ES2308844T3 - Vacuna de polisacaridos para infecciones estafilococidas. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un polisacárido capsular/adhesina puro que está libre en más del 92% de contaminantes que comprende: (a) extraer una preparación de polisacárido capsular/adhesina bruto a partir de un cultivo bacteriano de Estafilococos coagulasa negativos o coagulasa positivos utilizando un pH bajo y calor, (b) aislar un material enriquecido en polisacárido capsular/adhesina de elevado peso molecular de la preparación de polisacárido capsular/adhesina bruto, (c) precipitar un polisacárido capsular/adhesina impuro del material enriquecido en polisacárido capsular/adhesina de elevado peso molecular, (d) incubar el polisacárido capsular/adhesina impuro con una base para producir una preparación de polisacárido capsular/adhesina semi-puro, (e) neutralizar la preparación con un ácido, y (f) incubar la preparación neutralizada en ácido fluorhídrico para producir el polisacárido capsular/adhesina puro.

Description

Vacuna de polisacáridos para infecciones estafilocócicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de polisacáridos útiles para inducir inmunidad para la prevención de infecciones estafilocócicas. La invención también se refiere a métodos de elaboración y utilización de kits de diagnóstico y para inducir inmunidad activa o pasiva utilizando el material polisacárido y los anticuerpos para el mismo. En particular, el polisacárido es un polisacárido capsular/adhesina.

Antecedentes de la invención

Los Estafilococos son bacterias gram positivas que habitan normalmente y colonizan la piel y las membranas mucosas de los seres humanos. Si la piel o la membrana mucosa resulta dañada durante la cirugía u otro trauma, los estafilococos pueden tener acceso a tejidos internos haciendo se que desarrolle una infección. Si los estafilococos proliferan localmente o entran en el sistema linfático o sanguíneo, se pueden producir graves complicaciones infecciosas tales como las asociadas con la bacteremia estafilocócica. Las complicaciones asociadas con la bacteremia estafilocócica incluyen choque séptico, endocarditis, artritis, osteomielitis, neumonía, y abscesos en diversos órganos.

Los estafilococos incluyen tanto organismos coagulasa positivos que producen una coagulasa libre como organismos coagulasa negativos que no producen esta coagulasa libre. Staphylococcus aureus es la forma coagulasa positiva más común de los estafilococos. S. aureus causa generalmente infección en un sitio local, ya sea extravascular o intravascular, lo que puede producir por último la bacteremia. S. aureus es también una causa principal de osteomielitis aguda y causa un pequeño número de infecciones neumónicas estafilocócicas. Además, S. aureus es responsable de aproximadamente 1-9% de los casos de meningitis bacteriana y 10-15% de los abscesos en el cerebro. Existen al menos veintiuna especies conocidas de estafilococos coagulasa negativos, incluyendo S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophiticus, S. cohnii, S. xylosus, S. simulans, y S. capitis. S. epidermidis es el agente causante de infección más frecuente asociado con los dispositivos de acceso intravenosos y el producto aislado más frecuente en las bacteremias nocosomiales primarias. S. epidermidis también está asociado con la endocarditis de las válvulas protésicas.

Staphylococcus es también una fuente común de infección bacteriana en animales. Por ejemplo, la mastitis estafilocócica es un problema común en rumiantes incluyendo el ganado vacuno, las ovejas, y las cabras. La enfermedad se trata generalmente con antibióticos para reducir la infección pero el tratamiento es un procedimiento costoso y todavía produce pérdidas en la producción de leche. Las vacunas más eficaces identificadas hasta la fecha son vacunas de S. aureus vivo, intacto administradas subcutáneamente. Sin embargo, la administración de vacunas vivas está asociada con un riesgo de infección. Por esa razón, muchos investigadores han intentado producir vacunas de S. aureus muerto y/o aislar polisacáridos capsulares o componentes de la pared celular que induzcan inmunidad a S. aureus. No obstante, ninguno de estos intentos ha tenido éxito.

S. aureus incluye un componente de la pared celular compuesto por un complejo de peptidoglicano que permite al organismo sobrevivir en condiciones osmóticas desfavorables y también incluye un ácido teicoico único unido al peptidoglicano. Por fuera de la pared celular una fina cápsula de polisacárido recubre la mayoría de los productos aislados de S. aureus. Esta cápsula serológicamente distinta se puede utilizar para serotipificar diversos productos aislados de S. aureus. Se ha demostrado que muchos de los productos aislados clínicamente significativos incluyen dos tipos capsulares, CP5 y CP8.

El tipo CP5 tiene la siguiente estructura química:

\rightarrow4)-\betaD-ManpNAcA3Ac-(1\rightarrow4)-\alpha-L-FucpNAc-(1\rightarrow3)-\beta-D-FucpNAc-(1\rightarrow

El tipo CP8 tiene la siguiente estructura química:

\rightarrow3)-\beta-D-ManpNAcA4Ac-(1\rightarrow3)-\alpha-L-FucpNAc-(1\rightarrow3)-\beta-D-FucpNAc-(1\rightarrow

Los estudios sobre más de 1.600 productos aislados de S. aureus demostraron que el 93% eran de cualquiera de los polisacáridos capsulares de tipo 5 o de tipo 8. Adicionalmente, se ha demostrado que más de 80% de los productos aislados de S. aureus de ovejas, cabras, y vacas con mastitis y de pollos con osteomielitis incluyen al menos uno de estos dos tipos capsulares. Aunque CP5 y CP8 son estructuralmente similares, se ha demostrado que son inmunológicamente distintos.

Compendio de la invención

La presente invención es un método para preparar un polisacárido capsular/adhesina puro como se define en la reivindicación 1. La invención comprende un polisacárido que comprende un polisacárido/adhesina que está libre en más de 92% de contaminantes preparable de acuerdo con el método de la invención. La invención abarca una composición que comprende el polisacárido de la invención conjugado con un compuesto portador.

La descripción hace referencia a los métodos y productos para la inmunización pasiva y activa de seres humanos y animales contra la infección por estafilococos coagulasa negativos y coagulasa positivos. Se ha descubierto, que una verdadera "cápsula" de S. aureus se extiende más allá de la capa CP5 o CP8 o es producida en lugar de la capa CP5 o CP8. Este material, que es el antígeno polisacárido capsular/adhesina (PS/A), ha sido purificado casi hasta la homogeneidad y la estructura ha sido identificada. El antígeno PS/A nativo que se puede aislar a partir de Estafilococos tales como S. aureus y S. epidermis es una poliglucosamina de elevado peso molecular que está altamente sustituida con restos ácido succínico, y es referida como poli-beta-1-6-D-N-succinilglucosamina (PNSG).

Se ha encontrado que el antígeno PS/A aislado y purificado es altamente inmunogénico in vivo.

Se describe una composición de un PS/A puro que tiene la siguiente estructura:

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donde n es un número entero mayor o igual a 3, donde R se selecciona del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, -NH-(CH_{2})_{m}-COOH, y -NH_{2} donde m es 2-5, y donde al menos 10% de los grupos R se seleccionan del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH. En otros ejemplos al menos 50%, 75%, o 90% de los grupos R se seleccionan del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH. La composición se formula en forma de una vacuna. El PS/A es puro al menos en 95%, 97% o 99%. El enlace preferido del esqueleto es un enlace \beta 1-6.

La unidad monomérica de PS/A puede estar sustituida con succinato. En este ejemplo el grupo R es -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-COOH. En otros ejemplos el grupo R se selecciona del grupo que consiste en -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH,
-NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-COOH,
-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-
CH_{2}-(COOH)_{2}, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, y -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-
(COOH)_{2}. El PS/A puede estar sustituido con un solo tipo de grupo sustituyente R o con más de un tipo de grupo sustituyente R. Cuando el PS/A está sustituido con un solo tipo de grupo sustituyente R el PS/A es un polímero homosustituido. Cuando el PS/A está sustituido con más de un único tipo de grupo sustituyente R, el PS/A es un polímero heterosustituido.

El PS/A es un polímero de 3 o más unidades monoméricas repetitivas y por lo tanto puede tener un bajo peso molecular. El PS/A puede tener un peso molecular de más de 25.000, 30.000, 100.000.

La composición también puede incluir un compuesto portador conjugado con el PS/A. Cuando se utiliza el PS/A como vacuna y el PS/A tiene un peso molecular bajo se prefiere que el PS/A esté conjugado con un compuesto portador. En una realización el compuesto portador está conjugado con el PS/A a través de un conector.

En otra descripción, el PS/A está sustancialmente libre de fosfato. El PS/A está sustancialmente libre de ácido teicoico.

Se describe una composición de PS/A que tiene la siguiente estructura,

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donde n es un número entero mayor o igual a 3, donde R se selecciona del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{3-5}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, -NH-(CH_{2})_{m}-COOH, y -NH2, donde m es 2-5, y donde al menos 10% de los grupos R se seleccionan del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{3-5}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH. Al menos 50%, 75%, o 90% de los grupos R se pueden seleccionar del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{3-5}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH. La composición puede ser formulada en forma de vacuna. El enlace preferido del esqueleto es un enlace \beta 1-6.

El PS/A puede estar sustituido con un único tipo de grupo R sustituyente o con más de un tipo de grupo R sustituyente. Cuando el PS/A está sustituido con un único tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero homo-sustituido. Cuando el PS/A está sustituido con más de un único tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero hetero-sustituido.

Se describe una composición de PS/A que tiene la siguiente estructura

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donde n es un número entero mayor o igual a 3, donde R se selecciona del grupo que consiste en -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-COOH y -NH_{2} y donde entre 10 y un 90% de los grupos R son -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-COOH. En otras realizaciones preferidas entre 20 y 80%, 30 y 70%, o 40 y 60% de los grupos R son -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-COOH. La composición se puede formular en forma de vacuna. El enlace preferido del esqueleto es un enlace \beta 1-6.

El PS/A puede estar sustituido con un único tipo de grupo R sustituyente o con más de un tipo de grupo R sustituyente. Cuando el PS/A está sustituido con un único tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero homo-sustituido. Cuando el PS/A está sustituido con más de un único tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero hetero-sustituido.

Se describe una composición de PS/A compuesta por unidades monoméricas repetitivas donde la unidad monomérica se selecciona del grupo que consiste en \beta-1-6 poliglucosa, \alpha-1-4 poliglucosa, \alpha-1-3 poliglucosa, \beta-1-4 poliglucosa, \beta-1-3 poliglucosa, y \alpha-1-4 poligalactosamina y donde C2 de la unidad monomérica está sustituido con un grupo R seleccionado del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2};, -NH-(CH_{2})_{m}-COOH, y -NH_{2}, donde m es 2-5, y donde al menos 10% de los grupos R se seleccionan del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH- (CH_{2})_{m}-(COO_{H})_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH. La composición se puede formular en forma de vacuna.

Preferiblemente la unidad monomérica se selecciona del grupo que consiste en \beta-1-6 poliglucosa, \alpha-1-4 poliglucosa, \alpha-1-3 poliglucosa, \beta-1-4 poliglucosa, y \beta-1-3 poliglucosa. Preferiblemente el esqueleto de poliglucosa se encuentra en una formación 1-6. En otra realización el esqueleto de poliglucosa se encuentra en formación \beta-1-4. El esqueleto de poliglucosa se puede encontrar en formación \beta-1-3.

Al menos 50%, 75%, o 90% de los grupos R se seleccionan del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH.

La unidad monomérica de PS/A puede estar sustituida con succinato. En este caso el grupo R es -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-COOH. El grupo R se puede seleccionar del grupo que consiste en -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH,
-NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}- CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-
(COOH)_{2}, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, y -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-
(COOH)_{2}. El PS/A puede estar sustituido con un solo tipo de grupo R sustituyente o con más de un tipo de grupo R sustituyente. Cuando el PS/A está sustituido con un solo tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero homo-sustituido. Cuando el PS/A está sustituido con más de un solo tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero hetero-sustituido.

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Se describe una composición de PS/A que tiene la siguiente estructura

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donde n es un número entero mayor o igual a 3, donde R se selecciona del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, -NH-(CH_{2})_{m}-COOH, y -NH2, donde m es 2-5, y donde al menos 10% de los grupos R se seleccionan del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH y donde el PS/A está sustancialmente libre de ácido teicoico. Al menos 50%, 75%, o 90% de los grupos R se pueden seleccionar del grupo que consiste en -NH-CO-(CH_{2})_{m}-COOH, -NH-(CH_{2})_{m}-(COOH)_{2}, y -NH-(CH_{2})_{m}-COOH. La composición se formula en forma de una vacuna. El enlace preferido del esqueleto es un enlace \beta 1-6.

