MXPA04005611A - Reactivos y conjugados de transporte de guanidinio. - Google Patents

Abstract

Se describen reactivos y conjugados de transporte de agentes terapeuticos; en particular, los reactivos de transporte tienen una pluralidad de porciones de guanidino que estan contiguas o espaciadas a lo largo de un esqueleto, pero son removidos suficientemente del esqueleto a traves de ligaduras para permitir su interaccion con una superficie de celula o tejido, dando como resultado la incorporacion del agente terapeutico.

Description

REACTIVOS Y CONJUGADOS DE TRANSPORTE DE GUANIDINIO DECLARACION RESPECTO A INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACION Y DESARROLLO CON APOYO FEDERAL Esta invención se realizó con el apoyo de la subvención NIH No. CA 65237. Por lo tanto, el gobierno de E.U.A. tiene ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a métodos y composiciones que son efectivos para incrementar el transporte de agentes biológicamente activos, tales como compuestos orgánicos, polipéptidos, oligosacáridos, ácidos nucleicos y iones de metal, a través de las membranas biológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las membranas plasmáticas de las células representan una barrera para el paso de muchos agentes terapéuticos útiles. En general, un fármaco debe ser libremente soluble tanto en los compartimientos acuosos del cuerpo como en las capas lipídicas que debe atravesar para entrar a las células. En particular, las moléculas altamente cargadas experimentan dificultad para atravesar las membranas. Muchas macromoléculas terapéuticas, tales como péptidos y oligonucleótidos, también son particularmente intratables para su transporte a través de las membranas. De esta manera, aunque la biotecnología ha puesto disponible una gran cantidad de agentes terapéuticos potencialmente valiosos, las cuestiones de biodisponibilidad frecuentemente obstaculizan su utilidad médica. Por lo tanto, existe la necesidad de medios confiables para transportar fármacos a las células, particularmente macromoléculas. La presente invención se basa en parte en el descubrimiento del solicitante de que la conjugación de ciertos oligómeros o polímeros con moléculas pequeñas o macromoléculas, es efectiva para incrementar significativamente el transporte de la molécula unida a través de las membranas biológicas. Los reactivos de transporte contienen subunidades altamente básicas interrumpidas por subunidades neutras o que tienen un esqueleto más grande para proveer una separación adecuada entre los grupos básicos (por ejemplo grupos guanidino o amidino).

DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye, en un aspecto, un método para incrementar el transporte de un compuesto seleccionado a través de una membrana biológica. En el método, una membrana biológica se pone en contacto con un conjugado que contiene un agente biológicamente activo que está unido covalentemente a por lo menos un reactivo de transporte. El conjugado es efectivo para promover el transporte del agente a través de la membrana biológica, a una velocidad mayor que la velocidad de transporte de transmembrana del agente biológico en forma no conjugada. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención provee un compuesto que tiene la fórmula: en donde el subíndice m es un entero de 6 a 50; T representa un primer grupo funcional terminal protegido o sin proteger, un grupo de enlace protegido o sin proteger, o un grupo de enlace que tiene unido un agente biológicamente activo; y W representa un segundo grupo funcional terminal protegido o sin proteger, un grupo de enlace protegido o sin proteger, o un grupo de enlace que tiene unido un agente terapéutico. En la porción de subunidad (encerrada entre corchetes), el subíndice n puede ser 0, 1 o 2; cada X' es una subunidad de esqueleto en donde el superíndice i es un entero de 1 a m y denota la posición adelante de W; cada Y' se selecciona de H, una cadena lateral de aminoácido, arílo y heteroarilo, cuando el subíndice n es 0; o se selecciona de alquileno de C C8, alquenileno de C2-C8, alquinileno de C2-C8, heteroalquileno de C2-C8, cicloalquilalquileno de C3-C8, espirocicloalquileno de C2-C8, arileno, heteroarileno, y combinaciones de los mismos, cuando el subíndice n es 1 o 2; cada Z' es una porción de guanidinio seleccionada preferiblemente de: en donde la línea ondulada denota el punto de unión con Y'. Por consiguiente, para cada una de las subunidades, el subíndice n indica la presencia o ausencia de una o más porciones de guanidinio Z en cada posición i; con la condición de que el compuesto tenga por lo menos 4 porciones guanidinio, que pueden ser las mismas o diferentes. Más específicamente, W y T pueden ser grupos funcionales tales como hidroxi, tiol, carboxi, carboxamida, aldehido y similares, que pueden estar en una forma protegida o sin proteger. Grupos protectores adecuados para varios grupos funcionales se describen por ejemplo en Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2a. edición, John Wiley & Sons, New York, New York, 1991 . Adicionalmente, o T o W, o ambos, pueden ser un grupo de enlace que es un vestigio de la qu ímica de unión usada durante la síntesis del reactivo de transporte sobre un soporte sólido, o un grupo de enlace usado para unir un agente biológicamente activo. Para las modalidades en donde cualquiera de T o W es un grupo de enlace usado para unir un agente biológicamente activo, el grupo de enlace es preferiblemente un grupo que es escindible in vivo y produce la liberación del agente terapéutico del reactivo de transporte. Los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se pueden usar para incrementar el transporte de agentes terapéuticos seleccionados a través de muchas membranas biológicas, incluyendo sin limitación, membranas de células eucarióticas, membranas de células procarióticas y paredes celulares. Las membranas celulares procarióticas ejemplares incluyen membranas bacterianas. Las membranas celulares eucarióticas ejemplares de interés incluyen, sin limitación, membranas de células dendríticas, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, células de músculo, células de hongo, células bacterianas, células vegetales y similares. Los agentes biológicamente activos (que abarcan agentes terapéuticos y fármacos, ya que los términos se usan intercambiablemente) incluyen, sin limitación, iones de metal, que son suministrados típicamente como quelatos de metal; moléculas orgánicas pequeñas tales como moléculas anticancerosas (por ejemplo taxano) y antimicrobianas (por ejemplo contra bacterias u hongos tales como levadura); y macromoléculas como ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y análogos de los mismos. En una modalidad preferida, el agente es un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico, tal como un ribozima que contiene opcionalmente una o más subunidades de 2'-desoxi-nucleótido para mayor estabilidad. Alternativamente, el agente es un ácido nucleico péptido (PNA). En otra modalidad preferida, el agente es un polipéptido tal como un antígeno de proteína, y la membrana biológica es una membrana celular de una célula presentadora de antígeno (APC). El agente puede estar enlazado al reactivo de transporte por medio de un grupo de enlace que puede impartir flexibilidad conformacional dentro del conjugado y facilitar las interacciones entre el agente y su blanco biológico. En una modalidad, el grupo de enlace es un enlazador escindible, por ejemplo que contiene un grupo de enlace que es escindible por una enzima o por escisión mediada por solvente, tal como un grupo éster, amida o disulfuro. En otra modalidad, el enlazador escindible contiene un grupo fotoescindible. En una modalidad más especifica, el enlazador escindible contiene un primer grupo escindible que es distante del agente biológicamente activo, y un segundo grupo escindible que es cercano al agente, de tal manera que la escisión del primer grupo escindible produce un conjugado enlazador-agente que contiene una porción nucleofílica capaz de reaccionar intramolecularmente para soltar el segundo grupo escindible, liberando así el agente del enlazador y el reactivo de transporte. En otro aspecto, la invención provee un método para examinar una pluralidad de conjugados para determinar una actividad biológica seleccionada, en donde los conjugados se forman de una pluralidad de agentes candidatos. Los conjugados se ponen en contacto con una célula que exhibe una señal detectable después de su incorporación en la célula, de tal manera que la magnitud de la señal es indicativa de la eficacia del conjugado con respecto a la actividad biológica seleccionada. Este método es particularmente útil para analizar las actividades de agentes que por si solos son incapaces, o poco capaces, de entrar a las células para manifestar actividad biológica. En una modalidad, los agentes candidatos se seleccionan de una colección combinatoria. La invención también incluye una colección de conjugados que es útil para realizar el examen antes mencionado. En otro aspecto, la invención incluye una composición farmacéutica para suministrar un agente biológicamente activo a través de una membrana biológica. La composición comprende un conjugado que contiene un agente biológicamente activo unido covalentemente a por lo menos un reactivo de transporte como se describe arriba, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. El reactivo de transporte es efectivo para impartir al agente biológicamente activo una velocidad de transporte de transmembrana que es mayor que la velocidad de transporte de transmembrana del agente biológicamente activo en forma no conjugada. La composición, adicionalmente, se puede empacar con instrucciones de uso. En otro aspecto, la invención incluye un método terapéutico para tratar un sujeto mamífero, particularmente un sujeto humano, con una composición farmacéutica como la que se describió anteriormente.

Estos y otros objetos y características de la invención se harán muy evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención en conjunto con los dibujos anexos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1 A, 1 B y 1 C proveen comparaciones de histograma entre reactivos de transporte de carbamato y reactivos de transporte de poliArg.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I . Definiciones El término "membrana biológica", como se usa aquí, se refiere a una barrera que contiene lípido que separa las células o grupos de células del espacio extracelular. Las membranas biológicas incluyen, sin limitación, membranas plasmáticas, paredes celulares, membranas de organelos intracelulares tales como membrana mitocondrial, membranas nucleares, y similares. El término "concentración de transmembrana" se refiere a la concentración de un compuesto presente en el lado de una membrana que es opuesto o "trans" al lado de la membrana al que se ha agregado una composición particular. Por ejemplo, cuando un compuesto se agrega al fluido extracelular de una célula, la cantidad del compuesto medida subsiguientemente dentro de la célula es la concentración de transmembrana del compuesto. "Agente biológicamente activo" o "sustancia biológicamente activa" o "agente biológico" se refiere a una sustancia química, tal como una molécula pequeña, macromolécula, o ion de metal, que ocasiona un cambio observable en la estructura, función o composición de una célula después de ser incorporado en la célula. Los cambios observables incluyen un aumento o reducción de la expresión de uno o más ARNms, aumento o reducción de la expresión de una o más proteínas, fosforilación de una proteína u otro componente celular, inhibición o activación de una enzima, inhibición o activación de la unión entre miembros de un par de unión , un aumento o reducción de la velocidad de síntesis de un metabolito, un aumento o reducción de la proliferación celular, y similares. El término "macromolécula", como se usa aqu í, se refiere a moléculas grandes (PM mayor de 1000 daltons), ejemplificadas, sin limitación, por péptidos, proteínas, oligonucleótídos y polinucleótidos de origen biológico o sintético. Una "molécula orgánica pequeña" se refiere a un agente que contiene carbono que tiene un peso molecular (PM) de aproximadamente 100 a 1000. Los términos "agente terapéutico", "composición terapéutica" y "sustancia terapéutica", se refieren sin limitación a cualquier composición que se puede usar para beneficio de una especie de mamífero. Tales agentes pueden tomar la forma de iones, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, proteínas o polipéptidos, oligonucleótidos y oligosacáridos, por ejemplo. Los términos "agente no polipeptídico" y "agente terapéutico no polipeptídico" se refieren a la porción de un conjugado de transporte que no incluye el reactivo de transporte, y que es un agente biológicamente activo diferente de un polipéptido. Un ejemplo de un agente no polipeptídico es un oligonucleótido de antisentído, que se puede conjugar con un reactivo de transporte para formar un conjugado para incrementar el suministro a través de las membranas biológicas. El término "polímero" se refiere a una cadena lineal de dos o más subunidades idénticas o no idénticas unidas por enlaces covalentes. Un péptido es un ejemplo de un polímero que puede estar compuesto de subunidades de aminoácido idénticas o no idénticas que están unidas por enlaces peptídicos. El término "péptido", como se usa aquí, se refiere a un compuesto formado de una sola cadena de aminoácidos D- o L-, o una mezcla de D- y L-aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Generalmente, los péptidos contienen por lo menos dos residuos de aminoácido y son de menos de 50 aminoácidos de longitud. El término "proteína", como se usa aquí, se refiere a un compuesto que está formado por aminoácidos dispuestos linealmente unidos por enlaces peptídicos, pero a diferencia de los péptidos, tiene una conformación bien definida. Las proteínas, a diferencia de los péptidos, consisten generalmente de cadenas de 50 aminoácidos o más. "Polipéptido", como se usa aquí, se refiere a un polímero de por lo menos dos residuos de aminoácido y que contiene uno o más enlaces peptídicos. "Polipéptido" abarca péptidos y proteínas, sin importar si el polipéptido tiene una conformación bien definida. El término "alquilo", solo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique de otra manera, un radical hidrocarburo de cadena recta o ramificada , o cíclico, o combinaciones de los mismos, que puede estar completamente saturado, mono- o poliinsaturado, y puede incluir radicales divalentes y multivalentes, que tiene el número de átomos de carbono designado (es decir, C 1-C10 significa de uno a diez carbonos). Ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de los mismos, por ejemplo n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1 ,4-pentadienilo), etinilo, 1 - y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos superiores e isómeros. El término "alquileno", solo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de un alcano, ejemplificado por -CH2CH2CH2CH2-. Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, siendo preferidos en esta invención los grupos que tienen 10 átomos de carbono o menos. Un "alquilo inferior" o "alquenilo inferior" es un grupo alquilo o alquenilo de cadena más corta, generalmente que tiene seis átomos de carbono o menos. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional y se refieren a los grupos alquilo unidos al resto de la molécula por medio de un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo", solo o en combinación con otro término, a menos que se indique de otra manera, significa un radical hidrocarburo estable de cadena recta o ramificada o cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste del número indicado de átomos de carbono y de uno a tres heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de O, N, Si y S, y en donde opcionaimente los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar oxidados y opcionaimente el heteroátomo de nitrógeno puede estar cuaternizado. Los heteroátomos O, N y S pueden estar colocados en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo. El heteroátomo Si puede estar colocado en cualquier posición del grupo heteroalquilo, incluyendo la posición en la cual el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(0)-CH3. -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Pueden ser consecutivos hasta dos heteroátomos, tal como por ejemplo -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-S¡(CH3)3- Similarmente, el término "heteroalquileno", solo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, ejemplificado por -CH2-CH2-S-CH2CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar cualquiera de los extremos de la cadena, o ambos (por ejemplo alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Además, para grupos de enlace alquileno y heteroalquileno no está implicada ninguna orientación del grupo de enlace. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", solos o en combinación con otros términos, a menos que se indique de otra manera, representan versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo está unido al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, 1 -ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, y similares. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen 1 -(1 ,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Los términos "halo" o "halógeno", solos o como parte de otro sustituyente, a menos que se indique de otra manera, significan un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Adicionalmente, los términos tales como "haloalquilo" incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "haloalquilo de C C4" incluye trrfluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y similares. El término "arilo", a menos que se indique de otra manera, significa un sustituyente hidrocarburo poliinsaturado, típicamente aromático, que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (hasta tres anillos) que se fusionan entre sí o se enlazan covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de cero a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O y S, en donde opcionalmente los átomos de nitrógeno y azufre están oxidados, y opcionalmente los átomos de nitrógeno están cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede estar unido al resto de la molécula por medio de un heteroátomo. Ejemplos no limitativos de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-píridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolílo, 1 -isoquinolílo, 5-isoquínolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo arriba indicados se seleccionan del grupo de los sustituyentes aceptables que se describen mas abajo. Por brevedad, el término "arilo", cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos tanto arilo como heteroarilo como los que se definen arriba. De esta manera, el término "arilalquilo" incluye los radicales en los cuales un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo bencilo, fenetilo, plridilmetilo y similares), incluyendo los grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (por ejemplo un grupo metileno) ha sido reemplazado por ejemplo con un átomo de oxígeno (por ejemplo fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1 -naftiloxi)propilo y similares). Todos los términos anteriores (por ejemplo "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") incluyen formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proveen a continuación. Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo los grupos referidos frecuentemente como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo), pueden ser una variedad de grupos seleccionados de: -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R'", -OC(0)R\ -C(0)R\ -C02R', -CONR'R", -OC(0)NR,R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"\ -NR"C(0)2R', -NH-C(NH2)=NH , -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR\ -S(0)R\ -S(0)2R', -S hNR'R" -CN y -N02 en un número que varía de cero a (2m'+1 ), en donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. Cada uno de R', R" y R'" se refiere independientemente a grupos hidrógeno, alquilo de C-i-C8 no sustituido y heteroalquilo, arilo no sustituido, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo no sustituido, alcoxi o tioalcoxi, o grupos aril-alquilo de Ci-C4. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. De los sustituyentes anteriormente expuestos, el experto en la materia entenderá que el término "alquilo" incluye grupos tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3l -C(0)CH2OCH3, y similares). Preferiblemente, los grupos alquilo y heteroalquilo sustituidos tienen de 1 a 4 sustituyentes, de preferencia 1 , 2 o 3 sustituyentes. Son excepciones los grupos perhaloalquilo (por ejemplo, pentafluoroetilo y similares) que también son preferidos y contemplados por la presente invención. Similarmente, los sustituyentes de los grupos arilo y heteroarilo varían y se seleccionan de: -halógeno, -OR', -OC(0)R\ -NR'R", -SR', -R\ -CN, -N02, -C02R\ -CONR'R", -C(0)R', -OC(0)NR,R", -NR"C(0)R\ -NR"C(0)2R', -NR'-C(0)NR"R"'I -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR", -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, perfluoroalcoxi de C,-C4, y perfluoroalquilo de C1 -C4, en un número que varia de cero hasta el número total de valencias abiertas sobre el sistema de anillo aromático; y en donde R', R" y R'" se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C C8 y heteroalquilo, arilo no sustituido y heteroarilo, aril(no sustituido)-alquilo de Ci-C y aril(no sustituido)oxi-alquilo de C1 -C4. Opcionalmente dos de los sustituyentes sobre átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo, pueden estar reemplazados con un sustituyente de la fórmula -T-C(0)-(CH2)q-U-, en donde T y U son independientemente -NH-, -O-, -CH2- o un enlace sencillo, y q es un entero de 0 a 2. Alternativamente, dos de los sustituyentes sobre átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo opcionalmente pueden estar reemplazados con un sustituyente de la fórmula -A-(CH2)r-B-, en donde A y B son independientemente -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2NR'- o un enlace sencillo, y r es un entero de 1 a 3. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo así formado puede estar reemplazado opcionalmente con un doble enlace. Alternativamente, dos de los sustituyentes sobre átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo, opcionalmente pueden estar reemplazados con un sustituyente de la fórmula -(CH2)s-X-(CH2)t-, en donde s y t son independientemente enteros de 0 a 3, y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(0)r o -S(0)2NR'-. El sustituyente R' en -NR'- y -S(0)2NR'- se selecciona de hidrógeno o alquilo de CrC6 no sustituido. Como se usa aqu í, el término "heteroátomo" incluye oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S) y silicio (Si). Los términos "guanidilo", "guanidinilo" y "guanidino" se usan intercambiablemente para referirse a una porción que tiene la fórmula -HN-C(=NH)NH2 (en forma sin protonar). Como un ejemplo, la arginina contiene una porción guanidilo (guanidino), y también es referida como ácido 2-amino-5-guanidinovalérico o ácido oc-amino-ó-guanidinovalérico. "Guanidinio" se refiere a la forma ácida conjugada cargada positivamente. En la presente invención son útiles ambos grupos, guanidino y guanidinio, y con frecuencia se usan intercambiablemente.

"Amidinilo" y "amidino" se refieren a una porción que tiene la fórmula -C(=NH)(NH2). "Amidinio" se refiere a la forma conjugada ácida cargada positivamente. El término "poli-arginina" o "poli-Arg" se refiere a una secuencia polimérica compuesta de residuos de arginina contiguos; poli-L-arginina se refiere a todas las L-argininas; poli-D-arginina se refiere a todas las D-argininas. Poli-L-arginina también se abrevia con una mayúscula "R" seguida por el número de L-argininas en el péptido (por ejemplo R8 representa un octámero de residuos de L-arginina contiguos); poli-D-arginina se abrevia con una letra minúscula "r" seguida por el número de D-argininas en el péptido (r8 representa un octámero de residuos de D-arginina contiguos). Los residuos de aminoácido son referidos aquí por sus nombres completos o por notaciones estándares de una letra o de tres letras: A, Ala, alanina; C, Cys, cisteína; D, Asp, ácido aspártico; E, Glu, ácido glutámico; F, Fe, fenilalanina; G, Gly, glicina; H, His, histidina; I, lie, isoleucina; K, Lys, lisina; L, Leu, leucina; M, Met, metionina; N, Asn, asparagina; P, Pro, prolina; Q, GIn, glutamina; R, Arg, arginina; S, Ser, serina; T, Thr, treonina; V, Val, valina; W, Trp, triptófano; X, Hyp, hidroxiprolina; Y, Tyr, tirosina.

