ES2238080T3 - Tratamiento y diagnostico de infecciones por cocos gram positivos. - Google Patents
Tratamiento y diagnostico de infecciones por cocos gram positivos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA PROTEINAS TRANSPORTADORAS ABC BACTERIANAS Y FUNGICAS, FRAGMENTOS INMUNOGENICOS DE LAS MISMAS, AGENTES NEUTRALIZADORES ESPECIFICOS PARA ELLAS Y AGENTES AGLUTINANTES PROPIOS DE ELLAS PARA USO TERAPEUTICO Y DIAGNOSTICO, JUNTO CON PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO Y DIAGNOSTICO, PROCEDIMIENTOS PARA DICHOS ENSAYOS Y KITS PARA SU EJECUCION. SE PROPORCIONAN IGUALMENTE ANTIGENOS CONSERVADOS INMUNODOMINANTES DE ESTAFILOCOCOS GRAM - POSITIVOS, JUNTO CON AGENTES NEUTRALIZANTES Y DE FIJACION ESPECIFICOS DE ELLOS PARA USO EN TERAPIA Y DIAGNOSTICO, Y PROCEDIMIENTOS PARA ELLOS. SE PROPORCIONAN TAMBIEN HOMOLOGOS ESTAFILOCOCICOS DE SUS FRAGMENTOS INMUNOGENICOS 1°A Y 1°B, Y SUS USOS EN PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO Y DIAGNOSTICO DEL CUERPO HUMANO O ANIMAL.
Description
Tratamiento y diagnóstico de infecciones por
cocos Gram positivos.
La presente invención se refiere al tratamiento y
al diagnóstico de las infecciones bacterianas, en particular por
cocos Gram positivos, en particular por Enterococi.
La utilización generalizada de los antibióticos y
otros agentes (por ejemplo la penicilina, vancomicina, meticilina,
cefalosporina, tetraciclina, cloranfenicol, glicopéptidos y
aminoglicósidos) en el tratamiento de las infecciones bacterianas ha
conducido a un rápido desarrollo de las bacterias resistentes a
dichos agentes [ver por ejemplo, CDC, JAMA, 270:1796 (1993);
IDCP, Infect. Dis. Clin. Pract., 5:1-2
(1996); Spera, R.V. and Farber, B.F., Drugs,
48:678-688 (1994)] y muchas bacterias tienen
resistencia a una multiplicidad de fármacos. Esto demuestra ser un
problema en los ambientes clínicos [Morris, J.C., et al.,
Ann. Intern. Med., 123:250-259 (1995), Boyce,
J. M., et al., J. Clin. Micro.,
32:1148-1153 (1994)]. Las bacterias
particularmente problemáticas son los Enterococci y
Staphylococci.
Las infecciones debidas a enterococos son las
segundas más frecuentes en los hospitales en USA, produciendo
abscesos intraabdominales, endocarditis, infecciones del tracto
urinario y de los tejidos blandos y septicemias (con una elevada
mortalidad de entre el 34 y el 68%). En la actualidad son
resistentes a la ampicilina, gentamicina y cada vez con más
frecuencia, a la vancomicina. Los VRE (enterococos resistentes a la
vancomicina) en la actualidad no son tratables y son responsables
del 14% de las sepsis en las unidades de cuidados intensivos. Entre
1989 y 1993 se han incrementado de 20 veces las infecciones por VRE
(CDC National Nosocomial Infection Surveillance; WHO Report,
1996).
Staphilococcus aureus es una de las causas
más frecuentes de las infecciones de piel, septicemias,
osteomielitis y endocarditis. El 26% de los aislados de
S.aureus en Francia (1989), y el 38,3% USA (1991), fueron de
MRSA multiresistentes (S. áureos resistentes a la
meticilina). El MRSA es resistente a todos los antibióticos
excepto a la vancomicina y la mortalidad debida a septicemias por
MRSAs es del 40%. Sin embargo, la utilización de la vancomicina es
uno de los últimos recursos ya que puede producir nefrotoxicidad,
ototoxicidad, toxicidad a la médula ósea y el síndrome del "hombre
rojo". La transferencia de la resistencia a la vancomicina de un
VRE a un S. aureus ha sido demostrada en el laboratorio y
clínicamente con ciertas especies de estafilococos. Existe una
posibilidad significativa de que ello pueda ocurrir con S.
aureus en pacientes lo que conduciría a la creación de bacterias
no tratables mediante las terapias actuales.
Según la presente invención se proporciona una
proteína transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la misma
para su utilización en un procedimiento para el tratamiento del
cuerpo humano o animal. También se proporciona una proteína
transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la misma,
utilizados en la producción de un medicamento.
Los transportadores ABC son bien conocidos
[Faith, M.J. and Kolter, R., Microbiological Reviews,
57(4):995-1017 (1993); Borenkamp, S. J.
and St. Geme, J. W. III, Infection and Immunity,
62:3320-3328 (1994)]. Sin embargo, no tienen
una aplicación terapéutica conocida ni se ha sugerido aplicación
alguna. De modo semejante, los agentes que neutralizan su actividad
no han sido propuestos para una aplicación terapéutica.
Las aplicaciones particulares de las proteínas
transportadoras ABC o sus fragmentos inmunogénicos incluyen su
utilización como inmunógenos, tales como por ejemplo vacunas.
La referencia a las proteínas transportadoras ABC
lo es tanto a las proteínas importadoras como a las exportadoras.
La referencia a los fragmentos inmunogénicos también lo es a los
análogos de los fragmentos inmunogénicos, en particular a los
mimiotopos [Geysen, H. M., et al., Journal of
Immunological Methods, 102:259-274 (1987);
Geysen, H. M., et al., J. Mol. Recognit.,
1(1):32-41 (1988)].
La bacteria puede ser un enterococo, por ejemplo
seleccionado de entre el grupo constituido por E. faecium,
E. faecalis, E. avium, E.
gallinarium, E. durans, E. mundtii y
E. casseflavus.
La sección experimental (a continuación) describe
unas proteínas particulares transportadoras ABC de los enterococos
con pesos moleculares de 97 y 54 kDa. De ahí que la proteína
transportadora ABC pueda ser una proteína de enterococo seleccionada
de entre el grupo de los antígenos inmunodominates conservados de 97
y 54 kDa.
Los antígenos inmunodominantes conservados de
entre 97 y 54 kDa de los enterococos no son nuevos en sí, [Clark, I.
M. and Burnie, J. P., Serodiagn. Immunother. Infect. Disease,
5:85-92 (1993); Sulaiman, A. et al.,
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.,
15:826-829 (1996)]. Sin embargo, no han sido
previamente identificadas o sugeridas como proteínas transportadoras
ABC, ni han sido sugeridas para una aplicación terapéutica, ni lo
han sido los agentes que las neutralizan.
Un fragmento inmunogénico puede comprender un
lugar de unión a ATP o una parte de éste. Se ha determinado que los
lugares de unión a ATP despliegan epitopos específicos
(terapéuticamente útiles) de las proteínas transportadoras ABC y por
consiguiente éstos o los agentes neutralizantes específicos a éstos
se pueden utilizar terapéuticamente. De modo semejante, los agentes
que se unen a estos se pueden utilizar para el diagnóstico.
Un fragmento enterococal inmunogénico puede
presentar SEC ID nº:3, y lo despliegan los transportadores ABC de
p.ej. E. faecium y E. faecalis.
