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ES2451618T3 - Matriz de proteína maleable y usos de estas - Google Patents

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ES2451618T3
ES2451618T3 ES02787279.5T ES02787279T ES2451618T3 ES 2451618 T3 ES2451618 T3 ES 2451618T3 ES 02787279 T ES02787279 T ES 02787279T ES 2451618 T3 ES2451618 T3 ES 2451618T3
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ES
Spain
Prior art keywords
lactobacillus
bifidobacterium
matrix
mpm
subsp
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES02787279.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Simard
Dominique Pilote
Claude Dupont
Nathalie Lajoie
Marcel Paquet
Pierre Lemieux
Philippe Goyette
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOLACTIS Inc
TECHNOLOGIE BIOLACTIS Inc
Original Assignee
BIOLACTIS Inc
TECHNOLOGIE BIOLACTIS Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOLACTIS Inc, TECHNOLOGIE BIOLACTIS Inc filed Critical BIOLACTIS Inc
Application granted granted Critical
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Abstract

Un proceso para preparar una matriz de proteína maleable, dicho proceso comprende las etapas de: a) fermentar una solución de proteína de suero con bacterias en un medio; b) aglomerar las proteínas a partir de la solución de proteína de la etapa a); y c) aislar las proteínas aglomeradas del sobrenadante; caracterizado porque dichas bacterias comprenden al menos un bacteria seleccionada de R2C2, INIX, ES1 y K2.

Description

Matriz de proteina maleable y usos de estas Antecedentes de la invencion
(a)
Campo de la invencion Esta invencion se refiere a una matriz de proteina maleable natural y biodegradable, el metodo de preparacion de esta, y composiciones de esta, tales como alimento, cosmetico, nutraceutico, composiciones de alimento funcional y farmaceuticas.
(b)
Descripcion de la tecnica anterior La alta demanda del producto bajo en grasa lidera la industria de alimentos para desarrollar alimentos sustitutos. La alta demanda de tal producto se basa en estudios que recomiendan una disminucion en el consumo diario de grasa, siendo importante que el alimento sustituto tenga caracteristicas sensoriales interesantes como el alimento original (sabor, olor, textura, etc.). Otro campo que esta en aumento intensivo es los alimentos nutraceuticos y funcionales. El alimento funcional es un alimento con efectos beneficiosos sobre la salud. El consumo mundial de estos nuevos alimentos es de alrededor de 70 MM$ en una base anual. La popularidad de estos productos es tan alta que se espera que las ventas mundiales sean de 500 MM$ en 2010. En la industria cosmetica y farmaceutica, existe una necesidad muy sentida de materia prima para las formulaciones, proteccion y liberacion controlada de ingredientes activos. Varios productos ya existen, pero la mayoria de ellos son muy caros. La industria esta siempre en la necesidad de nuevas tecnologias y productos que produciran mejores resultados a un costo inferior. La ultrafiltracion, osmosis inversa y procesos de secado son algunos de los metodos usados actualmente para la valorizacion de las proteinas del suero de la denominada suero de leche, un subproducto de la elaboracion de queso. Estos metodos son eficientes pero extremadamente caros y no generan un producto facilmente utilizable en una variedad de sectores industriales. El hecho de que el costo de las instalaciones de los metodos anteriormente mencionados sea alto es un problema para la industria del queso en general. Solo los grandes fabricantes de queso con posiciones financieras fuertes y la generacion de grandes volumenes de suero de leche pueden alcanzar la rentabilidad con los metodos anteriormente mencionados a pesar de los altos costos. Ya que el suero de leche no se puede desechar libremente en el medio ambiente pues constituye un contaminante por sf mismo, los pequefos fabricantes tienen por lo tanto, que gastar dinero para desechar el suero de leche que se usa principalmente para la alimentacion animal. Procesos mas simples y menos costosas se desarrollaron para recuperar las proteinas de suero pero tambien con desventajas concomitantes. Los metodos que usan la temperatura, pH, sal, enzimas, fermentacion y floculacion se encuentran entre los principales parametros usados para ayudar a la recuperacion de las proteinas del suero, pero generalmente conducen a aislamientos que presentan pobre calidad y valor comercial. La patente CA 2,247,824 por Lewandoski y co-inventores describe un proceso para la produccion de biomasa microbiana a partir del efluente de los productos lacteos. La biomasa resultante de ese proceso se usa solamente para la alimentacion animal. Sin embargo, este producto no tiene propiedades funcionales tales como propiedades emulsificantes que se necesitan para las aplicaciones en la alimentacion humana. Muchos procesos y metodos se ofrecen para reemplazar la grasa en los productos alimenticios. Los aglomerados de las proteinas de suero se usan para reemplazar la grasa como tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,358,730. El proceso consiste en un tratamiento termico de proteinas de suero a un pH por encima de su punto isoelectrico con la adicion de sal. El proceso conduce a la formacion de grumos (geles solidos que se pueden cortar en pequefos fragmentos) que pueden usarse en el reemplazo de grasa. Las proteinas del suero se usan ampliamente en la industria alimentaria por sus propiedades funcionales. Sin embargo, este producto es un producto solido y no maleable, que es dificil de usar en la mayoria de los alimentos, cosmeticos, aplicaciones farmaceuticas y nutraceuticos. Las proteinas son ademas excelentes formadores de pelicula, agentes acondicionadores e hidratantes para el cabello y la piel. Sin embargo, las proteinas naturales generalmente tienen uso limitado en cosmeticos y articulos de tocador porque son un poco inestables y tienden a precipitar o desnaturalizar cuando se exponen a altas temperaturas o a soluciones salinas. Ademas frecuentemente son hidrolizadas por reactivos quimicos o acidos y bases. Incluso si se superan estas dificultades, la formulacion de productos cosmeticos que contienen proteinas esta mas cargada de dificultades, ya que cada proteina tiene un punto isoelectrico es decir un pH al cual la proteina es neutra. Si se desea formar composiciones que tienen un pH que esta por debajo del punto isoelectrico de la proteina, la proteina posiblemente puede formar un precipitado insoluble.
Ademas, un gran numero de productos alimenticios como la mayonesa, aderezos, margarina, extensores o sustitutos bajo en grasa o cero en grasa, se pueden estabilizar con polisacaridos como estabilizadores de la emulsion o agentes espesantes. Ademas en los campos de la medicina, farmaceutica y cosmetica, los polisacaridos se usan como estabilizadores de la emulsion. Los polisacaridos bien conocidos se obtienen a partir de una variedad de semillas de plantas, por ejemplo, goma de guar de Cyamopsis tetragonaloba (guar) o goma de algarrobilla (LBG) de algarrobo. Otras fuentes bien conocidas son las algas, dando carragenina, alginatos o agar.
El uso de polisacaridos y proteinas en las composiciones cosmeticas es bien conocido en la tecnica. Los polisacaridos son conocidos por ser buenos humectantes, formadores de pelicula, y funcion como hidratantes de la piel. Ciertos polisacaridos tienen ademas la capacidad gelificante y son utiles en la formacion de composiciones liquidas o solidas de mayor viscosidad. Sin embargo, los polisacaridos pueden tender a proporcionar una sensacion pesada, pegajosa en la piel y, cuando se usa en cantidades suficientes para causar la gelificacion, pueden proporcionar productos que no son esteticamente agradables.
Ciencia del alimento
El proceso descrito en la patente de Estados Unidos 4,699,793 se usa para producir aderezos. Debido al tratamiento termico realizado antes de la fermentacion, el producto resultante tiene un sabor desagradable y una pobre homogeneidad, que son los parametros mas importantes de la ciencia del alimento.
Se conoce que la presencia de ciertas bacterias se asocia con numerosos efectos beneficiosos sobre la salud (Gomes y otros (1999) T. Food Sc. & Tech. 10:139-157). Los microorganismos estan presentes en muchos alimentos y se usan con frecuencia como probioticos para mejorar algunas funciones biologicas en el huesped. Los ensayos clinicos han demostrado que las cepas probioticas seleccionadas pueden influir en la composicion de la microflora intestinal y modular el sistema inmune del huesped. Los pre-, pro- y simbioticos ofrecen tanto proteccion contra como cura de una variedad de enfermedades endemicas y agudas.
Mas particularmente, las bacterias del acido lactico (LAB) se conocen por sus varios efectos beneficiosos en la salud. Perdigon y otros (Curr Issues Intest Microbiol., 2001, Mar 2(1):27-42), han procedido con una revision importante de las bacterias lacticas en la salud, particularmente en el sistema inmunologico. La activacion de la respuesta inmune sistemica y secretora por LAB requiere muchas interacciones complejas entre los diferentes componentes del ecosistema intestinal (microflora, celulas epiteliales y celulas inmunes). A traves de diferentes mecanismos ellas envian sefales para activar las celulas inmunes. Asi el conocimiento de la microflora intestinal normal, la contribucion de LAB y su papel en las numerosas funciones en el tracto digestivo, asi como el funcionamiento del sistema inmune de la mucosa forman la base para el estudio y la seleccion de una cepa probiotica con propiedades inmunoestimulantes. En la seleccion de LAB por su capacidad inmunoestimulante ayuda saber no solo el efecto que tienen sobre el sistema inmune de la mucosa, sino el uso especifico para el cual estan siendo puestos estos vectores de vacuna oral.
EP 0 498 506 describe un agente de fermentacion lactica mixto que comprende al menos dos levaduras y al menos dos bacterias en una matriz de polisacarido. Un lactosuero se fermenta en presencia del agente de fermentacion para obtener un fermento lactico que se utiliza en la preparacion de productos alimenticios.
US 4,444,793 se refiere a un metodo para producir un producto de suero lacteo funcional que contiene un polimero espesante para uso en la industria alimentaria. Un caldo de fermentacion de suero y sacarosa se forma y fermenta con el organismo Leuconostoc mesenteroides ATCC 14935.
US 4,699,793 se refiere a un metodo para producir un aderezo a partir de suero. Un primer paso se describe en el que los factores de multiplicacion (es decir, vitaminas, extracto de levadura, leche descremada y lactulosa) y el clorhidrato de L-cisteina se afaden al suero y a la mezcla fermentada.
Farmaceutica
La entrega de agentes terapeuticos a un huesped mamifero puede ser frecuentemente tan importante como la actividad del farmaco para proporcionar el tratamiento eficaz. En su mayoria, los farmacos se entregan por via oral, frecuentemente al inicio de una dosificacion por debajo de la dosis terapeutica y mediante la administracion repetitiva del farmaco, la dosificacion se aumenta a un nivel terapeutico o un nivel que excede el nivel terapeutico. En muchos casos, el hecho de tener una dosificacion por encima del nivel terapeutico proporciona efectos adversos, ya que la mayoria de las drogas no solo son eficaces en el proposito previsto, sino frecuentemente tienen efectos colaterales adversos. Varias propuestas se han hecho para evitar estos problemas, tales como capsulas de liberacion lenta, depositos, bombas, y similares. Estos varios enfoques tienen numerosas deficiencias para las aplicaciones generales en las que se quiere mantener la presencia de un agente terapeutico a una dosificacion terapeutica por un periodo prolongado. Los procedimientos invasivos son frecuentemente indeseables, lo que requiere la cirugia para la introduccion del dispositivo de entrega, seguido de la eliminacion posterior. Cuando el dispositivo de suministro se coloca sobre la piel, el agente debe ser capaz de transportarse a traves de la piel a la velocidad deseada. Las particulas de liberacion lenta tienen un periodo de tiempo limitado y cuando se introducen en el torrente sanguineo seran fagocitadas rapidamente.
La administracion oral en la forma de una tableta, pildora o capsula convencional constituye la ruta generalmente preferida para la administracion de farmacos ya que esta ruta es generalmente conveniente y aceptable en los pacientes. Desafortunadamente tales composiciones pueden asociarse con ciertas desventajas, particularmente en el tratamiento de los pacientes pediatricos o geriatricos, que pueden disgustarle o tienen dificultad para tragar tales composiciones, o donde la administracion de una tableta, pastilla o capsula convencional no es duradera.
El campo de los polimeros biodegradables se ha desarrollado rapidamente desde que la sintesis y la biodegradabilidad del acido polilactico se informo por primera vez Kulkami y otros, 1966 quot;Polylactic acid for surgical implantsquot; Arch. Surg., 93:839, Muchos otros polimeros se conocen para biodegradar, que incluyen, polianhidricos y poliortoesteres, que toman ventaja de los enlaces de la cadena principal labil, como se reporta por Heller y otros, 1990,Biodegradable Polymersas Drug DeliverySystems; Chasin, M. yLanger, R., Eds.,Dekker, NuevaYork,121
161. Debido a que es deseable tener polimeros que se degradan en materiales de origen natural, se han sintetizado los poliaminoacidos para su uso in vivo. Esto fue la base para usar los poliesteres de los acidos alfa-hidroxi (viz, acido lactico, acidoglicolico), que son los materiales biodegradables mas ampliamente usados para las aplicaciones en el intervalo de dispositivos de cierre (suturas y hilos) en sistemas de entrega de farmacos (patente de Estados Unidos num. 4,741,337 de Smith y otros.; Spilizewski y otros, 1985 quot;The effect of hydrocortisone loaded poly(dllactide) films on the inflammatory response, quot; J. Control. Rcl. 2:197-203). Debido al desarrollo de polimeros biodegradables, existe aun la necesidad de sistemas de entrega baratos y eficaces.
Los exopolisacaridos actuan como modificadores de la respuesta biologica como se reporta por Ruiz-Bravo A. (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2001, Jul; 8(4)-706-10). Las patentes de Estados Unidos 5,888,552; 5,456,924; 5,451,412; 5,290,571; 5,230,902 describen las composiciones y metodos para mejorar las respuestas inmunes en grande ya sea para pacientes con cancer o VIH. La patente de Estados Unidos 5,888,552 describe las composiciones terapeuticas anti-cancer que contienen proteinas del suero mientras que U.S. 5,456,924 describe un metodo de tratamiento del individuo VIH-seropositivo con proteinas del suero dieteticas.
