ES2234575T3

ES2234575T3 - Grupo amino que contiene matrices de soporte, su utilizacion y su obtencion.

Info

Publication number: ES2234575T3
Application number: ES00911150T
Authority: ES
Inventors: Geir Fonnum
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1999-03-22
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2020-03-22
Also published as: AU773644B2; AU3314400A; NO20014563L; JP2002540231A; DE60015514D1; ATE281480T1; EP1433795A3; AU2004203549A1; WO2000056790A1; EP1171489A1; EP1171489B1; ATE472567T1; JP4523176B2; NO20014563D0; CA2368019C; US6335438B1; CA2368019A1; EP1433795A2; EP1433795B1; DE60044620D1

Abstract

Una matriz de soporte consistente en un esqueleto de polivinilo [(-CH2CH2)n] al que se une un nucleósido/nucleótido, un desoxinucleósido/desoxinucleótido o un oligonucleótido a través de una posición 3¿ disponible, teniendo la posición 5¿ disponible protegida o no protegida y, si están presentes, teniendo restos de grupos hidroxi o amino protegidos, caracterizada por ser dicha matriz de soporte porosa y por estar los diámetros de tamaño de

Description

Grupo amino que contiene matrices de soporte, su utilización y su obtención.

Campo técnico

Esta invención se relaciona con matrices de soporte consistentes en un esqueleto hidrocarbonado polimérico
[(-CH_{2}CH_{2})_{n}] al que se unen grupos amino y/o grupos amino derivatizados mediante estructuras de unión. Este esqueleto será en adelante denominado "esqueleto polivinílico" o simplemente "esqueleto".

Las expresiones "un grupo amino derivatizado" y "un grupo derivado de un grupo amino" significan que el grupo amino ha sido químicamente transformado en un grupo en el que el nitrógeno del grupo amino original permanece unido a una estructura de unión.

En las matrices de soporte conocidas anteriores, las estructuras entrecruzantes y los grupos que contienen grupos amino puros y grupos amino derivatizados han substituido a los hidrógenos del esqueleto polivinílico. Los hidrógenos han sido también substituidos por otros grupos, tales como alquilos (metilo, etilo, etc.), diversas formas de arilos (tales como fenilo, vinilfenilo, etilfenilo, etc.), aciloxi, ariloxi, alcoxi, etc. Estos grupos han sido a veces aún más derivatizados.

Este tipo de matrices de soporte puede ser usado como fase sólida en procedimientos de adsorción y reparto, tales como la cromatografía, y en síntesis orgánica de fase sólida, y como soporte en cultivo celular y para catálisis, tales como enzimas.

Este tipo de matrices de soporte ha sido previamente preparado por copolimerización de compuestos monovinílicos con compuestos di-, tri- y polivinílicos, conteniendo al menos uno de los monómeros una funcionalidad que puede transformarse en un grupo amino tras la polimerización. Una alternativa ha sido copolimerizar clorometilestireno con divinilbenceno, seguido de tratamiento con amoníaco. Otra alternativa ha sido la conversión de grupos vinilo residuales en grupos que contienen una función amina.

También se ha sugerido que se pueden producir matrices de soporte similares por tratamiento con plasma de amoníaco gaseoso de diversos polímeros que contienen un esqueleto polivinílico. Véase, por ejemplo, US 5.369.012. El tratamiento con plasma de fase gaseosa da una introducción más o menos aleatoria de grupos funcionales sobre los átomos de carbono del esqueleto y/o de grupos pendientes.

Otro método posible de preparación de matrices de soporte similares es la nitración de poliestirenos entrecruzados, seguida de reducción de los grupos nitro a grupos amino. Las nitraciones son generalmente llevadas a cabo en condiciones muy duras, que dan lugar a una serie de reacciones colaterales, como las oxidaciones. La etapa siguiente de reducción se caracteriza por rendimientos relativamente bajos, que dan lugar a grupos nitro no reaccionados en el poliestireno. En materiales altamente entrecruzados, estas reacciones son muy difíciles de utilizar con éxito. Se obtienen grupos nitro no deseados unidos directamente sobre el esqueleto polivinílico en las reacciones colaterales.

Por lo tanto, las matrices de soporte previamente conocidas han resultado relativamente problemáticas de fabricar, debido a las etapas extra necesarias para introducir las funciones amina y a las reacciones colaterales que se producen.

Para matrices porosas que llevan grupos amino, hemos visto que la disponibilidad de grupos amino en una matriz dada varía con frecuencia. No se ha considerado que esto fuera óptimo para ciertas aplicaciones, por ejemplo en la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos y en los procesos de adsorción.

Se venden matrices de soporte comerciales consistentes en esqueletos polivinílicos para uso en síntesis en fase sólida de oligonucleótidos con el primer monómero unido a la matriz. La carga ha sido de aproximadamente 90 \mumoles del primer nucleótido por gramo de matriz (Primer Support High Load 30: Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

Si no se especifica en contrario, los términos nucleótido, desoxinucleótido, residuo de aminoácido, ADN, ARN y oligo-/polipéptido incluyen su respectivo análogo sintético, tal como APN (WO 9220703) y ALN para el ADN.

Se han descrito investigaciones de polimerizaciones que implican a aminoestirenos con otros compuestos que contienen insaturación polimerizable en: Imoto y col., Bull. Chem. Soc. Jap. 49(5) (1976), 1342-1345; Donya y col., Russ. J. Appl. Chem. 71(1) (1998), 132-137 (traducido de Zhurnal Prikladnoi Khimii 71(1) (1998), 127-32); Russ. J. Appl. Chem. 67(3:2) (1994), 400-404 (traducido de Zhurnal Prikladnoi Khimii 67(3) (1994) 450-454); Donya y col., Vysokomol Soedin Ser A Ser B 36(12) (1994) 2068-2073; Donya y col., Vysokomol Soedin Ser A Ser B 37(5) (1995), 752-757; Donya y col., Vysokomol Soedin Ser B 34(8) (1992), 3-8, y Donya y col., Vysokomol Soedin Ser A 34(12) (1992), 2068-2073. En ninguno de estos artículos se describe la fabricación de polímeros entrecruzados que se supone soporten funcionalidades específicas (matrices de soporte).

Se ha descrito que las homopolimerizaciones de aminoestirenos pueden ser autoinhibitorias. Véase Donya y col., Ukr. Khim. Zh. (Russ. Ed.), 56(9) (1990), 984-990.

Masuda (Makromol, Chem. 190 (1989), 1007-1014) habló sobre los efectos de los solventes en la polimerización de radicales de estireno con aminoestireno.

En la solicitud de patente GB 990881630, presentada el 09.04.99, a nombre de Dyno Particle A/S (Dyno Specialty Chemicals A/S), se describe un tópico relacionado.

US 4.275.184 (Bargain y col., Rhône-Poulenc Industries) describe monómeros de vinilo en los que el grupo vinilo puede estar unido a un resto aromático a través de un grupo de silicio. El resto aromático puede estar funcionalizado con un grupo amino. Estos monómeros no son aromáticos de vinilo.

Objetos de la invención

\bullet: Un objeto consiste en proporcionar matrices de soporte mejoradas para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos y oligopéptidos, donde dichas matrices están mejoradas según el primer y el segundo objeto y conducen a mejores rendimientos de un oligonucleótido/oligopéptido deseado.