La unidad monomérica de PS/A puede estar sustituida con succinato. En esta realización el grupo R es -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-COOH. En otras realizaciones el grupo R se selecciona del grupo que consiste en -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CO-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COOH, -NH-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}, y -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-(COOH)_{2}. El PS/A puede estar sustituido con un solo tipo de grupo R sustituyente o con más de un tipo de grupo R sustituyente. Cuando el PS/A está sustituido con un solo tipo de grupo R sustituyente el PS/A es un polímero homo-sustituido. Cuando el PS/A está sustituido con más de un solo tipo de grupos R sustituyente el PS/A es un polímero hetero-sustituido.

En una realización preferida del método de la invención, el cultivo bacteriano es un cultivo de Staphylococcus aureus. En otra realización preferida el cultivo bacteriano es un cultivo de Estafilococos coagulasa negativos.

Otro aspecto de la invención es el uso de polisacárido capsular/adhesina puro en la preparación de un medicamento para producir una respuesta de anticuerpos.

En otro aspecto la invención es la utilización para la inducción de inmunidad activa para la infección por Estafilococos en un sujeto. La utilización incluye la etapa de administrar a un sujeto una cantidad eficaz para inducir inmunidad activa a los estafilococos de cualquiera de las composiciones de la invención.

Staphylococcus aureus, es la causa más común de infección bacteriana en pacientes hospitalizados.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un espectro de RMN de PS/A de S. aureus cepa MN8.

La Figura 2 es un gráfico que representa los resultados de una inhibición ELISA que muestra la capacidad de diversas cepas de Staphylococcus aureus desarrolladas durante la noche dos veces en caldo de infusión de cerebro corazón con un suplemento de glucosa al 0,5% para separar los anticuerpos que se unen al antígeno PS/A que ha sensibilizado la placa de ELISA (barras con puntos). Como control para la especificidad se trató una alícuota separada de la misma bacteria con metaperyodato de sodio 0,4 M para destruir el antígeno PS/A sobre la superficie de las cepas de S. aureus (barras de color gris). El porcentaje de inhibición de la unión se determinó a partir de la razón de la densidad óptica lograda utilizando un anticuerpo para PS/A adsorbido con la cepa de ensayo y un anticuerpo para PS/A adsorbido con una cepa negativa de PS/A (S. epidermidis sn-3).

La Figura 3 es un gráfico que representa la capacidad de un antígeno PS/A para inducir inmunidad activa en ratones frente a la infección por S. aureus.

La Figura 4 es un gráfico que representa la capacidad de un anticuerpo anti- PS/A para inducir inmunidad pasiva en ratones frente a la infección por S. aureus.

La Figura 5 muestra una fotografía de un gel de fragmentación de PCR.

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La Figura 6 muestra una fotografía de una transferencia Southern de genes ica (locus de adhesina intercelular) en S. aureus. La PCR se realizó sobre ADN cromosómico a partir de controles y ocho productos aislados de S. Aureus: (1) marcadores de peso molecular (2) S. Carnosus TM300, control negativo (3) ADN de control positivo de S. Epidermis RP62A; cepas de Staphylococcus aureus (4) Reynolds (5) MN8 (6) 5827 (7) S836 (8) Vas (9) VP (10) 265 (11) Por).

Breve descripción de las secuencias

El SEQ. ID. NO. 1 es una secuencia de ácido nucleico del locus ica que ha sido depositada en GenBank con el número de acceso U43366. (Técnica Anterior)

El SEQ. ID. NO. 2 es una secuencia del cebador directo para ica.

El SEQ. ID. NO. 3 es una secuencia del cebador inverso para ica.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a una microcápsula de bacterias estafilocócicas que es útil para inducir inmunidad frente a infecciones bacterianas y también para producir anticuerpos para fines diagnósticos y terapéuticos. La microcápsula es una preparación de PS/A que se puede aislar de Staphylococcus aureus o estafilococos coagulasa negativos, o se puede sintetizar de novo. El PS/A no se ha identificado previamente por ser un componente de la capa extracelular de Staphylococcus aureus. Antes de la presente invención, se demostró que dos tipos serológicos relacionados químicamente de cápsula, denominados polisacáridos capsulares CP5 y CP8 eran producidos por un 90% de las cepas de Staphylococcus aureus. Se creyó que estos polisacáridos capsulares eran responsables de la inducción del reconocimiento inmunitario S. aureus. Se ha descubierto que S. aureus incluye una cápsula verdadera que o bien se extiende más allá o bien remplaza la capa de CP5 o CP8 y es responsable de la producción de la respuesta inmunitaria. Como se demuestra en los ejemplos presentados en la presente memoria, el antígeno PS/A puede producir anticuerpos protectores opsónicos contra S. aureus y estafilococos coagulasa negativos cuando se administra in vivo.

Antes de la invención, el autor de la presente solicitud identificó y caracterizó una porción de la cápsula de los estafilococos coagulasa negativos, que fue PS/A (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.055.455, presentada por Gerald B. Pier). Se encontró que el PS/A de un estafilococo coagulasa negativo es un componente de la superficie celular y la capa de biopelícula y está implicado en la protección de la célula bacteriana frente a las defensas del anfitrión, tales como la opsonofagocitosis (Kojima, Y., M. Tojo, D. A. Goldmann, T. D. Tosteson y G. B. Pier. (1990) J Infect Dis. 162: 435. Tojo, M., N. Yamashita, D. A. Goldmann y G. B. Pier. (1988) J Infect Dis. 157: 713. Goldmann, D. A. y G. B. Pier. (1993) Clin Microbiol Rev. 6 : 176.) Sin embargo, la estructura química del PS/A no fue identificada debido a la dificultad asociada con la purificación del PS/A aislado. Solamente fue posible obtener una preparación con una pureza de aproximadamente 90%. De acuerdo con los métodos de la presente invención, el antígeno PS/A ha sido aislado y purificado para obtener una preparación de PS/A con una pureza de más del 92%.

Según se utiliza en la presente memoria, un "polisacárido capsular/adhesina puro" es una preparación de PS/A que ha sido aislada o sintetizada y que está libre de contaminantes en más de 92%. Preferiblemente, el material está libre de contaminantes en más de 95% o incluso más de 97% o 99%. El grado de pureza del antígeno PS/A se puede evaluar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza se puede evaluar mediante análisis químico así como cromatografía de gases y resonancia magnética nuclear para verificar los aspectos estructurales del material.

Un contaminante principal del antígeno PS/A de la técnica anterior fue el ácido teicoico que contenía fosfato. La contaminación con ácido teicoico del antígeno de la técnica anterior interfirió tanto en la caracterización química como en la inmunogenicidad del antígeno. Los procedimientos utilizados en la técnica anterior para aislar el PS/A no fueron suficientes para eliminar el ácido teicoico contaminante de la preparación de PS/A, haciendo imposible la caracterización química del antígeno PS/A. Los métodos de la invención descritos en la presente memoria son capaces de producir una preparación de antígeno PS/A aislado que está sustancialmente libre de ácido teicoico. Una preparación de PS/A que está sustancialmente libre de ácido teicoico es aquella que tiene menos de 1% de fosfato. En algunas realizaciones la preparación de PS/A que está sustancialmente libre de ácido teicoico es aquella que tiene menos de 0,1% de fosfato. La cantidad de fosfato presente en la muestra se puede evaluar mediante cualquier medio conocido en la técnica. Como se describe en los ejemplos más abajo la cantidad de contaminación con fosfato se puede evaluar utilizando los métodos descritos en Keleti, G. y W. H. Lederer, (1974) Handbook of Micromethods for the Biological Sciences Van Nostrand Reinhold Co., New York, que se incorpora como referencia. Brevemente, el análisis se realiza como sigue: a 100 \mug de muestra, se le añaden 100 \mul de una solución elaborada añadiendo juntos 43,5 ml de agua, 6,5 ml de ácido perclórico al 70% (HCL04) y 50 ml de ácido sulfúrico 20 N (H_{2}SO_{4}). Esto se calienta a 95ºC durante 2 horas en un tubo con una bola de vidrio en la parte superior. La mezcla se coloca a continuación en un horno a 165ºC y se calienta durante 2 horas más, después se enfría a la temperatura ambiente. A continuación, se añade a la muestra un ml de reactivo 5 elaborado mediante el siguiente método:

Reactivo 1: 1, 36 gramos de acetato de sodio. 3H_{2}O disuelto en 10 ml de agua.

Reactivo 2: 500 mg de molibdato de amonio disuelto en 20 ml de agua.

Reactivo 3: 2 ml de reactivo 1, 2 ml de reactivo 2 y 16 ml de agua.

Reactivo 4: 2 g de ácido ascórbico disuelto en 20 ml de agua, preparado inmediatamente antes de su uso.

Reactivo 5: Añadir en un baño de hielo 9 ml de reactivo 3 y 1 ml de reactivo 4.

Después de añadir el reactivo 5 a los tubos se mezcla cuidadosamente y se lee la densidad óptica a 820 nanómetros en un espectrofotómetro. Se utiliza una curva patrón que consiste en fosfato de sodio monobásico (intervalo de 0,1-5 \mug por tubo) para calcular la cantidad de fosfato presente en las muestras de ensayo. (Lowry, O. H., N. R. Roberts, K. Y. Leiner, M. L. Wu y A. L. Farr., (1954), Biol. Chem. 207, 1.)

Las composiciones de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones diferentes incluyendo la diagnosis in vitro, in situ e in vivo del estado patológico, tal como una infección. Adicionalmente, estas composiciones se pueden utilizar para inmunizar sujetos in vivo para evitar la infección. Las composiciones también se pueden utilizar para desarrollar anticuerpos y otros péptidos de unión que son útiles para los mismos fines que las composiciones de PS/A de la invención. De este modo, la invención incluye métodos para generar anticuerpos que son específicos para PS/A y que se pueden utilizar en la diagnosis y el tratamiento de los trastornos infecciosos.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se originan generalmente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales de un antígeno y un adyuvante. Los anticuerpos policlonales para el antígeno PS/A se pueden generar inyectando el antígeno PS/A solo o combinado con un adyuvante, o inyectando PS/A conjugado con un compuesto portador. Por ejemplo, puede ser útil conjugar el antígeno PS/A con una proteína, p. ej. hemocianina de lapa ojo de cerradura, seralbúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de haba de soja, que sea inmunogénica en la especie de animal que se va a inmunizar.

Se conocen muchos métodos en la técnica para conjugar un polisacárido con una proteína. En general, el polisacárido debe ser activado o se debe volver susceptible de conjugación de otro modo, esto es, al menos un radical se debe volver susceptible de unirse covalentemente a una proteína u otra molécula. Muchos de tales métodos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.356.170, presentada por Jennings, se describe el uso de un ácido peryódico para generar grupos aldehído en el polisacárido y después se realiza la aminación reductiva utilizando cianoborohidruro. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.663.160, presentada por Tsay et al., también se utilizó ácido peryódico para generar grupos aldehído pero después se unió el polisacárido a una proteína derivada con un radical de 4-12 carbonos (preparado en presencia de un agente condensante) con una reacción con una base de Schiffs en presencia de un agente reductor tal como cianoborohidruro. En la Patente de los Estados Unidos 4.619.828, presentada por Gordon, se utilizó bromuro de cianógeno para activar el polisacárido y después se conjugó a través de un puente espaciador de 4-8 átomos de carbono con la proteína. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.808.700, presentada por Anderson y Clements, se modificó un polisacárido para producir al menos un extremo reductor utilizando la escisión oxidativa por medio de peryodato, hidrólisis por medio de glicosidasas, o hidrólisis ácido y se conjugó con una proteína por medio de una aminación reductiva en presencia de cianoborohidruro. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.711.779, presentada por Porro y Costantino, se describió la activación de polisacáridos introduciendo grupos amino primarios en el grupo reductor terminal utilizando cianoborohidruro de sodio, seguido de conversión en ésteres en presencia de derivados de ácido adípico y conjugación con un toxoide en presencia de un disolvente orgánico, tal como dimetilsulfóxido. Se conocen en la técnica otros muchos métodos de conjugación.

