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JP2849773B2 - ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法 - Google Patents

ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法

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JP2849773B2
JP2849773B2 JP2226076A JP22607690A JP2849773B2 JP 2849773 B2 JP2849773 B2 JP 2849773B2 JP 2226076 A JP2226076 A JP 2226076A JP 22607690 A JP22607690 A JP 22607690A JP 2849773 B2 JP2849773 B2 JP 2849773B2
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streptomyces
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はストレプトミセス（Streptomyces）属由来の
トランスグルタミナーゼ製造法に関する。
更に詳しくはトランスグルタミナーゼ生産能を有する
ストレプトミセス属の菌株を栄養培地に培養し、該培養
物からトランスグルタミナーゼを採取することを特徴と
するトランスグルタミナーゼの製造法に関する。
トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあるグル
タミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応
を触媒する酵素である。
このトランスグルタミナーゼは、アシル受容体として
タンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が作用する
と、分子内及び分子間にε−（γ−Glu）−Lys架橋結合
が形成される。また水がアシル受容体として機能すると
きは、グルタミン残基が脱アミド化されグルタミン酸残
基になる反応を進行させる酵素である。
また、本発明のトランスグルタミナーゼを利用して製
造されるタンパク質のゲル化物は、従来のゲル状食品、
ゲル状化粧料をはじめとしてヨーグルト、ゼリー、チー
ズなどとして用いられる。
〔従来技術〕
トランスグルタミナーゼはこれまで動物由来のものと
しては、例えばモルモツトの肝臓〔Connellan,et al.,
ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Jo
urnal of Biological Chemistry）246巻４号,1093〜109
8頁（1971）〕及び哺乳動物の臓器，血液に広く分布し
〔Folk et al.,アドバンセス・イン・エンザイモロジー
（Advances in Enzymology）38巻,109〜191頁（197
3）〕、〔Folk et al.,アドバンセス・イン・プロテイ
ン・ケミストリー（Advances in Protein Chemystry）3
1巻,1〜133頁（1977）〕、その酵素の特徴も研究されて
いる。
また微生物由来のトランスグルタミナーゼは今までス
トレプトベルチシリウム（Streptoverticillium）属の
生産する酸素が報告されている（特開昭64−27471）。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明者等はその給源を微生物に求め鋭意検索を行っ
た結果、ストレプトベルチシリウム属以外の数種の微生
物にトランスグルタミナーゼの産生能が認められた。
本発明はストレプトミセス属由来のトランスグルタミ
ナーゼの製造法を提供するものであり、供給量、コスト
の面、精製の容易さ等のいずれの面からも問題はなく、
反応にCa2+を必要としない点等、実用性の高いトランス
グルタミナーゼの製造法である。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者等は給源を微生物に求め広く検索を行った結
果、ストレプトミセス属に属する菌株にトランスグルタ
ミナーゼの産生能が認められた。
ストレプトミセス属の菌を具体的に示すと、例えば本
発明者らが土壌からスクリーニングして得られた以下に
示すNo.83株あるいはNo.466株が挙げられる。
これらの菌株の菌学的性質について以下に示す。同定
のための実験方法は〔「放線菌の同定実験法」、日本放
線菌研究会（1985）〕、〔「微生物の分類と同定」、学
会出版センター（1975）〕、〔微生物の化学分類実験