\bullet: Otro objetivo es proporcionar matrices de soporte mejoradas del tipo antes mencionado para uso en la síntesis en fase sólida de compuestos orgánicos, siendo el perfeccionamiento en una carga (unión covalente) de \geq 100 \mumoles, tal como \geq 150 \mumoles o incluso \geq 200 \mumoles de un reactivo orgánico por gramo de matriz seca. Estas cifras, en particular, se refieren a matrices de soporte en las que el reactivo orgánico es un nucleótido, desoxinucleótido o análogo de éstos.

\bullet: Otro objeto es proporcionar matrices de soporte mejoradas para la síntesis en fase sólida de compuestos orgánicos, con énfasis particular de librerías combinatorias de pequeñas moléculas orgánicas.

La invención

Se ha reconocido ahora que estos objetos pueden ser conseguidos si se copolimerizan uno o más monómeros aromáticos de vinilo aminohidrocarbonados (C_{0-10}), que eventualmente tienen el grupo amino acilado, con otros monómeros de vinilo. En otras palabras, esencialmente todos los grupos amino de la matriz obtenida tras la polimerización serán del mismo tipo, es decir, o bien un grupo amino puro, o bien una forma acilada del mismo.

Para la fabricación de una matriz de soporte a la que se unen grupos amino y/o formas aciladas de los mismos, se puede usar un método que consiste en la etapa de copolimerizar uno o más monómeros monovinílicos (monómero I) con uno o más monómeros di-, tri- o polivinílicos (monómero II). El método se caracteriza en que una parte de los monómeros de vinilo llevan un grupo aminohidrocarbonado (C_{0-10}) o un grupo amido correspondiente (aminohidrocarburo (C_{0-10}) acilado) unido a un anillo aromático (monómero III). Después de la polimerización, el material polimérico formado puede ser recogido y posteriormente procesado. Los grupos amino y/o sus formas aciladas pueden transformarse a continuación en una funcionalidad deseada. El amino acilado, por ejemplo, puede transformarse por hidrólisis en el correspondiente grupo amino. Los grupos amino pueden ser primarios, secundarios o terciarios.

El grupo aminohidrocarbonado (C_{0-10}) es preferiblemente un grupo amino puro, tal como en los aminomonovinilbencenos (por ejemplo, aminoestirenos) y aminovinilnaftalenos, es decir, siendo inexistente el grupo hidrocarbonado. El grupo amino puede ser derivatizado, tal como en las amidas. El grupo vinilo está directamente unido al anillo aromático.

El grupo hidrocarbonado, si está presente en el grupo aminohidrocarbonado (C_{0-10}), puede ser lineal, ramificado o cíclico. Puede ser aromático o no aromático, tal como conteniendo un fenileno o consistente en una cadena de alquileno puro, respectivamente, es decir, que la cadena carbonada que une el grupo amino al anillo aromático preferiblemente no contiene ningún heteroátomo.

El monómero III es parte del monómero I y/o del monómero II.

El monómero III puede ser isoformas de aromáticos vinílicos aminohidrocarbonados (C_{0-10}) en donde un grupo vinilo y un grupo aminohidrocarbonado (C_{0-10}) son orto, meta o para el uno con respecto al otro. El monómero III puede también consistir en vinilnaftalenos aminohidrocarbonados (C_{0-10}) en donde o bien el grupo vinilo o bien el grupo aminohidrocarbonado (C_{0-10}) está en la posición 1 ó 2.

El grupo amino, que puede estar eventualmente acilado, en el monómero III se corresponde a la fórmula

-NR_{1}R_{2},

en donde R_{1} y R_{2} son seleccionados entre

a): hidrógeno y

b): grupos hidrocarbonados lineales, ramificados o cíclicos o grupos acilo correspondientes.

Cada uno de los grupos hidrocarbonados puede tener una cadena hidrocarbonada de 1-20 átomos de carbono, eventualmente substituida con uno o más grupos hidroxi, alcoxi o amino y que contiene un átomo de nitrógeno (nitrógeno amino), de oxígeno (oxígeno éter) o azufre (azufre tioéter) que substituye a un átomo de carbono en una o más posiciones de la cadena.

Más concretamente, R_{1} y R_{2} incluyen alquilos, aralquilos, arilalquilos y arilos, por ejemplo, fenilo substituido o no substituido que contiene ninguno, uno o más heteroátomos, tales como nitrógeno u oxígeno. El alcoxi es preferiblemente alcoxi C_{1-7}. El nitrógeno de un grupo amino que puede estar presente en un R_{1} o R_{2} puede llevar uno o dos grupos hidrocarbonados, tales como alquilo C_{1-7}.

Uno o ambos de R_{1} y R_{2} pueden estar de acuerdo con (b) anterior.

Los compuestos que se han usar como monómero I son alquenos, acrilatos/metacrilatos, acrilamidas/metacrilami-
das, acrilonitrilos/metacrilonitrilos, aromáticos vinílicos como los monovinilbencenos, tales como variantes no substituidas o substituidas de los mismos (isómeros meta, orto y para), etc. El monómero I puede también ser un alquilvinilbenceno, por ejemplo, con un substituyente alquilo C_{1-10}, tal como etilo. Los éteres vinílicos, los éteres estirílicos (con el oxígeno éter unido a un carbono), etc., son otros ejemplos. Las formas monovinílicas del monómero III con un grupo vinilo son parte del monómero I.

Los compuestos para uso como monómero II son alcadienos, bisformas de acrilatos/metacrilatos y de acrilamidas/metacrilamidas y aromáticos de vinilo, como diversas formas de divinilbencenos (por ejemplo, meta, orto y para). También se pueden usar, en principio, formas correspondientes que tengan más de dos grupos vinilo. El monómero II actúa como entrecruzante. El monómero II puede también ser formas alquiladas y formas etéreas de los monómeros divinílicos recién mencionados. Las formas de monómero III con dos o más grupos vinilo son parte del monómero II.

En una mezcla de polimerización típica, las cantidades en % son:

\bullet: monómero I: \geq 0,5%, tal como \geq 20%, y \leq 99,5%, tal como \leq 95%;

\bullet: monómero II: \geq 0,5%, tal como \geq 5%, y \leq 99,5%, tal como \leq 80%;

\bullet: monómero III: \geq 0,5% y \leq 80%.

El aumento de la cantidad en % del monómero II aumentará la rigidez del polímero final y reducirá la capacidad para hincharse en solventes orgánicos.

La selección exacta de las cantidades en % dependerá del uso contemplado de la matriz de soporte.

Para usos en los que la matriz no necesita soportar presión, por ejemplo, de un flujo líquido, las cantidades en % típicas son:

\bullet: monómero I: \geq 95%, tal como \geq 98%, y \leq 99,5%;

\bullet: monómero II: \geq 0,5% y \leq 5%, tal como \leq 2%;

\bullet: monómero III: \geq 5%, tal como \geq 15%, y \leq 80%, tal como \leq 50%.

Las matrices obtenidas son de particular importancia para la mayoría de los tipos de síntesis en fase sólida por etapas de compuestos orgánicos, excepto para la síntesis de ácidos nucleicos.

