JP2005538035A - グアニジニウム輸送試薬および結合体 - Google Patents

Abstract

輸送試薬および輸送試薬に連結された治療剤の結合体が記載される。特に、この輸送試薬は、骨格に沿って連続的にかまたは間隔を空けてかのいずれかであるが、係留を介して骨格から充分隔てられた、複数のグアニジニウム部分を有して、細胞または組織の表面との相互作用を可能にし、治療剤の取り込みを導く。本発明は、１つの局面において、生体膜を通る選択された化合物の輸送を増強するための方法を包含する。この方法において、生体膜に、少なくとも１種の輸送試薬に共有結合された生物学的に活性な薬剤を含む結合体が、接触される。この結合体は、非結合形態でのその生物学的薬剤の膜貫通輸送速度よりも速い速度での、生体膜を通るその薬剤の輸送を促進するために有効である。

Description

（連邦政府により支援された研究および開発の下でなされた本発明に対する権利に関する陳述）
本発明は、ＮＩＨ助成金番号ＣＡ ６５２３７に支援されてなされた。従って、米国政府は、本発明において特定の権利を有する。

本発明は、生体膜を通る生物学的に活性な薬剤（例えば、有機化合物、ポリペプチド、オリゴ糖、核酸、および金属イオン）の輸送を増強するために有効である、方法および組成物に関する。

細胞の形質膜は、多くの有用な治療剤の通過に対する障壁を提示する。一般に、薬物は、細胞に侵入するために、その薬物が通過しなければならない身体水性区画と脂質層との両方において自由に可溶性でなければならない。特に、高荷電分子は、膜を通過する際に困難さを経験する。多くの治療高分子（例えば、ペプチドおよびオリゴペプチド）はまた、膜貫通輸送に対して特に手に負えない。従って、生物学によって多数の潜在的に価値のある治療剤が利用可能になっているが、バイオアベイラビリティを考慮すると、しばしばその医学的有用性が妨げられる。従って、薬物（特に高分子）を細胞中に輸送する信頼できる手段についての必要性が存在する。

本発明は、低分子または高分子に特定のオリゴマーまたはポリマーを結合体化すると、この結合した分子が生体膜を通る輸送を有意に増強するために有効であるという本出願人らの知見に、部分的に基づく。この輸送試薬は、非常に塩基性であるサブユニットを含み、この塩基性サブユニットは、塩基性基（例えば、グアニジノ基またはアミジノ基）間の適切な間隔を提供するために、中性サブユニットにより中断されているかまたはより長い骨格を有するかのいずれかである。

（発明の開示）
本発明は、１つの局面において、生体膜を通る選択された化合物の輸送を増強するための方法を包含する。この方法において、生体膜に、少なくとも１種の輸送試薬に共有結合された生物学的に活性な薬剤を含む結合体が、接触される。この結合体は、非結合形態でのその生物学的薬剤の膜貫通輸送速度よりも速い速度での、生体膜を通るその薬剤の輸送を促進するために有効である。

従って、本発明は、別の局面において、式

を有する化合物を提供し、この式において、下付文字ｍは、６〜５０の整数であり；Ｔは、保護されたかもしくは保護されていない第一の末端官能基、保護されたかもしくは保護されていない連結基、または結合した生物学的に活性な薬剤を有する連結基を示し；Ｗは、保護されたかもしくは保護されていない第二の末端官能基、保護されたかもしくは保護されていない連結基、または結合した治療剤を有する連結基を示す。サブユニット部分（括弧により囲まれている）において、下付き文字ｎは、０、１、または２であり得；各Ｘ^ｉは、骨格サブユニットであり、ここで、上付文字ｉは、１〜ｍまでの整数であり、Ｗの下流の位置を示す；各Ｙ^ｉは、下付文字ｎが０である場合、Ｈ、アミノ酸側鎖、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；または下付文字ｎが１または２である場合、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）ヘテロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_８）シクロアルキルアルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）スピロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレンおよびこれらの組み合わせから選択され；各Ｚ^ｉは、グアニジウム部分であり、この部分は、好ましくは、

から選択され、ここで、波線は、Ｙ^ｉへの結合点を示す。従って、このサブユニットの各々について、下付文字ｎは、各ｉ位置での１つまたは２つのＺグアニジニウム部分の非存在または存在を示し；但し、この化合物は、同じであっても異なってもよい少なくとも４つのグアニジニウム部分を有する。

より詳細には、ＷおよびＴは、保護された形態または保護されていない形態であり得る官能基（例えば、ヒドロキシ、チオール、カルボキシ、カルボキサミド、アルデヒド、アミノなど）であり得る。種々の官能基のための適切な保護基は、例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９１に記載される。さらに、ＴおよびＷのいずれかまたは両方は、固体支持体におけるこの輸送試薬の合成の間に使用される結合化学の痕跡、または生物学的に活性な薬剤を結合するために使用される連結基のいずれかである連結基であり得る。ＴまたはＷが生物学的に活性な薬剤を結合するために使用される連結基である実施形態について、その連結基は、好ましくは、インビボで切断されそしてこの輸送試薬から治療剤を放出する連結基である。

本明細書中に記載される化合物、組成物、および方法は、多数の生体膜のいずれかを通る選択された治療剤の輸送を増強するために使用され得、この生体膜としては、真核生物細胞膜、原核生物細胞膜、および細胞壁が挙げられるが、これらに限定されない。例示的原核生物細胞膜は、細菌膜を包含する。目的とする例示的真核生物細胞膜としては、樹状細胞膜、上皮細胞膜、内皮細胞膜、ケラチノサイト膜、筋細胞膜、真菌細胞膜、細菌細胞膜、植物細胞膜などが挙げられるが、これらに限定されない。

生物学的に活性な薬剤（これは、治療剤および薬物を包含する。なぜなら、これらの用語は互換可能に使用されるからである）としては、金属イオン（これは、代表的には、金属キレートとして送達される）；有機低分子（例えば、抗癌（例えば、タキサン）分子および抗微生物分子（例えば、細菌に対するか、または酵母のような真菌に対する）；ならびに高分子（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、およびそのアナログ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの好ましい実施形態において、この薬剤は、核酸または核酸アナログ（例えば、安定性増強のために１つ以上の２’−デオキシヌクレオチドサブユニットを必要に応じて含むリボザイム）である。あるいは、この薬剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。別の好ましい実施形態において、この薬剤は、ポリペプチド（例えば、タンパク質抗原）であり、そして生体膜は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞膜である。

この薬剤は、連結基によりこの輸送試薬に連結され得、これにより、この結合体に立体構造的可撓性が付与され得、そしてこの薬剤とその生物学的標的との間の相互作用が促進され得る。１つの実施形態において、この連結基は、切断可能なリンカー（例えば、酵素によってかまたは溶媒媒介切断によって切断可能である連結基（例えば、エステル基、アミド基、またはジスルフィド基を含む））である。別の実施形態において、この切断可能なリンカーは、光切断可能な基を含む。

より特定の実施形態において、この切断可能なリンカーは、この生物学的に活性な薬剤に対して遠位にある第１の切断可能な基と、この薬剤に対して近位にある第２の切断可能な基を含み、その結果、この第１の切断可能な基の切断によって、第２の切断可能な基を切断するために分子内反応可能である求核部分を含むリンカー−薬剤結合体が生じ、これにより、このリンカーと輸送試薬からこの薬剤が放出される。

別の局面において、本発明は、選択された生物学的活性について複数の結合体をスクリーニングするための方法を提供し、この方法において、その結合体は、複数の候補薬剤から形成される。この結合体は、細胞中にこの結合体が取り込まれた際に検出可能なシグナルを示す細胞と接触され、その結果、そのシグナルの大きさが、選択された生物学的活性に関するこの結合体の効力を示す。この方法は、単独では細胞に入って生物学的活性を示すことができないかまたはほとんどできない薬剤の活性を試験するために、特に有用である。１つの実施形態において、この候補薬剤は、コンビナトリアルライブラリーから選択される。

本発明はまた、上記方法におけるスクリーニングのために有用である結合体ライブラリーを包含する。

別の局面において、本発明は、生体膜を通って生物学的に活性な薬剤を送達するための薬学的組成物を包含する。この組成物は、上記の少なくとも１種の輸送試薬に共有結合した生物学的に活性な薬剤と、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、結合体を含む。この輸送試薬は、非結合形態のこの生物学的に活性な薬剤の膜貫通輸送速度より大きい膜貫通輸送速度をこの生物学的に活性な薬剤に付与するために有効である。この組成物は、さらに、この組成物を使用するための指示書とともに包装され得る。

別の局面において、本発明は、哺乳動物被験体（特に、ヒト被験体）を、上記のような薬学的組成物で処置するための治療法を包含する。

本発明のこれらの目的および他の目的ならびにこれらの特徴および他の特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付の図面とともに読んだ場合に、より完全に明らかになる。

（発明の詳細）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される場合、用語「生体膜」は、細胞または一群の細胞を細胞外空間と分離する脂質含有障壁をいう。生体膜としては、原形質膜、細胞壁、細胞内オルガネラ膜（例えば、ミトコンドリア膜）、核膜などが挙げられるがこれらに限定されない。

用語「膜通過濃度（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」は、特定の組成物が添加された膜の側と反対、すなわち「トランス」である膜の側に存在する化合物の濃度を言う。例えば、化合物が、細胞の細胞外液に添加される場合、その後に細胞の内側で測定される化合物の量は、その化合物の膜通過濃度である。

「生物学的に活性な薬剤」または「生物学的活性物質」または「生物学的薬剤」は、細胞により取り込まれた際に、その細胞の構造、機能、または組成に観察可能な変化を引き起こす化学物質（例えば、低分子、高分子、または金属イオン）をいう。観察可能な変化としては、１つ以上のｍＲＮＡの増大または減少した発現、１つ以上のタンパク質の増大または減少した発現、タンパク質または他の細胞成分のリン酸化、酵素の阻害または活性化、結合対のメンバー間の結合の阻害または活性化、代謝産物の合成の増大または減少した速度、増大または減少した細胞増殖などが挙げられる。

本明細書中で使用される場合、用語「高分子」は、生物学的起源または合成起源のペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドによって例示される（しかし、これらに限定されない）大きな分子（１０００ダルトンよりも大きいＭＷ）をいう。

「有機低分子」は、約１００〜約１０００の分子量（ＭＷ）を有する炭素含有薬剤をいう。

用語「治療薬剤」、「治療組成物」、および「治療物質」は、限定することなく、哺乳動物種の利益のために使用され得る任意の組成物をいう。このような薬剤は、例えば、イオン、有機低分子、ペプチド、タンパク質またはポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびオリゴサッカリドの形態であり得る。

用語「非ポリペプチド薬剤」および「非ポリペプチド治療薬剤」は、輸送試薬を含まず、そしてポリペプチド以外の生物学的に活性な薬剤である輸送結合体の一部をいう。非ポリペプチド薬剤の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、生体膜を通じた増強された送達のための結合体を形成するために輸送試薬に結合され得る。

用語「ポリマー」は、共有結合によって連結された２つ以上の同一または非同一のサブユニットの直鎖をいう。ペプチドは、ペプチド結合によって連結された同一または非同一のアミノ酸サブユニットで構成され得るポリマーの例である。

本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されるＤ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸の単一鎖またはＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物で構成される化合物をいう。一般的に、ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含み、そして約５０アミノ酸長未満である。

本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、ペプチド結合により連結された直線的に配置されたアミノ酸で構成されるが、ペプチドとは対照的に、十分に規定された立体構造を有する化合物をいう。ペプチドとは対照的に、タンパク質は、一般に、５０アミノ酸以上の鎖からなる。

本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーであり、１つ以上のペプチド結合を含むポリマーをいう。「ポリペプチド」は、そのポリペプチドが十分に規定された立体構造を有するか否かに関わらず、ペプチドおよびタンパク質を包含する。

用語「アルキル」は、それ自体または別の置換基の一部として、そうでないことが記載されない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、完全に飽和され得るか、一不飽和または多不飽和であり得、そして二価ラジカルおよび多価ラジカルを含み得、示される炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ_１〜Ｃ_１０は、１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどのホモログおよび異性体のような基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルおよび３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高度のホモログおよび異性体が挙げられる。

用語「アルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−により例示されるようなアルカンから誘導される二価ラジカルを意味する。代表的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０数個の炭素原子を有する基が、本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、一般的には、６個程度の炭素原子を有する。

用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介してその分子の残りの部分に結合されているアルキル基をいう。

用語「ヘテロアルキル」は、それ自体または別の用語と組み合わせて、そうでないことが記載されない限り、示される数の炭素原子ならびにＯ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群より選択される１〜３個のヘテロ原子からなる安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、ここで、窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化され得、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化され得る。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、およびＳは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に位置し得る。ヘテロ原子Ｓｉは、アルキル基がその分子の残りの部分に結合されている位置を含む、ヘテロアルキル基の任意の位置に位置し得る。例としては、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ_３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３が挙げられる。２つまでのヘテロ原子が連続し得る（例えば、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３および−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３）。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２ＣＨ_２−および−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−によって例示されるようなヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子はまた、鎖の末端のいずれかまたは両方を占領し得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なおさらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキレン結合基については、連結基の方向は示されない。

用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体または他の用語と組み合わせて、そうでないことが記載されない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状型を示す。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、複素環がその分子の残りの部分に結合される位置を占有し得る。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。

用語「ハロ」または「ハロゲン」は、他に言及されなければ、それら自体によってかまたは別の置換基の一部として、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」のような用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことが意味される。例えば、用語「ハロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル」は、トリフルオロメチル，２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことが意味される。

用語「アリール」は、他に言及されなければ、ポリ不飽和の、代表的には芳香族の、炭化水素置換基（これは、単環であっても、一緒に縮合されたかまたは共有結合された多環（３環まで）であってもよい）を意味する。用語「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される０〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）をいい、ここで、この窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化され、そしてこの窒素原子は、必要に応じて四級化（ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅ）される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して、その分子の残基に結合され得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、以下が挙げられる：フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリル。上記アリール環系およびヘテロアリール環系の各々についての置換基は、下記の受容可能な置換基の群から選択される。

略して、用語「アリール」は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用される場合、上で定義されるアリール環とヘテロアリール環との両方を含む。従って、用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基に結合している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことが意味される。このアルキル基としては、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子によって置換されているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）が挙げられる。

上記用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）の各々は、指定された基の置換形態と非置換形態との両方を含むことが意味される。各型の基について好ましい置換基は、以下に提供される。

アルキル基およびヘテロアルキル基についての置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしてしばしば参照される置換基を含む）は、以下から選択される種々の基であり得る：０〜（２ｍ’＋１）（ここで、ｍ’は、このような基における炭素原子の総数である）の範囲の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’，−ＮＲ’Ｒ’’，−ＳＲ’，−ハロゲン，−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２。Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’とは、各々独立して、水素、非置換の（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル基およびヘテロアルキル基、非置換アリール基、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール基、非置換アルキル基、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、またはアリール−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル基をいう。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合される場合、これらは、その窒素と組み合わさって、５員環、６員環、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことが意味される。置換基の上記考察から、当業者は、用語「アルキル」が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ_３および−ＣＨ_２ＣＦ_３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）のような基を含むことが意味されることを理解する。好ましくは、置換アルキル基および置換ヘテロアルキル基は、１〜４個の置換基を有し、より好ましくは、１個、２個または３個の置換基を有する。例外は、ペルハロアルキル基（例えば、ペンタフルオロエチルなど）であり、これはまた、好ましくかつ本発明によって企図される。

同様に、アリール基およびヘテロアリール基についての置換基は、変更され、そして以下から選択される：０から芳香環系上の開放結合価の総数までの範囲の数の、−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−Ｎ_３、−ＣＨ（Ｐｈ）_２、ペルフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルコキシ、およびペルフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル（ここで、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、独立して、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_８）のアルキルおよびヘテロアルキル、非置換のアリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ−（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択される）。

アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｕ−の置換基で置き換えられ得、式中、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ_２−または単結合であり、そしてｑは、０〜２の整数である。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、必要に応じて、式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−の置換基によって置き換えられ得、式中、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−または単結合であり、そしてｒは、１〜３の整数である。そのように形成された新たな環の単結合のうちの１つは、必要に応じて、二重結合で置き換えられ得る。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、式−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｘ−（ＣＨ_２）_ｔの置換基で置き換えられ得、式中、ｓおよびｔは、独立して、０〜３の整数であり、そしてＸは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、水素または非置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択される。

本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことが意味される。

用語「グアニジル」、「グアニジニル」、および「グアニジノ」は、（非保護形態の）式−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２を有する部分をいうように、相互交換可能に使用される。例えば、アルギニンは、グアニジル（グアニジノ）部分を含み、これはまた、２−アミノ−５−グアニジノ吉草酸またはα−アミノ−δ−グアニジノ吉草酸とも呼ばれる。「グアニジニウム」とは、正に帯電した共役酸形態をいう。本発明において、グアニジノ基およびグアニジニウム基は、両方とも有用であり、かつしばしば相互交換可能に使用される。

「アミジニル」および「アミジノ」とは、式−Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ_２）を有する部分をいう。「アミジニウム」とは、正に帯電した共役酸形態をいう。

用語「ポリ−アルギニン」または「ポリ−Ａｒｇ」とは、連続したアルギニン残基からなる重合体配列をいい；ポリ−Ｌ−アルギニンとは、全てのＬ−アルギニンをいい；ポリ−Ｄ−アルギニンとは、全てのＤ−アルギニンをいう。ポリ−Ｌ−アルギニンはまた、ペプチド中のＬ−アルギニンの数に従って、大文字「Ｒ」で略記され（例えば、Ｒ８は、８マーの連続したＬ−アルギニン残基を表す）；ポリ−Ｄ−アルギニンは、ペプチド中のＤ−アルギニンの数に従って、小文字「ｒ」で略記される（ｒ８は、８マーの連続したＤ−アルギニン残基を表す）。

アミノ酸残基は、それらの完全な名称または標準的な一文字表記もしくは三文字表記によって、本明細書中で参照される：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｗ、Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｘ、Ｈｙｐ、ヒドロキシプロリン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン。

（ＩＩ．グアニジニウム輸送試薬および結合体）
（Ａ．概略）
本発明は、生物学的に活性な薬剤の、特定の部位（例えば、細胞内または上皮組織のような組織を横切るかまたはこのような組織内）への送達を増強するのに有用な、種々の輸送試薬を提供する。本発明の輸送試薬および結合体は、６〜５０までのサブユニットのオリゴマーまたは短長ポリマーを含み、これらの一部には、グアニジニウム基が結合されている。この輸送薬剤は、結合体化していない生物学的薬剤単独での輸送速度と比較して、生体膜を横切る結合体（輸送試薬−連結基−生物学的薬剤）の輸送速度を増強するのに有効である。特定の実施形態において、この輸送試薬は、ペプチドおよび／またはアミノ酸を含むが、本発明は、この輸送薬剤が以下でさらに考察される非ペプチド骨格および／またはサブユニットを含むようには制限されない。

