase de crecimiento exponencial y una proteína expresada a niveles más altos durante la fase de crecimiento postexponencial.

“Niveles más altos” hace referencia a que el nivel de expresión es más alto en una fase en comparación con la otra fase.

Polisacáridos

Las composiciones inmunógenas de la invención comprenden preferentemente de forma adicional polisacáridos capsulares que incluyen uno o más de PIA (también conocida como PNAG) y/o polisacárido capsular de tipo V y/o de tipo VIII de S. aureus y/o polisacárido capsular de tipo I y/o de tipo II y/o de tipo III de S. epidermidis.

PIA (PNAG)

Actualmente está claro que las diversas formas de polisacáridos de superficie de estafilococos identificados como PS/A, PIA y SAA son la misma entidad química - PNAG (Maira-Litran et al. Vaccine 22; 872 - 879 (2004)). Por tanto, el término PIA o PNAG abarca todos estos polisacáridos u oligosacáridos derivados de ellos.

PIA es una adhesina polisacarídica intercelular y está compuesta por un polímero de glucosamina unida por p-(1 ^ 6 ) sustituida con sustituyentes N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis y se puede aislar de cualquier fuente (Joyce et al. 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por ejemplo, PNAG se puede aislar de la cepa de S. aureus MN8m (documento WO 04/43407).

La PIA, aislada de S. epidermidis es un constituyente integral de biopelícula. Es responsable de la participación en la adhesión célula-célula y probablemente también funciona para proteger la colonia en crecimiento de la respuesta inmunitaria del huésped.

Recientemente se ha mostrado que el polisacárido conocido anteriormente como poli-N-succinil-p-(1 ^ 6)-glucosamina (PNSG) no tiene la estructura prevista ya que la identificación de la N-succinilación era incorrecta (Maira-Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por tanto el polisacárido oficialmente conocido como PNSG y que actualmente se ha descubierto que es PNAG también entra dentro del término PIA.

PIA (o PNAG) puede tener diferentes tamaños que varían desde más de 400 kDa a entre 75 y 400 kDa a entre 10 y 75 kDa a oligosacáridos compuestos por hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina p-(1 ^ 6)-unida sustituida con sustituyentes de N-acetilo o de O-succinilo). Cualquier tamaño de polisacárido u oligosacáridos PIA se puede usar en una composición inmunógena de la invención, aunque se prefiere un tamaño de más de 40 kDa. El tamaño se puede alcanzar por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo por microfluidización, irradiación ultrasónica o mediante escisión química (documentos WO 03/53462, EP497524, EP497525).

Los intervalos de tamaño preferidos de PIA (PNAG) son 40 - 400 kDa, 40 - 300 kDa, 50 - 350 kDa, 60 - 300 kDa, 50 - 250 kDa y 60 - 200 kDa.

PIA (PNAG) puede tener un grado de acetilación diferente debido a la sustitución sobre los grupos de amino con acetato. PIA producida in vitro está casi completamente sustituida en los grupos amino (95 - 100 %). Como alternativa, se puede usar una PIA desacetilada (PNAG) que tenga menos del 60 %, preferentemente menos del 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % de acetilación. Se prefiere el uso de un PIA (PNAG) desacetilado, ya que los epítopos no acetilados de PNAG son eficientes en la mediación de la muerte por opsonización de bacterias grampositivas, preferentemente S. aureus y/o S. epidermidis. Lo más preferentemente, el PIA (PNAG) tiene un tamaño entre 40 kDa y 300 kDa y está desacetilado de modo que menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 % o 20 % de los grupos amino están acetilados.

El término PNAG desacetilado (dPNAG) hace referencia a un polisacárido u oligosacárido PNAG en el que menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % o 10 % de los grupos amino están acetilados.

En una realización, el PNAH se desacetila para formar dPNAG tratando químicamente el polisacárido nativo. Por ejemplo, el PNAG nativo se trata con una solución básica de modo que el pH aumenta por encima de 10. Por ejemplo, el PNAH se trata con NaOH, KOH o NH⁴OH 0,1 - 5M, 0,2 - 4M, 0,3 - 3M, 0,5 - 2M, 0,75 - 1,5 M o 1 M. El tratamiento se realiza durante al menos 10 o 30 minutos o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 horas a una temperatura de 20 -100, 25 - 80, 30 - 60 o 30 - 50 o 35 - 45 ° C. El dPNAG se puede preparar como se ha descrito en el documento WO 04/43405.

El o los polisacáridos incluidos en la composición inmunógena de la invención están preferentemente conjugados a una proteína transportadora como se describe más adelante o como alternativa no están conjugados.

Polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus

La mayoría de las cepas de S. aureus que causan infección en el ser humano contienen polisacáridos de tipo 5 o de tipo 8. Aproximadamente el 60 % de las cepas humanas son de tipo 8 y aproximadamente el 30 % son de tipo 5. Las estructuras de los antígenos polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 se describen en Moreau et al. Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) y Fournier et al. Infect. Immun. 45; 87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición así como ManNAcA que se pueden usar para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras se notificaron como:

Tipo 5

^4)-P-D-ManNAcA(30Ac)-(1 ^4)-a-L-FucNAc(1 ^3)-P-D-FucNAc-(1 ^

Tipo 8

^3)-p-D-ManNACA(4OAc)-(1 ^3)-a-L-FucNAc(1 ^3)-(3-D-FucNAc-(1 ^

Recientemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097 - 1106 (2005)), la espectroscopia RMN revisó las estructuras a:

Tipo 5

^4)-P-D-ManNAcA-(1 ^4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1 ^3)-P-D-FucNAc-(1 ^

Tipo 8

^3)-p-D-ManNACA(40Ac)-(1 ^3)-a-L-FucNAc(1 ^3)-(a-D-FucNAc(1 ^

Los polisacáridos se pueden extraer de la cepa adecuada de S. aureus usando un procedimiento bien conocido para el experto, por ejemplo como se describe en el documento US6294177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus de tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus de tipo 8.

Los polisacáridos son del tamaño nativo o como alternativa pueden dimensionarse por ejemplo por microfluidizacion, irradiación ultrasónica o por tratamiento químico. La invención también cubre los oligosacáridos derivados de los polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus.

Los polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 incluidos en la composición inmunógena de la invención están preferentemente conjugados a una proteína transportadora como se describe más adelante o como alternativa no están conjugados.

Las composiciones inmunogénicas de la invención contienen alternativamente bien el polisacárido de tipo 5 o bien el de tipo 8.

Antígeno 336 de S. aureus

En una realización, la composición inmunógena de la invención comprende el antígeno 336 de S. aureus descrito en el documento US6294177.

El antígeno 336 comprende hexosamina unida con p, no contiene grupos O-acetilo y específicamente se une a los anticuerpos para tipo 336 de S. aureus depositados en la ATCC con el número 55804.

En una realización, el antígeno 336 es un polisacárido que es de tamaño nativo o como alternativa pueden dimensionarse por ejemplo por microfluidizacion, irradiación ultrasónica o por tratamiento químico. La invención también cubre los oligosacáridos derivados del antígeno 336.

El antígeno 336, cuando está incluido en la composición inmunógena de la invención está preferentemente conjugado a una proteína transportadora como se describe más adelante o como alternativa no están conjugados. Polisacáridos de tipo I, II y III de S. epidermidis

Las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10 de S. epidermidis son características de tres tipos capsulares diferentes, I, II y III, respectivamente (Ichiman y Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Los polisacáridos capsulares extraídos de cada serotipo de S. epidermidis constituyen los polisacáridos de tipo I, II y III. Los polisacáridos se pueden extraer mediante varios procedimientos, incluyendo el procedimiento descrito en el documento US4197290 o como se describe en Ichiman et al. 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176.

En una realización de la invención, la composición inmunógena comprende polisacáridos u oligosacáridos de tipo I y/o II y/o III de S. epidermidis.

Los polisacáridos son del tamaño nativo o como alternativa pueden dimensionarse por ejemplo por microfluidizacion, irradiación ultrasónica o por escisión química. La invención también cubre los oligosacáridos extraídos de cepas de S. epidermidis.

Estos polisacáridos no están conjugados o preferentemente están conjugados como se describe más adelante. Conjugación de polisacáridos

Entre los problemas asociados con el uso de polisacáridos en vacunación, se encuentra el hecho de que los polisacáridos per se son malos inmunógenos. Estrategias, que se han diseñado para superar esta falta de inmunogenicidad, incluyen la unión del polisacárido a vehículos proteicos grandes, que proporcionan ayuda por los linfocitos T inespecíficos. Se prefiere que los polisacáridos usados en la invención estén ligados a un vehículo proteico que proporcione ayuda por los linfocitos T inespecíficos. Ejemplos de tales vehículos que pueden estar conjugados con inmunógenos polisacáridos incluyen los toxoides de difteria y tétanos (DT, DT CRM197 y TT, respectivamente), hemocianina de lapa californiana (KLH) y el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), la exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), la proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina o fragmentos de cualquiera de los anteriores. Fragmentos adecuados para usar incluyen fragmentos que abarcan los epítopos de linfocitos T colaboradores. En concreto, el fragmento de proteína D contiene, preferentemente, el 1/3 en el extremo N de la proteína. La proteína D es una proteína de unión a IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0594610 B1) y es un inmunógeno potencial.

