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ES2311560T3 - Proteinas de fusion glp-1. - Google Patents

Proteinas de fusion glp-1. Download PDF

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ES2311560T3
ES2311560T3 ES01995845T ES01995845T ES2311560T3 ES 2311560 T3 ES2311560 T3 ES 2311560T3 ES 01995845 T ES01995845 T ES 01995845T ES 01995845 T ES01995845 T ES 01995845T ES 2311560 T3 ES2311560 T3 ES 2311560T3
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Wolfgang Glaesner
Radmilla Micanovic
Sheng-Hung Rainbow Tschang
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Eli Lilly and Co
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Eli Lilly and Co
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Abstract

Una proteína de fusión heteróloga que comprende un primer polipéptido con un terminal N y un terminal C fusionados a un segundo polipéptido con un terminal N y un terminal C, siendo el primer polipéptido un compuesto de GLP-1 y seleccionándose el segundo polipéptido entre: a) la porción Fc de una inmunoglobulina; b) un análogo de la porción Fc de una inmunoglobulina; y c) fragmentos de la porción Fc de una inmunoglobulina, y en el que el terminal C del primer polipéptido está fusionado al terminal N del segundo polipéptido.

Description

Proteínas de fusión GLP-1.
La presente invención se refiere a péptidos similares al glucagón, incluyendo análogos y derivados de los mismos, fusionados a proteínas que tienen el efecto de aumentar la vida media in vivo de los péptidos. Estas proteínas de fusión se pueden usar para tratar la diabetes mellitus no dependiente de la insulina, así como una variedad de otras condiciones.
El péptido similar al glucagón de tipo 1 (GLP-1) es un péptido de 37 aminoácidos secretado por las células L del intestino en respuesta a la ingestión de alimentos. Se ha descubierto que estimula la secreción de insulina (acción insulinotrópica), causando así la absorción de glucosa por las células y disminuyendo los niveles de glucosa en suero [véase, p.ej., Mojsov, S., (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333-343]. Sin embargo, el GLP-1 es poco activo. Una escisión endógena posterior entre la sexta y la séptima posición produce un péptido GLP-1(7-37)OH con una actividad biológica más potente. Se conocen numerosos análogos y derivados de GLP-1, y en la presente memoria se denominan "compuestos de GLP-1". Estos análogos de GLP-1 incluyen las exendinas, que son péptidos que se encuentran en el veneno de Heloderma. Las exendinas tienen una homología secuencial con el GLP-1 nativo y se pueden unir al receptor de GLP-1 e iniciar la cascada de transducción de señales responsable de numerosas actividades que han sido atribuidas al GLP-1(7-37)OH.
Los compuestos de GLP-1 tienen una variedad de actividades fisiológicamente significativas. Por ejemplo, se ha observado que el GLP-1 estimula la liberación de insulina, disminuye la secreción del glucagón, inhibe la evacuación gástrica y aumenta la utilización de la glucosa. [Nauck, M. A., et al. (1993) "Diabetologia" 36: 741-744; Gutniak, M., et al. (1992) New England J. of Med. 326: 1316 - 1322; Nauck, M. A., et al., (1993) J. Clin. Invest. 91: 301 -
307].
El GLP-1 es el más prometedor como tratamiento de la diabetes mellitus no dependiente de la insulina (DMNDI). Hay numerosos fármacos orales en el mercado para tratar la resistencia a la insulina asociada con la DMNDI. Sin embargo, a medida que va progresando la enfermedad, los pacientes deben pasar a tratamientos que estimulan la liberación de insulina y, finalmente, a tratamientos que implican inyecciones de insulina. Los fármacos actuales que estimulan la liberación de insulina, sin embargo, también pueden causar hipoglicemia, al igual que la propia administración de insulina. Sin embargo, la actividad de GLP-1 está controlada por los niveles de glucosa en sangre. Cuando los niveles caen hasta un cierto nivel umbral, GLP-1 deja de ser activo. De este modo, no existe el riesgo de una hipoglicemia asociada con el tratamiento con GLP-1.
Sin embargo, la utilidad de la terapia con péptidos GLP-1 se ha visto limitada por su rápido aclaramiento y sus cortas vidas medias. Por ejemplo, el GLP-1(7-37) tiene una vida media en suero de sólo 3 a 5 minutos. La GLP-1(7-36)amida tiene una acción temporal de aproximadamente 50 minutos cuando se administra subcutáneamente. Incluso los análogos y los derivados que son resistentes a la escisión por proteasas endógenas carecen de vidas medias lo suficientemente largas para evitar las administraciones repetidas durante un período de 24 horas. El aclaramiento rápido de un agente terapéutico no resulta deseable en aquellos casos en los que se desea mantener un nivel elevado en sangre del agente durante un período prolongado de tiempo, por lo que se crea la necesidad de administraciones repetidas. Además, los compuestos de actuación prolongada son particularmente importantes para los pacientes diabéticos cuyo régimen de tratamiento en el pasado ha implicado tomar únicamente una medicación oral. Estos pacientes suelen tener una transición temporal extremadamente difícil a un régimen que implica múltiples inyecciones de
medicación.
El documento WO 00/69911 revela péptidos insulinotrópicos modificados de larga duración que incluyen compuestos de GLP-1 y exendina, que comprenden un grupo reactivo que reacciona con grupos amino, grupos hidroxilo o grupos tiol sobre los componentes sanguíneos para formar un enlace estable. Knudsen et al., J. Med. Chem. Vol. 43, n.º 9, 1664-1669 (2000) describen un número de compuestos de GLP-1 derivados con ácidos grasos que tienen una acción prolongada en comparación con el GLP-1.
La presente invención resuelve los problemas asociados con la administración de un compuesto que tiene una vida media en plasma corta. Los compuestos de la presente invención engloban compuestos de GLP-1 fusionados con otra proteína con una vida media en circulación larga, tal como la porción Fc de una inmunoglobulina.
En general, los péptidos terapéuticos pequeños son difíciles de manipular porque incluso los cambios ligeros de su estructura pueden afectar a la estabilidad y/o a la actividad biológica. Esto ha sido especialmente cierto para los compuestos de GLP-1 que se encuentran actualmente en desarrollo. Por ejemplo, el GLP-1(7-37)OH tiene una tendencia a sufrir un cambio de configuración de una estructura fundamentalmente de hélice alfa a una estructura fundamentalmente de lámina beta. Esta forma de lámina beta da como resultado un material agregado que se cree que es inactivo. Por lo tanto, resultó sorprendente poder desarrollar proteínas de fusión GLP-1 biológicamente activas con vidas medias más prolongadas. Esto fue especialmente inesperado debido a la dificultad de trabajar con GLP-1(7-37)OH solo y el gran tamaño de la pareja de fusión en comparación con el pequeño tamaño del péptido GLP-1
unido.
\newpage
Los compuestos de la presente invención son proteínas de fusión heterólogas que comprenden un primer polipéptido con un terminal N y un terminal C fusionados a un segundo polipéptido con un terminal N y un terminal C, siendo el primer polipéptido un compuesto de GLP-1 y seleccionándose el segundo polipéptido entre:
a) la porción Fc de una inmunoglobulina;
b) un análogo de la porción Fc de una inmunoglobulina; y
c) fragmentos de la porción Fc de una inmunoglobulina,
y en el que el terminal C del primer polipéptido está fusionado con el terminal N del segundo polipéptido. El compuesto de GLP-1 puede ser fusionado con el segundo polipéptido mediante un ligador peptídico. Es preferible que el ligador peptídico se seleccione entre:
a) un péptido rico en glicina;
b) un péptido que tenga una secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{n} en la que n es 1, 2, 3, 4. 5 ó 6; y
c) un péptido que tenga una secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{3}.
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención incluyen proteínas en las que el compuesto de GLP-1 comprende la secuencia de fórmula I [SEQ ID NO: 2].
En general, es preferible que el compuesto de GLP-1 que forma parte de la proteína de fusión heteróloga no tenga más de 6 aminoácidos que sean diferentes del correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4. Es incluso más preferible que el compuesto de GLP-1 no tenga más de 5 aminoácidos que difieran del correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4. Lo más preferible es que el compuesto de GLP-1 no tenga más de 4, 3 ó 2 aminoácidos que difieran del correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4. Preferiblemente, el compuesto de GLP-1 que forma parte de la proteína de fusión heteróloga tiene glicina o valina en la posición 8.
La presente invención proporciona proteínas de fusión heterólogas en las que el segundo polipéptido es la porción Fc de una Ig seleccionada entre: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM. Preferiblemente, la Ig se selecciona entre: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Más preferiblemente, es IgG1 o IgG4. En una realización, la IgG es humana. En otra realización, la porción Fc comprende los dominios bisagra, CH_{2} y CH_{3}. En otra realización más, el segundo polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 32.
La presente invención proporciona una proteína de fusión heteróloga según lo descrito en la presente memoria para su uso como un medicamento. Además proporciona el uso de una proteína de fusión heteróloga según lo descrito en la presente memoria para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes con diabetes mellitus no dependiente de la insulina u obesidad. También proporciona formulaciones farmacéuticas adaptadas al tratamiento de pacientes con diabetes mellitus dependiente de la insulina u obesidad que comprenden una proteína de fusión heteróloga según lo descrito en la presente memoria.
Los polinucleótidos codificantes de la proteína de fusión heteróloga están descritos en la presente memoria. También se describen en la presente memoria los vectores que comprenden estos polinucleótidos y las células huésped transfectadas o transformadas con los vectores. También se revela un procedimiento para producir una proteína de fusión heteróloga que comprende las etapas de transcribir y traducir un polinucleótido descrito en la presente memoria en condiciones en las que la proteína de fusión heteróloga es expresada en cantidades detectables.
Se revela un procedimiento de normalización de los niveles de glucosa en sangre en un mamífero en necesidad del mismo que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión heteróloga descrita en la presente memoria.
La invención se ilustra en mayor profundidad con referencia a las siguientes figuras:
Fig. 1: Secuencia de aminoácidos de Fc de la IgG1 que engloba la región bisagra, los dominios CH_{2} y CH_{3}.
Fig. 2: A. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS e inmunotransferencia del mismo gel que ilustra el peso molecular de las proteínas de fusión IgG1-Fc y GLP-1-Fc (Ruta 1, patrones de PM; Ruta 2, Fc purificada; Ruta 3, medios transfectados de prueba; Ruta 4, Val^{8}-GLP-1-Fc; Ruta 5, Exendina-4-Fc).
Fig. 3: Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de Fc purificado, albúmina y proteínas de fusión GLP-1 (Ruta 1, patrones de PM; Ruta 2, Fc purificada; Ruta 3, Val^{8}-GLP-1-Fc; Ruta 4, Exendina-4-Fc; Ruta 5, patrón de PM; Ruta 6, Val^{8}-GLP-1-HSA; Ruta 7, Exendina-4-HSA; Ruta 8, Exendina-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{3}-HSA).
Fig. 4: Vector de clonación de la expresión que contiene las regiones de Fc ilustradas en la figura 1.
Fig. 5: Actividad dosis-respuesta in vitro de proteínas de fusión GLP-1.
Fig. 6: Farmacocinéticas de proteínas de fusión HSA y Fc GLP-1.
Fig. 7: Respuesta glucodinámica a Exendina-Fc en dos perros en ayunas normales.
Fig. 8: Respuesta insulinotrópica a Exendina-Fc en dos perros en ayunas normales.
Fig. 9: Secuencia de ADN codificante de una región de Fc de la IgG1 humana.
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención comprenden un compuesto de GLP-1 fusionado con la porción Fc de una inmunoglobulina, un análogo de la porción Fc de una inmunoglobulina o un fragmento de la porción Fc de una inmunoglobulina. El terminal C del compuesto de GLP-1 puede ser fusionado directamente o mediante un ligador peptídico con el terminal N de la proteína Fc. Estas proteínas de fusión heterólogas son biológicamente activas y tienen una vida media aumentada en comparación en la GLP-1 nativa.
Es preferible que los compuestos de GLP-1 que forman parte de la proteína de fusión heteróloga engloben polipéptidos que tengan de aproximadamente veinticinco a aproximadamente treinta y nueve aminoácidos naturales o no naturales que tengan una homología suficiente con el GLP-1(7-37)OH nativo tal que presenten una actividad insulinotrópica al unirse con el receptor de GLP-1 sobre células \beta del páncreas. Un compuesto de GLP-1 comprende comúnmente un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de GLP-1(7-37)OH, un análogo de GLP-1(7-37)OH, un fragmento de GLP-1(7-37)OH o un fragmento de un análogo de GLP-1(7-37)OH. GLP-1(7-37)OH tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
1
Según la costumbre en la técnica, al terminal amino de GLP-1(7-37)OH se le ha asignado el residuo número 7, y al terminal carboxilo, el número 37. El resto de aminoácidos del polipéptido están numerados consecutivamente, según lo mostrado en la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la posición 12 es fenilalanina y la posición 22 es glicina.
Los compuestos GLP-1 también engloban "fragmentos de GLP-1". Un fragmento de GLP-1 es un polipéptido obtenido tras el truncamiento de uno o más aminoácidos del terminal N y/o el terminal C de GLP-1(7-37)OH, o un análogo o derivado del mismo. La nomenclatura usada para describir a GLP-1(7-37)OH también es aplicable a los fragmentos de GLP-1. Por ejemplo, GLP-1(9-36)OH denota un fragmento de GLP-1 obtenido mediante el truncamiento de dos aminoácidos del terminal N y de un aminoácido del terminal C. Los aminoácidos del fragmento se indican por el mismo número que el correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH. Por ejemplo, el ácido glutámico N-terminal de GLP-1(9-36)OH está en la posición 9; la posición 12 está ocupada por fenilalanina; y la posición 22 está ocupada por glicina, como en GLP-1(7-37)OH. Para GLP-1(7-36)OH, la glicina de la posición 37 de GLP-1(7-37)OH está eliminada.
Los compuestos GLP-1 también incluyen polipéptidos a los que se ha añadido uno o más aminoácidos al terminal N y/o al terminal C de GLP-1(7-37)OH, o fragmentos o análogos del mismo. Es preferible que los compuestos de GLP-1 de este tipo tengan hasta aproximadamente treinta y nueve aminoácidos. Los aminoácidos del compuesto de GLP-1 "ampliado" se indican por el mismo número que el correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH. Por ejemplo, el aminoácido N-terminal de un compuesto de GLP-1 obtenido mediante la adición de dos aminoácidos en el terminal N de GLP-1(7-37)OH está en la posición 5; y el aminoácido C-terminal de un compuesto de GLP-1 obtenido mediante la adición de un aminoácido en el terminal C de GLP-1(7-37)OH está en la posición 38. De este modo, la posición 12 está ocupada por fenilalanina y la posición 22 está ocupada por glicina tanto en estos compuestos GLP-1 "ampliados" como en GLP-1(7-37)OH. Los aminoácidos 1-6 de un compuesto de GLP-1 ampliado son preferiblemente los mismos que o una sustitución conservadora del aminoácido de la correspondiente posición de GLP-1(1-37)OH. Los aminoácidos 38-45 de un compuesto de GLP-1 ampliado son preferiblemente los mismos que o una sustitución conservadora del aminoácido de la correspondiente posición de glucagón o exendina-4.
