ES2210761T3 - Composicion y procedimiento para mejorar el transporte a traves de las membranas biologicas. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a procedimientos y composiciones para transportar fármacos y macromoléculas a través de membranas biológicas. En una realización, la invención incluye un procedimiento para mejorar el transporte de compuestos seleccionados a través de membranas biológicas, cuya membrana biológica está en contacto con un conjugado que contiene un agente biológicamente activo y que se une al polímero de transporte de forma covalente. En una realización el polímero consta de entre 6 a 25 subunidades, con al memos el 50% de las cuales contienen una mitad cadena lateral de guanidino o amidino. El polímero es eficaz para impartir al agente unido una velocidad de transporte a través de la transmembrana biológica que es mayor que la velocidad de transporte a través de la membrana del agente en forma no conjugada.

Description

Composición y procedimiento para mejorar el transporte a través de las membranas biológicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y a composiciones que son efectivas para mejorar el transporte de agentes biológicamente activos, tales como compuestos orgánicos, polipéptidos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, e iones metálicos, a través de membranas biológicas.

Referencias

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Antecedentes de la invención

Las membranas plasmáticas de las células presentan una barrera al paso de muchos agentes terapéuticos útiles. En general, un fármaco debe ser totalmente soluble tanto en los compartimientos acuosos del cuerpo como en las capas de lípidos a través de las cuales debe pasar, a fin de penetrar las sellas. Las moléculas altamente cargadas experimentan en particular dificultad para pasar a través de las membranas. Muchas macromoléculas terapéuticas, tales como péptidos y oligonucleótidos, también son particularmente intratables para el transporte membránico. De este modo, mientras que la biotecnología ha hecho posible un gran número de productos terapéuticos potencialmente valiosos, las consideraciones sobre la biodisponibilidad a menudo impiden su utilidad médica. Por lo tanto, existe una necesidad de medios fiables para transportar fármacos, y particularmente macromoléculas, en las células.

Hasta ahora, se ha propuesto un gran número de moléculas transportadoras para acompañar a moléculas a través de las membranas biológicas. Ryser y col. (1979) enseña el uso de polímeros de lisina de alto peso molecular para aumentar el transporte de diversas moléculas a través de membranas celulares, siendo precedidos los pesos moleculares muy altos. Aunque los autores consideran a los polímeros de otros restos cargados positivamente, tales como ornitina y arginina, no se ha mostrado la operatividad de tales polímeros.

Frankel y col. (1991) da a conocer que la conjugación de moléculas seleccionadas a la proteína tat de VIH puede aumentar la captación celular de esas moléculas. Sin embargo, el uso de la proteína tat tiene ciertas desventajas, incluyendo propiedades desfavorables de agregación e insolubilidad.

Barsoum y col. (1994) y Fawell y col. (1994) proponen el uso de fragmentos más cortos de la proteína tat que contiene la región básica tat (restos 49-57 que tienen la secuencia RKKRRQRRR). Barsoum y col. señalaron que los polímeros de poliarginina moderadamente largos (Pm 5000-15000 daltons) no permitieron el transporte de \beta-galactosidasa a través de las membranas celulares (por ejemplo, Barsoum en la página 3), contrariamente a la sugerencia de Ryser y col. (más arriba).

Otros estudios han demostrado que un conjugado de colesterol con un péptido de 16 aminoácidos derivado del homeodominio de Antennapedia es internado rápidamente por neuronas cultivadas (Brugidou y col., 1995). Sin embargo, versiones ligeramente más cortas de este péptido (15 residuos) no son recogidas efectivamente por las células (Derossi y col., 1996).

La solicitud de patente canadiense nº 2094658 describe péptidos portadores que tienen D-aminoácidos positivamente cargados, por ejemplo péptidos portadores que constan de 8 ó 9 residuos de D-arginina, para el suministro intracelular de agentes bioquímicos.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la conjugación de ciertos polímeros compuestos de subunidades contiguas, altamente básicas, particularmente subunidades que contienen restos guadinilo o amidinilo, a pequeñas moléculas o macromoléculas es efectiva para mejorar significativamente el transporte de la molécula aneja a través de las membranas biológicas. Además, el transporte transcurre a una velocidad significativamente mayor que la velocidad de transporte proporcionada por un péptido tat de VIH básico que consta de los residuos 49-57.

Sumario de la invención

La presente invención incluye, en un aspecto, un procedimiento para mejorar el transporte de un agente biológicamente activo a través de una membrana biológica. En el procedimiento, se pone en contacto in vitro una membrana biológica con un conjugado que contiene un agente biológicamente activo que está unido covalentemente a un portador polímero de la invención. La puesta en contacto des efectiva para aumentar el suministro del conjugado a través de la membrana biológica, en comparación con el suministro del agente biológicamente activo en forma no conjugada.

En un aspecto, la invención proporciona un conjugado que comprende un agente biológicamente activo unido covalentemente a un portador polimérico que tiene una cadena principal no peptídica, en el que el portador polimérico (a) consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal, (b) contiene al menos seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y (c) es efectivo para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo que es transportada a través de una membrana biológica con relación a la cantidad del agente que se puede transportar a través de la membrana biológica en forma no conjugada.

En una realización, el polímero consta de 6 a 25 subunidades, al menos el 50% de las cuales contiene un resto de cadena lateral de guanidino o amidino, en el que el polímero consta de al menos 6, y más preferiblemente al menos 7, restos de cadena lateral de guanidino o amidino. En otra realización, el polímero consta de 6 a 20, 7 a 20, o 7 a 15 subunidades. Más preferiblemente, al menos el 70% de las subunidades en el polímero contiene restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y más preferiblemente aún 90%. Preferiblemente, ningún resto de cadena lateral de guanidino o amidino está separado de ningún otro resto por más de una subunidad no guadinídica o no amidínica. En una realización más específica, el polímero contiene al menos 6 subunidades contiguas conteniendo cada una un grupo guanidino o amidino, y preferiblemente al menos 6 ó 7 restos de cadena lateral de guanidino contiguos.

En otra realización, el polímero de transporte contiene de 6 a 25 subunidades contiguas, de 7 a 25, de 6 a 20, o preferiblemente de 7 a 20 subunidades contiguas, cada una de las cuales contiene un resto de cadena lateral de guanidino o amidino, y con la condición opcional de que una de las subunidades contiguas puede contener un resto no arginínico al que está unido el agente. En una realización, cada unidad contigua contiene un resto guanidino, según se ejemplifica por un polímero que contiene al menos seis restos de arginina contiguos.

Preferiblemente, cada polímero transportador es lineal. En una realización preferida, el agente se une a un extremo terminal del polímero transportador.

En otra realización específica, el conjugado contiene un único polímero transportador.

El procedimiento se puede usar para mejorar el transporte de agentes terapéuticos seleccionados a través de cualquiera de un número de membranas biológicas, incluyendo, pero sin limitarse a, membranas de células eucariotas, membranas de células procariotas, y paredes células. Las membranas ejemplares de células procariotas incluyen membranas bacterianas. Las membranas ejemplares de células eucariotas de interés incluyen, pero no se limitan a, membranas de célula dendríticas, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, células de los músculos, células fúngicas, células bacterianas, células de plantas, y similares.

Según una realización preferida de la invención, el polímero transportador de la invención tiene una afinidad aparente (Km) que es al menos 10 veces mayor, y preferiblemente al menos 100 veces mayor, que la afinidad medida para el péptido tat (49-57) mediante el procedimiento del ejemplo 6 cuando se mide a temperatura ambiente (23ºC) o 37ºC.

Los agentes biológicamente activos (que engloban a agentes terapéuticos) incluyen, pero no se limitan a, iones metálicos, que se suministran típicamente como quelatos metálicos; pequeñas moléculas orgánicas tales como moléculas contra el cáncer (por ejemplo taxano) y moléculas antimicrobianas (por ejemplo, frente a bacterias u hongos tales como levadura); y macromoléculas tales como ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y análogos de los mismos. En una realización preferida, el agente es un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico, tal como una ribozima que contiene opcionalmente una o más unidades 2-desoxinucleotídicas para una mayor estabilidad. Como alternativa, el agente es un ácido nucleico peptídico (PNA). En otra realización preferida, el agente es un polipéptido, tal como un antígeno proteínico, y la membrana biológica es una membrana celular de una célula que presenta el antígeno (APC). En otra realización, el agente se selecciona para promover o producir una respuesta inmune frente a un antígeno tumoral seleccionado. En otra realización preferida, el agente es un taxano o un compuesto anticancerígeno taxoide. en otra realización, el agente es un agente no polipeptídico, preferiblemente un agente terapéutico no polipeptídico. En una realización más general, el agente tiene preferiblemente un peso molecular menor que 10 kDa.

El agente puede estar enlazado al polímero mediante un resto enlace, que puede dar flexibilidad conformacional dentro del conjugado y puede facilitar las interacciones entre el agente y su objetivo biológico. En una realización, el resto enlace es un enlace rompible, por ejemplo, que contiene un grupo enlace que se puede romper mediante una enzima o mediante una ruptura a través de disolventes, tal como un grupo éster, amida, o disulfuro. En otra realización, el grupo enlace rompible contiene un grupo fotorrompible.

En una realización más específica, el grupo enlace rompible contiene un primer grupo rompible que está distante del agente biológicamente activo, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente biológicamente activo, de forma que la ruptura del primer grupo rompible produce un conjugado de grupo enlace/agente que contiene un resto nucleófilo capaz de reaccionar intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible, liberando de ese modo el agente del grupo enlace y del polímero.

En otra realización, la invención se puede usar para detectar sistemáticamente una pluralidad de conjugados en busca de una actividad biológica seleccionada, en el que los conjugado están formados de una pluralidad de agentes candidatos. Los conjugado se ponen en contacto con una célula que muestra una señal detectable con la captación del conjugado en la célula, de forma que la magnitud de la señal indica la eficacia del conjugado con respecto a la actividad biológica seleccionadas. Este procedimiento es particularmente útil para ensayar las actividades de los agente que por sí mismos son incapaces o muy poco capaces de penetrar en las células para manifestar actividad biológica. En una realización, los agentes cantidades se seleccionan de una biblioteca combinatoria.

La invención también incluye una biblioteca de conjugados que es útil para la detección sistemática en el procedimiento anterior.

En otro aspecto, la invención incluye una composición farmacéutica para suministrar un agente biológicamente activo a través de una membrana biológica. La composición comprende un conjugado que contiene un agente biológicamente activo enlazado covalentemente a al menos un polímero de transporte como se describe anteriormente, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. El polímero es efectivo para impartir al agente una velocidad de transporte transmembránico que es mayor que la velocidad de transporte transmembránico del agente en forma no conjugada. La composición se puede envasar adicionalmente con instrucciones para su uso.

En otro aspecto, la invención incluye un uso como se define en la reivindicación 30.

Estos y otros objetos y características de la invención serán manifiestos de forma más completa cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención conjuntamente con los dibujos que se acompañan.

Breve descripción de los dibujos

Las figs. 1A y 1B son representaciones gráficas de la captación celular de ciertos conjugados de polipéptido con fluoresceína que contienen el péptido básico tat (49-57, SEQ ID NO:1), poli-Lys (K9, SEQ ID NO:2), y poli-Arg (R4-R9 y r4-r9, SEQ ID NO:3-9 y 12-17, respectivamente), como una función de la concentración del péptido; la fig. 1C es un histograma de los niveles de captación de los conjugados medidos para conjugados a una concentración de 12,5 \muM (Ejemplos 2-3);

las figs. 2A-2F muestran imágenes generadas por ordenador de microfotografías confocales (Ejemplo 4) que muestran la fluorescencia emitida (2A-2C) y la luz transmitida (2D-2F) procedente de células Jurkat tras la incubación a 37ºC durante 10 minutos con 6,25 \muM de tat (49-57) conjugada con fluoresceína (paneles A y D), un 7-mer de poli-L-arginina (R7) marcada isotópicamente con fluoresceína (paneles B y E), o un 7-mer de poli-D-arginina (r7) marcada isotópicamente con fluoresceína (paneles C y F);

la fig. 3 muestra la captación celular de ciertos conjugados de poli-Arg con fluoresceína (r9, R9, R15, R20 y R25, SEQ ID NO: 17 y 8-11, respectivamente) como una función de la concentración del conjugado (Ejemplo 5);

la fig. 4 muestra un histograma de la captación celular de tat (49-57) conjugada con fluoresceína, y conjugados de poli-Arg con fluoresceína (R9, R8 y R7, respectivamente) en ausencia (las cuatro barras a la izquierda) y en presencia (cuatro barras a la derecha) de azida sódica al 0,5% (Ejemplo 7);

las figs. 5A-5C muestran representaciones gráficas de los niveles de captación de los conjugados poliméricos seleccionados (K9, R9, r4, r5, r6, r7, r8, y r9) por células bacterianas como una función de la concentración del conjugado; la fig. 5A compara los niveles de captación observados para los conjugados R9 y r9 como una función de la concentración del conjugado cuando se incuba con células HB 101 de E. coli; la fig. 5B muestra los niveles de captación observados para los conjugados K9 y r4 a r9 cuando se incuba células HB 101 de E. coli; la fig. 5C compara los niveles de captación de los conjugados de r9 y K9 cuando se incuba con células de Strep. bovis;

las figs. 6A-6E muestran conjugados ejemplares de la invención que contienen restos enlaces rompibles; las figs. 6F y 6G muestran estructuras químicas y la numeración convencional de los átomos constituyentes de la cadena principal para paclitaxel y "TAXOTERE"; la fig. 6H muestra una estructura química general y la numeración de los átomos del anillo para compuestos taxoides; y

la fig. 7 muestra la inhibición de la secreción de gamma-interferón (\gamma-IFN) por células T de múridos como una función de la concentración de un conjugado de r7 con PNA sentido (SEQ ID NO:18), conjugado de r7 con PNA antisentido (SEQ ID NO:19), y PNA antisentido no conjugado (SEQ ID NO:20), en los que las secuencias de PNA se basan en una secuencia procedente del gen para gamma-interferón.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

La expresión "membrana biológica", como se usa aquí en este documento, se refiere a una barrera que contiene lípidos, que separa a las células o grupos de células del espacio extracelular. Las membranas biológicas incluyen, pero no se limitan a, membranas plasmáticas, paredes celulares, membranas de orgánulos intracelulares, tales como la membrana mitocondrial, membranas nucleares, y similares.