Un fragmento inmunogénico de E. faecium
puede presentar la secuencia SEC ID N:4.
Se ha descubierto una multiplicidad de epitopos
específicos de E.faecium y por consiguiente el fragmento
inmunogénico puede presentar cualquiera de las secuencias
comprendidas entre SEC ID n^{os}: 5 a 8.
Según la presente invención también se
proporcionan unos agentes neutralizantes específicos para una
proteína bacteriana transportadora ABC o para un fragmento
inmunogénico de la misma para su utilización en un procedimiento
para el tratamiento del cuerpo humano o animal.
Un agente neutralizante se puede utilizar para la
preparación de un medicamento.
Los agentes neutralizantes son bien conocidos y
pueden incluir anticuerpos y los fragmentos de los mismos que se
unen a antígenos (Harlow, E. and Lane, D., "Antibodies - A
Laboratory Mannual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Press, New York, 1988), ribozimas y cadenas de ácidos
nucleicos antisentido. Otros agentes neutralizantes serán evidentes
para los expertos en la materia.
Según la presente invención también se
proporciona un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o
animal que comprende tratar a un paciente con una proteína
bacteriana transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la
misma o un agente neutralizante específico para la misma según la
presente invención.
Los medicamentos según la presente invención
pueden comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable, un
diluyente o excipiente (Remington's Pharmaceutical Sciences y US
Pharmacopea, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).
Según la presente invención también se
proporciona una proteína bacteriana transportadora ABC o un
fragmento inmunogénico de la misma para utilización en un
procedimiento de diagnóstico del cuerpo humano o animal. Tanto el
transportador ABC como el fragmento inmunogénico del mismo se
pueden utilizar en un procedimiento de diagnóstico.
La bacteria puede ser un enterococo,
seleccionado, por ejemplo, de entre el grupo que comprende E.
faeciun, E, faecalis, E. avium, E. gallinarium, E. durans, E.
mundtii y E. casseflavus.
La proteína transportadora ABC puede ser una
proteína de enterococo seleccionada de entre el grupo de antígenos
inmunodominantes conservados de entre 97 y 54 kDa.
Un fragmento inmunogénico puede comprender un
lugar de unión a ATP o una parte del mismo.
La bacteria puede ser un enterococo, presentando
el fragmento inmunogénico la secuencia SEC ID nº: 3. La bacteria
puede ser E. faecium, teniendo el fragmento inmunogénico la
secuencia SEC ID nº: 4.
La bacteria puede ser E. faecium,
presentando la secuencia del fragmento inmunogénico de entre
cualesquiera de las SEC ID n^{os}: 5 a 8.
Según la presente invención también se
proporciona un agente de unión específico para una proteína
bacteriana transportadora ABC o para un fragmento inmunogénico de la
misma según la presente invención para su utilización en un
procedimiento de diagnóstico del cuerpo humano o animal.
La presente invención también proporciona un
agente de unión específico para una proteína bacteriana
transportadora ABC o para un fragmento inmunogénico de la misma
según la presente invención utilizado en un procedimiento de
diagnóstico.
La presente invención también proporciona un
agente de unión según la presente invención utilizado en la
preparación de un kit para el ensayo de diagnóstico.
Los agentes de unión incluyen cualquier agente
capaz de detectar la proteína o los fragmentos inmunogénicos y son
bien conocidos e incluyen, por ejemplo, los anticuerpos y los
fragmentos de los mismos que se unen a los antígenos.
La presente invención también proporciona un
procedimiento de diagnóstico para el cuerpo humano o animal que
comprende la utilización de un transportador ABC bacteriano o un
fragmento inmunogénico del mismo, o un agente de unión específico
para el mismo según la presente invención.
La presente invención también proporciona un
procedimiento de ensayo de diagnóstico para una proteína bacteriana
transportadora ABC o para un fragmento inmunogénico de la misma
según la presente invención que comprende las etapas
siguientes:
- i)
- hacer reaccionar un agente de unión según la presente invención con una muestra de un paciente;
- ii)
- detectar una reacción entre el agente de unión y el antígeno; y
- iii)
- correlacionar la detección de la reacción con la presencia de la proteína o de un fragmento inmunogénico de la misma.
La muestra de un paciente puede ser por ejemplo
un dializado de un paciente o suero.
El agente de unión puede comprender un
anticuerpo, comprendiendo el procedimiento de ensayo de diagnóstico
las etapas siguientes:
- i)
- hacer reaccionar un anticuerpo según la presente invención con una muestra de un paciente;
- ii)
- detectar una reacción de unión anticuerpo-antígeno; y
- iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión entre anticuerpo y antígeno con la presencia de la proteína o de un fragmento inmunogénico de la misma.
También se proporciona un procedimiento de ensayo
de diagnóstico de anticuerpos específicos contra una proteína
bacteriana transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la
misma según la presente invención que comprende las etapas
siguientes:
- i)
- hacer reaccionar una proteína transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la misma según la presente invención con el antisuero de un paciente;
- ii)
- detectar una reacción de unión anticuerpo-antígeno; y
- iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión anticuerpo-antígeno con la presencia de un anticuerpo específico contra el transportador bacteriano ABC o contra un fragmento inmunogénico del mismo.
También se proporciona un kit de pieza para
realizar un ensayo de diagnóstico según la presente invención.
También se proporciona un procedimiento de
diagnóstico que comprende la utilización de una proteína bacteriana
transportadora ABC o de un fragmento imunogénico de la misma o un
agente de unión específico para éstos según la presente
invención.
Los presentes inventores han tenido éxito en el
aislamiento de dos antígenos conservados inmunodominantes de los
enterococos y han descubierto que, sorprendentemente, los
anticuerpos específicos para dichos antígenos se pueden utilizar
para proporcionar una terapia efectiva contra las infecciones de los
enterococos.
El antígeno puede estar destinado a su
utilización en un procedimiento para el tratamiento o para el
diagnóstico del cuerpo humano o animal.
El antígeno puede estar destinado a su
utilización como inmunógeno. Por consiguiente el antígeno se puede
utilizar para estimular una respuesta inmunogénica en los pacientes
para protegerlos contra las infecciones bacterianas. El antígeno
puede estar destinado por ejemplo a su utilización como vacuna.
La presente invención también proporciona un
anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a un antígeno,
específico para un antígeno según la presente invención. El
anticuerpo o el fragmento del mismo que se une a un antígeno pueden
ser para la utilización en el diagnóstico o en el tratamiento de las
infecciones por enterococos o estafilococos. En el caso de las
bacterias con resistencia a múltiples fármacos, en particular
aquellas para las que actualmente no existe farmacoterapia, la
utilización de un anticuerpo específico a la bacteria proporciona
una nueva y muy eficaz forma de tratamiento de la infección.