El compuesto portador puede estar unido directamente con el antígeno PS/A o puede estar conectado con el antígeno PS/A a través de un conector o un espaciador. Se puede acoplar un polisacárido a un conector o un espaciador mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, utilizando un extremo reductor libre del polisacárido para producir un enlace covalente con un espaciador o conector. Se puede producir un enlace covalente convirtiendo un extremo reductor libre de un antígeno PS/A en un 1-aminoglicósido libre, que se puede unir covalentemente con posterioridad a un espaciador mediante acilación. (Lundquist et al., J. Carbohydrate Chem., 10: 377 (1991)). Alternativamente, se puede unir covalentemente el antígeno PS/A al espaciador utilizando un éster activo de N-hidroxisuccinimida como grupo activado en el espaciador. (Kochetkow, Carbohydrate Research, 146: C1 (1986)). El extremo reductor libre del antígeno PS/A también se puede convertir en una lactona utilizando yodo e hidróxido de potasio. (Isebell et al., Methods of Carbohydrate Chemistry, Academic Press, New York (1962)). La lactona se puede unir covalentemente al espaciador por medio de un grupo amino primario en el espaciador o el conector. El extremo reductor libre del antígeno PS/A también puede unirse covalentemente al conector o espaciador utilizando la aminación reductiva.

El compuesto portador unido al antígeno PS/A puede ser una proteína inmunológicamente activa o inerte. Las proteínas incluyen, por ejemplo, proteínas del plasma tales como la seralbúmina, las inmunoglobulinas, las apolipoproteínas y la transferrina, los polipéptidos bacterianos tales como TRPLE, la \beta-galactosidasa, los polipéptidos tales como la proteína gD del herpes, las alerginas, los toxoides de la difteria y el tétanos, la flagelina de salmonela, la pilina de hemofilus, las proteínas de la membrana de 15kDa, 28-30kDa, y 40kDa de hemofilus, escherichia coli, enterotoxina lábil al calor ltb, la toxina del cólera, y las proteínas virales incluyendo VP de rotavirus y las proteínas f y g del virus respiratorio sincitial. Las proteínas que son útiles de acuerdo con la invención incluyen cualquier proteína que sea segura para la administración a mamíferos y que sirva como proteína portadora inmunológicamente eficaz.

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Para preparar los anticuerpos policlonales se combina el antígeno PS/A o el producto conjugado con adyuvante completo de Freund u otro adyuvante (1 mg o \mug de producto conjugado para conejos o ratones, respectivamente, en 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund) y se inyecta intradérmicamente en múltiples sitios. Aproximadamente un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5-1/10 de la cantidad original de antígeno o producto conjugado de antígeno en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiple sitios. De una a dos semanas más tarde los animales se desangran, y se somete a análisis el suero en cuanto a la presencia de anticuerpo. Los animales se pueden reforzar repetidamente hasta que el título de anticuerpo se estabiliza. El animal se puede reforzar con el antígeno PS/A solo, el producto conjugado de PS/A, o el PS/A conjugado con un compuesto portador diferente. También se puede utilizar un agente agregante, tal como alúmina, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Además de suministrar una fuente de anticuerpos policlonales, los animales inmunizados se pueden utilizar para generar anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno PS/A. Según se utiliza en la presente memoria el término "anticuerpo monoclonal" hace referencia a una población homogénea de inmunoglobulinas que se unen específicamente a un epítopo (esto es un determinante antigénico) de PS/A. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica tal como la inmortalización de células de bazo del animal inmunizado p. ej. mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con el virus de Epstein-bar y escrutinio de los clones que expresan el anticuerpo deseado. Los métodos para preparar y utilizar anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales anti-PS/A murinos se pueden elaborar mediante cualquiera de estos métodos que utilizan PS/A como inmunógeno. La siguiente descripción de un método para desarrollar un anticuerpo monoclonal anti-PS/A es ilustrativa y se proporciona solamente con fines ilustrativos. Se inmunizaron ratones Balb/c intraperitonealmente con aproximadamente 75-100 \mug de PS/A purificado en adyuvante completo de Freund. Se administran inyecciones de refuerzo de aproximadamente 25-50 \mug de PS/A en adyuvante incompleto de Freund aproximadamente los días 15 y 35 después de la inyección inicial. El día 60-65, los ratones reciben inyecciones de refuerzo de aproximadamente 25 \mug PA/A en ausencia de adyuvante. Tres días más tarde, los ratones se sacrificaron y las células del bazo aisladas se fusionaron con células de mieloma murino NS-1 utilizando polietilenglicol mediante un procedimiento tal como el descrito por Oi (Oi VT: Immunoglobulin- producing hybrid cell lines in Hezenberg LA (ed): selected methods in cellular biology, San Francisco, CA, Freeman, (1980)). Las células de hibridoma se seleccionan utilizando hipoxantina, aminopterina, y timidina y se desarrollan en cultivo. De catorce a quince días después de la fusión, se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales anti-PS/A utilizando un radioinmunoanálisis en fase sólida capturando los anticuerpos anti-PS/A del medio acondicionado con IgG anti-ratón de cabra inmovilizada seguido de cuantificación del PS/A marcado con I^{125} unido específicamente. Los hibridomas positivos en la prueba de anticuerpos contra PS/A se subclonaron mediante dilución limitante y se volvieron a someter a ensayo. Después se prepara la ascitis para los hibridomas en ratones BALB/c cebados con pristano inyectando aproximadamente 1 x 10^{6} células/ratón. Se producen productos concentrados enriquecidos en los anticuerpos monoclonales seleccionados a partir de fluido de ascitis mediante filtración en gel sobre S-200 y se concentran con (NH_{4})SO_{4}. Los sedimentos se disuelven en una solución de almacenamiento apropiada tal como glicerol/H_{2}O al 50% y se almacenan a 4ºC.

Un "anticuerpo anti-PS/A" según se utiliza en la presente memoria incluye anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos así como anticuerpos monoclonales y policlonales intactos.

El anticuerpo anti-PS/A puede ser un anticuerpo monoclonal anti-PS/S humanizado intacto en forma aislada o en una preparación farmacéutica. Un "anticuerpo monoclonal humanizado" según se utiliza en la presente memoria es un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento funcionalmente activo del mismo que tiene regiones constantes humanas y una región de unión a PS/A de un mamífero de una especie distinta del ser humano.

Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden elaborar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.567.610, presentada por Borrebaeck et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 565.354, presentada por Ostberg, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.571.893, presentada por Baker et al, Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984), Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, new York, 1987), y Boemer et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991). Además de los métodos convencionales para preparar anticuerpos monoclonales humanos, tales anticuerpos también se pueden preparar inmunizando animales transgénicos que sean capaces de producir anticuerpos humanos (p. ej., Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immun., 7:33 (1993) y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.569.825 presentada por Lonberg).

Los siguientes ejemplos de métodos para preparar anticuerpos monoclonales humanizados que interaccionan con PS/A son ilustrativos y se proporcionan solamente con fines ilustrativos. Los anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo, se pueden construir remplazando las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero no humano por regiones similares de anticuerpos humanos a la vez que se conserva la especificidad epitópica del anticuerpo original. Por ejemplo, las CDR no humanas y opcionalmente algunas regiones marco se pueden unir covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional. Existen entidades en los Estados Unidos que sintetizarán anticuerpos humanizados a partir de regiones específicas de anticuerpos murinos comercialmente, tal como Protein Design Labs (Mountain View California).

La Solicitud de Patente Europea 0239400, proporciona una enseñanza ilustrativa de la producción y uso de anticuerpos monoclonales humanizados en los que al menos la porción CDR de un anticuerpo murino (u otro mamífero no humano) está incluida en el anticuerpo humanizado. Brevemente, los siguientes métodos son útiles para construir un anticuerpo monoclonal CDR humanizado incluyendo al menos una porción de una CDR de ratón. Se preparar un primer vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado conectado operablemente a una secuencia de ADN que codifica al menos un dominio variable de una cadena pesada o ligera de Ig y el dominio variable que comprende las regiones marco de un anticuerpo humano y una región CDR de un anticuerpo murino. Opcionalmente se prepara un segundo vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado conectado operablemente a una secuencia de ADN que codifica al menos un dominio variable de una cadena ligera o pesada de Ig humana complementaria respectivamente. Después se transforma una línea celular con los vectores. Preferiblemente la línea celular es una línea celular de mamífero inmortalizada de origen linfoide, tal como una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma, o cuadroma, o es una célula linfoide normal que ha sido inmortalizada mediante transformación con un virus. La línea celular transformada se cultiva después en condiciones conocidas por los expertos en la técnica para producir el anticuerpo humanizado.

Como se muestra en la Solicitud de Patente Europea 0239400 se conocen en la técnica diversos mecanismos para crear los dominios concretos de anticuerpos que se van a insertar en el vector replicable. (Los vectores y las técnicas de recombinación preferidos se comentan con más detalle más abajo). Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el dominio se puede preparar mediante síntesis de oligonucleótidos. Alternativamente se puede preparar un gen sintético que carece de las regiones CDR en el que cuatro regiones marco se fusionan juntas con sitios de restricción adecuados en las uniones, de manera que casetes de CDR sintéticas de doble hebra o subclonadas por restricción con extremos cohesivos se podría ligar en las uniones de las regiones marco. Otro método implica la preparación de la secuencia de ADN que codifica el dominio que contiene la CDR variable mediante mutagénesis dirigida al sitio por oligonucleótidos. Cada uno de estos métodos es bien conocido en la técnica. Por lo tanto, aquellos expertos en la técnica pueden construir anticuerpos humanizados que contienen una región CDR murina sin destruir la especificidad del anticuerpo por su epítopo.

Los anticuerpos humanizados tienen una utilidad clínica concreta ya que reconocen específicamente el PS/A pero no causan una respuesta inmunitaria en seres humanos contra el propio anticuerpo. En una realización muy preferida, una CDR murina se injerta en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véase. p. ej., L. Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988); M. S. Neuberger et al., Nature 314, 268 (1985) y EPA 0 239 400 (publicada el 30 de Sep. 1987).

También se describen fragmentos de anticuerpos de unión a PS/A. Como es bien sabido en la técnica, solamente una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc del anticuerpo, por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento pero no están implicadas en la unión al antígeno. Un anticuerpo del cual se ha escindido enzimáticamente una región pFc', o que ha sido producido sin la región pFc', denominado fragmento F(ab')_{2}, conserva ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento F(ab')_{2} aislado es referido como fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión al antígeno. De un modo similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que ha sido producido sin la región Fc, denominado fragmento Fab, conserva uno de los sitios de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Yendo más lejos, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de un anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada del anticuerpo indicada Fd (región variable de la cadena pesada). Los fragmentos Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede estar asociado con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan su capacidad de unión al epítopo al aislarlos.

Los términos Fab, Fc, pFc', F(ab')_{2} y Fv se emplean con cualquiera de los significados inmunológicos normalizados [Klein, Immunology (John Wiley, New York, NY, 1982); Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7ª Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)]. Los fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos bien conocidos incluyen pero no están limitados a los fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fd de anticuerpos. Estos fragmentos que carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión al tejido no específica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla se pueden construir de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778 por Ladner et al. Tales anticuerpos de cadena sencilla incluyen regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas unidas por un radical conector flexible. También se ha informado sobre métodos para obtener un anticuerpo con un único dominio ("Fd") que comprende un único dominio de la cadena pesada variable aislado (véase, por ejemplo, Ward et al., Nature 341: 644-646 (1989), que describe un método de escrutinio para identificar una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de un solo dominio) con suficiente afinidad por su epítopo diana para unirse a este en forma aislada). Los métodos para elaborar fragmentos Fv recombinantes basados en secuencias de regiones de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos son conocidos en la técnica y han sido descritas, p. ej., por Moore et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.462.334. Otras referencias que describen el uso y la generación de fragmentos de anticuerpos incluyen p. ej., fragmentos Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), fragmentos Fv (Hochman et al., Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15: 1591 (1976); Ehrilch et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.355.023) y porciones de moléculas de anticuerpos (Audilore-Hargreaves, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.470.925). De este modo, los expertos en la técnica pueden construir fragmentos de anticuerpo a partir de diversas porciones de anticuerpos intactos sin destruir la especificidad de los anticuerpos por el epítopo PS/A.

Los fragmentos de anticuerpo también pueden abarcar "fragmentos de anticuerpos humanizados". Como reconocerá un experto en la técnica, tales fragmentos podrían ser preparados mediante escisión enzimática tradicional de anticuerpos humanizados intactos. No obstante, si los anticuerpos intactos no son susceptibles de semejante escisión, debido a la naturaleza de la construcción implicada, las construcciones observadas se pueden preparar con fragmentos de inmunoglobulina utilizados como materiales de partida; o, si se utilizan técnicas de recombinación, se puede adaptar las secuencias de ADN, como tales para codificar el "fragmento" deseado que, cuando es expresado, se puede combinar in vivo o in vitro, por medios químicos o biológicos, para preparar el fragmento de inmunoglobulina intacto deseado final.

