ES2275275T3

ES2275275T3 - Productos resistentes a herbicidas diseñados sobre la base de la estructura.

Info

Publication number: ES2275275T3
Application number: ES96913160T
Authority: ES
Inventors: Genichi Kakefuda; Karl-Heinz Ott; Jae-Gyu Kwagh; Gerald W. Stockton
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2016-04-19
Also published as: EP0821729A4; US6855533B2; BR9604993B1; NZ307012A; CZ331797A3; US20060156427A1; PL186091B1; JP2007159577A; BR9604993A; NO326115B1; EP0821729B1; JPH11504213A; DE69636637T2; WO1996033270A1; CA2218526A1; DE69636637D1; EP0821729A1; AU5575896A; US6576455B1; DK0821729T3

Abstract

EN LA PRESENTE SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS DE DISEÑO BASADO EN LA ESTRUCTURA PARA LA PREPARACION DE VARIANTES DE ACETOHIDROXIACIDO SINTASA (AHAS), INCLUYENDO LOS QUE MUESTRAN UNA RESISTENCIA AUMENTADA DE FORMA SELECTIVA A HERBICIDAS, TALES COMO HERBICIDAS DE IMIDAZOLINA Y HERBICIDAS QUE INHIBEN LA AHAS. LA INVENCION INCLUYE ADN AISLADOS QUE CODIFICAN PARA TALES VARIANTES, VECTORES QUE INCLUYEN LOS ADN Y PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR LOS POLIPEPTIDOS VARIANTES Y LAS PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDAS QUE CONTIENEN LAS MUTACIONES DEL GEN AHAS ESPECIFICAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA EL CONTROL DE MALAS HIERBAS EN CULTIVOS.

Description

Productos resistentes a herbicidas diseñados sobre la base de la estructura.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al modelado y el diseño basados en la estructura de variantes de la acetohidroxiácido sintasa (AHAS) que son resistentes a las imidazolinonas y otros herbicidas, a AHAS que inhiben herbicidas, a las propias variantes de AHAS, a DNAs que codifican estas variantes, a plantas que expresan estas variantes y a procedimientos de gestión de malas hierbas.

Antecedentes de la invención

La acetohidroxiácido sintasa (AHAS) es una enzima que cataliza la etapa inicial de la biosíntesis de isoleucina, leucina y valina en bacterias, levaduras y plantas. Por ejemplo, la AHAS madura de Zea Mays es una proteína de aproximadamente 599 aminoácidos que está localizada en el cloroplasto (véase la Fig. 1). La enzima utiliza pirofosfato de tiamina (TPP) y dinucleótido de flavina adenina (FAD) como cofactores y piruvato como sustrato para formar acetolactato. La enzima cataliza también la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato. La AHAS también es conocida como acetolactato sintasa o acetolactato piruvato liasa (que carboxila), y se designa EC 4.1.3.18. Probablemente, la enzima activa es como mínimo un homodímero. Ibdah y otros (Protein Science, 3:479-S, 1994), en un resumen, describen un modelo del sitio activo de AHAS.

Una variedad de herbicidas, entre las que están incluidos compuestos de imidazolinona tales como imazetapir (PURSUIT®, American Cyanamid Company-Wayne, NJ), compuestos basados en sulfonilurea tales como sulfometuronmetilo (OUST® - E.I. du Pont de Nemours and Company-Wilmington, DE), triazolopirimidin sulfonamidas (Broadstrike^{MC} - Dow Elanco; véase Gerwick y otros, Pestic. Sci. 29:357-364, 1990), sulfamoilureas (Rodaway y otros, Mechanisms of Selectivity of Ac 322.140 in Pady Rice, Wheat and Barley, Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 1993), ácidos pirimidiloxibenzoicos (STABLE® - Kumiai Chemical Industry Company, E.I. du Pont de Nemours and Company; véase The Pesticide Manual, 10ª ed., págs. 888-889, Clive Tomlin, Ed., British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49, Reino Unido), y sulfonilcarboxamidas (Alvarado y otros, patente U.S. nº. 4.883.914) actúan inhibiendo la actividad enzimática de AHAS. (véanse Chaleff y otros, Science 224:1443, 1984); LaRossa y otros, J. Biol. Chem. 259:8753, 1984; Ray, Plant Physiol. 75:827, 11984; Shaner y otros, Plant Physiol. 76:545, 1984). Estos herbicidas son muy efectivos y ambientalmente benignos. Sin embargo, su uso en agricultura es limitado por no tener selectividad, puesto que los cultivos, y también las indeseadas malas hierbas, son sensibles a los efectos fitotóxicos de estos herbicidas.

Bedbrook y otros, patentes U.S. nº. 5.013.659, nº. 5.141.870 y nº. 5.378.824 describen varias variantes de AHAS resistentes a sulfonilurea. Sin embargo, estas variantes se obtuvieron por mutagénesis de plantas, semillas o células y seleccionando mutantes resistentes a herbicidas, o derivaron de tales mutantes. Este enfoque es impredecible en cuanto a que se basa (al menos inicialmente) en la introducción al azar de una mutación relevante, y no en un criterio de diseño racional basado en un modelo estructural de la proteína diana.

Hay así necesidad en la técnica de procedimientos y composiciones que proporcionan un espectro selectivo amplio y/o una resistencia específica a herbicidas en cultivos. Los autores de la presente invención han descubierto que se pueden preparar formas variantes de AHAS resistentes selectivamente a herbicidas y plantas que contienen las mismas, mediante modelado basado en la estructura de AHAS contra la piruvato oxidasa (POX), identificando la bolsa o las bolsas que se unen al herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en el modelo de AHAS y diseñando mutaciones específicas que alteran la afinidad del herbicida basado en imidazolinona o sulfonilurea para la bolsa de unión. Estas variantes y plantas no son inhibidas o matadas por herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea y retienen una actividad enzimática de la AHAS suficiente para soportar el crecimiento de los cultivos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración de una secuencia de 600 aminoácidos que corresponde a la secuencia de aproximadamente 599 aminoácidos de la acetohidroxi sintasa (AHAS) de Zea Mays que se da como ejemplo de una enzima AHAS de una planta. La secuencia no incluye una secuencia de tránsito y la glicina extra es un vestigio de un sitio de escisión de trombina. Los restos Met53, Arg128 y Phe115 se representan en negritas.

La Figura 2 es una ilustración del alineamiento de la secuencia de AHAS de maíz y piruvatooxidasa (POX) de Lactobacillus planarum.

La Figura 3 es una representación esquemática de la estructura secundaria de una subunidad de AHAS. Los elementos estructurales secundarios, hélices \alpha y hojas \beta se representan como círculos y elipses, respectivamente, y están numerados separadamente para cada uno de los tres dominios dentro de una subunidad. Los lazos y las regiones enrolladas se representan con líneas negras, representando los números los comienzos y las terminales aproximados de los elementos. Las localizaciones de los sitios cofactores de unión y los sitios de mutación conocidos se indican por octaedros y estrellas, respectivamente.

La Figura 4 es una ilustración de un modelo generado con ordenador del sitio selectivo de AHAS de maíz con imazetapir (herbicida PURSUIT®) modelado en la bolsa de unión.