El papel que desempeñan los anticuerpos en las
infecciones por enterococos y estafilococos todavía no ha sido
definido por completo (Moellering, R.C., en: Mandell, G.L., 1995,
Bennett, J.E. and Dolin, R. (eds.) Mandell, Douglas and Bennett's
Principles Practice of Infectious Diseases, Fourth Edn., Churchill
Livingstone, 1826-1835). Aitchison, E.J. et
al., J. Med. Microbiol., 21:161-167
(1986) investigaron los componentes de la superficie de un aislado
asociado a la endocarditis por E. faecalis utilizando
SDS-PAGE (electroforesis en geles de dodecilsulfato
sódico poliacrilamida) y transferencia Western. Se definió una
importante proteína de envoltura antígeno con un peso molecular de
53 kDa en E. faecalis (no presente en E. faecium) y
otros antígenos comunes de E. faecalis con pesos moleculares
de 65, 63, 56, 49,5, 30 y 21 kDa. También se encontró que el
crecimiento de E. faecalis en suero para imitar las
condiciones de crecimiento in vivo en los pacientes afectados
de endocarditis alteró el patrón de antígenos y solamente dos
antígenos principales de pesos moleculares de 56 y 53 kDa
reaccionaron con el suero de los pacientes afectados de
endocarditis. Se sugirió que tales antígenos pueden tener potencial
para el diagnóstico. Burnie, J.P., et al., J. Clin.
Pathol., 40:1149-1158 (1987), exploraron el
papel de la inmunotransferencia en el diagnóstico de la endocarditis
enterococal negativa en cultivo. Se encontró que en la endocarditis
por E. faecalis se producía una fuerte respuesta IgM a las
bandas de 112, 88 a 90 y 45 a 47 kDa de E. faecalis y una
fuerte respuesta IgG a las bandas de 88 a 90 y 45 a 47 kDa. El
antígeno de 112 kDa de E. faecalis se utilizó más tarde para
desarrollar un ensayo indirecto por inmunoabsorbente unido a enzima
(ELISA) para el diagnóstico de la endocarditis por E.
faecalis [Burnie, J.P. and Clark, L., I. Immunol. Methods,
123:217-225 (1989)]. Los tres pacientes con
infección de E. faecium mostraron una fuerte respuesta IgG a
las bandas de 82 a 90 kDa.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o
un fragmento del mismo que se una al antígeno y en general el
anticuerpo puede pertenecer a cualquiera de las clases de
inmunoglobulinas. Por consiguiente, por ejemplo, puede ser un
anticuerpo inmunoglobulina M o un anticuerpo inmunoglobulina G. El
anticuerpo o fragmento puede ser animal, por ejemplo, de origen
mamífero y puede ser, por ejemplo, de origen murino, rata, oveja o
humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo, o,
si se desea, un fragmento de anticuerpo recombinante, es decir, un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido utilizando
técnicas de ADN recombinante.
Los anticuerpos recombinantes particulares o
fragmentos de anticuerpo recombinantes incluyen, (1) los que tienen
un lugar de unión al antígeno parte del cual está por lo menos
derivado de un anticuerpo diferente, por ejemplo, aquellos en los
que las regiones hipervariables o las regiones determinantes de la
complementariedad de un anticuerpo han sido injertadas en las
regiones del marco variable de un segundo anticuerpo diferente (tal
como se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente europea nº
239400); (2) los anticuerpos recombinantes o fragmentos de los
mismos en los que las secuencias no Fv han sido sustituidas por
secuencias no Fv de otros anticuerpos diferentes (tal como se
describe, por ejemplo, en las solicitudes de patentes europeas nºs
171469, 173494 y 194276) o (3) los anticuerpos recombinantes o
fragmentos que presentan sustancialmente la estructura de una
inmunoglobulina natural pero en los que la región de la bisagra
presentan un número de residuos de cisteína diferente al hallado en
la inmunoglobulina natural pero en los que uno o más de los residuos
de cisteína en un bolsillo superficial del anticuerpo recombinante o
fragmento reemplaza a otro residuo de aminoácido presente en la
inmunoglobulina natural [tal como se describe, por ejemplo, en las
solicitudes de patente internacional nºs PCT/GB88/00730 (WO89/01974)
y PCT/GB88/00729 (WO89/01782)].
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser
de origen policlonal, monoclonal o recombinante. Puede ser
específico para un epitopo por lo menos.
Los fragmentos de anticuerpo que se unen a
antígenos incluyen, por ejemplo, los fragmentos derivados del corte
proteolítico de un anticuerpo completo, tales como los fragmentos
F(ab')2, Fab', o Fab o los fragmentos obtenidos por técnicas
de ADN recombinante, por ejemplo, los fragmentos Fv [tal como se
describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional nº
PCT/GB88/0747 (WO89/02465)].
Los anticuerpos según la presente invención se
pueden preparar utilizando procedimientos inmunológicos bien
conocidos que utilizan como antígeno la proteína expresada durante
la infección. Así, por ejemplo, se puede inyectar cualquier huésped
adecuado con la proteína y recoger el suero para producir el
anticuerpo policlonal deseado después de la adecuada purificación
y/o concentración (por ejemplo por cromatografía de afinidad
utilizando proteína inmovilizada como medio afín). Por el
contrario, se pueden recobrar esplenocitos o limfocitos de un
huésped inyectado con la proteína e inmortalizarlos utilizando, por
ejemplo, el procedimiento de Kohler et al., [Eur. J.
Immunol., 6:511 (1976)], segregando las células resultantes para
obtener una única línea genética que produce los anticuerpos
monoclonales. Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir
utilizando procedimientos convencionales, por ejemplo, por digestión
enzimática con pepsina o papaína. Cuando se desea producir
anticuerpos recombinantes según la presente invención estos se
pueden producir utilizando, por ejemplo, los procedimientos
descritos en las solicitudes de patente europea nºs 171469, 173494,
194276 y 239400.
Los anticuerpos según la presente invención se
pueden marcar con un marcador detectable o se pueden conjugar a una
molécula efectora, por ejemplo, un fármaco, p. ej. un agente
antibacteriano o una toxina o un enzima, utilizando procedimientos
convencionales y la invención se extiende a dichos anticuerpos
marcados o anticuerpos conjugados.
Dicho anticuerpo se puede expresar, por ejemplo,
en animales transgénicos, por ejemplo, ovejas transgénicas y se
puede lograr utilizando los sistemas de expresión transgénica
existentes.
Según la presente invención también se
proporciona un procedimiento de tratamiento y diagnóstico de las
infecciones debidas a los enterococos que comprende la utilización
de un antígeno inmunodominante conservado según la presente
invención o un anticuerpo específico para el mismo o un fragmento
del mismo que se une al antígeno.
La invención resultará además evidente a partir
de la siguiente descripción, con referencia a las múltiples figuras
de las fotografías adjuntas que se muestran únicamente como ejemplos
de imunotranferencias de pacientes infectados y colonizados por
VRE.
Figura 1. Muestra inmunotransferencias pre- y
postinfección con VRE de la respuesta IgM de cinco pacientes
(carriles 1 y 2, 3 y 4, 5 y 6, 7 y 8, 9 y 10 respectivamente). El
carril 11 es una inmunotranferencia postinfección con VRE de la
respuesta IgM de un paciente. Todos los pacientes tuvieron
septicemia (Tabla 2);
Figura 2. Muestra la respuesta IgM de los
pacientes pre- y postinfección VRE. Los carriles 1 a 15 son post
infección de los 10 replicantes y la preinfección de cinco de los
replicantes (Tabla 2). Los carriles son: 1 (post, paciente 1), 2
(post, paciente 2), 3 (post, paciente 3) 4 (pre, paciente 4), 5
(post, paciente 4), 6 (pre, paciente 5), 7 (post, paciente 5), 8
(pre, paciente 6), 9 (post, paciente 6), 10 (pre, paciente 7), 11
(post, paciente 7), 12 (pre, paciente 8), 13 (post, paciente 8), 14
(post, paciente 9), 15 (post, paciente 10). El carril 16 es una
membrana de PDF teñida con azul Coomassie del extracto VRE. El
carril 17 contiene marcadores de peso molecular. Los pesos
moleculares de las bandas son tal como se indica; y
Figura 3. Muestra IgM en secuencia (carriles 1 y
2) e IgG en secuencia (carriles 3 y 4) de un paciente con septicemia
por S.aureus que se recuperó, transferida contra el extracto
de MRSA.
