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MX2011000847A - Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo. - Google Patents

Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo.

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Publication number
MX2011000847A
MX2011000847A MX2011000847A MX2011000847A MX2011000847A MX 2011000847 A MX2011000847 A MX 2011000847A MX 2011000847 A MX2011000847 A MX 2011000847A MX 2011000847 A MX2011000847 A MX 2011000847A MX 2011000847 A MX2011000847 A MX 2011000847A
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MX
Mexico
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protein
modality
albumin
conjugate
acid
Prior art date
Application number
MX2011000847A
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English (en)
Inventor
Nils Langeland Johansen
Henrik Sune Andersen
Bernd Peschke
Carsten Behrens
Patrick William Garibay
Soeren Oestergaard
Sonja Bak
Original Assignee
Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

La invención se refiere a proteínas conjugadas, en particular pero no exclusivamente, a factores de coagulación de la sangre, a procesos para preparar los conjugados, a composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados y al uso de los conjugados en la terapia, en particular pero no exclusivamente, para el tratamiento de enfermedades aliviadas por los factores de coagulación de la sangre tales como el tratamiento profiláctico de la hemofilia.

Description

PROTEINAS CONJUGADAS CON EFICACIA PROLONGADA IN V de la Invención La invención se refiere a proteínas conjug cular pero no exclusivamente, a factores de coa a sangre, a procesos para preparar los conjug siciones farmacéuticas que comprenden los conju o de los conjugados en la terapia, en particular sivamente, para el tratamiento de enfermedades a los factores de coagulación de la sangre tal miento profiláctico de la hemofilia. edentes de la Invención La coagulación de la sangre es un proc ste de una interacción compleja de varios compon angre (o factores) que da origen eventualmen lo de fibrina. Generalmente, los componentes Para los pacientes con hemofilia grave, exi ncia lejos de un tratamiento a petición hacia r lácticos para prevenir el sangrado y el daño sub as articulaciones. Sin embargo, con su vida m lación corta, los factores de coagulación tal , FIX y FVIIa en particular, no son ideales miento profiláctico a largo plazo, ya que se r altas e inyecciones frecuentes para mantener ni lasma farmacológicamente relevantes. Por lo ta ue actual se dirige hacia el desarrollo de aná n prolongada que son más adecuados para iláctico .
La conjugación con PEG es un método esta prolongar la vida media en circulación de las pr embargo, debido a la gran interfaz de interacció res de coagulación dentro de la membrana celula uales tienen un perfil de acción prolongado en d éptidos son unidos a un residuo de enlace a albú e un separador hidrófilo.
Por lo tanto, la invención proporciona co osos de proteínas con propiedades fármac radas así como también métodos para su producción. e Descripción de la Invención De acuerdo con un primer aspecto de la in roporciona un proceso para preparar una pro oproteína conjugada el cual comprende los pa isten en hacer reaccionar una proteína o glico una sustancia aglutinante de albúmina insoluble resencia de una molécula de ciclodextrina su onalmente.
De acuerdo con un segundo aspecto de la roporciona un conjugado de proteína el cual compr resenta un separador hidrófilo; un grupo químico que une A y B; resenta un residuo de enlace a albúmina; y resenta un número entero seleccionado de 1, 2, 3 7, 8, 9 o 10; o una sal, solvato o pr céuticamente aceptable del mismo.
De acuerdo con un tercer aspecto de la in roporciona un proceso para preparar un fa lación de la sangre conjugado el cual compre que consisten en hacer reaccionar un fa lación de la sangre como se define en este docum upo modificador como se define en este documento De acuerdo con un aspecto adicional ción, se proporciona un factor de coagulació re conjugado que comprende un factor de coagulaci re como se define en este documento conjugado ituido de por lo menos cinco aminoácidos consti tados por enlaces peptídicos. Los ami ituyentes pueden ser del grupo de los ami icados por el código genético y pueden ser ami ales los cuales no son codificados por el ico, así como también aminoácidos sintétic ácidos naturales los cuales no son codificados o genético son por ejemplo hidroxiproli xiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina mina. Los aminoácidos sintéticos comprenden ami acturados por medio de la síntesis química, es ros de los aminoácidos codificados por el ico tales como D-alanina y D-leucina, Aib (á isobutírico) , Abu (ácido -aminobutírico) , Tle lglicina) , ß-alanina, ácido 3 -aminometilbenzoico anílico. Se apreciará que el término co sacáridos (glicanos) unidas covalentemente a sus ales de polipéptidos . Se apreciará que cua proteína se utiliza en el proceso de conjugació ción, el residuo de enlace a albúmina puede ser licoproteína por vía de un residuo de glicano .
En el presente contexto, el término "comp na de crecimiento" como se utiliza en este d ifica una hormona de crecimiento de origen de u fero, tal como una hormona de crecimiento de o o porcino y una hormona de crecimiento recom como una hormona de crecimiento recombinante de no o porcino y variantes de estas horm imiento. Como se utiliza en este documento, puesto de hormona de crecimiento" son intercam do la GH es una variante de una hormona de crecim en de un animal mamífero, tal como hGH onal de uno o más residuos de aminoácid cular, estas sustituciones son conservadoras do de que un residuo de aminoácido es sustitu residuo de aminoácido del mismo grupo, es decir úo de aminoácido con propiedades similare ácidos se pueden dividir convenientemente entes grupos con base en sus propiedades: Ami os (tales como arginina, lisina, histidina) , ami s (tales como ácido glutámico y ácido asp ácidos polares (tales como glutamina, cis ragina) , aminoácidos hidrófobos (tales como ucina, prolina, metionina y valina) , ami áticos (tales como fenilalanina, triptófano, , tir oácidos pequeños (tales como glicina, alanina, nina) . Típicamente, la GH tiene por lo menos tidad con la hGH, y típicamente, tiene por lo m oximadamente 1 µ?. Se conoce una variedad de res e a albúmina entre porciones lipófilas lin icadas que contienen 12-40 átomos de carbono, co un esqueleto de ciclopentanofenantreno y/o pépti n 10-45 residuos de aminoácidos, etcéter edades de enlace a albúmina se pueden medir por sonancia de plasmones de la superficie como se . Biol. Chem. 277(38), 35035-35042, (2002).
El término "separador hidrófilo" como se ut documento significa un separador que separa una icoproteína y un residuo de enlace a albúmina ión química la cual comprende por lo menos 5 át n de hidrógeno donde 30-50% de éstos son ya sea El término "insoluble en agua" se refier ión que tiene un valor cLogP > 0.
El término "soluble en agua" se refiere te en el sentido de que no puede ser alcanzado, tablece que los grupos funcionales no son acces roteína que es conjugada se tiene por objeto ind rupo funcional está ausente de la proteína o, nte, de alguna manera se impide que tome parte iones. A manera de ejemplo, el grupo funcional soterrado profundamente en la estructura de la odo que está protegido de participar en la reac oce que si un grupo funcional es accesible o no as condiciones de reacción. Se puede contemplar lo en presencia de agentes de desnaturalizac raturas elevadas la proteína puede desdoblar er grupos funcionales de otra manera no accesi entender que "no accesible" significa "no acce condición de reacción seleccionada para la icular de interés" .
El término "alquilo de 1 a 6 átomos de cari re a un hidrocarburo saturado de cadena icada que tiene de uno a seis átomos de sive. Los ejemplos de estos grupos incluyen, limitados a, metilo, 2-propilo, 1-butilo, 2-bu -2-propilo, -metil-l-butilo y n-hexilo.
El término "cicloalquilo de 3 a 10 át no" se refiere típicamente a ciclopropilo, cicl pentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, cicl nonilo y ciclodecanilo .
El término "alqueno" se propone para carburos lineales, ramificados y/o cíclic enden por lo menos un enlace doble de carbono-ca que se especifique con otro número de át no, el término se propone para indicar hidrocarb a 30 (ambos incluidos) átomos de carbono, tal c tomos de carbono, el término se propone para carburos con de 2 a 30 (ambos incluidos) át no, tal como de 2 a 20 (ambos incluidos) , tal c (ambos incluidos) , por ejemplo de 2 a 5 idos) . Los términos alquinilo y alquinileno se dical y bi -radical correspondiente, . respectivame El término "compuesto aromático heterocícl ne para indicar hidrocarburos aromáticos, tal no y naftaleno.
El término "compuesto heterocíclico" se indicar un compuesto cíclico que comprende 5, s del anillo de los cuales 1, 2, 3 o 4 son hete cionados de N, O y/o S. Los ejemplos incluyen co áticos heterocíclicos , tales como tiofeno, o, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, is ina, pirazina, pirimidina, piridazina, así como )-, en donde R* representa hidrógeno o alquilo s de carbono. Los ejemplos de heteroalcanos incl El término "radical" o "bi - radical" se prop ar un compuesto del cual uno o dos, respecti S de hidrógeno han sido removidos. Cuando se e íficamente, un radical también puede indicar la da por la remoción formal de un grupo más gr s, por ejemplo hidroxilo, de un compuesto.
El término "halógeno" se propone para ros del séptimo grupo principal de la tabla pe radical de anillo aromático con por ejemplo d s miembros o a un radical de sistema de tico fusionado con por ejemplo de 7 a 18 ros, en donde por lo menos un anillo es aromát iene uno o más heteroátomos como átomos del ccionados de heteroátomos de nitrógeno, oxígeno o onde los N-óxidos y monóxidos de azufre y dió re son sustituciones heteroaromáticas permisibl los incluyen furanilo, tienilo, tiofenilo, pi azolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, ti olilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiadi iazolilo, piridinilo, piridazinilo, pir midinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzof otiofenilo, indolilo e indazolilo y similares.
La marcación de asterisco como se utiliza ucturas químicas en este documento indica la pres drolizables y también incluye a) compuestos s la funcionalidad biohidrolizable en este pr incluida en el compuesto de acuerdo con la ción y b) compuestos los cuales pueden ser oxi idos biológicamente en un grupo funcional dét producir sustancias de fármacos de acuerdo nte invención. Los ejemplos de estos grupos fun yen 1 , 4 -dihidropiridina , N-alquilcarbo ropiridina, 1 , 4-ciclohexadieno, tere-butilo y si Como se utiliza en este documento, el r biohidrolizable" es un éster de una susta co (en este caso, un compuesto de acuerdo ción) el cual ya sea a) no interfiere con la a gica de la sustancia precursora pero confier ncia propiedades ventajosas in vivo tal como la acción, comienzo de acción y similares o iaciloxialquílieos inferiores, ásteres de lcoxi es alquil-acilamino-alquílicos y esteres de coli Como se utiliza en este documento, el a biohidrolizable" es una amida de una susta co (en este caso, un compuesto de acuerdo nte invención) el cual ya sea a) no interfiere idad biológica de la sustancia precursora pero a sustancia propiedades ventajosas in vivo tal ión de acción, comienzo de acción y similares gicamente inactivo pero es convertida fácilmente el sujeto al principio biológicamente activo. La por ejemplo solubilidad incrementada o que l idrolizable es absorbida por la ruta oral d stino y es transformada a un compuesto de acuerd ente invención en el plasma. Muchos ejemplos de é cidas en el campo e incluyen a manera de ejempl s orgánicos. Los ejemplos representativos de ánicos adecuados incluyen ácido clor ídrico, yodhídrico, fosfórico, sulfúrico, ní ares. Los ejemplos representativos de ácidos o ados incluyen ácido fórmico, acético, tricloro uoroacético, propiónico, benzoico, cinámico, ico, glicólico, láctico, maleico, málico, m lico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, su osulfónico, etanosulfónico, tartárico, as ico, bismetilen-salicílico, etanodisulfónico, gl cónico, aspártico, esteárico, palmítico, lico, p-aminobenzoico, glutámico, bencensulfó ensulfónico y similares. Los ejemplos adicion s de adición de ácido inorgánico u acéuticamente aceptables incluyen las acéuticamente aceptables que están listadas en J dad suficiente para curar, aliviar o almente las manifestaciones clínicas de una en minada y sus complicaciones. Una cantidad adecu zar esto se define como una "cantidad terapéut iva" . Las cantidades efectivas para cada p derán de la gravedad de la enfermedad o lesión én del peso y estado general del sujeto. Se e la determinación de una dosificación apropiada r utilizando la experimentación de rutina, al c atriz de valores y someter a prueba diferentes p atriz, todo lo cual está dentro de la exp aria de un médico o veterinario entrenado.