Para usos en los que la matriz necesita soportar presión, las cantidades en % típicas son:

\bullet: monómero I: \geq 10%, tal como 50%, y \leq 90%, tal como \leq 80%;

\bullet: monómero II: \geq 5%, tal como \geq 10%, y \leq 80%, tal como \leq 50%;

\bullet: monómero III: \geq 0,5%, tal como \geq 2%, y \leq 40%, tal como \leq 35% e incluso \leq 20%.

Las matrices obtenidas son de particular importancia para aplicaciones en las que se pone una matriz en una columna/recipiente y se deja que pase a su través un flujo líquido que contiene reactivos. Los usos típicos son aplicaciones cromatográficas y síntesis en fase sólida de ácidos nucleicos.

Los porcentajes dados anteriormente son p/p y se calculan sobre la cantidad total de monómeros vinílicos polimerizables en la mezcla de polimerización.

Las condiciones de polimerización dependerán de los monómeros vinílicos usados y de las demandas sobre el polímero final. Dependiendo de los polímeros vinílicos usados, la polimerización puede ser realizada como polimerización aniónica, catiónica o de radicales libres.

Se prefiere seleccionar monómeros (monómero I, II y III) que tengan reactividades relativas en polimerización de radicales libres lo más próximas posible entre sí.

Uno de los tipos más preferidos de polimerizaciones para la invención utiliza radicales libres y un sistema iniciador. Los sistemas iniciadores son la irradiación de electrones, la radiación \gamma, los iniciadores de radicales, etc. Los iniciadores típicos son iniciadores químicos, térmicos y de irradiación. Con frecuencia, se prefieren los iniciadores térmicos. Tienen su mejor eficacia en el margen de 30 a 90ºC. La presencia de un grupo amino libre en el monómero III hace ventajoso no seleccionar iniciadores que reaccionen significativamente con el grupo amino libre en las condiciones de polimerización seleccionadas.

Los iniciadores térmicos/químicos son compuestos azo (por ejemplo, 2,2'-azobis(2,4-dimetilvalero-nitrilo), azoisonitrilos, peróxidos (por ejemplo, peróxido de benzoílo) y persulfatos.

También se pueden usar sistemas redox, por ejemplo el reactivo de Fenton (peróxido de hidrógeno + Fe^{2+}).

Los iniciadores de irradiación funcionan típicamente en la región UV y con frecuencia tienen una estructura de benzofenona o son derivados de benzoílo. Si es necesario, se combina el sistema iniciador seleccionado con un acelerador apropiado.

Es sabido que una polimerización de radicales eficiente que incluya aminoestireno y/u otros compuestos aromáticos de vinilo aminohidrocarbonados (C_{0-10}) (en particular, compuestos aromáticos aminovinílicos) puede ser contrarrestada por el hecho de que estos monómeros pueden actuar como agentes de transferencia de cadena y/o inhibidores durante la polimerización de radicales.

Una vía para minimizar este problema es eliminando el oxígeno del sistema de polimerización, como es bien sabido en este campo.

Una segunda vía es incluir en la mezcla de polimerización una substancia efectora de la polimerización que supere los inconvenientes de los compuestos aromáticos de vinilo que contienen amino definidos anteriormente, en particular un compuesto aromático aminovinílico. Las substancias efectoras adecuadas pueden actuar como agentes de transferencia de cadena y/o agentes neutralizantes de la propiedad posiblemente autoinhibidora de los aromáticos de vinilo que contienen amino utilizados. La eficacia de este tipo de efectores variará entre diferentes substancias efectoras y también entre diferentes sistemas de polimerización de radicales. La cantidad y el tipo de efector deberán ser seleccionados de tal forma que la reacción de polimerización sea capaz de proceder para dar una matriz de soporte que contenga grupos amino según se define en el contexto de la presente invención. El efector puede ser un componente solvente seleccionado, un agente de transferencia de cadena aparte, etc. Es también posible contemplar que determinado tipo de iniciadores pueden tener una función doble o triple con respecto a actuar como un iniciador y/o como un agente de transferencia de cadena y/o como un agente neutralizante de las propiedades autoinhibidoras de los aromáticos vinílicos amino-substituidos. Para la definición e ilustración de agentes de transferencia de cadena e iniciadores, véase Odian, George G., Principles of Polymerization, 3ª ed., "A Wiley-Interscience Publication" (1991), pp. 211-267. Seleccionando la substancia efectora de la polimerización apropiada, es posible promover el comportamiento de polimerización normal de los compuestos de vinilo (por ejemplo, compuestos aromáticos de vinilo) en mezclas de polimerización. Las mezclas en cuestión contienen monómeros tanto del tipo I como del tipo II definidos anteriormente, incluyendo también compuestos aromáticos de vinilo que contienen amino polimerizables (por ejemplo, compuestos aromáticos aminovinílicos).

Una tercera variante consiste en usar un monómero que contiene grupos amino en donde el grupo amino está protegido, por ejemplo, en forma acilada. Los inconvenientes del grupo amino libre se minimizarán entonces con ninguna o con muy poca alteración de la reacción de polimerización. Tras la polimerización, el grupo amino libre se forma por desprotección, por ejemplo, por hidrólisis cuando se usa en forma acilada durante la polimerización.

Las condiciones apropiadas aplicadas, incluyendo las cantidades eficientes para la polimerización, tendrán que ser optimizadas en relación al iniciador, al tipo de monómeros, a los agentes de transferencia de cadena, etc. de un caso a otro, según se señala en la parte experimental (Parte A) para el aminoestireno, el divinilbenceno y otros estirenos. Véanse también los antecedentes tecnológicos, por ejemplo, como se define en los documentos de patentes y publicaciones discutidos anteriormente.

Los grupos vinilo de reacción lenta requieren típicamente precauciones específicas. Se puede cumplir con ello seleccionando apropiadamente los sistemas de iniciadores-aceleradores o utilizando irradiación electrónica, como es sabido en este campo. Los grupos alquilo y otros grupos alqueno que tienen sólo hidrógenos y/o carbonos hibridados en sp^{3} unidos a los dobles enlaces C-C son ejemplos de grupos vinilo de reacción lenta.

La polimerización puede tener lugar en emulsiones/suspensiones de ac/ag y dispersiones convencionales para dar partículas más o menos esféricas, siempre que se apliquen las condiciones apropiadas, como es sabido en este campo. De forma similar, se puede utilizar también la polimerización en masa, posiblemente con posterior desintegración del bloque en partículas, si resulta así apropiado.

También se pueden usar emulsores y estabilizadores típicos para polimerizaciones en emulsiones, suspensiones y dispersiones en la presente invención. Son emulsores y estabilizadores bien conocidos el dodecilsulfato de sodio, los oligoetilenglicoles alquilados, los derivados de celulosa, etc.

También se puede contemplar que la polimerización se produzca en así llamadas emulsiones inversas (emulsiones de ag/ac), en donde las condiciones hayan sido seleccionadas de tal forma que las gotitas de agua se distribuyan formando una red macroporosa con cavidades esféricas abiertas que comuniquen entre sí (el agua actúa como porógeno). Véanse, por ejemplo, EP 60.138 y US 5.200.433. Se puede ampliar esto a las así llamadas emulsiones de ag/ac/ag, en donde la emulsión de ag/ac interna está en forma de gotas que forman HIPE. Véase también WO 9531485. Este tipo de emulsiones es con frecuencia denominado emulsiones de alta fase interna ("HIPE").

