PL209550B1

PL209550B1 - Heterogenne białko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów z cukrzycą insulinoniezależną i kompozycja do leczenia pacjentów z otyłością

Info

Publication number: PL209550B1
Application number: PL366208A
Authority: PL
Inventors: Wolfgang Glaesner; Radmilla Micanovic; Sheng-Hung Rainbow Tschang
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2011-09-30
Also published as: HK1061411A1; CY1108485T1; ATE437891T1; NO332221B1; NO20101602L; EA200300644A1; JP2004528014A; ATE406384T1; EP1724284B1; HU229218B1; HRP20030455A2; KR100942864B1; NO20032565L; UA81897C2; CZ2014740A3; IL184429A0; DK1355942T3; JP2011006447A; US20040053370A1; WO2002046227A2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest heterogenne białko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna do leczenia pacjentów z cukrzycą insulinoniezależną i kompozycja do leczenia pacjentów z otyłością. Heterogenne białko fuzyjne jest białkiem podobnym do glukagonu. Takie heterogenne białko może mieć analogi i pochodne i może być połączone przez fuzję z białkami, które mają działanie wydłużające czas półtrwania in vivo tych peptydów. Takich białek fuzyjnych używa się do leczenia cukrzycy insulinoniezależnej i różnych innych chorób.

Peptyd podobny do glukagonu 1 (GLP-1) jest peptydem wielkości 37 aminokwasów, który jest wydzielany przez komórki L jelita w odpowiedzi na proces trawienia pokarmu. Stwierdzono, że stymuluje on wydzielanie insuliny (działanie insulinotropiczne), powodując w ten sposób pobieranie glukozy przez komórki i obniżenie poziomu glukozy w osoczu [patrz na przykład Mojsov, S., (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40:333-343]. Jednakże GLP-1 ma małą aktywność. Następujące po tym przecięcie pomiędzy wewnętrznymi aminokwasami w pozycji 6 i 7 daje bardziej aktywny biologicznie peptyd GLP-1(7-37)OH. Znane są różne analogi i pochodne GLP-1 i są one tu określane jako związki GLP-1. Takie analogi GLP-1 obejmują eksendyny, które są peptydami znajdowanymi w jadzie jaszczurek z rodziny Helodermatidae. Eksendyny wykazują homologię sekwencji do natywnego GLP-1 i mogą wią zać się z receptorem GLP-1, co zapoczą tkowuje kaskadę przekazywania sygnał u odpowiedzialnego za różne przypisywane GLP-1(7-37)OH aktywności.

Związki GLP-1 wykazują różne, znaczące aktywności fizjologiczne. Na przykład wykazano, że GLP-1 stymuluje uwalnianie insuliny, obniża wydzielanie glukagonu, hamuje opróżnianie żołądka i zwię ksza wykorzystanie glukozy [Nauck, M.A. i wsp. (1993) Diabetologia 36:741-744; Gutniak, M. i wsp. (1992) New England J. of Med. 326:1316-1322; Nauck, M.A. i wsp., (1993) J. Clin. Invest. 91:301-7].

Użycie GLP-1 do leczenia cukrzycy insulinoniezależnej (NIDDM) jest bardzo obiecujące. Na rynku istnieje wiele leków doustnych służących do leczenia oporności na insulinę związanej z NIDDM. Jednak w miarę postępu choroby, pacjenci muszą być leczeni w sposób, który stymuluje uwalnianie insuliny i ewentualnie, który obejmuje wstrzykiwanie insuliny. Jednakże dostępne leki stymulujące uwalnianie insuliny mogą powodować hipoglikemię, tak samo jak podawanie insuliny. Natomiast aktywność GLP-1 kontrolowana jest przez poziom glukozy we krwi. Kiedy poziom glukozy spada do pewnego poziomu progowego GLP-1 traci aktywność. Nie ma więc ryzyka wystąpienia hipoglikemii związanej z leczeniem obejmującym podanie GLP-1.

Jednakże, użyteczność terapii obejmującej podanie peptydów GLP-1 ograniczona jest przez ich szybki klirens i krótki czas półtrwania. Na przykład, GLP-1(7-37) ma czas półtrwania w surowicy tylko 3 do 5 minut. Amid GLP-1(7-36) ma czas dział ania okoł o 50 minut po podaniu podskórnym. Nawet analogi i pochodne, które są oporne na cięcie przez endogenne proteazy, nie wykazują czasu półtrwania wystarczająco długiego, żeby uniknąć konieczności powtórnego podawania w czasie 24 godzin. Szybki klirens środków terapeutycznych nie jest korzystny w przypadkach, w których pożądane jest utrzymanie wysokiego poziomu środka we krwi przez dłuższy okres czasu, ponieważ niezbędne jest wtedy jego wielokrotne podawanie.

Ponadto, związki o przedłużonym działaniu są szczególnie ważne dla pacjentów chorych na cukrzycę, których wcześniejsze leczenie polegało na przyjmowaniu tylko leków doustnych. Tacy pacjenci mają szczególne trudności z przestawieniem się na sposób leczenia polegający na wielokrotnym wstrzykiwaniu leku.

Wynalazek przezwycięża problemy związane z podawaniem związku o krótkim czasie półtrwania w osoczu. Związki według wynalazku obejmują związki GLP-1 połączone z innym białkiem o długim półokresie cyrkulacji, takim jak część Fc immunoglobuliny lub albumina.

Małe peptydy o zastosowaniu terapeutycznym są trudne do manipulacji, ponieważ nawet niewielkie zmiany struktury wpływają na ich stabilność i/lub aktywność biologiczną. Szczególnie potwierdza się to w przypadku związków GLP-1 będących obecnie przedmiotem intensywnych badań. Na przykład, GLP-1(7-37)OH ma tendencję do ulegania zmianom konformacyjnym, powodującym zmianę pierwszorzędowej struktury alfa helis, na pierwszorzędową strukturę typu beta kartka. Powstanie struktury typu beta kartki powoduje agregację materiału, co jak się uważa prowadzi do jego inaktywacji. Dlatego ze zdumieniem stwierdziliśmy, że możliwe jest wytworzenie biologicznie aktywnego białka połączonego GLP-1 o zwiększonym okresie półtrwania. Jest to szczególnie zaskakujące, jeżeli weźPL 209 550 B1 mie się pod uwagę trudności związane z pracą z samym białkiem GLP-1(7-37) OH jak i z dużym rozmiarem przyłączonego białka w stosunku do niewielkiej wielkości peptydu GLP-1.

Przedmiotem wynalazku jest heterogenne białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd z N-końcem i C-końcem połączony z drugim polipeptydem z N-końcem i C-końcem charakteryzujące się tym, że pierwszy polipeptyd jest związkiem GLP-1 o wzorze [SEQ nr 2]

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa40 41 42 43 44 45

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa wzór I (SEQ ID NO: 2) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 9 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 11 oznacza Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 14 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 16 oznacza Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp lub Lys;

Xaa w pozycji 17 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 18 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr lub Lys;

Xaa w pozycji 19 oznacza Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 20 oznacza Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr lub Lys;

Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 22 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 23 oznacza Gln, Asn, Arg, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 24 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 25 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 26 oznacza Lys, Arg, Gln, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza Leu, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 31 oznacza Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 32 oznacza Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 33 oznacza Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 34 oznacza Asn, Lys, Arg, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 35 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 36 oznacza Gly, Arg, Lys, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 37 oznacza Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 38 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 39 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 40 oznacza Gly, Asp, Glu, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 41 oznacza Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 42 oznacza Ser, Pro, Lys, Glu, Asp lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 43 oznacza Ser, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 44 oznacza Gly, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty; i Xaa w pozycji 45 oznacza Ala, Ser, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty, przy czym jeżeli aminokwas w pozycji 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 lub 44 został usunięty, to usunięty został również każdy aminokwas poniżej tego aminowkasu, i drugi polipeptyd jest ludzką albuminą a C-koniec pierwszego polipeptydu połączony jest z N-końcem drugiego polipeptydu.

Przedmiotem wynalazku jest także heterogenne białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd z N-końcem i C-koń cem połączony z drugim polipeptydem z N-koń cem i C-koń cem, znamienne tym, że pierwszy polipeptyd jest związkiem GLP-1 o wzorze [SEQ nr 2]

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa4

PL 209 550 B1

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa40 41 42 43 44 45

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa wzór I (SEQ ID NO: 2) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 9 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 11 oznacza Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 14 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 17 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 19 oznacza Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 22 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 23 oznacza Gln, Asn, Arg, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 25 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 26 oznacza Lys, Arg, Gln, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza Leu, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 31 oznacza Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 32 oznacza Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 33 oznacza Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 34 oznacza Asn, Lys, Arg, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 35 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 36 oznacza Gly, Arg, Lys, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 38 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 39 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 40 oznacza Gly, Asp, Glu, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 41 oznacza Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 42 oznacza Ser, Pro, Lys, Glu, Asp lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 43 oznacza Ser, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 44 oznacza Gly, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty; i Xaa w pozycji 45 oznacza Ala, Ser, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty, przy czym jeżeli aminokwas w pozycji 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 lub 44 został usunięty, to usunięty został również każdy aminokwas poniżej tego aminowkasu, i drugi polipeptyd jest ludzką albuminą a C-koniec pierwszego polipeptydu połączony jest z N-końcem drugiego polipeptydu za pomocą łącznika peptydowego.

W korzystnym rozwią zaniu, heterogenne białko fuzyjne charakteryzuje się tym, że łącznik jest peptydem o sekwencji [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, w którym n jest 1, 2, 3, 4, 5 lub 6.

W innym korzystnym rozwiązaniu, w heterogennym białku fuzyjnym związek GLP-1 ma nie więcej niż 6 aminokwasów różnych od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4.

Bardziej korzystnie, w heterogennym białku fuzyjnym związek GLP-1 ma nie więcej niż 5 aminokwasów różnych od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4, lub jeszcze bardziej korzystnie związek GLP-1 ma nie więcej niż 4 aminokwasy różne od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub w eksendynie-4. W następnym bardzo korzystnym rozwiązaniu, związek GLP-1 ma nie więcej niż 3 aminokwasy różne od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub w eksendynie-4, ewentualnie również bardzo korzystnie GLP-1 ma nie więcej niż 2 aminokwasy różne od odpowiednich aminokwasów w GLP-1 (7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub w eksendynie-4.

PL 209 550 B1

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna dostosowana do leczenia pacjentów z cukrzycą insulinoniezależną, która zawiera zdefiniowane powyżej heterologenne białko fuzyjne lub farmaceutycznie akceptowalne jego sole wraz z jedną lub więcej akceptowalnymi zaróbkami.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna dostosowana do leczenia pacjentów z otyłością, która zawiera heterogenne białko fuzyjne jak zdefiniowano powyżej lub farmakologicznie akceptowalne jego sole wraz z jedną lub więcej akceptowalnymi zaróbkami.

Wynalazek opisuje także polinukleotydy kodujące opisane tu heterogenne białko fuzyjne, wektory zawierające te polinukleotydy oraz komórki gospodarza transfekowane lub transformowane takimi wektorami. Wynalazek przedstawia także sposób wytwarzania heterogennego białka fuzyjnego, który to sposób obejmuje etap transkrypcji i translacji opisanych tu polinukleotydów w warunkach, w których takie heterogenne białko fuzyjne ulega ekspresji w wykrywalnych ilościach.

W wynalazku opisano też metodę normalizacji poziomu glukozy we krwi u ssaków, które tego potrzebują, która to metoda obejmuje podanie terapeutycznie efektywnej dawki opisanego tu heterogennego białka fuzyjnego.

Wynalazek jest zilustrowany na następujących figurach:

Figura 1: Sekwencja aminokwasowa Fc IgG1 obejmująca region zawiasowy i domeny CH2 i CH3.

Figura 2: Sekwencja aminokwasowa albuminy surowicy ludzkiej.

Figura 3: A. Żel SDS-PAGE i immunoblot tego samego żelu pokazujące masę cząsteczkową białek fuzyjnych IgG1-Fc i GLP-1-Fc (Linia 1, standardy masy cząsteczkowej; Linia 2, Oczyszczony Fc; Linia 3, Pozornie transfekowane podłoże; Linia 4, Val⁸-GLP-1-Fc; Linia 5, Eksendyna-4-Fc) B. Żel SDS-PAGE i immunoblot tego samego żelu pokazujące masę cząsteczkową białek fuzyjnych ludzkiej HSA i GLP-1-HSA (Linia 1, standardy masy cząsteczkowej; Linia 2, Oczyszczona HSA; Linia 3, Pozornie transfekowane podłoże; Linia 4, Val⁸-GLP-1-HSA; Linia 5, Val⁸-GLP-1-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3HSA; Linia 6, Eksendyna-4-HSA; Linia 7, Eksendyna-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA).

Figura 4: Żel SDS-PAGE oczyszczonego Fc, albuminy i białek fuzyjnych GLP-1 (Linia 1, standardy masy cząsteczkowej; Linia 2, Oczyszczony Fc; Linia 3, Val⁸-GLP-1-Fc; Linia 4, Eksendyna-4-Fc; Linia 5, standardy masy cząsteczkowej; Linia 6, Val⁸-GLP-1-HSA; Linia 7, Eksendyna-4-HSA; Linia 8, Eksendyna-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA).

Figura 5: Ekspresyjny wektor do klonowania zawierający regiony Fc pokazane na fig. 1.

Figura 6: Ekspresyjny wektor do klonowania zawierający sekwencję albuminy pokazaną na fig. 2.

Figura 7: Ekspresyjny wektor do klonowania zawierający DNA kodujący 15 aminokwasowy łącznik połączony zgodnie z ramką odczytu z 5'-końcem sekwencji albuminy pokazanej na fig. 2.

Figura 8: Zależność aktywności in vitro białek fuzyjnych GLP-1 od dawki.

Figura 9: Farmakokinetyka białek połączonych GLP-1 Fc i HSA.

Figura 10: Odpowiedź glukodynamiczna na Eksendynę-Fc u dwóch normalnie jedzących psów.

Figura 11: Odpowiedź insulinotropiczna na Eksendynę-Fc u dwóch normalnie jedzących psów.

Figura 12: Sekwencja DNA kodująca ludzki region Fc IgGl.

Figura 13: Sekwencja DNA kodująca białko ludzkiej albuminy.

Heterogenne białka fuzyjne według wynalazku zawierają związek GLP-1 połączony z albuminą ludzką. C-koniec związku GLP-1 połączony jest bezpośrednio lub za pomocą peptydowego łącznika z N-koń cem albuminy. Takie heterogenne biał ka fuzyjne są aktywne biologicznie i maj ą wydł u ż ony czas półtrwania w porównaniu do natywnego białka GLP-1.

Korzystnie jest, gdy związki GLP-1, które są częścią heterogennego białka fuzyjnego zawierają polipeptydy mające od około 25 do około 39 występujących w naturze lub nie występujących w naturze aminokwasów, które wykazują wystarczającą homologię do natywnego GLP-1(7-37)OH, tak że posiadają one aktywność insulinotropową dzięki wiązaniu się z receptorem GLP-1 na komórkach β trzustki. Związek GLP-1 typowo zawiera polipeptyd mający sekwencję aminokwasową GLP-1(7-37)OH, analogu GLP-1(7-37)OH, fragmentu GLP-1(7-37)OH lub fragmentu analogu GLP-1(7-37)OH. GLP-1(7-37)OH ma sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 1:

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe6

PL 209 550 B1

30 31 32 33 34 35 36 37

Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 1)

Zgodnie z przyjętymi w tej dziedzinie zasadami, koniec aminowy GLP-1(7-37)OH przypisany jest do reszty numer 7, a koniec karboksylowy przypisany jest do reszty numer 37. Inne aminokwasy polipeptydu są ponumerowane kolejno, tak jak pokazano na SEQ ID NO: 1. Na przykład, w pozycji 12 znajduje się fenyloalanina, a w pozycji 22 glicyna.

Związki GLP-1 obejmują także fragmenty GLP-1. Fragment GLP-1 jest polipeptydem otrzymanym przez usunięcie jednego lub więcej aminokwasów z N-końca i/lub C-końca GLP-1(7-37)OH lub jego analogu lub jego pochodnej. Nazewnictwo użyte tu do opisania GLP-1(7-37)OH odnosi się także do fragmentów GLP-1. Na przykład, GLP-1(9-36)OH oznacza fragment GLP-1 otrzymany przez usunięcie dwóch aminokwasów z N-końca i jednego aminokwasu z C-końca. Aminokwasy w tym fragmencie oznaczone są tymi samymi numerami jak odpowiadające im aminokwasy w GLP-1(7-37)OH. Na przykład, podobnie jak w GLP-1(7-37)OH, N-końcowy kwas glutaminowy w GLP-1(9-36)OH znajduje się w pozycji 9; w pozycji 12 znajduje się fenyloalanina, a w pozycji 22 znajduje się glicyna. W przypadku GLP-1(7-36)OH glicyna w pozycji 37 GLP-1(7-37)OH została usunięta.

Związki GLP-1 obejmują także polipeptydy, w których do N-końca i/lub C-końca GLP-1(7-37)OH, jego fragmentów lub analogów dodaje się jeden lub więcej aminokwasów. Korzystnie jest, gdy tego typu związki GLP-1 mają do około trzydziestu dziewięciu aminokwasów. Aminokwasy w wydłużonym związku GLP-1 oznacza się tymi samymi numerami jak odpowiadające im aminokwasy w GLP-1(7-37)OH. Na przykład, N-końcowy aminokwas związku GLP-1 otrzymanego przez dodanie dwóch aminokwasów do N-końca GLP-1(7-37)OH znajduje się w pozycji 5, a C-końcowy aminokwas związku GLP-1 otrzymanego przez dodanie jednego aminokwasu do C-końca GLP-1(7-37)OH znajduje się w pozycji 38. Tak więc, podobnie jak w GLP-1(7-37)OH, w obu tych wydłużonych związkach w pozycji 12 znajduje się fenyloalanina, a w pozycji 22 znajduje się glicyna. Aminokwasy 1-6 wydłużonego związku GLP-1 są korzystnie takimi samymi lub konserwowanymi podstawieniami aminokwasowymi, jak aminokwasy w odpowiednich pozycjach GLP-1(1-37)OH. Aminokwasy 38-45 wydłużonego związku GLP-1 są korzystnie takimi samymi lub konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, jak aminokwasy w odpowiednich pozycjach glukagonu lub Eksendyny-4.

Związki GLP-1 według wynalazku obejmują analogi GLP-1. Analog GLP-1 wykazuje homologię do GLP-1(7-37)OH lub fragmentu GLP-1(7-37)OH, wystarczającą żeby posiadał on aktywność insulinotropową. Korzystnie analog GLP-1 ma sekwencję aminokwasową GLP-1(7-37)OH lub jego fragmentu, zmodyfikowaną w ten sposób, że od jednego, dwóch, trzech, czterech lub pięciu aminokwasów różni się od jednego, dwóch, trzech, czterech lub pięciu aminokwasów w odpowiednich pozycjach GLP-1(7-37)OH lub fragmentu GLP-1(7-37)OH. W nazewnictwie używanym tu do oznaczania związków GLP-1, podstawienia aminokwasowe i ich pozycje wskazane są przed strukturą wyjściową. Na przykład, Glu22-GLP-1(7-37)OH oznacza związek GLP-1, w którym glicyna normalnie znajdująca się w pozycji 22 GLP-1(7-37)OH został a zastąpiona przez kwas glutaminowy; Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH oznacza związek GLP-1, w którym alanina normalnie znajdująca się w pozycji 8 i glicyna normalnie znajdująca się w pozycji 22 GLP-1(7-37)OH zostały zastąpione, odpowiednio przez walinę i kwas glutaminowy.

Związki GLP-1 według wynalazku obejmują pochodne GLP-1. Pochodne GLP-1 określa się jako cząsteczki mające sekwencję aminokwasową GLP-1 lub analogów GLP-1, ale posiadające dodatkowo zmodyfikowane chemicznie jedną lub więcej bocznych grup aminokwasowych, atomów węgla w pozycji α, końcowych grup aminowych lub końcowych grup karboksylowych. Modyfikacje chemiczne obejmują, dodatkowe reszty chemiczne, tworzenie nowych wiązań chemicznych i usuwanie reszt chemicznych. Modyfikacje bocznych łańcuchów aminokwasowych obejmują, acylację grup ε-aminowych lizyny, N-alkilację argininy, histydyny lub lizyny, alkilację grup karboksylowych glutaminianu lub asparaginianu i deamidację glutaminianu lub asparaginianu. Modyfikacje końcowych grup aminowych obejmują, deaminację, N-podstawienia niższym alkilem, podwójne N-podstawienia niższym alkilem i N-acylowanie. Modyfikacje końcowych grup karboksylowych obejmują, modyfikacje grupami amidowymi, amidowymi niższego alkilu, dialkiloamidowymi i grupami estrowymi niższego alkilu. Niższy alkil oznacza C1-C4 alkil. Ponadto, jedna lub więcej bocznych grup lub końcowych grup może być chroniona grupami ochronnymi znanymi biegłym w chemii białek. Atomy węgla w pozycji α aminokwasów mogą być mono- lub dimetylowane.

PL 209 550 B1

Każdy związek GLP-1 może tworzyć część heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku, jeżeli sam związek GLP-1 zdolny jest do wiązania receptora GLP-1 i wywoływania sygnału zależnego od tego receptora. Wiązanie receptora GLP-1 i przekazywanie sygnału można oznaczyć za pomocą testów in vitro, takich jak testy opisane w Europejskim Dokumencie Patentowym EP 619322 i Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych 5120712.

Różne aktywne fragmenty GLP-1, analogi i pochodne znane są w stanie techniki i każdy z tych analogów i pochodnych także może być częścią heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku. Niektóre nowe przykłady analogów GLP-1, a także analogi i pochodne GLP-1 znane w stanie techniki pokazane są poniżej.

Niektóre analogi GLP-1 i fragmenty GLP-1 znane w stanie techniki obejmują, na przykład GLP-1(7-34) i GLP-1(7-35), GLP-1(7-36), Gln⁹-GLP-1(7-37), D-Gln⁹-GLP-1(7-37), Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1(7-37) i Lys¹⁸-GLP-1(7-37). Analogi GLP-1 takie jak GLP-1(7-34) i GLP-1(7-35) opisane są w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych 5118666. Znane są także podlegające obróbce biologicznej formy GLP-1, takie jak GLP-1(7-36), które mają działanie insulinotropowe. Inne związki GLP-1 o znanej aktywności biologicznej opisane są w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych 5977071 przyznanym Hoffmannowi i wsp., w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych 5545618 przyznanym Buckley'owi i wsp. i w Adelhorst i wsp., J. Biol. Chem. 269:6275 (1994).

Korzystna grupa analogów GLP-1 zawiera analogi GLP-1 o wzorze I (SEQ ID NO: 2)

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa40 41 42 43 44 45

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa

Wzór I (SEQ ID NO: 2) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 9 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 11 oznacza Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 14 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 17 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 19 oznacza Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 22 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 23 oznacza Gln, Asn, Arg, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 25 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 26 oznacza Lys, Arg, Gln, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza Leu, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 31 oznacza Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 32 oznacza Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 33 oznacza Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 34 oznacza Asn, Lys, Arg, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 35 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 36 oznacza Gly, Arg, Lys, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 38 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 39 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 40 oznacza Gly, Asp, Glu, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 41 oznacza Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

PL 209 550 B1

Xaa w pozycji 42 oznacza Ser, Pro, Lys, Glu, Asp lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 43 oznacza Ser, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 44 oznacza Gly, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

i Xaa w pozycji 45 oznacza Ala, Ser, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

z zastrzeżeniem, że jeżeli aminokwas w pozycji 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 lub 44 jest usunięty, to każdy aminokwas poniżej tego aminowkasu jest również usunięty.

Korzystnie jest, gdy związek GLP-1 o wzorze I zawiera mniej niż sześć aminokwasów, które różnią się od odpowiednich aminokwasów GLP-1(7-37)OH lub Eksendyny-4. Bardziej korzystnie jest, gdy związek GLP-1 zawiera mniej niż pięć aminokwasów, które różnią się od odpowiednich aminokwasów GLP-1 (7-37)OH lub Eksendyny-4. Jeszcze bardziej korzystnie jest, gdy związek GLP-1 zawiera mniej niż cztery aminokwasy, które różnią się od odpowiednich aminokwasów GLP-1(7-37)OH lub Eksendyny-4.

Związki GLP-1 według wynalazku obejmują pochodne związku o wzorze I, takie jak jego C-l-6-estry lub amidy lub C-l-6-alkiloamidy lub C-l-6-dialkiloamidy. W099/43706 opisuje pochodne związków GLP-1 o wzorze I i jest w całości włączony w zakres niniejszego wynalazku przez cytowanie. Związki o wzorze I derywatyzowane, tak jak opisano w W099/43706 i niederywatyzowane są włączone w zakres niniejszego wynalazku.

Inna korzystna grupa związków GLP-1 obejmuje analogi GLP-1 o wzorze II (SEQ ID NO: 3):

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Xaa-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37

Ile-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R

Wzór II (SEQ ID NO: 3) w którym:

Xaa w pozycji 7 oznacza: L-histydynę, D-histydynę, deaminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, α-fluorometylohistydynę lub α-metylohistydynę;

Xaa w pozycji 8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa w pozycji 9 oznacza: Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu lub His;

Xaa w pozycji 11 oznacza: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys lub His;

Xaa w pozycji 12 oznacza: His, Trp, Phe lub Tyr;

Xaa w pozycji 16 oznacza: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu lub Ala;

Xaa w pozycji 18 oznacza: His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala lub Lys;

Xaa w pozycji 22, oznacza: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg lub Cys;

Xaa w pozycji 23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu, Gln lub Arg;

Xaa w pozycji 24 oznacza: Glu, Arg, Ala lub Lys;

Xaa w pozycji 26 oznacza: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

Xaa w pozycji 31 oznacza: Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp lub Lys;

Xaa w pozycji 33 oznacza: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly lub Glu;

Xaa w pozycji 34 oznacza: Glu, Lys lub Asp;

Xaa w pozycji 35 oznacza: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His lub Glu;

Xaa w pozycji 36 oznacza: Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu lub His;

R w pozycji 37 oznacza: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro lub został usunięty.