La expresión "concentración transmembránica" se refiere a la concentración de un compuesto presente en el lado de una membrana que es opuesto o "trans" al lado de la membrana al que se ha añadido una composición particular. Por ejemplo, cuando se añade un compuesto al fluido extracelular de una célula, la cantidad del compuesto medida subsiguientemente en el interior de la célula es la concentración transmembránica del compuesto.

"Agente biológicamente activo" o "sustancia biológicamente activa" se refiere a una sustancia química, tal como una pequeña molécula, macromolécula, o ión metálico, que provoca un cambio observable en la estructura, función o composición de la célula con la captación por la célula. Los cambios observables incluyen el aumento o disminución de la expresión de uno o más ARNm, el aumento o disminución de la expresión de una o más proteínas, la fosforilación de una proteína o de otro componente celular, la inhibición o activación de una enzima, la inhibición o activación de la unión entre miembros de un par de unión, un aumento o disminución de la velocidad de síntesis de un metabolito, un aumento o disminución de la proliferación celular, y similar.

El término "macromolécula", como se usa en este documento, se refiere a moléculas grandes (peso molecular mayor que 1000 daltons), ejemplificadas pero no limitadas a péptidos, proteínas, oligonucleótidos y polinucleótidos de origen biológico o sintético.

"Pequeña molécula orgánica" se refiere a un agente que contiene carbono y que tiene un peso molecular (Pm) menor o igual a 1000 daltons.

Las expresiones "agente terapéutico" , "composición terapéutica", y "sustancia terapéutica", se refieren, sin limitación, a cualquier composición que se puede usar para el beneficio de una especie mamífera. Tales agentes pueden tener la forma de iones, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, proteínas o polipéptidos, oligonucleótidos y oligosacáridos, por ejemplo.

Las expresiones "agente no polipeptídico" y "agente terapéutico no polipeptídico" se refieren a la porción de un conjugado polimérico transportador que no incluye el polímero potenciador del transporte, y que es un agente biológicamente activo distinto de un polipéptido. Un ejemplo de un agente no polipeptídico es un oligonucleótido antisentido, que se puede conjugar con un péptido de poli-arginina para formar un conjugado para el suministro mejorado a través de las membranas biológicas.

El término "polímero" se refiere a una cadena lineal de dos o más subunidades idénticas o no unidas por enlaces covalentes. Un péptido es un ejemplo de un polímero que puede estar compuesto de subunidades de aminoácidos idénticas o no que están unidas por enlaces peptídicos.

El término "péptido", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto formado por una única cadena de D-o L-aminoácidos, o una mezcla de D- y L-aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos. Generalmente, los péptidos contienen al menos dos restos aminoácidos, y tienen una longitud menor que alrededor de 50 aminoácidos.

El término "proteína", como se usa aquí, se refiere a un compuesto que está compuesto de aminoácidos dispuestos linealmente unidos por enlaces peptídicos pero que, contrariamente a los péptidos, tienen una conformación bien definida. Las proteínas, en oposición a los péptidos, constan generalmente de cadenas de 50 ó más aminoácidos.

"Polipéptido", como se usa en este documento, se refiere a un polímero de al menos dos restos aminoácidos, y que contiene uno o más enlaces peptídicos. "Polipéptido" engloba a péptidos y a proteínas, independientemente de si el polipéptido tiene una conformación bien definida.

Los términos "guanidilo", "guanidinilo", y "guanidino", se usan de forma intercambiable para referirse a un resto que tiene la fórmula -HN=C(NH_{2})NH (fórmula no protonada). Como ejemplo, la arginina contiene un resto guanidilo (guanidino), y también se denomina como ácido 2-amino-5-guanidinovalérico o ácido \alpha-amino-\delta-guanidinovalérico. "Guanidinio" se refiere a la forma ácida conjugada positivamente cargada.

"Amidinilo" o "amidino" se refiere a un resto que tiene la fórmula -C(=NH)(NH_{2}). "Amidinio" se refiere a la forma ácida conjugada positivamente cargada.

El término "poli-arginina" o "poli-Arg" se refiere a una secuencia polimérica compuesta de residuos contiguos de arginina: poli-L-arginina se refiere a todas las L-argininas: poli-D-arginina se refiere a todas las D-argininas. La poli-L-arginina también se abrevia mediante una letra mayúscula "R" seguido del número de L-argininas en el péptido (por ejemplo, R8 representa un 8-mer de residuos contiguos de L-arginina); la poli-D-arginina se abrevia mediante una letra en minúsculas "r" seguido del número de D-argininas en el péptido (r8 representa un 8-mer de residuos contiguos de D-arginina).

Los restos de aminoácidos se nombran aquí por sus nombres completos o mediante abreviaturas estándares de una sola letra o de tres letras: A, Ala, alanina; C, Cys, cisteína; D, Asp, ácido aspártico; E, Glu, ácido glutámico; F, Phe, fenilalanina; G, Gly, glicina; H, His, histidina; I, Ile, isoleucina; K, Lys, lisina; L, Leu, leucina; M, Met, metionina; N, Asn, asparagina; P, Pro, prolina; Q, Gln, glutamina; R, Arg, arginina; S, Ser, serina; T, Thr, treonina; V, Val, valina; W, Trp, triptófano; X, Hyp, hidroxiprolina; Y, Tyr, tirosina.

II. Estructura del resto polimérico

En una realización, los polímeros transportadores según la presente invención contienen polímeros de cadena corta, de 6 hasta 25 subunidades, según se describe anteriormente. El conjugado es efectivo para mejorar la velocidad de transporte del conjugado a través de la membrana biológica con relación a la velocidad de transporte del agente biológico no conjugado solo. Aunque las composiciones poliméricas ejemplificadas con péptidos, los polímeros de la invención contienen cadenas principales no peptídicas, como se plantea posteriormente más abajo.

En un aspecto importante de la invención, los conjugados de la invención son particularmente útiles para transportar agentes biológicamente activos a través de las membranas celulares o de los orgánulos, cuando los agentes son del tipo que requieren el transporte transmembránico para mostrar sus efectos biológicos, y que no muestran sus efectos biológicos principalmente uniéndose a un receptor de la superficie, es decir de forma que no ocurre la entrada del agente. Además, los conjugados son particularmente útiles para transportar agentes biológicamente activos del tipo que requiere el transporte transmembránico para mostrar sus efectos biológicos, y que por sí mismos (sin conjugación a un polímero transportador o alguna otra modificación) son incapaces o sólo son muy poco capaces de penetrar en las células para manifestar actividad biológica.

Como un asunto general, el polímero transportador usado en el conjugado incluye preferiblemente una cadena principal lineal de subunidades. La cadena principal comprenderá habitualmente heteroátomos seleccionados de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, y fósforo, constando habitualmente la mayoría de los átomos de la cadena principal de carbonos. Cada subunidad contiene un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal.

Aunque el espaciamiento entre los restos de cadena lateral adyacentes será consistente habitualmente de una subunidad a otra, los polímeros usados en la invención también pueden incluir un espaciamiento variable entre restos de cadena lateral a lo largo de la cadena principal.

Los restos de cadena lateral se extienden alejándose de la cadena principal de forma que el átomo de carbono de guanidino o amidino central (al que están unidos los grupos NH_{2}) está enlazado a la cadena principal mediante un grupo enlace de cadena lateral que contiene preferiblemente al menos dos átomos de carbono en la cadena enlace, más preferiblemente de 2 a 5 átomos en la cadena, de forma que el átomo de carbono central es el tercer a sexto átomo de la cadena alejado de la cadena principal. Los átomos de la cadena se proporcionan preferiblemente como átomos de carbono metilénicos, aunque también pueden estar presentes uno o más átomos distintos tales como oxígeno, azufre o nitrógeno. Preferiblemente, el grupo enlace de la cadena lateral entre la cadena principal y el átomo de carbono central del grupo guanidino o amidino tiene una longitud de 4 átomos en la cadena, según se ejemplifica mediante una cadena lateral de arginina.

La secuencia del polímero transportador de la invención puede estar planteada por una o más subunidades no guanidínicas/no amidínicas, o un grupo enlace tal como un grupo ácido aminocaproico, que no acepta significativamente a la velocidad de transporte membránico del conjugado correspondiente que contiene el polímero, tal como, por ejemplo, glicina, alanina, y cisteína. También se puede tapar con un grupo bloqueante, tal como con un grupo acetilo o bencilo, cualquier grupo amino terminal libre, para evitar la omnipresencia in vivo.

El agente a transportar se puede enlazar al polímero transportador según un número de realizaciones. En una realización preferida, el agente se enlaza a un único polímero transportador, bien mediante un enlace a un extremo terminal del polímero transportador o bien a una subunidad interna dentro del polímero vía un grupo enlace adecuado.

En una segunda realización, el agente se une a más de un polímero, de la misma manera que antes. Esta realización es en cierto modo menos preferida, puesto que puede conducir a la reticulación de células adyacentes.

En una tercera realización, el conjugado contiene dos restos del agente unidos a cada extremo terminal del polímero. Para esta realización, se prefiere que el agente tenga un pero molecular menor que 10 kDa.

Con respecto a las realizaciones primera y tercera recientemente mencionadas, el agente generalmente no se une a ninguna de las cadenas laterales guanidínicas o amidínicas de forma que están libres para interaccionar con la membrana objetivo.

Los conjugados de la invención se pueden preparar mediante esquemas sintéticos directos. Además, los productos conjugados son habitualmente homogéneos de forma sustancial en longitud y composición, de modo que proporcionan una consistencia y reproducibilidad en sus efectos mayor que las mezclas heterogéneas.

Según un aspecto importante de la presente invención, se ha encontrado que la unión de un único polímero transportador a cualquiera de una variedad de tipos de agentes biológicamente activos es suficiente para mejorar sustancialmente la velocidad de captación de un agente a través de membranas biológicas, incluso sin que se requiera la presencia de un gran resto hidrófobo en el conjugado. De hecho, la unión de un resto hidrófobo grande puede impedir o prevenir significativamente el transporte a través de la membrana debido a la adhesión del resto hidrófobo a la bicapa lipídica. En consecuencia, la presente invención incluye conjugados que no contienen grandes restos hidrófobos, tales como moléculas de lípidos y de ácidos grasos. En otra realización, el procedimiento se usa para tratar un estado del sistema nervioso no central (SN no Central) en un individuo que no requiere el suministro a través de la membrana hematoencefálica.

A. Componentes poliméricos Aminoácidos

En una realización, el polímero transportador está compuesto de restos de D o L aminoácidos. El uso de restos de L-aminoácidos de origen natural en los polímeros transportadores tiene la ventaja de que los productos de la descomposición deben ser relativamente no tóxicos para la célula o para el organismo.

Más generalmente, se prefiere que cada subunidad del polímero contenga un resto de cadena lateral fuertemente básico que (i) tenga un pKa mayor que 11, más preferiblemente 12,5 o superior, y (ii) contenga, en estado protonado, al menos dos grupos amino (NH_{2}) geminales que compartan una carga positiva estabilizada por resonancia, lo que da al resto un carácter bidentado.

También se pueden usar D-aminoácidos en los polímeros transportadores. Las composiciones que contienen exclusivamente D-aminoácidos tienen la ventaja de una reducción de la degradación enzimática. Sin embargo, pueden también permanecer largamente intactas dentro de la célula objetivo. Tal estabilidad generalmente no es problemática si el agente es biológicamente activo cuando el polímero está aún unido. Para agentes que son inactivos en forma conjugada, se debe incluir en el conjugado un grupo enlace que sea rompible en el sitio de acción (por ejemplo, mediante ruptura enzimática o por disolventes dentro de la célula), para promover la liberación del agente en las células o orgánulos.

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Otras subunidades

También se pueden seleccionar subunidades distintas de aminoácidos para uso en la formación de los polímeros transportadores. Tales subunidades pueden incluir, pero no se limitan a, hidroxi-aminoácidos, N-metil-aminoácidos, aminoaldehídos, y similares, que dan como resultado polímeros con menor número de enlaces peptídicos. Se pueden usar otros tipos de subunidades, dependiendo de la naturaleza de la cadena principal seleccionada, según se plantea en la siguiente sección.

B. Tipo de cadena principal

Se puede usar una gran variedad de tipos de cadena principal para ordenar y colocar los restos guanidínicos y/o amidínicos de cadena lateral, tales como restos de cadena principal alquílica unidos por grupos tioéteres o sulfonilos, ésteres de hidroxiácidos (equivalentes a sustituir enlaces de amidas por enlaces de éster), sustituyendo el carbono de la posición alfa por nitrógeno para formar un análogo aza, restos de cadena principal alquílica unidos por grupos carbamato, polietileniminas (PEI), y aminoaldehídos, lo que da como resultado polímeros compuestos de amidas secundarias.

Una lista más detallada de cadenas principales incluye amida N-sustituida (CONR sustituye a los enlaces CONH), ésteres (CO_{2}), cetometileno (COCH_{2}) reducido o metilenamino (CH_{2}NH), tioamida (SCN), fosfinato (PO_{2}RCH_{2}), fosfonamidato y éster de fosfonamidado (PO_{2}RNH), retropéptido (NCO), trans-alqueno (CR=CH), fluoroalqueno (CF=CH), dimetileno (CH_{2},CH_{2}), tioéter (CH_{2}S), hidroxietileno (CH(OH)CH_{2}), metilenoxi (CH_{2}O), tetrazol (CN_{4}), retrotioamida (NHCS), retrorreducido (NHCH_{2}), sulfonamido (SO_{2}NH), metilensulfonamido (CHRSO_{2}NH), retrosulfonamida (NHSO_{2}), y peptoides (glicinas N-sustituidas), y cadenas principales con subunidades de malonato y/o diaminoalquílicas geminales, por ejemplo, según lo estudiado por Fletcher y col. (1998), y detallados mediante las referencias citadas allí. También se pueden usar cadenas principales de peptoides (glicinas N-sustituidas) (por ejemplo, Kessler, 1993; Zuckermann y col., 1992; y Simon y col., 1992). Muchas de las sustituciones anteriores dan como resultado cadenas principales de polímeros aproximadamente isostéricos con relación a cadenas principales formadas a partir de \alpha-aminoácidos.