Seria muy deseable que se proporcione con una matriz de proteinas biodegradable, maleable y no toxica y un proceso para producir tal que puede cambiar o convertir un residuo industrial en un producto con un valor comercial y una actividad biologica.
Resumen de la invencion
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar una matriz de proteina maleable (MPM) biodegradable y no toxica.
Preferentemente, la invencion se refiere a la matriz de proteinas del suero y expopolisacaridos. Ademas, la matriz de la presente invencion se usa ventajosamente para reemplazar la grasa o para la incorporacion o encapsulacion de varias sustancias hidrofilas o lipofilas y particularmente sustancias usadas en alimento, cosmetico, nutraceuticos y sectores farmaceuticos.
Otro objeto de la presente invencion, es proporcionar un nuevo metodo para la recuperacion de las proteinas del suero a partir del suero de leche que conduce a un nuevo tipo de producto a base de proteina de suero. Este nuevo producto se refiere hasta ahora como una matriz de proteina maleable (MPM), que es el producto de reaccion de la aglomeracion de las proteinas de suero presentes en el suero de leche despues de un proceso de fermentacion. Tiene la textura de una crema maleable que exhibe actividades biologicas y propiedades unicas para la incorporacion (o encapsulacion) de varias sustancias hidrofilas o lipofilas.
Es ademas un objeto de la invencion para preparar varios tipos de MPM con diferentes propiedades, caracteristicas y multiples aplicaciones y para prepararlas directamente a partir de un residuo industrial (suero o suero de leche).
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un proceso para fabricar una matriz de proteina maleable, dicho proceso que comprende las etapas de:
a) fermentar una solucion de proteina de suero con bacterias en un medio;
b) aglomerar proteinas a partir de la solucion de proteinas de la etapa a); y
c) aislar las proteinas aglomeradas a partir del sobrenadante;
caracterizado porque dichas bacterias comprende al menos una bacteria seleccionada de R2C2, INIX, ES 1 y K2.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicha etapa de fermentacion es promovida mediante el co-cultivo de al menos dos microorganismos simultaneamente o sucesivamente.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho proceso comprende ademas una etapa entre las etapas a) y b) por adicion de un polisacarido.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho proceso comprende ademas una etapa entre las etapas b) y c) por adicion de un polisacarido.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde la aglomeracion de las proteinas fermentadas se efectua por al menos un metodo seleccionado del grupo que consiste de adicion de sal, modulacion del pH, tratamiento termico, adicion de enzimas proteoliticas y adicion de floculante.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, que comprende ademas una etapa de pasteurizacion de dicha solucion de proteinas antes de la etapa a).
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicha etapa de pasteurizacion es seguida por una etapa de esterilizacion.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho floculante es un floculante bacteriano.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho floculante bacteriano es L. Kefirgranum.
El proceso de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde la separacion de las proteinas aglomeradas a partir del sobrenadante se realiza por un metodo seleccionado del grupo de centrifugacion y filtracion.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona una matriz de proteina maleable obtenible por el proceso de la presente invencion.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, que comprende ademas un subproducto de fermentacion de la fermentacion de dicha solucion que contiene dicha proteina por dicha bacteria.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, que comprende ademas un peptido.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho peptido comprende al menos dos residuos de aminoacidos.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho peptido comprende mas de cien residuos de aminoacidos.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho subproducto de fermentacion es un polisacarido.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho polisacarido se selecciona del grupo de exopolisacarido y polisacarido anionico.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho polisacarido contiene al menos cuatro porciones de sacaridos.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dichas porciones de sacarido se seleccionan del grupo que consiste en formas D y L de glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, fucosa, galactosa, acido piruvico, acido succinico, acido acetico, sulfato de 3,6-anhidrogalactosa, galactosa-4-sulfato, galactosa-2sulfato, galactosa-2, 6-disulfato, manosa, acido glucuronico, acido manuronico, acido guluronico, acido galactouronico, y ramnosa.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho polisacarido tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 15,000,000 daltons.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho peso molecular esta en el intervalo de aproximadamente 5,000 a 6,000,000 daltons.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho peso molecular esta en el intervalo de aproximadamente 25,000 a 1,000,000 daltons.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho polisacarido se selecciona del grupo que consiste de heteropolisacarido, homopolisacarido y mezcla de estos.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho heteropolisacarido se selecciona del grupo que consiste de gelana, welana, goma arabiga, goma karaya, goma okra, goma de aloe, goma de tragacanto, goma de Anogeissus latifolia, goma de semilla de membrillo, psyllium, galactanas, galactomananas, glucomananas, acidos poliuronicos, sulfato de dextrano, heparina, pectina, alginato sodico y almidon arabinogalactana.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicha galactana se selecciona del grupo que consiste de agar, agarosa, kappa, carragenina, carragenina iota, carragenina lambda.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicha galactomanana se selecciona del grupo que consiste de goma de algarrobo y guar.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicha glucana se selecciona del grupo que consiste de celulosa y derivados de esta, almidon y derivados, dextranas, pululana, beta 1,3-glucanas, quitina, xantano y tamarindo.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicha glucomanana es konjac.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho acido poliuronico se selecciona del grupo que consiste de algina, alginato y pectina.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, en donde dicho homopolisacarido es celulosa.
La matriz de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, que ademas comprende una a mas bacterias se selecciona del grupo que consiste de Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catanulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium dentium, Birdobacterium gallicum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium longum DJO1OA, Bifidobacterium longum NCC2705, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium thermacidophilum, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. suis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacteilum urinalis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus arizonenis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus corniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus cypricasei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subps. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus durianis, Lactobacillus equi, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacfllus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus helveticus subsp. jugurti, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus japonicus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefer, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus letivazi, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Laetobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacilhus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus parakefri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei L45, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius subsp. salicinius, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus sp. NGRI 0001, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus thermotolerans, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus vermtiforme, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus zeae, Lactococcus gameae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus latis subsp. lactis bv. diacetylactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Leuconostoc argentinum, Leuconostoc camosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconstoc niesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides ATCC 8293, Leuconostoc pseudomesenteroides, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense, Propionobacterium avidum, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii, Propiontbacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium jensenii, Propionobacterium lumpliophilum, Propionibacterium microaerophilum, Propionibacterium propionicum y Propionibacterium thoenii.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un microorganismo R2C2 aislado de un consorcio obtenido de grano de kefir bajo el numero de acceso NML 041202-3.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un microorganismo K2 aislado de un consorcio obtenido de grano de kefir bajo el numero de acceso NML 041202-1.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un microorganismo ES1 aislado de un consorcio obtenido de grano de kefir bajo el numero de acceso NML 041202-2.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un microorganismo INIX aislado de la cepa ATCC 43761.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona una composicion que comprende la matriz de la presente invencion en asociacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion para la fabricacion de un producto seleccionado a partir del grupo de producto alimenticio, producto medico, producto farmaceutico, producto cosmetico y nutraceutico.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion para la fabricacion de un producto alimenticio. Preferentemente, dicha matriz se utiliza como un estabilizador de emulsion o agente espesante. Preferentemente, dicho producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de mayonesa, aderezo, margarina, extensor, mantequilla, crema batida y sustituto bajo de grasa. Preferentemente, dicha matriz se usa como vehiculo de entrega.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion, en donde dicho uso es para el producto cosmetico. Preferentemente, dicho producto cosmetico se selecciona del grupo que consiste de locion para la piel, crema, protector solar, rubor, mascara, sombra de ojos, champu y acondicionador.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento para aumentar la respuesta inmune en un sujeto.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento para reducir el nivel de triglicerido en un sujeto.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento para reducir el nivel de TNF-a en un sujeto.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona el uso de la matriz de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento para aumentar el nivel de glutation en un sujeto.
El MPM de la presente invencion ademas satisface una necesidad largamente sentida en diferentes sectores, a saber, en alimento (reemplazo de grasa, agente espesante), cosmeticos (sistemas de entrega, efectos fisiologicos), nutraceuticos, alimentos funcionales, probioticos y farmaceuticos (sistemas de entrega oral, sistemas de entrega de farmacos modificadores de la respuesta biologica).
Breve descripcion de las figuras
Fig. 1 ilustra un esquema general del proceso de preparacion de MPM; Fig. 2 ilustra un esquema detallado de la formacion de la matriz; Fig. 3 ilustra la formulacion de la formulacion de la matriz; Fig. 4 ilustra un ejemplo de una implementacion industrial de la presente invencion; y Las Figs. 5A-B ilustran la homologia entre el gen ARN165 de las cepas INIX (sec. con num. de ident. : 1), K2 (sec. con num. de ident. : 2), R2C2 (sec. con num. de ident. : 3), ES1 (sec. con num. de ident. : 4), ATCC 43761 (sec. con num. de ident. : 5) y ATCC 51647 (sec. con num. de ident. : 6).
Descripcion detallada de la invencion
La invencion consiste en una matriz de proteina maleable (MPM) producida a partir del suero residual fermentado obtenido de la industria del queso. El MPM se obtiene mediante la induccion de la aglomeracion de proteinas del suero, que se recuperan despues por varios medios. El proceso permite la produccion de la matriz de proteina maleable e insoluble compuesta de 1) proteinas y/o peptidos, 2) una o varias cepas bacterianas, 3) sub-productos fermentados, 4) otros componentes obtenidos durante el proceso de aglomeracion y recuperacion de los aglomerados y 5) componentes presentes en la fase acuosa. Despues de la aglomeracion, la matriz resultante se recupera por filtracion, centrifugacion o con cualquier otro metodo que permitan dicha recuperacion. La aglomeracion de proteinas puede inducirse por, pero sin limitarse a, una modulacion de pH, temperatura, adicion de sales, adicion de enzimas proteoliticas, adicion de floculante o combinacion de todos o algunos de esos metodos. La invencion tambien describe varios parametros que pueden afectar las caracteristicas resultantes de la matriz como el componente bacteriano del MPM.
Esta matriz y su proceso de produccion presentan grandes ventajas sobre la matriz y los procesos de produccion conocidos en la tecnica. El proceso de produccion tal como que se describe mas abajo permite la obtencion de una formulacion uniforme directamente a partir de lactosuero u otra fuente de proteina primaria cuando todos los componentes estan presentes antes de la aglomeracion. Los componentes se encuentran ya sea en el aglomerado y la fase acuosa del producto de fermentacion despues de la aglomeracion. Una formulacion que contiene MPM se produce para mezclar el MPM y otros productos que se introdujeron en la formulacion con agua, aceite u otro liquido adecuado para tal formulacion. Otra formulacion se produce para liofilizar MPM e hidratarlas con una solucion que contiene otros productos que se introducen en las formulaciones.
Los polimeros usados pueden ser de diferentes origenes, tales como a partir de un microorganismo, de la planta y tambien pueden ser sinteticos. El polimero se mezcla con las proteinas antes, durante o despues del proceso de aglomeracion. La cantidad de polimeros atrapados en la matriz pueden variar para formar la matriz resultante. La fuente de proteinas usadas en el proceso de aglomeracion puede ser de cualquier suero puro obtenido a partir de una fabrica de queso o de un concentrado de proteinas de suero (WPC, CPI) resuspendido en una solucion acuosa. El proceso de aglomeracion se precede por un proceso de fermentacion para mejorar la calidad del producto final obtenido: sabor, color, textura, tiempo de conservacion, propiedades funcionales, propiedades nutricionales, propiedades biologicas, propiedades farmaceuticas.
Fig. 1 ilustra la modalidad preferida del proceso de la presente invencion que consiste en un proceso de fermentacion de suero con una cepa pura de lactobacillus aislada de un consorcio obtenido a partir del grano de kefir (numero de acceso de la cepa R2C2: 041202-3 Laboratorio Nacional de Microbiologia, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2). El primer paso es un pre-cultivo donde el cultivo de fermento liofilizado o congelado se usa para inocular el suero o medio de siembra adecuado para la especie usada como cepa pura de lactobacilo aislada de un consorcio obtenido a partir de granos de Kefir (cepa R2C2). La fermentacion se continua para dar una concentracion de bacteria de 108 a 109 bacterias por ml de pre-cultivo. El precultivo se inocula despues en la solucion de suero o proteina en una cantidad a partir de 1 a 12,5%. El suero se puede usar como es, o suplementado con diferentes aditivos de cultivo adecuados para las especies usadas. Durante el proceso de proliferacion, el lactobacilo produce un exopolisacarido (EPS), que se secreta en el medio, junto con algunas proteasas endogenas. Las proteasas endogenas presentes en el medio hidrolizan las proteinas del suero para generar peptidos con diversas longitudes e hidrofobicidad. El medio de suero se mantiene bajo condiciones de cultivo apropiadas para promover una rapida multiplicacion de los microorganismos usados. Si necesario, se suministran una temperatura constante, pH, agitacion, aireacion y otras condiciones de cultivo. Para inducir la aglomeracion de las proteinas del suero, varios medios se pueden usar para facilitar o inducir la formacion de aglomerados como la modificacion del pH, la adicion de sales y el tratamiento termico. Se necesita la agitacion para proporcionar una buena homogeneidad de la matriz resultante que contienen microorganismos, peptidos, proteinas, y sub-productos fermentados. Se prefiere la centrifugacion continua para promover una mejor homogeneidad de la matriz pero varios medios de recuperacion se pueden usar ademas.
MPM se puede usar en una forma humeda o seca y se puede liofilizar o secar por otros medios y una vez seca las MPM se comprimen tambien con una prensa Carver para formar tabletas solidas. Las MPM liofilizadas son comprimibles sin necesidad de afadir cualquiera de los excipientes para formar las tabletas que pueden tener multiples aplicaciones como la incorporacion de probioticos o farmacos. Las tabletas se hidratan lentamente debido a su alto contenido de proteinas y se protegen de los agentes incorporados al pasar en el ambiente del estomago. La MPM puede integrar agua, aceite u otro solvente para mejorar sus propiedades generales. Las composiciones y/o formulaciones obtenidas son utiles en la ciencia de los alimentos, cosmeticos, nutraceuticos, alimentos funcionales, probioticos y productos farmaceuticos.
