ES2313848B1 - Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. - Google Patents
Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2313848B1 ES2313848B1 ES200702792A ES200702792A ES2313848B1 ES 2313848 B1 ES2313848 B1 ES 2313848B1 ES 200702792 A ES200702792 A ES 200702792A ES 200702792 A ES200702792 A ES 200702792A ES 2313848 B1 ES2313848 B1 ES 2313848B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- virus
- seq
- dlc8
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 41
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 102100040565 Dynein light chain 1, cytoplasmic Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 101710096197 Dynein light chain 1, cytoplasmic Proteins 0.000 title claims abstract 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 4
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000877350 Alphaentomopoxvirus Species 0.000 claims description 3
- 241000725171 Mokola lyssavirus Species 0.000 claims description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 claims 1
- 108060002430 dynein heavy chain Proteins 0.000 abstract description 56
- 102000013035 dynein heavy chain Human genes 0.000 abstract description 56
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 16
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 13
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 101001064096 Homo sapiens Protein disulfide-thiol oxidoreductase Proteins 0.000 description 7
- 102100030728 Protein disulfide-thiol oxidoreductase Human genes 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 101000782453 Homo sapiens Vacuolar protein sorting-associated protein 18 homolog Proteins 0.000 description 6
- 102100035870 Vacuolar protein sorting-associated protein 18 homolog Human genes 0.000 description 6
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 5
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 5
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 102400001302 Gasdermin-B, N-terminal Human genes 0.000 description 4
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 4
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 4
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 101710151911 Phosphoprotein p30 Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- VDMABHYXBULDGN-LAEOZQHASA-N Gln-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VDMABHYXBULDGN-LAEOZQHASA-N 0.000 description 3
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- -1 COVA2 Proteins 0.000 description 2
- 101000966403 Homo sapiens Dynein light chain 1, cytoplasmic Proteins 0.000 description 2
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710120319 Photosystem I reaction center subunit IV Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 108010091356 Tumor Protein p73 Proteins 0.000 description 2
- 102000018252 Tumor Protein p73 Human genes 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282551 Cercopithecus Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- 108010070977 Cytoplasmic Dyneins Proteins 0.000 description 1
- 102000005362 Cytoplasmic Dyneins Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101001053992 Homo sapiens Deleted in lung and esophageal cancer protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000605534 Homo sapiens Prostate-specific antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001106322 Homo sapiens Rho GTPase-activating protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-ZDLURKLDSA-N L-Glutaminyl-L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 101100297655 Rattus norvegicus Pim3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 101150078906 U19 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 101150086963 Znf354a gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000003879 microtubule-organizing center Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000000236 nitric oxide synthase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 108010048898 phenylalanyl-arginyl-phenylalanyllysinamide Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000006656 viral protein synthesis Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/065—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/12011—Asfarviridae
- C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Nuevos péptidos antivirales que impiden la unión
del virus a DLC8.
Un elevado número de agentes patógenos de origen
viral se sirven de la maquinaria de transporte intracelular basada
en la dineína en algún momento de su ciclo infectivo. La presente
invención consiste en una nueva terapéutica antiviral consistente
en bloquear las infecciones víricas producidas por aquellos virus
que utilizan el sistema de la dineína (DLC8) mediante mecanismos de
interferencia con el uso que los virus hacen de dicha proteína
celular, bien mediante antagonistas de la función de la dineína o
por bloqueo de la interacción entre la proteína vírica y la
proteína celular.
Description
Nuevos péptidos antivirales que impiden la unión
del virus a DLC8.
Los virus son parásitos intracelulares que
requieren de la integridad de ciertas funciones celulares para que
su ciclo replicativo dentro de las células pueda realizarse con
éxito. La dineína ha demostrado tener un papel relevante en
distintos pasos de la infección de virus tan distintos como el
virus de la rabia, el virus Herpes simple humano tipo I o el virus
de la inmunodeficiencia humana. La dineína es una proteína motora
microtubular, que interviene en la internalización y el transporte
intracelular ligado a microtúbulos y es moduladora de varias vías
de traducción de señales intracelulares, entre otras funciones. Los
virus utilizan la dineína para su internalización y transporte
intracelular, para la formación de la factoría vírica donde se van
a producir los nuevos viriones y para la regulación de las señales
intracelulares necesarias en la coordinación de estos y otros
procesos. Hemos demostrado, con uno de estos modelos virales, que
el interferir este sistema supone el bloqueo de la infección lo que
proporciona la prueba de principio para una nueva estrategia
antiviral que constituye el objeto de la presente invención.
La base de este nuevo procedimiento terapéutico
se ha desarrollado a través del estudio de las interacciones de
tipo proteína de origen viral - proteína de origen celular, que son
una fuente de conocimiento de nuevas dianas terapéuticas. Hemos
identificado los dominios de interacción de algunas de las proteínas
implicadas y esta información ha sido utilizada para el diseño de
péptidos que son la prueba de principio de antagonistas del par de
proteínas que interaccionan o, al menos, de una de las dos.
En concreto, hemos encontrado que la proteína
del virus de la Peste porcina africana (VPPA) p54, que está
externamente expuesta en la partícula vírica interacciona con una
proteína celular que forma parte del complejo motor microtubular
basado en la dineína y cuya función está relacionada esencialmente
con el transporte intracelular.
Está interacción se encontró empleando el
sistema de doble híbrido en levaduras, para buscar en una genoteca
de macrófago porcino posibles proteínas de interacción de la
proteína vírica p54 [1]. La secuencia codificante para p54 (gen
E183L) se encuentra incluida en la secuencia completa del aislado
BA71V, depositada en la base de datos del NCBI con número de acceso
U18466. Los clones obtenidos e identificados como positivos
se secuenciaron para descubrir que contenían la secuencia
codificante completa de la cadena ligera de la dineína de 8
kilodaltons (kDa), llamada DLC8, LC8, DLC1, DNLC1 o PIN (proteína
inhibidora de la sintetasa del oxido nítrico neuronal). La
secuencia codificante para dicha cadena en Sus scrofa se
encuentra depositada en la base de datos del NCBI con el número
AF436777. Posteriormente este resultado fue corroborado
utilizando otro tipo de técnicas entre las que figuran la
cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y colocalización de
ambos componentes en los mismos compartimentos celulares mediante
microscopía confocal. Los resultados obtenidos confirmaron la
interacción entre p54 y DLC8, demostrando además la especificidad
de ésta [1].
DLC8 es una proteína con una secuencia
aminoacídica altamente conservada entre especies evolutivamente muy
distantes (desde nematodos al hombre), lo que ya sugiere la
relevancia de la función de esta proteína en las células [2, 3].
Las dineínas citoplásmicas son una familia de motores moleculares
que conducen a lo largo de los microtúbulos cargas muy diferentes.
Se encargan del transporte de vesículas y organelas desde el
exterior de la célula al interior, a la zona nuclear o perinuclear
(tráfico hacia el polo negativo de los microtúbulos). Son grandes
complejos multiproteicos, constituidos por de una a tres cadenas
pesadas con una cabeza globular y actividad ATPasa que son las
responsables de generar la energía necesaria para producir
movimiento. Unidas a estas cadenas pesadas se encuentra un número
variable de cadenas intermedias y de cadenas ligeras. Estas últimas
son las responsables de interaccionar directamente con la carga a
transportar. Se han descrito, hasta la fecha, siete familias de
cadenas ligeras, entre las que podemos encontrar a DLC8. DLC8 se
encuentra dispuesta como un dímero in vivo, lo que permite
la existencia de dos lugares idénticos de unión a diferentes
péptidos entre ambos monómeros.