Los fragmentos de anticuerpos y otros polipéptidos de unión a PS/A que tienen especificidad de unión para PS/A para los métodos diagnósticos de la invención mostrados más abajo también están abarcados por la invención. Se pueden utilizar varios análisis rutinarios para identificar fácilmente tales péptidos. Los análisis de escrutinio para identificar péptidos de la invención se realizan por ejemplo, utilizando procedimientos de presentación en fagos tales como los descritos por Hart, et al.,en J. Biol. Chem. 269: 12468 (1994). Hart et al. informan sobre una genoteca de presentación en fagos filamentosos para identificar ligandos peptídicos novedosos para receptores de células de mamífero. En general, las genotecas de presentación en fagos, p. ej., utilizando M13 o el fago fd, se preparan utilizando procedimientos convencionales tales como los descritos en la referencia anterior. Las genotecas presentan insertos que contienen de 4 a 80 restos aminoácido. Los insertos representan opcionalmente una disposición de péptidos completamente degenerada o sesgada. Los ligandos que se unen selectivamente a PS/A se obtienen seleccionado aquellos fagos que expresan sobre su superficie un ligando que se une a PS/A. Estos fagos se someten después a varios ciclos de reselección para identificar los fagos que expresan el ligando peptídico que tienen las características de unión más útiles. Típicamente, los fagos que muestran las mejores características de unión (p. ej., mayor afinidad) se caracterizan adicionalmente mediante análisis de ácido nucleico para identificar las secuencias de aminoácidos concretas de los péptidos expresados sobre la superficie de los fagos y la longitud óptima del péptido expresado para obtener una unión óptima a PS/A. Alternativamente, tales ligandos peptídicos se pueden seleccionar a partir de genotecas combinatorias de péptidos que contienen uno o más aminoácidos. Se pueden sintetizar adicionalmente genotecas que no contengan radicales sintéticos peptídicos que estén menos sujetos a degradación enzimática en comparación con sus contrapartes naturales.

Para determinar si un péptido se une a PS/A se puede emplear cualquier análisis de unión conocido. Por ejemplo, el péptido se puede inmovilizar sobre una superficie y después poner en contacto con un PS/A marcado. La cantidad de PS/A que interacciona con el péptido o la cantidad que no se une al péptido se puede cuantificar después para determinar si el péptido se une al PS/A. Una superficie que tiene un anticuerpo anti-PS/A inmovilizado allí puede servir como control positivo.

Las composiciones de la invención son útiles para muchos fines in vivo, e in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención son útiles para producir una respuesta de anticuerpos, p. ej., como una vacuna para la inmunización activa de seres humanos y animales para evitar la infección por S. aureus y las infecciones causadas por otras especies de bacterias que elaboran el antígeno PS/A; como una vacuna para la inmunización de seres humanos o animales para producir anticuerpos anti-PS/A que se pueden administrar a otros seres humanos o animales para evitar o tratar infecciones estafilocócicas; como antígeno para escrutar importantes agentes biológicos tales como anticuerpos monoclonales capaces de evitar la infección por S. aureus, genotecas de genes implicadas en la elaboración de anticuerpos, o peptidomiméticos; como reactivo de diagnóstico para las infecciones por S. aureus y las infecciones causadas por otras especies de bacterias que elaboran el antígeno PS/A; y como reactivo de diagnóstico para determinar el estatus inmunológico de seres humanos o animales con respecto a su susceptibilidad a las infecciones por S. aureus y las infecciones causadas por otras especies de bacterias que elaboran el antígeno PS/A.

El PS/A de la invención se puede utilizar para proteger a un sujeto frente a la infección con una bacteria que tiene una cápsula de PS/A en su superficie induciendo una inmunidad activa frente a la infección por estafilococos en un sujeto. El método se completa administrando al sujeto una cantidad eficaz para inducir una inmunidad activa frente a estafilococos de cualquiera de las composiciones de PS/A de la invención.

"Inmunidad activa" según se utiliza en la presente memoria implica la producción de un antígeno de manera que el antígeno ocasiona la diferenciación de algunas células linfoides en células que producen anticuerpos y otras células linfoides en las células de memoria. Las células de memoria no secretan anticuerpos pero en lugar de eso incorporan los anticuerpos en su membrana con el fin de percibir el antígeno si es administrado de nuevo al organismo.

El método es útil para inducir inmunidad frente a la infección por estafilococos. "Estafilococos" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a todas las especies bacterianas estafilocócicas bien conocidas por los expertos en la técnica y se describen en la literatura sobre microbiología. Los estafilococos que expresan una cápsula que contiene PS/A incluyen pero no están limitados a Staphylococcus epidermidis (incluyendo RP62A (Número ATCC: 35984), RP12 (Número ATCC: 35983), y M187), Staphylococcus aureus (incluyendo RN4220 (pCN27) y mucoide MN8), y cepas tales como Staphylococcus carnosus transformado con los genes en el locus ica (incluyendo TM300 (pCN27)). Otras cepas bacterianas que expresan una cápsula que contiene PS/A pueden ser fácilmente identificadas por los expertos en la técnica. Por ejemplo una bacteria estafilocócica que expresa el locus ica expresará una cápsula que contenga PS/A. Un experto normal en la técnica puede escrutar fácilmente la expresión del ARNm o la proteína relacionada con locus ica puesto que la secuencia de ácido nucleico del locus ica es conocida (SEQ ID NO. 1 y originalmente descrita por Heilmann, C., O. Schweitzer, C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack y F. Gotz (1996) Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Molec. Microbiol. 20: 1083). Aunque la publicación de Heilmann describe la secuencia de ácido nucleico del locus ica, la publicación establece erróneamente que este locus codifica la producción del antígeno PIA. Se descubrió de acuerdo con la presente invención que ica codifica realmente proteínas implicadas en la producción de PS/A. Las cepas bacterianas que expresan una cápsula que contiene PS/A también pueden ser identificadas mediante microscopía inmunoelectrónica (u otro inmunoanálisis) utilizando anticuerpos anti-PS/A para detectar la presencia de la cápsula sobre la superficie de la bacteria como se describe en el Ejemplo 6 más abajo. Adicionalmente la cápsula de las cepas bacterianas se puede aislar como se describe en el Ejemplo 1 y analizar utilizando la cromatografía líquida y la espectroscopía de masas como se describe en el Ejemplo 4 más abajo.

Un "sujeto" según se utiliza en la presente memoria es un mamífero e sangre caliente e incluye, por ejemplo, seres humanos, primates, caballos, vacas, cerdos, cabras, ovejas, pollos, perros, y gatos.

Los PS/A de la invención se pueden utilizar para producir un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno pero están especialmente adaptados a la inducción de una inmunización activa contra la infección sistémica causada por estafilococos en un sujeto capaz de inducir una respuesta inmunitaria y en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica. Un sujeto capaz de inducir una respuesta inmunitaria y en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica es un mamífero que posee un sistema inmunitario sano normal que se encuentra en riesgo de estar expuesto a estafilococos medioambientales. Por ejemplo, un paciente hospitalizado que no está inmunocomprometido de otro modo se encuentra en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica como resultado de la exposición a la bacteria en el entorno del hospital. En particular las poblaciones de alto riesgo para desarrollar una infección por S. aureus incluyen, por ejemplo, pacientes con enfermedades renales en diálisis, e individuos que experimentan cirugía de alto riesgo. Las poblaciones de alto riesgo para desarrollar una infección por S. epidermidis incluyen, por ejemplo, pacientes con dispositivos médicos permanentes debido a que los productos aislados clínicos a menudo son muy adherentes a las superficies plásticas como resultado de su material extracelular referido como biopelícula o baba.

Una "cantidad eficaz para inducir una respuesta de anticuerpos" según se utiliza en la presente memoria es una cantidad de PS/A que es suficiente para (i) ayudar al sujeto a producir su propia protección inmunitaria por ejemplo induciendo la producción de anticuerpos anti-PS/A en el sujeto, induciendo la producción de células de memoria, induciendo una reacción de linfocitos citotóxicos etc. y/o (ii) evitar que se produzca la infección por estafilococos en un sujeto que está expuesto a estafilococos.

Un experto normal en la técnica puede evaluar si una cantidad de PS/A es suficiente para inducir inmunidad activa mediante métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo se puede evaluar la capacidad de un antígeno específico para producir anticuerpos en un mamífero escrutando el antígeno PS/A en un ratón u otro sujeto.

Antes de la presente invención no se conocía que Staphylococcus aureus expresaba PS/A en su superficie. Se creía que CP5 y CP8 formaban la cápsula externa de Staphylococcus aureus y que estas cápsulas podrían ser antígenos eficaces para inducir inmunidad. Se descubrió de acuerdo con la invención, no obstante, que el PS/A es útil como antígeno en la inducción de inmunidad activa contra la infección por Staphylococcus aureus.

"Inmunidad pasiva" según se utiliza en la presente memoria implica la administración de anticuerpos a un sujeto, donde los anticuerpos son producidos en un sujeto diferente (incluyendo sujetos de la misma y diferente especie), de manera que los anticuerpos se anclan a la superficie de la bacteria y hacen que la bacteria sea fagocitada.

El anticuerpo anti-PS/A se puede administrar a cualquier sujeto en riesgo de desarrollar una infección estafilocócica para inducir inmunidad pasiva. El anticuerpo anti-PS/A se puede administrar incluso a un sujeto que es incapaz de inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno. Aunque la vacunación con un antígeno PS/A pueda no ser eficaz en sujetos inmunocomprometidos con alto riesgo, estos sujetos se beneficiarán del tratamiento con preparaciones de anticuerpo originadas contra S. aureus. Un sujeto que es incapaz de inducir una respuesta inmunitaria es un sujeto inmunocomprometido (p. ej. un paciente que está siendo sometido a quimioterapia, un paciente con SIDA, etc.) o un sujeto que todavía no ha desarrollado un sistema inmunitario (p. ej., un neonato prematuro). El anticuerpo anti-PS/A se puede administrar a un sujeto con riesgo de desarrollar una infección estafilocócica para evitar que el agente infeccioso se multiplique en el organismo o para eliminar el agente infeccioso. El anticuerpo anti-PS/A también puede ser administrado a un sujeto que ya tiene una infección causada por estafilococos para evitar que el agente infeccioso se multiplique en el organismo o para eliminar el agente infeccioso.

El anticuerpo anti-PS/A se puede administrar al sujeto en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra Staphylococcus aureus. Una "cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra Staphylococcus aureus" según se utiliza en la presente memoria es una cantidad de PS/A que es suficiente para (i) evitar que se produzca la infección por estafilococos en un sujeto que está expuesto a estafilococos; (ii) inhibir el desarrollo de infección, esto es, detener o ralentizar su desarrollo; y/o (iii) mitigar la infección, esto es erradicación de la bacteria que causa la infección.

Utilizando procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica, se puede determinar si una cantidad de anticuerpo anti-PS/A es una "cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra Staphylococcus aureus" en un análisis de opsonización in vitro que predice el grado de opsonización de un anticuerpo. Un anticuerpo que opsoniza una bacteria estafilocócica es uno que cuando se añade a una muestra de la bacteria estafilocócica ocasiona la fagocitosis de la bacteria. Un análisis de opsonización puede ser un análisis colorimétrico, un análisis quimioluminiscente, un análisis de absorción fluorescente o de radiomarcaje, un análisis bactericida mediado por células u otro análisis que mide el potencial opsónico de una sustancia. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente análisis de opsonización para determinar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PS/A. El anticuerpo anti-PS/A se incuba con una bacteria estafilocócica y una célula fagocítica eucariótica y opcionalmente proteínas del complemento. La capacidad opsónica del anticuerpo anti-PS/A se determina basándose en la cantidad de estafilococos que quedan después de la incubación. Esto se puede lograr comparando el número de estafilococos supervivientes entre dos análisis similares, solo uno de los cuales incluye inmunoglobulina opsonizante o midiendo el número de estafilococos viables antes y después del análisis. Una reducción del número de estafilococos indica opsonización.

Se describen los métodos para inducir la inmunización pasiva contra estafilococos coagulasa negativos en un sujeto administrando a un sujeto una cantidad eficaz para inducir la opsonización de los estafilococos coagulasa negativos de un anticuerpo anti-PS/A_{puro}. Aunque se han desarrollado en la técnica anterior anticuerpos dirigidos contra PS/A aislados de estafilococos coagulasa negativos y se han utilizado para inducir una inmunidad pasiva contra los estafilococos coagulasa negativos, los anticuerpos anti-PS/A_{puros} no se han utilizado previamente con este fin.