Fig. 2 ilustra la formacion de la matriz y la Fig. 3 ilustra formulaciones producidas con MPM.
El proceso descrito para producir MPM se realiza preferentemente de fuentes no concentrados de proteinas de suero como suero de leche. La exposicion MPM una homogeneidad mejorada y un producto con propiedades funcionales y organolepticas mejoradas, asi como efectos beneficiosos sobre la salud debido a que el proceso de fermentacion de la presente invencion se lleva a cabo en una solucion no concentrada. No existe por lo tanto ninguna necesidad de homogeneizar la matriz resultante con condiciones de alto cizallamiento como en los procesos conocidos en la tecnica.
Fig. 4 ilustra un ejemplo de una implementacion industrial del proceso de la presente invencion. Como se muestra en la Fig. 4, se prepara un medio de precultivo con suero y extracto de levadura, seguido de la pasteurizacion de esta preparacion. La solucion pasteurizada se inocula despues con fermento y se fermenta bajo el control para la obtencion de un cultivo bacteriano de 108-109 bacterias por ml de precultivo. Una persona experta en la tecnica entenderia que la preparacion del medio de precultivo no necesita ser parte del proceso de produccion.
El suero se proporciona despues en el fermentador al que se afade el medio de precultivo para la fermentacion. Despues de la terminacion del proceso de fermentacion, se logra la aglomeracion de las proteinas fermentadas mediante uno o mas de los metodos anteriormente descritos y las proteinas aglomeradas se aislan del sobrenadante y almacenan hasta la entrega.
Las MPM descritos anteriormente tienen multiples aplicaciones que se enumeran a continuacion. MPM es un producto barato con una variedad de ventajas competitivas y aplicaciones. En la industria alimentaria/alimento funcional/ nutraceuticos, los MPM se puede usar como un agente de reemplazo de grasa, como un suplemento de proteina, como un producto alimenticio funcional que tiene una caracteristica especifica (estimulacion del sistema inmune, disminucion de los niveles de trigliceridos), como un bio-vehiculo para los ingredientes, sabores, suplementos, aditivos alimentarios, vitaminas, en el cosmetico y como cosmeceutico, el MPM se puede usar como agente de reemplazo de grasa y/o petroleo, como un suplemento de proteina en lociones y cremas para el cuerpo, como producto cosmeceutico que tiene caracteristicas especificas (aumento in situ de la produccion de colageno), como un bio-vehiculo del agente terapeutico, suplementos, y vitaminas. Desde el punto de vista de productos farmaceuticos, las MPM se pueden usar como un bio-vehiculo para agentes terapeuticos, para aumentar formulacion oral o farmacos genericos (excipiente), para mejorar los indices terapeuticos de farmacos (sinergia), para reducir los efectos secundarios de los farmacos y aumentar la biodisponibilidad.
Proteinas
Aunque la fuente preferida de proteina de la invencion es el suero de leche, el proceso tambien se puede aplicar a la solucion de proteina diluida. El termino quot;proteinaquot; cuando se usa de acuerdo con esta invencion significa una cadena de peptido que tiene al menos dos residuos de aminoacidos, preferentemente al menos cuatro, y mas preferentemente mas de un centenar de residuos de aminoacidos. Mas preferentemente, la proteina es un polipeptido de alto peso molecular que es preferentemente soluble en agua.
La fuente de proteina usada en la invencion es el suero. Preferido es de suero que es una mezcla de proteinas de suero obtenidas de la leche de vaca despues de la elaboracion de queso.
MPM puede convertirse en una solucion a las dificultades encontradas en la formulacion de proteinas. MPM se puede formular en cremas, por ejemplo bajo condiciones ya sean acidas o alcalinas sin afectar la textura y apariencia de la crema.
Polimeros
Varios polimeros se pueden usar en la produccion de MPM. Son ya sea sintetico o natural. Sin embargo, una variedad de exopolisacaridos y polisacaridos son adecuados para la preparacion de la MPM usada en las composiciones de la invencion, siempre que los exopolisacaridos y polisacarido contienen un numero suficiente de grupos hidrofilos para dar lugar al MPM resultante. Ademas, el polisacarido debe ser capaz de reaccionar con la proteina para formar un MPM que tiene una proporcion de proteina/polisacarido suficiente para causar la agregacion. El termino quot;polisacaridoquot; cuando se usa de acuerdo con la invencion significa un polisacarido que contiene al menos cuatro restos sacarido. El termino quot;porcion de sacaridosquot; significa un aldehido o cetona polihidroxi, o producto de hidrolisis de acido del mismo, que, preferentemente, tiene la formula general Cx(H2O)y. Los ejemplos de porciones de sacaridos incluyen las formas D y L de glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, fucosa, galactosa, acido piruvico, acido succinico, acido acetico, galactosa, sulfato de 3,6-anhidrogalactosa, galactosa-4sulfato, galactosa-2-sulfato, galactosa-2, 6-disulfato, manosa, acido glucuronico, acido manuronico, acido guluronico, acido galactouronico, ramnosa, y otros. Preferentemente los polisacaridos usados para preparar la MPM tienen pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 500 a 15,000,000 daltons, preferentemente 5,000 a 6,000,000, con mayor preferencia 25.000 a 1,000,000 daltons.
Estos polisacaridos se afaden exogenamente o producidos por un microorganismo. Los ejemplos de polisacaridos anionicos adecuados incluyen galactanas, galactomananas, glucomananas, acidos poliuronicos, y similares, que exhiben el numero requerido de grupos hidrofilos colgantes. Las galactanas adecuadas son agar, agarosa, carragenina kappa, carragenina iota, carragenina lambda, y similares. Los ejemplos de las galactomananas adecuadas son goma de algarrobo y guar; los ejemplos de glucanas son celulosa y derivados de estas, almidon y derivados, dextranas, pululana, beta 1,3-glucanas, quitina, xantano, tamarindo y similares; los ejemplos de glucomananas son konjac; los ejemplos de acidos poliuronico son algina, alginatos, pectinas; los ejemplos de heteropolisacaridos son gelana, welana, goma arabiga, goma karaya, goma okra, goma de aloe, goma de tragacanto, goma de Anogeissus latifolia, goma de semilla de membrillo, psyllium, almidon arabinogalactana etcetera. Ademas son adecuados el sulfato de dextrano, heparina, pectina, alginato sodico, y mezclas de estos.
Estos polisacaridos pueden modificarse ademas como se ensefa en Aoki, T. T.; Araki & M. Kitamikado; 1990, Vibrio sp. AP-2. Pat Eur. J. Biochem, 187, 461-465, a condicion de que contenga el numero requerido de grupos colgantes hidrofilos. Tambien adecuados para su uso en las composiciones de la invencion son los galactanos quimicamente modificados, tales como las que se ensefan en un articulo escrito por K. B. Guiseley en Industrial Polysaccharides;Genetic Engineering, Structure/Property Relations and Applications, Editado por M. Yalpani, 1987, Elsevier Science Publishers. El articulo Guiseley ensefa metodos para la modificacion quimica de agar para obtener propiedades optimas de gelificacion. En general, cualquier modificacion de los galactanos que no afectan a la conformacion helicoidal (es decir, que se obtiene a traves del enlace de la 06 y 04 de galactosa al 02 de 3,6anhidrogalactosa) preservara la capacidad de gelificacion y es adecuado para su uso en las composiciones de la invencion siempre que el numero requerido de grupos hidrofilos estan presentes. Los grupos hidrofilos proporcionan un polisacarido que es soluble en agua. Muchos otros polimeros se puede afadir antes, durante o despues del proceso de fermentacion. Ellos se pueden usar para cambiar 1) las propiedades funcionales de las MPM, 2) las propiedades fisicas de la quimica de las MPM, 3) la agregacion de proteinas, 4) la capacidad para formular o encapsular diversos componentes de los varios sectores, como alimentos, cosmeticos, productos nutriceuticos y productos farmaceuticos y 5) la actividad biologica de las MPM. Los ejemplos de polimeros como el polietilenglicol, polietilenoimina, poliesteres, copolimeros de mono-, di-, tri-bloque o cualquiera de los polimeros que ayudan a la formacion de los sistemas coloidales se podrian usar para mejorar las MPM.
Microorganismos
La bacteria usada en la invencion es R2C2 (numero de acceso 041202-3, Laboratorio Nacional de Microbiologia, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2), INIX, ESI y/o K2. El proceso puede integrar ademas una variedad de otras bacterias solas o en combinacion como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium longum DJ010A, Bifidobacterium longum NCC2705, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycium, Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, pseudolongum, Bifidobacterium ifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium pllorum, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium subtile, ifidobacterium suis, Bifidobacterium thermacidophilum, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. suis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium urinalis, Lactobacillus, acetotolerans, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus arizonensis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus cypricasei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus durianis, Lactobacillus equi, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus helveticus subsp. jugurti, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus infestinalis, Lactobacillus japonicus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefir, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus letivazi, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei L45, Lactobacillus salivarrus, Lactobacillus salivarius subsp. salicinius, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus sp. NGRI 0001, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus thermotolerans, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus vermiforme, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus zeae, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis, Lactococcus piscium, Lactococcus
plantarum, Lactococcus raffinolactis, Leuconostoc argenfinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconosfoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides ATCC 8293, Leuconostoc pseudomesenteroides, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense, Proplonibactetium avidum, Propionibacterlum cyclohexanicum,Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium lymphophilum, Proplonibacterium microaerophilum, Propionibacterium propionicum, Propionibacterium thoenii, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporus, Saccharomyces globosus, Saccharomyces carisbergensis,Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces lactis, Torula holmii, Candida tenuis. Las bacterias son preferentemente homolacticas pero pueden ser heterolacticas.
Una MPM puede usar varios generos y especies y se expondran ejemplos para demostrar que modifican las propiedades funcionales de las MPM como su hidratacion y capacidades de emulsificacion, sus efectos beneficiosos en la salud o sus respectivos tiempos de conservacion. Las MPM generadas con la cepa probiotica como Lactobacillus plantarum permite una mejor estimulacion de la flora intestinal. Las MPM generadas con Lactococcus lactis permiten la produccion de bacteriocina, nisina, que conduce a un tiempo de conservacion mejorada de las matrices. Las MPM generadas con Lactobacillus kefiranofaciens o L. ramnosus 9595 permiten una mejor estimulacion positiva global del sistema inmunologico por sus EPS, Murofushi y otros 1986. Immunopharmacology. Vol. 12. pags. 29-35. MPM puede prolongar la conservacion de los productos en los que se agrego o incorporo. El yogur que contiene MPM exhibio una mejor vida en estante que el yogur libre de MPM. Ademas, la MPM puede ayudar a mantener la supervivencia de los microorganismos durante un periodo prolongado de tiempo. Ademas, la MPM en el yogur sirve como un agente estabilizante y reemplaza cualquier gelatina, pectina o almidon de maiz.
En el procedimiento de la presente invencion, el cultivo de una bacteria puede favorecer el crecimiento de un segundo o mas microorganismos en una fermentacion secuencial. Una primera fermentacion de las bacterias lacticas permite el crecimiento de las bacterias mas exigentes como las bifidobacterias y propionibacterias.
El aislamiento de las cepas bacterianas (R2C2, K2, ES1) se realizo en agares RCW como se describe por Kojima, S. y otros, 1993, Biosei. Biotech. Blochem. Vol. 57, num. 1, pags: 119-120. Los granos de kefir se homogeneizaron con un mezclador en una solucion isotonica y esteril (triptona 8,5 g/l + NaCl 1 g/l). Esta solucion se uso para la inoculacion en agar RCW.
Se aislaron diferentes tipos de colonias. Las cepas seleccionadas son gram positivas, no moviles, catalasa negativas y cepas homofermentadoras. Las cepas son opcionalmente anaerobicas, no crecen a 15 °C y tienen una fisiologia similar que las especies descritas en Fujisawa y otros, International Journal of Systematic Bacteriology. Vol. 38. num.
1. pags: 12-14. Las cepas se compararon con la cepa de referencia ATCC # 43761 para el patron de fermentacion de azucar, como se ilustra en la Tabla 1. Ademas, las cepas se compararon con las cepas de referencia ATCC 43761 y 51647 para la homologia de 16S como se muestra en las Figs. 5A-B. Las cepas se compararon con la cepa de referencia ATCC 43761 para patron de fermentacion de azucar (como se ilustra en la Tabla 1) y con la cepa de referencia ATCC 43761 y 51647 para la homologia de ARN 16S (como se ilustra en la Tabla 2). Las cepas aisladas se clasificaron en el genero Lactobacillus, y las especies kefiranofaciens.
Tabla�1
Perfil�de�fermentaci6n�de�azucar�a��artir�de�APA�0C�C.�Ymedio�API�0C�C.L�
Sustratos
R2C2 INIX K2 ES1
Glicerol
- - - -
Eritritol
- - - -
D-Arabinosa
- - - -
L-Arabinosa
- - - -
Ribosa
- - - -
D-xilosa
- - - -
L-xilosa
- - - -
Adonitol
- - - -
�-Metil glicosido
- - - -
Galactosa
+++ +++ +++ +++
Perfil�de�fermentaci6n de�azucar�a��artir�de�APA �0C�C. Y medio�API�0C�C.L�
Sustratos
R2C2 INIX K2 ES1
D-Fructosa
+++ +++ +++ +++
D-Manosa
++ +++ +++ +++
L-Sorbosa
- - - -
Ramnosa
- - - -
Dulcitol
- - - -
Inositol
- - - -
Manitol
+++ +++ - +++
Sorbitol
- - - -
a-Metil-D-Manosida
- - - -
a-Metil-D-glucosido
- - - -
N-acetilo glucosamina
++ ++ ++ ++
Amigdalina
- - - -
Arbutina
- - - -
Esculina
++ - +++ +++
Salicina
+ ++ +++ -
Celobiosa
- - +++ -
Maltosa
++ +++ - +++
Lactosa
+++ +++ +++ +++
Melbiosa
- - - -
Sacarosa
+++ ++ - +++
Trehalosa
+++ +++ - +++
Inulina
- - - -
Melezitosa
- - - -
D-Rafinosa
+ ++ - +++
Almidon
- - - -
Glicogeno
- - - -
xilitol
- - - -
-Gentibiosa
- - +++ -
D-Turanosa
- - - -
D-Lixosa
- - - -
D-Tagarosa
- - - -
D-Fucosa
- - - -
L-Fucosa
- - - -
D-Arabitol
- - - -
L-Arabitol
- - - -
Gluconato
- - - -
2-ceto-gluconato
- - - -
5-ceto-gluconato
- - - -
Factores que influencian la aglomeracion
La sal es un factor para la recuperacion de la MPM. En una modalidad preferida, el CaCl2 se usa, pero se podria reemplazar ademas por cualquier sal que se conoce en la tecnica por tener un efecto sobre la aglomeracion de proteinas como el pirofosfato de sodio. Para el mismo proposito, se pueden variar parametros como el pH, temperatura, hidrolisis enzimatica para promover la aglomeracion de las proteinas para formar una matriz.