Los ejemplos referentes a los estafilococos se
proporcionan únicamente con fines ilustrativos.
Los siguientes experimentos muestran la
existencia de antígenos inmunodominantes conservados de
estafilococos con pesos moleculares de 69 y 37 kDa. Los pacientes
que sobrevivieron a la infección por MRSA produjeron niveles
crecientes de anticuerpo contra dichos antígenos mientras que los
que no sobrevivieron no tuvieron anticuerpo contra dichos antígenos.
Para caracterizar los antígenos, se construyó una genoteca genómica
de MRSA y se seleccionó para los antígenos reconocidos por el
dializado peritoneal y se aislaron dos clones. El anticuerpo del
dializado peritoneal que se unió al producto de expresión de los
clones aislados se separó del producto de expresión y se unió al
antígeno MRSA de 69 kDa, demostrando que el mismo epitopo estaba
desplegado tanto en el antígeno de 69 kDa como en el clon aislado.
A continuación se secuenció el ADN de MRSA clonado y se derivó y
analizó la secuencia de aminoácidos putativa de los dos marcos de
lectura abiertos (ORFs). El análisis incluyó la comparación con la
secuencia del producto de expresión derivada por secuenciación
directa de aminoácidos, comparación del peso molecular teórico con
el peso molecular observado del producto de expresión y comparación
con las secuencias de proteínas conocidas. Ello demostró que dos de
las secuencias de aminoácidos putativas (SEC ID n^{os}: 10 y 11 y
la correspondiente secuencia de ADN SEC ID nº: 9) eran posibles
productos de expresión. La comparación de las secuencias de dichas
secuencias de aminoácidos en las facilidades de búsqueda BLAST y
BEAUTY demostró que eran muy homólogas a las proteínas IstA y IstB
respectivamente del bacilus thuringiensis [Menou et
al., J. of Bacteriology, 172:6689-6696
(1990)]. El mapeo de epítopos de la SEC ID nº: 10 (denominada MRSA1)
identificó 3 epitopos (SEC ID n^{os}:12 a 14; MRSA1a, MRSA1b y
MRSA1c respectivamente) y el mapeo de epitopos de la SEC ID nº:11
(denominada MRSA2) identificó 1 epitopo (SEC ID nº:15; denominada
MRSA2A). Se encontró que el anticuerpo específico contra los
antígenos era protector en modelos animales y por consiguiente los
antígenos y los agentes que neutralizan su función son
terapéuticamente útiles. De modo semejante, los agentes de unión que
se unen específicamente a los antígenos pueden ser de utilidad
diagnóstica. Los fragmentos inmunogénicos de los antígenos se
pueden utilizar en lugar de los antígenos en si para el diagnóstico
y la terapia.
Los experimentos siguientes, identifican
antígenos conservados inmunodominantes de Enterococcus
faecium resistentes a la vancomicina (VRE) con pesos moleculares
de 54 y 97 kDa. Los pacientes que sobrevivieron a las infecciones
VRE produjeron niveles incrementados de anticuerpos contra los
antígenos, mientras que los que no sobrevivieron presentaron
durante el curso de su infección niveles de anticuerpo contra los
antígenos que no cambiaron o decrecieron. Para caracterizar los
antígenos, se construyó una genoteca genómica de VRE y se hizo una
selección de los antígenos reconocidos por un dializado peritoneal
y se aislaron dos clones. El anticuerpo de los dializados
peritoneales que se unió al producto de expresión del clon aislado
se separó del producto de expresión y se unió al antígeno VRE de 97
kDa, demostrando que el mismo epitopo estaba desplegado tanto en el
antígeno de 97 kDa como en el clon aislado. A continuación se
secuenció el ADN del VRE clonado y se derivó y analizó la secuencia
de aminoácidos putativa de los seis marcos de lectura abiertos
(ORFs). El análisis incluyó la comparación con la secuencia del
producto de expresión derivada por secuenciación de aminoácidos
directa, la comparación del peso molecular teórico con el peso
molecular del producto de expresión observado y la comparación con
las secuencias de proteínas conocidas. Ello demostró que solamente
una de las secuencias de aminoácidos putativas (SEC ID nº:2;
codificada por la secuencia de ADN SEC ID nº:1) podía corresponder
con el producto de expresión. La comparación de ésta en las
facilidades BLAST y BEAUTY demostró que era muy homóloga a la de las
proteínas transportadoras ABC conocidas, en particular a la de los
lugares de unión a ATPasa en los transportadores ABC. El mapeo de
epitopos de la SEC ID nº:2 identificó 1 epitopo genérico y cinco
epitopos específicos (SEC ID n^{os}: 3 a 8) que corresponden a
zonas en el transportador ABC, en particular en y alrededor de las
zonas de unión a ATP. El suero de paciente y el dializado que se
unió a los antígenos de 97 kDa y 54 kDa y a los epitopos fue
protector en un modelo animal y por consiguiente los agentes que
neutralizan la función de los transportadores ABC de patógenos tales
como las bacterias y los hongos se pueden utilizar con fines
terapéuticos. Los agentes que detectan transportadores ABC
específicos también se pueden utilizar para el diagnóstico.
El antígeno se preparó mediante el siguiente
procedimiento. Utilizando un aislado clínico de enterococos
resistentes a la vancomicina, una cepa epidémica de MRSA 16, una
cepa epidémica de MRSA 2, el S. aureus Oxford y un aislado
clínico de S. epidermis, se inocularon 10 ml de caldo de
infusión de corazón cerebro (Oxoid) con el organismo y se creció a
37ºC aeróbicamente durante 4 horas. Esto se añadió a 300 ml del
mismo caldo y se incubó en un agitador orbital a 37ºC durante 24
horas. El cultivo se centrífugo a 2500 g durante 15 minutos, se
resuspendió en 10 ml de 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) y
se centrífugo de nuevo como anteriormente. A continuación, se
fragmentó el organismo en una prensa hidráulica (Enkoping, Sweden) a
-20ºC, se centrífugo a 13.000 rpm durante 30 minutos y el
sobrenadante (que contiene el antígeno) se almacenó a -20ºC. A
continuación se prepararon lotes de antígeno para VRE y MRSA 16
creciéndolos a 30ºC y 37ºC en presencia de 3 \mug/ml de
vancomicina.
El suero recogido había sido sometido a los
laboratorios de bacteriología, virología y bioquímica para los
ensayos de rutina. Se almacenó a -20ºC hasta que se necesitó para
las inmnotransferencias.
Los pacientes de septicemia del Grupo 1
presentaron señales y síntomas (p. ej. pirexia) consistentes con la
infección cuando se aisló el VRE de los cultivos de sangre. Dichos
pacientes fueron neutropénicos durante la admisión secundaria a
quimioterapia para cánceres hematológicos (en su mayoría leucemias).
Se definió la neutropenia como una cuenta de neutrófilos de <
1,0 x 10^{9}/l. Los sueros pre- y postinfección se conservaron y
ensayaron en paralelo. Éstos se separaron en sobrevivientes y no
sobrevivientes (los que tuvieron cultivos de sangre positivos a un
VRE que no respondieron a la quimioterapia y murieron).