Además, las proteínas estafilocócicas se pueden usar como proteína vehículo en los conjugados de polisacáridos de la invención. Las proteínas estafilocócicas descritas más adelante se pueden usar como proteína vehículo; por ejemplo el receptor de laminina, la proteína de unión a SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de unión a elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, proteína de unión a fibrinógeno, coagulasa, Fig, MAP; transportador de ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg²⁺, SitC, toxina alfa del transportador de Ni ABC (Hla), mutante H35R de la toxina alfa, proteína de activación de RNA III (RAP) o fragmentos de las mismas.

Una nueva proteína vehículo que sería particularmente ventajosa para usar en el contexto de una vacuna de estafilococos es el alfa toxoide de estafilococos. La forma nativa puede estar conjugada a un polisacárido ya que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferentemente una toxina alfa genéticamente destoxificada tal como las variantes His35Leu o His 35 Arg se usan como vehículos, ya que la toxicidad residual es menor. Como alternativa la toxina alfa se destoxifica químicamente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldehído o glutaraldehído. Una toxina alfa destoxificada genéticamente se destoxifica químicamente opcionalmente, preferentemente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldehído o glutaraldehído para reducir aún más la toxicidad.

Los polisacáridos pueden unirse a la(s) proteína(s) vehículo por cualquier procedimiento conocido (por ejemplo, por Likhite, Patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor et al., Patente de EE.^u U. 4.474.757 y Jennings et al., Patente de EE.UU. 4.356.170). Preferentemente se lleva a cabo la química de conjugación CDAP (documento WO 95/08348).

En CDAP, el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) se usa preferentemente para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse según condiciones relativamente suaves, que evitan la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a la alcalinidad. Esta síntesis permite un acoplamiento directo con una proteína vehículo.

El polisacárido se solubiliza en agua o una solución salina. CDAP se disuelve en acetonitrilo y se añade inmediatamente a la solución de polisacáridos. El CDAP reacciona con los grupos hidroxilo del polisacárido para formar un éster de cianato. Después de la etapa de activación, se añade la proteína vehículo. Los grupos amino de la lisina reaccionan con el polisacárido activado para formar un enlace covalente de isourea. Después de la reacción de acoplamiento, se añade luego un gran exceso de glicina para inactivar los grupos funcionales activados residuales. Después el producto se hace pasar a través de una columna de permeación en gel para eliminar la proteína vehículo sin reaccionar y los reactivos residuales.

La conjugación implica preferentemente producir un enlace directo entre la proteína vehículo y el polisacárido. Opcionalmente se puede introducir un espaciador (tal como dihidruro adípico (ADH)) entre la proteína vehículo y el polisacárido.

Protección contra S. aureus y S. epidermidis

En una realización preferida de la invención la composición inmunógena proporciona una respuesta inmunitaria eficaz contra más de una cepa de estafilococos, preferentemente contra cepas tanto de S.aureus como de S. epidermidis. Más preferentemente, se genera una respuesta inmunitaria protectora contra los serotipos 5 y 8 de S. aureus. Más preferentemente, se genera una respuesta inmunitaria protectora contra múltiples cepas de S. epidermidis, por ejemplo a partir de cepas de al menos dos serotipos I, II y III de S. epidermidis.

Un uso de la composición inmunógena de la invención es prevenir las infecciones nosocomiales mediante la inoculación antes del tratamiento hospitalario. En esta etapa, es difícil predecir de forma precisa a qué cepas estafilocócicas estará expuesto el paciente. Por tanto, es ventajoso inocular una vacuna que sea capaz de generar una respuesta inmunitaria protectora eficaz contra varias cepas de estafilococos.

Una respuesta inmunitaria eficaz se define como una respuesta inmunitaria que confiere protección significativa en un modelo de exposición de ratones o ensayo de opsonofagocitosis como se describe en los ejemplos. Una protección significativa en un modelo de exposición de ratones, por ejemplo el del ejemplo 5, se define como un incremento de la DL⁵⁰ en comparación con los ratones a los que se ha inoculado vehículo de al menos el 10 %, 20 %, 50 %, 100 % o 200 %. Una protección significativa en un modelo de exposición de rata algodonera, por ejemplo el del ejemplo 8, se define como una disminución del log UFC medio observado de al menos el 10 %, 20 %, 50 %, 70 % o 90 %. Se sabe que la presencia de anticuerpos de opsonizacion está correlacionada con la protección, por tanto una protección significativa viene indicada por una disminución del recuento bacteriano de al menos el 10 %, 20 %, 50 %, 70 % o 90 % en un ensayo de opsonofagocitosis, por ejemplo el del ejemplo 7.

Varias de las proteínas incluyendo el transportador de ABC inmunodominante, la proteína de activación de ARN III, los receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SsaA, EbhA/EbhB, EbpS y Aap están bien conservados entre S. aureus y S. epidermidis y el ejemplo 8 muestra que IsaA, ClfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA y Sbi pueden generar una respuesta inmunitaria de reacción cruzada (por ejemplo, reacción cruzada entre al menos una cepa de S. aureus y al menos una cepa de S. epidermidis). PIA también está bien conservado entre S. aureus y S. epidermidis y es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de protección cruzada.

Por tanto en una realización preferida, la composición inmunógena de la invención comprenderá dos, tres o cuatro de las proteínas anteriores, que comprenden preferentemente además, PIA (PNAG).

Vacunas de polinucleótidos

También se hace referencia al uso de los polinucleótidos de la Figura 2 en el tratamiento, prevención o diagnóstico de infección por estafilococos. Dichos polinucleótidos incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 70 %, preferentemente una identidad de al menos un 80 %, más preferentemente una identidad de al menos un 90 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la figura 1, sobre la longitud completa de la secuencia. A este respecto, los polipéptidos que tienen una identidad de al menos un 97 % son altamente preferidos, mientras que aquellos con una identidad de al menos un 98 - 99 % son más altamente preferidos y aquellos con una identidad de al menos un 99 % son los más altamente preferidos.

Otros polinucleótidos que encuentran utilidad incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención sobre la región de codificación completa. A este respecto, los polinucleótidos que tienen una identidad de al menos un 97 % son altamente preferidos, mientras que aquellos con una identidad de al menos un 98 - 99 % son más altamente preferidos y aquellos con una identidad de al menos un 99 % son los más altamente preferidos.

Otros polinucleótidos incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 70 %, preferentemente una identidad de al menos un 80 %, más preferentemente una identidad de al menos un 90 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos un 95 %, con la secuencias de la figura 1. A este respecto, los polinucleótidos que tienen una identidad de al menos un 97 % son altamente preferidos, mientras que aquellos con una identidad de 98 -99 % son más altamente preferidos y aquellos con una identidad de al menos un 99 % son los más altamente preferidos. Dicho polinucleótido se puede insertar en un plásmido o vector de microorganismo recombinante adecuado y usar para inmunización (véase, por ejemplo, Wolff et al., Science 247:1465 - 1468 (1990); Corr et al., J. Exp. Med. 184:1555 - 1560 (1996); Doe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8578 - 8583 (1996)).

También se hace referencia a un ácido nucleico que codifica las proteínas mencionadas anteriormente y a su uso en medicina. En un caso preferido los polinucleótidos aislados pueden ser monocatenarios (de codificación o antisentido) o bicatenarios y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Las secuencias codificantes y no codificantes adicionales pueden estar presentes dentro de un polinucleótido, aunque no es necesario. En otros casos relacionados, también se hace referencia a variantes polinucleotídicas que tienen una identidad sustancial con las secuencias divulgadas en el presente documento en la figura 2; los que comprenden una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o mayor, la identidad de secuencia comparada con una secuencia de polinucleótidos en el presente documento usando los procedimientos descritos en el presente documento (p. ej., análisis BLAST usando parámetros convencionales). En un caso relacionado, el polinucleótido aislado comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de un 95 % o superior, con la secuencia de aminoácidos de la figura 1, sobre la longitud completa de una secuencia de la Figura 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

También se hace referencia al uso de polinucleótidos que son complementarios con todos los polinucleótidos descritos anteriormente.

También se hace referencia al uso de un fragmento de un polinucleótido de la invención que cuando se administra a un sujeto tiene las mismas propiedades inmunógenas que un polinucleótido de la Figura 1.

También se hace referencia al uso de un polinucleótido que codifica un fragmento inmunológico de una proteína de la Figura 1 como se ha definido anteriormente en el presente documento. También se contempla el uso de fragmentos que tienen un nivel de actividad inmunógeno de al menos aproximadamente un 50 %, preferentemente de al menos aproximadamente un 70 % y más preferentemente, de al menos aproximadamente un 90 % del nivel de actividad inmunógena de una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia de polinucleótidos expuesta en la Figura 2.

Los fragmentos polipeptídicos para dicho uso comprenden preferentemente al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, o 100 aminoácidos contiguos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, de una composición polipeptídica expuesta en el presente documento, tal como las expuestas anteriormente.