Ciencia del alimento
Existe una necesidad de un polisacarido producido por un microorganismo de grado alimentario, que tiene propiedades similares o incluso superiores a la goma de xantano. Tal exopolisacarido (EPS) se puede afadir ya sea al producto alimenticio y el producto resultante se tiene que etiquetear (pero el producto despues es un aditivo denominado quot;etiquetado sin riesgoquot;), o se puede producir in situ sin la necesidad de cualquier etiquetado, porque el microorganismo es de calidad alimentaria. Se prefiere el uso de este tipo de microorganismos para la produccion de MPM asi el MPM producido ofrece caracteristicas ya sea de proteinas y propiedades EPS. Las MPM se pueden usar como un agente de sustitucion de la grasa, como un suplemento de proteina, como un producto alimenticio funcional que tiene una funcion especifica (estimulacion del sistema inmunologico, disminucion de los niveles de trigliceridos), como un bio-vehiculo para los ingredientes, sabores, suplementos, aditivos alimentarios, vitaminas, etc.
Cosmeticos
La MPM combinada en una matriz de polisacaridos y proteinas se puede usar en una amplia variedad de composiciones, que incluyen base de maquillajes, lociones para la piel y cremas, protectores solares, rubores, mascaras, sombras de ojos, ademas de los productos de cuidado del cabello tales como champus, acondicionadores, y similares. Los intervalos sugeridos de MPM son 0,01-95%, preferentemente 0,05-50%, con mayor preferencia 0,1-30% en peso de la composicion total. La composicion en la que el MPM se incorpora puede contener al menos un surfactante, que puede ser un surfactante anionico, anfoterico, no ionico, cationico, o zwitterionico.
Las MPM son adecuadas para el uso en bases de maquillaje o cosmeticos de color tal como sombra de ojos, rubor, corrector, o composiciones delineadoras en forma de liquido, crema, solido o barra. Las composiciones adecuadas pueden ser emulsiones agua-en-aceite o aceite-en-agua, pero son preferentemente emulsiones de aceite-en-agua. Tales composiciones generalmente comprenden: 0,01-95% MPM, 0,5-95% de agua, 0,5-25% de materia particulada, 0,01-20% surfactante, y 0,1-95% de aceite. Adicionalmente, estas composiciones pueden contener ademas ingredientes seleccionados a partir del grupo de humectantes, conservantes, aceites no volatiles o volatiles, agentes gelificantes, y mezclas de estos.
Nutraceuticos
La MPM de la presente invencion posee la suma sinergica de los efectos fisiologicos de los exopolisacaridos, proteinas de suero, bacterias, productos de la fermentacion que son partes de la MPM, y asi se puede usar en productos nutraceuticos.
Las MPM tienen multiples ventajas ademas en el campo de los probioticos. Primero, las MPM constituyen un medio para producir probioticos a un bajo costo. Durante la recuperacion de MPM, todas las bacterias en suspension se recuperan en las MPM, lo que representa alrededor de 5% del volumen fermentado y asi un factor de concentracion de 20. Una solucion fermentada, que contiene 1x109 bacterias genera una concentracion de 2x1010 bacterias en las MPM. La produccion de probioticos al mismo tiempo conducira a la recuperacion de componentes que tienen beneficios para la salud como proteinas, peptidos y subproductos de fermentacion tales como exopolisacaridos, vitaminas, proteinas bacterianas, etc. Las MPM constituiran ademas un vehiculo multifuncional para los probioticos. Las MPM permiten la incorporacion de sustancias hidrofobicas o hidrofilicas que se pueden usar para proteger, sinergizar y alimentar a los probioticos. Por ejemplo, la vitamina C, que es hidrofilica, ayuda a mantener la viabilidad de los probioticos concentrados. La presencia de ciertos exopolisacaridos (como por ejemplo oligogalactosacaridos) tiene un efecto prebiotico (sinergia) en la estimulacion de la flora intestinal o la presencia de vitamina E (hidrofobica), tiene efecto protector sobre la viabilidad del microorganismo (antioxidante) y un efecto nutritivo (vitamina). Adicionalmente, debido a su composicion en proteinas, las MPM son potencialmente capaces de proteger la viabilidad de los probioticos. Finalmente, MPM puede servir como un vehiculo en formas diferentes, humedas, liofilizadas o en tabletas comprimidas. Todas las formas constituyen ventajas en el campo de los probioticos. Las MPM humedas son faciles de formular como se muestra en las formulaciones alimentarias, cosmeticos sugiriendo asi las mismas para la formulacion de probioticos. Las MPM liofilizadas, ofrecen una proteccion potencial importante debido a su contenido en proteinas y la posibilidad de la incorporacion de sustancias protectoras hidrofilicas e hidrofobicas. Las MPM liofilizadas son compresibles sin la necesidad de afadir cualquiera de los excipientes para formar tabletas que se pueden usar para la incorporacion de los probioticos o farmacos.
Farmaceuticos
Varios farmacos se pueden formular con la MPM y que se pueden entregar por via oral y por via topica.
Una pluralidad de productos relacionados farmaceuticamente y farmacos o materiales bioactivos se pueden formular con MPM como pequefas moleculas de varias clases (hidrofilicas e hidrofobicas), proteinas, ARN, oligonucleotidos, ADN, virus, bacterias. Los ejemplos o tipos de materiales bioactivos que se usan en la MPM y metodos de la presente invencion incluyen cualquier agentes farmaceuticos, que incluyen, pero sin limitarse a los farmacos antiinflamatorios, analgesicos, farmacos anti-artriticos, antiespasmodicos, antidepresivos, antipsicoticos, tranquilizantes, farmacos contra la ansiedad, narcoticos, antagonistas, agentes antiparkinsonianos, agonistas colinergicos, farmacos quimioterapeuticos, agentes inmunosupresores, agentes antivirales, agentes antibioticos, supresores del apetito, antiemeticos, anticolinergicos, antihistaminicos, agentes antimigrafosos, vasodilatadores coronarios, cerebrales o perifericos, agentes hormonales, anticonceptivos, agentes antitromboticos, diureticos, agentes antihipertensivos, farmacos cardiovasculares, opioides, y similares.
Materiales bioactivos adecuados incluyen ademas agentes terapeuticos y profilacticos. Estos incluyen, pero sin limitarse a cualquier modificador biologico terapeuticamente eficaz. Tales modificadores incluyen, pero sin limitarse a lipidos, compuestos organicos, proteinas y peptidos (sinteticos y naturales), peptidos mimeticos, hormonas (peptidos, esteroides y corticosteroides), polimeros de aminoacidos D y L, oligosacaridos, polisacaridos, nucleotidos, oligonucleotidos y acidos nucleicos, que incluyen ADN y ARN, hibridos de acidos nucleicos de proteinas, moleculas pequefas y analogos fisiologicamente activos de estos. Ademas, los modificadores se pueden derivar de fuentes naturales o preparar por medios recombinantes o sinteticos e incluyen analogos, agonistas y homologos. Como se usa en la presente quot;proteinaquot; se refiere ademas a peptidos y polipeptidos. Tales proteinas incluyen, pero sin limitarse a enzimas, biofarmacos, hormonas de crecimiento, factores de crecimiento, insulina, anticuerpos monoclonales, interferones, interleuquinas y citoquinas. Los organicos incluyen, pero sin limitarse a los productos quimicos farmaceuticamente activos con grupos amino, imino y guanidino. Las hormonas esteroides adecuadas incluyen, pero sin limitarse a estrogeno, progesterona, testosterona y analogos fisiologicamente activos de estas. Numerosos analogos de hormonas esteroides se conocen en la tecnica e incluyen, pero sin limitarse a estradiol, SH-135 y tamoxifeno. Como se usa en la presente, quot;acidos nucleicos incluye ADN, ARN y analogos fisiologicamente activos de estos. Los nucleotidos pueden codificar genes individuales o pueden ser cualquier vector conocido en la tecnica de ADN recombinante que incluyen, pero sin limitarse a, plasmidos, retrovirus y virus adeno-asociado.
Las MPM descritas en la presente invencion tienen una ventaja sobre la pildora de tabletas convencionales en los pacientes descritos anteriormente, ya que es un vehiculo no solido biodegradable, cremoso, que se puede tragar facilmente. Ciertos polisacaridos encontrados en las MPM, como los productos kefiran de L.Kefiranofaciens, se conocen por pasar a la circulacion sanguinea. Estos polisacaridos, peptidos y bacterias encontrados en los diferentes MPM aumentan la absorcion de algunos medicamentos.
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran ademas la invencion y no se deben contemplar en cuanto a limitar el alcance de la presente invencion.
Ejemplo 1
Preparacion de MPM
La preparacion de una MPM tipica se describe en el siguiente Ejemplo.
El suero obtenido a partir de la produccion de queso cheddar se esteriliza por filtracion (0.22 !m). El suero esterilizado esta contenido en una camara de fermentacion en el momento de la inoculacion con la cepa R2C2. Un pre-cultivo se prepara para obtener una concentracion de bacterias de 108a 109 por ml de medio de precultivo. La inoculacion se realiza con un volumen de medio de precultivo (108 R2C2/ml) correspondiente al 1% y 15%, pero preferentemente 10% del volumen final de suero. El proceso de fermentacion se realiza a 37 °C y a pH controlado en 5. El pH se controla por la adicion de NaOH. La agitacion se mantiene a un minimo para permitir una distribucion uniforme, pero sin causar una aireacion excesiva. El proceso de fermentacion se lleva a cabo durante un periodo de 16 a 36 horas, dependiendo de las caracteristicas requeridas. Siguiendo el proceso de fermentacion, se afade entre 0,1% y 1,5%, pero preferentemente 1% de CaCl2 (p/v) y se ajusta el pH entre 6,5 y 8, pero preferentemente 7,5. Las MPM resultantes son maleables, parecen un pudin de color cremoso blanco sin sabor u olor apreciable. La recuperacion de la matriz se realiza por centrifugacion. Numerosas fuerzas centrifugas son adecuadas dependiendo de las caracteristicas funcionales deseadas. Sin embargo, muchas pruebas indicaron que se prefiere una fuerza centrifuga de 3500 RCF (Fuerza Centrifuga Relativa) para la produccion de una matriz con propiedades funcionales adecuadas y que una fuerza centrifuga entre 3500 y 7476 RCF ademas es adecuada.
Un proceso alternativo es mediante el uso de ES1, INIX, K2 o R2C2 y un proceso comparativo Lactobacillus helveticus ATCC 10386, Lactobacillus kefirgranum ATCC 51647, Lactobacillus ramnosus ATCC 7469, Lactobacillus zeae ATCC 15820 o Lactococcus lactis ATCC 11454 y controlando las condiciones de cultivo de pH y temperatura a los valores de control que se muestran en la Tabla 2. Un proceso alternativo es ajustar el pH inicial al valor de control del microorganismo usado como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2
Parametros �ara�diferentes ce�as
Ce�as
Tem�eratura�DCC� �.
ES1
37 5
INIX
37 5
K2
37 5
R2C2
37 5
ATCC10386
42 5,5
ATCC 51647
30 5,5
ATCC 7469
42 6
ATCC 15820
42 6
ATCC 11454
24 6
En otro proceso alternativo, el lactosuero se pasteuriza antes de la fermentacion y la solucion fermentada se pasteuriza de nuevo antes de la separacion de las MPM de los co-productos. Esta alternativa, sin embargo no se usa cuando se necesitan las bacterias activas en el producto final.
10 En un proceso alternativo adicional, se realiza una doble inoculacion con R2C2 y Lactococcus lactis para obtener un co-cultivo. Las dos especies se pueden cultivar ademas juntas para la inoculacion futura.
En otro proceso comparativo, la cepa usada es Propionibacterium acidipropionici ATCC 4875, que produce acido propionico. La temperatura de fermentacion es 30 °C, el pH es 7, y la fermentacion se realiza por un periodo de 96
15 horas. Los extractos de levadura se pueden suplementar en proporciones de 0,5 a 1% (p/v) para estimular la produccion de acido propionico. Cuando se usan bacterias anaerobias, el proceso puede usar adicion de gases como CO2 o nitrogeno para eliminar el oxigeno y/o aumentar la presion parcial de CO2.
Ejemplo 2
Composicion de aderezo solido para ensaladas
La matriz se incorpora en las proporciones como se ilustra en la Tabla 3, para producir un aderezo solido para ensalada. De esta manera, se obtiene un sabroso, cremoso y firme aderezo similar a la mayonesa.
25 Asi, la formulacion del aderezo se caracteriza por el hecho de que el aderezo, cuando se refrigera a 4 °C, mantiene todas sus propiedades. La matriz puede sustituir a las yemas de huevo como emulsionantes y estabilizantes en las emulsiones aceite-agua y la matriz puede emulsionar tanto como su propio volumen de aceite.