Los estudios llevados a cabo para apoyar la presente invención han utilizado polipéptidos (por ejemplo, cadenas principales peptídicas). Sin embargo, las cadenas principales no peptídicas de la invención, tales como las descritas anteriormente, pueden proporcionar una mejor estabilidad biológica (por ejemplo, resistencia a la degradación enzimática in vivo).

C. Síntesis de moléculas transportadoras poliméricas

Los polímeros se construyen mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.

III. Unión de polímeros transportadores a agentes biológicamente activos

Los polímeros transportadores de la invención se pueden unir covalentemente a los agentes biológicamente activos mediante procedimientos químicos.

A. Enlaces químicos

Los agentes biológicamente activos, tales como pequeñas moléculas orgánicas y macromoléculas, se pueden enlazar a los polímeros transportadores de la invención vía un número de procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Wong, 1991), bien directamente (por ejemplo, con una carbodiimida) o bien mediante un resto enlace. En particular, los enlaces de carbamato, éster, tioéter, disulfuro e hidrazona generalmente son fáciles de formar y adecuados para la mayoría de las aplicaciones. Se prefieren los enlaces de tipo éster y disulfuro si el enlace se va a degradar fácilmente en el citosol, después del transporte de la sustancia a través de la membrana celular.

Se pueden usar diversos grupos funcionales (hidroxilo, amino, halógeno, etc.) para unir el agente biológicamente activo al polímero transportador. Se prefieren los grupos que se sabe que no son parte de un sitio activo del agente biológicamente activo, particularmente si el polipéptido o cualquier porción del mismo va a permanecer unido a la sustancia después del suministro.

Los polímeros, tales como los péptidos producidos según el Ejemplo 1, generalmente se producen con un grupo protector amino terminal, tal como FMOC. Para agentes biológicamente activos que pueden sobrevivir a las condiciones usadas para romper el polipéptido de la síntesis de la resina y desproteger las cadenas laterales, el FMOC se puede romper a partir del N-término del polipéptido completo unido a la resina de forma que el agente se pueda enlazar a la amina N-terminal libre. En tales casos, el agente a unir se activa típicamente por procedimientos bien conocidos en la técnica, para producir un resto de éster activo o de carbonato activo efectivo para formar un enlace de tipo amida o carbamato, respectivamente, con el grupo amino del polímero. Por supuesto, también se pueden usar otras químicas de enlace.

Para ayudar a minimizar las reacciones laterales, los restos guanidínicos y amidínicos se pueden bloquear usando grupos protectores convencionales, tales como grupos carbobenciloxi (CBz), di-t-BOC, PMC, Pbf, N-NO_{2}, y similares.

Las reacciones de acoplamiento se realizan mediante procedimientos de acoplamiento conocidos en cualquiera de un conjunto de disolventes, tales como N,N-dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidinona, diclorometano, agua, y similares. Los reactivos de acoplamiento ejemplares incluyen hexafluorofosfato de O-benzotriazoliloxi-tetrametiluronio (HATU), diciclohexilcarbodiimida, bromuro de bromo-tris(pirrolidino)fosfonio (PyBroP), etc. Se pueden incluir otros reactivos, tales como N,N-dimetilaminopiridina (DMAP), 4-pirrolidinopiridina, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxibenzotriazol, y similares.

Para agentes biológicamente activos que son inactivos hasta que se libera el polímero transportador unido, el grupo enlace es preferiblemente un grupo enlace fácilmente rompible, queriendo decir que es susceptible a la ruptura enzimática o mediante disolventes in vivo. Para este fin, se prefieren los grupos enlaces que contienen enlaces de tipo ésteres de ácidos carboxílicos y enlaces de tipo disulfuro, en los que los primeros grupos se hidrolizan enzimática o químicamente, y los últimos se rompen mediante intercambio de disulfuro, por ejemplo, en presencia de glutationa.

En una realización preferida, el grupo enlace rompible contiene un primer grupo rompible que está distante del agente, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente, de forma que la ruptura del primer grupo rompible produce un conjuntado de grupo enlace/agente que contiene un resto nucleófilo capaz de reaccionar intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible, liberando de ese modo el agente del grupo enlace y del polímero. Esta realización se ilustra adicionalmente por los diversos conjugados de pequeñas moléculas planteados más abajo.

IV. Mejora del transporte de agentes biológicamente activos a través de membranas biológicas A. Medida del transporte a través de membranas biológicas

Los sistemas de modelos para determinar la capacidad de los polímeros de la invención para transportar biomoléculas y otras sustancias terapéuticas a través de membranas biológicas incluyen sistemas que miden la capacidad del polímero para transportar una molécula fluorescente, unida covalentemente, a través de la membrana. Por ejemplo, la fluoresceína (Pm de \approx376) puede servir como un modelo para el transporte de pequeñas moléculas orgánicas (Ejemplo 2). Para el transporte de macromoléculas, se puede unir un polímero transportador a un gran polipéptido, tal como ovoalbúmina (peso molecular 45 kDa; por ejemplo, Ejemplo 14). La detección de la captación de macromoléculas se puede facilitar uniendo un marcador fluorescente. La captación celular también se puede analizar mediante microscopia confocal (Ejemplo 4).

B. Mejora del transporte a través de membranas biológicas

En experimentos llevados a cabo para apoyar la presente invención, se analizó el transporte transmembránico y la captación celular concomitante mediante la captación de un péptido transportador enlazado a fluoresceína, según los procedimientos descritos en los Ejemplos 2 y 3. Brevemente, se incubaron suspensiones de células con conjugados fluorescentes suspendidos en tampón durante tiempos variables a 37ºC, 33ºC, o 3ºC. Tras la incubación, la reacción se detuvo y las células se recogieron mediante centrifugación y se analizaron para determinar la fluorescencia usando separación de células activadas por fluorescencia (FACS).

En las condiciones usadas, la captación celular de los conjugados no fue saturable. En consecuencia, no se pudieron calcular los valores de ED_{50} para los péptidos. En su lugar, los datos se presentan como histogramas para permitir comparaciones directas de la captación celular a concentraciones individuales de los conjugados.

Las figs. 1A-1C muestran los resultados procedentes de un estudio en el que se analizaron polímeros de L-arginina (R; fig. 1A) o D-arginina (r; fig. 1B), de una longitud que oscila de 4 a 9 subunidades de arginina, para determinar la capacidad para transportar fluoresceína en células Jurkat. Para comparación, también se analizaron los niveles de transporte para restos de HN tat 49-57 ("49-57") y un nonámero de L-lisina (K9). La fig. 1C muestra un histograma de los niveles de captación para los conjugados a una concentración de 12,5 \muM.

Como se muestra en las figuras, los polímeros peptídicos fluorescentemente marcados, compuestos de 6 o más restos de arginina, entraron a las células de forma más eficiente que la secuencia 49-57 de tat. en particular, la captación mejoró hasta al menos alrededor de dos veces el nivel de captación de tat 49-57, y tanto como alrededor de 6-7 veces el nivel de captación de tat 49-57. La captación de fluoresceína sola fue insignificante. También, el nonámero de lisina (K9) mostró muy poca captación, indicando que los polímeros cortos de lisina son ineficaces como transportes transmembránicos, en contraste con los polímeros de longitud comparables que contienen guanidino.

Con referencia a la fig. 1B, los homopolímeros de D-arginina mostraron un actividad transportadora incluso mayor que sus contrapartes L. Sin embargo, el orden de magnitud de los niveles de captación fue aproximadamente el mismo. Para los D-homopolímeros, los péptidos con 7 a 9 argininas mostraron actividad casi igual. El hexámero (R6 o r6) fue en cierto modo menos efectivo, pero aún mostró una actividad transportadora al menos alrededor de 2 a 3 veces mayor que tat (49-57).

La capacidad de los polímeros de D- y L- arginina para mejorar el transporte transmembránico se confirmó mediante microscopia confocal (figs. 2A-2F, y Ejemplo 4). Consistente con los datos de FAC descritos anteriormente, el citosol de las células incubadas con R9 (figs. 2B y 2E) o r9 (figs. 2C y 2F) fue brillantemente fluorescente, indicando niveles elevados de transporte de conjugado al interior de las células. Por el contrario, tat(49-57) a la misma concentración mostró sólo una débil tinción (figs. 2A y 2D). Las microfotografías confocales también enfatizan el punto en el que el polímero de D-arginina (fig. 2C) fue más eficaz entrando en la célula que el polímero compuesto de L-arginina (fig. 2F).

A partir de lo anterior, es manifiesto que los polímeros transportadores de la invención son significativamente más efectivos que el péptido tat 49-57 de VIH transportando fármacos a través de las membranas plasmáticas de las células. Además, el nonámero de poli-Lys fue ineficaz como transportador.

Para determinar si había una longitud óptima para homopolímeros contiguos que contienen guanidinio, se examinó un conjunto de conjugados de homopolímeros más largos de arginina (R15, R20, R25, y R30). Para examinar el efecto de polímeros sustancialmente más largos, también se ensayó (Ejemplo 5) una mezcla de polímeros de L-arginina con un peso molecular medio de \approx 12.000 daltons (\approx 100 aminoácidos). Sin embargo, para evitar problemas de precipitación, se hubo de reducir el nivel de suero en el ensayo para ensayar conjugados con el material polimérico de peso molecular = 12.000. La captación por las células fue analizada mediante FACS como antes, y se midió la fluorescencia media de las células vivas. También se midió la citotoxicidad de cada conjugado.

Con referencia a la fig. 3, la captación de los conjugados de homopolímeros de L-arginina, con 15 o más argininas, mostró patrones de captación celular claramente diferentes de los polímeros que contienen nueve argininas o menos. Las curvas de los conjugados más largos fue más plana, atravesando a las de los conjugados de R9 y r9. A mayores concentraciones (> 3 \muM), la captación de R9 y r9 fue significativamente mejor para los polímeros más largos. Sin embargo, a menores concentraciones, las células incubadas con los péptidos más largos mostraron una mayor fluorescencia.

Basándose en estos datos, parece que r9 y R9 entran a las células a velocidades mayores que los polímeros que contienen 15 o más argininas contiguas. Sin embargo, la semivida biológica de R9 (péptido L) fue más corta para los conjugados más largos, presumiblemente debido a que la proteolisis de los péptidos más largos (debida a las enzimas del suero) produce fragmentos que retienen actividad transportadora. Por el contrario, el isómero D (r9) no mostró signos de degradación proteolítica, consistente con la mayor especificidad de las proteasas del suero por los L-polipéptidos.

De este modo, parece la eficacia global transportadora de un polímero transportador depende de una combinación de (i) la relación de captación transmembránica (los polímeros con menos de aproximadamente 15 argininas contiguas son mejores) frente a la susceptibilidad a la inactivación proteolítica (los polímeros más largos son los mejores). en consecuencia, se prefieren polímeros que contienen 7 a 20 restos contiguos de guanidinio, y preferiblemente 7 a 15.

Principalmente, el conjugado de poliarginina de peso molecular elevado (Pm 12.000) no mostró captación detectable. Este resultado es consistente con las observaciones de Barsoum y col. (1994), y sugiere que los polímeros de arginina tienen propiedades transportadoras que son significativamente diferentes de aquellas que pueden ser mostradas por los polímeros de lisina. Además, se encontró que el conjugado de poliarginina de 12.000 fue muy tóxico (Ejemplo 5). En general, la toxicidad de los polímeros aumentó con la longitud, aunque sólo el conjugado de peso molecular 12.000 mostró una elevada toxicidad a todas las concentraciones ensayadas.

Cuando se analizó la captación celular de los polímeros de D- y L-arginina mediante la cinética de Michaelis-Menten (Ejemplo 6), la velocidad de captación por las células Jurkat fue tan eficaz que sólo se pudieron obtener valores precisos de K_{m} cuando los ensayos se llevaron a cabo a 3ºC (sobre hielo). Tanto la velocidad máxima de transporte (V_{max}) como la afinidad aparente de los péptidos por el receptor putativo de la constante de Michaelis (K_{m}) se derivaron de las gráficas de Lineweaver-Burk de la fluorescencia observada de células Jurkat tras la incubación con concentraciones variables de nonámeros de D- y L- arginina durante 30, 60, 120, y 240 segundos.

El análisis de la cinética también revela que los polímeros ricos en arginina muestran una capacidad para unirse al sitio de transporte celular putativo, y para atravesarlo, mejor que, por ejemplo, el péptido tat(49-57), puesto que K_{m} para el transporte de la poli-L-arginina nonámera (44 \muM) fue sustancialmente menor que K_{m} del péptido tat (722 \muM). Además, el nonámero de D-arginina mostró el valor más bajo de K_{m} (7 \muM) de los polímeros analizados en este ensayo (Tabla 1), es decir, una afinidad aparente de aproximadamente 100 veces mayor. Según una realización preferida de la invención, el polímero transportador de la invención tiene una afinidad aparente (K_{m}) que es al menos 10 veces, y preferiblemente al menos 100 veces, mayor que la afinidad medida para tat mediante el procedimiento del Ejemplo 6 cuando se mide a temperatura ambiente (23ºC) o 37ºC.

TABLA 1

	K_{m} (\muM)	V_{max} (\muM/s)
H_{3}N-RRRRRRRRR-COO-	44,43	0,35
H_{3}N-rrrrrrrrr-COO-	7,21	0,39
tat 49-57	722	0,38

Los experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención indican que el transporte facilitado por los polímeros depende de la integridad metabólica de las células. La adición de una cantidad tóxica de azida de sodio (0,5% p/v) a las células dio como resultado la inhibición de la captación de conjugados en alrededor de 90% (Ejemplo 7). Los resultados mostrados en la fig. 4 demuestran (i) sensibilidad a la azida de sodio del transporte transmembránico, sugiriendo dependencia de la energía (captación celular), y (ii) la superioridad de los polímeros de poli-guanidinio de la invención (R9, R8, y R7) con relación a tat(49-57) de VIH.