Los sujetos que tienen un alto riesgo de desarrollar infección por S. epidermidis incluyen, por ejemplo, los neonatos prematuros, los pacientes que están siendo sometidos a quimioterapia, y otros pacientes con dispositivos médicos permanentes. Los productos aislados clínicos son a menudo muy adherentes a las superficies plásticas debido a que elaboran un material extracelular referido como biopelícula o baba.

Cuando se utiliza un antígeno PS/A para evitar una infección bacteriana, éste de formula como una vacuna. Un medio portador adecuado para formular una vacuna incluye solución salina tamponada con fosfato de sodio (pH 7,4) o gel de fosfato de aluminio suspendido en solución salina tamponada con fosfato de sodio a pH 6 y otro medio convencional. Generalmente, las vacunas que contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 \mug, preferiblemente aproximadamente 10-50 \mug de antígeno son adecuadas para obtener niveles eficaces de anticuerpo contra el antígeno PS/A en mamíferos de sangre caliente. Cuando se administra en forma de vacuna el PS/A puede incluir opcionalmente un adyuvante.

Se pretende que el término "adyuvante" incluya cualquier sustancia que se incorpore o se administre simultáneamente con el PS/A de la invención que potencie la respuesta inmunitaria en el sujeto. Los adyuvantes incluyen compuestos de aluminio, p. ej., geles, hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, y adyuvante completo o incompleto de Freund (en el que el antígeno PS/A es incorporado en la fase acuosa de una emulsión de agua en aceite de parafina estabilizada). El aceite de parafina se puede remplazar por diferentes tipos de aceites, p. ej., escualeno o aceite de cacahuete. Otros materiales con propiedades adyuvantes incluyen BCG (Mycobacteria de la tuberculosis atenuada), fosfato de calcio, levamisol, isoprinosina, polianiones (p. ej., poliA:U), lentinano, toxina pertussis, lípido A, saponinas y péptidos, p. ej., muramildipéptido. También se pueden utilizar como adyuvantes las sales de tierras raras, p. ej., lantano y cerio. La cantidad de los adyuvantes depende del sujeto y del antígeno PS/A concreto utilizado y puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica sin experimentación indebida.

En general, cuando se administran con fines terapéuticos, las formulaciones de la invención se aplican en solución farmacéuticamente aceptables. Tales preparaciones pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tamponadores, conservantes, portadores compatibles, adyuvantes, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

Las composiciones de la invención se pueden administrar per se (puras) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se utilizan en medicina las sales deben ser farmacéuticamente aceptable, pero las sales no aceptables farmacéuticamente se pueden utilizar convenientemente para preparar sales farmacéuticamente de las mismas y no están excluidas del alcance de la invención. Las sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitadas a, aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicíclico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metabosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico, y bencenosulfónico. Asimismo, las sales farmacéuticamente aceptables se pueden preparar en forma de sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.

Los agentes tamponadores adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% P/V); ácido cítrico y una sal (1-3% P/V); ácido bórico y una sal (0,5-2,5% P/V); y ácido fosfórico y una sal (0,8-2% P/V). Los conservantes adecuados incluyen cloruro e benzalconio (0,003-0,03% P/V); clorobutanol (0,3-0,9% P/V); parabenos (0,01-0,25% P/V) y timerosal (0,004-0,02% P/V).

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, para uso médico, que comprenden el PS/A de la invención junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El término "portador farmacéuticamente aceptable" según se utiliza en la presente memoria, y descrito más completamente más abajo, representa uno o más cargas, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles que son adecuadas para la administración a un ser humano u otro animal. En la presente invención, el término "portador" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son susceptibles de ser mezclados con los antígenos PS/A de la presente invención, y entre sí, de una manera tal que no haya una interacción que deteriore sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril del polisacárido, que puede ser isotónica con la sangre del receptor. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer, y la solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijados, estériles se emplean convencionalmente como medio disolvente o de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijado blando incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. Las formulaciones portadoras adecuadas para las administraciones subcutáneas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, etc. se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Las preparaciones de la invención se administran en cantidades eficaces. Una cantidad eficaz, como se ha comentado antes, es aquella cantidad de antígeno PS/A que, sola o junto con dosis adicionales, inducirá inmunidad activa u opsonización de las bacterias infecciosas, respectivamente. Se cree que serán eficaces las dosis que oscilan entre 1nanogramo/kilogramo y 100 miligramos/kilogramo, dependiendo del modo de administración. Se cree que el intervalo preferido está entre 500 nanogramos y 500 microgramos/kilogramo, y muy preferiblemente entre 1 microgramo y 100 microgramos/kilogramo. La cantidad absoluta dependerá de una variedad de factores incluyendo si la administración se realiza en un sujeto con alto riesgo aún no infectado con la bacteria o en un sujeto que ya tiene la infección, del tratamiento concurrente, del número de dosis y de los parámetros del paciente individual incluyendo la edad, el estado físico, el tamaño y el peso. Estos son factores bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden tratar sólo con la experimentación rutinaria. Se prefiere utilizar generalmente una dosis máxima, esto es, la dosis segura más alta de acuerdo con el criterio médico lógico.

Se contemplan múltiples dosis de las composiciones farmacéuticas de la invención. Generalmente los esquemas de inmunización implican la administración de una elevada dosis de un antígeno seguido de dosis posteriores más bajas de antígeno después de un período de espera de varias semanas. También se pueden administrar dosis adicionales. El programa de dosificación para una inmunización pasiva sería bastante diferente con una administración más frecuente si fuera necesario. Se puede utilizar cualquier régimen que de como resultado un aumento de la respuesta inmunitaria a la infección bacteriana y/o la protección subsiguiente contra la infección. Los intervalos de tiempo deseados para la liberación de múltiples dosis de un PS/A concreto pueden ser determinados por un experto en la técnica empleando simplemente la experimentación rutinaria.

Se encuentran disponibles una variedad de rutas de administración. El modo concreto seleccionado dependerá, por supuesto, del PS/A concreto seleccionado, de la condición concreta que se esté tratando y de la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de esta invención, en general, se pueden poner en práctica utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles eficaces de respuesta inmunitaria sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Los modos de administración preferidos son las rutas parenterales. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal o técnicas de infusión.

Las composiciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el PS/A activo con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el polímero con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y después, si fuera necesario, dando forma al producto. El polímero se puede almacenar liofilizado.

Otros sistemas de liberación pueden incluir los sistemas de liberación controlada, liberación retardada o liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los polisacáridos de la invención, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Se encuentran disponibles muchos tipos de sistemas de liberación y son conocidos por los expertos normales en la técnica. Incluyen sistemas con una base polimérica tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico), polianhídridos y policaprolactona; sistemas no poliméricos que son lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogeles; sistemas silásticos; sistemas con una base peptídica; recubrimientos de cera, comprimidos utilizando aglutinantes y excipientes convencionales, implantes parcialmente fusionados y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a: (a) sistemas por erosión en los que el polisacárido está contenido en una forma dentro de una matriz, encontrados en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.452.775 (Kent); 4.667.014 (Nestor et al.); y 4.748.034 y 5.239.660 (Leonard) y (b) sistemas por difusión en los que el componente activo penetra a una velocidad controlada a través de un polímero, encontrados en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.832.253 (Higuchi et al.) y 3.854.480 (Zaffaroni). Además, se pueden utilizar sistemas de liberación dotados de un equipo de bombeo, algunos de los cuales están adaptados para la implantación.

Los antígenos PS/A de la invención pueden ser liberados junto con otro fármaco antibiótico antibacteriano o en forma de cócteles con otros antígenos bacterianos o anticuerpos. Un cóctel antibiótico antibacteriano es una mezcla de cualquier composición útil de acuerdo con esta invención con un fármaco antibiótico antibacteriano. El uso de antibióticos en el tratamiento de la infección bacteriana es rutinario. El uso de antígenos para inducir la inmunización activa y de anticuerpos para inducir la inmunización pasiva también es rutinario. En esta realización, un vehículo de administración común (p. ej., comprimido, implante, solución inyectable, etc.) podría contener tanto la composición útil en esta invención como el fármaco antibiótico antibacteriano y/o el antígeno/anticuerpo. Alternativamente, el fármaco antibiótico antibacteriano y/o el antígeno/anticuerpo se puede administrar en dosis separadas.

Los fármacos antibióticos antibacterianos son bien conocidos e incluyen: penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, ciclacilina, epicilina, hetacilina, pivampicilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, carbenicilina, ticarcilina, avlocilina, mezlocilina, piperacilina, amdinocilina, cefalexina, cefradina, cefadoxil, cefaclor, cefazolin, cefuroxima axetil, cefamandol, cefonicid, cefoxitin, cefotaxima, ceftizoxima, cefmenoxina, ceftriaxona, moxalactam, cefotetan, cefoperazona, ceftazidma, imipenem, clavulanato, timentin, sulbactam, neomicina, eritromicina, metronidazol, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, vancomicina, trimetoprim-sulfametoxazol, aminoglicósidos, quinolonas, tetraciclinas y rifampina. (Véase Pharmacological Basics of Therapeutics de Goodman y Gilman, 8ª Ed., 1993, McGraw Hill Inc).

Otros antígenos polisacáridos y anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los siguientes antígenos polisacáridos y/o sus anticuerpos se pueden administrar junto con el antígeno PS/A y/o anticuerpo: el antígeno capsular Vi de la cápsula de Salmonella typhi (Szu, S. C., X. Li, A. L. Stone y J. B. Robbins, Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide, Infection and Immunity. 59: 4555-4561 (1991)); la cápsula K5 de E. Coli (Vann, W., M. A. Schmidt, B. Jann y K. Jann, The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary tract infective Escherichia coli, 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin, European Journal of Biochemistry. 116: 359-364, (1981)); la cápsula de tipo 5 de Staphylococcus aureus (Fournier, J. M., K. Hannon, M. Moreau, W. W. Karakawa y W. F. Vann, Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. (Paris). 138: 561-567, (1987)); el expolisacárido II de Rhizobium melilori (Glazebrook, J. y G. C. Walker, "A novel expolysaccharide can function in place of the calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti", Cell. 65: 661-672 (1989)); el estreptococo tipo III del Grupo B (Wessels, M. R., V. Pozsgay, D. L. Kasper y H. J. Jennings, Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus, Journal of Biological Chemistry. 262:8262-8267 (1987)); la cadena lateral específica de O de Pseudomonas aeruginosa Fisher 7 (Knirel, Y. A., N. A. Paramonov, E. V. Vinogradov, A. S. Shashkow, B. A. N. K. Kochetkov, E. S. Stanislavsky y E. V. Kholodkova, Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa The structure of O-specific polysaccharide chains of lipopolysaccharides of P. aeruginosa 03 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher immunotypes 3 y 7, European Journal of Biochemistry. 167:549, (1987)); la cadena lateral específica de O de Shigella sonnei (Kenne, L., B. Lindberg y K. Petersson, Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide, Carbohydrate Research. 78: 119-126, (1980)); la cápsula de tipo I de S. pneumoniae (Lindberg, B., Lindqvist, B., Lonngren, J., Powell, D. A., Structural studies of the capsular polysaccharide from Streptococcus pneumoniae type 1, Carbohydrate Research. 78:111-117 (1980)); y el antígeno del grupo de Streptococcus pneumoniae (Jennings, H. J., C. Lugowski y N. M. Young, Structure of the complex polysaccharide C-substance from Streptococcus pneumoniae type 1, Biochemistry. 19:
4712-4719 (1980)).

Otros antígenos no polipeptídicos y sus anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden utilizar junto con las composiciones de PS/A de la invención.

Los antígenos PS/A y los anticuerpos también son útiles en análisis de diagnóstico para determinar un estatus inmunológico de un sujeto o una muestra o se pueden utilizar como reactivos para inmunoanálisis. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar para detectar la presencia en una muestra de una bacteria que tiene un antígeno PS/A en la superficie. Si la bacteria se encuentra presente en la muestra, se pueden utilizar los anticuerpos para tratar al sujeto infectado. Los anticuerpos también se pueden utilizar para escrutar en bacterias la presencia del antígeno PS/A y para aislar el antígeno PS/A y las bacterias que contienen el antígeno PS/A de mezclas complejas.