30 El aderezo para ensaladas se prepara afadiendo azucar al MPM con agitacion para evitar el apelmazamiento, afadiendo vinagre y jarabe de maiz y agitando con una batidora Osterizer a la velocidad maxima por 30 segundos, afadiendo aceite de maiz rapidamente a la jarra de la batidora y manteniendo la mezcla por 1 minuto y se almacena el aderezo para ensalada a 4 °C por al menos 24 horas.
35 TABLA 3
Com�osici6n�de�aderezo s6lido��ara ensaladas
%
MPM
37.6
Aceite para ensaladas (maiz)
37.3
Jarabe de maiz
3.7
Azucar
1.5
Ejemplo 3
Composicion de leche con chocolate
Una leche con chocolate se produce mezclando leche y MPM con un homogeneizador ultraturrax, afadiendo el ingrediente seco, afadiendo los ingredientes liquidos hasta que los ingredientes secos esten completamente en solucion y refrigerando a 4 °C por al menos 24 horas. Los ingredientes son enumerados en la Tabla 4.
Tabla 4
Com�osici6n�de�leche�con�chocolate
%
Leche
53.5
MPM
40.8
Azucar
4.7
Sabor chocolate
0.2
Cacao
0.1
Potenciador lacteo
Para satisfacer el 100%
Ejemplo 4
Composicion de mantequilla ligera
15 Una mantequilla ligera se produce ablandando la mantequilla a temperatura ambiente, mezclando mantequilla y MPM, homogeneice la mezcla mediante el uso de homogeneizador ultraturrax hasta que se alcanza la mezcla suave y refrigere a 4 °C por al menos 24 horas. Los ingredientes son enumerados en la Tabla 5.
Tabla 0
Com�osici6n�de �mantequilla �lieera
%
mantequilla
50-85
MPM
15-50
Ejemplo 5
Uso de MPM como agente espesante en yogurt
25 El yogurt es un producto lacteo obtenido a traves de la fermentacion de la leche por cepas bacterianas especificas que convierten parte de la lactosa en acido lactico tales como Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La leche coagula cuando se produce una cantidad suficiente de acido lactico.
Dado que las virtudes del yogurt se asocian entre otras cosas con la accion de las bacterias en el intestino, es
30 importante su presencia en un numero suficiente. Con respecto a esto, el yogurt debe por ley, en varios paises, contener al menos 10 millones de bacterias por gramo en el momento de su comercializacion.
Los estandares de la composicion estipulan que el yogurt no debe contener menos del 9.5% de solidos no grasos de la leche y no menos de 3.0% de proteina. Puede contener ademas algunos ingredientes que provienen de la leche 35 (ya sea leche en polvo entera o descremada o leche evaporada concentrada), frutas, jugos de frutas o extractos, mermeladas, cereales o cualquier otro aroma, edulcorantes, una cantidad que no supere el 2.0% de agentes de textura (estabilizantes, gelificantes, espesantes o emulsionantes), acido citrico, colorante de alimentos y, en el caso de yogurt con frutas adicionales, zumos de fruta o extractos o mermeladas, un conservante que no excedan 50 ppm.
40 El uso potencial de la MPM, como agente espesante en el yogurt, puede ser posible para mejorar la textura y viscosidad en la sustitucion de carragenina, pectina, gelatina y almidon de maiz, entre otros. La MPM puede ser de interes como un ingrediente de la leche en un producto lacteo ya que es un ingrediente de caloria baja.
Ejemplo comparativo 6
MPM como un vehiculo para preservar los microorganismos vivos
5 MPM puede mantener bacterias en la vida por un largo periodo de tiempo. Tres muestras de MPM R2C2 (producida con tres fuerza de centrifuga diferente: 1592, 3500 y 7476 RCF) se conservaron a 4 °C durante 11 meses. Despues de ese periodo de tiempo, una pequefa cantidad de MPM se inoculo en agar RCW. Los geles se incubaron sin oxigeno a 37 °C por 5 dias. Despues de la incubacion, la cepa R2C2 se aislo de las muestras. Se encontro que MPM puede mantener bacterias en vida por un periodo prolongado de tiempo y por lo tanto se puede usar como
10 vehiculo probiotico.
Ejemplo comparativo 7
Produccion de MPM que contiene una cepa probiotica
TABLA 6
Parametros de��roducci6n
Parametros
Lactobacillus rhamnosus 7469
* recuento de bacterias
5,1 x 108 b/ml
Acido lactico; t0
0,439 g/l
Acido lactico, Fin de la fermentacion
1,67 g/l
Acido lactico en la solucion residual
0,215 g/l
MPM
15,82 g/kg
Total de glucidos, t0
59,25 g/l
Glucido al final
51,0 g/l
Glucido en MPM
48,0 g/l
Lactosa a T0
45,52 g/l
Lactosa al final
39,68 g/l
Lactosa en la solucion residual
42,40 g/l
Lactosa en MPM
20,70 g/kg
Rendimiento de MPM
28,69 g/l
% humedad
84,67%
% materia organica
9,01%
% minerales
4,95%
* a partir del cultivo antes de la recuperacion de las MPM. El recuento en las MPM es 20 veces mayor.
Ejemplo 8 20 Produccion de maquillaje La MPM como preparado a partir del metodo descrito en el Ejemplo 1 se uso para preparar dos formulaciones de barras de maquillaje como sigue:
25 TABLA 7
Formulaciones �de maquillaje
F6rmula
COMPONENTES % �I�
A
Estearato sodico 7.56
agua
43.77
Fenoxietanol
0.50
Propilparaben
0.10
Formulaciones �de maquillaje
F6rmula
COMPONENTES % �I�
Metilparaben
0.30
Butilenglicol
13.04
Cloruro calcico
0.80
MPM
0.80
PEG-20 sesquiisostearato de metil glucosa
3.49
B
Aceite de ricino hidrogenado 2.00
Alcohol isoestearilico
5.74
Dioxido de titanio
0.74
Amarillo de oxido de hierro
1.05
Rojo de oxido de hierro
0.33
Oxido negro de hierro
0.13
Talco
2.23
Dimeticona
11.63
Dioxido de titanio/trimetiloletano
6.30
Ejemplo 9 Preparacion de una locion para la piel Una locion para la piel se preparo de acuerdo con la siguiente formula:
Tabla 8
Formulaci6n�de�loci6n��ara�la ��iel
Componentes
% p/p
MPM
1.60
EDTA trisodico
0.10
Butilenglicol
5.00
Estearato de sorbitan/cocoato de sacarosa
6.00
Metilparaben
0.25
Etilparaben
0.15
goma xantana
0.30
Octilmetoxicinamato
7.50
Octilsalicilato
5.00
Benzofenona-3
3.00
C12-15 alquil benzoato
8.00
Alcohol cetilico
1.00
Fenoxietanol
1.00
Propilparaben
0.10
agua
csp
Ejemplo 9
Encapsulacion de azul tripan y fluoresceina con las MPM
Las moleculas marcadoras como azul tripan y fluoresceina se encapsularon en las MPM a varias concentraciones. Se usaron estas formulaciones para realizar experimentos in vitro e in vivo para estudiar los parametros farmacocineticos como la absorcion, biodisponibilidad, distribucion, metabolismo y excrecion de formulaciones orales basadas en MPM. La solubilidad, estabilidad, liberacion se analizaron y compararon con los marcadores libres. Se encontro que las MPM tienen alta capacidad de encapsulacion y permiten una mejora general de los parametros farmacocineticos generales.
Para evaluar la eficacia de una sonda fluorescente (Fluoresceina (Sigma, Canada)) para penetrar en el torrente sanguineo en la complejacion con un potencial portador de farmaco, se usaron ratas hembras Wistar de 8 semanas. El peso promedio de la rata fue 200 g y se alimentaron libremente. La fluoresceina (5 mg/Kg de peso corporal) se agito en vortex ya sea en solucion salina 0,9% o en MPM antes de la alimentacion forzada. 3 ratas/grupo se alimentaron con 1 ml de solucion mixta a traves de agujas de alimentacion en T0 (Ttiempo). La fluoresceina solo estaba presente en la primera alimentacion forzada. Las ratas se alimentaron a la fuerza dos veces al dia en un intervalo de 4 horas. 300 !l de muestras de sangre se recogieron en T1, T3, 5. Cuando fue posible, se recogio la orina antes del sangrado. La sangre se centrifugo a 13000 rpm por 5 minutos. El plasma se recogio. 20 !l de plasma se diluyeron en 2 ml de PBS pH 7,2. Las lecturas se registraron en un espectrofluorometro Eclipse (Varian, Australia) a una longitud de onda de excitacion de 490 nm y una emision de 514 nm. Las concentraciones se determinaron contra una curva estandar de fluoresceina. Los datos mas abajo se recogieron mostrando que en fluoresceina esta entrando en la circulacion sanguinea ligeramente mejor que cuando se formulan en solucion salina y se excreta mejor en animales alimentados a la fuerza con MPM lo que sugiere una mejor absorcion de fluoresceina.
Tabla 9 Concentraci6n�de�fluoresceina �en sanere en�el�tiem�o
Tiempo (horas)
1h 3h30
(ng/ml)
(ng/ml)
Solucion salina 0,9%
336,699 99,693
MPM-R2C2
415,701 116,622
MPM-Inix
323,532 84,645
Tabla 1C
Concentraci6n�de�fluoresceina �en�la �ori
na �en el�tiem�o
Tiempo (horas)
1h 3h30
(ug/ml)
(ug/ml)
Solucion salina 0,9%
96,3072 125,6508
MPM-R2C2
176,49423 126,027
MPM-Inix
213,58755 125,0865
Ejemplo 10
Condiciones para la produccion industrial de MPM
El medio de precultivo es un medio compuesto de permeado de suero (62,5 g/l) que contiene 10 g/l de extracto de levadura (1%). Se usa agua esterilizada para reconstituir el suero en polvo. Se afade polvo de permeado de suero junto con el extracto de levadura. El medio se pasteuriza a 90 °C por 30 minutos, evitando el fenomeno de formacion de caramelo y permitiendo un crecimiento mejor del fermento.
El precultivo se genera en el fermentador en las siguientes condiciones: 39 °C, el pH inicial de 5 se controla a 4,3 durante la fermentacion, la agitacion minima (50 RPM) por 18 a 20 horas con una relacion de inoculacion inicial entre 1 a 15%, pero preferentemente 10% (108 bacterias/ml). La inoculacion se realiza a partir de fermentos congelados. Las mismas condiciones se usan para fermentar suero para producir las MPM, pero 1% de CaCl2 se afade al suero crudo, justo antes del ajuste del pH a 5 con HCl. Esto minimiza los riesgos de contaminacion y permite llevar el pH inicial cerca el crecimiento optimo de la cepa bacteriana usada. Una vez que el pH se ajusta, el suero se pasteuriza en el fermentador a 70 °C por 40 minutos, la temperatura se lleva a 39 °C y el suero se inocula con 0,5 a 5%, pero preferentemente 2,5% de precultivo como se definio previamente. La fermentacion de suero dura 16 horas con la cepa R2C2. El pH se controla afadiendo NaOH. La agitacion se mantiene a un minimo para permitir una buena distribucion pero sin causar una aireacion excesiva. El reajuste del pH a 7,5 y la recuperacion de las MPM se realiza con un clarificador industrial Westfalia modelo NA-7. Los rendimientos obtenidos dependen de la firmeza deseada y varian entre 30 a 50 g/l de solucion fermentada. La recuperacion de la MPM desencadena la recuperacion practicamente de todas las bacterias que se encuentran en la suspension.
Ejemplo 11
Inoculacion con fermento congelado en suero para la produccion de MPM
La MPM se preparo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 10 excepto que la fermentacion se inoculo sin precultivo pero directamente en el suero con un fermento congelado. El crecimiento del fermento es mas lento y requiere un tiempo de fermentacion mas largo (24 horas). La calidad y el rendimiento de la MPM recuperada en esas condiciones es comparable con el uso del fermento mediante la recogida en un precultivo como se describio previamente.
Ejemplo 12
Almacenamiento del precultivo de R2C2 para la produccion de MPM
El precultivo de R2C2 como se describio en el Ejemplo 10 se puede refrigerar y almacenar por 2 dias sin ninguna alteracion apreciable. Un periodo de refrigeracion mas largo de 72 horas desencadena la aparicion de la fase latente del fermento durante una fermentacion posterior del suero.
Ejemplo 13
Pasteurizacion del suero fermentado
El suero fermentado se puede someter a un tratamiento termico de 65 °C por 30 minutos para garantizar la ausencia de contaminantes viables. La pasteurizacion de la solucion fermentada se tiene que evitar sin embargo si la misma quiere preservar los efectos beneficiosos de los probioticos cuando se usan en el proceso de fermentacion.
Ejemplo 14
El uso de un clarificador para recuperar las MPM.
A continuacion de una fermentacion como se describio en el Ejemplo 10 de las MPM, un equipo Westfalia, modelo NA-7, se probo para recuperar continuamente por medio de la boquilla o para recuperar por descargas periodicas. La recuperacion con boquilla genera un MPM menos denso y liquido. Este tipo de MPM no respondio a las necesidades de las formulaciones de alimentos. Para aumentar la densidad, se prefiere un tiempo de residencia corto en el clarificador. Esto se logro mediante el uso de descargas periodicas. La densidad deseada de MPM se puede ajustar para satisfacer las necesidades de los formuladores de alimentos para diferentes productos (mantequilla y crema, etc.). La NA-7 se usa a la velocidad maxima de rotacion con un flujo de 330 L/h de solucion fermentada y se descarga en intervalos cada 7 minutos. El tiempo de apertura del bol se ajusta para permitir una descarga adecuada parcial, por ejemplo no permitiendo ni la acumulacion de MPM dentro de la NA -7, ni una descarga completa del bol. Los rendimientos obtenidos son 40 a 45 g/l para las MPM que tienen una medicion de la extension de 8 a 10 cm, mientras que se obtiene MPM en un rendimiento inferior de 30 a 35 g/l para una medicion de la extension de 3 cm. Se recuperan todos aglomerados y microorganismos en suspension.