Los compuestos GLP-1 de la presente invención engloban "análogos de GLP-1". Un análogo de GLP-1 tiene una homología suficiente con GLP-1(7-37)OH o un fragmento de GLP-1(7-37)OH tal que el análogo tenga actividad insulinotrópica. Preferiblemente, un análogo de GLP-1 tiene una secuencia de aminoácidos de GLP-1(7-37)OH o un fragmento de la misma, modificada tal que uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos difieran del aminoácido de la correspondiente posición de GLP-1(7-37)OH o de un fragmento de GLP-1(7-37)OH. En la nomenclatura usada en la presente memoria para designar los compuestos de GLP-1, el aminoácido sustituyente y su posición están indicados antes de la estructura parental. Por ejemplo, Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH designa un compuesto de GLP-1 en el que la glicina normalmente encontrada en la posición 22 de GLP-1(7-37)OH ha sido reemplazada por ácido glutámico; Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH designa un compuesto de GLP-1 en el que la alanina normalmente encontrada en la posición 8 y la glicina normalmente encontrada en la posición 22 de GLP-1(7-37)OH han sido reemplazadas por valina y ácido glutámico, respectivamente.
Los compuestos de GLP-1 de la presente invención también incluyen "derivados de GLP-1". Un derivado de GLP-1 se define como una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos de GLP-1 o de un análogo de GLP-1, pero que también tiene la modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácido, átomos \alpha-carboxilo, grupo amino-terminal o grupo de ácido carboxílico terminal. Una modificación química incluye, pero no se limita a, la adición de restos químicos, la creación de nuevos enlaces y la eliminación de restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácido incluyen, sin limitación, la acilación de \varepsilon-amino de lisina, la N-alquilación de arginina, histidina o lisina, la alquilación de grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico y la desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino-terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones des-amino, de N-alquilo inferior, de N-di-alquilo inferior y de N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, alquil-amida inferiores, dialquil-amida y alquil-éster inferior. Alquilo inferior es alquilo(C_{1}-C_{4}). Además, se pueden proteger uno o más grupos laterales, o grupos terminales, mediante grupos protectores conocidos por el experto en Química de Proteínas. El carbono \alpha de un aminoácido puede ser mono o dimetilado.
Cualquier compuesto de GLP-1 puede formar parte de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención, siempre y cuando el propio compuesto de GLP-1 pueda unirse a e inducir la señalización a través del receptor de GLP-1. La unión al receptor de GLP-1 y la transducción de señales se puede evaluar usando análisis in vitro tales como los descritos en el documento EP 619.322 y en la patente estadounidense n.º: 5.120.712, respectivamente.
Se conocen numerosos fragmentos, análogos y derivados de GLP-1 en la técnica y cualquiera de estos análogos y derivados también puede formar parte de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención. En la presente memoria, se proporcionan algunos ejemplos de nuevos análogos de GLP-1, así como de análogos y derivados de GLP-1 conocidos en la técnica.
Algunos análogos de GLP-1 y fragmentos de GLP-1 conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, GLP-1(7-34) y GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Gln^{9}-GLP-1(7-37), D-Gln^{9}-GLP-1(7-37), Thr^{16}-Lys^{18}-GLP-1(7-37) y Lys^{18}-GLP-1(7-37). En la patente estadounidense n.º: 5.118.666, se revelan análogos de GLP-1 tales como GLP-1(7-34) y GLP-1(7-35). También se conocen formas procesadas biológicamente de GLP-1 que tienen propiedades insulinotrópicas, tales como GLP-1(7-36). En la patente estadounidense n.º: 5.977.071 concedida a Hoffmann, et al., la patente estadounidense n.º: 5.545.618 concedida a Buckley, et al., y en Adelhorst, et al., J. Biol. Chem. 269: 6275 (1994), se revelan otros compuestos GLP-1 biológicamente activos conocidos.
Un grupo preferido de análogos de GLP-1 está compuesto por análogos de GLP-1 de fórmula I (SEQ ID NO: 2)
2
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 8 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 9 es Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 11 es Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 14 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 16 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 17 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 18 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 19 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 20 es Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 21 es Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 22 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 23 es Gln, Asn, Arg, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 24 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 25 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 26 es Lys, Arg, Gln, Glu, Asp o His;
\quad
el Xaa de la posición 27 es Leu, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 30 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 31 es Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 32 es Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 33 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 34 es Asn, Lys, Arg, Glu, Asp o His;
\quad
el Xaa de la posición 35 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 36 es Gly, Arg, Lys, Glu, Asp o His;
\quad
el Xaa de la posición 37 es Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 38 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp o His, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 39 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp o His, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 40 es Gly, Asp, Glu o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 41 es Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 42 es Ser, Pro, Lys, Glu o Asp, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 43 es Ser, Pro, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 44 es Gly, Pro, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
y
\quad
el Xaa de la posición 45 es Ala, Ser, Val, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
con la condición de que cuando el aminoácido de la posición 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ó 44 está eliminado, entonces todos los aminoácidos secuencia abajo del aminoácido también están eliminados.
Es preferible que el compuesto de GLP-1 de fórmula I contenga menos de seis aminoácidos que difieran del correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH o exendina-4. Es más preferible que menos de cinco aminoácidos difieran del correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH o exendina-4. Es incluso más preferible que menos de cuatro aminoácidos difieran del correspondiente aminoácido de GLP-1(7-37)OH o exendina-4.
Los compuestos GLP-1 de la presente invención incluyen derivados de fórmula I tales como un éster(C_{1}-C_{6}) o una amida o una alquilamida(C_{1}-C_{6}) o una dialquilamida(C_{1}-C_{6}) de la misma. El documento WO99/43706 describe derivados de compuestos de GLP-1 de fórmula I. Los compuestos de fórmula I derivados según lo descrito en el documento WO99/43706 y no derivados están englobados por la presente invención.
\global\parskip0.870000\baselineskip
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 está compuesto por análogos de GLP-1 de fórmula II (SEQ ID NO: 3):
3
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil-histidina;
\quad
el Xaa de la posición 8 es: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\quad
el Xaa de la posición 9 es: Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu o His;
\quad
el Xaa de la posición 11 es: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys o His;
\quad
el Xaa de la posición 12 es: His, Trp, Phe o Tyr;
\quad
el Xaa de la posición 16 es: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu o Ala;
\quad
el Xaa de la posición 18 es: His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 23 es: His, Asp, Lys, Glu, Gln o Arg;
\quad
el Xaa de la posición 24 es: Glu, Arg, Ala o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 26 es: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu o His;
\quad
el Xaa de la posición 27 es: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 30 es: Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\quad
el Xaa de la posición 31 es: Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 33 es: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly o Glu;
\quad
el Xaa de la posición 34 es: Glu, Lys o Asp;
\quad
el Xaa de la posición 35 es: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His o Glu;
\quad
el Xaa de la posición 36 es: Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu o His;
\quad
el R de la posición 37 es: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, o está eliminado.
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 está compuesto por análogos de GLP-1 de fórmula III (SEQ ID NO: 4):
4
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil- histidina;
\global\parskip1.000000\baselineskip
\quad
el Xaa de la posición 8 es: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\quad
el Xaa de la posición 11 es: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys o His;
\quad
el Xaa de la posición 12 es: His, Trp, Phe o Tyr;
\quad
el Xaa de la posición 16 es: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu o Ala;
\quad
el Xaa de la posición 22: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\quad
el Xaa de la posición 23 es: His, Asp, Lys, Glu o Gln;
\quad
el Xaa de la posición 24 es: Glu, His, Ala o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 25 es: Asp, Lys, Glu o His;
\quad
el Xaa de la posición 27 es: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 30 es: Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\quad
el Xaa de la posición 33 es: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly o Glu;
\quad
el Xaa de la posición 34 es: Glu, Lys o Asp;
\quad
el Xaa de la posición 35 es: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His o Glu;
\quad
el Xaa de la posición 36 es: Arg, Glu o His;
\quad
R de la posición 37 es: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, o está eliminado.
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 está compuesto por análogos de GLP-1 de fórmula IV (SEQ ID NO: 5):
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil-histidina;
\quad
el Xaa de la posición 8 es: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met o Thr;
\quad
el Xaa de la posición 12 es: His, Trp, Phe o Tyr;
\quad
el Xaa de la posición 16 es: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu o Ala;
\quad
el Xaa de la posición 22 es: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\quad
el Xaa de la posición 23 es: His, Asp, Lys, Glu o Gln;
\quad
el Xaa de la posición 26 es: Asp, Lys, Glu o His;
\quad
el Xaa de la posición 30 es: Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\quad
el Xaa de la posición 35 es: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His o Glu;
\quad
el R de la posición 37 es: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, NH_{2}, Gly-Pro-NH_{2} o está eliminado.
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 está compuesto por análogos de GLP-1 de fórmula V (SEQ ID NO: 6):
6
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil-histidina;
\quad
el Xaa de la posición 8 es: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\quad
el Xaa de la posición 22 es: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\quad
el Xaa de la posición 23 es: His, Asp, Lys, Glu o Gln;
\quad
el Xaa de la posición 24 es: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 30 es: Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\quad
el R de la posición 37 es: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, o está eliminado.
Los compuestos GLP-1 de fórmula I, II, III, IV y V preferidos comprenden análogos de GLP-1 o fragmentos de análogos de GLP-1, conteniendo los análogos o los fragmentos un aminoácido distinto de alanina en la posición 8 (análogos de posición 8). Es preferible que estos análogos de posición 8 contengan uno o más cambios adicionales en las posiciones 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36 y 37 en comparación con el correspondiente aminoácido del GLP-1(7-37)OH nativo. También es preferible que estos análogos tengan 6 o menos cambios en comparación con los correspondientes aminoácidos del GLP-1(7-37)OH o GLP-1(7-36)OH nativo. Los análogos más preferidos tienen 5 o menos cambios en comparación con los correspondientes aminoácidos del GLP-1(7-37)OH o GLP-1(7-36)OH nativo, o tienen 4 o menos cambios en comparación con los correspondientes aminoácidos del GLP-1(7-37)OH o GLP-1(7-36)OH nativo. Es incluso más preferible que estos análogos tengan 3 o menos cambios en comparación con los correspondientes aminoácidos del GLP-1(7-37)OH o GLP-1(7-36)OH nativo. Lo más preferible es que estos análogos tengan 2 o menos cambios en comparación con los correspondientes aminoácidos del GLP-1(7-37)OH nativo.
Se ha descubierto que los compuestos de fórmula II, III, IV y V tienen una reducida propensión a agregarse y a generar formas insolubles. Esto también es importante en el contexto de las proteínas de fusión en las que un péptido GLP-1 relativamente pequeño debe mantener una configuración activa a pesar de ser fusionado con una proteína mucho mayor. Los compuestos de GLP-1 de fórmula II, III, IV y V preferidos englobados por las proteínas de fusión de la presente invención comprenden análogos de GLP-1 o fragmentos de análogos de GLP-1 en los que la glicina de la posición 22 y, preferiblemente, la alanina de la posición 8 han sido reemplazadas por otro aminoácido.
Cuando la posición 22 es ácido aspártico, ácido glutámico, arginina o lisina, la posición 8 es preferiblemente, glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, valina o glicina. Cuando la posición 22 es ácido sulfónico, tal como ácido cisteico, la posición 8 es preferiblemente, glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, valina o glicina.
Otros compuestos de GLP-1 preferidos incluyen análogos de GLP-1 de fórmula IV (SEQ ID NO:5), teniendo los análogos la secuencia de GLP-1(7-37)OH a excepción de que el aminoácido de la posición 8 es preferiblemente glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, valina o glicina, y la posición 30 es ácido glutámico, ácido aspártico, serina o histidina, y más preferiblemente, ácido glutamático.
Otros compuestos de GLP-1 preferidos incluyen análogos de GLP-1 de fórmula IV (SEQ ID NO:5), teniendo los análogos la secuencia de GLP-1(7-37)OH a excepción de que el aminoácido de la posición 8 es preferiblemente glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, valina o glicina, y la posición 37 es histidina, lisina, arginina, treonina, serina, ácido glutámico, ácido aspártico, triptófano, tirosina, fenilalanina y más preferiblemente, histidina.
Otros compuestos de GLP-1 preferidos incluyen análogos de GLP-1 de fórmula IV (SEQ ID NO:5), teniendo los análogos la secuencia de GLP-1(7-37)OH a excepción de que el aminoácido de la posición 8 es preferiblemente glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, valina o glicina, y la posición 22 es ácido glutámico, lisina, ácido aspártico o arginina, y más preferiblemente, ácido glutámico o lisina, y la posición 23 es lisina, ácido glutámico, ácido aspártico e histidina, y más preferiblemente, lisina y ácido
glutámico.
Otros compuestos de GLP-1 preferidos incluyen análogos de GLP-1 de fórmula V (SEQ ID NO:6), teniendo los análogos la secuencia de GLP-1(7-37)OH a excepción de que el aminoácido de la posición 8 es preferiblemente glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, valina o glicina, y la posición 22 es ácido glutámico, lisina, ácido aspártico o arginina, y más preferiblemente, ácido de glutamina o lisina, y la posición 27 es alanina, lisina, arginina, triptófano, tirosina, fenilalanina o histidina, y más preferiblemente, alani-
na.
Otros compuestos de GLP-1 preferidos incluyen análogos de GLP-1 de fórmula II, teniendo los análogos la secuencia GLP-1(7-37)OH a excepción de que el aminoácido de la posición 8 y uno, dos o tres aminoácidos seleccionados del grupo constituido por la posición 9, posición 11, posición 12, posición 16, posición 18, posición 22, posición 23, posición 24, posición 26, posición 27, posición 30, posición 31, posición 33, posición 34, posición 35, posición 36 y posición 37, difieren del aminoácido de la correspondiente posición del GLP-1(7-37)OH nativo.
Otros compuestos de GLP-1 de fórmula II preferidos incluyen: Val^{8}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-GLP-1(7-37)OH, Glu^{22}-GLP-1(7-37OH, Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Arg^{22}-GLP-1(7-37)OH, Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Cys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Arg^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Cys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Arg^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Cys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Glu^{22}-GLP-1(7-36)OH, Asp^{22}-GLP-1(7-36)OH, Arg^{22}-GLP-1(7-36)OH, Lys^{22}-GLP-1(7-36)OH, Cys^{22}-GLP-1(7-36)OH, Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)OH, Val^{8}-Asp^{22}-
GLP-1(7-36)OH, Val^{8}-Arg^{22}-GLP-1(7- 36)OH, Val^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)OH, Val^{8}-Cys^{22}-GLP-1(7-36)OH, Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)OH, Gly^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)OH, Gly^{8}-Arg^{22}-GLP-1(7-36)OH, Gly^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)OH, Gly^{8}-
Cys^{22}-GLP-1(7-36)OH, Lys^{23}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Lys^{23}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Lys^{23}-GLP-1(7-37)OH, Lys^{24}-
GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Lys^{24}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Lys^{23}-GLP-1(7-37)OH, Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Asp^{30}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Asp^{30}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Asp^{30}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{30}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Ser^{30}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Ser^{30}-GLP-1(7-37)OH, His^{30}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-His^{30}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-His^{30}-GLP-1(7-37)OH, Glu^{34}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{34}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{34}-GLP-1(7-37)OH, Lys^{35}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Lys^{35}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Lys^{35}-GLP-1(7-37)OH, His^{35}-GLP-1(7-37)OH Val^{8}-His^{35}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-His^{35}-GLP-1(7-37)OH, Pro^{35}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Pro^{35}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Pro^{35}-GLP-1(7-37)OH, Glu^{35}-GLP-1(7-37)OH Val^{8}-Glu^{35}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{35}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Ala^{27}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-Lys^{23}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-Glu^{23}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-Ala^{27}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-Ala^{27}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{22}-Ala^{27}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Lys^{22}-Glu^{23}-GLP-1(7-37)OH y Gly^{8}-Lys^{22}-Glu^{23}-GLP-1(7-37)OH.