La Figura 5 es una ilustración de la homología entre secuencias de aminoácidos de AHAS derivadas de diferentes especies de plantas. PAC751 es isozima de AHAS als 2 de maíz según se expresa del vector de expresión pAC 751 de E. coli según la Figura 1; als 2 de maíz es la isozima de AHSA als 2 de maíz; als 1 de maíz es la isozima de AHAS als 1 de maíz; Tobac 1 es la isozima SuRA de AHAS de tabaco; Tobac 2 es la isozima SuRB de AHAS de tabaco; Athcar 12 es el gen Csr 1.2 de AHS de Arabidoposis thaliana; Bnaal 3 es la isozima de AHAS de Brassica napus; y Bnaal2 es la isozima de AHAS de Brassica napus.

PAC 751 y als 2 de maíz son genes idénticos excepto que als 2 de maíz empieza al comienzo de la secuencia de tránsito y pAC 751 empieza en el sitio N-terminal putativo maduro con una glicina adicional en el terminal N debido a la secuencia de reconocimiento en el vector de expresión pGEX-2T. La glicina de la terminal N no es un aminoácido natural en esa posición.

Los alineamientos de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de AHAS se generaron por PILEUP (paquete de GCG - Genetics Computer Group, Inc., -University Research Park - Madison-WI). La secuencia de consenso se generó por empaquetamiento PRETTY GCG.

La Figura 6 es una ilustración fotográfica de un gel de SDS-poliacrilamida teñida para proteína que muestra la purificación de AHAS de maíz. Los carriles contienen (de izquierda a derecha): A, marcadores del peso molecular; B, extracto en bruto de células de E. coli; C, preparación purificada por afinidad de glutationa-agarosa; D, digestión de trombina de la preparación purificada por afinidad; E, segunda pasada a través de la columna de glutationa-agarosa y filtración de gel de Sefacril S-100.

La Figura 7 es una ilustración gráfica de los resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de las proteínas de AHAS de tipo salvaje y mutantes en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir (herbicida PURSUIT®). El eje Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de inhibidor.

La Figura 8 es una ilustración gráfica de los resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de las proteínas de AHAS de tipo salvaje y mutantes en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de sulfometironmetilo (herbicida OUST®). El eje Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de inhibidor.

La Figura 9 es una ilustración gráfica de los resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de la proteína de AHAS de Arabidopsis de tipo salvaje y la proteína Met124Ile mutante de AHAS mutante de Arabidopsis en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir (herbicida PURSUIT®) y sulfometironmetilo (herbicida OUST). El eje Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de inhibidor.

La Figura 10 es una ilustración gráfica de los resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de la proteína de AHAS de Arabidopsis de tipo salvaje y la proteína Met124Ile de AHAS mutante de Arabidopsis en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir (herbicida PURSUIT®) y sulfometuronmetilo (herbicida OUST®). El eje Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de inhibidor.

La Figura 11 es una ilustración gráfica de los resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de la proteína de AHAS de Arabidopsis de tipo salvaje y la proteína Arg199Glu de AHAS mutante de Arabidopsis en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir (herbicida PURSUIT®) y sulfometuronmetilo (herbicida OUST®).. El eje Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de inhibidor.

La Figura 12 es una ilustración gráfica de un vector de DNA usado para transformación de plantas, que contiene el gen nptII (que codifica la resistencia a la canamicina) bajo el control del promotor 35S y un gen de AHAS (de tipo salvaje o variante) bajo el control del promotor de AHAS de Arabidopsis.

La Figura 13 es una fotografía que ilustra el desarrollo de la raíz de plantas de tabaco transformadas con el gen de AHAS de Arabidopsis que contiene la mutación de Met124Ile o Arg19Glu y un control no transformado. Las plantas crecieron durante 18 días después de su paso a un medio que contenía imazetapir 0,25 \muM.

La Figura 14 es una fotografía que presenta plantas de tabaco transformadas con el gen de AHAS de Arabidopsis que contiene la mutación de Met124Ile, Met124His o Arg199Glu y un control no transformado, sobre las que se había proyectado dos veces la cuantía del campo (100 g/ha) de imazetapir.

La Figura 15 es una fotografía que muestra los resultados de ensayos de germinación realizados en presencia del herbicida CL 299.263 (imazamox), que se realizaron sobre semillas cosechadas de transformantes da plantas de tabaco primarias que se habían transformado con el gen de AHAS de Arabidoposis que contiene la mutación Met124Ile, Met 124His o Arg199Glu.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento de modelado basado en la estructura para la producción de proteína variante de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea: El procedimiento incluye:

(a): alinear una proteína de AHAS diana sobre un molde de piruvato oxidasa para derivar la estructura tridimensional de la proteína de AHAS diana;

(b): modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en la proteína de la AHAS diana;

(c): seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la bolsa de unión;

(d): mutar DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición; y

(e): expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mutación en la posición.

El procedimiento puede incluir además:

(f): expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;

(g): purificar las proteínas de AHAS de tipo salvaje y de la variante de las células;

(h): ensayar las proteínas de AHAS de tipo salvaje y la variante en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato en ausencia y presencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea;

(i): repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene

(i): en ausencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea,

(a): una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o

(b): una actividad catalítica en combinación con una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;

: en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

(ii): una actividad catalítica que es más resistente al mencionado herbicida basado en imidazolina y/o sulfonilurea que la HAAS de tipo salvaje.

También se proporciona un procedimiento alternativo de modelado basado en la estructura para la producción de una proteína variante resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea. Este procedimiento
incluye:

(a): alinear una proteína de AHAS diana en un primer molde de AHAS derivado de un polipéptido que tiene la secuencia de la Figura 1 o un equivalente funcional de él para derivar la estructura tridimensional de la proteína de AHAS diana;

(b): modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolina y/o sulfonilurea en la proteína de AHAS diana;

(c): seleccionar como diana para una mutación, al menos una posición del aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la bolsa de unión;

(d): mutar el DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición, y

Este procedimiento puede incluir además:

(g): purificar la proteínas de AHAS de tipo salvaje y la variante de las células;

(h): ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje y la variante en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato en ausencia y presencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea;

(i): repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica la variante de AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una primera proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene

(i): en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea

(b): una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;

: en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

(ii): una actividad catalítica que es más resistente a al menos el mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.

En otra realización alternativa, el procedimiento incluye

(a): alinear una proteína de AHAS diana en un primer molde de AHAS que tiene una bolsa identificada de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y que tiene la secuencia de la Figura 1 o un equivalente funcional de ella para derivar la estructura tridimensional de la proteína de AHAS diana;

(b): seleccionar como diana para una mutación, al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la bolsa de unión;

(c): mutar el DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición, y

(d): expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mutación en la posición.

El procedimiento puede incluir además:

(e): expresar DNA que codifica la proteína de AHAS diana de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;

(f): purificar la proteína de AHAS de tipo salvaje y la variante de las células;

(g): ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje y la variante en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y en presencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, y

(h): repetir las etapas (b)-(g), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (d) se usa como el DNA que codifica la AHAS en la etapa (b) hasta que se identifica una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene

(i): en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea,

: en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

(ii): una actividad catalítica que es más resistente a al menos el herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.