Sin adscribirse a ninguna teoría particular, los datos sugieren que el proceso de transporte es un proceso dependiente de la energía mediado por el reconocimiento específico de polímeros que contienen guanidinio o amidinio mediante un transportador molecular presente en las membranas plasmáticas celulares.

Otros experimentos en apoyo de la invención han demostrado que los conjugados de la invención son eficaces para transportar agentes biológicamente activos a través de membranas de una variedad de tipos celulares, incluyendo células T de seres humanos (Jurkat), células B (CH27 de múridos), células T de linfomas (EL-4 de múridos), células de mastocitomas (P388 de múridos), varios hibridomas de células T de múridos, células neuronales (PC-12), fibroblastos (RT de múridos), células del riñón (HELM de múridos), mieloblastoma (K562 de múridos); y células de tejidos primarios, incluyendo todas las células de la sangre humana (excepto los glóbulos rojos), tales como linfocitos T y B, macrófagos, células dendríticas, y eosinófilos, basófilos, mastocitos, células endoteliales, células del tejido cardíaco, células del hígado, células del bazo, células de los nódulos linfáticos y queratinocitos.

Los conjugados también son eficaces para atravesar tanto las células bacterianas gram-negativas como gram-positivas, según se describe en el Ejemplo 8 y en las figs. 5A-5C. En general, se encontró que los polímeros de las subunidades de D-arginina entran a las bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas a velocidades significativamente más rápidas que las velocidades de transporte observadas para polímeros de L-arginina. Esto se ilustra mediante la fig. 5A, que muestra niveles de captación para el conjugado r9 (D-argininas) mucho mayores que para el conjugado R9 (L-argininas), cuando se incuba con células HB 101 (procariotas) de E. coli. Esta observación se puede atribuir a la degradación proteolítica de los polímeros L por las enzimas bacterianas.

La fig. 5B muestra niveles de captación para conjugados de D-arginina como una función de la longitud (r4 a r9) en comparación con un conjugado de poli-L-lisina (K9), cuando se incuba con células HB 101 de E. coli. Como se puede observar, los conjugados de poliarginina mostraron una tendencia similar a la de la fig. 2B observada con células eucariotas, de forma que los polímeros más cortos de r6 mostraron niveles bajos de captación, aumentando los niveles de captación como una función de la longitud.

Las bacterias gram-positivas, ejemplificadas por Strep. bovis, también se tiñeron eficazmente con polímeros de arginina, pero no de lisina, según se muestra en la fig. 5C.

Más generalmente, se observaron niveles máximos de captación por las bacterias a 37ºC. Sin embargo, se observó una tinción significativa cuando la incubación se realizó a temperatura ambiente o a 3ºC. La microscopia confocal reveló que el pretratamiento de las bacterias con azida de sodio al 0,5% inhibió el transporte a través de las membranas plasmáticas internas de bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas, pero no el transporte a través de la pared celular (bacterias gram-positivas) en el espacio periplásmico.

De este modo, la invención incluye conjugados que contienen agentes antimicrobianos, tales como compuestos antibacterianos y antifúngicos, para uso en la prevención o inhibición de la proliferación o infección microbiana, y para desinfectar superficies para mejorar la seguridad médica. Además, la invención se puede usar para el transporte en células de plantas, particularmente en plantas de hojas verdes.

Estudios adicionales en apoyo de la invención han demostrado que la translocación a través de las membranas bacterianas depende tanto de la energía como de la temperatura, consistente con las observaciones señaladas al principio para otros tipos de células.

V. Composiciones terapéuticas A. Pequeñas moléculas orgánicas

Los agentes terapéuticos de pequeñas moléculas orgánicas se pueden unir ventajosamente a composiciones poliméricas lineales como se describe en este documento para facilitar o mejorar el transporte a través de membranas biológicas. Por ejemplo, el suministro de agentes altamente cargados, tales como levodopa (L-3,4-dihidroxi-fenilalanina; L-DOPA, se puede ver beneficiado por el enlace a moléculas transportadoras poliméricas como se describe aquí. También se contemplan agentes peptoides y peptidomiméticos (por ejemplo, Langston, 1997; Giannis y col., 1997). También, la invención es ventajosa para suministrar pequeñas moléculas orgánicas que tienen malas solubilidades en líquidos acuosos, tales como el suero y disolución salina acuosa. De este modo, se pueden administrar compuestos, cuyas eficacias terapéuticas están limitadas por sus bajas solubilidades, a mayores dosis según la presente invención, y pueden ser más eficaces en una base molar en forma conjugada, con relación a la forma no conjugada, debido a mayores niveles de captación por las células.

Puesto que una parte significativa de la superficie topológica de una pequeña molécula está implicada a menudo, y por lo tanto se requiere, para la actividad biológica, en casos particulares puede ser necesario cortar la parte de la pequeña molécula del conjugado del polímero transportador unido y del resto enlace (si lo hay) para que el agente de pequeña molécula ejerza actividad biológica después de atravesar la membrana biológica objetivo. Para tales situaciones, el conjugado incluye preferiblemente un grupo enlace rompible para liberar al fármaco después de pasar a través de una membrana biológica.

En un enfoque, el conjugado puede incluir un enlace de tipo disulfuro, como se ilustra en la fig. 6A que muestra un conjugado (1) que contiene un polímero transportador T que está enlazado a un agente citotóxico, 6-mercaptopurina, mediante un grupo de cisteína N-acetil protegido que sirve como grupo enlace. De este modo, el agente citotóxico está unido mediante un enlace disulfuro al grupo 6-mercapto, y el polímero transportador está unido al resto carbonílico de la cisteína mediante un enlace de tipo amida. La ruptura del enlace disulfuro por reducción o intercambio de disulfuro da como resultado la liberación del agente citotóxico libre.

En el Ejemplo 9A se proporciona un procedimiento para sintetizar un conjugado que contiene disulfuro. El producto contiene un heptámero de restos de Arg que está enlazado a 6-mercaptopurina mediante un grupo enlace N-acetil-Cys-Ala-Ala, en el que los restos Ala se incluyen como un espaciador adicional para hacer al disulfuro más accesible a tioles y a agentes reductores para la rotura dentro de una célula. El grupo enlace en este ejemplo también ilustra el uso de enlaces amida, que se pueden romper enzimáticamente dentro de una célula.

En otro enfoque, el conjugado incluye un grupo enlace fotorrompible que se rompe con la exposición a radiación electromagnética. En la fig. 6B se ilustra un enlace ejemplar, que muestra un conjugado (II) que contiene un polímero T transportador que está enlazado a 6-mercaptopurina mediante un resto enlace meta-nitrobenzoato. El polímero T está enlazado al resto nitrobenzoato mediante un enlace amida al grupo carbonílico del benzoato, y el agente citotóxico está unido mediante su grupo 6-mercapto al grupo p-metileno. El compuesto se puede formar haciendo reaccionar 6-mercaptopurina con ácido p-bromometil-m-nitrobenzoico en presencia de NaOCH_{3}/metanol con calentamiento, seguido del acoplamiento del benzoato del ácido carboxílico a un polímero transportador, tal como el grupo amino de un enlace de ácido \gamma-aminobutírico unido al polímero (Ejemplo 9B). La fotoiluminación del conjugado provoca la liberación de la 6-mercaptopurina en virtud del grupo nitro que está en posición orto con respecto al resto mercaptometílico. Este enfoque encuentra utilidad en procedimientos de fototerapia como son conocidos en la técnica, particularmente para localizar la activación de fármacos a un área seleccionada del cuerpo.

Preferiblemente, el enlace rompible contiene un primer y segundo grupos rompibles que pueden cooperar para romper el polímero del agente biológicamente activo, según se ilustra mediante los siguientes enfoques. Esto es, el enlace rompible contiene un primer grupo rompible que está distante al agente, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente, de forma que la ruptura del primer grupo rompible produce un conjugado de enlace/agente que contiene un resto nucleófilo capaz de reaccionar intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible, liberando de ese modo el agente del grupo enlace y del polímero.

La fig. 6C muestra un conjugado (III) que contiene un polímero transportador T enlazado a un agente contra el cáncer, 5-fluorouracilo (5FU). Aquí, el enlace se proporciona mediante un resto lisilo modificado. El polímero transportador se enlaza al grupo \alpha-amino, y el 5-fluorouracilo está enlazado mediante el \alpha-carbonilo. El grupo \varepsilon-amino de lisilo ha sido modificado a un éster de carbamato de o-hidroximetil-nitrobenceno, que comprende un primer grupo rompible fotolábil en el conjugado. La fotoiluminación rompe al resto nitrobenceno del conjugado, dejando un carbamato que también se descompone rápidamente para dar el grupo \varepsilon-amino libre, un nucleófilo eficaz. La reacción intramolecular del grupo \varepsilon-amino con el enlace de amida al grupo 5-fluorouracilo conduce a la ciclación con liberación del grupo 5-fluorouracilo.

La fig. 6D ilustra un conjugado (IV) que contiene un polímero transportador T enlazado a 2'-oxígeno del agente contra el cáncer paclitaxel. El enlace se proporciona mediante un resto enlace que incluye (i) un átomo de nitrógeno unido al polímero transportador, (ii) un monoéster de fosfato localizado en para con respecto al átomo de nitrógeno, y (iii) un grupo carboximetílico en meta con respecto al átomo de nitrógeno, que está unido al 2'-oxígeno de paclitaxel mediante un enlace de éster de carboxilato. La ruptura enzimática del grupo fosfato a partir del conjugado a un grupo hidroxilo de fenol libre. Este grupo nucleófilo reacciona entonces intramolecularmente con el éster de carboxilato para liberar paclitaxel para la unión a su diana biológica. El Ejemplo 9C describe un protocolo sintético para preparar este tipo de conjugado.

La fig. 6E ilustra aún otro enfoque en el que se enlaza un polímero transportador a un agente biológicamente, por ejemplo, paclitaxel, mediante un ácido aminoalquilcarboxílico. Preferiblemente el grupo amino del enlace está enlazado al carbono carboxílico del enlace mediante 3 a 5 átomos de cadena (n = 3 a 5), preferiblemente 3 ó 4 átomos de cadena, que se proporcionan preferiblemente como carbonos metilénicos. Como se observa en la fig. 6E, el grupo amino del enlace está unido al polímero transportador mediante un enlace amida, y está unido al resto de paclitaxel mediante un enlace éster. La ruptura enzimática del enlace amida libera el polímero y produce un grupo amino nucléofilo libre. El grupo amino libre puede reaccionar entonces intramolecularmente con el grupo éster para liberar el enlace del paclitaxel.

Las figs. 6D y 6E son ilustrativas de otro aspecto de la invención, que comprenden conjugados taxánicos y taxoides contra el cáncer que tienen mayores velocidades de transporte transmembránico con relación a las formas no conjugadas correspondientes. Los conjugados son particularmente útiles para inhibir el crecimiento de células cancerígenas. Se cree que los taxanos y taxoides manifiestan sus efectos contra el cáncer promoviendo la polimerización de microtúbulos (e inhibiendo la despolimerización) hasta un grado que es perjudicial para el funcionamiento celular, inhibiendo la replicación celular, y finalmente conduciendo a la muerte de la célula.

El término "taxano" se refiere a paclitaxel (fig. 6F, R' = acetilo, R'' = bencilo), también conocido con el nombre "TAXOL", y a análogos de origen natural, sintéticos, u obtenidos por bioingeniería, que tienen un núcleo de cadena principal que contiene los anillos A, B, C y D de paclitaxel, según se ilustra en la fig. 6G. La fig. 6F también indica la estructura de "TAXOTERE®" (R' = H, R'' = BOC), que es un análogo sintético en cierto modo más soluble del paclitaxel, medido por Rhone-Poulenc. "Taxoide" se refiere a análogos de origen natural, sintéticos, u obtenidos por bioingeniería, de paclitaxel, que contienen los anillos básicos A, B y C de paclitaxel, según se muestra en la fig. 6H. La información sintética y biológica substancial está disponible en las síntesis y actividades de una variedad de compuestos taxánicos y taxoides, como se explica en Suffness (1995), particularmente en los capítulos 12 a 14, así como en la bibliografía subsiguiente del paclitaxel. Además, hay disponible un hospedante de estirpes celulares para predecir las actividades contra el cáncer de estos compuestos frente a ciertos tipos de cáncer, como se describen, por ejemplo en Suffness, en los capítulos 8 y 13.

El polímero transportador se conjuga al resto taxánico o taxoide mediante cualquier sitio de unión adecuado en el taxano o taxoide. Convenientemente, el polímero transportador se enlaza vía un átomo de oxígeno C2', un átomo de oxígeno C7, usando estrategias de enlace como antes. La conjugación de un polímero transportador mediante un oxígeno C7 conduce a conjugados de taxano que tienen actividad contra el cáncer y antitumoral a pesar de la conjugación en esa posición. En consecuencia, el enlace se puede romper o no. La conjugación mediante el oxígeno C2' reduce significativamente la actividad contra el cáncer, de forma que se prefiere un enlace rompible para la conjugación para este sitio. También se pueden usar otros sitios de unión, tal como C10.

Se apreciará que los conjugados de taxano y taxoide de la invención tienen una solubilidad mejorada en agua con relación a Taxol (\approx0,25 \mug/ml) y Taxotere (6-7 \mug/ml). Por lo tanto, no se requieren grandes cantidades de agentes solubilizantes, tales como "CREMOPHOR EL" (aceite de ricino polietoxilado), polisorbato 80 (monooleato de sorbitán polietoxilado, también conocido como "TWEEN 80"), ni de etanol, de forma que se pueden reducir los efectos secundarios asociados típicamente con estos agente solubilizantes, tales como anafilaxis, disnea, hipotensión y sonrojamiento.

B. Metales

Los metales se pueden transportar en células eucariotas y procariotas usando agentes quelantes, tales como texafirina o ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), conjugados a una membrana transportadora de la invención, según se ilustra mediante el Ejemplo 10. Estos conjugados son útiles para suministrar iones metálicos para la formación de imágenes o para terapia. Los iones metálicos ejemplares incluyen Eu, Lu, Pr, Gd, Tc99m, Ga67, In111, Y90, Cu67, y Co57. Los estudios preliminares de transporte membránico con candidatos conjugados se pueden realizar usando ensayos a base de células, tales como se describen en la sección de Ejemplos a continuación. Por ejemplo, usando iones de europio, se puede monitorizar la captación celular mediante medidas de fluorescencia a tiempos determinados. Para iones metálicos que son citotóxicos, la captación se puede monitorizar mediante la citotoxicidad.