Con respecto a la proteína celular, DLC8
presenta dos tipos de lugares preferencias de unión con las
proteínas celulares con las que interacciona. Uno de los motivos 1)
(Lys/Arg)XThrThr (siendo X un amino ácido cualquiera) es el
que se encuentra uniendo DLC8 con la cadena intermedia de la
dineína, con la molécula proapoptótica Bim, los factores de
transcripción Kid1 y Swallow y algunas proteínas virales de diverso
origen. Este sitio de unión está localizado en un cañón hidrofóbico
entre los dos dímeros de la molécula de DLC8. El segundo motivo es:
Gly(Ile/val)GlnValAsp es el que une DLC8 con la oxido
nítrico sintetasa neuronal (nNOS) o con la proteína de skafolding
neuronal.
Diversos virus utilizan la cadena ligera de la
dineína en distintas etapas de su ciclo infectivo en el interior de
la célula huésped, por lo que las estrategias antivirales objeto de
la presente invención tratan de bloquear la infección de dichos
virus por interferencia con el uso que los virus hacen de la
dineína celular, es decir bloqueando bien su función o bien los
sitios de unión que permiten a las distintas proteínas de origen
vírico el utilizar la dineína. La presente invención pone de
manifiesto por primera vez que el bloqueo de la función de esta
molécula mediante péptidos cuya secuencia comprende o consiste en,
la totalidad o una secuencia parcial correspondiente al dominio de
unión con DLC8. La invención se ejemplifica mediante péptidos
obtenidos de la secuencia de p54 del VPPA y que impiden que la
infección se complete, siendo la base para una terapéutica
antiviral.
Figura 1: Esquema de infección viral de células
e inhibición de dicha infección por acción de los péptidos de la
invención. 1.- Células Vero cultivadas a una densidad de
9x10^{4}/cm^{2} la noche anterior en DMEM 5%. 2.- Se añaden 300
\mul de soluciones con diferentes péptidos en el rango 0 a 100
\muM en DMEM SC durante 1 h a 37ºC para internalización de los
péptidos. 3.- Infección con 1 \muf/cel. de BA71V. 4.- Adsorción de
2 h a 37ºC. 5.- Eliminación del virus residual con 2 lavados con 11
ml de DMEM SC. 6.- Transcurso de la infección desde 6 a 18 h
post-infección en DMEM + péptidos. 7.- Detección de
células infectadas; Observación del efecto citopático del cultivo
celular; Análisis de proteínas virales tempranas 8p30) y tardías
(p72) por Western Blot.
Figura 2: Visualización de la internalización
del péptido antiviral COVA2 marcado con fluoresceína, a diferentes
concentraciones (5, 25, 50 y 100 \muM), en células Vero, mediante
microscopía de fluorescencia.
Figura 3: Visualización por microscopía
convencional de la inhibición del efecto citopático de VPPA en
presencia de concentraciones crecientes de péptidos antivirales
(RS27 y PS19) en las columnas 1 y 2, controles (RS28 y SS20) en las
columnas 3 y 4 y en ausencia de péptidos en la columna 5.
Figura 4: Histograma de porcentajes de reducción
de células Vero infectadas con VPPA (ordenadas), preincubadas con
concentraciones crecientes (5, 25, 50 y 100 \muM) de péptido
antiviral COVA2 o péptido control RS28 (abcisas).
Figura 5: Histograma de reducción de síntesis de
proteínas virales de VPPA medido por Western Blot (ordenadas), en
presencia de concentraciones crecientes (25, 50 y 100 \muM) de
péptido antiviral COVA1 (abcisas). Gris: proteína temprana p30;
Negro: proteína tardía p72.
Recientes trabajos, llevados a cabo por nuestro
grupo de investigación empleando técnicas de resonancia magnética
nuclear (RMN) con ambas proteínas (p54 y DLC8) producidas en
sistemas heterólogos, han proporcionado datos que han permitido
conocer en detalle dicha interacción. Se han identificado aquellos
residuos de DLC8 que se modifican en el espectro HSQC
característico de la DLC8, y que por lo tanto están involucrados en
la interacción con p54. Estos residuos serían los siguientes:
Trp54, Lys9, Ser88, Asn6l, Asn23, Asn33, Gly59, Ser86, Arg60, Glu15,
y Tyr75.
La presente invención demuestra que la
interacción proteína vírica - dineína es crítica para el transporte
intracelular del virus desde la membrana hasta la zona perinuclear
(en la zona correspondiente al organizador de microtúbulos o MTOC,
donde se produce la mayor acumulación de DLC8 en la células sanas) y
que en el caso de la infección por el VPPA, es donde se sitúa la
factoría vírica y se sintetizan las proteínas víricas para ser
ensambladas y dar origen a nuevos viriones.
Para identificar aquellos residuos concretos
requeridos para la unión de la proteína vírica a dineína, se
realizó un mareo fino del sitio de unión por expresión de varios
fragmentos truncados de la proteína p54, que revelaron que la zona
de unión a DLC8 está localizada en el extremo carboxi- terminal de
la proteína p54, y que los 13 aminoácidos comprendidos entre Tyr149
y Thr161 (TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr) son
suficientes para que se mantenga dicha interacción. Dentro de estos
13 residuos, resultan críticos los 5 últimos. Se identificaron
aquellos cambios o sustituciones puntuales de estos seis
aminoácidos que mantenían o abolían la interacción. Recientemente,
los estudios realizados empleando RMN, mencionados anteriormente,
han permitido demostrar en nuestro laboratorio que es posible
impedir la unión de p54 a DLC8, añadiendo previamente a DLC8 un
péptido que represente la secuencia de interacción
TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr existente en p54.
Una realización preferida de la presente
invención consiste en dificultar el uso de la dineína por los virus
durante la infección, mediante la utilización de una secuencia de
una proteína vírica, o parte de ella, para dificultar la infección,
en algunos casos por saturación de los sitios de unión de la
proteína celular mediante péptidos antivirales antagonistas de la
unión proteína viral - dineína. Dentro de dichos péptidos la
invención se ha probado en el tratamiento de células de cualquier
origen con secuencias peptídicas que intervengan en la interacción
de las proteínas víricas con la cadena ligera de la dineína, por
ejemplo aquellas que contengan los 13 aminoácidos:
TyrThrThrThrValThrThr
GlnAsnThrAlaSerGlnThr, incluyendo los cambios de aminoácidos conservativos en esa secuencia y los análogos de secuencia de distintos virus animales o análogos funcionales a este péptido. Mediante una técnica de pepscan, se ha ensayado la unión de diferentes péptidos de origen viral con respecto a su capacidad para unirse a DLC8 [10] y se ha podido determinar que secuencias tales como las que figuran a continuación son adecuadas para dicha unión. Son motivos que contienen con frecuencia un residuo Gln (Q), con frecuencia, con un residuo T (Thr) contiguo en la
secuencia:
GlnAsnThrAlaSerGlnThr, incluyendo los cambios de aminoácidos conservativos en esa secuencia y los análogos de secuencia de distintos virus animales o análogos funcionales a este péptido. Mediante una técnica de pepscan, se ha ensayado la unión de diferentes péptidos de origen viral con respecto a su capacidad para unirse a DLC8 [10] y se ha podido determinar que secuencias tales como las que figuran a continuación son adecuadas para dicha unión. Son motivos que contienen con frecuencia un residuo Gln (Q), con frecuencia, con un residuo T (Thr) contiguo en la
secuencia:
- -
- El motivo TyrAlaSerGlnThr de la proteína p54 del virus de la Peste porcina africana
- -
- El motivo TyrSerThrGlnThr de la glicoproteína de unión del virus respiratorio sincitial
- -
- El motivo LysSerThrGlnThr de la proteína P del virus de la rabia y del virus Mokola, de la helicasa del virus del herpes simplex humano, de la proteasa de adenovirus, o del entomopoxvirus A. moorei.