En realizaciones preferentes de los procedimientos mencionados, la actividad catalítica en ausencia del herbicida es como mínimo de aproximadamente 5% y, muy preferiblemente, es de más de aproximadamente 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje. Cuando el herbicida es un herbicida de imidazolinona, la proteína variante de AHAS resistente al herbicida tiene, preferiblemente:

(i): una actividad catalítica en ausencia del herbicida de más de aproximadamente 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje;

(ii): una actividad catalítica que es relativamente más resistente a la presencia de herbicidas de imidazolinona en comparación con AHAS de tipo salvaje, y

(iii): una actividad catalítica que es relativamente más sensible a la presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con herbicidas de imidazolinona.

La presente invención proporciona además DNA aislado que codifica proteínas variantes de acetohidroxiácido sintasa, proteínas variantes que comprenden una proteína de AHAS modificada por

(i) sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente de un resto de aminoácido de la secuencia de la Figura 1 seleccionado entre M53, R128, F135 y cualquier combinación de cualquier de los anteriores.

En este sistema de numeración el resto nº. 12 corresponde al término amino putativo de la proteína madura, esto es, después de la eliminación de un péptido que apunta la diana de cloroplasto.

Las modificaciones anteriores están dirigidas a alterar la capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para inhibir la actividad enzimática de la proteína. En una realización preferente, el DNA aislado codifica una variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfinilurea. También se proporcionan vectores de DNA que comprenden DNA que codifica estas variantes de AHAS, las propias proteínas de AHAS variantes, y células, crecidas in vivo o en cultivos de células, que expresan las variantes de AHAS o comprenden estos vectores.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para conferir resistencia a un herbicida basado en imidazolinona y/ sulfonilurea en una célula o en unas células y, en particular, una célula o unas células de plantas, como puede ser en una semilla. Se muta un gen de AHAS, preferiblemente el gen de AHAS de Arabidopsis thaliana, para alterar la capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea de inhibir la actividad enzimática de la AHAS. El gen mutante se clona en un vector de expresión compatible y el gen se transfiere a una célula sensible a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en condiciones bajo las cuales se expresa a niveles suficientes para conferir a la célula resistencia a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea.

También se contemplan procedimientos para el control de malas hierbas, en los que se trata un cultivo que contiene un gen de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea de acuerdo con la presente invención, con una cantidad efectiva del herbicida para controlar las malas hierbas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención abarca el diseño racional o el modelado molecular basado en la estructura de versiones modificadas de la enzima AHAS y AHAS que inhiben herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. Estas enzimas modificadas (proteínas variantes de AHAS) son resistentes a la acción de herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. La presente invención abarca también DNAs que codifican estas variantes, vectores que incluyen estos DNAs, las proteínas variantes de AHAS y células que expresan estas variantes. Adicionalmente se proporcionan procedimientos para producir resistencia a herbicidas basados en imidazolidinona y/o sulfonilurea en plantas por expresión de estas variantes y procedimientos de control de las malas hierbas. El DNA y las variantes de AHAS de la presente invención se descubrieron en estudios basados en el modelado molecular de la estructura de las AHAS.

Diseño racional basado en la estructura de variantes de AHAS y AHAS que inhiben herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea

Las variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea de acuerdo con la presente invención son útiles por conferir resistencia a herbicidas basados en imidazolinina y/o sulfonilurea en plantas y se pueden diseñar con el modelo de POX.

1. Modelado molecular

Las técnicas de modelado molecular (y en particular, el modelado de homología de proteínas) pueden proporcionar una comprensión de la estructura y la actividad de una proteína dada. El modelo estructural de una proteína se puede determinar directamente a partir de datos experimentales tales como cristalografía de rayos X, indirectamente por modelado de la homología o una característica similar, o mediante combinación de ambos procedimientos (véase White y otros, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23:349, 1994). La elucidación de la estructura tridimensional de AHAS proporciona una base para el desarrollo de un esquema racional de la mutación de restos de aminoácidos particulares dentro de la AHAS que confieren al polipéptido resistencia a los herbicidas.

El modelado molecular de la estructura de AHAS de Zea Mays, usando como molde la estructura cristalina obtenida por rayos X de la piruvato oxidasa (POX) afín de Lactobacillus plantarum proporciona un modelo tridimensional de la estructura de AHAS que es útil para el diseño de variantes de AHAS resistentes a herbicidas o AHAS que inhiben herbicidas. Este procedimiento de modelado aprovecha el hecho de que AHAS y POX comparten varias características bioquímicas y que pueden derivarse de un gen ancestral común (Chang y otros, J. Bacteriol. 170:3937, 1988).

Se describe detalladamente más adelante la derivación de un modelo usando gráficos y alineamientos moleculares interactivos. La estructura tridimensional de AHAS que resulta de este procedimiento predice la organización espacial aproximada del sitio activo de la enzima y del sitio o bolsa de unión de inhibidores tales como herbicidas, entre los que están incluidos los herbicidas de imidazolinona, aunque no únicamente. El modelo se afina luego y se reinterpreta basándose en estudios bioquímicos que también se describen más adelante.

El modelado de la homología de proteínas requiere el alineamiento de la secuencia primaria de la proteína en estudio con una segunda proteína cuya estructura cristalina es conocida. Para el modelado de la homología de AHAS se escogió la piruvato oxidasa (POX) porque la POX y la AHAS comparten varias características bioquímicas. Por ejemplo, ambas, AHAS y POX, comparten aspectos de los mecanismos de la reacción enzimática, así como requerimientos en cuanto a cofactor y metal. En ambas enzimas, para la actividad enzimática se requieren pirofosfato de tiamina (TPP), dinucleótido de flavina adenina (FAD) y un catión divalente. El FAD media una reacción rédox durante la catálisis en la POX pero, presumiblemente, tiene sólo una función estructural en la AHAS, que posiblemente es resto vestigio de la evolución de la evolución de AHAS desde POX. Ambas enzimas utilizan piruvato como sustrato y forman pirofosfato de hidroxietiltiamina como intermedio de reacción estable (Schloss, J.V. y otros, en Biosynthesis of branched chain amino acids, Barak, Z.J.M., Chipman, D.M., Schloss, J.V. (eds.) VCH Publishers, Weinheim, Alemania, 1999).

Adicionalmente, la actividad de AHAS está presente en proteínas quiméricas de POX-AHAS que constan de la mitad N-terminal de POX y la mitad C-terminal de AHAS, y hay un grado pequeño de actividad de AHAS exhibido por la propia POX. AHAS y POX también presentan propiedades similares en solución (Risse, B. y otros, Protein Science, 1: 1699 y 1710, 1992; Singh, B.K. y Schmitt, G.K. (1989), FEBS Letters, 258: 113; Singh, B.K. y otros (1989), en Prospects for Amino Acid Biosynyhesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G. y otros, eds., HCPC Monograph p- 87). Al aumentar la concentración de proteína, tanto la POX como la AHAS experimentan transiciones escalonadas de monómeros a dímeros y tetrámeros. Los aumentos de la concentración de FAD inducen también órdenes más altos del conjunto subunidad. La forma tetrámera de ambas proteínas es muy estable al calor y la desnaturalización química.