Otro grupo preferido de análogos y derivados de GLP-1 para su uso en la presente invención está compuesto por moléculas de fórmula VI (SEQ ID NO: 6):
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
R_{1} se selecciona del grupo constituido por L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, alfa- fluorometil-histidina y alfa-metil-histidina; X se selecciona del grupo constituido por Ala, Gly, Val, Thr, Ile y alfa-metil-Ala; Y se selecciona del grupo constituido por Glu, Gln, Ala, Thr, Ser y Gly; Z se selecciona del grupo constituido por Glu, Gln, Ala, Thr, Ser y Gly; y R_{2} es Gly-OH.
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 para su uso en la presente invención se revela en el documento WO91/11457, y está esencialmente constituido por GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) o GLP-1(7-37), o la forma amida de los mismos, y sus sales farmacéuticamente aceptables, que tienen al menos una modificación seleccionada del grupo constituido por:
(a) sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, arginina o D-lisina por lisina en la posición 16 y/o en la posición 34; o la sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, lisina o D-arginina por arginina en la posición 36;
(b) sustitución de un aminoácido resistente a la oxidación por triptófano en la posición 31:
(c) sustitución de al menos uno entre: tirosina por valina en la posición 16; lisina por serina en la posición 18; ácido aspártico por ácido glutámico en la posición 21; serina por glicina en la posición 22; arginina por glutamina en la posición 23; arginina por alanina en la posición 24; y glutamina por lisina en la posición 26; y
(d) sustitución de al menos una entre: glicina, serina o cisteína por alanina en la posición 8; ácido aspártico, glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina por ácido glutámico en la posición 9; serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina por glicina en la posición 10; y ácido glutámico por ácido aspártico en la posición 15; y
(e) sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina, o la forma D- o N-acilada o alquilada de histidina por histidina en la posición 7; en la que, en las sustituciones (a), (b), (d) y (e), los aminoácidos sustituidos pueden estar opcionalmente en la forma D y los aminoácidos sustituidos en la posición 7 pueden estar opcionalmente en la forma N-acilada o N-alquilada.
Debido a que la enzima dipeptidil-peptidasa IV (DPP IV) puede ser responsable de la rápida desactivación in vivo observada del GLP-1 administrado, [véase, p.ej., Mentlein, R., et al., Eur. J. Biochem., 214: 829-835 (1993)], se prefieren los análogos y derivados de GLP-1 que están protegidos de la actividad de la DPP IV en el contexto de una proteína de fusión, siendo más preferidas las proteínas de fusión en las que el compuesto de GLP-1 es Gly^{8}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-GLP-1(7-37)OH, \alpha-metil-Ala^{8}-GLP-1(7-37)OH o Gly^{8}-Gln^{21}-GLP-1(7-37)OH.
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 para su uso en la presente invención está constituido por compuestos de fórmula VII (SEQ ID NO: 8) reivindicada en la patente estadounidense n.º 5.512.549:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} se selecciona del grupo constituido por 4-imidazopropionilo, 4-imidazoacetilo o 4-imidazo-\alpha,\alpha-dimetilacetilo; R^{2} se selecciona del grupo constituido por acilo(C_{6}-C_{10}) sin ramificar, o está ausente; R^{3} se selecciona del grupo constituido por Gly-OH o NH_{2}; y Xaa es Lys o Arg.
Los compuestos de fórmula VII más preferidos para su uso en la presente invención son aquellos en los que Xaa es Arg y R^{2} es acilo(C_{6}-C_{10}) no ramificado. Los compuestos de fórmula VII todavía más preferidos para su uso en la presente invención son aquellos en los que Xaa es Arg, R^{2} es acilo(C_{6}-C_{10}) no ramificado y R^{3} es Gly-OH. Otros compuestos de fórmula VII muy preferidos para su uso en la presente invención son aquellos en los que Xaa es Arg, R^{2} es acilo(C_{6}-C_{10}) no ramificado, R^{3} es Gly-OH y R^{1} es 4-imidazopropionilo. Un compuesto de fórmula VII especialmente preferido para su uso en la presente invención es aquél en el que Xaa es Arg, R^{2} es acilo(C_{8}) no ramificado, R^{3} es Gly-OH y R^{1} es 4-imidazopropionilo.
Preferiblemente, los compuestos de GLP-1 comprenden análogos de GLP-1 en los que la estructura para tales análogos o fragmentos contiene un aminoácido distinto de alanina en la posición 8 (análogos de posición 8). La estructura también puede incluir L-histidina, D-histidina o formas modificadas de histidina tales como desamino-histidina, 2-amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil-histidina en la posición 7. Es preferible que estos análogos de la posición 8 contengan uno o más cambios adicionales en las posiciones 12, 16, 18, 19, 20, 25, 27, 30, 33 y 37 en comparación con el correspondiente aminoácido del GLP-1(7-37)OH nativo. Es más preferible que estos análogos de posición 8 contengan uno o más cambios adicionales en las posiciones 16, 18, 22, 25 y 33 en comparación con el correspondiente aminoácido del GLP-1(7-37)OH nativo.
En una realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 12 se selecciona del grupo constituido por triptófano o tirosina. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 12, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de la sustitución de la posición 12 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 16 se selecciona del grupo constituido por triptófano, isoleucina, leucina, fenilalanina o tirosina. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 16, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de las sustituciones de las posiciones 16 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 16 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 16 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por histidina.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 18 se selecciona del grupo constituido por triptófano, tirosina, fenilalanina, lisina, leucina o isoleucina, preferiblemente, triptófano, tirosina e isoleucina. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 18, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de la sustitución de la posición 18 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 18 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 18 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por
histidina.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 19 se selecciona del grupo constituido por triptófano, o fenilalanina, preferiblemente, triptófano. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 19, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de las sustituciones de las posiciones 19 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 19 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 19 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por histidina.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 20 se selecciona del grupo constituido por tirosina o triptófano. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 20, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de las sustituciones de las posiciones 20 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 20 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 20 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por histidina.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 25 se selecciona del grupo constituido por valina, isoleucina y leucina, preferiblemente, valina. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 25, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de las sustituciones de las posiciones 25 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 25 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 25 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por histidina.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 27 se selecciona del grupo constituido por isoleucina o alanina. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 27, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de las sustituciones de las posiciones 27 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 27 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 27 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por histidina.
En otra realización preferida, el análogo de GLP-1 es GLP-1(7-37)OH, en el que el aminoácido de la posición 33 es isoleucina. Es más preferible que además de la sustitución de la posición 33, el aminoácido de la posición 8 esté sustituido por glicina, valina, leucina, isolecina, serina, treonina o metionina, y más preferiblemente, por valina o glicina. Es incluso más preferible que además de las sustituciones de las posiciones 33 y 8, el aminoácido de la posición 22 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 33 y 8, el aminoácido de la posición 30 esté sustituido por ácido glutámico. También es preferible que además de las sustituciones de las posiciones 33 y 8, el aminoácido de la posición 37 esté sustituido por histidina.
\newpage
Los compuestos de GLP-1 tienen modificaciones en una o más de las siguientes posiciones: 8, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 y 37. Estos compuestos de GLP-1 muestran una mayor potencia en comparación con GLP-1(7-37)OH y comprenden la secuencia de aminoácidos de fórmula IX (SEQ ID NO: 12)
9
en la que:
\quad
Xaa_{7} es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil- histidina;
\quad
Xaa_{8} es: Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\quad
Xaa_{12} es: Phe, Trp o Tyr;
\quad
Xaa_{16} es: Val, Trp, Ile, Leu, Phe o Tyr;
\quad
Xaa_{18} es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
Xaa_{19} es: Tyr, Trp o Phe;
\quad
Xaa_{20} es: Leu, Phe, Tyr o Trp;
\quad
Xaa_{22} es: Gly, Glu, Asp o Lys;
\quad
Xaa_{25} es: Ala, Val, Ile o Leu;
\quad
Xaa_{27} es: Glu, Ile o Ala;
\quad
Xaa_{30} es: Ala o Glu;
\quad
Xaa_{33} es: Val o Ile; y
\quad
Xaa_{37} es: Gly, His, NH_{2} o está ausente.
Algunos compuestos de GLP-1 de fórmula IX preferidos incluyen GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)-NH_{2}, Gly^{8}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-GLP-1(7-36) NH_{2}, Val^{8}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Leu^{8}-GLP-1(7-37)OH, Leu^{8}-
GLP-1(7-36)NH_{2}, Ile^{8}-GLP-1(7-37)OH, Ile^{8}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ser^{8}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{8}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Thr^{8}-GLP-1(7-37)OH, Thr^{8}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-Tyr^{12}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Tyr^{12}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-Tyr^{16}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Ty^{16}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Gly^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Gly^{8}-
Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Leu^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Leu^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2},
Ile^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Ile^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Leu^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Leu^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ile^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Ile^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Leu^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Leu^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ile^{6}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Ile^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ser^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Thr^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Thr^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ser^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)
NH_{2}, Thr^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Thr^{8}-Asp^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ser^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Thr^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Thr^{8}-Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Glu^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Asp^{22}-GLP-1(7-37)OH, Asp^{22}-GLP-14(7-36)NH_{2}, Lys^{22}-GLP-1(7-37)OH, Lys^{22}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-Ala^{27}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{22}-Ala^{27}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Gly^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-36)NH, Leu^{6}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Leu^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ile^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Ile^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-36) NH_{2}, Ser^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Thr^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-37)OH, Thr^{8}-Glu^{30}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Val^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-His^{37}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Gly^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Gly^{8}-His^{37}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Leu^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Leu^{8}-His^{37}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ile^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Ile^{8}-His^{37}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Ser^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Ser^{8}-His^{37}-GLP-1(7-36)NH_{2}, Thr^{8}-His^{37}-GLP-1(7-37)OH, Thr^{8}-His^{37}-GLP-1(7-36) NH_{2}.
Algunos compuestos de GLP-1 de fórmula IX preferidos que tienen múltiples sustituciones incluyen GLP-1(7-37)OH en el que la posición 8 es valina o glicina, la posición 22 es ácido glutámico, la posición 16 es tirosina, leucina o triptófano, la posición 18 es tirosina, triptófano o isoleucina, la posición 25 es valina y la posición 33 es isoleucina. Otros compuestos de GLP-1 preferidos incluyen los siguientes: Val^{8}-Tyr^{16}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Tyr^{12}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Tyr^{16}-Phe^{19}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Tyr^{16}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Trp^{16}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Leu^{16}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Ile^{16}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Phe^{16}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH; Val^{8}-Trp^{18}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Tyr^{18}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH, Val^{8}-Phe^{18}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH y Val^{8}-Ile^{18}-Glu^{22}-GLP-1(7-37)OH.
Los compuestos de GLP-1 de la presente invención también engloban compuestos de exendina. La exendina-3 y la exendina-4 son péptidos biológicamente activos que fueron aislados por primera vez del veneno de lagartos Heloderma, y han demostrado unirse al receptor de GLP-1 y estimular la producción de H^{+} dependiente del AMP cíclico en células parietales de mamífero. La exendina 3 y la exendina-4 son péptidos ambos de 39 aminoácidos que tienen una homología del aproximadamente 53% con el GLP-1. Actúan como potentes agonistas de la actividad de GLP-1. En particular, un derivado truncado N-terminalmente de la exendina, conocido como exendina(aminoácidos 9-39), es un inhibidor de la exendina-3, la exendina-4 y el GLP-1.
Un compuesto de exendina comprende comúnmente un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la exendina-3, la exendina-4 o un análogo o un fragmento de las mismas. La exendina 3 y la exendina 4 se revelan en la patente estadounidense n.º: 5.424.286.
La exendina-3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
La exendina-4 tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
11
Los compuestos de GLP-1 también incluyen fragmentos de exendina que son polipéptidos obtenidos tras el truncamiento de uno o más aminoácidos del terminal N y/o del terminal C de la exendina o de un análogo de exendina. Además, los compuestos de GLP-1 incluyen polipéptidos de exendina a los que se ha añadido uno o más aminoácidos al terminal N y/o al terminal C de la exendina o fragmentos de la misma. Los compuestos de exendina de este tipo tienen hasta aproximadamente cuarenta y cinco aminoácidos.
Los compuestos de GLP-1 también incluyen "análogos de exendina". Un análogo de exendina tiene una homología suficiente con la exendina-4, la exendina-3 o un fragmento de las mismas tal que el análogo tenga actividad insulinotrópica. Se puede analizar la actividad de los fragmentos y/o los análogos de exendina usando análisis in vitro tales como los descritos en el documento EP 619.322 y en la patente estadounidense n.º: 5.120.712.
Preferiblemente, un análogo de exendina tiene una secuencia de aminoácidos de exendina-4 o un fragmento de la misma, modificada tal que uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos difieren del aminoácido de la correspondiente posición de la exendina-4 o del fragmento de exendina-4. En la nomenclatura usada en la presente memoria para designar los compuestos de exendina, el aminoácido sustituyente y su posición están indicados antes de la estructura parental. Por ejemplo, Val^{8}-exendina-4 designa un compuesto de exendina en el que la glicina normalmente encontrada en la posición 8 de la exendina-4 ha sido reemplazada por valina.
Otro grupo preferido de compuestos de GLP-1 está compuesto por análogos de GLP-1/exendina-4 de fórmula VIII (SEQ ID NO: 11):
12
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2- amino-histidina, \beta-hidroxi-histidina, homohistidina, \alpha-fluorometil-histidina o \alpha-metil-histidina;
\quad
el Xaa de la posición 8 es: Gly, Ala o Val;
\quad
el Xaa de la posición 16 es: Leu o Val;
\quad
el Xaa de la posición 18 es Lys o Ser;
\quad
el Xaa de la posición 19 es: Gln o Tyr;
\quad
el Xaa de la posición 20 es: Met o Leu;
\quad
el Xaa de la posición 22 es: Glu o Gln;
\quad
el Xaa de la posición 23 es: Glu o Gln;
\quad
el Xaa de la posición 25 es: Val o Ala;
\quad
el Xaa de la posición 26 es: Arg o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 27 es Leu o Glu;
\quad
el Xaa de la posición 30 es: Glu o Ala;
\quad
el Xaa de la posición 33 es: Val o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 34 es: Asn o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 36 es: Gly o Arg; y
el R de la posición 37 es: Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser o está ausente. En la tabla 6, se proporciona la actividad de 18 especies diferentes de GLP-1.
En las publicaciones de patente conforme al PCT WO 99/25728 (Beeley et al.), WO 99/25727 (Beeley et al.), WO 98/05351 (Young et al.), WO 99/40788 (Young et al.), WO 99/07404 (Beeley et al) y WO 99/43708 (Knudsen et al), se describen más análogos de exendina que son útiles para la presente invención.