I I. Reactivos y conjugados de transporte de quanidinio A. Generalidades La presente invención provee una variedad de reactivos de transporte que son útiles para incrementar el suministro de un agente biológicamente activo a un sitio particular (por ejemplo a células a través de tejidos como el tejido epitelial). Los reactivos y conjugados de transporte de la presente invención contienen oligómeros o polímeros de longitud corta de 5 a 50 subunidades, una porción de las cuales tiene unidos grupos guanidinio. El reactivo de transporte es efectivo para incrementar la velocidad de transporte del conjugado (reactivo de transporte-grupo de enlace-agente biológico) a través de la membrana biológica con respecto a la velocidad de transporte del agente biológico solo no conjugado. Aunque en algunas modalidades los reactivos de transporte contienen péptidos o aminoácidos, la invención no está limitada a estos, ya que los reactivos de transporte contienen esqueletos o subunidades no peptidicas como se expone mas abajo. Los reactivos de transporte de la presente invención generalmente se construyen para proveer separación adecuada entre los grupos guanidinio de cabeza. Se puede lograr una separación adecuada insertando subunidades que no contienen guanidinio en el reactivo de transporte, o construyendo subunidades que contienen guanidinio que tienen cadenas de esqueleto más grandes, aumentando asi la distancia entre los grupos guanidinio de cabeza (cuando están protonados). A continuación se ilustra el concepto general de los presentes reactivos de transporte. Como puede verse, cualquiera de W y T o ambos pueden ser grupos funcionales (por ejemplo amino, hidroxi, ácido carboxilico, y similares) o grupos funcionales protegidos, grupos de enlace que llevan grupos funcionales protegidos o sin proteger, o grupos de enlace que tienen unidos agentes terapéuticos. También se representan las porciones de subunidad y se ilustran tanto subunidades que contienen guanidinio como subunidades espaciadoras. También se ilustran las porciones de subunidades para dar la estructura de los términos esqueleto, cadena lateral y grupo de cabeza. Finalmente se provee una fórmula de reactivo de transporte de guanidinio espaciado como una ilustración de los reactivos que tienen separación equivalente, aunque la invención no está limitada a esto. - subunidad subunidad contiene espaciadora guanidinio de guanidino o guanidinio Reactivo de transporte de guanidinio espaciado En vista de lo anterior, algunos reactivos de transporte se pueden representar como oligómeros de las siguientes fórmulas: poli-G*, (G*SpG*)nG*, (G*Sp)nG\ (G*SpSp)nG* y (G*SpSpSp)nG*. "G*" en las fórmulas es una subunidad que contiene guanidino y "S " es una subunidad (o espaciador) que no contiene una porción guanidino ni amidino. El subíndice "n" es un entero que varía de 2 a 25. Los oligómeros que tienen las separaciones descritas tienen la ventaja de que se preparan fácilmente en forma de bloques, esto es, sintetizando grupos tales como por ejemplo G*SPSP y enlazándolos entre sí para formar un reactivo de transporte completo. En las fórmulas anteriores de la porción de transporte, la letra "Sp" puede representar un aminoácido natural o no natural, o cualquier otra subunidad descrita más abajo que carece de un grupo guanidino o amidino. Para las modalidades en las que Sp es un aminoácido, el aminoácido puede ser esencialmente cualquier compuesto que tenga (antes de su incorporación a la porción de transporte) un grupo amino (NH2 o NH-alquilo) y un grupo ácido carboxilico (C02H), y no contiene una porción guanidilo ni amidinilo. Ejemplos de dichos compuestos incluyen D y L-alanina, D y L-cisteína, ácido D y L-aspártico, ácido D y L-glutámico, D y L-fenilalanina, glicina, D y L-histidina, D y L-isoleucina, D y L-lisina, D y L-leucina, D y L-metionina, D y L-asparagina, D y L-prolina, D y L-glutamina, D y L-serina, D y L-treonina, D y L-valina, D y L-triptófano, D y L-hidroxiprolina, D y L-tirosina, sarcosina, ß-alanina, ácido ?-aminobutírico y ácido e-aminocaproico. En cada una de las fórmulas anteriores, cada Sp será independiente de cualquier otro Sp presente en la porción de transporte, aunque en algunas modalidades todos los grupos Sp pueden ser los mismos. En un grupo preferido de modalidades, la porción de transporte tiene la fórmula (G*SpG*)nG*, en donde cada "Sp" se selecciona independientemente de glicina, -alanina, ácido ?-aminobutírico y ácido e-aminocaproico, "G*" es preferiblemente un carbamato, etilendiamina, aza-aminoácido, o un ?-aminoácido, y n es preferiblemente un entero que varía de 2 a 5. Muy preferiblemente, cada "Sp " es glicina o ácido e-aminocaproico y n es 3. Dentro de este grupo de modalidades se prefiere usar glicina para aquellas composiciones en las que el reactivo de transporte se une covalentemente de manera directa con un agente biológico polipéptido. Para las modalidades en las que se va a ensamblar la porción de transporte usando por ejemplo métodos en fase sólida, se prefiere el ácido e-aminocaproico.

En otro grupo de modalidades preferidas, el reactivo de transporte tiene la fórmula (G*Sp)nG*, en donde cada "Sp" se selecciona preferiblemente de glicina, -alanina, ácido ?-aminobutírico y ácido e-aminocaproico; "G*" es preferiblemente un carbamato, etilendiamina , aza-aminoácido, o un ?-aminoácido, y n es preferiblemente un entero que varía de 3 a 10. Muy preferiblemente, cada "Sp" es glicina o ácido e-aminocaproico y n es 3, 4, 5 o 6. Como con el grupo anterior de modalidades específicas, se prefiere usar glicina en las composiciones en las que la porción de transporte se fusiona o une covalentemente de modo directo con un agente biológico polipéptido, de tal manera que la composición completa se puede preparar mediante métodos recombinantes. Para la construcción de la porción de transporte en solución o en fase sólida se prefiere el ácido e-aminocaproico. En otro grupo más de modalidades preferidas la porción de transporte tiene la fórmula (G*SpSp)nG*, en donde cada "Sp" se selecciona preferiblemente de glicina, -alanina, ácido ?-aminobutírico y ácido e-aminocaproico; "G*" es preferiblemente un carbamato, etilendiamina, aza-aminoácido, o un ?-aminoácido, y n es preferiblemente un entero que varía de 4 a 10. Muy preferiblemente, cada "Sp" es glicina o ácido e-aminocaproico y n es 6. En otro grupo de modalidades preferidas, la porción de transporte tiene la fórmula (G*SpSpSp)nG*, en donde cada "Sp" se selecciona preferiblemente de glicina, -alanina, ácido ?-aminobutírico y ácido e-aminocaproico; "G*" es preferiblemente un carbamato, etilendiamina, aza- aminoácido, o un ?-aminoácido, y n es preferiblemente un entero que varía de 4 a 10. Muy preferiblemente, cada "Sp" es glicina y n es 6. Aunque la separación entre porciones de cadena lateral adyacentes usualmente será consistente de subunidad a subunidad (ilustrado por la naturaleza repetitiva de los grupos anteriores), los reactivos de transporte usados en la invención también pueden incluir separación variable entre porciones de cadena lateral a lo largo del esqueleto. En otras modalidades, cada uno de los grupos Sp será seleccionado para incrementar ciertas propiedades deseadas de la porción de transporte. Por ejemplo, cuando se buscan porciones de transporte con un carácter más hidrofóbico, cada S se puede seleccionar de los aminoácidos naturales que típicamente se agrupan entre sí como aminoácidos hidrofóbicos (por ejemplo fenilalanina, fenilglicina, valina, leucina, isoleucina). Los reactivos de transporte que tienen un carácter más hidrofílico se pueden preparar similarmente cuando algunos o todos los grupos Sp son aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo lisina, serina, treonina, ácido glutámico, y similares). El experto en la materia apreciará que el reactivo de transporte puede ser de fórmula (G*SpSp)nG*, pero con aminoácidos adicionales que flanquean esta porción (por ejemplo Xm(G*SpSp)nG*-Xp, en donde los subíndices m y p representan enteros de cero a 1 0 aproximadamente y cada X es independientemente un aminoácido natural o no natural). De esta manera, se puede ver que la porción de transporte tiene cierto carácter de péptido en el sentido de que puede tener un extremo carboxi y un extremo amino. Por lo menos uno de los extremos, preferiblemente, está unido covalentemente a un agente biológicamente activo o, alternativamente, a un grupo de enlace que es parte de un conjugado reactivo de transporte - grupo de enlace - agente biológico. En otras modalidades, el agente biológicamente activo se puede unir al reactivo de transporte por medio de un grupo de enlace que a su vez está unido a un grupo funcional de cadena lateral (por ejemplo el grupo hidroxilo de un residuo de serina, el grupo amino de un residuo de lisina, el grupo ácido carboxílico de un residuo de ácido glutámico, y similares). En un aspecto importante de la invención, los conjugados de la invención son particularmente útiles para transportar agentes biológicamente activos a través de membranas de células u organelos, cuando los agentes son del tipo que requiere transporte de transmembrana para ejercer sus efectos biológicos, y que no exhiben sus efectos biológicos principalmente por unión a un receptor de superficie, es decir, de tal modo que no ocurre la entrada del agente. Además, los conjugados son particularmente útiles para transportar agentes biológicamente activos del tipo que requiere transporte de transmembrana para exhibir sus efectos biológicos, y que por si solos (sin conjugación con un reactivo de transporte o alguna otra modificación), son incapaces, o poco capaces de entrar a las células para manifestar su actividad biológica. En general, el reactivo de transporte usado en los presentes conjugados incluye preferiblemente un esqueleto lineal de subunidades. El esqueleto usualmente comprenderá átomos seleccionados de carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, usualmente siendo de carbono la mayoría de los átomos de la cadena del esqueleto. Las subunidades opcionalmente contendrán una porción de cadena lateral que incluye un grupo guanídino o amidino terminal, aunque algunas subunidades no contendrán un grupo guanidino ni amidino y se insertarán en el esqueleto para proveer separación entre las subunidades que contienen guanidino o amidino que sirven para facilitar la incorporación a una célula o a través de un tejido. Las porciones de cadena lateral se extienden en alejamiento del esqueleto, de tal manera que el átomo de carbono central de guanidino o amidino (al que están unidos los grupos NH2) está enlazado al esqueleto por medio de un enlazador de cadena lateral que contiene preferiblemente por lo menos 2 átomos de cadena enlazadores, más preferiblemente de 2 a 7 átomos de cadena, de tal manera que el átomo de carbono central es del tercero al octavo átomo de cadena en alejamiento del esqueleto. Los átomos de cadena están provistos preferiblemente como átomos de carbono de metileno, aunque también pueden estar presentes uno o más de otros átomos tales como oxígeno, azufre o nitrógeno. Preferiblemente, el enlazador de cadena lateral entre el esqueleto y el átomo de carbono central del grupo guanidino o amidino, tiene 4, 5 o 6 átomos de cadena de largo, ejemplificado por una cadena lateral de arginina (o una cadena lateral de homoarginina, etc.). Como se indicó arriba, el reactivo de transporte de la invención puede estar flanqueado por una o más subunidades que no son de guanidino ni de amidino (por ejemplo glicina, alanina o cisteína), o un enlazador tal como un grupo de ácido aminocaproico, que no afecta significativamente la velocidad de transporte de membrana del conjugado correspondiente, reactivo de transporte - grupo de enlace - agente biológico. También, cualquier grupo terminal amino libre puede estar bloqueado con un grupo bloqueador o grupo protector, tal como un grupo acetilo o bencilo, para prevenir la aparición de ubicuidad ¡n vivo. . El agente biológico a transportar se puede enlazar al reactivo de transporte de acuerdo con varias modalidades. En una modalidad preferida, el agente se enlaza a un solo reactivo de transporte, por enlace con un grupo funcional terminal en un extremo del reactivo de transporte, o con una subunidad interna dentro del polímero por medio de un grupo de enlace adecuado. En una segunda modalidad , el agente se une a más de un polímero de la misma forma arriba indicada. Esta modalidad es un poco menos preferida puesto que puede conducir a entrelazamiento de células adyacentes. En una tercera modalidad, el conjugado contiene dos porciones de agente unidas a cada extremo terminal del polímero. Para esta modalidad se prefiere que el agente tenga un peso molecular de menos de 10 kDa. Con respecto a la primera y tercera modalidad mencionadas, generalmente el agente no se une a una de las cadenas laterales de guanidino o amidino, de modo que quede libre para interaccionar con la membrana objetivo. Los conjugados de la invención se pueden preparar por medio de esquemas sintéticos directos. Además, los productos conjugados por lo regular son sustancialmente homogéneos en cuanto a longitud y composición, de modo que proveen mayor consistencia y reproducibilidad en sus efectos que las mezclas heterogéneas. De acuerdo con un aspecto importante de la presente invención, los solicitantes han encontrado que la unión de un solo reactivo de transporte con cualquiera de una variedad de tipos de agentes biológicamente activos, es suficiente para incrementar sustancialmente la velocidad de incorporación de un agente a través de las membranas biológicas, incluso sin requerir la presencia de una porción hidrofóbica grande en el conjugado. De hecho, la unión de una porción hidrofóbica grande puede impedir o prevenir significativamente el transporte a través de la membrana debido a la adhesión de la porción hidrofóbica a la bicapa lipidica. Por consiguiente, la presente invención incluye conjugados que no contienen porciones hidrofóbicas grandes, tales como moléculas de lípido y ácido graso.

B. Características estructurales de los reactivos y conjugados de transporte En vista de la anterior exposición, la presente invención provee, en un grupo de modalidades, compuestos que tienen la fórmula: en donde el subíndice m es un entero de 6 a 50; T representa un primer grupo funcional terminal protegido o sin proteger, un grupo de enlace protegido o sin proteger, o un grupo de enlace que tiene unido un agente biológicamente activo; y W representa un segundo grupo funcional terminal protegido o sin proteger, un grupo de enlace protegido o sin proteger, o un grupo de enlace que tiene unido un agente terapéutico. En la porción de subunidad (encerrada entre corchetes), el subíndice n puede ser 0, 1 o 2; cada X' es una subunidad de esqueleto en donde el superíndice i es un entero de 1 a m y denota la posición adelante de W; cada Y' se selecciona de H, una cadena lateral de aminoácido, arilo y heteroarilo, cuando el subíndice n es 0; o se selecciona de alquileno de C C8, alquenileno de C2-C8, alquinileno de C2-C8, heteroalquileno de C2-C8, cicloalquilalquileno de C3-C8, espirocicloalquileno de C2-C3, arileno, heteroarileno, y combinaciones de los mismos, cuando el subíndice n es 1 ; cada Z' es una porción de guanidinio seleccionada preferiblemente de: en donde la línea ondulada denota el punto de unión con Y1; y el subíndice n es 0, 1 o 2, indicando la ausencia o presencia de una porción de guanidinio Z en cada posición i; con la condición de que el compuesto tenga por lo menos 6 porciones guanidinio, que pueden ser las mismas o diferentes, e incluyen además las porciones ilustradas que tienen sustituyentes adicionales no interferentes (por ejemplo alquilo, heteroalquilo, y similares). Más particularmente, W y T pueden ser grupos funcionales tales como hidroxi, tiol, carboxi, carboxamída, aldehido, amino, y similares, que pueden estar en una forma protegida o sin proteger. Grupos protectores adecuados para varios grupos funcionales se describen por ejemplo en Greene y Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2a. edición, John Wiley & Sons, New York, New York, 1991 . Adicionalmente, o T o W o ambos pueden ser un grupo de enlace que es un vestigio de la química de unión usada durante la síntesis del reactivo de transporte sobre un soporte sólido, o un grupo de enlace usado para unir un agente terapéutico. Para las modalidades en donde cualquiera de T o W es un grupo de enlace, o un grupo de enlace unido a un agente biológicamente activo, el grupo de enlace es preferiblemente un grupo que sea escindible in vivo y que de como resultado la liberación del agente terapéutico del reactivo de transporte. Para agentes biológicamente activos que son inactivos hasta que se libera el reactivo de transporte unido, el enlazador es preferiblemente un enlazador fácilmente escindible, lo que significa que es susceptible de escisión enzimática o mediada por solvente in vivo. Para este fin, se prefieren enlazadores que contienen ésteres de ácido carboxílico y enlaces disulfuro, en donde los primeros grupos se hidrolizan enzimáticamente o químicamente, y los segundos son divididos por intercambio de disulfuro, por ejemplo en presencia de glutatión. En una modalidad preferida, el enlazador escindible contiene un primer grupo escindible que es distante al agente, y un segundo grupo escindible que es cercano al agente, de tal manera que la escisión del primer grupo escindible produce un conjugado enlazador-agente que contiene una porción nucleofílica capaz de reaccionar intramolecularmente para soltar el segundo grupo escindible, liberando así el agente del enlazador y el polímero. Esta modalidad se ilustra adicionalmente por medio de los diversos conjugados de molécula pequeña que se exponen más abajo. A continuación se presenta una exposición más completa de los componentes de este aspecto de la invención.

C. Componentes del reactivo de transporte Los reactivos de transporte de la presente invención (por ejemplo los compuestos de fórmula I en donde W y T son grupos funcionales terminales protegidos o sin proteger) pueden contener varias subunidades diferentes, incluyendo aminoácidos. En general, sin embargo, los reactivos y conjugados no se preparan completamente de aminoácidos naturales. Adicionalmente, los reactivos de transporte incluyen un componente de esqueleto, un componente de grupo de cabeza de guanidinio, que se presenta a continuación: y un componente de cadena lateral que une ese esqueleto con el grupo de cabeza, que se presenta a continuación.

Aminoácidos. En una modalidad, el reactivo de transporte incluye residuos de D o L-aminoácidos (por ejemplo algunos de -X'(-Y'-(Z')n) son aminoácidos). El uso de residuos de L-aminoácidos naturales en los reactivos de transporte tiene la ventaja de que los productos de descomposición serían relativamente inocuos para la célula u organismo. Las subunidades de aminoácido preferidas son arginina (ácido a-amino-ó-guanidinovalérico) y ácido a-amino-£-amidino-hexanoico (análogo de amidino isostérico). El grupo guanidinio en la arginina tiene un pKa de aproximadamente 12.5. Más generalmente, se prefiere que cada subunidad de polímero contenga una porción de cadena lateral altamente básica que (i) tenga un pKa mayor de 1 1 , de preferencia 1 2.5 o mayor, y (ii) contenga en su estado protonado por lo menos dos grupos amino (NH2) gemínales que comparten una carga positiva estabilizada por resonancia, que da a la porción un carácter bidentado. También se pueden usar otros aminoácidos, tales como ácido a-amino-P-guanidino-propiónico, ácido a-amino-Y-guanidino-butírico, o ácido a-amino-8-guanidino-caproico (que contienen 2, 3, o 5 átomos enlazadores, respectivamente, entre la cadena de esqueleto y el carbono de guanidinio central). También se pueden usar D-aminoácidos en los reactivos de transporte. Las composiciones que contienen exclusivamente D-aminoácidos tienen la ventaja de una degradación enzimática disminuida. Sin embargo, también pueden permanecer en gran parte intactos dentro de la célula objetivo. Tal estabilidad generalmente no es problemática si el agente es biológicamente activo cuando el polímero todavía está unido. Para agentes que son inactivos en forma conjugada se debe incluir dentro del conjugado un enlazador que es escindible en el sitio de acción (por ejemplo por escisión mediada por enzima o solvente dentro de una célula), para promover la liberación del agente en las células u organelos.