Además, la estructura cristalina de POX de Lactobacillus planarum ha sido resuelta por Muller y otros, Science 259:965, 1993. Los autores de la presente invención encontraron que, en parte sobre la base del grado de homología física, bioquímica y genética entre AHAS y POX, se puede usar la estructura cristalina de POX obtenida por rayos X como punto estructural de partida para el modelado de la homología de la estructura de AHAS.

Sin embargo, las secuencias de AHADS y POX de L. plantarum no eran suficientemente similares para un alineamiento completamente computarizado. Globalmente, sólo aproximadamente 20% de los átomos son idénticos, mientras que aproximadamente 50% de los restos son de clase similar (esto es, ácidos, básicos, aromáticos, etc.). Sin embargo, si se comparan las secuencias respecto a las clasificaciones de restos hidrófilos e hidrófobos, casan más de 500 de los 600 aminoácidos. Las predicciones de la estructura secundaria de AHAS (Holley y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:152, 1989) revelaron una fuerte similitud con la estructura secundaria real de POX. Para casi el 70% de los restos, la estructura secundaria de AHAS predicha casa con la de POX.

Los monómeros de POX están constituidos por tres dominios, teniendo todos ellos una hoja \beta central, paralela con pasos superiores que están constituidos por hélices \alpha y unos lazos grandes. (Muller y otros, Science, 259:965, 1993). La topología de las hojas difiere entre los dominios, esto es, en los dominios primero y tercero, las cadenas están unidas
a la hoja \beta en la secuencia 2-1-3-4-6-5, mientras que en la hoja \beta del segundo dominio, la secuencia lee 3-2-1-4-5-6.

Los alineamientos generados con ordenador estaban basados en la predicción de la estructura secundaria y la homología de secuencia. Se usó el procedimiento convencional de alineamiento de secuencia pareada descrito por Needleman y Wunch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970. Se alinearon dos secuencias para maximizar la puntuación del alineamiento. La puntuación de alineamiento (puntuación de la homología) es la suma de puntuaciones de todos los pares de restos alineados más una sanción opcional por la introducción de brechas en el alineamiento. La puntuación del alineamiento de un par de restos es un valor entero tabulado. El sistema de puntuación de la homología está basado en la observación de la frecuencia de la divergencia entre un par dado de restos. (MO Dayhoff, RM Schwartz y BC Orcutt, Atlas of Protein Sequence and Sructure, vol. 5, supl. 3, págs. 345-362, 1978).

Los alineamientos se afinaron más mediante brechas de redisposición de manera que se conservaran estructuras secundarias regulares continuas. Las sustituciones de aminoácidos generadas por evaluación de esquemas de probable alineamiento se compararon mediante gráficos moleculares interactivos. Se escogieron los alineamientos con las sustituciones más conservadoras con respecto a la funcionalidad particular de los aminoácidos dentro de un sitio dado. En la Figura 2 se representa el alineamiento final de los aminoácidos de POX y AHAS. Se identificaron conjuntos conservados de restos, en particular para el sitio de unión de TPP y para partes del sitio de unión de FAD. El alineamiento reveló una gran similitud entre AHAS y POX para el primer dominio, para la mayoría de las partes del segundo dominio y para aproximadamente la mitad del tercer dominio. Se esperaba que la mayoría de las regiones que se alinearon malamente y pueden plegar de forma diferente en POX y AHAS estuviera en la superficie de la proteína y no estuviera implicada en el cofactor de unión del inhibidor. La predicción de los sitios de mutación no está afectada sustancialmente por pequeños desplazamientos en el alineamiento.

La mayoría de los restos de unión de TPP está altamente conservados entre POX y AHAS (por ejemplo, P48-G49-G50). En algunos casos, los restos que estaban próximos a TPP difieren entre POX y AHAS pero permanecen dentro de una región que está altamente conservada (por ejemplo, restos 90-110). Por otra parte, el sitio de unión de FAD parecía menos conservado. Aunque algunos sitios de unión de FAD estaban fuertemente conservados, (por ejemplo, D325-I326-D327-P328), otros se diferenciaban claramente entre AHAS y POX (por ejemplo, los restos en el lazo de las posiciones 278 a 285 no son homólogos). Un análisis detallado reveló que, al menos para algunos de los sitios de contacto menos conservados, las interacciones estaban mediadas por el espinazo del polipéptido más bien que por las cadenas laterales. Por tanto, la conservación se requería sólo para el pliegue del polipéptido y no se requería para la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, el espinazo de los restos 258-263 une la cadena de robitol de FAD). La mitad de los sitios de unión de la adenina y la isoaloxazina se diferencia claramente.

Después de alinear la estructura primaria, se construyó un modelo de homología por transposición de secuencias de aminoácidos de AHAS en la estructura del molde de POX. Se construyeron coordenadas por defecto escalonadamente usando moldes de aminoácidos para completar cadenas laterales indefinidas. Se usó la investigación de bancos de datos y la minimización energética de partes pequeñas de la molécula para completar las conformaciones de regiones indefinidas de lazo. Los cofactores TPP y FAD se modelaron en sus bolsas de unión. Este modelo se sometió a una minimización completa de energía a 5000 ciclos. Todo el modelado con ordenador se realizó en una estación de trabajo IRIS Indigo Elan R4000 de Silicon Graphics Co. El modelado interactivo y la minimización de energía se realizaron usando Quanta/CHERMm 4.0 de Molecular Simulationes Inc. Durante esta etapa, la conformación era estable, lo que indicaba que no se habían presentado interacciones fuertemente desfavorecidas tales como, por ejemplo, contactos próximos a van der Waals. Los resultados se presentan esquemáticamente en la Figura 3.

Características de la estructura de AHAS predicha

La inspección de la estructura de AHAS modelada descrita antes reveló que la mayor parte de la proteína se pliega con un espinazo que es energéticamente razonable, siendo accesible al disolvente la mayor parte de las cadenas laterales hidrófilas. La superficie de las hojas \beta es suave y acomoda las regiones de paso por encima que están unidas a las hojas.

Se generó un modelo para AHAS dímera por duplicación de coordenadas de la AHAS monómera de energía minimizada y sobreponiendo las dos copias en dos unidades de POX usando pares de coordenadas de C\alpha según se define en el esquema de alineamiento. La cadena de polipéptido de AHAS se pliega entre dominios plegados similarmente compuestos por un núcleo de hoja \beta paralela de seis cadenas rodeado de "lazos" largos y hélices \alpha. Dos unidades están unidas de manera que el primer dominio de una subunidad está muy próximo a los dominios 2 y 3 de la otra subunidad que unen el cofactor. Entre las subunidades queda en este sitio un espacio lleno de disolvente. Esta bolsa, que queda delimitada por la confluencia de los tres dominios, es el sitio de entrada propuesto para el sustrato. También es el sitio de unión propuesto para herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.