Además, se dispuso de dializado peritoneal de un
paciente único con una peritonitis debida a un VRE.
Se consideró que los pacientes del Grupo 2
estaban colonizado por VRE, ya que en el momento del aislamiento de
tales organismos el paciente no tenía signos de o síntomas de
infección que pudiesen ser atribuidos a VRE. Este grupo se dividió
en Grupo 2a y Grupo 2b. El Grupo 2a consistió en pacientes todos los
neutropénicos en algún momento de su enfermedad. Por consiguiente,
se hará referencia a este grupo como el de pacientes neutropénicos
colonizados. Los pacientes del Grupo 2b fueron todos pacientes
renales o de cuidados intensivos y ninguno había sido neutropénico.
A dicho subgrupo se lo referirá como al de pacientes colonizados no
neutropénicos. El suero postcolonización solo se guardó de los
pacientes del Grupo 2 debido a que la colonización puede ser
intermitente y en un paciente cualquiera nunca
queda claro exactamente cuando fue inicialmente colonizado, o si quizás fue colonizado durante una admisión anterior.
queda claro exactamente cuando fue inicialmente colonizado, o si quizás fue colonizado durante una admisión anterior.
Los pacientes del Grupo 3 constituyeron el grupo
control para el estudio de VRE. El suero había sido rutinariamente
recogido de mujeres embarazadas de la comunidad que atendían a las
clínicas prenatales. El nivel de VRE en la comunidad es bajo en la
actualidad y la mayoría de las mujeres no se debería haber
encontrado con él. Los pacientes hospitalizados no fueron
utilizados como grupo control debido a la posibilidad de que
hubiesen sido colonizados por VRE sin conocerlo.
El Grupo 4 fue de pacientes con una septicemia
debida a un MRSA, cultivos de sangre positivos, que fueron tratados
por terapia con vancomicina. Los sueros apareados estuvieron
disponibles antes y después de la septicemia. Además, se dispuso del
dializado de peritoneo de un paciente único con peritonitis debida
a MRSA.
El Grupo 5 fue de pacientes colonizados por MRSA
que no mostraron síntomas clínicos de infección.
El Grupo 6 de pacientes fue el grupo de control
para el estudio de MRSA. El suero había sido rutinariamente recogido
de mujeres embarazadas de la comunidad que habían atendido a las
clínicas prenatales.
El Grupo 7, fue de pacientes con septicemia
debida a MSSA (S. aureus sensible a meticilina), cultivos de
sangre positivos que fueron tratados con éxito. Antes y después de
la septicemia se dispuso de sueros apareados.
Se preparó un gel de poliacrilamida de 1,5 mm de
grosor en un aparato vertical para geles Protean II xi Cell
(Biorad). Se vertió primero un gel separador del 10% y se dejó
polimerizar a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se colocó un
peine de 10 carriles en la parte superior de éste y se vertió el gel
apilador alrededor y sobre el gel separador. Se dejó polimerizar
durante 30 minutos. Se utilizaron los siguientes componentes para
preparar los geles:
| 30% acrilamida/0,8% bisacrilamida | 25 ml | |
| (Ultra pure Protogel, National Diagnostics) | ||
| Tampón para el gel separador (ver más adelante) | 14,06 ml | |
| 10% SDS | 0,75 ml | |
| Agua destilada | 32,2 ml | |
| 10% persulfato amónico | 350 \mul | |
| TEMED | 37,5 \mul |
| Tris | 24,22 g | |
| Agua destilada | 40 ml |
Ajustar el pH a 8,8 con HCl concentrado,
completar hasta 100 ml con agua destilada.
| 30% acrilamida/0,8% bisacrilamida | 3,6 ml | |
| Tampón para el gel apilador (ver más adelante) | 7,3 ml | |
| 10% SDS | 0,3 ml | |
| Agua destilada | 19 ml | |
| 10% persulfato amónico | 300 \mul | |
| TEMED | 30 \mul |
| Tris | 6,05 g | |
| Agua destilada | 90 ml | |
| Ajustar el pH a 6,8 con HCl concentrado. |
El antígeno que se va a separar en el gel se
disolvió hirviéndolo con tampón de craqueo y agua destilada. Éste
fue VRE y la cepa epidémica 16 de MRSA crecida a 37ºC para todos los
sueros. Cinco sueros positivos a anticuerpo, derivados de casos de
septicemia por VRE se ensayaron contra VRE crecido a 30ºC y a 37ºC
en presencia de vancomicina (3 \mug/ml). Dos antisueros positivos
a anticuerpo, derivados de pacientes de septicemia por MRSA se
inmunotransfirieron contra MRSA 2 y S.aureus Oxford. Otros 8
sueros adicionales se inmunotransfirieron contra el antígeno
derivado de S. epidermis y la cepa epidémica 16 de MRSA
crecida a 30ºC y la cepa epidémica 16 de MRSA crecida a 37ºC en
presencia de vancomicina (3 \mug/ml). Se hirvieron múltiples de
los siguientes ya que se encontró que la cantidad de proteína en
esta proporción daba buenos resultados en la inmunotransferencia:
sobrenadante (conteniendo antígeno), 15 \mul; agua destilada, 10
\mul; tampón de craqueo, 25 \mul.
| 20% SDS | 4ml | |
| Tampón para apilar | 1ml | |
| Agua destilada | 4 ml | |
| 2-mercaptoetanol | 0,4 ml | |
| Glicerina | 0,6 ml |
Azul de Bromofenol - una pequeña cantidad añadida
hasta que el tampón vuelve azul.
Cada carril se cargó con 50 \mul de la mezcla
anterior. Se utilizaron marcadores de peso molecular con los
colores del arco iris (Amesham Life Science) en uno de los carriles
de cada gel. Se hirvieron 20 \mul de marcador con 20 \mul de
tampón de craqueo antes de la carga. Los marcadores de peso
molecular fueron: miosina 220.000, fosforilasa B 97.400, albúmina de
suero bovino 66.000, ovalbúmina 46.000, anhidrasa carbónica 30.000,
inhibidor de la tripsina 21.500 y lisozima 14.300 (todos los pesos
moleculares están dados en Daltons).
El tampón de electroforesis se colocó en el
tanque de electroforesis y en la celda sobre el gel. Ello formó el
sistema discontinuo de tampones. La electroforesis se realizó con
una corriente constante de 40 mA por gel, con enfriamiento por agua.
Se corrió hasta que el frente del colorante justo salió del gel.
| Tris | 18,96 g | |
| Glicina | 12 g | |
| SDS | 3 g | |
| Agua destilada hasta | 1 l |
El gel fue extraído cuidadosamente de entre las
placas de cristal y se eliminó el gel de apilar. El gel de separar
se colocó a continuación sobre papel de nitrocelulosa (Biorad) y
esta se envolvió en papel de filtro. La nitrocelulosa y el papel de
filtro habían sido previamente remojados en tampón de transferencia.