本発明の輸送試薬は、一般に、グアニジニウムヘッド基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）の間に適切な空間を提供するように構築されている。適切な空間は、非グアニジノ含有サブユニットをこの輸送試薬に挿入することによって、またはより長い骨格鎖を有するグアニジノ含有サブユニットを構築し、それによって（プロトン化されている場合）グアニジニウムヘッド基の間の距離を増加させることによって、達成され得る。

図１は、本発明の輸送試薬の一般概念を示している。この図において見られ得るように、ＷおよびＴの一方または両方は、官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシ、カルボン酸など）もしくは保護された官能基、保護されているかもしくは保護されていない官能基を保有する連結基、または治療剤が結合されている連結基であり得る。これらのサブユニット部分はまた、グアニジニウム含有サブユニットと間隔を空けたサブユニットとの両方を表しかつ示している。これらのサブユニットの一部はまた、終端骨格、側鎖およびヘッド基のための構造を提供するように示されている。最終的に、間隔を空けたグアニジニウム輸送試薬の処方箋は、等しい間隔を有する試薬の例示として提供され、これは、本発明を通して制限されない。

上記の観点から、特定の輸送試薬は、以下の式のオリゴマーとして表され得る：ポリＧ^＊、（Ｇ^＊Ｓ^ｐＧ^＊）_ｎＧ^＊、（Ｇ^＊Ｓ^ｐ）_ｎＧ^＊、（Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐ）_ｎＧ^＊および（Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐＳ^ｐ）_ｎＧ^＊。式中「Ｇ^＊」は、グアニジノ含有サブユニットであり、そして「Ｓ^ｐ」は、グアニジノ部分もアミジノ部分も含まないサブユニット（またはスペーサー）である。添字「ｎ」は、２〜２５の範囲の整数である。記載される空間を有するオリゴマーは、ブロックワイズ（ｂｌｏｃｋｗｉｓｅ）様式（すなわち、例えば、Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐのような基を合成し、そしてそれらの基を一緒に連結して、競合性の輸送試薬を形成する）で容易に調製されるという利点を有する。

上記輸送部分の式において、文字「Ｓ^ｐ」は、天然のアミノ酸もしくは非天然のアミノ酸、またはグアニジノ基もアミジノ基も有さない、以下に記載の任意の他のサブユニットを表し得る。Ｓ^ｐがアミノ酸である実施形態について、このアミノ酸は、アミノ基（ＮＨ_２またはＮＨ−アルキル）およびカルボン酸基（ＣＯ_２Ｈ）を有し（輸送部分に組み込まれる前）、かつグアニジル部分もアミジニル部分も含まない、本質的に任意の化合物であり得る。このような化合物の例としては、以下が挙げられる：Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニン、Ｄ−システインおよびＬ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸およびＬ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニンおよびＬ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−ヒスチジンおよびＬ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシンおよびＬ−イソロイシン、Ｄ−リジンおよびＬ−リジン、Ｄ−ロイシンおよびＬ−ロイシン、Ｄ−メチオニンおよびＬ−メチオニン、Ｄ−アスパラギンおよびＬ−アスパラギン、Ｄ−プロリンおよびＬ−プロリン、Ｄ−グルタミンおよびＬ−グルタミン、Ｄ−セリンおよびＬ−セリン、Ｄ−トレオニンＬ−トレオニン、Ｄ−バリンおよびＬ−バリン、Ｄ−トリプトファンおよびＬ−トリプトファン、Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＬ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−チロシンおよびＬ−チロシン、サルコシン、−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸。上記式の各々において、各Ｓ^ｐは、輸送部分に存在する任意の他のＳ^ｐとは無関係であり、いくつかの実施形態において、全てのＳ^ｐ基は，同じであり得る。

好ましい実施形態の１つの群において、この輸送部分は、式（Ｇ^＊Ｓ^ｐＧ^＊）_ｎＧ^＊を有し、式中、各「Ｓ^ｐ」は、独立して、グリシン、−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｇ^＊」は、好ましくは、カルバメート、エチレンジアミン、アザ−アミノ酸、またはγ−アミノ酸であり、そしてｎは、好ましくは、２〜５の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｓ^ｐ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは、３である。この実施形態の群において、グリシンの使用が、これらの組成物のために好ましい。これらの組成物中、輸送試薬が、ポリペプチドの生物学的薬剤に直接的に、共有結合される。輸送部分が、例えば固相方法を使用して構築される実施形態について、ε−アミノカプロン酸が好ましい。

好ましい実施形態の別の群において、この輸送試薬は、式（Ｇ^＊Ｓ^ｐ）_ｎＧ^＊を有する。式中、各「Ｓ^ｐ」は、好ましくは、グリシン、−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｇ^＊」は、好ましくは、カルバメート、エチレンジアミン、アザ−アミノ酸、またはγ−アミノ酸であり、そしてｎは、好ましくは、３〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｓ^ｐ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは、３、４、５または６である。特定の実施形態の上記群に関して、グリシンの使用が、これらの組成物のために好ましい。これらの組成物中、輸送部分は、これら組成物全体が組換え方法によって調製され得るように、ポリペプチドの生物学的薬剤に直接的に、融合されるかまたは共有結合される。溶液または輸送部分の固相構築物のために、ε−アミノカプロン酸が好ましい。

好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は式（Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐ）_ｎＧ^＊を有し、ここで、各「Ｓ^ｐ」は好ましくはグリシン、−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｇ^＊」は好ましくは、カルバメート、エチレンジアミン、アザ−アミノ酸またはγ−アミノ酸であり、そしてｎは好ましくは４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｓ^ｐ」はグリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である。

好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は式（Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐＳ^ｐ）_ｎＧ^＊を有し、ここで、各「Ｓ^ｐ」は好ましくはグリシン、−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｇ^＊」は好ましくは、カルバメート、エチレンジアミン、アザ−アミノ酸またはγ−アミノ酸であり、そしてｎは好ましくは４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｓ^ｐ」はグリシンであり、そしてｎは６である。

隣接する側鎖部分の間の間隔開けは、通常はサブユニットからサブユニットまでに一貫しているが（上記で基の繰り返しの性質によって図示される）、本発明において使用される輸送試薬はまた、骨格に沿って、側鎖部分の間の変動性の間隔開けもまた含み得る。

他の実施形態において、Ｓ^ｐ基の各々は、輸送部分の特定の所望される特性を増強するように選択される。例えば、より疎水性特性を有する輸送部分が所望される場合、各Ｓ^ｐは、代表的に疎水性アミノ酸として一緒に分類される、天然に存在するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、フェニルグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン）から選択され得る。同様に、Ｓ^ｐ基のいくらかまたはその全てが親水性アミノ酸（例えば、リジン、セリン、スレオニン、グルタミン酸など）である場合、より親水性特性を有する輸送試薬が調製され得る。

当業者は、輸送試薬が式（Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐ）_ｎＧ^＊のものであり得るが、この部分の隣に位置する、さらなるアミノ酸を有し得る（例えば、Ｘ_ｍ（Ｇ^＊Ｓ^ｐＳ^ｐ）_ｎＧ^＊−Ｘ_ｐであり、ここで、下付添え字のｍおよびｐは０〜約１０の整数を表し、そして各Ｘは、独立して、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である）ことを理解する。

従って、輸送部分は、カルボキシ末端およびアミノ末端を有し得る、という意味において特定のペプチド特性を有するように概説され得る。末端の少なくとも１つは、好ましくは、生物学的に活性な薬剤と共有結合で末端に結合されるか、または代替的に、輸送試薬−連結基−生物学的に活性な薬剤の結合体のうちの一部である連結基に結合されるかの、いずれかである。他の実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、連結基を介して輸送試薬に結合され得、この連結基は次いで側鎖官能基（例えば、セリン残基のヒドロキシ基、リジン残基のアミノ基、グルタミン酸残基のカルボン酸基など）に結合される。

本発明の重要な局面において、本発明の結合体は、生物学的に活性な薬剤がその生物学的効果を提示するために膜横断輸送を必要とし、且つ表面レセプターに結合することによっては本来生物学的効果を提示しない、すなわち、結果としてこの薬剤の侵入が起こらない型である場合、細胞膜またはオルガネラの膜を横切って生物学的に活性な薬剤を輸送するのに特に有用である。さらに、この結合体は、生物学的に活性な薬剤の生物学的効果を提示するために膜横断輸送を必要とし、且つ単独では（輸送試薬との結合体化も他のいくらかの修飾もなしには）、細胞に侵入して生物学的活性を顕在化するのが不可能であるか、またはごく僅かに可能である型の生物学的に活性な薬剤を輸送するのに特に有用である。

一般的な事象として、本発明の結合体において使用される輸送試薬としては、好ましくは、直鎖骨格のサブユニットが挙げられる。この骨格は、通常、炭素、窒素、酸素、硫黄、およびリンから選択される原子を包含し、大部分の骨格鎖原子は通常炭素である。このサブユニットは、必要に応じて、末端のグアニジノ基またはアミジノ基を含む側鎖部分を含むが、いくつかのサブユニットはグアニジノ基もアミジノ基も含まず、そして細胞内取り込みまたは組織を横切っての取り込みを容易にするのに役立つ、グアニジノ含有サブユニット間またはアミジノ含有サブユニット間の間隔開けをもたらすために、骨格に挿入される。

側鎖部分は、中心のグアニジノ炭素原子またはアミジノ炭素原子（これらにＮＨ_２基が結合される）が、好ましくは少なくとも２つのリンカー鎖原子、より好ましくは２〜７個の鎖原子を含む、側鎖リンカーによって骨格に連結されるように、骨格から離れて延び、その結果、中心炭素原子は、骨格から離れて３個目から８個目の鎖原子である。この鎖原子は、好ましくは、メチレン炭素原子として提供されるが、酸素、硫黄、または窒素のような１つ以上の他の原子もまた存在し得る。好ましくは、骨格とグアニジノ基またはアミジノ基の中心炭素原子との間の側鎖リンカーは、アルギニンン側鎖（またはホモアルギニン側鎖など）によって例示されるような、４個、５個または６個の鎖原子の長さである。

上に注記したように、本発明の輸送試薬は、１つ以上の非グアニジノサブユニット／非アミジノサブユニット（例えば、グリシン、アラニンまたはシステイン）によってか、またはアミノカプロン酸のようなリンカー（これは、対応する輸送試薬−連結基−生物学的薬剤の結合体の膜輸送率に有意には影響しない）によって、隣接され得る。また、任意の遊離アミノ末端基は、ブロッキング試薬または保護基（例えば、アセチル基またはベンジル基）を用いてキャッピングされて、インビボでのユビキチン化を妨げ得る。

輸送される生物学的薬剤は、多数の実施形態に従って輸送試薬に連結され得る。好ましい実施形態において、この薬剤は、輸送試薬の一方の末端上の末端官能基への連結を介してか、または適切な連結基を介したポリマー内の内部サブユニットへの連結を介して、１つの輸送試薬に連結され得る。

第２の実施形態において、この薬剤は、上記と同じ様式で、１つより多くのポリマーに結合される。この実施形態は、やや好まれない。なぜなら、これは隣接細胞の架橋を導き得るからである。

第３の実施形態において、結合体は、ポリマーの各末端に結合した２つの薬剤部分を含む。この実施形態に関して、薬剤は分子量１０ｋＤａ未満であることが好ましい。

先に述べた第１の実施形態および第３の実施形態に関して、薬剤は、一般的に、グアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖のいずれにも結合せず、その結果、これらは自由に標的膜に相互作用する。

本発明の結合体は、一直線の合成スキームによって調製され得る。さらに、この結合体生成物は、通常、長さおよび組成が実質的に均一であり、その結果、これらは、その効果が、不均一混合物より大きな一貫性および再現性を提供する。

本発明の重要な局面によると、１つの輸送試薬を任意の種々の型の生物学的に活性な薬剤に結合することが、結合体中に巨大な疎水性部分の存在を必要とすることすらなく、生物学的な膜を横切った薬剤の取り込み率を実質的に増強するのに十分であることが、出願人らにより発見された。実際に、巨大な疎水性部分を結合することは、この疎水性部分の脂質二重層への接着に起因した、膜横断輸送を、有意に妨げるかまたは防止し得る。従って、本発明は、巨大な疎水性部分（例えば、脂質分子および脂肪酸分子）を含まない結合体を包含する。

（Ｂ．輸送試薬および結合体の構造特徴）
上記の考察を考慮して、本発明は、実施形態のうちの１つの群において、以下の式：

を有する化合物を提供し、ここで、下付添え字ｍは６〜５０の整数であり、Ｔは、保護されるかもしくは保護されない第１の末端官能基、保護されるかもしくは保護されない連結基、または結合された生物学的に活性な薬剤を有する連結基を表し、そしてＷは、保護されるかもしくは保護されない第２の末端官能基、保護されるかもしくは保護されない連結基、または結合された治療薬剤を有する連結基を表す。サブユニットの部分（括弧によって囲まれる）において、下付添え字ｎは０、１または２であり得、各Ｘ^ｉは骨格サブユニットであり、ここで、上付添え字ｉは１〜ｍの整数であり、そしてＷの下流の位置を表し、各Ｙ^ｉは、下付添え字ｎが０である場合、Ｈ、アミノ酸側鎖、アリールおよびヘテロアリールから選択されるか、または下付添え字ｎが１である場合、（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２−Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２−Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_２−Ｃ_８）ヘテロアルキレン、（Ｃ_３−Ｃ_８）シクロアルキルアルキレン、（Ｃ_２−Ｃ_８）スピロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびそれらの組み合せから選択され、各Ｚ^ｉはグアニジニウム部分であり、好ましくは、以下：

から選択され、ここで、波線はＹ^ｉへの結合点を表し、そして下付添え字ｎは０、１または２であり、各ｉ位置でＺグアニジニウム部分の存在または非存在を示し、但し、この化合物は、同じかまたは異なり得る、少なくとも６個のグアニジニウム部分を有し、そしてさらに、さらなる非障害性置換基（例えば、アルキル、ヘテロアルキルなど）を有する、例示された部分を含む。

さらに具体的には、ＷおよびＴは、ヒドロキシ、チオール、カルボキシ、カルボキサミド、アルデヒド、アミノなどのような官能基であり得、これは保護形態または非保護形態であり得る。種々の官能基に対する適切な保護基は、例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９１に記載される。さらに、ＴおよびＷのうちの片方または両方は、固体支持体上で輸送試薬の合成の間に使用される結合化学反応の跡であるか、または治療薬剤を結合するために使用される連結基のいずれかである連結基であり得る。ＴもしくはＷが連結基であるか、または生物学的に活性な薬剤に結合された連結基であるかのいずれかの実施形態に関して、この連結基は、好ましくは、インビボで切断可能であり、そしてその結果、輸送試薬から治療薬剤の放出を生じる基である。

結合された輸送試薬が解放されるまで不活性である生物学的に活性な薬剤に関して、リンカーは好ましくは、容易に切断可能であるリンカーであり、このことは、インビボで酵素的切断または溶媒媒介性切断に感受性であることを意味する。この目的のために、カルボン酸エステルおよびジスルフィド結合を含むリンカーが好ましい。ここで、前者の基は酵素的または化学的に加水分解され、そして後者はジスルフィド交換（例えば、グルタチオンの存在下）によって切断される。

１つの好ましい実施形態において、切断可能なリンカーは、薬剤から遠位にある第１の切断可能基、および薬剤から近位にある第２の切断可能基を含み、その結果、第１の切断可能基の切断は、分子内で反応可能な求核性部分を含むリンカー−薬剤結合体を生じて、第２の切断可能基を切断し、これによってリンカーおよびポリマーから薬剤が解放される。この実施形態は、さらに、以下で考察される種々の低分子結合体によって例示される。

本発明のこの局面の成分についてのより完全な考察は、以下に提示される。

（Ｃ．輸送試薬成分）
本発明の輸送試薬（例えば、ＷおよびＴが保護されるかまたは保護されていない末端官能基である式Ｉの化合物）は、多くの異なるサブユニット（アミノ酸を含む）を含み得る。しかし、一般的に、試薬および結合体は、天然に存在するアミノ酸からは完全には調製されない。さらに、輸送試薬は、骨格成分、グアニジニウムヘッド基成分（図２を参照のこと）およびこの骨格およびヘッド基を連結する側鎖成分（図３を参照のこと）を含む。

（アミノ酸）
１つの実施形態において、輸送試薬はＤアミノ酸残基またはＬアミノ酸残基を含む（例えば、−Ｘ^ｉ（−Ｙ^ｉ−（Ｚ^ｉ）_ｎ）のいくつかはアミノ酸である）。輸送試薬における天然に存在するＬ−アミノ酸残基の使用は、分解産物が細胞または生物に対して比較的無毒性であるはずであるという利点を有する。好ましいアミノ酸サブユニットは、アルギニン（α−アミノ−δ−グアニジノ吉草酸）およびα−アミノ−ε−アミジノ−ヘキサン酸（等配電子のアミジノアナログ）である。アルギニンにおけるグアニジニウム基は、約１２．５のｐＫａを有する。

より一般的には、各ポリマーサブユニットは、（ｉ）１１より大きいｐＫａを有し、より好ましくは１２．５以上のｐＫａを有する高塩基性側鎖部分を含み、そして（ｉｉ）プロトン化状態で、共鳴安定化した正電荷（これはこの部分に二座の特性を付与する）を共有する、少なくとも２つのジェミナルアミノ基（ＮＨ_２）を含む高塩基性側鎖部分を含むことが、好ましい。

他のアミノ酸（例えば、α−アミノ−β−グアニジノプロピオン酸、α−アミノ−γ−グアニジノ酪酸、またはα−アミノ−ε−グアニジノ−カプロン酸）もまた、使用され得る（骨格鎖と中心グアニジニウム炭素との間に、それぞれ、２個、３個または５個のリンカー原子を含む）。

Ｄ−アミノ酸もまた、輸送試薬において使用され得る。Ｄ−アミノ酸を排他的に含む組成物は、酵素的分解が少ないという利益を有する。しかし、これらはまた、標的細胞内で大部分がインタクトなままであり得る。このような安定性は、一般的に、ポリマーが依然として結合している場合でも薬剤が生物学的に活性である場合、問題にはならない。結合体形態で不活性である薬剤に関して、（例えば、細胞内で酵素媒介性切断または溶媒媒介性切断によって）作用部位で切断可能であるリンカーは、結合体中に包含され、細胞またはオルガネラの中で薬剤の解放を促進するはずである。

（他のサブユニット）
アミノ酸以外のサブユニットもまた、輸送試薬を形成する使用のために選択され得る。このようなサブユニットとしては、ヒドロキシアミノ酸、Ｎ−メチル−アミノ酸、アミノアルデヒドなどが挙げられ得るが、これらに限定されず、これらは、結果として減少したペプチド結合を有するポリマーを生じる。さらに別のサブユニットの型は、次の節において考察されるように、選択された骨格の性質に依存して使用され得る。

（ｉ．骨格の型）
種々の骨格のサブユニットおよび型（例えば、Ｘ^ｉ成分）を使用して、側鎖のグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を並べ、そして位置決めし得る。用語「骨格サブユニット」とは、一般に、必要に応じて置換された任意の２〜８原子の直鎖連結を含むこと、および／または２〜８原子の鎖のメンバーとしてヘテロ原子を有することを意味し得る。例えば、骨格サブユニットとしては、チオエステルまたはスルホニル基によって連結されたアルキレン骨格部分、ヒドロキシ酸エステル（エステル結合でアミド結合を交換することと等価）、α−アミノ酸のα−炭素を窒素で置き換えてアザアナログを形成すること、カルバメート基によって連結されたアルキレン骨格部分、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびアミノアルデヒド（これらは、二級アミンからなるポリマーを生じる）が挙げられる。