Los polinucleótidos para usar se pueden obtener usando técnicas de clonación y detección selectiva estándar, de una biblioteca de ADNc derivada de ARNm en células de tejido tumoral o preneoplásico humano (por ejemplo, pulmón), (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1989)). Los polinucleótidos también se pueden obtener de fuentes naturales tales como bibliotecas de ADN genómico o se pueden sintetizar usando técnicas bien conocidas y disponibles comercialmente.

Existen varios procedimientos disponibles y muy conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADNc de longitud completa, o extender ADN cortos, por ejemplo los basados en los procedimientos de amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998 - 9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon™, se preparan ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y se liga en cada extremo una secuencia "adaptadora". A continuación se lleva a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADNc usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. Después se repite la reacción de PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse con el producto amplificado (normalmente un cebador específico del adaptador que se hibrida más allá de 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que se hibrtida más allá de 5' en la secuencia del gen conocida). Después los productos de esta reacción se pueden analizar mediante secuenciación del ADN y se puede construir un ADNc de longitud completa uniendo directamente el producto al ADNc existente para dar una secuencia completa o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de la secuencia para el diseño del cebador 5'.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria vivo recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo darán lugar a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunitarias.

Por tanto, en ciertos casos, los polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos para usar como se ha tratado en el presente documento se introducen en células huésped de mamífero para expresión usando cualquiera de una serie de sistemas virales conocidos. En un caso ilustrativo, los retrovirus proporcionan una plataforma cómoda y eficaz para sistemas de liberación génica. Una secuencia de nucleótidos seleccionada que codifica un polipéptido para uso como se ha descrito se puede insertar en un vector y empaquetar como partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la materia. A continuación, se puede aislar el virus recombinante y se puede liberar en un sujeto. Se ha descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (p. ej., la Patente de EE.UU. N.°: 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980 - 990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5 - 14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849 - 852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 - 8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102 - 109).

Además, también se han descrito numerosos sistemas ilustrativos basados en adenovirus. Al contrario que los retrovirus que se integran en el genoma huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente, de modo que se minimizan los riesgos asociados con mutagénesis de inserción (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57:267 -274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911 - 5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717 - 729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933 - 940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51 - 58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616 -629; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461 - 476). También se han desarrollado diversos sistemas de vectores víricos adenoasociados (AAV) para liberación de polinucleótidos. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.°s: 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionales N.°s: WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988 - 3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533 - 539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97 - 129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793 - 801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165 - 169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867 - 1875.

Vectores virales adicionales útiles para liberar las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos para usar por transferencia génica incluyen los derivados de la familia de poxvíridos, tales como el virus variolovacunal y los poxvirus aviares. A modo de ejemplo, los recombinantes del virus variolovacunal que expresan las moléculas de interés se pueden construir del siguiente modo. El ADN que codifica un polipéptido se inserta primero en un vector adecuado de modo que esté adyacente a un promotor variolovacunal y que flanquee las secuencias de ADN variolovacunales, tal como la secuencia que codifica la timidina cinasa (TK). Después, este vector se usa para transfectar células que se infectan de forma simultánea con el virus variolovacunal. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor variolovacunal más el gen que codifica el polipéptido de interés en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante se puede seleccionar cultivando de las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y escogiendo las placas virales resistentes en el mismo.

Un sistema de infección/transfección basado en el virus variolovacunal se puede usar de forma conveniente para proporcionar expresión o coexpresión inducible, transitoria de uno o más polipéptidos descritos en el presente documento en las células huésped de un organismo. En este sistema concreto, las células se infectaron primero in vitro con un virus variolovacunal recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta polimerasa exhibe una especificidad exquisita en cuanto a que solo transcribe moldes que llevan promotores de T7. Tras la infección, las células se transfectan el polinucleótido o los polinucleótidos de interés dirigido(s) por un promotor de T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus variolovacunal recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que después es traducido al polipéptido por la maquinaria de traducción del huésped. El procedimiento proporciona una producción citoplásmica transitoria y de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véanse, por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743 - 6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122 - 8126.

Como alternativa, los poxvirus aviares, tales como los virus de la viruela aviar y de la viruela de canario, también se pueden usar para liberar las secuencias de codificación de interés. Se sabe que los virus de la viruela aviar recombinantes, que expresan inmunogenes de patógenos de mamífero, confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector del virus de la viruela aviar es particularmente deseable en especies humanas y de otros mamíferos ya que los miembros del género Avipox solo se replican de forma productiva en especies de aves susceptibles y por tanto no son infectivos en células de mamífero. Los procedimientos para producir virus de la viruela aviar recombinante son conocidos en la técnica y emplean recombinación genética, como se ha descrito anteriormente con respecto a la producción de virus variolovacunales. Véase, por ejemplo, los documentos WO 91/12882, WO 89/03429 y WO 92/03545.

También se pueden usar cualquiera de una serie de vectores alfavirus para liberar composiciones de polinucleótidos para usar como se ha descrito en el presente documento, tales como los vectores descritos en las patentes de EE.UU. N.°: 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. Determinados vectores basados en la encefalitis equina venezolana (EEV) también se pueden usar y ejemplos ilustrativos de los mismos se pueden encontrar en las patentes de EE.UU. N.°: 5.505.947 y 5.643.576.

Además, también se pueden usar vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866 - 6869 y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099 - 6103, para la liberación génica conforme a la invención.

Información ilustrativa adicional sobre estos y otros sistemas de liberación basados en virus conocidos se pueden encontrar en, por ejemplo, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317 - 321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86 - 103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17 - 21, 1990; las Patentes de EE.UU. N.°s: 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; el documento WO 89/01973; la patente de EE.UU. N.°: 4.777.127; el documento GB 2.200.651; el documento EP 0.345.242; el documento WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616 - 627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431 - 434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215 - 219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498 - 11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838 - 2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202 - 1207, 1993.

Los microorganismos vivos recombinantes descritos anteriormente pueden ser virulentos o pueden atenuarse de diversos modos para obtener vacunas con microorganismos vivos. Dichas vacunas con microorganismos vivos también forman parte de la invención.

En determinados casos, un polinucleótido se puede integrar en el genoma de una célula diana. Esta integración puede realizarse en una ubicación y orientación específicas mediante recombinación homóloga (sustitución génica) o puede integrarse en una ubicación inespecífica aleatoria (aumento génico). En otros casos adicionales, el polinucleótido puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento episómico separado de ADN. Dichos segmentos polinucleotídicos o “episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y replicación independiente o sincronizada con el ciclo de la célula huésped. El modo en que la construcción de la expresión se libera en una célula y donde permanece en la célula el polinucleótido depende del tipo de construcción de expresión usada.

En otro caso de la invención, se administra/libera un polinucleótido como ADN “desnudo”, por ejemplo como se describe en Ulmer et al., Science 259:1745 - 1749, 1993 y se revisa por Cohen, Science 259:1691 - 1692, 1993. La captación de ADN desnudo puede aumentarse recubriendo esferas biodegradables con el ADN, que se transportan de forma eficiente dentro de las células.

En otro caso más, se puede liberar una composición mediante un abordaje de bombardeo de partículas, muchos de las cuales se han descrito. En un ejemplo ilustrativo, se puede alcanzar aceleración de partículas dirigida por gas con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Phanmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), algunos ejemplos de los cuales se describen en las patentes de Ee .UU. N.°s: 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807; y la Patente EP N.°: 0500 799. Esto enfoque ofrece un abordaje de administración sin aguja en el que una formulación en polvo seco de partículas microscópicas, tal como un polinucleótido o partículas polipeptídicas, se acelera a alta velocidad en un chorro de gas helio generado por un dispositivo manual, que propulsa las partículas hacia un tejido diana de interés.

En una realización relacionada, otros dispositivos y procedimientos que pueden ser útiles para inyección sin aguja dirigida por gas de composiciones de la presente invención incluyen los proporcionados por

Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales se describen en las patentes de EE.UU. N.°s: 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163, 5.520.639 y 5.993.412.

Vacunas

En una realización preferida, la composición inmunógena de la invención se mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable, más preferentemente con un adyuvante para formar una vacuna. Por tanto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una composición inmunógena de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las vacunas de la presente invención están preferentemente adyuvadas. Adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, magnesio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados, polisacáridos derivados catiónica o aniónicamente o polifosfacenos.

Se prefiere seleccionar el adyuvante de modo que sea un inductor preferente de una respuesta de tipo TH1 o TH2. Niveles elevados de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunitarias celulares a un antígeno dado, mientras que niveles elevados de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al antígeno.

Es importante recordar que la distinción entre las respuestas inmunitarias Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. No obstante, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo descrito en los clones de linfocitos T CD4 ve por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág. 145 - 173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 se asocian con la producción de las citocinas INF-y e IL-2 por parte de los linfocitos T. Otras citocinas a menudo asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo Th1 no son producidas por los linfocitos T, tales como la IL-12. En contraste con ello, las respuestas de tipo Th2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Sistemas adyuvantes adecuados que estimulan una respuesta predominantemente de tipo TH1 incluyen: lípido A monofosforilo o un derivado del mismo, en particular el monofosforilo lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para su preparación véase el documento GB 2220211 A); y una combinación de monofosforilo lípido A, preferentemente monofosforilo lípido A 3-des-O-acilado, junto con una sal de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite en agua. En dichas combinaciones, el antígeno y el 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras particuladas, lo que permite una liberación más eficiente de las señales antigénicas e inmunoestimuladoras. En los estudios se ha demostrado que el 3D-MPL es capaz de potenciar adicionalmente la inmunogeneicidad de un antígeno adsorbido sobre alúmina [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708 - 14; EP 689454-B1].

Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y 3D-MPL, como se divulga en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva con colesterol, como se divulga en el documento WO 96/33739. Una formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida. Preferentemente, la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferentemente QS21. La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol (documento WO 95/17210). Un procedimiento para producir una formulación de vacuna comprende mezclar una proteína descrita en el presente documento junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL Los oligonucleótidos que contienen CpG no metilada (documento WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta TH1 y son adecuados para su uso en la presente invención.

Composiciones preferidas de la invención son las que forman una estructura de liposoma. Las composiciones en las que la fracción esterol/saponina inmunológicamente activa forma una estructura ISCOM también forman un aspecto de la invención.

La proporción QS21 : Esterol normalmente será del orden de 1 : 100 a 1: 1 en peso:peso. Preferentemente hay un exceso de esterol, siendo la proporción de QS21 : esterol de al menos 1: 2 en peso/peso. Normalmente para la administración a seres humanos QS21 y esterol estarán presentes en una vacuna en el intervalo de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 100 |jg, preferentemente de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 50 |jg por dosis.

Preferentemente los liposomas contienen un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que es preferentemente, no cristalino a temperatura ambiente, por ejemplo, fosfatidilcolina de yema de huevo, dioleoilfosfatidilcolina dilaurilfosfatidilcolina. Los liposomas pueden también contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura de liposoma-QS21 para liposomas compuestos por lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado es, preferentemente, 1 - 20 % peso/peso, lo más preferentemente 5 - 10 %. La proporción entre esterol y fosfolípidos es 1 - 50 % (mol/mol), lo más preferentemente 20 - 25 %.

Preferentemente, las composiciones de la invención contienen MPL (monofosforilo lípido A 3-desacilado, también conocido como 3D-MPL). El 3D-MPL se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi) como una mezcla de 3 tipos de monofosforil lípido A Des-O-acilado con 4, 5, o 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Immunochem., Montana. Una forma preferida se divulga en la solicitud de patente internacional 92/116556.

Las composiciones adecuadas de la invención son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sin MPL y después se añade MPL, preferentemente como partículas de 100 nm. Por tanto el MPL no está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL externo). Las composiciones en las que el MPL está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL interno) también forman un aspecto de la invención. El antígeno puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Preferentemente los antígenos solubles están fuera y los antígenos hidrófobos o lipidados están contenidos dentro o fuera de la membrana.

Las preparaciones de vacunas de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a infección estafilocócica, por medio de administrar dicha vacuna por medio de una vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosal en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. Se prefiere la administración intranasal de las vacunas para el tratamiento de la neumonía o de la otitis media (ya que el transporte nasofaríngeo de los neumococos se puede prevenir con más eficacia y de este modo, se atenúa la infección en su estadio más temprano). Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis única, los componentes de la misma también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o a tiempos diferentes (por ejemplo, los polisacáridos neumocócicos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración de cualquier componente de la proteína bacteriana de la vacuna para una coordinación óptima de las respuestas inmunitarias unas con respecto de otras). Para la administración conjunta, el adyuvante Th1 opcional puede estar presente en cualquiera o en todas las administraciones diferentes, aunque se prefiere que esté presente en combinación con el componente proteico bacteriano de la vacuna. Además de una única vía de administración, se pueden usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, los polisacáridos se pueden administrar por vía intramuscular (o intradérmica) y las proteínas bacterianas se pueden administrar por vía intranasal o intradérmica. Además, las vacunas de la invención se pueden administrar intramuscularmente para las dosis primeras e intranasalmente para las dosis de refuerzo.

La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos en los vacunados típicos. Tal cantidad variará en función de qué inmunógeno específico se emplea y de la manera en que se presente. Generalmente cabe esperar que cada dosis comprenda 0,1-100 |jg de cada polisacárido, preferentemente 0,1 - 50 |jg para los conjugados de polisacáridos, preferentemente 0,1 - 10 jg, más preferentemente 1 - 10 jg, de los cuales 1 a 5 jg es un intervalo más preferido.

El contenido de antígenos proteicos en la vacuna normalmente estará en el intervalo de 1 - 100 |jg, preferentemente 5 - 50 jg, lo más habitualmente en el intervalo de 5 - 25 jg. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

La preparación de las vacunas está descrita en general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nueva York”). La encapsulación en liposomas la describe Fullerton, en la Patente de EE.UU. 4.235.877.

Las vacunas de la presente invención se pueden almacenar en solución o liofilizadas. Preferentemente la solución está liofilizada en presencia de un azúcar, tal como sacarosa, trehalosa o lactosa. Todavía es más preferible que estén liofilizadas y se reconstituyan de forma extemporánea antes de usar. La liofilización puede tener como resultado una composición más estable (vacuna) y posiblemente, puede conducir a títulos de anticuerpos más altos en presencia de 3D-MPL y en ausencia de un adyuvante a base de aluminio.

Anticuerpos e inmunización pasiva

nción o tratamiento de la infección por estafilococos se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las etapas de inmunizar un receptor con la vacuna de la invención y aislar la inmunoglobulina del receptor. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable se podrían usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la enfermedad estafilocócica. Un procedimiento para el tratamiento o prevención de la enfermedad estafilocócica comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de la preparación farmacéutica.

Normalmente los inóculos para la producción de anticuerpos policlonales se preparan dispersando la composición antigénica en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como solución salina u otros adyuvantes adecuados para uso humano con el fin de formar una composición acuosa. Una cantidad inmunoestimuladora del inóculo se administra a un mamífero y después el mamífero inoculado se mantiene durante un tiempo suficiente para que la composición antigénica induzca anticuerpos protectores.

Los anticuerpos se pueden aislar en la medida deseada mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de afinidad (Harlow and Lane Antibodies; a laboratory manual 1988).

Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de antisueros a partir de diversos animales de uso habitual, por ejemplo cabras, primates, burros, cerdos, caballos, cobayas, ratas o seres humanos. Los animales se mezclan y se recupera el suero.

Una inmunoglobulina producida como se ha descrito en el presente documento puede incluir anticuerpos enteros, fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas enteras de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad doble por dos o más antígenos descritos en el presente documento. También pueden ser fragmentos por ejemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares incluyendo fragmentos híbridos. Una inmunoglobulina también incluye proteínas naturales, sintéticas o modificadas genéticamente que actúan como un anticuerpo por unión a antígenos específicos para formar un complejo.

Una vacuna de la presente invención se puede administrar a un receptor que después actúa como fuente de inmunoglobulina, producida en respuesta a la exposición de la vacuna específica. Un sujeto tratado de este modo donaría plasma del que se obtendría globulina hiperinmune mediante metodología de fraccionamiento en plasma. La globulina hiperinmune se administraría a otro sujeto con el fin de conferir resistencia contra una infección por estafilococos o tratar la misma. Las globulinas hiperinmunes son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de la enfermedad estafilocócica en lactantes, individuos inmunocomprometidos o cuando se requiera tratamiento y no haya tiempo para que el individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación.

Una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos; preferentemente humanos o humanizados) reactivos contra al menos dos constituyentes de la composición inmunógena de la invención podría usarse para tratar o prevenir la infección por bacterias grampositivas, preferentemente estafilococos, más preferentemente S. aureus o S. epidermidis.

Dichas composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos monoclonales que pueden ser inmunoglobulinas enteras de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad por dos o más antígenos a los que se ha hecho referencia. También pueden ser fragmentos, por ejemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares incluyendo fragmentos híbridos.

En la técnica se conocen bien los procedimientos para fabricar anticuerpos monoclonales y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohler y Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow y Lane 1988). Como alternativa, los fragmentos Fv monoclonales se pueden obtener mediante detección selectiva de una biblioteca de expresión en fagos adecuada (Vaughan TJ et al. 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Los anticuerpos monoclonales pueden humanizarse o humanizarse parcialmente mediante procedimientos conocidos.

Procedimientos

La invención proporciona un procedimiento para preparar una vacuna que comprende las etapas de mezclar antígenos para hacer la composición inmunógena de la invención y añadir un excipiente farmacéuticamente aceptable.

T ratamiento

La invención también proporciona el uso de la composición inmunógena de la invención en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos. La infección por estafilococos, es particularmente infecciones nosocomiales adquiridas en hospital.

Esta composición inmunógena o vacuna de la invención es particularmente ventajosa para usar en los casos de cirugía programada. Dichos pacientes conocerán la fecha de la cirugía con antelación y se les podrá inocular antes. Dado que no se sabe si el paciente estará expuesto o no a la infección por S.aureus o S. epidermidis, se prefiere inocularles una vacuna de la invención que los proteja contra ambos, como se describe anteriormente. Preferentemente, los adultos mayores de 16 años de edad en espera de una cirugía programada son tratados con composiciones inmunógenas y vacunas de la invención.