Esto se colocó en un tanque de transferencia (Hoefer) que contenía
tampón de transferencia. La corriente se pasó al máximo durante 45
minutos y el sistema se enfrió por agua. Se retiró la nitrocelulosa
y se bloqueó durante la noche en 3% albúmina de suero bovino (BSA) a
4ºC.
| Tris | 9,07 g | |
| Glicina | 43,2 g | |
| Metanol | 750 ml | |
| Agua destilada | 3l |
| Cloruro sódico | 9 g | |
| Tris | 1,2 g | |
| Agua destilada | 1 l |
El papel de nitrocelulosa se cortó en tiras que
correspondieron con los carriles y cada una se coloco en un
compartimiento separado de un recipiente de incubación. Se añadió
disolución de (3%) BSA a cada tira y suficiente cantidad del suero
apropiado para producir una dilución de 1:10. Se agitó a
temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación las tiras se
lavaron en disolución de lavado durante 30 minutos con cambios de la
disolución cada 6 minutos. A continuación se añadió una dilución
1:1000 de inmunoglobulina antihumana conjugada a fosfatasa alcalina
(Sigma) en 3% BSA. La principal inmunotransferencia para sueros
derivados de pacientes colonizados o infectados fue para IgA, IgM e
IgG. Por consiguiente se necesitaron tres tiras para cada suero,
una incubada con IgA antihumana, otra con IgM antihumana y otra con
IgG antihumana. El grupo de control tuvo una tira incubada con las
tres inmunoglobulinas a la vez. Éstas se agitaron durante 1 hora a
temperatura ambiente y a continuación se repitió la etapa de lavado.
El sustrato se preparó añadiendo 660 \mul de disolución de
nitroblue tetrazolium y 330 \mul de disolución de
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato a 100 ml de tampón alternativo para sustrato de fosfatasa
alcalina y se añadieron 4 ml de éste a cada una de las tiras y se
agitó durante 20 minutos. Se encontró que este era el tiempo
necesario para que las tiras se tiñan suficientemente bien.
| Cloruro sódico | 4,5 g | |
| Tween 20 | 0,25 ml | |
| Agua destilada | 500 ml |
| Nitroblue tetrazolium | 0,05 g | |
| 70% N,N-dimetilformamida | 1 ml |
| BCIP | 0,05 g | |
| 70% N,N-dimetilformamida | 1 ml |
| Tris | 1,12 g | |
| Cloruro sódico | 0,58 g | |
| Cloruro de magnesio | 0,1 g | |
| Agua destilada | 100 ml | |
| Ajustar a pH 9,5 |
Las inmunotransferencias (Tablas 1 y 2; Figuras 1
y 2) demostraron una multiplicidad de bandas antigénicas de entre
las cuales cuatro fueron inmunodominantes (97, 57, 54 y 40 kDa).
Estos antígenos estuvieron conservados entre los aislados y
estuvieron presentes cuando las cepas se crecieron con y sin
vancomicina. Se produjo IgG contra la banda de 97 kDa en 11 de los
12 pacientes que sobrevivieron una septicemia y estuvo presente en
12 de los pacientes neutropénicos que no desarrollaron una
septicemia. Se produjo IgM en 8 e IgA en 4 de los pacientes de
septicemia. En el caso del antígeno de 54 kDa, 10 de los pacientes
con septicemia produjeron una respuesta de IgM y 5 una respuesta de
IgA. Cuatro pacientes neutropénicos que no desarrollaron una
septicemia produjeron una respuesta de IgM. Un paciente en diálisis
peritoneal crónica en el ambulatorio e infección en el fluido debida
a VRE produjo una respuesta de IgM a las bandas de 97 y 54 kDa en el
suero y el dializado y no produjo respuesta de IgG. El dializado se
utilizó para seleccionar la genoteca de expresión (mas
adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos de enterococos de 97 y 54 kDa son
inmunodominantes y se pueden utilizar terapéuticamente y
diagnósticamente. Una inmunotransferencia adicional demostró la
presencia del antígeno cuando el VRE se creció a 30ºC y en presencia
de vancomicina a 37ºC.
El suero para inmunotranferencias (Tabla 3;
Figura 3) reveló múltiples antígenos con pesos moleculares
aparentes entre 31 y 120 kDa. Las bandas más inmunodominantes
fueron de 69 y 37 kDa. En el grupo de septicemias se produjo un
incremento de la IgM ó IgG contra la banda de 69 kDa en 3 de los 5
pacientes. Respectivamente los números para la banda de 37 kDa
fueron 4 para la IgM y 3 para la IgG. Dichos anticuerpos estuvieron
ausentes en el paciente que murió pero estuvieron presentes en
algunos de los pacientes que fueron colonizados y no desarrollaron
la infección. También estuvieron presentes, en baja cantidad, en
los sueros control de las mujeres embarazadas. El dializado
peritoneal reaccionó con las bandas de 37 kDa (IgG) y 69 kDa (IgM e
IgG) y se utilizó para seleccionar una genoteca de expresión (más
adelante).
Los pacientes se seroconvierten al antígeno de 37
kDa si se recuperan y también despliegan inmunogenicidad al antígeno
de 69 kDa. Por consiguiente los antígenos de 37 y 69 kDa se pueden
utilizar terapéuticamente y diagnósticamente. Bandas equivalentes
de 120, 84, 69, 53 y 37 kDa también se demostraron por
imunotransferencia en las cepas de MRSA y S. aureus Oxford y
bandas de 120, 69 y 37 kDa en S. epidermidis.
Para ensayar el potencial terapéutico del
anticuerpo específico a los antígenos de E. faecium, se
inyectaron 10 ratones control con 200 \mul de disolución salina y
10 ratones ensayo con 200 \mul de antisuero de un paciente que se
había recuperado de una septicemia. Una hora más tarde cada ratón
se inyectó con 100 \mul que contenían 5 x 10^{8} unidades
formadoras de colonia (CFU) de E. faecium resistente a
vancomicina.
De los 10 ratones control murieron 8, mientras
que de los ratones ensayo solamente murieron 4, lo que indica que el
anticuerpo específico al antígeno enterococal inmunodominante se
puede utilizar terapéuticamente.
Dos conjuntos de 30 ratones hembra
CD-1 que pesaban 22 g cada uno se infectaron por la
vena de la cola con un bolo de 3 x 10^{9}/100 \mul de E.
faecium resistente a vacomicina. A continuación los ratones
infectados se inyectaron con 200 \mul (Grupo A) de fluido
peritoneal dializado (tal como se describió anteriormente) de un
paciente con peritonitis CAPD debida a VRE, o se inyectaron con
(Grupo B) 200 \mul de fluido normal.
A las 48 horas murieron 5 de 30 en el Grupo A,
contra 9 de 30 en el Grupo B.
Se obtuvo suero de dos pacientes. El paciente 1
se había recuperado de un abceso subfrénico que había sido tratado
con vancomicina. El anticuerpo del suero del paciente 1 fue positivo
tanto para el antígeno de 37 como para el de 69 kDa. El paciente 2
había sido tratado con vancomicina para una septicemia de MRSA. El
anticuerpo del suero del paciente 2 fue preinmune temprano y
negativo para los antígenos de 37 y 69 kDa. Los ensayos con
vancomicina demostraron que el paciente 2 tuvo un nivel de
vancomicina superior (30 \mug/ml) al del paciente 1 (12
\mug/ml). A 20 ratones CD-1 se les suministró por
vía intravenosa 1 x 10^{7} de MRSA, cepa epidémica 16, y 2 horas
más tarde a dos grupos de 10 ratones cada uno se les suministraron
100 ml de suero del paciente 1 o del paciente 2, como un único
volumen intravenoso.