C. Macromoléculas

El procedimiento de transporte mejorado de la invención es particularmente adecuado para mejorar el transporte a través de membranas biológicas para un gran número de macromoléculas, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, y análogos de los mismos. Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos formados de ADN y ARN, y sus análogos, que tienen secuencias seleccionadas diseñadas para la hibridación a dianas complementarias (por ejemplo, secuencias antisentido para dianas de una sola hebra o de doble hebra), o para expresar transcriptos de ácidos nucleicos o proteínas codificados por las secuencias. Los análogos incluyen análogos de cadena principal cargados y preferiblemente no cargados, tales como fosfonatos (preferiblemente metilfosfonatos), fosforamidatos (N3' o N5'), tiofosfonatos, polímeros a base de morfolino no cargados, y ácido nucleicos de proteínas (PNA). Tales moléculas se pueden usar en una variedad de regímenes terapéuticos, que incluyen, por ejemplo, terapia de sustitución de enzimas, terapia génica, y terapia antisentido.

A título de ejemplo, los ácidos nucleicos de proteínas (PNA) son análogos de ADN en los que la cadena principal es estructuralmente homomorfa con una cadena principal de desoxirribosa. Consta de unidades de N-(2-aminoetil)glicina a las que se unen nucleobases. Los PNA que contienen las cuatro nucleobases naturales se hibridan a oligonucleótidos complementarios obedeciendo a las reglas de apareamiento de Watson-Crick, y son imitaciones verdaderas de ADN en términos de reconocimiento de pares de bases (Egholm y col. 1993). La cadena principal de un PNA está formada por enlaces peptídicos más que ésteres de fosfato, haciéndola muy adecuada para aplicaciones antisentido. Puesto que la cadena principal no está cargada, los dúplex PNA/ADN o PNA/ARN que se forman muestran una estabilidad térmica mayor de lo normal. Los PNA tienen la ventaja adicional de que no son reconocidos por nucleasas o proteasas. Además, los PNA se pueden sintetizar en un sintetizador automatizado de péptidos usando la química estándar de t-Boc. El PNA se enlaza entonces fácilmente a un polímero transportador de la invención.

En la patente U.S. 5.594.122, por ejemplo, se describen ejemplos de oligonucleótidos antisentido cuyo transporte al interior de las células se puede mejorar usando los procedimientos de la invención. Tales oligonucleótidos están dirigidos a tratar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La conjugación de un polímero transportador a un oligonucleótido antisentido se puede efectuar, por ejemplo, formando un enlace amida entre el péptido y el término 5' del oligonucleótido a través de un enlace de tipo succinato, según procedimientos bien establecidos. El uso de conjugados de PNA se ilustra adicionalmente en el Ejemplo 11.

La fig. 7 muestra los resultados obtenidos con un conjugado de la invención que contiene una secuencia de PNA para inhibir la secreción de gamma-interferón (\gamma-IFN) mediante células T, según se detalla en el Ejemplo 11. Como se puede observar, el conjugado de PNA antisentido fue eficaz bloqueando la secreción de \gamma-IFN cuando el conjugado estaba presente en cantidades por encima de alrededor de 10 \muM. Por el contrario, no se observó inhibición con el conjugado de PNA sentido o con el PNA antisentido solo no conjugado.

Otra clase macromoléculas que se pueden transportar a través de membranas biológicas se ejemplifican mediante proteínas, y en particular enzimas. Las proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de sustitución. Las enzimas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, alglucerasa para uso en el tratamiento de la deficiencia de glucocerebrosidasa lisosómica (enfermedad de Gaucher), alfa-L-iduronidasa, para uso en el tratamiento de mucopolisacaridosis 1, alfa-N-acetilglucosamidasa, para uso en el tratamiento del síndrome de San Filippo B, lipasa, para uso en el tratamiento de insuficiencia pancreática, adenosina desaminasa, para uso en el tratamiento de síndrome de inmunodeficiencia combinado grave, y triosa fosfato isomerasa para uso en el tratamiento de la disfunción neuromuscular asociada con deficiencia de triosa fosfato isomerasa.

Además, y según un aspecto importante de la invención, se pueden suministrar antígenos proteínicos al compartimiento citosólico de células que presentan antígenos (APC), en el que son degradados en péptidos. Los péptidos se transportan entonces al retículo endoplásmico, en el que se asocian con moléculas nacientes de HLA de clase I y se despliegan por toda la superficie celular. Tales APC "activadas" pueden servir como inductores de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígenos restringidos de clase I, que entonces proceden a reconocer y destruir células que presentan el antígeno particular. Las APC que son capaces de llevar a cabo este proceso incluyen, pero no se limitan a, ciertos macrófagos, células B y células dendríticas. En una realización, el antígeno proteínico es un antígeno tumoral para provocar o promover una respuesta inmune frente a células tumorales.

El transporte de proteínas aisladas o solubles en el citosol de APC con la activación subsiguiente de CTL es excepcional puesto que, con pocas excepciones, la inyección de proteínas aisladas o solubles no da como resultado la activación de APC o la inducción de CTL. De este modo, los antígenos que están conjugados a las composiciones potenciadoras del transporte de la presente invención pueden servir para estimular una respuesta celular inmune in vitro o in vivo.

El ejemplo 14 proporciona detalles de experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención en los que se suministra un antígeno proteínico ejemplar, ovoalbúmina, a APC tras la conjugación a un polímero R7. La adición subsiguiente de las APC a linfocitos T citotóxicos (CTL) dio como resultado células T citotóxicas específicas de albúmina CD8+ (CTL estimulados). Por el contrario, las APC que se habían expuesto a ovoalbúmina sin modificar fracasaron estimulando los CTL.

En experimentos paralelos, se expusieron células dendríticas histocompatibles (un tipo específico de APC) a conjugados de ovoalbúmina con R7, y después se inyectaron en ratones. El análisis subsiguiente de la sangre procedente de estos ratones reveló la presencia de CTL específicos para albúmina. A los ratones del control se les proporcionó células dendríticas que se habían expuesto a albúmina no modificada. Los ratones del control no mostraron la respuesta de CTL específicos para albúmina. Estos experimentos ejemplifican una de las utilidades específicas asociadas con el suministro de macromoléculas en general, y proteínas en particular, a las células.

En otra realización, la invención es útil para suministrar anticuerpos inmunoespecíficos o fragmentos de anticuerpos al citosol para interferir con procesos biológicos perjudiciales tales como la infección microbiana. Experimentos recientes han demostrado que los anticuerpos intracelulares pueden ser agentes antivíricos efectivos en células de plantas y de mamíferos (por ejemplo, Tavladoraki y col., 1993 y Shaheen y col., 1996). Estos procedimientos han usado típicamente fragmentos de región variable de cadena única (scFv), en los que las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos se sintetizan como un único polipéptido. Las cadenas pesadas y ligeras variables están separadas habitualmente mediante un péptido enlace flexible (por ejemplo, de 15 aminoácidos) para producir una molécula de 28 kDa que retiene el sitio de unión a ligando de alta afinidad. El principal obstáculo para la aplicación amplia de esta tecnología ha sido la eficacia de la captación en células infectadas. Pero uniendo polímeros transportadores a los fragmentos scFv, se puede mejorar el grado de captación celular, permitiendo que los fragmentos inmunoespecíficos se unan e incapaciten a importantes componentes microbianos tales como Rev de VIH, transcriptasa inversa de VIH, y proteínas integrasas.

D. Péptidos

Los péptidos a suministrar mediante los procedimientos mejorados de transporte descritos aquí incluyen, pero no se deben limitar a, polipéptidos efectores, fragmentos receptores, y similares. Los ejemplos incluyen péptidos que tienen sitios de fosforilación usados por proteínas que median señales intracelulares. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se limitan a proteína quinasa C, RAF-1, p21 Ras, NF-_{K}B, C-JUN, y colas citoplásmicas de receptores de membrana tales como receptor IL-4, CD28, CTLA-4, V7, y antígenos de la clase I y clase II de MHC.

En experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención (Ejemplo 15) se sintetizó un segmento de 10 aminoácidos de la región de cola citoplásmica de la proteína transmembránica V7 (también conocida como CD101), con una secuencia de polímero R7 en su término C. Se sabe que esta región de cola se asocia físicamente con, y media, la inactivación de RAF-1 quinasa, una enzima crítica en la ruta de MAP quinasas de la activación celular. Se añadió el conjugado V7/R7 a células T, que se lisaron subsiguientemente con detergentes. La fracción soluble se ensayó para determinar la inmunoprecipitación mediante anticuerpo anti-V7 de múrido en combinación con IgG antiratón de cabra.

En ausencia del tratamiento peptídico, la RAF-1, una quinasa que se sabe que se asocia y se inactiva por asociación con V7, coprecipitó con V7. en células tratadas con el péptido, se eliminó la proteína RAF-1 del inmunocomplejo V7. El mismo tratamiento peptídico no destruyó un complejo que consta de RAF-1 y p21 Ras, descartando cualquier modificación no específica de RAF-1 mediante los péptidos V7. Estos resultados mostraron que un péptido V7 de la región de cola citoplásmica, cuando se conjuga a un péptido que mejora el transporte membránico de la presente invención, entra a una célula diana y se asocia específicamente con una molécula efectora fisiológica, RAF-1. Tal asociación se puede usar para interrumpir procesos intracelulares.

En un segundo conjunto de estudios, se fosforiló in vitro la porción V7 del conjugado usando proteína quinasa C. Precipitados anti-RAF-1 de células T que se habían expuesto a los péptidos de cola V7 fosforilados, pero no al péptido de cola V7 sin fosforilar, demostraron una potente inhibición de actividad de RAF-quinasa. Estos estudios demuestran dos principios. En primer lugar, los polímeros transportadores de la invención pueden efectuar el transporte de una molécula muy cargada (fosforilada) a través de la membrana celular. En segundo lugar, aunque tanto los péptidos de cola V7 fosforilados como no fosforilados se pueden unir a RAF-1, sólo el péptido fosforilado modificó la actividad de RAF-1 quinasa.

VI. Procedimiento de ensayo para la detección sistemática y librería

En otra realización, la invención se puede usar para detectar sistemáticamente uno o más conjugados en busca de una actividad biológica seleccionada, en la que el conjugado o conjugados se forman a partir de uno o más agentes candidatos. El conjugado o conjugados se ponen en contacto con una célula que muestra una señal detectable con la captación del conjugado en la célula, de forma que la magnitud de la señal es indicadora de la eficacia del conjugado con respecto a la actividad biológica seleccionada.

Una ventaja de esta realización es que es particularmente útil para ensayar las actividades de agentes que por sí mismos son incapaces o muy poco capaces de penetrar en las células para manifestar actividad biológica. De este modo, la invención proporciona una forma particularmente eficaz de identificar agentes activos que de otro modo pueden no ser accesibles a través de programas de detección sistemática a gran escala, debido a la falta de una vía eficaz y conveniente para transportar los agentes al interior de la célula o de los orgánulos.

Preferiblemente, el agente o más de un agente candidato se proporcionan como una librería combinatoria de conjugados que se preparan usando cualquiera de un gran número de procedimientos sintéticos combinatorios conocidos en la técnica. Por ejemplo, Thompson y Ellman (1986) reconocieron al menos cinco enfoques generales diferentes para preparar librerías conminatorias sobre soportes sólidos, a saber, (1) la síntesis de compuestos discretos, (2) la síntesis de desdoblamiento (desdoblamiento y reagrupamiento), (3) desconjunción de librerías solubles, (4) determinación estructural mediante procedimientos analíticos, y (5) estrategias de codificación en las que las composiciones químicas de los candidatos activos se determinan mediante marcadores únicos, tras un ensayo positivo en busca de la actividad biológica en el ensayo. La síntesis de librerías en disolución incluye al menos (1) las síntesis espacialmente separadas y (2) las síntesis de conjuntos (Thompson, más arriba). En Lam y col (1997) se puede encontrar una descripción adicional de los procedimientos sintéticos conminatorios, referencia a la cual describe particularmente el enfoque de una perla un compuesto, para preparar conjugados según la presente invención.

Estos enfoques se adaptan fácilmente para preparar conjugados según la presente invención, incluyendo esquemas de protección adecuados según sea necesario. Por ejemplo, para una librería que se construye en uno o más soportes sólidos, se puede unir un resto transportador al soporte o soportes primeramente, seguido de la construcción o anexión de agentes candidatos combinatoriamente sobre los polímeros mediante funcionalidades reactivas adecuadas. En un ejemplo alternativo, primero se forma una librería combinatoria de agentes sobre uno o más soportes sólidos, seguido de la anexión a un polímero transportador para cada agente candidato inmovilizado. Se pueden usar enfoques similares o diferentes para la síntesis en fase en disolución. Las librerías formadas sobre un soporte sólido se rompen preferiblemente del soporte mediante un grupo enlace rompible por procedimientos conocidos (Thompson y col., y Lam y col.).

El candidato o más de un candidato conjugado se puede ensayar con cualquiera de un número de ensayos a base de células que provocan señales detectables en proporción a la eficacia del conjugado. De forma conveniente, los candidatos se incuban con células en placas de múltiples pocillos, y los efectos biológicos se miden mediante una señal (por ejemplo, fluorescencia, reflectancia, absorción o quimioluminiscencia) que se puede cuantificar usando un lector de placas. Como alternativa, se pueden eliminar las mezclas de incubación de los pocillos para un procesamiento y/o análisis posterior. Entonces se determinan las estructuras de los compuestos activos y opcionalmente inactivos, si no se conocen ya, y esta información se puede usar para identificar compuestos y para centrar posteriormente la síntesis y los esfuerzos de la detección sistemática.