法」，学会出版センター（1982）〕によった。
また分類、同定の基準として〔バージーズ・マニユア
ル・オブ・デタミナテイブ・バクテリオロジイ（Berge
y's Manual of Determinative Bacteriology）第８版
（1974）〕、〔デタミネイテブ バクテリオロジー（De
terminative bacteriology）第７版及び第８版〕、〔イ
ンターナショナル ジャーナル オブ システマティッ
ク バクテリオロジー（International journal of sys
tematic bacterology）19巻（1969）、28巻（1978）〕
及び〔放線菌の同定実験法（1985）〕を参考にした。色
彩については〔JIS標準色票「日本規格協会」（197
2）〕を用いた。
（１） 菌学的性質 a.形態的特徴を第１表に示す。
b.No.83株とNo.466株の各種培養基上の生育状態（28℃
で培養30日まで観察）と色を第２表および第３表に示
す。
c.生理学的性質 生育温度、ゼラチンの液化性、スターチの加水分解、
脱脂牛乳の凝固及びペプトン化、メラニン様色素生成、
硫化水素の生産性については第４表に示した。炭素源の
同化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上）について
は第５表に示した。
d.化学的性質 細胞壁のアミノ酸、菌体中におけるジアミノピメリン
酸については第４表に示した。
本菌株は細胞壁にジアミノピメリン酸が存在し、菌体
中にLL−ジアミノピメリン酸が存在し、メソ−ジアミノ
ピメリン酸が存在しなかった。
No.83株の同定 胞子鎖はごく稀なopen loops型（RA）を除けば、その
ほとんどが直線状で著しく長く（50〜80個のarthrospor
e型連鎖）、培地の種類によりボール状体を作り、酵母
エキス含有培地（ISP No.2培地等）では基菌糸が著しく
発達し、ベルベット状もしくは綿毛状でアズキ色となる
のが特徴である。LL−ジアミノピメリン酸が存在し、メ
ソ−ジアミノピメリン酸が存在しなかったことから、細
胞壁タイプＩに相当するが、糖ではガラクトース、ラム
ノースが検出され、アラビノース、キシロース、は検出
されなかった。さらに菌糸の断裂、胞子の連鎖、胞子の
運動、気菌糸の形成、輪生枝の形成、抗酸性、カタラー
ゼの産生などから総合判定し、ストレプトミセス属であ
ると同定した。
糖資化スペクトルが比較的せまく、澱粉、グルコー
ス、サリシン、ラムノース、フラクトース（弱）のみで
ある。さらに諸性状からしてストレプトミセス・シナモ
ネンシス（Streptomyces cinnamonensis）、ストレプト
ミセス・ノジリエンシス（Streptomyces nojiriensi
s）、ストレプトミセス・ディアスタチカス（Streptomy
ces diastaticus）に類似するが、大きく異なるのはこ
の菌種がメラニン色素を生ずること、ラムノースを資化
しないことである。従って本菌株はストレプトミセスの
新菌種と同定し、ストレプトミセス・エスピーNo.83と
命名した。
No.466株の同定 気菌糸は通常薄く一見、基生菌糸が裸出しているかの
様に見え、その色が真紅であり、コロニーの表面は放射
フイルム状で固く寒天内部に菌糸を良く延ばすのが特徴
である。胞子鎖は分節胞子の比較的短い（５〜10個）連
鎖をプリドハム・ゴトリーブ（Pridham＆Gottlieb）の
澱粉培地で作るが、その他の殆どの培地では胞子鎖は不
揃いで球状〜鈎状でかつ菌糸の先端部が瘤状にくびれた
り分枝したりする。細胞壁の構成成分にはLL−ジアミノ
ピメリン酸が存在し、メソ−ジアミノピメリン酸が存在
しなかったことから、細胞壁タイプＩに相当する。グル
コースと澱粉しか資化しないこと、４％以下の食塩生育
性、胞子形態の直状または指骨状、赤系気菌糸色、メラ
ニン色素産生などからバージーズ・マニュアル（Berge
y's manual）８版のストレプトミセス・キサントファエ
ウス（Streptomyces xanthophaeus）および、ストレプ
トミセス・フラボトリシニ（Streptomyces flavotricin
i）に相当する菌であり、現在システマチック・バクテ
リオロジー（Systematic Bacteriology）（1989年）で
はストレプトミセス・ラベンデュラエ（Streptomyces l
avendurae）に編入されている菌と同定し、ストレプト
ミセス・ラベンデュラエNo.466と命名した。
なお、ストレプトミセス・エスピーNo.83およびスト
レプトミセス・ラベンデュラエNo.466は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第11656号（FERM P−116
56）および微工研菌寄第11657号（FERM P−11657）とし