Los términos "tratamiento" y "tratar" izan en este documento significan el manejo y el n paciente con el propósito de combatir una co como una enfermedad o un trastorno. El término se sito de combatir la enfermedad, condición o tra ye la administración de los compuestos activ nir el comienzo de los síntomas o complicacio nte a ser tratado es preferiblemente un mamíf icular un ser humano, pero también puede les, tales como perros, gatos, vacas, ovejas y c El término "análogo" como se utiliza nento con referencia a un polipéptido signi éptido modificado en donde uno o más resi oácidos del péptido han sido sustituidos po dúos de aminoácidos y/o en donde uno o más res oácidos han sido suprimidos del péptido y/o en d s residuos de aminoácidos han sido agregados al adición o supresión de residuos de aminoácid r lugar en la N-terminal del péptido y/o en la C-péptido. Se debe entender que todos los aminoáci minar la vida media in vivo funcional, se minar la "vida media en el plasma in vivo", es d o en el cual 50% de las proteínas modifi ulas de referencia circulan en el plasma o el íneo antes de ser eliminadas. La determinació media en el plasma es frecuentemente más simple minación de la vida media funcional y la magnit media en el plasma es usualmente una buena indic gnitud de la vida media in vivo funcional . Los nativos para la vida media en el plasma incluyen en el suero, vida media en circulación, vid latoria, eliminación del suero, eliminación del media de eliminación. La funcionalidad que es elecciona normalmente de la actividad procoa olítica, de enlace de co-factores, de en tores u otro tipo de actividad biológica asociad és de la administración de la proteína modific en aparente medio de la distribución en el es ibrio se mide y la eliminación media se determin El término "incrementado" como se utiliza a ida media in vivo funcional o la vida media en e a que la vida media relevante de la proteína mo ncrementada estadísticamente de manera significa ión a aquella de una molécula de referencia, roteína de otra manera idéntica la cual, sin emb ido sujetada al método de la invención. De esta ida media se determina bajo condiciones comparab lo, la vida media relevante se puede incrementa S aproximadamente 25%, tal como por al imadamente 50%, por ejemplo, por al imadamente 100%, 150%, 200%, 250% o 500%. En lidades, las proteínas modificadas de la és de la administración. Típicamente sponibilidad se mide en animales de pru istrar una dosis entre aproximadamente 25-250' [ reparación; obtener muestras de plasma en terminados después de la administración; y deter nido de proteína en las muestras utilizando un b ado, o inmunoensayo o un ensayo equivalente. L hiben típicamente de manera gráfica como [prot o y la biodisponibilidad se expresa como el área (AUC, por sus siglas en inglés) . La biodispon iva de una preparación de prueba se refier ión entre la AUC de la preparación de prueba y proteína no modificada.
El término "inmunogenicidad" de una prepar re a la disponibilidad de la preparación, cu istra a un humano, para producir una respuest iduo sensible de por lo menos aproximadamen riblemente por lo menos aproximadamente 25 riblemente por lo menos aproximadamente 40% y m riblemente por lo menos aproximadamente 50 ión a la inmunogenicidad para ese individuo ína no modificada.
La inmunogenicidad de un fármaco también se hecho de que los fármacos proteínicos pue ogenos en sujetos no sensibles, lo que significa istraciones repetidas del fármaco condu lecimiento continuo de una respuesta inmune co co. Esto es indeseable en la mayoría de los caso e la respuesta inmune interferirá con la activ co, por lo cual se vuelve necesario adm ficaciones crecientes del fármaco a través del de proporcionar un efecto terapéutico. En documento con referencia a una proteína signif ína la cual ha sido modificada químicamente a r al compuesto resistente a las peptidasas o p plasma. Se sabe que las proteasas en el plasm icadas en la degradación de varias hormonas pept ién desempeñan un papel en la degradación de p randes .
La resistencia de una proteína a la degrada lo por la dipeptidil-aminopeptidasa IV (DP rmina por medio del siguiente ensayo de degradac otas de la proteína (5 nmol) se incuban a 37 °C ipeptidil -aminopeptidasa IV purificada que corre actividad enzimática de 5 mU durante 10-180 mi µ? de amortiguador de trietilamina-HCl 0.1 M, pH ciones enzimáticas se terminan por medio de la ad de ácido trifluoroacético al 10% y los prod te 1 minuto) de acuerdo con Siegel y colabo . Pept. 1999; 79:93-102 y Mentlein y colaborado iochem. 1993; 214:829-35. Los péptidos y sus prod dacion se pueden supervisar por su absorbancia ces peptídicos) o 280 nm (aminoácidos aromático ificados por medio de la integración de sus ár cionadas con aquellas de estándares. La t lisis de un péptido por la dipeptidil-aminopept alcula en tiempos de incubación los cuales itado menos de 10% del péptido que es hidroli rimento se puede conducir opcionalmente en pres ina, a fin de estudiar las propiedades de pr eídas por la formación de complejos de albúmina.
El término "formulación acuosa" se define lación que comprende por lo menos 50% en p/p mismo modo, el término "solución acuosa" se def ácidos. La "identidad" mide el porcent idencias idénticas entre la más pequeña de do ncías con alineamientos de espacios (si lto por un modelo matemático particular o prog tadora (es decir, "algoritmos" ) . La identi ínas relacionadas se puede calcular fácilmente p étodos conocidos. Estos métodos incluyen, pero ados a, aquellos descritos en Computational M gy, Lesk, A. M. , ed. , Oxford University Press , 1988; Biocomputing : Informatics y Genome P , D. W. , ed. , Academic Press, Nueva York, 1993; sis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. fin, H. G. , eds . , Humana Press, Nueva Jersey ence Analysis in Molecular Biology, von Hein emic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Grib vereux, J. , eds., M. Stockton Press, Nueva York, te de programa GCG, que incluye GAP (Dev oradores, Nucí. Acid. Res., 12, 387, (1984); iter Group, University of Wisconsin, Madison, P, BLASTN y FASTA (Altschul y colaboradores, 215, 403-410, (1990)) . El programa BLAS onible para el público en general de the Nationa Biotechnology Information (NCBI) y otras fuente al, Altschul y colaboradores NCB/NLM/NIH Bethes 4; Altschul y colaboradores, supra) . El algor h Waterman bien conocido también se puede utili rminar la identidad.
Por ejemplo, utilizando el algoritmo de com (Genetics Computer Group, University of WÍ son, is.), dos proteínas para las cuales rminar el porcentaje de identidad de secuen ean para el apareamiento óptimo de sus ami ) así como también una matriz de comparación t 50 o BLOSUM 62 se utilizan en conjunto con el al matriz de comparación estándar (véase Day oradores, Atlas of Protein Sequence y Structure, upp. 3 (1978) para la matriz de comparación off y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci E -10919, (1992) para la matriz de comparación BL én es utilizada por el algoritmo.
Los parámetros preferidos para una compar ncías de proteínas incluyen los siguientes: Al ernán y colaboradores, J. Mol. Biol, 48, 443-453, iz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y colabo Nati. Acad. Sci. EUA, 89, 10915-10919, lización por Hueco: 12, Penalización por Long o : 4, Umbral de Similitud: 0.
El programa GAP es útil con los pa una sustancia aglutinante de albúmina insoluble resencia de una molécula de ciclodextrina su nalmente .
En una modalidad, el conjugado de proteín gado de proteína de la fórmula (I) : (A-W-B)y-P (I) nde resenta una proteína o glicoproteína; resenta un separador hidrófilo; un grupo químico que une A y B; resenta un residuo de enlace a albúmina; e presenta un número entero seleccionado de 1, 2, 8, 9 o 10; a sal, solvato o profármaco farmacéuticamente a mismo, de tal manera que la porción A-W-B- compr ión insoluble en agua. dad incrementada por un receptor enamiento incrementada, vida media nuida y vida media en el plasma in ??? Las ciclodextrinas (también conocidas amilosas) constituyen una familia de oligos cos, compuestos de 5 o más unidades d piranosida enlazadas l->4, como en amilosa (un f almidón) . Las ciclodextrinas típicas contie dad de monómeros de glucosa que varían de seis des en un anillo, creando una forma de co los de estas ciclodextrinas incluyen oc-ciclodext molécula de anillo de azúcar de seis miembr dextrina (ß-CD; molécula de anillo de azúcar ros) y ?-ciclodextrina (?-CD; molécula de an ar de ocho miembros) como se muestra a continuaci ejemplo metilo, etilo o propilo) cada uno de los ser sustituido opcionalmente por uno o más XÍIO (por ejemplo, hidroxietil-ciclodextr xipropil -ciclodextrina) . En una modalida dextrina sustituida opcionalmente compren xietil--ciclodextrina .
La molécula de ciclodextrina su nalmente se puede agregar en una concentración (por ejemplo 5%) .
En una modalidad, la reacción de conj ende una reacción en una solución amortiguada omo un amortiguador de Hepes (por ejemplo Hepes 100 mM y CaCl2 10 mM) . En una modalidad, la rea gación comprende una reacción en un pH consta ío pH 7.0) y una temperatura constante (por . La ventaja de conducir la reacción de conjug ína con una masa molecular superior a 10,000 Da.
En otra modalidad, P representa una prote asa molecular superior a 20,000 Da.
En otra modalidad, P representa una prote asa molecular superior a 30,000 Da.
En otra modalidad, P representa una prote asa molecular superior a 40,000 Da.
Las proteínas y péptidos dentro del alcan yen, pero no están limitados a, hemoglobina, p suero tales como factores de la sangre que incl res VII, FX, FII, FV, proteína C, proteína S, t ctor de tejido, FXI , FXII y FXIII, así como tam ntes de FVIII y FIX de secuencia de las noglobulinas , citocinas tales como interleucinas y gamma- interferones , factores de estimula ias que incluyen factores de estimulación de col miento tales como factores de crecimiento de como TGFa's o TGFps y factores de cre rmico, hormonas, somatomedinas , eritropoyetina, ntarias, factores de liberación hipotalámica , iuréticas, prolactina, gonadotropina coriónica, uladora de folículos, hormona estimuladora de t ador de plasminógeno de tejido y similar oglobulinas de interés incluyen IgG, IgE, IgM, gmentos de las mismas.
En una modalidad de la invención, el pép inina, inhibidor de la vía de factor de tejido idores de proteasa, insulina o precursores de i na de crecimiento de humano o bovino, ínter gón, oxintomodulina, GLP-1, GLP-2, IGF-I, ador de plasminógeno de tejido, factor de cre sformante ? o ß, factor de crecimiento deri cturalmente similar a la proteína nativa y s ar de la proteína nativa por medio de la adició aminoácidos a cualquiera o ambos del extremo te extremo terminal N de la proteína nativa, la sus o o más aminoácidos en uno o una variedad de di s en la secuencia de aminoácidos nativa, la supr o más aminoácidos en cualquiera o ambos extremo ína nativa o en uno o varios sitios en la secu ácidos o la inserción de uno o más aminoácidos sitios en la secuencia de aminoácidos nativa. Ad ína se puede acilar en una o más posiciones, vé lo, el documento WO 98/08871, el cual da a co ción de GLP-1 y análogos de la misma y el docu 8872, el cual da a conocer la acilación de gos de la misma. Un ejemplo de un derivado ada es Lys26 (Népsilon-tetradecanoil ) -GLP-1 (7-37) Estos materiales se obtienen de génicos, es decir ratones, cerdos, vacas, etcét la proteína es expresada en leche, sangre o insectos transgénicos y sistemas de expres ovirus también están contemplados como fuentes. versiones mutantes de proteínas, tales com tes y/o interferones mutantes también están de ce de la invención. Otras proteínas de ínte ínas de alérgenos tales como ambrosía, Antí o de abejas, alérgeno de ácaros y similares.
En una modalidad, P representa un fa lación de la sangre. Los ejemplos de fact lación de la sangre adecuados incluyen: I (fibri protrombina) , factor de tejido, V (proacelerin VIII, IX (factor de Christmas) , X (factor de r) , XI (antecedente de tromboplastina del plas idad adicional, el factor de coagulación de la sa ciona de FVII, FX, FII, FV, proteína C, proteína , factor de tejido, FXI, FXII y FXIII, así como ariantes de FVIII, FIX de secuencia de los mismos En una modalidad adicional, el fac lación de la sangre es FVII (es decir FVIIa) .