La superficie interior de la mencionada bolsa de unión está perfilada por los cofactores. El tiazol de TPP está situado en el fondo de la bolsa. El dominio 3 contribuye a la superficie interior de la bolsa con una hélice \alpha corta que dirige su eje hacia el pirofosfato del TPP, compensando las cargas de fosfato con su momento dipolar. Esta hélice crítica, que comienza con G498, un resto "paso" en contacto próximo con TPP y que termina en G498, contiene tres sitios de mutación conocidos para la resistencia a la sulfonilurea: V500, W503 y F507. (Véanse patentes U.S. nº. 5.013.659, nº. 5.141.870 y nº. 5.378.824). En el dominio 1, el lazo definido como P48-S52 (entre la \beta-cadena 2 y la \alpha-hélice 2) se enfrenta a W503, una mutación en la que confiere resistencia a imidazolinonas. Los restos Y47 a G50 también están en contacto con TPP. Este lazo es adyacente a P184-Q189, otro paso, que conecta la última cadena de la hoja \beta del dominio 1 con una cadena \beta que conecta con el dominio 2. Dentro de la bolsa, cerca de su entrada, hay una región alargada del dominio 1 que interacciona con una extensión complementaria del dominio 2. Los restos 125-129 y 133-137 del dominio 1 y los restos 304-313 del dominio 2 están en la superficie de la bolsa. Un paso constituido por T96-G100 está entre el lazo 125-129 y TPP. En el extremo opuesto de la bolsa hay otra extensión del dominio 3 y dos regiones del dominio 2 que alinean la bolsa de unión. Los restos 572, 575, 582 y 583 del dominio 3 delimitan la superficie de la bolsa en un lado. La parte restante del interior de la superficie de la bolsa está delimitada por FAD y por un lazo, L278-G282, que tiene contacto con el anillo de isoaloxazina de FAD.

2. Modelado de herbicidas en sitios de unión

Se puso imazetapir, la imidazolinona activa de PURSUIT®, en su sitio de unión propuesto usando un gráfico molecular interactivo (Figura 4) y el soporte lógico descrito antes (Figura 4). Se escogió K185 como un "anclaje" para interaccionar con la carga del grupo carboxilo. La unidad NH-CO de imidazolinona se situó para formar uniones de hidrógeno a G50 y A51. Esto puso el sustituto metilo de imazetapir próximo a V500 en el espinazo de la hélice \alpha pequeña. Posiblemente, el grupo isopropilo está unido a restos hidrófobos de los aminoácidos en la región de los restos 125-135 que contribuyen a la superficie interior de la bolsa. Muy probablemente, el anillo de piridina está "intercalado" entre A134 o F135, F507 y W503. W503 también interactúa con el sistema anular de la imidazolinona.

De manera similar, los herbicidas de sulfonilurea se modelaron en un sitio que se solapaba en parte con el sitio de unión de imidazolinona descrito. El solapamiento de los sitios de unión de la sulfonilurea y la imdazolinona era consistente con experimentos de unión con competición y con los datos mutantes establecidos, lo que revela que la misma mutación en el maíz, W503L, puede conferir resistencia a ambos herbicidas. En estos modelos, la mayoría de los sitios de mutación conocidos que confieren resistencia a herbicidas de sulfonilurea, esto es, G50, A51, K185, V500, W503, F507, está en contacto íntimo con los herbicidas unidos. P126 y A51 son requeridos para mantener en su sitio la cadena lateral de K185 generando un poro hidrófobo. S582, un sitio para resistencia específica a la imidazolinona, está alejado de la región de unión y está situado en le región en la que la homología es tan baja que es de esperar un cambio del pliegue. Aparentemente, el sitio de unión de FAD tiene una homología baja entre AHAS y POX en esta región; S582 es un resto que confiere resistencia en el maíz y S582 y sus restos adyacentes están en contacto íntimo con la bolsa del sitio activo. Se propone que FAD y la región del lazo que abarca los restos 278 a 285 se separen ligeramente del tercer dominio (hacia abajo en la Figura 4) y que un lazo que contiene S582 se pliegue al espacio entre la hélice en las posiciones 499 a 507 y el lazo en las posiciones 278 a 285. D305, otro sitio de resistencia conocido, está próximo a FAD y modula la interacción entre los dominios 1 y 2. M280 puede estar implicado en situar la hélice en las posiciones 498 a 507 o directamente en unir un inhibidor. M280 y D305 podrían también estar implicados directamente en unir un inhibidor si los dominios 1 y 2 se acercaran entre sí ligeramente más próximos.

3. Selección de mutaciones

Los restos de aminoácidos específicos están indicados precisamente como sitios para la introducción de mutaciones en la secuencia primaria de AHAS. Estos aminoácidos se seleccionan sobre la base de su posición en la que, si se modifica la posición ese aminoácido, habrá una alteración resultante (esto es, una caída) de la afinidad del herbicida a la bolsa de unión. No es necesario que la posición de mutación resida en la bolsa de unión, puesto que restos de aminoácidos fuera de la propia bolsa pueden alterar la carga o la configuración de la bolsa. La selección de sitios diana para mutación se consigue usando modelos moleculares como se ha descrito antes. Por ejemplo, de acuerdo con el modelo anterior, se sitúa arginina de la posición 128 (designada R128 en la Figura 1 usando el código de letra individual para los aminoácidos) cerca de la entrada a la bolsa de unión al sustrato y la bolsa de unión al herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y tiene un grado alto de libertad de conformación que permite que participe en el transporte de herbicidas cargados a la bolsa de unión. Por tanto, este resto se sustituye por alanina para eliminar su carga y su cadena lateral hidrófoba larga. La mutación resultante se designa R128A.

Las mutaciones pueden comprender sustituciones simples que reemplazan la secuencia de tipo salvaje con cualquier otro aminoácido. Alternativamente, las mutaciones pueden comprender supresiones o adiciones de uno o varios aminoácidos, preferiblemente hasta 5 aminoácidos, en un sitio dado. La secuencia añadida puede comprender una secuencia de aminoácidos que se sabe que existe en otra proteína, o puede comprender una secuencia completamente sintética. Además, en un polipéptido individual se pueden introducir más de un aminoácido y/o más de un tipo de mutación.

4. Mutagénesis dirigida al sitio

El DNA que codifica AHAS se puede manipular de manera que se introduzcan las mutaciones deseadas. La mutagénesis se realiza usando procedimientos que son convencionales en la técnica según se describe, por ejemplo, por Higuchi, R., Recombinant PCR, en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis M.A. y otros, eds., Academic Press. Págs. 177-183, 1990.

5. Expresión y purificación de variantes

La secuencia de AHAS mutada o variante se clona en un vector de expresión de DNA (véase, por ejemplo, Ejemplo 3) y se expresa en una célula adecuada tal como, por ejemplo, E. coli. Preferiblemente, el DNA que codifica AHAS se une a un elemento regulador de transcripción y la AHAS variante se expresa como parte de una proteína de fusión, por ejemplo, glutationa-S-transferasa, para facilitar la purificación (véase el Ejemplo 3 más adelante.) La AHAS variante se purifica luego por cromatografía de afinidad o por cualquier otro procedimiento conocido en la técnica. "Purificación" de un polipéptido de AHAS se refiere al aislamiento del polipéptido de AHAS en una forma que permite medir su actividad enzimática sin interferencias de otros componentes de la célula en la que se expresa el polipéptido.