Incluyendo un porógeno apropiado en una mezcla de polimerización, se pueden conseguir materiales porosos en forma de partículas/perlas y de material en tapón monolítico. Los porógenos son típicamente compuestos que se separan y forman canales/poros cuando se forma el polímero. Los porógenos pueden estar en forma de líquidos, sólidos o gases y será posible eliminarlos tras la polimerización. Los porógenos en forma de líquidos son típicamente capaces de disolver por completo los monómeros usados, pero no la cadena polimérica creada. Esto significa que las cadenas poliméricas se separarán y formarán un material polimérico que contiene un sistema de poros lleno del porógeno. Las características del sistema de poros dependerán de la cantidad y del tipo de porógeno. En general, los porógenos con valores de parámetro de solubilidad próximos al valor de parámetro de solubilidad del polímero darán un material poroso elástico de tipo gel con una proporción relativamente alta de poros más pequeños. Se obtendrá este efecto, para los aromáticos de vinilo, con, por ejemplo, alcanoles e hidrocarburos alifáticos como porógenos. Con frecuencia, los porógenos usados de este tipo han sido alcanos, tales como heptano, y alcanoles, tales como decanol. También se han usado mezclas de compuestos líquidos como porógenos.

Con respecto a los monómeros aromáticos de vinilo y a la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, se prefieren como porógenos los porógenos que contienen solventes aromáticos líquidos, posiblemente en combinación con otros líquidos miscibles con ellos.

También se pueden usar polímeros como porógenos.

Los principios generales señalados anteriormente para la selección del porógeno también se aplican a polímeros basados en monómeros vinílicos que no son aromáticos.

Los materiales porosos obtenidos pueden tener tamaños de poro, volúmenes de poro y áreas superficiales de poro como es sabido en la técnica para los polímeros de vinilo. Los diámetros del tamaño de poro, por lo tanto, pueden estar dentro del intervalo de 10 \ring{A} a 1.000 \mum. La selección óptima de los diámetros de poro depende típicamente del uso contemplado y pueden, por ejemplo, ser seleccionados según reglas conocidas en este campo.

Para determinadas aplicaciones, puede ser importante que una determinada fracción de los poros esté por encima o por debajo de un cierto límite o dentro de un cierto intervalo. Se ha visto ahora que, para la síntesis en fases sólidas porosas, en particular de oligonucleótidos y sus análogos, los diámetros óptimos de tamaño de poro de la matriz de soporte deben estar dentro del intervalo de 10-2.000 \ring{A}, tal como de 100-1.000 \ring{A}, para más del 10%, tal como más del 30%, del volumen de poro. Los mejores porógenos encontrados hasta la fecha son el tolueno, el xileno y el mesitileno, para obtener estas características de poro en matrices basadas en monómeros aromáticos de vinilo. Muy probablemente, también se pueden usar otros solventes que tengan propiedades comparables con respecto a la disolución de los monómeros aromáticos de vinilo y su adsorción por los polímeros obtenidos a partir de ellos.

Los poros son frecuentemente irregulares, lo que significa que es frecuentemente difícil calcular sus tamaños. Las cifras dadas anteriormente y en la parte experimental para los tamaños de poro y las distribuciones de tamaño de poro se refieren a valores obtenidos por cromatografía de exclusión por tamaños ("SEC") de poliestirenos en tetrahidrofurano y relacionando el peso molecular de los poliestirenos con los tamaños de poro según la fórmula:

\phi \ (\ring{A}) = 0,62 \ (M_{p})^{0,59}

donde \phi (\ring{A}) es el diámetro de poro en \ring{A} y M_{p} es el peso molecular medio del poliestireno. El método aproxima los poros irregulares a poros cilíndricos y ha sido descrito por Halasz y col. (Angew. Chem. Int. Engl. 17 (1978), 901-908) y Halasz y col. (Angew. Chem. Int. Engl. 19 (1980), 24-28).

En caso de que el material esté en forma de partículas, su tamaño medio de partícula está típicamente dentro del rango de 1-1.000 \mum, preferiblemente de 3-1.000 \mum o de 3-500 \mum, es decir, tamaños de partícula que normalmente no se obtienen por polimerización en emulsión. Las partículas pueden tener una forma irregular, tal como la obtenida por desintegración de bloques obtenidos de polimerizaciones en masa, o esférica (de perlas), como la obtenida por polimerización en suspensiones. Las partículas pueden ser monodispersas o polidispersas, teniendo las poblaciones de partículas monodispersas más de un 95% de las partículas con tamaños dentro de su diámetro medio \pm 5%.

Un mecanismo importante particular para la fabricación de las partículas según la invención es la utilización de las así llamadas partículas semilla, preferiblemente con inclusión de una primera etapa consistente en hinchar las partículas semilla y de una segunda etapa después consistente en la captación de monómeros antes de la polimerización. Véase, por ejemplo, US 4.336.173, que es aquí incorporada a modo de referencia. Como se describe en US 4.336.173, este método significa

i): preparar una emulsión o dispersión acuosa, lo que consiste en

(A): obtener una dispersión o emulsión que contiene partículas semilla, preferiblemente consistentes en un polímero y preferiblemente con un diámetro < 1 \mum, y una Substancia I que consiste en uno o más materiales que tienen un peso molecular < 5.000 y una solubilidad en agua < 10^{-2} g/l y que es substancialmente absorbida por dichas partículas semilla, y

(B): añadir a dicha dispersión o emulsión de la etapa (A)

(a): una Substancia II que consiste en uno o más materiales parcialmente solubles en agua que tienen una solubilidad en agua al menos 10 veces mayor que la de la Substancia I, mediante lo cual la Substancia II se difunde hacia las partículas semilla que contienen Substancia I a una velocidad substancialmente en exceso de la velocidad de salida de la Substancia I de dichas partículas semilla, siendo la cantidad de dicha Substancia II que se difunde hacia dichas partículas que contienen substancia I al menos 20 veces la de las partículas semilla originales usadas en la etapa (A) en base al volumen,

(b): emulsores e iniciadores necesarios para la polimerización;

: consistiendo dicha Substancia I y dicha Substancia II en materiales que contienen (a) uno o más de los monómeros polimerizables con iniciadores incluidos y (b) líquidos que no son polimerizables en las mismas condiciones que los monómeros, y

ii): polimerizar por activación del iniciador.

Después de la polimerización según el presente método de la invención, se puede transformar el grupo -NR_{1}R_{2} por métodos conocidos en este campo en

-N^{(+)}R_{1}\text{'}R_{2}\text{'}R_{3}\text{'}.

R_{3}' es un grupo que puede o no estar presente. (+) significa que el nitrógeno está cargado positivamente cuando R_{3}' está presente (forma de amonio) y que no está cargado cuando R_{3}' está ausente.