Ejemplo 15
Recuperacion de MPM con un LAPX404
La maquina LAPX404 de Alfa Laval se utiliza ademas a una velocidad de flujo de 130 l/h, a una velocidad de rotacion maxima de 9500 RPM que descarga cada 7 minutos. El volumen descargado con LAPX404 es parcial, pero constante. En esas condiciones, la densidad de las MPM recuperadas es adecuada para las formulaciones de alimentos. La densidad se puede ajustar variando los intervalos de las descargas y la velocidad de flujo. Se recuperan todos los aglomerados y microorganismos en suspension.
Ejemplo 16
Produccion de MPM a partir de suero concentrado
En las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 10, suero concentrado (13% de materia solida) se utiliza como la solucion del comienzo de la fermentacion. En esas condiciones, los rendimientos obtenidos para la produccion de MPM fermentada con la cepa R2C2 aumento a 85 g por litro de solucion fermentada.
Ejemplo 17
Recuperacion de proteina por fermentacion con microorganismo especifico
Este Ejemplo describe el uso de Lactobacillus kefirgranum para recuperar proteinas en soluciones fermentadas. Lactobacillus kefirgranum se inocula a partir de una biomasa liofilizada en medio salado PL como se describe: Triptona peptona (caseina) 1%, MgS04 0,02%, MnSO4 0,005%, acetato sodico 0,2%, Tween 80 0,05%, extracto de levadura 1%, polvo de permeado de suero 62,5 g/l. Completar con agua destilada, ajustar el pH entre 5,0 y 5,5 con HCl y poner en autoclave a 121 °C, 30 minutos. Mantener a 4 °C hasta el uso. Despues de la fermentacion 24 a 60 horas, preferentemente de 40, a 30 °C, el cultivo resultante se puede filtrar o centrifugar u otro tratamiento sin ninguna adicion para recuperar las proteinas y las bacterias que forman aglomerados.
Para la misma aplicacion, Lactobacillus kefirgranum se puede cultivar en medio de Suero de Queso Rogosa (RCW) preparado como sigue: RCW se prepara a partir del Caldo Rogosa S1 (Difco # 0478-17-4) y se prepara de acuerdo con los protocolos del fabricante, excepto que el agua destilada se sustituye por permeado de suero que se prepara a partir de un polvo de permeado de suero ( 62.5 g/l) y las proteinas se desnaturalizan termicamente (Esterilizacion 121 °C por 15 minutos ) y se fraccionan por filtracion antes del uso. Lactobacillus kefiranofaciens se cultiva a 30 °C por 24 a 60 horas, preferentemente 40, para permitir la recuperacion de las bacterias y parte de las proteinas. El cultivo se puede filtrar o centrifugar sin ningun otro tratamiento o adicion para recuperar las proteinas y las bacterias que forman aglomerados.
Ademas, un cultivo de 400 ml en salado PL, por 24 horas de fermentacion a 30 °C , se usa para inocular 10 litros de suero esteril. La fermentacion se controla a pH 5,5, 30 °C por 24 horas y la solucion fermentada se centrifuga sin ningun otro tratamiento o adicion para recuperar las proteinas y las bacterias que forman aglomerados. El producto recuperado es un MPM a pH 5,5.Otra aplicacion es ajustar el pH de la solucion fermentada entre 5,5 a 8, preferentemente a 7,5, antes de la recuperacion de los aglomerados. Por ultimo, otra aplicacion es ajustar CaCl2 entre 0,1 y 1,5%, preferentemente al 1%, a la solucion fermentada antes de ajustar el pH entre 5,5 y 8, preferentemente a 7,5, y recuperar los aglomerados.
Ejemplo 18
MPM como un agente potenciador del sabor
En un panel de degustacion, la mayoria de la gente concluyo que el producto que contiene las MPM tuvo un sabor mejorado. Esto se reporto en la mantequilla (el sabor salado) y en las bebidas preparadas con chocolate (el sabor del chocolate). Asi, la MPM se puede usar para ayudar a aumentar el sabor de cierto producto.
Ejemplo 19
Efecto antiinflamatorio de las MPM (Reduccion de TNF-a en las celulas sanguineas)
Ratas Wistar hembra, que pesan 150 g y se alimentan libremente se sometieron a 3 sesiones de alimentacion forzada (cada sesion duro una semana por 7 alimentaciones forzadas repetidas) con una semana de descanso entre cada sesion. Las muestras de sangre se recogieron durante y en el curso del experimento y las ratas se sacrificaron 2 h despues de la ultima alimentacion forzada para un total de 21 alimentaciones forzadas. Las muestras se cosecharon (celulas sanguineas), en hielo seco, y congelaron a -80 °C. El ARN se aislo usando el reactivo TRIZOL (Gibco) segun las especificaciones de los fabricantes. Diez microgramos de ARN total se transcribio inversamente usando Superscript RT (Gibco), 500 ng de iniciadores oligodT (Gibco), y 250 ng de iniciadores al azar Hexamero (Gibco) por 20 minutos a temperatura ambiente, seguido por 2 horas a 424 °C.
TNF-a se amplifico a partir de 2ul de reaccion de transcripcion inversa usando kit de PCR Titanium (Clontech). La amplificacion de los iniciadores fue como sigue: Rat TNF-a directo: CCCAACAA GGAGGAGAGTTCCC (sec. con num. de ident.:7) Rat TNF-a reverso: ATGACTCCAAAGTAGACCTGCCC (sec. con num. de ident.:8)
La reaccion PCR se realizo por 30 ciclos usando 100 pmol de cada iniciador, con una temperatura de hibridacion de 68 °C. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa 1.5%. Los datos mostraron que las MPM pueden reducir el nivel de TNF-a en el nivel de ARN en las celulas sanguineas despues de 7 dias en el grupo de ratas alimentadas con MPM en contraste a lo observado en los grupos alimentados con solucion salina (control -), HMS90™ (un aislado de proteina de suero vendido por Immunotec), yogurt (Danone reducido en calorias) por lo tanto, sugiriendo que un efecto anti-inflamatorio esta teniendo lugar en las celulas sanguineas.
Ejemplo 20
Efecto inmunomodulador de las MPM (produccion de IL-18) Ratas Wistar hembra, que pesan 150 g y alimentan libremente se sometieron a 3 sesiones de alimentacion forzada (cada sesion duro una semana por 7 alimentaciones forzadas repetidas) con una semana de descanso entre cada sesion. Las muestras de sangre se recogieron durante y en el curso del experimento y las ratas se sacrificaron 2 h despues de la ultima alimentacion forzada para un total de 21 alimentaciones forzadas. Las muestras se cosecharon
5 (celulas sanguineas), en hielo seco, y congelaron a -80 grados. El ARN se aislo usando el reactivo TRIZOL (Gibco) segun las especificaciones de los fabricantes. Diez microgramos de ARN total se transcribio inversamente usando Superscript RT (Gibco), 500 ng de iniciadores oligodT (Gibco), y 250 ng de iniciadores al azar Hexamero (Gibco) por 20 minutos a temperatura ambiente, seguido por 2 horas a 42 °C.
10 IL-18 se amplifico a partir de 2ul de reaccion de transcripcion inversa, usando kit PCR Titanium (Clontech). Los iniciadores de amplificacion fueron como sigue:
IL-18 directo: ATGCCTGATATCGACCGAACA GCC (sec. con num. de ident.; 9)
15 IL-18 reverso: CAAATTCCATTTTGTTGTGTCCTG G (sec. con num. de ident.: 10)
La reaccion PCR se realizo por 30 ciclos usando 100 pmol de cada iniciador, con una temperatura de hibridacion de 684 °C. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa 1.5%. Los datos mostraron que las MPM aumentan los niveles de IL-18 en el nivel de ARN en las celulas sanguineas despues de 24 horas en el grupo de
20 ratas alimentadas con MPM en contraste a lo observado en los grupos alimentados con solucion salina (control -), HMS90 (un aislado de proteina de suero vendido por Immunotec), yogurt (Danone reducida en calorias), por lo tanto sugiriendo una estimulacion de la inmunidad de la mucosa.
Ejemplo 21
Estimulacion de PBMC en ratas alimentadas con MPM
Ratas Wistar hembra, que pesan 150 g y se alimentan libremente se sometieron a 3 sesiones de alimentacion forzada (cada sesion duro una semana por 7 alimentaciones forzadas repetidas) con una semana de descanso entre
30 cada sesion. Las muestras de sangre se recogieron durante y en el curso del experimento y las ratas se sacrificaron 2 h despues de la ultima alimentacion forzada para un total de 21 alimentaciones forzadas. Las muestras de sangre se midieron con Unopett (BD) para contar el total de celulas mononucleares de sangre periferica. Los datos se muestran mas abajo y sugieren que las ratas alimentadas con MPM tienen una tendencia a ver aumentar su conteo de PBMC, casi duplicado despues de 4 dias despues de la alimentacion forzada.
TABLA 11
Recuento de�PBMC
Grupo prueba
Recuento de PBMC aumenta en relacion la solucion salina
solucion salina
1
MPM
1.8
HMS 90
1.2
Yogurt
0.6
Mantequilla
1.2
Mantequilla/MPM (40% MPM)
1.6
Ejemplo 22
40 Efecto anti-trigliceridemia de las MPM
Ratas Wistar hembra, que pesan 150 g y alimentan libremente se sometieron a 3 sesiones de alimentacion forzada (cada sesion duro una semana por 7 alimentaciones forzadas repetidas) con una semana de descanso entre cada sesion. Las muestras de sangre se recogieron durante y en el curso del experimento y las ratas se sacrificaron 2 h
45 despues de la ultima alimentacion forzada para un total de 21 alimentaciones forzadas. Los sueros se midieron por el metodo de Wahlefeld (GPO-PAP) para determinar los niveles de trigliceridos circulantes. Los datos de la tabla 12 mas abajo muestran que MPM afectan el nivel basal de TG.
TABLA 12
Niveles�de�trieliceridos�des�ues�de �24�horas Y 3�dias
TG despues de 24 horas mg/dl suero (SEM) TG despues de 3 dias mg/dl suero (SEM)
solucion salina
62 (15) 51 (4)
MPM
33 (5) 32(10)
HMS 90
31 (4) 101 (15)
Yogurt
118(38) 76 (27)
Mantequilla
64 (30) 128 (46)
Mantequilla/MPM
83 (9) 156 (22)
TABLA 13
Niveles�de�trieliceridos�des�ues�de �24�horas, 16�dias Y 21 �dias
Grupos de prueba
TG despues de 24 horas mg/dl suero (SEM) TG despues de dias mg/dl suero (SEM) TG despues de dias mg/dl suero (SEM)
solucion salina
71(14) 80(19) 43(14)
MPM
50(15) 52(1) 35(1)
HMS 90
56(6) 102(34) 92(21)
Yogurt
57(4) 56(13) 99(24)
5 Ejemplo 23
Analisis del contenido de aminoacidos de las MPM
Las MPM se analizaron por Bodycote Canada para determinar el contenido de aminoacidos comparativo de varios
10 productos a base de proteinas de suero. WPH917 es un hidrolizado de proteina de suero de alta calidad producido por un tratamiento enzimatico controlado de proteina de suero que proporciona aminoacidos, peptidos y polipeptidos. PowerPro 80 es el concentrado de proteina de suero 80% producido por un proceso de ultrafiltracion que concentra las proteinas nativas de suero.
15 Tabla 14
Analisis�del contenido�de�aminoacidos
Aminoacido
MPM (lote 15) WPH 917 PowerPro 80
Acido glutamico
22,92 18,3 10,1
Alanina
5,73 5,2 4,1
Arginina
4,01 3 1,9
Cistina
10,32 2,9 2
Glicina
13,61 2,3 1,5
Histidina
11,17 1,9 1,6
Isoleucina
6,45 5,5 5,1
Leucina
11,89 14,2 9
Serina
7,02 5 3,9
Triptofano
No determinado 2,3 1,4

Ejemplo 24 Analisis del contenido de las MPM
MPM se analizaron por Bodycote Canada para determinar el contenido total de varios productos a base de proteinas de suero. WPH917 es un hidrolizado de proteina de suero de alta calidad producido por un tratamiento enzimatico controlado de proteina de suero que proporciona aminoacidos, peptidos y polipeptidos.
Tabla 10
Analisis�del contenido
Contenido
Metodos MPM %(g/100g) WPH917 %(g/100g)
Humedad
AC-HUM 04 80 4
Proteinas
AC-PRO01AOAC 8 89
Cenizas
AC-CEN01AOAC 6 3.1
Carbohidratos
AC-SUB01AOAC 5 No determinado
Lactosa
AC-LAB01AOAC 2.5 0.3
Grasa
AC-GRA 01 1.3 3.5
Minerales (Na, Ca, K)
SAA 0.1, 1.8, 0.2 1.3,0.1,002
Ejemplo 25
Efecto biologico resultante de MPM - INIX pasteurizada en Glutation
10 Ratas Wistar hembra, que pesan 150 g y se alimentan libremente se sometieron a 3 sesiones de alimentacion forzada (cada sesion duro una semana por 7 alimentaciones forzadas repetidas) con una semana de descanso entre cada sesion. Las muestras de sangre se recogieron durante y en el curso del experimento y las ratas se sacrificaron 2 h despues de la ultima alimentacion forzada para un total de 21 alimentaciones forzadas. Las muestras de sangre
15 se midieron despues de 3 semanas de acuerdo con un metodo modificado de Anderson disefado para medir los niveles de glutation en el plasma.