En una modalidad alternativa, P represe na de crecimiento (GH) .
En una modalidad, y representa un número cionado de 1, 2 o 3. Esta modalidad es particu ada para modalidades en donde P representa una ecimiento debido a que la hormona de crecimiento s de unión para esta porción de A-W-B-, específ rmino N, Gln40 y Glnl41.
En una modalidad, y representa un número cionado de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En una m En una modalidad de la presente invenc ador hidrófilo B tiene un valor cLogP < 0 como s Am. C em. Soc, 86 (1964) 5175-5180 "A New Sub ant, ?, Derived from Partition Coefficients" y calcular utilizando el paquete de software Sy s (Tripos Associates, 1699 South Hanley Road, St . 144-2319 EUA) .
En una modalidad adicional del conjugado la (I) , el separador hidrófilo B tiene la fórmul nde X1 es -Wi- [ (CH2) nlEl] [{CHR2)I2- X2 es - [(CHR3)I3-W4]m4-{ [(CH2)n3E2]m5- [ (CHR4) I4-W5 X3 es - [ (CHR5)is-W6]m7-f X4 es F-Dl- (CH2) I6-D2- , II, 12, 13, 14, 15 e 16 se sel 20H o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, R1, R2 , R3, R4 y R5 se sel endientemente de hidrógeno, -C(0)OH, -C(0)NH2, 20H, -NH-C (==NH) -NH2, alquilo de 1 a 6 átomos de o heteroarilo; en donde los grupos alquilo, oarilo son sustituidos opcionalmente por h 0H, -C(0)NH2/ -S(0)OH, -S(0)2OH, -CN u -OH, DI, D2 , El y E2 se seleccionan independie -, -NR6-, -N(C0R7)- o un enlace de valencia; en representan independientemente hidrógeno o alqui tomos de carbono, V¡i a W6 se seleccionan independíentem NH-, -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC(0)-, -C(0)N )2NHC(0)-, -0C(0)NH-, -NHC{0)0-, -C(0)CH2-, -C )CH=CH-, -CH=CHC (0) - , -(CH2)S2-/ -C(0)-, -C(0)0-, enlace de valencia; en donde s2 es 0 o 1.
H-, -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC(0)-, -C(0)N 2NHC(0)- o un enlace de valencia. Típicamente, ciona de -C(0)NH-, - HC(O)- o -C (O) HS (O) 2- .
En una modalidad adicional, 4 se selecc NH-, -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC{0)-, -C(0)N 2NHC(0)- o un enlace de valencia. Típicamente ciona de -C(0)NH-, -NHC(O)- o -C (0) HS (O) 2- .
En una modalidad adicional, W5 se selecc NH-, -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC (0) - , -C(0)N 2NHC(0)- o un enlace de valencia. Típicamente ciona de -C(0)NH-, -NHC(O)- o -C (0) NHS (O) 2- .
En una modalidad adicional, W6 se selecc )NH-, -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC(0)-, -C(0)N )2NHC(0)- o un enlace de valencia. Típicamente ciona de -C(0)NH-, -NHC(O)- o -C (O) NHS (0) 2- .
En una modalidad adicional, R1 se selecc nalmente por -C(0)OH, -C(0)NH2, -S(0)2OH. Tipicam lecciona de -C(0)OH, -C(0)NH2 o alquilo de 1 a carbono; en donde el grupo alquilo es su nalraente por -C(0)OH, -C(0)NH2 o -S(0)2OH.
En una modalidad adicional, R se selecc geno, -C(0)OH, -C(0)NH2/ -S(0)2OH o alquilo de s de carbono; en donde el grupo alquilo es su nalmente por -C(0)OH, -C(0)NH2, -S(0)2OH. Típicam elecciona de -C(0)OH, -C(0)NH2 o alquilo de 1 a carbono; en donde el grupo alquilo es su nalmente por -C(0)OH, -C(0)NH2 o -S(0)2OH.
En una modalidad adicional, R4 se selecc ógeno, -C(0)OH, -C(0)NH2/ -S(0)2OH o alquilo de os de carbono; en donde el grupo alquilo es su onalmente por -C(0)OH, -C(0)NH2/ -S(0)2OH. Típicam elecciona de -C(0)OH, -C(0)NH2 o alquilo de 1 a En una modalidad adicional, El se seleccion R6- o un enlace de valencia. Típicamente, ciona de -0- .
En una modalidad adicional, E2 se seleccion R6- o un enlace de valencia. Típicamente, ciona de -0- .
En una modalidad adicional, El y ?2 son amb En una modalidad adicional, El y E2 son ambo En una modalidad adicional, F es lidin-2 , 5-diona o un enlace de valencia.
En una modalidad adicional, DI se seleccion NR6- o un enlace de valencia. Típicamente, ciona de -NR6-.
En una modalidad adicional, D2 se seleccion NR6- o un enlace de valencia. Típicamente, cciona de -NR6- .
En una modalidad adicional, 16 es 0-6, tal 3 , 4 , 5 o 6.
En una modalidad adicional, mi es 0-6, tal 3 , 4 , 5 o 6.
En una modalidad adicional, m2 es 0-10, tal 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En una modalidad adicional, m3 es 0-6, tal , 3 , 4 , 5 o .
En una modalidad adicional, m4 es 0-6, tal , 3 , 4 , 5 o 6.
En una modalidad adicional, m5 es 0-10, tal , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En una modalidad adicional, m6 es 0-6, tal , 3 , 4 , 5 o 6.
En una modalidad adicional, m7 es 0-6, tal , 3 , 4 , 5 o 6.
{ [ (CH2)nlO]m2- [(CHR2)I2-W3]m3}n2- Y 2 es -[(CHR3) 2)?3?]p?5- [ (CHR4)I4-W5]m6}n4-, en donde -{[(C 2)l2-W3]m3}n2- -{ [(CH2)n30]m5- [(CHR4)I4-W5] m6 } n cionan de, (CHR2), (CHR¾ en donde Y es - (CH2) i7-cicloalquil C3-Ci0- 8- o un en cia, 17 es 0-6, W7 se selecciona de -C(0)NH-, -NHC(O)-, -C(0 HC(O)-, -C(0)NHS{0)2-, -S(0)2NHC(0) -, -0 (0)0-, -0(0)012-, -CH2C(0)-, -C(0)CH=CH-, -CH= ) 33-/ -C(0)-f -C(0)0-, -0C(0)-, o un enlace de v nde s3 es 0 o 1, W8 se selecciona de -C(0)NH-, - HC(0)-# -C( ÍHC(O)-, -C(0)NHS(0)2-, -S (0)2NHC(0) -, -0 (0)0-, -C(0)CH2-, -CH2C(0)-, -C(0)CH=CH-, -CH= )s4-/ -C(0)-, -C(0)0-, -0C(0)-, o un enlace de v nde s4 es 0 o 1.
En una modalidad de W, Y es - (CH2) I7-ciclohe En una modalidad adicional, Y es un en En una modalidad adicional, 17 es 0 o 1.
En una modalidad adicional, el separador esente invención se selecciona de ?? El residuo de enlace a albúmina (sustituyen rmula (I) anterior) unido a P es un residuo lipo se enlaza de manera no covalente a la a amente, el residuo de enlace a albúmina tien iltraciones de un compuesto en las dos fases a de dos solventes inmiscibles en equ ámente, uno de los solventes es agua mientras do solvente se selecciona de octan-l-ol, clo hexano y dipelargonato de propilenglicol (PGD es Log P medidos en estos solventes diferentes encias principalmente debido a los efectos de e geno. El octanol puede donar y aceptar enl geno mientras que el ciclohexano es iner formo puede donar enlaces de hidrógeno mientras solo puede aceptarlos.
En una modalidad de la invención, la s íñante de albúmina tiene un valor Log P de > -octan-l-ol, cloroformo, ciclohexano y dipelargo englicol (PGDP) .
En una modalidad adicional, la s "A New Substituent Constant, ?, Derived from P icients" , C. A. Lipinski y colaboradores Advanc ery Reviews, 23 (1997) 3-25, "Experime tational Approaches to Estímate Solubil ability in Drug Discovery y Development Setting uchi, S. Hirono, I. Nakagome, H. Hirano, Chem. 42 (1994) 976-978 "Comparison of Reliability s for Drugs Calculated by Several Methods" .
En una modalidad de la invención, la s inante de albúmina tiene un valor cLog P de > octan-l-ol, cloroformo, ciclohexano y dipelargo lenglicol (PGDP) . En una modalidad adicional ción, la sustancia aglutinante de albúmina t cLog P de > 2 en ya sea octan-l-ol, clo hexano y dipelargonato de propilenglicol (PGDP) . idad todavía adicional de la invención, la s En una modalidad adicional, el residuo de ina se selecciona de un grupo alquilo de caden upo alquilo de cadena ramificada, un grupo el cu rupo de ácido ?-carboxílico o un isoéster de á xílico. Típicamente, el residuo de enlace a de 6 a 40 átomos de carbono. En una m onal, el residuo de enlace a albúmina tiene de s de carbono. En una modalidad adicional, el re e a albúmina tiene de 8 a 20 átomos de carbono.
En una modalidad adicional, A tiene de S de carbono y comprende un grupo de á xílico. En una modalidad adicional, A tiene de s de carbono y comprende un isoéster de á xílico, tal como tetrazol .
Las propiedades de enlace a albúmina se r por medio de la resonancia de plasmones 50 En otra modalidad, el residuo de enlace a une al residuo N-terminal de la proteína P por ador hidrófilo B.
En otra modalidad, el residuo de enlace a une al residuo C-terminal de la proteína P por ador hidrófilo B.
En otra modalidad, el residuo de enlace a une al residuo de lisina de la proteína P por ador hidrófilo B.
En todavía otra modalidad, el residuo de ina A se une a un residuo de glicano oxidad proteína P por vía del separador hidrófilo B.
En una modalidad, A-W-B- es En una modalidad, P es FVIIa glicooxidado y FVIIa una modalidad, P es FVIIa glicooxidado, B=)VP es En una modalidad, P es FVIIa glicooxidado, -B=)vP es En una modalidad, A-W-B- es 53 55 acuerdo con un aspecto adicional ion, se proporciona un conjugado de proteína e en este documento para el uso en la terapia.
En un aspecto adicional, la invención se r De acuerdo con un aspecto adicional ción, se proporciona un proceso para preparar u agulación de la sangre conjugado el cual compre que consisten en hacer reaccionar un fac lación de la sangre como se define en este docum upo modificador como se define en este documento.
El proceso de la invención da por r res de coagulación de la sangre modificados que edades farmacológicas mejoradas en comparación r de coagulación de la sangre no modifica ío, la propiedad farmacológica mejorada se se grupo que consiste de biodisponibilidad incre media in vivo funcional incrementada, vida medi a in vivo incrementada, inmunogenicidad r tencia a la proteasa incrementada, afinidad incr albúmina, afinidad mejorada por un receptor, est En una modalidad, el agente de solubi ende una molécula de ciclodextrina su nalmente .
De esta manera, de acuerdo con un aspecto a invención, se proporciona un proceso para prep ína o glicoproteína conjugada el cual compre que consisten en hacer reaccionar una pro proteína como se define en este documento ncia aglutinante de albúmina como se define entó en presencia de una molécula de ciclo tuida opcionalmente . En una modalidad, la s íñante de albúmina comprende una sustancia agl lbúmina insoluble en agua y la proteína o glico ende una proteína o glicoproteína soluble en agu Algunos factores de coagulación (por ejempl , FXa, Fila) actúan como proteasas en la cascad actor de coagulación y el grupo modificador se condiciones donde el sitio funcional del fa lación (es decir el sitio de proteasa) es bloqu molécula auxiliar tal como un inhibidor de asa. Preferiblemente, la molécula auxiliar es reconoce específicamente el sitio de proteasa a reversible y puede ser retirada fácilmente dur de purificación subsecuentes. Por ejemp midina es un inhibidor de sitios activos, rev ado para el FVIIa.