Otras subunidades. También se pueden seleccionar subunidades diferentes de aminoácidos para usarlos en la formación de reactivos de transporte. Dichas subunidades pueden incluir, sin limitación, hidroxi-aminoácidos, N-metil-aminoácidos, aminoaldehídos y similares, que producen polímeros con enlaces peptídicos reducidos. Se pueden usar otros tipos de subunidad, dependiendo de la naturaleza del esqueleto seleccionado, como se expone en la siguiente sección. i. Tipo de esqueleto Se puede usar una variedad de subunidades y tipos de esqueleto (por ejemplo componentes X1) para ordenar y colocar las porciones guanidino o amidino de cadena lateral. Generalmente se entiende que el término "subunidad de esqueleto" incluye cualquier enlace lineal de 2 a 8 átomos que está opcionalmente sustituido o tiene heteroátomos como miembros de la cadena de 2 a 8 átomos. Por ejemplo, las subunidades de esqueleto incluyen porciones de esqueleto de alquileno unidas por grupos tioéteres o sulfonilo, ésteres de hidroxiácido (equivalente a reemplazar enlaces amida con enlaces éster), reemplazando el carbono a de un a-aminoácido con nitrógeno para formar un análogo aza, porciones de esqueleto de alquileno unidas por grupos carbamato, polietileniminas (PEIs), y aminoaldehídos, que producen polímeros compuestos de aminas secundarias. Una lista de esqueletos más detallada incluye amida (CON reemplaza enlaces CONH), ésteres (C02), cetometileno (COCH2) reducido o metilenamino (CH2NH), tioamída (CSNH), fosfinato (P02RCH2), fosfonamidato y éster de fosfonamidato (P02RNH), retropéptido (NHCO), írans-alqueno (CR=CH), fluoroalqueno (CF=CH), dimetileno (CH2CH2), tioéter (CH2S), hidroxietileno (CH(OH)CH2), metilenoxi (CH20), tetrazol (CN4), retrotioamida (NHCS), retrorreducido (NHCH2), sulfonamido (S02NH), metilensulfonannido (CHRS02NH), retrosulfonamida (NHS02), y peptoides (glicinas N-sustituidas), y esqueletos con subunidades de malonato o gem-diaminoalquilo, por ejemplo como lo revisan Fletcher y otros (1998) y las referencias ahí citadas. También se pueden usar esqueletos peptoides (glicinas N-sustituidas) (por ejemplo, Kessler, 1 993; Zuckermann y otros, 1992; y Simón y otros, 992). Muchas de las sustituciones anteriormente mencionadas producen esqueletos de polímero aproximadamente isostéricos con respecto a los esqueletos formados de a-aminoácidos. Volviendo a la fórmula I, en cada una de las siguientes estructuras Z' representa un grupo guanidino o guanidinio (?' en la fórmula I ) y Y' indica un grupo de enlace de cadena lateral (es decir, el enlace entre Z' y X1 en la fórmula I ). El alcance de Y1 y Z' se describe más abajo en mayor detalle. La estructura I muestra una porción de un reactivo de transporte de péptido en la cual subunidades de aminoácido que tienen unidos grupos guanidino (por ejemplo arginina, homoarginina) están separados por aminoácidos que no contienen grupos guanidino (por ejemplo glicina). Véase también la publicación de patente internacional No. WO 02/065986. En la estructura I I se ilustra un reactivo de transporte que comprende subunidades de glicina y subunidades de glicina N-func¡onalizadas. Como resultado, la estructura I I es una combinación de un oligómero péptido/peptoide. De manera similar, la estructura II I se muestra como una combinación de subunidades de glicina (que no contiene guanidino) y una subunidad de aza-aminoácido que tiene unidos grupos guanidino. La estructura IV ilustra un oligómero de subunidades de ácido hidroxámico en donde las subunidades que llevan un grupo guanidino están separadas entre si por subunidades de ácido hidroxámico que no contienen guanidino. La estructura V ilustra el uso de un esqueleto de oligosacárido en donde un solo grupo guanidino está unido a cada subunidad de azúcar.

La estructura VI ¡lustra un reactivo de transporte de oligocarbamato en el cual un grupo guanidino está unido a cada subunidad monoméhca. En este grupo de modalidades, es suficiente la separación entre los grupos guanidino sin usar grupos separadores adicionales. Sin embargo, la invención contempla también las modalidades en donde se incorporan subunidades que no contienen guanidino (por ejemplo aminoácidos, aminoetilcarbonatos protegidos y similares). La estructura VI I ilustra un reactivo de transporte de poliamina (la construcción de la cual se muestra más abajo). La estructura VIII ilustra un reactivo de transporte preparado de ?-aminoácidos. Como con los reactivos de transporte de carbamato (véase la estructura VI ), cada subunidad se muestra con un grupo guanidino unido, pero se pueden usar aminoácidos adicionales (por ejemplo glicina, ß-alanina, ácido ?-aminobutírico, ácido e-aminocaproico, y similares) para proveer aún mayor separación entre los grupos guanidino a lo largo del esqueleto. La estructura IX ilustra un reactivo de transporte de "glutaramida" en el cual el esqueleto consiste de unidades de etilendiamina enlazadas entre sí por unidades de ácido glutárico. La preparación de estos reactivos de transporte se describe más abajo junto con los enlaces relacionados de "oxalamida" y "urea ".

Los estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención han utilizado tanto polipéptidos (por ejemplo esqueletos de péptido) como otros esqueletos (por ejemplo reactivos de transporte de carbamato), y demostraron que esqueletos alternativos pueden incrementar el suministro a través de una membrana biológica y también pueden proveer resistencia a la degradación enzimática in vivo. ii. Enlaces de la cadena lateral (?') En cada una de las fórmulas anteriores, el grupo Y1 indica un enlace entre el esqueleto y el grupo de cabeza de guanidino o guanidinio (Z1). La presente invención contempla una variedad de enlaces incluyendo alquileno de C Cs, alquenileno de C2-C8, alquinileno de C2-C8, heteroalquileno de C2-C8, cicloalquilalquileno de C3-C8, espirocicloalquileno de C2-C8, arileno, heteroarileno, y combinaciones de los mismos. A continuación se ilustran miembros de estos grupos, usando un grupo de cabeza de guanidinio y un esqueleto de péptido como una característica común para ilustrar los diversos enlaces de cadena lateral. la Ib le Id ?? X© le lh Como se ve arriba, el monómero la es una subunidad de L-arginina y el grupo de enlace de cadena lateral es -CH2CH2CH2-. El monómero Ib muestra una subunidad en la que el grupo de enlace de cadena lateral puede ser más corto (n = 0) o más largo (por ejemplo, n = 2, 3, 4) que el grupo de enlace de cadena lateral en arginina. Los monómeros le, Id y le ilustran grupos de enlace de cadena lateral que tienen sitios de insaturación. Para las subunidades en donde la cadena lateral contiene un grupo alqueno, la presente invención contempla cualquier orientación (E o Z, trans o cis). Todos los monómeros restantes muestran alguna porción de una estructura cíclica como parte del grupo de enlace de cadena lateral. En el monómero If, un anillo de ciclopropano forma un enlace entre el esqueleto y un grupo de cabeza de guanidinio, restringiendo la flexibilidad conformacional del grupo de enlace de cadena lateral. En el monómero Ig se muestra un anillo de fenilo como el grupo de enlace entre el esqueleto y el grupo guanidino. Modalidades relacionadas incluyen aquellas en donde otros grupos arilo o heteroarilo forman el grupo de enlace de cadena lateral (por ejemplo piridina, piridazina, naftaleno, bifenilo y similares). Adicionalmente, el enlace puede estar en una orientación 1 ,3- (o meta) como se muestra, o en una orientación 1 ,4- (o para) o 1 ,2- (u orto), o cualquier otra orientación que sirva para colocar el grupo guanidino en una posición lejos de la carga estérica del esqueleto. Adicionalmente, los enlaces de cadena lateral de grupo arileno o heteroarileno pueden tener sustituyentes que se seleccionan para proveer más o menos carácter electrónico al grupo de cabeza de guanidinio. Por ejemplo, un sustituyente nitro sobre un grupo de enlace de fenileno puede reducir el carácter electrónico del grupo de cabeza de guanidinio, mientras que un sustituyente donador de electrones (por ejemplo metoxí) puede aumentar el carácter electrónico del grupo de cabeza de guanidinio. El monómero Ih ilustra un grupo de enlace que tiene una porción de anillo espirocíclico. En Ih se muestra un anillo de cuatro miembros, pero también otros anillos (anillos carbocíclicos y heterocíclicos de 3, 5, 6 y 7 miembros) están dentro del alcance de la invención. El monómero li ilustra un grupo de enlace de cadena lateral, en donde una porción del grupo de enlace forma una estructura de anillo con una porción del esqueleto para restringir la libertad conformacional del grupo de enlace y también del grupo de cabeza de guanidinio. El monómero Ij ilustra un grupo de enlace de cadena lateral que tiene un anillo de cinco miembros en común con un átomo de nitrógeno del grupo de cabeza de guanidinio, mientras que el monómero Ik ilustra la combinación de un grupo de enlace de cadena lateral y un grupo de cabeza de guanidinio en una sola porción de 2-aminobencimidazol. El experto en la materia apreciará que se contemplan modalidades adicionales en las cuales los grupos de enlace de cadena lateral contienen heteroátomos como reemplazo para algunos de los átomos de carbono mostrados, o en donde se combinan características de dos o más de los monómeros arriba ilustrados en un solo grupo de enlace de cadena lateral. iii. Grupos de cabeza de guanidinio o grupos de quanidino (?') Como con los grupos de enlace de cadena lateral arriba descritos, la presente invención está dirigida a composiciones en donde Z' representa un grupo de cabeza de guanidino o guanidinio. Preferiblemente, cada Z' en el reactivo de transporte se selecciona independientemente de: en donde la línea ondulada denota el punto de unión con Y1. Otros grupos Z1 útiles son: más abajo se proveen monómeros que incorporan algunos de los grupos Z' de arriba. Por ejemplo, monómeros adecuados en un formato de esqueleto de aminoácido incluyen: Na ilb He lid para referencia con otros monómeros de arriba, Ha es un residuo de arginina (mostrado en una forma cargada positivamente). Los monómeros l lb y l ie ilustran grupos de cabeza de guanidino o guanidinio que están sustituidos con grupos R (R puede ser, por ejemplo, grupos alquilo o grupos arilalquilo). Los monómeros l id , l ie, l lf y l lg ilustran grupos de cabeza de guanidino o guanidinio en los cuales la porción de guanidinio es parte de un anillo heterocíclico (opcionalmente fusionado a un segundo anillo; véase l lg). Los monómeros llh, lli y l lj ilustran análogos de heteroátomo de grupos de cabeza de guanidino en donde el átomo de carbono central de la porción guanidino es reemplazada con un heteroátomo como fósforo, boro o azufre (por ejemplo ll h, l li y llj, respectivamente). El monómero llk ilustra un grupo de cabeza amidino/guanidinio combinado, de tal manera que el monómero tiene características electrónicas y esféricas similares a un residuo de arginina. ¡v. Modalidades preferidas Volviendo a la fórmula I de arriba, se prefieren varias modalidades para los reactivos de transporte y sus conjugados con agentes biológicamente activos. En un grupo de modalidades preferidas, cada X1 se selecciona independientemente de: en donde cada R se selecciona de H y una cadena lateral de aminoácido (diferente de una cadena lateral que tiene unido un grupo guanidino o amidino, por ejemplo una cadena lateral de arginina); la línea ondulada marcada con asterisco indica el punto de unión con Y' y las demás líneas onduladas indican el punto de unión a lo largo del esqueleto. Muy preferiblemente, X1 se selecciona de: Más preferiblemente, el reactivo de transporte comprende un esqueleto no peptídico en donde cada X' se selecciona de: volviendo a la fórmula I, en un grupo de modalidades preferidas, cada Y' unido a Z' se selecciona de alquileno de C Ce, alquenileno de C2-C8, heteroalquileno de C2-C3, cicloalquilalquileno de C3-Cs, arileno y combinaciones de los mismos. Muy preferiblemente, cada Y' unido a 71 es un alquileno de C3-C7 no ramificado. Algunos grupos Z' también son preferidos en la presente invención. En un grupo de modalidades preferidas, cada Z' se selecciona de: En otras modalidades preferidas, cada Y1 unido a Z1 es un alquileno de C4-C6 no ramificado y cada Z' es -NH-C(=NH)-NH2. En otro grupo de modalidades preferidas, para cada entero i impar de la fórmula I, n es 0; y para cada entero i par, n es 1 . En otro grupo de modalidades preferidas, m es un entero de 12 a 25, y el compuesto tiene de 6 a 8 porciones de guanidinio que pueden ser iguales o diferentes. En otras modalidades preferidas, el reactivo de transporte comprende las estructuras l-IX arriba provistas.

D. Agentes biológicamente activos En algunas modalidades, los reactivos de transporte se enlazan a un agente biológicamente activo. En esta invención es útil una variedad de agentes biológicamente activos, incluyendo sin limitación moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo agentes terapéuticos), iones de metal (típicamente conjugados como sus quelatos), macromoléculas, péptidos, agentes de diagnóstico o imagen y reactivos de boro. i. Moléculas orgánicas pequeñas Agentes terapéuticos de molécula orgánica pequeña (los agentes que tienen un peso molecular de aproximadamente 100 a 1000) se pueden unir ventajosamente a composiciones poliméricas lineales como las que se describen aquí, para facilitar o incrementar su transporte a través de las membranas biológicas. Por ejemplo, se puede mejorar el suministro de agentes altamente cargados tales como levodopa (L-3,4-dihidroxifenilalanina; L-DOPA) mediante su unión a moléculas de transporte poliméricas como se describen aquí. También se contemplan agentes peptoides y peptidomiméticos (por ejemplo, Langston, 1997; Giannis y otros, 1997). También, la invención es ventajosa para suministrar moléculas orgánicas pequeñas que tienen solubilidad muy baja en líquidos acuosos tales como el suero y solución salina acuosa. Así, los compuestos cuyas eficacias terapéuticas están limitadas por su solubilidad, se pueden administrar en dosis más grandes de acuerdo con la presente invención, y pueden ser más eficaces en una base molar en forma conjugada con respecto a la forma no conjugada, debido a los niveles de incorporación más altos en las células. Otros agentes terapéuticos que se pueden unir al reactivo de transporte se pueden seleccionar de agentes antibacterianos conocidos, agentes antifúngicos, agentes antivirales, agentes antiproliferativos, agentes inmunosupresores, vitaminas, analgésicos, hormonas y similares. Los agentes antibacterianos útiles en las presentes composiciones y métodos incluyen en general los antibióticos de ß-lactama y los antibióticos de quinolona. Más particularmente, los agentes pueden ser nafcilina, oxacilina, penicilina, amoxicilina, ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, rifampina, minociclina, ciprofloxacina, norfloxacina, eritromicina, vancomicina, o un análogo de los mismos. Los agentes antimicrobianos útiles en las presentes composiciones y métodos incluyen en general sulfanilamida, sulfametoxazol, sulfacetamida, sulfisoxazol, sulfadiazina, penicilinas (por ejemplo, penicilina G y V, meticilina, oxacilina, naficilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina y piperacilina), cefalosporinas (por ejemplo, cefalotina, cefaxolina, cefalexina, cefadroxilo, cefamandol, cefoxitina, cefaclor, cefuroxina, loracarbef, cefonicid, cefotetan, ceforanida, cefotaxima, cefpodoxima proxetil, ceftizoxima, cefoperazona, ceftazidima y cefepima), aminoglicósidos (por ejemplo, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina, kanamicina, estreptomicina, y similares), tetraciclinas (por ejemplo, clortetraciclina, oxitetraciclina, demeclociclina, metaciclina, doxiciclina y minociclina), y macrólidos (por ejemplo, eritromicina, claritromicina, azitromicina). Los agentes antifúngicos útiles en las presentes composiciones y métodos incluyen en general anfotericina, itraconazol, ketoconazol, miconazol, nistatina, clotrimazol, fluconazol, ciclopirox, econazol, naftifina, terbinafina y griseofulvina. Los agentes antivirales útiles en las presentes composiciones y métodos incluyen en general aciclovir, famciclovir, ganciclovir, foscarnet, idoxuridina, sorivudina, trifluridina, valaciclovir, cidofovir, didanosina, estavudina, zalcitabina, zidovudina, ribavirina y rimantatina. Los agentes antiproliferativos e ¡nmunosupresores que son útiles en las presentes composiciones y métodos incluyen metotrexate, azatioprina, fluorouracilo, hidroxiurea, 6-tioguanina, ciclofosfamida, clorhidrato de mecloroetamina, carmustina, ciclosporina, taxol, tacrolimo, vinblastina, dapsona y sulfasalazina. Los agonistas y antagonistas del receptor de histamina son otra clase de agentes útiles en la presente invención. Ejemplos de agentes adecuados incluyen, 2-metilhistamina, 2-piridiletilamina, 2-tiazoliletilamina, (R)-a-metilhistamina, impromidina, dimaprit, 4(5)metilhistamina, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina, clorciclizina, terfenadina y similares. Otra clase de agentes útiles en la presente invención son los compuestos usados para tratar el asma. Ejemplos de tales agentes incluyen los corticoesteroides (por ejemplo, beclometasona, budesónido y prednisona), cromolin, nedocromil, albuterol, bitolterol mesilato, pirbuterol, salmeterol, terbutalina y teofilina. Otra clase de agentes biológicamente activos que son útiles en las presentes composiciones y métodos son las vitaminas (véase "Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Therapeutics", 9a. edición, Hardman, y otros, eds. McGraw-Hill, p. 1 547-1590 ( 1996)). Una variedad de agentes analgésicos son útiles en la presente invención, incluyendo por ejemplo lidocaína, bupivacaina, novocaína, procaína, tetracaína, benzocaína, cocaína, mepivacaína, etidocaína, proparacaína, ropivacaína, prilocaína y similares. Los agentes antineoplásicos útiles en las presentes composiciones y métodos incluyen en general pentostatina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexate, bleomicinas, etopósido, tenipósido, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitoxantrona, hidroxiurea, 5-fluorouracilo, citarabina, fludarabina, mitomicina, cisplatina, procarbazina, dacarbazina, paclitaxel , colchicina, los alcaloides de la vinca y similares. ii. Metales Se pueden transferir metales a células eucarióticas y procarióticas usando agentes de quelación tales como texafirina o ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), conjugados con un transportador de la invención. Estos conjugados son útiles para suministrar iones de metal para ímagografía o terapia. Iones de metal ejemplares incluyen Eu, Lu , Pr, Gd, 99mTc, 67Ga, 11 In, 90Y, 67Cu y 57Co. Se pueden realizar estudios preliminares de transporte de membrana con conjugados candidatos usando pruebas basadas en células. Por ejemplo, usando iones de europio se puede monitorear la incorporación celular mediante mediciones de fluorescencia con respecto al tiempo. Para iones de metal que son citotóxicos, la incorporación se puede monitorear por medio de la citotoxicidad. ¡ii. acromoléculas El método de transporte incrementado de la invención es particularmente adecuado para incrementar el transporte a través de membranas biológicas de varias macromoléculas que incluyen, sin limitación, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, y análogos de los mismos. Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos formados de ADN y ARN, y análogos de los mismos, que tienen secuencias seleccionadas diseñadas para hibridación con objetivos complementarios (por ejemplo secuencias de antisentido para objetivos de una cadena o doble cadena), o para expresar transcritos de ácido nucleico o proteínas codificadas por las secuencias. Los análogos incluyen análogos de esqueleto cargados y preferiblemente sin carga, tales como fosfonatos (preferiblemente metilfosfonatos), fosforamidatos (?3' o N5'), tiofosfatos, polímeros sin carga basados en morfolino y ácidos nucleicos proteína (PNAs). Tales moléculas se pueden usar en una variedad de regímenes terapéuticos que incluyen terapia de reemplazo de enzima, terapia génica y terapia de antisentido, por ejemplo. A manera de ejemplo, los ácidos nucleicos proteína (PNA) son análogos de ADN en los cuales el esqueleto es estructuralmente similar a un esqueleto de desoxirribosa. El esqueleto consiste de unidades de N-(2-aminoetil)glicina a las cuales están unidas las nucleobases. Los PNAs que contienen las cuatro nucleobases naturales hibridan con oligonucleótidos complementarios obedeciendo las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick, y son imitadores de ADN verdadero en términos de reconocimiento de par de bases (Egholm y otros, 1993). El esqueleto de un PNA está formado por enlaces peptídicos en lugar de ésteres de fosfato, haciéndolo muy adecuado para aplicaciones de antisentido. Puesto que el esqueleto no está cargado, los dúplex PNA/ADN o PNA/ADN que forman exhiben estabilidad térmica mayor que la normal. Los PNAs tienen la ventaja adicional de que no son reconocidos por nucleasas ni proteasas. Además, los PNAs se pueden sintetizar en un sintetizador automático de péptidos usando química t-Boc estándar. El PNA se enlaza entonces fácilmente a un reactivo de transporte de la invención. Ejemplos de oligonucleótidos de antisentido cuyo transporte hacia las células se puede incrementar usando los métodos de la invención, se describen por ejemplo en la patente de E.U.A. No. 5,594, 1 22. Dichos oligonucleótidos están dirigidos al tratamiento del virus de inmunodeficiencia humana (VI H). La conjugación de un reactivo de transporte con un oligonucleótido de antisentido se puede efectuar por ejemplo formando un enlace amida entre el péptido y el extremo 5' del oligonucleótido a través de un enlazador de succinato, de acuerdo con los métodos bien establecidos. Otra clase de macromoléculas que pueden ser transportadas a través de las membranas biológicas es ejemplificada por proteínas, y en particular enzimas. Las proteínas terapéuticas incluyen, sin limitación, enzimas de reemplazo. Las enzimas terapéuticas incluyen, sin limitación, alglucerasa, para usar en el tratamiento de deficiencia de glucocerebrosidasa lisosomal (enfermedad de Gaucher), alfa-L-iduronidasa, para usar en el tratamiento de mucopolisacaridosis I, alfa-N-acetilglucosamidasa, para usar en el tratamiento del síndrome de Sanfilippo B, lipasa, para usar en el tratamiento de insuficiencia pancreática, adenosina desaminasa, para usar en el tratamiento de síndrome de inmunodeficiencia combinada severa , y triosa fosfato isomerasa, para usar en el tratamiento de disfunción neuromuscular asociada con deficiencia de triosa fosfato isomerasa. Además, y de acuerdo con un aspecto importante de la invención, se pueden suministrar antígenos de proteína al compartimiento citosólico de las células presentadoras de antígeno (APCs) en donde son degradados a péptidos. Los péptidos son transportados entonces al retículo endoplásmico en donde se asocian con moléculas HLA de clase I nacientes y son desplegados sobre la superficie de la célula. Tales APCs "activadas" pueden servir como inductores de linfocitos T citotóxicos (CTLs) específicos de antígeno restringidos de clase I , que entonces proceden a reconocer y destruir células que exhiben el antígeno particular. Las APCs que son capaces de llevar a cabo este proceso incluyen, sin limitación, ciertos macrófagos, células B y células dendríticas. En una modalidad, el antígeno de proteína es un antígeno de tumor para provocar o promover una respuesta inmune contra células de tumor. El transporte de proteínas aisladas o solubles hacia el citosol de APC con la activación subsiguiente de CTL es excepcional, puesto que, con muy pocas excepciones, la inyección de proteínas aisladas o solubles no produce la activación de APC ni la inducción de CTLs. De esta manera, los antígenos que se conjugan con las composiciones incrementadoras de transporte de la presente invención pueden servir para estimular una respuesta inmune celular in vitro o ¡n vivo. En otra modalidad , la invención es útil para suministrar al citosol anticuerpos o fragmentos de anticuerpo inmunoespecíficos para afectar procesos biológicos nocivos tales como la infección microbiana. Experimentos recientes han mostrado que los anticuerpos intracelulares pueden ser agentes antivirales efectivos en células de planta y mamífero (véase por ejemplo, Tavladoraki y otros, 1993; y Shaheen y otros, 1996). Estos métodos han usado típicamente fragmentos de región variable de una sola cadena (scFv), en los cuales las cadenas pesada y ligera de anticuerpo se sintetizan como un solo polipéptido. Las cadenas pesada y ligera variables usualmente se separan con un péptido enlazador flexible (por ejemplo de 1 5 aminoácidos), para producir una molécula de 28 kDa que retiene el sitio de unión de ligando de alta afinidad. El principal obstáculo para una amplia aplicación de esta tecnología ha sido la eficiencia de incorporación en las células infectadas. Sin embargo, uniendo reactivos de transporte a fragmentos scFv, se puede incrementar el grado de incorporación celular, permitiendo que los fragmentos inmunoespecíficos se unan e inhabiliten componentes microbianos importantes tales como Rev de VIH, transcriptasa inversa de VIH y proteínas integrasa. ¡v. Péptidos Los péptidos por suministrar con los métodos de transporte incrementado aqu í descritos incluyen, sin limitación, polipéptidos efectores, fragmentos de receptor y similares. Los ejemplos incluyen péptidos que tienen sitios de fosforilación usados por proteínas que median señales intracelulares. Ejemplos de dichas proteínas incluyen, sin limitación, proteína cinasa C, RAF-1 , p21 Ras, NF-??, C-JUN, y colas citoplásmicas de receptores de membrana, tales como receptor IL-4, CD28, CTLA-4, V7, y antígenos de MHC de clase I y clase I I. Cuando la molécula incrementadora de transporte también es un péptido, la síntesis se puede realizar usando un sintetizador automático de péptidos o usando métodos recombinantes en los cuales se produce un polinucleótido que codifica un péptido de fusión, como se mencionó arriba. v. Imagografia diagnóstica y agentes de contraste Las composiciones de la presente invención también son útiles para el suministro de agentes de imagografia diagnóstica y de contraste, en y a través de una o más capas de un tejido epitelial o endotelial. Ejemplos de agentes diagnósticos incluyen sustancias que están marcadas con radioactividad, tales como 99mTc glucoheptonato, o sustancias usadas en procedimientos de imagografia de resonancia magnética (MRI) tales como agentes de quelación impurificados con gadolinio (por ejemplo Gd-DTPA). Otros ejemplos de agentes diagnósticos incluyen genes marcadores que codifican proteínas que son fácilmente detectables cuando se expresan en una célula (incluyendo, sin limitación, ß-galactosidasa, proteína fluorescente verde, luciferasa y similares). Se puede emplear una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, marcas de flúor, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, ligandos (particularmente haptenos) y similares. vi. Reactivos de boro Las composiciones y métodos de la presente invención también son útiles para el suministro de reactivos de boro, tales como los que se usan en la terapia de captura de neutrón de boro. En esta modalidad, las especies de boro se pueden incorporar solas en el reactivo de transporte incrementador de suministro, o se pueden combinar con el reactivo de transporte para transferir más eficientemente el boro a una célula o tejido objetivo. Revisiones sobre la captura de neutrón de boro se pueden encontrar en las siguientes referencias: Barth y otros, Mol. Chem. Neuropathol. 21 : 139-1 54 (1994); Barth y otros, Cáncer Inv. 14:534-550 (1996); Coderre y otros, Radiat. Res. 151 :1 -18 (1999); Gahbauer y otros, Recent Results Cáncer Res. 150: 183-209 (1998); Hawthorne, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 32:950-984 (1993); Hawthorne, Mol. Med. Today 4:174-181 (1998); Soloway y otros, J. Neuro-Oncol. 33:9-18 (1997); Soloway y otros, Chem. Rev. 98: 1 51 5-1 562 (1998). Para una revisión sobre los métodos para preparar e incorporar boro en aminoácidos y péptidos, véase Spielvogel y otros, Phosphorus, Sulfur, Silicon Relat. Elem. 87:267-276 (1 994). Véase también, Cai y otros, J. Med. Chem. 40:3887-3896 ( 1997).