- -
- El motivo LysGlnThrGlnThr de la proteína E4 del virus del papiloma humano o de la polimerasa del virus vaccinia.
- -
- El motivo LysGlnThrGlnThr del gen U19 del herpes virus humano
- -
- El motivo ArValMetGlnLeu de la proteína de la cápside del virus coxackie humano, etc.
Esta aproximación metodológica de la presente
invención también incluye cualquier tratamiento de células de
cualquier origen con secuencias peptídicas que comprendan alguna de
las secuencias anteriores o con cambios de aminoácidos
conservativos en dichas secuencias. Se incluyen todas las
transformaciones conservativas de esas secuencias y todos los
mecanismos conocidos en la actualidad encaminados a vehicular estos
péptidos al interior de las células, por ejemplo: Cualquiera de los
péptidos unidos a secuencias translocadoras al interior de la
célula, liposomas o cualquier otro vehículo que sirva para
internalizar dichos péptidos en la célula (vectores, etc.). El
tratamiento con péptidos tiene como objeto saturar los motivos de
unión a dineína en los virus que utilizan el transporte ligado a
dineína preincubándolos con la cadena ligera de dineína, la
proteína DLC8, o cualquier secuencia de aminoácidos contenida en la
misma, o cualquier péptido que contengan los motivos
(Lys/Arg)XThrThr o Gly(lle/val)GlnValAsp, o con
las propias secuencias peptídicas con cambios de aminoácidos
conservativos [10]. Se definen cambios conservativos aquéllos que
no cambien la carga o la conformación de la proteína. Asimismo, la
invención comprende cualquiera de los péptidos anteriores unidos a
otras secuencias peptídicas, péptidos translocadores, etc., o
suministrados junto a liposomas y otros vehículos para internalizar
los péptidos en la célula y en general los sistemas de vehiculación
conocidos en la actualidad para células de cualquier origen.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida de la invención
consiste en composiciones antivirales que comprenden un compuesto
capaz de inhibir la unión del virus, o una proteína del mismo, a la
proteína DLC8, opcionalmente, con cualquier vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Más particularmente la invención
describe composiciones antivirales a base de péptidos. Dentro de las
diferentes infecciones de origen viral susceptibles de ser tratadas
con las composiciones de la invención se encuentran aquéllas
causadas por alguno de los siguientes virus: VPPA, virus del
papiloma humano, adenovirus, entomopoxvirus A. moorei, virus
vaccinia, virus respiratorio sincitial, virus coxackie humano,
virus de la rabia, virus del Herpes simple humano, virus Mokola o
el virus del SIDA.
De una forma más concreta se prefieren péptidos
que comprendan alguna de las siguientes secuencias:
(Lys/Arg)XThrThr; Gly(Ile/Val)GlnValAsp;
TyrThrThrThrValThrThrGlnAsnThrAlaSerGlnThr; LysSerThrGlnThr;
ThrSerThr
GlnThr; ArgValMetGlnLeu, LysGlnThrGlnThr, ArgSerThrGlnThr, AsnThrAlaSerGlnThr, o una secuencia análoga a cualquiera de las anteriores con cambios conservativos en al menos uno de sus amino ácidos.
GlnThr; ArgValMetGlnLeu, LysGlnThrGlnThr, ArgSerThrGlnThr, AsnThrAlaSerGlnThr, o una secuencia análoga a cualquiera de las anteriores con cambios conservativos en al menos uno de sus amino ácidos.
Una realización también preferida de la presente
invención es aquélla en que el péptido contiene además una cola de
Argininas en su extremo N-terminal para incrementar
su internalización en la célula, preferentemente de 8 Argininas.
Ejemplos concretos de composición antiviral son
aquéllas que contienen un péptido seleccionado entre: COVA1, COVA2,
PEP1, PEP3 o PS19.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización preferida de la presente
invención es un método de selección de compuestos antivirales y de
evaluación de su eficacia caracterizado por:
- a)
- Preincubar o premezclar un virus con un compuesto que comprenda la secuencia de DLC8, una secuencia parcial de DLC8 o una secuencia análoga a DLC8 obtenida por sustitución conservativa de al menos un amino ácido
- b)
- Poner en contacto un cultivo celular con el virus incubado o mezclado previamente de la etapa a)
- c)
- Detectar y cuantificar el nivel de infección vírica en el interior de la célula al cabo de un tiempo
- d)
- Comparar dicho nivel de infección vírica con el alcanzado en un cultivo celular infectado con el virus sin preincubar o premezclar con el compuesto de la etapa a)
\vskip1.000000\baselineskip
Una última realización de la invención consiste
en un método de selección de compuestos antivirales y de evaluación
de su eficacia caracterizado por:
- a)
- Preincubar o premezclar un cultivo celular con un compuesto capaz de unirse a DLC8
- b)
- Poner en contacto el virus con el cultivo celular incubado o mezclado previamente en la etapa a)
- c)
- Detectar y cuantificar el nivel de infección vírica en el interior de la célula al cabo de un tiempo
- d)
- Comparar dicho nivel de infección vírica con el alcanzado en un cultivo celular infectado con el virus, sin preincubar o premezclar con el compuesto capaz de unirse a DLC8
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se propone un ejemplo que sirve
para ilustrar la invención sin que deba ser considerado como
limitativo del alcance de la misma. El ejemplo Nº 1 ilustra una
estrategia empleada para inhibir exclusiva y específicamente la
función de la dineína celular, afectando así al normal progreso del
ciclo infectivo de estos virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Nº
1
A lo largo de este ejemplo se ha utilizado la
línea celular Vero como modelo. Las infecciones y ensayos de
internalización de péptidos se desarrollaron en esta línea celular
establecida, aneuploide y de crecimiento indefinido en cultivo.