より詳細な骨格の列挙は、Ｎ置換アミド（ＣＯＮＲがＣＯＮＨ結合を置き換える）、エステル（ＣＯ_２）、還元されたケトメチレン（ＣＯＣＨ_２）またはメチレンアミノ（ＣＨ_２ＮＨ）、チオアミド（ＳＣＮＨ）、ホスフィネート（ＰＯ_２ＲＣＨ_２）、ホスホンアミデートおよびホスホンアミデートエステル（ＰＯ_２ＲＮＨ）、レトロペプチド（ＮＨＣＯ）、トランス−アルケン（ＣＲ＝ＣＨ）、フルオロアルケン（ＣＦ＝ＣＨ）、ジメチレン（ＣＨ_２ＣＨ_２）、チオエーテル（ＣＨ_２Ｓ）、ヒドロキシエチレン（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２）、メチレンオキシ（ＣＨ_２Ｏ）、テトラゾール（ＣＮ_４）、レトロチオアミド（ＮＨＣＳ）、レトロ還元（ＮＨＣＨ_２）、スルホンアミド（ＳＯ_２ＮＨ）、メチレンスルホンアミド（ＣＨＲＳＯ_２ＮＨ）、レトロスルホンアミド（ＮＨＳＯ_２）、およびペプトイド（Ｎ置換グリシン）、ならびにマロネートサブユニットおよび／またはｇｅｍ−ジアミノアルキルサブユニットを有する骨格（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９８）によって概説され、そしてそこに引用される参考文献によって詳述される）を含む。ペプトイド骨格（Ｎ置換グリシン）もまた、使用され得る（例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒ，１９９３；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９２；およびＳｉｍｏｎら、１９９２）。上記置換の多くは、α−アミノ酸から形成された骨格に対して、およそ等配電子のポリマーを生じる。

式Ｉに戻ると、以下の構造の各々において、Ｚ^ｉは、グアニジノ基またはグアニジニウム基を表し（式ＩにおけるＺ^ｉ）、そしてＹ^ｉは、側鎖連結基（すなわち、式ＩにおけるＺ^ｉとＸ^ｉとの間の連結）を示す。Ｙ^ｉおよびＺ^ｉの各々の範囲は、以下により詳細に記載される。

構造Ｉは、グアニジノ基に結合したアミノ酸サブユニット（例えば、アルギニン、ホモアルギニン）がグアニジノアミノ基を含まないアミノ酸（例えば、グリシン）によって分離されている、ペプチド輸送試薬の一部を示す。ＷＯ０２／０６５９８６もまた参照のこと。構造ＩＩにおいて、グリシンサブユニットおよびＮ置換グリシンサブユニットを含む輸送試薬が示される。その結果、構造ＩＩは、ペプチド／ペプトイドオリゴマーからなる。

類似の様式で、構造ＩＩＩは、グリシン（非グアニジノ含有）サブユニットおよびグアニジノ基に結合したアザ−アミノサブユニットの複合体として示される。

構造ＩＶは、グアニジノ基を保有するサブユニットがヒドロキサム酸サブユニットを含む非グアニジノによって互いから分離されている、ヒドロキサム酸サブユニットのオリゴマーを示す。

構造Ｖは、単一のグアニジノ基が糖サブユニットの各々に結合した、オリゴサッカリド骨格の使用を示す。

構造ＶＩは、グアニジノ基がモノマーサブユニットの各々に結合した、オリゴカルバメート輸送試薬を示す。この群の実施形態において、グアニジノ基の間の分離は、さらなるスペーシング基の使用なしで、十分である。しかし、本発明は、非グアニジノ含有サブユニット（例えば、アミノ酸、保護アミノエチルカーボネートなど）が組み込まれる実施形態もまた企図する。

構造ＶＩＩは、ポリアミン輸送試薬（これの構築は、以下に示される）を示す。

構造ＶＩＩＩは、γ−アミノ酸から調製された輸送試薬を示す。カルバメート輸送試薬（構造ＶＩを参照のこと）の場合と同様に、各サブユニットは、グアニジノ基が結合されて示されるが、さらなるアミノ酸（例えば、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸など）が、骨格に沿ったグアニジノ基の間にさらに大きいスペーシングを提供するために使用され得る。

構造ＩＸは、骨格がグルタル酸ユニットによって一緒に結合されたエチレンジアミンユニットからなる、「グルタルアミド」輸送試薬を示す。これらの輸送試薬の調製は、関連する「オキサルアミド」結合および「尿素」結合と共に、以下に記載される。

本発明を指示して実施される研究は、ポリペプチド（例えば、ペプチド骨格）と他の骨格（例えば、カルバメート輸送試薬）の両方を利用し、そして代替の骨格が、生物学的膜を横切る送達の増強を提供し得、そしてまた、インビボでの酵素分解に対する耐性を提供し得ることを実証した。

（ｉｉ．側鎖連結（Ｙ^ｉ））
上記式の各々において、基Ｙ^ｉは、骨格とグアニジノヘッド基またはグアニジニウムヘッド基（Ｚ^ｉ）との間の連結を示す。種々の連結が、本発明によって期とされ、以下が挙げられる：（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）ヘテロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_８）シクロアルキルアルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）スピロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびこれらの組み合わせ。これらの基のメンバーは、種々の側鎖連結を表すための共通の特徴としてグアニジニウムヘッド基およびペプチド骨格を使用して、以下に示される。

上に見られるように、モノマーＩａは、Ｌ−アルギニンサブユニットであり、そして側鎖連結基は、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−である。モノマーＩｂは、側鎖連結基が、アルギニンにおける側鎖連結基より短い（ｎ＝０）かまたはより長く（例えば、ｎ＝２、３、４）あり得る、サブユニットを示す。モノマーＩｃ、Ｉｄ、およびＩｅは、不飽和部位を有する側鎖連結基を示す。側鎖がアルケン基を含むサブユニットについては、いずれの配向も（ＥまたはＺ、トランスまたはシス）、本発明によって企図される。残りのモノマーは、全て、側鎖連結基の一部として環状構造の何らかの部分を示す。モノマーＩｆにおいて、シクロプロパン環が、骨格とグアニジニウムヘッド基との間の連結を形成し、側鎖連結基のコンホメーション可撓性に対して制限を与える。モノマーＩｇにおいて、フェニル環が、骨格基とグアニジノ基との間の連結基として示される。関連する実施形態は、他のアリール基またはヘテロアリール基（例えば、ピリジン、ピリダジン、ナフタレン、ビフェニルなど）が、側鎖連結基を形成する実施形態を含む。さらに、連結は、示されるような１，３−（すなわち、メタ）配向、１，４−（すなわち、パラ）配向または１，２−（すなわち、オルト）配向であり得るか、あるいはグアニジノ基を骨格の立体障害から離れた位置に配置するように働く、他の任意の配向であり得る。さらに、アリーレン基またはヘテロアリーレン基の側鎖連結は、グアニジニウムヘッド基に多少の電子的特徴を提供するように選択された置換基を有し得る。例えば、フェニレン連結基上のニトロ基置換基は、グアニジニウムヘッド基の電子的特徴を減少させ得、一方で電子供与置換基（例えばメトキシ）は、グアニジニウムヘッド基の電子的特徴を増加させ得る。モノマーＩｈは、スピロ環式環部分を有する連結基を示す。四員環が、Ｉｈにおいて示されるが、他の環（三員環、五員環、六員環、および七員環の炭素環式環および複素環式環）もまた、本発明の範囲内である。モノマーＩｉは、連結基の一部が骨格基の一部と環構造を形成して、連結基およびまたグアニジニウムヘッド基のコンホメーション自由度を制限する、側鎖連結基を示す。モノマーＩｊは、グアニジニウムヘッド基の１つの窒素原子と共通の五員環を有する側鎖連結基を示し、一方でモノマーＩｋは、単一の２−アミノベンゾイミダゾール部分への、側鎖連結基とグアニジニウムヘッド基との組み合わせを示す。

当業者は、側鎖連結基が、示される炭素原子のいくつかの代わりとしてヘテロ原子を含むさらなる実施形態、または２つ以上の上記モノマーが単一の側鎖連結基に組み合わせられたことを特徴とするさらなる実施形態が企図されることを理解する。

（ｉｉｉ．グアニジニウムヘッド基またはグアニジノ基（Ｚ^ｉ））
上記側鎖連結基と同様に、本発明は、Ｚ^ｉがグアニジノヘッド基またはグアニジニウムヘッド基を表す組成物に関する。好ましくは、輸送試薬における各Ｚ^ｉは、以下から独立して選択される：

ここで、波線は、Ｙ^ｉへの結合点を表す。

なお他の有用なＺ^ｉ基は、以下である：

上記からの特定のＺ^ｉ基を組み込むモノマーが、以下に提供される。例えば、アミノ酸骨格形式における適切なモノマーとしては、以下が挙げられる：

上記の他のモノマーを参照すると、ＩＩａは、アルギニン残基（正に荷電した形態で示される)である。モノマーＩＩｂおよびＩＩｃは、Ｒ基で置換されたグアニジノヘッド基またはグアニジニウムヘッド基を示す（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリールアルキル基であり得る）。モノマーＩＩｄ、ＩＩｅ、ＩＩｆおよびＩＩｇは、グアニジニウム部分が複素環式環の一部である（必要に応じて、第二の環に縮合している。ＩＩｇを参照のこと）、グアニジノヘッド基またはグアニジニウムヘッド基を示す。モノマーＩＩｈ、ＩＩｉおよびＩＩｊは、グアニジノ部分の中心炭素原子がヘテロ原子（例えば、リン、ホウ素または硫黄）によって置き換えられている、グアニジノヘッド基のヘテロ原子アナログを示す（例えば、それぞれＩＩｈ、ＩＩｉおよびＩＩｊ）。モノマーＩＩｋは、組み合わせられたアミジノ／グアニジニウムヘッド基を示し、その結果、このモノマーは、アルギニン残基と類似の電子的特性および立体特性を有する。

（ｉｖ．好ましい実施形態）
上記式Ｉに戻ると、輸送試薬およびこれらの生物学的に活性な薬剤への結合体化のための、多数の実施形態が好ましい。

好ましい実施形態の１つの群において、各Ｘ^ｉは、以下から選択される：

ここで、各Ｒは、Ｈおよびアミノ酸側鎖（グアニジノ基またはアミジノ基が結合した側鎖（例えば、アルギニン側鎖）以外）から選択され；星印付きの波線は、Ｙ^ｉへの結合点を示し、そして残りの波線は、骨格に沿った結合点を示す。

より好ましくは、Ｘ^ｉは、以下から選択される：

なおより好ましくは、輸送試薬は、各Ｘ^ｉが以下から選択される、非ペプチド骨格を含む：

式Ｉに戻ると、好ましい実施形態の１つの群において、Ｚ^ｉに結合した各Ｙ^ｉは、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）ヘテロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_８）シクロアルキルアルキレン、アリーレンおよびこれらの組み合わせから選択される。より好ましくは、Ｚ^ｉに結合した各Ｙ^ｉは、非分枝の（Ｃ_３〜Ｃ_７）アルキレンである。

特定のＺ^ｉ基はまた、本発明において好ましい。好ましい実施形態の１つの群において、各Ｚ^ｉは、以下から選択される：

なお他の好ましい実施形態において、Ｚ^ｉに結合する各Ｙ^ｉは、非分枝の（Ｃ_４〜Ｃ_６）アルキレンであり、そして各Ｚ^ｉは、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ_２である。

好ましい実施形態のなお別の群において、式Ｉにおける各奇数の整数ｉに対して、ｎは０であり；そして各偶数の整数ｉに対して、ｎは１である。

好ましい実施形態の別の群において、ｍは、１２〜２５の整数であり、そしてこの化合物は、同じであり得るかまたは異なり得る６〜８個のグアニジニウム部分を有する。

なお他の好ましい実施形態において、輸送試薬は、上に提供される構造Ｉ〜ＩＸを含む。

（Ｄ．生物学的に活性な薬剤）
いくつかの実施形態において、輸送試薬は、生物学的に活性な薬剤に連結される。種々の生物学的に活性な薬剤が、本発明において有用であり、この薬剤としては、有機低分子（例えば、治療剤）、金属イオン（代表的に、これらのキレートとして結合体化する）、高分子、ペプチド、診断剤または画像化剤、およびホウ素試薬が挙げられるが、これらに限定されない。

（ｉ．有機低分子）
有機低分子の治療剤（約１００〜約１０００の分子量を有する薬剤）は、本明細書中に記載されるような線状ポリマー組成物に有利に結合されて、生物学的膜を横切る輸送を容易にするかまたは増強し得る。例えば、非常に荷電した薬剤（例えば、レボドパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン；Ｌ−ＤＯＰＡ））の送達は、本明細書中に記載されるようなポリマー輸送分子への連結から利益を得ることができる。ペプトイドおよびペプチド模倣薬剤もまた、企図される（例えば、Ｌａｎｇｓｔｏｎ，１９９７；Ｇｉａｎｎｉｓら、１９９７）。また、本発明は、水性液体（例えば、血清および水性生理食塩水）における乏しい溶解度を有する有機低分子を送達するために、有利である。従って、治療効率がその低い溶解度によって制限される化合物が、本発明に従って、より多い投薬量で投与され得、そして細胞によるより高い取り込みに起因して、非結合体化形態と比較して、結合体化形態において、モルベースでより大きい効率であり得る。

輸送試薬に結合され得るなお他の治療剤は、公知の抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、ビタミン、鎮痛薬、ホルモンなどから選択され得る。

本発明の組成物および方法において有用な抗菌剤としては、一般に、β−ラクタム抗生物質およびキノロン抗生物質が挙げられる。より具体的には、この薬剤は、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、アモキシリン（ａｍｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、リファンピン、ミノサイクリン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、またはこれらのアナログであり得る。

本発明の組成物および方法において有用な抗菌剤としては、一般に、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルフィソキサゾール、スルファジアジン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧおよびペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン（ｎａｆｉｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン、アモキシリン（ａｍｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリンおよびピペラシリン）、セファロスポリン（例えば、セファロチン、セファゾリン（ｓｅｆａｘｏｌｉｎ）、セファレキシン、セファドロキシル、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロール、セフロキシム（ｃｅｆｕｒｏｘｉｎｅ）、ロラカルベフ（ｌｏｒａｃａｒｂｅｆ）、セフォニシド（ｃｅｆｏｎｉｃｉｄ）、セフォテタン、セフォラニド、セフォタキシム、セフポドキシム・プロキセチル、セフチゾキシム、セフォペラゾン、セフタジジムおよびセフェピム）、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシンなど）、テトラサイクリン（例えば、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリンおよびミノサイクリン）、ならびにマクロライド（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）が挙げられる。

本発明の組成物および方法において有用な抗真菌剤としては、一般に、アンホテリシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナイスタチン、クロトリマゾール、フルコナゾール、シクロピロックス、エコナゾール、ナフチフィン、テルビナフィンおよびグリセオフルビンが挙げられる。

本発明の組成物および方法において有用な抗ウイルス剤としては、一般に、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、ホスカネット、イドクスウリジン、ソリブジン（ｓｏｒｉｖｕｄｉｎｅ）、トリフルリジン、バラシクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ジドブジン、リバビリンおよびリマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｔｉｎｅ）が挙げられる。

本発明の組成物および方法において有用な、抗増殖剤および免疫抑制剤としては、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、６−チオグアニン、シクロホスファミド（ｃｈｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、塩酸メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、カルムスチン、シクロスポリン、タキソール、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ビンブラスチン、ダプソンおよびスルファサラジンが挙げられる。

ヒスタミンレセプターアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明において有用な別のクラスの薬剤である。適切な薬剤の例としては、２−メチルヒスタミン、２−ピリジルエチルアミン、２−チアゾリルエチルアミン、（Ｒ）−α−メチルヒスタミン、インプロミジン、ジマプリット（ｄｉｍａｐｒｉｔ）、４（５）メチルヒスタミン、ジフェンヒドラミン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフェニラミン、クロルサイクリジン、テルフェナジンなどが挙げられる。

本発明において有用な別のクラスの薬剤は、喘息を処置する際に使用される化合物である。このような薬剤の例としては、コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニドおよびプレドニゾン）、クロモリン、ネドロクロミル（ｎｅｄｏｃｒｏｍｙｌ）、アルブテロール、メタンスルホン酸ビトルテロール、ピルブテロール、サルメテロール、テルブチリン（ｔｅｒｂｕｔｙｌｉｎｅ）およびテオフィリンが挙げられる。

本発明の組成物および方法において有用な、なお別のクラスの生物学的に活性な薬剤は、ビタミンである（ＧＯＯＤＭＡＮおよびＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１５４７−１５９０頁（１９９６）を参照のこと）。

種々の鎮痛剤が、本発明において有用であり、鎮痛剤としては、例えば、リドカイン、ブピバカイン、ノボカイン（ｎｏｖｏｃａｉｎｅ）、プロカイン、テトラカイン、ベンゾカイン、コカイン、メピバカイン、エチドカイン、プロパラカイン、ロピバカイン、プリロカインなどが挙げられる。

本発明の組成物および方法において有用な抗腫瘍剤としては、一般に、ペントスタチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シタラビン、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、マイトマイシン、シスプラチン、プロカルバジン、ダカルバジン、パクリタキセル、コルヒチン、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。

（ｉｉ．金属）
金属は、真核生物細胞および原核生物細胞に、本発明のトランスポーターと結合体化したキレート剤（例えば、テキサフィリンまたはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））を使用して輸送され得る。これらの結合体は、画像化または治療のための、金属イオンの送達のために有用である。例示的な金属イオンの例としては、Ｅｕ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｇｄ、^９９ｍＴｃ、^６７Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、および^５７Ｃｏが挙げられる。結合体候補物を用いる予備的な膜輸送研究を、細胞ベースのアッセイを使用して実施し得る。例えば、ユーロピウムイオンを使用して、細胞取り込みは、時間分解した蛍光測定によってモニタリングされ得る。細胞傷害性の金属イオンについては、取込は、細胞傷害によってモニタリングされ得る。

（ｉｉｉ．高分子）
本発明の増強された輸送方法は、特に、多数の高分子（タンパク質、核酸、多糖類、およびこれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない）についての生物学的膜を横切る輸送を増強するために適切である。例示的な核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡから形成されるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそのアナログが挙げられ、これらは、相補的な標的（例えば、一本鎖標的または二本鎖標的についてのアンチセンス配列）に対するハイブリダイゼーションのため、またはこの配列によってコードされる核酸転写物またはタンパク質の発現のために設計された、選択された配列を有する。アナログとしては、荷電した骨格アナログおよび好ましくは荷電していない骨格アナログ（例えば、ホスホネート（好ましくは、メチルホスホネート）、ホスホロアミデート（Ｎ３’またはＮ５’）、チオホスフェート、荷電していないモルホリノベースのポリマー、ならびにタンパク質核酸（ＰＮＡ））が挙げられる。このような分子は、種々の治療レジメン（例えば、酵素置換治療、遺伝子療法、およびアンチセンス治療が挙げられる）において使用され得る。