Los análisis descritos antes y otros análisis conocidos en la técnica se pueden completar mediante marcaje del PS/A o los anticuerpos y/o inmovilización del PS/A o los anticuerpos sobre una matriz soluble. Los métodos analíticos y de diagnóstico para utilizar PS/A y/o sus anticuerpos utilizan al menos uno de los siguientes reactivos: análogo del analito marcado, análogo del analito inmovilizado, compañero de unión marcado, compañero de unión inmovilizado, y productos conjugados estéricos. La marca utilizada puede ser cualquier funcionalidad detectable que no interfiera en la unión del analito y su compañero de unión. Se conocen numerosas marcas para semejante uso en inmunoanálisis. Por ejemplo, compuestos que se pueden detectar directamente, tales como marcas de fluorocromos, quimioluminiscentes, y radiactivas, así como compuestos que se pueden detectar por medio de una reacción o transformación, tales como enzimas. Los ejemplos de estos tipos de marcas incluyen los radioisótopos P^{32}, C^{l4}, I^{125}, H^{3}, e I^{131}, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalavinodionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido-oxidasas, tales como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Las oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas a una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina-avidina, marcas de espín, marcas de bacteriófagos, y radicales libres estables.

Las marcas se pueden conjugar con el PS/A o el anticuerpo mediante métodos conocidos por los expertos normales en la técnica. Por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.940.475 y 3.645.090 se demuestra la conjugación de fluoróforos y enzimas con anticuerpos. Otros análisis que según se informa se utilizan comúnmente con antígenos y anticuerpos y que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen análisis competitivos y sándwich.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de Antígeno PS/A

Se ha descubierto de acuerdo con la invención que se puede purificar PS/A de cualquier cepa bacteriana que exprese el locus ica. Específicamente, estas incluyen Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, y otras cepas Estafilocócicas tales como Staphylococcus carnosus transformado con los genes en el locus ica. Las siguientes cepas específicas que se han utilizado de acuerdo con la invención para purificar PS/A incluyen S. epidermidis RP62A (Número ATCC: 35984), S. epidermidis RP12 (Número ATCC: 35983), Staphylococcus epidermidis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27), y S. aureus MN8 mucoide.

1. Método de purificación de PS/A a partir de estafilococos coagulasa negativos que contienen loci ica que codifican la producción de proteínas necesarias para sintetizar PS/A

La sustancia de partida se preparó a partir de cultivos de estafilococos que expresan los genes ica haciendo crecer la bacteria en cualquier medio de crecimiento que soporte el crecimiento de estas cepas estafilocócicas. Un medio preferido es un medio definido químicamente (CDM) (Hussain, M., J. G. M. Hastings y P. J. White. 1991. A chemically defined medium for slime production by coagulase-negative Staphylococci. J. Med. Microbiol. 34:143) compuesto por RPMI-1640 AUTO-MOD, una preparación de RPMI-1640 modificada para permitir la esterilización en autoclave; (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como base de partida. Se omitió el rojo fenol debido a que se une fácilmente al PS/A purificado. El CDM tiene un suplemento de aminoácidos, vitaminas, y nucleótidos adicionales para darle una composición final similar a la descrita en otra parte (Hussain, M., J. G. M. Hastings y P. J. White. 1991. A chemically defined medium for slime production by coagulase-negative Staphylococci. J. Med. Microbiol. 34:143). El medio tenía un suplemento adicional de dextrosa y sacarosa; cada una fue introducida en un autoclave por separado y después se añadió a una concentración final de 1%.

Los cultivos se inocularon con una única colonia de estafilococos (Muller, E., J. Huebner, N. Gutierrez, S. Takeda, D. A. Goldmann y G. B. Pier. 1993. Isolation and characterization of transposon mutants of Staphylococcus epidermidis deficient in capsular polysaccharide/adhesin and slime. Infect Immun. 61:551) de una placa de agar tal como agar soja con tripticasa, que había sido incubada durante la noche a 37ºC. Los cultivos se hicieron crecer con mezclado vigoroso a 37ºC, haciendo burbujear 2 L de O_{2}/min por medio de un purgador y el pH se mantuvo a 7,0 mediante la adición automática de NaOH 5 M con un titulador de pH. Los cutlivos se hicieron crecer hasta que dejaron de necesitar la adición de NaOH para mantener el pH a 7,0 (esto es, durante 48-72 horas).

Se extrajo el antígeno bruto de las células bacterianas directamente al sobrenadante de cultivo utilizando cationes divalentes, pH bajo, y calor. Un método preferido consiste en añadir MgCl_{2} al cultivo a una concentración final de 100 mM, y ajustar el pH a 5,0. Después el cultivo se calentó y se agitó. Una temperatura de 65ºC durante 90 minutos fue satisfactoria. Los cuerpos celulares se sedimentaron a 9.000 X g durante 15 min. El sobrenadante se concentró a \sim1000 ml por medio de una filtración de flujo tangencial (filtro de corte de peso molecular 10.000 (PM)), y se realizaron los cambios de tampón y tratamientos mientras la solución todavía estaba en el dispositivo de filtración: El tampón se cambió por H_{2}O desionizada ajustada a pH 5,0 (para separar el exceso de iones Mg^{2+}). A continuación el pH se ajustó a 7,4 con Tris 0,1 M-NaCl 0,15 M, y la solución se trató durante 4 horas a la temperatura ambiente con ARNasa y ADNasa, 5 mg de cada una, y después durante 2 horas con 5 mg de tripsina. El tampón se cambió en el dispositivo de flujo
tangencial por EDTA 10 mM (pH 8,6), y se añadió desoxicolato de sodio (DOC) a una concentración final de 3%.

Otro método para aislar el antígeno polisacárido de la invención implica incubar la bacteria con una base o un ácido fuerte, tal como NaOH o HCl 5 Molar. Las bacterias se agitan en la base o el ácido fuerte durante 18-24 horas. Los cuerpos celulares se recogen después mediante centrifugación y se vuelven a extraer dos veces más. El sobrenadante de cada una de las extracciones se reúne y se neutraliza a pH 7 utilizando un ácido o una base. La suspensión de antígeno bruto resultante se somete a diálisis frente a agua desionizada durante 2-24 horas. El antígeno bruto insoluble restante se recoge por centrifugación. El sobrenadante se somete a ensayo en cuanto a la presencia de antígeno soluble mediante análisis conocidos, tales como métodos inmunológicos. Si el sobrenadante es positivo para antígeno soluble, se puede liofilizar el sobrenadante y volver a extraer para obtener antígeno bruto adicional. El antígeno bruto insoluble se vuelve a suspender en una solución tampón de PBS 50 mM o Tris 100 mM con NaCl 150 mM.

El antígeno bruto suspendido se trató con 5 mg de cada una de ARNasa y ADNasa durante 4 horas a 37ºC y después con 5 mg de tripsina durante 2 horas; Las células se sedimentaron, y este sobrenadante se añadió al sobrenadante de cultivo concentrado que estaba siendo tratado con tripsina. Los cuerpos celulares restantes se volvieron a suspender en EDTA 10 mM/DOC al 3% (pH 8,6); se agitaron durante 2 horas y se sedimentaron una tercera vez. El sobrenadante resultante se añadió al sobrenadante de cultivo concentrado que estaba siendo tratado con EDTA 10 mM/DOC al 3% (pH 8,6). Otra alternativa es un tampón con un pH >10. Un tampón preferido es carbonato de amonio 0,4 M a un pH de 11. Finalmente, los sobrenadantes reunidos se concentraron por medio de una filtración celular agitada utilizando, por ejemplo, un filtro de membrana de corte 30.000 PM). El material particulado o insoluble se sedimentó centrifugando a 2.000 x g durante 30 min y se conservó el sobrenadante.

Como alternativa para utilizar las extracciones y tampones DOC anteriores para obtener antígeno bruto disuelto, también se obtuvo antígeno bruto a partir de los extractos iniciales de las células ajustando el pH de los extractos a >8,0 con una base tal como hidróxido de sodio, añadiendo 4 volúmenes de alcohol tal como etanol, recuperando el material precipitado por centrifugación, y redisolviendo el producto precipitado con HCl 0,1 M o cualquier tampón con un pH por debajo de 4,0.

El material enriquecido en P/A de elevado peso molecular se aisló a continuación del extracto de baba bruto mediante cromatografía con tamices moleculares. Se cargó una columna de 5,0 cm X 100 cm con Sepharose CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) o un gel de tamiz molecular comparable y se lavó con EDTA 10 mM que contenía DOC al 1% (pH 8,6). Como alternativa se utilizó a veces un tampón con pH <4,0. Un tampón preferido fue glicina-HCl 0,1 m a un pH de 2,0. La baba bruta se aplicó en un volumen de 10-20 ml y las fracciones que contenían PS/A se identificaron mediante la medida de la absorción de luz UV a 206 nm e inmunoanálisis de transferencia puntual utilizando un antisuero de conejo policlonal específico para el antígeno PS/A.

El material que eluye en las fracciones de volumen vacío (PM > 100.000 Daltons) de las columnas utilizando tampones basados en DOC se reunió y se trató con proteinasa K (0,1 mg/ml), que es proteolíticamente activa en DOC al 1%; el material se concentró simultáneamente a 100 ml con una unidad de filtración celular agitada (membrana de corte a PM 30.000). El material que eluyó en el volumen vacío de una columna de tamices moleculares con un tampón de bajo pH (< 4,0) se reunió, se añadió fosfato de sodio dibásico a una concentración final de al menos 0,1 M y un pH de al
menos 8,0, y después se añadieron 4 volúmenes de alcohol, tal como etanol del 95%, para precipitar el antígeno PS/A.

En la purificación adicional de material recuperado de las columnas DOC se utilizó una etapa para destruir los restos de antígeno de la pared celular lábil a los álcalis presente en las preparaciones. El material digerido con proteinasa K se trató mediante la adición de NaOH a una concentración final de 500 mM y la mezcla se agitó a 22ºC durante 2 horas y después se neutralizó con HCl. El PS/A se recuperó mediante precipitación en alcohol (tal como metanol añadido a 50% v/v) y se sedimentó mediante centrifugación a 30.000 x g durante 30 min. El DOC y las impurezas residuales se separaron mediante numerosos lavados del producto precipitado con metanol puro.

Para separar el ácido teicoico residual del material recuperado en el volumen vacío de las columnas dirigidas utilizando el sistema tampón DOC o el sistema tampón de bajo pH, se suspendieron los productos precipitados en alcohol en ácido fluorhídrico (HF) al 24% (v/v) a 4ºC durante 48 horas. La solución de HF se diluyó en agua a una concentración de HF al 12%, después se neutralizó con NaOH y se sometió a diálisis frente a agua corriente. El PS/A era en su mayoría insoluble en este punto. Cualquier PS/A soluble restante se hizo precipitar mediante la adición de metanol del 50%, el sedimento se lavó con metanol puro de 3 a 5 veces, se suspendió en H_{2}O desionizada, se congeló, y se liofilizó.

2. Purificación de PS/A a partir de Staphylococcus aureus

El PS/A también se purificó a partir de S. aureus utilizando el procedimiento para los estafilococos coagulasa negativos anterior o una modificación del procedimiento anterior. La recuperación de PS/A a partir de S. aureus se facilitó preferiblemente utilizando una cepa que elabora PS/A constitutivamente tal como la cepa MN8 mucoide. Tales cepas se pueden hacer crecer en cualquier medio que soporte su crecimiento aunque un medio preferido es el caldo Columbia. Alternativamente, cualquier cepa de S. aureus con un locus ica intacto se puede hacer crecer en caldo de infusión cerebro corazón con un suplemento de glucosa \geq 0,25% (v/v) para producir PS/A.

En los cultivos se inoculó una única colonia de Staphylococcus aureus de cualquier medio apropiado que hubiera sido incubado durante la noche a 37ºC. Los cultivos se hicieron crecer con mezclado vigoroso a 37ºC, haciendo burbujear 2 L de O_{2}/min a través de un purgador y el pH se mantuvo a 7,0 mediante la adición automática de NaOH 5M con un titulador de pH. Los cultivos se hicieron crecer rutinariamente hasta que dejaron de necesitar la adición de NaOH para mantener el pH a 7,0 (esto es, durante 48-72 horas).

Las células bacterianas se recuperaron después del cultivo mediante centrifugación y se volvieron a suspender en solución salina tamponada. Después se añadieron las enzimas lisozima y lisostafina a concentraciones de >0,1 mg/ml. Esta suspensión se agitó durante 2-24 horas a 37ºC, después de lo cual se añadió una proteasa. Una proteasa preferida fue la Proteinasa K a una concentración de al menos 0,1 mg/ml, aunque se pueden utilizar otras proteasas tales como Pronasa E o tripsina. La mezcla se agitó a 37ºC durante al menos 2 horas. El pH de la suspensión se hizo disminuir después por debajo de 4,0, pero preferiblemente a 2,0, utilizando un ácido tal como HCl. El material insoluble se separó mediante centrifugación y el producto precipitado se volvió a extraer 3 veces mediante resuspensión en soluciones de pH bajo (<4,0, preferiblemente 2,0) seguido de agitación durante \geq 10 minutos y centrifugación para separar los materiales insolubles. Los extractos de pH bajo se reunieron, el pH se elevó por encima de 8,0 mediante la adición de fosfato de sodio a una concentración de \geq 0,1 M y de una base tal como hidróxido de sodio, y después se añadieron 4 volúmenes de alcohol tal como etanol del 95%. Otra alternativa es un tampón con un pH>10. Un tampón preferido es carbonato de amonio 0,4 M a un pH de 11.