Las proteínas de fusión GLP-1 de la presente invención pueden comprender sitios de glicosilación. La glicosilación es una modificación química en la que se añaden restos de azúcar a la proteína en sitios específicos. La glicosilación de proteínas desempeña un papel que garantiza la carga correcta, la confirmación y la estabilidad de las proteínas en maduración, y puede dirigir a la proteína a la superficie celular y a la secreción final de la misma. Lo más importante es que la glicosilación ejerce la velocidad de aclaramiento in vivo para muchas proteínas. Los azúcares pueden estar a O o a N. En general, los azúcares enlazados a O se añaden al oxígeno del grupo hidroxilo de la serina y la treonina, mientras que los azúcares enlazados a N se añaden al nitrógeno de la amida de la asparagina. El sitio consenso para la N-glicosilación es Asn X1 X2, en el que X1 es cualquier aminoácido a excepción de Pro, y X2 es Ser o Thr.
Los compuestos de GLP-1 no son generalmente glicosilados in vivo; sin embargo, lo interesante es que las proteínas de fusión GLP-1 de la presente invención que comprenden un compuesto de GLP-1 con una extensión C-terminal fusionada a una secuencia de Fc están glicosiladas en la última serina de la extensión C-terminal (SSGAPPPS*) y en la treonina en la posición 11 de la región N-terminal de Fc (AEPKSCDKTHT*CPPC...).
\vskip1.000000\baselineskip
Proteínas de fusión Fc heterólogas
Los compuestos de GLP-1 descritos anteriormente pueden ser fusionados directamente o mediante un ligador peptídico a la porción Fc de una inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas son moléculas que contienen cadenas polipeptídicas unidas mediante enlaces tipo disulfuro, que comúnmente tienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (V) tiene una secuencia de aminoácidos variable en función de la especificidad de la molécula por el anticuerpo. Los otros dominios (C) tienen una secuencia bastante constante común a las moléculas de la misma clase.
Como se usa en la presente memoria, la porción Fc de una inmunoglobulina tiene el significado que comúnmente se otorga al término en el campo de la Inmunología. Específicamente, este término se refiere a un fragmento de anticuerpo que se obtiene retirando dos regiones de unión a antígenos (los fragmentos Fab) del anticuerpo. Un modo de retirar los fragmentos Fab es mediante la digestión de la inmunoglobulina con la proteasa papaína. De este modo, se forma la porción Fc a partir de fragmentos de un tamaño aproximadamente igual de la región constante de ambas cadenas pesadas, que se asocian a través de interacciones no covalentes y enlaces tipo disulfuro. La porción Fc puede incluir las regiones bisagra y extenderse por los dominios CH_{2} y CH_{3} hasta el terminal C del anticuerpo. Las regiones bisagra representativas para las inmunoglobulinas humanas y de ratón se pueden encontrar en "Antibody Engineering, A Practical Guide", Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman and Co., 1992. La porción Fc puede incluir además uno o más sitios de glicosilación. En la figura 1, se muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína Fc representativa que contiene la región bisagra y los dominios CH_{2} y CH_{3}, y un sitio de N-glicosilación en la posición
82.
Hay cinco tipos de regiones Fc de inmunoglobulina humana con diferente efecto y/o propiedades farmacocinéticas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. La IgG es la inmunoglobulina más abundante en suero. La IgG también tiene la vida media mas larga en suero que cualquiera de las inmunoglobulinas (23 días). A diferencia del resto de inmunoglobulinas, la IgG es recirculada eficazmente tras la unión a un receptor de Fc. Hay cuatro subclases de IgG: G1, G2, G3 y G4, cada una de las cuales tiene diferente efecto o funciones. G1, G2 y G3 pueden unirse a C1q y fijar complementos, mientras que G4 no. Aunque G3 puede unirse a C1q más eficazmente que G1, G1 es más eficaz en la mediación de la lisis celular dirigida a complementos. G2 fija complementos muy ineficazmente. El sitio de unión a C1q de IgG está localizado en la región del terminal carboxilo del dominio CH_{2}.
Todas las subclases de IgG son capaces de unirse a receptores de Fc (CD16, CD32, CD64), siendo G1 y G3 más eficaces que G2 y G4. La región de unión a receptores de Fc de la IgG está formada por residuos localizados tanto en la región bisagra como en las regiones terminales carboxilo del dominio CH_{2}.
IgA puede existir tanto en forma monomérica como dimérica unida por una cadena J. IgA es la segunda Ig más abundante en suero, pero tiene una vida media de sólo 6 días. IgA tiene tres efectos o funciones. Se une a un receptor específico de IgA sobre macrófagos y eosinófilos, lo que conduce a la fagocitosis y a la desgranulación, respectivamente. También puede fijar complementos mediante una ruta alternativa desconocida.
IgM se expresa bien como pentámero o como un hexámero, ambos de los cuales se mantienen unidos por una cadena J. IgM tiene una vida media en suero de 5 días. Se une débilmente a C1q por un sitio de unión localizado en su dominio CH_{3}. IgD tiene una vida media en suero de 3 días. No está claro cuál es el efecto o cuáles son las funciones atribuibles a esta Ig. IgE es una Ig monomérica y tiene una vida media en suero de 2,5 días. IgE se une a dos receptores de Fc que conducen a la desgranulación y resulta en la liberación de agentes proinflamatorios.
Dependiendo del efecto in vivo deseado, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden contener cualquiera de los isótopos descritos anteriormente o pueden contener regiones Fc mutadas en las que las funciones de unión a complementos y/o a receptores de Fc hayan sido alteradas. De este modo, las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención pueden contener la porción Fc entera de una inmunoglobulina, fragmentos de la porción Fc de una inmunoglobulina o análogos de los mismos fusionados a un compuesto de GLP-1.
Las proteínas de fusión de la presente invención pueden estar constituidas por proteínas de una sola cadena o por polipéptidos de múltiples cadenas. Se pueden producir dos o más proteínas de fusión Fc tal que interactúen a través de enlaces tipo disulfuro que se forman de manera natural entre las regiones Fc. Estos multímeros pueden ser homogéneos con respecto al compuesto de GLP-1 o pueden contener diferentes compuestos de GLP-1 fusionados al terminal N de la porción Fc de la proteína de fusión.
Independientemente de la estructura final de la proteína de fusión, la región Fc o de tipo Fc debe servir para prolongar la vida media en plasma in vivo del compuesto de GLP-1 fusionado por el terminal N. Además, el compuesto de GLP-1 fusionado debe conservar cierta actividad biológica. Se puede demostrar un aumento de la vida media usando el procedimiento descrito en el ejemplo 7, en el que se compara la vida media de la proteína de fusión con la vida media del compuesto de GLP-1 solo. Es posible determinar la actividad biológica mediante procedimientos in vitro e in vivo conocidos en la técnica. En los ejemplos 6, 8 y 9 se describen análisis biológicos representativos.
Como la región Fc de la IgG producida mediante proteólisis tiene la misma vida media in vivo que la molécula de IgG intacta, y los fragmentos Fab son degradados rápidamente, se cree que la secuencia relevante para prolongar la vida media reside en los dominios CH_{2} y/o CH_{3}. Además, se ha demostrado en la bibliografía que las velocidades catabólicas de las variantes de IgG que no se unen al receptor de Fc de alta afinidad ni a C1q son indistinguibles a partir de la velocidad de aclaramiento del anticuerpo de tipo natural parental, lo que indica que el sitio catabólico es distinto de los sitios implicados en la unión al receptor de Fc y a C1q. [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29: 221]. Los estudios de mutagénesis de sitio dirigida que usan una región Fc de IgG1 murina sugirieron que el sitio de la región Fc de IgG1 que controla la velocidad catabólica está localizado en la interfase de los dominios
CH_{2}-CH_{3}.
En base a estos estudios, es posible modificar las regiones Fc en el sitio catabólico para optimizar la vida media de las proteínas de fusión. Es preferible que la región Fc usada para las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención sea derivada de una IgG1 o de una región Fc de IgG4. En todavía más preferible que la región Fc sea IgG4 o esté derivada de IgG4. Preferiblemente, la región Fc de IgG contiene tanto la región CH_{2} como la región CH_{3}, incluyendo la región bisagra.
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención engloban proteínas que tienen sustituciones conservadoras de aminoácidos en el compuesto de GLP-1 y/o en la porción Fc de la proteína de fusión. Una "sustitución conservadora" es el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene la misma carga electrónica neta, y aproximadamente el mismo tamaño y la misma forma. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o alifáticas sustituidas de aminoácidos tienen aproximadamente el mismo tamaño cuando el número total de carbonos y de heteroátomos de sus cadenas laterales difiere en no más de aproximadamente cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de ramificaciones de sus cadenas laterales difiere en no más de uno. Se considera que los aminoácidos con grupos fenilo o fenilo sustituidos en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el mismo tamaño y la misma forma. Excepto que se dispongan específicamente de otra manera en la presente memoria, las sustituciones conservadoras se hacen preferiblemente con aminoácidos naturales.
Sin embargo, el término "aminoácido" se usa en la presente memoria en su sentido más amplio e incluye aminoácidos naturales, así como aminoácidos no naturales, incluyendo análogos y derivados de aminoácido. Estos últimos incluyen moléculas que contienen un resto de aminoácido. Cualquier experto en la técnica entenderá, en vista de esta amplia definición, que la referencia que se hace en la presente memoria a un aminoácido incluye, por ejemplo, L-aminoácidos proteogénicos naturales; D-aminoácidos; aminoácidos químicamente modificados tales como análogos y derivados de aminoácido; aminoácidos no proteogénicos naturales tales como norleucina, \beta-alanina, ornitina, GABA, etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica por ser características de los aminoácidos. Como se usa en la presente memoria, el término "proteogénico" indica que el aminoácido puede ser incorporado en un péptido, polipéptido o proteína de una célula a través de una ruta metabólica.
La incorporación de aminoácidos no naturales, incluyendo aminoácidos no nativos sintéticos, aminoácidos sustituidos, o uno o más D-aminoácidos en las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención puede ser ventajosa en un número de diferentes modos. Los péptidos que contienen D-aminoácidos, etc., presentan una mayor estabilidad in vitro o in vivo en comparación con sus homólogos que contienen L-aminoácidos. De este modo, la construcción de péptidos, etc., incorporando D-aminoácidos puede ser particularmente útil cuando se desee o se necesite una mayor estabilidad intracelular. Más específicamente, los D-péptidos etc., son resistentes a las peptidasas y a las proteasas endógenas, proporcionando así una mejor biodisponibilidad de la molécula y tiempos de vida prolongados in vivo cuando se desean tales propiedades. Además, los D-péptidos, etc., no pueden ser procesados eficazmente para una presentación restringida por el complejo de histocompatibilidad de clase II a células auxiliares T, y son por tanto menos propensos a inducir respuestas inmunes humorales en todo el organismo.
Además de los análisis de estructura/función de los diversos polipéptidos englobados por la presente invención, son numerosos los factores que pueden ser considerados al seleccionar los aminoácidos para una sustitución. Un factor que puede ser considerado en la elaboración de tales cambios es el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en conferir función biológica interactiva a una proteína ha sido tratada por Kyte y Doolittle (1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132). Está aceptado que el carácter hidropático relativo de los aminoácidos contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante. Esto, a su vez, afecta a la interacción de la proteína con moléculas tales como enzimas, sustratos, receptores, ligandos, ADN, anticuerpos, antígenos, etc. En base a su hidrofobicidad y a sus características de carga, se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático según se presenta a continuación: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato/glutamina/aspartato/asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina
(-4,5).
Como se sabe en la técnica, se pueden sustituir ciertos aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático similar y producir un péptido resultante, etc., que tenga una actividad biológica similar o incluso mejor. Al realizar tales cambios, es preferible que los aminoácidos que tengan índices hidropáticos de \pm2 sean sustituidos por otro. Las sustituciones más preferidas son aquéllas en las que los aminoácidos tienen índices hidropáticos de \pm1. Las sustituciones más preferidas son aquéllas en las que los aminoácidos tengan índices hidropáticos de \pm0,5.
Los aminoácidos similares también pueden ser sustituidos en base a la hidrofilidad. La patente estadounidense n.º: 4.554.101 revela que la mayor hidrofilidad media local de una proteína, gobernada por la hidrofilidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilidad a los aminoácidos: arginina/lisina (+3,0); aspartato/glutamato (+3,0\pm1); serina (+0,3); asparagina/glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,51\pm1); alanina/histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina/isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). De este modo, se puede sustituir un aminoácido de un péptido, polipéptido o proteína por otro aminoácido que tenga un índice de hidrofilidad similar y seguir produciendo un péptido resultante, etc., que tenga una actividad biológica similar, i.e., que sigue conservando una función biológica correcta. Al realizar tales cambios, es preferible que los aminoácidos que tengan índices hidropáticos de \pm2 sean sustituidos por otro, siendo más preferidos los de \pm1 y los más preferidos los de \pm0,5.
Como se destaca anteriormente, las sustituciones de aminoácidos de las proteínas de fusión de la presente invención pueden estar basadas en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño, etc. Además, las sustituciones se pueden hacer en base a la tendencia a una estructura secundaria. Por ejemplo, se puede reemplazar un aminoácido helicoidal por un aminoácido que conserve la estructura helicoidal. Es posible seleccionar ejemplos de sustituciones que tengan varias de las características anteriores en consideración con el fin de producir cambios de aminoácidos conservadores que den como resultado cambios silenciosos dentro de los presentes péptidos, etc., de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido natural. Los aminoácidos se pueden dividir en los cuatro siguientes grupos: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; y (4) aminoácidos no polares neutros.
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Procedimientos generales para elaborar las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención
Aunque las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se pueden elaborar mediante una variedad de diferentes procedimientos, se prefieren los procedimientos recombinantes. A efectos de la presente invención, según lo revelado y reivindicado en la presente memoria, se definen a continuación los siguientes términos y abreviaturas generales de Biología Molecular. Los términos y las abreviaturas usados en este documento tienen sus significados normales a no ser que se designe lo contrario. Por ejemplo, "ºC" se refiere a grados Celsius; "mmol" se refiere a milimol o milimoles; "mg" se refiere a miligramos; "\mug" se refiere a microgramos; "ml" se refiere a mililitros; y "\mul" se refiere a microlitros. Las abreviaturas de los aminoácidos se exponen en 37 C. F. R. \NAK 1.822 (b) (2) (1994).
"Par de bases" o "pb", como se usa en la presente memoria, se refiere a ADN o ARN. Las abreviaturas A, C, G y T corresponden a las formas 5'-monofosfato de los desoxirribonucleósidos (desoxi)adenosina, (desoxi)citidina, (desoxi)guanosina y timidina, respectivamente, cuando tienen lugar en moléculas de ADN. Las abreviaturas U, C, G y A corresponden a las formas 5'-monofosfato de los ribonucleósidos uridina, citidina, guanosina y adenosina, respectivamente, cuando tienen lugar en moléculas de ARN. En el ADN bicatenario, el par de bases puede referirse a una pareja de A con T o de C con G. En un ADN/ARN, el par de bases de heterodúplex puede referirse a una pareja de A con U o de C con G. (Véase la definición de "complementario", infra).
"Digestión" o "restricción" de ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que sólo actúa en ciertas secuencias del ADN ("endonucleasas específicas de secuencia"). Las diversas enzimas de restricción usadas en la presente memoria se encuentran comercialmente disponibles y sus condiciones de restricción, cofactores y otros requisitos se usaron tal y como es conocido por cualquier experto habitual en la técnica. Los tampones y las cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción concretas son especificados por el fabricante y pueden encontrarse fácilmente en la bibliografía.