例として、タンパク質核酸（ＰＮＡ）は、骨格が構造的にデオキシリボース骨格に類似している、ＤＮＡのアナログである。この骨格は、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットからなり、これに、核酸塩基が結合する。４つ全ての天然の核酸塩基を含むＰＮＡは、ワトソン−クリックの塩基対合規則に従って、相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして塩基対認識の観点から、真のＤＮＡ模倣物である（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。ＰＮＡの骨格は、リン酸エステルではなくペプチド結合によって形成され、この骨格を、アンチセンス増幅のために十分に適切にする。この骨格は荷電していないので、形成するＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、通常より大きい熱安定性を示す。ＰＮＡは、ヌクレアーゼによってもプロテアーゼによっても認識されないという、さらなる利点を有する。さらに、ＰＮＡは、標準的なｔ−Ｂｏｃ化学を使用して、自動ペプチド合成機で合成され得る。次いで、ＰＮＡは、本発明の輸送試薬に容易に連結される。

本発明の方法を使用して、細胞への輸送が増強され得る、アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、例えば、米国特許第５，５９４，１２２号に記載されている。このようなオリゴヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を処置するための標的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドへの輸送試薬の結合体化は、十分に確立された方法に従って、例えば、ペプチドとオリゴヌクレオチドの５’末端との間に、スクシネート結合を介して、アミド結合を形成することによって、なされ得る。

生物学的膜を横切って輸送され得る高分子の別のクラスは、タンパク質、および特に、酵素によって例示される。治療タンパク質としては、置換酵素が挙げられるが、これらに限定されない。治療酵素としては、リソソームグルコセレブロシダーゼ不全（ゴシェ病）を処置する際に使用するための、アルグルセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ムコ多糖体症Ｉを処置する際に使用するための、α−Ｌ−イズロニダーゼ、サンフィリポＢ症候群を処置する際に使用するための、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、膵臓機能不全を処置する際に使用するための、リパーゼ、重症複合型免疫不全症候群を処置する際に使用するための、アデノシンデアミナーゼ、およびトリオースホスフェートイソメラーゼ欠損に関連する神経筋機能不全を処置する際に使用するための、トリオースホスフェートイソメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

さらに、そして本発明の重要な局面に従って、タンパク質抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾル区画に送達され得、ここで、これらの抗原は、ペプチドに分解される。次いで、これらのペプチドは、小胞体に輸送され、ここで、これらのペプチドは、発生器のＨＬＡクラスＩ分子と会合し、そして細胞表面上で提示される。このような「活性化」ＡＰＣは、クラスＩを制限された抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導薬剤として働き得、これは次いで、特定の抗原を提示する細胞を認識し、そして破壊を続ける。このプロセスを実施し得るＡＰＣとしては、特定のマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、タンパク質抗原は、腫瘍細胞に対する免疫応答を引き起こすかまたは促進するための、腫瘍抗原である。

単離されたタンパク質または可溶性タンパク質の、ＡＰＣの細胞質ゾルへの輸送（引き続くＣＴＬの活性化を伴う）は、例外的に優れている。なぜなら、わずかな例外を伴って、単離されたタンパク質または可溶性タンパク質の注入は、ＡＰＣの活性化もＣＴＬの誘導もいずれも生じないからである。従って、本発明の輸送増強組成物に結合体化した抗原は、インビトロまたはインビボでの細胞性免疫応答を刺激するように働き得る。

別の実施形態において、本発明は、免疫特異的抗体または抗体フラグメントを細胞質ゾルに送達して、有害な生物学的プロセス（例えば、微生物感染）を防止するために有用である。最近の実験は、細胞内抗体が、植物細胞および哺乳動物細胞において有効な抗ウイルス剤であり得ることを示した（例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら、１９９３；およびＳｈａｈｅｅｎら、１９９６）。これらの方法は、代表的に、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用し、ここで、抗体の重鎖および軽鎖は、単一のペプチドとして合成される。可変重鎖および可変軽鎖は、通常、可撓性リンカーペプチド（例えば、１５アミノ酸のもの）によって分離されて、２８ｋＤａの分子を与え、これは、高親和性リガンド結合部位を保持する。この技術の広範な適用に対する最も重要な障害は、感染した細胞への取り込みの効率であった。しかし、輸送試薬をｓｃＦｖフラグメントに結合させることによって、細胞取り込みの程度は増加し得、免疫特異的フラグメントが重要な微生物成分（例えば、ＨＩＶ Ｒｅｖ、ＨＩＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼタンパク質）に結合し、そして不能にすることを可能にする。

（ｉｖ．ペプチド）
本明細書中に記載される増強された輸送方法によって送達されるためのペプチドとしては、エフェクターポリペプチド、レセプターフラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されるべきではない。例としては、細胞内シグナル伝達を媒介するタンパク質によって使用される、リン酸化部位を有するペプチドが挙げられる。このようなタンパク質の例としては、プロテインキナーゼＣ、ＲＡＦ−１、ｐ２１Ｒａｓ、ＮＦ−κＢ、Ｃ−ＪＵＮ、および膜レセプター（例えば、ＩＬ−４レセプター、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｖ７ならびにＭＨＣクラスＩ抗原およびＭＨＣクラスＩＩ抗原）の細胞質テイルが挙げられるが、これらに限定されない。

輸送増強分子がまた、ペプチドである場合、合成は、自動ペプチド合成機を使用してか、または上記のような融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドが産生される組換え方法によってかのいずれかで、達成され得る。

（ｖ．診断画像化剤および造影剤）
本発明の組成物はまた、上皮組織および／または内皮組織の１つ以上の層中へ、またはそれを横切って診断画像化剤および造影剤を送達するのに有用である。診断薬剤の例としては、放射能で標識された物質（例えば、^９９ｍＴｃグルコヘプトネート）、または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）手順において使用される物質（例えば、ガドリニウムをドープされたキレート剤（例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡ））が挙げられる。診断薬剤の他の例としては、細胞において発現された場合に容易に検出可能であるタンパク質をコードするマーカー遺伝子（β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。広範な種々の標識が使用され得、例えば、放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特に、ハプテン）などが使用され得る。

（ｖｉ．ホウ素試薬）
本発明の組成物および方法はまた、ホウ素試薬（例えば、Ｂｏｒｏｎ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ治療において使用される試薬）の送達に有用である。この実施形態において、ホウ素種は、送達増強輸送試薬自体に組み込まれ得るか、または標的細胞もしくは組織へのホウ素のより効率的な輸送のために輸送試薬と合わせられ得る。Ｂｏｒｏｎ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ治療における概説は、以下のように見出され得る：Ｂａｒｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２１：１３９−１５４（１９９４）；Ｂａｒｔｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖ．１４：５３４−５５０（１９９６）；Ｃｏｄｅｒｒｅら，Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１５１：１−１８（１９９９）；Ｇａｈｂａｕｅｒら，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５０：１８３−２０９（１９９８）；Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：９５０−９８４（１９９３）；Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ４：１７４−１８１（１９９８）；Ｓｏｌｏｗａｙら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ．３３：９−１８（１９９７）；Ｓｏｌｏｗａｙら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８：１５１５−１５６２（１９９８）。アミノ酸およびペプチドにおけるホウ素の調製および組み込みのための方法の概説については、Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌら，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ，Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｒｅｌａｔ．Ｅｌｅｍ．８７：２６７−２７６（１９９４）を参照のこと。Ｃａｉら，Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：３８８７−３８９６（１９９７）もまた参照のこと。

（Ｅ．試薬を輸送するための生物学的に活性な薬剤を結合するための連結基）
輸送されるべき薬剤は、多数の実施形態に従って輸送試薬に連結され得る。１つの実施形態において、この薬剤は、輸送試薬の末端または適切な連結基を介する試薬内の内部サブユニットへの結合のいずれかを介して、１つの輸送試薬に連結される。

第２の実施形態において、この試薬は、上記と同じ様式で、１つより多い輸送試薬に結合される。この実施形態は、幾分好ましくない。なぜなら、それは、隣接する細胞の架橋を生じ得るからである。

第３の実施形態において、結合体は、輸送試薬の各末端に結合された２つの生物学的に活性な薬剤（同じかまたは異なるかのいずれか）を含む。この実施形態について、薬剤が、１０ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは、約１ｋＤａ未満の分子量を有することが、現在好ましい。

言及したばかりの第１および第３の実施形態に関して、生物学的に活性な薬剤は、一般的に、グアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖のいずれにも結合せず、その結果、それらは、標的膜と自由に相互作用する。種々の連結基を使用して、輸送部分に生物学的に活性な薬剤を共有結合し得、これらには、本質的に任意の市販の二官能性連結基が挙げられ、好ましくは、異種二官能性連結基（Ｐｉｅｒｃｅカタログを参照のこと）が挙げられる。連結基が、いずれかの末端に同じ官能基を有する場合、これらの基は、好ましくは、直交方向に保護され、その結果、各保護基が除去され得、一方、残る保護基をインタクトなままで残す。図５は、本発明において有用な数種の連結基を示す。

本発明の結合体は、容易な合成スキームによって調製され得る。さらに、結合生成物は、好ましくは、長さおよび組成において実質的に均質であり、その結果、それらは、不均質混合物よりも、それらの効果においてより高い整合性および再生性を提供する。より好ましくは、これらの組成物は、少なくとも９０％相同であり（輸送結合体において）、そして最も好ましくは、少なくとも約９９％相同である。

本発明の輸送試薬は、化学的方法または組換え方法によって生物学的に活性な薬剤に共有結合で結合し得る。化学的方法が、好ましい。

（ｉ．化学連結）
生物学的に活性な薬剤（例えば、有機低分子および高分子）は、当該分野で公知の多数の方法（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．編，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１）を参照のこと）を介してか、または、直接的にか（例えば、カルボジイミドを用いて）、もしくは連結部分を介して本発明の輸送試薬に連結され得る。特に、カルバメート結合、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、およびヒドラジン結合は、一般的に、形成が容易であり、そしてほとんどの適用に適している。細胞膜を横切る生物学的に活性な薬剤の輸送後に、結合が、細胞質ゾルにおいて容易に分解されるべきならば、エステル結合およびジスルフィド結合が、好ましい。

種々の官能基（ヒドロキシ、アミノ、ハロゲンなど）を使用して、生物学的に活性な薬剤を輸送試薬に結合し得る。特に、輸送試薬またはその任意の部分が、送達後に生物学的に活性な薬剤に結合したままである場合、生物学的に活性な薬剤の活性部位の部分であると知られていない基が、好ましい。

多数の輸送試薬は、固体支持体上で調製され得、そしてアミノ末端基および保護基（例えば、ＦＭＯＣ）を用いて、簡易的に生成される。合成樹脂および脱保護側鎖から試薬を切断し、側鎖を脱保護するために使用される条件を生き残り得る生物学的に活性な薬剤について、ＦＭＯＣは、完成された樹脂結合試薬のＮ末端から切断され得、その結果、生物学的に活性な薬剤は、遊離のＮ末端アミンに連結され得る。このような場合に、結合される薬剤は、代表的に、当該分野で周知の方法によって活性化され、輸送試薬のアミノ基とアミド結合またはカルバメート結合をそれぞれ形成するのに有効な、活性なエステル部分または活性なカーボネート部分を生成する。もちろん、他の連結化学物質もまた、使用され得る。

副反応を最小限にすることを補助するために、グアニジノ部分およびアミジノ部分は、従来の保護基（例えば、カルボベンジルオキシ基（ＣＢＺ）、ｄｉ−ｔ−ＢＯＣ、ＰＭＣ、Ｐｂｆ、Ｎ−ＮＯ_２など）を用いてブロックされ得る。

カップリング反応は、溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、水など）の任意のアレイにおける、公知のカップリング方法によって実施される。例示的なカップリング試薬としては、例えば、Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−ｔｒｉｓ（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）などが挙げられる。他の試薬としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４−ピロリジノピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどが挙げられ得る。

（ｉｉ．放出可能なリンカー）
生物学的に活性な薬剤は、本発明の好ましい実施形態において、特異的に切断可能または放出可能な結合を使用して、輸送試薬に結合される。このような結合の使用は、結合された輸送試薬が放出されるまで不活性である生物学的に活性な薬剤にとって、特に重要である。幾つかの場合において、輸送試薬に結合された薬物分子からなるこのような結合体は、薬物からの輸送試薬の放出が、不活性な形態から活性な形態への薬物の変換を生じるという点で、プロドラッグといわれ得る。本明細書で使用される場合、結合体またはリンカーの「切断された」または「切断」とは、輸送試薬分子からの生物学的薬剤の放出をいい、これによって、活性な生物学的薬剤が放出される。「特異的に切断可能」または「特異的に放出可能」とは、分解される輸送試薬（例えば、タンパク質分解によって）以外の、輸送試薬と切断される薬剤との間の結合をいう。

幾つかの実施形態において、結合は、容易に切断可能な結合であり、このことは、この結合が、インビボに見出される条件下で切断を許容することを意味する。従って、上皮組織および／または内皮組織の１つ以上の層中へ、またはそれを通じて通過する際に、薬剤は、輸送試薬から放出される。容易に切断可能な結合は、例えば、比活性を有する酵素（例えば、エステラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼなど）によるか、または加水分解によって切断される結合であり得る。この目的のために、カルボン酸エステルおよびジスルフィド結合を含む結合は、時々好ましく、ここで、前者の基は、酵素的または化学的に加水分解され、そして後者は、ジスルフィド交換（例えば、グルタチオンの存在下で）によって過酷にされる。この結合は、上皮細胞または内皮組織の１つ以上の層に存在することが知られている酵素活性によって切断可能なように選択され得る。例えば、皮膚の顆粒層は、比較的高い濃度のＮ−ペプチダーゼ活性を有する。

特異的に切断可能なリンカーは、輸送試薬分子上に操作され得る。例えば、プロテアーゼ認識部位を構成するアミノ酸、またはこのような特異的に認識される酵素切断部位を使用して、輸送試薬と薬剤とを連結し得る。あるいは、例えば、光または他の刺激への曝露によって切断可能な化学的リンカーまたは他の型のリンカーを使用して、輸送試薬と目的の薬剤とを連結させ得る。

送達される薬剤および輸送試薬が、特異的に切断可能なリンカーまたは特異的に放出可能なリンカーによって連結された結合体は、半減期を有する。用語「半減期」は、この文脈において、結合体の上皮膜または内皮膜への適用後、２分の１の量の結合体が解離して、遊離の薬剤を放出するのに必要な時間量をいう。幾つかの実施形態についての半減期は、代表的に、５分〜２４時間であり、そしてより好ましくは、３０分〜２時間である。結合体の半減期は、以下に記載されるように、本発明に従って、「調整」され得るか、または改変され得る。

幾つかの実施形態において、リンカーの切断速度は、ｐＨ依存性である。例えば、リンカーは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．５以下、より好ましくは約６以下、そしてなおより好ましくは約５．５以下）で薬剤と輸送試薬との間で安定な結合を形成し得る。しかし、結合体が、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７以上、好ましくは約ｐＨ７．４）に置かれた場合、リンカーは切断を受け、薬剤を放出する。このようなｐＨ感受性は、例えば、プロトン化された場合に（すなわち、酸性ｐＨで）、求核試薬として作用しない官能基を含むことによって得られ得る。より高い（例えば、生理学的な）ｐＨにおいて、官能基は、もはやプロトン化されず、従って、求核試薬として作用し得る。適切な官能基の例としては、例えば、ＮおよびＳが挙げられる。このような官能基を使用して、自己切断を生じるｐＨを微調整し得る。

別の実施形態において、連結部分は、自己犠牲を介して切断される。輸送部分−生物学的に活性な化合物結合体におけるこのような連結部分は、生物学的に活性な化合物に遠位の求核試薬（例えば、酸素、窒素および硫黄）ならびに生物学的に活性な化合物に近位の切断可能な基（例えば、エステル、カルボネートカルバメートおよびチオカルバメート）を含む。切断可能な基に対する求核試薬の分子内攻撃は、共有結合の切断を生じ、それによって、生物学的に活性な化合物から連結部分を放出する。

図５は、異なる連結基を介して本発明の輸送部分に結合した幾つかの治療薬剤の図を提供する。図５Ａにおいて、メルカプトプリンは、ジスルフィド結合を介して、輸送部分への結合として機能するＮ−アセチルシステインに結合する。図５Ｂおよび５Ｃにおいて、適切な光源からの活性化に対して、それぞれメルカプトプリンおよび５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を放出する光不安定性結合が、示される。図５Ｄにおいて、インビボで切断され、タキサン化合物（例えば、タキソール）を放出する結合が、示される。

自己犠牲連結部分（例えば、生物学的に活性な薬剤−Ｌ−輸送部分結合体）を含む結合体の例が、構造１、２および３によって表される：

ここで；Ｒ^１は、生物学的に活性な化合物であり；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間に形成される結合であり；Ｙは、輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から形成される結合であり；Ａは、ＮまたはＣＨであり；Ｒ^２は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；Ｒ^３は、輸送部分であり；Ｒ^４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ^６またはＣＲ^７Ｒ^８であり；Ｒ^５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ^６であり；Ｒ^６は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；Ｒ^７およびＲ^８は、独立して水素またはアルキルであり；ｋおよびｍは、独立して１または２であり；そしてｎは、１〜１０の範囲の整数である。Ｘ結合およびＹ結合の非限定的な例は、以下である（いずれの方向においても）：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ_２ＮＨ−，−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネートおよびホスフィネート。当業者は、生物学的薬剤が、ヒドロキシ官能基を有する場合、Ｘは、好ましくは、−ＯＣ（Ｏ）−または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−であることを理解する。同様に、連結基が、輸送部分のアミノ末端に結合される場合、Ｙは、好ましくは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ_２ＮＨ−，−ＳＯＮＨ−または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などである。上記に提供される各々の基において、ＮＨは、簡潔のために示されるが、各々の結合（ＸおよびＹ）は、置換された（例えば、Ｎ−アルキルまたはＮ−アシル）結合も含み得る。

構造１により例示される連結基を最初に参照すると、例および好ましい実施形態が、式１ａについて例示される：

ここで、波線は、輸送部分および生物学的に活性な化合物への結合点を示す。この連結基を含む結合体は、国際特許公開ＷＯ０２／０６５９８６に記載される輸送試薬について提供される様式と類似の様式で調製され得る。当業者は、Ｎ−ベンジル基が、式１ａにおいて、他の基（例えば、アルキル、アリール、アリルなど）で置換され得るか、またはメチレン基が、例えば、エチレン、プロピレンなどで置換され得ることを理解する。好ましくは、メチレン基は、１ａで示されるように保持され、結合のインビボでの切断を可能にする適切な立体的または空間的な配向を提供する。

従って、構造１について、以下の置換基が好ましい：Ａは、Ｎであり、Ｒ^２は、ベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎは、１であり；Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。