Deriva del riñón de mono verde africano adulto
(Cercopithecus) y fue obtenida a través de la European
Collection of Cell Cultures (ECACC), depositada con el número
84113001. Su morfología es de tipo fibroblasto y fue utilizada
siempre en un número de pases menor de 20, manteniéndose congelados
y alicuotados en nitrógeno líquido hasta su uso. Esta línea celular
fue cultivada empleado medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM, Lonza), suplementado con 5% de suero bovino fetal (SBF,
Lonza) inactivado durante 30 minutos a 56ºC, 4 mM glutamina
(Invitrogen), 200 UI/ml de penicilina y 100 mM estreptomicina
(Invitrogen). Las condiciones de cultivo de las células fueron 37ºC
y una atmósfera de 5% de CO_{2}. De rutina estas células fueron
subcultivadas 1:6 en dos ocasiones a la semana, creciendo en
frascos de cultivo Easy-T-Flasks de
75 cm^{2} recubiertos de Nunclon®
(Nunc).
(Nunc).
El medio de cultivo DMEM fue suplementado de
diversas maneras atendiendo a las necesidades del ensayo en
particular. Así, nos referimos a DMEM SC cuando fue utilizado sin
antibióticos, glutamina ni SBF. Referimos DMEM 2% cuando el
porcentaje de SBF se adiciona en este porcentaje manteniendo el
resto de aditivos en las concentraciones mencionadas en el párrafo
anterior.
Para los plaqueos en agarosa se utilizó medio de
Dulbecco 2X (Gibco).
El aislado del virus de la Peste porcina
africana utilizado en los ensayos de inhibición de la infección fue
el BA71V, adaptado a crecer en la línea celular Vero [4]. El
stock viral fue conservado en alícuotas de 100 \mul a -
80ºC en medio DMEM suplementado con 15% de suero bovino fetal. En
el momento de su uso las alícuotas necesarias fueron descongeladas
rápidamente en baño a 37ºC y mantenidas en hielo.
- \bullet
- Criotubos de 1 ml de capacidad (Nalgene) para conservar alicuotados los aislados virales y mantener a línea celular Vero en nitrógeno líquido.
- \bullet
- Micropipetas (Gilson) con capacidades máximas de 1000, 200 y 20 \mul.
- \bullet
- Puntas de micropipeta (Arc) con filtro y libres de RNasas, para evitar posibles contaminaciones, de 1000, 200 y 20 \mul de capacidad.
- \bullet
- Tubos de 1.5 ml de capacidad (Eppendorf) libres de RNAsas.
- \bullet
- Placas de cultivo celular multipocillo de 4, 6, 12 y 24 pocillos (Nunc).
- \bullet
- Cubreobjetos redondos de 12 mm de diámetro (Gever Labs).
- \bullet
- Portaobjetos convencional rectangular (Gever Labs).
- \bullet
- Membrana de nitrocelulosa para proteínas de 9 x 7 cm (GE Healthcare).
- \bullet
- Panel Whatman de 9 x 7 cm.
- \bullet
- Anticuerpo monoclonal anti-p30: desarrollado en el laboratorio del Dr. Jose Angel Martínez Escribano, reconoce y detecta de manera específica la proteína temprana p30 del VPPA.
- \bullet
- Anticuerpo policlonal anti-DLC8 obtenido en conejos inmunizados con la proteína DLC8 unida a 10 residuos de Histidina expresada en el sistema heterólogo de E. coli y posteriormente purificada. Generado en nuestro laboratorio.
- \bullet
- Anticuerpo monoclonal anti-\alpha tubulina (Sigma).
- \bullet
- Anticuerpo monoclonal anti-p72 (anti-p73): comercializado por Ingenasa, reconoce y detecta de manera específica la proteína estructural tardía mayoritaria p72 o p73 del VPPA.
- \bullet
- Anticuerpo anti IgG de ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (Molecular Probes).
- \bullet
- Anticuerpo anti IgG de conejo conjugado al fluorocromo Alexa 488 (Molecular Probes).
- \bullet
- Anticuerpo anti IgG de ratón conjugado a peroxidasa HRP (GE Healthcare).
- \bullet
- Anticuerpo anti IgG de conejo conjugado a peroxidasa HRP (GE Healthcare).
- \bullet
- Triton X-100 (Sigma).
- \bullet
- Tween 20. (Sigma).
- \bullet
- Buffer fosfato (PBS).
- \bullet
- BSA, Albúmina de suero bovino (Sigma).
- \bullet
- Reactivo de quimioluminiscencia ECL (GE Healthcare).
- \bullet
- Agua libre de RNAsas (Ambion).
- \bullet
- Solución RNAseZAP (Ambion) para eliminar actividad RNAse de las superficies y materiales de trabajo.
- \bullet
- ProLong, reactivo de montaje para conservar la fluorescencia (Invitrogen).
- \bullet
- Hoechst 3332 (Sigma) como agente cromógeno intercalante de ácidos nucleicos.
- \bullet
- B-mercaptoetanol, SDS, Tris base (Sigma).
- \bullet
- NP-40 (Fluka).
- \bullet
- NaCl (Duchefa biochemicals).
- \bullet
- Agarosa de bajo punto de fusión ultra pura (Invitrogen).
Se diseñaron diferentes péptidos conteniendo el
motivo de unión a DLC8 previamente descrito en la proteína del VPPA
p54 y otra serie de péptidos de secuencia irrelevante para usar
como controles negativos (péptidos RS27 y SS20). Todos ellos se
encuentran descritos en la Tabla nº 1. En algunos péptidos se
incluyeron algunas modificaciones como las siguientes:
- \bullet
- Adición de 8 residuos de arginina (R) en el extremo N-terminal, con el fin de incrementar la internalización del péptido en la célula [6] (RS27; RS28; COVA1; COVA2; PEP3; PEP1).
- \bullet
- Conjugación a fluoresceína en el extremo N-terminal para su directa visualización directa por microscopía de fluorescencia (COVA2; PEP3; PEP1).
- \bullet
- Sustitución de residuos concretos para facilitar la disolución del péptido y evitar su agregación (COVA1, COVA2, PEP1 y PEP3).
- \bullet
- Sustitución de residuos dentro del motivo ThrAlaSerGlnThr por otros que mantienen la capacidad de p54 de interaccionar con DLC8 (PEP3) [1].
Todos los péptidos empleados a lo largo del
presente ejemplo fueron sintetizados por
Sigma-Genosys. La purificación de los mismos se
llevó a cabo por HPLC obteniendo en todos los casos un grado de
pureza superior al 90%. Una vez sintetizados y purificados los
péptidos se recibieron en el laboratorio como un liofilizado.
Atendiendo a su peso molecular (ver Tabla nº 1)
los péptidos fueron resuspendidos en el volumen de H_{2}O con un
grado de pureza mQ y estéril correspondiente, para obtener una
solución madre a una concentración de 5 mM. Se prestó especial
atención para evitar turbidez en la solución y siempre se utilizaron
puntas con filtro para evitar posibles contaminaciones cruzadas. Se
realizaron alícuotas de 20 \mul y se conservaron a -80ºC hasta el
momento de su uso. Para usarlos su descongelación fue lenta, en
hielo.
Las soluciones de trabajo con los péptidos se
realizaron a partir de las soluciones madre en medio DMEM SC en el
rango de concentraciones 0 - 100 \muM, siempre en condiciones de
esterilidad y justo antes de su adición al cultivo celular para
evitar su degradación.