TABLA 16
Niveles�de�HS.�en�ratas
Grupos de prueba
Niveles de GSH In ug GSH/ml plasma (+/-SD)
Solucion salina
0.05 (0.05)
MPM 1*
0.08 (0.08)
MPM**
1.08 (0.31)
* MPM natural producida con MPM pasteurizada R2C2 ** producida con INIX
20 Ejemplo 26
Solubilizacion de pireno mediante el uso de MPM
50 !M de solucion concentrada de pireno en acetona se prepara y 20 !l de la solucion concentrada se pone en
25 tubos de borosilicato (10 x 13 mm). Los tubos se mantienen parados a temperatura ambiente en una campana de extraccion por 20-30 minutos hasta que se completa la evaporacion de la acetona.2.0 ml de MPM se disuelven en 0,1 M de solucion salina regulada con fosfato (PBS) a pH 7,2 se insertan en los tubos de borosilicato. La concentracion de MPM usada esta dentro del intervalo de 0,001 a 1,0% (p/v). Deje reposar la solucion a temperatura ambiente, protegida de la luz y las lecturas fluorescencia se realizan despues de 24, 48 y 69 h de incubacion. Las
30 lecturas de fluorescencia se realizan en un Varian Cary Eclipse a 37 °C con una longitud de onda de excitacion ajustada a 340 nm y se registran las exploraciones por emision de 350 a 600 nm. El grado de solubilizacion de pireno se mide graficando la I3/I3 (acuoso) del compuesto estudiado como una funcion de la concentracion del compuesto. El punto de inflexion del grafico corresponde con el valor critico de concentracion micelar. Los datos de la Tabla 17 muestran la relacion de la intensidad de fluorescencia del pico I3 sobre la intensidad del pico I3 de la
35 solucion PBS como una funcion de la concentracion de MPM y P85.
TABLA 17
relaci6n �entre�la�intensidad de�fluorescencia�del��ico�I3 sobre�la �intensidad �del �ico I3�de la�soluci6n PBS
P85 MPM lote 78
0.001%
1,107 1,123
0.01%
1,168 1,328
0.1%
2,564 2,416
1%
8,813 3,687
Los datos de la Tabla 18 muestran la relacion de la intensidad de la fluorescencia del pico Ie sobre la intensidad del pico Ie de la solucion PBS como una funcion de la concentracion de MPM y P85. Los datos muestran que las MPM promueven la formacion de excimeros (microdominios hidrofobicos).
Tabla 18
relaci6n �entre�la�intensidad de�fluorescencia�del��ico�le sobre�la �intensidad �de��ico�le�de�la �soluci6n�PBS
P85 MPM lote 78
0.001%
0,9619 1.567
0.01%
1,233 4,834
0.1%
2,443 30,88
1%
4,829 25,24
Ejemplo 27
Incorporacion de MPM en la locion corporal
Para validar las propiedades funcionales de las MPM en una formulacion cosmetica, se hizo un ensayo para formular una locion corporal comercial. El producto comercial fue una locion preparada de leche de cabra que contiene 0.3% 15 de extracto de leche de cabra. La MPM se incorporo en un 10% ( p/p) . El recipiente se cerro antes de mezclar el componente y agito a mano y almaceno a temperatura ambiente. Despues de 24 horas, la mezcla resultante exhibio particulas finas en las paredes del vaso y fue mas liquido que la locion corporal comercial original. Sin embargo, la mezcla resultante no mostro signos de degradacion o separacion de la emulsion y el olor se mantuvo similar al producto comercial. La viscosidad de MPM se evaluo usando las tecnicas de extension de acuerdo con el principio 20 de consistometria USDA (Adams & Birdsall, 1946) permitiendo la medicion, en cm, de la distancia de extension de un alimento semi-fluido realizado en una placa equipada con una serie de circulos concentricos en el tiempo predeterminado y estandarizado. La mezcla resultante de la locion corporal + MPM registro 13 cm en la escala de extension, pero volviendo a su extension original por ejemplo 8 cm en un periodo de 3 semanas. Los datos indican que la adicion de 10% de MPM desencadeno una licuacion de la matriz. En cuanto a la preservacion de la vida util
25 de la mezcla resultante se encontro estable y no se contamino por un periodo de 3 semanas con la misma particula en suspension con el mismo olor caracteristico que el producto original.
Ejemplo 28
30 Mantequilla ligera
Se prepararon dos tipos de mantequilla ligera que contiene 25 y 40% MPM, respectivamente. Generalmente, la mantequilla con MPM es mas cremosa a temperatura ambiente, se solidifica menos a 4 °C, y exhibe una textura que es mas fragil que la mantequilla regular. Es importante tener en cuenta que el sabor salado de la mantequilla se
35 potencio por las MPM que permiten una reduccion de la cantidad normal de la sal (NaCl) en la mantequilla por 33 a 50%. La mantequilla que contiene 25% de MPM es utilizable para freir y se vuelve marron como la mantequilla natural, mientras que la mantequilla 40% no permite freir y se usa solamente como una crema. Ademas, el tiempo de conservacion de mantequilla con MPM fue aceptable por 45 dias y la mantequilla que contiene MPM se podria congelar sin ningun cambio de las propiedades organolepticas.
Ejemplo 29
MPM en crema batida Formulaciones de crema ligera se prepararon a partir de crema 40%, leche y MPM para obtener una crema con 21% de grasa que exhibe una textura agradable y gruesa que puede ser batida. La crema batida resultante es firme y se puede almacenar por 15 dias en la nevera sin alteracion. El olor y sabor son similares a la nata natural. La receta es como sigue: 200 ml de crema al 40%, 85 ml de leche, 95 g de MPM y azucar y/o aroma.
Ejemplo 30
Mayonesa y aderezo para ensaladas
10 El mismo tipo de MPM usado previamente se uso para preparar Mayonesa y aderezo para ensalada de acuerdo con la siguiente formula:
Tabla 19
Pre�araci6n de aderezo��ara �ensaladas
Ingredientes :
Cantidad (gramos)
MPM
19.6
Aceite
19.4
Jarabe de maiz
1.9
azucar
0.8
aroma
para degustar
especias
para degustar
Vinagre
10.3
15 Ejemplo 31
Bebida de Chocolate
El mismo tipo de MPM usado previamente se uso para preparar bebidas de chocolate de acuerdo con la siguiente
20 formula:
Tabla 2C
Pre�araci6n de�la �bebida�de chocolate
Ingrediente
Cantidad en gramos
MPM
60
leche
100 ml
cacao
0.16
azucar
7
Aroma de chocolate
0.25
Potenciador del sabor
a ajustar
Esta formulacion permite el enriquecimiento de la leche de 3,6 g de proteinas que se duplica practicamente en
25 comparacion con la leche natural. La MPM ofrece una mejor viscosidad y una textura cremosa que se aprecia en la boca. Las MPM se afadieron ademas a una bebida para el control de peso (Slim fast™) y el producto resultante se encontro que tiene un sabor reducido de las proteinas de soja que se encuentran en esa bebida.
Ejemplo 32
Yogurt
Cuatro intentos se prepararon con la formulacion de yogurt. (1) control con 3,25% de leche y (3) intentos con 1% de leche todo suplementado con 3% de leche descremada en polvo. Las etapas para la preparacion de yogurt incluyen
35 calentar la leche a 82-85 °C, agitar por 30 min, seguido de una etapa de enfriamiento a 44-45 °C. Los cultivos (yogourmet, LYO-SAN Co) que contienen L. Bulgaricus, S. Thermophilus y L. Acidophilus se afadieron para obtener 5 g por litro de leche, seguido por una incubacion a 45 °C por 4 horas, sin agitacion. Prueba de control preparada a partir de leche 3,25%.
Prueba 2: calentar simultaneamente la leche y la MPM (100 g/l) seguido por la adicion del fermento. Prueba 3: la leche se calienta primero seguido por la adicion de la MPM (100 g/l) y el fermento. Prueba 4: adicion de la MPM al final de la produccion, al mismo tiempo que la adicion de las frutas como en una produccion industrial.
Despues de la incubacion, el producto obtenido por la Prueba 2 es comparable con la prueba de control mientras que las pruebas 3 y 4 no permitieron la coagulacion. Despues de 6 semanas de almacenamiento, la prueba de control exhibe un drenaje significativo y se contamino con levadura mientras que la prueba 2 no mostro ni signos de desestabilizacion ni deterioro microbiologico desde su preparacion. Asi, la MPM juega un papel de conservante en la
10 formulacion y ayuda a obtener muy buena y tipica textura de un yogurt mientras que reduce la cantidad de grasa en la formulacion final sin la adicion de almidon u otros agentes espesantes.
Ejemplo 33
15 El uso de diferentes cepas afecta el perfil analitico de las MPM resultantes producidas en lotes de 10 litros.
La concentracion de varios carbohidratos (glucidos), acido lactico y los rendimientos de MPM varian de acuerdo con la cepa usada. Ademas, la composicion de la solucion fermentada influye en la composicion de la matriz, ya sea directamente y proporcionalmente como en el caso de los carbohidratos encontrados en la fase acuosa y fase
20 liquida de la matriz, o de acuerdo con un efecto de concentracion como en el caso del acido lactico que precipita en parte durante la recuperacion de la matriz.
Tabla 21
Perfil�analitico de MPM en�funci6n�de�las�diferentes ce�as �usadas��ara��roducirlas
INIX Lactobacillus�rhamno 7469* Lactobacillus zeae � Lactobacillus kefireranum� Lactobacillus helveticus�
*recuento de bacterias
2,47 x 108 b/ml 5,1 x 108 b/ml 1,34 x 108 b/ml No determinado 6,77 x 107 b/ml
Acido lactico ; t0
0,211 g/l 0,439 g/l 0,143 g/l 0,234 g/l 0,157 g/l
Acido lactico, Fin de la fermentacion
2,414 g/l 1,67 g/l 0,821 g/l 2,22 g/l 3,5 g/l
Acido lactico en la solucion residual
1,122 g/l 0,215 g/l 0,384 g/l 1,11 g/l 1,53 g/l
MPM
9,57 g/kg 15,82 g/kg 9,85 g/kg 2,94 g/kg 5,23 g/kg
Total de glucidos, t0
45,0 g/l 59,25 g/l 41,30 g/l 54,22 g/l 47,06 g/l
Glucido al final
41,25 g/l 51,0 g/l 55,01 g/l 51,55 g/l 42,67 g/l
Glucido en la solucion residual
42,0 g/l 48,0 g/l 53,86 g/l 46,54 g/l 54,24 g/l
Glucido en MPM
36,50 g/kg 29,35 g/kg 39,86 g/kg 38,593 g/kg 41,197 g/kg
Lactosa a T0
47,95 g/l 45,52 g/l 53,46 g/l 50,99 g/l 52,58 g/l
Lactosa al final
42,95 g/l 39,68 g/l 51,74 g/l 47,28 g/l 42,65 g/l
Lactosa en la solucion residual
42,57 g/l 42,40 q/l 47,31 g/l 44,92 g/l 41,55 g/l
* comparativo
25 Tabla 21
Perfil�analitico de MPM en�funci6n�de�las�diferentes ce�as �usadas��ara��roducirlas
INIX Lactobacillus rhamno 7469** Lactobacillus zeae �*� Lactobacillus kefireranum** Lactobacillus helveticus�*�
Lactosa en MPM
24,78 g/kg 20,70 g/kg 27,70 g/kg 37,02 g/kg 35,17 g/kg
HALACTOSA a�TC
0 0 0 0,13 g/l 0
Perfil�analitico de MPM en�funci6n�de�las�diferentes ce�as �usadas��ara��roducirlas
INIX Lactobacillus rhamno 7469** Lactobacillus zeae �** Lactobacillus kefireranum** Lactobacillus helveticus�**
Galac. Al final
0,75 g/l 0 0 0,75 g/l 2,51 g/l
Galac. en la solucion residual
0,70 g/l 0 0 0,36 g/l 2,02 g/l
MPM
1,72 g/kg 0 0 1,55 g/kg 2,22 g/kg
HLUCOSA a TC
0 0 0 0 0
Glucosa al final
0 0 0 0,49 g/l 1,49 g/l
Glucosa en la solucion residual
0 0 0 0 0,88 g/l
MPM
0 0 0 1,48 g/kg 1,74 g/kg
Rendimiento de�MPM
41,2 g/l 28,69 g/l 27,5 g/l 40,6 g/l 40,12 g/l
% humedad
85,98% 84,67% 85,23% 85,11%
% materia oreanica
9,49% 9,01% 8,66% 9,87%
% minerales
4,53% 4,95% 6,12% 5,03%
* a partir del cultivo antes de la recuperacion de las MPM. El recuento en las MPM es 5 veces mayor. ** comparativo

Ejemplo 34 Caracteristicas de varias MPM producidas a partir de diferentes cepas El uso de diferentes cepas durante el proceso de fermentacion afecta la textura, sabor, y olor de la MPM resultante
como se muestra en la Tabla 22.
Tabla 22
Caracteristicas�de �MPM ��roducidas�a��artir�de�diferentes�ce�as
Parametros
Lactococcuslactis t Lactobacillus helveticus t INIX Lactobacillus rhamnosus � R2C2
�.
5.69 6.99 6.58 5.06 6,26
Color
7039-12 7042-22 7042-12 7039-12 salsa
sabor
Acre Acre Acre ND neutro
olor
yogurt natural leche condensada Algas Suero fuerte Coliflor cocida
A�ariencia
sineresis importante Textura homogenea, buena Textura viscosa y suave, buena Aglomerados en burbujas Aglomerados heterogeneos
%sineresis
0.07 0.08 0.1 0 0,23
Drenaje
nul nul nul nul nul
*Extensi6n
1.25 2 2 5.5 0
**�Actividad
Mayonesa Vinagreta Vinagreta Vinagreta Vinagreta
TABLA 33
Caracteristicas�de �las �MPM varian�de�acuerdoa la�velocidad�de crecimiento �de�la �ce�a
Parametros
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 7 �asteurizada
�.