て寄託されている。
本発明に使用できる微生物はストレプトミセス属に属
し、トランスグルタミナーゼ産生能を有する微生物で有
れば使用できるが、好ましくはストレプトミセス・エス
ピー（Streptomyces sp.）No.83（以下、No.83株とい
う）およびストレプトミセス・ラベンデュラエ（Strept
omyces lavendulae）No.466（以下、No.466株という）
が挙げられる。
これら微生物を培養し、トランスグルタミナーゼを取
得するための培養法及び精製法等について述べる。
本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液
体培養、固体培養いずれも可能であるが工業的には深部
通気撹拌培養を行うのが有利である。又使用する培養源
としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素
源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、ストレプトミ
セス属に属する微生物の利用出来る栄養源であれば全て
使用出来る。培地の炭素源としてはブドウ糖、ショ糖、
ラスターゲン、グリセリン、デキストリン、澱粉等の
他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独で又は組合せて用
いられる。窒素源としては無機室素源、有機窒素源のい
ずれも使用可能であり無機栄養源としては硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アン
モニウム等が挙げられる。又有機窒素源としては大豆、
米、トウモロコシ、小麦などの粉、糠、脱脂粕をはじめ
コーンステイープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイ
ン、アミノ酸、酵母エキス等が挙げられる。無機塩及び
微量栄養素としてはリン酸、マグネシウム、カリウム、
鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン
界面活性剤、消泡剤等の菌の生育やトランスグルタミナ
ーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用出
来る。培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育しトラ
ンスグルタミナーゼが産生する範囲であれば良く、好ま
しくは25〜35℃である。培養時間は条件により異なるが
トランスグルタミナーゼが最も産生される時間まで培養
すれば良く、通常２〜４日程度である。トランスグルタ
ミナーゼは液体培養では培養液中に溶解されており、培
養終了後培養液より固形分を除いた培養ろ液より採取さ
れる。
培養ろ液よりトランスグルタミナーゼを精製するには
通常酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用出来る。
例えばエタノール、アセトン、イソプロピレンアルコ
ール等の有機溶媒による処理、硫安、食塩等による塩
析、透析、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフイ
ー、吸着クロマトグラフイー、ゲルろ過、吸着剤、等電
点分画等の方法が使用出来る。又これらの方法を適当に
組合せる事によりトランスグルタミナーゼの精製度が上
る場合は適宜組合せて行う事が出来る。これらの方法に
よって得られる酵素は安定化剤として各種の塩類、糖
類、蛋白質、脂質、界面活性剤等を加え或いは加えるこ
となく、限外ろ過濃縮、逆浸透濃縮、減圧乾燥、凍結乾
燥、噴霧乾燥の方法により液状又は固形のトランスグル
タミナーゼを得ることが出来る。
トランスグルタミナーゼの活性測定はベンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシル
アミンを基質としてCa2+非存在下で反応を行い、生成し
たヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形
成させ525nmの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検
量線より求め活性を算出する。トランスグルタミナーゼ
活性は特に記載しないかぎり以下に記載する方法により
測定した。
＜活性測定法＞ 試薬Ａ 0.2 M トリス塩酸緩衝液（pH6.0） 0.1 M ヒドロキシルアミン 0.01M 還元型グルタチオン 0.03M ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシン 試薬Ｂ 3N−塩酸 12％−トリクロロ酢酸 ５％FeCl3・6H2O（0.1N−HClに溶解） （上記溶液の1:1:1の混合液） 酵素液の0.05mlに試薬A0.5mlを加えて混合し37℃で10