Se cultivaron 9 x 10^{4} células Vero en
placas de 24 pocillos la noche anterior al experimento. A la mañana
siguiente se lavaron las células en DMEM SC y se sustituyó el medio
existente por 300 \mul de las soluciones conteniendo los
diferentes péptidos en diferentes concentraciones. La incubación de
las células con los péptidos tuvo lugar durante 1 hora a 37ºC y 5%
CO_{2}, transcurridos los cuales se procedió a infectar las
células con el VPPA. Para infectar las células se retiró el medio de
cultivo existente y se sustituyó por 350 \mul/pocillo 2%
conteniendo la cantidad de virus correspondiente para obtener una
multiplicidad de infección de 1 unidad formadora de placa (ufp) por
célula. Se dejo transcurrir la infección hasta el momento deseado a
37ºC y 5% CO_{2}, Transcurrido el periodo de adsorción (2 h a
37ºC) se eliminó el virus residual lavando 2 veces con DMEM SC y
finalmente se dejaron las células en 300 \mul de DMEM SC fresco
conteniendo las correspondientes concentraciones de péptidos. Se
dejó transcurrir la infección a 37ºC el tiempo deseado en cada
experimento, dependiendo del parámetro de la infección a analizar.
De forma esquemática se representa este proceso en la Figura 1.
La detección de células infectadas por el VPPA
en células previamente expuestas a los diferentes péptidos se
realizó a las 6 horas post-infección. Las técnicas
de IFI empleadas para detectar por inmunofluorescencia aquellas
células infectadas por el VPPA fueron convencionales. De modo
resumido, se lavaron las células con 1 ml de PBS antes de ser
fijadas con una solución de PBS-paraformaldehído al
3.8% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se eliminó a
continuación el paraformaldehído residual lavando 3 veces las
células con 1 ml de PBS. La permeabilización de las membranas
celulares se realizó empleando PBS-Triton
X-100 al 0.2% durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Tras otros 3 lavados con PBS, las células se incubaron a
37ºC en solución de bloqueo (PBS-BSA al 3%) durante
45 minutos. Como antígeno viral a detectar se eligió la proteína
temprana del VPPA p30 [5] y su detección se llevó a cabo mediante el
anticuerpo anti-p30 diluido en PBS 1:200 durante 1
hora a 37ºC. Se lavaron las células 3 veces con PBS y se incubaron
durante 30 minutos a temperatura ambiente con una solución con
anticuerpo anti-IgG de ratón diluido 1:300 en PBS.
Se lavaron las células en PBS y se incorporó finalmente un marcaje
de núcleos con Hoechst 3332. Finalmente los coverslips conteniendo
las células se montaron sobre portaobjetos empleando Prolong como
medio de montaje. Las preparaciones se observaron en un microscopio
de fluorescencia convencional (Leica) para contabilizar el número
de células positivas para el antígeno viral p30.
Las proteínas virales objeto de análisis fueron
la proteína del VPPA temprana p30 expresada durante las fases
iniciales de la infección [5] y la proteína p72 (en ocasiones
también denominada p73) expresada durante la fase tardía de la
infección [7, 8]. El western blot se llevó a cabo sobre las
células, que se lavaron con 1 ml de PBS frío, antes de ser
recogidas en 50 \mul de buffer de extracción de proteínas RIPA
helado (NaCl 150 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM,
NP40 1%, SDS 1% y Tris-HCl pH=8 50 mM). Se
incubaron a 4ºC con agitación orbital durante 20 minutos para
solubilizar las proteínas y a continuación se centrifugaron a
12.000 rpm en centrífuga de mesa a 4ºC durante 10 minutos. Se
descartaron los precipitados y se recogieron los sobrenadantes, que
se guardaron a -70ºC hasta su análisis por western blot.
Las muestras se descongelaron en hielo y se
cuantificó la cantidad de proteína de las diferentes muestras por
el método de Bradford. 20 \mug de proteína total desnaturalizada
a 100ºC durante 5 minutos fueron separados mediante electroforesis
en geles de acrilamida:bis-acrilamida al 15% durante
90 minutos a 100 V constantes. Las proteínas separadas se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante 90 minutos a
100 V constantes en presencia de buffer de transferencia
(Tris-Glicina, Metanol 20%). La membrana se bloqueó
en presencia de 50 ml de PBS-leche desnatada en
polvo al 5% a temperatura ambiente durante un mínimo de 1 hora con
agitación orbital. A continuación la membrana se hibridó con 10 ml
del anticuerpo policlonal anti-DLC8 diluido 1:50 en
PBS durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación.
Transcurrido este tiempo la membrana se lavó 3 veces con 20 ml de
PBS-Tween 0.05% a temperatura ambiente durante 15
minutos en cada ocasión. La incubación con el anticuerpo secundario
anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa y diluido
1:4000 en PBS duró 1 h a temperatura ambiente con agitación.
Finalizada ésta las membranas se lavaron otras 3 veces con
PBS-Tween 0.005% durante 15 minutos en cada
ocasión. Finalmente la detección mediante quimioluminiscencia
empleando ECL se realizó siguiendo de manera convencional las
instrucciones del fabricante.
Como muestra de partida a analizar se utilizaron
extractos de proteína soluble total procedentes de células Vero
expuestas o no a los diferentes péptidos y posteriormente
infectadas o no con el VPPA durante 16 horas.
Como anticuerpos primarios se utilizaron en
membranas independientes el anticuerpo monoclonal
anti-p30 diluido 1:100 en PBS y el anticuerpo
monoclonal anti-p72 diluido 1:2000 en PBS. Las
incubaciones de las membranas con ambos anticuerpos tuvo una
duración de 1 hora a temperatura ambiente con agitación orbital.
Como anticuerpo secundario se utilizó en ambos
casos el anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a
peroxidasa.
Finalmente se realizó el densitometrado de la
reacción de quimioluminiscencia para cuantificar y relativizar la
cantidad de proteína existente en cada banda detectada.
En la bibliografía se describe que la adición de
residuos de Arginina en los extremos de un péptido incrementa de
manera significativa la penetración de éstos al interior celular.
Con dicho fin, esta modificación se incorporó al diseño de nuestros
péptidos en el extremo N-terminal. Para comprobar
que los péptidos diseñados se internalizasen con eficacia al
interior celular se incorporó un marcaje de fluoresceína en el
extremo N-terminal. El péptido COVA2 reúne este
conjunto de características, incluyendo el motivo de unión a DLC8
previamente descrito en p54, por lo que se utilizó para visualizar
directamente la internalización en células Vero.
Como se puede observar en la Figura 2, el
péptido fue eficientemente internalizado, pudiendo ser detectado
fácilmente por microscopia de fluorescencia directa, incluso 6 h
después de su adición.
Las concentraciones de péptido COVA2 óptimas
resultaron ser 50 y 100 \muM, sin observar grandes diferencias
entre ambas concentraciones. 25 \muM de COVA2 pudieron ser
detectados, aunque con mayor dificultad que en las concentraciones
mayores, y sin embargo concentraciones menores, es decir por debajo
de 5µM no pudieron apenas ser detectados por microscopía de
fluorescencia.
Tal y como se detalla en la sección de métodos
de este ejemplo, se infectaron con 1 ufp/célula del VPPA monocapas
de células Vero que previamente fueron expuestas a los diferentes
péptidos. La infección se dejó transcurrir en presencia del péptido
y se analizaron los siguientes parámetros de la infección para
comprobar el efecto inhibidor de los péptidos en cuestión.