Inna korzystna grupa związków GLP-1 obejmuje analogi GLP-1 o wzorze III (SEQ ID NO: 4):

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Xaa-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37

Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R

Wzór III (SEQ ID NO: 4) w którym:

PL 209 550 B1

Xaa w pozycji 8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa w pozycji 11 oznacza: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys lub His;

Xaa w pozycji 12 oznacza: His, Trp, Phe lub Tyr;

Xaa w pozycji 16 oznacza: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu lub Ala;

Xaa w pozycji 22: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg lub Cys;

Xaa w pozycji 23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu lub Gln;

Xaa w pozycji 24 oznacza: Glu, His, Ala lub Lys;

Xaa w pozycji 25 oznacza: Asp, Lys, Glu lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

Xaa w pozycji 33 oznacza: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly lub Glu;

Xaa w pozycji 34 oznacza: Glu, Lys lub Asp;

Xaa w pozycji 36 oznacza: Arg, Glu lub His;

Inna korzystna grupa związków GLP-1 obejmuje analogi GLP-1 o wzorze IV (SEQ ID NO: 5):

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-R Wzór IV (SEQ ID NO: 5) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met lub Thr;

Xaa w pozycji 12 oznacza: His, Trp, Phe lub Tyr;

Xaa w pozycji 16 oznacza: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu lub Ala;

Xaa w pozycji 22 oznacza: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg lub Cys;

Xaa w pozycji 23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu lub Gln;

Xaa w pozycji 26 oznacza: Asp, Lys, Glu lub His;

Xaa w pozycji 30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

Inna korzystna grupa związków GLP-1 obejmuje analogi GLP-1 o wzorze V (SEQ ID NO: 6):

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Lys-Glu-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R Wzór V (SEQ ID NO: 6) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa w pozycji 22 oznacza: Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg lub Cys;

Xaa w pozycji 23 oznacza: His, Asp, Lys, Glu lub Gln;

Xaa w pozycji 24 oznacza: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza: Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

PL 209 550 B1

Korzystne związki GLP-1 o wzorach I, II, III, IV i V obejmują analogi GLP-1 lub fragmenty analogów GLP-1 charakteryzujące się tym, że analogi te lub fragmenty zawierają aminokwasy inne niż alanina w pozycji 8 (w pozycji 8 analogów). Korzystnie jest, gdy analogi w pozycji 8 zawierają jedną lub więcej dodatkowych zmian w pozycjach 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36 i 37 w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami natywnego GLP-1(7-37)OH. Korzystnie jest także, gdy analogi te mają 6 lub mniej zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami natywnego GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)OH. Bardziej korzystne analogi mają 5 lub mniej zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami natywnego GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)OH lub mają 4 lub mniej zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami natywnego GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)OH. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy te analogi mają 3 lub mniej zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami natywnego GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)OH. Najbardziej korzystnie jest, gdy te analogi mają 2 lub mniej zmian w porównaniu z odpowiednimi aminokwasami natywnego GLP-1(7-37)OH lub GLP-1(7-36)OH.

Stwierdzono, że związki o wzorach II, III, IV i V cechują się zmniejszoną zdolnością do agregacji i tworzenia form nierozpuszczalnych. Jest to ważne także w kontekście białek fuzyjnych, w których relatywnie mały peptyd GLP-1 musi zachować aktywną konformację chociaż został połączony z dużo większym białkiem. Korzystne związki GLP-1 o wzorze II, III, IV i V obejmują białka fuzyjne według wynalazku zawierające analogi GLP-1 lub fragmenty analogów GLP-1, w których glicyna w pozycji 22 i korzystnie alanina w pozycji 8 został y zamienione na inny aminokwas.

Jeżeli w pozycji 22 znajduje się kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, arginina lub lizyna, w pozycji 8 korzystnie znajduje się glicyna, walina, leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a bardziej korzystnie walina lub glicyna. Jeżeli w pozycji 22 znajduje się kwas sulfonowy, taki jak kwas cysteinowy, w pozycji 8 korzystnie znajduje się glicyna, walina, leucyna, izoleucyna, seryna, treonina lub metionina, a bardziej korzystnie walina lub glicyna.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1 o wzorze IV (SEQ ID NO:5), które mają sekwencję GLP-1(7-37)OH, z zastrzeżeniem, że aminokwas w pozycji 8 korzystnie oznacza glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę i w pozycji 30 znajduje się kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, seryna lub histydyna, a bardziej korzystnie kwas glutaminowy.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1 o wzorze IV (SEQ ID NO:5), które mają sekwencję GLP-1(7-37)OH, z zastrzeżeniem, że aminokwas w pozycji 8 korzystnie oznacza glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę i w pozycji 37 znajduje się histydyna, lizyna, arginina, treonina, seryna, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina, a bardziej korzystnie histydyna.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1 o wzorze IV (SEQ ID NO:5), które mają sekwencję GLP-1(7-37)OH, z zastrzeżeniem, że aminokwas w pozycji 8 korzystnie oznacza glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę i w pozycji 22 znajduje się kwas glutaminowy, lizyna, kwas asparaginowy lub arginina, a bardziej korzystnie kwas glutaminowy lub lizyna i w pozycji 23 znajduje się lizyna, arginina, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy lub histydynę, a bardziej korzystnie lizyna lub kwas glutaminowy.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1 o wzorze V (SEQ ID NO:6), które mają sekwencję GLP-1(7-37)OH, z zastrzeżeniem, że aminokwas w pozycji 8 korzystnie oznacza glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę i w pozycji 22 znajduje się kwas glutaminowy, lizyna, kwas asparaginowy lub arginina, a bardziej korzystnie kwas glutaminowy lub lizyna i w pozycji 27 znajduje się alanina, lizyna, arginina, tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina lub histydynę, a bardziej korzystnie alanina.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1 o wzorze II, znamienne tym, że mają sekwencję GLP-1(7-37)OH, z zastrzeżeniem, że aminokwas w pozycji 8 i jeden, dwa lub trzy aminokwasy wybrane z grupy obejmującej pozycję 9, pozycję 11, pozycję 12, pozycję 16, pozycję 18, pozycję 22, pozycję 23, pozycję 24, pozycję 26, pozycję 27, pozycję 30, pozycję 31, pozycję 33, pozycję 34, pozycję 35, pozycję 36 i pozycję 37 różnią się od aminokwasów w odpowiednich pozycjach natywnego GLP-1(7-37)OH.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1 o wzorze II obejmują:

PL 209 550 B1

Glu²²-GLP-1(7-37)

Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Glu²²-GLP-1(7-37)OH,

OH,

Val⁸

Val⁸-Cys²²-GLP-1Val⁸-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-GLP-1(7-37)OH,

Arg²²-GLP-1(7-37)OH, Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Cys²²-GLP-1(7-37)OH,

Val⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Arg²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH,

-(7-37)OH, Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Arg²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Cys²²-GLP-1(7-37)OH, Glu²²-GLP-1(7-36)OH, Asp²²-GLP-1(7-36)OH, Arg²²-GLP-1(7-36)OH, Lys²²-GLP-1(7-36)OH, Cys²²-GLP-1(7-36)OH, Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)OH, Val⁸Asp²²-GLP-1(7-36)OH, Val⁸-Arg²²-GLP-1(7-36)OH, Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)OH, Val⁸-Cys²²-GLP-1(7-36)OH, Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)OH, Gly⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)OH, Gly⁸-Arg²²-GLP-1(7-36)OH, Gly⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)OH, Gly⁸-Cys²²-GLP-1(7-36)OH, Lys²³-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Lys²³-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Lys²³-GLP-1(7-37)OH, His²⁴-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-His²⁴-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-His²⁴-GLP-1(7-37)OH, Lys²⁴-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Lys²⁴-GLP-1(7-37) OH, Gly⁸-Lys²³-GLP-1(7-37)OH, Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Asp³⁰-GPL-1(7-37)OH, Val⁸-Asp³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Asp³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gln³⁰-GPL-1(7-37)OH, Val⁸-Gln³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Gln³⁰-GLP-1(7-37)OH, Tyr³⁰-GLP-1 (7-37)OH, Val⁸-Tyr³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Tyr³⁰-GLP-1(7-37)OH, Ser³⁰-GLP-1(7-37)-OH, Val⁸-Ser³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Ser³⁰-GLP-1(7-37)OH, His³⁰-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-His³⁰-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-His³⁰-GLP-1(7-37)OH, Glu³⁴-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu³⁴-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Glu³⁴-GLP-1(7-37)OH, Ala³⁴-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Ala³⁴-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Ala³⁴-GLP-1(7-37)OH, Gly³⁴-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Gly³⁴-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Gly³⁴-GLP-1(7-37)OH, Ala³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val³-Ala³⁵-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Ala³⁵-GLP-1(7-37)OH, Lys³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Lys³⁵-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Lys³⁵-GLP-1(7-37)OH, His³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-His³⁵-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-His³⁵-GLP-1(7-37)-OH, Pro³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Pro³⁵-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Pro³⁵-GLP-1(7-37)OH, Glu³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu³⁵-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Glu³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-His³⁷-GLP-1-(7-37)OH, Val⁸-Glu²²-Lys²³-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu²²-Glu²³-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Gly³⁴-Lys³⁵-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Lys²²-Glu²³-GLP-1(7-37)OH i Gly⁸-Lys²²-Glu²³-GLP-1(7-37)OH.

Inna korzystna grupa analogów i pochodnych GLP-1 według wynalazku obejmuje cząsteczki o wzorze VI (SEQ ID NO: 7)

R1-X-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Y-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Z-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R2

Wzór VI (SEQ ID NO: 7) w którym: R1 wybiera się z grupy zawierającej L-histydynę, D-histydynę, deaminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, alphafluorometylohistydynę i alpha-metylohistydynę; X wybiera się z grupy zawierającej Ala, Gly, Val, Thr, Ile i alpha-metylo-Ala; Y wybiera się z grupy zawierającej Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly; Z wybiera się z grupy zawierającej Glu, Gln, Ala, Thr, Ser i Gly; i R2 oznacza Gly-OH.

Inna korzystna grupa analogów i pochodnych GLP-1 według wynalazku jest opisana w WO 91/11457 i obejmuje zasadniczo GLP-1(7-34), GLP-1(7-35), GLP-1(7-36) lub GLP-1(7-37) lub ich formy amidowe i ich akceptowane farmaceutycznie sole, mające przynajmniej jedną modyfikację wybraną z grupy zawierającej:

(a) podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, argininy lub D-lizyny za lizynę w pozycji 26 i/lub w pozycji 34; lub podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny, fenyloalaniny, lizyny lub D-argininy za argininę w pozycji 36;

(b) podstawienie opornego na utlenianie aminokwasu za tryptofan w pozycji 31;

(c) podstawienie przynajmniej jednego z: tyrozyna za walinę w pozycji 16; lizyna za serynę w pozycji 18; kwas asparaginowy za kwas glutaminowy w pozycji 21; seryna za glicynę w pozycji 22; arginina za glutaminę w pozycji 23; arginina za alaninę w pozycji 24 i glutamina za lizynę w pozycji 26; i (d) podstawienie przynajmniej jednego z: glicyna, seryna lub cysteina za alaninę w pozycji 8; kwas asparaginowy, glicyna, seryna, cysteina, treonina, asparagina, glutamina, tyrozyna, alanina, walina, izoleucyna, leucyna, metionina lub fenyloalanina za kwas glutaminowy w pozycji 9; seryna, cysteina, treonina, asparagina, glutamina, tyrozyna, alanina, walina, izoleucyna, leucyna, metionina lub fenyloalanina za glicynę w pozycji 10; i kwas glutaminowy za kwas asparaginowy w pozycji 15; i

PL 209 550 B1 (e) podstawienie glicyny, seryny, cysteiny, treoniny, asparaginy, glutaminy, tyrozyny, alaniny, waliny, izoleucyny, leucyny, metioniny lub fenyloalaniny lub D- lub N-acylowanej lub alkilowanej formy histydyny za histydynę w pozycji 7;

przy czym w podstawieniach (a), (b), (d) i (e) podstawiane aminokwasy mogą być ewentualnie formą w konformacji D i podstawiane aminokwasy w pozycji 7 mogą być ewentualnie w formie N-acylowanej lub N-alkilowanej.

Ponieważ enzym, dipeptydylopeptydaza IV (DPP IV), może powodować obserwowaną in vivo gwałtowną inaktywację podawanego GLP-1 [patrz, na przykład Mentlein, R. i wsp., Eur. J. Biochem., 214:829-835 (1993)], w kontekście białek fuzyjnych korzystne są więc analogi i pochodne GLP-1, które są chronione przed działaniem DPP IV. Bardziej korzystne są białka fuzyjnie charakteryzujące się tym, że są następującymi zawiązkami GLP-1: Gly⁸-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-GLP-1(7-37)OH, α-metylo-Ala⁸-GLP-1(7-37)OH lub Gly⁸-Gln²¹-GLP-1(7-37)OH.

Inna korzystna grupa analogów i pochodnych GLP-1 według wynalazku obejmuje związki o wzorze VII (SEQ ID NO: 8) zastrzeżone w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5512549, który jest włączony w zakres sposobu według wynalazku przez cytowanie.

R¹Ala-Glu-Gly¹⁰Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-R³ ^| _R2

Wzór VII (SEQ ID NO: 8) w którym R¹ wybiera się z grupy zawierającej 4-imidazolopropionyl, 4-imidazoloacetyl lub 4-imidazolo-a,a-dimetyloacetyl; R² wybiera się z grupy zawierającej C₆-C₁₀ nierozgałęziony acyl lub został usunięty; R³ wybiera się z grupy zawierającej Gly-OH lub NH2; i Xaa oznacza Lys lub Arg.

Bardziej korzystne związki o wzorze IV według wynalazku są związkami, w których Xaa oznacza Arg i R2 oznacza C6-C10 nierozgałęziony acyl. Nawet bardziej korzystne związki o wzorze IV według wynalazku są związkami, w których Xaa oznacza Arg, R2 oznacza C6-C10 nierozgałęziony acyl i R3 oznacza Gly-OH. Inne bardzo korzystne związki o wzorze IV według wynalazku są związkami, w których Xaa oznacza Arg, R2 oznacza C6-C10 nierozgałęziony acyl, R3 oznacza Gly-OH i R1 oznacza

4-imidazolopropionyl. Szczególnie korzystny związek o wzorze IV według wynalazku jest związkiem, w którym Xaa oznacza Arg, R2 oznacza C8 nierozgałęziony acyl, R3 oznacza Gly-OH i R1 oznacza

4-imidazolopropionyl.

Korzystnie, związki GLP-1 obejmują analogi GLP-1, charakteryzujące się tym, że szkielet takich analogów lub fragmentów zawiera aminokwas inny niż alanina w pozycji 8 (w pozycji 8 analogu). Szkielet może także zawierać L-histydynę, D-histydynę lub zmodyfikowane formy histydyny, takie jak deaminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, α-fluorometylohistydynę lub α-metylohistydynę w pozycji 7. Korzystnie jest, gdy takie analogi w pozycji 8 zawierają jedną lub więcej dodatkowych zmian w pozycjach 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 i 37 w porównaniu do aminokwasów w odpowiednich pozycjach natywnego GLP-1(7-37)OH. Bardziej korzystnie jest, gdy takie analogi w pozycji 8 zawierają jedną lub więcej dodatkowych zmian w pozycjach 16, 18, 22, 25 i 33 w porównaniu do aminokwasów w odpowiednich pozycjach natywnego GLP-1(7-37)OH.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 12 wybiera się z grupy zawierającej tryptofan lub tyrozynę. Bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 12, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę lub metioninę, a bardziej korzystnie przez walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 12 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 16 wybiera się z grupy zawierającej tryptofan, izoleucynę, leucynę, fenyloalaninę lub tyrozynę. Bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 16, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy oprócz podstawienia w pozycji 16 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy oprócz podstawienia w pozycji 16 i 8, aminokwas w pozycji 30

PL 209 550 B1 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy oprócz podstawienia w pozycji 16 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 18 wybiera się z grupy zawierającej tryptofan, tyrozynę, fenyloalaninę, lizynę, leucynę lub izoleucynę, korzystnie tryptofan, tyrozynę i izoleucynę. Bardziej korzystnie jest, gdy oprócz podstawienia w pozycji 18, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy oprócz podstawienia w pozycji 18 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy oprócz podstawienia w pozycji 18 i 8, aminokwas w pozycji 30 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy oprócz podstawienia w pozycji 18 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 19 wybiera się z grupy zawierającej tryptofan, fenyloalaninę, korzystnie tryptofan. Bardziej korzystnie jest, gdy poza podstawieniem w pozycji 19, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy poza podstawieniem w pozycji 19 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy poza podstawieniem w pozycji 19 i 8, aminokwas w pozycji 30 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy poza podstawieniem w pozycji 19 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 20 jest fenyloalaniną, tyrozyną lub tryptofanem. Bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 20, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 20 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 20 i 8, aminokwas w pozycji 30 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 20 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 25 wybiera się z grupy zawierającej walinę, izoleucynę, leucynę, korzystnie walinę. Bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 25, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 25 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 25 i 8, aminokwas w pozycji 30 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 25 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 27 wybiera się z grupy zawierającej izoleucynę lub alaninę. Bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 27, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 27 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 27 i 8, aminokwas w pozycji 30 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 27 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

W innym korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, analogiem GLP-1 jest GLP-1(7-37)OH charakteryzujący się tym, że aminokwas w pozycji 33 jest izoleucyną. Bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 33, aminokwas w pozycji 8 podstawiony jest przez glicynę, walinę, leucynę, izoleucynę, serynę, treoninę, lub metioninę, a bardziej korzystnie walinę lub glicynę. Nawet bardziej korzystnie jest, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 33 i 8, aminokwas w pozycji 22 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 33 i 8, aminokwas w pozycji 30 podstawiony jest przez kwas glutaminowy. Korzystnie jest

PL 209 550 B1 także, gdy w dodatku do podstawienia w pozycji 33 i 8, aminokwas w pozycji 37 podstawiony jest przez histydynę.

Związki GLP-1 mają modyfikacje w jednej lub więcej następujących pozycji: 8, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 i 37. Takie związki GLP-1 wykazują zwiększone działanie w porównaniu z GLP-1-(7-37)OH i zawierają sekwencję amino-kwasową o wzorze IX (SEQ ID NO: 12)

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-SerXaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Gln-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Arg-Xaa37

Wzór IX (SEQ ID NO: 12) w którym:

Xaa₇ oznacza: L-histydynę, D-histydynę, deaminohistydynę, 2-aminohistydynę, β-hydroksyhistydynę, homohistydynę, α-fluorometylohistydynę lub α-metylohistydynę;

Xaa8 oznacza: Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

Xaa12 oznacza: Phe, Trp lub Tyr;

Xaa16 oznacza: Val, Trp, Ile, Leu, Phe lub Tyr;

Xaa18 oznacza: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;

Xaa19 oznacza: Tyr, Trp lub Phe;

Xaa20 oznacza: Leu, Phe, Tyr lub Trp;

Xaa22 oznacza: Gly, Glu, Asp lub Lys ;

Xaa25 oznacza: Ala, Val, Ile lub Leu;

Xaa27 oznacza: Glu, Ile lub Ala;

Xaa30 oznacza: Ala lub Glu Xaa33 oznacza: Val lub Ile; i Xaa37 oznacza: Gly, His,NH2 lub został usunięty

Niektóre korzystne związki GLP-1 o wzorze IX obejmują GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)-NH2,

Gly⁸-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-GLP-1(7-36)NH2, Leu⁸-GLP1(7-37)OH, Leu⁸-GLP-1(7-36)NH2, Ile⁸-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-GLP-1(7-36)NH2, Ser⁸-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-GLP-1(7-36)NH2, Thr⁸-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-Tyr¹²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸16

Tyr12-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-Tyr¹⁶-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Tyr¹⁶-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)

OH, Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-Asp²GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Gly⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)NH2, Gly⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-Lys²²GLP-1(7-36)NH2, Leu⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Ile⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Leu⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Ile⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Leu⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)-NH2, Ile⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)NH2, Ser⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Thr⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Ser⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Thr⁸-Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸-Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Ser⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)NH2, Thr⁸-Lys²²-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸-Lys²²-GLP-1(7-36)NH2, Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Glu²²-GLP-1(7-36)NH2, Asp²²-GLP-1(7-37)OH, Asp²²-GLP-1(7-36)NH2, Lys22-GLP-1(737)OH, Lys²²-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-36)NH2, Gly⁸-Glu-GLP-1(7-37)OH, Gly-Glu-GLP-1(7-36) NH2, Leu-Glu-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-36)NH2, Ile8-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-Glu³⁰-GLP-1(736)NH2, Ser⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-36)NH2, Thr⁸-Glu³⁰-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸Glu³⁰-GLP-1(7-36)NH2, Val⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-His³⁷-GLP-1(7-36)NH2, Gly⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Gly⁸-His³⁷-GLP-1(7-36)NH2, Leu⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Leu⁸-His³⁷-GLP-1(7-36)NH2, Ile⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Ile⁸-His³⁷-GLP-1(7-36)NH2, Ser⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Ser⁸-His³⁷-GLP-1(7-36)-NH2, Thr⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH, Thr⁸-His³⁷-GLP-1(7-36)NH2.

Niektóre korzystne związki GLP-1 o wzorze IX, mające wielokrotne podstawienia, obejmują GLP-1(7-37)OH charakteryzują się tym, że w pozycji 8 ma walinę lub glicynę, w pozycji 22 ma kwas glutaminowy, w pozycji 16 ma tyrozynę, leucynę lub tryptofan, w pozycji 18 ma tyrozynę, tryptofan lub izoleucynę, w pozycji 25 ma walinę i w pozycji 33 ma izoleucynę.

Inne korzystne związki GLP-1 obejmują następujące związki: Val⁸-Tyr¹⁶-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Tyr¹²-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Tyr¹⁶-Phe¹⁹-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Tyr¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37) OH, Val⁸-Trp¹⁵-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Leu¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Ile¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸PL 209 550 B1

Phe¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Trp¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸-Tyr¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH, Val⁸Phe¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH i Val⁸-Ile¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH.

Związki GLP-1 według wynalazku obejmują także związki typu Eksendyn. Eksendyna-3 i Eksendyna-4 są biologicznie aktywnymi peptydami, wyizolowanymi po raz pierwszy z jadu jaszczurek z rodziny Helodermatidae. Wykazano, że wiążą się one z receptorem GLP-1 i stymulują zależne od cAMP wytwarzanie H⁺ w ssaczych komórkach okładzinowych. Eksendyna-3 i Eksendyna-4 są peptydami aminokwasowymi, które w około 53% są homologiczne do GLP-1. Działają one jak silni agoniści aktywności GLP-1. Co ciekawe, pochodna Eksendyny z usuniętą częścią N-końca, znana jako Eksendyna(aminokwasy 9-39), jest inhibitorem Eksendyny-3, Eksendyny-4 i GLP-1.

Związek typu Eksendyna typowo zawiera polipeptyd mający sekwencję aminokwasową Eksendyny-3, Eksendyny-4 lub jego analog lub fragment. Eksendyna-3 i Eksendyna-4 są opisane w Dokumencie Patentowym Stanow Zjednoczonych Ameryki No. 5424286.

Eksendyna-3 ma sekwencję aminokwasową pokazaną jako SEQ ID NO: 9:

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser40 41 42 43 44 45

Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9)

Eksendyna-4 ma sekwencję aminokwasową pokazaną jako SEQ ID NO: 10:

8 9 10 11 12 13 14 15 16; 17

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 23

Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser40 41 42 43 44 45

Gly-Ala-Pro-Pro- Pro-Ser (SEQ ID NO: 10

Związki GLP -1 obejmują także fragmenty Eksendyn, które są polipeptydami otrzymanymi przez usunięcie jednego lub więcej aminokwasów z N-końca i/lub C-końca Eksendyny lub analogu Eksendyny. Ponadto, związki GLP-1 obejmują polipeptydy Eksendyn, w których jeden lub więcej aminokwasów zostało dodanych do N-końca i/lub C-końca Eksendyny lub jej fragmentu. Tego typu związki Eksendyn mają do około czterdziestu pięciu aminokwasów.

Związki GLP-1 obejmują także analogi Eksendyny. Analog Eksendyny ma homologię do Eksendyny-4, Eksendyny-3 lub ich fragmentu wystarczającą, żeby ten analog wykazywał aktywność insulinotropową. Aktywność fragmentów i/lub analogów Eksendyny bada się testami in vitro, takimi jak te opisane w Europejskim Dokumencie Patentowym EP 619322 i Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki No. 5120712.

Korzystnie, analog Eksendyny ma sekwencję aminokwasową Eksendyny-4 lub jej fragmentu, zmodyfikowaną tak, że od jednego, dwóch, trzech, czterech lub pięciu aminokwasów różni się od aminokwasów w odpowiednich pozycjach Eksendyny-4 lub fragmentu Eksendyny-4. W nazewnictwie tu stosowanym do oznaczania związków typu Eksendyna, podstawiony aminokwas i jego pozycja wskazane są przed strukturą wyjściową. Na przykład, Val⁸-Eksendyna-4 oznacza związek typu Eksendyna, w którym glicyna normalnie znajdująca się w pozycji 8 Eksendyny-4 została zastąpiona walinę.

Inna korzystna grupa związków GLP-1 obejmuje analogi GLP-1/Eksendyny-4 o wzorze VIII (SEQ ID NO:11).

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37

Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-R

PL 209 550 B1 wzór VIII (SEQ ID NO: 11) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza: Gly, Ala lub Val;

Xaa w pozycji 16 oznacza: Leu lub Val;

Xaa w pozycji 18 oznacza Lys lub Ser;

Xaa w pozycji 19 oznacza: Xaa w pozycji 20 oznacza: Xaa w pozycji 22 oznacza: Xaa w pozycji 23 oznacza: Xaa w pozycji 25 oznacza: Xaa w pozycji 26 oznacza: Xaa w pozycji 27 oznacza: Xaa w pozycji 30 oznacza: Xaa w pozycji 33 oznacza: Xaa w pozycji 34 oznacza: Xaa w pozycji 36 oznacza:

: Gln lub Tyr;

: Met lub Leu;

: Glu lub Gln;

: Val lub Ala;

: Arg lub Lys;

: Leu lub Glu;

: Glu lub Ala;

: Val lub Lys;

: Asn lub Lys;

: Gly lub Arg; i

R w pozycji 37 oznacza: Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser lub został usunięty. Aktywność 18 różnych związków które zostały zakwalifikowane do tej grupy pokazano w tabeli 6.

Ponadto analogi Eksendyny, które są użyteczne według wynalazku są opisane w publikacji patentowej PCT WO 99/25728 (Beeley i wsp.), WO 99/25727 (Beeley i wsp.), WO 98/05351 (Young i wsp.), WO 99/40788 (Young i wsp.), WO 99/07404 (Beeley i wsp.) i WO 99/43708 (Knudsen i wsp).