Cuando R_{3}' está ausente, R_{1}' y R_{2}', además de ser seleccionados entre los mismos grupos que R_{1} y R_{2}, pueden ser seleccionados entre grupos que tienen la fórmula -A-X, donde

(a): A es una estructura puente orgánica y

(b): X es una estructura que contiene

(i): uno o más grupos reactivos capaces de reaccionar con una substancia portadora de un grupo nucleófilo o electrófilo o con un radical libre para unir covalentemente dicha substancia o una parte de la misma a dicha matriz de soporte, o

(ii): uno o más grupos que pueden transformarse en dicho grupo reactivo, o

(iii): un miembro de un par de afinidad que media en la unión de afinidad del otro miembro del par.

Cuando R_{3}' está presente, el grupo -N^{(+)}R_{1}'R_{2}'R_{3}' es un grupo amonio y lleva una carga positiva. R_{1}', R_{2}' y R_{3}' son grupos que proporcionan una funcionalidad amina/amonio al nitrógeno. Son, por lo tanto, seleccionados entre los de R_{1}' y R_{2}' que dan un carbono hibridado en sp^{3} o un carbono aromático directamente al nitrógeno de -N^{(+)}R_{1}'R_{2}'R_{3}'.

Típicamente, A consiste en una cadena orgánica estable en la que hay uno o más elementos estructurales orgánicos seleccionados entre (a) cadenas hidrocarbonadas lineales, ramificadas o cíclicas que tienen 1-20 átomos de carbono; (b) éter; (c) tioéter; (d) estructuras de amida; (e) éster; (f) azo; (g) estructuras de amina secundaria o terciaria, etc. Las estructuras preferidas tienen típicamente una estabilidad hidrolítica comparable o superior a la de la acetamida, por ejemplo. En algunas aplicaciones, puede ser ventajoso incluir estructuras que tengan una estabilidad reducida con objeto de permitir la escisión selectiva en una determinada localización. Véase, por ejemplo, la discusión que se da a continuación sobre la síntesis en fase sólida de polímeros.

Mediante el término "estable" anterior, se contempla que la cadena orgánica no se deteriore inintencionadamente o reaccione con cualquiera de los grupos presentes en la matriz de soporte de la invención o en las condiciones aplicadas durante su uso.

La estructura A puede ser común para al menos dos de R_{1}', R_{2}' y R_{3}'. La estructura A puede, por lo tanto, tener un grupo terminal que, junto con el nitrógeno de -N^{(+)}R_{1}'R_{2}'R_{3}', forme -N=N-, -N=C<, N^{+}\equivN, etc. En -N^{+}\equivN, -A-X
es \equivN, lo que significa que A y X coinciden.

Los grupos reactivos definidos anteriormente y presentes en la estructura X son bien conocidos en este campo. Hidroxi, amino, tiol, carboxi, etc. y sus formas activadas son ejemplos típicos.

La estructura X puede ser un nucleótido o desoxinucleótido o un ácido nucleico (ADN, ARN, oligonucleótido y análogos tales como APN y ALN), que está unido, en su posición 3' (la terminal para los oligonucleótidos) a través de A a la matriz de soporte y, en su posición 5' (la terminal para los oligonucleótidos) está protegido o desprotegido. Si están presentes, los grupos amino, los grupos fosfato y los grupos hidroxi están preferiblemente en forma protegida.

La posición 2' está preferiblemente protegida en caso de que X sea un nucleótido.

Para la posición 5', un grupo protector familiar es el dimetoxitritilo (DMtr).

Para los grupos amino, que están presentes en el resto básico, el grupo protector óptimo depende del nucleósido/nucleótido, del desoxinucleótido/desoxinucleósido o del ácido nucleico en cuestión. Son grupos protectores de amino típicos para las formas desoxi: adenosina - benzoílo/fenoxiacetilo, citosina - benzoílo/isobutirilo/acetilo, guanina - isobutirilo/isopropilfenoxiacetilo, timidina - ninguno, y, para los nucleósidos/nucleótidos: adenosina - fenoxiacetilo, citosina - acetilo, guanosina - isopropilfenoxiacetilo, uracilo - ninguno.

Un grupo protector de fosfato típico es el \beta-cianoetilo. En determinadas variantes, un oxígeno de fosfato puede estar substituido con un sulfuro, es decir, que en una cadena oligonucleotídica el grupo fosfato puede ser -P(-S^{-}) (=O) -
[P(=S)(-O^{-})-].

Para la posición 2' del resto de azúcar, el t-butildimetilsililo es un grupo protector típico.

La estructura orgánica A es seleccionada de tal forma que los ciclos de reacción en la síntesis en fase sólida de nucleótidos puedan ser realizados sin liberar la cadena oligonucleotídica en crecimiento, es decir, que la estructura A es estable en las diversas etapas hasta la etapa de liberación final.

Para la síntesis de oligonucleótidos y similares, la estructura A proporciona típicamente una función éster a la posición 3' del primer nucleótido de la cadena nucleotídica en crecimiento, mientras que los otros elementos estructurales de A son más estables. Otros elementos estructurales en A, por lo tanto, pueden ser amida, cadena hidrocarbonada pura, éter, tioéter, etc. Alternativamente, el grupo éster puede ser substituido con una estructura de éter silílico única o repetitiva. Véanse, por ejemplo, WO 9209615 y WO 9808857. Es, sin embargo, obvio para un experto en la técnica que muchas variantes de la estructura A entran también dentro del alcance de esta invención.

X puede ser también un residuo de aminoácido o un oligopéptido unido en su extremo carboxi a una matriz de soporte según se ha definido anteriormente. El grupo amino, por ejemplo un grupo \alpha-amino, puede estar protegido o sin proteger, como es sabido en este campo. Si están presentes, otros grupos carboxi y otros grupos amino, y también un grupo tiol, pueden ser protegidos de un modo conocido en este campo. Los requerimientos de estabilidad para la estructura puente A son en este caso diferentes de los que son válidos para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, pero que son bien conocidos para los expertos en la técnica.

X puede ser también un miembro de un así llamado par de afinidad y puede ser usado para la unión de afinidad ("adsorción de afinidad") del otro miembro del par a la matriz de soporte. Los pares de afinidad conocidos son (a) entidades cargadas positiva y negativamente (intercambio iónico, con grupos seleccionados entre amonio primario, secundario, terciario y cuaternario, sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato y carboxi unidos covalentemente a una matriz de soporte), (b) anticuerpos y antígenos/haptenos, (c) lectinas y estructuras de carbohidratos, (d) proteínas de unión a IgG e IgG, etc. Los tipos de X son frecuentemente usados en soluciones acuosas y la selectividad y especificidad de unión pueden resultar frecuentemente alteradas en caso de que la superficie de contacto entre el medio acuoso y la fase sólida sea hidrofóbica. Así, en este modo de la invención, es frecuentemente importante hidrofilizar la superficie, por ejemplo teniendo entidades que contienen grupos hidroxilo unidas como A, que a su vez pueda exhibir X, es decir, el miembro del par de afinidad. Los procedimientos de hidrofilización y los procedimientos para unir covalentemente ligantes de afinidad a fases sólidas son conocidos en este campo.