De acuerdo con un aspecto adicional ción, se proporciona una proteína o glico ugada que se puede obtener por medio de un proc efine anteriormente en este documento.
De acuerdo con un aspecto adicional nción, se proporciona un factor de coagulació r de tejido, V (proacelerina) , VI, VII, VIII, IX ristmas) , X (factor de Stuart-Prower) , XI (ante omboplastina del plasma) , XII (factor de Hagema or de estabilización de fibrina) , factor brand, precalicreína, kininógeno de alto peso m ) , fibronectina, antitrombina III, cofactor de roteína C, proteína S, proteína Z, inhibidor de ionado con la proteína Z (ZPI) , plasminóg lasmina alfa, activador de plasminógeno de tejid nasa, inhibidor de activador de plasminógeno-1 idor de activador de plasminógeno- 2 (P agulante del cáncer.
La invención también incluye proteínas dise ales con actividades de coagulación, tales c gos del factor de tejido (TF) , proteínas de fu quimeras del TF que tienen afinidad increment onales incluyen un MAB biespecífico que imita al En una modalidad, el factor de coagulació e es el factor Vlla (FVIIa) , factor VIII (F r IX (FIX) . En una modalidad adicional, el fa lación de la sangre es el factor Vlla (FVIIa) .
En una modalidad, el factor de coagulació e es un análogo del factor Vlla (FVIIa) , fact I) o factor IX (FIX) . En una modalidad adicio r de coagulación de la sangre es un análogo de (FVIIa) .
En una modalidad, el grupo modificador ex o de prolongación por medio del enlace a albú ina, la cual está presente en gran cantidad re, enlaza los ácidos grasos, moleculares, pequ idades de micro a nanomolares . Si el ácido graso molécula más grande tal como un péptido, el conj s deben ser suficientemente grandes para ev nación renal .
Adicionalmente , es sorprendente que los c proteínas grandes de tamaño comparable pue nidos juntos por fuerzas lipófilas ejercidas po icadores como se define en este documento cular aquellos que comprenden un compuesto de la De esta manera como se indicara anteriorme ostrado que la unión de sustancias aglutina ina a proteínas o péptidos incrementa potencialn media en el plasma de las proteínas o péptid de sustancias aglutinantes de albúmina típ a de ácidos grasos, debido a que la albúmina es arse a moléculas sumamente hidrófobas.
Por lo tanto, los compuestos que tienen una mecanismos de prolongación tal como el en ífico a capas de lípidos, etcétera.
En algunas modalidades, las preparaciones nte invención exhiben una biodisponibilidad rel lo menos aproximadamente 110%, preferiblemente aproximadamente 120%, más preferiblemente por imadamente 130% y mucho más preferiblemente por imadamente 140% de la biodisponibilidad de la dificada, correspondiente. La biodisponibilidad en cualquier especie de mamífero, preferi S, y los tiempos predeterminados que se utiliz lar la AUC pueden incluir diferentes incremento os - 8 horas. La biodisponibilidad se puede me lo, en un modelo de perro de la siguiente ma rimento se realiza como un estudio cruzado de S en 12 perros Beagle divididos en cuatro grupo .
En una modalidad, el grupo modificador comp ado de ácido graso. En una modalidad adicional, icador comprende un derivado de ácido graso de 1 arbono, 14 átomos de carbono, 16 átomos de carb s de carbono y 20 átomos de carbono. Sin ser na teoría, y como se mencionara previamente, se lbúmina, la cual está presente en gran cantida e, enlaza los ácidos grasos moleculares peque dades de micro a nanomolares. La albúmina func cuencia como una molécula portadora, la cual pr ido de la eliminación renal, anticuerpos neutral inación mediada por receptores o ataque proteolít anto, la presente invención proporciona anál r de coagulación de la sangre conjugados que S medias en el plasma in vivo increment uiera de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 0, 21, 22, 23, 24, 25; y presenta alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, lfenilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquiltetraz 0 átomos de carbono o alquilcarboxilo de 1 a 20 rbono .
En una modalidad, R1 representa -COO senta un número entero seleccionado de 12 a ío 12, 14, 16 o 18) .
En una modalidad, el grupo modificador comp de la fórmula (III) : (??) una modalidad, el grupo modificador res de coagulación de la sangre se pueden prepa de la oxidación directa (por ejemplo co dico) cuando las porciones de glicano están pres ctor de coagulación de la sangre (como se descri entó O 2008/025856) o son eliminadas de manera permitir la oxidación con galactosa oxidasa ( ibe en el documento WO 2005/014035) . En el caso esiduo expuesto de galactosa o ácido siálico nte en el factor de coagulación de la sangre n ser galactosilados o sialilados antes de la o zando galactosiltransferasa o sialiltransferasa .
En una modalidad alternativa, el grupo mod ende una porción de conjugación seleccionada on de maleimida o haloacetato. Estas porci mida y haloacetato serán adecuadas para la conju variedad de factores de coagulación de la doso del potencial de redox (GSSG/GSH) en prese rredoxina. Las cisteínas expuestas en la su én pueden ser desbloqueadas químicamente por me de por ejemplo agentes de reducción a base de como tricarboxietilfosfina o tris(3-su )fosfina (como se describe en el d 6/0115876) . Los tioles libres en el fac lación también se pueden hacer reaccionar con ados tales como sulfuros activados con tiopiridi r disulfuros mezclados.
En modalidades alternativas, el fac lación de la sangre se puede conjugar al icador utilizando la oxidación de serina N- da por ejemplo por la oximacion (como se descri entó O 2006/122982) , transpeptidación C- zando carboxipeptidasa (como se describe en el d zar en el tratamiento de enfermedades aliviadas istración de factores de coagulación de la sang ío FVII(a), FVIII o FIX) , tal como un trast ado por ejemplo hemofilia, una enfermedad de la trosis, hematomas, sangrado mucocutáneo, enferm sangre heredada, trastorno de sangrado f medad de la sangre familiar o terapia de reemp res. En una modalidad, la enfermedad aliviada istración de un factor de coagulación de la sang ilia, tal como hemofilia B o enfermedad de Chris De esta manera, de acuerdo con un aspecto a a invención se proporciona un método para tr ilia el cual comprende administrar a un pacie dad terapéuticamente efectiva de un fac lación de la sangre conjugado como se iormente en este documento. se define anteriormente en este documento para e atamiento de la hemofilia.
Se debe entender que los regímenes terapé lácticos (preventivos) representan aspectos sepa ésente invención. En particular, se debe entende nte invención proporciona factores de coagulaci e conjugados con vidas medias en el plasma incre cuales los hacen deseables para el tra il ctico de la hemofilia. Este tratamiento prof a hemofilia constituye una modalidad preferid ción.
De acuerdo con un aspecto adicional ción, se proporciona una formulación farmacéut rende un factor de coagulación de la sangre c se define anteriormente en este documento.
La formulación puede comprender además un paciente agrega solventes y/o diluyentes antes d En una modalidad, la formulación farmacéu ormulación seca (por ejemplo secada por congela a por pulverización) que está lista para el na disolución anterior.
En una modalidad, la invención se refier lación farmacéutica que comprende una solución a actor de coagulación de la sangre conjugado nte invención, y un amortiguador, en donde el f lación de la sangre conjugado está presente ntración de 0.1-100 mg/ml y en donde la for un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente En una modalidad de la invención, el p lación se selecciona de la lista que consiste 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4 lino) ropanosulfónico (MOPS) ácido lino) etanosulfónico (MES); ácido N-ciclo propanosulfónico (CAPS) ; ácido N-Ciclo etanosulf nico (CHES) ; histidina, glicina, ina, fosfato diácido de sodio, fosfato ácido de to de sodio y tris (hidroximetil) -aminometano, na, ácido málico, succinato, ácido maleico, ico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas s . Cada uno de estos amortiguadores esp ituye una modalidad alternativa de la invención.
En una modalidad de la invención, la for ende además un inhibidor de sitios activos.
En una modalidad de la invención, la for rende además un conservador farmacéuticamente ac una modalidad de la invención, el conserv cciona del grupo que consiste de fenol, o-cre presente en una concentración de 0.1 mg/ml a 20 na modalidad de la invención, el conservad nte en una concentración de 0.1 mg/ml a 5 mg/ml. idad de la invención, el conservador está pres oncentración de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En una moda invención el conservador está presente ntración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno d rvadores específicos constituye una m nativa de la invención. El uso de un conserv siciones farmacéuticas es bien conocido para la ta. Por conveniencia, se hace referencia a Re cience and Practice of Pharmacy, 20a edición, 200 En una modalidad de la invención, la for ende además un agente isotónico. En una modalid ción, el agente isotónico se selecciona del g iste de una sal (por ejemplo cloruro de sodio) , u losa, dextrano, pululano, dextrina, ciclod on soluble, almidón de hidroxieti ximetilcelulosa-Na . En una modalidad, el adi r es sacarosa. El alcohol de azúcar se define carburo de 4 a 8 átomos de carbono que tiene un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, s tol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. idad, el aditivo de alcohol de azúcar es manit res o alcoholes de azúcar mencionados anterior n utilizar individualmente o en combinación. N imite fijo para la cantidad utilizada, siempre zúcar o alcohol de azúcar sea soluble en la pre da y no afecte de manera adversa los ilizantes logrados utilizando los métodos ción. En una modalidad, la concentración del ol de azúcar está entre aproximadamente 1 idad alternativa de la invención. El uso de un nico en composiciones farmacéuticas es bien la persona experta. Por conveniencia, se hace re mington: The Science and Practice of Pharma on, 2000.
En una modalidad de la invención, la for ende además un agente quelatante. En una modalid ción, el agente quelatante se selecciona de s etilendiaminotetraacético (EDTA) , ácido cítrico tico, y mezclas de los mismos. En una modalida ción, el agente quelatante está presente ntración de 0.1 mg/ml a 5 mg/ml. En una modalid ción, el agente quelatante está presente ntración de 0.1 mg/ml a 2 mg/ml. En una modalid ción, el agente quelatante está presente ntración de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada uno de estos gton: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Más particularmente, las composiciones ción son composiciones farmacéuticas, l ilizadas cuyos componentes terapéuticamente yen un polipéptido que exhibe posiblemente la f gregados durante el almacenamiento en formu céuticas líquidas. Por "formación de agrega ne una interacción física entre las moléc éptido que da por resultado la formación de oli cuales pueden permanecer solubles o agregados v es que se precipitan de la solución. Por "dur enamiento" se propone una composición o for céutica, líquida que una vez preparada no se ad iatamente a un sujeto. Preferiblemente, despué araci0n, se empaca para el almacenamiento, ya , Reino Unido), páginas 491-676; Broadt oradores (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169- thaler y colaboradores (1994) Pharm. Res. 11:12 o con aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology y Roser (1991) Biopharm. 4:47-53).
La formación de agregados por un pol te el almacenamiento de una composición farma da puede afectar adversamente la actividad biol polipéptido, dando por resultado la pérdida de éutica de la composición farmacéutica. Adicion ormación de agregados puede causar otros problem el bloqueo de la tubería, membranas o bombas c sición farmacéutica que contiene el polipép istra utilizando un sistema de infusión.
Las composiciones farmacéuticas de la i en comprender además una cantidad de una ntes en sus formas de bases libres mientras qu presentes en sus formas de sales. En una modali ácidos para el uso en la preparación siciones de la invención son aquellos que lle a lateral cargada, tales como arginina, lisina tico y ácido glutámico. Cualquier estereoisóm , L, D o mezclas de los mismos) de un am cular (por ejemplo metionina, histidina, i ina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, tri ina y mezclas de los mismos) o combinaciones eoisómeros , pueden estar presentes en las compo céuticas de la invención siempre y cuando el am cular esté presente ya sea en su forma de base forma de sal. En una modalidad, se utiliza eoisómero. Las composiciones de la invención ta n formular con análogos de estos aminoácid análogos de aminoácidos se incorporan siciones en ya sea su forma de base libre o su En una modalidad de la invención, los aminoá gos de aminoácidos se utilizan en una concentra es suficiente para prevenir o retardar la agreg oteína .