E. Grupos de enlace para unir agentes biológicamente activos a reactivos de transporte El agente por transportar se puede enlazar al reactivo de transporte de acuerdo con varias modalidades. En una modalidad, el agente se enlaza con un solo reactivo de transporte, ya sea por medio de enlace con un extremo terminal del reactivo de transporte o con una subunidad interna dentro del reactivo por medio de un grupo de enlace adecuado. En una segunda modalidad, el agente se une a más de un reactivo de transporte, de la misma forma que arriba. Esta modalidad es un poco menos preferida puesto que puede dar como resultado entrelazamiento de células adyacentes En una tercera modalidad, el conjugado contiene dos agentes biológicamente activos (ya sea iguales o diferentes) unidos a cada extremo terminal del reactivo de transporte. Para esta modalidad , actualmente se prefiere que el agente tenga un peso molecular de menos de 10 kDa, de preferencia de menos de 1 kDa aproximadamente. Con respecto a la primera y tercera modalidad recién mencionadas, el agente biológicamente activo generalmente no se une a una de las cadenas laterales de guanidino o amidino, de modo que queda libre para interaccionar con la membrana objetivo. Se puede usar una variedad de grupos de enlace para unir covalentemente el agente biológicamente activo con la porción de transporte, incluyendo esencialmente cualquiera de los grupos de enlace bifuncionales disponibles comercialmente, preferiblemente grupos de enlace heterobifuncionales (véase el Pierce Catalog). Cuando los grupos de enlace tienen los mismos grupos funcionales en cualquier extremo, preferiblemente los grupos serán protegidos ortogonalmente de modo que cada grupo protector pueda ser removido dejando intacto el resto del grupo protector. Las fórmulas mostradas más abajo ilustran algunos grupos de enlace que son útiles en la presente invención.

Los conjugados de la invención se pueden preparar por medio de esquemas sintéticos directos. Además, de preferencia, los productos conjugados son sustancialmente homogéneos en cuanto a longitud y composición, de tal manera que tienen efectos más consistentes y reproducibles que las mezclas heterogéneas. Muy preferiblemente, las composiciones son por lo menos 90% homogéneas (en conjugados de transporte), y de preferencia por lo menos aproximadamente 99% homogéneas. Los reactivos de transporte de la invención se pueden unir covalentemente con agentes biológicamente activos por medios químicos o recombinantes. Se prefieren los métodos qu ímicos. i. Enlaces químicos Los agentes biológicamente activos, tales como moléculas orgánicas pequeñas y macromoléculas, se pueden enlazar con reactivos de transporte de la invención por medio de varios métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Wong, S. S., ed. , "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida. (1991 ), ya sea directamente (por ejemplo con una carbodiimida), o por medio de una porción de enlace. En particular, los enlaces de carbamato, éster, tioéter, disulfuro e hidrazona por lo general son fáciles de formar y son adecuados para la mayoría de las aplicaciones. Se prefieren los enlaces de éster y disulfuro si se quiere que el enlace sea degradado fácilmente en el citosol después de transportar el agente biológicamente activo a través de una membrana celular. Se pueden usar varios grupos funcionales (hidroxilo, amino, halógeno, etc.) para unir el agente biológicamente activo al reactivo de transporte. Se prefieren los grupos que no son conocidos como parte de un sitio activo del agente biológicamente activo, particularmente si el reactivo de transporte o cualquier porción del mismo va a permanecer unido al agente biológicamente activo después de la administración. En un soporte sólido se pueden preparar varios reactivos de transporte, y se producen convenientemente con un grupo terminal amino y un grupo protector tal como F OC. Para agentes biológicamente activos que pueden resistir las condiciones usadas para separar el reactivo de la resina de síntesis y desproteger las cadenas laterales, el FMOC se puede separar del extremo N del reactivo completo ligado a la resina de tal manera que el agente biológicamente activo se puede enlazar a la amina N-terminal libre. En dichos casos, el agente por unir se activa típicamente por medio de métodos bien conocidos en la técnica para producir un éster activo o una porción de carbonato activo, efectivo para formar un enlace de amida o carbamato, respectivamente, con el grupo amino del reactivo de transporte. Desde luego, también se pueden usar otras químicas de enlace. Para ayudar a minimizar las reacciones secundarias, las porciones guanidino y amidino se pueden bloquear usando grupos protectores convencionales tales como los grupos carbobenciloxi (CBZ), di-t-BOC, PMC, Pbf, N-NÜ2, y similares. Las reacciones de acoplamiento se realizan por medio de métodos de acoplamiento conocidos, en cualquiera de una variedad de solventes tales como ?,?-dimetilformamida (D F), N-metilpirrolidinona, diclorometano, agua y similares. Los reactivos de acoplamiento ejemplares incluyen, por ejemplo, hexafluorofosfato de O-benzotriazoliloxi-tetrametiluronio (HATU), diciclohexilcarbodiimida, bromuro de bromo-tris(pirrolidino)-fosfonio (PiBroP), etc. Se pueden incluir otros reactivos como ?,?-dimetilaminopiridina (DMAP), 4-pirrolidinopiridina, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxibenzotriazol y similares. ii. Enlazadores liberables Los agentes biológicamente activos, en las modalidades actualmente preferidas, se unen al reactivo de transporte usando un enlace que es específicamente escindible o liberable. El uso de dichos enlaces es particularmente importante para agentes biológicamente activos que son inactivos hasta que se libera el reactivo de transporte unido. En algunos casos, los conjugados que consisten de una molécula de fármaco que está unida a un reactivo de transporte se pueden referir como profármacos, porque la liberación del reactivo de transporte del fármaco convierte el fármaco de una forma inactiva a una activa. Como se usa aquí, "escindido" o "escisión" de un conjugado o enlazador se refiere a la liberación de un agente biológico de una molécula de reactivo de transporte, liberando así un agente biológicamente activo. "Específicamente escindible" o "específicamente liberable" se refiere al enlace entre el reactivo de transporte y el agente que se escinde, mas bien que el reactivo de transporte se degrade (por ejemplo por degradación proteolítica). En algunas modalidades el enlace es un enlace fácilmente escindible, lo que significa que es susceptible de escisión bajo las condiciones encontradas in vivo. De esta manera, después de pasar a través de una o más capas de un tejido epitelial o endotelial, el agente se libera del agente de transporte. Los enlaces fácilmente escindibles pueden ser, por ejemplo, enlaces que son escindidos por una enzima que tiene una actividad específica (por ejemplo una esterasa, proteasa, fosfatasa, peptidasa y similares) o por hidrólisis. Para este propósito, algunas veces se prefieren los enlazadores que contienen ésteres de ácido carboxílico y enlaces disulfuro, en donde los primeros grupos se hidrolizan enzimáticamente o qu ímicamente y los segundos son cortados por intercambio de disulfuro, por ejemplo en presencia de glutatión. El enlace se puede seleccionar de modo que sea escindible por una actividad enzimática que se conozca esté presente en una o más capas de un tejido epitelial o endotelial. Por ejemplo, el estrato córneo de la piel tiene una concentración relativamente alta de actividad N-peptidasa. Un enlazador específicamente escindible se puede construir por ingeniería en una molécula de reactivo de transporte. Por ejemplo, se pueden usar aminoácidos que constituyen un sitio de reconocimiento de proteasa u otros sitios de escisión enzimática reconocidos específicamente, para enlazar el reactivo de transporte al agente. Alternativamente, para enlazar el reactivo de transporte al agente de interés se pueden usar enlazadores qu ímicos u otros enlazadores que son escindibles por ejemplo por exposición a la luz u otros estímulos. Un conjugado en el cual un agente por administrar y un reactivo de transporte se enlazan por medio de un enlazador específicamente escindible o específicamente liberable, tendrá una vida media. En este contexto, el término "vida media" se refiere a la cantidad de tiempo requerida, después de aplicar el conjugado a una membrana epitelial o endotelial, para que la mitad de la cantidad de conjugado se disocie liberando el agente libre. Para algunas modalidades, la vida media es típicamente entre 5 minutos y 24 horas, y de preferencia es entre 30 minutos y 2 horas. La vida media de un conjugado se puede "ajustar" o modificar de acuerdo con la invención como se describe abajo. En algunas modalidades, la velocidad de escisión de los enlazadores es dependiente del pH. Por ejemplo, un enlazador puede formar un enlace estable entre un agente y un reactivo de transporte a un pH ácido (por ejemplo pH 6.5 o menor, de preferencia aproximadamente 6 o menor, y de preferencia aproximadamente 5.5 o menor). Sin embargo, cuando el conjugado se pone a pH fisiológico (por ejemplo pH 7 o mayor, de preferencia aproximadamente 7.4), el enlazador sufrirá escisión para liberar el agente. Esta sensibilidad al pH se puede obtener por ejemplo incluyendo un grupo funcional que, cuando está protonado (es decir, a un pH ácido) no actúa como nucleófilo. A un pH mas alto (por ejemplo fisiológico), el grupo funcional ya no está protonado y de esta manera puede actuar como nucleófilo. Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, N y S. Se pueden usar tales grupos funcionales para ajustar finamente el pH al cual ocurre la autoescisión . En otra modalidad, la porción de enlace es escindida por medio de autosacrificio. Estas porciones de enlace en un conjugado, porción de transporte - compuesto biológicamente activo, contienen un nucleófilo (por ejemplo oxígeno, nitrógeno y azufre) distante del compuesto biológicamente activo, y un grupo escindible (por ejemplo éster, carbonato, carbamato y tiocarbamato) cercano al compuesto biológicamente activo. El ataque intramolecular del nucleófilo sobre el grupo escindible da como resultado la escisión de un enlace covalente, liberando así la porción de enlace del compuesto biológicamente activo. Las fórmulas 5A-5D siguientes proveen una ilustración de varios agentes terapéuticos que están unidos por medio de diferentes grupos de enlace con porciones de transporte de la presente invénción. En la fórmula 5A una mercaptopurina está unida por medio de un enlace disulfuro a una N-acetil-cisteína que sirve como un enlace para la porción de transporte. En las fórmulas 5B y 5C se observan enlaces fotolábiles que por activación de una fuente de luz adecuada liberan mercaptopurina y 5-fluorouracilo (5FU), respectivamente. En la fórmula 5D se observa un enlace que es escindido in vivo para liberar un compuesto de taxano (por ejemplo Taxol).

Fórmula 5A Fórmula 5B Fórmula 5C Fórmula 5D Ejemplos de conjugados que contienen porciones de enlace de autosacrificio (por ejemplo conjugados de agente biológicamente activo-L-porción de transporte) están representados por las estructuras 1 , 2 y 3: H R1-X (CH2) -A-C-(CH2)m-N-(CH2) -Y-R3 O 1 R5 R1-X (CH2)k-R -(CH2)m-CH-Y-R3 2 R5 R1— X-(CH2)k— ¿H-Y-R3 3 en donde: R1 es el compuesto biológicamente activo; X es un enlace formado entre un grupo funcional sobre el compuesto biológicamente activo y un grupo funcional terminal sobre la porción de enlace; Y es un enlace formado de un grupo funcional sobre la porción de transporte y un grupo funcional sobre la porción de enlace; A es N o CH; R2 es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, acilo o alilo; R3 es la porción de transporte; R4 es S, O, NR6 o CR7R8; R5 es H, OH, SH o NHR6; R6 es hidrógeno, alquilo, arilo, acilo o alilo; R7 y R8 son independientemente hidrógeno o alquilo; k y m son independientemente 1 o 2; y n es un entero que varía de 1 a 10. Ejemplos no limitativos de los enlaces X e Y son (en cualquier orientación): -C(0)0-, -C(0)NH-, -OC(0)NH-, -S-S-, -C(S)0-, -C(S)NH-, -NHC(0)NH-, -S02NH-, -SONH-, fosfato, fosfonato y fosfinato. Una persona experta en la materia apreciará que cuando el agente biológico tiene un grupo funcional hidroxi, entonces X será preferiblemente - OC(0)- o -OC(0)NH-. Similarmente, cuando el grupo de enlace está unido a un extremo amino de la porción de transporte, Y será preferiblemente -C(0)NH-, -NHC(0)NH-, -S02NH-, -SONH- o -OC(0)NH-, y similares. En cada uno de los grupos arriba provistos se muestra NH por brevedad, pero cada uno de los enlaces (X e Y) pueden contener también enlaces sustituidos (por ejemplo N-alquilo o N-acilo). Volviendo primero a los grupos de enlace ilustrados por la estructura 1 , un ejemplo y modalidad preferida se ilustra con la fórmula 1 a: 1a en donde las líneas onduladas indican puntos de unión con la porción de transporte y con el compuesto biológicamente activo. Los conjugados que contienen este grupo de enlace se pueden preparar de una manera similar a la provista para los reactivos de transporte descritos en la publicación de patente internacional No. WO 02/0655986. Un experto en la materia apreciará que el grupo N-bencilo puede ser reemplazado en la fórmula 1 a con otros grupos (por ejemplo alquilo, arilo, alilo y similares), o que los grupos metileno pueden ser remplazados por ejemplo con etileno, propileno y similares. Preferiblemente, los grupos metileno son retenidos como se muestra en 1a, para proveer una orientación estérica o espacial apropiada que permita escindir el enlace ¡n vivo.

Por consiguiente, para la estructura 1 se prefieren los siguientes sustituyentes: A es N; R2 es bencilo; k, m y n son 1 ; X es -OC(O)- y Y es -C(0)NH-. Los enlaces de la estructura 2 se ejemplifican con la fórmula 2a: en donde, como arriba, las líneas onduladas indican el punto de unión con la porción de transporte y el agente biológicamente activo. A continuación se muestra la preparación de un conjugado de fármaco que tiene un grupo de enlace de fórmula 2a (véase también el esquema mostrado en el ejemplo 1 1 , que ilustra la unión de un enlace de este tipo con ciclosporina A).