Białka fuzyjne GLP-1 według wynalazku mogą zawierać miejsca glikozylacji. Glikozylacja jest modyfikacją chemiczną, w której do białka dodawane są w określonych miejscach reszty cukrowe. Glikozylacja białek pełni ważną rolę w zapewnieniu odpowiedniego ładunku, konformacji i stabilności dojrzałego białka i może kierować białko na powierzchnię komórki i ewentualnie powodować wydzielanie białka. Najważniejsze jednak jest, że glikozylacja wpływa na tempo klirensu in vivo wielu białek. Reszty cukrowe mogą być połączone przez atom tlenu lub przez atom azotu. Generalnie, reszty cukrowe połączone przez atom tlenu dodawane są do tlenu grupy hydroksylowej seryny i treoniny, a reszty cukrowe połączone przez atom azotu dodawane są do azotu grupy amidowej asparaginy. Ujednoliconym miejscem N-glikozylacji jest Asn X1 X2, w którym X1 oznacza każdy aminokwas oprócz Pro, a X2 oznacza Ser lub Thr.

Związki GLP-1 nie są zwykle glikozylowane in vivo. Jednakże, białka fuzyjne GLP-1 według wynalazku które zawierają związek GLP-1 z końcem C połączonym z sekwencją Fc jest glikozylowane na ostatniej serynie w C-końcowego rozszerzenia (SSGAPPPS*) i na treoninie w pozycji 11 regionu N-końcowego Fc (AEPKSCDKTHT*CPPC . . .).

Heterogenne białka fuzyjne poprzez połączenie z albuminą:

Opisane powyżej związki GLP-1 można połączyć poprzez fuzję bezpośrednio lub przez łącznik peptydowy z albuminą, jej fragmentem lub pochodną.

Ogólnie białka typu albuminy będące częścią białka fuzyjnego według wynalazku pochodzą od albuminy zklonowanej z dowolnego gatunku. Jednakże, ludzka albumina i jej fragmenty i analogi są korzystne ponieważ zmniejszają ryzyko wywołania przez białko fuzyjne odpowiedzi immunologicznej u ludzi. Albumina surowicy ludzkiej (HSA) zawiera pojedynczy nieglikozylowany łańcuch polipeptydowy o wielkości 585 aminokwasów, o ciężarze cząsteczkowym 66500. Sekwencja aminokwasowa ludzkiej HSA pokazana jest na fig. 2 [Patrz Meloun i wsp. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens i wsp. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn i wsp. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; Minghetti i wsp. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747]. Opisano także różne warianty polimorficzne, a także analogi i fragmenty albuminy [Patrz Weitkamp i wsp., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219]. Na przykład, w Europejskim Dokumencie Patentowym EP 322094, twórcy opisują różne krótsze formy HSA. Niektóre z tych fragmentów obejmują HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369) i HSA(1-419) i fragmenty pomiędzy 1-369 i 1-419. Europejski Dokument Patentowy EP 399666 opisuje fragmenty albuminy, które obejmują HSA(1-177) i HSA(1-200) i fragmenty pomiędzy HSA(1-177) i HSA(1-200). Zrozumiałe jest, że heterogenne białka fuzyjne według wynalazku obejmują związki GLP-1, które są połączone z dowolnym fragmentem, analogiem i pochodną białka albuminy, pod warunkiem, że takie białko połączone jest aktywne biologicznie i ma dłuższy czas półtrwania w surowicy niż sam związek GLP-1.

PL 209 550 B1

Część albuminowa białka fuzyjnego nie musi mieć koniecznie czasu półtrwania w surowicy równego czasowi półtrwania w surowicy natywnej ludzkiej albuminy. Można wytworzyć lub już są znane fragmenty, analogi i pochodne albuminy, które mają dłuższe czasy półtrwania lub mają czasy półtrwania pomiędzy czasem półtrwania natywnej ludzkiej albuminy i czasem półtrwania interesującego związku

GLP-1.

Heterogenne białka fuzyjne według wynalazku obejmują białka mające jako części białka fuzyjnego konserwatywnie podstawione aminokwasowo związki GLP-1 i albuminę. Konserwatywne podstawienie oznacza zastąpienie aminokwasu przez inny aminokwas mający taki sam całkowity ładunek elektryczny i w przybliżeniu taką samą wielkość i kształt. Aminokwasy z alifatycznymi lub podstawionymi alifatycznymi łańcuchami bocznymi mają w przybliżeniu taką samą wielkość, jeżeli całkowita liczba atomów węgla i heteroatomów ich łańcuchów bocznych różni się nie więcej niż o około cztery. Mają one w przybliżeniu taki sam kształt, jeżeli liczba rozgałęzień ich łańcuchów bocznych różni się nie więcej niż o jeden. Przyjmuje się, że aminokwasy z grupami fenylowymi lub podstawionymi grupami fenylowymi w łańcuchach bocznych mają w przybliżeniu taką samą wielkość i kształt. Jeżeli specjalnie nie napisano inaczej, do konserwatywnych podstawień korzystnie stosuje się aminokwasy występujące w naturze.

Termin aminokwas użyty jest tu w swoim szerszym sensie i obejmuje aminokwasy występujące w naturze, a także aminokwasy nie występujące w naturze, włączając analogi i pochodne aminokwasów. Te drugie obejmują cząsteczki mające resztę aminokwasową. Fachowcy w tej dziedzinie wiedzą, że w świetle tej szerszej definicji zawarte tu odwołania do aminokwasów obejmują, na przykład, występujące w naturze proteogenne L-aminokwasy; D-aminokwasy; chemicznie zmodyfikowane aminokwasy, takie jak analogi i pochodne aminokwasów; występujące w naturze nieproteogenne aminokwasy, takie jak norleucyna, β-alanina, ornityna, GABA; i chemicznie zsyntetyzowane związki mające znane w tej dziedzinie własności charakterystyczne dla aminokwasów. Użyty tu termin proteogenny oznacza, że w wyniku metabolizmu komórkowego aminokwas może być włączony w peptyd, polipeptyd lub białko.

Włączenie w heterologiczne białka fuzyjne według wynalazku nie występujących w naturze aminokwasów, włączając aminokwasy syntetyczne, aminokwasy podstawione lub jeden lub więcej D-aminokwasów może być korzystne na kilka sposobów. W porównaniu do peptydów zawierających L-aminokwasy, peptydy zawierające D-aminokwasy wykazują zwiększoną stabilność in vitro lub in vivo. Zatem wytworzenie peptydów zawierających D-aminokwasy jest szczególnie użyteczne, gdy konieczna jest lub pożądana jest większa wewnątrzkomórkowa, stabilność. Jeżeli takie cechy są pożądane, można zastosować D-peptydy, które są oporne na endogenne peptydazy i proteazy, zapewniając w sposób lepszą biodostępność cząsteczek i wydłużony czas półtrwania in vivo. Ponadto, D-peptydy nie są wydajnie przekształcane i prezentowane na białkach głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II, co ogranicza ich prezentację pomocniczym komórkom T, i dlatego jest mniej prawdopodobne, że wywołają humoralną odpowiedź immunologiczną całego organizmu.

Oprócz analizy zależności struktura/funkcja różnych polipeptydów według wynalazku, istnieje wiele czynników, które należy wziąć pod uwagę, gdy wybiera się aminokwasy do podstawień. Jednym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę robiąc takie zmiany jest indeks hydropatyczny aminokwasu. Ważność indeksu hydropatycznego aminokwasu dla uzyskania funkcji biologicznej białka była dyskutowana przez Kyte'a i Doolittle'a (1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132). Przyjmuje się, że względnie hydropatyczny charakter aminokwasu bierze udział w kształtowaniu się struktury drugorzędowej powstałego białka. To z kolei wpływa na oddziaływania białka z cząsteczkami, takimi jak enzymy, substraty, receptory, ligandy, DNA, przeciwciała, antygeny. W oparciu o charakterystykę hydrofobowości i ładunku, wszystkie aminokwasy mają przypisany następujący indeks hydropatyczny: izoleucyna (+4,5); walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian/glutamina/asparaginian/asparagina (-3,5); lizyna (-3,9) i arginina (-4,5).

Fachowcy w tej dziedzinie wiedzą, że pewne aminokwasy w peptydach, polipeptydach lub białkach można podstawić innymi aminokwasami mającymi podobne indeks lub wartość hydropatyczną i otrzymać peptyd mający podobną lub nawet lepszą aktywność biologiczną. Robiąc takie zmiany, korzystnie jest, gdy zamieniane aminokwasy mają indeksy hydropatyczne różniące się o ±2. Bardziej korzystnymi podstawieniami są te, w których aminokwasy mają indeksy hydropatyczne różniące się o ±1. Najbardziej korzystnymi podstawieniami są te, w których aminokwasy mają indeksy hydropatyczne różniące się o ±0,5.

PL 209 550 B1

Aminokwasy można podstawiać także w oparciu o hydrofilowość. Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki No. 4554101 opisuje, że największa miejscowa średnia hydrofilowość białka, oznaczona w oparciu o hydrofilowość otaczających aminokwasów, koreluje z własnościami biologicznymi tego białka. Następujące wartości hydrofilowości zostały przypisane określonym aminokwasom: arginina/lyzyna (+3,0); asparaginian/glutaminian (+3,0±1); seryna (+0,3); asparagina/glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina/histydyna (-0,5); cysteina (-1,0); metionina (-1,3); walina (-1,5); leucyna/izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5) i tryptofan (-3,4). Jeden aminokwas w peptydzie, polipeptydzie lub białku można podstawić innym aminokwasem mającym podobną wartość hydrofilowości i otrzymuje się peptyd mający podobną aktywność biologiczną, to znaczy ciągle posiadający odpowiednie funkcje biologiczne. Robiąc takie zmiany korzystnie jest, gdy zamieniane aminokwasy mają indeksy hydropatyczne różniące się o ±2, bardziej korzystnie zamieniane aminokwasy mają indeksy hydropatyczne różniące się o ±1, najbardziej korzystnie zamieniane aminokwasy mają indeksy hydropatyczne różniące się o ±0,5.

Jak omówiono powyżej, podstawienia aminokwasowe w białku fuzyjnym według wynalazku robi się w oparciu o względne podobieństwa łańcuchów bocznych podstawianych aminokwasów. Na przykład, ich hydrofobowość, hydrofilowość, ładunek, wielkość. Ponadto, podstawienia można zrobić w oparciu o własności struktury drugorzędowej. Na przykład, aminokwas helikalny można zastąpić aminokwasem, który utrzyma strukturę helikalną. Przykładowe podstawienia, które spełniają różne wymienione wymagania, i które można wziąć pod uwagę robiąc konserwatywne zmiany aminokwasowe w celu wprowadzenia cichych zmian w peptydach według wynalazku, wybiera się wśród aminokwasów należących do tej samej klasy, do której należą aminokwasy występujące w naturze. Aminokwasy dzieli się na cztery grupy: (1) aminokwasy kwasowe; (2) aminokwasy zasadowe; (3) neutralne polarne aminokwasy i (4) neutralne niepolarne aminokwasy.

Ogólne metody otrzymywania heterologicznych białek fuzyjnych według wynalazku

Chociaż heterologiczne białka fuzyjne według wynalazku można otrzymać różnymi metodami, korzystne są metody rekombinacji. Tak jak tu opisano i zastrzeżono, dla celów tego wynalazku zdefiniowano poniżej ogólne terminy i skróty używane w biologii molekularnej. Terminy i skróty używane w tym dokumencie, uż ywane są w ich normalnym znaczeniu, chyba że napisano inaczej. Na przykład, „°C” oznacza stopień Celsjusza; „mmol” oznacza milimol lub milimole; „mg” oznacza miligramy; „gg” oznacza mikrogramy; „ml” lub „Ml” oznacza mililitry i „gl” lub „gL” oznacza to mikrolitry. Skróty aminokwasów opisane są w 37 C.F.R. § 1.822 (b)(2) (1994).

Użyty tu termin „para zasad” lub „pz” odnosi się do DNA lub RNA. Skróty A, C, G i T oznaczają, odpowiednio 5'-jednofosforanowe formy deoksyrybonukleozydów (deoksy)adenozynę, (deoksy)cytydynę, (deoksy)guanozynę i tymidynę, jeżeli występują w cząsteczce DNA. Skróty U, C, G i A odpowiednio 5'-jednofosforanowe formy rybonukleozydów urydynę, cytydynę, guanozynę i adenozynę, jeżeli występują w cząsteczce RNA. W dwuniciowym DNA, para zasad odnosi się do sparowanych zasad A z T lub C z G. W heterodupleksach DNA/RNA, para zasad może odnosi się do sparowanych zasad A z U lub C z G. (Patrz poniżej na definicję terminu „komplementarny”).

Termin „trawienie” lub „restrykcyjny” w odniesieniu do DNA oznacza katalityczne ciecie DNA przez enzymy restrykcyjne, które działają tylko na określone sekwencje DNA („endonukleazy specyficzne dla sekwencji”). Różne enzymy restrykcyjne użyte w wynalazku są dostępne w handlu. Fachowcom znane są także warunki reakcji, kofaktory i inne wymogi niezbędne do działania tych enzymów.

Bufory i ilości substratu odpowiednie dla poszczególnych enzymów restrykcyjnych określone są przez wytwórcę lub można je łatwo znaleźć w literaturze.

„Ligacja” oznacza proces tworzenia wiązań fosfodiesterowych pomiędzy dwoma fragmentami dwuniciowego kwasu nukleinowego. Jeżeli nie napisano inaczej, łączenie prowadzi się w odpowiednich warunkach przy użyciu znanych buforów i ligazy DNA, takiej ligaza DNA faga T4.

„Plazmid” oznacza pozachromosomalny (przeważnie) samoreplikujący element genetyczny. Plazmidy ogólnie oznacza się małą literą „p”, po której następują litery i/lub numery. Wyjściowe plazmidy opisane w niniejszym wynalazku są dostępne w handlu, dostępne publicznie bez żadnych ograniczeń lub mogą być skonstruowane z dostępnych plazmidów zgodnie z opublikowanymi procedurami. Ponadto, plazmidy równoważne do tych opisanych tutaj znane są w stanie techniki i są oczywiste dla fachowców w tej dziedzinie.

Użyty tu termin „rekombinowany wektor DNA do klonowania” oznacza dowolny autonomicznie replikujący środek, włączając, ale bez ograniczania, plazmidy i fagi, zawierający cząsteczkę DNA do której dodano jeden lub więcej dodatkowych segmentów DNA.

PL 209 550 B1

Użyty tu termin „rekombinowany wektor DNA do ekspresji” as oznacza dowolny rekombinowany wektor DNA do klonowania, w który włączono promotor do kontroli transkrypcji wstawionego DNA.

„Transkrypcja” oznacza proces, w czasie którego informacja zawarta w sekwencji nukleotydowej DNA jest przenoszona na komplementarną sekwencję RNA.

„Transfekcja” oznacza pobieranie wektora do ekspresji przez komórki gospodarza, bez względu na to, czy jakiekolwiek kodowane sekwencje w rzeczywistości ulegają ekspresji, fachowcy znają wiele metod transfekcji, na przykład, koprecypitacja fosforanem wapnia, transfekcja liposomami i elektroporacja. Udaną transfekcję ogólnie rozpoznaje się po jakichkolwiek oznakach działania wektora w komórkach gospodarza.

„Transformacja” oznacza wprowadzenie DNA do organizmu, w taki sposób, że DNA to ulega replikacji jako element pozachromosomowy lub po włączeniu w chromosom. Metody transformowania bakteryjnych lub ssaczych komórek gospodarza są dobrze znane w tej dziedzinie. Wiele z tych metod, na przykład wstrzykiwanie do jądra, fuzja protoplastów lub działanie chlorkiem wapnia opisanych jest w J. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989). Gdy wprowadza się DNA do drożdży, termin transformacja używany jest jako przeciwieństwo terminu transfekcja.

Użyty tu termin „translacja” oznacza proces, w którym informacja genetyczna zawarta w informacyjnym RNA (mRNA) użyta jest do specyficznej i kierunkowej syntezy łańcucha polipeptydowego.

„Wektor” oznacza związek kwasu nukleinowego użyty do transfekcji i/lub transformacji komórek w czasie manipulowania genami niosący sekwencje polinukleotydowe odpowiadające właściwym cząsteczkom białka, które jeżeli są połączone z właściwymi sekwencjami kontrolnymi, nadają specyficzne własności komórkom gospodarza, które zostały transfekowane i/lub transformowane. Przydatnymi wektorami są plazmidy, wirusy i bakteriofagi.

Sztuczne wektory konstruuje się przez cięcie i łączenie cząsteczek DNA pochodzących z różnych źródeł przy użyciu enzymów restrykcyjnych i ligaz. Użyty tu termin „wektor” obejmuje rekombinowane wektory DNA do klonowania i rekombinowane wektory DNA do ekspresji.

Użyty tu termin „komplementarny” lub „komplementarność” oznacza pary zasad (puryn i pirymidyn), które łączą się przez wiązania wodorowe w dwuniciowy kwas nukleinowy. Następujące pary zasad są komplementarne: guanina i cytozyna; adenina i tymina; adenina i uracyl.

Użyty tu termin „hybrydyzacja” oznacza proces, w którym łańcuch kwasu nukleinowego łączy się z komplementarnym łańcuchem dzięki parowaniu zasad. Warunki hybrydyzacji, w których dwa nie identyczne, ale bardzo podobne, komplementarne kwasy nukleinowe łączą się ze sobą, różnią się w zależności od stopnia komplementarności tych dwóch łańcuchów i długości tych łańcuchów. Takie techniki i warunki są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie.

„Izolowana sekwencja aminokwasowi” oznacza jakąkolwiek sekwencję aminokwasową, jednakże skonstruowaną lub zsyntetyzowaną, która jest inaczej położona niż sekwencja występująca w naturze.

„Izolowany związek DNA” oznacza jakąkolwiek sekwencję DNA, jednakże skonstruowaną lub zsyntetyzowaną, która znajduje się w innym miejscu niż jej naturalne położenie w genomowym DNA.

„Izolowany związek kwasu nukleinowego” oznacza jakąkolwiek sekwencję DNA lub RNA, jednakże skonstruowaną lub zsyntetyzowaną, która znajduje się w innym miejscu niż jej naturalne położenie.

„Starter” oznacza fragment kwasu nukleinowego, który działa jako substrat inicjujący enzymatyczne lub syntetyczne wydłużanie.

„Promotor” oznacza sekwencję DNA, która kieruje transkrypcją DNA do RNA.

„Sonda” oznacza związek kwasu nukleinowego lub jego fragment, który hybrydyzuje z innym związkiem kwasu nukleinowego.

„Ostrość” reakcji hybrydyzacji łatwo może być określona przez biegłych fachowców. Opiera się ona generalnie na obliczeniach empirycznych i zależy od długości sondy, temperatury przemywania i stężenia soli. Dłuższe sondy wymagają wyższych temperatur do prawidłowego przyłączenia, podczas gdy krótkie sondy wymagają niższych temperatur. Hybrydyzacja zależy generalnie od zdolności zdenaturowanego DNA do ponownego połączenia się w temperaturze poniżej punktu topnienia, jeżeli w środowisku występuje komplementarny łańcuch. Im wyższy jest pożądany stopień homologii pomiędzy sondą i sekwencją, z która zachodzi hybrydyzacja, tym wyższej względnej temperatury hybrydyzacji można użyć. Wynika z tego, że wyższe względne temperatury hybrydyzacji oznaczają ostrzejsze warunki hybrydyzacji, podczas gdy niższe temperatury hybrydyzacji oznaczają słabsze warunki hybry20

PL 209 550 B1 dyzacji. Dodatkowe szczegóły i wyjaśnienia ostrości warunków reakcji hybrydyzacji, opisane są przez Ausubela i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.

„Ostre warunki” lub „warunki o dużej ostrości” tak jak tu zdefiniowano, oznacza, że (1) zastosowano niską siłę jonową i wysoką temperaturę przepłukiwania, na przykład, 15 mM chlorek sodu/1,5 mM cytrynian sodu/0,1% sól sodowa siarczanu dodecylu w temperaturze 50°C; (2) w czasie hybrydyzacji użyto czynnika denaturującego, takiego jak formamid, na przykład, 50% (objętościowo/objętościowy) formamid, 0,1% albumina surowicy bydlęcej/0,1% fikol/0,1% poliwinylopirolidon/50 mM bufor fosforanowy w pH 6,5 i 750 mM chlorek sodu/75 mM cytrynian sodu w temperaturze 42°C; lub (3) zastosowano 50% formamid, 5X SSC (750 mM chlorek sodu, 75 mM cytrynian sodu), 50 mM fosforan sodu (pH 6,8), 0,1% pirofosforan sodu, 5X roztwór Denhardta, sonikowany DNA z mlecza łososia (50 mg/ml), 0,1% SDS i 10% siarczan dekstranu w temperaturze 42°C i płukanie w temperaturze 42°C w 0,2 X SSC (30 mM chlorek sodu/3 mM cytrynian sodu) i 50% formamid w temperaturze 55°C, a następnie płukanie w ostrych warunkach, czyli 0,1 X SSC zawierający EDTA w temperaturze 55°C.

„Umiarkowanie ostre warunki” można zidentyfikować jako te opisane przez Sambrook i wsp. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, (1989)], i obejmują one użycie roztworu do płukania i warunków hybrydyzacji (na przykład, temperatury, siły jonowej i % SDS) mniej ostrych niż opisane powyżej. Przykładem umiarkowanie ostrych warunków jest całonocna inkubacja w temperaturze 37°C w roztworze zawierającym: 20% formamid, 5X SSC (750 mM chlorek sodu, 75 mM cytrynian sodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5X roztwór Denhardta i 20 mg/ml zdenaturowanego, porwanego DNA z mlecza łososia, 0,1% SDS i 10% siarczan dekstranu w temperaturze 42°C i przemycie filtrów w 1X SSC w temperaturze około 37-50°C. Fachowcy wiedzą jak dobrać temperaturę, siłę jonową, uwzględniając czynniki takie jak długość sondy.

„PCR” oznacza powszechnie znaną reakcję łańcuchową polimerazy DNA z wykorzystaniem termostabilnej polimerazy.

„Sekwencja wiodąca” oznacza sekwencję aminokwasową, która może być enzymatycznie lub chemicznie usunięta w celu otrzymania pożądanego polipeptydu.

„Sekwencja sygnału wydzielania” oznacza sekwencję aminokwasową, która z reguły występuje w N-końcowym regionie dużych polipeptydów i której zadaniem jest zapoczątkowanie oddziaływania polipeptydu z błoną komórkową przedziałów wewnątrzkomórkowych, takich jak retikulum endoplazmatyczne i wydzielanie tego polipeptydu przez błonę plazmatyczną.

Konstruowanie DNA kodującego heterogenne białka fuzyjne:

Albumina typu dzikiego i białka immunoglobulin można uzyskać z różnych źródeł. Na przykład, białka te można uzyskać z biblioteki cDNA otrzymanej z tkanek lub komórek wytwarzających interesujący mRNA w wykrywalnej ilości. Biblioteki takie można przeszukiwać za pomocą sond zaprojektowanych przy użyciu opublikowanych sekwencji DNA lub sekwencji białka dla poszczególnych, interesujących białek. Na przykład, regiony stałe lekkiego i ciężkiego łańcucha immunoglobulin opisane są w Adams i wsp. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet i wsp. (1980) Biochemistry 19:27022710; Dolby i wsp. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6027-6031; Rice i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862-7862; Falkner i wsp. (1982) Nature 298:286-288; i Morrison i wsp. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256. Niektóre odnośniki opisujące białko albuminy i jego sekwencję DNA obejmują Meloun i wsp. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens i wsp. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn i wsp. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114 i Minghetti i wsp. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747.

Przeszukiwanie bibliotek cDNA lub bibliotek genomowych przy użyciu wybranych sond prowadzi się według standardowych procedur, takich jak opisane w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Można także wyizolować gen kodujący albuminę lub białko immunoglobuliny przy użyciu metody PCR [Sambrook i wsp., supra; Dieffenbach i wsp., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. Startery PCR można zaprojektować w oparciu o opublikowane sekwencje.

Pełnej długości sekwencje typu dzikiego zklonowane z określonego gatunku mogą służyć jako matryca do otrzymania analogów, fragmentów i pochodnych, które zachowują zdolność do zapewnienia wydłużonego czasu półtrwania w surowicy związku GLP-1 będącego częścią białka fuzyjnego. W celu zmniejszenia potencjalnego ryzyka wywołania u ludzi odpowiedzi immunologicznej przez białko fuzyjne, korzystnie jest, gdy część Fc i część albuminowa heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku pochodzą z natywnej ludzkiej sekwencji.

Okazało się, że część immunoglobulinowa białka fuzyjnego może także zawierać tylko fragment Fc immunoglobuliny. W zależności od potrzeby osiągnięcia określonego efektu lub funkcji i strukturalPL 209 550 B1 nej charakterystyki białka fuzyjnego, fragment Fc może zawierać region zawiasowy i domeny CH2 i CH3 lub pewne ich kombinacje. Takie fragmenty Fc można otrzymać technikami PCR przy użyciu starterów zaprojektowanych do hybrydyzowania z sekwencjami odpowiadającymi pożądanym końcom klonowanego fragmentu. Podobnie, jeżeli pożądane są fragmenty albuminy, startery PCR projektuje się tak, żeby były komplementarne do wewnętrznych sekwencji albuminy. W celu ułatwienia klonowania w wektory do ekspresji, startery PCR można też zaprojektować tak, żeby stworzyć miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny.

DNA kodujący związki GLP-1 według wynalazku można otrzymać różnymi metodami włączając metody klonowania, jak te opisane powyżej, a także DNA zsyntetyzowany chemicznie. Chemiczna synteza może być interesująca do otrzymywania krótkich peptydów. Sekwencja aminokwasowa GLP-1 została opublikowana, tak jak sekwencja genu preproglukagonu. [Lopez i wsp. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:5485-5489; Bell i wsp. (1983) Nature, 302:716-718; Heinrich G. i wsp. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181; Ghiglione M. i wsp. 91984) Diabetologia 27:599-600]. Można więc zaprojektować startery PCR dla natywnych związków GLP-1 i ich fragmentów.

Gen kodujący białko fuzyjne można skonstruować przez łączenie DNA kodującego związek GLP-1 zgodnie z ramką odczytu z DNA kodującym albuminę lub białko Fc. Gen kodujący związek GLP-1 i gen kodujący albuminę lub białko Fc można także połączyć zgodnie z ramką odczytu poprzez DNA kodujący peptyd łącznikowy.

Funkcję in vivo i stabilność heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku można zoptymalizować przez dodanie małego peptydu łącznikowego, co zapobiega potencjalnie niepożądanym oddziaływaniom między domenami. Chociaż teoretycznie taki łącznik może mieć dowolną długość i zawierać dowolną kombinację aminokwasów, korzystnie jest, gdy nie jest on dłuższy niż to konieczne do zapobieżenia niepożądanym oddziaływaniom między domenami i/lub optymalizacji biologicznej aktywności i/lub stabilności. Łączniki nie powinny zawierać aminokwasów o wyjątkowo dużych łańcuchach bocznych lub aminokwasów, które mogą wprowadzić znaczące zmiany struktury drugorzędowej. Korzystnie jest, gdy łącznik jest bogaty w serynę-glicynę i ma długość nie większą niż 30 aminokwasów. Bardziej korzystnie jest, gdy łącznik ma długość nie większą niż 20 aminokwasów. Jeszcze bardziej korzystnie jest, gdy łącznik ma długość nie większą niż 15 aminokwasów. Korzystny łącznik zawiera powtórzenia sekwencji Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Korzystnie jest, gdy łącznik zawiera pomiędzy 2 i 6 powtórzeń tej sekwencji. Bardziej korzystnie jest, gdy łącznik zawiera pomiędzy 3 i 4 powtórzeń tej sekwencji.