Por ejemplo, el ensayo de secreción de gamma-interferón detallado en el Ejemplo 11 se adapta fácilmente a un formato de múltiples pocillos, de forma que se pueden detectar inhibidores activos de la secreción mediante detección de fluorescencia basada en europio usando un lector de placas. Los agentes anticancerígenos se pueden detectar sistemáticamente usando estirpes celulares de cáncer ya conocidas (por ejemplo, proporcionadas por National Institute of Health (NIH) y el National Cancer Institute (NCI)). Los efectos citotóxicos de los agentes contra el cáncer se pueden determinar mediante exclusión con colorante tripán, por ejemplo.

Otros ejemplos incluyen ensayos dirigidos a inhibir la señalización celular, tal como la inhibición del receptor de IL-4; ensayos para bloquear la proliferación celular; y ensayos para la expresión génica. En un ensayo típico para la expresión génica, se coloca un gen de interés bajo el control de un promotor adecuado y es seguido en la dirección 3' mediante un gen para producir un especie informadora tal como \beta-galactosidasa o luciferaza de luciérnaga. Se puede detectar un efecto inhibidor basándose en una disminución en la señal informadora.

La invención también incluye una librería de conjugados que es útil para la detección sistemática en el procedimiento anterior. La librería incluye una pluralidad de agentes candidatos para una o más actividades biológicas seleccionadas, cada uno de los cuales está conjugado a al menos un polímero transportador según la invención. Preferiblemente la librería de conjugados es una librería combinatoria. En otra realización, la invención incluye una batería regular de distintos conjugados de polímero/agente distribuidos en una pluralidad indexada o indexable de pocillos para muestras, para ensayar e identificar agentes activos de interés.

VII. Utilidad

Las composiciones y procedimientos de la presente invención tienen utilidad particular en el área de compuestos terapéuticos para seres humanos y para veterinaria. Generalmente, las dosis administradas serán eficaces para suministrar concentraciones picomolares a micromolares de la composición terapéutica al sitio efector. Las dosis y concentraciones apropiadas dependerán de factores tales como la composición terapéutica o el fármaco, el sitio de administración pretendido, y la ruta de administración, todos los cuales se pueden derivar empíricamente según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se pueden obtener guías adicionales a partir de estudios usando modelos de animales experimentales para evaluar la dosis, según se conocen en la técnica.

La administración de los compuestos de la invención con un excipiente farmacéutico adecuado según sea necesario se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los modos de administración aceptados. De este modo, la administración se puede realizar, por ejemplo, de forma intravenosa, tópica, subcutánea, transcutánea, intramuscular, oral, intraarticular, parenteral, peritoneal, intranasal, o mediante inhalación. Las formulaciones pueden tomar la forma de un polvo sólido, semisólido, liofilizado, o formas de dosificación líquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, disoluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, ungüentos, lociones, aerosoles o similares, preferiblemente en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración simple de dosis precisas.

Las composiciones incluyen típicamente un vehículo o excipiente farmacéutico convencional, y pueden incluir adicionalmente otros agentes médicos, vehículos, coadyuvantes, y similares. Preferiblemente, la composición será alrededor de 5% hasta 75% en peso de un compuesto o compuestos de la invención, constando el resto de excipientes farmacéuticos adecuados. Los excipientes apropiados se pueden ajustar a la medida para la composición particular y la vía de administración mediante procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, Gennaro, 1990).

Para la administración oral, tales excipientes incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. La composición puede tomar la forma de una disolución, suspensión, comprimido, pastilla, cápsula, polvo, formulación de liberación sostenida, y similar.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas tienen la forma de una pastilla, comprimido o cápsula, y de este modo la composición puede contener, junto con el conjugado biológicamente activo, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico, y similar; un disgregante tal como almidón o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similar; y un aglutinante tal como almidón, goma arábiga, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y derivados del mismo.

Los compuestos activos de las fórmulas se pueden formular en un supositorio que comprende, por ejemplo, alrededor de 0,5% hasta alrededor de 50% de un compuesto de la invención, dispuesto en un vehículo de polietilenglicol (PRG) (por ejemplo, PEG 1000 [96%] y PEG 4000 [4%]).

Las composiciones líquidas se pueden preparar disolviendo o dispersando el compuesto (alrededor de 0,5% hasta alrededor de 20%) y coadyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como, por ejemplo, disolución salina acuosa (por ejemplo, cloruro de sodio al 0,9% p/v), dextrosa acuosa, glicerol, etanol, y similares, para formar una disolución o suspensión, por ejemplo para administración intravenosa. Los compuestos activos también se pueden formular en un enema de retención.

Si se desea, la composición a administrar también puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán u oleato de trietanolamina.

Para la administración tópica, la composición se administra en cualquier formato adecuado, tal como una loción o un parche transdérmico. Para el suministro mediante inhalación, la composición se puede suministrar como un polvo seco (por ejemplo, Inhale Therapeutics) o en forma líquida vía un nebulizador.

Los procedimientos para preparar tales formas de dosificación son conocidos o serán manifiestos para los expertos en la técnica; véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). La composición a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad del profármaco y/o del compuesto o compuestos activos en una cantidad farmacéuticamente efectiva para aliviar el estado tratado cuando se administra según las enseñanzas de esta invención.

Generalmente, los compuestos de la invención se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, una dosis suficiente para efectuar el tratamiento, que variará dependiendo del sujeto y del estado a tratar. Típicamente, una dosis diaria terapéuticamente efectiva es de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal por día de fármaco. La mayoría de los estados responden a la administración de una dosis total de entre alrededor de 1 y alrededor de 30 mg/kg de peso corporal por día, o entre alrededor de 70 mg y 2100 mg por día para una persona de 70 kg.

La estabilidad del conjugado se puede controlar adicionalmente mediante la composición y la estereoquímica de la cadena principal y cadenas laterales del polímero. Para polímeros polipeptídicos, los isómeros D son generalmente resistentes a proteasas endógenas, y por lo tanto tienen semividas más prolongadas en el suero y en las células. Los polímeros D-polipeptídicos son por lo tanto apreciados cuando se desea una duración más prolongada de la acción. Los polímeros L-polipeptídicos tienen semividas más cortas debido a su susceptibilidad a proteasas, y por lo tanto se escogen para dar efectos más cortos de actuación. Esto permite que se prevengan efecto secundarios más fácilmente retirando la terapia tan pronto como se observan los efectos secundarios. Los polipéptidos que comprenden mezclas de restos D y L tienen estabilidades intermedias. Generalmente se prefieren los homo-D-polímeros.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención.

Ejemplo 1 Síntesis de péptidos

Los péptidos se sintetizaron usando técnicas de fase sólida en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems usando la química FastMOC™ y resinas Wang comercialmente disponibles y aminoácidos protegidos Fmoc, según procedimientos bien conocidos en la técnica (Bonifaci). Los péptidos se purificaron usando columnas de HPLC de fase inversa C4 o C18, y sus estructuras se confirmaron usando análisis de aminoácidos y espectrometría de masas.

Ejemplo 2 Ensayos de fluorescencia

Se sintetizaron péptidos fluorescentes mediante modificación del término amino del péptido con ácido aminocaproico seguido de reacción con isotiocianato de fluoresceína en presencia de hexafluorofosfato de (2-1H-benzotiazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio/N-hidroxi-benzotriazol disuelto en N-metil-pirrolidona. Los productos se purificaron mediante filtración en gel.

Las suspensiones celulares (10^{6}/ml) se incubaron durante tiempos variables, a 37ºC, 23ºC, o 4ºC, con un intervalo de concentraciones de péptidos o conjugados en PBS pH 7,2 que contiene 2% de suero fetal de ternero (PBS/FCS) en placas de 96 pocillos. Tras una incubación de 15 minutos, las células se peletizaron mediante centrifugación, se lavaron tres veces con PBS/FCS que contiene 1% de azida de sodio, se incubaron con tripsina/EDTA (Gibco) a 37ºC durante cinco minutos, después se lavaron dos veces más con PBS/FCS/NaN. Las células peletizadas se resuspendieron en PBS que contiene 2% de FCS y 0,1% de yoduro de propidio, y se analizaron en un FACScan (Becton Dickenson, Mountain View, CA). Las células positivas para el yoduro de propidio se excluyeron del análisis. Para el análisis de polímeros de arginina, se redujo el voltaje del fotomultiplicador en un orden de magnitud tal para permitir una medida más exacta.

Ejemplo 3 Péptido básico tat frente a péptidos de poli-Arg

Se midieron los niveles de captación de los siguientes péptidos mediante el procedimiento en el Ejemplo 2: (1) un polipéptido que comprende restos tat 49-57 de VIH (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg = SEQ ID NO: 1), (2) un nonámero de restos de L-Lys (K9, SEQ ID NO: 2), y (3) homo-L u homopolipéptidos que contienen cuatro a nueve restos Arg (SEQ ID NO: 3-8 y 12-17). Los resultados se muestran en las Figs. 2A-2C.

Ejemplo 4 Microscopia confocal de células

Se prepararon células incubadas con péptidos de poliarginina fluorescentes según se describe anteriormente para ensayos de unión, y se analizaron en la Instalación de Toma de Imágenes de Ciencias de la Célula (Stanford University, CA), usando un microscopio confocal de láser de barrido, de un solo haz, con una longitud de excitación de 488 nm (láser de ion de argón), y una anchura de banda de emisión de 510-550 usando un filtro de paso de banda. Los conjugados (6,25 \muM) que contienen tat(49-57), R7, o r7 acoplados a fluoresceína se incubaron en células Jurkat a 37ºC durante 10 minutos. Las figs. 2A-2F muestran los resultados para la fluorescencia emitida (figs. 2A-2C) y la luz transmitida (2D-2F) para tat(49-57) (figs. 2A y 2C), R7 (figs. 2B y 2E), y r7 (figs. 2C y 2F).

Ejemplo 5 Estudios de intervalo de longitud

Los siguientes homopolímeros de poliarginina se ensayaron mediante el ensayo de fluorescencia en el Ejemplo 2, con incubación a 37ºC durante 15 minutos antes de peletizar a las células: r9, R9, R15, R20, R25 y R30. Además, también se ensayó una mezcla de polímeros de L-arginina que tienen un peso molecular medio de 12.000 daltons (aproximadamente 100 aminoácidos) (Sigma Chem. Co.) después de ser marcada con isotiocianato de fluoresceína y purificada por filtración en gel ("SEPHADEX" G-25). Las células se analizaron mediante FACS, y se midió la fluorescencia media de las células vivas. También se midió la citotoxicidad de cada conjugado calculando el porcentaje de células que se tiñeron con yoduro de propidio, que es característico de la muerte celular. Los resultados de la captación para los conjugados r9, R9, R15, R20 y R25 se muestran en la fig. 3.

La poliarginina comercialmente disponible (peso molecular = 12.000) precipitó proteínas en el suero, lo más probable glicoproteína ácida. Por lo tanto, el nivel de suero fetal de ternero se redujo diez veces en el ensayo para conjugados preparados a partir de este material.

La composición de poli-Arg de Pm 12.000 fue tóxica a concentraciones de 800 nM hasta 50 \muM, y está excluida de la fig. 3. Los conjugados de poli-L-Arg que contienen 20 restos o más de arginina fueron tóxicos a concentraciones mayores que 12 \muM, de forma que la toxicidad aumenta con la longitud.

Ejemplo 6 Cinética de la captación

Para medir los parámetros Vmax y Km de la captación celular, se usó el procedimiento de ensayo del ejemplo 2, con las siguientes modificaciones. Los péptidos se incubaron con células durante 0,5, 1, 2 y 4 minutos a 4ºC por triplicado, en 50 \mul de PBS/FCS en placas de 96 pocillos. Al final de la incubación, la reacción se detuvo rápidamente diluyendo las muestras en 5 ml de PBS/FCS, centrifugando y lavando una vez con PBS/FCS, tripsina/EDTA, y finalmente de nuevo con PBS/FCS, y recogiendo los peletes en PBS/FCS que contiene yoduro de propidio para análisis en un FACScan. Los datos de FACS se ajustaron a la ecuación de Lineweaver-Burk para la cinética de Michaelis-Menten. Los datos de la cinética para los conjugados fluorescentes de tat(49-57), R9, y r9 se muestran en la Tabla 1 antes.

Ejemplo 7 Efectos inhibidores metabólicos sobre el transporte

Se incubaron células en suspensión (10^{6}/ml) durante 30 minutos con azida de sodio al 0,5% en PBS que contiene 2% de FCS. Al final de la incubación, se añadieron los péptidos fluorescentes (tat(49-57), R7, R8, o R9) a una concentración final de 12,5 \muM. Tras la incubación durante 30 minutos, las células se lavaron como en el Ejemplo 2, excepto que todos los tampones de lavado contenían azida de sodio al 0,1%. Los resultados se muestran en la fig. 5.

Ejemplo 8 Transporte en células bacterianas

Se hicieron crecer bacterias gram-negativas (cepa HB101 de E. coli) y bacterias gram-positivas (Strep. bovis) en medios apropiados en fase logarítmica. Los cultivos celulares (4 x 10^{8} por ml) se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con concentraciones variables de conjugados fluorescentes que contienen polímeros lineales de L-arginina (R4 a R9), D-arginina (r4 a r9), o L-lisina (K9), a concentraciones del conjugado de 3 hasta 50 \muM. Las células se lavaron y se recogieron en yoduro de propidio que contiene PBS (para distinguir las células muertas), y se analizaron mediante FACS y microscopia de fluorescencia. Los resultados se muestran en las figs. 5A-5C, según se explica antes.

Ejemplo 9 Conjugados con grupos enlaces rompibles ejemplares A. Conjugado de disulfuro de cisteína con mercaptopurina A1. Activación con tiol

Se disolvió N-acetil-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO_{2}H (12,2 mg, 0,0083 mmoles) en 3 ml de AcOH:H_{2}O 3:1, con agitación a temperatura ambiente. A esta disolución se añadió ditio-bis(5-nitropiridina) (DTPN) (12,9 mg, 0,0415 mmoles, 5 equiv.). La disolución se dejó agitar durante 24 h a temperatura ambiente, tras lo cual la mezcla tomó un color amarillo brillante. El disolvente se eliminó a vacío, y el residuo se redisolvió en 5 ml de H_{2}O, y se extrajo 3 veces con acetato de etilo para eliminar el exceso de DTPN. La capa acuosa se liofilizó, y el producto se usó sin purificación adicional.