FA Como se ve arriba, un fármaco se somete a acilación con anhídrido cloroacético para formar un éster cloroacetato, que se trata con una porción de transporte que tiene unido un residuo de cisteína para proveer el compuesto objetivo en el cual el enlace tiene la forma: por consiguiente, en un grupo de modalidades preferidas, el conjugado se representa con la fórmula 2, en la cual X es -OC(O)-; Y es -C(0)NH-; R4 es S; R5 es NHR6; y los subíndices k y m son 1. En otro grupo de modalidades preferidas, el conjugado se representa con la fórmula 2 en la cual X es -OC(O)-, Y es -NHC(O)-; R4 es S; R5 CONH2; y los subíndices k y m son 1. Los conjugados particularmente preferidos son aquellos en los cuales R6 es hidrógeno, metilo, alilo, butilo o fenilo. Los grupos de enlace representados por los conjugados mostrados en la fórmula 3 son generalmente del tipo heterobifuncional (por ejemplo ácido aminocaproico, serina, homoserina, ácido aminobutirico y similares), aunque con ciertos agentes biológicos también son útiles los ácidos dicarboxílicos o diaminas convenientemente protegidos. Para la estructura 3 se prefieren los siguientes sustituyentes: R5 es NHR6, en donde R6 es hidrógeno, metilo, alilo, butilo o fenilo; k es 2; X es -C(0)0-; y Y es -C(0)NH-. Los enlazadores de autosacrificio típicamente sufren escisión intramolecular con una vida media de entre aproximadamente 10 minutos y 24 horas, en agua a 37 °C y un pH de aproximadamente 7.4. De preferencia, la vida media de escisión es de entre aproximadamente 20 minutos y 4 horas en agua a 37 °C y un pH de aproximadamente 7.4. Mas preferiblemente, la vida media de escisión es de entre aproximadamente 30 minutos y 2 horas en agua a 37 °C a un pH de aproximadamente 7.4. Volviendo ahora a los conjugados representados por la estructura 1 , el experto en la materia apreciará que la vida media de escisión, que es la separación del agente biológico del transportador, se puede ajustar variando el sustituyente R2. Usando un R2 de mayor o menor tamaño, se puede obtener un conjugado que tiene una vida media más larga o más corta, respectivamente. R2 en la estructura 1 es preferiblemente metilo, etilo, propilo, butilo, alilo, bencilo o fenilo. Cuando hay un grupo básico o ácido en un enlazador de autosacrificio, a veces se puede ajustar la vida media de escisión de acuerdo con el pH de la solución del conjugado. Por ejemplo, el grupo amina de esqueleto de la estructura 1 se protona a pH ácido (por ejemplo pH 5.5). La amina no puede servir como un nucleófilo que induce escisión intramolecular cuando está protonada. Sin embargo, por introducción del conjugado en un medio a pH fisiológico (7.4), la amina se desprotona durante un período significativo. Correspondientemente, la vida media de escisión se reduce. En una modalidad, la escisión de un enlazador de autosacrificio ocurre en dos pasos: reacción intramolecular de un grupo nucleofílico dando como resultado la escisión de una parte de la porción de enlace; y eliminación de la parte restante de la porción de enlace. El primer paso de la escisión es limitativo de la velocidad y se puede ajustar finamente con respecto a la sensibilidad al pH y la vida media.

La estructura 4 es un ejemplo de una porción de autosacrifico de dos pasos que se incorpora en un conjugado, porción de transporte - compuesto biológicamente activo: O R5 R1— X— CH2-Ar-0-C-(CH2)lrR4— (CH^m-CH-Y-R3 4 en donde: R1 es el compuesto biológicamente activo; X representa un enlace entre un grupo funcional en el compuesto biológicamente activo y un grupo funcional en la porción de enlace; Ar es un grupo arilo sustituido o no sustituido, en donde el sustituyente metileno y el átomo de oxígeno fenólico son orto o para uno con respecto a otro; R3 es la porción de transporte; R4 es S, O, NR6 o CR7R8; R5 es H, OH, SH o NHR6; R6 es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, acilo o alilo; R7 y R8 son independientemente hidrógeno o alquilo; y k y m son independientemente 1 o 2. Un grupo de enlace particularmente preferido tiene la fórmula 4a: 4a por consiguiente, los grupos de enlace usados en los conjugados de fórmula 4, son preferiblemente aquellos en los cuales Ar es un grupo fenileno sustituido o no sustituido; R4 es S; R5 es NHR6, en donde R6 es hidrógeno, metilo, alilo, butilo, acetilo o fenilo; k y m son 1 ; X es -C(0)0-; y Y es -C(0)0-o -C(0)NH-. Muy preferiblemente, R6 es hidrógeno o acetilo. Otros grupos de enlaces útiles para usar en la presente invención se han descrito en solicitudes copendientes de PCT. Véase por ejemplo las publicaciones de patente internacional Nos. WO 98/52614 y WO 01/13957, que describen grupos de enlace para composiciones similares, por ejemplo conjugados de agentes biológicamente activos y oligómeros de transporte. La tecnología de enlace descrita en dichas publicaciones se puede usar en las presentes composiciones de una manera similar.

III. Síntesis de reactivos de transporte y conjugados Los reactivos descritos en la presente se construyen mediante cualquier método conocido en la técnica. Las poliamidas ejemplares se pueden producir de manera sintética, usando preferiblemente un sintetizador de péptidos adaptado para usar las subunidades adecuadas (Applied Biosystems Model 433). Los N-metil e hidroxi-aminoácidos pueden sustituir a los aminoácidos convencionales en la síntesis de péptidos de fase sólida. Sin embargo, la producción de reactivos con enlaces peptídicos reducidos requiere la síntesis del dímero de aminoácidos que contienen el enlace peptídíco reducido. Tales dímeros se incorporan en polímeros usando procedimientos estándares de síntesis en fase sólida. Otros procedimientos de síntesis son bien conocidos y se pueden encontrar por ejemplo en Fletcher y otros (1998), Simón y otros (1992), y referencias citadas en los mismos.

A. Reactivos de transporte de carbamato Los reactivos de transporte de carbamato se pueden preparar ilustra en los esquemas 1 y 2.

Esquema 1 Esquema 2 vi Con respecto al esquema 1 , las unidades monoméricas usadas en la construcción de algunas versiones de los reactivos de transporte de carbamato se pueden preparar a partir de formas adecuadamente protegidas de ornitína. Por lo tanto, el tratamiento de N-Fmoc N6-Boc-L-ornitina (i) con cloroformiato de isobutirilo, seguido por borohidruro de sodio, provee el alcohol (ii) que se puede convertir al monómero protegido (ii¡) por tratamiento con clororformiato de 4-nitrofenilo y piridina. El experto en la materia apreciará que la sustitución de la ornitina protegida (i) con ácidos relacionados (por ejemplo formas protegidas de D- o L- lisina) puede proveer otros intermediarios de monómeros protegidos que tienen enlaces de cadena lateral más largos o más cortos. Como se muestra en el esquema 2, el tratamiento de una resina amina (iv) con el monómero (iii) en presencia de HPBt, DIEA y DMF, seguido por piperidina en DMF, provee un monómero ligado a soporte de fórmula v (el subíndice n es 1 ). Repitiendo los pasos de la adición de monómero y remoción de Fmoc, se obtiene un oligómero ligado a soporte de fórmula v (el subíndice n es 4-12). Una vez que se ha construido un oligómero de longitud apropiada, se puede añadir un grupo de enlace para un agente terapéutico o diagnostico adecuado. De esta manera, el tratamiento de v con ácido Fmoc-aminocaproico en presencia de DIC, HOBt y DMF, seguido por piperidina y DMF, provee el conjugado de ácido aminocaproico que se puede combinar con FITC en presencia de DIEA y DMF para proveer el conjugado FITC enlazado. Los grupos protectores Boc se pueden remover entonces, el intermediario se puede retirar de la resina, y los grupos amino primarios se pueden someter a perguanilación por ejemplo con lm-C(=NH)NH2 en presencia de carbonato de sodio, para proveer un compuesto objetivo.

El esquema 2 muestra la preparación de un polímero de transporte que tiene unidas subunidades por medio de enlaces de carbamato. El experto en la materia entenderá que la síntesis puede incluir monómeros de aminoácido (por ejemplo glicina, ácido e-aminocaproico, ácido ?-aminobutírico y similares) para proveer una separación adecuada entre las unidades monoméricas que contienen guanidino.

B. Reactivos de transporte de péptido En otro grupo de modalidades, el reactivo de transporte se puede construir de monómeros de ?-aminoácido (preparados como se ilustra en el esquema 3).

Esquema 4 Como se muestra en el esquema 3, una ornitina adecuadamente protegida vii se puede convertir a su homologo de dos carbonos en un proceso de múltiples pasos. El tratamiento de vii con ácido de Meldrum en presencia de DCC, DMAP y diclorometano, provee viii. La reducción de la carbonilcetona se puede realizar usando ácido acético, borohidruro de sodio en diclorometano, para proveer ix. El calentamiento ix en tolueno a reflujo produce x, que se puede hidrolizar (NaOH en acetona) para proveer xi. La remoción del grupo protector Boc y la reprotección del grupo funcional amina resultante con Fmoc-OSu en DMF, provee el monómero xii. El esquema 4 ilustra el uso del monómero xii en la preparación de un conjugado de transporte. Como se mostró arriba, una resina amina (iv) se trata con xii en presencia de DIEA, HOBt, HBTU y NMP, y se desprotege (piperidina) para proveer xiii (en donde el subíndice n es 1 ). Se pueden añadir grupos monoméricos adicionales ya sea secuencialmente como se muestra en el esquema 4, o de manera interrumpida por medio de subunidades que no contienen guanidino. Por simplicidad, el esquema 4 ilustra la preparación de un oligómero en el cual todas las subunidades tienen una cadena lateral que será convertida a un grupo guanidino. De esta manera, xiii (n=1 ) se puede someter a n pasos de acoplamiento monomérico y desprotección para proveer por ejemplo xiii en donde n = 5. Los pasos subsiguientes para acoplar ácido aminocaproico (acá) y FITC proceden como se describe en el esquema 2 para proveer xiv. La remoción de los grupos Z (grupos benciloxicarbonilo) y la separación del intermediario de conjugado de transporte de la resina provee xv. La conversión de los grupos funcionales amina primarios a grupos guanidino se puede realizar con guanilpirazol en presencia de carbamato de sodio para proveer xvi.

C. Reactivos de transporte de qlutaramida y oxalamida En otro grupo de modalidades, el reactivo de transporte es un derivado de glutaramida, cuya preparación se ilustra en el esquema 5.

Esquema 5 En el esquema 5, la A/,A/,'-b¡s(3-am¡noprop¡l)et¡lendiamina (xvii) se somete a guanidinilación en los grupos amino primarios terminales, y se somete a monoprotección para dar xviü. Se forma entonces una estructura dimérica formada por combinación de dos equivalentes de xviü con un ácido glutárico adecuadamente activado, y se somete a monodesproteccion para formar xix. Nuevamente, dos equivalentes de xix se combinan con un reactivo de ácido glutárico activado para formar xx. La remoción de un grupo protector Boc y el acoplamiento con aca-FITC como se describió anteriormente para los reactivos de transporte y la posterior remoción de los grupos protectores carbobenciloxi (Z), proveen el compuesto xxi. El esquema 6 ilustra la extensión de la metodología anterior a reactivos de transporte de "oxalamida" (L = -C(0)C(0)-), reactivos de transporte de "urea" (L = -C(O)-) y similares.

Esquema 6 Esquema 6 (Continuación) D. Reactivos de transporte de poliamina En otro grupo de modalidades, el reactivo de transporte es un reactivo de transporte de poliamina. En este grupo de modalidades, el esqueleto es una poliamina o contiene características de poliamina (por ejemplo polietilenamina, polipropilenamina y similares). El esquema 7 ilustra un reactivo de transporte de tipo poliamina.

Esquema 7 XXV 1 Acilación de cadena lateral 2. Desprotección 3 Perguanidilación 4. Desprotección y unión del fármaco En el esquema 7, una polietilenimina se somete a monoacilacion con una forma protegida de ácido e-aminocaproico para proveer el material de partida mostrado. Los grupos amino restantes se pueden someter a peracilación, por ejemplo con cloruro del ácido e-aminocaproico protegido, para proveer un esqueleto adecuado con grupos de enlace de cadena lateral. La remoción de los grupos de protección de cadena lateral y la perguanidilación proveen un reactivo de transporte que tiene unido un grupo de enlace protegido adecuado para conjugación con un agente biológicamente activo.

IV. Incremento del transporte de agentes biológicamente activos a través de membranas biológicas A. Medición de transporte a través de las membranas biológicas Los sistemas modelo para determinar la capacidad de los reactivos de transporte de la invención para transportar agentes biológicamente activos y otras sustancias terapéuticas a través de las membranas biológicas, incluyen sistemas que miden la capacidad del reactivo de transporte para transportar una molécula fluorescente unida covalentemente a través de la membrana. Por ejemplo, la fluoresceína (PM «376) puede servir como un modelo para el transporte de moléculas orgánicas pequeñas. Para transportar macromoléculas se puede fusionar un reactivo de transporte con un polipéptido grande tal como ovoalbúmina (peso molecular 45 kDa). La detección de las macromoléculas incorporadas se puede facilitar uniendo una marca fluorescente. La incorporación celular también se puede analizar por medio de microscopía confocal.

B. Incremento de transporte a través de las membranas biológicas En experimentos llevados a cabo para apoyar la presente invención se determinó el transporte de transmembrana y la incorporación celular concomitante por medio de la incorporación de un reactivo de transporte enlazado con fluoresceína, de acuerdo con métodos conocidos (véase la publicación de patente internacional No. WO 02/065986 previamente citada). Brevemente, suspensiones de células se incubaron con conjugados fluorescentes suspendidos en amortiguador por varios tiempos a 37 °C, 23 °C, o 3 °C. Después de la incubación, la reacción se detuvo y las células se recogieron por centrifugación y su fluorescencia se analizó usando clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Bajo las condiciones usadas, la incorporación celular de los conjugados no fue saturable. Consecuentemente, los valores de DE50 no se pudieron calcular para los reactivos de transporte. En su lugar, los datos se presentan como histogramas para permitir comparaciones directas de incorporación celular a concentraciones únicas de conjugado. Las comparaciones de reactivos de transporte de carbamato y reactivos de transporte oligoArg indican que los reactivos de transporte de carbamato son comparables o mejores que los reactivos de transporte de péptido que tienen características similares (por ejemplo longitud general, número y tipo de grupos de cabeza de guanidinio, etc.). La eficacia general de transporte de un reactivo de transporte parece depender de una combinación de (i) la velocidad de incorporación de transmembrana (los polímeros con menos de aproximadamente 15 grupos continuos que contienen guanidino son mejores) contra la susceptibilidad a inactivación proteolítica (los polímeros más grandes son mejores). Por consiguiente, se prefieren los polímeros que contienen de 7 a 20 residuos de guanidinio, y preferiblemente de 7 a 15. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el reactivo de transporte de la invención tiene una afinidad aparente (Km) que es por lo menos 10 veces mayor, y preferiblemente por lo menos 100 veces mayor, que la afinidad medida para tat con los métodos descritos en la presente, cuando se mide a temperatura ambiente (23 °C) o 37 °C. Sin atribuirlo a ninguna teoría en particular, los datos sugieren que el proceso de transporte es un proceso dependiente de energía mediado por el reconocimiento específico de polímeros que contienen guanidinio o amidinio por parte de un reactivo de transporte molecular presente en las membranas plasmáticas celulares. Otros experimentos que apoyan la invención han mostrado que los conjugados de la invención son efectivos para transportar agentes biológicamente activos a través de membranas de una variedad de tipos de células, incluyendo células T humanas (Jurkat), células B (CH27 de murino), células T de linfoma (EL-4 de murino), células de mastocitoma (P388 de murino), varios hibridomas de células de T de murino, células neuronales (PC-12), fibroblastos (RT de murino), células de riñon (HELA de murino), mieloblastoma (K562 de murino); y células de tejido primarias incluyendo todas las células sanguíneas humanas (excepto los glóbulos rojos), tales como linfocitos T y B, macrófagos, células dendríticas y eosinófilos; basófilos, mastocitos, células endoteliales, células de tejido cardiaco, células de hígado, células de bazo, células de ganglio linfático y queratinocitos. Los conjugados también son efectivos para atravesar células bacterianas gram negativas y gram positivas. Mas generalmente, los niveles de incorporación máxima por parte de las bacterias se pueden observar a 37 °C. Sin embargo, cuando la incubación se realiza a temperatura ambiente o a 3 °C se puede observar tinción significativa. La microscopía confocal reveló que el pretratamiento de las bacterias con azida de sodio al 0.5% inhibió el transporte a través de las membranas plasmáticas internas de bacterias tanto gram positivas como gram negativas, pero no el transporte a través de la pared celular (bacterias gram positivas) hacia el espacio perisplásmico. De esta manera, la invención incluye conjugados que contienen agentes antimicrobianos tales compuestos antibacterianos y compuestos antifúngicos, para usar en la prevención o inhibición de la proliferación o infección microbiana, y para desinfectar superficies para mejorar la seguridad médica. Además, la invención se puede usar para el transporte hacia células de plantas, particularmente plantas de hojas verdes.

Estudios adicionales que apoyan la invención han mostrado que la translocalización a través de membranas bacterianas es dependiente tanto de la energía como de la temperatura, lo cual es consistente con las observaciones hechas anteriormente para otros tipos de células.

V. Métodos de prueba y colecciones En otra modalidad, la invención se puede usar para examinar uno o más conjugados en busca de una actividad biológica seleccionada, en donde los conjugados se forman de uno o más agentes candidatos. Los conjugados se ponen en contacto con una célula que exhibe una señal detectable por incorporación del conjugado hacia la célula, de tal manera que la magnitud de la señal es indicativa de la eficacia del conjugado con respecto a la actividad biológica seleccionada. Una ventaja de esta modalidad es que es particularmente útil para probar las actividades de agentes que por si solos son incapaces, o poco capaces, de entrar a las células para manifestar actividad biológica. De esta manera, la invención provee una manera particularmente eficiente para identificar agentes activos que de otra manera podrían no ser accesibles con los programas de examen y búsqueda de gran escala, por carecer de una manera efectiva y conveniente de transporte de los agentes hacia la célula u organelo. Preferiblemente, los agentes candidatos, uno o más, se proveen como una colección combinatoria de conjugados que se preparan usando cualquiera de una cantidad de métodos sintéticos combinatorios conocidos en la técnica. Por ejemplo, Thompson y Ellman (1996) reconocieron por lo menos cinco enfoques generales diferentes para preparar colecciones combinatorias sobre soportes sólidos, a saber, (1 ) síntesis de compuestos discretos, (2) síntesis por división (división y depósito), (3) desconvolución de colección soluble, (4) determinación estructural por métodos analíticos, y (5) estrategias de codificación en las cuales las composiciones químicas de candidatos activos son determinadas por marcas únicas, después de probarse una actividad biológica positiva en el ensayo. La síntesis de colecciones en solución incluye por lo menos (1 ) síntesis separadas espacialmente, y (2) síntesis de depósitos (Thompson, arriba). Mayor descripción de métodos sintéticos combinatorios se puede encontrar en Lam y otros (1997), que describe particularmente el enfoque de un glóbulo-un compuesto. Estos enfoques se adaptan fácilmente para preparar los conjugados de acuerdo con la presente invención, incluyendo los esquemas de protección adecuados conforme sea necesario. Por ejemplo, para una colección que es construida sobre uno o más soportes sólidos primero se puede unir al soporte una porción de péptido de transporte, seguido por construcción o anexión combinatoria de agentes candidatos sobre los polímeros por medio de funcionalidades reactivas adecuadas. En un ejemplo alternativo, primero se forma una colección combinatoria de agentes sobre uno o más soportes sólidos, seguido por anexión de un reactivo de transporte a cada agente candidato inmovilizado. Se pueden usar enfoques similares o diferentes para síntesis en fase de solución. Las colecciones formadas sobre un soporte sólido preferiblemente se separan del soporte a través de un grupo de enlace escindible por medio de métodos conocidos (Thompson y otros, y Lam y otros, arriba). Los candidatos conjugados, uno o más, se pueden analizar con cualquiera de varias pruebas basadas en célula que producen señales detectables en proporción a la eficacia del conjugado. Convenientemente, los candidatos se incuban con células en placas de cavidades múltiples y los efectos biológicos se miden por medio de una señal (por ejemplo fluorescencia, reflectancia, absorción o quimiolumíniscencia) que se puede cuantificar usando una lectora de placa. Alternativamente, las mezclas de incubación se pueden remover de las cavidades para procesamiento o análisis posterior. Se determinan entonces las estructuras de los compuestos activos, y opcionalmente los inactivos, si es que no se conocen todavía, y esta información se puede usar para identificar compuestos guía y enfocar más los esfuerzos de síntesis, examen y selección. Por ejemplo, se puede adaptar fácilmente una prueba de secreción de ?-interferón a un formato de cavidades múltiples, de tal manera que los inhibidores de secreción activa pueden ser detectados por fluorescencia basada en europio usando una lectora de placa. Los agentes anticancerosos se pueden examinar usando líneas de células de cáncer establecidas (por ejemplo provistas por el National Institutes of Health (NIH) y el National Cáncer Institute (NCI) de E.U.A. Los efectos citotóxicos de agentes anticancerosos pueden ser determinados por exclusión de colorante tripano, por ejemplo. Otros ejemplos incluyen pruebas dirigidas para inhibir la señalización celular, tal como la inhibición del receptor de IL-4; pruebas para bloquear la proliferación celular, y pruebas de expresión de genes. En una prueba típica de expresión de gen, un gen de interés se pone bajo el control de un promotor adecuado y es seguido hacia el extremo 3' por un gen para producir una especie reportera tal como ß-galactosidasa o luciferasa de luciérnaga. Un efecto inhibidor se puede detectar en base a una reducción de la señal de reportero. La invención también incluye una colección de conjugados que es útil para el examen y selección del método anterior. La colección incluye una pluralidad de agentes candidatos para una o más actividades biológicas seleccionadas, cada uno de las cuales se conjuga por lo menos con un reactivo de transporte de acuerdo con la invención. Preferiblemente, la colección de conjugados es una colección combinatoria. En otra modalidad, la invención incluye un arreglo regular de distintos conjugados polímero-agente distribuidos en una pluralidad señalada o señalable de cavidades de muestra, para prueba e identificación de agentes activos de interés.