DNA kodujący polipeptydy GLP-1, typu dzikiego, albuminę, Fc i ich fragmenty można poddawać mutacji przed połączeniem lub po połączeniu w kontekście cDNA kodującego całe białko fuzyjne. W omawianej dziedzinie znane są różne techniki mutagenezy. Na przykład, mutageneza przy użyciu technik PCR wykorzystuje wydłużanie nakładających się łańcuchów w celu wprowadzenia specyficznych mutacji zasad, żeby zmienić specyficzną sekwencję aminokwasową w odpowiadającym białku. Taka mutageneza techniką PCR wymaga użycia czterech starterów, dwóch w orientacji zgodnej z kierunkiem transkrypcji (startery A i C) i dwóch w orientacji przeciwnej do kierunku transkrypcji (startery B i D) Zmutowany gen amplifikuje się przy użyciu matrycy typu dzikiego w dwóch różnych etapach. W pierwszej reakcji amplifikuje się połowy genu przeprowadzając reakcję A do B i oddzielnie reakcję C do D, gdzie startery B i C określają obszar genu, który ma być zmutowany. Po przyłączeniu tych starterów do obszaru docelowego, startery zawierają niesparowane zasady, które mają być zmienione. Po zakończeniu reakcji A do B i C do D, produkty reakcji izoluje się, miesza i używa jako matrycy dla reakcji A do D. Ta reakcja daje zmutowany produkt pełnej długości.

Po wytworzeniu genu kodującego pełnej długości białko fuzyjne, można go włączyć w odpowiedni wektor do ekspresji. Specyficzne strategie, których można użyć do wytworzenia białka fuzyjnego GLP-1 według wynalazku opisane są w przykładzie 1.

Ogólne metody eksprymowania rekombinowanego heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku

W celu wytworzenia heterogennego białka fuzyjnego, komórki gospodarza transfekuje się lub transformuje wektorem do ekspresji lub wektorem do klonowania opisanym w niniejszym wynalazku i hoduje się je w tradycyjnym podłożu do hodowli zmodyfikowanym tak, żeby uzyskać indukcję promotorów, wyselekcjonować transformanty lub amplifikować geny kodujące pożądane sekwencje. Fachowcy mogą łatwo dobrać odpowiednie warunki hodowli, takie jak podłoże, temperatura i pH. Ogólne zasady, protokoły i techniki praktyczne maksymalizacji produktywności hodowli komórkowych można znaleźć w Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)

PL 209 550 B1 i Sambrook i wsp., supra. Metody transfekcji są znane fachowcom, na przykł ad, takie jak CaPO4 i elektroporacja. Ogólne aspekty transformacji ssaczych komórek gospodarza opisane są w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4399216. Transformację komórek drożdży typowo prowadzi się według metody van Solingen i wsp., J Bact. 130(2): 946-7 (1977) i Hsiao i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(8): 3829-33 (1979). Jednakże, można też użyć innych metod wprowadzania DNA do komórek, takich jak mikrowstrzyknięcia do jądra, elektroporacja, fuzja protoplastów bakteryjnych z nienaruszonymi komórkami lub polikationów, na przykład polibrenu lub poliomityny. Różne techniki transformowania komórek ssaków opisane są w Keown i wsp., Methods in Enzymology 185: 527-37 (1990) i Mansour i wsp., Nature 336(6197): 348-52 (1988).

Odpowiednie komórki gospodarza do klonowania lub ekspresji kwasów nukleinowych (na przykład DNA) w wektorach opisanych w wynalazku obejmują komórki prokariotyczne, drożdżowe lub komórki wyższych eukariotów. Odpowiednie komórki prokariotyczne obejmują, ale bez ograniczania, eubak-terie, takie jak Gram-ujemne lub Gram-dodatnie organizmy, na przykład, Enterobacteriaceae, takie jak E. coli. Różne szczepy E. coli dostępne są publicznie, takie jak E. coli K12 szczep MM294 (ATCC 3 1.446); E. coli Xl 776 (ATCC 3 1.537); E. coli szczep W3 110 (ATCC 27.325) i K5 772 (ATCC 53.635). Inne odpowiednie komórki prokariotyczne obejmują Enterobacteriaceae, takie jak Escherichia, na przykład E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebisella, Proteus, Salmonella, na przykład Salmonella typhimurium, Serratia, na przykład Serratia marcescens i Shigella, a także Bacilli, takie jak B. subtilis i B. licheniformis (na przykład B. licheniformis 4 1 P opisany w DD266,7 10, opublikowanym 12 kwietnia 1989), Pseudomonas, takie jak P. aeruginosa oraz Streptomyces. Szczep W3 110 jest szczególnie użyteczny gospodarzem lub gospodarzem wyjściowym, ponieważ jest to powszechnie używany szczep do fermentacji rekombinowanych produktów DNA. Korzystnie, komórki gospodarza wydzielają minimalne ilości enzymów proteolitycznych. Na przykład, szczep W3 110 można zmodyfikować tak, że niesie mutację w genach kodujących białka endogenne dla gospodarza, przykładem takiego gospodarza jest E. coli W3 110 szczep 1A2, który ma kompletny genotyp ronA; E. coli W3 110 szczep 9E4, który ma kompletny genotyp ton4 ptr3; E. coli W3 110 szczep 27C7 (ATCC 55,244), który ma kompletny genotyp tonA, ptr3 phoA E15 (argF-lac) I69 degP ompT/can'; E. coli W3 110 szczep 40B4, który jest szczepem 37D6 z mutacją delecyjną degP znoszącą oporność na kanamycynę; i opisany w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4946783 wydanym 7 sierpnia 1990 szczep E. coli maj ą cy zmutowaną peryplazmatyczną proteazę . Ewentualnie, korzystne są metody klonowania in vivo, na przykład PCR lub inne reakcje polimerazy kwasów nukleinowych.

Oprócz organizmów prokariotycznych, jako organizmy gospodarza do klonowania i ekspresji wektorów zawierających białka fuzyjne przydatne są też mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby filamentujące lub drożdże. Saccharomyces cerevisiae są powszechnie używanymi komórkami gospodarza z grupy niższych organizmów eukariotycznych. Inne mikroorganizmy obejmują Schizosaccharomyces pombe [Beach i Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); Europejski Dokument Patentowy EP 139383 opublikowany 2 maja 1995]; komórki gospodarza z rodzaju Muyveromyces [Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki No. 4943529; Fleer i wsp., Bio/Technology 9(10): 968-75 (1991)], takie jak na przykład K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt i wsp., J. Bacteriol. 154(2): 737-42 (1983)]; K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg i wsp., Bio/Technology 8(2): 135-9 (1990)]; K. thermotolerans i K. marxianus; komórki gospodarza z rodzaju Yarrowia (Europejski Dokument Patentowy EP 402226); Pichia pastoris (Europejski Dokument Patentowy EP 183070) [Sreekrishna i wsp., J. Basic Microbiol. 28(4): 265-78 (1988)]; Drożdżaki; Trichoderma reesia (Europejski Dokument Patentowy EP 244234); Neurospora crassa [Case i wsp., Proc. Natl. Acad Sci. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces, takie jak Schwanniomyces occidentalis (Europejski Dokument Patentowy EP 394538 opublikowany 31 października 1990); i grzyby filamentujące, takie jak na przykład Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 opublikowane 10 stycznia 1991) i komórki gospodarza z rodzaju Aspergillus, takie jak A. nidulans [Ballance i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilburn i wsp., Gene 26(2-3): 205-21 (1983); Yelton i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(5): 1470-4 (1984)] i A. niger [Kelly i Hynes, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985)]. Drożdże metylotropiczne wybiera się z rodzajów Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis i Rhodotoruia. Listę specyficznych gatunków, które mogą być przykładem dla tej klasy drożdży można znaleźć w C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982).

PL 209 550 B1

Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji białka fuzyjnego według wynalazku pochodzą z organizmów wielokomórkowych. Przykładem komórek bezkręgowców są komórki owadów, takie jak komórki Drosophila S2 i Spodoptera Sp, Spodoptera highS a także komórki roślin. Przykłady komórek ssaków użytecznych jako linie komórek gospodarza obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórki COS. Bardziej specyficznie przykłady takie obejmują linię komórek nerki małpy CVI transformowaną wirusem SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ludzką embrionalną linię komórek nerki [293 lub komórki 293 rosnące w hodowli zawiesinowej, Graham i wsp., J. Gen Virol., 36(1): 59-74 (1977)]; komórki jajnika chomika chińskiego/-DHFR [CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]; mysie komórki Sertoliego [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; ludzkie komórki płuca (W138. ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065) i mysie komórki nowotworu sutka (MMT 060562, ATCC CCL51). Wybranie odpowiednich komórek gospodarza leży w zakresie możliwości fachowców w tej dziedzinie. Białka fuzyjne według wynalazku można wytwarzać drogą rekombinacji bezpośrednio lub jako białka mające sekwencję sygnałową lub inne dodatkowe sekwencje, które stwarzają specyficzne miejsce cięcia w N-końcu dojrzałego białka fuzyjnego. Sekwencja sygnałowa może być częścią wektora lub może być częścią DNA kodującego białko fuzyjne, który został wstawiony w taki wektor. Sekwencja sygnałowa może być prokariotyczną sekwencją sygnałową wybraną, na przykład, z grupy zawierającej fosfatazę alkaliczną, penicylinazę, lpp lub termostabilną sekwencję wiodącą enterotoksyny II. Odpowiednie sekwencje sygnałowe do wydzielania w drożdżach obejmują, na przykład sekwencję wiodącą inwertazy drożdżowej, sekwencję wiodącą czynnika alfa (włączając sekwencje wiodące czynnika α Saccharomyces i Kluyveromyces, ta ostatnia opisana w Dokumencie Patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki No. 5010182) lub sekwencję wiodącą kwaśnej fosfatazy, sekwencję wiodącą glukoamylazy C. albicans (Europejski Dokument Patentowy EP 362179) lub sygnał opisany w WO 90/13646. W celu uzyskania wydzielania białek w czasie ekspresji w komórkach ssaków można użyć ssaczych sekwencji sygnałowych, takich jak sekwencje sygnałowe polipeptydów wydzielanych przez te lub pokrewne gatunki, a także wirusowych sekwencji wiodących. Zarówno wektory do ekspresji jak i wektory do klonowania zawierają sekwencję kwasu nukleinowego, która umożliwia takiemu wektorowi replikację w jednym lub więcej wybranych typach komórek gospodarza. Takie sekwencje są dobrze znane dla różnych bakterii, drożdży i wirusów. Miejsce inicjacji procesu replikacji plazmidu pBR322 jest odpowiednie dla większości Gram-ujemnych bakterii. Miejsce inicjacji procesu replikacji plazmidu 2u jest odpowiednie dla drożdży, a różne miejsca inicjacji procesu replikacji pochodzenia wirusowego (SV40, polioma, adenowirusa, VSV lub BPV) są odpowiednie dla wektorów do klonowania w komórkach ssaków.

Wektory do ekspresji jak i wektory do klonowania przeważnie zawierają gen selekcyjny, nazywany także markerem do selekcji. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które (a) dają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, na przykład ampicylinę, neomycynę, metotreksat lub tetracyklinę, (b) komplementują defekty autotrofii lub (c) zapewniają niezbędne składniki odżywcze, których brak jest w podłożu do hodowli, na przykład gen kodujący racemazę D-alaniny dla Bacilli.

Przykładem odpowiednich markerów do selekcji dla komórek ssaka są takie markery, które umożliwiają identyfikację komórek kompetentnych do pobrania kwasu nukleinowego kodującego białko fuzyjne, takie jak DHFR lub kinaza tymidynowa. Jeżeli używa się markera DHFR typu dzikiego, odpowiednimi komórkami gospodarza są komórki linii CHO pozbawione aktywności DHFR, otrzymane i namnożone tak, jak opisał [Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. Odpowiednim genem selekcyjnym do użycia w komórkach drożdży jest gen trpl zawarty w plazmidzie drożdżowym YRp7 [Stinchcomb i wsp., Nature 282(5734): 39-43 (1979); Kingsman i wsp., Gene 7(2): 141-52 (1979); Tschumper i wsp., Gene 10(2): 157-66 (1980)]. Gen trpl zapewnia marker do selekcji w zmutowanym szczepie drożdży pozbawionym zdolności wzrostu na tryptofanie, na przykład ATCC No. 44076 lub PEPC1 [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)].

Wektory do ekspresji i wektory do klonowania przeważnie zawierają promotor połączony funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego białko fuzyjne w celu umożliwienia bezpośredniej syntezy mRNA. Promotory rozpoznawane przez różne potencjalne komórki gospodarza są dobrze znane. Promotory odpowiednie do użycia w komórkach prokariotycznych obejmują promotory β-laktamazy i laktozy [Chang i wsp., Nature 275(5681): 617-24 (1978); Goeddel i wsp., Nature 281(5732): 544-8 (1979)], fosfatazy alkalicznej, a operonu tryptofanowego [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8(18): 4057-74 (1980); Europejski Dokument Patentowy EP 36,776 opublikowany 30 września 1981] i promotory hybrydowe, takie jak promotor tat [deBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1):

PL 209 550 B1

21-5 (1983)]. Promotory do użycia w systemach bakteryjnych zawierają także sekwencję Sine-Dalgarno (S.D.) połączoną funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującego białko fuzyjne.

Przykłady odpowiednich sekwencji promotorowych do użycia w drożdżowych komórkach gospodarza, obejmują promotor kinazy 3-fosfoglicerynianu [Hitzeman i wsp., J. Biol. Chem. 255(24): 12073-80 (1980)] lub innych enzymów glikolitycznych [Hess i wsp., J. Adv. 5 Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17(23): 4900-7 (1978)], takich jak enolaza, dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianu, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozofosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianu, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozy i glukokinaza.

Inne promotory drożdżowe, które są promotorami indukowanymi i mają dodatkową zaletę, ponieważ transkrypcja kontrolowana jest przez czynniki wzrostowe, obejmują regiony promotorowe dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów degradujących związanych z metabolizmem azotu, metalotioneiny, dehydrogenazy aldehydu fosfoglicerynowego i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiednie wektory i promotory do ekspresji w komórkach drożdży są także opisane w Europejskim Dokumencie Patentowym EP 73657. Transkrypcja mRNA kodującego białko fuzyjne z wektorów w komórkach ssaka może być kontrolowana przez promotory kompatybilne z użytym systemem komórek gospodarza, na przykład przez promotory otrzymane z genomów wirusów, takich jak wirus polioma, wirus ospy ptasiej, adenowirus (taki jak Adenowirus 2), wirus brodawczaka bydła, wirus mięsaka ptaków, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby typu B i wirus SV40, przez heterogenne promotory ssaków, na przykład promotor aktyny lub promotor immunoglobuliny lub przez promotory białek szoku cieplnego.

Transkrypcję polinukleotydu kodującego białko fuzyjne w wyższych eukariontach można zwiększyć wstawiając sekwencję wzmacniającą do wektora. Sekwencje wzmacniające są elementami działającymi z DNA w układzie cis, znajdującymi się przeważnie od około 10 do 300 par zasad od promotora, które oddziałują na promotor w celu zwiększenia jego transkrypcji. W sztuce znanych jest wiele sekwencji wzmacniających dla genów ssaków (globiny, elastazy, albuminy, α-ketoproteiny i insuliny). Przeważnie używa się jednak sekwencji wzmacniających wirusów komórek eukariotycznych. Przykłady obejmują sekwencję wzmacniającą w miejscu inicjacji procesu replikacji późnego regionu transkrypcji wirusa SV40 (pary zasad 100-270), sekwencję wzmacniającą wczesnego promotora cytomegalowirusa, sekwencję wzmacniającą w miejscu inicjacji procesu replikacji późnego regionu transkrypcji wirusa polioma i sekwencje wzmacniające adenowirusa. Sekwencja wzmacniająca może być umieszczona w wektorze w pozycji 5' lub 3' w stosunku do sekwencji kodującej białko fuzyjne, ale korzystnie położona jest w pozycji 5' od promotora. Wektory do ekspresji używane w eukariotycznych komórkach gospodarza (drożdże, grzyby, owady, rośliny, zwierzęta, ludzie lub komórki jądrzaste z innych organizmów wielokomórkowych) zawierają także sekwencje konieczne dla zakończenia transkrypcji i stabilizacji mRNA. Takie sekwencje zwykle pochodzą z 5', a czasami z 3' nie ulegających translacji regionów eukariotycznego lub wirusowego DNA lub cDNA. Regiony takie zawierają segmenty nukleotydów transkrybowanych jako fragmenty poliadenylowane w nieulegającej translacji części mRNA kodującego białko połączone.

Różne formy białka fuzyjnego odzyskuje się z podłoża do hodowli lub z lizatów komórek gospodarza. Jeśli są związane z błonami uwalnia się je z błon przy użyciu odpowiednich roztworów detergentów (na przykład Triton-X 100) lub przez cięcie enzymatyczne. Komórki wykorzystane do ekspresji białka fuzyjnego można rozbić różnymi fizycznymi lub chemicznymi sposobami, takimi jak cykliczne zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja, rozbicie mechaniczne lub przy pomocy środków lizujących.

Oczyszczanie heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku

Po uzyskaniu ekspresji heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku w odpowiednich komórkach gospodarza izoluje się je i oczyszcza. Do oczyszczania odpowiednie są na przykład następujące procedury: frakcjonowanie na karboksymetylocelulozie; filtracja na żelu, takim jak Sephadex G-75; żywica anionowymienna, taka jak DEAE lub Mono-Q; żywica kationowymienna, taka jak CM lub Mono-S; w celu usunięcia zanieczyszczeń, takich jak IgG przydatna jest sefaroza z immobilizowanym białkiem A; kolumny chelatujące metale w celu związania form polipeptydu znakowanych odpowiednik epitopem; HPLC z odwróconymi fazami; ogniskowanie chromatograficzne; żel krzemionkowy; wytrącanie etanolem i wytrącanie siarczanem amonu.

Do oczyszczania białka można zastosować wiele metod i metody takie znane są w stanie techniki i są opisane, na przykład w Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) i Scopes, Protein

PL 209 550 B1

Purification: Principles i Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Wybór etapów oczyszczania zależy od użytego procesu wytwarzania i natury wytwarzanego białka fuzyjnego. Na przykład, białka fuzyjne zawierające fragment Fc można wydajnie oczyścić przy użyciu matrycy powinowactwa z białkiem A lub białkiem G. Do wymycia białka fuzyjnego z matrycy powinowactwa używa się buforów o niskim lub wysokim pH. Umiarkowane warunki wymywania zapobiegają nieodwracalnej denaturacji białka fuzyjnego. Można także użyć buforów zawierających imidazol. Przykład 3 opisuje pewne udane protokoły oczyszczania białka fuzyjnego według wynalazku.

Charakteryzowanie heterogennego białka fuzyjnego według wynalazku

Istnieje wiele metod przydatnych do scharakteryzowania białka fuzyjnego według wynalazku. Metody te obejmują: SDS-PAGE połączona z metodami barwienia białek lub immunoblot przy użyciu przeciwciał przeciw IgG lub przeciw HSA. Inne metody obejmują laserową desorpcję/jonizację wspomaganą matrycą (MALDI-MS), chromatografię cieczową/spektrometrię masową, ogniskowanie izoelektryczne, analityczną wymianę jonową, ogniskowanie chromatograficzne i dichroizm kołowy. Reprezentatywną liczbę heterogennych białek fuzyjnych scharakteryzowano przy użyciu SDS-PAGE połączonej z immunoblotem, a także spektrometrii masowej (Patrz przykłady 4 i 5 i fig. 3 i 4).

Na przykład tabela 3 (patrz przykład 5) pokazuje obliczoną masę cząsteczkową reprezentatywnej liczby białek fuzyjnych, a także masę określoną metodą spektrometrii masowej. Ponadto, fig. 3 i 4 pokazują masy cząsteczkowe reprezentatywnej liczby białek fuzyjnego określonych metodą SDS

PAGE. Wszystkie badane heterogenne białka fuzyjne były przejściowo eksprymowane i wydzielane.

Ponadto, sekwencja sygnałowa IgK została odcięta żeby otrzymać białko z prawidłowym N-końcem.

Tabela 3 pokazuje, że w pewnych warunkach masa określona metodą spektrometrii masowej jest większa niż się spodziewano. Jest to wynikiem glikozylacji części Fc i C-końcowego wydłużenia. Trawienie enzymatyczne białka fuzyjnego, a następnie HPLC z odwróconymi fazami i spektrometria masowa pozwala zidentyfikować frakcje peptydu, które zawierają reszty cukrowe.

W celu zidentyfikowania potencjalnych miejsc glikozylacji można określić sekwencję aminokwasów N-końca białka w tych frakcjach. Na przykład, badanie Eksendyny-4-Fc (SEQ ID NO: 29) wykazało, że seryna w pozycji 39 i treonina w pozycji 50 są glikozylowane przez wiązanie O-glikozylowe, a asparagina w pozycji 122 jest glikozylowana przez wiązanie N-glikozylowe.

Reprezentatywną liczbę białek fuzyjnego GLP-1 bada się też pod kątem aktywności. Istnieje wiele metod wykrywania aktywności GLP-1 in vitro i in vivo (patrz przykłady 6, 7, 8 i 9). Tabela 4 (przykład 6) pokazuje aktywność w stosunku do receptora GLP-1 wielu białek fuzyjnych GLP-1. Liczby pokazują aktywność w stosunku do aktywności Val⁸-GLP-1(7-37)OH. Wszystkie badane białka fuzyjne wykazywały aktywność w stosunku do receptora GLP-1. Niski poziom aktywności in vitro nie koniecznie wskazuje na słabe działanie in vivo. Ze względu na istotny wzrost czasu półtrwania białka fuzyjnego, słaba aktywność in vitro nie jest wskaźnikiem słabej aktywności in vivo. Figura 7 i przykład 7 pokazują wydłużony okres półtrwania jaki wykazują białka fuzyjne opisane w wynalazku. Na przykład, Val⁸GLP-1-Fc ma okres półtrwania u małp wynoszący około 45 godzin, Val⁸-GLP-1-HSA ma okres półtrwania u małp wynoszący około 7 godzin, Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1 ma okres półtrwania po dożylnym podaniu psom około 55 godzin i Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1 ma okres półtrwania po podskórnym podaniu psom około 38 godzin.

Kompozycje według wynalazku

Stabilność fizyczna jest także bardzo ważną cechą szczególnie dla zastosowania w terapeutycznych kompozycjach białkowych. Związki GLP-1 są szczególnie trudne do obróbki i wytwarzania leków, ponieważ w czasie obróbki zachodzą w nich zmiany strukturalne. Na przykład, niektóre związki GLP-1 mają ogólną tendencję do agregacji. Ponadto wykazano, że niektóre związki GLP-1 przekształcają się z rozpuszczalnej i aktywnej formy α-helisy w nierozpuszczalną i potencjalnie nieaktywną formę pofałdowanej kartki typu β. Połączenie związków GLP-1 z dużymi białkami, takimi jak region Fc IgG lub albumina nie tylko zwiększa okres półtrwania związku GLP-1, ale także wspomaga fizyczną i konformacyjną stabilność związku GLP-1. Na przykład, Val⁸-GLP-1-łącznik-HSA w PBS jest stabilne w temperaturze 37°C przez około 30 dni.

Heterogenne białka fuzyjne według wynalazku można wytwarzać z jedną lub więcej zaróbek. Aktywne białka fuzyjne według wynalazku łączy się z farmaceutycznie akceptowanym buforem, doprowadza się pH do wartości zapewniającej akceptowaną stabilność, i akceptowanej z punktu widzenia sposobu podawania, takiego jak podawanie pozajelitowe.

Ewentualnie, dodaje się jeden lub więcej farmaceutycznie akceptowany środek przeciwbakteryjny. Korzystnymi farmaceutycznie akceptowanymi środkami przeciwbakteryjnymi są metakrezol

PL 209 550 B1 i fenol. W celu doprowadzenia do odpowiednich wartości siły jonowej i toniczności dodaje się jedną lub więcej farmaceutycznie akceptowaną sól. Aby zapewnić izotoniczność postaci leku można jeszcze dodać jedną lub więcej zarobek. Przykładem zaróbki służącej do ustalenia izotoniczności jest gliceryna. Farmaceutycznie akceptowany oznacza odpowiedni do podawania ludziom lub zwierzętom i nie zawierający elementów toksycznych lub niepożądanych zanieczyszczeń i nie zaburzający aktywności substancji czynnej leku.

W niniejszym wynalazku można użyć różnych postaci farmaceutycznie akceptowanych soli heterogennych białek fuzyjnych. Do otrzymywania kwaśnych soli addycyjnych powszechnie używa się kwasów nieorganicznych, takich jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy i kwasów organicznych, takich jak kwas p-toluenosulfonowy, kwas metanosulfonowy, kwas szczawiowy, kwas p-bromofenylosulfonowy, kwas węglowy, kwas bursztynowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy i kwas octowy.

Korzystnymi kwaśnymi solami addycyjnymi są sole tworzone przez kwasy mineralne, takie jak kwas chlorowodorowy i kwas bromowodorowy.

Zasadowe sole addycyjne obejmują, sole pochodzące od zasad nieorganicznych, takich jak wodorotlenki, węglany, dwuwęglany amonu lub zasad (ługów lub metali ziem alkalicznych). Zasady przydatne do wytwarzania soli białek fuzyjnych według wynalazku obejmują wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek amonu, węglan potasu.

Podawanie kompozycji

Kompozycje podaje się dowolną efektywną drogą, którą wybierze lekarz. Jedną z takich metod jest podawanie zewnętrzne, pozajelitowe. Podawanie pozajelitowe jest przeważnie rozumiane w literaturze medycznej jako wstrzykiwanie dawki do ciała przy użyciu sterylnej strzykawki lub innego urządzenia medycznego, takiego jak pompa infuzyjna. Zewnętrzne, pozajelitowe drogi podawania obejmują podawanie dożylne, domięśniowe, podskórne i śródotrzewnowe.

Heterogenne białka fuzyjne według wynalazku można także podawać innymi drogami niepozajelitowymi, takimi jak podawanie doustnie, doodbytnicze, donosowe lub podawanie do dolnych dróg oddechowych. Z tych niepozajelitowych dróg, korzystne jest podawanie do dolnych dróg oddechowych i podawanie doustne.