Un aspecto de la invención es un método para usar el soporte de la invención en los diversos campos indicados en la parte introductoria anterior. En principio, las diversas etapas para cada uso respectivo son conocidas per se, sin exclusión de futuros desarrollos.

Un uso es la síntesis en fase sólida por etapas de un compuesto orgánico. Típicamente, la síntesis es también cíclica. El compuesto orgánico puede ser un polímero compuesto por uno o más monómeros difuncionales análogos diferentes. Mediante el término difuncional, se contempla que una función en un monómero puede participar en una reacción de desplazamiento nucleofílico/electro-fílico con la segunda función. Cuando se lleva a cabo este tipo de reacción de un modo cíclico, de tal forma que el producto de reacción de un ciclo es usado como compuesto de partida en el siguiente ciclo, se formará una cadena polimérica compuesta por varios monómeros en secuencia. Para cada ciclo, se añade una unidad monomérica a la cadena polimérica creciente, que está anclada en un extremo de la matriz de soporte. Un protocolo típico consiste en:

1.: Disponer de una matriz de soporte según se ha definido antes que lleva un X que consiste en uno de los monómeros unido a la matriz de soporte a través de uno de sus grupos funcionales, mientras que el segundo grupo funcional está protegido.

2.: Si es aplicable, desproteger el segundo grupo funcional.

3.: Hacer reaccionar dicho segundo grupo funcional con un monómero que está activado en su primer grupo funcional y que está protegido en su segundo grupo funcional.

4.: Repetir las etapas 2-3 un número predeterminado de veces con el mismo monómero u otro diferente.

5.: Desproteger eventualmente y liberar el polímero formado del soporte.

En caso de que los monómeros usados contengan más grupos funcionales que puedan participar en las reacciones, éstos son apropiadamente protegidos. Típicamente, se incluyen etapas de lavado entre las etapas 1-5.

Este modo de la invención es útil, entre otros, para la síntesis en fase sólida de oligonucléotidos regulares y modificados (ADN, ARN, APN (WO 9220703), ALN, etc.) y oligopéptidos.

No debe haber grupos nucleofílicos libres en A o en la matriz de soporte que sean capaces de dar reacciones colaterales con los reactivos usados. Los grupos prohibidos típicos son grupos OH- o amino.

La síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos de ADN o ARN y análogos) sobre matrices de soporte es conocida en la técnica. Así, partiendo de una matriz de soporte que lleva un X que es igual a un nucleósido/desoxinucleósido protegido, un protocolo típico consiste en:

1.: Desproteger el desoxinucleósido/desoxinucleótido protegido en 5' unido a la matriz de soporte.

2.: Hacer reaccionar el desoxinucleósido desprotegido en 5' con una amidita activada de un desoxinuclósido protegido en 5' deseado.

3.: Oxidar el grupo fosfito que une el desoxinucleósido desprotegido en la etapa 1 al desoxinucleósido introducido en la etapa 2 a un grupo fosfato o un grupo tiofosfato.

4.: Rematar el desoxinucleósido desprotegido en 5' no reaccionado.

5.: Repetir las etapas 1-4 un número predeterminado de veces con el mismo o diferente desoxinucleósido en cada ciclo.

6.: Desproteger y liberar el ADN producido (oligonucleótido) de la matriz.

Típicamente, también hay etapas de lavado entre las etapas 1-6. Excepto por las etapas 3 y 6, todas las etapas son realizadas en condiciones anhidras, típicamente en acetonitrilo (etapas 1, 2 y 4). El procedimiento para la síntesis de ARN es análogo, substituyendo los desoxinucleósidos por nucleósidos. Siempre que se mantengan las condiciones totalmente anhidras en la etapa 2, la cantidad de amidita añadida puede ser de tan sólo 1,5 equivalentes del primer monómero unido a la matriz.

Los protocolos para la síntesis de oligonucleótidos son mayormente realizados en columnas/recipientes en los que se ha puesto una matriz de soporte en forma de partículas empaquetadas en un lecho. Se deja entonces que el reactivo y las soluciones de lavado pasen a través de la columna, preferiblemente en gasto de tipo pistón. Las partículas son preferiblemente porosas y pueden ser monodispersas o polidispersas, según se ha definido anteriormente. Para los diámetros adecuados de tamaño de poro, véase lo anterior.

Para una revisión de la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, véase Sanghvi Y.S. y col., "Chemical Synthesis and Purification of Phosphothioate Antisense Oligonucleotides", en: "Manual of Antisense Methodology", G. Hartman y S. Endrés (Eds.), Kluwer Academic Publishers (1998), páginas 1-19. Véase OligoPilot User Manual, Amersham Pharmacia Biotech AB, en particular el capítulo 4.

Los protocolos para la síntesis de oligopéptidos son análogos a los protocolos para la síntesis de oligonucleótidos. Así, partiendo de una matriz de soporte que lleva un X que es igual a un residuo de aminoácido protegido en su extremo amino, por ejemplo, un grupo \alpha-amino, y continuando, un protocolo típico consiste en:

1.: Desproteger el grupo amino, por ejemplo, un grupo \alpha-amino, del residuo de aminoácido introducido en último lugar.

2.: Hacer reaccionar el grupo amino desprotegido en la etapa 1 con un derivado de aminoácido apropiadamente protegido y activado.

3.: Repetir las etapas 1-2 un número predeterminado de veces con el mismo o diferente aminoácido.

4.: Desproteger y liberar el oligopéptido formado de la matriz de soporte.

Véase también Peptidsyntase: Miklos Bodanszky Peptide Chemistry Springer Verlag 1988.

En caso de que las matrices de soporte definidas anteriormente sean usadas para adsorción de afinidad, X es un miembro de un par de afinidad según se ha definido anteriormente. Este uso consiste en poner en contacto la matriz de soporte y un líquido, típicamente un líquido acuoso, que contiene el otro miembro del par de afinidad. Las condiciones son seleccionadas para promover la unión de afinidad y son consideradas, en principio, como conocidas per se en la técnica. A continuación, se separa la matriz de soporte del líquido y, si se desea, se puede liberar y seguir procesando el miembro adsorbido por afinidad.

La presente invención se relaciona con un nucleósido/nucleótido, un desoxinucleósido/desoxinucleóti-do, un oligonucleótido o un análogo de estos compuestos, unido en su posición 3' (terminal para el oligonucleótido) a través de una estructura de unión B a una matriz de soporte porosa compuesta por un esqueleto de polivinilo. La entidad unida está preferiblemente protegida en las posiciones 2'-amino y fosfato y está protegida o no protegida en la posición 5' (terminal para el oligonucleótido). En este aspecto de la presente invención, la matriz de soporte se caracteriza por el hecho de que los diámetros del tamaño de los poros están dentro del intervalo de 10-2.000 \ring{A}, tal como de 100-1.000 \ring{A}, para más del 10%, tal como más del 30% del volumen del poro. Véase lo anterior. En una variante preferida, las partículas pueden ser monodispersas, según se ha definido antes, con un diámetro medio de 5-100 \mum, preferiblemente de 10-50 \mum. La estructura de unión B proporciona un grupo que se une a la posición 3' del mismo modo que como se ha descrito antes para el segundo aspecto de la invención. La estructura B más el nucleósido/nucleótido, el desoxinucleósido/desoxinucleótido o el oligonucleótido pueden o no ser parte del grupo -N^{(+)}R_{1}''R_{2}''R_{3}'', que se une a través de un arileno al esqueleto de polivinilo.