En una modalidad de la invención, la metio aminoácidos sulfúricos o análogos de aminoáci agregar para inhibir la oxidación de los resi nina a sulfóxido de metionina cuando el polipép como el agente terapéutico es un polipépt ende por lo menos un residuo de metionina susce oxidación. Por "inhibir" se propone la acu a de especies oxidadas de metionina a través del nhibición de la oxidación de metionina da por r mayor retención del polipéptido en su forma m nina de tal manera que la relación de metionina S residuos de metionina varía de aproximadament imadamente 1000:1, tal como de 10:1 a aproxim .
En una modalidad de la invención, la for ende además un estabilizador seleccionado del eros de alto peso molecular o compuestos de b ular. En una modalidad de la invención, el estab elecciona de polietilenglicol (por ejemplo PEG ol polivinílico (PVA) , polivinilpirrolidona, oxicelulosa o derivados de la misma (por ejem L, HPC-L y HPMC) , ciclodextrinas , sustanc ienen azufre como monotioglicerol , ácido tiogli tiltioetanol y diferentes sales (por ejemplo cí ) . Cada uno de estos estabilizadores esp tituye una modalidad alternativa de la invención. lamiento-descongelamiento o el esquileo mecánico.
En una modalidad de la invención, la for ende además un surfactante . En una modalidad ción, el surfactante se selecciona de un dét e de ricino etoxilado, glicéridos poliglico licéridos acetilados, ásteres de ácidos gr tan, polímeros de bloque de polioxipr xietileno (por ejemplo poloxámeros tales como poloxámero 188 y 407, Tritón X-100) , esteres d s de polioxietilen-sorbitan, derivados de poliox lietileno tales como derivados, alquilados y ale ns, por ejemplo Tween-20MR, Tween-40MR, Tween-80MR , monoglicéridos o derivados etoxilados de los icéridos o derivados de polioxietileno de los oles, glicerol, lecitinas y fosfolípidos (por tidil-serina, fosfatidil-colina , fos icaciones del grupo principal polar, que es laminas, ácido fosfatídico, serinas, tre rol, inositol y DODAC, DOTMA, DCP, osfatidilserina y lisofosfatidiltreonina con iva y glicerofosfolípidos (por ejemplo cef roglicolípidos (por ejemplo galactopir goglicolípidos (por ejemplo ceramidas, gangli ilfosfocolina, lisolecitina de huevo de ados de ácido fusídico (por ejemplo rofusidato de sodio etcétera) , ácidos grasos de y sales de los mismos de 6 a 12 átomos de carb ío ácido oleico y ácido caprílico) , acilcarni ados, derivados Na-acilados de lisina, argi dina o derivados acilados de cadena lateral de ina, derivados ?a-acilados de dipéptidos que co uier combinación de lisina, arginina o histidi o de sodio, desoxicolato de sodio, taurocol , glicocolato de sodio, N-hexadecil-N,N-di o-l-propanosulfonato, surfactantes monovalen il-aril-sulfonatos) aniónicos, surfa eriónicos (por ejemplo N-alquil -N, N-dimetilam nosulfonatos , 3 -colamido- l-propildimetila nosulfonato , surfactantes catiónicos {bases de rnario) (por ejemplo bromuro de cetil -trimeti ro de cetilpiridinio) , surfactantes no iónic ío ß-D-glucopiranosida de dodecilo) , poloxamin ío Tetronic's), las cuales son copolímeros de funcionales derivados de la adición secuencial ropileno y óxido de etileno a etilendiamin ctante se puede seleccionar del grupo de deri zolina, o mezclas de los mismos. Cada uno d ctantes específicos constituye una modalidad alt es de carga, modificadores de tonicidad, tantes, iones de metal, vehículos oleaginosos, p ejemplo, albúmina de suero humano, gelatina o pr zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal como na, arginina, glicina, lisina e histidina) . dientes adicionales, por supuesto, no deben samente la estabilidad total de la for céutica de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas que conti r de coagulación de la sangre conjugado de la ción se pueden administrar a un paciente neces tratamiento en varios sitios, por ejemplo, en os, por ejemplo, la piel y sitios de mucosi s los cuales desvían la absorción, por ejem istración en una arteria, en una vena, en el c itios los cuales involucran la absorción, por ejei s de la conjuntiva, uretal y parenteral a p itados de este tratamiento.
Las composiciones de la invención actual s istrar en varias formas de dosificación, por soluciones, suspensiones, emulsiones, microemu ión múltiple, espumas, bálsamos, pastas, em ntos, tabletas, tabletas recubiertas, en las, por ejemplo cápsulas de gelatina dura y cáp ina suave, supositorios, cápsulas rectales, , pulverizaciones, polvo, aerosoles, inhalantes los ojos, ungüentos oftálmicos, enjuagues oft rios vaginales, anillos vaginales, ungüentos va ción para inyección, soluciones de transforma , por ejemplo gelificación in situ, endurecimi , precipitación in situ, cristalización in situ, nfusión e implantes. ampo e incrementar el apego del paciente o c nación de los mismos. Los ejemplos de por mas de suministro de fármacos y sistemas de su ármacos avanzados incluyen, pero no están limit eros, por ejemplo celulosa y derivados, polisa ejemplo dextrano y derivados, almidón y de ol poli (vinílico) , acrilato y polímeros de meta poliláctico y poliglicólico y co-polímeros de mismo, polietilenglicoles , proteínas portador ío albúmina, geles, por ejemplo, siste gelificación, por ejemplo sistemas co-polimér e bien conocidos para aquellas personas experta , micelas, liposomas, microesferas , nanopar ales líquidos y dispersiones de los mismos, fa rsiones de la misma, bien conocidos para nas expertas en el campo del comportamiento de l sitivos son bien conocidos para aquellas tas en el campo.
Las composiciones de la invención act ialmente útiles en la formulación de sist istro de fármaco de liberación controlada, so ngada, retardada y lenta. Más específicamente ado a, las composiciones son útiles en la formul mas de liberación controlada y liberación s teral (ambos sistemas conducen a una reducción d en el número de administraciones) , bien conoci ias personas expertas en el campo. A riblemente, son sistemas de liberación contr ación sostenida administrados por la ruta sub limitar el alcance de la invención, los ejem mas y composiciones de liberación controlada út hidrogeles, geles oleaginosos, cristales l isión y procesos de fluidos supercríticos . encia general a Handbook of Pharmaceutical Co se (Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, Nueva York, and the Pharmaceutical Sciences volumen 99: lation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel York, 2000) .
La administración parenteral se puede reali de una inyección subcutánea, intram peritoneal o intravenosa por medio de una j nalmente una jeringa similar a un l nativamente, la administración parenteral s zar por medio de una bomba de infusión. Una onal es una composición la cual puede ser una so nsión para la administración del péptido de la ción en la forma de una pulverización nasal o p una opción aún adicional, las compo ca incrementada.
El término "estabilidad física" de la com oteína como se utiliza en este documento se refi ncía de la proteína a formar agregados biológ ivos y/o insolubles de la proteína como resulta ición de la proteína a tensiones termomecáni acción con interfases y superficies q tabilizante , tales como superficies e in fobas. La estabilidad física de las composici ína acuosas se evalúa por medio de la inspecció las mediciones de turbidez después de exp sición vertida en contenedores adecuados (por chos o frasquitos) a tensión mecánica/físi lo agitación) a diferentes temperaturas durant dos de tiempo. La inspección visual de las compo ealiza en una luz enfocada , bien definida con sición se puede evaluar por medio de mediciones urbidez bien conocidas para la persona expe ilidad física de las composiciones de proteína én se puede evaluar por medio del uso de un troscópico o sonda del estado conformacional ína. La sonda es preferiblemente una molécula e enlaza preferentemente a un confórmero no nati ína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica, mo ña de la estructura de la proteína es la Tiofl ioflavina T es un tinte fluorescente que izado ampliamente para la detección de f ides. En presencia de las fibrillas, y quizás S configuraciones de proteínas, la Tioflavina T d nuevo límite superior de excitación a aproxim nm y una emisión mejorada a aproximadamente 482 ni nlaza a una forma de proteína de fibrilla. La Ti roteína comienza a desplegarse o desnaturalizar íos de estas sondas espectroscópicas , mole ñas son tintes hidrófobos aromáticos, tale ceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras troscópicas son complejos de metal-aminoácido complejos con metal de cobalto de ami fobos, tales como fenilalanina, leucina, iso nina y valina o similares.
El término "estabilidad química" de la com proteína como se utiliza en este documento se r os covalentes químicos en la estructura de la conducen a la formación de productos de deg ea con una posible potencia biológica menor y/o edades inmunógenas incrementadas en comparación ctura de la proteína nativa. Varios produ dación química se pueden formar dependiendo del aginilo es hidrolizado para formar un ácido car . Otras vías de degradaciones involucran la form ctos de transformación de alto peso molecular d s moléculas de proteínas se enlazan covalentemen través de la transamidación y/o interacci furo que conducen a la formación de produ dación diméricos, oligoméricos y poliméricos e entemente {Stability of Protein Pharmaceuticals, & Manning M.C., Plenum Press, Nueva York 19 ción (por ejemplo de los residuos de metionina) ionar como otra variante de la degradación quí ilidad química de la composición de proteína ar al medir la cantidad de los productos de deg ica en varios puntos de tiempo después de la expo rentes condiciones ambientales (la formación de egradación se puede acelerar frecuentemente por mentada o estabilidad física y química increment al, una composición debe ser estable durante el enamiento (de conformidad con las con endadas de uso y almacenamiento) hasta que se al de caducidad.
En una modalidad de la invención, la com céutica que comprende el conjugado de proteín la (I) es estable durante más de 6 semanas d te más de 3 años de almacenamiento.
En otra modalidad de la invención, la com céutica que comprende el conjugado de proteín la (I) es estable durante más de 4 semanas d te más de 3 años de almacenamiento.
En una modalidad adicional de la invenc sición farmacéutica que comprende el conju ína de la fórmula (I) es estable durante m o y durante más de seis meses de almacenamiento. os generales de preparación Las porciones A-W-B- se pueden unir enzimát oteínas, o por vía de un grupo reactivo quím ión del grupo reactivo depende de la funci nte en la sustancia aglutinante de albúmin onalidad en la proteína a modificar.
Grupos reactivos químicos es activados Los ésteres activados son en general r funciones de amino, tales como los grupos amino s residuos de lisina y el grupo amino presente nal de la cadena de péptido/proteína. + encía de ciclodextrina o un deriva odextrina . amiento a grupos tiol libres Las proteínas pueden contener grupos tiol e pueden hacer reaccionar con sustancias aglutin ina derivatizadas con maleimida como se il nuación : Otros grupos reactivos tiol cetamidas, por ejemplo yodoacetamidas o bromoac pos S-tiopiridilo.
En una modalidad, una proteína, que cont tiol libre se hace reaccionar con una s tinante de albúmina insoluble en agua funcionali zina o hidrazidas se puede acoplar subsecuenteme ína como se ilustra a continuación: oxidación na Proteína - CHO NH20-B-W-A En una modalidad, una proteína se oxida de ene una funcionalidad de aldehido y se hace re cuentemente con una sustancia aglutinante de uble en agua funcionalizada con un grupo hidrox olución acuosa en presencia de ciclodextrin ado de ciclodextrina.
Acoplamientos enzimáticos Las sustancias aglutinantes de albúmina se lar a proteínas utilizando enzimas, sa oxidasa Las glicoproteínas que contienen termin ción .
Remodelación opcional Galactosa Oxidasa Proteína - CHO NH20-B-W-A Proteína - CH=N-0-B-W-A En una modalidad, una glicoproteína s zando galactosa oxidasa de modo que conti onalidad de aldehido y se hace re cuentemente con una sustancia aglutinante de uble en agua funcionalizada con un grupo hidrox olución acuosa en presencia de ciclodextrin ado de ciclodextrina . glutaminasa La transglutaminasa (E . C . 2 . 3 . 2 . 13 ) tamb cida como proteína-glutamina-y-glutamiltransfe liza la reacción general siduo de glutamina y Q' -NH2 representa un nucleó ene amina como se indica anteriormente.