構造２の結合は、式２ａによって例示される：

ここで、上記のように、波線は、輸送部分および生物学的に活性な薬剤の各々への結合点を示す。式２ａの連結基を有する薬物結合体の調製は、図６に示される（図７もまた参照のこと。図７は、このタイプの結合のシクロスポリンＡへの結合を例示する）。図６に示されるように、薬物は、無水クロロ酢酸でアシル化されて、クロロ酢酸エステルを形成し、これは、結合システイン残基を有する輸送部分で処理されて、結合が以下の形態を有する標的化合物を提供する：

従って、好ましい実施形態の一群において、この結合体は、式２によって表され、ここで、Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−であり；Ｙは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり；Ｒ^４は、Ｓであり；Ｒ^５は、ＮＨＲ^６であり；そして添え字のｋおよびｍは、それぞれ１である。好ましい実施形態の別の群において、結合体は、式２によって表され、ここで、Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−であり；Ｙは、−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ^４は、Ｓであり；Ｒ^５は、ＣＯＮＨ_２であり；そして添え字のｋおよびｍは、それぞれ１である。特に好ましい結合体は、Ｒ^６が水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである結合体である。

式３に示される結合体によって表される連結基は、一般に、ヘテロ二官能型（例えば、アミノカプロン酸、セリン、ホモセリン、アミノ酪酸など）であるが、適切に保護されたジカルボン酸またはジアミンもまた、特定の生物学的薬剤と共に有用である。

構造３について、以下の置換基が好ましい：Ｒ^５は、ＮＨＲ^６（ここで、Ｒ^６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである）であり；ｋは、２であり；Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏであり；そしてＹは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。

自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ ｌｉｎｋｅｒ）は、代表的に、約７．４のｐＨにて、３７℃の水中において、約１０分と約２４時間との間の半減期を有する分子内切断を受ける。好ましくは、切断半減期は、約７．４のｐＨにて、３７℃の水中において、約２０分と約４時間との間である。より好ましくは、切断半減期は、約７．４のｐＨにて、３７℃の水中において、約３０分と約２時間との間である。

ここで構造１により表される結合体を参照すると、当業者は、輸送体からの生物学的薬剤の分離である、切断半減期が、Ｒ^２置換基を変えることによって調整され得ることを理解する。増加または減少したサイズのＲ^２を使用することによって、それぞれ、より長いかまたはより短い半減期を有する結合体が得られ得る。構造１中のＲ^２は、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである。

ここで、自己犠牲リンカー中に塩基性基または酸性基が存在し、一方は、結合体溶液のｐＨに従って切断半減期をしばしば調節し得る。例えば、構造１の骨格アミン基は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）でプロトン化される。このアミンは、プロトン化される場合、分子内切断を含む求核剤として作用し得ない。しかし、生理学的ｐＨ（７．４）での中間体への結合体の導入の際、このアミンは、重要なときにプロトン化されない。この切断半減期は、相応して減少される。

１つの実施形態において、自己犠牲リンカーの切断は、以下の２つの工程において生じる：連結部分の一部の切断を生じる、求核基の分子内反応；および連結部分の残りの部分の除去。切断の第１工程は、速度が制限されており、そしてｐＨ感応性および半減期について微調整され得る。

構造４は、輸送部分−生物学的に活性な化合物の結合体中に取りこまれる、２工程の、自己犠牲リンカーの例である：

ここで：Ｒ^１は、生物学的に活性な化合物であり；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と、連結部分上の官能基との間の連結を示しており；Ａｒは、置換もしくは非置換のアリール基であって、ここで、メチレン置換基およびフェノールの酸素原子は、互いに対して、オルトまたはパラのいずれかであり；Ｒ^３は、輸送部分であり；Ｒ^４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ^６またはＣＲ^７Ｒ^８であり；Ｒ^５はＨ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ^６であり；Ｒ^６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；Ｒ^７およびＲ^８は、独立して水素またはアルキルであり；そしてｋおよびｍは、独立して１または２である。

特に好ましい連結基は、式４ａを有する：

。

従って、式４の結合体で使用されるこの連結基は、好ましくは、以下の連結基である：Ａｒが置換もしくは非置換のフェニレン基であり；Ｒ^４がＳであり；Ｒ^５がＮＨＲ^６であって、ここで、Ｒ^６は、水素、メチル、アリル、ブチル、アセチルまたはフェニルであり；ｋおよびｍは１であり；Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり；そしてＹは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。より好ましくは、Ｒ^６は水素またはアセチルである。

本発明で使用するためのなお他の有用な連結基は、同時係属のＰＣＴ出願に記載されている。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９８／５２６１４およびＷＯ０１／１３９５７は、類似の組成物（例えば、生物学的に活性な薬剤と輸送オリゴマーとの結合体）に対する連結基を記載する。これらに記載される連結技術は、類似の様式で本発明の組成物中で使用され得る。

（ＩＩＩ．輸送試薬および結合体の合成）
本明細書中に記載される試薬は、当該分野で公知の任意の方法によって構築される。例示的なポリアミドは、好ましくは、適切なサブユニット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３３）の使用に適合されるペプチド合成機を使用して、合成的に生成され得る。

Ｎ−メチルおよびヒドロキシアミノ酸は、固相ペプチド合成において従来のアミノ酸の代わりとして置換され得る。しかし、還元されたペプチド結合を有する試薬の製造は、還元されたペプチド結合を含有するアミノ酸の二量体の合成を必要とする。このような二量体は、標準的な固相合成手順を使用してポリマー中に組み込まれる。他の合成手順は周知であり、例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９８）、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）およびこれらに引用される参考文献に見出され得る。

（Ａ．カルバメート輸送試薬）
カルバメート輸送試薬は、スキーム１および２（図１１を参照のこと）に図示されるように調製され得る。

スキーム１を参照すると、カルバメート輸送試薬のいくつかのバージョンの構築に使用されるモノマー単位は、適切に保護された形態のオルニチンから調製され得る。従って、イソブチリルクロロホルメート、その後の水素化ホウ素ナトリウムでのＮ−Ｆｍｏｃ Ｎ^δ−Ｂｏｃ Ｌ−オルニチン（ｉ）の処理は、アルコール（ｉｉ）を提供し、このアルコールは、４−ニトロフェニルクロロホルメートおよびピリジンでの処理の際に、保護モノマー（ｉｉｉ）に転換され得る。当業者は、関連する酸（例えば、Ｄ−リジンまたはＬ−リジンの保護形態）での、保護されたオルニチン（ｉ）の置換は、より長いかもしくはより短い側鎖結合を有する他の保護されたモノマー中間体を提供し得ることを理解する。

スキーム２に示されるように、ＨＯＢｔ、ＤＩＥＡおよびＤＭＦの存在下での、モノマー（ｉｉｉ）でのアミン樹脂（ｉｖ）の処理、その後のＤＭＦ中のピペリジンでの処理は、式（ｖ、添え字のｎが１）の支持体結合モノマーを提供する。モノマー付加およびＦｍｏｃ除去の工程を繰り返すことによって、式ｖ（添え字のｎが４〜１２）の支持体結合オリゴマーを提供する。一旦適切な長さのオリゴマーが構築されると、適切な治療剤または診断剤に対する連結基は、結合され得る。従って、ＤＩＣ、ＨＯＢｔおよびＤＭＦの存在下でのＦｍｏｃアミノカプロン酸でのｖの処理、その後のピペリジンおよびＤＭＦによる処理によって、ＤＩＥＡおよびＤＭＦの存在下でＦＩＴＣと合わせられ得るアミノカプロン酸結合体を提供し、連結されたＦＩＴＣ結合体を提供する。次いで、このＢｏｃ保護基は、除去され得、中間体が樹脂から除去され得、そして１級アミノ基が、炭酸ナトリウムの存在下で例えば、Ｉｍ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２でペルグアニル化され得、標的化合物を提供する。

スキーム２は、カルバメート連結を介して結合されるサブユニットを有する、輸送ポリマーの調製を示す。当業者は、この合成が、アミノ酸モノマー（例えば、グリシン、ε−アミノカプロン酸、γ−アミノブチル酸など）を含み得、グアニジノ含有モノマー単位間に適切な空間を提供し得ることを理解する。

（Ｂ．ペプチド輸送試薬）
別の群の実施形態において、輸送試薬は、γ−アミノ酸モノマーから構築され得る（スキーム３に図示されるように調製される、図１２を参照のこと）。

スキーム３に示されるように、適切に保護されたオルニチンｖｉｉは、複数工程プロセスにおいて、２つのその炭素ホモログへと変換され得る。ＤＣＣ、ＤＭＡＰおよびジクロロメタンの存在下で、Ｍｅｌｄｒｕｍ酸でのｖｉｉの処理は、ｖｉｉｉを提供する。ケトンカルボニルの還元は、酢酸、ジクロロメタン中の水素化ホウ素ナトリウムを使用して達成され得、ｉｘを提供する。トルエン中でｉｘを加熱し還流して、ｘを生成する。このｘは、加水分解（アセトン中ＮａＯＨ）され、ｘｉを提供し得る。ＤＭＦ中でのＢｏｃ保護基の除去およびＦｍｏｃ−ＯＳｕでの得られたアミン官能基の再保護は、モノマーｘｉｉを提供する。

スキーム４（図１２を参照のこと）は、輸送結合体の調製におけるモノマーｘｉｉの使用を図示する。上記のように、アミノ樹脂（ｉｖ）は、ＤＩＥＡ、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵおよびＮＭＰの存在下でｘｉｉで処理され、そして脱保護され（ピペリジン）、ｘｉｉｉを提供する（ここで、添字ｎは１である）。さらなるモノマー基は、スキーム４に示されるように連続して添加され得るか、または非グアニジド含有サブユニットによって中断され得る。単純性について、スキーム４は、全てのサブユニットがグアニジド基に編管される側鎖を有するオリゴマーの調製を図示する。従って、ｘｉｉｉ（ｎ＝１）は、ｎ工程のモノマーカップリングおよび脱保護に供され、例えば、ｘｉｉｉを提供し得、ここでｎ＝５である。アミノカプロン酸（ａｃａ）とＦＩＴＣとの結合の後の工程が、スキーム２に要約されるように進行し、ｘｉｖを提供する。Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）の除去および樹脂からの輸送結合体中間体の切断によってｘｖを提供する。グアニジド基への１級アミン官能基の変換が、炭酸ナトリウムの存在下で、グアニルピラゾールを用いて達成され得、ｘｖｉを提供する。

（Ｃ．グルタルアミドおよびオキサルアミド輸送試薬）
別の群の実施例において、輸送試薬は、グルタルアミド誘導体であり、このグルタルアミド誘導体の調製は、スキーム５に図示される（図１３を参照のこと）。

スキーム５において、Ｎ’，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）エチレンジアミン（ｘｖｉｉ）は、末端１級アミノ基でグアニジニル化され、そして一保護され、ｘｖｉｉｉを提供する。次いで、二量体構造は、適切な活性化グルタル酸と２当量ｘｖｉｉｉとを合わせることによって形成され、そして一保護され、ｘｉｘを形成する。再び、２当量のｘｉｘは、活性化グルタル酸試薬と合わせられ、ｘｘを形成する。上記の輸送試薬のように１つのＢｏｃ保護基の除去およびａｃａ−ＦＩＴＣへのカップリング、ならびにカルボベンジルオキシ保護基（Ｚ）のさらなる除去は、化合物ｘｘｉを提供する。

スキーム６（図１４を参照のこと）は、「オキサルアミド」輸送結合体（Ｌ＝−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−）、「尿素」輸送試薬（Ｌ＝−Ｃ（Ｏ）−）などへの上記の方法論の拡張を図示する。

（Ｄ．ポリアミン輸送結合体）
なお別の群の実施形態において、輸送試薬は、ポリアミン輸送試薬である。この群の実施形態において、骨格は、ポリアミンであるかまたはポリアミンの性質（例えば、ポリエチレンアミン、ポリプロピレンアミンなど）を含むかのいずれかである。スキーム７（図１５を参照のこと）は、ポリアミン輸送試薬の１つの型を図示する。

スキーム７において、ポリエチレンイミンは、ε−アミノカプロン酸の保護化形態を用いて一アシル化され、示された開始物質を提供する。残っているアミノ基は、例えば、保護化ε−アミノカプロン酸クロリドを用いてペルアシル化され得、側鎖連結基を有する適切な骨格を提供する。側鎖保護基の除去およびペルグアニジル化は、生物学的に活性な薬剤に結合体化するのに適切な結合された保護化連結基を有する輸送試薬を提供する。

（ＩＶ．生体膜を横断する生物学的に活性な薬剤の増強された輸送）
（Ａ．生体膜を横断する輸送の測定）
生物学的に活性な薬剤および他の治療物質を、生体膜を横断して輸送する本発明の輸送試薬の能力を評価するためのモデル系は、膜を横断して共有結合された蛍光分子を輸送する能力を測定する系を含む。例えば、フルオレセイン（約３７６ＭＷ）は、有機低分子の輸送のためのモデルとして働き得る。高分子の輸送について、輸送試薬は、例えば、オボアルブミン（分子量４５ｋＤａ）のような巨大ペプチドに融合され得る。巨大分子の取り込みを検出することは、蛍光タグを結合することによって容易にされ得る。細胞取り込みはまた、共焦点顕微鏡法によって分析され得る。

（Ｂ．生体膜を横断する増強された輸送）
実施された、本発明を支持する実験において、膜貫通輸送および同時に生じる細胞取り込みを、公知の方法（前に引用されるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ０２／０６５９８６）に従って、フルオレセインに結合された輸送試薬の取り込みによって評価した。簡潔には、細胞の懸濁物を、緩衝液中に懸濁された蛍光結合体と、３７℃、２３℃、または３℃で種々の時間、インキュベートした。インキュベーション後、反応を中止し、細胞を遠心分離によって回収し、そして蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、蛍光について分析した。

使用される条件下で、結合体の細胞取り込みは、飽和し得なかった。結果として、ＥＤ_５０値は、輸送試薬について計算され得なかった。代わりに、データを、ヒストグラムとして示し、単一の結合体濃度での細胞取り込みの直接比較を可能にする。

カルバメート輸送試薬とオリゴＡｒｇ輸送試薬との比較は、カルバメート輸送試薬が、同様の特性（例えば、全長、グアニジウムヘッド基の数および型など）を有するペプチド輸送試薬と類似するか、またはそれより良好であることを示す。

輸送試薬の全輸送効率は、（ｉ）膜貫通取り込み速度（約１５未満の連続するグアニジノ含有基を有するポリマーはより良好である） 対 タンパク質分解不活性化に対する感受性（より長いポリマーがより良好である）の組み合わせに依存するようである。従って、７〜２０（およびより好ましくは７〜１５）のグアニジノ残基を含むポリマーが、好ましい。

本発明の好ましい実施形態に従って、本発明の輸送試薬は、室温（２３℃）または３７℃で測定される場合、本明細書中に記載される方法によってｔａｔに対して測定される親和性よりも、少なくとも１０倍より大きい見かけの親和性（Ｋｍ）、およびより好ましくは少なくとも１００倍より大きい見かけの親和性を有する。

任意の特定の理論に起因せずに、データは、輸送プロセスが、細胞形質膜に存在する分子輸送試薬による、グアニジウム含有ポリマーまたはアミジニウム含有ポリマーの特異的認識によって媒介されるエネルギー依存性プロセスであることを示唆する。

本発明を支持する他の実験は、本発明の結合体が、種々の細胞型の膜を横断する生物学的に活性な薬剤の輸送に有効であることを示し、この細胞型としては、ヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）、Ｂ細胞（マウスＣＨ２７）、リンパ腫Ｔ細胞（マウスＥＬ−４）、肥満細胞腫細胞（マウスＰ３８８）、種々のマウスＴ細胞ハイブリドーマ、神経細胞（ＰＣ−１２）、線維芽細胞（マウスＲＴ）、腎臓細胞（マウスＨＥＬＡ）、骨髄芽球腫（マウスＫ５６２）；および一次組織細胞（ヒト血球（赤血球を除く）（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球）、マクロファージ、樹状細胞、および好酸球（ｅｉｏｓｉｎｏｐｈｉｌｅ）を含む）；好塩基球、肥満細胞、内皮細胞、心細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、リンパ節細胞、ならびにケラチノサイトが挙げられる。

結合体はまた、グラム陰性細菌細胞およびグラム陽性細菌細胞の両方を横切るために有効である。より一般的には、細菌による最大取り込みレベルは、３７℃で観察され得る。しかし、有意な染色は、インキュベーションが、室温または３℃のいずれかで実施される場合、観察され得る。共焦点顕微鏡法は、０．５％のアジ化ナトリウムでの細菌の前処理が、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方の内部形質膜を横断する輸送を阻害するが、細胞壁（グラム陽性細菌）を横断するペリプラズム空間への輸送は阻害しないことを示した。

従って、本発明は、抗菌剤を含む結合体を包含し、この抗菌剤は、微生物の増殖または感染を防止するかまたは阻害することにおける使用のための、そして表面を殺菌し、医療安全性を改善するための、抗細菌化合物および抗真菌化合物である。さらに、本発明は、植物細胞への輸送のために、特に緑葉植物において使用され得る。

本発明を支持するさらなる研究は、細胞膜を横断するトランスロケーションが、エネルギーおよび温度依存性であり、他の細胞型について以前に示された観察と一致する。

（Ｖ．スクリーニングアッセイ法およびライブラリー）
別の実施形態において、本発明は、選択された生物学的活性についての１つ以上の結合体をスクリーニングするために使用され得、ここで、結合体は、１つ以上の候補薬剤から形成される。結合体を、結合体の細胞への取り込みの際に検出可能な信号を示す細胞と接触させ、その結果、信号の大きさは、選択された生物学的活性に関する結合体の効力を示す。

この実施形態の１つの利点は、それが、独力で細胞に入り生物学的活性を示すのが不可能であるかまたはわずかに可能である、薬剤の活性を試験するために特に有用であるということである。従って、本発明は、薬剤の細胞または細胞小器官への輸送の有効かつ便利な方法がないために、大スケールスクリーニングプログラムによって他に入手可能であり得ない活性薬剤を同定する特に有用な方法を提供する。

好ましくは、１つ以上の候補薬剤は、結合体のコンビナトリアルライブラリーとして提供され、このライブラリーは、当該分野で公知である任意の多くのコンビナトリアル合成方法を使用して調製される。例えば、ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＥｌｌｍａｎ（１９９６）は、固体支持体上にコンビナトリアルライブラリーを調製するための以下の少なくとも５つの異なる一般的アプローチを理解した：すなわち、（１）別個の化合物の合成、（２）分割合成（分割およびプール）、（３）可溶性ライブラリーデコンボリューション、（４）分析方法による構造決定、および（５）アッセイにおける生物学的活性についてポジティブな試験を行った後、活性候補の化学的組成物が、特有の標識によって決定される、コード戦略。溶液中のライブラリーの合成は、少なくとも（１）離れた合成および（２）プールの合成（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，上述）を含む。コンビナトリアル合成法のさらなる記載は、Ｌａｍら（１９９７）において見出され得、これは、特に、１ビーズ−１化合物アプローチを記載する。