A2. Unión del fármaco

Se disolvió N-acetil-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO_{2}H (0,0083 mmoles) en 1 ml de H_{2}O desgasificada (pH = 5) en argón a temperatura ambiente, con agitación. Se añadió 6-mercaptopurina (1,42 mg, 0,0083 mmoles, 1 eq.) en 0,5 ml de DMF a la mezcla. La reacción se dejó agitar durante 18 h en atmósfera inerte a temperatura ambiente. Después de 18 h, se observó un color amarillo, indicando la presencia de5-nitro-2-tiopiridina libre. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó mediante HPLC, proporcionando el producto deseado (I, fig. 6A) con un rendimiento global de 50%.

B. Conjugado de Taxol fotorrompible

Se disolvió ácido 3-nitro-4-(bromometil)benzoico (100 mg, 0,384 mmoles) en metanol anhidro (5 ml) en una atmósfera de nitrógeno. A esta disolución se añadió metóxido de sodio (88 \mul, 25% (p/p) en metanol, 0,384 mmoles, 1 eq.) seguido de la adición de 6-mercaptopurina (58,2 mg, 0,384 mmoles, 1 eq.). La mezcla se calentó hasta reflujo, y se dejó agitar durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió entonces, se filtró, y se paralizó por acidificación con HCl 6N. El volumen de reacción se redujo entonces hasta la mitad, en cuyo momento el producto precipitó y se recogió por filtración. El residuo se redisolvió en metanol, se filtró (si es necesario), y se concentró a presión reducida para proporcionar el sulfuro deseado (II, fig. 6B) con un rendimiento del 50% como un sólido pulverulento amarillo.

C. Conjugado de Taxol rompible con fosfato

C1. A una suspensión de ácido o-hidroxifenilacético (15,0 g, 0,099 moles) en H_{2}O (39 ml) a 0ºC se añadió una disolución de ácido nítrico (12 ml de 65% en 8 ml de H_{2}O) lentamente mediante una pipeta. La disolución se agitó durante 1,5 h adicionales, a 0ºC. La mezcla se calentó entonces hasta temperatura ambiente, y se dejó agitar durante 0,5 h adicionales. La disolución heterogénea se vertió sobre hielo (10 g) y se filtró para eliminar el isómero orto-nitro insoluble. La disolución rojiza se concentró a presión reducida, y el residuo espeso se redisolvió en HCl 6N y se filtró a través de celita. El disolvente se eliminó nuevamente a presión reducida para proporcionar el ácido 2-hidroxi-4-nitro-fenilacético deseado como un sólido claro, rojo marrón (rendimiento 40%). El producto (IV-a) se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

C2. Se disolvió el producto IV-a (765 mg, 3,88 mmoles) en THF recientemente destilado (5 ml) en atmósfera de argón. La disolución se enfrió hasta 0ºC, y se añadió gota a gota borano-THF (1,0 M en THF, 9,7 ml, 9,7 mmoles, 2,5 eq.) mediante una jeringuilla, con evolución aparente de hidrógeno. La reacción se dejó agitar durante 16 h adicionales, calentando lentamente hasta temperatura ambiente. La reacción se paralizó mediante adición lenta de HCl 1M (con burbujeo violento), y 10 ml de acetato de etilo. La capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo cinco veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, y se secaron sobre sulfato de magnesio. El disolvente se evaporó a vacío, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna rápida (hexano:acetato de etilo 1:1) para proporcionar el nitroalcohol deseado (IV-b) como un sólido amarillo pálido (rendimiento 85%).

C3. Se disolvió el nitroalcohol (IV-b) (150 mg, 0,819 mmoles) en DMF seca (5 ml) que contiene dicarbonato de di-t-butilo (190 mg, 1,05 eq.) y Pd al 10% sobre C (10 mg). La mezcla se colocó en un aparato Parr, y se sometió a presión/se purgó cinco veces. La disolución se sometió a presión entonces hasta 47 psi, y se dejó agitar durante 24 h. La reacción se paralizó mediante filtración a través de celita, y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano:acetato de etilo 1:1) para proporcionar el producto de anilina protegido (IV-c) como un sólido cristalino con un rendimiento de 70%.

C4. Se disolvió TBDMS-C1 (48 mg, 0,316 mmoles) en diclorometano recientemente destilado (4 ml) en una atmósfera de argón. A esta disolución se añadió imidazol (24 mg, 0,347 mmoles, 1,1 eq.) e inmediatamente se formó un precipitado blanco. La disolución se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, en cuyo momento se añadió rápidamente el producto IV-c (80 mg, 0,316 mmoles, 1.0 eq) como una disolución en diclorometano/THF (1,0 ml). La mezcla resultante se dejó agitar durante 18 h adicionales, a temperatura ambiente. La reacción se paralizó por adición de cloruro de amonio saturado acuoso. Las capas se separaron, y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio. La fase orgánica se concentró para proporcionar el producto de silil-éter-fenol (IV-d) como un aceite amarillo pálido (rendimiento de 90%).

C5. Se disolvió el silil-éter-fenol IV-d (150 mg, 0,408 mmoles) en THF recientemente destilado (7 ml) en argón, y la disolución se enfrió hasta 0ºC. Entonces se añadió gota a gota n-BuLi (2,3 M en hexano, 214 ul) mediante una jeringuilla. Se observó inmediatamente un cambio de color de amarillo pálido a rojo intenso. Después de 5 minutos, se añadió rápidamente pirofosfato de tetrabencilo (242 mg, 0,45 mmoles, 1,1 eq) a la disolución en agitación con argón. La disolución se agitó durante 18 h adicionales en atmósfera inerte, calentando lentamente hasta temperatura ambiente, durante lo cual se formó un precipitado blanco. La reacción se paralizó por adición de cloruro de amonio saturado acuoso, y 10 ml de acetato de etilo. Se separaron las capas, y la capa acuosa se extrajo cinco veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, y se secaron sobre sulfato de magnesio. El disolvente se eliminó por evaporación, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna rápida (hexano:acetato de etilo 1:1) para proporcionar el éter de silil-fosfato deseado (IV-e) como un aceite naranja pálido (rendimiento de 90%).

C6. Se disolvió el éter de silil-fosfato (IV-e) (10 mg, 0,0159 mmoles) en 2 ml de etanol seco a temperatura ambiente. A la disolución agitada se añadió 20 ul de HCl concentrado (disolución 1% v:v), y la mezcla se dejó agitar hasta que el análisis de TLC indicó que la reacción estuvo terminada. Se añadió carbonato de potasio sólido para paralizar la reacción, y la mezcla se filtró rápidamente a través de gel de sílice, y se concentró para dar el producto de alcohol/fosfato de dibencilo bruto (IV-f) como un aceite amarillo pálido (rendimiento de 100%).

C7. Se disolvió el alcohol IV-f (78 mg, 0,152 mmoles) en diclorometano recientemente destilado (10 ml) en una atmósfera de argón. A la disolución se añadió peryodinano de Dess-Martin (90 mg, 0,213 mmoles, 1,4 eq). La disolución se dejó agitar, y el transcurso de la reacción se monitorizó mediante análisis de TLC. Una vez que la TCL indicó que se había terminado la reacción, ésta se paralizó mediante adición de bicarbonato de sodio acuoso saturado:tiosulfito de sodio acuoso saturado 1:1. La mezcla bifásica se dejó agitar durante 1 h a temperatura ambiente. Se separaron las capas, y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio. El disolvente se eliminó a presión reducida para proporcionar el producto aldehídico (IV-g) como un aceite bronceado pálido (rendimiento de 100%).

C8. Se disolvió el aldehído IV-g (78 mg, 0,152 mmoles) en t-butanol/agua (3,5 ml) en una atmósfera inerte. A la disolución en agitación se añadió rápidamente 2-metil-2-buteno (1,0 M en THF, 1,5 ml), fosfato monobásico de sodio (105 mg, 0,76 mmoles, 5 eq) y clorito de sodio (69 mg, 0,76 mmoles, 5 eq). Se dejó que la disolución se agitara durante 8 horas adicionales a temperatura ambiente. La disolución se concentró, y el residuo se acidificó y se extrajo con acetato de etilo 3 veces. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio. La disolución se concentró nuevamente a presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo:hexano 2:1) para dar el ácido carboxílico/fosfato de dibencilo (IV-h) deseado como un aceite amarillo pálido (rendimiento 65%).

C9. Se disolvió el ácido IV-h (8,0 mg, 0,0512 mmoles, 1,1 eq) en diclorometano recientemente destilado (2 ml) en argón a temperatura ambiente. A esta mezcla se añadió paclitaxel (12 mg, 0,0138 mmoles, 1 eq), seguido de DMAP (2 mg, 0,0138 mmoles, 1 eq) y DCC (3,2 mg, 0,0152 mmoles, 1,1 eq). La mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante 4 h adicionales, durante las cuales se formó un precipitado pálido. Una vez que el análisis de TLC indicó que la reacción estaba completa, se eliminó el disolvente a presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna rápida (hexano:acetato de etilo 1:1) para proporcionar éster de carboxilato C2' de paclitaxel (IV-i) como un sólido blanco cristalino (rendimiento 65%).

C10. El éster IV-i (5,0 mg) se disolvió en ácido fórmico puro (1,0 ml) en atmósfera de argón, a temperatura ambiente, y se dejó agitar durante 30 minutos. Una vez que la TLC indicó que la reacción estaba terminada, la disolución se concentró a presión reducida, y el residuo se purificó mediante filtración rápida a través de gel de sílice, para dar el compuesto de anilina/taxol (IV-j) deseado con un rendimiento de 50% como un polvo blanco.

C11. A una disolución de AcHN-RRRRRRR-CO2H protegido con (poli-di-CBZ) (1,2 eq, 0,1 a 1,0 M) en DMF seca se añadió hexafluorofosfato de O-benzotriazoliloxitetrametil-uronio (HATU, 1,0 eq), y una cantidad catalítica de DMAP (0,2 eq). La disolución se agitó en atmósfera inerte durante 5 minutos, a temperatura ambiente. A esta mezcla se añadió entonces el derivado de Taxol/anilina (IV-j) como una disolución en DMF seca (volumen mínimo para disolver). La disolución resultante se agitó durante 5 h adicionales, a temperatura ambiente. La reacción se terminó concentrando la mezcla de reacción a presión reducida. La mezcla de reacción bruta se purificó entonces mediante HPLC para proporcionar el material deseado (IV, fig. 6D).

Ejemplo 10 Transporte de iones metálicos

Se disolvieron 3,93 g de DTPA en 100 ml de HEPES, y se añadieron 1,52 ml de disolución atómica estándar de cloruro de europio (Aldrich) disuelta en 8 ml de tampón HEPES, y se ajustó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La separación cromatográfica y la liofilización da un complejo de quelato de Eu-DTPA. Este complejo se conjuga entonces al término amino de un polipéptido mediante química de péptidos en fase sólida. La captación celular del ion europio se puede monitorizar mediante fluorescencia de tiempo fijado.

Ejemplo 11 Captación de conjugados de PNA/péptidos

Los conjugados de PNA con péptidos se sintetizaron usando química de fase sólida con reactivos Fmoc comercialmente disponibles (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 433A o en un sistema sintetizador de ácidos nucleicos Millipore Expedite. Los polímeros de D- o L-arginina se unieron a los términos amino o carboxilo de los PNA, que son análogos a los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos, respectivamente. Los conjugados también se modificaron para incluir fluoresceína o biotina, añadiendo un espaciador de ácido aminocaproico al término amino del conjugado, y después uniendo biotina o fluoresceína. Lo conjugados de PNA/péptidos se rompieron de la resina en fase sólida usando TFA al 95%, triisopropilsilano al 2,5%, y fenol acuoso al 2,5%. La resina se eliminó por filtración, y el ácido residual se eliminó por evaporación. El producto se purificó mediante HPLC usando una columna de fase inversa C18, y el producto se liofilizó. Los conjugados deseados de PNA/polímero se identificaron usando espectrometría de masas por desorción con láser.

A. Inhibición de la secreción celular de gamma-IFN

1. Conjugados de PNA/péptido. Se prepararon los siguientes conjugados de PNA sentido y antisentido/péptidos para inhibir la producción de gamma-IFN, en los que r = D-arginina y R = L-arginina:

Sentido:

NH_{2}-rrrrrrr-AACGCTACAC-COOH

(SEQ ID NO:18)

Antisentido:

NH_{2}-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH

(SEQ ID NO:19)

Antisentido fluorescente:

X-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH

(X-SEQ ID NO:19)

en la que X=fluoresceína/aminocaproato

Antisentido biotinilado:

Z-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH

(Z-SEQ ID NO:19)

en la que Z=biotina/aminocaproato

2. Captación por células T. Para mostrar que los conjugados de PNA/poliarginina entran en las células de forma efectiva, se sintetizó el conjugado antisentido fluorescente anterior (X-SEQ ID NO:19), conjugando isotiocianato de fluoresceína al término amino de SEQ ID NO:18, usando un espaciador de ácido aminocaproico.

La captación celular se determinó incubando la estirpe de células T humanas Jurkat (5 x 10^{5} células/pocillo) pretratadas durante 30 minutos con azida de sodio al 0,5% o disolución salina tamponada con fosfato, con cantidades variables (100 nM hasta 50 \muM) del conjugado de PNA sentido y antisentido con r7, marcado con fluoresceína, así como el PNA antisentido solo (sin el segmento r7). La cantidad de Pna antisentido que entró a las células se analizó mediante microscopia confocal y FACS. En ambos casos, las señales fluorescentes estaban presentes sólo en células no expuestas a azida, y la señal fluorescente dependió de la dosis del conjugado fluorescente y de la temperatura y duración de incubación.