También es ventajoso inocular a los profesionales sanitarios con la vacuna de la invención.

Las preparaciones de vacunas de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a infección estafilocócica por medio de administrar dicha vacuna por vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección por vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por administración mucosal en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario.

La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que incluye una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos en las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de que inmunógenos específicos se emplean y de como se presenten. El contenido de proteínas de la vacuna normalmente estará en el intervalo de 1 - 100 |jg, preferentemente 5 - 50 |jg, lo más habitualmente en el intervalo de 10 - 25 |jg. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 0,1-100 |jg del polisacárido cuando esté presente, preferentemente 0,1 - 50 jg, preferentemente 0,1 - 10 jg, de los cuales 1 a 5 jg es el intervalo más preferido. Una cantidad óptima para una vacuna concreta se puede determinar mediante estudios convencionales que implican observación de respuestas inmunitarias adecuadas en los sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

Aunque las vacunas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, la administración de las vacunas descritas en la piel (i.d.) forma un caso. La piel humana comprende una cutícula externa “espinosa”, denominada estrato córneo, que reviste la epidermis. Debajo de esta epidermis hay una capa llamada la dermis que a su vez reviste el tejido subcutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna en la piel y en particular en la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, que también puede estar asociada con una serie de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas en el presente documento es por tanto una vía preferida.

La técnica convencional de inyección intradérmica, el "procedimiento de mantoux”, comprende las etapas de limpiar la piel y después, estirando con una mano y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (calibre 26 - 31) hacia arriba, se inserta la aguja en un ángulo de entre 10 - 15°. Una vez que el bisel de la aguja se ha insertado, se baja el émbolo y se hace avanzar proporcionando al mismo tiempo una ligera presión para elevarlo debajo de la piel. Después, el líquido se inyecta muy despacio formando una vesícula o bulto sobre la superficie de la piel, seguido de una lenta retirada de la aguja.

Más recientemente se han descrito dispositivos específicamente diseñados para administrar agentes líquidos en o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en los documentos WO 99/34850 and EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos en, por ejemplo, los documentos WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520 , 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Procedimientos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones de la vacuna pueden incluir jeringuillas y agujas convencionales diseñadas para administración balística de vacunas sólidas (documento WO 99/27961) o parches transdérmicos (documentos WO 97/48440; WO 98/28037); o aplicados a la superficie de la piel (administración transdérmica o transcutánea, documentos WO 98/20734; WO 98/28037).

Cuando las vacunas de la presente invención se van a administrar a la piel o, más específicamente en la dermis, la vacuna está en un volumen de líquido bajo, en particular un volumen entre aproximadamente 0,05 ml y 0,2 ml. El contenido de antígenos en la piel o vacunas intradérmicas de la presente invención puede ser similar a las dosis convencionales como se encuentran en las vacunas intramusculares (véase anteriormente). No obstante, es una característica de las vacunas en la piel o intradérmicas que las formulaciones puedan ser de “dosis baja”. De acuerdo con lo anterior, los antígenos proteicos en las vacunas de “dosis baja” están presentes preferentemente en tan poco como de 0,1 a 10 jg, preferentemente de 0,1 a 5 jg por dosis; y los antígenos polisacáridos (preferentemente conjugados) pueden estar presentes en el intervalo de 0,0 1 - 1 jg y preferentemente, entre 0,0 1 a 0,5 jg de polisacárido por dosis.

Como se usa en el presente documento, la expresión "administración intradérmica” quiere decir la administración de la vacuna en la región de la dermis en la piel. No obstante, la vacuna no necesariamente se localizará exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa de la piel localizada entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 2,0 mm de la superficie en la piel humana, pero existe una cierta cantidad de variación entre individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar alcanzar la dermis a 1,5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato córneo y la epidermis en la superficie y la capa subcutánea de debajo. Dependiendo del modo de administración, la vacuna puede localizarse en última instancia única o principalmente dentro de la dermis, o en última instancia se puede distribuir en la epidermis y la dermis. Una realización preferida de la invención es el uso de una composición inmunógena de la invención en la fabricación de una vacuna para impedir o tratar la infección por estafilococos mediante un procedimiento que comprende la etapa de administrar la vacuna a un paciente que lo necesite.

En una forma de realización preferida, el paciente está en espera de una cirugía electiva.

Una realización preferida adicional de la invención es un uso de la composición inmunógena de la invención en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos, preferentemente la infección por estafilococos posquirúrgica.

La expresión “infección por estafilococos” abarca la infección causada por S. aureus y/o S. epidermidis y otras cepas de estafilococos capaces de producir infección en un mamífero, preferentemente un huésped humano.

Los autores de la invención pretenden que las expresiones “que comprende”, “comprenden” y “comprende” en el presente documento sean opcionalmente sustituibles por las expresiones “que consiste en”, “consisten en" y “consiste en”, respectivamente, en cada caso.

Con el fin de que esta invención se entienda mejor, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención de ningún modo. Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción de plásmido para expresar proteínas recombinantes

A: Clonación

Los sitios de restricción adecuados introducidos mediante ingeniería en los oligonucleótidos específicos del gen de estafilococos permitieron la clonación direccional del producto de la PCR en el plásmido de expresión en E. coli pET24d o pQE-30 de modo que se pudo expresar una proteína como proteína de fusión que contenía un marcador de (His)6 para la cromatografía de afinidad en el extremo N o C.

Los cebadores usados fueron:

Toxina alfa - 5'-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3' y 5'CCCAAGCTTTTAATTTGT CATTT CTTCTTTTT C-3'

EbpS - 5'-CGCGGATCCGCT GGGT CT AAT AATTTT AAAGAT G-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGGAAT AACGATTTGTT G-3'

ClfA - 5'-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3' y 5'CCCAAGCTTTTACT CT GGAATTGGTTCAATTTC-3'

FnbA - 5'-CGCGGATCCACACAAACAACT GCAACT AACG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGCTTT GT GATT CTTTTT CAAAC3'

Sbi - 5'-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' y 5'GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3' SdrC - 5'-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3' SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3' Ebh - 5'-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3' y 5'AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3'

Aaa - 5'-GCGCGCCATGGCACAAGCTT CTACACAACAT AC-3' y 5'GCGCGCTCGAGAT GGATGAAT GCAT AGCTAGA-3'

IsaA - 5'-GCATCCAT GGCACCAT CACCATCACCACGAAGT AAACGTTGAT CAAGC-3' y 5'-AGCACTCGAGTT AGAATCCCCAAGCACCT AAACC-3'

HarA - 5'-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' and 5'TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3' Autolisina glucosaminidasa - 5'-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3' y 5'-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3'

Autolisina amidasa - 5'-AGCT CAT AT GGCTTAT ACT GTTACT AAACC-3' y 5'GCGCCTCGAGTTT ATATT GT GGGAT GTCG-3'

IsdA - 5'-CAAGT CCCATGGCAACAGAAGCT ACGAACGCAAC-3' y 5'ACCAGT CTCGAGT AATTCTTTAGCTTT AGAGCTT G-3'

IsdB - 5'-T ATTCTCGAGGCTTTGAGTGT GTCCAT CATTTG-3' y 5' GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3'

MRPII - 5'-GATT ACACCAT GGTT AAACCT CAAGCGAAA-3' y 5'AGGT GT CTCGAGT GCGATTGT AGCTTCATT-3' Los productos de la PCR se introdujeron primero en el vector de clonación pGEM-T (Novagen) usando células bacterianas Top10 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta construcción intermedia se realizó para facilitar la posterior clonación en un vector de expresión. Los transformantes que contienen el inserto de ADN se seleccionaron mediante análisis con enzimas de restricción. Tras la digestión, un alícuota de ~20 pl de la reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa (0,8 % de agarosa en un tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Un ADN de tamaño molecular estándar (marcador de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con las muestras problema y se usó para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN, El plásmido purificado de los transformantes seleccionados para cada clonación se digirió después secuencialmente por completo con las enzimas de restricción adecuadas siguiendo las recomendaciones del fabricante (Life Technologies). Después el fragmento de ADN digerido se purificó usando columnas giratorias de gel de sílice antes de la unión en el plásmido pET24d o pQE-30. La clonación de Ebh (fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atlamidasa, Atl-glucosamina, MRP, IsaA se llevó a cabo usando el plásmido pET24d y la clonación de ClfA, SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, toxina alfa y Sbi se llevó a cabo usando el plásmido pQE-30.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pET24d o pQE-30 para la unión, se digirió de manera similar por completo con las enzimas de restricción adecuadas. Se usó un exceso molar de aproximadamente 5 veces de los fragmentos digeridos para qye se usase el vector preparado para programar la reacción de unión. Se realizó una reacción de unión estándar de ~ 20 |jl (~ 16 °C, ~ 16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica, usando la T4 ADN ligasa (~ 2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la unión (~5 jl) se usó para transformar células M15(pREP4) o BT21::DE3 electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en al técnica. Después de un período de crecimiento de ~ 2 - 3 horas a 37 °C en ~ 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 jg/ml) y/o kanamicina (30 jg/ml). En la selección se incluyeron antibióticos. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C durante ~16 horas. Se escogieron colonias individuales ApR/KanR con mondadientes estériles y se usaron para inocular “parches” en placas de ApR/KanR en LB reciente así como ~ 1,0 ml de caldo de cultivo de Ap/Kan en LB. Tanto las placas de parche como el caldo de cultivo se incubaron durante toda la noche a 37 °C en un incubador estándar (placas) o en un baño de agua en agitación. Se empleó un análisis de PCR basado en células enteras para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN. Aquí, el ~ 1,0 ml de caldo de cultivo de Ap/Kan en LB durante toda la noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (~ 3 minutos, temperatura ambiente, ~ 12.000 x g). El sedimento celular se suspendió en ~ 200 j l de agua estéril y se usó una alícuota de ~ 10 j l para programar una reacción de PCR de ~ 50 j l de volumen final que contenía cebadores de amplificación tanto directos como inversos. La etapa inicial de desnaturalización a 95°C se incrementó hasta 3 minutos para asegurar la rotura térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN del plásmido. Un ciclador térmico modelo 9700 de ABI y un perfil de amplificación térmica de tres etapas, 32 ciclos, es decir 95 °C, 45 segundos, 55-58 °C, 45 segundos, 72 °C 1 minuto, se usaron para amplificar el fragmento de PCR BASB201 a partir de las muestras transformantes lisadas. Tras la amplificación térmica, una alícuota de ~20 |jl de la reacción se analizó por electroforesis en gel de agarosa (0,8 % de agarosa en un tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. En paralelo con las muestras problema se sometió a electroforesis un ADN de tamaño molecular estándar (marcador de 1 Kb, Life Technologies) y se usó para estimar el tamaño de los productos de la PCR, Los transformantes que producían el producto de PCR de tamaño previsto se identificaron como cepas que contenían una construcción de expresión proteica. El plásmido de expresión que contenía las cepas se analizó después para detectar expresión inducible de proteína recombinante.