VI. Composiciones farmacéuticas Los compuestos y métodos de la presente invención tienen particular utilidad en el área de terapéutica humana y veterinaria.

Generalmente, las dosis administradas serán efectivas para suministrar concentraciones picomolares a micromolares de la composición terapéutica al sitio efector. Las dosis y concentraciones apropiadas dependerán de factores tales como la composición terapéutica o fármaco, el sitio de suministro pretendido, y la vía de administración, todos los cuales se pueden derivar empíricamente de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Se puede obtener mayor guia de los estudios que usan modelos animales experimentales para evaluar las dosis, que son conocidos en la técnica. La administración de los compuestos de la invención con un excipiente farmacéutico adecuado conforme sea necesario se puede llevar a cabo por medio de los modos de administración aceptados. Así, la administración puede ser por ejemplo intravenosa, tópica, subcutánea, transcutánea, intramuscular, oral, intraarticular, parenteral, peritoneal, intranasal, o por inhalación. Las formulaciones pueden tener la forma de dosis sólidas, semisólidas, polvo liofilizado o formas líquidas, tales como por ejemplo tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, ungüentos, lociones, aerosoles o similares, preferiblemente en formas de dosis unitarias adecuadas para la administración simple de dosis precisas. Las composiciones típicamente incluyen un vehículo o excipiente farmacéutico convencional y adicionalmente pueden incluir otros agentes medicinales, vehículos, adyuvantes y similares. Preferiblemente, la composición será aproximadamente 5% a 75% en peso de uno o más compuestos de la invención, el resto consistiendo de excipientes farmacéuticos adecuados. Se pueden diseñar excipientes apropiados para la composición y vía de administración particular por medio de métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Gennaro, 1990). Para administración oral, dichos excipientes incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. La composición puede tomar la forma de una suspensión, solución, tableta, pildora, cápsula, polvo, formulación de liberación sostenida y similares. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas toman la forma de una pildora, tableta o cápsula, y de esta manera la composición puede contener, junto con el conjugado biológicamente activo, cualquiera de lo siguiente: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio y similares; un desintegrante tal como almidón o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un aglutinante tal como almidón, goma acacia, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y derivados de la misma. Los compuestos activos de las fórmulas se pueden formular en un supositorio que comprende por ejemplo aproximadamente de 0.5% a 50% de un compuesto de la invención, dispuesto en un vehículo de polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG 1000 [96%] y PEG 4000 [4%]). Las composiciones líquidas se pueden preparar disolviendo o dispersando un compuesto (aproximadamente 0.5% a 20%) y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como por ejemplo solución salina acuosa (por ejemplo de cloruro de sodio 0.9% p/v), dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una solución o suspensión por ejemplo para administración intravenosa. Los compuestos activos también se pueden formular en un enema de retención. Si se desea, la composición por administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes de mojado o emulsificantes, agentes amortiguadores de pH tales como por ejemplo acetato de sodio, monolaurato de sorbitán u oleato de trietanolamina. Para administración tópica, la composición se administra en cualquier formato adecuado tal como una loción o un parche transdérmico. Para administración por inhalación, la composición se puede suministrar como un polvo seco (por ejemplo Inhale Therapeutics) o en forma líquida por medio de un nebulizador. Los métodos para preparar dichas formas de dosis son conocidos o serán evidentes para el experto en la materia; véase por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1980). La composición por administrar en cualquier caso contendrá una cantidad del profármaco o compuesto activo en una cantidad farmacéuticamente efectiva para aliviar la condición tratada cuando se administra de acuerdo con las enseñanzas de esta invención.

Generalmente, los compuestos de la invención se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, una dosis suficiente para efectuar un tratamiento, que ha de variar dependiendo del individuo y condición tratada. Típicamente, una dosis diaria terapéuticamente efectiva es de 0.1 a 100 mg/kg de peso corporal por día de fármaco. La mayoría de las condiciones responden a la administración de una dosis total de entre aproximadamente 1 y 30 mg/kg de peso corporal por día, o entre aproximadamente 70 mg y 2100 mg por día para una persona de 70 kg. La estabilidad del conjugado se puede controlar adicionalmente mediante la composición y estereoquímica del esqueleto y las cadenas laterales del polímero. Para polímeros de polipéptido, los isómeros D generalmente son resistentes a proteasas endógenas y por lo tanto tienen vidas medias más largas en suero y dentro de las células. Por lo tanto, los polímeros de D-polipéptido son apropiados cuando se desea una duración de acción mas prolongada. Los polímeros de L-polipéptido tienen vidas medias más cortas debido a su susceptibilidad a las proteasas y por lo tanto se eligen para impartir efectos de acción más corta. Esto permite evitar mas fácilmente los efectos secundarios retirando la terapia tan pronto como se observan los efectos secundarios. Los polipéptidos que comprenden mezclas de residuos D y L tienen estabilidades intermedias. Generalmente se prefieren los homo-D-polímeros. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la presente invención, sin limitación.

EJEMPLOS En los siguientes ejemplos se muestra la incorporación de los conjugados a las células y a través de los tejidos; en los conjugados el agente biológicamente activo está unido a oligómeros de arginina (D- o L-arginina) así como a reactivos de transporte que tienen esqueletos tales como los carbamatos y ?-aminoácidos. Los reactivos de transporte de péptido sirvieron como un modelo adecuado para la construcción de los presentes conjugados y para evaluar la incorporación y liberación de los agentes biológicamente activos. Por consiguiente, la eficacia de los conjugados que tienen reactivos de transporte de péptido es indicativa de la eficacia de los conjugados de reactivo de transporte no peptídicos relacionados.

EJEMPL0 1 Este ejemplo ilustra la preparación de varios enlaces liberables basados en un aminoácido, que se puede modificar para unir (y liberar) un fármaco que tiene grupos funcionales adecuados. Los esquemas 8A-8E proveen sistemas y modelos objetivo para enlaces que incluyen enlaces de amida (esquema 8A), enlaces de carbonato (esquema 8B), enlaces de carbamato (esquema 8C), enlaces fotolábiles (esquema 8D), y enlaces de liberación de fosfatasa (esquema 8E).

Esquema 8A xxvii xxviii Esquema 8B Sistema objetivo Sistema modelo Esquema 8C Esquema 8D ¡) Trifosgeno, piridina ü) Fármaco-OH Esquema 8E Sistema Modelo aco Sistema objetivo xxxviü Preparación de sistemas modelo Ac-Tyr(OAc)-OH (xxviii). A una suspensión agitada vigorosamente de (-)tirosina xxvii (700 mg, 3.87 mmol) en H20 (6 mL) a 0 °C, se le agregó NaOH (aq) (1.0 N, 3.87 mL, 3.87 mmol). Se le agregó gota a gota anhídrido acético (0.802 mL, 868 mg, 8.51 mmol). Durante esta adición se le agregó NaOH (aq) 1 N a fin de mantener el pH de la reacción entre 6 y 8. Después de completar la adición, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó 35 minutos. Después, la solución incolora se acidificó cuidadosamente hasta pH 2 con HCI 6 N (aq). Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos se formó un precipitado blanco. Este sólido se filtró y se lavó con H20 (3x) para dar el producto deseado xxviii (581 mg, 2.19 mmol, 57%). Ac-Tyr(02COBn)-OH (xxix). A una solución de (-)tirosina xxvii (2.50 g, 13.8 mmol) en NaOH (aq) (2 N, 7.59 mL, 15.2 mmol) se le agregó H2O (6 mL). Esta solución vigorosamente agitada se enfrió a 0 °C y se le agregó anhídrido acético (3.25 mL, 3.52 g, 34.5 mmol) por medio de una bomba de jeringa durante 30 minutos. Durante esta adición se le agregó un exceso de NaOH (aq) (2 N, 34.5 mL, 69.0 mmol) en 10 porciones. Después de completar la adición, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó 45 minutos. Después, la solución incolora se acidificó cuidadosamente a pH 2 con HCI 6N (aq). Después de concentrar bajo presión reducida, el sólido resultante se extrajo con H20 al 15% en acetona (4x). El filtrado se concentró bajo presión reducida para producir un aceite ligeramente amarillo. La adición de H20 (1 .5 mL) produjo N-acetil-tirosina como un precipitado blanco (670 mg, 3.00 mmol, 22%), que se lavó con H20 (3x). Los lavados se lavaron para precipitaciones posteriores. A una solución de N-acetil-tirosina (72 mg, 0.32 mmol) en THF : H20, 1 :1 (1 mL) se le agregó NaOH (aq) (1 N, 0.32 mL, 0.32 mmol). Se le agregó cloroformiato de bencilo (49 pL, 58 mg, 0.34 mmol), seguido por la adición gota a gota de K2CO3 (aq) (2 N, 0.16 mL, 0.32 mmol). Después de agitar 7 horas a temperatura ambiente, la reacción se vació sobre H20 (10 mL) y se acidificó cuidadosamente a pH 2 con HCI 6N (aq). El producto se extrajo de la capa de agua con EtOAC (3x) y la fase orgánica combinada se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida, para dar el producto deseado xxix como un sólido blanco (81 mg, 0.24 mmol, 75%). Ac-Tyr(02CNHCy)-OH (xxx). A una solución de (-)tirosina (2.50 g, 13.8 mmol) en NaOH (aq) (2 N, 7.59 ml_, 15.2 mmol) se le agregó H20 (6 ml_). Esta solución, vigorosamente agitada, se enfrió a 0 "C y se le agregó anhídrido acético (3.25 mL, 3.52 g, 34.5 mmol) por medio de una bomba de jeringa durante 30 minutos. Durante esta adición se le agregó un exceso de NaOH (aq) (2 N, 34.5 mL, 69.0 mmol) en 10 porciones. Después de completar la adición, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó 45 minutos. Después, la solución incolora se acidificó cuidadosamente a pH 2 con HCI 6N (aq). Después de concentrar bajo presión reducida, el sólido resultante se extrajo con H20 al 15% en acetona (4x). El filtrado se concentró bajo presión reducida para producir un aceite ligeramente amarillo. La adición de H20 (1 .5 mL) produjo N-acetil-tirosina como un precipitado blanco (670 mg, 3.00 mmol, 22%) que se lavó con H20 (3x). Los lavados se guardaron para precipitaciones posteriores. A una solución de N-acetil-tirosina (76 mg, 0.34 mmol) en NaOH (aq) (0.5 N, 0.61 mL, 0.31 mmol), se le agregó K2HP04 (aq) (1 M, 0.61 mL, 0.61 mmol). Esta solución, vigorosamente agitada, se enfrió a 0 °C y se le agregó gota a gota a 0 °C isocianato de ciclohexilo (48 pL, 47 mg, 0.37 mmol). Durante la adición se le agregó NaOH 0.5M (aq) (4 gotas) para mantener el pH entre 8 y 9. Después de completar la adición, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó 3 horas. Se formó un precipitado blanco y la suspensión resultante se lavó con Et20 (2x). La capa acuosa se separó y se acidificó cuidadosamente a pH 2 con HCI 6N (aq). El producto deseado xxx precipitó como un sólido blanco (89 mg, 0.26 mmol, 76%), que se filtró y se lavó con H20 (3x).

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la preparación de un reactivo de transporte híbrido péptido/peptoide que se puede unir a un agente terapéutico en el extremo amino o carboxi. La síntesis se puede llevar a cabo como se describe en el esquema 9 Esquema 9 xlviii xlix I Preparación de unidades monoméricas Aldehido xliíi. A una solución de 3-amino-1 -propanol (0.750 mL, 737 mg, 9.82 mmol) en THF (7 mL), se le agregó secuencialmente dicarbonato de di-t-butilo (2.35 g, 10.8 mmol) y una solución de carbonato de sodio (2.08 g, 19.6 mmol) en H20 (5 mL). Después de agitar vigorosamente 2 horas, la mezcla de reacción se vació sobre EtOAc. El sólido residual se trituró con EtOAc, y la fase orgánica combinada se lavó con NaHC03 saturado (aq). La capa orgánica se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida para dar un aceite crudo de color amarillo claro (1.66 g, 9.49 mmol, 97 % crudo) que se usó sin mayor purificación. A una solución de este alcohol crudo (1 .05 g, 6.01 mmol) en CH2CI2 (7 mL) se le agregó una solución de KBr (722 mg, 6.07 mmol) en H20 (3 mi). Se le agregó TEMPO (9 mg, 0.06 mmol) y la mezcla bifásica se enfrió a 0 °C. Después de agitar 10 minutos, se le agregó gota a gota una solución de NaOCI (0.7 M, 9.44 mL, 6.61 mmol) y NaHC03 (1 .84 g, 17.4 mmol) en H20 (9 mL), para mantener la temperatura interna de la reacción por debajo de 10 °C. Después de agitar 1.5 horas se le agregó mas NaOCI (0.7 M, 2.00 mL, 1.4 mmol), y un análisis de TLC indicó que el material de partida se había consumido en 20 minutos. Después, la reacción se inactivo con Na2S203 (aq) saturado, y el producto se extrajo con CH2CI2 (2x). La fase orgánica combinada se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El producto crudo resultante se purificó por cromatografía en columna para producir el aldehido deseado xliii (792 mg, 4.58 mmol, 76%).

H-0rn(Z)-0Me HCI (xliv). A una solución de H-0m(Z)-0H (1.00 g, 3.76 mmol) en MeOH anhidro (25 ml_) a 0 °C, se le agregó lentamente cloruro de tionilo (1.37 ml_, 2.24 g, 18.8 mmol), a fin de mantener la temperatura de reacción interna por debajo de 10 °C. Después de completar la adición, se retiró el baño de enfriamiento y la agitación se continuó a temperatura ambiente durante 18 horas. Después, la reacción se concentró bajo presión reducida para producir un sólido amarillento. La recristalización con MeOH.EtOAc (1 :6) dio el producto deseado xliv como un sólido blanco (600 mg, 0.190 mmol). El filtrado y los lavados de EtOAc se enfriaron durante 48 horas a -20 °C para proveer mas producto xliv (177 mg, 0.56 1 mmol). Los dos lotes (total: 777 mg, 2.46 mmol, 65%) se combinaron para uso posterior. Troc-Om(Z)-OMe alquilado (xlv). A una mezcla bifásica de EtOAc (20 mL) y NH4OH saturado (20 mL) se le agregó H-Orn(Z)-OMe«HCI sólido (184 mg, 0.582 mmol). La mezcla se agitó en un embudo de separación hasta que se disolvió el sólido. La capa orgánica se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida para producir la amina libre de H-0m(Z)-0Me. A una solución de esta amina (142 mg, 0.507 mmol) en CH2CI2 anhidro (5 mL) se le agregaron tamices moleculares de 4Á. A esta suspensión se le agregó una solución del aldehido xliii (84 mg, 0.49 mmol) en CH2CI2 (2 mL). Después de agitarla durante 20 horas, se le agregó NaCNBH3 sólido (48 mg, 0.76 mmol) en dos porciones con 45 minutos de separación. La reacción se agitó 18 horas, y la mezcla se filtró después. El filtrado se concentró bajo presión reducida, se volvió a disolver en EtOAc, se vació sobre Na2S03 (aq) saturado, y se lavó con ácido cítrico al 5% (aq). Después se separó la capa orgánica, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida para producir un aceite crudo que se uso sin mas purificación. A una solución de la amina secundaria cruda en THF anhidro (5ml_) se le agregó secuenicalmente trietilamina (0.149 ml_, 108 mg, 1.07 mmol) y cloroformiato de 2,2,2-tricloroetilo (0.101 ml_, 155 mg, 0.73 1 mmol). Se formó inmediatamente un precipitado blanco y después de agitar durante 1 5 minutos, la reacción se inactivo con NaHC03 (aq) saturado. La mezcla resultante se vació sobre EtOAc y la capa orgánica se lavó con ácido cítrico al 5% (aq), NaHC03 (aq) saturado y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida. Una cromatografía en columna produjo el producto deseado xlv (98 mg, 0.16 mmol, 32% en los dos pasos). Acido carboxílico (xlvi). A una mezcla del éster metílico xlv (10 mg, 16 µ?t???) en THF:H20 1 :1 (0.8 mL) se le agregó LiOH (aq) (1 .0 M, 19 pL, 19 pmol). Después de agitar 5 horas, la reacción se diluyó con EtOAc y se inactivo con NaHC03 (aq) saturado. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3x), y la fase orgánica combinada se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida. La película resultante (7.0 mg, 12 pmol, 75% en crudo) se usó sin mayor purificación. Amina secundaria (xlvii). Una mezcla de polvo de Zn (230 mg) en HCI (aq) al 10% (2.5 mL) se agitó vigorosamente durante 2 minutos.

Después de filtrar, el Zn activado se lavó secuencialmente con H20 (3x) y acetona (3x) y se secó bajo alto vacío. El Zn activado (196 mg, 3.00 mmol) se agregó a una solución del substrato de Troc carbamato xlv (37 mg, 60 pmol) en THF anhidro (2.0 ml_) bajo N2. Se agregó amortiguador de fosfato (pH 4.8, 0.4 mL), y la mezcla se agitó vigorosamente durante 45 minutos. El precipitado se lavó con THF (5x), y los lavados combinados se concentraron bajo presión reducida. El aceite resultante se disolvió en CHCI3 y se vació sobre Na2CC>3 (aq) saturado. La capa acuosa se extrajo se extrajo con CHCI3 (3x), y la fase orgánica combinada se separó, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró bajo presión reducida. Por cromatografía en columna se aisló el producto deseado xlvii (18 mg, 41 µ????, 68%). Siguiendo el procedimiento descrito en el esquema 9, las unidades monoméricas xlvi y xlvii se pueden acoplar usando procedimientos estándares de acoplamiento de péptido para producir xlviii. Repitiendo los pasos 3, 4 y 5 usando xlviii como material de partida, se obtiene xlix. La conversión de xlix al reactivo de transporte 1 , se puede realizar sometiendo xlix a saponificación (por ejemplo con LiOH, THF y agua), remoción del grupo protector (Troc), remoción de grupos protectores Cbz mediada por TFA, y perguanidinilación, usando los métodos conocidos en la técnica.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra la preparación de una serie de reactivos de transporte de péptido como se describe en los esquemas 10 y 1 1.

Esquema 10 Esquema 11 El monómero ?-ornitina Ivi se sintetizó como se muestra en el esquema 10 [Smreina y otros, Tetrahedron, 53,12867-12874 (1997)]. El tratamiento del derivado de ?-ornitina li con ácido de Meldrum y DCC dio Mi, que por reducción con acetoxiborohidruro de sodio dio liii. El compuesto liii sufrió cierre de anillo de descarboxilación para producir la lactama liv, que por hidrólisis básica dio Iv. La desprotección de Z y la desprotección de Fmoc del nitrógeno alfa de Iv, dio el monómero requerido Ivi. El compuesto Ivi se acopló entonces sobre la fase sólida usando condiciones estándares de acoplamiento de péptido en un sintetizador de péptidos como se muestra en el esquema 1 1 para producir los oligómeros ligados a resina lix-lxi. La desprotección de estos de la resina usando TFA también logró la desprotección de los grupos Boc para producir los oligómeros de ?-ornitina Ixii-lxiv, que se sometieron a perguanidinilación para producir los oligómeros finales de ?-arginina Ixv-lxvii.