Białek fuzyjnych według wynalazku używa się do leczenia wielu chorób i stanów chorobowych. Główną aktywność biologiczną białek fuzyjnych według wynalazku stanowi działanie na receptor, oznaczony tu jako „receptor GLP-1”. Pacjentów chorych na choroby lub stany chorobowe, które odpowiadają na stymulację receptora GLP-1 lub na podanie związków GLP-1 można leczyć białkami fuzyjnymi GLP-1 wytworzonymi sposobem opisanym w wynalazku. O pacjentach takich mówi się, że „potrzebują leczenia związkami GLP-1” lub „potrzebują stymulacji receptora GLP-1”. Grupa ta obejmuje pacjentów, chorych na cukrzycę insulinoniezależną, cukrzycę insulinozależną, udar (patrz WO 00/16797), zawał serca (patrz WO 98/08531), otyłość (patrz WO 98/19698), pooperacyjne zmiany katabolizmu (patrz Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 6006753), niestrawność nerwową, zespół pobudliwego jelita (patrz WO 99/64060). Grupa ta obejmuje pacjentów, wymagających leczenia profilaktycznego związkiem GLP-1, na przykład pacjentów narażonych na ryzyko wystąpienia cukrzycy insulinoniezależnej (patrz WO 00/07617). Na ryzyko wystąpienia cukrzycy insulinoniezależnej narażeni są pacjenci z zaburzeniami tolerancji glukozy lub zaburzeniami poziomu glukozy na czczo, pacjenci, których ciężar ciała wynosi powyżej 25% ciężaru ciała prawidłowego dla swojego wzrostu i budowy, pacjenci z częściowo usuniętą trzustką, pacjenci mający jednego lub więcej rodziców chorych na cukrzycę insulinoniezależną, pacjenci chorzy na cukrzycę ciążową i pacjenci, którzy mają ostre lub chroniczne zapalenie trzustki.

„Efektywna ilość” związku GLP-1 oznacza taką ilość związku, która po podaniu pacjentowi potrzebującemu stymulacji receptora GLP-1 powoduje pożądane działanie terapeutyczne i/lub profilaktyczne bez wywoływania niepożądanych efektów ubocznych. Pojęcie „pożądane działanie terapeutyczne” obejmuje jedno lub więcej działań opisanych poniżej: 1) zniesienie objawów związanych z wystąpieniem choroby lub stanu chorobowego; 2) opóźnienie początku wystąpienia objawów związanych z wystąpieniem choroby lub stanu chorobowego; 3) wydłużony czas życia w porównaniu z brakiem leczenia i 4) lepszą jakość życia w porównaniu z brakiem leczenia. Na przykład, „efektywna ilość” związku GLP-1 do leczenia cukrzycy jest ilością, która powoduje lepszą kontrolę stężenia glukozy we krwi niż przy braku leczenia, powodując w ten sposób opóźnienie początku wystąpienia powikłań związanych z wystąpieniem cukrzycy, takich jak retinopatia, neuropatia lub choroby nerek. „Efektywna ilość” związku GLP-1 do zapobiegania cukrzycy jest ilością, która opóźni w porównaniu z braPL 209 550 B1 kiem leczenia wystąpienie podniesionego poziomu glukozy we krwi, co wymaga podawania leków przeciw hipoglikemii, takich jak sulfonylomoczniki, tiazolidynodiony, insulina i/lub bisguanidyny.

Dawka białka fuzyjnego konieczna do normalizacji poziomu glukozy u pacjenta zależy od wielu czynników, między innymi, ale bez ograniczania, płci pacjenta, sposobu podawania i dostępności biologicznej, profilu farmakokinetycznego takiego białka fuzyjnego, jego aktywności i postaci leku.

Wynalazek obejmuje związki GLP-1, które dzięki połączeniu z albuminą, fragmentem albuminy lub analogiem albuminy mają poprawione własności biochemiczne i biofizyczne. Takie białka heterogenne mogą ulegać ekspresji w komórkach gospodarza, jednocześnie zachowując aktywność generowania sygnałów związaną z aktywacją receptora GLP-1 i mając przedłużone czasy półtrwania.

Poniższe przykłady są ilustracją wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Konstruowanie DNA kodującego heterogenne białka fuzyjne

P r z y k ł a d 1a: Konstruowanie DNA kodującego Val⁸-GLP-1 (7-37)-Fc:

Część Fc ludzkiej IgGl zawierającą cały region zawiasowy i domeny CH2 i CH3 izoluje się z biblioteki cDNA. Zawierający 696 par zasad fragment części Fc ludzkiej IgGl wstawia się w miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Nhel i Eco47III ssaczego wektora do ekspresji pJB02 i otrzymuje się wektor pJB02/Fc (patrz fig. 5). DNA kodujący sekwencję sygnału wydzielania IgK połączoną z Val⁸-GLP-1(7-37) otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro z czterech nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów:

5'- CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTT CCAGGTTCCACTGGTGACCAGTG - 3' [SEQ ID NO:12]

5'- GAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGAGGGCCAGGCCGCCAAGGA GTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGAAGAGGC - 3' [SEQ ID NO:13]

5'- TGAAGGTGCCCTCCACGTGGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTA CCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGG - 3' [SEQ ID NO:14]

5'- CCTCTTCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCCTGGCCCTCCAGA TAGGAGGACACGTCGGAGG - 3' [SEQ ID NO:15]

Reakcję hybrydyzacji prowadzi się używając jednakowych ilości każdego oligonukleotydu (stężenie końcowe każdego oligo 1 pm/il). Mieszaninę oligonukleotydów ogrzewa się przez 5 minut w temperaturze 100°C w buforze do ligacji (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1mM ATP, 25 ig/ml albuminy surowicy bydlęcej) i a następnie oziębia przez przynajmniej 2 godziny w temperaturze 30°C.

Otrzymany produkt łączy się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 16°C ze szkieletem wektora pJB02/Fc, który trawi się enzymami Nhel i Eco47III. Produktów łączenia używa się do transformowania kompetentnych komórek XL-1 Blue (Stratagene). Rekombinowane plazmidy bada się pod kątem obecności wstawek kodujących peptyd (kodujących sekwencję Kozak i pierwszą Met peptydu sygnałowego), trawiąc otrzymane klony enzymem Ncol i sekwencjonując. Otrzymany plazmid do ekspresji używa się do transfekcji i oznacza pJB02-V8-GLP-1-Fc (fig. 5).

P r z y k ł a d 1b: Konstruowanie DNA kodującego Val⁸-GLP-1(7-37)-HSA:

Plazmid HSA/pcDNA3.1GS został zakupiony w firmie Invitrogen (Numer katalogowy H-M12523M-pcDNA3.l/GS) i użyto go jako matrycy do wyizolowania cDNA kodującego albuminę surowicy ludzkiej (HSA). HSA cDNA otrzymuje się metodą PCR, w czasie której usuwa się DNA kodujący sekwencję wiodącą i sześć aminokwasów z 5' końca pro-peptydu. Bezpośrednio na 3' końcu sekwencji kodującej HSA dodaje się kodony stop. W celu ułatwienia klonowania na 5' i 3' końcu dodaje się także miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. W porównaniu z sekwencją natywnej ludzkiej HSA, sekwencja HSA DNA zawarta w oryginalnym wektorze zakupionym w firmie Invitrogen zawiera jedną zmienioną zasadę w 3' regionie genu (w pozycji 667). Zmiana ta powoduje powstanie kodonu kodującego Asn zamiast Asp. Stosując opisaną powyżej standardową metodę mutagenezy PCR za pomocą nakładających się oligonukleotydów, zmienia się ten kodon tak, żeby w tej pozycji kodował Asp. Powstający DNA kodujący HSA klonuje się w miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Nhel i Hindlll wektora pJB02 i otrzymuje się wektor pJB02-HSA (fig. 6).

Sekwencję sygnału wydzielania IgK połączoną z Val⁸-GLP-1(7-37) otrzymuje się tak jak opisano powyżej w przykładzie 1a. Taki DNA wstawia się w miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Nhel i Fspl wektora pJB02-HSA i otrzymuje się wektor pJB02-Val⁸-GLP-1-HSA.

P r z y k ł a d 1c: Konstruowanie DNA kodującego Val⁸-GLP-1(7-37)-łącznik-HSA:

Wektor pJB02-HSA otrzymuje się tak jak opisano w przykładzie 1b. DNA kodujący sekwencję łącznika [GGGGS]3 łączy się zgodnie z ramką odczytu z 5' końcem DNA kodującego HSA i otrzymuje

PL 209 550 B1 się wektor pJB02-łącznik-HSA (fig. 7). DNA kodujący sekwencję sygnału wydzielania IgK połączoną z Val⁸-GLP-1(7-37) i 5' część sekwencji łącznika otrzymuje się tak, jak opisano powyżej w przykładzie 1a. Taki DNA wstawia się w miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Nhel i BspEI wektora pJB02 i otrzymuje się wektor pJB02-Val⁸-GLP-1-łącznik-HSA.

P r z y k ł a d 1d: Konstruowanie DNA kodującego Eksendynę-4-Fc:

Plazmid pJB02/Fc wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1a. DNA kodujący sekwencję sygnału wydzielania IgK połączoną z Eksendyną-4 otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro z poniższych nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów:

5' - CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG GGTTCCAGGTTCCACCGGTCAC - 3' [SEQ ID NO:16]

5' - GGAGAGGGAACCTTCACCAGCGACCTGAGCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGT GAGACTG - 3' [SEQ ID NO:17]

5' - TTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGAGGACCAAGCAGCGGAGCCCCTCCTCCT AGC - 3' [SEQ ID NO:18]

5' - GAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCA TGGTGG - 3' [SEQ ID NO:19]

5' - CTCCTCCTCCATCTGCTTGCTCAGGTCGCTGGTGAAGGTTCCCTCTCCGTGA CCGGTG - 3' [SEQ ID NO:20]

5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTTGGTCCTCCGTTCTTCAGCCACTCGAT GAACAGTCTCACGGC - 3' [SEQ ID NO: 21]

Reakcję hybrydyzacji prowadzi się tak, jak opisano w przykładzie 1a. Zhybrydyzowany produkt wstawia się w wektor pJB02, wcześniej trawiony enzymami Nhel i Eco47III tak, jak opisano w przykładzie 1a i otrzymuje się wektor pJB02-Eksendyna-4-Fc.

P r z y k ł a d 1e: Konstruowanie DNA kodującego Eksendynę-4-HSA:

Plazmid pJB02-HSA wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1b. DNA kodujący sekwencję sygnału wydzielania IgK połączoną z Eksendyną-4 otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro tych samych nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów tak, jak opisano w przykładzie 1d. Reakcję hybrydyzacji prowadzi się tak, jak opisano powyżej. DNA wstawia się w unikatowe miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Nhal i Fspl wektora pJB02-HSA i otrzymuje się wektor pJB02-Eksendyna-4-HSA.

P r z y k ł a d 1f: Konstruowanie DNA kodującego Eksendynę-4-łącznik-HSA:

Plazmid pJB02-łącznik-HSA wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1b. DNA kodujący sekwencję sygnału wydzielania IgK połączoną z Eksendyną-4 i 5' część sekwencji łącznika otrzymuje się tak, jak opisano w przykładzie 1d. Taki DNA wstawia się w unikatowe miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Nhel i FspEI wektora pJB02-łącznik-HSA i otrzymuje się wektor pJB02-Eksendyna-4-łącznik-HSA.

P r z y k ł a d 1g: Konstruowanie DNA kodującego Val⁸-GLP-1/C-Ex-Fc:

Plazmid pJB02-Eksendyn-4-Fc wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1d. DNA kodujący Eksendynę-4 wycina się z wektora enzymami Agel i Eco47III. DNA kodujący Val8-GLP-1/C-Ex otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro z poniższych nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów :

5' - CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTGGA GGGCCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:22]

5' - AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGG AGCCCCTCCTCCTAGC - 3' [SEQ ID NO:23]

5' - CTCCAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:24]

5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGA TGAATTCCTTGGCGGCCTGGCC - 3' [SEQ ID NO:25]

Reakcję hybrydyzacji prowadzi się tak, jak opisano w przykładzie 1a. Zhybrydyzowany produkt wstawia się w miejsce Eksendyny-4 w wektor do ekspresji pJB02-Eksendyna-4-Fc i otrzymuje się wektor pJB02-Val⁸-GLP-l/C-Ex-Fc.

P r z y k ł a d 1h: Konstruowanie DNA kodującego Val⁸-Glu²²-GLP-1-Fc:

Plazmid pJB02-Eksendyn-4-Fc wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1d. DNA kodujący Eksendynę-4 wycina się z wektora enzymami Agel i Eco47III. DNA kodujący Val⁸-Glu²²-GLP-1

PL 209 550 B1 otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro z poniższych nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów:

5' - CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGA

GGAGCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:26]

5' - AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC - 3'

[SEQ ID NO: 27]

5' - GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGCC

TGCTC - 3' [SEQ ID NO:28]

5' - CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCT CCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:2 9]

Reakcję hybrydyzacji prowadzi się tak, jak opisano w przykładzie 1a. Zhybrydyzowany produkt wstawia się w miejsce Eksendyny-4 w wektor do ekspresji pJB02-Eksendyna-4-Fc i otrzymuje się wektor pJB02-Val⁸-Glu²²-GLP-1-Fc.

P r z y k ł a d 1i: Konstruowanie DNA kodującego Val⁸-Glu²²-GLP-1/C-Ex-Fc:

Plazmid pJB02-Eksendyn-4-Fc wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1d. DNA kodujący Eksendynę-4 wycina się z wektora enzymami Agel i Eco47lII. DNA kodujący Val⁸-Glu²²-GLP-1/C-Ex otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro z poniższych nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów:

5' - CCGGTCACGTGGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGA

GGAGCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:30]

5' - AGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGCAGCAGCGGA GCCCCTCCTCCTAGC - 3' [SEQ ID NO:31]

5' - CTCGAGATAGGAGGACACGTCGGAGGTGAAGGTGCCCTCCACGTGA - 3' [SEQ ID NO:32]

5' - GCTAGGAGGAGGGGCTCCGCTGCTGCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGA TGAATTCCTTGGCGGCCTGCTC - 3' [SEQ ID NO:33]

Reakcję hybrydyzacji prowadzi się tak, jak opisano w przykładzie 1a. Zhybrydyzowany produkt wstawia się w miejsce Eksendyny-4 w wektor do ekspresji pJB02-Eksendyna-4-Fc i otrzymuje się wektor pJB02-Val⁸-Glu²²-GLP-1/C-Ex-Fc.

P r z y k ł a d 1j: Konstruowanie DNA kodującego Gly⁸-GLP-1-Fc:

Plazmid pJB02-Eksendyn-4-Fc wytwarza się tak, jak opisano w przykładzie 1d. DNA kodujący Eksendynę-4 wycina się z wektora enzymami Agel i Eco47III. DNA kodujący Gly⁸-GLP-1 otrzymuje się metodą hybrydyzacji in vitro z poniższych nakładających się i komplementarnych oligonukleotydów:

5' - CCGGTCACGGCGAGGGCACCTTCACTAGTGACGTGTCCTCCTATCTGGA GGGCCAGGCCGCCA - 3' [SEQ ID NO:34]

5' - AGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCCGGGGC - 3'

[SEQ ID NO:35]

5' - CTCCAGATAGGAGGACACGTCACTAGTGAAGGTGCCCTCGCCGTGA - 3'

[SEQ ID NO:36]

5' - GCCCCGGCCCTTCACCAGCCAGGCGATGAACTCCTTGGCGGC

CTGGCC - 3' [SEQ ID NO:37]

Reakcję hybrydyzacji prowadzi się tak, jak opisano w przykładzie 1a. Zhybrydyzowany produkt wstawia się w miejsce Eksendyny-4 w wektor do ekspresji pJB02-Eksendyna-4-Fc i otrzymuje się wektor pJB02-Gly⁸-GLP-1-Fc.

P r z y k ł a d 2: Ekspresja heterogennego białka fuzyjnego

Ekspresję białka fuzyjnego kodowanego przez konstrukty DNA wytworzone w przykładzie 1 uzyskuje się metodą przejściowej transfekcji komórek HEK 293EBNA (zarówno rosnących w na podłożu stałym jak i w zawiesinie). Komórki liczy się i wysiewa 24 godziny przed transfekcją. Mieszaninę transfekcyjną przygotowuje się mieszając odczynnik do transfekcji FuGene™6 (Roche Molecular Biochemicals, katalog # 1814443) z OptiMEM (Gibco/BRL) i inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie dodaje się DNA i koktajl inkubuje przez następne 15 minut. Tuż przed transfekcją do płytek hodowlanych dodaje się nowe podłoże. W tabelach 1 i 2 podane są dodatkowe szczegóły transfekcji.

PL 209 550 B1

T a b e l a 1:

Odczynniki użyte do przejściowej transfekcji komórek 293EBNA

Naczynie do hodowli	Liczba Wysianych Komórek	DMA (ng)	FuGene (il)	Podłoże OptiMEM (ml)	Objętość Podłoża do Hodowli (ml)
35 mm	5 x 10⁵	1,5	9	0,102	2
100 mm	2 x 10⁶	12	73	0,820	10
700 cm² (RB)	2 x 10⁷	65	400	4,0	100

T a b e l a 2: Skł ad podł ó ż

Podłoże do hodowli i transfekcji	Podłoże do zbierania białka
DMEM F12 3:1	Hybritech base
5% FBS	1 mM Ca²*
20 mM HEPES	20 mM HEPES
2 mM L-glutamina	1 ig/ml Nuselina (insulina ludzka)
50 ig/ml genetycyna (G418 NEO)	1 ig/ml transferyna ludzka
50 ig/ml tobromycyna	50 ig/ml tobromycyna

Przy transfekcjach na małą skalę (płytki o średnicy 35 mm - 10 mm), 24 godziny po transfekcji komórki przemywa się PBS i zmienia się im podłoże na podłoże do zbierania białka. Przez kilka następnych dni co 24 godziny zmienia się i zbiera podłoże. Przy transfekcjach na dużą skalę (butelki obrotowe o pojemności 700 cm²), komórki w butelkach obrotowych przemywa się PBS 48 godzin po i zmienia się im podłoże na podłoże do zbierania białka. Przez co najmniej 10 kolejnych dni co 24 godziny zmienia się i zbiera podłoże. Do oczyszczania białka wykorzystuje się rutynowo tylko podłoże z 10 zmian.

P r z y k ł a d 3: Oczyszczanie heterogennego białka fuzyjnego

P r z y k ł a d 3a: Oczyszczanie Val⁸-GLP-1-Fc

Około 4,5 litrów podłoża, w którym rosły komórki (poziom ekspresji białka połączonego około 20 ig/ml), otrzymanego z transfekcji na dużą skalę, filtruje się przez system filtrów CUNO i zatęża do 250 ml przy użyciu systemu filtracji ze stycznym przepływem ProFlux wyposażonym w filtr membranowy 10000. Białko Val⁸-GLP-1-Fc wychwytuje się na 5 ml kolumnie HiTrap protein A zrównoważonej 1x PBS, pH 7,4 przy szybkości przepływu 2 ml/min i wymywa z kolumny 50 mM kwasem cytrynowym pH 3,3. Frakcje (po 1 ml) zbiera się do probówek zawierających 4 ml 1x PBS i 100/il 1 M Tris pH 8.

Frakcje zawierające białko połączone, które wykrywa się metodą SDS-PAGE i HPLC z odwróconymi fazami na Zorbax C8, zlewa się i nanosi w 1x PBS, pH 7,4 na kolumnę Superdex 75 60/60 przy szybkości przepływu 10 ml/min. Frakcje zawierające białko połączone (20 ml/probówkę) zbiera się i zlewa. Zlane frakcje poddaje się C4 chromatografii z odwróconymi fazami w 0,1% TFA w wodzie przy szybkości przepływu 3 ml/min. Białko Val⁸-GLP-1-Fc wymywa się stosując gradient od 5% B (0,1% TFA w acetonitrylu) do 100% B w 70 minut. Wymyte frakcje (3 ml/probówkę) zbiera się. Acetonitryl usuwa się przez odparowanie w warunkach obniżonego ciśnienia i dodaje się 1 ml H2O. Oczyszczoną próbkę (około 32 ml) dializuje się dwa razy wobec 4 litrów 1x PBS pH 7,4.

Dializowaną próbkę filtruje się przez zestaw do filtracji MILLEX-GV wyposażony w filtr o wielkości porów 0,22 im i określa się stężenie białka mierząc absorpcję przy długości fali 280 nm.

P r z y k ł a d 3b: Oczyszczanie Val⁸-GLP-1-HSA lub Val⁸-GLP-łącznik-HSA

Około 6,5 litrów podłoża w którym rosły komórki (poziom ekspresji białka fuzyjnego około 10 ig/ml), filtruje się przez system filtrów CUNO i zatęża do 380 ml przy użyciu systemu filtracji ze stycznym przepływem ProFlux wyposażonym w filtr membranowy 10000. Białko połączone wychwytuje się na 50 ml kolumnie Fast Flow Q (Pharmacia) zrównoważonej 20 mM Tris pH 7,4 przy szybkości przepływu 5ml/min. Białko wymywa się z kolumny stosując gradient od 0% do 50% 20mM Tris pH 7,4, 1M NaCl w 10 CV, a następnie do 100% B w 2 CV.

Frakcje zawierające białko fuzyjne, zlewa się i poddaje C4 chromatografii z odwróconymi fazami w 0,1% TFA w wodzie przy szybkości przepływu 5 ml/min. Białko fuzyjne wymywa się stosując gradient od 20% B (0,1% TFA w acetonitrylu) do 90% B w 120 minut. Wymyte frakcje (3,5 ml/probówkę) zbiera się.

PL 209 550 B1

Acetonitryl usuwa się przez odparowanie w warunkach obniżonego ciśnienia i frakcje zlewa się. Do około ml zlanych frakcji dodaje się 1x PBS pH 7,4 do objętości 40 ml i dializuje przez noc się wobec 4 litrów 1x PBS pH 7,4. Próbkę filtruje się i mierzy stężenie białka określając absorpcję przy długości fali 280 nm.

P r z y k ł a d 3c: Oczyszczanie białka Eksendyna-4-Fc:

Około 4 litrów podłoża w którym rosły komórki (poziom ekspresji białka połączonego około 8 μg/ml), filtruje się przez system filtrów CUNO i zatęża do 250 ml przy użyciu systemu filtracji ze stycznym przepływem ProFlux wyposażonym w filtr membranowy 30000. Białko Eksendyna-4-Fc wychwytuje się na 5 ml kolumnie HiTrap protein A zrównoważonej 1x PBS, pH 7,4 przy szybkości przepływu 2 ml/min i wymywa z kolumny 50 mM kwasem cytrynowym pH 3,3. Frakcje zawierające białko połączone zbiera się, filtruje i dializuje przez noc wobec 4 litrów 1x PBS pH 7,4. Dializowaną próbkę nanosi się w 1x PBS pH 7,4, 0,5 M NaCl na kolumnę Superdex 75 60/60 przy szybkości przepływu ml/min. Frakcje zawierające białko połączone (20 ml/probówkę) zbiera się, zlewa i zatęża do stężenia około 1 mg/ml. Zatężone frakcje filtruje się przez zestaw do filtracji MILLEX-GV wyposażony w filtr o wielkości porów 0,22 μm.

P r z y k ł a d 3d: Oczyszczanie białka Eksendyna-4-HSA lub Eksendyna-4-łącznik-HSA:

Około 1,1 litra podłoża w którym rosły komórki (poziom ekspresji białka połączonego około 6 μg/ml), filtruje się przez system filtrów CUNO i zatęża do 175 ml, przy użyciu systemu filtracji ze stycznym przepływem ProFlux wyposażonym w filtr membranowy 30000.

Białko fuzyjne wychwytuje się na 5 ml kolumnie HiTrap Q-sepharose (Pharmacia) w 20 mM Tris pH 7,4 przy szybkości przepływu 2 ml/min. Białko wymywa się z kolumny stosując gradient od 0% do 50% 20mM Tris pH 7,4, 1M NaCl w 12 CV, a następnie do 100% B w 4 CV.

Frakcje zawierające białko fuzyjne zlewa się i poddaje C4 chromatografii z odwróconymi fazami w 0,1% TFA w wodzie przy szybkości przepływu 5 ml/min. Białko fuzyjne wymywa się stosując gradient od 10% B (0,1% TFA w acetonitrylu) do 100% B w 70 minut. Wymyte, zawierające białko fuzyjne frakcje (10 ml/probówkę) zbiera się. Acetonitryl usuwa się przez odparowanie w warunkach obniżonego ciśnienia. Około 8 ml zlanych frakcji dializuje przez noc się wobec 4 litrów 1x PBS pH 7,4. Próbkę filtruje się i mierzy stężenie białka określając absorpcję przy długości fali 280 nm. Dializowaną próbkę w 1x PBS pH 7,4, 0,5 M NaCl nanosi się na kolumnę Superdex 200 26/60 przy szybkości przepływu ml/min. Frakcje zawierające białko fuzyjne (3 ml/probówkę) zbiera się, zlewa, zatęża i filtruje.

P r z y k ł a d 4: Charakterystyka białka połączonego metodą SDS PAGE:

Metody SDS-PAGE połączonej z immunoblotem używa się do badania zarówno oczyszczonego białka fuzyjnego, jak i do badania podłoża, w którym rosły komórki transfekowane różnymi wektorami do ekspresji białek fuzyjnych. SDS-PAGE robi się za pomocą systemu Novex Powerease 500 przy użyciu gotowych żeli Novex 16% Tris-Glycine Precast Gels (EC6498), buforu do rozwijania (10x, LC2675) i buforu do próbek (L2676). Przed nałożeniem na żel próbki redukuje się 50 mM DTT i ogrzewa przez 3-5 min w temperaturze 95°C.

Po rozwinięciu żelu SDS-PAGE, do wymycia z żelu SDS używa się wody i buforu do przenoszenia (1x Tris-Glycine Seprabuff (Owi Scientific Cat. No. 5 ER26-S) z 20% metanolem). Do przenoszenia na błonę używa się aparatu do przenoszenia Novex i błon PVDF (BioRad, Cat. No. 162-0174) i nitrocelulozowej (BioRad, Cat. No. 1703965 lub 1703932). Przenoszenie prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 90 minut i przy napięciu 30-35 V. Błony blokuje się 1x PBS z 0,1% Tween-20 (Sigma, Cat. No. P-7949) i 5% Mleka (BioRad, Cat. No. 170-6404) przez 1-12 godzin w temperaturze 4°C. Przeciwciała rozcieńcza się w 1x PBS + 5% mleka i bioty inkubuje się w tych roztworach przez 1-2 godziny w temperaturze 4°C. Pomiędzy inkubacjami bioty przemywa się cztery razy po 5 minut roztworem 1x PBS z 0,2% Tween-20 w temperaturze pokojowej. PBS robi się z GIBCO 10x PBS (Cat No. 70011) i otrzymuje się gotową kompozycję o składzie 1 mM jednozasadowy fosforan potasu, mM dwuzasadowy fosforan sodu, 153 mM chlorek sodu, pH 7,4 lub z torebek z PBS dostarczonych przez firmę Sigma (Cat. No. 1000-3) i otrzymuje się kompozycję o składzie 120 mM NaCl, 2,7 mM KCl i 10 mM fosforanu, pH 7,4 w temperaturze 25°C.