Los ejemplos de transglutaminasas útiles glutaminasas microbianas, tales como por ias de Streptomyces mojbaraense, Streptomyces cin reptomyces griseocarneum (todas dadas a conoce entó US 5,156,956, el cual se incorpora ento a manera de referencia) y de Stre dulae (dada a conocer en el documento US 5,252, se incorpora en este documento a manera de refer tomyces ladakanum (documento JP 2003/199569, el pora en este documento a manera de referencia) . rvar que los miembros del género toverticillium ahora están incluidos en el tomyces (Kaempfer, J". Gen. Microbiol . 137. 1 1) ) . Otras transglutaminasas microbianas útiles glutaminasas de varias fuentes marinas como el p s major (dadas a conocer en el documento EP-0555 se incorpora en este documento a manera de refer stra japonesa Crassostrea gígas (dada a conoce entó US 5,736,356, el cual se incorpora entó a manera de referencia) .
NH3 En una modalidad, una proteína se tr glutaminasa y una sustancia aglutinante de uble en agua derivatizada con una asa de amina, ión acuosa en presencia de ciclodextrina o un clodextrina . xipeptidasa Y Las proteínas se pueden modificar en su C- En una modalidad, una proteína se tr xipeptidasa Y y N6- (4-acetilbenzoil) lisina, seg sustancia aglutinante de albúmina insoluble atizada con un asa de aminoxi , en solución ac ncia de ciclodextrina o un derivado de ciclodext = milibar miligramo (s) minuto (s) mililitro (s) milimolar milímetro (s) = milimol (es) = nanomol (es) mol (es) Peso molecular ormal nanómetro (s) segundo (s) partes por millón ionización de electropulverización = intravenoso = subcutáneo tiempo de retención terc-butiloxicarbonilo = éster terc-butílico tere-butilo -ABZ-OH = ácido 4 - terc-butoxicarbonilamino-benzo í = acetonitrilo diclorometano, CH2C12/ cloruro de metileno diisopropilcarbodiimida = N, N-diisopropiletilamina N, N-dimetilformamida = sulfóxido de dimetilo ditiotreitol = clorhidrato de l-etil-3- (3 -dimetilamino diimida = éter dietílico , 3 -tetrametiluronio = l-Hidroxi-7-azabenzotriazol = 1-hidroxibenzotriazol = acetonitrilo = metanol = cloruro de sodio = hidróxido de sodio N-metilpirrolidin-2 -ona ácido (2 [2 - (amino) etoxi] etoxi ) acético = éster terc-butílico ácido trifluoroacético tetrahidrófurano triisopropilsilano trifenilmetilo - tetrafluoroborato de O- (N-succinimidil) -metil -uranio roforesis capilar La electroforesis capilar se llevó zando un sistema Agilent Technologies 3DCEMR ologies) . La adquisición de datos y el procesam ñal se realizaron utilizando el software ChemSt nt Technologies 3DCEMR. El tubo capilar fue de itud eficiente de 56.0 cm) 50 µt? identi nded Light Path Capillary" de Agilent. La dete ción ultravioleta se realizó a 200 nm (16 encia 380 nm y 50 nm Bw) . El electrolito de co amortiguador de fosfato 50 mM pH 7 (método A) . ar se acondicionó con NaOH 0.1 M durante 3 con agua Milli-QMR durante 2 minutos y rolito durante 3 minutos. Después de cada conduc capilar se enjuagó con agua Milli-QMR durante 2 con ácido fosfórico durante 2 minutos y con agu LC El análisis de RP-HPLC se realizó en un nt 1100 utilizando una columna de sílice C-18 mm x 250 mm Vydac 218TP54MR (The Separations ria) . La detección fue por medio de r violeta a 214 nm, 254 nm, 280 nm y 301 nm. La co ibró con 0.1% de ácido trifluoracético/H20 y la luyó por medio de un gradiente adecuado de 0 a nitrilo contra 0.1% de ácido trifluoracético/H20.
El análisis de LC-MS se realizó en un espec masas PE-Sciex API 100MR o 150MR equipado bombas Perkin Elmer Series 200MR, un toma ático Perkin Elmer Series 200MR, un dete ción ultravioleta Applied Biosystems 785AMR ctor de dispersión de Luz Evaporativo Sedex 7 API 100 . El rango de masa 300 - 2000 amu se 2 segundos durante la conducción, ificación de proteína Las concentraciones de proteína se calcul la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrof diación ultravioleta NanoDrop ND-1000MR. grafía enzimática de péptidos para la determin (s) de derivatización La cartografía de péptidos se realizó utili ti n con Asp-N de la proteína reducida y al ro, la proteína se trató con DTT y yodoaceta do con los procedimientos estándar. El iado se purificó utilizando HPLC. Subsecuentem cto purificado, alquilado se digirió durante con endoproteasa Asp-N (Boehringer) en una reí a : substrato de 1:100. La digestión se separó p trogen NP0321BOX) . Los geles estaban teñidos co trogen LC6100) o teñidos con Coomassie (In 5) y donde fue relevante también estaban teñidos oduro de bario como es descrito por M. M. Kurf . Biochem. 200(2), 244-248, (1992). tografía de proteínas La cromatografía de proteínas se realizó ma cromatográfico Ákta ExplorerMR y columnas h Care . El intercambio aniónico se realizó ut olumna Q-Sepharose HP 26/10MR. El amortiguador d amortiguador de trietanolamina 20 mM pH 8. iguador de elución fue el amortiguador de inici M. Los compuestos se eluyeron típicamente íente de 0-75% de amortiguador de elución s enes de columna. La desalinización y el interc tiguador se realizaron utilizando una columna La sustancia aglutinante de albúmina (1) se medio de la síntesis de fase sólida conv zando resina de cloruro de 2-clorotritilo : La r ó en DCM luego se agregó un exceso de 10 veces de a- 1, 13 -diamina. Después del lavado, el Fmoc-Glu( Glu-OtBu y Fmoc-Thex-OH (ácido transámico) se a a secuencial y se desprotegió utilizando HOBt/DI piperidina-DMF . Finalmente, el diácido de etamente desprotegido se acopló en exceso ut DIC, lutidina. La sustancia aglutinante de se separó de la resina utilizando 10% de TFA en D (a) - Procedimiento Alternativo La resina de 2-clorotritilo (2.0 g, 2,6 ó en DCM durante ½ hora. Una solución de 4,7,10 -diamina en DCM (30 mi) se agregó. La resina se ratura ambiente durante 1 hora. La resina se . Una solución de Ac20/DIPEA/NMP (1:1:5) se agr a se agitó a temperatura amiente durante 10 min a se lavó (5x MP y 5xDCM) . La resina luego se t de piperidina-NMP durante 2x10 minutos y final con 5xNMP y 5xDCM. El péptido entonces se agre ión 0.25 M de diácido de eicosano (6 eq. ) que 0.125 M (3 eq.), DIC 0.125 M (3 eq.) y lutidina q.) . La resina se agitó a temperatura ambiente d . La resina se lavó con 5xNMP y 8xDCM. El prod eparó de la resina utilizando 10% de TFA-DCM du os. La resina se filtró y la resina se trató una 10% de TFA-DCM durante 20 minutos adiciónal ctos filtrados combinados se recolectaron y se t dad . (b) - Preparación de Sustancia Aglutinante de ionalizada con Maleimida (2) stalización en acetonitrilo, el compuesto de la e obtuvo como un polvo fino de color blanco, (b) - Procedimiento Alternativo El producto del paso (a) anterior se diso (6 mi) y se agregó ácido 3 -maleimidopropiónico TSTU (hecho previamente al hacer reaccionar T 3 -maleimidopropiónico en DMF (2 mi) durante 45 PEA (200 µ?) . La mezcla se agitó a temperatura te 1 hora. La mezcla de reacción luego se lle dad. El residuo se disolvió en 95% de TFA-agua agitó a temperatura ambiente durante 20 minu 1a se llevó a la sequedad. Al residuo se agregó u ua para precipitar los sólidos. Los sólidos se f recristalizaron en acetonitrilo. Los crist lectaron y se lavaron extensivamente con éter die (c) - Conjugación de Sustancia Aglutinante de a 25 °C. La autoactivación y la conjugación sele s pesadas se confirmaron por medio de ición reductiva) . ío 1 1. Preparación de sustancias aglutinan ina (II) tor de Tetrazol OEG (lia) : (Ha) El conector de tetrazol OEG (lia) se sint do con el esquema de reacción 1. ma de Reacción 1 4) Fm«A 2 g de resina de amida Rink (2 g, 0.6 mMo on en un matraz. La resina se hinchó con NMP (3 te 2 horas .
Remoción del grupo Fmoc : La resina se agitó peridina en NMP (30 mL) durante 10 minutos. La r y se trató con 25% de piperidina en NMP (30 mL) ra seguido por el drenaje y el lavado con NMP El Fmoc-Lys (Mtt) -OH y HOBT se pesaron en un ma vieron en azul de bromofenol en NMP (30 mL, 0 solución se agregó a la resina drenada anterior la adición de DIC. La reacción se agitó a tem nte durante 21 horas. La resina se drenó y se (6 x 30 mL) seguido por el lavado con DCM (3 x 30 La resina se trató con hexafluorisopropanol te 10 minutos. Se agitó durante 10 minutos. La r y se lavó con DCM (3 x 30 mL) . La resina se t ión del grupo Fmoc : La resina se agitó con idina en NMP (10 mL) durante 10 minutos. La re y se trató con 25% de piperidina en NMP (10 mL) a seguido por el drenaje y el lavado con NMP El Fmoc-OEG-OH y HOBT se pesaron en un mat vieron en azul de bromofenol en NMP (15 mL, 0 solución se agregó a la resina drenada seguido on de DIC. La reacción se agitó a temperatura te 23 horas. La resina se drenó y se lavó con ? ) . Remoción del grupo Fmoc : La resina se agitó peridina en NMP (10 mL) durante 10 minutos. La r y se trató con 25% de piperidina en NMP (10 mL) ra seguido^ por el drenaje y el lavado con NMP El Fmoc-Glu-0- t-Bu y HOBT se pesaron en un MP (6 x 15 mL) .
El Fmoc-Glu-O- -Bu y HOBT se pesaron en un solvieron en 15 mi de azul de bromofenol 0.5 mM solución se agregó a la resina drenada seguido on de DIC. La reacción se agitó a temperatura te 18 horas. La resina se drenó y se lavó con N ) . Remoción del grupo Fmoc : La resina se agitó peridina en NMP (10 mL) durante 10 minutos. La r y se trató con 25% de piperidina en NMP (10 mL) ra seguido por el drenaje y el lavado con NMP El Fmoc-OEG-OH y HOBT se pesaron en un mat vieron en azul de bromofenol en NMP (15 mL, 0 solución se agregó a la resina drenada seguido on de DIC. La reacción se agitó a temperatura a esina se drenó y se lavó con NMP (6 x 15 mL) . nte durante 21 horas. La resina se drenó y se (6 x 15 mL de NMP) seguido por el drenaje y el la (6 x 15 mL) .
La resina se separó con una mezcla de 95% d (10 mL) + DCM (0.25 mL) y TIPS (0.25 mL) . La r durante 2 horas a temperatura ambiente. Se fi dietílico frío (75 mL) . El producto pre tante se aisló por medio de la centrifugación el lavado con éter dietílico (3 x) y el secado te 48 horas proporcionando 300 mg del compue IO crudo .
S: t = 4.7 minutos, masa 1268.71 El compuesto del título crudo se purificó en pr SON) . T2145-10; 30->80% de eCN. Las fr iadas se evaporaron hasta la sequedad en un ev torio y el residuo se disolvió en H20/MeCN 1:1 y ío 3 De manera similar a aquella descrita en el terior y representada posteriormente, el s esto se preparó utilizando resina de Boc-Gly-P ial de partida. 1) TFA 1 ) Fmoc-OEG-OH 1 ) Fmoc-Glu(Oí-Bu)-0H PAM » H N-Gly-PAM H 2N -OEG- OEG-G ly-P AM NHj-Glu-OEG-OEG-Gly-PA 2) DMF ' 2K 2) Piperidina 2) Piperidina 1) 1u(OH)-0tBu NH gGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-PAM a 1 ) 2) TFA ío 5 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Lys (Mtt ) -OH y resina de amida Rink.
S: masa 1320.67 lo 6 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut -Lys (Mtt ) -OH y resina de amida Rink.
MS: masa 2114.64 plo 7 terior, el siguiente compuesto se preparó ut Lys(Mtt)-OH y resina de amida Rink.