Sección experimental. (R)-5-[(2-Benciloxicarbonilamino-3-(Boc)aminoprop¡l)-propil]-2,2-d¡met¡l-1 ,3-dioxano-4,6-diona (liü). Se disolvieron 20 mmol de Z-(Boc)Orn-OH con 22 mmol de ácido de Meldrum y 31 mmol de DMAP en cloruro de metileno (100 mi). La mezcla de reacción se enfrió a -5 °C y se le agregó una solución de 22 mmol de DCC en 50 mi de cloruro de metileno durante 1 hora. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche. El DCU precipitado se filtró entonces y el resto de la solución se lavó 4x con KHS04 al 5%, 1x con salmuera, y se secó sobre MgS04 en el refrigerador durante 5 horas. Esta solución se filtró entonces y se enfrió a -5 °C y se le agregaron 13.3 mi de ácido acético al 98%, seguido por la adición en porciones de 1.85 g de borohidruro de sodio. La mezcla de reacción se agitó a <0 °C durante 10 horas y después se lavó 3x con salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó al vacío para dar un producto crudo que se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando hexano : acetato de etilo, 1 :1 . 1H RMN (CDCI3) d 7.3-7.4 (s, 3.8H), 5.1 (s, 1 .93H), 4.8-4.9 (br s, 0.75H), 4.4-4.5 (br d, 0.9H), 3.8-4 (br d, 1 5H), 3.1-3.3 (d, 1 .97H), 2-2.3 (m, 3.85H), 1.7-1.8 (2 s, 7.14H), 1 .5-1.7 (m, 4.95H), 1.4 (s, 9.59H). (R)-N-Benciloxicarbonil-5-t-butoxicarbonilaminopropil-2-pirrolidinona (liv). Se pusieron en reflujo 31 mmol de liü en 100 mi de tolueno durante 3 horas. El solvente se evaporó al vacío para producir liv. R( = 0.54 (EtOAc 66% en pentano; molibdato); 1 H RMN (CDCI3) d 7.3-7.4 (br s, 4.05H), 5.1 q, (1.99H), 4.6b (r s, 0.88H), 4-4.2 (br s, 1 .26H), 3.2 (m, 2.28H), 2.4-2.6 (m, 2.54H), 2-2.2 (m, 1.24H), 1.7-1 .9 (m, 1 .9H), 1 .4-1.6 (s, 12.26H); 3C RMN (CDCI3) d 225.153, 1 73.848, 155.873, 151 .44, 135.24, 134.42, 128.62, 128.43, 128.23, 105.47, 77.42, 77.21 , 77.00, 76.57, 68.05, 61.54, 57.65, 40.12, 31.24, 30.77, 28.39, 26.14, 22.68, 17. Gamma-Z-(Boc)Orn-OH (Iv). Se disolvieron 34 mmol de liv en acetona (60 mi) y NaOH aq 1 M (90 mi). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La acetona se removió al vacío y la solución acuosa se acidificó con HCI 6M hasta pH 2. El producto cristalizó como un sólido blanco que se recogió por filtración. 1 H RMN (CDCI3) d 7.2-7.4 (s, 4.42H), 5.05 (s, 1 .98H), 4.8-5 (br s, 1 .2H), 3.4-3.6 (br s, 1.01 H), 3-3.2 (d, 1 .97H), 2.3 (m, 1.96H), 1 .5 (m, 1.89H), 1 .3 (s, 12.5H); 13C RMN (CDCI3) d 177.66, 156.44, 1 56.10, 136.44, 128.51 , 128.1 1 , 128.03, 79.31 , 77.43, 77.21 , 77.00, 76.57, 67.26, 66.74, 51 .64, 50.79, 40.22, 32.63, 30.67, 30.40, 28.38, 26.6. Gamma-Fmoc-(Boc)Orn-OH (Ivi). Se trataron 1 1 mmol de Iv con Pd al 10% / C (0.4 moles %) en 300 mi de MeOH durante 4 horas, hasta que una TLC indicó el consumo completo del material de partida y después el solvente se evaporó al vacío. El aceite amarillo remanente se disolvió entonces en solución de carbonato de sodio al 9% hasta que la solución se hizo básica y entonces se le agregó Fmoc-OSu (1 1 mmol) como una solución en DMF (25 mi). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se acidificó entonces con HCI 12M hasta que se hizo ácida y después se extrajo con EtOAc (3x, 100 mi cada vez). La fase orgánica combinada se lavó entonces con salmuera y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se evaporó al vacío para producir un sólido amarillo que se purificó por cromatografía en columna sobre sílice. 1H RMN (CDCI3) d 7.6-7.8 (m, 2.07H), 7.4-7.6 (m, 2.2H), 7.2-7.4 (m, 9.61 H), 5.1 (s, 2H), 4.9 (br t, 0.73H), 4.7 (d, 0.52H), 4.5 (s, 0.52H), 4.4 (d, 1 .63H), 4.1 (t, 1 .13H), 3.6 (br s, 0.87H), 3.1 5 (s, 1 .8H), 2.3 (d, 1 .56H), 2.05 (br m, 0.57H), 1 .8 (br m, 0.7H), 1 .1 -1 .5 (br m, 5.95H); 13C RMN (CDCI3) d 177.5, 156.5, 143.7, 141 .3, 136.5, 128.5, 127.6, 125.0, 1 19.9, 94.0, 77.4, 77.1 , 76.5, 66.7, 66.2, 51 .6, 50.6, 47.3, 47.1 , 40.5, 32.5, 30.5, 26.3, 26.1 , 25.7. Compuesto ES-MS cale. Encontrado g-0m5 (lix) 1230.6 (z1 ) 1230.6 (z1 ) g-Orn7 (Ix) 1515.0 (z1 ), 1514.5 (z1 ) 758.5 (z2) 757.9 (z2) g-Orn9 (Ixi) 600.7 (z3) 600.7 (z3) g-R5 (Ixii) 1440.8 (z1 ) 1452.7 (z1 + Na) g-R7 (Ixiü) 905.6 (z2) 905.4 (z2) gR9 (Ixiv) 1089.86 (z2) 1089.7 (z2) EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra la preparación de un reactivo de transporte de glutaramida, así como también los derivados relacionados de urea (L = C(O)); oxalamida (L = C(0)C(0)); y succinamida (L = C(0)CH2CH2C(0)). Las vías sintéticas se proveen en el esquema 6.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ¡lustra la preparación de un reactivo de transporte sobre un esqueleto de monosacárido (véase el esquema 12) Esquema 12 H2N ^ ?? N OTs Boc Ixviii N Boc Ixxi a) i) BnBr, DCM ¡i) NMM, BOC20 21 %, b) TsCI, NMM, DMAP, DCM, 80%, c) Nal acetona, reflujo, d) l2, PPh3, imid., DCM, e) bromuro de alilo, NaH, DMF, 0°C, 74% Como se muestra en el esquema 12, se puede proteger 3-aminopropanol con un grupo bencilo y un grupo Boc de acuerdo con los métodos establecidos para proveer Ixix. El desplazamiento del grupo hidroxi con yodo para proveer Ixxi se puede realizar con l2 y PPh3. El tratamiento del monosacárido Ixxü con Ixxi en presencia de un barredor de ácido puede producir Ixxvü, que después de desprotección y guanidinilación de acuerdo con los métodos aquí descritos, provee el reactivo de transporte objetivo Ixxix.

También se ¡lustra en el esquema 12 la preparación de un reactivo de transporte relacionado (Ixxvi) y utiliza una química similar a la provista para el compuesto homólogo Ixxix.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra la preparación y evaluación de una serie de reactivos de transporte de carbamato usando fluoresceína o biotina como un agente terapéutico sustituto. En cada caso, la síntesis comienza con la preparación de un monómero Ixxxii, ilustrado en el esquema 13 (véanse los esquemas 13 y 14).

Esquema 13 Ixxx Ixxxi Ixxxii (a) (i) cloroformiato de isobutilo, DME, NMM, 1 5°C (¡i) NaBH4, H20 (85%); (b) cloroformiato de p-nitrofenílo, THF, piridina (92%) Ester 9H-fluoren-9-¡lmetílico del ácido (1 S)-(4-ter-butoxicarbonílamino-1 -hidroximet¡l-butil)-carbámico (Ixxxi).

FTOCHN / .OH "^NHBoc lxxxi Se agregaron 20 mi de dimetoxietano a un matraz seco de fondo redondo de 100 ml_ bajo N2. Se le agregaron con agitación 4.54 g (10.0 mmol) de Fmoc-Orn(Boc)-OH, Ixxx. La suspensión se enfrió en un baño de hielo / agua / sal a -1 5 °C. Al sólido bien suspendido se le agregaron 1 .1 1 mi (10 mmol) de N-metilmorfolina, seguido por 1 .36 ml_ (10 mmol) de cloroformiato de isobutilo. La reacción se agitó vigorosamente 1 minuto y después se filtró al vacío. El filtrado se agitó y se le agregó inmediatamente una solución de 570 mg (1 5 mmol) de borohidruro de sodio en 20 mL de agua. Después de 20 minutos se le agregaron 150 mL de agua, y después de 1 hora el precipitado blanco resultante se filtró, se lavó con agua y hexano, y después se secó en un horno de vacío a 40 °C durante 36 horas para dar 3.75 g (8.52 mmol, 85%); sólido blanco; Rf TLC (acetato de etilo 60% / hexano): 0.45; p.f: 107-109 °C; HRMS cale. (M+ menos C4H90, C21 H23N2O4.) 367.1658, encontrado 367.1664. 1H RMN (300 MHz, D20) d 7.74 (d, 2H, J=7.5), 7.58 (d, 2H, J=7.2), 7.38 (t, 2, J=7.3), 7.29 (t, 2H, ¿=7.2), 5.05 (m, 1 H), 4.57 (m, 1 1 H), 4.42 (d, 2H, J=6.6), 4.19 (t, 1 1 H, J=6.5), 3.72-3.50 (m, 3H), 3.1 1 (m, 2H), 2.14 (m, 1 H), 1 .62-1 .41 (m, 4H), 1.43 (s, 9H). 13C RMN (125 MHz, CDCI3) d 156.7, 156.2, 143.8, 141.2, 127.6, 127.0, 125.0, 1 19.9, 79.2, 66.4, 64.8, 52.8, 47.2, 40.2, 28.4, 28.2, 26.7. Ester 4-n¡tro-fenílico del ácido 5-ter-butoxicarbonilamino-2-(9/-/-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-pentilcarbón¡co (Ixxxii). Ixxxii El compuesto Ixxxi (5.705 g, 13.0 mmol) se disolvió en 65 mL de THF en un matraz seco de fondo redondo de 250 mL bajo N2. Se le agregó piridina (3.1 mL, 39 mmol), seguida por una solución de 5.23 g (26 mmol) de cloroformiato de 4-nitrofenilo en 25 mL de THF. Se observó inmediatamente un precipitado blanco. Después de agitar 2 horas a temperatura ambiente, el material de partida se había consumido (TLC). El solvente se concentró al vacío hasta aproximadamente 5 mL. El residuo se tomó en 100 mL de CH2CI2 y se lavó con NaHS04 1 M (5 x 30 mL), seguido por Na2C03 1 M (3 x 40 mL) y 25 mL de salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSC>4 y se removió al vacío para dar 7.21 g (1 1.9 mmol, 92%) de Ixxxii como un sólido blanco; TLC Rf (acetato de etilo 50% / hexano): 0.60; p.f: 140-142 °C; HRMS (reexpuesto). 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 8.25 (d, 2H, J=9.0), 7.77 (d, 2H, J=7.3), 7.60 (d, 2H, J=7.3), 7.27 (m, 6), 5.04 (m, 1 H), 4.55 (m, 1 H), 4.44 (t, 2H, J=6.3), 4.35-4.17 (m, 3H, J=6.5). 3.99 (m, 1 H), 3.15 (m, 2H), 1 .68-1 .47 (m, 4H), 1.44 (s, 9H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3) d 156.0, 155.3, 152.4, 145.4, 143.8, 143.7 141 .3, 127.7, 127.0, 125.3, 124.9, 121.7, 120.0, 79.4, 70.7, 66.6, 50.0, 47.2, 40.0, 28.4, 28.2, 26.8.

La preparación de los conjugados de fluoresceína o de biotina procede como se describe en los esquemas 14 y 15.

Esquema 14 (a) piperidina 20%/DMF; (b) 3, HOBT, DIEA, DMF; (c) Fmoc-aca-OH, DIC, DMF, HOBT; (d) FITC, DIEA, DMF; (f) TFA/TIS 95:5; (g) clorhidrato de pirazol-1 -carboxamidina, K2C03! H2O Esquema 15 Ixxxiv Ixxxix xc (a) piperidina 20%/DMF; (b) 3, HOBT, DIEA, DMF; (c) Fmoc-aca-OH, DIC, DMF, HOBT; (d) éster p-nitrofenílico de biotina, DIEA, DMF; (f) TFA/TIS 95:5 (35% de 4); (g) clorhidrato de pirazol-1-carboxamidina, K2CO3, H2O (70%) Procedimiento general para la síntesis de FITC-aca-OrnV CONH2 Se trató resina Fmoc-amida (159 mg, 0.1 mmol, 0.63 mmol/g) con piperidina al 20% / DMF (10 mL) durante 30 minutos (3x) para dar la amina libre ligada a resina que se lavó con DMF (3 x 10 mL). La resina se trató con una solución de Ixxxii (1.0 mmol), DIEA (0.5 mmol), HOBT (2.0 mmol) en DMF (10 mL) durante 4 horas, y después se lavó con DMF (3 x 10 mL). Estos cuatro pasos (desprotección, lavado, acoplamiento, lavado) se repitieron para dar los oligómeros de la longitud deseada. Se añadió un espaciador de ácido aminocaproico por desprotección con piperidina 20% / DMF (10 mL) durante 30 minutos (3x), seguido por tratamiento con ácido Fmoc-aminocaproico (1 .0 mmol), DIEA (0.5 mmol), HOBT (2.0 mmol), DIC (1.0 mmol), DMF (10 mL) durante 1 hora (2x). Después se realizó desprotección con piperidina 20% / DMF (10 mL) durante 30 minutos (3x) y tratamiento con isotiocianato de fluoresceína (0.5 mmol), DIEA (0.5 mmol), DMF (7 mL) durante 18 horas. La resina se lavó con DMF (3 x 10 mL) y después diclorometano (5 x 10 mL). La separación del oligómero de la resina se realizó en un tubo de plástico de 15 mL por tratamiento con 10mL de TFA / triisopropilsilano 95:5. Después de 12 horas, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con 10 mL de TFA. La concentración del filtrado al vacío hasta aproximadamente 1 .5 mL de solvente, seguida por su adición gota a gota a éter frío, produjo un precipitado amarillo. El sólido se hizo pella por centrifugación y el líquido se Por HPLC de fase inversa y liofilización se obtuvo el oligómero FITC-aca-0mC5-C0NH2 (lxxxvi-a) 66 mg (0.036 mmol, 49%), sólido amarillo; tiempo de retención en RP-HPLC = 7.87 minutos; ES-MS (ionización +) cale. (M+H, C57H86Ni3016S) 1240.6, encontrado 1240.5. 1H RMN (300 MHz, D20) d 7.88 (s, 1 H), 7.49 (d, 1 H, J=7.5), 7.08 (d, 1 H, J=8.1 ), 6.98 (d, 2H, J=8.7), 6.79 (s, 2H), 6.66 (dd, 2H, J=9.2, 2.0), 3.95-3.60 (m, 10H), 3.61 -3.49 (m, 5H), 3.47-3.38 (m, 2H), 2.84-2.73 (m, 10H), 2.13-2.07 (m, 2H), 1.60-1.14 (m, 26H). FITC-aca-0mC7-C0NH2 (lxxxvi-b) 93 mg (0.061 mmol, 53%), sólido amarillo, tiempo de retención RP-HPLC = 7.50 min; ES-MS (ionización +) cale. (M+ C69H110N17O20S) 1528.8, encontrado 1528.6. 1 H RMN (300 MHz, D20) d 7.84 (s, 1 H), 7.56-7.48 (m, 1 H), 7.14 (d, 1 H, J=7.8), 6.93 (d, 2H, J=8.4), 6.81 (s, 2H), 6.64 (d, 2H, J=8.7), 3.97-3.39 (m, 23H), 2.84-2.70 (m, 14H), 2.15-2.06 (m, 2H), 1 .60-1 .17 (m, 34H). FITC-aca-Ornc9-CONH2 (lxxxvi-c) 81 mg (0.028 mol, 28%), sólido amarillo, tiempo de retención de RP-HPLC =7.23 min; ES-MS (ionización +) cale. (M+ C8iH134N2i024S) 1817.0, encontrado 1816.4. 1H RMN d 7.89 (s, 1 H), 7.51 (d, 1 H, J=6.6), 7.03 (d, 1 H, J=8.1 ), 6.87 (d. 2H, J=8.7), 6.71 (s, 2H), 6.60 (d, 2H, J=9.0), 3.97-3.62 (m, 18H), 3.62-3.45 (m, 9H), 3.45-3.35 (m, 2H), 2.88-2.68 (m, 18H), 2.14-2.04 (m, 2H), 1 .63-1 .14 (m, 42H). Biotina-aca-Omc8-CONH2 (Ixxxix) se trató resina Fmoc-amida (159 mg, 0.1 mmol, 0.63 mmol/g) con piperidina 20% / DMF (10 mL) durante 30 minutos (3x) para dar la amina libre ligada a la resina, que se lavó con DMF (3 x 10 mL). La resina se trató con una solución de Ixxxii (1 .0 mmol), DIEA (0.5 mmol), HOBT (2.0 mmol) en DMF (10 mL) durante 4 horas, y después se lavó con DMF (3 x 10 mL). Estos cuatro pasos (desprotección, lavado, acoplamiento, lavado) se hicieron 7 veces mas para dar el octámero ligado a la resina. Se añadió un espaciador de ácido aminocaproico por desprotección con piperidina 20% / DMF (10 mL) durante 30 minutos (3x), seguida por tratamiento con ácido Fmoc-aminocaproico (1 .0 mmol), DIEA (0.5 mmol), HOBT (2.0 mmol), DIC (1 .0 mmol), DMF (10 mL), durante 1 hora (2x). Se realizó biotinilación por desprotección con piperidina 20% / DMF (10 mL) durante 30 minutos (3x) y tratamiento con p-nitrofenilester de biotina (0.25 mmol), DIEA (0.5 mmol), DMF (7 mL), durante 4 horas (2x). La resina se lavó con DMF (3 x 10 mL), y después con diclorometano (5 x 10 mL). La separación del oligómero de la resina se realizó en un tubo de plástico de 15 mL por tratamiento con 10 mL de TFA / triisopropilsilano, 95:5. Después de 12 horas, la mezcla de reacción se filtró y la resina se lavó con 10 mL de TFA. La concentración del filtrado al vacío hasta aproximadamente 1 .5 mL de solvente, seguida por su adición gota a gota a éter frío, produjo un precipitado blanco. El sólido se hizo pella por centrifugación y el líquido se decantó. Por HPLC de fase inversa y liofilización se obtuvo el oligómero deseado, 84 mg (0.035 mmol, 35%) como un sólido blanco; tiempo de retención de RP-HPLC =4.82 minutos; ES-MS (ionización +) cale. (M+H, H125N20O19S) 1509.9, encontrado 1509.7. 1H RMN (300 MHz, D20) d 4.42 (dd, 1 H, J=4.7, 8.0), 4.23 (dd, 1 H, J=4.4, 8.0), 4.02-3.70 (m, 16H), 3.65-3.53 (m, 8H), 3.17-3.1 1 (m, 1 H), 2.98 (t, 2H, J=6.7), 2.86-2.75 (m, 17H), 2.59 (d, 1 H, J=12.9), 2.1 1 -2.02 (m, 4H), .64-1 .08 (m, 44H). Perquanidinilación: Una solución de carbamato amina (0.03 mmol) disuelta en agua desionizada (3mL), se trató con carbonato de potasio (5 equivalentes por residuo de amina) y pirazol-1-carboxamidina (5 equivalentes por residuo de amina), y se calentó 36 horas a 40 °C. La mezcla cruda se acidificó después con TFA (0.3 mL), se purificó por RP-HPLC y se liofilizó para producir el oligómero guanidinilado. FITC-aca-ArgC5 (Ixxxviia) 10 mg (0.0049 mmol, 26%), sólido amarillo; tiempo de retención de RP-HPLC = 8.35 minutos; ES-MS (ionización +) cale. (M+H, C^Hg^OieS) 1450.1 , encontrado 1451 .0. 1H R N (300 MHz, D20) d 7.93 (s, 1 H), 7.61 -7.49 (m, 1 H), 7.18 (d, 1 H, J=8.1 ), 7.00 (d, 2H, J=8.7), 6.88 (s, 2H), 6.71 (d, 2H, J=9.0), 3.95-3.41 (m, 17H), 3.03-2.86 (m, 10H), 2.16-2.07 (m, 2H), 1.57-1 .13 (m, 26H). FITC-aca-Argc7 (lxxxvii-b) 21 mg (0.0080 mmol, 27%), sólido amarillo; tiempo de retención de RP-HPLC = 8.38 minutos; ES-MS (ionización +) cale. (M+H, C76Hi24N3iO20S) 1822.9, encontrado 1823.5. 1H RMN (300 MHz, D20) d 7.92 (s, 1 H), 7.62-7.55 (m, 1 H), 7.17 (d, 1 H, J=8.4), 6.92 (d, 2H, J=9.0), 6.83 (s, 2H), 6.65 (d, 2H, J=9.0), 3.96-3.40 (m, 23H), 3.04-2.88 (m, 14H), 2.18-2.10 (m, 2H), 1.58-1 .14 (m, 34H). FITC-aca-ArgC9 (lxxxvii-c) 22 mg (0.0068 mmol, 40%), sólido amarillo; tiempo de retención de RP-HPLC = 8.29 minutos; ES-MS (ionización +) cale. (M+2H, C9oH15 N39024S; z=2) 1098.0, encontrado 1098.5 H RMN (300 MHz, D20) d 7.89 (s, 1 H), 7.59-7.49 (m, 1 H), 7.12 (d, 1 H, J=8.1 ), 6.85 (d, 2H, J=9.0), 6.75 (s, 2H), 6.59 (d, 2H, J=9.0), 3.95-3.34 (m, 29H), 3.02-2.85 (m, 18H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.54-1.1 1 (m, 42H). B¡otina-aca-ArgC8 (xc) 68 mg (0.028 mmol, 70%), sólido blanco; tiempo de retención de RP-HPLC = 6.33 minutos; ES-MS (ionización) cale. (M+2H, C72H 2N36O19S; z=2) 923.5, encontrado 924.1 (z=2). H RMN (300 MHz, D20) d 4.42 (dd, 1 H, J=4.6, 8.0), 4.22 (dd, 1 H, J=4.5, 7.8), 4.02-3.68 (m, 16H), 3.68-3.51 (m, 8H), 3.16-3.08 (m, 1 H), 3.05-2.91 (m, 18H), 2.79 (dd, 1 H, J=5.1 , 12.9), 2.58 (d, 1 H, J=12.9), 2.1 1-2.00 (m, 4H), 1.59-1.06 (m, 44H).