Jako przeciwciał pierwotnych używa się albo poliklonalnych przeciwciał kozich przeciw IgGl lub przeciwciał króliczych przeciw HSA. Jako przeciwciał pierwotnych używa się albo przeciwciał przeciw IgG kozy sprzężonych z HRP lub przeciwciał przeciw IgG królika sprzężonych z HRP. Przeciwciała wtórne rozcieńcza się 1:5000. Do wizualizacji biotów używa się systemu ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Cat. No. RN2108 i Cat. No. RPN1674H).

Figura 3A porównuje oczyszczone białko Fc i podłoże, w którym rosły komórki transfekowane pJB02-Val⁸-GLP-1-Fc i pJB02-Eksendyna-4-Fc. Zmniejszenie mobilności zgodne jest ze zwiększe32

PL 209 550 B1 niem wielkości wynikającym z obecności części GLP-1 w białku fuzyjnym. Figura 3A porównuje oczyszczone białko HSA i podłoże w którym rosły komórki transfekowane pJB02-Val⁸-GLP-2-HSA, pJB02-Val⁸-GLP-1-łącznik-HSA, pJB02-Eksendyna-4-HSA lub pJB02-Eksendyna-4-łącznik-HSA. Figura 4 identyfikuje oczyszczone preparaty białka fuzyjnego.

P r z y k ł a d 5: Charakterystyka białek fuzyjnych użytych do spektrometrii masowej:

Wszystkie eksperymenty wykonuje się na spektrometrze masowym Micromass TofSpec-2E wyposażonym w elektronikę typu ogniskowanie opóźnienia czasowego, reflektron (używany do analizy peptydów o wielkości 0-8000 Da), detektor liniowy (używany do analizy wyników typu duża masa/dobry sygnał) i detektor poprzyspieszeniowy (P.A.D., używany do analizy wyników typu duża masa/wyjątkowo niski sygnał). Efektywna długość ścieżki instrumentu w trybie liniowym wynosi 1,2 metra, w trybie reflektronowym 2,3 metra. Do detekcji w trybie liniowym i w trybie reflektronowym używa się dwóch podwójnych mikrokanałowych detektorów płytkowych. Do detekcji używa się lasera azotowego VSL-337 i firmy Laser Science Inc. działającego przy długości fali 337 nm i 5 impulsach lasera na sekundę. Dane zbiera się przy użyciu 2 GHz, 8 bitowego wewnętrznego konwertera analogowocyfrowego i na jedno spektrum uśrednia się do 50 impulsów lasera.

W celu wykonania analizy białek fuzyjnych GLP-1 urządzenie powinno działać w trybie liniowym. Detektor liniowy jest urządzeniem wykrywającym jony przemieszczające się w dół rurki przelotowej instrumentu MALDI-ToF-MS. Mierzy on częstość występowania danych jonów w czasie i wysyła sygnał, który jest zamieniany przez konwerter analogowo-cyfrowy. Konwerter analogowo-cyfrowy jest urządzeniem, które pozwala na przeniesienie sygnału generowanego przez spektrometr mas do komputera, w którym następuje jego przetworzenie na spektrum m/z.

Jako matrycy jonizacyjnej używa się nasyconego, rekrystalizowanego roztworu kwasu synapinowego (rozcieńczonego w 50/50 Acn / H2O i 0,1% TFA). Kwas synapinowy jest odpowiednią matrycą dla białek o wielkości powyżej 10 kDa. Do otrzymania dokładnych pomiarów masy analizowanych próbek używa się zewnętrznych plików kalibracyjnych i białek referencyjnych o odpowiedniej masie, jako standardu wewnętrznego. Próbki analizuje się stosując rozcieńczenie próbka:matryca wynoszące 1:2. Początkowo instrument ustawia się na następujące warunki detekcji liniowej:

Napięcie źródła: 20,0 keV

Napięcie ekstrakcji: 20,0 keV

Napięcie ogniska: 16,0 keV

Detektor liniowy: 3,7 keV

P.A.D.: (wyłączony)

Napięcie pulsu: 3,0 keV

Zgrubna nastawa lasera: 50

Dokładna nastawa lasera: 50

Ustawienia te zmienia się w miarę potrzeby żeby otrzymać jak najlepszy stosunek sygnał/szum i najwyższą rozdzielczość. W tabeli 3 pokazano charakterystykę różnych białek połączonych GLP-1.

T a b e l a 3

Białko fuzyjne	Spodziewana masa (KDa)	Masa określona metodą spektromerii mas (kDa)
Val⁸-GLP-1-IgG1	59,08	61,94
Val⁸Glu²²-GLP-1-IgG1	59,23	63,61
Gly⁸-GLP-1-IgG1	59,00	62,93
Val⁸-GLP-1-CEx-IgG1	60,45	65,1-65,6
Val⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-IgG1	60,69	65,86
Eksendyna-4-IgG1	60,69	65,86
Val⁸-GLP-1-łącznik-HSA	70,70	69,89, 70,74
Eksendyna-4-HSA	70,56	70,62
Eksendyna-4-łącznik-HSA	71,56	71,62

CEx oznacza C-końcowe wydłużenie i obejmuje sekwencję Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser. Łącznik oznacza Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.

PL 209 550 B1

P r z y k ł a d 6: Aktywność heterogennych białek fuzyjnych:

Zdolność białek fuzyjnych według wynalazku do aktywowania receptora GLP-1 bada się testami in vitro, takimi jak te opisane w Europejskim Dokumencie Patentowym EP 619322 dla Gelfand i wsp. i Dokumencie Patentowym Stanow Zjednoczonych Ameryki No. 5120712. Aktywność tych związków w porównaniu do aktywności Val⁸-GLP-1(7-37)OH pokazana jest w tabeli 4. Figura 8 pokazuje krzywe typu dawka efekt in vitro białek fuzyjnych Val⁸-GLP-1 i Eksendyny-4. Ponadto, tabele 5a i 5b pokazują aktywność in vitro dużej grupy analogów GLP-1, które połączono z Fc lub albuminą w celu otrzymania biologicznie aktywnych białek fuzyjnych. Aktywności te porównano z GLP-1(7-37)OH.

T a b e l a 4: Aktywność in vitro białek fuzyjnych GLP-1

Białko fuzyjne	Aktywność in vitro (% aktywności Val⁸-GLP-1)
Val⁸-GLP-1-IgG1	1
Eksendyna-4-IgG1	240
Val⁸-GLP-1-łącznik-HSA	0,2
Eksendyna-4-HSA	20
Eksendyna-4-łącznik-HSA	90
Eksendyna-4	500
Val⁸-Glu²²-GLP-1-IgG1	3,7
Gly⁸-GLP-1-IgG1	3,3
Val⁸-GLP-1-CEx-IgG1	3,3
Val⁸-Glu²²-GLP-1 -CEx-IgG1	29
Gly⁸-Glu²²-GLP-1-C2-IgG1	75
Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1	150
Eksendyna-4-C2-IgG1	250
Eksendyna-4-łącznik-IgG1	330
Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-HSA	4
Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG4	80

C2 oznacza Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-Ser-Gly-Ala.

Sekwencje aminokwasowe białek fuzyjnych opisanych w tabelach 3 i 4 przedstawione są jako SED ID NO: 13 do SEQ ID NO: 31.

Sekwencja aminokwasowa białka Val⁸-GLP-1-albumina surowicy ludzkiej przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 13.

HVEGTFTSDV SSYLEGOAAK EFIAWLVKGR GDAHKSEVAH RFKDLGEENF KALVLIAFAQ

YLQQCPFEDH VKLVNEVTEF AKTCVADESA ENCDKSLHTL FGDKLCTVAT LRETYGEMAD 121 CCAKQEPERN ECFLQHKDDN PNLPRLVRPE VDVMCTAFHD NEETFLKKYL YEIARRHPYF 181 YAPELLFFAK RYKAAFTECC CAADKAACLL PKLDELRDEG KASSAKQRLK CASLQKFGER 241 AFKAWAVARL SQRFPKAEFA EVSKLVTDLT KVHTECCHGD LLECADDRAD LAKYICENGjD 301 SISSKLKECC EKPLLEKSHC IAEVENDEMP ADLPSLAADF VESKDVCKNY AEAKDVFLGM 361 FLYEYARRHP DYSWLLLRL AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAKVFDEFKP LVEEPQNLIK 421 QNCELFEQLG EYKFQNALLV RYTKKVPQVS TPTLVEVSRN LGKVGSKCCK HPEAKRMPCA 481 EDYLSVVLNQ LCVLHEKTPV SDRVTKCCTE SLVNRRPCFS ALEVDETYVP KEFNAETFTF 541 HADICTLSEK ERQIKKQTAL VELVKHKPKA TKEQLKAVMD DFAAFVEKCC KADDKETCFA 601 EEGKKLVAAS QAALGL [SEQ ID NO: 13]

Sekwencja aminokwasowa białka Val⁸-GLP-1-łącznik-albumina surowicy ludzkiej przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 14.

HVEGTFTSDV SSYLEGOAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSDAHK SEVAHRFKDL

GEENFKALVL IAFAQYLQQC PFEDHVKLVN EVTEFAKTCV ADESAENCDK SLHTLFGDKL

121 CTVATLRETY GEMADCCAKQ EPERNECFLQ HKDDNPNLPR LVRPEVPVMC TAFHDNEETF

PL 209 550 B1

181 LKKYLYEIAR RHPYFYAPEL LFFAKRYKAA FTECCQAADK AACLLPKLDE LRDEGKASSA 241 KQRLKCASLQ KFGERAFKAW AVARLSQRFP KAEFAEVSKL VTDLTKVHTE CCHGDLLECA 301 DDRADLAKYI CENQDSISSK LKECCEKPLL EKSHCIAEVE NDEMPADLPS LAADFVESKD 361 VCKNYAEAKD VFLGMFLYEY ARRHPDYSW LLLRLAKTYE TTLEKCCAAA DPHECYAKVF 421 DEFKPLVEEP QNLIKQNCEL FEQLGEYKFQ NALLVRYTKK VPQVSTPTLV EVSRNLGKVG 481 SKCCKHPEAK RMPCAEDYLS VVLNQLCVLH EKTPVSDRVT KCCTESLVNR RPCFSALEVD 541 ETYVPKEFNA ETFTFHADIC TLSEKERQIK KQTALVELVK HKPKATKEQL KAVMDDFAAF 601 VEKCCKADDK ETCFAEEGKK LVAASQAALG L [SEQ ID NO: 14]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-albumina surowicy ludzkiej przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 15.

HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGG5GGGGS GGGGSDAHKS

EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA DESAENCDKS 121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLQH KDDNPNLPRL VRPEVDVMCT 181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA ACLLPKLDEL 241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC 301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL 361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSWL LLRLAKTYET TLEKCCAAAD 421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE 481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR 541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK 601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO 15]

Sekwencja aminokwasowa białka Eksendyna-4-albumina surowicy ludzkiej przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 16.

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSD AHKSEVAHRF KDLGEENFKA

LVLIAFAQYL QQCPFEDHVK LVNEVTEFAK TCVADESAEN CDKSLHTLFG DKLCTVATLR

121 ETYGEMADCC AKQEPERNEC FLQHKDDNPN LPRLVRPEVD VMCTAFHDNE ETFLKKYLYE 181 IARRHPYFYA PELLFFAKRY KAAFTECCQA ADKAACLLPK LDELRDEGKA SSAKQRLKCA 241 SLQKFGERAF KAWAVARLSQ RFPKAEFAEV SKLVTDLTKV HTECCHGDLL ECADDRAOLA 301 KYICENQDSI SSKLKECCEK PLLEKSHCIA EVENDEMPAD LPSLAADFVE SKDVCKNYAE 361 AKDVFLGMFL YEYARRHPDY SVYLLLRLAK TYETTLEKCC AAADPHECYA KVFDEFKPLV 421 EEPQNLIKQN CELFEQLGEY KFQNALLVRY TKKVPQVSTP TLVEVSRNLG PCVGSKCCKHP 481 EAKRMPCAED YLSVVLNQLC VLHEKTPVSD RVTKCCTESL VNRRPCFSAL EVDETYVPKE 541 FNAETFTFHA DICTLSEKER QIKKQTALVE LVKHKPKATK EQLKAVMDDF AAFVEKCCKA 601 DDKETCFAEE GKKLVAASQA ALGL [SEQ ID NO: 16]

Sekwencja aminokwasowa białka Eksendyna-4-łącznik-albumina surowicy ludzkiej przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 17.

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGGSGGGGS GGGGSDAHKS

EVAHRFKDLG EENFKALVLI AFAQYLQQCP FEDHVKLVNE VTEFAKTCVA DESAENCDKS

121 LHTLFGDKLC TVATLRETYG EMADCCAKQE PERNECFLOH KDDNPNLPRL VRPEVDVMCT 181 AFHDNEETFL KKYLYEIARR HPYFYAPELL FFAKRYKAAF TECCQAADKA ACLLPKLDEL 241 RDEGKASSAK QRLKCASLQK FGERAFKAWA VARLSQRFPK AEFAEVSKLV TDLTKVHTEC 301 CHGDLLECAD DRADLAKYIC ENQDSISSKL KECCEKPLLE KSHCIAEVEN DEMPADLPSL 361 AADFVESKDV CKNYAEAKDV FLGMFLYEYA RRHPDYSWL LLRLAKTYET TLEKCCAAAD 421 PHECYAKVFD EFKPLVEEPQ NLIKQNCELF EQLGEYKFQN ALLVRYTKKV PQVSTPTLVE 481 VSRNLGKVGS KCCKHPEAKR MPCAEDYLSV VLNQLCVLHE KTPVSDRVTK CCTESLVNRR 541 PCFSALEVDE TYVPKEFNAE TFTFHADICT LSEKERQIKK QTALVELVKH KPKATKEQLK 601 AVMDDFAAFV EKCCKADDKE TCFAEEGKKL VAASQAALGL [SEQ ID NO: 17]

Sekwencja aminokwasowa białka Val⁸-GLP-1-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 18.

HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV

121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV 181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLY3KLTVD KSRWQQGNVF 241 SCSYMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 18]

Sekwencja aminokwasowa białka Val⁸-GLP-1-CEx-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 19.

HVEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

121 YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 19]

Sekwencja aminokwasowa białka Val⁸-GLP-1-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 20.

HVEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV

PL 209 550 B1

121 SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV 181 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 241 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 20]

Sekwencja aminokwasowa białka Val⁸-GLP-1-CEx-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 21.

HVEGTFTSDV SSYLEEOAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS

241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 21]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-C2-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 22.

HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKYSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS

241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 22]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 23.

HGEGTFTSDV SSYLEECAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC

DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 23]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG4 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 24.

HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAESKYG

PPCPSCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE

121 VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP 181 REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS

241 FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK [SEQ ID NO: 24]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-2łącznik-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 25.

HGEGTFTSDV SSYLEECAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG

GGGSGGGGSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD

121 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN 181 KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 241 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 301 GK [SEQ ID NO: 25]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-2łącznik-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 26.

HGEGTFTSDY SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SGGGGSGGGG

SAEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV

121 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE 181 KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

241 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 3CSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK [SEQ ID NO: 26]

22

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-GLP-1-2CEx-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 27.

HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGR GSSGAPPPSS SGAPPPSAEP KSCDKTHTCP

PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA

121 KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ 181 VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY

241 SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 27]

22 25 33

Sekwencja aminokwasowa białka Gly⁸-Glu²²-Val²⁵-Ile³³-GLP-1-CEx-łącznik-IgG4 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 28.

HGEGTFTSDV SSYLEEQAVK EFIAWLIKGR GSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC

DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

121 GVEVHNAKTK PREECjYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO: 28] Sekwencja aminokwasowa białka Eksendyna-4-IgG1 przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 29.

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

PL 209 550 B1

121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 29]

Sekwencja aminokwasowa białka Eksendyna-4-C2-IgGl przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 30.

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGASSGAA EPKSCDKTHT CPPCPAPELL

GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

121 YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKV3N KALPAPIEKT ISKAKGGjPRE PQVYTLPPSR 181 EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS 241 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK [SEQ ID NO: 30]

Sekwencja aminokwasowa białka Eksendyna-4-łącznik-IgGl przedstawiona jest jako SEQ ID NO: 31.

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPSG GGGSGGGGSG GGGSAEPKSC

DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 181 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK [SEQ ID NO 31]

T a b e l a 5a: Aktywność in vitro analogów GLP-1

Związek GLP-1	Aktywacja receptora GLP-1
1	2
GLP-1 (7-37)OH	1,0
Val⁸ -GLP-1(7-37)OH	0,47 (n=6)
Gly⁸-His¹¹-GLP-1(7-37)OH	0,282
Val⁸-Ala¹¹-GLP-1(7-37)OH	0,021
Val⁸-Lys¹¹-GLP-1(7-37)OH	0,001
Val⁸-Tyr¹²-GLP-1 (7-37)OH	0,81
Val⁸-Glu¹⁶-GLP-1(7-37)OH	0,047
Val⁸-Ala¹⁶-GLP-1(7-37)OH	0,112
Val⁸-Tyr¹⁶-GLP-1 (7-37)OH	1,175
Val⁸-Lys²⁰-GLP-1 (7-37)OH	0,33
Gln²²-GLP-1 (7-37)OH	0,42
Val⁸-Ala²²-GLP-1 (7-37)OH	0,56
Val⁸-Ser²²-GLP-1 (7-37)OH	0,50
Val⁸-Asp²²-GLP-1 (7-37)OH	0,40
Val⁸-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,29
Val⁸-Lys²²-GLP-1 (7-37)OH	0,58
Val⁸-Pro²²-GLP-1(7-37)OH	0,01
Val⁸-His²²-GLP-1(7-37 )OH	0,14
Val⁸-Lys²²-GLP-1(7-36) NH2	0,53
Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-36) NH2	1,0
Gly⁸-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,07
Val⁸-Lys²³-GLP-1 (7-37)OH	0,18
Val⁸-His²⁴-GLP-1(7-37)OH	0,007
Val⁸-Lys²⁴-GLP-1 (7-37)OH	0,02
Val⁸-His²⁶-GLP-1(7-37)OH	1,6
Val⁸-Glu²⁶-GLP-1 (7-37)OH	1,5
Val⁸-His²⁷-GLP-1(7-37)OH	0,37

PL 209 550 B1 cd. tabeli 5a

1	2
Val⁸-Ala²⁷-GLP-1 (7-37)OH	0,47
Gly⁸-Glu³⁰-GLP-1 (7-37)OH	0,29
Val⁸-Glu³⁰-GLP-1 (7-37)OH	0,29
Val⁸-Asp³⁰-GLP-1 (7-37)OH	0,15
Val⁸-Ser³⁰-GLP-1 (7-37)OH	0,19
Val⁸-His³⁰-GLP-1(7-37)OH	0,19
Val⁸-Glu³³-GLP-1 (7-37)OH	0,039
Val⁸-Ala³³-GLP-1 (7-37)OH	0,1
Val⁸-Gly³³-GLP-1 (7-37)OH	0,01
Val⁸-Glu³⁴-GLP-1 (7-37)OH	0,17
Val⁸-Pro³⁵-GLP-1(7-37)OH	0,094
Val⁸-His³⁵-GLP-1(7-37)OH	0,41
Val⁸-Glu³⁵-GLP-1 (7-37)OH	0,15
Val⁸-Glu³⁶-GLP-1 (7-37)OH	0,11
Val⁸-His³⁶-GLP-1(7-37)OH	0,22
Val⁸-His³⁷-GLP-1(7-37)OH	0,33
Val⁸-Leu¹⁵-Glu²⁶-GLP-1(7-37)OH	0,23
Val⁸-Lys²²-Glu30-GLP-1 (7-37)OH	0,37
Val⁸-Lys²²-Glu²³-GLP-1 (7-37)OH	0,35
Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1 (7-37)OH	1,02
Val⁸-Glu²²-Lys²³-GLP-1 (7-37)OH	1,43
Val⁸-Lys³³-Val³⁴-GLP-1 (7-37)OH	0,08
Val⁸-Lys³³-Asn³⁴-GLP-1 (7-37)OH	0,09
Val⁸-Gly³⁴-Lys³⁵-GLP-1 (7-37)OH	0,34
Val⁸-Gly³⁶-Pro³⁷-GLP-1(7-37)NH2	0,53

T a b e l a 5b: Aktywność in vitro analogów GLP-1

Związek GLP-1	Aktywacja receptora GLP-1
1	2
GLP-1(7-37)OH	1,0
Val⁸-GLP-1(7-37)OH	0,47
Glys⁸-GLP-1(7-37)OH	0,80
Val⁸-Tyr¹²-GLP-1 (7-37)OH	0,80
Val⁸-Tyr¹²-GLP-1(7-36)NH2	0,52
Val⁸-Trp¹²-GLP-1 (7-37)OH	0,52
Val⁸-Leu¹⁶-GLP-1 (7-37)OH	0,52
Val⁸-Val¹⁶-GLP-1(7-37)OH	0,52
Val⁸-Tyr¹⁶-GLP-1 (7-37)OH	1,18
Gly⁸-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,03
Val⁸-Leu²⁵-GLP-1 (7-37)OH	0,24
Val⁸-Tyr¹²-Tyr¹⁶-GLP-1 (7-37)OH	0,70

PL 209 550 B1 cd. tabeli 5b

1	2
Val⁸-Trp¹²-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	0,80
Val⁸-Tyr¹²-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,27
Val⁸-Tyr¹⁶-Phe¹⁹-GLP-1(7-37)OH	1,32
Val⁸-Tyr¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	1,69, 1,79
Val⁸-Trp¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	2,30, 2,16
Val⁸-Leu¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	2,02
Val⁸-Ile¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	1,55
Val⁸-Phe¹⁶-Glu²² -GLP-1(7-37)OH	1,08
Val⁸-Trp¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	1,50, 3,10
Val⁸-Tyr¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	2,40, 2,77
Val⁸-Phe¹⁸-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	0, 94
Val⁸-Ile¹⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	1,88
Val⁸-Lys¹⁸-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,18
Val⁸-Trp¹⁹-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,50
Val⁸-Phe¹⁹-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	0,70
Val⁸-Phe²⁰-Glu²²-GLP-1 (7-37)OH	1,27
Val⁸-Glu²²-Leu²⁵-GLP-1 (7-37)OH	1,32
Val⁸-Glu²²-Ile²⁵-GLP-1(7-37) OH	1,46
Val⁸-Glu²²-Val²⁵-GLP-1(7-37) OH	2,21, 1,36
Val⁸-Glu²²-Ile²⁷-GLP-1(7-37)OH	0,94
Val⁸-Glu²²-Ala²⁷-GLP-1 (7-37)OH	1,03
Val⁸-Glu²²-Ile³³-GLP-1(7-37)OH	2,21, 1,79, 1,60
Val⁸-Asp⁹-Ile¹¹-Tyr¹⁶-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	2,02
Val⁸-Tyr¹⁶-Trp¹⁹-Glu²²-GLP-1(7-37)OH	1,64
Val⁸-Trp¹⁶-Glu²²-Val²⁵-Ile³³-GLP-1(7-37)OH	2,35
Val⁸-Trp¹⁶-Glu²²-Ile³³-GLP-1(7-37)OH	1,93
Val⁸-Glu²²-Val²⁵-Ile³³-GLP-1(7-37)OH	2,30, 2,73, 3,15
Val⁸-Trp¹⁶-Glu²²-Val²⁵-GLP-1(7-37)OH	2,07
Val⁸-Cys¹⁶-Lys²⁶-GLP-1(7-37)OH	1,97
Val⁸-Cys¹⁶-Lys²⁶-Arg³⁴-GLP-1(7-37)OH	2,4, 1,9

T a b e l a 6. Aktywność in vitro analogów GLP/Eksendyny

Sekwencja peptydu	Aktywność in vitro (% aktywności Val⁸-GLP-1(7-37)OH)
1	2
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2	6,21
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2	6,75, 3,25
HVEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIAWLVKGRG	2,86
HVEGTFTSDVSSYLEEEAVRLFIAWLVKGRG	1,47
HVEGTFTSDLSKQMEGQAAKEFIAWLVKGRG	0,11

PL 209 550 B1 cd. tabeli 6

1	2
HVEGT FT S DVS KQMEGQAAKE FIAWLVKGRG	0,04
HGEGTFTSDLSKQMEGQAAKEFIEWLKNGGP-NH2	1,44
HGEGTFTSDLSKQMEEEAAKEFIEWLKNGGP-NH2	2,80
HGEGTFTSDVSSYLEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2	5,40
HGEGTFTSDLSSYLEEEAVRLFIEWLKNGGP-NH2	5,07
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2	3,30
HAEGTFTSDVSKQLEEEAAKEFIAWLVKGRG	2,15
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLKNGGP-NH2	2,36
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIAWLVKGRG	3,25
HVEGTFTSDVSSYLEEEAAKEFIAWLVKGRG	1,00
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGRG	0,20
HVEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG	1,00
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG	2,12

P r z y k ł a d 7: Farmakokinetyka in vivo Val⁸-GLP-1-IgGl i Val⁸- GLP-1-HSA:

Badania farmakokinetyczne Val⁸-GLP-1-IgG1 i Val⁸-GLP-1-HSA prowadzi się na małpach z rodzaju Cynomologus. Małpom podaje się dawkę 5,6 nmoles/kg albo oczyszczonego Val⁸-GLP-1-IgG1 lub Val⁸-GLP-1-HSA. Związek podaje się w dużej jednorazowej dawce dożylne. Krew pobiera się do probówek zawierających EDTA przed podaniem leku i 0,083, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 i 216 godzin po podaniu leku. Stężenie immunoreaktywnego Val⁸-GLP-1 określa się w surowicy krwi przy użyciu testu radioimmunosorbcyjnego, w którym wykorzystuje się poliklonalną surowicę, której główna specyficzność skierowana jest przeciw N-końcowemu (7-16) regionowi Val⁸-GLP-1(7-37). Figura 9 pokazuje stężenie się w surowicy krwi Val⁸-GLP-1-Fc i Val⁸-GLP-1-łącznik-HSA po podaniu pojedynczej dożylnej dawki dwóm małpom. Białko połączone Fc ma czas półtrwania około 45 godzin, a połączenie z albuminą ma czas półtrwania około 87 godzin.