S: masa 823.05 ío 9 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Lys (Mtt ) -OH y Resina Wang.
S: masa 980.22 lo 10 De manera similar a aquella descrita en el Lys (Mtt) -OH y resina de amida Rink.
S: masa 1258.51 ío 12 De manera similar a aquella descrita en terior, el siguiente compuesto se preparó Lys (Mtt ) -OH y Resina Wang.
S: masa 1269.49 ío 13 De manera similar a aquella descrita en terior, el siguiente compuesto se preparó -Lys (Mtt ) -OH y resina de amida Rink.
O^NH, S: masa 863.07 ío 15 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Lys (Mtt) -OH y resina de amida Rink.
S: masa 855.07 ío 16 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut -Lys (Mtt ) -OH y resina de amida Rink. lo 18 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Lys(Mtt)-OH y resina de amida Rink.
S: Rt = 4.7 minutos, masa 1267.45 ío 19 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Lys(Mtt)-0H y resina de amida Rink.
S: masa 1310.67 lo 20 De manera similar a aquella descrita en el Glu (ODmab) -OH y resina de cloruro de 2 -clorotriti S: masa 1235.56 ío 22 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Glu (ODmab) -OH y resina de cloruro de 2 -clorotrit S: masa 1173.40 lo 23 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut -Lys (Mtt ) -OH y resina de amida Rink.
.OH °-¾s^NH_ ío 25 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó ut Glu (ODmab) -OH y resina de cloruro de 2-clorotrit S: masa 1182.34 ración de compuestos de GH- sustancia aglutin ina : lo 26 1. Acoplamiento del compuesto de GH transa da (I) con una sustancia aglutinante de albúmina Se preparó la siguiente solución: Amortiguador A: La trietanolamina (119 t ) se disolvió en agua (40 mL) y el pH se ajustó a Amortiguador B: Trietanolamina 20 mM; NaCl iguador A (500 mL) con agitación. A esta solu ó lentamente una mezcla de DAP (8.1 g) iguador A (50 mL) . El pH de la mezcla result ó a 8.5 por medio de la adición de HC1 acuoso. mL, 1.3 mg/mL) se agregó mientras se mezclaba. L se agitó durante toda la noche a temperatura am La mezcla de reacción se diluyó con el amor .2 L) y el producto (IV) se purificó por medi tografía de intercambio iónico. 100 ml/minuto ae. Amortiguador del Paso B 40% - gradiente de mortiguador B durante 15 CV = 225 minutos.
Oxidacion de la hGH transaminada (IV) Gln i Gln14' vió en agua (1.0 mL) . A una solución del compu mg, 0.5 µp???) se agregó el Amortiguador B ( do por la solución de peryodato (0.03 mL) . Despu os de incubación en frío, la mezcla se dializó l amortiguador C. El residuo se concentró hasta 1 (C) Aminación reductiva del compuesto (I) ncia aglutinante de albúmina (II) La sustancia aglutinante de albúmina (II) s se describe en el ejemplo 1 hasta el ejemplo ión final del paso (B) (1 mL, 10 mg, 0.45 µp??? ó con una solución de la sustancia aglutin de la elución de la columna con un gradiente de ío 27 De manera similar a aquella descrita en el iterior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 2.
S: masa 23.473,81 ío 28 De manera similar a aquella descrita en el nterior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 4.
S: masa 23.428 terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 6.
S: masa 24.265,71 ío 31 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 7.
S : masa 23.686 , 83 lo 32 De manera similar a aquella descrita en el ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 9.
S: masa 23.131,31 ío 34 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 10.
S: masa 23.002 ío 35 De manera similar a aquella descrita en el nterior, el siguiente compuesto se preparó utili S: masa 23.420,58 ío 37 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 13.
S : masa 22.992 , 13 lo 38 De manera similar a aquella descrita en el nterior, el siguiente compuesto se preparó utili ancia aglutinante de albúmina del Ejemplo 14.
S : masa 23.006 , 15 ío 40 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 16.
S: masa 23.034,18 lo 41 De manera similar a aquella descrita en el nterior, el siguiente compuesto se preparó utili ancia aglutinante de albúmina del Ejemplo 17.
S : masa 23.333 ío 43 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 19.
S: masa 23.461,75 ío 44 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 20.
S: masa 23.459,67 terior, el siguiente compuesto se preparó utiliz ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 22.
S: masa 23.324 , 8 ío 47 De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 23. masa 22.841 48 De manera similar a aquella descrita en el nterior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 24.
S: Rt = 4.7 minutos, masa 1268.7051 ío 50 1. Acoplamiento del compuesto saminada y oxidada (I) con una sustancia aglu Ibúmina (II) Se preparó la siguiente solución: iguador A: La trietanolamina (119 mg, 0.8 m vió en agua (40 mL) y el pH se ajustó a 8.5.
(A) Transaminación de la hGH (III) c no- 2 -propanol Gln40 Gln40 IV I Se prepararon las siguientes soluciones: De manera similar a aquella descrita en el terior, el siguiente compuesto se preparó utili ncia aglutinante de albúmina del Ejemplo 6.
Rt = 4.7 minutos, masa 23.473,81 51 1. Acoplamiento de un compuesto de GH lmente con una sustancia aglutinante de albúmi ácidoC20-Trx-'¾Glu-Glu-OEG-OEG-Gly-Glicina-amida) -eti La hGH (23 mg) se disolvió en amortigu S (2.3 mL 0.25 mM pH 7.0). El diácido C20-T OEG-OEG-Gly-Gly-dimetilacetal (2 mg, véa plo 3 anterior) se trató con TFA (50 µ?_) du tos y se evaporó hasta la sequedad in va duo se retiró con EtOH (200 µ?.) y se evapor equedad in vacuo. El residuo se disolvió en D y se agregó a la solución de hGH. Un p ipitado se formó y se disolvió de nuevo por m adición de DMF (1 mL) . Después de 1 ho ción de NaCNBH3 (20 mg, en 0.5 mL de MeCN (2 gregó en porciones y se dejó durante 20 ho OS FARMACOLOGICOS o (I) ensayo de BAF-3GHR para determinar la acti rmona de crecimiento Las células BAF-3 (una línea de células l de murino derivada de la médula ósea nalmente dependientes de IL-3 para el crecimien vivencia. La IL-3 activa en JA -2 y STAT los cu mismos mediadores que la GH está activando ulación. Después de la transfección . del recepto na de crecimiento humana, la línea de cél irtió en una línea de células dependiente de la recimiento . Este clon se puede utilizar para ev o de diferentes muestras de hormonas de cre la supervivencia de las células BAF-3GHR.
Las células BAF-3GHR se desarrollan en un ición (medio de cultivo sin hormona de crec lamar es un indicador de redox y es reducido iones innatas al metabolismo celular y, por lo rciona una medida indirecta del número de es .
Finalmente, la actividad metabólica de las edida en un lector de placas de fluorescen bancia en las muestras se expresa en % de cél uladas con el compuesto de hormona de crecimien ol y a partir de las curvas de respuest ntración se puede calcular la actividad (cantid esto que estimula las células con 50%) . de Modalidades Modalidad 1. Un proceso para preparar una icoproteína conjugada, el cual comprende los p isten en hacer reaccionar una proteína o glico una sustancia aglutinante de albúmina insoluble no (por ejemplo metilo, etilo o propilo) cada un s puede ser sustituido opcionalmente por uno s hidroxilo (por ejemplo hidroxietil-ciclodex xipropil -ciclodextrina) .
Modalidad 4. Un proceso como se define idad 3, en donde la ciclodextrina su nalmente comprende 2 -hidroxietil-P-ciclodextrina .
Modalidad 5. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, en d ula de ciclodextrina sustituida opcionalmente s a concentración entre 1% y 10% (por ejemplo 5%) .
Modalidad 6. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, el cual c reacción en una solución amortiguada acuosa, tal iguador de Hepes (por ejemplo Hepes 50 mM, NaCl 10 mM) . nde resenta una proteína o glicoproteína; resenta un separador hidrófilo; un grupo químico que une A y B; resenta un residuo de enlace a albúmina; e resenta un número entero seleccionado de 1, 2, 3 8, 9 o 10; a sal, solvato o profármaco farmacéuticamente a ismo, tal como la porción A-W-B- comprende una uble en agua .
Modalidad 9. Un proceso como se define idad 8, en donde la proteína tiene una masa m ior a 20, 000 Da.
Modalidad 10. Un proceso como se define idad 8 o la Modalidad 9, en donde la proteína re actor de coagulación de la sangre, tal como F Modalidad 13. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 12, en donde y re mero entero seleccionado de 1, 2 o 3.
Modalidad 14. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 13, en donde y re mero entero seleccionado de 2, 3, 4, 5 o 6.
Modalidad 15. Un proceso como se define idad 14, en donde y representa 2.
Modalidad 16. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 12, en donde y re Modalidad 17. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 16, en donde el s filo tiene un valor cLogP < 0.
Modalidad 18. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 17, en donde el s mi, m3 , m4 , m6 y m7 se sel endientemente de 0-10, m2 y m5 se seleccionan independientemente de ni, n2 , n3 y n4 se seleccionan independie 16, F es arilo, heteroarilo, pirrolidin-2 , 5-di los grupos arilo y heteroarilo son sus nalmente por halógeno, -CN, -OH, -C(0)OH, -)2OH o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, R1, R2, R3, R4 y R5 se sel endientemente de hidrógeno, -C(0)OH, -C(0)NH2, )2OH, -NH-C (=NH) -NH2, alquilo de 1 a 6 átomos de o heteroarilo; en donde los grupos alquilo, roarilo son sustituidos opcionalmente por h )OH, -C(0)NH2, -S(0)OH, -S(0)2OH, -CN u -OH, DI, D2 , El y E2 se seleccionan independie uiera de las Modalidades 8 a 18, en donde W t la -W7-Y-, en donde Y es - (CH2) i7-cicloalquil C3-Ci0- 8- o un en cia , 17 es 0-6, W7 se selecciona de -C(0)NH-, -NHC(0)-f -C{0 HC(O)-, -C(0)NHS (0) 2-, -S (0) 2NHC (0) - , -0 (0)0-, -C(0)CH2-, -CH2C(0)-, -C (0) CH=CH- , -CH= )s3-/ -C(0)-, -C(0)0-, -00(0)-, o un enlace de v nde s3 es 0 o 1, W8 se selecciona de -C(0)NH-, -NHC(0)-, -C( HC(0)-# -C(0)NHS(0)2-, -S (O) 2NHC (0) - , -0 (0)0-, -C(0)CH2-, -CH2C(0)-7 -C (0) CH=CH- , -CH= >s4-/ -C(0)-, -C(0)0-, -0C{0)-, o un enlace de v sentan independientemente 0-10.
Modalidad 23. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 18 a 22, en donde ni, presentan independientemente 0-10, tal como 0-6.
Modalidad 24. Un proceso como se define en c as Modalidades 18 a 23, en donde DI y D2 se sel endientemente de -0- o -NR6- o un enlace de valencia.
Modalidad 25. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 18 a 24, en donde DI -0-.
Modalidad 26. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 18 a 25, en donde DI s -NR6-.
Modalidad 27. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 18 a 26, en donde El ccionan independientemente de -0- o -NR6- o un e leccionan independientemente del grupo que cons NH-, -NHC(0)-# -C (0) NHCH2- , -CH2NHC{0)-, -C(0)N 2NHC(0)- o un enlace de valencia.
Modalidad 31. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 18 a 30, en donde R1, R2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, NH2, -S(0)20H o alquilo de 1 a 6 átomos de car el grupo alquilo es sustituido opcionalme 0H, -C(0)NH2/ -S(0)20H.
Modalidad 32. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 18 a 31, en donde (CHR1) ii-W2] ml- { [ (CH2) nl0] m2- [ (CHR2) I2-W3] m3 } n2 Y R3) !3 -W4] M4 - { [ (CH2) n30] M5- [ (CHR4) i4-W5] M6}N4- , en H2)nlO]m2- [ (CHR2)I2-W3] m3 } n2 ~ y -{ [ (CH2)n30]m5- [ (CHR4) i4 leccionan de Modalidad 33. Un proceso como se uiera de las Modalidades 8 a 32, en donde filo se selecciona de: ??? ??? lace a albúmina se enlaza de manera no covalen ina.