これらのアプローチは、本発明に従う結合体を調製するように迅速に適合され、必要に応じて、適切な保護スキームを含む。例えば、１つ以上の固体支持体に対して構築されるライブラリーに対して、輸送ペプチド部分は、まず支持体に結合され、次いで、候補薬剤を、適切な反応性官能基によってポリマーに、コンビナトリアル的に組み入れるか付着させる。代替的な例において、薬剤のコンビナトリアルライブラリーは、まず、１つ以上の固相支持体上に形成され、続いて、輸送試薬を各固定化された候補薬剤に付着する。同じアプローチまたは異なるアプローチは、液相合成のために使用され得る。固体支持体上に形成されるライブラリーは、好ましくは、公知の方法による切断可能な連結基によって支持体から切断される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、およびＬａｍら、上述）。

１つ以上の結合体候補は、結合体の効率に比例して検出可能な信号を誘発する任意の多くの細胞ベースのアッセイを用いて試験され得る。都合の良いことに、候補は、マルチウェルプレート中で細胞と共にインキュベートされ、生物学的効果は、プレートリーダーを使用して定量化され得る信号（例えば、蛍光、反射、吸収、または化学発光）によって測定される。あるいは、インキュベーション混合物は、さらなるプロセシングおよび／または分析のためにウェルから除去され得る。活性化合物の構造および必要に応じて不活性な化合物の構造は、既知でない場合、決定され、この情報は、リード化合物を同定し、さらなる合成およびスクリーニング行動に集中するために使用され得る。

例えば、γ−インターフェロン分泌アッセイは、マルチウェル形式に容易に適合され得、その結果、活性な分泌インヒビターは、プレートリーダーを使用するユーロピウムベースの蛍光検出によって検出され得る。抗癌剤は、確立された癌細胞株（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ））を使用してスクリーンされ得る。抗癌剤の細胞毒性効果は、例えば、トリパン色素排除によって決定され得る。

他の例としては、細胞シグナル伝達を阻害するために指向されるアッセイ（例えば、ＩＬ−４レセプター阻害；細胞増殖をブロッキングするためのアッセイ、および遺伝子発現アッセイ）が挙げられる。代表的な遺伝子発現アッセイにおいて、目的の遺伝子は、適切なプロモーターの制御下に配置され、下流にレポーター種を発現するための遺伝子（例えば、β−ガラクドシダーゼまたはホタルルシフェラーゼ）が続く。阻害効果は、レポーター信号の減少に基づいて検出され得る。

本発明はまた、上記方法においてスクリーニングするために有用である結合体ライブラリーを包含する。ライブラリーは、１つ以上の選択された生物学的活性についての複数の候補薬剤を含み、この各々は、本発明に従う少なくとも１つの輸送試薬に結合される。好ましくは、結合体ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーである。別の実施形態において、本発明は、目的の活性薬剤を試験し同定するための、指数付けされた複数のサンプルウェルまたは指数付け可能な複数のサンプルウェルに分配された異なるポリマー試薬結合体の規則的なアレイを包含する。

（ＶＩ．薬学的組成物）
本発明の化合物および組成物は、ヒトの治療および獣医学治療の領域において、特別の有用性を有する。一般的に、投与される投薬量は、ピコモルからマイクロモルの治療組成物をエフェクター部位に送達するために有効である。適切な投薬量および濃度は、治療組成物または薬物、意図される送達部位、および投与の経路のような因子に依存し、これらの全ては、当該分野において周知の方法に従って経験的に導出され得る。さらなる指針は、当該分野で公知であるように、投薬量を評価するための実験動物モデルを使用する研究から得られ得る。

必要に応じての、適切な薬学的賦形剤との本発明の化合物の投与は、任意の受容される投与様式によって実施され得る。従って、投与は、例えば、静脈的、局所的、皮下的、経皮的、筋内的、経口的、関節内的、非経口的、腹腔内的、鼻内的、または吸入によってであり得る。処方物は、固体投薬形態、半固体投薬形態、凍結乾燥粉末投薬形態、または液体投薬形態（例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン、坐剤、停留浣腸、クリーム剤、軟膏、ローション、エーロゾルなど）であり得、好ましくは、正確な投薬量の
単回投与に適切な単位投薬形態である。

組成物は、代表的に、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤を含有し、これは、他の薬効薬剤、キャリア、アジュバント、などをさらに含有し得る。好ましくは、組成物は、約５重量％〜７５重量％の本発明の化合物であり、残りは適切な薬学的賦形剤からなる。適切な賦形剤は、当該分野で周知の方法（例えば、（Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０））によって、特定の組成物および投与経路に調整され得る。

経口投与について、このような賦形剤としては、薬学的等級の、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物などの形態をとり得る。

いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態をとり、従って、組成物は、生物学的に活性な結合体と共に、以下のいずれかを含有し得る：希釈剤（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはその誘導体）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）；および結合剤（例えば、デンプン、アカシアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース、およびこれらの誘導体）。

処方の活性化合物は、坐剤に処方され得、この坐剤は、例えば、約０．５％〜約５０％の本発明の化合物を含み、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）キャリア（例えば、ＰＥＧ１０００［９６％］およびＰＥＧ４０００［４％］）中に配置される。

液体組成物は、化合物（約０．５％〜約２０％）および必要に応じて薬学的アジュバントをキャリア中に溶解するか、または分散することによって調製され得、このアジュバントは、水性生理食塩水（例えば、０．９％ ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどであり、例えば、静脈投与のために溶液または懸濁液を形成する。活性化合物はまた、停留浣腸に処方され得る。

所望ならば、投与される組成物はまた、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝化剤（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタンもしくはオレイン酸トリエタノールアミン）を含み得る。

局所投与について、この組成物は、任意の適切な様式（例えば、ローションまたは経皮パッチ）で投与される。吸入による送達について、この組成物は、乾燥粉末（例えば、吸入治療剤）として、またはネブライザーを介して液体形態で送達され得る。

このような投薬形態を調製する方法は、公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）を参照のこと。いずれにしても、投与される組成物は、ある量のプロドラッグおよび／または活性化合物を、本発明の教示に従って投与される場合に処置される状態の軽減のために薬学的に有効な量で含む。

一般に、本発明の化合物は、治療的有効量（すなわち、処置を行うのに十分な投薬量）で投与され、この量は、個体および処置される状態に依存して変化する。代表的に、治療的に有効な一日の用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の薬物である。ほとんどの状態は、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約３０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間、または７０ｋｇの人について、約７０ｍｇ／日と約２１００ｍｇ／日との間の全投薬量の投与に応答する。

結合体の安定性は、ポリマーの骨格および側鎖の組成および立体化学によってさらに制御され得る。ポリペプチドポリマーについて、Ｄ−異性体は、一般に、内因性プロテアーゼに対して耐性であり、従って、血清および細胞におけるより長い半減期を有する。従って、Ｄ−ポリペプチドポリマーは、より長い作用の持続時間が所望される場合に、適切である。Ｌ−ポリペプチドポリマーは、プロテアーゼに対するその感受性に起因して、より短い半減期を有し、従って、より短い作用効果を与えるように選択される。このことによって、副作用は、副作用が観察されると直ぐに治療をやめることによって、迅速に防がれ得る。Ｄ−残基およびＬ−残基の混合物を含むポリペプチドは、中程度の安定性を有する。ホモ−Ｄ−ポリマーが、一般に好ましい。

以下の実施例は、例示を意図し、本発明を限定することを意図しない。

以下の実施例において、細胞への取込みおよび組織を横切る取込みは、生物学的に活性な薬剤がアルギニン（Ｄ−アルギニンもしくはＬ−アルギニン）およびカルバメートおよびγ−アミノ酸のような骨格を有する輸送試薬に結合されている結合体について証明される。ペプチド輸送試薬は、本発明の結合体の構築のため、および生物学的に活性な薬剤の取込みおよび放出の評価のための適切なモデルとして働いた。

従って、ペプチド輸送試薬を有する結合体の有効性は、関連の非ペプチド輸送試薬結合体についての有効性を示す。

（実施例１）
本実施例は、アミノ酸に基づくいくつかの遊離可能な結合の調製を例示し、この結合は、適切な官能基を有する薬物に結合（および、このような薬物を放出）するように改変され得る。スキーム８（図１６ａ、１６ｂ、１６ｃおよび１６ｄ）は、アミド結合（スキーム８Ａ）、カーボネート結合（スキーム８Ｂ）、カルバメート結合（スキーム８Ｃ）、感光性結合（スキーム８Ｄ）およびホスファターゼ遊離結合（スキーム８Ｅ）を含む結合についての標的系およびモデルを示す。

（モデル系の調製）
Ａｃ−Ｔｙｒ（ＯＡｃ）−ＯＨ（ｘｘｖｉｉｉ）。Ｈ_２Ｏ（６ｍＬ）中の（−）チロシンｘｘｖｉｉ（７００ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ）の激しく撹拌した懸濁液に、０℃で、ＮａＯＨ（ａｑ）（１．０Ｎ、３．８７ｍＬ、３．８７ｍｍｏｌ）を添加した。無水酢酸（０．８０２ｍＬ、８６８ｍｇ、８．５１ｍｍｏｌ）を滴下した。この滴下の間に、１ＮのＮａＯＨ（ａｑ）を、反応ｐＨを６と８との間に維持するように添加した。この添加が完了した後、この反応物を室温まで加温し、そして３５分間撹拌した。次いで、この無色の溶液を、６ＮのＨＣｌ（ａｑ）を用いて、ｐＨ２まで慎重に酸性化した。室温で２分間静置すると、白色の沈殿物が形成した。この固体を濾過し、そしてＨ_２Ｏ（３×）で洗浄して、所望の生成物ｘｘｖｉｉｉ（５８１ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、５７％）を得た。

Ａｃ−Ｔｙｒ（Ｏ_２ＣＯＢｎ）−ＯＨ（ｘｘｉｘ）。ＮａＯＨ（ａｑ）（２Ｎ、７．５９ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ）中の（−）チロシンｘｘｖｉｉ（２．５０ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ_２Ｏ（６ｍＬ）を添加した。この激しく撹拌した溶液を、０℃まで冷却し、そして無水酢酸（３．２５ｍＬ、３．５２ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを介して３０分間かけて添加した。この添加の間、過剰のＮａＯＨ（ａｑ）（２Ｎ、３４．５ｍＬ、６９．０ｍｍｏｌ）を、１０回に分けて添加した。この添加が完了した後、この反応物を室温まで加温し、そして４５分間撹拌した。次いで、この無色の溶液を、６ＮのＨＣｌ（ａｑ）を用いて、ｐＨ２まで慎重に酸性化した。減圧下で濃縮した後、得られた固体を、アセトン中１５％のＨ_２Ｏで抽出した（４×）。濾液を減圧下で濃縮して、わずかに黄色の油状物を得た。Ｈ_２Ｏ（１．５ｍＬ）を添加することによって、Ｎ−アセチルチロシンを白色沈殿物（６７０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ、２２％）として得、これをＨ_２Ｏ（３×）で洗浄した。この洗浄液を、後の沈殿のために保存した。１：１のＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ（１ｍＬ）中のＮ−アセチルチロシン（７２ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ（ａｑ）（１Ｎ、０．３２ｍＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。クロロギ酸ベンジル（４９μＬ、５８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＫ_２ＣＯ_３（ａｑ）（２Ｎ、０．１６ｍＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で７時間撹拌した後、この反応物を、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）に注ぎ入れ、そして６ＮのＨＣｌ（ａｑ）を用いてｐＨ２まで慎重に酸性化した。この生成物を、水層からＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、そして合わせた有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して、所望の生成物ｘｘｉｘを白色の固体として得た（８１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、７５％）。

Ａｃ−Ｔｙｒ（Ｏ_２ＣＮＨＣｙ）−ＯＨ（ｘｘｘ）。ＮａＯＨ（ａｑ）（２Ｎ、７．５９ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ）中の（−）チロシン（２．５０ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ_２Ｏ（６ｍＬ）を添加した。この激しく撹拌した溶液を、０℃まで冷却し、そして無水酢酸（３．２５ｍＬ、３．５２ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを介して３０分間かけて添加した。この添加の間、過剰のＮａＯＨ（ａｑ）（２Ｎ、３４．５ｍＬ、６９．０ｍｍｏｌ）を、１０回に分けて添加した。この添加が完了した後、この反応物を室温まで加温し、そして４５分間撹拌した。次いで、この無色の溶液を、６ＮのＨＣｌ（ａｑ）を用いて、ｐＨ２まで慎重に酸性化した。減圧下で濃縮した後、得られた固体を、アセトン中１５％のＨ_２Ｏで抽出した（４×）。濾液を減圧下で濃縮して、わずかに黄色の油状物を得た。Ｈ_２Ｏ（１．５ｍＬ）を添加することによって、Ｎ−アセチルチロシンを白色沈殿物（６７０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ、２２％）として得、これをＨ_２Ｏ（３×）で洗浄した。この洗浄液を、後の沈殿のために保存した。ＮａＯＨ（ａｑ）（０．５Ｎ、０．６１ｍＬ、０．３１ｍｍｏｌ）中のＮ−アセチルチロシン（７６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ_２ＨＰＯ_４（ａｑ）（１Ｍ、０．６１ｍＬ、０．６１ｍｍｏｌ）を添加した。この激しく撹拌した溶液を、０℃まで冷却し、そしてシクロヘキシルイソシアネート（４８μＬ、４７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をこの反応物に滴下した。添加の間、０．５ＭのＮａＯＨ（ａｑ）（４滴）を添加して、ｐＨをｐＨ８とｐＨ９との間に維持した。この添加が完了した後、この反応物を室温まで加温し、そして３時間撹拌した。白色の沈殿物が形成し、そして得られた懸濁液を、Ｅｔ_２Ｏ（２×）で洗浄した。水層を分離し、そして６ＮのＨＣｌ（ａｑ）を用いてｐＨ２まで慎重に酸性化した。所望の生成物ｘｘｘが、白色固体として沈殿し（８９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、７６％）、これを濾過し、そしてＨ_２Ｏ（３×）で洗浄した。

（実施例２）
本実施例は、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで治療剤に結合され得るペプチド／ペプトイドハイブリッド輸送試薬の調製を例示する。合成は、スキーム９に概説したように行われ得る（図１７を参照のこと）
（モノマー単位の調製）
アルデヒドｘｌｉｉｉ。ＴＨＦ（７ｍＬ）中の３−アミノ−１−プロパノール（０．７５０ｍＬ、７３７ｍｇ、９．８２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（２．３５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）およびＨ_２Ｏ（５ｍＬ）中の炭酸ナトリウム（２．０８ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）の溶液を続けて添加した。２時間激しく撹拌した後、この反応混合物をＥｔＯＡｃに注ぎ入れた。残りの固体を、ＥｔＯＡｃで粉砕し、そして合わせた有機相を、飽和ＮａＨＣＯ_３（ａｑ）で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して、粗製の淡黄色の油状物（１．６６ｇ、９．４９ｍｍｏｌ、９７％の粗製物）を得、これをさらに精製することなく使用した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（７ｍＬ）中のこの粗製アルコール（１．０５ｇ、６．０１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ_２Ｏ（３ｍＬ）中のＫＢｒ（７２２ｍｇ、６．０７ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。ＴＥＭＰＯ（９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの二相混合物を、０℃まで冷却した。１０分間撹拌した後、Ｈ_２Ｏ（９ｍＬ）中ＮａＯＣｌ（０．７Ｍ、９．４４ｍＬ、６．６１ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ_３（１．８４ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）の溶液を、この反応物の内部温度を１０℃未満に維持するようにして、滴下した。１．５時間撹拌した後、追加のＮａＯＣｌ（０．７Ｍ、２．００ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、そしてＴＬＣ分析は、出発物質が、２０分以内に消費されたことを示した。次いで、この反応を、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３（ａｑ）でクエンチし、そしてその生成物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２×）で抽出した。合わせた有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。得られた粗生成物を、カラムクロマトグラフィーで精製して、所望のアルデヒドｘｌｉｉｉ（７９２ｍｇ、４．５８ｍｍｏｌ、７６％）を得た。

Ｈ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＭｅ・ＨＣｌ（ｘｌｉｖ）。無水ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）中のＨ−ＯＲＮ（Ｚ）−ＯＨ（１．００ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、塩化チオニル（１．３７ｍＬ、２．２４ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を、内部反応温度を１０℃未満に維持するようにゆっくりと添加した。この添加が完了した後、冷却浴を取り外し、そして室温で１８時間撹拌し続けた。次いで、この反応物を、減圧下で濃縮して、黄色がかった固体を得た。ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ（１：６）で再結晶して、所望の生成物ｘｌｉｖを白色固体（６００ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）として得た。濾液およびＥｔＯＡｃ洗浄液を、４８時間、−２０℃で冷却して、さらなる生成物ｘｌｉｖ（１７７ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）を得た。これら２つのバッチ（合計７７７ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、６５％）を、さらなる使用のために合わせた。

アルキル化Ｔｒｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＭｅ（ｘｌｖ）。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）と飽和ＮＨ_４ＯＨ（２０ｍＬ）との二相混合物に、固体のＨ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＭｅ・ＨＣｌ（１８４ｍｇ、０．５８２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、固体が溶解するまで、分液漏斗中で振盪した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して、Ｈ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＭｅの遊離アミンを得た。無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中のこのアミン（１４２ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ）の溶液に、４Åのモレキュラーシーブを添加した。この懸濁液に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）中のアルデヒドｘｌｉｉｉ（８４ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。これを２０時間撹拌した後、固体のＮａＣＮＢＨ_３（４８ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を、４５分空けて、２回に分けて添加した。この反応物を１８時間撹拌し、次いでこの混合物を濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃに再溶解し、飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（ａｑ）に注ぎ入れ、そして５％のクエン酸（ａｑ）で洗浄した。次いで、有機層を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して、粗製の油状物を得、これをさらに精製することなく使用した。無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中のこの粗製の２級アミンの溶液に、トリエチルアミン（０．１４９ｍＬ、１０８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）および２，２，２−トリクロロエチルクロロホルメート（０．１０１ｍＬ、１５５ｍｇ、０．７３１ｍｍｏｌ）を続けて添加した。直ぐに白色の沈殿物が形成され、そして１５分間撹拌した後、この反応物を、飽和ＮａＨＣＯ_３（ａｑ）でクエンチした。得られた混合物を、ＥｔＯＡｃに注ぎ入れ、そして有機層を５％のクエン酸（ａｑ）、飽和ＮａＨＣＯ_３（ａｑ）およびブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィーによって、所望の生成物ｘｌｖ（９８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、２工程にわたって３２％）を得た。

カルボン酸（ｘｌｖｉ）。１：１のＴＨＦ:Ｈ_２Ｏ（０．８ｍＬ）中のメチルエステルｘｌｖ（１０ｍｇ、１６μｍｏｌ）の混合物に、ＬｉＯＨ（ａｑ）（１．０Ｍ、１９μＬ、１９μｍｏｌ）を添加した。５時間撹拌した後、この反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ_３（ａｑ）でクエンチした。水層をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、そして合わせた有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。得られた膜（７．０ｍｇ、１２μｍｏｌ、７５％の粗製物）を、さらに精製することなく使用した。