P r z y k ł a d 8: Farmakokinetyka in vivo Eksendyny-4-IgG1:

Bada się dwa psy Beagle z założonymi na stałe kaniulami, które nie jadły przez noc. Używa się wyjścia tętniczego i żylnego. Cewnik zakłada się przezskórnie do żyły głowowej i zabezpiecza. Zwierzęta umieszcza się w klatkach i ich cewniki podłącza się do obrotowej podwiązki typu swivel/teter. Roztwór zawierający białko fuzyjne Eksendyna-4-IgG1 (11,8 μM) wstrzykuje się dożylnie (1,0 nmol/kg) przez cewnik w żyle głowowej. Cewnik przepłukuje się 10 ml roztworu solanki. Po dwóch godzinach, zakłada się zacisk hyperglikemiczny (150 mg/dl) i utrzymuje przez trzy godziny. Przez ten 5-godzinny okres pobiera się próbki krwi tętniczej w celu określenia stężenia białka połączonego glukozy i insuliny w surowicy krwi. Wyniki tych badań porównuje się z wynikami wcześniejszych badań, w czasie których oba zwierzęta dostały dużą jednorazową dawkę solanki, s.c, i po trzech godzinach były badane przy użyciu 3-godzinnego zacisku hyperglikemicznego (150 mg/dl). W tych badaniach stężenie glukozy w surowicy krwi określa się przy użyciu analizatora poziomu glukozy firmy Beckman. Stężenie insuliny w surowicy krwi zostało określone przez pracowników Lineo Research, Inc. za pomocą zestawu RIA opracowanego przez tę firmę. Wyniki pokazano na fig. 10 i 11.

P r z y k ł a d 9: Farmakokinetyka in vivo Gly ⁸-Glu ²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1:

Dwie grupy po trzy normalne samce psów Beagle otrzymały 0,1 mg/kg Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1 przez podanie podskórne (SC) lub dożylne (IV). W obu grupach (IV i SC) testem radioimmunosorbcyjnym określa się stężenie w surowicy krwi immunoreaktywnego Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CExłącznik-IgG1 w próbkach pobranych od 30 minut przed podaniem do 216 godziny po podaniu. Stężeń tych używa się następnie do obliczenia podanych tu parametrów farmakokinetycznych. Średni czas półtrwania po podaniu IV Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgGl wynosi około 55 godzin, a całkowity klirens ciała wynosi 1,5 mL/godzinę/kg. Średni czas półtrwania po podaniu SC Gly⁸-Glu²²-GLP-1-CEx-łącznik-IgG1 wynosi około 38 godzin.

PL 209 550 B1

Lista sekwencji <110> Eli Lilly <120> Białka fuzyjne GLP-1 <130> Χ-13991 <150> US 60/251954 <151> 2000-06-12 <160> '35 <170> Patentin wersja 3.1

<210>	1
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

<400> 1

His

Ala

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Ser Tyr

Leu

Glu Gly

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys Gly

Arg

Gly

20

25

30

<210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Sztuczna sekwejncja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) i <223> Xaa w pozycji \2 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys; )

PL 209 550 B1 <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (3) . . (3) <223> Xaa w pozycji 3 oznacza Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) .

<223> Xaa w pozycji 5 oznacza Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (8) . . (8) <223> Xaa w pozycji 8 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (10) . . (10) <223> Xaa w pozycji 10 oznacza Val, Ala, Gly, Ser Ile, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

Thr, Leu, <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa w pozycji 11 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa w pozycji 12 oznacza Ser Val, Glu, Asp, Lys, Trp lub Tyr;

Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, <220>

<221> MISC FEATURE

PL 209 550 B1 <222> (13)..(13) · <223> Xaa at posifion 13 oznacza Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa w pozycji 14 oznacza Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Lys, Trp lub Tyr; .

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa w pozycji 15 oznacza Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa w pozycji 17 oznacza Gin, Asn, Arg, Glu, Asp lub Lys <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa w pozycji 18 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa w pozycji 19 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

PL 209 550 B1 <220> · <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa w pozycji 20 oznacza Lys, Arg, Gin, Glu, Asp lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa w pozycji 21 oznacza Leu, Glu, Asp lub Lys; .

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa w pozycji 24 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile,

Val, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa w pozycji 25 oznacza Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa w pozycji 26 oznacza Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa w pozycji 27 oznacza Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa w pozycji 28 oznacza Asn, Lys, Arg, Glu, Asp lub His;

PL 209 550 B1 <220> · <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa w pozycji 29 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) .

<223> Xaa w pozycji 30 oznacza Gly, Arg, Lys, Glu, Asp lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (31) . . (31) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa w pozycji 32 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa w pozycji 33 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa w pozycji 34 oznacza Gly, Asp, Glu, Lys lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35)

PL 209 550 B1 <223> Xaa w pozycji 35 oznacza Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu; Asp, Lys lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (36) . . (36) <223> Xaa w pozycji 36 oznacza Ser, Pro, Lys, Glu, Asp lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa w pozycji 37 oznacza Ser, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa w pozycji 38 oznacza Gly, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa w pozycji 39 oznacza Ala, Ser, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

<400> 2

His Xaa Xaa

Xaa Xaa Xaa

Gly

Xaa

Xaa Phe Thr Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 10 15

Xaa Phe Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

30

Xaa Xaa Xaa <210> 3 <211> 32

PL 209 550 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukt syntetyczny <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)

<223> Xaa w usunięty.	pozycji 1 oznacza L-histydynę, D-histydynę	lub	jest
<220>
<221> MISC_	FEATURE
<222> (2)..	(2)
<223> Xaa w	pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile,	Ser	lub
Thr ;
<220>
<221> MISC_	FEATURE <222> (3)..C3)
<223> Xaa w	pozycji 3 oznacza Thr, Ser, Arg, Lys, Trp,	Phe,	Tyr,

Glu lub His;

<220>

<221> MISC FEATURE

<222> <223> His;	(5) . Xaa	• (5) w pozycji	5	oznacza Asp,	Glu,	Arg,	Thr, Ala,	Lys lub
<220>
<221>	MISC	_FEATURE
<222>	(6) .	. (6)
<223>	Xaa	w pozycj i	6	oznacza His,	Trp,	Phe	lub Tyr;
<220>
<221>	MISC	_FEATURE
<222>	(10)	.·(10)
<223>	Xaa	w pozycji	10	oznacza Leu,	, Ser	, Thr, Trp, His,	, Phe,

PL 209 550 B1

Asp, Val, Tyr, Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12)	lub	Ala;
<223> Xaa w pozycji lub Lys ; <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13) . . (13)	12	oznacza	His,	Pro,	Asp,	, Glu,	Arg, Ser, Ala
<223> Xaa w pozycji lub Cys; <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17)	13	oznacza	Gly,	Asp,	Glu,	, Gin,	Asn, Lys, Arg
<223> Xaa w pozycji <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18)	17	oznacza	His,	Asp,	Lys,	Glu,	Gin lub Arg;
<223> Xaa w pozycji <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20)	18	oznacza	Glu,	Arg,	Ala	lub Lys;
<223> Xaa w pozycji His ; <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) . . (21)	20	oznacza	Trp,	Tyr,	Phe,	Asp,	Lys, Glu lub
<223> Xaa w pozycji lub Lys; <220> <221> MISC_FEATURE	21	oznacza	Ala,	Glu,	His,	Phe,	Tyr, Trp, Arg

PL 209 550 B1 <222> (24) .. (24) · <223> Xaa w pozycji 24 oznacza Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa w pozycji 25 oznacza Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa w pozycji 27 oznacza Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly lub Glu;

<220>

<221> MISC.FEATURE <222> (28).. (28) <223> Xaa w pozycji 28 oznacza Glu, Lys lub Asp;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa w pozycji 29 oznacza Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His lub Glu;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa w pozycji 30 oznacza Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (31) . . (31) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly lub jest usunięty.

PL 209 550 B1 <220> · <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Pro lub jest usunięty.

<400> 3

Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Leu Glu Gly ¹ 5 10 .15

Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Phe Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

25 30 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa w pozycji 1 oznacza L-histydynę, D-histydynę lub jest usunięty.

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa w pozycji 5 oznacza Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys lub His;

PL 209 550 B1 <220> · <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa w pozycji 6 oznacza His, Trp, Phe lub Tyr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa w pozycji 10 oznacza Leu, Ser, Thr, Trp, His,. Phe,

Asp, Val, Glu lub Ala;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg lub Cys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa w pozycji 17 oznacza His, Asp, Lys, Glu lub Gin;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa w pozycji 18 oznacza Glu, His, Ala lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa w pozycji 19 oznacza Asp, Lys, Glu lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa w pozycji 21 oznacza Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

PL 209 550 B1 <220><221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa w pozycji 24 oznacza Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa w pozycji 28 oznacza Glu, Lys lub Asp;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa w pozycji 30 oznacza Arg, Glu lub His;

<220>
<221>	MIS_	FEATURE
<222>	(31)	. · (31)
<223>	Xaa	w pozycji
Trp, Tyr,	Phe, His,
<220>
<221>	MISC	'_FEATURE
<222>	(32)	• · (32)
<223>	Xaa	w pozycji

PL 209 550 B1 <400> 4

Xaa

Glu

Gly

Xaa

Thr

Ser

Asp

Xaa

Ser

Tyr

Leu

Glu

Xaa

1

5

10

15

Xaa

Lys

Xaa

Phe

Ile

Xaa

Trp

Leu

Xaa

20

25

30

<210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met lub Thr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa w pozycji 6 oznacza His, Trp, Phe lub Tyr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (10) . . (10) <223> Xaa w pozycji 10 oznacza Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu lub Ala;

<220>

PL 209 550 B1

<221> MISC_FEATURE ·
<222> (16) . . (16) <223> Xaa w pozycji lub Cys;	16	oznacza Gly,	Asp,	Glu,	Gin, Asn	, Lys, Arg
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(17)..(17)
<223>	Xaa w pozycji	17	oznacza	His,	Asp,	Lys,	Glu lub <	Gin;
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(20) . . (20)
<223>	Xaa w pozycji	20	oznacza	Asp,	Lys,	Glu	lub His;
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(24) . . (24)
<223>	Xaa w pozycj i	24	oznacza	Ala,	Glu,	Asp,	Ser lub His;
<220>
<221>	MISC-FEATURE
<222>	(29) . . (29)
<223>	Xaa w pozycji	29	oznacza	Thr,	Ser,	Lys,	Arg, Trp	, Tyr,
Phe, Asp, Gly, Pro,	His	lub Glu;
<220>
<221>	MISC_FEATURE
<222>	(31) . . (31)
<223>	Xaa w pozycji	31	oznacza	Lys,	Arg,	Thr,	Ser, Glu	, Asp,

Trp, Tyr, Phe, His, Gly lub jest usunięty.

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa w pozycji 32 oznacza Pro lub jest usunięty

PL 209 550 B1 <400> 5

Xaa

Glu

Gly

Thr

Xaa

Thr

Ser

Asp

Xaa

Ser

Tyr

Leu

Glu

Xaa

1

5

10

15

Xaa

Ala

Xaa

Glu

Phe

Ile

Xaa

Trp

Leu

Val

Lys

Xaa

Arg

Xaa

20

25

30

<210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2) . . (2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr ;

<220>

PL 209 550 B1 <221> MISC_FEATURE · <222> (18)..(18) <223> Xaa w pozycji 18 oznacza Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa w pozycji 24 oznacza Ala, Glu, Asp, Ser lub His;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp,

Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro lub jest usunięty.

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa w pozycji 32 oznacza Pro lub jest usunięty.

<400> 6

Xaa

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr Leu

Glu

Xaa

1

5

10

15

Xćlćl

Xaa

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Xaa

Trp

Leu

Val

Lys

Gly Arg

Xaa

20

25

30

<210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<221> MISC_FEATURE

PL 209 550 B1 <222> (1)..(1) <223> Xaa w pozycji 1 oznacza L-histydynę, D-histydynę lub jest usunięty.

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Ala, Gly, Val, Thr, Ile lub alfametylo-Ala;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa w pozycji 15 oznacza Glu, Gin, Ala, Thr, Ser lub Gly;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Gin, Ala, Thr, Ser lub Gly;

<400> 7

Xaa

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr Leu

Xaa Gly

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Xaa

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly Arg

Gly

20

25

30

<210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<221> MISC FEATURE

PL 209 550 B1 <222> (19)..(19) <223> Xaa w pozycji 19 oznacza Lys lub Arg;

<220>

<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> ACETYLACJA <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa w pozycji 30 oznacza Gly;

<220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDACJA <400> 8

Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin 15 10 15

Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa

25 30 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <400> 9

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15

PL 209 550 B1

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <400> 10

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Leu

Ser

Lys

Gin

Met

Glu

1

5

10

15

Glu

Ala

Val

Arg

Leu

Phe

Ile

Glu

Trp

Leu

Lys

Asn

Gly

Pro

Ser

20

25

30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<220>

<221> MISC FEATURE

PL 209 550 B1 <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Gly, Ala lub Val;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (10) . . (10) <223> Xaa w pozycji 10 oznacza Leu lub .Val;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (12) . . (12) <223> Xaa w pozycji 12 oznacza Lys lub Ser;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa w pozycji 13 oznacza Gin lub Tyr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa w pozycji 14 oznacza Met lub Leu;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (16) . . (16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza Glu lub Gin;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (17) . . (17) <223> Xaa w pozycji 17 oznacza Glu lub Gin;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa w pozycji 19 oznacza Val lub Ala;

PL 209 550 B1 <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (20) . . (20) <223> Xaa w pozycji 20 oznacza Arg lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa w pozycji 21 oznacza Leu lub Glu;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa w pozycji 24 oznacza Glu lub Ala;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa w pozycji 27 oznacza Val lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (28) . . (28) <223> Xaa w pozycji 28 oznacza Asn lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (30) . . (30) <223> Xaa w pozycji 30 oznacza Gly lub Arg;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (31) . . (31) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Gly lub Pro;

<220>

<221> MISC FEATURE

PL 209 550 B1 <222> (32)..(32)

<223>	Xaa w	pozycj i	32	oznacza	Ser	lub	jest	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(33) .	. (33)
<223>	Xaa w	pozycj i	33	oznacza	Ser	lub	jest	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(34) .	. (34)
<223>	Xaa w	pozycj i	34	oznacza	Gly	lub	jest	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(35) .	. (35)
<223>	Xaa w	pozycj i	35	oznacza	Ala	lub	jest	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(36) .	. (36)
<223>	Xaa w	pozycji	36	oznacza	Pro	lub	j est	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(37) .	. (37)
<223>	Xaa w	pozycji	37	oznacza	Pro	lub	j est	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(38) .	. (38)
<223>	Xaa w	pozycji	38	oznacza	Pro	lub	jest	usunięty
<220>
<221>	MISC_	FEATURE
<222>	(39) .	. (39)
<223>	Xaa w	pozycji	39	oznacza	Pro	lub	jest	usunięty

PL 209 550 B1 <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa w pozycji 39 oznacza Ser lub jest usunięty <400> 11

Xaa

Glu

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Xaa

Ser

Xaa

Xaa Xaa

Glu

Xaa

1

5

10

15

Xaa

Ala

Xaa

Phe

Ile

Xaa

Trp

Leu

Xaa

Gly Xaa

Xaa

20

25

30

Xaa

<210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <220>

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa w pozycji 2 oznacza Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser lub Thr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6)

PL 209 550 B1 <223> Xaa w pozycji 6 oznacza Phe, Trp lub Tyr; · <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa w pozycji 10 oznacza Val, Trp, Ile, Leu, Phe lub Tyr;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (12) .. (12) <223> Xaa w pozycji 12 oznacza Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu lub Val;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (13) . . (13) <223> Xaa w pozycji 13 oznacza Tyr, Trp lub Phe;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (14) . . (14) <223> Xaa w pozycji 14 oznacza Leu, Phe, Tyr lub Trp;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (16) . . (16) <223> Xaa w pozycji 16 oznacza Gly, Glu, Asp lub Lys;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa w pozycji 19 oznacza Ala, Val, Ile lub Leu;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Ile lub Ala;

PL 209 550 B1 <220> · <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa w pozycji 24 oznacza Ala lub Glu;

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa w pozycji 27 oznacza Val lub Ile;

<220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDACJA <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa w pozycji 31 oznacza Gly, His lub jest usunięty.

<400> 12

Xaa Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 15 10 15

Gin Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Lys Gly Arg Xaa

25 30 <210> 13 <211> 616 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <400> 13

PL 209 550 B1

His

Val

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

Gly

1.

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

Asp

20

25

30

Ala

His

Lys

Ser

Glu

Val

Ala

His

Arg

Phe

Lys

Asp

Leu

Gly

Glu

35

40

45

Asn

Phe

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Ile

Ala

Phe

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

50

55

60

Cys

Pro

Phe

Glu

Asp

His

Val

Lys

Leu

Val

Asn

Glu

Val

Thr

Glu

Phe

65

70

75

80

Ala

Lys

Thr

Cys

Val

Ala

Asp

Glu

Ser

Ala

Glu

Asn

Cys

Asp

Lys

Ser

85

90

95

Leu

His

Thr

Leu

Phe

Gly

Asp

Lys

Leu

Cys

Thr

Val

Ala

Thr

Leu

Arg

100

105

110

Glu

Thr

Tyr

Gly

Glu

Met

Ala

Asp

Cys

Ala

Lys

Gin

Glu

Pro

Glu

115

120

125

Arg

Asn

Glu

Cys

Phe

Leu

Gin

His

Lys

Asp

Asn

Pro

Asn

Leu

Pro

130

135

140

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Glu

Val

Asp

Val

Met

Cys

Thr

Ala

Phe

His

Asp

145

150

155

160

Asn

Glu

Thr

Phe

Leu

Lys

Tyr

Leu

Tyr

Glu

Ile

Ala

Arg

165

170

175

His

Pro

Tyr

Phe

Tyr

Ala

Pro

Glu

Leu

Phe

Ala

Lys

Arg

Tyr

180

185

190

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Cys

Gin

Ala

Asp

Lys

Ala

Cys

195

200

205

Leu

Pro

Lys

Leu

Asp

Glu

Leu

Arg

Asp

Glu

Gly

Lys

Ala

Ser

210

215

220

Ala

Lys

Gin

Arg

Leu

Lys

Cys

Ala

Ser

Leu

Gin

Lys

Phe

Gly

Glu

Arg

225

230

235

240

Ala

Phe

Lys

Ala

Trp

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

Ser

Gin

Arg

Phe

Pro

Lys

245

250

255

Ala

Glu

Phe

Ala

Glu

Val

Ser

Lys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Thr

Lys

Val

260

265

270

His

Thr

Glu

Cys

His

Gly

Asp

Leu

Glu

Cys

Ala

Asp

Arg

275

280

285

Ala

Asp

Leu

Ala

Lys

Tyr

Ile

Cys

Glu

Asn

Gin

Asp

Ser

Ile

Ser

290

295

300

PL 209 550 B1

Lys Leu Lys Glu 305

Ile Ala Glu Val

Ala Ala Asp Phe 340

Ala Lys Asp Val 355

His Pro Asp Tyr 370

Glu Thr Thr Leu

385

Tyr Ala Lys Val

Asn Leu Ile Lys 420

Lys Phe Gin Asn 435

Val Ser Thr Pro 450

Gly Ser Lys Cys 465

Glu Asp Tyr Leu

Lys Thr Pro Val 500

Val Asn Arg Arg 515

Val Pro Lys Glu 530

Cys Thr Leu Ser 545

Val Glu Leu Val

Ala Val Met Asp 580

Asp Asp Lys Glu 595

Cys Cys 310

Glu Asn

325

Val Glu

Phe Leu

Ser Val

Glu Lys 390

Phe Asp 405

Gin Asn

Ala Leu

Thr Leu

Cys Lys 470

Ser Val

485

Ser Asp

Pro Cys

Phe Asn

Glu Lys 550

Lys His 565

Asp Phe

Thr Cys

Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 315 320

Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 330 335

Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu 345 350

Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg

360 365

Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 375 380

Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys 395 400

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin 410 415

Cys Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr 425 430

Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin

440 445

Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val 455 460

His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala 475 480

Val Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His Glu 490 495

Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 505 510

Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr

520 525

Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 535 540

Glu Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala Leu 555 560

Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu Lys 570 575

Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 585 590

Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala

600 605

PL 209 550 B1

Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15

Val Lys Gly Arg Gly Gly 30

Gly Gly Gly Ser Asp Ala 45

Asp Leu Gly Glu Glu Asn 60

Gin Tyr Leu Gin Gin Cys 75 80

Glu Val Thr Glu Phe Ala

Asn Cys Asp Lys Ser Leu 110

Val Ala Thr Leu Arg Glu 125

Lys Gin Glu Pro Glu Arg 140

Asn Pro Asn Leu Pro Arg 155 160

Thr Ala Phe His Asp Asn

175

Glu Ile Ala Arg Arg His

PL 209 550 B1

180

185

190

Pro

Tyr

Phe

Tyr

Ala

Pro

Glu

Leu

Phe

Ala

Lys

Arg

Tyr

Lys

195

200

205

Ala

Phe

Thr

Glu

Cys

Gin

Ala

Asp

Lys

Ala

Cys

Leu

210

215

220

Leu

Pro

Lys

Leu

Asp

Glu

Leu

Arg

Asp

Glu

Gly

Lys

Ala

Ser

Ala

225

230

235

240

Lys

Gin

Arg

Leu

Lys

Cys

Ala

Ser

Leu

Gin

Lys

Phe

Gly

Glu

Arg

Ala

245

250

255

Phe

Lys

Ala

Trp

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

Ser

Gin

Arg

Phe

Pro

Lys

Ala

260

265

270

Glu

Phe

Ala

Glu

Val

Ser

Lys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Thr

Lys

Val

His

275

280

285

Thr

Glu

Cys

His

Gly

Asp

Leu

Glu

Cys

Ala

Asp

Arg

Ala

290

295

300

Asp

Leu

Ala

Lys

Tyr

Ile

Cys

Glu

Asn

Gin

Asp

Ser

Ile

Ser

Lys

305

310

315

320

Leu

Lys

Glu

Cys

Glu

Lys

Pro

Leu

Glu

Lys

Ser

His

Cys

Ile

325

330

335

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Glu

Met

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ala

340

345

350

Ala

Asp

Phe

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Val

Cys

Lys

Asn

Tyr

Ala

Glu

Ala

355

360

365

Lys

Asp

Val

Phe

Leu

Gly

Met

Phe

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Ala

Arg

His

370

375

380

Pro

Asp

Tyr

Ser

Val

Leu

Arg

Leu

Ala

Lys

Thr

Tyr

Glu

385

390

395

400

Thr

Leu

Glu

Lys

Cys

Ala

Asp

Pro

His

Glu

Cys

Tyr

405

410

415

Ala

Lys

Val

Phe

Asp

Glu

Phe

Lys

Pro

Leu

Val

Glu

Pro

Gin

Asn

420

425

430

Leu

Ile

Lys

Gin

Asn

Cys

Glu

Leu

Phe

Glu

Gin

Leu

Gly

Glu

Tyr

Lys

435

440

445

Phe

Gin

Asn

Ala

Leu

Val

Arg

Tyr

Thr

Lys

Val

Pro

Gin

Val

450

455

460

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

Glu

Val

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Val

Gly

465

470

475

480

Ser

Lys

Cys

Lys

His

Pro

Glu

Ala

Lys

Arg

Met

Pro

Cys

Ala

Glu

PL 209 550 B1

	485	490 .	495
Asp Tyr Leu	Ser Val Val	Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His	Glu Lys
	500	505 510
Thr Pro Val	Ser Asp Arg	Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser	Leu Val
515		520 525
Asn Arg Arg	Pro Cys Phe	Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr	Tyr Val
530		535 540
Pro Lys Glu	Phe Asn Ala	Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp	Ile Cys
545	550	555	560
Thr Leu Ser	Glu Lys Glu	Arg Gin Ile Lys Lys Gin Thr Ala	Leu Val
	565	570	575
Glu Leu Val	Lys His Lys	Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu	Lys Ala
	580	585 590
Val Met Asp	Asp Phe Ala	Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys	Ala Asp
595		600 605
Asp Lys Glu	Thr Cys Phe	Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val	Ala Ala
610		615 620
Ser Gin Ala	Ala Leu Gly	Leu
625	630
<210> 15
<211> 640
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja	L
<220>
<223 > konstrukt syntetyczny

<400

>> 15

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

Ser

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Pro

Ser

Gly

Ser

Gly

35

40

45

Gly

Ser

Gly

Ser

Asp

Ala

His

Lys

Ser

Glu

Val

Ala

His

55 60

PL 209 550 B1

Arg

Phe

Lys

Asp

Leu

Gly

Glu

Asn

Phe

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Ile

65

70

75

80

Ala

Phe

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

Cys

Pro

Phe

Glu

Asp

His

Val

Lys

85

90

95

Leu

Val

Asn

Glu

Val

Thr

Glu

Phe

Ala

Lys

Thr

Cys

Val

Ala

Asp

Glu

100

105

110

Ser

Ala

Glu

Asn

Cys

Asp

Lys

Ser

Leu

His

Thr

Leu

Phe

Gly

Asp

Lys

115

120

125

Leu

Cys

Thr

Val

Ala

Thr

Leu

Arg

Glu

Thr

Tyr

Gly

Glu

Met.