6. Ensayo de propiedades enzimáticas

La AHAS purificada se puede ensayar en cuanto a una o varias de las propiedades siguientes:

(a) actividad específica o catalítica para la conversión de piruvato en acetolactato (expresada como unidades/mg de AHAS pura, definiéndose una unidad de actividad como 1 \mumol de acetolactato producido/hora), o para la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato (expresada como unidades/mg de AHAS pura, definiéndose una unidad de actividad como 1 \mumol de acetohidroxibutirato producido/hora;

(b) nivel de inhibición por un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, por ejemplo, imidazolinona (expresada como IC_{50}, la concentración a la que se inhibe el 50% de la actividad de la enzima), y

(c) selectividad de la resistencia al herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea frente a otros herbicidas. El índice de selectividad se define como la resistencia al plegado del mutante a imidazolinonas en relación a la enzima de tipo salvaje dividida por la resistencia al plegado del mismo mutante a otros herbicidas también en relación a la del tipo salvaje. La resistencia al plegado a un herbicida en relación a la enzima de tipo salvaje se expresa como la IC_{50} de la variante dividida por la IC_{50} del tipo salvaje. Por tanto, el índice de selectividad (S.I.) se representa por la ecuación siguiente:

S.I. = \frac{IC_{50} de \ la \ variante \ para \ el \ herbicida \ A/IC_{50} \ del \ tipo \ salvaje \ para \ el \ herbicida \ A}{IC_{50} \ de \ la \ variante \ para \ el \ herbicida \ B/IC_{50} \ del \ tipo \ salvaje \ para \ el \ herbicida \ B}

Los sistemas de ensayo adecuados para hacer estas determinaciones incluyen aunque no únicamente, los descritos detalladamente en el siguiente Ejemplo 4.

7A, Evaluación de variantes adecuadas

Las propiedades enzimáticas de polipéptidos de AHAS variantes se comparan con las de AHAS de tipo salvaje. Preferiblemente, una mutación dada da por resultado un polipéptido de AHAS variante que retiene in vitro la actividad enzimática hacia piruvato o piruvato y 2-cetobutirato, esto es, la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato (y por ello se espera que sea biológicamente activa in vivo), mientras que tiene una actividad catalítica que es relativamente más resistente al (los) herbicida(s) seleccionado(s) que la de AHAS de tipo salvaje. Preferiblemente, la AHAS variante exhibe:

(i) en ausencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea presente como mínimo,

(a): sola, una actividad catalítica suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; o

(b): en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a herbicidas también expresada en la célula, que puede ser la misma proteína variante de AHAS o una diferente, una actividad catalítica suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa,

: en la que la célula requiere la actividad de AHAS para su viabilidad, y

(ii) una actividad catalítica que es más resistente al herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea presente como mínimo que la AHAS de tipo salvaje,

y que es relativamente más resistente al (los) herbicida(s) basado(s) en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.

Por tanto, una proteína cualquiera variante específica de AHAS no necesita tener la actividad catalítica total necesaria para mantener la viabilidad de la célula, sino que debe tener alguna actividad catalítica en una cuantía, sola o en combinación con la actividad catalítica de copias adicionales de la misma variante de AHAS y/o la actividad catalítica de otra(s) proteína(s) variante(s) de AHAS, suficiente para mantener la viabilidad de una célula que requiere la actividad de AHAS para su viabilidad. Por ejemplo, la actividad catalítica se puede aumentar a niveles mínimos aceptables en la célula, introduciendo en la célula múltiples copias de un gen que codifica una variante o introduciendo el gen que además incluye un promotor relativamente fuerte para intensificar la producción de la variante.

Más resistente significa que la actividad catalítica de la variante es disminuida por el (los) herbicida(s) basado(s) en imidazolinona y/o sulfonilurea, si disminuye, en un grado menor que el grado en que es disminuida por el (los) herbicida(s) basado(s) en diazolinona y/o sulfonilurea la actividad catalítica de AHAS de tipo salvaje. Una variante preferida de AHAS más resistente retiene la actividad catalítica suficiente para mantener la viabilidad de una célula, una planta o un organismo en el que la misma concentración del (los) mismo(s) herbicida(s) basados(s) en imidazolinona y/o sulfonilurea no retendría suficiente actividad catalítica para mantener la viabilidad de la célula, la planta o el organismo.

Preferiblemente, la actividad catalítica en ausencia de herbicida(s) basado(s) en imidazolinona y/o sulfonilurea es como mínimo de aproximadamente 5% y, muy preferiblemente, es de más de aproximadamente 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje en ausencia de herbicida(s) basado(s) en diazolinona y/o sulfonilurea. Las variantes de AHAS muy preferidas son más resistentes a herbicidas de imidazolinona que otros herbicidas tales como los herbicidas basados en sulfonilurea, aunque en algunas aplicaciones ni son necesarias ni preferidas.

En el caso de una AHAS variante resistente a imidazolinona, se prefiere que la proteína de la variante de AHAS tenga:

(i) una actividad catalítica en ausencia del mencionado herbicida de más de aproximadamente 20% de la actividad catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje;

(ii) una actividad catalítica que es relativamente más resistente a la presencia de herbicidas de imidazolinona en comparación con la de AHAS de tipo salvaje, y

(iii) una actividad catalítica que es relativamente más sensible en presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con la de herbicidas de imidazolinona. La mayoría de variantes de AHAS muy preferidas resistentes a herbicidas presentan una actividad específica mínima de aproximadamente 20 unidades/mg, una inhibición mínima o ninguna inhibición por la imidazolinona y un índice de selectividad que varía de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3000 en relación a otros herbicidas.

Sin que ello suponga un condicionamiento teórico, se cree que la aplicación sistemática e iterativa de este procedimiento para proteína de AHAS de tipo salvaje y otras AHAS diana dará por resultado la producción de variantes de AHAS que tienen las propiedades deseadas de una alta actividad enzimática según se ha explicado antes y resistencia a una clase o varias clases de herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. Por ejemplo, la mutación de una secuencia de AHAS de tipo salvaje en una posición particular a un aminoácido dado puede dar por resultado un mutante que exhibe un grado alto de resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, pero que tiene una pérdida significativa de actividad enzimática a piruvato y 2-cetobutirato. En una segunda aplicación del procedimiento anterior, el polipéptido de AHAS de partida o diana sería luego esta variante (en vez de la AHAS de tipo salvaje). El diseño racional implica luego la sustitución de otros aminoácidos en la posición originalmente mutada y/o la adición o supresión de aminoácidos en puntos o intervalos seleccionados en espera de que se retenga la resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea pero que se mantenga un nivel más alto de actividad enzimática.

El diseño racional basado en la estructura de proteínas de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea ofrece muchas ventajas sobre otros enfoques que descansan en mutagénesis al azar y selección. Por ejemplo, cuando la sustitución de un aminoácido particular con otro requiere la sustitución de más de un nucleótido en el codón, la probabilidad de que esto se produzca al azar es tan baja, que es impracticable. A diferencia, se pueden realizar fácilmente incluso cambios dobles o triples en la secuencia de nucleótido dentro del codón cuando lo sugieren criterios de diseño racional. Por ejemplo, una mutación diseñada racionalmente para conferir resistencia selectiva a imidazolinona requiere un cambio de arginina a glutamato. La arginina es codificada por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, mientras que el glutamato es codificado por GAA y GAG. Puesto que ninguno de los codones de la arginina comienza con GA, esta mutación requeriría una doble sustitución de nucleótidos adyacentes que se produciría tan raramente usando mutagénesis al azar que sería impredecible e irrepetible con un cierto éxito. Aunque la frecuencia de mutación se puede aumentar durante la mutagénesis al azar, las alteraciones de la secuencia tendrían una probabilidad igual de que se presentaran en el gen de AHAS, en ausencia de una anterior dirección al sitio de las mutaciones. Esto aumenta la probabilidad de obtener una mutación irrelevante que interfiere con la actividad enzimática. Análogamente, sería raro, usando mutagénesis al azar, encontrar una mutación por sustitución, supresión o sustitución/supresión de múltiples aminoácidos que confiriera resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea a la vez que se mantiene la actividad catalítica. Serían también improbables, usando un enfoque de mutagénesis al azar, mutaciones por supresión que confirieran resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. Sería necesario que las supresiones estuvieran limitadas a regiones pequeñas y tendrían que presentarse en tripletes de manera que retuvieran el marco de lectura de AHAS con el fin de retener la actividad
enzimática.