3. Ensayo de gamma-IFN. Se midió la cantidad de gamma-interferón segregada por la estirpe de célula T de múrido (clon 11,3), incubando 10^{5} células T con cantidades variables de antígeno (péptido que consta de restos 110-121 de mioglobina de esperma de ballena) y células de bazo histocompatibles procedentes de ratones DBA/2 (H-2d, 5 x 10^{5}), que actúan como células que presentan antígeno (APC), en placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante 24 horas a 37ºC, se transfirieron 100 \mul de los sobrenadantes a placas de microtitulación revestidas con anticuerpos monoclonales anti-gamma-IFN comercialmente disponibles (Mab) (Pharmigen, San Diego, CA). Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron con PBS que contiene suero fetal de ternero al 1% y Tween 20 al 0,1%, después de lo cual se añadió un segundo Mab gamma-IFN biotinilado. Después de una segunda hora de incubación, las placas se lavaron como antes, y se añadió europio (Eu)-estreptavidina (Delphia-Pharmacia). Nuevamente, después de una hora de incubación, se añadió un tampón ácido para liberar el Eu, que se midió mediante fluorometría de tiempo fijado, en un lector de placas Delphia. La cantidad de fluorescencia fue proporcional a la cantidad de gamma-IFN que se había producido, y se pudo cuantificar de forma precisa usando cantidades conocidas de gamma-IFN para crear una curva estándar.

4. Inhibición de la producción de gamma-IFN mediante los conjugados. Se analizó la capacidad de los conjugados de PNA/poliarginina para inhibir la secreción de gamma-IFN, añadiendo diversas concentraciones de los conjugados anteriores de gamma-IFN con dosis por debajo de las óptimas de antígeno peptídico (0,5 \muM), a una mezcla de células T de clon 11.3 y células de bazo histocompatibles. También se ensayaron las secuencias de PNA que carecen de los restos de poliarginina, y el heptámero de D-arginina no conjugado.

Después de 24 horas, se tomaron alícuotas de los sobrenadantes cultivados, y se midió la cantidad de gamma-IFN usando el ensayo de unión al fluorescente descrito en la sección 3 anterior. El tratamiento de las células con el conjugado de PNA antisentido/r7 dio como resultado una reducción de alrededor de 70% en la secreción de IFN, mientras que cantidades molares equivalentes de PNA sentido/r7, PNA antisentido que carece de r7, o r7 solo, no mostraron ninguna inhibición (fig. 7).

Ejemplo 12 Transporte de antígeno proteínico grande en APC

Se formó un conjugado de ovoalbúmina acoplado a un heptámero de poli-L-arginina haciendo reaccionar un polímero polipeptídico que contiene citeína (Cys-Ala-Ala-Ala-Arg_{7}, SEQ ID NO:21) con ovoalbúmina (45 kDa) en presencia de sulfo-MBS, un agente reticulante heterobifuncional (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). La relación molar de péptido conjugado a ovoalbúmina se cuantificó mediante análisis de aminoácidos. El producto conjugado se denominó OV-R7. El conjugado se añadió (concentración final \approx 10 \muM) a las células B, también denominadas como células que presentan antígenos (APC), que se aislaron según procedimientos estándar. Las APC se incubaron con OV-R7, y después se añadieron a una preparación de linfocitos T citotóxicos aislados mediante procedimientos estándar. La exposición de los CTL a las APC que se habían incubado con OV-R7 produjo CTL específicos para albúmina CD8+. Por el contrario, las APC que se habían expuesto a ovoalbúmina sin modificar no estimularon los CTL.

En otro experimento, se expusieron células dendríticas histocompatibles (un tipo específico de APC) a conjugados de albúmina/R7, y después se inyectaron en ratones. El análisis subsiguiente de la sangre procedente de estos ratones reveló la presencia de CTL específicos de albúmina. A los ratones del control se les dio células dendríticas que se habían expuesto a albúmina sin modificar. Los ratones del control no mostraron la respuesta de CTL específica para albúmina.

Ejemplo 13 Mejora de la captación de péptido derivado de V7

Se sintetizó un conjugado que consta de una parte de la región de cola citoplásmica C terminal de V7 (una proteína de la superficie de leucocitos), que tiene la secuencia KLSTLRSNT (SEQ ID NO:22; Ruegg y col., 1995), con 7 restos de arginina unidos a su término C según procedimiento estándar usando un sintetizador de péptidos (Applied Biosystems modelo 433). El conjugado se añadió (concentración final \approx 10 \muM) a células T que se habían aislado mediante procedimientos estándar, y se incubó a 37ºC durante varias horas toda la noche. Las células se lisaron usando detergente (Triton X-100 al 1%). Se eliminó el ADN, y la fracción soluble (que contiene la proteína) se sometió a inmunoprecipitación con un anticuerpo monoclonal de múrido anti-V7 en combinación con IgG antirratón de cabra. La RAF-1 es una quinasa que se asocia con, y se inactiva por asociación con, V7.

En ausencia de tratamiento peptídico, la proteína RAF-1 coprecipitó con V7. En células tratadas con el péptido, la proteína RAF-1 se eliminó del inmunocomplejo V7. Los mismos péptidos fueron incapaces de interrumpir el complejo que consta de RAF-1 y p21 Ras, excluyendo la modificación no específica de RAF-1 por el péptido V7.

En un segundo estudio, la porción del péptido V7 del conjugado de V7/poliarginina se fosforiló in vitro usando proteína quinasa C. Los precipitados anti-RAF 1 de células T que habían sido expuestas a péptidos de cola de V7 fosforilados, pero no al péptido de cola V7 sin fosforilar, demostraron inhibición potente de la actividad de RAF-quinasa.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a procedimientos y realizaciones específicos, será notorio que se pueden realizar diversas modificaciones y cambios.

Claims (41)

1. Conjugado compuesto por un agente biológicamente activo unido covalentemente a un soporte polimérico que tiene una cadena principal no peptídica, en el que el soporte polimérico (a) consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal, (b) contiene al menos seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y (c) es efectivo para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo que es transportada a través de una membrana biológica con relación a la cantidad del agente que se puede transportar a través de la membrana biológica en forma no conjugada.

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el soporte polimérico es efectivo para aumentar la cantidad del agente biológicamente activo que es transportado a través de un membrana biológica en al menos dos veces, opcionalmente en al menos seis veces, con relación a la cantidad del agente que se puede transportar a través de la membrana biológica cuando el agente está conjugado a un péptido tat básico de VIH que consta de restos 49-57.

3. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el soporte polimérico es también efectivo para aumentar la velocidad a la que el agente biológicamente activo es transportado a través de una membrana biológica con relación a la velocidad a la que el agente se puede transportar a través de la membrana biológica en forma no conjugada.

4. Conjugado según la reivindicación 3, en el que el soporte polimérico es efectivo para aumentar la velocidad a la que el agente biológicamente activo es transportado a través de una membrana biológica en al menos dos veces, opcionalmente en al menos seis veces, con relación a la velocidad a la que el agente se puede transportar a través de la membrana biológica cuando el agente está conjugado a un péptido tat básico de VIH que consta de restos 49-57.

5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente biológicamente activo está unido covalentemente al soporte mediante un enlace rompible, y en el que el enlace es rompible in vivo.

6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte polimérico consta de 6 a 25 subunidades contiguas, cada una de las cuales contiene un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal.

7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cadena principal no peptídica es una cadena principal de peptoide, y las subunidades son subunidades de glicina N-sustituidas.

8. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cadena principal no peptídica comprende restos alquílicos unidos por enlaces carbamato.

9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cadena principal no peptídica se selecciona del grupo que consta de restos alquilénicos unidos por tioéteres, grupos sulfonilo, grupos carbamato, polietileniminas o aminoaldehídos, ésteres de hidroxiácidos, y análogos aza en los que el carbono en alfa se sustituye por nitrógeno, opcionalmente en el que la cadena principal no peptídica comprende subunidades peptoides, de malonato y/o gem-diaminoalquílicas.

10. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la cadena principal no peptídica comprende enlaces seleccionados del grupo que consta de enlaces de amida N-sustituida, éster, cetometileno, metilenamino, tioamida, fosfinato, fosfonamidato, éster de fosfonamidato, retropéptido, trans-alqueno, fluoroalqueno, dimetileno, tioéter, hidroxietileno, metilenoxi, tetrazol, retrotioamida, sulfonamido, metilensulfonamido, retrosulfonamido.

11. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que cada uno de dicho grupo guanidino o amidino terminal está unido a la cadena principal mediante una cadena lateral que comprende al menos alrededor de 2 átomos de cadena, seleccionados del grupo que consta de carbono, oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno, y sus combinaciones.

12. Conjugado según la reivindicación 11, en el que el enlace de cadena lateral contiene 2 a 5 átomos de cadena.

13. Conjugado según la reivindicación 11, en el que la cadena lateral tiene la estructura -(CH_{2})_{n}- en la que n es un número entero en el intervalo de 2 a 5, inclusive.

14. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el agente biológicamente activo es una pequeña molécula orgánica.

15. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que incluye además un soporte polimérico adicional conjugado covalentemente al agente biológicamente activo, en el que el soporte polimérico adicional tiene una cadena principal no peptídica, consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal, y contiene al menos seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino.

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16. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que incluye además un agente biológicamente activo adicional conjugado covalentemente al soporte.

17. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en el que el enlace rompible es rompible enzimáticamente, es rompible químicamente, o es fotorrompible.

18. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, en el que el enlace rompible comprende un enlace carbamato, éster, tioéter, disulfuro o hidrazona.

19. Conjugado según la reivindicación 18, en el que el enlace rompible comprende un enlace éster o un enlace disulfuro.

20. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 19, en el que el enlace rompible contiene un primer grupo rompible que está distante del agente biológicamente activo, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente biológicamente activo, de forma que la ruptura del primer grupo rompible produce un conjugado de grupo enlace/agente biológicamente activo que contiene un resto nucleófilo que reacciona intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible, liberando de ese modo el agente biológicamente activo del grupo enlace y del soporte.

21. Procedimiento para mejorar el transporte de un agente biológicamente activo a través de una membrana biológica, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto, in vitro, la membrana biológica con un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20;

con lo que dicha puesta en contacto es efectiva para aumentar el suministro del conjugado a través de la membrana biológica, comparada con el suministro del agente biológicamente activo a través de la membrana en forma no conjugada.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el agente biológicamente activo está unido covalentemente al soporte mediante un enlace rompible, en el que el enlace es rompible in vivo.

23. Procedimiento según la reivindicación 21 o reivindicación 22, en el que la membrana biológica es una membrana de célula eucariota.

24. Procedimiento según la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que la membrana biológica es una membrana de célula procariota.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que el enlace rompible se rompe para liberar el agente biológicamente activo tras pasar a través de la membrana biológica.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el enlace rompible es un enlace enzimáticamente rompible, y el agente biológicamente activo libre se libera al poner en contacto el conjugado con una enzima que rompe al enlace.

27. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el enlace rompible es un enlace fotorrompible, y el agente biológicamente activo libre se libera al poner en contacto el conjugado con la luz.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el que el enlace rompible es un enlace químicamente rompible.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que el enlace rompible comprende un enlace disulfuro, y la ruptura del enlace se efectúa por reducción o intercambio de disulfuro.

30. Uso de un soporte polimérico que tiene una cadena principal no peptídica, para la preparación de un medicamento para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo que es transportada a través de una membrana biológica con relación a la cantidad de agente que se puede transportar a través de la membrana biológica en forma no conjugada, en el que

el agente biológicamente activo está unido covalentemente al soporte polimérico, y

el soporte polimérico (a) consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal, y (b) contiene al menos seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino.

31. Uso según la reivindicación 30, en el que el agente biológicamente activo está unido covalentemente al soporte mediante un enlace rompible, y el enlace es rompible in vivo.

32. Uso según la reivindicación 30 ó 31, en el que el soporte polimérico consta de 6 a 25 subunidades contiguas, cada una de las cuales contiene un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal.

33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en el que la cadena principal no peptídica es una cadena principal de peptoide, y las subunidades son subunidades de glicina N-sustituidas.

34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en el que la cadena principal no peptídica comprende restos alquílicos unidos por enlaces carbamato.

35. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en el que cada uno de dicho grupo guanidino o amidino terminal está unido a la cadena principal mediante una cadena lateral que comprende al menos alrededor de 2 átomos de cadena, seleccionados del grupo que consta de carbono, oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno, o sus combinaciones.

36. Uso según la reivindicación 35, en el que el enlace de cadena lateral contiene 2 a 5 átomos de cadena.

37. Uso según la reivindicación 35, en el que la cadena lateral tiene la estructura -(CH_{2})_{n}- en la que n es un número entero en el intervalo de 2 a 5, inclusive.

38. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, en el que el enlace rompible comprende un enlace carbamato, éster, tioéter, disulfuro o hidrazona.

39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, en el que el enlace rompible contiene un primer grupo rompible que está distante del agente biológicamente activo, y un segundo grupo rompible que está próximo al agente biológicamente activo, de forma que la ruptura del primer grupo rompible produce un conjugado de grupo enlace/agente biológicamente activo que contiene un resto nucleófilo que reacciona intramolecularmente para romper el segundo grupo rompible, liberando de ese modo el agente biológicamente activo del grupo enlace y del soporte.

40. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el agente biológicamente activo es (a) un ácido nucleico; (b) un oligonucleótido; (c) un polinucleótido; (d) un péptido, por ejemplo, un polipéptido efector o un fragmento receptor, tal como RAF-1; (e) una proteína, por ejemplo, una enzima, un antígeno, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo; (f) un ácido nucleico de proteína; (g) un polisacárido; (h) un agente antimicrobiano; o (i) un agente contra el cáncer.

41. Composición farmacéutica para la administración de un agente biológicamente activo cuya eficacia en forma no conjugada está limitada por su solubilidad acuosa, estando dicha composición compuesta por el agente biológicamente activo y, unido covalentemente al mismo, un soporte polimérico que tiene una cadena principal no peptídica, en el que el soporte polimérico (a) consta de 6 a 25 subunidades, de las cuales al menos el 50% están sustituidas con un resto de cadena lateral que incluye un grupo guanidino o amidino terminal, (b) contiene al menos seis de tales restos de cadena lateral de guanidino o amidino, y (c) es efectivo para aumentar la cantidad de agente biológicamente activo que es transportada a través de una membrana biológica con relación a la cantidad del agente que se puede transportar a través de la membrana biológica en forma no conjugada.