Ala

Asp

130

135

140

Cys

Ala

Lys

Gin

Glu

Pro

Glu

Arg

Asn

Glu

Cys

Phe

Leu

Gin

His

145

150

155

160

Lys

Asp

Asn

Pro

Asn

Leu

Pro

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Glu

Val

Asp

165

170

175

Val

Met

Cys

Thr

Ala

Phe

His

Asp

Asn

Glu

Thr

Phe

Leu

Lys

180

185

190

Tyr

Leu

Tyr

Glu

Ile

Ala

Arg

His

Pro

Tyr

Phe

Tyr

Ala

Pro

Glu

195

200

205

Leu

Phe

Ala

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Cys

210

215

220

Gin

Ala

Asp

Lys

Ala

Cys

Leu

Pro

Lys

Leu

Asp

Glu

Leu

225

230

235

240

Arg

Asp

Glu

Gly

Lys

Ala

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg

Leu

Lys

Cys

Ala

245

250

255

Ser

Leu

Gin

Lys

Phe

Gly

Glu

Arg

Ala

Phe

Lys

Ala

Trp

Ala

Val

Ala

260

265

270

Arg

Leu

Ser

Gin

Arg

Phe

Pro

Lys

Ala

Glu

Phe

Ala

Glu

Val

Ser

Lys

275

280

285

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Thr

Lys

Val

His

Thr

Glu

Cys

His

Gly

Asp

290

295

300

Leu

Glu

Cys

Ala

Asp

Arg

Ala

Asp

Leu

Ala

Lys

Tyr

Ile

Cys

305

310

315

320

Glu

Asn

Gin

Asp

Ser

Ile

Ser

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Glu

Lys

325

330

335

Pro

Leu

Glu

Lys

Ser

His

Cys

Ile

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Glu

340

345

350

Met

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ala

Asp

Phe

Val

Glu

Ser

Lys

355 360 365

PL 209 550 B1

Asp Val Cys 370

Phe Leu Tyr 385

Leu Leu Arg

Ala Ala Ala

Lys Pro Leu 435

Leu Phe Glu

450

Arg Tyr Thr 465

Val Ser Arg

Glu Ala Lys

Asn Gin Leu

515

Thr Lys Cys 530

Ala Leu Glu

545

Thr Phe Thr

Gin Ile Lys

Lys Ala Thr 595

Phe Val Glu

610

Glu Glu Gly

625
<210>	16
<211>	624
<212>	PRT

Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys 375

Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro 390

Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr 405 410

Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala 420 425

Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu

440

Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe 455

Lys Lys Val Pro Gin Val Ser 470

Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser 485 490

Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp 500 505

Cys Val Leu His Glu Lys Thr

520

Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn 535

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro 550

Phe His Ala Asp Ile Cys Thr 565 570

Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu 580 585

Lys Glu Gin Leu Lys Ala Val

600

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp 615

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser 630

Asp Val Phe Leu Gly 380

Asp Tyr Ser Val Val 395

Thr Leu Glu Lys Cys 415

Lys Val Phe Asp Glu 430

Ile Lys Gin Asn Cys 445

Gin Asn Ala Leu Leu

460

Thr Pro Thr Leu Val

475

Lys Cys Cys Lys His 495

Tyr Leu Ser Val Val 510

Pro Val Ser Asp Arg 525

Arg Arg Pro Cys Phe 540

Lys Glu Phe Asn Ala 555

Leu Ser Glu Lys Glu 575

Leu Val Lys His Lys 590

Met Asp Asp Phe Ala 605

Lys Glu Thr Cys Phe 620

Gin Ala Ala Leu Gly 635

Met

Leu

400

Cys

Phe

Glu

Val

Glu

480

Pro

Leu

Val

Ser

Glu

560

Arg

Pro

Ala

Leu

640

PL 209 550 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt	syntetyczny
<400> 16
His Gly Glu Gly	Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu
1	5 10 .15
Glu Ala Val Arg	Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20	25 30
Ser Gly Ala Pro	Pro Pro Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His
35	40 45
Arg Phe Lys Asp	Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile
50	55 60
Ala Phe Ala Gin	Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys
65	70 75 80
Leu Val Asn Glu	Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu
	85 90 95
Ser Ala Glu Asn	Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
100	105 110
Leu Cys Thr Val	Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp
115	120 125
Cys Cys Ala Lys	Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His
130	135 140
Lys Asp Asp Asn	Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp
145	150 155 160
Val Met Cys Thr	Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys
	165 170 175
Tyr Leu Tyr Glu	Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
180	185 190
Leu Leu Phe Phe	Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys
195	200 205
Gin Ala Ala Asp	Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu
210	215 220
Arg Asp Glu Gly	Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala
225	230 235 240
Ser Leu Gin Lys	Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala

PL 209 550 B1

245

250 .

255

Arg

Leu

Ser

Gin

Arg

Phe

Pro

Lys

Ala

Glu

Phe

Ala

Glu

Val

Ser

Lys

260

265

270

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Thr

Lys

Val

His

Thr

Glu

Cys

His

Gly

Asp

275

280

285

Leu

Glu

Cys

Ala

Asp

Arg

Ala

Asp

Leu

Ala

Lys

Tyr

Ile

Cys

290

295

300

Glu

Asn

Gin

Asp

Ser

Ile

Ser

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Glu

Lys

305

310

315

320

Pro

Leu

Glu

Lys

Ser

His

Cys

Ile

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Glu

325

330

335

Met

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ala

Asp

Phe

Val

Glu

Ser

Lys

340

345

350

Asp

Val

Cys

Lys

Asn

Tyr

Ala

Glu

Ala

Lys

Asp

Val

Phe

Leu

Gly

Met

355

360

365

Phe

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Ala

Arg

His

Pro

Asp

Tyr

Ser

Val

Leu

370

375

380

Leu

Arg

Leu

Ala

Lys

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Glu

Lys

Cys

385

390

395

400

Ala

Asp

Pro

His

Glu

Cys

Tyr

Ala

Lys

Val

Phe

Asp

Glu

Phe

405

410

415

Lys

Pro

Leu

Val

Glu

Pro

Gin

Asn

Leu

Ile

Lys

Gin

Asn

Cys

Glu

420

425

430

Leu

Phe

Glu

Gin

Leu

Gly

Glu

Tyr

Lys

Phe

Gin

Asn

Ala

Leu

Val

435

440

445

Arg

Tyr

Thr

Lys

Val

Pro

Gin

Val

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

Glu

450

455

460

Val

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Val

Gly

Ser

Lys

Cys

Lys

His

Pro

465

470

475

480

Glu

Ala

Lys

Arg

Met

Pro

Cys

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu

Ser

Val

Leu

485

490

495

Asn

Gin

Leu

Cys

Val

Leu

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Val

Ser

Asp

Arg

Val

500

505

510

Thr

Lys

Cys

Thr

Glu

Ser

Leu

Val

Asn

Arg

Pro

Cys

Phe

Ser

515

520

525

Ala

Leu

Glu

Val

Asp

Glu

Thr

Tyr

Val

Pro

Lys

Glu

Phe

Asn

Ala

Glu

530

535

540

Thr

Phe

Thr

Phe

His

Ala

Asp

Ile

Cys

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Glu

Arg

PL 209 550 B1

Cys Cys Ala Lys Gin Glu Pro Glu

145 150

Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro

165

Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp 180

Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg 195 200

Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr 210 215

Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys

225 230

Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser

245

Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg 260

Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys 275 280

Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val 290 295

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg

305 310

Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser Ser

325

Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 340

Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 355 360

Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu 370 375

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg

385 390

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr

405

Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys 420

Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin 435 440

Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His 155 160

Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp 170 175

Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys

185 190

His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu

205

Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys 220

Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu 235 240

Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala 250 255

Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala

265 270

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys

285

His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp 300

Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 315 320

Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys 330 335

Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu

345 350

Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys

365

Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met 380

His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu 395 400

Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys 410 415

Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe

425 430

Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu

445

PL 209 550 B1

Leu Phe Glu	Gin Leu	Gly Glu Tyr 455	Lys	Phe Gin	Asn 460	Ala	Leu	Leu	Val
	450
Arg	Tyr Thr	Lys Lys	Val Pro Gin	Val	Ser Thr	Pro	Thr	Leu	Val	Glu
465			470		475					480
Val	Ser Arg	Asn Leu	Gly Lys Val	Gly	Ser Lys	Cys	Cys	Lys	His	Pro
		485			490				495
Glu	Ala Lys	Arg Met	Pro Cys Ala	Glu	Asp Tyr	Leu	Ser	Val	Val	Leu
		500		505				510
Asn	Gin Leu	Cys Val	Leu His Glu	Lys	Thr Pro	Val	Ser	Asp	Arg	Val
	515		520				525
Thr	Lys Cys	Cys Thr	Glu Ser Leu	Val	Asn Arg	Arg	Pro	Cys	Phe	Ser
	530		535			540
Ala	Leu Glu	Val Asp	Glu Thr Tyr	Val	Pro Lys	Glu	Phe	Asn	Ala	Glu
545			550		555					560
Thr	Phe Thr	Phe His	Ala Asp Ile	cys	Thr Leu	Ser	Glu	Lys	Glu	Arg
		565			570				575
Gin	Ile Lys	Lys Gin	Thr Ala Leu	Val	Glu Leu	Val	Lys	His	Lys	Pro
		580		585				590
Lys	Ala Thr	Lys Glu	Gin Leu Lys	Ala	Val Met	Asp	Asp	Phe	Ala	Ala
	595		600				605
Phe	Val Glu	Lys Cys	Cys Lys Ala	Asp	Asp Lys	Glu	Thr	Cys	Phe	Ala
	610		615			620
Glu	Glu Gly	Lys Lys	Leu Val Ala	Ala	Ser Gin	Ala	Ala	Leu	Gly	Leu
625			630		635					640
<210> 18
<211> 264
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223 > konstrukt syntetyczny

<400> 18

His

Val Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

Gly

1

5

10

15

Gin

Ala Ala

Lys

Glu

Phe

ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

Ala

PL 209 550 B1

25 30'

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

40 45

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

70 75 80

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

90 . 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

100 105 110

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

130 135 140

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 <210> 19 <211> 272 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

PL 209 550 B1 <223> konstrukt syntetyczny · <400> 19

His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser

25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

PL 209 550 B1 <210> 20 <211> 264 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt	syntetyczny
<400> 20
His Val Glu Gly	Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1	5 10 15
Gin Ala Ala Lys	Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
20	25 30
Glu Pro Lys Ser	Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
35	40 45
Pro Glu Leu Leu	Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50	55 60
Lys Asp Thr Leu	Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65	70 75 80
Val Asp Val Ser	His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
	85 90 95
Asp Gly Val Glu	Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
100	105 110
Tyr Asn Ser Thr	Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin
115	120 125
Asp Trp Leu Asn	Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
130	135 140
Leu Pro Ala Pro	Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro
145	150 155 160
Arg Glu Pro Gin	Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
	165 170 175
Lys Asn Gin Val	Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180	185 190
Asp Ile Ala Val	Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr
195	200 205
Lys Thr Thr Pro	Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

PL 209 550 B1

210

215 Lys Glu Gly

220 -

Ser Lys 225 Ser Cys

Leu Thr Ser Val

Val Met 245 Ser

Asp 230 His Pro

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val

Phe 240 Lys

Ala Lys

235

Thr

Gin 255

Leu

His 250

Asn

His

Tyr

Ser

Leu

Ser

Leu 260

<210> 21

<211> 272

<212> PRT

<213> Sztuczna sekwencja

<220>

<223> konstrukt

syntetyczny

<400> 21

His

Val

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

Ser

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Pro

Ser

Ala

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

35

40

45

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

50

55

t

60

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

65

70

75

80

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

85

90

95

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

100

105

110

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

115

120

125

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

130

135

140

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

145 150 155 160

PL 209 550 B1

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 165

Gly

Gin

Pro Arg Glu 170

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 175

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

180

185

190

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

195

200

205

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

210

215

220

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

225

230

235

240

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

245

250

255

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

260

265

270

<210> 22

<211> 272

<212> PRT

<213

> Sztuczna ε

:ekwenc j a

L

<220

>

<223

> konstrukt

syntetyczny

<400> 22

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

Ser

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Ser

Gly

Ala

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

35

40

45

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

50

55

60

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

65

70

75

80

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

85

90

95

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

PL 209 550 B1

100	105	110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu	Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr	Arg Val Val
115	120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His	Gin Asp Trp Leu Asn Gly	Lys Glu Tyr
130 135	140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys	Ala Leu Pro Ala Pro Ile	Glu Lys Thr
145 150	155	160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin	Pro Arg Glu Pro Gin Val	Tyr Thr Leu
165	170	. 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met	Thr Lys Asn Gin Val Ser	Leu Thr Cys
180	185	190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro	Ser Asp Ile Ala Val Glu	Trp Glu Ser
195	200 205
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn	Tyr Lys Thr Thr Pro Pro	Val Leu Asp
210 215	220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu	Tyr Ser Lys Leu Thr Val	Asp Lys Ser
225 230	235	240
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val	Phe Ser Cys Ser Val Met	His Glu Ala
245	250	255
Leu His Asn His Tyr Thr Gin	Lys Ser Leu Ser Leu Ser	Pro Gly Lys
260	265	270
<210> 23
<211> 287
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> konstrukt syntetyczny

<400> 23

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

Ser

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Pro

Ser

Gly

Ser

Gly

35

40

45

PL 209 550 B1

Ser Gly 50

Gly

Ser Ala Glu Pro 55

Lys

Ser

Cys 60

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

65

70

75

80

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

85

90

95

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

100

105

110

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

115

120

125

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

130

135

140

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

145

150

155

160

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

165

170

175

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

180

185

190

Pro

Ser

Arg

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

195

200

205

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

210

215

220

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

225

230

235

240

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

245

250

255

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

260

265

270

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

275

280

285

<210> 24 <211> 284 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukt syntetyczny

PL 209 550 B1 <400> 24

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser

25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

55 60

Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

70 75 80

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

90 95

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe

100 105 110

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

115 120 125

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

130 135 140

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

145 150 155 160

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

165 170 175

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin

180 185 190

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro

210 215 220

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

225 230 235 240

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu

245 250 255

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

260 265 270

PL 209 550 B1

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys .

275 280 <210> 25 <211> 302 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukt syntetyczny <400> 25

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu ¹ 5 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser

25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

40 45

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

55 60

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

70 75 80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

90 95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

100 105 no

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

115 120 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

130 135 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145 150 155 160

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

165 170 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro

PL 209 550 B1

	195	200	205 -
Ser Arg	Glu Glu	Met Thr Lys Asn Gin	Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
210		215	220
Lys Gly	Phe Tyr	Pro Ser Asp Ile Ala	Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
225		230	235 240
Gin Pro	Glu Asn	Asn Tyr Lys Thr Thr	Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
		245	250 255
Gly Ser	Phe Phe	Leu Tyr Ser Lys Leu	Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
	260	265	270
Gin Gin	Gly Asn	Val Phe Ser Cys Ser	Val Met His Glu Ala Leu His
	275	280	285
Asn His	Tyr Thr	Gin Lys Ser Leu Ser	Leu Ser Pro Gly Lys
290		295	300
<210> 26
<211> 294
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> konstrukt	syntetyczny

<400> 26

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

1

5

10

15

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

20

25

30

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

35

40

45

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Glu

Pro

50

55

60

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

85

90

95

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

100

105

110

PL 209 550 B1

25 30.

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Ala

40 45

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

55 60

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

70 75 80

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

90 95

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

100 105 110

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

115 120 125

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin

130 135 140

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

145 150 155 160

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro

165 170 175

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

180 185 190

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

195 200 205

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr

210 215 220

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe

245 250 255

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys

260 265 270

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280 <210> 28 <211> 287 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

PL 209 550 B1 <220>

<223> konstrukt	syntetyczny
<400> 28
His Gly Glu Gly	Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1	5 10 15
Gin Ala Val Lys	Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys Gly Arg Gly Ser
20	25 30
Ser Gly Ala Pro	Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35	40 45
Ser Gly Gly Gly	Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
50	55 60
Thr Cys Pro Pro	Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
65	70 75 80
Phe Leu Phe Pro	Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
	85 90 95
Pro Glu Val Thr	Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
100	105 no
Val Lys Phe Asn	Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
115	120 125
Thr Lys Pro Arg	Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
130	135 140
Val Leu Thr Val	Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
145	150 155 160
Cys Lys Val Ser	Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
	165 170 175
Ser Lys Ala Lys	Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
180	185 190
Pro Ser Arg Glu	Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
195	200 205
Val Lys Gly Phe	Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
210	215 220
Gly Gin Pro Glu	Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
225	230 235 240
Asp Gly Ser Phe	Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

245 250 255

PL 209 550 B1

Trp Gin

Gin Gly Asn 260

Val

Phe

Ser

Cys Ser Val 265

Met

His

Glu Ala Leu 270

His

Asn

His

Tyr Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

275

280

285

<210> 29
<211>	272
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	konstrukt syntetyczny

<400> 29

His

Gly

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Leu

Ser

Lys

Gin

Met

Glu

1

5

10

15

Glu

Ala

Val

Arg

Leu

Phe

Ile

Glu

Trp

Leu

Lys

Asn

Gly

Pro

Ser

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Pro

Ser

Ala

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

35

40

45

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

50

55

60

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

65

70

75

80

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

85

90

95

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

100

105

110

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

115

120

125

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

130

135

140

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

145

150

155

160

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

PL 209 550 B1

165 170 . 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270 <210> 30 <211> 272 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukt syntetyczny <400> 30

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 15 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

25 30

Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

PL 209 550 B1

Lys

Thr

Lys 115

Pro

Arg Glu

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

Val

120

125

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

130

135

140

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

145

150

155

160

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

165

170

175

Pro

Ser

Arg

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

180

185

190

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

195

200

205

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asp

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

210

215

220

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

225

230

235

240

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

245

250

255

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

260

265

270

<210> 31

<211> 287

<212> PRT

<213> Sztuczna sekwencja

<220>

<223> konstrukt

syntetyczny

<400

i> 31

His

Gly Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

Asp

Leu

Ser

Lys

Gin

Met

Glu

1

5

10

15

Glu

Ala Val

Arg

Leu

Phe

Ile

Glu

Trp

Leu

Lys

Asn

Gly

Pro

Ser

20

25

30

Ser

Gly Ala

Pro

Ser

Gly

Ser

Gly

35

40

45

Ser

Gly Gly

Gly

Ser

Ala

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

PL 209 550 B1

55 60

Thr Cys	Pro	Pro Cys	Pro	Ala	Pro Glu Leu	Leu Gly Gly	Pro	Ser	Val
65			70			75			80
Phe Leu	Phe	Pro Pro	Lys	Pro	Lys Asp Thr	Leu Met Ile	Ser	Arg	Thr
		85			90			95
Pro Glu	Val	Thr Cys	Val	Val	Val Asp Val	Ser His Glu	Asp	Pro	Glu
		100			105		110
Val Lys	Phe	Asn Trp	Tyr	Val	Asp Gly Val	Glu Val His	Asn	Ala	Lys
	115				120	125
Thr Lys	Pro	Arg Glu	Glu	Gin	Tyr Asn Ser	Thr Tyr Arg	Val	Val	Ser
130				135		140
Val Leu	Thr	Val Leu	His	Gin	Asp Trp Leu	Asn Gly Lys	Glu	Tyr	Lys
145			150			155			160
Cys Lys	Val	Ser Asn	Lys	Ala	Leu Pro Ala	Pro Ile Glu	Lys	Thr	Ile
		165			170			175
Ser Lys	Ala	Lys Gly	Gin	Pro	Arg Glu Pro	Gin Val Tyr	Thr	Leu	Pro
		180			185		190
Pro Ser	Arg	Glu Glu	Met	Thr	Lys Asn Gin	Val Ser Leu	Thr	Cys	Leu
	195				200	205
Val Lys	Gly	Phe Tyr	Pro	Ser	Asp Ile Ala	Val Glu Trp	Glu	Ser	Asn
210				215		220
Gly Gin	Pro	Glu Asn	Asn	Tyr	Lys Thr Thr	Pro Pro Val	Leu	Asp	Ser
225			230			235			240
Asp Gly	Ser	Phe Phe	Leu	Tyr	Ser Lys Leu	Thr Val Asp	Lys	Ser	Arg
		245			250			255
Trp Gin	Gin	Gly Asn	Val	Phe	Ser Cys Ser	Val Met His	Glu	Ala	Leu
		260			265		270
His Asn	His	Tyr Thr	Gin	Lys	Ser Leu Ser	Leu Ser Pro	Gly	Lys
	275				280	285
<210> 32
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo	sapiens
<400> 32
Ala Glu	Pro	Lys Ser	Cys	Asp	Lys Thr His	Thr Cys Pro	Pro	Cys	Pro

PL 209 550 B1

1

5

10 .

15

Ala

Pro

Glu

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

Lys

Asp

Thr

Lys

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

50

55

60

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

100

105

110

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

115

120

125

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Glu

Met

Thr

130

135

140

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

225

230

<210> 33 <211> 703 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

PL 209 550 B1

gggggaccgt	cagtcttcct	cttcccccca	aaacccaagg	acaccctcat	gatctcccgg	120
acccctgagg	tcacatgcgt	ggtggtggac	gtgagccacg	aagaccctga	ggtcaagttc	180
aactggtacg	tggacggcgt	ggaggtgcat	aatgccaaga	caaagccgcg	ggaggagcag	240
tacaacagca	cgtaccgtgt	ggtcagcgtc	ctcaccgtcc	tgcaccagga	ctggctgaat	300
ggcaaggagt	acaagtgcaa	ggtctccaac	aaagccctcc	cagcccccat	cgagaaaacc	360
atctccaaag	ccaaagggca	gccccgagaa	ccacaggtgt	acaccctgcc	cccatcccgg	420
gaggagatga	ccaagaacca	ggtcagcctg	acctgcctgg	tcaaaggctt	ctatcccagc	480
gacatcgccg	tggagtggga	gagcaatggg	cagccggaga	acaactacaa	gaccacgcct	540
cccgtgctgg	actccgacgg	ctccttcttc	ctctatagca	agctcaccgt	ggacaagagc	600
aggtggcagc	aggggaacgt	cttctcatgc	tccgtgatgc	atgaggctct	gcaca.accac	660
tacacgcaga	agagcctctc	cctgtctccg	ggtaaatgat	agt		703

<210> 34 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Asp

Ala

His

Lys

Ser

Glu

Val

Ala

His

Arg

Phe

Lys

Asp

Leu

Gly

Glu

1

5

10

15

Glu

Asn

Phe

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Ile

Ala

Phe

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

20

25

30

Gin

Cys

Pro

Phe

Glu

Asp

His

Val

Lys

Leu

Val

Asn

Glu

Val

Thr

Glu

40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys

55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala 65 70 75

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gin 85 90

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys Asp Asp Asn Pro 100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala 115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala 145 150 155

Asp

Thr

Glu

Asn

Phe

Ala

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Arg

160

PL 209 550 B1

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gin Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190

Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu 195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gin Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

55 360 3 65

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gin Asn Leu Ile Lys Gin Asn Cys Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His

450 455 460

PL 209 550 B1

Glu

Lys

Thr

Pro

Val

Ser

Asp Arg Val

Thr

Lys

Cys

Thr

Glu

Ser

465

470

475

480

Leu

Val

Asn

Arg

Pro

Cys

Phe

Ser

Ala

Leu

Glu

Val

Asp

Glu

Thr

485

490

495

Tyr

Val

Pro

Lys

Glu

Phe

Asn

Ala

Glu

Thr

Phe

Thr

Phe

His

Ala

Asp

500

505

510

Ile

Cys

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Glu

Arg

Gin

Ile

Lys

Gin

Thr

Ala

515

520

525

Leu

Val

Glu

Leu

Val

Lys

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Lys

Glu

Gin

Leu

530

535

540

Lys

Ala

Val

Met

Asp

Phe

Ala

Phe

Val

Glu

Lys

Cys

Lys

545

550

555

560

Ala

Asp

Lys

Glu

Thr

Cys

Phe

Ala

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

565

570

575

Ala

Ser

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

580

585

<210>	35
<211>	1762
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	35

gatgcgcaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

Claims

1. Heterogenne białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd z N-końcem i C-końcem połączony z drugim polipeptydem z N-końcem i C-końcem, znamienne tym, że pierwszy polipeptyd jest związkiem GLP-1 o wzorze [SEQ nr 2]

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa40 41 42 43 44 45

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa wzór I (SEQ ID NO: 2) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 9 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 11 oznacza Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 14 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 17 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 19 oznacza Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 22 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 23 oznacza Gln, Asn, Arg, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 25 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 26 oznacza Lys, Arg, Gln, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza Leu, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 31 oznacza Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 32 oznacza Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 33 oznacza Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 34 oznacza Asn, Lys, Arg, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 35 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 36 oznacza Gly, Arg, Lys, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 38 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 39 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 40 oznacza Gly, Asp, Glu, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 41 oznacza Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 42 oznacza Ser, Pro, Lys, Glu, Asp lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 43 oznacza Ser, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 44 oznacza Gly, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty; i Xaa w pozycji 45 oznacza Ala, Ser, Val, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty, przy czym jeżeli aminokwas w pozycji 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 lub 44 został usunięty, to usunięty został również każdy aminokwas poniżej tego aminowkasu, i drugi polipeptyd jest ludzką albuminą, a C-koniec pierwszego polipeptydu połączony jest z N-końcem drugiego polipeptydu.

2. Heterogenne białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd z N-końcem i C-końcem połączony z drugim polipeptydem z N-końcem i C-końcem, znamienne tym, że pierwszy polipeptyd jest związkiem GLP-1 o wzorze [SEQ nr 2]

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Phe-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

PL 209 550 B1

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa40 41 42 43 44 45

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa wzór I (SEQ ID NO: 2) w którym:

Xaa w pozycji 8 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 9 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 11 oznacza Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 14 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 17 oznacza Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 19 oznacza Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 21 oznacza Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 22 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 23 oznacza Gln, Asn, Arg, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 25 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 26 oznacza Lys, Arg, Gln, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 27 oznacza Leu, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 31 oznacza Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 32 oznacza Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 33 oznacza Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 34 oznacza Asn, Lys, Arg, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 35 oznacza Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp lub Lys;

Xaa w pozycji 36 oznacza Gly, Arg, Lys, Glu, Asp lub His;

Xaa w pozycji 38 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 39 oznacza Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, His lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 40 oznacza Gly, Asp, Glu, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 41 oznacza Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 42 oznacza Ser, Pro, Lys, Glu, Asp lub jest usunięty;

Xaa w pozycji 43 oznacza Ser, Pro, Glu, Asp, Lys lub jest usunięty;

3. Heterogenne białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że łącznik jest peptydem o sekwencji [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, w którym n jest 1, 2, 3, 4, 5 lub 6.

4. Heterogenne białko fuzyjne według zastrz. od 1 do 3, znamienne tym, że związek GLP-1 ma nie więcej niż 6 aminokwasów różnych od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4.

5. Heterogenne białko fuzyjne według zastrz. 4, znamienne tym, że związek GLP-1 ma nie więcej niż 5 aminokwasów różnych od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4.

6. Heterogenne białko fuzyjne według zastrz. 5, znamienne tym, że związek GLP-1 ma nie więcej niż 4 aminokwasy różnych od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4.

7. Heterogenne białko fuzyjne według zastrz. 6, znamienne tym, że związek GLP-1 ma nie więcej niż 3 aminokwasy różnych od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4.

100

PL 209 550 B1

8. Heterogenne biał ko fuzyjne wedł ug zastrz. 7, znamienne tym, ż e zwią zek GLP-1 ma nie więcej niż 2 aminokwasy różne od odpowiednich aminokwasów w GLP-1(7-37)OH, GLP-1(7-36)OH lub eksendynie-4.

9. Kompozycja farmaceutyczna dostosowana do leczenia paicjentów z cukrzycą insulinoniezależną, znamienna tym, że zawiera heterogenne białko fuzyjne jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8 lub farmaceutycznie akceptowalne jego sole wraz z jedną lub więcej akceptowalnymi zaróbkami.

10. Kompozycja farmaceutyczna dostosowana do leczenia rejentów z otyłością, znamienna tym, że zawiera heterogenne białko fuzyjne jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 8 lub farmaceutycznie akceptowalne jego sole wraz z jedną lub więcej akceptowalnymi zaróbkami.