分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止とFe錯体の形成を
行った後525nmの吸光度を測定する。対照としてあらか
じめ熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたもの
の吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に
酵素液のかわりにＬ−グルタミン酸−γ−モノヒドロキ
サム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成
されたヒドロキサム酸の量を求め、１分間に１μモルの
ヒドロキサム酸を生成する酸素活性を１単位とした。
No.83株及びNo.466株の生産するトランスグルタミナ
ーゼ（以下各々No.83酵素及びNo.466酵素という）の酵
素化学的性質について以下に記す。
（ａ） 至適pH 37℃、10分反応で、基質としてベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミン
を使用した場合、No.83酵素およびNo.466酵素の至適pH
はどちらも６〜７付近にある（第１図、第５図に示
す）。
（ｂ） 至適温度 pH7、10分反応で、基質としてベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミン
を使用した場合、No.83酵素およびNo.466酵素の至適温
度はどちらも40〜45℃付近である（第２図、第６図に示
す）。
（ｃ） pH安定性 37℃、10分間処理で、No.83酵素およびNo.466酵素は
どちらもpH6〜９で安定である（第３図、第７図に示
す）。
（ｄ） 温度安定性 pH7で10分間処理で、No.83酵素は40℃では100％活性
が残存し、50℃では55％活性が残存し、No.466酵素は40
℃では94％活性が残存し、50℃では32％活性が残存する
（第４図，第８図に示す）。
（ｅ） 基質特異性 各種合成基質とヒドロキシアミンとの反応を調べた。
いずれの酵素も合成基質がベンジルオキシカルボニルア
スパラギニルグリシン、ベンジルオキシカルボニルグル
タミン、グリシルグルタミニルグリシンの場合には反応
しない。しかし合成基質がベンジルオキシカルボニルグ
ルタミニルグリシンの場合の反応性は最も高い。この時
の各種合成基質濃度は5mMとした。結果は第６表に示
す。なお表中のCBZはベンジルオキシカルボニル基の略
であり、Glnはグルタミル基の略であり、Glyはグリシル
基の略であり、Asnはアスパラギニル基の略である。
（ｆ） 金属イオンの影響 活性測定系に1mM濃度になるように各種金属イオンを
加えて影響を調べた（結果は第７表に示す）。いずれの
酵素もCu2+、Zn2+及びPb2+により活性が阻害される。
（ｇ） 阻害剤の影響 各阻害剤を1mMになるように加え、25℃、30分放置
後、活性を測定した。なお、フエニルメチルスルホニル
フロオライドはPMSFと略した。（結果は第８表に示す） いずれの酵素もパラクロロマーキユリー安息香酸（以
下、PCMBと略する）、Ｎ−エチルマレイミド（以下、NE
Mと略する）、モノヨード酢酸により活性が阻害され
る。
（ｈ） 等電点 アンホライン等電点電気泳動により求めたところNo.8
3酵素の等電点pIは10付近であり、No.466酵素の等電点p
Iは6.8付近である。
（ｈ） 分子量 SDSデイスク電気泳動法より求めたところNo.83酵素お
よびNo.466酵素の分子量はどちらも約39,000である。
次にNo.83株およびNo.466株の液体培養により得られ
たトランスグルタミナーゼとモルモツト肝由来のそれと
の性質を比較する。尚、モルモツト肝由来のトランスグ
ルタミナーゼはConnellan et al.,ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry）246巻４号、1093〜1098頁（1971）に従っ
て調製した。第６表には各酵素化学的性質の比較を、第
９表にはCa2+の活性に及ぼす影響を示す。
第６表及び第９表より明らかのように従来から主とし
て研究されているモルモツト肝のトランスグルタミナー
ゼと放線菌由来のトランスグルタミナーゼとには酵素化
学的性質において種々の差が見られ、特に温度安定性、
分子量、等電点、基質特異性に差が見られる。またCa2+
の存在下及び非存在下においても本発明のトランスグル
タミナーゼは作用する点等でも明らかな差がみられる。
従って本発明の各酵素はモルモツト肝より得られたトラ
ンスグルタミナーゼとはその性質を異にするものと考え
られる。
以下に本発明の実施例について述べる。
実施例１ No.83株を培地組成ポリペプトン0.2％、グルコース0.