Sin embargo, con un criterio racional basado en la estructura, las mutaciones por sustitución y/o supresión de aminoácidos se logran fácilmente y se apuntan como dianas con precisión. Además, diferentes mutagenes usados en la mutagénesis al azar crean tipos específicos de mutaciones. Por ejemplo, la azida sódica crea mutaciones por sustitución puntual en plantas, mientras que la radiación tiende a crear supresiones. Consecuentemente, tendrían que emplearse dos protocolos de mutagénesis para obtener una combinación múltiple de sustitución/supresión.

Finalmente, el presente procedimiento basado en la estructura para el diseño racional de variantes de AHAS resistentes a herbicidas permite la mejora iterativa de mutaciones de resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, una etapa que no es facilitada por la mutagénesis al azar. La identificación de un sitio de mutación para resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea por mutagénesis al azar puede ofrecer un valor pequeño, si ofrece alguno, para guiar más mejoras en las características del mutante. El presente enfoque basado en la estructura, por otra parte, permite implantar mejoras basadas en la posición, el medio y la función de la posición de aminoácidos en el modelo estructural.

El procedimiento de mejora iterativa también permite la manipulación independiente de tres propiedades importantes de AHAS: nivel de resistencia, selectividad de la resistencia y eficiencia catalítica. Por ejemplo, se pueden diseñar de forma predictiva mutaciones compensatorias. Si una mutación particular tiene un efecto perjudicial sobre la actividad de una enzima, para restaurar la actividad se puede usar una segunda mutación compensatoria. Por ejemplo, se puede compensar introduciendo una segunda mutación, un cambio de la carga neta dentro de un dominio cuando se introduce o se pierde un resto cargado debido a una mutación. La predicción de la posición y el tipo de resto(s) a introducir, suprimir o sustituir en un segundo sitio con el fin de restablecer la actividad enzimática requiere el conocimiento de las relaciones de estructura-función derivadas de un modelo tal como el descrito aquí.

Variantes de AHAS resistentes a herbicidas: DNA, vectores y polipéptidos

La presente invención abarca también moléculas de DNA aisladas que codifican polipéptidos de AHAS variantes resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. Los genes que codifican polipéptidos de AHAS de acuerdo con la presente invención pueden derivar de cualquier especie y preferiblemente de especies de plantas, y las mutaciones que confieren resistencia a los herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea se pueden introducir en posiciones equivalentes dentro de cualquiera de estos genes de AHAS. La equivalencia de una posición de codón dada en diferentes genes de AHAS es función de la conservación de la secuencia primaria de aminoácidos y su proteína y la retención de la estructura tridimensional similar. Por ejemplo, la Figura 5 ilustra el alto grado de homología de secuencia entre polipéptidos de AHAS derivados de diferentes especies de plantas. Estos polipéptidos de AHAS presentan como mínimo de aproximadamente 60% a aproximadamente 70% de homología global. Sin que eso signifique un condicionamiento teórico, se cree que la conformación de la cadena de polipéptido se conservará también en las regiones del polipéptido que tienen una secuencia altamente conservada. Así, es posible usar una secuencia que codifica AHAS de una especie para modelado molecular para introducir previsiblemente mutaciones en un gen de AHAS de una segunda especie para ensayo inicial y mejora iterativa y, finalmente, para introducir mutaciones optimizadas en AHAS derivada de una tercera especie de planta para expresión en una planta transgénica.

En una serie de realizaciones, estos DNAs de AHAS codifican variantes de un polipéptido de AHAS y preferiblemente del polipéptido de AHAS de maíz de la Figura 1, en la que el polipéptido es modifica por sustitución o supresión de restos de aminoácidos.

La presente invención abarca DNA y las correspondientes secuencia de RNA, así como secuencias de sentido y antisentido. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de AHAS pueden estar flanqueadas por secuencias reguladoras naturales de AHAS, o pueden estar asociadas con secuencias heterólogas, incluidos promotores, agentes de intensificación, elementos de respuesta, secuencias de señalización, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificadoras de 5'- y 3'-, etc. Además, los ácidos nucleicos se pueden modificar para alterar la estabilidad, la solubilidad. La afinidad y la especifidad. Por ejemplo, se pueden metilar selectivamente AHAS variantes que codifican secuencias. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también se pueden modificar con una marca capaz de proporcionar una señal detectable, directa o indirectamente. Entre los ejemplos de marcadores están incluidos radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, etc.

La invención proporciona también vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican variantes de AHAS. Se han descrito numerosos vectores, incluidos vectores de plásmidos y de hongos para expresión en una variedad de huéspedes eucarióticos y procarióticos. Los vectores pueden incluir también ventajosamente un promotor operativamente unido a la porción que codifica AHAS. La AHAS codificada puede expresarse usando cualesquier vectores adecuados y células huésped, por procedimientos descritos o citados aquí o conocidos por los expertos en la técnica relevante. Entre los ejemplos de vectores adecuados están incluidos, aunque no limitativamente, vectores basados en pBIN, vectores pBluescript y vectores pGEM.

La presente invención también abarca polipéptidos de AHAS variantes resistentes a ambos herbicidas o fragmentos peptídicos de ellos. Como se ha explicado antes, los polipéptidos de AHAS variantes pueden derivar del polipéptido principal de maíz representado en la Figura 1 o de cualquier planta o polipéptido microbiano de AHAS, preferiblemente cualquier polipéptido de AHAS de plantas. Los polipéptidos se pueden modificar más mediante, por ejemplo, fosforilación, sulfatación, acilación, glicosilación u otras modificaciones de proteínas. Los polipéptidos se pueden aislar de plantas o de organismos heterólogos o células (incluidas, aunque no únicamente, células de bacterias, levaduras, insectos, plantas y de mamífero) en los que se ha introducido y expresado el gen que codifica un polipéptido de AHAS variante. Además, los polipéptidos de AHAS se pueden modificar con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, directa o indirectamente, incluidos radioisótopos, compuestos fluorescentes, etc.

Plantas y plantas que contienen genes de AHAS variantes, resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea

La presente invención abarca células transgénicas, incluidas, aunque no únicamente, semillas, organismos y plantas en las que se han introducido genes que codifican variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. En la Tabla 1 se dan ejemplos no limitativos de plantas receptoras adecuadas.