（第２級アミン（ｘｌｖｉｉ））１０％ＨＣｌ（水性）（２．５ｍＬ）中の亜鉛粉（２３０ｍｇ）の混合物を、２分間、激しく攪拌した。濾過後、活性化Ｚｎを、Ｈ_２Ｏ（３×）、およびアセトン（３×）で連続的に洗浄し、高減圧下で乾燥させた。活性Ｚｎ（１９６ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）をＮ_２下で、無水ＴＨＦ（２．０ｍＬ）中のＴｒｏｃカルバメート基質ｘｌｖ（３７ｍｇ、６０μｍｏｌ）の溶液に添加した。リン酸緩衝液（ｐＨ４．８、０．４ｍＬ）を添加し、そしてこの混合物を４５分間激しく攪拌した。沈殿をＴＨＦ（５×）で洗浄し、そして合わせた洗浄物を減圧下で濃縮した。得られた油状物を、ＣＨＣｌ_３中に溶解させ、そして飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（水性）に注いだ。水層をＣＨＣｌ_３（３×）で抽出し、そして合わせた有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィーによって、所望の生成物ｘｌｖｉｉ（１８ｍｇ、４１μｍｏｌ、６８％）を単離した。

スキーム９に概説されるプロセスに従って、モノマー単位ｘｌｖｉおよびｘｌｖｉｉは、標準的なペプチドカップリング手順を使用して連結されて、ｘｌｖｉｉｉを生成する。ｘｌｖｉｉｉを開始物質として使用して工程３、４、および５を繰り返すことによって、ｘｌｉｘが提供される。ｘｌｉｘを輸送試薬ｌに変換することは、ｘｌｉｘをけん化（例えば、ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、および水を用いる）に供し、保護基（Ｔｒｏｃ）を除去し、Ｃｂｚ保護基をＴＦＡ媒介除去し、そして当該分野で公知の方法を使用してペルグアニジニル化することによって達成され得る。

（実施例３）
この実施例は、スキーム１０および１１に概説される、一連のペプチド輸送試薬の調製を説明する（図１８および１９を参照のこと）。

γ−オルニチンモノマーｌｖｉを、スキーム１０に示されるように合成した［Ｓｍｒｅｉｎａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，１２８６７−１２８７４（１９９７）］。γ−オルニチン誘導体ｌｉの、Ｍｅｌｄｒｕｍ酸およびＤＣＣでの処理によって、ｌｉｉが与えられ、これは、ナトリウムアセトキシボロヒドリドでの還元によって、ｌｉｉｉを与えた。化合物ｌｉｉｉは、脱炭酸的閉環を受けて、ラクタムｌｉｖを生じ、これは、塩基性加水分解によってｌｖを与えた。ｌｖのα窒素のＺ脱保護およびＦｍｏｃ保護によって、必要なモノマーｌｖｉが与えられた。

次いで、化合物ｌｖｉを、スキーム１１に示されるように、ペプチド合成機において標準的なペプチドカップリング条件を使用して、固相に結合させ、樹脂結合オリゴマーｌｉｘ〜ｌｘｉを得た。ＴＦＡを使用する樹脂からのこれらの脱保護はまた、Ｂｏｃ基の脱保護を達成して、γオルニチンオリゴマーｌｘｉｉ〜ｌｘｉｖを生じ、これは、ペルグアニジニル化されて、最終のγアルギニンオリゴマーｌｘｖ〜ｌｘｖｉｉを生じた。

（実験セクション）
（Ｒ）−５−［（２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−（Ｂｏｃ）アミノプロピル）−プロピル］−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（ｌｉｉｉ）。２０ｍｍｏｌのＺ−（Ｂｏｃ）Ｏｒｎ−ＯＨを、塩化メチレン（１００ｍｌ）中の２２ｍｍｏｌのＭｅｄｒｕｍ酸および３１ｍｍｏｌのＤＭＡＰを用いて溶解させた。この反応混合物を、−５℃に冷却し、そして５０ｍｌの塩化メチレン中の２２ｍｍｏｌのＤＣＣの溶液を１時間かけて添加した。この混合物を、一晩室温に温めた。次いで、沈殿したＤＣＵを濾過し、そして残りの溶液を、５％ＫＨＳＯ_４で４回、ブラインで１回洗浄し、そして冷蔵庫中で５時間、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。次いで、この溶液を濾過し、−５℃に冷却し、そして１３．３ｍｌの９８％酢酸を添加し、続いて、１．８５ｇのナトリウムボロヒドリドを一部ずつ添加した。この反応混合物を、＜０℃で１０時間攪拌し、次いで、ブラインで３回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下でエバポレートして、粗生成物を得、これを１：１ヘキサン：酢酸エチルを使用して、シリカゲルでカラムクロマトグラフィーによって精製した。

（Ｒ）−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル−２−ピロリジノン（ｌｉｖ）。３１ｍｍｏｌのｌｉｉｉを１００ｍｌのトルエン中で３時間還流させた。溶媒を減圧下でエバポレートして、ｌｉｖを得た。Ｒ_ｆ＝０．５４（ペンタン中６６％ＥｔＯＡｃ；Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ）；

γ−Ｚ−（Ｂｏｃ）Ｏｒｎ−ＯＨ（ｌｖ）。３４ｍｍｏｌのｌｉｖをアセトン（６０ｍｌ）および１Ｍ 水性ＮａＯＨ（９０ｍｌ）中に溶解させた。反応混合物を室温で３０分間室温で攪拌した。アセトンを減圧下で除去し、そして水溶液を６Ｍ ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した。生成物を白色固体として粉砕し、これを濾過によって収集した。^１Ｈ ＮＭＲ

γ−Ｆｍｏｃ−（Ｂｏｃ）Ｏｒｎ−ＯＨ（ｌｖｉ）。１１ｍｍｏｌのｌｖを、ＴＬＣが、開始物質の完全な消費を示すまで、４時間、３００ｍｌのＭｅＯＨ中の１０％Ｐｄ／Ｃ（０．４ｍｏｌ％）で処理し、次いで、溶液を減圧下でエバポレートした。次いで、残りの黄色油状物を、溶液が塩基性になるまで、９％炭酸ナトリウム中に溶解させ、次いで、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２５ｍｌ）中の溶液として添加した。この反応物を、室温で２時間攪拌した。次いで、この反応混合物を、１２Ｍ ＨＣｌで、酸性になるまで酸性化し、そしてＥｔＯＡｃ（３×、１００ｍｌそれぞれ）で抽出した。次いで、合わせた有機物をブラインで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下でエバポレートして黄色固体を得、これを、シリカでのカラムクロマトグラフィーによって精製した。

（実施例４）
この実施例は、グルタルアミド輸送試薬、ならびに関連する尿素誘導体（Ｌ＝Ｃ（Ｏ））；オキサルアミド誘導体（Ｌ＝Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ））；およびスクシンアミド誘導体（Ｌ＝Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ））の調製を示す。

（実施例５）
この実施例は、単糖骨格における輸送試薬の調製を示す（スキーム１２、図２０を参照のこと）。

スキーム１２に示されるように、３−アミノプロパノールは、確立された方法に従って、ベンジル基およびＢｏｃ基で保護されて、ｌｘｉｘを提供し得る。ヒドロキシル基をヨウ素で置換してｌｘｘｉを得ることは、Ｉ_２およびＰＰｈ_３で達成され得る。酸スカベンジャーの存在下での単糖ｌｘｘｉｉのｌｘｘｉでの処理は、ｌｘｘｖｉｉを生じ得、これは、本明細書中に記載される方法に従う脱保護およびグアニジニル化の後に、標的輸送試薬ｌｘｘｉｘを提供する。

関連する輸送試薬（ｌｘｘｖｉ）の調製はまた、スキーム１２に示され、相同な化合物ｌｘｘｉｘを提供する化学と類似の化学を使用する。

（実施例６）
この実施例は、代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）治療剤としてフルオレセインまたはビオチンを使用する一連のカルバメート輸送試薬の調製および評価を示す。各場合において、この合成は、スキーム１３に示されるように、モノマーｌｘｘｘｉｉの調製から始まる（図２１を参照のこと）。

（１Ｓ）−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−１−ヒドロキシメチル−ブチル）−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（ｌｘｘｘｉ）

２０ｍＬのジメトキシエタンを、Ｎ_２下で、乾燥１００ｍＬ丸底に添加した。４．５４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、ｌｘｘｘを、攪拌しながら加えた。この懸濁液を、氷／水／塩浴中で−１５℃に冷却した。十分に懸濁した固体に、１．１１ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン、続いて、１．３６ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）のイソブチルクロロホルメートを添加した。この反応物を１分間激しく攪拌し、次いで、減圧濾過した。濾液を攪拌し、そして２０ｍＬ水中の５７０ｍｇ（１５ｍｍｏｌ）のナトリウムボロヒドリドの溶液をすぐに添加した。２０分後、１５０ｍＬの水を添加し、そしてさらに１時間の後に、得られた白色沈殿を濾過し、水およびヘキサンで洗浄し、次いで、４０℃で３６時間、減圧乾燥して、３．７５ｇ（８．５２ｍｍｏｌ、８５％）を得た；白色固体；ＴＬＣ Ｒｆ（６０％酢酸エチル／ヘキサン）；０．４５ｍｐ：１０７〜１０９℃；ＨＲＭＳ

炭酸５−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ペンチルエステル４−ニトロ−フェニルエステル（ｌｘｘｘｉｉ）

化合物ｌｘｘｘｉ（５．７０５ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ_２下で乾燥２５０ｍＬ丸底フラスコにおいて、６５ｍＬのＴＨＦ中に溶解させた。ピリジン（３．１ｍＬ、３９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、２５ｍＬのＴＨＦ中の５．２３ｇ（２６ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルメートの溶液を添加した。白色沈殿を、すぐに観察した。周囲温度での２時間の攪拌後、開始物質が消費された（ＴＬＣ）。溶媒を約５ｍＬに減圧下で濃縮した。残渣を１００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２にとり、そして１Ｍ ＮａＨＳＯ_４（５×３０ｍＬ）、続いて、１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（３×４０ｍＬ）および２５ｍＬのブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥し、そして減圧で除去して、７．２１１ｇ（１１．９ｍｍｏｌ、９２％）のｌｘｘｘｉｉを白色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ（５０％酢酸エチル／ヘキサン）：０．６０；ｍｐ：１４０〜１４２℃；ＨＲＭＳ（再提出される）。

フルオレセインまたはビオチン結合体のいずれかの調製は、スキーム１４および１５に概説されるように進行する（図２１および２２を参照のこと）。

（ＦＩＴＣ−ａｃａ−Ｏｒｎ^ｃ _ｎ−ＣＯＮＨ_２の合成のための一般的手順）
Ｆｍｏｃ−アミド樹脂（１５９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．６３ｍｍｏｌ／ｇ）を３０分間（３×）、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で処理し、遊離樹脂結合アミンを得、これをＤＭＡ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。樹脂を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のｌｘｘｘｉｉ（１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２．０ｍｍｏｌ）の溶液で、４時間処理し、次いで、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。これらの４つの工程（脱保護、洗浄、結合、洗浄）を繰り返して、所望の長さのオリゴマーを得た。

アミノカプロン酸スペーサーを、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で３０分間脱保護（３×）、続いて、Ｆｍｏｃ−アミノカプロン酸（１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（１．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で、１時間（２×）での処理によって、付けた。次いで、フルオレセイン付加を、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で３０分間脱保護（３×）、およびフルオレセインイソチオシアネート（０．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（７ｍＬ）で１８時間の処理によって達成した。

樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、ジクロロメタン（５×１０ｍＬ）で洗浄した。樹脂からのオリゴマーの切断は、１５ｍＬのプラスチックチューブ中において、１０ｍＬの９５：５ＴＦＡ／トリイソプロピルシランでの処理によって達成された。１２時間後、反応混合物を濾過し、樹脂を１０ｍＬのＴＦＡで洗浄した。減圧での約１．５ｍＬの溶媒への濾液の濃縮、続く、冷エーテルへの滴下によって、黄色沈殿を得た。固体を、遠心分離によってペレット化し、そして液体をデカントした。逆相ＨＰＬＣおよび凍結乾燥によって、所望のオリゴマーが得られた。

６６ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ、４９％）、黄色固体；ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間＝７．８７分；

９３ｍｇ（０．０６１ｍｍｏｌ、５３％）、黄色固体、ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間＝７．５０分；

８１ｍｇ（０．０２８ｍｏｌ、２８％）、黄色固体、ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間＝７．２３分；

Ｆｍｏｃアミド樹脂（１５９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．６３ｍｍｏｌ／ｇ）を、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で３０分間（３×）で処理して、遊離樹脂結合アミンを得、これを、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。樹脂を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のｌｘｘｘｉｉ（１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２．０ｍｍｏｌ）の溶液で４時間、処理し、次いで、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。これらの４つの工程（脱保護、洗浄、結合、洗浄）をさらに７回行い、樹脂結合オクタマーを得た。

アミノカプロン酸スペーサーを、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で３０分間の脱保護（３×）、続いて、Ｆｍｏｃ−アミノカプロン酸（１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（１．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で、１時間（２×）での処理によって、付けた。ビオチニル化を、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で３０分間の脱保護（３×）、およびビオチンｐ−ニトロフェニルエステル（０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（７ｍＬ）で４時間の処理（２×）によって達成した。

樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、ジクロロメタン（５×１０ｍＬ）で洗浄した。樹脂からのオリゴマーの切断は、１５ｍＬのプラスチックチューブ中において、１０ｍＬの９５：５ＴＦＡ／トリイソプロピルシランでの処理によって達成された。１２時間後、反応混合物を濾過し、樹脂を１０ｍＬのＴＦＡで洗浄した。減圧での約１．５ｍＬの溶媒への濾液の濃縮、続く、冷エーテルへの滴下によって、白色沈殿を得た。固体を、遠心分離によってペレット化し、そして液体をデカントした。逆相ＨＰＬＣおよび凍結乾燥によって、所望のオリゴマー、８４ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ、３５％）を白色固体として得た；ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間＝４．８２分；

（ペルグアニジニル化）
脱イオン水（３ｍＬ）中に溶解されたカルバメートアミン（０．０３ｍｍｏｌ）の溶液を、炭酸カリウム（アミン残基当たり５当量）およびピラゾール−１−カルボキサミジン（アミン残基当たり５当量）で処理し、そして４０℃で３６時間加熱した。次いで、粗混合物をＴＦＡ（０．３ｍＬ）で酸性化し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、そして凍結乾燥して、グアニジニル化オリゴマーを得た。

１０ｍｇ（０．００４９ｍｍｏｌ、２６％）、黄色固体、ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間＝８．３５分；

（結果）
図ｌ０ａ〜ｃは、カルバメートトランスポーターのペンタマー、ヘプタマーおよびノナマーについて、これらの対応するＤ−アルギニンペプチドアミドのペンタマー、ヘプタマーおよびノナマーと比較して、約１２．５ｕＭ〜約５０ｕＭの濃度で観察した取り込みを示す一連の３つのヒストグラムを提供する。各トランスポーターは、フルオレセイン部分に共有結合しており、適切な標識を提供し、輸送部分が細胞内に低分子を運ぶ能力を示した。

（実施例７）
本実施例は、シクロスポリンカルバメート輸送試薬結合体の調製を示す（図２３のスキーム１６を参照のこと）。

（放出不可能なシクロスポリンＲｃ８結合体（ｘｃｖｉ））
１８．６ｍｇのシクロスポリン誘導体ｘｃｖをＤＭＦ２８０ｕＬに溶解した。トリエチルアミン（２０ｕＬ）およびＤＭＡＰ（１ｍｇ）を添加し、得られた溶液を３７ｍｇのｘｃｉｖに添加した。この溶液を１６時間攪拌し、水で希釈し、セライトのプラグでろ過し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、白色固体４８ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ、８４％）を得た。

（放出可能なシクロスポリンＲｃ８結合体（ｘｃｖｉｉ））
固体ｘｃｖｉ（６ｍｇ、０．００１９ｍｍｏｌ）に、９６％ギ酸１ｍＬを添加した。この溶液を２４時間攪拌し、水１０ｍＬで希釈し、凍結乾燥させて、粗生成物７ｍｇを得た。

（実施例８）
（ｐＨ放出可能なリンカーを用いた、タキソールと輸送試薬との結合体）
本実施例は、生理学的ｐＨにさらされた際に、トランスポーターから薬物を放出するリンカーによって、薬物に結合されたトランスポーターを有するプロドラッグを合成するための一般的なストラテジーの使用を示す。一般的には、薬物上の適切な部位は、α−クロロアセチル残基を保有するために誘導体化されている。次に、塩素は、保護されていないアミンを有するシステイン残基のチオールと交換されている。

（方法）
タキソール−２’−クロロアセチルの合成
タキソール（８９．５ｍｇ、１０４．９μｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（３．５ｍＬ）に溶解した。この溶液を窒素雰囲気下で０℃に冷却した。α−クロロ酢酸無水物（１９．７ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を添加した後、ＤＩＥＡ（１４．８ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を添加した。この溶液を室温まで温めた。薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）分析によって出発物質が完全に消費されたことが示された後に、溶媒を減圧下で除去し、粗物質を、シリカゲル上フラッシュクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡＣ／Ｈｅｘ ２０％〜５０％）で精製し、所望の物質（９９．８ｍｇ、定量的）を得た。

（トランスポーターに対するタキソールの結合）
Ｎ_２雰囲気下でＤＭＦ（１．０ｍＬ）中に溶解した、結合したシステイン残基を有するトランスポーターに、ＤＩＥＡ（２．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を添加する。タキソール−２’−クロロアセテート（２０．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液を添加する。室温で６時間攪拌を続ける。０．１％ＴＦＡ（１．０ｍＬ）を含む水を添加し、サンプルを凍結させ、溶媒を凍結乾燥した。粗物質をＲＰ−ＨＰＬＣ（溶出液：水／ＭｅＣＮ^＊０．１％ＴＦＡ：８５％〜１５％）によって精製する。

（細胞傷害性アッセイ）
タキソール結合体は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム−ブロミド（ＭＴＴ）色素還元における細胞傷害性について試験可能である。

（実施例９）
（イトラコナゾール−トランスポーター結合体の合成）
本実施例は、トリアゾール構造を含む化合物に対してトランスポーターを結合させるための一般的なストラテジーの１つの適用を提供する。イトラコナゾールのトランスポーターへの結合を用いたスキームは、図８に示される。このスキームにおいて、ＲはＨまたはアルキルであり、ｎは１または２であり、Ｘはハロゲンである。

この反応は、ハロゲン（例えば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）またはメチルエステルを有するアシル基を結合するために、トリアゾール環中の窒素の四級化を利用する。化合物３を、ＨＰＬＣによって単離した。Ｄ_２Ｏ中のプロトンＮＭＲにより、イトラコナゾールおよびトランスポーターのピークが示された。

メチルエステルは、７０％以上の収率で得られた。一方、Ｂｒ−プロピオン酸／エステル対を用いて得られた収率は、４０〜５０％であった。次いで、アシル誘導体を、トランスポーターのアミンと反応させ、結合体を形成させた。あるいは、アミド結合を介して、ハロゲン化アシル基を最初にトランスポーター分子に結合させた後、薬物化合物との反応を行うことも可能である。

（実施例１０）
（ＦＫ５０６結合体の調製）
本実施例は、結合体の調製を記載する。ここで、ＦＫ５０６は、トランスポーターに結合している。２つの異なるリンカーを使用し、２つの異なるリンカーのそれぞれは、生理学的ｐＨ（ｐＨ５．５〜７．５）でＦＫ５０６を放出可能であるが、より酸性のｐＨではさらに長い半減期を有する。これらのスキームは、図９Ａおよび９Ｂ中に図示される。