C: Análisis de la expresión de los transformantes positivos en la PCR

Un alícuota del cultivo de siembra durante toda la noche (~ 1,0 ml) se inoculó en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía ~ 25 ml de caldo de Ap/Kn en LB y se cultivó a 37°C con agitación (~ 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D. O. a 600 de ~ 0,5, es decir, fase semilogarítmica (usualmente aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (~ 12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de proteína recombinante mediante la adición de IPTG (solución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación de tanto los cultivos inducidos con IPTG como los no inducidos continuó durante ~ 4 horas adicionales a 37°C con agitación. Las muestras (~1,0 ml) de cultivos tanto inducidos como no inducidos se retiraron después del período de inducción y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante ~ 3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se suspendieron en ~ 50 j l de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra de SDS-PAGE de Laemelli 2 x que contenía 2-mercaptoetanol y se introdujeron en un baño de agua en ebullición durante ~ 3 minutos para desnaturalizar la proteína. Volúmenes iguales (~ 15 jl) de lisados celulares tanto inducidos por IPTG en bruto como no inducidos se cargaron por duplicado en gel de poliacrilamida Tris/glicina al 12 % (Minigeles de 1 mm de espesor, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón estándar. Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de carrera SDS/Tris/glicina (Bio Rad). Tras la electroforesis, un gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R250 (BioRad) y después se decoloró para visualizar las nuevas proteínas inducibles mediante IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVD^f (tamaño de poro 0,4 micrómetros, Novex) durante ~ 2 horas a 4 °C usando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol (20 %) de Towbin. El bloqueo de las incubaciones de membrana y de anticuerpos se realizó de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido de un segundo anticuerpo anti­ ratón de conejo conjugado con HPR (QiaGen) se usó para confirmar la expresión y la identidad de la proteína recombinante. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se logró bien usando un sustrato insoluble en ABT o bien usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

Ejemplo 2: Producción de proteínas recombinantes

Cepa bacteriana

Para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli M15(pREP4) que contenía un plásmido (pQE60) o BL21::DE3 que contenía el plásmido pET24d que codificaba la proteína estafilocócica.

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante consistió en caldo 2X YT (Difco) que contenía 100 |jg/ml de Ap y/o 30 |jg/ml de Km. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante se añadió al fermentador IPTG (isopropilo I3-D-Tiogalactopiranósido) (1 mM, final).

Producción de proteínas recombinantes

En condiciones nativas

El IPTG se añadió a una concentración final de 1mM y el cultivo se sembró durante 4 horas adicionales. El cultivo se centrifugó después a 6.000 rpm durante 10 minutos y el sedimento se suspendió en tampón fosfato (K2HPO4 50 mM, KH2PO4 pH 7) incluyendo un cóctel de inhibidores de la proteasa. Esta muestra se sometió a lisis con presión francesa usando una presión de 150 MPa (1500 bar) (2 ciclos). Tras la centrifugación durante 30 minutos a 15.000 rpm, el sobrenadante se reservó para purificación adicional y se añadió NaCl hasta 0,5 M. A continuación se cargó la muestra en una resina de Ni-NTA (columna XK 16 Pharmacia, resina de Ni-NTA Qiagen) acondicionada en K2HPO4 50 mM KH2PO4 pH 7. Después de cargar la muestra, la columna se lavó con tampón A (NaH2PO4 0,2 M pH 7, NaCl 0,3 M, 10 % de glicerol). Para eluir la proteína unida se usó un gradiente por etapas en el que al tampón A se añadieron diferentes proporciones de tampón B (NaH2PO40,2 M, pH 7, NaCl 0,3 M, glicerol al 10 % e imidazol 200 mM). La proporción del tampón B se aumentó gradualmente del 10 % al 100 %. Después de purificar, la fracción eluída que contiene la proteína se combinó, se concentró y se dializó frente a KH2PO40,002M /K2HPO4 pH7, NaCl 0,15M.

Este procedimiento se usó para purificar ClfA, SdrG, IsdA, IsaB, HarA, Atl-glucosamina y toxina alfa.

En condiciones desnaturalizantes

El IPTG se añadió a una concentración final de 1 mM y el cultivo se sembró durante 4 horas adicionales. El cultivo se centrifugó después a 6.000 rpm durante 10 minutos y el sedimento se suspendió en tampón fosfato (K2HPO450 mM, KH2PO4 pH 7) incluyendo un cóctel de inhibidores de la proteasa. Esta muestra se sometió a lisis con presión francesa usando una presión de 150 MPa (1500 bar) (2 ciclos). Tras la centrifugación durante 30 minutos a 15.000 rpm, el sedimento se lavó con tampón fosfato, incluyendo urea 1 M. La muestra se centrifugó durante 30 minutos a 15.000 rpm y el sedimento se resuspendió en urea 8 M, NaH2PO40,1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 0,01 M a pH 8 y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente. La muestra se centrifugó durante 20 minutos a 15000 rpm y el sobrenadante se recogió para su purificación adicional. Después se cargó la muestra en una resina de Ni-NTA (columna XK 16 Pharmacia, resina de Ni-NTA Qiagen) acondicionada en urea 8 M, NaH2PO4, 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 0,01 M pH 8. Después del paso del caudal, la columna se lavó sucesivamente con tampón A (urea 8 M, NaH2PO40,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,01 M, pH 8,0), tampón C (Urea 8 M, NaH2PO40,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,01 M, pH 6,3), tampón D (Urea 8 M , NaH2PO40,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,01 M, pH 5,9) y tampón E (Urea 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,01 M, pH 4,5). La proteína recombinante se eluyó de la columna durante los lavados con tampón D y E. La proteína recombinante desnaturalizada se pudo solubilizar en una solución desprovista de urea. Para este fin, la proteína desnaturalizada contenida en urea 8 M se dializó sucesivamente contra urea 4 M, Na2PO4 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,1, urea 2 M, NaH2PO40,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,1, arginina 0,5 M y KH2PO40,002 M/K2HP pH 7,1, NaCl 0,15M, arginina 0,5 M.

Este procedimiento se usó para purificar Ebh (fragmento H2), AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidasa e IsaA.

Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE. Los resultados para una proteína en condiciones nativas (toxina alfa) y una proteína purificada en condiciones desnaturalizantes (SdrC) se muestran en las Figuras 3 y 4.

Ejemplo 3 - Preparación de polisacáridos

El PIA (PNAG) se prepara como se describe en Joyce et al. 2003, Carbohydrate Research 338; 903 - 922.

Los polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 se extraen de S. aureus como se describe en Infection and Immunity 58(7); 2367.

Química de activación y acoplamiento:

El polisacárido nativo se disuelve en NaCl 2 M o en agua. La concentración óptima del polisacárido se evalúa para todos los serotipos y está entre 2 mg/ml y 5 mg/ml.

De una solución madre de 100 mg/ml en acetonitrilo se añade CDAP (proporción CDAP/PS: 0,75 mg/mg PS) a la solución de polisacárido, 1,5 minutos después se añade trietilamina 0,2 M para obtener el pH de activación específico (pH 8,5 -10,0). La activación del polisacárido se realiza a este pH durante 2 minutos a 25 °C. La proteína transportadora se añade al polisacárido activado en una cantidad suficiente para dar una proporción molar de 1/1 y la reacción de acoplamiento se realiza al pH específico durante 1 hora.