Los resultados (Tabla 4) muestran que el
antisuero positivo tanto para el antígeno de 37 como para el de 69
kDa protegió contra MRSA, con una mortalidad del 20% en el grupo
tratado con el paciente 1 (anticuerpo positivo tanto para el
antígeno de 37 como para el de 69 kDa) en comparación con una
mortalidad del 50% en el otro grupo.
Se construyó una genoteca genómica (una para cada
uno de Enterococus faecium y Staphilococcus
aureus de resistencia múltiple) en el vector de
expresión/clonaje lambda ZAP express, esencialmente tal como se
describe en Young and Davies (PNAS USA,
80:1194-1198 (1983). El ADN cromosómico de un
aislado clínico se digirió parcialmente con Sau3a y los fragmentos
con tamaños entre 2 y 9 kbp se insertaron en el vector, resultando
en la producción de la proteína de fusión con
\beta-galactosidasa. Cada genoteca se seleccionó
con unos fluidos peritoneales dializados positivos a anticuerpo
(bandas de 37 y 69 kDa para MRSA o bandas de 54 y 97 kDa para VRE)
de pacientes con las infecciones respectivas (dilución 1 a 100). Los
clones positivos se detectaron utilizando inmunoglobulina (IgG) de
cabra antihumana conjugada a fosfatasa alcalina (1 en 5.000) (Sigma,
Poole UK). Los lisógenos se prepararon a partir de clones positivos
en Escherichia coli Y1089 según Huynh, Young and Davies
(1985, DNA cloning vol 1, a practical approach, IRL Press Oxford, p
49-78, Ed. D.M. Glover). Las proteínas de fusión a
\beta-galactosidasa se detectaron mediante
inmunotransferencia utilizando los respectivos dializados de fluido
peritoneal (1 en 10) y un anticuerpo monoclonal contra
\beta-galactosidasa (1 en 1.000). El
epitopo expresado por cada uno de los clones positivos se identificó
mediante selección por antígeno según se describe en Lyon et
al., (PNAS USA, 83:2989-2993 (1986).
Para ello, el fluido de dializado peritoneal se purificó por
afinidad mediante hibridación a placas positivas de lambda
recombinante. El anticuerpo unido se eluyó con tampón de glicina pH
2,8 y se utilizó para inmunotransferir los homogeneizados de las
bacterias relevantes.
Se utilizó PCR con cebadores directos e inversos
T3 y T7 para amplificar el inserto de ADN de los clones
seropositivos. Esto fue subclonado en el TA Cloning System
(versión 1.3, Invitrogen Corporation, Oxon, UK) antes de la
secuenciación de ADN utilizando el procedimiento de terminación por
dideoxi (kit de secuenciación versión 2.0; United States
Biochemical, Cambridge, UK). Las reacciones de secuenciación
iniciales se realizaron utilizando cebadores de secuenciación
universales, la secuencia restante se determinó utilizando una
estrategia de paseo con cebadores mediante la síntesis de cebadores
de secuenciación progresivos para generar los nuevos datos de la
secuencia.
Una serie de nonapéptidos solapados que cubrió la
secuencia de aminoácidos derivada, fue sintetizada en pernos de
polietileno con los reactivos de un kit para el barrido de epitopos
(Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, UK) tal como se
describió anteriormente en Geysen et al., Journal of
Immunological Methods, 102:259-274 (1987). El
péptido 1 consistió en los residuos 1 a 9, el péptido 2 consistió en
los residuos 2 a 10 etc. Ello se realizó para las proteínas
transportadoras ABC derivadas de VRE (Figura 1) y MRSA1 y MRSA2 del
clon MRSA. La reactividad de cada péptido con el suero del paciente
(diluido 1 a 2000) se determinó para la IgG mediante ELISA. Los
datos se expresaron como la A405 después de 30 minutos de
incubación.
Los sueros fueron positivos a anticuerpo, 54 y 97
kDa de pacientes que se recuperaron de septicemia por VRE (n = 6) y
el control fue una muestra de suero de un paciente que murió a
continuación de una septicemia provocada por VRE (n = 1). Para
MRSA1 y MRSA2, se mapeó el suero de pacientes que se habían
recuperado de la infección (n = 3) y el control fue de un paciente
que había muerto (n = 1).
Se detectaron 4 colonias positivas con el
dializado del paciente. Dos de éstas produjeron una proteína de
fusión de 180 kDa que reaccionó con el dializado peritoneal y con un
anticuerpo monoclonal específico para
\beta-galactosidasa. La selección de antígenos
demostró un epitopo expresado por las dos colonias probadas que
reaccionó con el antígeno de 69 kDa de MRSA cepa epidémica 16. La
secuenciación demostró que había 2 ORFs homólogos a las proteínas
IstA y IstB expresadas por la secuencia de inserción IS232 del
Bacilus thuringiensis [Menou et al., J. of
Bacteriology, 172:6689-6696 (1990)].
Se detectaron cuatro colonias positivas con el
dializado de paciente. Dos de éstas produjeron una proteína de
fusión de 140 kDa que reaccionó tanto con el dializado peritoneal
como con el anticuerpo monoclonal a
\beta-galactosidasa. La selección de antígenos
demostró un epítopo para dos de los clones que reaccionó con el
antígeno de 97 kDa de la cepa VRE.
La secuenciación demostró una secuencia parcial
en el marco de lectura del gen de la
\beta-galactosidasa. El tamaño total del inserto
fue de 4,5 kb. La secuencia de aminoácidos derivada produjo una
proteína con dos dominios de unión a ATP y con secuencia homóloga a
la del grupo de proteínas que son transportadores ABC [Fath and
Kolter, Microbiological Reviews, 57:995-1017
(1993)].
Éste mostró 5 epitopos tal como se derivó de tres
o más pocillos consecutivos con una densidad óptica media de por lo
menos dos desviaciones estándar sobre los resultados del suero del
paciente control. Para VRE éstos fueron SEC ID n^{os}: 3 a 8;
para MRSA1 éstos fueron SEC ID n^{os}: 12 a 14; y para MRSA2 fue
SEC ID nº: 15.
(1) Información General:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre: NeuTec Pharma plc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Calle: Clinical Science Building, Central Manchester Healthcare
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Ciudad: Trust, Oxford Road, Manchester
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- País: GB
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal (ZIP): M13 9WL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Titulo de la invención: Tratamiento y diagnóstico de las infecciones de cocos Gram positivos.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Número de secuencias: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Forma legible por ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Tipo de medio: disquete de 31/2
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Ordenador: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Programa: PatentIn Versión 1.0, Versión 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- Datos de solicitud anterior:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Número de solicitud: GB 9614274.0
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Fecha de presentación: 06-Jul-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 540 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 180 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Xaa Gly Lys Ser Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Gln His Leu Asn Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Val Gly Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Pro Lys Asn Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Val Ala Ile Ala Gly Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 1457 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 347 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 100 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Val Asp Trp Lys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Phe Glu Tyr Thr Glu Gly Val Pro
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia.
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Descripción de la secuencia: SEC ID nº:
14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Lys Ser Gly Val Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Val Gly Lys Thr His Leu Ala}
Claims (18)
1. Fragmento inmunogénico de una proteína
bacteriana transportadora ABC para su utilización en un
procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal, siendo
la bacteria un enterococo y presentando el fragmento inmunogénico
la secuencia de SEC ID nº: 3, o siendo la bacteria E. faecium
y presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de una
cualquiera de entre SEC ID n^{os}: 4 a 8.