Parte experimental Polimerizaciones

Monómeros: Divinilbenceno (grado técnico) que contiene un 80% (p/p) de meta- y para-divinilbenceno y un 20% (p/p) principalmente de meta- y para-etilvinilbenceno. Estireno (grado técnico). El aminovinilbenceno (aminoestireno, vinilanilina) era de Oakwood (EE.UU.). Monómero I: meta- y para-etilbenceno + aminovinilbenceno (monómero III) + eventualmente también estireno. Monómero II: meta- y para-divinilbenceno.

A. Tapones porosos (monolitos) y poblaciones de partículas polidispersas (de diversos tamaños) Polimerización 1 Polimerización de radicales de estireno, divinilbenceno y aminoestireno en ausencia de oxígeno

En un matraz de fondo redondo, de 3 cuellos y de 50 ml, se disolvió el iniciador, 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo (V-65, Wako), (0,526 g, 2,12 mmol) en tolueno (23,34 g) (porógeno). Después de esto, se añadieron los monómeros, divinilbenceno (3,001 g, 23,1 mmol), estireno (6,013 g, 57,6 mmol) y aminoestireno (1,000 g, 8,39 mmol). Se agitó la mezcla con una varilla de vidrio para obtener una solución homogénea. Se equipó entonces el matraz de reacción con un condensador de agua y se puso en un baño de aceite a temperatura ambiente. Se pasó nitrógeno gaseoso a través de la mezcla a través de un tubo equipado con una pipeta Pasteur. Se mantuvo un bajo flujo de nitrógeno gaseoso bajo la superficie de la mezcla de reacción durante 30 minutos. Durante este tiempo, se dejó que el flujo de nitrógeno gaseoso saliera a través del condensador de agua. Después de esto, se levantó la pipeta Pasteur por encima de la superficie de la mezcla de reacción y se dejó ahí con un lento flujo de nitrógeno durante el resto del experimento. A continuación, se calentó el baño de aceite a 70ºC y se dejó así la reacción durante la noche. Después de 21 horas, se sacó el matraz de reacción del baño de aceite y se enfrió lentamente hasta la temperatura ambiente. Por entonces, la mezcla de reacción se había convertido en un caucho húmedo y suave, como un tapón polimérico. Se dividió el tapón en pequeños fragmentos usando una espátula y se puso en un embudo de filtración de vidrio. Se lavaron entonces los fragmentos con tolueno (10 x 50 ml). El procedimiento de lavado fue muy lento, ya que el tolueno hinchaba el tapón polimérico muy bien. A mitad del procedimiento de lavado, se pusieron los fragmentos en un recipiente de cristalización y se cortaron en piezas más pequeñas usando un escalpelo para obtener un mejor efecto del lavado. Se evaporó el tolueno que quedaba en los fragmentos poliméricos después del procedimiento de lavado en un horno de vacío (25ºC, \sim 1 mbar, 24 h). Durante la evaporación, los fragmentos poliméricos se endurecieron lo suficiente como para ser triturados en partículas incluso menores. Finalmente, se trituraron las partículas aún más para obtener partículas incluso más pequeñas.

Se vio la presencia de unidades monoméricas de aminoestireno en el producto por FTIR, análisis elemental, GC-MS de pirólisis y prueba de tinción con ninhidrina.

Polimerización 2 Polimerización de radicales de estireno, divinilbenceno y aminoestireno en presencia de un agente de transferencia de cadena (CBr_{4})

En cuatro tubos de ensayo diferentes, se disolvieron el iniciador, 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitrilo) (V-65), y el agente de transferencia de cadena (CBr_{4}) en tolueno (también porógeno). Se añadieron entonces divinilbenceno, estireno y aminoestireno. Se usaron las cantidades según las Tablas 1-3. Se agitaron entonces los tubos de ensayo a conciencia durante unos cuantos segundos para conseguir una mezcla homogénea. Se lavó luego cada tubo de ensayo con nitrógeno gaseoso por debajo de la superficie de la mezcla de reacción durante 5-10 minutos para eliminar cualquier oxígeno y se equipó entonces con un tabique. Más aún, por cada tubo de ensayo, se llenó un balón equipado con una jeringa con nitrógeno. Se clavaron entonces las agujas de las jeringas a través del tabique para asegurar que no entrara nada de oxígeno en los tubos de ensayo. Se iniciaron las reacciones de polimerización poniendo todos los tubos de ensayo en un baño de aceite a una temperatura de 60ºC, donde se dejaron durante la noche. Al día siguiente, se usó una espátula para fragmentar los tapones poliméricos producidos. Finalmente, se lavaron los fragmentos poliméricos con metanol (4 x 10 ml) y tolueno (10 x 10 ml) y se secaron en un horno de vacío (25ºC, \sim 1 mbar, 24 h).

El primer grupo de reacciones (Tabla 1) mostró que casi no había signos de polimerización alguna. Sólo la muestra con la cantidad más pequeña de CBr_{4} en combinación con la cantidad más alta del iniciador se había vuelto ligeramente más viscosa.

TABLA 1

1

En el segundo grupo de reacciones (Tabla 2), se usaron cantidades mucho menores de CBr_{4}. Todos los tubos de ensayo contenían un tapón polimérico blando después de aproximadamente 20 h en el baño de aceite. Se siguieron analizando estos tapones poliméricos, por lo tanto, para determinar la cantidad de aminoestireno que se había incorporado realmente a la matriz polimérica durante la polimerización. La FTIR, el análisis elemental y la prueba de tinción con ninhidrina mostraron que el aminoestireno se había incorporado al polímero formado.

TABLA 2

2

Un tercer grupo de reacciones (Tabla 3) fueron también llevadas a cabo usando cantidades incluso menores del agente de transferencia de cadena. Esta vez, los resultados variaron entre los diferentes tubos de ensayo. Las dos muestras con la mayor cantidad de CBr_{4} habían formado tapones poliméricos que visualmente parecían aceptables. La muestra con la menor cantidad de CBr_{4} en combinación con la cantidad menor de V-65 no mostró signos de polimerización. La muestra con la menor cantidad de CBr_{4} en combinación con la mayor cantidad de V-65 había polimerizado, pero pareció tener lugar algo de separación de fases. No se siguió analizando ninguna de las muestras de este experimento.

TABLA 3

\vskip1.000000\baselineskip

3

FTIR: Se registraron los espectros de infrarrojos de los diferentes materiales poliméricos triturados en un Perkin Elmer 16 PC FTIR usando la técnica de reflectancia difusa (DRIFT).

Análisis elemental: Se analizaron muestras para determinar la cantidad de nitrógeno. El usado por Mikro Kemi AB está etiquetado como MK 2006.

GC-MS de pirólisis: Se llevó a cabo un análisis de GC-MS de pirólisis sobre el producto de reacción final de la polimerización 1. El instrumento de GC-MS era un Finnigan Trace GCQ y el equipo de pirólisis era un Pyrola 2000. Se realizó la pirólisis a 700ºC.