ND ND 7.17 7.21 7.06
Color
7042-22 7042-22 7039-12 7039-12 7041-22
Sabor
Amargo Amargo Amargo Amargo ND
Olor
Coliflor cocida Coliflor cocida Coliflor cocida Coliflor cocida Algas
A�ariencia
Firme, sin sineresis Sineresis tipo yogurt homogeneo suave homogeneo suave homogeneo suave tipo yogurt
%sineresis
0 0.01 0.1 0 0
Drenaje
nulo nulo nulo nulo nulo
Extensi6n
ND ND 8.25 mas de 12 6.5
Actividad emulsionante
Vinagreta Vinagreta Vinagreta Vinagreta Vinagreta
Recuento de bacterias en MPM
2 x 109 b/g 1,4x 109 b/g 5 x 108 b/g 6,7 x 108 b/g 5 x 108 b/g
Acido lactico
16,39 mg/g 24,38 mg/g 7,02 mg/g 5,61 mg/g 7,02 mg/g
Azucares totales
15,70 g/kg 18,30 g/kg 45,19 g/kg 43,15 g/kg 45,19 g/kg
Lactosa
0 0 49,88 g/kg 48,57 g/kg 49,88 g/kg
Halactosa
14,9 g/kg 18,1 g/kg 0,66 g/kg 0,77 g/kg 0,66 g/kg
Rendimiento
27,32 g/l 33,85 g/l 41,10 g/l 44,10 g/l 41,10 g/l
% humedad
82,26% 84,82% 86,05% 85,86% 86,05%
% materia oreanica
10,92% 9,37% 9,01% 9,86% 9,01%
% minerales
6,83% 5,82% 5,08% 4,28% 5,08%
Leyenda Nd, no determinado 7039-12 esparrago blanco, blanquecino con tendencia verdosa. 7041-12 blanquecino y menos verde que 7039-12 (canevas)
Caracteristicas�de �las �MPM varian�de�acuerdoa la�velocidad�de crecimiento �de�la �ce�a
Parametros
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 7 �asteurizada
7042-12 coliflor, mas beige que blanco 7042-22 blanco pero con el fondo naranja
Ejemplo comparativo 36
Produccion de las MPM que contienen proteinas de origen vegetal
El medio de precultivo es un medio compuesto de permeato de suero (62,5 g/l) que contiene 10 g/l de extracto de levadura (1%). Se usa agua esterilizada para reconstituir el suero en polvo. Se afade polvo de permeado de suero junto con el extracto de levadura. El medio se pasteuriza a 90 °C por 30 minutos, evitando el fenomeno de formacion de caramelo y permitiendo un crecimiento mejor del fermento.
10 El precultivo se genera en el fermentador en las siguientes condiciones: 39 °C, el pH inicial de 5 se controla a 4,3 durante la fermentacion, la agitacion minima (50 RPM) por 18 a 20 horas con una relacion de inoculacion inicial entre 1 a 15%, pero preferentemente 10% (108 bacterias/ml). La inoculacion se realiza a partir de fermentos congelados. Las mismas condiciones se usan para fermentar el suero (suplementado con proteinas de soja
15 comercial 1 a 10% p/v) para producir las MPM, pero se afade 1% de CaCl2 al suero crudo, justo antes del ajuste de pH a 5 con HCl. Esto minimiza los riesgos de contaminacion y lleva el pH inicial cerca del crecimiento optimo de la cepa bacteriana usada. Una vez el pH ajustado, el suero se pasteuriza en el fermentador a 70 °C por 40 minutos, la temperatura se lleva a 39 °C y el suero se inocula con 0.5 a 5%, pero preferentemente 2,5% de precultivo como se definio previamente. La fermentacion de suero dura 16 horas con la cepa R2C2. El pH se controla afadiendo NaOH.
20 La agitacion se mantiene a un minimo para permitir una distribucion uniforme sin causar una aeracion excesiva. El reajuste del valor del pH a 7,5 y la recuperacion de las MPM se realiza con un, clarificador industrial Westfalia modelo NA-7. Los rendimientos obtenidos dependen de la firmeza deseada y varian entre 30 a 50 g/l de solucion fermentada. La recuperacion de la MPM desencadena la recuperacion practicamente de todas las bacterias que se encuentran en la suspension.
Ejemplo 37
Formulacion de 5-Fluoro Uracilo con las MPM
30 Las MPM se pueden usar para formular varios materiales bioactivos. En este ejemplo 5-Fluoro Uracilo se formulo con la MPM tipica descrita en los Ejemplos anteriores y se administro por la via oral mediante alimentacion forzada a los ratones. La eficacia de esta nueva formulacion se comparo con el 5FU libre y probo en modelos animales en los que se implantaron celulas de cancer de colon o en los que el cancer de colon se indujo quimicamente. El hallazgo fue que la formulacion 5FU/MPM mejoro el indice terapeutico de 5FU como se muestra por la reduccion del
35 crecimiento del tumor.
Ejemplo 38
Formulacion basica de un yogurt firme
1.
Adicionar 3 a 5% de solidos suaves a la leche
2.
Calentar la leche a 85 °C y mantener por 30 minutos
45 3. Alcanzar la ebullicion y afadir 0.5% de gelatina, pectina o almidon de maiz a la leche
4. Enfriar la leche a 44-46 °C y afadir cepas bacterianas que convierten parte de la lactosa en acido lactico Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus
50 5. Adicionar 20% de MPM
6.
Colocar en recipientes e incubar entre 40-46 °C hasta alcanzar 80 °D, por 4-6 horas
7.
Refrigerar a 4 °C por al menos 24 horas.
Ejemplo 39
Composicion del pudin de vainilla Un pudin de vainilla se produce mezclando leche y MPM, afadiendo el ingrediente seco a la mezcla de leche-MPM para mezclar bien, afadiendo lentamente el aceite a la mezcla usando un homogeneizador Ultra-Turrax, cocinando entre 60-70 °C hasta que la mezcla se espese y refrigerando a 4 DC durante al menos 24 horas. Los ingredientes se enumeran en la Tabla 34.
Tabla 34
Com�osici6n�del��udin�de vainilla
%
MPM
50
Leche
36.1
Azucar
14.9
Aceite vegetal
3.3
Na2HPO4
0.2
Vainilla
0.5

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1� Un proceso para preparar una matriz de proteina maleable, dicho proceso comprende las etapas de: a) fermentar una solucion de proteina de suero con bacterias en un medio; b) aglomerar las proteinas a partir de la solucion de proteina de la etapa a); y c) aislar las proteinas aglomeradas del sobrenadante; caracterizado �orque dichas bacterias comprenden al menos un bacteria seleccionada de R2C2, INIX, ES1 y K2. 2� El proceso de la reivindicacion 1, en donde dicha etapa de fermentacion se promueve por el co-cultivo de al menos dos microorganismos simultaneamente o sucesivamente. 3� El proceso de la reivindicacion 1, en donde dicho proceso comprende ademas una etapa entre las etapas a) y b) por adicion de un polisacarido. 4� El proceso de la reivindicacion 1, en donde dicho proceso comprende ademas una etapa entre las etapas b) y c) por adicion de un polisacarido. 0� El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la aglomeracion de las proteinas fermentadas se efectua por al menos un metodo seleccionado del grupo que consiste de adicion de sal, modulacion del pH, tratamiento termico, adicion de enzimas proteoliticas y adicion de floculante. 6� El proceso de la reivindicacion 2, que ademas comprende una etapa de pasteurizacion de dicha solucion de proteinas antes de la etapa a). 7� El proceso de la reivindicacion 6, en donde dicha etapa de pasteurizacion es seguida por una etapa de
    esterilizacion.
    8� El proceso de la reivindicacion 5, en donde dicho floculante es un floculante bacteriano.
    9� El proceso de la reivindicacion 8, en donde dicho floculante bacteriano es L. Kefirgranum.
    1C� El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la separacion de las proteinas aglomeradas
    del sobrenadante se efectua por un metodo seleccionado del grupo de centrifugacion y filtracion.
    11� Una matriz proteina maleable obtenible por el proceso de la reivindicacion 1.
    12� La matriz de la reivindicacion 11, que ademas comprende un subproducto de fermentacion de la fermentacion
    de dicha solucion que contiene dicha proteina por dicha bacteria.
    13� La matriz de la reivindicacion 11, que ademas comprende un peptido.
    14� La matriz de la reivindicacion 13, en donde dicho peptido comprende al menos dos residuos de aminoacidos.
    10� La matriz de la reivindicacion 13, en donde dicho peptido comprende mas de cien residuos de aminoacidos.
    16� La matriz de la reivindicacion 12, en donde dicho subproducto de fermentacion es un polisacarido.
    17� La matriz de la reivindicacion 16, en donde dicho polisacarido se selecciona del grupo de exopolisacarido y
    polisacarido anionico.
    18� La matriz de la reivindicacion 16, en donde dicho polisacarido contiene al menos cuatro porciones de sacarido.
    19� La matriz de la reivindicacion 18, en donde dichas porciones de sacarido se seleccionan del grupo que consiste en formas D y L de glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, fucosa, galactosa, acido piruvico, acido succinico, acido acetico, sulfato de 3,6-anhidrogalactosa, galactosa-4-sulfato, galactosa-2-sulfato, galactosa2, 6-disulfato, manosa, acido glucuronico, acido manuronico, acido guluronico, acido galactouronico, y ramnosa.
    2C� La matriz de la reivindicacion 16, en donde dicho polisacarido tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 15,000,000 daltons.
    21� La matriz de la reivindicacion 16, en donde dicho peso molecular esta en el intervalo de aproximadamente 5,000 a 6,000,000 daltons.
    22� La matriz de la reivindicacion 16, en donde dicho peso molecular esta en el intervalo de aproximadamente 25,000 a 1,000,000 daltons.
    23� La matriz de la reivindicacion 16, en donde dicho polisacarido se selecciona del grupo que consiste en heteropolisacarido, homopolisacarido y mezcla de estos.
    24� La matriz de la reivindicacion 23, en donde dicho heteropolisacarido se selecciona del grupo que consiste en gelana, welana, goma arabiga, goma karaya, goma okra, goma de aloe, goma de tragacanto, goma de Anogeissus latifolia, goma de semilla de membrillo, psyllium, galactanas, galactomananas, glucomananas, acidos poliuronicos, sulfato de dextrano, heparina, pectina, alginato sodico y almidon arabinogalactana.
    20� La matriz de la reivindicacion 24, en donde dicha galactana se selecciona del grupo que consiste en agar, agarosa, kappa, carragenina, carragenina iota y carragenina lambda.
    26� La matriz de la reivindicacion 24, en donde dicha galactomanana se selecciona del grupo que consiste en goma de algarrobo y guar.
    27� La matriz de la reivindicacion 24, en donde dicha glucana se selecciona del grupo que consiste en celulosa y derivados de esta, almidon y derivados, dextranas, pululana, beta 1,3-glucanas, quitina, xantano y tamarindo.
    28� La matriz de la reivindicacion 24, en donde dicha glucomanana es konjac.
    29� La matriz de la reivindicacion 24, en donde dicho acido poliuronico se selecciona del grupo que consiste en algina, alginato y pectina.
    3C� La matriz de la reivindicacion 24, en donde dicho homopolisacarido es celulosa.
  2. 31. La matriz de la reivindicacion 11, que ademas comprende una o mas bacterias se selecciona del grupo que consiste en Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catanulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium longum DJOIOA, Bifidobacterium longum NCC2705, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium subtitle, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium thermacidophilum, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. suis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium urinalis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animals, Lactobacillus arizonenis, Lactobacillus aviarvius, Lactobacillus bifermentans; Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus corniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus cypricasei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subps. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp, lactis, Lactobacillus durianis, Lactobacillus equi, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus helveticus subsp. jugurti, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus japonicus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefer, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus letivazi, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamrrosus, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei L45, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius subsp. salicinius, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus sp. NGRI 0001, Lactobacillus suebicus, Lactobacilluss thermotolerans, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus vermiforme, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus zeae, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus latis subsp. lactis bv. diacetylactis, Lactococcus piscium; Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Leuconostoc argentinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostbo gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconstoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides ATCC 8293, Leuconostoc pseudomesenteroides, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes; Propionibacterium australiense, Propionobacterium avidum; Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium jensenii, Propionobacterium lumphophilum; Propionibacterium microaerophilum; Propionibacterium propionicum y Propionibacterium thoenii.
    32� Un microorganismo R2C2 aislado de un consorcio obtenido de grano de kefir bajo el numero de acceso NML 041202-3.
    33� Un microorganismo K2 aislado de un consorcio obtenido de grano de kefir bajo el numero de acceso NML 041202-1.
    34� Un microorganismo ES1 aislado de un consorcio obtenido de grano de kefir bajo el numero de acceso NML 041202-2.
    30� Un microorganismo INIX aislado de la cepa ATCC 43761.
    36� Una composicion que comprende la matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 31 en asociacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
    37� Uso de la matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 31, en donde dicho uso es para la fabricacion de un producto seleccionado del grupo de producto alimenticio, producto medico, producto farmaceutico producto cosmetico y nutraceutica.
    38� Uso de la matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 31, en donde dicho uso es para la fabricacion de un producto alimenticio.
    39� El uso como se reivindica en la reivindicacion 38, en donde dicha matriz se usa como un estabilizador de emulsion o agente espesante.
    4C� El uso como se reivindica en la reivindicacion 37 y 38, en donde dicho producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de mayonesa, aderezo, margarina, extensor, mantequilla, crema batida y sustituto bajo de grasa.
    41� El uso como se reivindica en la reivindicacion 37, en donde dicha matriz se usa como un vehiculo de entrega.
    42� Uso de la matriz de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 31, en donde dicho uso es para productos cosmeticos.
    43� El uso segun la reivindicacion 42, en donde dicho producto cosmetico se selecciona del grupo consistente de locion para la piel, crema, protector solar, rubor, mascara, sombra de ojos, champu y acondicionador.
    44� El uso de la matriz de cualquier una de las reivindicaciones 11 a 31 para la fabricacion de un medicamento para aumentar la respuesta inmune en un sujeto.
    40� El uso de la matriz de cualquier una de las reivindicaciones 11 a 31 para la fabricacion de un medicamento para reducir el nivel de triglicerido en un sujeto.
    46� El uso de la matriz de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 31 para la fabricacion de un medicamento para reducir el nivel de TNF-a en un sujeto.
    47� El uso de la matriz de cualquier una de las reivindicaciones 11 a 31 en la fabricacion de un medicamento para aumentar el nivel de glutation en un sujeto.
    n
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