"Ligación" se refiere al procedimiento de formación de enlaces de tipo fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios. A no ser que se proporcione de otro modo, la ligación se puede realizar usando tampones y condiciones conocidos con una ADN ligasa, tal como la ADN ligasa T4.
"Plásmido" se refiere a un elemento genético (habitualmente) auto-replicativo extracromosómico. Los plásmidos se designan generalmente por una "p" minúscula seguida por letras y/o números. Los plásmidos iniciales de la presente memoria bien se encuentran comercialmente disponibles, accesibles al público en una base no restringida o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles conforme a los procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y al experto habitual en la técnica le resultarán evidentes.
"Vector de clonación de ADN recombinante", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier agente replicante de manera autónoma, incluyendo, pero no limitándose a, plásmidos y fagos que comprenden una molécula de ADN a la que se puede añadir o se han añadido uno o más segmentos de ADN adicionales.
"Vector de expresión de ADN recombinante", como se usa en la presente, memoria se refiere a cualquier vector de clonación de ADN recombinante al que se haya incorporado un promotor para controlar la transcripción del ADN insertado.
"Transcripción" se refiere al procedimiento mediante el cual la información contenida en una secuencia de nucleótidos de ADN se transfiere a una secuencia de ARN complementaria.
"Transfección" se refiere a la absorción de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de si se expresa alguna secuencia codificante o no. El experto habitual en la técnica conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, la coprecipitación con fosfato de calcio, la transfección de liposomas y la electroporación. En general, se reconoce que una transfección se ha realizado satisfactoriamente cuando se produce cualquier indicación del funcionamiento de este vector dentro de la célula huésped.
"Transformación" se refiere a la introducción de ADN en un organismo tal que el ADN es replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante la integración cromosómica. Los procedimientos de transformación de huéspedes bacterianos y eucariotas son conocidos en la técnica, resumiéndose muchos de ellos, tales como la inyección nuclear, la fusión protoplástica o el tratamiento con calcio usando cloruro de calcio, en J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (1989). En general, cuando se introduce ADN en levadura, se usa el término transformación en contraposición con el término transfección.
"Traducción", como se usa en la presente memoria, se refiere al procedimiento mediante el cual se usa la información genética del ARN mensajero (ARNm) para especificar y dirigir la síntesis de una cadena polipeptídica.
"Vector" se refiere a un compuesto de ácido nucleico usado para la transfección y/o la transformación de células en secuencias de polinucleótidos que portan manipulaciones genéticas correspondientes a moléculas proteínicas apropiadas que, cuando se combina con secuencias control apropiadas, confiere propiedades específicas a la célula huésped por ser transfectada y/o transformada. Los plásmidos, los virus y los bacteriófagos son vectores adecuados. Los vectores artificiales se construyen cortando y uniendo moléculas de ADN de diferentes fuentes usando enzimas de restricción y ligasas. El término "vector", como se usa en la presente memoria, incluye vectores de clonación de ADN recombinante y vectores de expresión de ADN recombinante.
"Complementario" o "complementariedad", como se usa en la presente memoria, se refiere a pares de bases (purinas y pirimidinas) que se asocian a través de enlaces de hidrógeno en un ácido nucleico bicatenario. Son complementarios los siguientes pares de bases: guanina y citosina; adenina y timina; y adenina y uracilo.
"Hibridación", como se usa en la presente memoria, se refiere a un procedimiento en el que una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través del apareamiento de bases. Las condiciones empleadas en la hibridación de dos ácidos nucleicos complementarios no idénticos, pero muy similares, varían con el grado de complementariedad de las dos cadenas y la longitud de las mismas. Tales técnicas y condiciones son conocidas por los profesionales de este campo.
"Secuencia de aminoácidos aislada" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos, bien construida o sintetizada, que tenga una ubicación diferente a su ubicación natural.
"Compuesto de ADN aislado" se refiere a cualquier secuencia de ADN, bien construida o sintetizada, que tenga una ubicación diferente a su ubicación natural en el ADN genómico.
"Compuesto de ácido nucleico aislado" se refiere a cualquier secuencia de ADN o ARN, bien construida o sintetizada, que tenga una ubicación diferente a su ubicación natural.
"Cebador" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona como un sustrato iniciador del alargamiento enzimático o sintético.
"Promotor" se refiere a una secuencia de ADN que dirige la transcripción del ADN o el ARN.
"Sonda" se refiere a un compuesto de ácido nucleico o un fragmento del mismo que se hibrida con otro compuesto de ácido nucleico.
Las "condiciones restrictivas" de las reacciones de hibridación son fácilmente determinables por cualquier experto habitual en la técnica, y generalmente se trata de un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado y de la concentración de sales. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para aparearse apropiadamente, mientras que las sondas cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volverse a aparear cuando hay presentes cadenas complementarias en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más elevado es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, más elevada será la temperatura que se pueda usar. Como resultado, las temperaturas relativas más elevadas tenderían a hacer posibles reacciones con condiciones más restrictivas, mientras que las temperaturas más bajas, con condiciones menos restrictivas. Para más información sobre las condiciones restrictivas de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience Publishers, 1995.
"Las condiciones restrictivas" o "las condiciones muy restrictivas", según lo definido en la presente memoria, se pueden identificar por aquéllas que (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para lavar, por ejemplo, cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM/dodecil sulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM/citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a tratamiento con ultrasonidos (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC con lavados a 42ºC en 0.2 x SSC (cloruro de sodio 30 mM/citrato de sodio 3 mM) y formamida al 50% a 55ºC, siguiendo con un lavado en condiciones muy restrictivas que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente restrictivas" se pueden identificar según lo descrito por Sambrook et al. ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Nueva York: Cold Spring Harbor Press, (1989)], e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (p.ej., temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es la incubación durante una noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM a pH 7,5; 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguido por un lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la técnica sabe cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sus necesidades en virtud de factores tales como la longitud de sonda y similares.
"PCR" se refiere a la tan extendida reacción en cadena de la polimerasa que emplea una ADN polimerasa térmicamente estable.
"Secuencia líder" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede ser eliminada enzimática o químicamente para producir el polipéptido de interés deseado.
"La secuencia de señales de secreción" se refiere a una secuencia de aminoácidos generalmente presente en la región N-terminal de un polipéptido más largo que funciona para iniciar la asociación de ese polipéptido con los compartimentos de la membrana celular como el retículo endoplasmático y la secreción de ese polipéptido a través de la membrana plasmática.
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Construcción de ADN codificante de proteínas de fusión heterólogas de la presente invención
Las proteínas inmunoglobulinas se pueden obtener de una variedad de fuentes. Por ejemplo, estas proteínas se pueden obtener de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejido o células que expresen el ARNm de interés a un nivel detectable. Las genotecas se pueden rastrear con sondas diseñadas usando el ADN o la secuencia de proteínas publicados para la proteína concreta de interés. En Adams, et al. (1980) Biochemistry 19: 2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19: 2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 79: 7862-7862; Falkner, et al.(1982) Nature 298: 286-288; y Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256, se describen, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera o pesada de las inmunoglobulinas.
El rastreo de una genoteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada se puede realizar usando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Un procedimiento alternativo para aislar un gen codificante de una proteína inmunoglobulina consiste en usar una metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. Los cebadores PCR se pueden diseñar en base a las secuencias publicadas.
En general, las secuencias de tipo natural de longitud completa clonadas a partir de una determinada especie pueden servir como molde para crear análogos, fragmentos o derivados que conserven la capacidad de conferir una vida media en plasma más larga al compuesto de GLP-1 que forma parte de la proteína de fusión. Es preferible que la porción Fc de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención sea derivada de la secuencia humana nativa con el fin de reducir el riesgo de una posible inmunogenicidad de la proteína de fusión en seres humanos.
En concreto, es preferible que la porción de inmunoglobulina de una proteína de fusión englobada por la presente invención sólo contenga un fragmento Fc de la inmunoglobulina. Dependiendo de si se desea un determinado efecto o determinadas funciones, o de las características deseadas de la proteína de fusión, un fragmento Fc puede contener la región bisagra junto con los dominios CH_{2} y CH_{3} o alguna combinación de los mismos. Estos fragmentos Fc se pueden generar usando técnicas PCR con cebadores diseñados para hibridarse a secuencias correspondientes a los extremos deseados del fragmento. También se pueden diseñar cebadores PCR para crear sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación en vectores de expresión.
Se puede elaborar ADN codificante de los compuestos de GLP-1 de la presente invención mediante una variedad de diferentes procedimientos incluyendo procedimientos de clonación como aquéllos descritos anteriormente, así como ADN sintetizado químicamente. La síntesis química puede resultar atractiva dada la corta longitud del péptido codificado. La secuencia de aminoácidos para GLP-1 ha sido publicada, así como la secuencia del gen preproglucagón. [Lopez, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 80: 5485-5489; Bell, et al. (1983) Nature, 302: 716-718; Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115: 2176-2181; Ghiglione, M., et al. 91984) Diabetologia 27: 599-600]. De este modo, se pueden diseñar cebadores para utilizar la PCR en los compuestos de GLP-1 nativos y en los fragmentos de los mismos.
Entonces se puede construir el gen codificante de una proteína de fusión ligando ADN codificante de un compuesto de GLP-1 en marco con ADN codificante de una proteína Fc. El gen codificante del compuesto de GLP-1 y el gen codificante de la proteína Fc también pueden unirse en marco mediante ADN codificante de un péptido ligador.
Se puede optimizar la función y la estabilidad in vivo de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención añadiendo pequeños ligadores peptídicos para evitar las posibles interacciones no deseadas entre dominios. Aunque estos ligadores pueden ser potencialmente de cualquier longitud y estar constituidos por cualquier combinación de aminoácidos, es preferible que la longitud no sea mayor de lo necesario para evitar las interacciones no deseadas entre dominios y/o optimizar la actividad biológica y/o la estabilidad. Generalmente, los ligadores no deberían contener aminoácidos con cadenas laterales extremadamente voluminosas ni aminoácidos propensos a introducir una estructura secundaria significativa. Es preferible que el ligador sea rico en serina-glicina y que tenga una longitud de menos de 30 aminoácidos. Es más preferible que el ligador tenga una longitud de no más de 20 aminoácidos. Es incluso más preferible que el ligador tenga una longitud de no más de 15 aminoácidos. Un ligador preferido contiene repeticiones de la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Es preferible que haya entre 2 y 6 repeticiones de esta secuencia. Es incluso más preferible que haya entre 3 y 4 repeticiones de esta secuencia.
El ADN codificante del GLP-1 de tipo natural, y los polipéptidos de Fc y los fragmentos de los mismos puede ser mutado bien antes de la ligación o en el contexto de un ADNc codificante de una proteína de fusión entera. Hay una variedad de técnicas de mutagénesis conocidas en la materia. Por ejemplo, el procedimiento de PCR mutagénica utiliza la extensión por solapamiento de cadenas para crear mutaciones de bases específicas a efectos de cambiar la secuencia de aminoácidos específica de la proteína correspondiente. Esta mutagénesis de PCR requiere el uso de cuatro cebadores, dos en sentido directo (cebadores A y C) y dos en sentido inverso (cebadores B y D). Los genes mutados se amplifican desde el molde de tipo natural en dos etapas diferentes. La primera reacción amplifica el gen en mitades realizando una reacción de A a B y una reacción separada de C a D en la que los cebadores B y C son dirigidos a la zona del gen por ser mutado. Cuando se alinean estos cebadores con la zona diana, contienen apareamientos erróneos para las bases que se dirigen a ser cambiadas. Una vez completadas las reacciones de A a B y de C a D, se aíslan los productos de reacción y se mezclan para su uso como el molde para la reacción de A a D. Entonces, la reacción genera el producto mutado completo.
Una vez que se produce un gen codificante de una proteína de fusión entera, se puede clonar en un vector de expresión apropiado. En el ejemplo 1, se describen las estrategias específicas que se pueden emplear para elaborar las proteínas de fusión GLP-1 de la presente invención.
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Procedimientos generales para expresar recombinantemente las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención
Se transfectan o transforman células huésped con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente memoria para la producción de proteínas de fusión heterólogas, y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según proceda para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como los medios, la temperatura, el pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la técnica sin la necesidad de una experimentación. En general, los principios, los protocolos y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares se pueden encontrar en "Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook, et al., supra. El experto habitual en la técnica conoce procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y la electroporación. En la patente estadounidense n.º: 4.399.216, se han descrito los aspectos generales de las transformaciones de los sistemas huésped de células de mamífero. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo comúnmente según el procedimiento de van Solingen et al., J Bact. 130 (2): 946-7 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76 (8): 3829-33 (1979). Sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, p.ej., polibreno o poliomitina. Para diversas técnicas de transformación de células mamíferas, véase Keown, et al., "Methods in Enzymology" 185: 527-37 (1990) y Mansour, et al., Nature 336 (6197): 348-52
(1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ácido nucleico (p.ej., ADN) en los vectores de la presente memoria incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, enterobacterias tales como E. coli. Hay diversas cepas de E. coli accesibles al público, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 3 1.446); 776 de E. coli X1 (ATCC 3 1.537); la cepa W3 110(ATCC 27.325) y K5 772 de E. coli (ATCC 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen géneros de la familia Enterobactericeae tales como Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebisella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratia marcescans y Shigeila, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. lichentformis (p.ej., B. licheniformis 4 1 P revelado en el documento DD266.710, publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos y no restrictivos. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferido, porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para que realice una mutación genética en los genes codificantes de proteínas endógenas para el huésped, incluyendo como ejemplos de tales huéspedes la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo ronA completo; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo ton4 ptr3 completo; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo tonA, ptr3 phoA E15 completo (argF-lac) 169 degP ompT/can'; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutación por eliminación de degP no resistente a la canamicina; y una cepa de E. coli que tiene la proteasa periplásmica mutante revelada en la patente estadounidense n.º: 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vivo, p.ej., PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos
nucleicos.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores de proteínas de fusión. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1995]; huéspedes Muyveromyces [patente estadounidense n.º: 4.943.529; Fleer, et al., BiolTechnology 9 (10): 968-75 (1991)] tales como, p.ej., K lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2): 737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K wickeramii (ATCC 24.178), K waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg et al., BiolTechnology 8 (2): 135-9 (1990)]; K. thermotoierans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070) [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28 (4): 265-78 (1988)]; Candid; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa [Case, et al., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 76 (10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentulis (documento EP 394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tal como, p.ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112 (1): 284-9 (1983)]; Tilburn, et al., Gene 26 (2-3): 205-21 (1983); Yelton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81 (5): 1470-4 (1984)] y A. niger [Kelly e Hynes, EMBO J. 4 (2): 475-9 (1985)]. Las levaduras metilotrópicas se seleccionan del género constituido por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsia y Rhodotoruia. En C. Antony, "The Biochemistry of Metilotrophs" 269 (1982), se puede encontrar una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levadura.
Las células huésped adecuadas para la expresión de las proteínas de fusión de la presente invención están derivadas de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sp., Spodoptera high5, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas de células huésped útiles de mamífero incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónico humano [células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensiones, Graham, et al., J. Gen Tirol., 36 (1): 59-74 (1977)]; células de ovario de hámster chino/-DHFR [CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77 (7): 4216-20 (1980)]; células de Sertoli de ratón [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1): 243-52 (1980)]; células de pulmón humano (W138. ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Se considera que la selección de la célula huésped apropiada es competencia del experto en la técnica.