Resultados: Las figuras 1A-1 C proveen una serie de tres histogramas que muestran la incorporación observada a concentraciones de aproximadamente 12.5 µ? a 50 µ para pentámeros, heptámeros y nonámeros de transportadores de carbamato, en comparación con los pentámeros, heptámeros y nonámeros correspondientes de péptido amidas de D-arginina. La figura 1A es para 25 µ?, la figura 1 B es para 50 µ? y la figura 1 C es para 12.5 µ?. Cada transportador se unió covalentemente a una porción de Conjugado de ciclosporina -Rc8 liberable (xcvii) Al sólido xcvi (6 mg, 0.0019 mmol) se le agregó 1 ml_ de ácido fórmico al 96%. La solución se agitó 24 horas, se diluyó con 10 mL de agua y se liofilizó para dar 7 mg de producto crudo.

EJEMPLO 8 Conjugado de taxol y un reactivo de transporte con enlazador liberable de pH Este ejemplo muestra el uso de una estrategia general para sintetizar profármacos que tienen un transportador enlazado con un fármaco por medio de un enlazador, que libera el fármaco del transportador por exposición al pH fisiológico. En general, un sitio adecuado sobre el fármaco se modifica para llevar un residuo de a-cloroacetilo. Después, el cloro se desplaza con el tiol de un residuo de cisteína que lleva una amina desprotegida.

Métodos: Síntesis de taxol-2'-cloroacetilo. Se disolvió taxol (89.5 mg, 104.9 pmol) en CH2CI2 (3.5 ml_). La solución se enfrió a 0 °C bajo una atmósfera de N2. Se le agregó anhídrido a-cloroacético (19.7 mg, 1 15.4 pmol), seguido por DIEA (14.8 mg, 1 15.4 pmol). La solución se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de que un análisis de cromatografía de capa delgada (TLC) indicó el consumo completo del material de partida, el solvente se removió al vacío y el material crudo se purificó por cromatografía de vaporización instantánea sobre gel de sílice (eluyente: EtOAC/Hex 20%-50%), produciendo el material deseado (99.8 mg, cuantitativo). H-RMN (CDCI3): d = 8.13 (d, J=7.57 Hz, 2H), 7.72 (d, J=7.57 Hz, 2H), 7.62-7.40 (m, 1 H), 6.93 (d, J=9.14 Hz, 1 H), 6.29-6.23 (m, 2H), 6.01 (d, J=7.14 Hz, 1 H), 5.66 (d, J=6.80 Hz, 1 H), 5.55 (d, J=2.24 Hz, 1 H), 4.96 (d, J=8.79 Hz, 1 H), 4.43 (m, 1 H), 4.30 (d, J=8.29 Hz, 1 H), 4.20-4.15 (m, 2H), 3.81 (d, J=6.71 Hz, 1 H), 2.56-2.34 (m, 3H), 2.45 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.19 (m, 1 H), 1.95-1.82 (m, 3H), 1.92 s, (3H), 1.67 (s, 3H), 1.22 (s, 3H), 1 .13 (s, 3H) ppm. 3C-RMN (CDCI3): d = 203.6, 171.1 , 169.7, 167.3, 167.0, 166.9, 166.3, 142.3, 136.4, 133.6, 133.5, 132.9, 132.0, 130.1 , 129.2, 121.1 , 128.7, 128.6, 127.0, 126.5, 84.3, 81 .0, 79.0, 76.3, 75.4, 75.2, 75.0, 72.2, 72.0, 58.4, 52.7, 45.5, 43.1 , 40.1 , 35.5, 26.7, 22.6, 22.0, 20.7, 14.7, 9.5 ppm.

Enlace de taxol al transportador. Al transportador que tiene unido un resido de cisteína, disuelto en DMF (1.0 mL), se le agrega DIEA (2.8 mg, 22.4 pmol) bajo una atmósfera de N2. Se le agrega una solución de taxol-2'-cloroacetato (20.8 mg, 22.4 pmol) en DMF (1 .0 mL). Se continúa la agitación a temperatura ambiente durante 6 horas. Se le agrega agua conteniendo TFA al 0.1 % (1 .0 mL), y la muestra se congela y los solventes se liofilizan. El material crudo se purifica por RP-HPLC (eluyente: agua / MeCN*0.1 % TFA: 85%-15%).

Prueba de citotoxicidad. La citoxicidad de los conjugados de taxol se puede determinar en una prueba de reducción del colorante bromuro de 3-(4 , 5-d i meti lt¡azol-2- i I )-2,5-difenil-tetrazolio (MTT).

EJEMPLO 9 Síntesis del conjugado itraconazol-transportador Este ejemplo provee una aplicación de una estrategia general para unir un transportador a un compuesto que incluye una estructura de triazol. Más abajo se muestra un esquema que usa la unión de itraconazol con un transportador. En este esquema, R es H o alquilo, n es 1 o 2, y X es un halógeno.

La reacción incluye el uso de cuatemización de un nitrógeno en el anillo de triazol para unir un grupo acilo que tiene un halógeno (por ejemplo Br, F, I) o un éster metílico. El compuesto 3 se aisló por HPLC. Una RMN de protones en D20 reveló picos de itraconazol y transportador. El éster metílico dio rendimientos de 70% y más, mientras que los rendimientos obtenidos usando el par ácido/éster propiónico-Br fue de 40-50%. El derivado acilo se hace reaccionar entonces con la amina del transportador para formar el conjugado. Alternativamente, primero se puede unir el grupo acilo halogenado a la molécula transportadora por medio de un enlace de amida, después de lo cual se realiza la reacción con el compuesto fármaco.

EJEMPLO 10 Preparación de conjugados FK506 Este ejemplo describe la preparación de conjugados en donde se une FK506 al transportador. Se usaron dos enlazadores diferentes, cada uno de los cuales puede liberar FK506 a pH fisiológico (pH 5.5 a 7.5), pero tienen vidas medias más largas a pH más ácido. Estos esquemas se muestran a continuación como los esquemas l-IV.

Esquema I 1) Et3N, CICOOCH(CH3)2, NH2NHtBoc, 2h, (81 %) 2) TFA, CH2CI2l 3h, (95%) Esquema II Esquema III Esquema IV Enlazador 1 : Trifluoroacetato de la hidrazida 6-maleimido-caproica Una solución de FK506 (1 ) (0.1 g, 124.4 mol), trifluoroacetato de la hidrazida 6-maleimidocaproica (2) (0.126 g, 373.2 mol) y ácido trifluoroacético (catalítico, 1 L) en metanol anhidro (5 mL), se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas. La reacción se monitoreó por cromatografía en capa delgada, que mostró desaparición casi completa del material de partida [sistema de solventes de la TLC: diclorometano (95) : metanol (5), Rf = 0.3]. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y se disolvió en acetato de etilo (20 ml_). La capa orgánica se lavó con agua y solución al 10% de bicarbonato de sodio, y después se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando diclorometano (96) : metanol (4) como eluyente para dar la hidrazona 3 (0.1 16 g, 92%). Una solución de la hidrazona anterior (3), transportador y diisopropiletilamina (1 x) en dimetilformamida anhidra (1 ml_), se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 36 horas, cuando una TLC indicó la desaparición completa de la hidrazona de partida. El solvente se evaporó de la mezcla de reacción y el residuo se purificó por HPLC de fase inversa usando solución acuosa amortiguadora de ácido trifluoroacético, y acetonitrilo. Véase Willner y otros, Bioconjugate Chemistr 4:521 -527 (1993).

Enlazador 2: Carboxilato de 2-(2-piridinilditio)etilhidrazina Una solución de FK506 (1 ) (0.1 g, 124.4 mol), carboxilato de 2- (2-p¡ridinilditio)etilhidrazina (9) (0.091 g, 373.2 mol) y ácido trifluoroacético (catalítico, 1 L) en metanol anhidro (5 mL), se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se monitoreó por medio de cromatografía en capa delgada, que mostró la desaparición casi completa del material de partida [sistema de solventes de TLC -acetato de etilo, Rf = 0.5]. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y se disolvió en acetato de etilo (20 mL). La capa orgánica se lavó con agua y solución de bicarbonato de sodio al 10%, y después se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando diclorometano (97) : metanol (3) como eluyente para dar el conjugado de hidrazona 10 (0.091 g, 71 %). El acoplamiento de 10 con un transportador que tiene un residuo de cisteína terminal se puede realizar por medio de desplazamiento de piridinatiol como se muestra en el esquema IV. Véase Kaneko y otros, Bioconjugate Chemistry 2: 133 (1991 ).

EJEMPLO 11 Este ejemplo ilustra la conjugación de ciclosporina con una porción transportadora usando un grupo de enlace sensible al pH (véase el siguiente esquema).

En este ejemplo, la ciclosporina es convertida a su éster de cloroacetato usando anhídrido cloroacético. El éster se trata entonces con un reactivo de transporte que tiene unido un grupo de cisteína para proveer el conjugado de ciclosporina.

EJEMPLO 12 Este ejemplo ilustra dos métodos para enlazar agentes activos a porciones de transporte. Se da una ilustración para derivados de ácido retinoico enlazados a derivados de poli-D-Arg, pero se puede aplicar a enlaces entre otros agentes biológicos y las porciones de transporte de la presente invención. (a) Enlace entre un agente biológico que tiene un grupo funcional aldehido Este ejemplo ilustra la preparación de un conjugado entre un nonámero de D-arginina (H2N-r9-C02H 10TFA) y rrans-retinal o 13-c/s-retinal. De esta manera, la condensación de cualquier retinal con h^N-rg-CC^H' OTFA en MeOH en presencia de tamices moleculares de 4 Á, a temperatura ambiente durante 4 horas, produce un enlace de tipo base de Schiff entre el retinal aldehido y el grupo terminal amino. La purificación del conjugado se puede llevar a cabo filtrando los tamices moleculares y removiendo el metanol bajo presión reducida. (b) Conjugación de ácido retinoico con r7-CONH? Este ejemplo ¡lustra la preparación de un conjugado entre ácido retinoico y r7-CONH2 usando el grupo de enlace: aquí, primero se combina el ácido retinoico con el éster cloroacetato de 4-hidroximetil-2,6-dimetilfenol para proveer un conjugado con grupo de enlace adecuado. La combinación del conjugado con grupo de enlace con ácido retinoico en cloruro de metileno, en presencia de diciciohexilcarbodiimida y una cantidad catalítica de 4-dimetilaminopiridina, provee un derivado retinoide que entonces se puede condensar con H2NCys-r7CONH2- 8TFA en presencia de diisopropiletilamina (DMF, temperatura ambiente, 2 horas) para proveer el producto conjugado deseado.

EJEMPLO 13 Este ejemplo ilustra el uso de aminoácidos espaciadores para proveer una orientación facial de los grupos de cabeza de guanidinio hacia un lado del reactivo de transporte. Se entiende que los ejemplos y modalidades aquí descritas solamente tienen fines ilustrativos, y que varias modificaciones o cambios a la luz de la misma serán sugeridas al experto en la materia y se incluyen dentro del espíritu y extensión de esta solicitud, y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan aquí como referencia para todos sus fines.

Claims (10)

142 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Un compuesto que tiene la fórmula: en donde: el subíndice m es un entero de 6 a 25; T es un miembro seleccionado del grupo que consiste de un primer grupo funcional terminal protegido o sin proteger, un grupo de enlace protegido o sin proteger, y un grupo de enlace que tiene unido un agente terapéutico; W es un miembro seleccionado del grupo que consiste de un segundo grupo funcional terminal protegido o sin proteger, un grupo de enlace protegido o sin proteger, y un grupo de enlace que tiene unido un agente terapéutico, con la condición de que T y W no contienen simultáneamente un agente terapéutico unido; cada X' es una subunidad de esqueleto en donde el superíndice i es un entero de 1 a m, y denota la posición adelante de W; cada Y' se selecciona del grupo que consiste de H, una cadena lateral de aminoácido, arilo y heteroarilo, cuando el subíndice n es 0; o se selecciona del grupo que consiste de alquileno de Ci-C8, alquenileno de C2-C8, alquinileno de C2-C8, heteroalquileno de C2-C8, cicloalquilalquileno de C3-C8, espirocicloalquileno de C2-C8, arileno, 143 heteroarileno, y combinaciones de los mismos, cuando el subíndice n es 1 ; cada Z1 es una porción de guanidinio seleccionada del grupo que consiste de: en donde la línea ondulada denota el punto de unión con Y'; y el subíndice n es 0, 1 o 2, indicando la ausencia o presencia de una o dos porciones de guanidinio Z en cada posición i; con la condición de que el compuesto tenga por lo menos 4 porciones guanidinio, que pueden ser las mismas o diferentes, y la porción del compuesto que une a W con T sea diferente de un polípéptido.

2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada X1 se selecciona independientemente del grupo que consiste de: 144 en donde cada R es un miembro seleccionado del grupo que consiste de H y una cadena lateral de aminoácido; y la línea ondulada marcada con asterisco indica el punto de unión con Y' y las demás lineas onduladas indican el punto de unión a lo largo del esqueleto.

3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque cada X1 se selecciona del grupo que consiste de: * donde cada R se selecciona del grupo que consiste de H y CH3.

4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 145 caracterizado además porque cada Z' se selecciona del grupo que consiste de:

5. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque cada Y1 que está unido a Z' se selecciona del grupo que consiste de alquileno de C Cs, alquenileno de C2-C8, heteroalquileno de C2-C8, cicloalquilalquileno de C3-C8, arileno y combinaciones de los mismos.

6. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque cada Y' que está unido a Z1 es un alquileno de C3-C7 no ramificado.

7.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque cada Y' que está unido a Z' es un alquileno de C4-C6 y cada Z¡ es -NH-C(=NH2)-NH2.

8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque para cada entero i impar, n es 0; y para cada entero i par, n es 1 .

9. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque m es un entero de 12 a 25, y con la condición de que el compuesto tenga de 6 a 8 porciones de guanidinio que pueden ser 146 iguales o diferentes.

10. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene un esqueleto de carbamato. 1 1 . - El compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque tiene de 5 a 15 grupos de cabeza de guanidinio. 12. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque tiene de 5 a 9 grupos de cabeza de guanidinio. 13. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caractenzado además porque tiene un esqueleto de glutaramida. 14.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque tiene de 5 a 15 grupos de cabeza de guanidinio. 15. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene un esqueleto de poliamina. 16. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque tiene de 5 a 15 grupos de cabeza de guanidinio. 17. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene un esqueleto de ?-péptido. 18. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque tiene de 5 a 15 grupos de cabeza de guanidinio. 19.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque W es un grupo de enlace que tiene unido un agente biológicamente activo y tiene la fórmula: 147 en donde: R1 es el agente biológicamente activo; X es un enlace entre un grupo funcional sobre el agente biológicamente activo y un grupo funcional sobre el grupo de enlace entre R1 y el reactivo de transporte; Y es un grupo funcional que une a W con el resto del compuesto; A es N o CH; R2 es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, acilo o alilo; k y m son independientemente 1 o 2; y n es un entero de 1 a 10. 20.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de O, NH, C(0)0, NHC(O) y C(0)NH. 21 .- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque W es un grupo de enlace que tiene unido un agente biológicamente activo y tiene la fórmula: R5 R -X— (CH2) -R4-(CH2)m-CH-Y-J en donde: R1 es el compuesto biológicamente activo; X es un enlace entre un grupo funcional sobre el agente biológicamente activo y un grupo funcional sobre el grupo de enlace entre R y el reactivo de transporte; Y es un grupo funcional que une a W con el resto del compuesto; R4 es S, O, NR6 o CR7R8; 148 R5 es OH, SH o NHR6; R6 es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, acilo o alilo; R7 y R8 son independientemente hidrógeno, alquilo o arilalquilo; y k y m son independientemente 1 o 2. 22. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de O, NH, C(0)0, NHC(O) y C(0)NH. 23. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque W es un grupo de enlace que tiene unido un agente biológicamente activo y tiene la fórmula: Fr R — X-(CH2) -CH-Y-^ en donde: R1 es el compuesto biológicamente activo; X es un enlace entre un grupo funcional sobre el agente biológicamente activo y un grupo funcional sobre el grupo de enlace entre R y el reactivo de transporte; Y es un grupo funcional que une a W con el resto del compuesto; R5 es H, OH, SH o NHR6; R6 es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, acilo o alilo; y k es 1 o 2. 24. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de O, NH, C(0)0, NHC(O) y C(0)NH. 25. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque W es un grupo de enlace que tiene unido un agente biológicamente activo y tiene la fórmula: 149 o R5 R1-X— CH2-Ar-0-C-(CH2)k- 4— (CH2)m-CH-Y- en donde: R1 es el compuesto biológicamente activo; X es un enlace entre un grupo funcional sobre el agente biológicamente activo y un grupo funcional sobre el grupo de enlace entre R1 y el reactivo de transporte; Y es un grupo funcional que une a W con el resto del compuesto; Ar es un grupo arilo sustituido o no sustituido, en donde los sustituyentes metileno y oxígeno son orto o para uno con respecto a otro; R4 es S, O, NR6 o CR7R8; R5 es H, OH, SH, CONHR6 o NHR6; R6 es hidrógeno, alquilo, arilo, arilalquilo, acilo o alilo; R7 y R8 son independientemente hidrógeno o alquilo; y k y m son independientemente 1 o 2. 26. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de O, NH, C(0)0, NHC(O) y C(0)NH. 27. - El uso de un conjugado que contiene un agente biológicamente activo que está unido covalentemente a un reactivo de transporte, que comprende un polímero, en donde dicho polímero consiste de 6 a 25 subunidades, por lo menos 50% de las cuales contienen una porción de cadena lateral de guanidino o amidino, para preparar un medicamento para incrementar el transporte de un compuesto seleccionado a través de una membrana biológica, en donde dicho medicamento promueve el transporte de dicho conjugado a través de dicha membrana biológica a una velocidad mayor 150 que la velocidad de transporte de transmembrana del agente biológico en forma no conjugada. 28. - El uso como se reclama en la reivindicación 27, en donde cada porción de cadena lateral de guanidino o amidino está separada de otra de tales porciones por una a tres subunidades que no son de guanidino ni de amidino. 29. - El uso de un compuesto como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde uno de W o T que comprende un agente biológico está unido covalentemente a un reactivo de transporte, para preparar un medicamento para incrementar el transporte de un agente biológico seleccionado a través de una membrana biológica, en donde dicho medicamento promueve el transporte de dicho conjugado a través de dicha membrana biológica, a una velocidad que es mayor que la velocidad de transporte de transmembrana del agente biológico en forma no conjugada. 30.- El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde dicho agente biológico se selecciona del grupo que consiste de agentes diagnósticos, agentes anticancerosos, agentes antibacterianos, agentes antiinflamatorios y agentes antifúngicos. 31. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde dicho agente es un agente diagnóstico. 32. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde dicho agente es un agente anticanceroso. 33. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde 151 dicho agente es un agente antibacteriano. 34.- El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde dicho agente es un agente antiinflamatorio.