Después, la reacción se inactiva con glicina durante 30 minutos a 25 °C y durante la noche a 4 °C.

Los conjugados se purifican mediante filtración en gel usando una columna de filtración en gel Sephacryl 500HR equilibrada con NaCl 0,2 M.

Se determina el contenido de hidratos de carbono y proteínas de las fracciones eluidas. Los conjugados se combinan y se filtran en esterilidad en una membrana de esterilización de 0,22 |jm. Se determinan las proporciones PS/Proteína en las preparaciones del conjugado.

Caracterización:

Cada conjugado se caracteriza para determinar el contenido de proteínas y polisacárido.

El contenido de polisacárido se mide mediante la prueba del resorcinol y el contenido de proteínas mediante la prueba de Lowry. La proporción final de PS/PD (peso/peso) se determina mediante la proporción de las concentraciones.

Contenido residual de DMAP (ng/ pg de PS):

La activación del polisacárido con CDAP introduce un grupo cianato en el polisacárido y se libera DMAP (4-dimetilaminopiridina). El contenido residual de DMAP se determina mediante un ensayo específico desarrollado y validado en GSK.

Contenido de polisacárido libre (%):

El contenido de polisacárido libre de los conjugados mantenidos a 4 °C o almacenados 7 días a 37 °C se determina en el sobrenadante obtenido tras la incubación con anticuerpos a-vehículo y sulfato amónico saturado, seguido de una centrifugación.

Se usa un ELISA de a-PS/a-PS para la cuantificación del polisacárido libre en el sobrenadante. La ausencia de conjugado también se controla mediante un ELISA de a-vehículo/a-PS.

Ejemplo 4 Formulación

Composiciones adyuvantes

La proteína, bien individualmente o bien de forma conjunta, de los ejemplos anteriores se puede formular con la combinación de polisacáridos de estafilococos y como adyuvante, la formulación puede comprender una mezcla de monofosforilo lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) e hidróxido de aluminio o de monofosforilo lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) y fosfato de aluminio, o 3D-MPL y/o QS21 opcionalmente en una emulsión de aceite/agua y formulado opcionalmente con colesterol, o sal de aluminio sola, preferentemente fosfato de aluminio.

3D-MPL: es una forma químicamente destoxificada del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria gramnegativa Salmonella minnesota.

Los experimentos realizados en GSK Biologicals han demostrado que 3D-MPL combinado con varios vehículos potencia fuertemente la inmunidad humoral y la inmunidad celular de tipo Th1.

QS21: es una saponina purificada de un extracto en bruto de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina, que tiene una fuerte actividad adyuvante: induce la linfoproliferación específica de antígeno y los LTC frente a varios antígenos.

La vacuna que contiene un antígeno de la invención que contiene 3D-MPL y alumbre se puede preparar de un modo análogo al descrito en los documentos WO93/19780 o 92/16231.

Los experimentos realizados en GSK Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de las combinaciones de 3D-MPL y QS21 en la inducción de las respuestas inmunitarias tanto humoral como celular de tipo TH1. Las vacunas que contienen un antígeno, dichos antígenos se describen en el documento US 5750110.

Una emulsión de aceite/agua puede estar compuesta por 2 aceites (un tocoferol y un escualeno) y por PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía 5 % de escualeno, 5 % de tocoferol, 0,4 % de Tween 80 y tenía un tamaño medio de partícula de 180 nm y se conoce como SB62 (véase el documento WO 95/17210).

En los experimentos realizados en GSK Biologicals se ha demostrado que la unión de esta emulsión de Ac/A con MPL/QS21 incrementa de forma adicional sus propiedades de inmunoestimulación.

Preparación de la emulsión SB62 (concentrado por 2)

El Tween 80 se disuelve en solución salina tamponada con fosfato (PBS), para dar una solución al 2 % en PBS. Para proporcionar 100 ml, una emulsión concentrada multiplicada por dos, 5 g de DL alfa tocoferol y 5 ml de escualeno se agitan en vórtex para mezclar íntimamente. Se añaden 90 ml de la solución PBS/Tween y se mezclan completamente. La emulsión resultante se pasa después por una jeringuilla y por último, se microfluidiza usando una máquina M110S Microfluidics. Las gotas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm. Ejemplo 5

Experimentos con animales.

Ratones CD-1 hembra de 8 a 10 semanas de edad se obtienen de Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para estudios de letalidad, cinco grupos de 9 a 11 ratones CD-1 se expusieron por vía intraperitoneal (i.p.) con diluciones en serie de S. aureus cultivados en placas de CSA. Los tamaños del inóculo varían de ~1010 to 108 UFC/ratón. La mortalidad se evalúa a diario durante 3 días. Las dosis letales al 50 % (DL⁵⁰) se estiman usando un modelo de probabilidad de la relación dosis-respuesta. La hipótesis nula de las DL⁵⁰ comunes se analizó mediante la prueba del cociente de verosimilitudes. La bacteremia subletal se inicia exponiendo grupos de 8 a 20 ratones por vía intravenosa (i.v.) a ~ 2 x 106 UFC/ratón o por vía i.p. a ~ 2 x 107 UFC/ratón. Después de la inoculación, se extrae sangre en grupos separados de animales de la cola a tiempos especificados y se estiman los niveles de bacteremia mediante recuentos cuantitativos de las placas por duplicado en placas de agar de soja tríptica con 5 % de sangre bovina (Becton Dickinson Microbiology Systems). La significación estadística se determina con la modificación de Welch de la prueba t de Student no apareada.

Ejemplo 6

Metodología general de la determinación de respuestas de anticuerpos en varios mamíferos

Se analizaron los sueros para determinar los anticuerpos IgG frente a los polisacáridos de estafilococos mediante un ELISA. Brevemente, los polisacáridos capsulares purificados de la ATCC (Rockville, Md, 20852) se recubren en 25 |jg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de unión alta (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 °C. Las placas se bloquean con 10 % de suero bovino fetal (FCS), 1 hora a 37 °C. Las muestras de suero se preincuban con 20 jg/ml del polisacárido de la pared celular (Statens Serum Institute, Copenhage) y 10 % de FCS a temperatura ambiente durante 30 minutos para neutralizar los anticuerpos frente a este antígeno. Después, las muestras se diluyen dos veces en la microplaca en 10 % de FCS en PBS y se equilibran a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Después de lavar, las microplacas se equilibran con el anticuerpo monoclonal Fc IgG anti-humano marcado con peroxidasa (HP6043-HRP, Stratech Scientific Ltd) diluido a 1:4000 en 10 % de FCS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. El ELISA se realiza para medir la IgG de rata usando IgG anti-rata de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa (H+L) (código 112 - 035 -003) a 1:5000. Las curvas de titulación se relacionan con los sueros estándar para cada serotipo usando comparación log logística mediante SoftMax Pro. Las concentraciones del polisacárido usadas para revestir la placa de ELISA son 10 - 20 jg/ml. El color se desarrolla usando 4 mg de OPD (Sigma) por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1 M con 14 j l de H²O² durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detiene con 50 j l de HCl y la densidad óptica se lee a 490 nm relativa a 650 nm. Las concentraciones de IgG se determinan mediante referencia de los puntos de titulación a la curva de calibración modelada usando una ecuación log logística de 4 parámetros calculada mediante el software SoftMax Pro.

El ELISA para medir la IgG murina y de rata a los polisacáridos de estafilococos es similar con las excepciones siguientes. IgG (H+L) anti-ratón de cabra affiniPure conjugada con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. e IgG anti-rata de cabra AffiniPure (H+L) se usaron para detectar la IgG unida.

HP6043-HRP reacciona igual con IgG purificada de ser humano y de Rhesus, por lo que este reactivo se usa para el antisuero de Rhesus.

El ELISA de proteínas se realiza de un modo similar al ELISA del polisacárido con las modificaciones siguientes. La proteína se reviste durante la noche a 2,0 jg/ml en PBS. Las muestras de suero se diluyen en PBS que contiene 10 % de suero bovino fetal y 0,1 % de alcohol polivinílico. El anticuerpo humano unido se detecta usando anticuerpo purificado por afinidad de cabra conjugado con peroxidasa Sigma frente a la Fc de IgG humana (referencia A-2290). Ejemplo 7

Ensayo de opsonofagocitosis.

La muerte por opsonofagocitosis in vitro de S. aureus mediante leucocitos polimorfonucleares (PMN) humanos se realiza como se describe en Xu et al. 1992 Infect. Immun. 60; 1358. Los PMN humanos se preparan a partir de sangre heparinizada mediante sedimentación en 3 % de dextrano T-250. La mezcla de reacción opsónica (1 ml) contiene ~106 PMN en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal inactivado con calor, ~108 UFC de S. aureus y 0,1 ml del suero de ensayo o preparación de IgG. El suero hiperinmunizado de conejo se usa como control positivo y se usaron 0,1 ml de suero de conejo no inmune como una fuente completa para las muestras de IgG. Las mezclas de reacción se incuban a 37 °C y las muestras bacterianas se transfieren a 0, 60 y 120 min en agua y después se diluyeron, se extendieron sobre placas de agar de soja tríptica y se incubaron a 37°C para el recuento bacteriano tras la incubación durante la noche.