Las proteínas de fusión de la presente invención se pueden producir recombinantemente directamente o como una proteína que tenga una secuencia señal u otras secuencias adicionales que creen un sitio de escisión específico en el terminal N de la proteína de fusión madura. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN codificante de la proteína de fusión que esté insertado en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de la alcalino-fosfatasa, penicilina, lpp o enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levaduras la secuencia señal puede ser, p.ej., la invertasa de levadura líder, el factor alfa líder (incluyendo los factores cc líderes de Saccharomyces y Kluyveromyces, estando el último descrito en la patente estadounidense n.º: 5.010.182) o la fosfatasa ácida líder, la gucoamilasa de C. albicans líder (EP 362.179) o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, se pueden usar secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como secretores víricos
líderes.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2u es adecuado para la levadura y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero.
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Los vectores de expresión y de clonación contendrán comúnmente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección comunes codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias autotróficas de complemento o (c) suministro de nutrientes fundamentales no disponibles en los medios complejos, p. ej., el gen codificante de D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para la absorción de ácido nucleico codificante de proteínas de fusión, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo natural es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada según lo descrito [Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77 (7): 4216-20 (1980)]. Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb, et al., Nature 282 (5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al., Gene 7(2): 141-52 (1979); Tschumper, et al., Gene 10(2): 157-66 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.º 44076 o PEPC1 [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)].
Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico codificante de proteína de fusión para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de posibles células huésped son conocidos. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de \beta-lactamasa y lactosa [Chang, et al., Nature 275 (5681): 617-24 (1978); Goeddel, et al., Nature 281 (5732): 544-8 (1979)], alcalino fosfatasa, un sistema promotor de triptófano (up) [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8 (18): 4057-74 (1980); documento EP 36,776 publicado el 30 de septiembre de 1981], y promotores híbridos tales como el promotor tat [deBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80 (1): 21-5 (1983)]. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente al ADN codificante de la proteína de fusión.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255 (24): 12073-80 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17 (23): 4900-7 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C y fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. En el documento EP 73.657, se describen más detalladamente los vectores y los promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras. La transcripción de ARNm codificante de la proteína de fusión procedente de vectores de células huésped de mamífero se puede controlar, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus 40 del simio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulinas, y de promotores de choque térmico, siempre y cuando tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
Se puede aumentar la transcripción de un polinucleótido codificante de una proteína de fusión mediante eucariotas superiores insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar la transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-ketoproteína e insulina). Sin embargo, lo común es usar un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el último lado del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma sobre el último lado del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Se puede cortar el potenciador y empalmarlo en el vector en la posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante de la proteína de fusión, pero se localiza preferiblemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongos, insecto, planta, animal, ser humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias se encuentran comúnmente disponibles desde las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm codificante de la proteína de fusión.
Se pueden recuperar diversas formas de una proteína de fusión de un medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Si está unido a la membrana, puede ser liberado de ellos usando una solución detergente adecuada (p.ej., Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de una proteína de fusión pueden ser alteradas mediante diversos procedimientos físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, tratamiento de ultrasonidos, alteración mecánica o con agentes de lisado celular.
Purificación de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención
Una vez expresadas las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención en la célula huésped apropiada, se pueden aislar y purificar los análogos. Los siguientes procedimientos son ejemplos de los procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento sobre carboximetilcelulosa; filtración sobre gel tal como Sephadex G-75; resina de intercambio aniónico tal como DEAE o Mno-Q; intercambio catiónico tal como CM o Mono-S; proteína A sefarosa para eliminar los contaminantes tales como IgG; columnas quelantes de metales para unir formas del polipéptido marcadas con epítopos; CLAR en fase inversa; cromatoenfocamiento; gel de sílice; precipitación en etanol; y precipitación en sulfato de amonio.
Se pueden emplear diversos procedimientos de purificación de proteínas, y tales procedimientos son conocidos en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en Deutscher, "Methods in Enzymology" 182: 83-9 (1990) y Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", Springer-Verlag, NY (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n) de la naturaleza del procedimiento de producción usado y de la proteína de fusión producida en particular. Por ejemplo, se pueden purificar eficazmente proteínas de fusión que comprendan fragmentos Fc usando una matriz de afinidad con proteína A o proteína G. Se pueden usar tampones de pH bajo o alto pare eluir la proteína de fusión de la matriz de afinidad. Las condiciones de elución suaves ayudarán en la prevención de la desnaturalización irreversible de la proteína de fusión. También se pueden usar tampones que contienen imidazol. El ejemplo 3 describe algunos protocolos de purificación satisfactorios para las proteínas de fusión de la presente invención.
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Caracterización de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención
Existen numerosos procedimientos para caracterizar las proteínas de fusión de la presente invención. Algunos de estos procedimientos incluyen: la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS junto con procedimientos de tinción de proteínas o inmunotransferencia usando anticuerpos anti-IgG o anti-HSA. Otros procedimientos incluyen la espectrometría de masas de desorción/ionización en matriz inducida por láser (MALDI-SM), cromatografía en fase líquida/espectrometría de masas, isoelectroenfoque, intercambio aniónico analítico, cromatoenfoque y dicroísmo circular por nombrar unos cuantos. Se caracterizó un número representativo de proteínas de fusión heterólogas usando electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS junto con una inmunotransferencia, así como espectrometría de masas (véanse los ejemplos 4 y 5 y las figuras 2 y 3).
Por ejemplo, la tabla 3 (véase el ejemplo 5) ilustra la masa molecular calculada para un número representativo de proteínas de fusión, así como la masa determinada mediante espectrometría de masas. Además, las figuras 2 y 3 ilustran los pesos moleculares de un número representativo de proteínas de fusión determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Todas las proteínas de fusión heterólogas analizadas fueron expresadas y secretadas transitoriamente. Además, se escindió la secuencia señal de Igk para producir proteínas con el terminal N
correcto.
Además, la tabla 3 ilustra que en algunos casos la masa determinada por espectrometría de masas es mayor que la esperada. Esto es el resultado de la glicosilación de la porción Fc y de la extensión del terminal C. La digestión enzimática de las proteínas de fusión seguida por una CLAR en fase inversa y una espectrometría de masas pueden identificar las fracciones peptídicas que contienen restos de azúcar. Estas fracciones luego pueden ser secuenciadas con aminoácidos N-terminales para identificar el posible sitio de glicosilación. Por ejemplo, la caracterización de exendina-4-Fc (SEQ ID NO: 29) muestra que la serina de la posición 39 y la treonina de la posición 50 están glicosiladas enlazadas a O y la asparagina de la posición 122 está glicosilada enlazada a N.
También se analizó un número representativo de proteínas de fusión GLP-1 en cuanto a su actividad. Existen numerosos procedimientos para detectar la actividad de GLP-1 in vitro e in vivo (véanse los ejemplos 6, 7, 8 y 9). La tabla 4 (ejemplo 6) ilustra la actividad del receptor de GLP-1 asociado con varias fusiones de GLP-1. Los números son relativos a la actividad asociada con Val^{8}-GLP-1(7-37)OH. Todas las proteínas de fusión analizadas tenían actividad de receptor de GLP-1. Un nivel bajo de actividad in vitro no es necesariamente indicativo de un efecto débil in vivo. Debido al sustancial aumento de la vida media de estas proteínas de fusión, una actividad in vitro débil no implica generalmente una actividad in vivo débil. La figura 6 y el ejemplo 7 ilustran la vida media prolongada asociada con las proteínas de fusión de la presente invención. Por ejemplo, Val^{8}-GLP-1-Fc mostró una vida media de aproximadamente 45 horas en monos, Val^{8}-GLP-1-HSA mostró una vida media de aproximadamente 87 horas en monos, Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1 mostró una vida media tras la administración de IV de aproximadamente 55 horas en perros y Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1 mostró una vida media tras la administración s.c. de aproximadamente 38 horas en perros.
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Composiciones de la invención
La estabilidad física también es una característica esencial de las formulaciones de proteínas terapéuticas. Los compuestos GLP-1 han resultado especialmente difíciles de fabricar y formular debido a los cambios estructurales que tienen lugar durante su procesamiento. Por ejemplo, algunos compuestos de GLP-1 tienen una tendencia general a agregarse. Además, se ha observado que algunos compuestos de GLP-1 pasan de una forma soluble y de hélice \alpha activa a una forma insoluble y de lámina \beta potencialmente inactiva. La fusión de compuestos de GLP-1 a proteínas de gran tamaño tales como la región Fc de una IgG no sólo actúa para aumentar la vida media del compuesto de GLP-1, sino que además contribuye a la estabilidad física y configuracional del compuesto de GLP-1.
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención se pueden formular con uno o más excipientes. Es posible combinar las proteínas de fusión activas de la presente invención con un tampón farmacéuticamente aceptable, y ajustar el pH para proporcionar una estabilidad aceptable y un pH aceptable para la administración tal como una administración parenteral.
Opcionalmente, se pueden añadir uno o más agente antimicrobianos farmacéuticamente aceptables. El meta-cresol y el fenol son agentes microbianos farmacéuticamente aceptables preferidos. Se pueden añadir una o más sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la fuerza iónica o la tonicidad. Se pueden añadir uno o más excipientes para ajustar más la isotonicidad de la formulación. La glicerina es un ejemplo de excipiente ajustador de la isotonicidad. "farmacéuticamente aceptable" significa adecuado para la administración a un ser humano o a otro animal y, por tanto, que no contiene elementos tóxicos o contaminantes no deseados ni interfiere en la actividad de los compuestos activos presentes.
Se puede usar una forma de una sal farmacéuticamente aceptable de las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención en la presente invención. Los ácidos comúnmente empleados para formar las sales de adición ácida son ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, y similares, y los ácidos orgánicos tales como ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético y similares. Las sales de adición ácida preferidas son aquéllas formadas con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico y ácido bromhídrico.
Las sales de adición básica incluyen aquéllas derivadas de bases inorgánicas, tales como hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos o de amonio, carbonatos, bicarbonatos y similares. Tales bases útiles en la preparación de sales de esta invención incluyen por tanto hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de potasio y similares.
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Administración de las composiciones
La administración se puede realizar por cualquier vía conocida que le resulte eficaz al profesional habitual en la técnica. La administración periférica parenteral es uno de tales procedimientos. La administración parenteral se encuentra ampliamente descrita en la bibliografía médica como la inyección de una forma farmacéutica en el cuerpo mediante una jeringa estéril o algún otro dispositivo mecánico tal como una bomba de infusión. Las vías parenterales periféricas pueden incluir las vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.
Las proteínas de fusión heterólogas de la presente invención también se pueden adaptar a la administración mediante vía oral, rectal, nasal o respiratoria inferior, que son vías no parenterales. De estas vías no parenterales, se prefieren la vía respiratoria inferior y la vía oral.
Las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar para tratar una amplia variedad de enfermedades y condiciones. Las proteínas de fusión de la presente invención ejercen principalmente sus efectos biológicos actuando en un receptor denominado "receptor de GLP-1". Los sujetos con enfermedades y/o condiciones que responden favorablemente a la estimulación con receptor de GLP-1 o a la administración de compuestos de GLP-1 pueden ser por tanto tratados con las proteínas de fusión GLP-1 de la presente invención. Se dice que estos sujetos "están en necesidad del tratamiento con compuestos de GLP-1" o "en necesidad de la estimulación con receptores de GLP-1". Se incluyen sujetos con diabetes no dependiente de la insulina, diabetes dependiente de la insulina, derrame cerebral (véase el documento WO 00/16797), infarto de miocardio (véase el documento WO 98/08531), obesidad (véase el documento WO 98/19698), cambios catabólicos tras una cirugía (véase la patente estadounidense n.º:6.006.753), dispepsia funcional y síndrome del intestino irritable (véase el documento WO 99/64060). También se incluyen los sujetos que requieren un tratamiento profiláctico con un compuesto de GLP-1, p.ej., sujetos con riesgo de desarrollar diabetes no dependiente de la insulina (véase el documento WO 00/07617). Los sujetos con problemas de tolerancia a la glucosa o con problemas de la glucosa en ayunas, los sujetos cuyo peso corporal es de aproximadamente un 25% superior al peso corporal normal correspondiente a la altura y la constitución corporal del sujeto, los sujetos con una pancreatectomía parcial, los sujetos que tienen uno o más padres con diabetes no dependiente de la insulina, los sujetos que han tenido diabetes gestacional y los sujetos que han padecido pancreatitis aguda o crónica están en riesgo de desarrollar diabetes no dependiente de la insulina.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto de GLP-1 es la cantidad que da como resultado un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado sin causar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto en necesidad de una estimulación con receptores de GLP-1. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de los siguientes efectos: 1) una mejoría del/de los síntoma(s) asociados con la enfermedad o la condición; 2) un retraso de la aparición de los síntomas asociados con la enfermedad o la condición; 3) un aumento de la longevidad en comparación con la ausencia del tratamiento; y 4) una mayor calidad de vida en comparación con la ausencia del tratamiento. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" de un compuesto de GLP-1 para el tratamiento de la diabetes es la cantidad que daría como resultado un mayor control de la concentración de glucosa en sangre del que habría en ausencia del tratamiento, dando así como resultado un retraso de la aparición de complicaciones diabéticas tales como retinopatía, neuropatía o enfermedad de riñón. Una "cantidad eficaz" de un compuesto de GLP-1 para la prevención de la diabetes es la cantidad que retardaría, en comparación con la ausencia del tratamiento, la aparición de niveles elevados de glucosa en sangre que requieren el tratamiento con fármacos anti-hipoglicémicos tales como sulfonilureas, tiazolidinodionas, insulina y/o
bisguanidinas.
La dosis de proteína de fusión eficaz para normalizar la glucosa en sangre de un paciente dependerá de un número de factores, entre los que se incluyen, sin limitación, el sexo, el peso, la edad del sujeto, la gravedad de la imposibilidad de regular la glucosa en sangre, la vía de administración y la biodisponibilidad, el perfil farmacocinético de la proteína de fusión, la potencia y la formulación.
La presente invención comprende compuestos de GLP-1 que tienen mejores propiedades bioquímicas y biofísicas en virtud de ser fusionados a una proteína Fc, un fragmento Fc o un análogo de Fc. Estas proteínas heterólogas se pueden expresar satifactoriamente en células huésped, conservar las actividades de señalización asociadas con la activación del receptor de GLP-1 y tener vidas medias prolongadas.
Los siguientes ejemplos se presentan para describir en mayor profundidad la presente invención. No se pretende que el ámbito de la presente invención sólo esté constituido por los siguientes ejemplos. Los expertos en la técnica reconocerán que los reactivos concretos, el equipo y los procedimientos descritos son meramente ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención de ningún modo.
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Ejemplo 1
Construcción de ADN codificante de proteínas de fusión heterólogas
Ejemplo 1a
Construcción de ADN codificante de de Val^{8}-GLP-1(7-37)-Fc
Se aisló una porción Fc de IgG1 humana de una genoteca de ADNc y que contenía la región bisagra completa y los dominios CH_{2} y CH_{3}. Se subclonó un fragmento que contenía 696 pares de bases de esta porción Fc de la IgG1 humana en los sitios NheI y Eco47III del vector de expresión mamífero pJB02 para crear pJB02/Fc (véase la figura 4). El ADN codificante de la secuencia de señales de secreción de lg\kappa fusionada a Val^{8}-GLP-1(7-37) fue generado mediante hibridación in vitro de cuatro oligonucleótidos solapantes y complementarios:
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La reacción de hibridación se llevó a cabo usando cantidades equivalentes de cada oligonucleótido (1 pm/\mul de concentración final para cada oligo). Se calentó la mezcla de oligonucleótidos durante 5 min a 100ºC en tampón de unión (Tris-HCl 50 mM; pH 7,5; MgCl_{2} 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 mM; 25 \mug/ml de albúmina de suero bovino) y luego se enfrió durante al menos 2 horas a 30ºC.