Otro método preferido para aislar el antígeno polisacárido de la invención implica incubar la bacteria con una base o ácido fuerte, tal como NaOH o HCl 5 M. Las bacterias se agitan en la base o ácido fuerte durante 18-24 horas. Los cuerpos celulares se recogen después por centrifugación y se vuelven a extraer dos veces más. Los sobrenadantes de cada una de las extracciones se reúnen y se neutralizan a pH 7 utilizando un ácido o una base. La suspensión de antígeno bruto resultante se somete a diálisis frente a agua desionizada durante 2-24 horas. El antígeno bruto insoluble restante se recoge por centrifugación. El sobrenadante se somete a ensayo en cuanto a la presencia de antígeno soluble mediante análisis conocidos, tales como métodos inmunológicos. Si el sobrenadante es positivo para el antígeno soluble, el sobrenadante se puede liofilizar y volver a extraer para obtener antígeno bruto adicional. El antígeno bruto insoluble se resuspende en una solución tampón PBS 50 mM o Tris 100 mM con NaCl 150 mM. Después el material se sometió a los mismos tratamientos enzimáticos descritos antes con respecto al método de purificación de PS/A a partir de estafilococos coagulasa negativos.

El material insoluble se recuperó después mediante centrifugación, se redisolvió en soluciones de pH bajo (<4,0, preferiblemente 1,0), el material insoluble se separó por centrifugación, y el material de elevado peso molecular de la fracción soluble se recuperó mediante aplicación a una columna con tamices moleculares equilibrada en un tampón con un pH por debajo de 4,0. El tampón preferido fue glicina-HCl 0,1 M a un pH de 2,0. La columna con tamices moleculares típica tiene unas dimensiones de 2,6 X 100 cm y se cargó con un gel tal como Sephacryl S-500 (Pharmacia). Las fracciones que contenían PS/A se identificaron mediante la medida de la absorción a 206 nm e inmunoanálisis de transferencia puntual con antisuero de conejo policlonal para PS/A. Las fracciones inmunológicamente reactivas que eluyeron en el intervalo de elevado peso molecular (>100.000) se reunieron, el pH se elevó a >8 mediante adición de fosfato de sodio a una concentración \geq 0,1 M y de una base (tal como hidróxido de sodio) seguido de la adición de 4 volúmenes de un alcohol tal como etanol y el producto precipitado resultante se recuperó por centrifugación. Los productos precipitados en alcohol se suspendieron a continuación en ácido fluorhídrico (HF) al 24% durante 48 horas. La solución en HF se diluyó en agua a una concentración de HF del 12%, después se neutralizó con NaOH y se sometió a diálisis frente a agua corriente. El PS/A era en su mayor parte insoluble en este punto. Cualquier PS/A soluble restante se precipitó mediante la adición de alcohol a una concentración final de >50%, el sedimento se lavó con alcohol tal como etanol del 95% o metanol puro 3 a 5 veces, y el sedimento se suspendió en H_{2}O desionizada, se congeló, y se liofilizó.

Ejemplo 2 Síntesis química de antígeno PS/A Métodos

El PS/A es químicamente similar a la quitina (poli-N-acetil-glucosamina con enlaces beta-1-4) y al quitosán (poli-glucosamina con enlaces beta-1-4). Los grupos N-acetilo de la quitina se separaron fácilmente mediante tratamiento con una base débil (NaOH 1,0 M, 95ºC, 1 hora) para producir quitosán. El grupo amino libre se sustituyó después con succinato utilizando ácido succínico añadido a estas sustancias en presencia de un reactivo de carbodimida soluble en agua que promueve el acoplamiento de grupos amino libres a grupos carboxilo libres.

Se suspendieron 10 mg de quitosán en HCl de 1,0 a 0,1 M y se agitaron hasta que se obtuvo una suspensión de tipo gel. Después se añadieron 100 mg de ácido succínico seguido de 75 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida-HCl (EDC, Sigma) y la suspensión se agitó durante 2 días a la temperatura ambiente. La solución se neutralizó después con hidróxido de sodio 2 M, el ácido succínico libre no unido y la EDC libre se separaron mediante diálisis frente a agua, y el quitosán succinilado se lioflizó.

Resultados

El material resultante era similar a la poli-N-succinil glucosamina del PS/A, difiriendo en la naturaleza de los enlaces entre los restos glucosamina individuales. Sin embargo, los autores de la presente invención han encontrado de acuerdo con la invención que los anticuerpos originados contra PS/A reaccionarán con quitosán N-succinilado, indicando que la modificación química apropiada de quitina y quitosán da como resultado una molécula con capacidad para obtener anticuerpos para PS/A.

Ejemplo 3 Análisis del antígeno PS/A

El uso de los tratamientos con base (NaOH) y ácido fluorhídrico para degradar los contaminantes mejora significativamente la pureza de PS/A sobre las preparaciones de la técnica anterior obtenidas previamente. El PS eluyó en las fracciones de volumen vacío, de elevado peso molecular de una columna de Sepharose 4B (> 100.000 Da) y dio una única banda de precipitina en la inmunodifusión, como se ha mostrado previamente (Tojo, M., N. Yamashita, D. A. Goldmann y G. B. Pier. 1988. Isolation and characterization of a capsular polysaccharide/adhesin from Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis. 157:713). Además, la sensibilización de los pocillos ELISA con diluciones de PS/A por debajo de 0,02 \mug/pocillo dio como resultado la unión de una dilución significativamente mayor de 1:500 de anticuerpo para PS/A purificado que de suero preinmunitario. Se encontró que el uso de DOC al 3% o tampones de pH bajo (<4,0) para solubilizar el PS/A durante la purificación era importante, pero una vez que el PS/A hubo precipitado a partir de estas soluciones por medio del metanol, éste no pudo ser solubilizado de nuevo a un pH >4,0, ni siquiera en tampones DOC. El PS/A era ligeramente soluble (\sim500 \mug) en propanol del 50%-butanol del 50% y en piridina. El antígeno PS/A estaba desprovisto de fosfato detectable (<0,1%) (Keleti, G. y W. H. Lederer. 1974. Handbook of Micromethods for the Biological Sciences. Van Nostrand Reinhold Co., New York).

Ejemplo 4 Análisis de las Propiedades Químicas de PS/A

Cuando los autores de la presente invención analizaron el PS/A aislado de S. epidermidis M187, S. carnosus (pCN27) y S. aureus MN8 mucoide después de la hidrólisis en ácido HCl 4 M a elevada temperatura (95-100ºC) durante 14 horas, encontraron que la glucoamina era el único componente azúcar en el PS/A utilizando combinaciones de cromatografía gas-líquido-espectrometría de masas (GLC-MS) y resonancia magnética nuclear (RMN). En la Figura 1 se muestra un espectro RMN representativo. Además, también se definió en las preparaciones una elevada cantidad de succinato (aproximadamente equimolar con la glucosamina). El succinato fue liberado de los antígenos mediante hidrólisis en NaOH 5 M durante \geq 10 minutos a 95ºC, pero no con NaOH 1 M en las mismas condiciones. La cantidad inferior de NaOH liberaría fácilmente el succinato unido al éster carboxilo. Junto con los resultados de la RMN, esto establece el succinato unido a los grupos amino, y no hidroxilo de la glucosamina. La hidrólisis del PS/A en fragmentos oligosacáridos por ozono y el análisis mediante RMN establecieron la unión entre los azúcares como un enlace beta. El PS/A aislado de estas cepas pierde la reactividad serológica y las propiedades químicas detectables mediante GLC-MS después del tratamiento con peryodato de sodio (0,2 M durante 14 h), indicando un enlace 1-6 entre los restos glucosamina. Asimismo, la hidrólisis con NaOH 5M durante >5 min destruye la actividad serológica.

De este modo el material PS/A nativo es un homopolímero de elevado peso molecular (>100.000 Daltons) de restos N-succinil D-glucosamina unidos entre sí por un enlace 1-6. El nivel de sustitución de los grupos succinato en el grupo amino de la glucosamina se aproxima al 100% en la molécula nativa.

Ejemplo 5 La inmunización con PS/A purificado obtiene anticuerpos reactivos con el antígeno

Método: Se utilizaron los métodos descritos previamente para obtener anticuerpos para PS/A mediante inmunización de conejos (Kojima, Y., M. Tojo, D. A. Goldmann, T. D. Tosteson y G. B. Pier. 1990. Antibody to the capsular polysaccharide/adhesin protects rabbits against catheter related bacteremia due to coagulase-negative staphylococci. J Infect Dis. 162:435; Tojo, M., N. Yamashita, D. A. Goldmann y G. B. Pier. 1988. Isolation and characterization of a capsular polysaccharide/adhesin from Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis. 157:713; Takeda, S., G. B. Pier, Y. Kojima, M. Tojo, E. Muller, T. Tosteson y D. A. Goldmann. 1991. Protection against endocarditis due to Staphylococcus epidermidis by immunization with capsular polysaccharide/adhesin. Circulation. 84:2539) para preparar antisueros a partir del antígeno aislado de S. epidermidis M187 y S. aureus MN8 mucoide.

Resultados: Los anticuerpos obtenidos mediante preparaciones de ambas cepas bacterianas indujeron anticuerpos de títulos comparables para ambos antígenos (Tabla 1).

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TABLA I

5

Ejemplo 6 Localización física del antígeno PS/A en cepas estafilocócicas

Métodos: Se hicieron crecer las cepas MN8 mucoide y RN4220 (pCN27) de S. aureus en agar de soja tripticasa, y se hizo crecer S. aureus MN8 en Caldo de Infusión de Cerebro-Corazón con un suplemento de glucosa \geq0,25%. Después se sondearon las células primero con antisuero policlonal de conejo contra PS/A y después con proteína A marcada con oro, o anti-IgG de conejo marcada con oro, y se obtuvieron micrografías.

Se ha demostrado previamente que el PS/A representa la cápsula bacteriana par S. epidermidis. Los autores de la presente invención investigaron si las cepas que portaban el locus ica estaban encapsuladas utilizando microscopía inmunoelectrónica. Se tomaron una serie de fotografías microscópicas inmunoelectrónicas de: (a) la interacción de anticuerpos anti-PS/A con una cápsula de PS/A en la cepa MN8 mucoide de S. aureus; (b) el control negativo utilizando tinción con suero de conejo normal (NRS) de la cepa MN8 mucoide de S. aureus; (c) la interacción de anticuerpos anti-PS/A con la cápsula de PS/A en la cepa RN4220 (pCN27) de S. aureus; (d) el control negativo utilizando la tinción con NRS de la cepa RN4220 de S. aureus; (e) la interacción de anticuerpos anti-PS/A con la cepa MN8 de S. aureus desarrollada en caldo de infusión de cerebro-corazón con un suplemento de glucosa al 0,25%; y (f) el control negativo utilizando tinción con NRS de la cepa MN8 de S. aureus desarrollada en caldo de infusión de cerebro-corazón con un suplemento de glucosa al 0,25%. Las micrografías demuestran que los anticuerpos para PS/A se unen a una cápsula extracelular en estas cepas.

Ejemplo 7 Expresión del antígeno PS/A por productos aislados clínicos humanos de S. aureus

Muchos productos aislados clínicos humanos de S. epidermidis expresan antígenos PS/A constitutivamente (esto es, todo el tiempo en una variedad de condiciones de crecimiento). Asimismo, algunas cepas de S. aureus hacen lo mismo (esto es, MN8 mucoide). No obstante la mayoría de los productos aislados clínicos humanos no expresan demasiado PS/A cuando se hacen crecer en condiciones normales de laboratorio. Los autores de la invención encontraron que si estas cepas de S. aureus se hacían crecer en medio de caldo de infusión de cerebro-corazón que contenía glucosa al 0,25%, la expresión del PS/A se podía detectar mediante métodos serológicos tales como un análisis de inhibición ELISA (mostrado en la Figura 2). Además, los autores de la invención encontraron que se puede demostrar que los productos aislados de S. aureus que no expresan PS/A detectable antes de la infección en ratones producen PS/A cuando se recuperan de un tejido infectado tal como riñón. De este modo en condiciones in vitro especializadas o después de las infecciones experimentales en animales, las cepas de S. aureus que de otro modo no elaboran PS/A detectable ahora lo hacen. Otro medio, que los autores de la invención han encontrado que potencia la expresión de PS/A in vitro es medio Staphylococcus Núm. 110.