La infección por el VPPA produce un efecto
citópatico sobre las células infectadas muy característico y
fácilmente detectable por microscopía convencional. Comienza
temprano tras la infección y desemboca finalmente en el
redondeamiento del contorno celular, la progresiva vacuolización
intracelular y el desprendimiento de la superficie a la cual se
encontraba adherida la célula infectada [9].
Observamos la presencia o ausencia de efecto
citópatico generalizado a las 18 horas
post-infección en cultivos de células Vero donde la
infección progresó en presencia de los diferentes péptidos. De este
modo se pudo constatar la inhibición del efecto citópatico en
aquellos cultivos celulares incubados con los péptidos que
contenían en su secuencia el motivo de unión a DLC8 junto la
secuencia de argininas para facilitar su entrada al interior
celular. Por el contrario aquellas células expuestas a los péptidos
controles o bien sin la secuencia de argininas desarrollaron un
efecto citópatico semejante al observado en las células control
donde la infección se desarrolló de un modo normal.
Como se puede observar en la Figura 3, el grado
de efecto citópatico observado fue directamente proporcional a la
concentración de péptido empleada. Así, las concentraciones del
péptido PS19 inhibieron el efecto citópatico totalmente en el rango
de concentraciones que oscila entre 25 y 100 \muM, pero
concentraciones inferiores a 25 \muM no resultaron efectivas a la
hora de inhibir el efecto citopático.
En la siguiente tabla se resume la capacidad de
inhibición del efecto citópatico para los diferentes péptidos
ensayados y sus correspondientes concentraciones.
Además el péptido que contiene el motivo de
unión a DLC8 con aquellas modificaciones que permiten mantener
intacta dicha capacidad de interacción también se mostró eficaz a
la hora de inhibir el efecto citopático en la infección.
Se analizó el efecto inhibidor de los péptidos
contabilizando el número de células infectadas por el VPPA
(positivas para el antígeno p30). Para ello se incubaron las
células en presencia de diferentes concentraciones de los péptidos
inhibidores y controles como se detalla en la sección de métodos del
presente ejemplo.
Como se puede observar en la Figura 4, la
incubación con el péptido COVA2 previa a la infección resultó en
una drástica reducción el porcentaje de células infectadas, al
comparar con los datos obtenidos en células incubadas con el péptido
control RS28. Además esta reducción fue proporcional a las
concentraciones de COVA2 empleadas.
Se analizó la síntesis de proteínas del VPPA
tempranas y tardías por western blot empleando anticuerpos
específicos. Así se pudo observar que tanto la síntesis de
proteínas virales tempranas (p30) y tardías (p72) disminuye en modo
dependiente de dosis cuando la infección por el VPPA transcurre en
presencia del péptido COVA1. Además dicha reducción es dependiente
de la dosis de COVA1 añadida al cultivo celular (Fig. 5).
Estos resultados concuerdan perfectamente con
los resultados obtenidos anteriormente y demuestran que se puede
inhibir la infección por el VPPA empleando péptidos con el motivo
de unión a DLC8 existente en p54 y que impide la interacción entre
ambas proteínas. Esta inhibición se refleja en una inhibición del
efecto citopático, una reducción drástica de las células infectadas
y una reducción significativa en la síntesis de proteínas
virales.
1. Alonso, C., et al., African
swine fever virus protein p54 interacts with the microtubular motor
complex through direct binding to light-chain
dynein. J Virol, 2001. 75(20): p.
9819-27.
2. Harrison, A. and S.M. King,
The molecular anatomy of dynein. Essays Biochem,
2000. 35: p. 75-87.
3. King, S.M., Organization and
regulation of the dynein microtubule motor. Cell Biol
Int, 2003. 27(3): p. 213-5.
4. Enjuanes, L., et al.,
Titration of African swine fever (ASF) virus. J Gen
Virol, 1976. 32(3): p. 471-7.
5. Afonso, C.L., et al.,
Characterization of p30, a highly antigenic membrane and secreted
protein of African swine fever virus. Virology,
1992. 189(1): p. 368-73.
6. Melikov, K. and L.V.
Chernomordik, Arginine-rich cell
penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery.
Cell Mol Life Sci, 2005. 62(23): p.
2739-49.
7. Tabares, E., et al.,
Proteins specified by African swine fever virus. II. Analysis of
proteins in infected cells and antigenic properties. Arch
Virol, 1980. 66(2): p.
119-32.
8. Cobbold, C. and T. Wileman,
The major structural protein of African swine fever virus, p73,
is packaged into large structures, indicative of viral capsid or
matrix precursors, on the endoplasmic reticulum. J Virol,
1998. 72(6): p. 5215-23.
9. Nunes, J.F., J.D. Vigario, and
A.M. Terrinha, Ultrastructural study of African swine
fever virus replication in cultures of swine bone marrow cells.
Arch Virol, 1975. 49(1): p.
59-66.
10. Martínez-Moreno, M.
et al., Recognition of novel viral sequences that
associate with the dynein light chain LC8 identified through a
pepscan technique. FEBS Letters 2003. 544:
262-267.
<110> INIA
\vskip0.400000\baselineskip
<110> ALGENEX
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS PÉPTIDOS ANTIVIRALES QUE
IMPIDEN LA UNIÓN DEL VIRUS A DLC8
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-01707
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PS19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RS27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SS20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RS28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> COVA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> COVA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PEP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICO
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PEP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /NOTA=Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /NOTA=Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARTIFICIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PÉPTIDO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
Claims (9)
1. Composición antiviral que comprende un
péptido capaz de inhibir la unión de los virus o una proteína de
los mismos a la proteína DLC8 caracterizada porque el
péptido comprende una secuencia seleccionada entre: SEQ ID NO: 9,
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID
NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, o cualquier
secuencia análoga a alguna de las anteriores con cambios
conservativos en al menos un amino ácido.
2. Composición antiviral, según la
reivindicación 1, que además comprende cualquier vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
3. Composición antiviral según la
reivindicación 1 ó 2 útil en el tratamiento de las infecciones
atribuibles a un virus seleccionado entre: VPPA, virus del papiloma
humano, adenovirus, entomopoxvirus A. moorei, virus vaccinia,
virus respiratorio sincitial, virus coxackie humano, virus de la
rabia, virus del Herpes simple humano, virus Mokola o el virus del
SIDA.
4. Composición antiviral según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque el péptido
comprende la secuencia SEQ ID NO: 18 o comprende una secuencia
análoga a la anterior con cambios conservativos en al menos un amino
ácido y la infección viral a tratar es causada por VPPA.
5. Composición antiviral según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque el péptido
contiene además una cola de Argininas en su extremo
N-terminal para incrementar su internalización en la
célula.
6. Composición antiviral según la
reivindicación 5 en que la cola consta de 8 Argininas.
7. Composición antiviral según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores caracterizada por consistir
en un péptido seleccionado entre: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: 8, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 1.