Se unió el producto de hibridación resultante durante 2 horas a temperatura ambiente o durante una noche a 16ºC a la estructura del vector pJB02/Fc que había sido digerido con NheI y Eco47III. Los productos de unión se usaron para transformar células azules XL-1 competentes (Stratagene). Se rastrearon los plásmidos recombinantes para detectar la presencia de insertos codificantes de péptidos mediante la digestión de clones con NcoI (codificando la secuencia Kozak y la primera Met del péptido señal) y se secuenciaron. El plásmido de expresión resultante usado para los ensayos de transfección fue denominado pJB02-V8-GLP-1-Fc (Figura 4).
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Ejemplo 1b
Construcción de ADN codificante de exendina-4-Fc
El plásmido pJB02/Fc fue preparado según lo descrito en el ejemplo 1a. El ADN codificante de la secuencia de señales de Igk fusionada con la exendina-4 fue generado mediante una hibridación in vitro de los siguientes oligonucleótidos solapantes y complementarios:
17
18
19
20
21
22
La reacción de hibridación se llevó a cabo según lo descrito en el ejemplo 1a. El producto hibridado fue enlazado al vector pJB02 que había sido digerido con NheI y Eco47III según lo descrito en el ejemplo 1a para crear pJB02-exendina-4-Fc.
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Ejemplo 1c
Construcción de ADN codificante de Val^{8}-GLP-1/C-Ex-Fc
El plásmido pJB02-Exendin-4-Fc se preparó según lo descrito en el ejemplo 1b. Se escindió el ADN codificante de exendina-4 del vector con AgeI y Eco47III. El ADN codificante de Val^{8}-GLP-1/C-Ex fue generado mediante hibridación in vitro de los siguientes oligonucleótidos solapantes y complementarios:
\vskip1.000000\baselineskip
23
24
25
26
La reacción de hibridación se llevó a cabo según lo descrito en el ejemplo 1a. Se unió el producto hibridado en lugar de Exendina-4 en el vector de expresión pJB02-Exendin-4-Fc para crear pJB02-Val^{8}-GLP-1/C-Ex-Fc.
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Ejemplo 1d
Construcción de ADN codificante de Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1-Fc
El plásmido pJB02-Exendin-4-Fc se preparó según lo descrito en el ejemplo 1b. Se escindió el ADN codificante de exendina-4 del vector con AgeI y Eco47III. El ADN codificante de Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1 fue generado mediante hibridación in vitro de los siguientes oligonucleótidos solapantes y complementarios:
27
28
29
30
La reacción de hibridación se llevó a cabo según lo descrito en el ejemplo 1a. Se unió el producto hibridado en lugar de Exendina-4 en el vector de expresión pJB02-Exendin-4-Fc para crear pJB02-Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1-Fc.
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Ejemplo 1e
Construcción de ADN codificante de Val^{8}-Glu^{22}GLP-1/C-Ex-Fc
El plásmido pJB02-Exendin-4-Fc se preparó según lo descrito en el ejemplo 1b. Se escindió el ADN codificante de exendina-4 del vector con AgeI y Eco47III. El ADN codificante de Val^{8}-Glu^{22}GLP-1/C-Ex fue generado mediante hibridación in vitro de los siguientes oligonucleótidos solapantes y complementarios:
31
32
33
34
La reacción de hibridación se llevó a cabo según lo descrito en el ejemplo 1a. Se unió el producto hibridado en lugar de Exendina-4 en el vector de expresión pJB02-Exendin-4-Fc para crear pJB02-Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1/C-Ex-Fc.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1f
Construcción de ADN codificante de Gly^{8}-GLP-1-Fc
El plásmido pJB02-Exendin-4-Fc se preparó según lo descrito en el ejemplo 1b. Se escindió el ADN codificante de exendina-4 del vector con AgeI y Eco47III. El ADN codificante de Gly^{8}-GLP-1 fue generado mediante hibridación in vitro de los siguientes oligonucleótidos solapantes y complementarios:
\vskip1.000000\baselineskip
35
36
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de hibridación se llevó a cabo según lo descrito en el ejemplo 1a. Se unió el producto hibridado en lugar de Exendina-4 en el vector de expresión pJB02-Exendin-4-Fc para crear pJB02-Gly^{8}-GLP-1-Fc.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Construcción de proteínas de fusión heterólogas
La expresión de las proteínas de fusión codificadas por los constructos de ADN del ejemplo 1 se llevó a cabo transfectando transitoriamente células HEK 293ANEB (tanto adherentes como en suspensión). Se contaron y se sembraron las células 24 horas antes de la transfección. La mezcla de transfección se preparó mezclando reactivo de transfección FuGene®6 (Roche Molecular Biochemicals, n.º de catálogo 1814443) con OptiMEM (Gibco/BRL) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min, tras lo que se añadió ADN y se incubó la mezcla durante 15 min más. Inmediatamente antes de la transfección, se añadió medio de crecimiento recién preparado a la placa. Las tablas 1 y 2 proporcionan más datos sobre la transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Reactivos usados en las transfecciones transitorias de células 293ANEB.
39 
\newpage
\global\parskip0.860000\baselineskip
TABLA 2 Composición de los medios
40
Para las transfecciones a pequeña escala (recipientes de 35 mm-10 mm), se aclararon las células con PBS y se cambiaron a medios de cosecha 24 horas después de la transfección, recogiéndose y reemplazándose los medios cada 24 horas durante varios días. En el caso de las transfecciones a gran escala (frascos rotativos de 700 cm^{2}), se aclararon los frascos rotativos con PBS 48 horas después de la transfección y se cambiaron a medios de cosecha. Los medios fueron recogidos y cambiados cada 24 horas durante al menos 10 días consecutivos. Rutinariamente, sólo se usaron 10 cosechas para la purificación posterior de las proteínas.
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Ejemplo 3
Purificación de proteínas de fusión heterólogas
Ejemplo 3a
Purificación de Val^{8}-GLP-1-Fc
Se filtraron aproximadamente 4,5 litros de medio acondicionado (nivel de expresión de proteínas de fusión de aproximadamente 20 \mug/ml) de las transfecciones a gran escala usando un sistema de filtros CUNO, y se concentraron hasta 250 ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial Pro Flux con una membrana de filtro de 10 K. La proteína Val^{8}-GLP-1-Fc fue capturada con una columna A de proteínas HiTrap de 5 ml en 1 x PBS, pH de 7,4 a una velocidad de flujo de 2 ml/min y se eluyó con ácido cítrico 50 mM, pH 3,3. Las fracciones (1 ml) se recogieron en tubos que contenían 4 ml de 1 x PBS y 100 \mul de Tris 1M, pH 8.
Se mezclaron las fracciones que contenían la proteína de fusión determinadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y CLAR en fase inversa sobre Zorbax C8, y se aplicaron a una columna Superdex 75 60/60 en 1 x PBS, pH 7,4 a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Se recogieron y se mezclaron las fracciones positivas (20 ml/tubo). Entonces se sometieron las fracciones mezcladas a una cromatografía en fase inversa C4 en agua y TFA al 0,1% a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se eluyó Val^{8}-GLP-1-Fc usando un gradiente de B al 5% (TFA al 0,1% en acetonitrilo) hasta B al 100% en 70 min. Se recogieron las fracciones de eluyente (3 ml/tubo). Se retiró el acetonitrilo mediante secado al vacío y se añadió 1 ml de H_{2}O. Se sometió a diálisis la mezcla purificada (aproximadamente 32 ml) dos veces frente a 4 litros de 1 x PBS, pH 7,4.
Entonces se filtró la muestra sometida a diálisis usando una unidad de filtración de 0,22 um de MILLEX-GV, y se determinó la concentración usando una absorción a 280 nm.
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Ejemplo 3b
Purificación de Exendin-4-Fc
Se filtraron aproximadamente 4 litros de medio acondicionado (nivel de expresión de proteínas de fusión de aproximadamente 8 \mug/ml) usando un sistema de filtros CUNO, y se concentraron hasta 250 ml usando un sistema de filtración de flujo tangencial Pro Flux con una membrana de filtro de 30 K.
La proteína exendin-4-Fc fue capturada con una columna A de proteínas HiTrap de 5 ml en 1 x PBS, pH 7,4 a una velocidad de flujo de 2 ml/min y se eluyó con ácido cítrico 50 mM, pH 3,3. Las fracciones que contenían la proteína de fusión fueron mezcladas, filtradas y sometidas a diálisis frente a 4 litros de 1 x PBS durante una noche. Se aplicó la mezcla sometida a diálisis a una columna Superdex 75 60/60 en 1 x PBS, pH 7,4; NaCl 0,5M, a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Las fracciones (20 ml/tubo) que contenían la proteína de fusión fueron recogidas, mezcladas y concentradas hasta aproximadamente 1 mg/ml. Entonces se filtraron las muestras concentradas usando una unidad de filtración de 0,22 um de MILLEX-GV.
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Ejemplo 4
Caracterización de proteínas de fusión mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
Se usó una electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS seguida por una inmunotransferencia para analizar tanto la proteína de fusión purificada como el medio acondicionado de células transfectadas con diversos vectores de expresión de proteínas de fusión. La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS fue realizada en un sistema Novex Powerease 500 usando geles Precast de tris-glicina al 16% de Novex (EC6498), tampón de ejecución (10 x LC2675) y tampón de muestra (L2676). Se redujeron las muestras con DTT 50 mM y se calentaron durante 3-5 min a 95ºC antes de la carga.
Tras la realización de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, se usaron gel, agua y tampón de transferencia (1 x Seprabuff de tris-glicina (Owl Scientific n.º de cat. ER26-S) con metanol al 20%) para aclarar el SDS de los geles. Se usó un aparato de transferencia de Novex con PVDF (BioRad, n.º de cat. 162-0174) y membranas de nitrocelulosa (BioRad, n.º de cat. 1703965 ó 1703932). La transferencia se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 90 min a 30-35 V. Se bloquearon las membranas en 1 x PBS con Tween-20 al 0,1% (Sigma, n.º de cat. P-7949) y leche al 5% (BioRad, n.º de cat. 170-6404) durante 1-12 horas a 4ºC. Se diluyen anticuerpos en 1 x PBS + leche al 5% y se incuban las transferencias en estas soluciones durante 1-2 h a 4ºC. Entre las incubaciones, se lavan las transferencias cuatro veces durante 5 min cada una con 1 x PBS y Tween-20 al 0,2% a temperatura ambiente. El PBS se elaboró bien a partir de GIBCO 10 X PBS (n.º de cat. 70011) para proporcionar una composición final de fosfato de potasio monobásico 1 mM, fosfato de sodio dibásico 3 mM, cloruro de sodio 153 mM, pH 7,4 o bolsas de PBS de Sigma (n.º de cat. 1000-3) para proporcionar NaCl 120 mM, KCl 2,7 mM y fosfato 10 mM, pH 7,4 a 25ºC.
Los anticuerpos primarios eran bien anticuerpos policlonales anti-IgG1 de cabra o anti-HSA de conejo. El anticuerpo secundario era bien HRP de anti-IgG de cabra o HRP de anti-IgG de conejo. El anticuerpo secundario fue diluido 1:5000. Se usó un sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech, n.º de cat. RN2108 y n.º de cat. RPN1674H) para desarrollar las transferencias.
La figura 2A compara la proteína Fc purificada con el medio acondicionado de células transfectadas de pJB02-Val^{8}-GLP-1-Fc y pJB02-exendina-4-Fc. La disminución en la movilidad coincide con el aumento de tamaño debido a la porción de GLP-1 de la proteína de fusión.
La figura 4 identifica preparaciones de proteínas de fusión purificadas.
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Ejemplo 5
Caracterización de proteínas de fusión usando espectrometría de masas
Todos los experimentos se realizaron en un espectrómetro de masas TofSpec-2E de Micromass equipado con electrónica de enfoque retardado, un reflectrón (usado en el análisis del intervalo peptídico de 0-8000 Da), un detector lineal (usado durante el análisis de señales de masa elevada/buenas) y un detector de post-aceleración (o P.A.D., usado para el análisis de señales de masa elevada/extremadamente bajas). La longitud de la trayectoria eficaz del instrumento en el modo lineal es de 1,2 metros, en el modo Reflectrón es de 2,3 metros. Se conectan dos detectores duales de placa de microcanal para una detección del modo lineal y del modo reflectrón. El láser usado es el láser de nitrógeno de Laser Science Inc. VSL-337i, que funciona a 337 mm a 5 pulsaciones de láser por segundo. Todos los datos fueron adquiridos usando un digitalizador 
\hbox{interno
de 8 bits, 2 GHz, haciéndose  una media de hasta 50 pulsaciones de
láser por espectro.}
El instrumento fue utilizado en el modo lineal para el análisis de las proteínas de fusión GLP-1 en cuestión. El detector lineal es un dispositivo que detecta iones que se transportan por el tubo de vuelo del instrumento MALDI-ToF-EM. Mide la abundancia iónica a lo largo del tiempo y envía una señal al digitalizador para la conversión. El digitalizador es un convertidor de los datos analógicos en digitales que permite la transferencia de la señal desde el espectrómetro de masas al ordenador, donde es reconstruida en el espectro m/z usable.
Se utilizó una solución de ácido sinapínico saturada recristalizada (diluida en Acn/H_{2}O 50/50 y TFA al 0,1%) como la matriz de ionización. El ácido sinapínico es una matriz apropiada para las proteínas de más de 10 kDa. Se usaron proteínas de referencia de masa apropiada para los archivos de calibración internos y externos con el fin de obtener determinaciones de masas exactas para las muestras analizadas. Todas las muestras fueron analizadas usando una proporción de 1:2 de muestra con respecto a la dilución matriz. El instrumento se configuró inicialmente según las siguientes condiciones del detector lineal:
Tensión de la fuente: 20,0 keV
Tensión de los impulsos: 3,0 keV
Tensión de extracción: 20,0 keV
Grueso láser: 50
Tensión de focalización: 16,0 keV
Fino láser: 50
Detector lineal: 3,7 keV
P.A.D.: (fuera de línea)
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Estas configuraciones fueron modificadas (según lo necesario) para proporcionar la mejor proporción señal/ruido y la resolución más elevada. La tabla 3 proporciona una caracterización de las diferentes proteínas de fusión GLP-1.
TABLA 3
41
CEx se refiere a una extensión C-terminal y comprende la secuencia de Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser.
El ligador es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Actividad de las proteínas de fusión heterólogas
Se analizó la capacidad de las proteínas de fusión de la presente invención para activar al receptor de GLP-1 usando análisis in vitro tales como aquéllos descritos en el documento EP 619.322 concedido a Gelfand, et al., y la patente estadounidense n.º: 5.120.712, respectivamente. La actividad de estos compuestos relativa a la actividad de Val^{8}-GLP-1(7-37)OH se presenta en la tabla 4. La figura 5 representa las curvas de dosis-respuesta in vitro para las proteínas de fusión Val^{8}-GLP-1 y exendina-4. Además, la tabla 5a y 5b proporcionan la actividad in vitro de una amplio grupo de análogos de GLP-1 que se pueden fusionar a una proteína Fc para formar proteínas de fusión biológicamente activas. Estas actividades se comparan con GLP-1(7-37)OH.