2. Utilización de una proteína bacteriana
transportadora ABC que presenta la secuencia de SEC ID n^{os}: 1 y
2 o un fragmento inmunogénico de la misma en la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento de una infección causada por
dicha bacteria.
3. Utilización de anticuerpos específicos de una
proteína bacteriana transportadora ABC que presenta la secuencia de
SEC ID n^{os}: 1 y 2 o un fragmento inmunogénico de la misma en la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de
infecciones debidas a dicha bacteria.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 y 3 de una proteína bacteriana transportadora ABC
o un fragmento inmunogénico de la misma; o anticuerpos y fragmentos
de los mismos que se unen al antígeno, específicos de la proteína
bacteriana transportadora ABC o fragmentos inmunogénicos de la
misma, siendo la bacteria un enterococo.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 y 3 de una proteína bacteriana transportadora ABC
que presenta la secuencia de SEC ID nº:1 o un fragmento inmunogénico
de la misma o ribozimas y cadenas de ácidos nucleicos específicos de
la proteína bacteriana transportadora ABC o fragmento inmunogénico
de la misma, siendo la bacteria un enterococo.
6. Utilización según las reivindicaciones 4 ó 5
de una proteína bacteriana transportadora ABC o un fragmento
inmunogénico de la misma; o anticuerpos, o fragmentos de los mismos
que se unen al antígeno, ribozimas y cadenas de ácidos nucleicos
antisentido específicos para la proteína bacteriana transportadora
ABC o fragmento inmunogénico de la misma, siendo seleccionada la
bacteria de entre el grupo constituido por E. faecium, E.
faecalis, E. avium, E.gallinarum, E.durans, E. mundtii y E.
casseflavus.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5 ó 6 de una proteína bacteriana transportadora
ABC o un fragmento inmunogénico de la misma; o anticuerpos,
fragmentos de los mismos que se unen al antígeno, ribozimas
y cadenas de ácidos nucleicos antisentido específicos de la proteína bacteriana transportadora ABC o fragmento inmu-
nogénico de la misma, siendo la proteína transportadora ABC un antígeno conservado inmunodominante de 97 kDa.
y cadenas de ácidos nucleicos antisentido específicos de la proteína bacteriana transportadora ABC o fragmento inmu-
nogénico de la misma, siendo la proteína transportadora ABC un antígeno conservado inmunodominante de 97 kDa.
8. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7 de una proteína bacteriana transportadora ABC
o un fragmento inmunogénico de la misma; o anticuerpos, fragmentos
de los mismos que se unen al antígeno, ribozimas y cadenas de ácidos
nucleicos antisentido específicos de la proteína bacteriana
transportadora ABC o fragmento inmunogénico de la misma,
comprendiendo el fragmento inmunogénico un lugar de unión a ATP o
una parte del mismo.
9. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8 de una proteína bacteriana transportadora ABC
o un fragmento inmunogénico de la misma; o anticuerpos, fragmentos
de los mismos que se unen al antígeno, ribozimas y cadenas de ácidos
nucleicos antisentido específicos de la proteína bacteriana
transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo
la bacteria un enterococo y presentando el fragmento inmunogénico la
secuencia de SEC ID nº:3.
10. Utilización según la reivindicación 9 de una
proteína bacteriana transportadora ABC o un fragmento inmunogénico
de la misma; o anticuerpos, fragmentos de los mismos que se unen al
antígeno, ribozimas y cadenas de ácidos nucleicos antisentido
específicos de la proteína bacteriana transportadora ABC o un
fragmento inmunogénico de la misma, siendo la bacteria E.
faecium y presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de
SEC ID nº:4.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 8 de una proteína bacteriana transportadora ABC
o un fragmento inmunogénico de la misma; o anticuerpos, fragmentos
de los mismos que se unen al antígeno, ribozimas y cadenas de ácidos
nucleicos antisentido específicos de la proteína transportadora ABC
o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la bacteria E.
faecium y presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de
una cualquiera de entre SEC ID n^{os}:5 a 8.
12. Fragmento inmunogénico de una proteína
bacteriana transportadora ABC para su utilización en un
procedimiento de diagnóstico de un cuerpo humano o animal, siendo la
bacteria un enterococo y presentando el fragmento inmunogénico la
secuencia de SEC ID nº:3, o siendo la bacteria E. faecium y
presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de una cualquiera
de entre SEC ID n^{os}:4 a 8.
13. Utilización de un fragmento inmunogénico de
una proteína bacteriana transportadora ABC para la producción de un
agente de diagnóstico para su utilización en el diagnóstico de una
infección por una bacteria, siendo la bacteria un enterococo y
presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de SEC ID nº: 3,
o siendo la bacteria E.faecium y presentando el fragmento
inmunogénico la secuencia de una cualquiera de entre las SEC ID
n^{os}: 4 a 8.
14. Utilización de un agente de unión específico
de un fragmento inmunogénico de una proteína bacteriana
transportadora ABC para la preparación de un agente de de
diagnóstico para su utilización en el diagnóstico de una infección
del cuerpo humano o animal por una bacteria, siendo la bacteria un
enterococo y presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de
SEC ID nº: 3, o siendo la bacteria E. faecium y presentando
el fragmento la secuencia de cualquiera de entre SEC ID n^{os}: 4
a 8.
15. Utilización de un agente de unión específico
de un fragmento inmunogénico de una proteína bacteriana
transportadora ABC destinado a la preparación de un kit de prueba
de diagnóstico, siendo la bacteria un enterococo y presentando el
fragmento inmunogénico la SEC ID nº:3, o siendo la bacteria E.
faecium y presentando el fragmento inmunogénico la secuencia de
cualquiera de entre SEC ID n^{os}:4 a 8.
16. Procedimiento de ensayo de diagnóstico para
una proteína bacteriana transportadora ABC o un fragmento
inmunogénico de la misma que comprende las etapas siguientes:
- i)
- hacer reaccionar un agente de unión tal como se define en la reivindicación 14 con una muestra de un paciente;
- ii)
- detectar una reacción entre el agente de unión y el antígeno; y
- iii)
- relacionar la detección de la reacción con la presencia de la proteína o un fragmento inmunogénico de la misma.
17. Procedimiento de ensayo de diagnóstico según
se define en la reivindicación 15, comprendiendo el agente de unión
un anticuerpo y comprendiendo las etapas siguientes:
- i)
- hacer reaccionar un agente de unión según la reivindicación 14 con una muestra de un paciente;
- ii)
- detectar una reacción de unión anticuerpo-antígeno; y
- iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión anticuerpo-antígeno con la presencia de la proteína o un fragmento inmunogénico de la misma.
18. Procedimiento de ensayo de diagnóstico para
un anticuerpo específico contra la proteína bacteriana
transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la misma, que
comprende las etapas siguientes:
- i)
- hacer reaccionar un fragmento inmunogénico de una proteína transportadora ABC con el antisuero de un paciente, siendo el fragmento inmunogénico de un enterococo y presentando la secuencia SEC ID nº: 3, o siendo el fragmento inmunogénico de E. faecium y presentando la secuencia de una cualquiera de entre SEC ID n^{os}: 4 a 8;
- ii)
- detectar una reacción de unión anticuerpo-antígeno; y
- iii)
- correlacionar la detección de una reacción de unión anticuerpo-antígeno con la presencia de un anticuerpo específico contra la proteína bacteriana transportadora ABC o un fragmento inmunogénico de la misma.
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