Se tomó una fotografía microscópica inmunoelectrónica de un producto aislado clínico humano (ASEAN) recién aislado de agar para detectar la expresión de PS/A y se tiñó con (a) anticuerpos anti-PS/A, o (b) control de NRS. Los autores de la invención encontraron que los productos aislados clínicos humanos de S. aureus expresan PS/A cuando las cepas se someten a ensayo mediante microscopía electrónica de transmisión desde una placa de agar que se utilizó primero para detectar la infección en una muestra de fluido o tejido. De este modo si se sometían a ensayo productos aislados clínicos humanos en cuanto a la expresión de PS/A sin un paso extenso de la bacteria por medios de laboratorio se podía demostrar que elaboraban el antígeno PS/A.

Ejemplo 8 Expresión de antígeno PS/A por productos aislados de animales de S. aureus

S. aureus es la principal causa de infecciones de mastitis en animales y ocasiona considerables pérdidas económicas. Los autores de la invención también han analizado productos aislados de S. aureus de animales (vacas y ovejas) en cuanto a la expresión de PS/A. Los autores de la invención han encontrado que muchos de los productos aislados analizados elaboran el antígeno PS/A, como se determina mediante el ensayo serológico. De los 40 productos aislados de animales sometidos a ensayo, 23 tenían fuertes reacciones en las transferencias puntuales inmunológicas con anticuerpos PS/A. Esto fue detectable incluso aunque los productos aislados no se hicieran crecer en medio especial para potenciar la producción de PS/A como se debe hacer con los productos aislados de seres humanos. De este modo, a diferencia de los productos aislados clínicos de seres humanos de S. aureus, muchos productos aislados de animales parecen ser capaces de elaborar PS/A constitutivamente.

Ejemplo 9 Protección contra la infección por S. aureus mediante anticuerpos para PS/A

Métodos: Se utilizó antígeno PS/A 1-100/g (se prefiere 100 \mug/ratón) para inmunizar ratones para obtener anticuerpos. Después los ratones fueron sensibilizados con bacterias S. aureus vivas, o bien la cepa Reynolds o bien la cepa MN8 de S. aureus y se demostró que aquellos con anticuerpos para PS/A estaban protegidos contra la infección.

Resultados: La inmunización activa de los ratones con PS/A seguido de sensibilización intravenosa con S. aureus redujo el número de bacterias en el riñón cinco días más tarde cuando los animales fueron sacrificados y sometidos a ensayo (Figura 3).

De un modo similar, la administración a los ratones de anticuerpos originados en conejos para el antígeno PS/S seguido de sensibilización de los ratones con cepas de S. aureus protege a los ratones frente a la infección por S. aureus (Figura 4). De este modo los anticuerpos para PS/A protegen a los ratones frente a la infección por S. aureus. Como se ha observado antes, el análisis de los productos aislados recuperados de los riñones infectados de ratones de control no inmunes demostró que la infección había inducido la expresión de PS/A durante el tiempo de infección en el animal.

Ejemplo 10 Detección de genes para la producción de PS/A en productos aislados de S. aureus Métodos: Extracción de ADN de bacterias, análisis mediante PCR y análisis de transferencia Southern

Preparación de ADN: Se inocularon bacterias en 10-2- ml de caldo de soja tripticasa (TXB) y se hicieron crecer durante la noche a 37ºC. El crecimiento resultante se recuperó por centrifugación. Las células bacterianas se volvieron a suspender en tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 8,0, EDTA 25 mM, sacarosa 300 mM). Después las células se incubaron con lisostafina (0,2 mg/ml) y lisozima (2 mg/ml) durante 1-3 horas a 37ºC. Después de esta digestión con enzimas, se añadieron 0,5 ml de dodecilsulfato de sodio al 5% (SDS) en etanol al 45%, se sometieron a vórtice y se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente. Después se añadió 1 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (razones en volumen de 27:12:1) tamponado seguido de vórtice y centrifugación (15 min, 5.000 rpm, 4ºC) . La capa acuosa superior se separó y se añadió a cloroformo:alcohol isoamílico (razón 24:1). De nuevo esto se centrifugó (15 min, 5.000 rpm, 4ºC). El ADN se recuperó en la capa acuosa superior, después se hizo precipitar mediante la adición de etanol del 95% en una cantidad igual al doble del volumen de partida, y el ADN precipitado se enrolló sobre una varilla de vidrio. El ADN se disolvió después en agua destilada.

La digestión con enzimas de restricción del ADN para el análisis de transferencia Southern se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Gibco BRL, Grand Island, NY). La sonda de ADN se marcó utilizando el protocolo ECL (Amersham International plc, Buckinghamshire, England) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La PCR se realizó utilizando un protocolo de termociclación ("touchdown"). Brevemente, se añadieron los cebadores (SEQ ID NO: 2-3) al ADN obtenido de las cepas Estafilocócicas (concentración final 200 nM) y se utilizó el programa del termociclador para realizar la fusión del ADN a 95ºC y las extensiones con polimerasa partiendo a 60ºC con temperaturas de hibridación descendentes de 0,5ºC en cada ciclo hasta alcanzar los 45ºC.

Resultados: Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los autores de la invención han demostrado que los productos aislados de S. aureus tienen los genes para elaborar PS/A. Estos genes están contenidos en un locus denominado ica y fueron asilados originalmente y secuenciados por Heilmann et al. (Heilmann, C., O. Schweitzer, C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack y F. Gotz. 1996. Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Molec. Microbiol. 20: 1083). Los autores de la invención demuestran en la presente memoria que el locus ica codifica las proteínas que sintetizan la molécula de poli-N-succinil glucosamina PS/A y no la molécula de poliglucosamina poli-N-acetilada denominada PIA.

Se diseñaron los cebadores para el análisis por PCR basándose en la secuencia de los genes ica para amplificar un fragmento de ADN de 2,7 kB (SEQ ID NO: 2 y 3). Cuando estos cebadores se mezclaron con el ADN aislado de las cepas MN8, MN8 mucoide, RN450, Becker, Reynolds y 1A de S. aureus, junto con el ADN de la cepa RP62A de S. epidermidis, de la cual se habían clonado originalmente los genes ica, y se utilizaron en una reacción de PCR, lo autores de la invención encontraron que todas las cepas de S. aureus tenían el locus ica (Figura 5). Cuando el fragmento de 2,7 kb amplificado se marcó y se utilizó como sonda en una reacción de transferencia Southern del ADN extraído de estas cepas de S. aureus, los autores de la invención también detectaron la presencia de los genes en el locus ica (Figura 6). De este modo los autores de la invención demostraron que los genes necesarios para elaborar las proteínas para sintetizar el antígeno PS/A estaban presentes en S. aureus.

Se considera que la memoria escrita anterior es suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención. La presente invención no debe estar limitada en su alcance por los ejemplos proporcionados, puesto que se pretende que los ejemplos sean una simple ilustración de un aspecto de la invención y otras realizaciones funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente memoria se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> The Brigham and Women's Hospital, Inc.

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Pier, Gerlad B.

\hskip1cm

McKenney, David

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Wang, Ying

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<120> PREPARACIÓN, PURIFICACIÓN Y USO DE ANTÍGENO POLISACÁRIDO CAPSULAR ADHESINA,

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<130> US 60/093.117

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<151> 1998-07-15

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<160> 3

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<170> FastSeq para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 4500

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<212> ADN

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<213> Staphylococcus epidermidis

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<400> 1

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6

7

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 2

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8

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<210> 3

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 3

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\hskip1cm

80

Claims (29)

1. Un método para preparar un polisacárido capsular/adhesina puro que está libre en más del 92% de contaminantes que comprende:

(a) extraer una preparación de polisacárido capsular/adhesina bruto a partir de un cultivo bacteriano de Estafilococos coagulasa negativos o coagulasa positivos utilizando un pH bajo y calor,

(b) aislar un material enriquecido en polisacárido capsular/adhesina de elevado peso molecular de la preparación de polisacárido capsular/adhesina bruto,

(c) precipitar un polisacárido capsular/adhesina impuro del material enriquecido en polisacárido capsular/adhesina de elevado peso molecular,

(d) incubar el polisacárido capsular/adhesina impuro con una base para producir una preparación de polisacárido capsular/adhesina semi-puro,

(e) neutralizar la preparación con un ácido, y

(f) incubar la preparación neutralizada en ácido fluorhídrico para producir el polisacárido capsular/adhesina puro.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, donde el cultivo bacteriano de Estafilococos coagulasa positivos es un cultivo de Staphylococcus aureus.

3. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el cultivo bacteriano es un cultivo de una cepa bacteriana que expresa el locus ica.

4. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la extracción del polisacárido capsular/adhesina bruto de un cultivo bacteriano en la etapa (a) es a un pH de 5,0.

5. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la extracción del polisacárido capsular/adhesina bruto de un cultivo bacteriano en la etapa (a) es a una temperatura de 65ºC.

6. Un método como se reivindica en la reivindicación 5, donde la temperatura de 65ºC es durante 90 minutos.

7. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la extracción del polisacárido capsular/adhesina bruto de un cultivo bacteriano en la etapa (a) es con el uso de cationes divalentes.

8. Un método como se reivindica en la reivindicación 7, donde se añade MgCl_{2} a una concentración final de 100 mM.

9. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el material enriquecido en polisacárido capsular/adhesina de elevado peso molecular de la preparación de polisacárido capsular/adhesina bruto de (b) se aísla mediante cromatografía con tamices moleculares.

10. Un método como se reivindica en la reivindicación 9, donde el material enriquecido en polisacárido capsular/adhesina de elevado peso molecular eluye en las fracciones de volumen vacío (>100.000 Da).

11. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la etapa (c) se realiza utilizando etanol del 95%.

12. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la base de la etapa (d) es NaOH.

13. Un método como se reivindica en la reivindicación 12, donde la etapa (d) se realiza mediante la adición de NaOH a una concentración final de 500 mM.

14. Un método como se reivindica en la reivindicación 12 o 13, donde la incubación de la etapa (d) se produce a aproximadamente 22ºC durante aproximadamente 2 horas.

15. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el ácido de la etapa (e) es HCl.

16. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la preparación neutralizada se incuba en ácido fluorhídirico al 24% (v/v) en la etapa (f) para producir el polisacárido capsular/adhesina puro.

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17. Un método como se reivindica en la reivindicación 16, donde la incubación de la etapa (f) se produce a aproximadamente 4ºC durante aproximadamente 48 horas.

18. Un método como se reivindica en la reivindicación 9, que comprende adicionalmente un tratamiento enzimático.

19. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde el polisacárido capsular/adhesina puro tiene un peso molecular de más de 100.000 Daltons.

20. Un polisacárido que comprende un polisacárido capsular/adhesina puro que está libre en más del 92% de contaminantes preparable de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que se formula en forma de vacuna.

21. Un polisacárido como se reivindica en la reivindicación 20 y que tiene un peso molecular de más de 100.000 Daltons.

22. Un polisacárido como se reivindica en la reivindicación 20 o 21 para su uso en medicina.

23. Un polisacárido como se reivindica en la reivindicación 22, para tratar la infección por Estafilococos induciendo inmunidad activa a Estafilococos.

24. Un polisacárido como se reivindica en la reivindicación 22 o en la reivindicación 23, donde se induce la inmunidad a una infección por Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis.

25. Una composición que comprende un polisacárido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un compuesto portador conjugado con el polisacárido capsular/adhesina.

26. Una composición que comprende un polisacárido como se reivindica en la reivindicación 25, donde el compuesto portador está conjugado con el polisacárido capsular/adhesina por medio de un conector.

27. El uso del polisacárido capsular/adhesina puro reivindicado en la reivindicación 20 o 21 opcionalmente junto con un adyuvante, en la preparación de un medicamento para producir una respuesta de anticuerpos.

28. Un método para producir un anticuerpo contra el polisacárido capsular/adhesina puro reivindicado en la reivindicación 20 o 21, que comprende inmunizar un animal no humano con múltiples inyecciones subcutáneas, intraperitoneales o intradérmicas con el polisacárido capsular/adhesina puro reivindicado en la reivindicación 20 o 21 junto con un adyuvante.

29. Un método como se reivindica en la reivindicación 28, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y el método comprende adicionalmente inmortalizar células de bazo aisladas del animal inmunizado.