TABLA 4 Actividad in vitro de proteínas de fusión GLP-1
43
CEx se refiere a una extensión C-terminal y comprende la secuencia de Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser. El ligador es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, C2 es Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Gly-Ala.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión descritas en las tablas 3 y 4 se representan en SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 31.
Las secuencias de aminoácidos de Val^{8}-GLP-1-IgG1 representadas por SEQ ID NO: 18
44
La secuencia de aminoácidos de Val^{8}-GLP-1-Cex-IgG1 representada por SEQ ID NO: 19.
45
La secuencia de aminoácidos de Val^{8}-Glu^{22}GLP-1-IgG1 representada por SEQ ID NO: 20.
46
La secuencia de aminoácidos de Val^{8}-Glu^{22}GLP-1-CEx-IgG1 representada por SEQ ID NO: 21.
47
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}GLP-1-C2-IgG1 representada por SEQ ID NO: 22.
48 
\newpage
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}GLP-1-CEx-ligador-IgG1 representada por SEQ ID NO: 23.
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}GLP-1-CEx-ligador-IgG4 representada por SEQ ID NO: 24.
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}GLP-1-CEx-2-ligador-IgG1 representada por SEQ ID NO: 25.
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}GLP-1-2-ligador-IgG1 representada por SEQ ID NO: 26.
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}GLP-1-2CEx-IgG1 representada por SEQ ID NO: 27.
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\newpage
La secuencia de aminoácidos de Gly^{8}-Glu^{22}-Val^{25}-Ile^{33}GLP-1-CEx-ligador-IgG1 representada por SEQ ID NO: 28.
\vskip1.000000\baselineskip
54 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Exendina-4-IgG1 representada por SEQ ID NO: 29.
\vskip1.000000\baselineskip
55 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Exendina-4-C2-IgG1 representada por SEQ ID NO: 30.
\vskip1.000000\baselineskip
56 
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos de Exendina-4-ligador-IgG1 representada por SEQ ID NO: 31.
\vskip1.000000\baselineskip
57
TABLA 5a Actividad in vitro de análogos de GLP-1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
58
TABLA 5a (continuación) 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
59
TABLA 5b Actividad in vitro de análogos de GLP-1 
\vskip1.000000\baselineskip
60
TABLA 5b (continuación)
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Actividad in vitro de análogos de GLP/exendina 
\vskip1.000000\baselineskip
62
TABLA 6 (continuación) 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7
Farmacocinética in vivo de Val^{8}-GLP-1-IgG1 y Val^{8}-GLP-1-HSA
Se realizó un estudio de farmacocinética de Val^{8}-GLP-1-IgG1 y Val^{8}-GLP-1-HSA en monos cynomologus. Se administraron a los monos 5,6 nmoles/kg bien de Val^{8}-GLP-1-IgG1 purificada o de Val^{8}-GLP-1-HSA purificada. Los compuestos fueron administrados por medio de bolos intravenosos. Se recogieron muestras de sangre antes de la dosis y a las 0,083; 0,25; 0,5; 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 216 horas de la administración en tubos que contenían EDTA. Las concentraciones de Val^{8}-GLP-1 inmunorreactivo en plasma se determinaron usando un radioinmunoanálisis que utilizaba un antisuero policlonal cuya especificidad primaria era para la región N-terminal (7-16) de Val^{8}-GLP-1(7-37). La figura 6 representa la concentración en plasma de Val^{8}-GLP-1-Fc y de Val^{8}-GLP-1-ligador-HSA tras una dosis intravenosa única a dos monos cynomologus. La proteína de fusión Fc resultó tener una vida media de aproximadamente 45 horas y la fusión de albúmina, una vida media de aproximadamente 87
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8
Farmacocinéticas in vivo de exendina-4-IgG1
Se estudiaron dos perros sabuesos macho normales canulados crónicamente tras una noche en ayunas. Se abrieron puertos de acceso vasculares arteriales y venosos, se insertó un catéter percutáneamente en una vena cefálica y se aseguró. Se introdujeron los animales en jaulas y se unieron sus catéteres a un sistema de pivote/soga. Se inyectó una solución que contenía la proteína de fusión exendina-4-IgG1 (PM: 11,8 \muM) intravenosamente (1,0 nmoles/kg) a través del catéter de la vena cefálica. Entonces se aclaró el catéter con 10 ml de solución salina. Dos horas después, se inició un clamp hiperglicémico (150 mg/dl) y se continuó durante tres horas. Se extrajeron muestras sanguíneas arteriales durante este período de 5 horas para la determinación de las concentraciones de la proteína de fusión, la glucosa y la insulina en plasma.
Se compararon los resultados de este estudio con lo de un estudio previo similar en el que ambos animales habían recibido un bolo de solución salina s.c., y habían sido estudiados 3 horas más tarde usando un clamp hiperglicémico (150 mg/dl) de 3 horas.
En ambos conjuntos de estudios, se determinaron las concentraciones de glucosa en plasma usando un analizador de glucosa de Beckman. Las concentraciones de insulina en plasma fueron determinadas por empleados de Linco Research, Inc. usando un equipo RIA desarrollado en sus laboratorios. Los datos se ilustran en las figuras 7
y 8.
\newpage
Ejemplo 9
Farmacocinéticas in vivo de Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1
Dos grupos de tres perros sabuesos macho normales recibieron 0,1 mg/kg de Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1 mediante una administración subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.). Se determinó la inmunorreactividad de las concentraciones en plasma de Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1 mediante radioinmunoanálisis en las muestras recogidas 30 minutos antes de la dosis hasta 216 horas posteriores a la dosis tanto para los grupos i.v. como para los grupos s.c. Estas concentraciones se usaron posteriormente para determinar los parámetros farmacocinéticos presentados. La vida media de eliminación media de Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1 administrado i.v. resultó ser de aproximadamente 55 horas y el aclaramiento corporal total de 1,5 ml/h/kg. La vida media de eliminación media de Gly^{8}-Glu^{22}-GLP-1-CEx-ligador-IgG1 administrado s.c. resultó ser de aproximadamente 38 horas.
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<110> Eli Lilly y Compañía
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN A GLP-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X-13991
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/251.954
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 12-06-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip 0,8cm
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 3 es Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 5 es Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 8 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 10 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 11 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 12 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Lys, Trp o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 13 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 14 es Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Lys, Trp o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 15 es Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 16 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 17 es Gln, Asn, Arg, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 18 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 19 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 20 es Lys, Arg, Gln, Glu, Asp o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 21 es Leu, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)...(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 25 es Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)...(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 26 es Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 27 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 28 es Asn, Lys, Arg, Glu, Asp o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)...(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 29 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 30 es Gly, Arg, Lys, Glu, Asp o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)...(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 32 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, o His, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 33 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, o His, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 34 es Gly, Asp, Glu o Lys o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)...(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 35 es Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, o Lys o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (36)...(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 36 es Ser, Pro, Lys, Glu o Asp, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)...(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 37 es Ser, Pro, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)...(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 38 es Gly, Pro, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)...(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 39 es Ala, Ser, Val, Glu, Asp, o Lys, o está eliminado;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip 0,8cm
83 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 3 es Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 5 es Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 6 es His, Trp, Phe o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 10 es Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu, o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 12 es His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 13 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 17 es His, Asp, Lys, Glu, Gln o Arg;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 18 es Glu, Arg, Ala o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 20 es Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 21 es Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)...(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 25 es Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 27 es Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 28 es Glu, Lys o Asp;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)...(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 29 es Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 30 es Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)...(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Pro o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 5 es Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 6 es His, Trp, Phe o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 10 es Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu, o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> MISC_FEATURE
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<223> El Xaa de la posición 16 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 17 es His, Asp, Lys, Glu o Gln;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 18 es Glu, His, Ala o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 20 es Asp, Lys, Glu o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 21 es Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 27 es Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 28 es Glu, Lys o Asp;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)...(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 29 es Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 30 es Arg, Glu o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)...(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 32 es Pro o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip 0,8cm
92 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met o Thr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 6 es His, Trp, Phe o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 10 es Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu, o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 16 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 17 es His, Asp, Lys, Glu o Gln;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 20 es Asp, Lys, Glu o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)...(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 29 es Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)...(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 32 es Pro o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip 0,8cm
96 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 16 es Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg o Cys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 17 es His, Asp, Lys, Glu o Gln;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 18 es Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Ala, Glu, Asp, Ser o His;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)...(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 32 es Pro o está eliminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip 0,8cm
98 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Ala, Gly, Val, Thr, Ile y alfa-metil-Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 15 es Glu, Gln, Ala, Thr, Ser y Gly;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 21 es Glu, Gln, Ala, Thr, Ser y Gly;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip 0,8cm
99 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 19 es Lys o Arg;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 30 es Gly;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip 0,8cm
100 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip 0,7cm
101 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip 0,8cm
102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Gly, Ala o Val;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 10 es Leu o Val;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 12 es Lys o Ser;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 13 es Gln o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 14 es Met o Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 16 es Glu o Gln;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 17 es Glu o Gln;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 19 es Val o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 20 es Arg o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 21 es Leu o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Glu o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 27 es Val o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 28 es Asn o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 30 es Gly o Arg; y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Gly o Pro;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)...(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 32 es Ser o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)...(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 33 es Ser o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)...(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 34 es Gly o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)...(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 35 es Ala o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (36)...(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 36 es Pro o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)...(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 37 es Pro o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)...(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 38 es Pro o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)...(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 39 es Pro o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)...(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 39 es Ser o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip 0,8cm
103 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 1 es L-histidina, D-histidina o está eliminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 2 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser o Thr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 6 es Phe, Trp o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 10 es Val, Trp, Ile, Leu, Phe o Tyr;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 12 es Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 13 es Tyr, Trp o Phe;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 14 es Leu, Phe, Tyr o Trp;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)...(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 16 es Gly, Glu, Asp o Lys;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 19 es Ala, Val, Ile o Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)...(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 21 es Glu, Ile o Ala;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 24 es Ala o Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 27 es Val o Ile; y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)...(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El Xaa de la posición 31 es Gly, His o está ausente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip 0,8cm
104 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 616
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
105
106 
\hskip 0,7cm
107 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 631
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
108
109 
\hskip 0,8cm
110 
\hskip 1cm
111 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
112
113 
\hskip 0,8cm
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 624
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
115
116
117 
\hskip 0,8cm
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
119
120 
\hskip 0,8cm
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,7cm
122 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
123 
\hskip 0,8cm
124 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
125 
\hskip 0,8cm
126 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
127 
\hskip 0,8cm
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
129 
\hskip 0,7cm
130 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip 0,8cm
131 
\hskip 0,7cm
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,7cm
133 
\hskip 0,8cm
134 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
135 
\hskip 0,8cm
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
137 
\hskip 0,8cm
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
139 
\hskip 0,8cm
140 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
141 
\hskip 0,8cm
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,7cm
143 
\hskip 0,8cm
144 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
145 
\hskip 0,8cm
146 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
147 
\hskip 0,7cm
148 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,7cm
149 
\hskip 0,7cm
150 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 703
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
151
152 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
153
154 
\hskip 0,8cm
155 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip 0,8cm
156
157

Claims (22)

1. Una proteína de fusión heteróloga que comprende un primer polipéptido con un terminal N y un terminal C fusionados a un segundo polipéptido con un terminal N y un terminal C, siendo el primer polipéptido un compuesto de GLP-1 y seleccionándose el segundo polipéptido entre:
a)
la porción Fc de una inmunoglobulina;
b)
un análogo de la porción Fc de una inmunoglobulina; y
c)
fragmentos de la porción Fc de una inmunoglobulina,
y en el que el terminal C del primer polipéptido está fusionado al terminal N del segundo polipéptido.
2. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 1, en la que el terminal C del primer polipéptido está fusionado al terminal N del segundo polipéptido mediante un ligador peptídico.
3. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 2, en la que el ligador peptídico se selecciona entre
a)
un péptido rico en glicina;
b)
un péptido que tiene una secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{n} en la que n es 1, 2, 3, 4. 5 ó 6; y
c)
un péptido que tiene una secuencia [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_{3}.
4. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto de GLP-1 comprende la secuencia de fórmula I [SEQ ID NO:2]
158
en la que:
\quad
el Xaa de la posición 8 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 9 es Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 11 es Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 14 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 16 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 17 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 18 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 19 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 20 es Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 21 es Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 22 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 23 es Gln, Asn, Arg, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 24 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 25 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 26 es Lys, Arg, Gln, Glu, Asp o His;
\quad
el Xaa de la posición 27 es Leu, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 30 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 31 es Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 32 es Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 33 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 34 es Asn, Lys, Arg, Glu, Asp o His;
\quad
el Xaa de la posición 35 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys;
\quad
el Xaa de la posición 36 es Gly, Arg, Lys, Glu, Asp o His;
\quad
el Xaa de la posición 37 es Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 38 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp o His, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 39 es Ser, Arg, Lys, Glu, Asp o His, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 40 es Gly, Asp, Glu o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 41 es Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 42 es Ser, Pro, Lys, Glu o Asp, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 43 es Ser, Pro, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
\quad
el Xaa de la posición 44 es Gly, Pro, Glu, Asp o Lys, o está eliminado; y
\quad
el Xaa de la posición 45 es Ala, Ser, Val, Glu, Asp o Lys, o está eliminado;
con la condición de que cuando el aminoácido de la posición 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ó 44 esté eliminado, entonces todos los aminoácidos secuencia abajo de ese aminoácido también están eliminados.
5. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto de GLP-1 no tiene más de 6 aminoácidos que son diferentes del correspondiente aminoácido de GLP-1-(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4.
6. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 5, en la que el compuesto de GLP-1 no tiene más de 5 aminoácidos que son diferentes del correspondiente aminoácido de GLP-1-(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4.
7. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 6, en la que el compuesto de GLP-1 no tiene más de 4 aminoácidos que son diferentes del correspondiente aminoácido de GLP-1-(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4.
8. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 7, en la que el compuesto de GLP-1 no tiene más de 3 aminoácidos que son diferentes del correspondiente aminoácido de GLP-1-(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4.
9. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 8, en la que el compuesto de GLP-1 no tiene más de 2 aminoácidos que son diferentes del correspondiente aminoácido de GLP-1-(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH o exendina-4.
10. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto de GLP-1 tiene glicina o valina en la posición 8.
11. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el segundo polipéptido es la porción Fc de una Ig seleccionada entre: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM.
12. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 11, en la que el segundo polipéptido es la porción Fc de una Ig seleccionada entre: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
13. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 12, en la que el segundo polipéptido es la porción Fc de una inmunoglobulina IgG1.
14. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 12, en la que el segundo polipéptido es la porción Fc de una inmunoglobulina IgG4.
15. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que la IgG es humana.
16. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la porción Fc comprende los dominios bisagra, CH_{2} y CH_{3}.
17. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 13, en la que el segundo polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 32.
18. Una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso como un medicamento.
19. Una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso en el tratamiento de pacientes con diabetes mellitus no dependiente de la insulina.
20. Una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso en el tratamiento de pacientes con obesidad.
21. Una formulación farmacéutica adaptada para el tratamiento de pacientes con diabetes mellitus no dependiente de la insulina que comprende una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
22. Una formulación farmacéutica adaptada para el tratamiento de pacientes con obesidad que comprende una proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
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