（リンカー１：６−マレイミドカプロイックヒドラジドトリフルオロアセテート）
ＦＫ５０６（１）（０．ｌｇ、１２４．４ｍｏｌ）、６−マレイミドカプロイックヒドラジドトリフルオロアセテート（２）（０．１２６ｇ、３７３．２ｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒、１Ｌ）の無水メタノール（５ｍＬ）溶液を室温で３６時間攪拌した。反応を薄層クロマトグラフィーでモニターし、出発物質がほとんど完全に消失したのを確認した。［ＴＬＣ溶媒系−ジクロロメタン（９５）：メタノール（５）、Ｒ_ｆ＝０．３］。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解した。有機層を水および１０％炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。ジクロロメタン（９６）：メタノール（４）を溶出液として用いたカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製し、ヒドラゾン３（０．１１６ｇ、９２％）を得た。

上述のヒドラゾン（３）、トランスポーターおよびジイソプロピルエチルアミン（ｌ×）の無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）溶液を窒素下室温で３６時間攪拌し、この時点でＴＬＣは、出発物質のヒドラゾンが完全に消失していることを示す。反応混合物から溶媒をエバポレートし、トリフルオロ酢酸によって緩衝化された水およびアセトニトリルを用いて、残渣を逆相ＨＰＬＣによって精製する。

（リンカー２：２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート）
ＦＫ５０６（１）（０．ｌｇ、１２４．４ｍｏｌ）、２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート（９）（０．０９１ｇ、３７３．２ｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒、１Ｌ）の無水メタノール（５ｍＬ）溶液を、室温で１６時間攪拌した。反応を薄層クロマトグラフィーでモニターし、出発物質がほとんど完全に消失したのを確認した。［ＴＬＣ溶媒系−酢酸エチル、Ｒ_ｆ＝０．５］。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解した。有機層を水および１０％炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。ジクロロメタン（９７）：メタノール（３）を溶出液として用いたカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製し、１０（０．０９１ｇ、７１％）を得た。末端システイン残基を有するトランスポーターに対するヒドラゾン結合体１０の結合は、図９Ｂ中に示されるように、ピリジンチオールの置換を介して達成可能である。

（実施例１１）
本実施例は、ｐＨ感受性連結基を用いた、輸送部分に対するシクロスポリンの結合を示す（図７を参照のこと）。

本実施例において、シクロスポリンは、クロロ酢酸無水物を用いて、クロロアセテートエステルに変換される。次いで、このエステルを、結合したシステイン基を有する輸送試薬を用いて処理し、シクロスポリン結合体を得る。

（実施例１２）
本実施例は、輸送部分に対して活性薬剤を連結させる２つの方法を示す。例示によって、ポリ−Ｄ−Ａｒｇ誘導体に結合したレチノイン酸誘導体を提供するが、他の生物学的薬剤と本発明の輸送部分との間の結合に適用可能である。

（ａ．アルデヒド官能基を有する生物学的薬剤との間の結合）
本実施例は、Ｄ−アルギニンのノナマー（Ｈ_２Ｎ−ｒ_９−ＣＯ_２Ｈ・１０ＴＦＡ）と、全てトランスのレチナールまたは１３−ｃｉｓ−レチナールのいずれかとの結合体の調製を示す。従って、４Åのモレキュラーシーブの存在下、いずれか１つのレチナールとメタノール中Ｈ_２Ｎ−ｒ_９−ＣＯ_２Ｈ・１０ＴＦＡとを室温で４時間縮合させると、レチナールアルデヒドとアミノ末端基との間にＳｃｈｉｆｆ塩基型結合が形成する。結合体の精製は、モレキュラーシーブをろ過し、減圧下でメタノールを除去することによって達成可能である。

（ｂ．ｒ_７−ＣＯＮＨ_２に対するレチノイン酸の接合）
本実施例は、以下の連結基

を用いたレチノイン酸とｒ_７−ＣＯＮＨ_２との間の結合体の調製を示す。

ここで、レチノイン酸は、最初に、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジメチルフェノールのクロロアセテートエステルと合わされ、適切な連結基の結合体を与える。ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび触媒量の４−ジメチルアミノピリジンの存在下、塩化メチレン中のレチノイン酸と連結基の結合体とを組み合わせると、レチノイド誘導体が得られる。このレチノイド誘導体は、次いで、ジイソプロピルエチルアミンの存在下、Ｈ_２ＮＣｙｓ−ｒ_７ＣＯＮＨ_２・８ＴＦＡと縮合可能であり（ＤＭＦ、室温、２時間）、所望の結合された生成物を与える。

（実施例１３）
本実施例は、輸送試薬の片側に対するグアジニウムヘッド基の面の配向を提供するためのスペーサーアミノ酸の使用を示す。

本明細書中に記載される実施例および実施形態は、単に例示の目的のためであり、これらを考慮した種々の改変または変更は、当業者に示唆され、本明細書の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。

図１は、本発明において提供されるグアニジニウム輸送試薬の成分を示す。グアニジニウムのヘッド基、側鎖および骨格成分が、間隔を空けたグアニジニウム輸送試薬の図（例えば、グアニジニウムヘッド基を含むサブユニットが、グアニジニウムヘッド基を含まないサブユニットに連結されている）とともに示されている。 図２は、本発明において使用され得る多数のグアニジニウムヘッド基を示す。 図３は、立体化学、不飽和部位、ヘテロ原子、および環状形態（芳香族基を含む）を有する多数の側鎖部分を示す。 図４は、グアニジニウム輸送試薬を治療剤に結合して結合体を形成するために使用され得る、多数の連結基を示す。 図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、種々の型の連結基を使用する結合基を示す。 図６は、１つの型の薬物−トランスポーター結合体を調製する際に放出可能なリンカーを使用するための一般的手順を示す。ここで、治療剤上の官能基（例えば、−ＯＨまたは−ＮＨ_２）は、クロロ酢酸誘導体へと転換され、そしてシステイン改変トランスポーターで処理される。放出は、示される分子内環化に起因してインビボで生じる。 図７は、図６に概略される方法論を使用する、シクロスポリンＡと、トランスポーター部分との間の化学的結合についての合成スキームを示す。ここで、シクロスポリンＡが、クロロ酢酸無水物で処理されて、対応するクロロ酢酸エステルが生成され、その後、さらなる連結基成分として作動するためにシステインを有するトランスポーター試薬を含むトランスポーター結合体へと転換される。 図８は、トリアゾール環構造を含む薬物にトランスポーターを結合するための一般的ストラテジーを示す。 図９Ａは、別の連結ストラテジーを使用してＦＫ５０６がトランスポーターに結合される、結合体を調製するための合成スキームを示す。 図９Ｂは、別の連結ストラテジーを使用してＦＫ５０６がトランスポーターに結合される、結合体を調製するための合成スキームを示す。 図１０Ａは、カルバメート輸送試薬とポリＡｒｇ輸送試薬との間のヒストグラムの比較を提供する。 図１０Ｂは、カルバメート輸送試薬とポリＡｒｇ輸送試薬との間のヒストグラムの比較を提供する。 図１０Ｃは、カルバメート輸送試薬とポリＡｒｇ輸送試薬との間のヒストグラムの比較を提供する。 図１１は、カルバメート骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム１および２を提供する。合成は固体支持体上で達成され得、アミノカプロン酸（ａｃａ）が、生物学的薬剤（ＦＩＴＣ）に対する連結基として使用される。 図１２は、ペプチド骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム３および４を提供する。合成は固体支持体上で達成され得、アミノカプロン酸（ａｃａ）が、生物学的薬剤（ＦＩＴＣ）に対する連結基として使用される。 図１３は、グルタルアミド骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム５を提供する。合成は、生物学的薬剤（ＦＩＴＣ）に対する連結基としてアミノカプロン酸（ａｃａ）を含む溶液中で達成され得る。 図１４は、図１３に示すグルタルアミド骨格に関連する骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム６を提供する。これらの骨格誘導体は、「尿素」、「オキサルアミド」、および「スクシンイミド」と称される。合成は溶液中で達成され得、チオ尿素連結を通じたＦＩＴＣの結合によって示される。 図１５は、ポリアミン骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム７を提供する。合成は、生物学的薬剤（薬物）に対する連結基としてアミノカプロン酸を含む溶液中で達成され得る。 図１６Ａは、アミド結合の使用（８Ａ）およびホスファターゼ反応性結合（８Ｅ）を示すスキーム８を提供する。 図１６Ｂは、カルボネート結合の使用（８Ｂ）およびホスファターゼ反応性結合（８Ｅ）を示すスキーム８を提供する。 図１６Ｃは、カルバメート結合の使用（８Ｃ）およびホスファターゼ反応性結合（８Ｅ）を示すスキーム８を提供する。 図１６Ｄは、光変性結合（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ ｌｉｎｋａｇｅ）の使用（８Ｄ）をおよびホスファターゼ反応性結合（８Ｅ）を示すスキーム８を提供する。 図１７は、ペプチド／ペプトイドハイブリッド骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム９を提供する。生物学的薬剤の連結は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで達成され得る。 図１８は、ペプチド骨格を有する輸送試薬の合成のための、保護されたモノマー単位の調製を示すスキーム１０を提供する。 図１９は、スキーム１０における保護されたモノマー単位から出発したペプチド骨格を有する輸送試薬の固相調製を示すスキーム１１を提供する。 図２０は、単糖骨格を有する輸送試薬の調製を示すスキーム１２を提供する。 図２１は、それぞれ、カルバメート骨格を有する輸送試薬の合成のための保護されたモノマー単位の調製、およびスキーム１３における保護されたモノマー単位から出発したカルバメートを有する輸送試薬の固相調製を示すスキーム１３および１４を提供する。 図２２は、ビオチン−トランスポーター結合体の固相合成および液相合成を示すスキーム１５を提供する。ここで、トランスポーターは、カルバメート骨格を有する。 図２３は、シクロスポリン−トランスポーター結合体の固相合成および液相合成を示すスキーム１６を提供する。ここで、トランスポーターは、カルバメート骨格を有する。

Claims (34)

1. 式：
   

   

   を有する化合物であって、ここで、
   下付文字ｍは、６〜２５の整数であり；
   Ｔは、保護されているかまたは保護されていない第一の末端官能基、保護されているかまたは保護されていない連結基、および結合した治療剤を有する連結基からなる群より選択されるメンバーであり；
   Ｗは、保護されているかまたは保護されていない第二の末端官能基、保護されているかまたは保護されていない連結基、および結合した治療剤を有する連結基からなる群より選択されるメンバーであるが、但し、ＴおよびＷは、結合した治療剤を同時には含まない；
   各Ｘ^ｉは、骨格サブユニットであり、ここで、上付文字ｉは、１〜ｍまでの整数であり、Ｗの下流の位置を示す；
   各Ｙ^ｉは、下付文字ｎが０である場合、Ｈ、アミノ酸側鎖、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択されるか、または下付文字ｎが１である場合、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）ヘテロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_８）シクロアルキルアルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）スピロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択され；
   各Ｚ^ｉは、以下：
   

   

   からなる群より選択されるグアニジニウム部分であり、ここで、
   波線は、Ｙ^ｉへの結合点を示し；そして
   下付文字ｎは、０、１または２であり、各ｉ位置での１つまたは２つのＺグアニジニウム部分の非存在または存在を示し；
   但し、該化合物は、同じであっても異なってもよい少なくとも４つのグアニジニウム部分を有し、そしてＷおよびＴを連結する該化合物の部分は、ポリペプチド以外である、
   化合物。
2. 請求項１に記載の化合物であって、ここで、各Ｘ^ｉは、以下：
   

   

   からなる群より独立して選択され、ここで、
   各Ｒは、Ｈおよびアミノ酸側鎖からなる群より選択されるメンバーであり；そして
   星付の波線は、Ｙ^ｉへの結合点を示し、残りの波線は、前記骨格に沿った結点を示す、
   化合物。
3. 請求項２に記載の化合物であって、各Ｘ^ｉは、以下：
   

   

   からなる群より選択され、ここで、
   各Ｒは、ＨおよびＣＨ_３からなる群より選択される、化合物。
4. 請求項３に記載の化合物であって、各Ｚ^ｉは、以下：
   

   

   からなる群より選択される、化合物。
5. 請求項４に記載の化合物であって、Ｚ^ｉに結合した各Ｙ^ｉが、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２〜Ｃ_８）ヘテロアルキレン、（Ｃ_３〜Ｃ_８）シクロアルキルアルキレン、アリーレンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、化合物。
6. 請求項５に記載の化合物であって、Ｚ^ｉに結合した各Ｙ^ｉが、非分枝の（Ｃ_３〜Ｃ_７）アルキレンである、化合物。
7. 請求項６に記載の化合物であって、Ｚ^ｉに結合した各Ｙ^ｉが、（Ｃ_４〜Ｃ_６）アルキレンであり、そして各Ｚ^ｉが、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ_２）−ＮＨ_２である、化合物。
8. 請求項７に記載の化合物であって、各奇数の整数ｉについて、ｎは０であり、そして各偶数の整数ｉについて、ｎは１である、化合物。
9. 請求項７に記載の化合物であって、ｍは、１２〜２５の整数であり、但し、該化合物は、同じであっても異なってもよい、６〜８個のグアニジニウム部分を有する、化合物。
10. カルバメート骨格を有する、請求項１に記載の化合物。
11. ５〜１５個のグアニジニウム頭部基を有する、請求項１０に記載の化合物。
12. ５〜９個のグアニジニウム頭部基を有する、請求項１０に記載の化合物。
13. グルタルアミド骨格を有する、請求項１に記載の化合物。
14. ５〜１５個のグアニジニウム頭部基を有する、請求項１３に記載の化合物。
15. ポリアミン骨格を有する、請求項１に記載の化合物。
16. ５〜１５個のグアニジニウム頭部基を有する、請求項１５に記載の化合物。
17. γ−ペプチド骨格を有する、請求項１に記載の化合物。
18. ５〜１５個のグアニジニウム頭部基を有する、請求項１７に記載の化合物。
19. 請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｗは、結合した生物学的に活性な薬剤を有する連結基を有し、そして以下の式：
    

    

    を有し、ここで：
    Ｒ^１は、生物学的に活性な薬剤であり；
    Ｘは、該生物学的に活性な薬剤上の官能基と、Ｒ^１と輸送試薬との間の該連結基上の官能基との間の連結であり；
    Ｙは、該化合物の残部にＷを結合させる官能基であり；
    Ａは、ＮまたはＣＨであり；
    Ｒ^２は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；
    ｋおよびｍは、独立して、１または２のいずれかであり；そして
    ｎは、１〜１０の整数である、
    化合物。
20. 請求項１９に記載の化合物であって、ここで、Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）およびＣ（Ｏ）ＮＨからなる群より選択される、化合物。
21. 請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｗは、結合した生物学的に活性な薬剤を有する連結基であり、そして以下の式：
    

    

    を有し、ここで：
    Ｒ^１は、前記生物学的に活性な化合物であり；
    Ｘは、該生物学的に活性な薬剤上の官能基と、Ｒ^１と該輸送試薬との間の該連結基上の官能基との間の連結であり；
    Ｙは、該化合物の残部にＷを結合させる官能基であり；
    Ｒ^４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ^６またはＣＲ^７Ｒ^８であり；
    Ｒ^５は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ^６であり；
    Ｒ^６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；
    Ｒ^７およびＲ^８は、独立して、水素、アルキルまたはアリールアルキルであり；そして
    ｋおよびｍは、独立して、１または２のいずれかである、
    化合物。
22. 請求項２１に記載の化合物であって、ここで、Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）およびＣ（Ｏ）ＮＨからなる群より選択される、化合物。
23. 請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｗは、結合した生物学的に活性な薬剤を有する連結基であり、そして以下の式：
    

    

    を有し、ここで：
    Ｒ^１は、前記生物学的に活性な化合物であり；
    Ｘは、該生物学的に活性な薬剤上の官能基と、Ｒ^１と該輸送試薬との間の該連結基上の官能基との間の連結であり；
    Ｙは、該化合物の残部にＷを結合させる官能基であり；
    Ｒ^５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ^６であり；
    Ｒ^６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；そして
    ｋは、１または２である、
    化合物。
24. 請求項２３に記載の化合物であって、Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）およびＣ（Ｏ）ＮＨからなる群より選択される、化合物。
25. 請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｗは、結合した生物学的に活性な薬剤を有する連結基であり、そして以下の式：
    

    

    を有し、ここで：
    Ｒ^１は、前記生物学的に活性な化合物であり；
    Ｘは、該生物学的に活性な薬剤上の官能基と、Ｒ^１と該輸送試薬との間の該連結基上の官能基との間の連結であり；
    Ｙは、該化合物の残部にＷを結合させる官能基であり；
    Ａｒは、置換または非置換のアリール基であり、ここで、前記メチレンおよび酸素置換基が、互いにオルトまたはパラのいずれかであり；
    Ｒ^４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ^６またはＣＲ^７Ｒ^８であり；
    Ｒ^５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＮＨＲ^６またはＮＨＲ^６であり；
    Ｒ^６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；
    Ｒ^７およびＲ^８は、独立して、水素またはアルキルであり；そして
    ｋおよびｍは、独立して、１または２のいずれかである、
    化合物。
26. 請求項２５に記載の化合物であって、ここで、Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）およびＣ（Ｏ）ＮＨからなる群より選択される、化合物。
27. 生物学的膜を横切る、選択された化合物の輸送を増強するための方法であって、該方法は、以下：
    生物学的膜を、輸送試薬に共有結合した生物学的に活性な薬剤を含む結合体と接触させる工程、
    を包含し、ここで、
    ポリマーは、６〜２５個のサブユニットからなり、その少なくとも５０％が、グアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を含み、そして
    それによって、該接触させる工程は、非結合体化形態における該生物学的薬剤の膜貫通輸送速度よりも大きい速度で、該生物学的膜を横切る該結合体の輸送を促進するのに有効である、方法。
28. 請求項２７に記載の方法であって、ここで、各グアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分は、１〜３個の非グアニジノサブユニットまたは非アミジノサブユニットだけ、別のこのような部分から分離されている、方法。
29. 生物学的膜を横切る、選択された生物学的薬剤の輸送を増強するための方法であって、該方法は、以下：
    生物学的膜を、請求項１に記載の化合物と接触させる工程、を包含し、ここで、ＷまたはＴの１つは、輸送試薬に共有結合した該生物学的薬剤を構成し、
    それによって、該接触させる工程は、非結合体化形態における該生物学的薬剤の膜貫通輸送速度よりも大きい速度で、該生物学的膜を横切る該結合体の輸送を促進するのに有効である、方法。
30. 請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記生物学的薬剤が、診断剤、抗癌剤、抗菌剤、抗炎症剤および抗真菌剤からなる群より選択される、方法。
31. 前記薬剤が、診断剤である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記薬剤が、抗癌剤である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記薬剤が、抗菌剤である、請求項３０に記載の方法。
34. 前記薬剤が、抗炎症剤である、請求項３０に記載の方法。

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