8. Método de selección de compuestos antivirales
y de evaluación de su eficacia caracterizado por:
- a)
- Preincubar o premezclar un virus con un compuesto que comprenda una secuencia peptídica capaz de unirse a DLC8, una secuencia parcial de la misma o una secuencia análoga obtenida por sustitución conservativa de al menos un amino ácido de la secuencia capaz de unirse a DLC8 o de una secuencia parcial de la misma
- b)
- Poner en contacto un cultivo celular con el virus incubado o mezclado previamente de la etapa a)
- c)
- Detectar y cuantificar el nivel de infección vírica en el interior de la célula al cabo de un tiempo
- d)
- Comparar dicho nivel de infección vírica con el alcanzado en un cultivo celular infectado con el virus sin preincubar o premezclar con el compuesto de la etapa a).
9. Método de selección de compuestos antivirales
y de evaluación de su eficacia caracterizado por:
- a)
- Preincubar o premezclar un cultivo celular con un compuesto capaz de unirse a DLC8
- b)
- Poner en contacto el virus con el cultivo celular incubado o mezclado previamente en la etapa a)
- c)
- Detectar y cuantificar el nivel de infección vírica en el interior de la célula al cabo de un tiempo
- d)
- Comparar dicho nivel de infección vírica con el alcanzado en un cultivo celular infectado con el virus, sin preincubar o premezclar con el compuesto capaz de unirse a DLC8.
Priority Applications (17)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702792A ES2313848B1 (es) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. |
| MX2010004424A MX2010004424A (es) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. |
| JP2010530422A JP2011502110A (ja) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | ウイルスのｄｌｃ８への結合を阻害するアフリカブタコレラウイルス由来の新規抗ウイルス性ペプチド |
| US12/739,415 US8592552B2 (en) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Antiviral peptides from african swine fever virus which prevent the binding of the virus to DLC8 |
| BRPI0818574 BRPI0818574A2 (pt) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Peptídeos antivirais do vírus da febre suína africana que previnem a ligação do virus a dlc8 |
| PT08843012T PT2203468E (pt) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Novos péptidos antivirais do vírus da pesta suína africana que inibem a ligação do vírus a dlc8 |
| EP08843012A EP2203468B8 (en) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | New antiviral peptides from african swine fever virus which prevent the binding of the virus to dlc8 |
| AT08843012T ATE523521T1 (de) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Neue antivirale peptide aus dem afrikanischen schweinepestvirus als hemmer der bindung des virus an dlc8 |
| AU2008314669A AU2008314669A1 (en) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | New antiviral peptides from african swine fever virus which prevent the binding of the virus to DLC8 |
| PCT/EP2008/064155 WO2009053340A1 (en) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | New antiviral peptides prom african swine fever virus which prevent the binding of the virus to dlc8 |
| CA2703368A CA2703368A1 (en) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | New antiviral peptides which prevent the binding of the virus to dlc8 |
| RU2010120714/10A RU2503686C2 (ru) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Новые противовирусные пептиды, которые предотвращают связывание вируса с dlc8 |
| ES08843012T ES2373258T3 (es) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Nuevos péptidos antivirales del virus de la fiebre porcina africana que impiden la unión del virus a dlc8. |
| KR1020107008093A KR20100109543A (ko) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | 디엘씨8에의 바이러스 결합을 방지하는 신규의 아프리카 돼지 콜레라 바이러스 유래 항바이러스 펩티드 |
| CN200880112912A CN101835795A (zh) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | 防止病毒与dlc8结合的新型抗病毒肽 |
| ZA201001710A ZA201001710B (en) | 2007-10-24 | 2010-03-10 | New antiviral peptides from african swine fever virus which prevent the binding of the virus to DLC8 |
| IL205260A IL205260A0 (en) | 2007-10-24 | 2010-04-22 | New antiviral peptides from african swine fever virus which prevent the binding of the virus to dlc8 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702792A ES2313848B1 (es) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2313848A1 ES2313848A1 (es) | 2009-03-01 |
| ES2313848B1 true ES2313848B1 (es) | 2010-03-22 |
Family
ID=40365182
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200702792A Expired - Fee Related ES2313848B1 (es) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. |
| ES08843012T Active ES2373258T3 (es) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Nuevos péptidos antivirales del virus de la fiebre porcina africana que impiden la unión del virus a dlc8. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES08843012T Active ES2373258T3 (es) | 2007-10-24 | 2008-10-20 | Nuevos péptidos antivirales del virus de la fiebre porcina africana que impiden la unión del virus a dlc8. |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8592552B2 (es) |
| EP (1) | EP2203468B8 (es) |
| JP (1) | JP2011502110A (es) |
| KR (1) | KR20100109543A (es) |
| CN (1) | CN101835795A (es) |
| AT (1) | ATE523521T1 (es) |
| AU (1) | AU2008314669A1 (es) |
| BR (1) | BRPI0818574A2 (es) |
| CA (1) | CA2703368A1 (es) |
| ES (2) | ES2313848B1 (es) |
| IL (1) | IL205260A0 (es) |
| MX (1) | MX2010004424A (es) |
| PT (1) | PT2203468E (es) |
| RU (1) | RU2503686C2 (es) |
| WO (1) | WO2009053340A1 (es) |
| ZA (1) | ZA201001710B (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921878B (zh) * | 2010-09-21 | 2012-09-05 | 扬州大学 | 一种非洲猪瘟病毒核酸扩增引物、检测方法和试剂盒 |
| EP2489371A1 (en) * | 2011-02-18 | 2012-08-22 | Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria | Carrier peptides for drug delivery |
| CN104962581B (zh) * | 2015-04-07 | 2018-05-25 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株 |
| CN109781980A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-05-21 | 河南中泽生物工程有限公司 | 非洲猪瘟病毒快速检测卡及其应用 |
| JP7518149B2 (ja) | 2019-07-12 | 2024-07-17 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 高濃度インスリン製剤 |
| CN110862435B (zh) * | 2019-12-05 | 2021-09-24 | 中国农业大学 | 非洲猪瘟ctl表位多肽及其应用 |
| CN111537480B (zh) * | 2020-04-26 | 2023-05-02 | 中央民族大学 | 基于单分子全内反射荧光成像技术的病毒快速检测方法 |
| CN111620954B (zh) * | 2020-06-28 | 2022-11-29 | 江苏芝海生物科技有限公司 | 一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN111777672A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-10-16 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种重组的非洲猪瘟病毒pKP177R亚单位可溶性蛋白及其制备方法和应用 |
| CN113999317B (zh) * | 2021-10-29 | 2022-06-07 | 吉林农业大学 | 激发机体抗非洲猪瘟感染的融合基因及其编码蛋白和应用 |
| WO2024054009A1 (ko) * | 2022-09-08 | 2024-03-14 | 대한뉴팜㈜ | 신규 항바이러스 펩타이드 |
| CN116769019B (zh) * | 2023-03-09 | 2023-12-15 | 河北农业大学 | 一种ASFVp30蛋白单克隆抗体及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005013916A2 (en) * | 2003-02-26 | 2005-02-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Targeting cellular entry, cell survival, and pathogenicity by dynein light chain 1/pin in human cells |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125089C1 (ru) * | 1996-08-23 | 1999-01-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и набор для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции |
| EP0975370B9 (en) * | 1997-05-21 | 2004-11-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Composition and method for enhancing transport across biological membranes |
| US7396531B2 (en) * | 2006-07-05 | 2008-07-08 | Matthias Rath | Preventive and therapeutic use of polypeptides from African Swine virus as vaccines |
| ES2337113B1 (es) * | 2007-04-17 | 2011-01-24 | Centre De Recerca En Sanitat Animal (Cresa) | Empleo de la hemaglutinina del virus de la peste porcina africana como adyuvante. |
-
2007
- 2007-10-24 ES ES200702792A patent/ES2313848B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-10-20 AT AT08843012T patent/ATE523521T1/de not_active IP Right Cessation
- 2008-10-20 RU RU2010120714/10A patent/RU2503686C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-10-20 AU AU2008314669A patent/AU2008314669A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-20 ES ES08843012T patent/ES2373258T3/es active Active
- 2008-10-20 MX MX2010004424A patent/MX2010004424A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-10-20 EP EP08843012A patent/EP2203468B8/en not_active Not-in-force
- 2008-10-20 KR KR1020107008093A patent/KR20100109543A/ko not_active Withdrawn
- 2008-10-20 PT PT08843012T patent/PT2203468E/pt unknown
- 2008-10-20 CN CN200880112912A patent/CN101835795A/zh active Pending
- 2008-10-20 US US12/739,415 patent/US8592552B2/en active Active
- 2008-10-20 WO PCT/EP2008/064155 patent/WO2009053340A1/en not_active Ceased
- 2008-10-20 JP JP2010530422A patent/JP2011502110A/ja active Pending
- 2008-10-20 CA CA2703368A patent/CA2703368A1/en not_active Abandoned
- 2008-10-20 BR BRPI0818574 patent/BRPI0818574A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-03-10 ZA ZA201001710A patent/ZA201001710B/xx unknown
- 2010-04-22 IL IL205260A patent/IL205260A0/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005013916A2 (en) * | 2003-02-26 | 2005-02-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Targeting cellular entry, cell survival, and pathogenicity by dynein light chain 1/pin in human cells |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| COVADONGA ALONSO et al. African Swine Fever Virus Protein p54 Interacts with the Microtubular Motor Complex through Direct Binding to Light-Chain Dynein. Journal of Virology. Octubre 2001, Vol 75(20), páginas 9819-9827, página 9819, resumen, columna 2; página 9820, columnas 1-2; página 9823, FIG 3; página 9825, FIG 5, columnas 1- 2; página 9826, columna 1. * |
| IGNACIO RODRIGUEZ CRESPO et al. Identification of novel cellular proteins that bind to the dynein LC8 dynein using a pepscan technique. FEBS Letters. 2001, Vol 503, páginas 135-141, página 138, Tabla 1; página 139, Fig. 3. * |
| MONICA MARTINEZ-MORENO et al. Recognition of novel viral sequences that associate with the dynein light chain LC8 identified through a pepscan technique. FEBS Letters. 2003, Vol 544, páginas 262-267, página 262, resumen; página 265, Tabla 2; página 267, columnas 1-2. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010120714A (ru) | 2011-11-27 |
| KR20100109543A (ko) | 2010-10-08 |
| ZA201001710B (en) | 2010-10-27 |
| MX2010004424A (es) | 2010-08-23 |
| US8592552B2 (en) | 2013-11-26 |
| ES2373258T3 (es) | 2012-02-01 |
| ATE523521T1 (de) | 2011-09-15 |
| EP2203468A1 (en) | 2010-07-07 |
| WO2009053340A1 (en) | 2009-04-30 |
| EP2203468B1 (en) | 2011-09-07 |
| EP2203468B8 (en) | 2012-03-07 |
| RU2503686C2 (ru) | 2014-01-10 |
| ES2313848A1 (es) | 2009-03-01 |
| IL205260A0 (en) | 2010-12-30 |
| BRPI0818574A2 (pt) | 2015-04-22 |
| PT2203468E (pt) | 2011-12-20 |
| AU2008314669A1 (en) | 2009-04-30 |
| JP2011502110A (ja) | 2011-01-20 |
| US20120289459A1 (en) | 2012-11-15 |
| CN101835795A (zh) | 2010-09-15 |
| CA2703368A1 (en) | 2009-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2313848B1 (es) | Nuevos peptidos antivirales que impiden la union del virus a dlc8. | |
| ES2533352T3 (es) | Proteínas de fijación al antígeno receptor A de la IL-17 | |
| ES2296665T3 (es) | Proteina cinco-helice. | |
| Chen et al. | Novel recombinant engineered gp41 N-terminal heptad repeat trimers and their potential as anti-HIV-1 therapeutics or microbicides | |
| Jiang et al. | A salt bridge between an N-terminal coiled coil of gp41 and an antiviral agent targeted to the gp41 core is important for anti-HIV-1 activity | |
| ES2346771T3 (es) | Peptidos con multiples dominios a-helicoidales anfipaticos y procedimientos para su uso. | |
| ES2253241T3 (es) | Detivados cilutrinados de la fibrina y su utilizacion para el diagnostico o el tratamiento de la poliartritis reumatoide. | |
| RU2013109273A (ru) | Полипептиды, используемые для лечения и/или подавления инфекций, вызываемых вирусом гриппа | |
| Kobs-Conrad et al. | Engineered topographic determinants with alpha beta, beta alpha beta, and beta alpha beta alpha topologies show high affinity binding to native protein antigen (lactate dehydrogenase-C4). | |
| Qi et al. | A recombinant mimetics of the HIV-1 gp41 prehairpin fusion intermediate fused with human IgG Fc fragment elicits neutralizing antibody response in the vaccinated mice | |
| US20050256056A1 (en) | Peptide inhibitors of HIV | |
| WO1994016109A9 (en) | Membrane fusion events and means for altering same | |
| Hayouka et al. | A comparative study of backbone versus side chain peptide cyclization: application for HIV-1 integrase inhibitors | |
| CA2414308A1 (en) | Transport peptides derived from erns protein, cytotoxic rnase of ribosome-inactivating protein or a rsv g-protein and analogues thereof | |
| WO2016092380A1 (es) | Anticuerpos monoclonales especificos del antigeno m del virus metapneumovirus humano (hmpv) y su uso en un metodo de diagnostico | |
| Shepperson et al. | Thiol–ene enabled preparation of S-lipidated anti-HBV peptides | |
| Besselaar et al. | The effect of neutralizing monoclonal antibodies on early events in Rift Valley fever virus infectivity | |
| Zhu et al. | Design and characterization of viral polypeptide inhibitors targeting Newcastle disease virus fusion | |
| Osman et al. | Microwave assisted peptide synthesis of some rationally designed cell penetrating peptides from c-kit receptor | |
| ES2275305T3 (es) | Peptidos sinteticos utilizables en los ensayos biologicos para la deteccion de infecciones debidas a los virus vih-1 del grupo o. | |
| JP7333538B2 (ja) | 抗ウイルス性ペプチドおよびその利用 | |
| ES2369771T3 (es) | Péptidos y su uso para el tratamiento de infecciones por vih. | |
| GB2354241A (en) | Regulatory/unfolding peptides of ezrin | |
| US20070167366A1 (en) | Peptide with putative role in cytoskeletal protection | |
| Yamamoto et al. | The Dansyl Group as a Molecular Probe for the Histochemical Localization of a Synthetic Fibronectin-related Peptide. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20090301 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2313848B1 Country of ref document: ES |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180912 |