Prueba de tinción con ninhidrina: Se realizó esta prueba según el procedimiento descrito por Bunin (The Combinatorial Index, Academic Press (1998), página 214). Se prepararon tres soluciones stock diferentes:

A - Ninhidrina (500 mg, 2,81 mmol) en etanol (10 ml).

B - Fenol (40 g, 425 mmol) en etanol (10 ml).

C - Solución de KCN (2 ml, 0,001 M) diluida con piridina (hasta un volumen total de 100 ml).

Se pesaron aproximadamente 20 mg de los fragmentos poliméricos en un tubo de ensayo. Se añadieron entonces 2-3 gotas de cada solución stock (A, B y C) a los fragmentos poliméricos y se puso el tubo de ensayo en un baño de aceite manteniendo una temperatura de \sim100ºC durante 5 minutos con agitación ocasional. Los materiales que contenían grupos amino se volvieron de color azul obscuro cuando se trataron de esta forma. Los materiales sin grupo grupos amino no cambiaron de color.

B. Fabricación de partículas optimizadas para uso en la síntesis de oligonucleótidos

Principio de la polimerización: Se prepararon partículas semilla de alrededor de 0,5 \mum de diámetro por polimerización de estireno en emulsión, para obtener cadenas poliméricas de una longitud relativamente corta. Se hincharon las partículas semilla en un procedimiento de dos etapas con adición de tolueno como porógeno más los monómeros (grado técnico de divinilbenceno, aminovinilbenceno y estireno) más un azoiniciador y se polimerizaron. Se incluyeron estabilizadores, iniciadores, etc. apropiados según se ha discutido anteriormente. Se seleccionó el sistema para dar partículas finales monodispersas con un tamaño de 30 \mum. El procedimiento fue como se señala en US 4.336.173.

Resultados

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{147mm} * Estirenos significa etilestirenos
como parte del grado técnico del divinilbenceno más el grado técnico
del estireno.\end{minipage} \cr  ** mmoles de grupos amino
añadidos por cantidad total de monómeros en gramos.\cr  *** mmoles
de nitrógeno (grupos amino) de las partículas obtenidas en base al
análisis elemental.\cr  El % p/p se basa en la cantidad total de
monómeros.\cr   \begin{minipage}[t]{147mm} Los valores de la
porosidad se basan en el porcentaje de tolueno incluido en la mezcla
de
polimerización.\end{minipage} \cr}

Analizando la distribución del tamaño de poro mediante el uso de poliestirenos en tetrahidrofurano, se vio que un 48-61% de los volúmenes de poro de los lotes 1-7 estaban en poros con diámetros de tamaño de poro en el intervalo de 115-880 \ring{A}, constituyendo más de un 30% del volumen de poro.

Síntesis de oligonucleótidos

Introducción de desoxinucleótido 5'-protegido sobre las matrices de soporte: Se hizo esto succinilando primeramente el desoxinucleótido seleccionado en su posición 3' (protegido con DMTr en la posición 5' y apropiadamente protegido en el grupo amino, si está presente). Se activó el monoéster de ácido succínico obtenido con cloroformiato de isobutirilo y se copuló a una matriz de soporte que contenía grupos amino. Se determinó la carga por liberación del DMTr-compuesto y medición de este compuesto por UV/VIS. Inicialmente, se vio que las matrices de soporte (partículas) del lote 1 (70% de porógeno) podían ser cargadas con hasta 0,344 mmoles de nucleótido por gramo de partículas. El resto de los grupos amino son probablemente inaccesibles para la copulación, posiblemente por esta presentes en poros demasiado pequeños o embebidos en el material polimérico.

Síntesis de oligonucleótidos

Se realizó ésta automáticamente en Oligo Pilotil (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Partiendo de un soporte de nucleótidos protegidos con DMTr, la síntesis consiste en las siguientes etapas:

1. Hidrólisis del dimetoxitritilo mediante un 3% (v/v) de ácido dicloroacético en diclorometano.

2. Lavado con acetonitrilo.

3. Adición de tetrazol 0,45 M en acetonitrilo y amidita en acetonitrilo (1,5 equivalentes con respecto al nucleótido de partida en el soporte).

4. Lavado con acetonitrilo.

5. Oxidación del fosfito mediante I_{2} 50 mM en 10% de agua y 90% de piridina (% v/v).

6. Lavado con acetonitrilo.

7. Remate de los grupos hidroxi no reaccionados que no han reaccionado con la amidita. Cantidades iguales de solución A (20% de N-metilimidazol en acetonitrilo) y de solución B (20% de anhídrido del ácido acético en 30% de 2,6-dimetilpiridina y 50% de acetonitrilo.

8. Lavado con acetonitrilo.

Para la síntesis de un 20-mero, se realizaron 19 ciclos de las etapas 1-8 antes de desproteger totalmente el oligonucleótido y de liberarlo de la matriz de soporte.

Al valorar conjuntamente todas las características de las partículas producidas (hinchabilidad, rigidez, capacidad de carga, rendimiento de síntesis de oligonucleótidos, costes, etc.), la matriz de soporte del lote 6 fue considerada óptima en la solicitud de prioridad y fue utilizada como primer prototipo. Hubo indicaciones de que se podrían obtener partículas aún mejores aumentando todavía más el contenido en porógeno (tolueno).

Claims

1. Una matriz de soporte consistente en un esqueleto de polivinilo [(-CH_{2}CH_{2})_{n}] al que se une un nucleósido/nucleótido, un desoxinucleósido/desoxinucleótido o un oligonucleótido a través de una posición 3' disponible, teniendo la posición 5' disponible protegida o no protegida y, si están presentes, teniendo restos de grupos hidroxi o amino protegidos, caracterizada por ser dicha matriz de soporte porosa y por estar los diámetros de tamaño de poro dentro del intervalo de 10-2.000 \ring{A} para más del 10% del volumen de poro.

2. La matriz de soporte según la reivindicación 1, donde dichos diámetros de tamaño de poro están dentro del intervalo de 100-1.000 \ring{A} para más del 10% del volumen de poro.

3. La matriz de soporte según la reivindicación 2, donde dichos diámetros de tamaño de poro están dentro del intervalo de 100-1.000 \ring{A} para más del 30% del volumen de poro.

4. La matriz de soporte según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha matriz está en forma de población de partículas monodispersas.

5. La matriz de soporte según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha matriz tiene una carga de > 100 \mumoles de una única unidad monomérica de un nucleótido/nucleósido o desoxinucleótido/desoxinucleósido por gramo de matriz seca.

6. La matriz de soporte según la reivindicación 5, donde dicha matriz tiene una carga de \geq 150 \mumoles de una única unidad monomérica de un nucleótido/nucleósido o desoxinucleótido/desoxinucleósido por gramo de matriz seca.

7. La matriz de soporte según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que ha sido obtenida por copolimerización de uno o más monómeros monovinílicos (monómero I) con uno o más monómeros di-, tri- o polivinílicos (monómero II) en presencia de un monómero de vinilo que lleva un grupo aminohidrocarbonado (C_{0-10}) unido a un anillo aromático.

8. Utilización de la matriz de soporte definida en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la síntesis en fase sólida de un oligo/polinucleótido o de un oligo/polipéptido.