Ejemplo 8

Inmunogeneicidad de las proteínas estafilocócicas en ratones y conejos

Se inmunizó a los animales con proteínas estafilocócicas purificadas con el fin de generar sueros hiperinmunes. Se inmunizó a los ratones tres veces (días 0, 14 y 28) con 10 |jg de cada proteína adyuvada en Specol. Se inmunizó a los conejos tres veces (días 0, 21 y 42) con 20 jg de cada proteína adyuvada en Specol. Los sueros inmunes se recogieron y se evaluaron en ELISA de células enteras anti-proteínas y anti-muertas.

ELISA antiproteína:

La proteína purificada se recubrió a 1 jg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de unión alta (Nunc MAXISORP) durante la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Después las muestras de ensayo se diluyeron a 1/1000 y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Después de lavar, el anticuerpo unido murino o de conejo se detectó usando IgG anti-ratón de cabra (H+L) affiniPure conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115 - 035 - 003) o IgG anti-conejo de cabra (H+L) AffiniPure (ref: 11-035-003) diluida a 1:5000 en PBS-tween al 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El color se desarrolló usando 4 mg de OPD (Sigma) 5 j l de H2O2 por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1 M durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 j l de HCl y la densidad óptica se leyó a 490 nm relativa a 650 nm. La DO para una dilución a 1/1000 de Post III se comparó con la DO obtenida con la misma dilución del suero preinmune.

Los resultados generados con sueros de ratón y de conejo se presentan en la Figura 5. Se observó una buena seroconversión contra cada antígeno. La evaluación de los sueros dirigidos contra SBI se alteró debido a la actividad de unión a Ig de esta proteína.

ELISA anti-células enteras muertas:

Las células enteras muertas (inactivadas con calor o con formaldehído) de S. aureus de tipo 5 u 8 o de la cepa Hay de S. epidermidis se recibieron a 20 jg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de unión alta (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 °C con evaporación. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. La proteína A se neutralizó mediante la adición de 10 jg/ml de anti-proteína A de pollo purificada por afinidad (ICL ref.: CPA-65A-2) diluida en PBS-tween al 0,05 %, seguido de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después las muestras de ensayo se diluyeron dos veces en la microplaca en PBS al 0,05 % a partir de una dilución de partida a 1/10 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de lavar, el anticuerpo unido murino o de conejo se detectó usando IgG anti-ratón de cabra (H+L) affiniPure conjugada con peroxidadas de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115 - 035 - 003) o IgG anti-conejo de cabra (H+L) AffiniPure (ref: 11-035-003) diluida a 1:5000 en PBS-tween al 0,05 %. Estos anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El color se desarrolló usando 4 mg de OPD (Sigma) 5 j l de H²O² por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1M durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 j l de HCl y la densidad óptica se leyó a 490 nm relativa a 650 nm.

Cabe destacar que los niveles de expresión de las proteínas en estafilococos variarán en función de las condiciones de cultivo. Por tanto, un resultado negativo puede reflejar la elección de condiciones de cultivo incorrectas en lugar de una falta de inmunogeneicidad.

Los resultados usando sueros de ratón se muestran en la Tabla 5 y algunos de los gráficos se muestran en la Figura 6. Se observa un débil reconocimiento de la cepa 5 de S. aureus con los sueros dirigidos contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. El reconocimiento de la cepa 8 de S. aureus solo se observa con el suero dirigido contra Sbi. El débil reconocimiento de S. epidermidis Hay se observa con los sueros dirigidos contra Atl amidasa, MRP, IsdA, IsaA, Ebh, Aaa y Sbi.

Una selección de los resultados generados usando sueros de conejo se muestra en la Figura 7 y se resume en la Tabla 6. Se observó un reconocimiento muy bueno de las tres cepas con IsaA e IsdB. Un débil reconocimiento de las tres cepas se observó con HarA, aunque los animales solo recibieron una inyección en lugar de las tres inyecciones usadas para las otras proteínas.

Tabla 5

Tabla 6

Ejemplo 9

Eficacia de las combinaciones de proteínas estafilocócicas en un modelo de colonización nasal Quince grupos de tres ratas algodoneras se inocularon con combinaciones de ocho antígenos de estafilococos y cinco ratas algodoneras que actuaron como controles se trataron sin antígeno. Estos dieciséis grupos son los siguientes:

Grupo 1 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, AAA, toxina alfa, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi

Grupo 2 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, IsdA, IsdB, ClfA, SdrC, Ebh, FnbpA

Grupo 3 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, IsdA, MRP, IsdB, AAA, toxina alfa

Grupo 4 - Atl-glucosamina, HarA, IsdA, AAA, ClfA, IsaA, Ebh, Sbi

Grupo 5 - HarA, MRP, AAA, toxina alfa, ClfA, SdrC, Ebh, FnbpA

Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, toxina alfa, ClfA, SdrG, Sbi, FnbpA

Grupo 7 - Atl-aminidasa, IsdA, MRP, AAA, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA

Grupo 8 - Control

Grupo 9 - Atl-glucosamina, IsdA, MRP, toxina alfa, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA

Grupo 10 - Atl-glucosamina, MRP, IsdB, AAA, ClfA, IsaA, SdrC, SdrG

Grupo 11 - Atl-aminidasa, MRP, IsdB, toxina alfa, ClfA, IsaA, Ebh, Sbi

Grupo 12 - Atl-glucosamina, HarA, IsdB, toxina alfa, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA

Grupo 13 - Atl-aminidasa, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA

Grupo 14 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, MRP, ClfA, SdrG, Sbi, FnbpA

Grupo 15 - Atl-aminidasa, HarA, IsdA, toxina alfa, ClfA, IsaA, SdfC, SdrG

Grupo 16 - HarA, IsdA, MRP, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi

Cada mezcla de antígenos contenía 3 |jg de cada antígeno mezclados con un adyuvante formado por liposomas que contienen MPL y QS21. Se inoculó a las ratas algodoneras tres veces los días 1, 14 y 28 del experimento. Dos semanas después de las inmunizaciones se evaluó la eficacia de las inmunizaciones usando un ensayo de colonización nasal como se describe en Kokai-Kun et al. (2003) Antimicrob. Agents. Chemother. 47; 1589 - 1597. Se llevó a cabo un análisis de regresión lineal múltiple clásico con los datos usando el software "Design Expert 6". La presencia de un antígeno se codificó como 1 y la ausencia de un antígeno por -1. Usando la ecuación del modelo, fue posible determinar qué antígenos eran los antígenos fundamentales que produjeron una gran disminución del número de colonias por nariz.

Resultados

Los resultados del ensayo de colonización nasal se muestran en la Tabla 7. El grupo control tenía un log medio de UFC/nariz de 3,51335 y una disminución de la colonización nasal se pudo ver para todos los grupos de ratas algodoneras a las que se habían inoculado proteínas de estafilococos. Los grupos 4, 9 y 13 mostraron la mayor disminución en la colonización nasal con una disminución de más de 2 log en las UFC/nariz. Los grupos 12 y 16 también dieron buenos resultados, lo que muestra una disminución de aproximadamente 2 log en las UFC/nariz.

Tabla 7

La contribución de los antígenos específicos dentro de la mezcla antigénica se calculó usando un análisis de regresión múltiple de los datos de colonización nasal. El modelo final contiene los siete mejores antígenos. Los resultados para estos antígenos se muestran en la Tabla 8. Dentro del contexto de la mezcla de proteínas, la inclusión de HarA dio la mayor disminución de la colonización nasal, seguido de IsaA, Sbi, SdrC, autolisinaglucosamina, MRP y Ebh.

Tabla 8. Efectos en la diferencia del log de UFC/nariz y proporción de UFC/nariz para los siete mejores antígenos en

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición inmunógena que comprende:

   - ClfA estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo; y

   - SitC estafilocócico aislado o un fragmento inmunógeno del mismo.

   2. La composición inmunógena de la reivindicación 1 que comprende al menos una proteína o un fragmento inmunógeno de S. aureus.

   3. La composición inmunógena de una cualquiera de la reivindicación 1 o 2 que comprende al menos una proteína o fragmento inmunógeno de S. epidermidis.

   4. La composición inmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende además un polisacárido y oligosacárido PIA y/o polisacárido u oligosacárido capsular de tipo V y/o de tipo VIIⁱ de S. aureus. 5. La composición inmunógena de la reivindicación 4 en la que un polisacárido capsular estafilocócico está conjugado con un vehículo proteico.

   6. La composición inmunógena de la reivindicación 5 en la que el vehículo proteico está seleccionado del grupo que consiste en toxoide del tétanos, toxoide diftérico, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina y toxoide alfa.

   7. La composición inmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que puede generar una respuesta inmunitaria eficaz tanto contra S. aureus como contra S. epidermidis.

   8. Una vacuna que comprende la composición inmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

   9. Un procedimiento de fabricación de una vacuna que comprende las etapas de mezclar antígenos para preparar la composición inmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y añadir un excipiente farmacéuticamente aceptable.

   10. Un uso de la composición inmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por estafilococos.