Modalidad 37. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, en donde el nlace a albúmina tiene una carga negativa en lógico .
Modalidad 38. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, en donde el lace a albúmina tiene una afinidad de enlace ina de suero humano que es inferior a aproximada inferior a aproximadamente 1 µ?.
Modalidad 39. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, en donde el nlace a albúmina se selecciona de un grupo al a recta, un grupo alquilo de cadena ramificada, ual tiene un grupo de ácido co-carboxílico o un Modalidad 42. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, en do ncia aglutinante de albúmina se selecciona de nde * indica la unión a B hasta W.
Modalidad 43. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 42, en donde el re e a albúmina A se une al residuo de glutamin ína P por vía del separador hidrófilo B.
Modalidad 44. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 42, en donde el re e a albúmina A se une a un residuo de cisteín ína P por vía del separador hidrófilo B.
Modalidad 45. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 42, en donde el re e a albúmina A se une al residuo N-terminal ína P por vía del separador hidrófilo B.
Modalidad 46. Un proceso como se def uiera de las Modalidades 8 a 42, en donde el re e a albúmina A se une al residuo C-terminal Modalidad 49. Un proceso como se def uiera de las Modalidades anteriores, en d gado se selecciona de i52 i53 Modalidad 50. Una proteína conjugada que s er por medio de un proceso como se define en cu s Modalidades anteriores .
Modalidad 51. Un conjugado de proteína ende una proteína o glicoproteína unida a un re e a albúmina por vía de un separador hidrófilo solvato o profármaco farmacéuticamente acepta .
Modalidad 52. Un conjugado de proteína la (I) : (A-W-B)y-P (I) nde resenta una proteína o glicoproteína; resenta un separador hidrófilo; Modalidad 54. Un conjugado de proteína e en las Modalidades 51 a 53, en donde la senta un factor de coagulación de la sangre, t FX, FII, FV, proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, jido, FXI, FXII y FXIII, así como también las v III, FIX de secuencia de los mismos.
Modalidad 55. Un conjugado de proteína e en la Modalidad 54, en donde el factor de coa sangre es FVII, tal como FVIIa.
Modalidad 56. Un conjugado de proteína e en la Modalidad 52 o la Modalidad 53, en ína representa una hormona de crecimiento (GH) .
Modalidad 57. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 52 a 56, en esenta un número entero seleccionado de 1, 2 o 3.
Modalidad 58. Un conjugado de proteína ador hidrófilo tiene un valor cLogP < 0.
Modalidad 62. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 52 a 61, en ador hidrófilo tiene la fórmula nde Xi es - x- [(CHR1)I1-W2]ml-{ [(CHaJmEl]^- [(CHR2)I2- X2 es - [(CHR3)I3-W4]m4-{ [ (CH2)n3E2]m5- [ (CHR4) I4- 5] X3 es - [ (CHR5)I5-W6]m7-, X4 es F-Dl- (CH2)i6-D2-, II, 12, 13, 14, 15 e 16 se sel endientemente de 0-16, mi, m3 , m4 , m6 y m7 se sel endientemente de 0-10, m2 y m5 se seleccionan independientemente d ni, n2, n3 y n4 se seleccionan independie oarilo son sustituidos opcionalmente por h 0H, -C(0)NH2, -S(0)OH, -S(0)2OH, -CN u -OH, DI, D2 , El y E2 se seleccionan independie -, -NR6-, -N(C0R7)- o un enlace de valencia; en representan independientemente hidrógeno o alqui tomos de carbono, V¡i a W6 se seleccionan independienteme NH- , -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC(0)-, -C(0)N 2 HC(0)-, -0C(0)NH-, -NHC(0)0-, -C(0)CH2-, -C CH=CH-, -CH=CHC(0)-, -(CH2)s2-, -C{0)-, -C(0)0-, enlace de valencia; en donde s2 es 0 o 1.
Modalidad 63. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 52 a 62, en la fórmula -W7-Y-, en donde HC(O)-, -C(0)NHS(0)2-, -S(0)2NHC(0) -, -O (0)0-, -C(0)CH2-, -CH2C(0)-, -C(0)CH=CH-, -CH= )54-/ -C(0)-, -0(0)0-, -0C(0)-, o un enlace de v nde s4 es 0 o 1.
Modalidad 64. Un conjugado de proteína e en la Modalidad 62 o la Modalidad 63, en donde 4, 15 e 16 representan independientemente 0-6.
Modalidad 65. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 64, en d 4 , m6 y m7 representan independientemente 0-6.
Modalidad 66. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 65, en representan independientemente 0-10.
Modalidad 67. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 66, en d n3 y n4 representan independientemente 0-10, tal e en cualquiera de las Modalidades 62 a 68, en son ambos -NR6-.
Modalidad 71. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 70, en se seleccionan independientemente de -0- o -N e de valencia.
Modalidad 72. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 71, en son ambos -O- .
Modalidad 73. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 71, en son ambos -NR6- .
Modalidad 74. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 62 a 73, en W8 se seleccionan independientemente del gr iste de -C(0)NH-, -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2 Wi- [ (CHR1) n-W2] mi" { [ (CH2) nlO] m2- [ (CHR2) I2-W3] m3}n2- R3) i3-W4]m4-{ [ (CH2)n30]m5- [ (CHR4)I4-W5] m6} n4~ i H2)nlO]m2- [(CHR2)I2-W3] m3 } n2 ~ y - [ (CH2)n30]m5- [ (CHR¾) leccionan de (CHR% (CHR% 161 i62 Modalidad 78. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 77, en molar del separador hidrófilo está en el rango o en el rango de 500D a 1100D.
Modalidad 79. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 78, en úo de enlace a albúmina es un residuo lipofilo.
Modalidad 80. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 79, en úo de enlace a albúmina se enlaza de manera no c imadamente 10 µ? o inferior a aproximadamente 1 µ Modalidad 83. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 82, en úo de enlace a albúmina se selecciona de u lo de cadena recta, un grupo alquilo de icada, un grupo el cual tiene un grupo de á xílico o un isoéster de ácido ?-carboxílico .
Modalidad 84. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 83, en úo de enlace a albúmina tiene de 6 a 40 át no, de 8 a 26 átomos de carbono o de 8 a 20 á no .
Modalidad 85. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 84, en úo de enlace a albúmina es un péptido, tal ido que comprende menos de 40 residuos de aminoác i65 ína de la proteína P por vía del separador hidróf Modalidad 89. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 86, en o de enlace a albúmina A se une al residuo N- proteína P por vía del separador hidrófilo B.
Modalidad 90. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 86, en úo de enlace a albúmina A se une al residuo C- proteína P por vía del separador hidrófilo B.
Modalidad 91. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 86, en úo de enlace a albúmina A se une a un residuo d proteína P por vía del separador hidrófilo B.
Modalidad 92. Un conjugado de proteína e en cualquiera de las Modalidades 51 a 86, en úo de enlace a albúmina A se une a un residuo de ??? 170 Modalidad 96. Un método para el tra láctico de la hemofilia., el cual comprende adm paciente una cantidad terapéuticamente efectiv r de coagulación de la sangre conjugado como se Modalidad 11.
Modalidad 97. Un factor de coagulación e conjugado como se define en la Modalidad 11, n el tratamiento profiláctico de la hemofilia.
Modalidad 98. El uso de un factor de coagul angre conjugado como se define en la Modalidad 1 actura de un medicamento para el tra láctico de la hemofilia.
Modalidad 99. Una composición farmacéuti ende un factor de coagulación de la sangre c se define en la Modalidad 11 para el uso miento profiláctico de la hemofilia. entó (hasta el grado máximo permitido por l endientemente de cualquier incorporación propo eparado de documentos particulares hechos en ot te documento .
El uso de los términos "un" y "una" y "el" y "las" y referentes similares en el context ipción de la invención se deben interpretar c n tanto las formas singulares como las formas p os que se indique de otra manera en este docume xto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, der que la frase "el compuesto" se refiere a uestos" de la invención o un aspecto cular, a menos que se indique de otra manera.
A menos que se indique de otra manera, t es exactos proporcionados en este documen sentativos de los valores aproximados correspo proporcionar un soporte para un aspecto si to de la invención que "consiste de", " ialmente de" o "comprende sustancialmente" ese mentos particulares, a menos que se establezca a o el contexto dicte claramente lo contrar ío, se debe entender que una composición desc documento que comprende un elemento particular ibe una composición que consiste de ese elem que se establezca lo contrario o el context menté lo contrario) .
Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para llev ica la citada invención, es el que resulta cla nte descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antec ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Un proceso para preparar una pro proteína conjugada, caracterizado porque compre que consisten en hacer reaccionar una pro proteína con una sustancia aglutinante de uble en agua en presencia de una moléc dextrina sustituida opcionalmente. 2. Un proceso de conformidad con la reivi aracterizado porque la molécula de ciclodextrina c dextrina, tal como ß-ciclodextrina sustituida opcio uno o más alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, o, etilo o propilo, cada uno de los cuales p reivindicaciones anteriores, caracterizado ende una reacción en una solución amortiguada omo un amortiguador de Hepes, en particular Hepe 100 mM y CaCl210 mM. 5. Un proceso de conformidad con cualqu reivindicaciones anteriores, caracterizado po ncia aglutinante de albúmina tiene un valor cL al como >2 , por ejemplo >3 , en particular >4 tal sea octan-l-ol, cloroformo, ciclohexano y dipel opilenglicol (PGDP) . 6. Un proceso de conformidad con cualquier ndicaciones anteriores, caracterizado porque el c oteína es un conjugado de proteína de la fórmula (I) (A-W-B)y-P (I) nde resenta una proteína o glicoproteína; ndicaciones anteriores, caracterizado porque la senta un factor de coagulación de la sangre, tal co FII, FV, proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, fa o, FXI, FXII y FXIII, así como también las vari , FIX de secuencia de los mismos, en particular F FVIIa. 8. Un proceso de conformidad c ndicación 6 o la reivindicación 7, caracterizad parador hidrófilo tiene la fórmula -Xi -X2 -X3 - - nde Xx es -Wi- [ (CH2) nlEl] [(CH 2)I2-W X2 es - [(CHR3)I3- 4]m4-{ [(CH2)n3E2]m5- [ (CHR4) I4-W5] X3 es - [(CHR5)I5-W6]m7-, X4 es F-Dl- (CH2) i6-D2-, II, 12, 13, 14, 15 e 16 se sel R1, R2, R3 , R4 y R5 se sele endientemente de hidrógeno, -C(0)OH, -C(0)NH2/ -20H, -NH-C (=NH) -NH2/ alquilo de 1 a 6 átomos de o heteroarilo; en donde los grupos alquilo, oarilo son sustituidos opcionalmente por h 0H, -C(0)NH2/ -S(0)OH, -S(0)2OH, -CN u -OH, DI, D2 , El y E2 se seleccionan independie -, -NR6-, -N(COR7)- o un enlace de valencia; en representan independientemente hidrógeno o alqui tomos de carbono, i a W6 se seleccionan independienteme NH- , -NHC(O)-, -C(0)NHCH2-, -CH2NHC(0)-, -C(0)N 2NHC(0)-, -OC(0)NH-, -NHC(0)0-# -C(0)CH2-, -C CH=CH-, -CH=CHC(0)-, -(CH2)s2-, -C(0)-, -C(0)0-, enlace de valencia; en donde s2 es 0 o 1. 9. Un proceso de conformidad con cualqu ??? 10. Un proceso de conformidad con cualqu reivindicaciones anteriores, caracterizado po ncia aglutinante de albúmina se selecciona de nde * indica la unión a B hasta W. 11. Una proteína conjugada, caracterizad uede obtener por medio de un proceso de conform uiera de las reivindicaciones anteriores. 12. Un conjugado de proteína, caracterizad lecciona de OOC i82 i83 i84 13. Un conjugado de proteína de conformida ndicación 11 o la reivindicación 12, carac e es para el uso en la terapia. 14. Una composición farmacéutica, carac e comprende un conjugado de proteína de conform ivindicación 11 o la reivindicación 12, opcional nación con un excipiente aceptable, farmacéutico. 15. Una proteína conjugada, caracterizada ede obtener de conformidad con la reivindicació SO en el tratamiento profiláctico de la hemofilia
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