5％、リン酸二カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.1％
からなる培地（pH7）200mlに接種し30℃、48時間培養
し、得られた種培養液をポリペプトン2.0％、ラスター
ゲン2.0％、リン酸二カリウム0.2％、硫酸マグネシウム
0.1％、酵母エキス0.2％、消泡剤としてアデカノール
（商品名、旭電化社製品）0.05％からなる培地20l（pH
7）に加え30℃で３日間培養後ろ過し培養液18.5lを得
た。この培養液の活性は0.71u/mlである。
培養液を塩酸でpH6.5に調製し、予め0.05Mリン酸緩衝
液（pH6.5）で平衡化しておいたCG−50（商品名、オル
ガノ社製品）のカラムに通した。この操作でトランスグ
ルタミナーゼは吸着された。さらに同緩衝液で不純蛋白
質を洗い流した後、さらに0.05〜0.5Mの同緩衝液の濃度
勾配をつくり、通液して溶出液を分画回収し、比活性の
高い分画を集めた。電導度を10ms以下になるように希釈
後ブルーセフアロースのカラムに通した。この操作でト
ランスグルタミナーゼは吸着された。更に0.05Mリン酸
緩衝液（pH7）で不純蛋白質を洗い流した後、０〜1Mの
食塩濃度勾配をつくり通液して溶出液を回収し比活性の
高い画分を集めた。この液を脱塩してCG−50の再クロマ
トを行ない溶出液を分画した。この結果活性画分は単一
のピークとして溶出された。この画分の比活性は培養ろ
液に対し356倍であり、回収率は43％であった。
実施例２ No.466株を実施例１と同じ前培培地200mlに接種し30
℃、48時間培養し、得られた種培養液をポリペプトン2.
0％、グリセリン2.0％、リン酸二カリウム0.2％、硫酸
マグネシウム0.1％、酵母エキス0.2％、消泡剤としてア
デカノール（商品名、旭電化社製品）0.05％からなる培
地20l（pH7）に加え30℃で３日間培養後ろ過し培養液1
8.5lを得た。この培養液の活性は2.47u/mlである。
培養液をUF6000膜を使い脱塩濃縮し、塩酸でpH7.0に
調製し、予め0.005Mリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化し
ておいたDEAEセルロファイン（商品名、生化学工業株式
会社製品）のカラムに通した。この操作でトランスグル
タミナーゼは吸着された。さらに同緩衝液で不純蛋白質
を洗い流した後、さらに0.005〜0.5Mの同緩衝液の濃度
勾配をつくり、通液して溶出液を分画回収し、比活性の
高い分画を集めた。以下ブルーセファロース、CG−50を
用い実施例１と同様な方法で酵素を精製してSDSデイス
ク電気泳動で単一の酵素を得た。このものの比活性は培
養ろ液に対し169倍であり、回収率は37％であった。
〔発明の効果〕
本発明の微生物由来のトランスグルタミナーゼは安価
に供給され、かつ精製も容易であるので実用性が大であ
る。
本発明によってトランスグルタミナーゼを用いる食品
加工の研究、医療面への利用の研究が促進され用途開発
の実用への道が開かれた。
【図面の簡単な説明】
第１図〜第４図は各々、No.83酵素の至適pH曲線、至適
温度曲線、pH安定曲線及び温度安定曲線を示すものであ
り、第５図〜第８図は各々、No.466酵素の至適pH曲線、
至適温度曲線、pH安定曲線及び温度安定曲線を示すもの
である。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】トランスグルタミナーゼ生産能を有するス
    トレプトミセス属に属する微生物を培養し、トランスグ
    ルタミナーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴
    とするトランスグルタミナーゼの製造法。
JP2226076A 1990-08-27 1990-08-27 ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法 Expired - Lifetime JP2849773B2 (ja)

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JP2226076A JP2849773B2 (ja) 1990-08-27 1990-08-27 ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法
US07/750,160 US5252469A (en) 1990-08-27 1991-08-26 Process for producing a transglutaminase derived from streptomyces

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