TABLA 1 Plantas receptoras

1

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

La expresión de los polipéptidos de AHAS variante en plantas transgénicas confiere un nivel de resistencia alto a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, incluido imazetapir (PURSUIT®), permitiendo el uso de estos herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea durante el cultivo de las plantas transgénicas.

Los procedimientos para introducir genes foráneos en plantas son conocidos en la técnica. Entre los ejemplos no limitativos de tales procedimientos están incluidos infección por Agrobacterium, bombardeo de partículas, tratamiento de protoplastos con polietilenglicol (PEG), electroporación de protoplastos, microinyección, macroinyección, inyección de siembra, paso de un tubo de polen, incorporación de semilla seca, perforación con láser y electroforesis. Estos procedimientos son descritos, por ejemplo, por B. Jenes y otros, y S.W. Ritchie y otros, en Transgenic Plants, vol. 1, Enginering and Utilization, ed. S.D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich 1993; y L. Mannonen y otros, Critical Reviews in Biotechnology, 14:287-310, 1994.

En una realización preferente, el DNA que codifica una AHAS variante se clona en un vector de DNA que contiene un gen de marcador de resistencia a antibióticos, y el AHAS-DNA que contiene el plásmido se introduce en Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido de Ti. Este "sistema de vector binario" se describe en por ejemplo, la patente U.S. nº. 4.490.838 y por An y otros en Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19 (1988). El Agrobacterium transformado se cocultiva luego con discos de hojas de la planta receptora para posibilitar la infección y transformación de las células de la planta. Las células transformadas de la planta se cultivan luego en el medio de regeneración, que promueve la formación de vástagos, primeramente en presencia del antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas, luego en presencia de herbicida. En células de plantas transformadas satisfactoriamente con DNA que codifica AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, la formación de vástagos se produce incluso en presencia de niveles de un herbicida basado en inidazolinona y/o sulfonilurea que inhiben la formación de vástagos de células no transformadas. Después de confirmar la presencia de DNA de AHAS variante usando, por ejemplo, el análisis por reacción en cadena de polimerasa (PCR), las plantas transformadas se ensayaron en cuanto a su capacidad de resistir la aplicación por proyección de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y en cuanto a su capacidad para la germinación de semillas y la iniciación de la raíz y la proliferación en presencia de herbicida.

Otras aplicaciones

Los procedimientos y las composiciones de presente invención se pueden usar en el diseño racional basado en la estructura de variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, que se pueden incorporar en plantas para conferir a las plantas una resistencia selectiva a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.

Los genes de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea se pueden transformar en cultivos en copias individuales o múltiples para conferir resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. La ingeniería genética de especies de cultivos con una sensibilidad reducida a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea puede:

(1) aumentar el espectro y la flexibilidad de aplicación de herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, ambientalmente benignos;

(2) intensificar el valor comercial de estos herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea;

(3) reducir la presión de malas hierbas en campos de cultivo por uso efectivo de herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea sobre las especies de cultivos resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea y aumentar correspondientemente los rendimientos de las cosechas;

(4) aumentar las ventas de semillas de plantas resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea;

(5) aumentar la resistencia a daños de cultivos debidos a la aplicación de herbicidas basados en imidazoliniona y/o sulfonilurea en una plantación anterior;

(6) disminuir la susceptibilidad a cambios en las características de herbicidas basados en imidazoliniona y/o sulfonilurea debidos a condiciones climáticas adversas, y

(7) aumentar la tolerancia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea aplicados no homogéneamente o mal aplicados.

Por ejemplo, se pueden cultivar plantas que contienen proteínas de variantes transgénicas de AHAS. El cultivo se puede tratar con el herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea al que es resistente la planta transgénica de variante de AHAS en una cantidad efectiva para controlar las malas hierbas, lo que da por resultado el control de las malas hierbas en el cultivo sin afectar perjudicialmente al cultivo.

Los vectores de DNA descritos antes que codifican variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en diazolinona y/o sulfonilurea se pueden utilizar de manera que la expresión de la variante de AHAS proporcione un marcador seleccionable para la transformación de las células por el vector. Las células receptoras en cuestión pueden estar en un cultivo o in situ y los genes de las variantes de AHAS pueden usarse solos o en combinación con otros marcadores seleccionables. El único requerimiento es que la célula receptora sea sensible a los efectos citotóxicos del herbicida cognado. Esta realización se aprovecha ventajosamente del bajo coste y la carencia de toxicidad de los herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, y se puede aplicar en cualquier sistema que requiera una transformación mediada por DNA.

Ejemplos de realizaciones preferentes Ejemplo 1 Diseño de variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea

Para la mutagénesis se seleccionaron restos situados en la proximidad del sitio de unión del herbicida basado en diazolinona y/o sulfonilurea con el fin de diseñar un polipéptido activo de AHAS con una capacidad disminuida de unión del herbicida basado en diazolinona y/o sulfonilurea. Cada sitio de la superficie de la bolsa se consideró en términos de interacciones potenciales con otros restos de la bolsa, así como con cofactores y herbicidas basados en diazolinona y/o sulfonilurea. Por ejemplo, se esperaba que la adición de resto(s) cargado(s) positivamente interfiriera con la distribución de la carga dentro del sitio de unión, dando por resultado una pérdida de la afinidad de unión del herbicida basado en diazolinona y/o sulfonilurea.

Se identificaron tres restos como las dianas más útiles para la mutagénesis:

(1) se consideró que F135 interacciona con el anillo de isoaloxazina de FAD y con el grupo aromático de los herbicidas. De acuerdo con la estrategia de introducir restos más cargados en la bolsa de unión, este resto se cambió a arginina.

(2) M53 tiene contacto con la hélice 498-507. Esta hélice contiene sitios de mutación conocidos de resistencia a herbicidas y también está implicada en la unión de TPP. Además, se creía que la sustitución del ácido glutámico en la posición 53 favorece una interacción con K185, reduciendo la afinidad de K158 para el grupo carboxilato de imazetapir.

(3) R128 está situado cerca de la entrada a la bolsa, donde se creía que estaba implicado en el transporte inicial a la bolsa de unión de herbicidas basados en diazolinona y/o sulfonilurea cargados. Este resto se cambió a alanina para eliminar tanto su carga como su cadena lateral hidrófoba larga.

Ejemplo 2 Mutagénesis de AHAS dirigida al sitio para producir variantes resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfoniluea

El gen de AHAS de Arabidopsis se insertó en marco al extremo 3' de la región de codificación del gen de glutationa S-transferasa en el vector pGEX-2T (Pharmacia). La construcción del vector de esta manera mantenía la secuencia de reconocimiento de seis aminoácidos de trombina en la unión de la proteína de fusión expresada glutationa-S-transferasa (GST)/AHAS. La digestión de trombina de la mencionada proteína de fusión expresada da por resultado una proteína de AHAS con una posición de partida N-terminal en el extremo del péptido de tránsito en un sitio de tratamiento del péptido de tránsito putativo, con una glicina N-terminal residual derivada del sitio de reconocimiento de trombina. El terminal final amino de la proteína de AHAS escindida está constituida por Gly-Ser-Ser-Ile-Ser. En el gen de AHAS en este vector se introdujeron mutaciones dirigidas al sitio.

Se construyeron mutaciones dirigidas al sitio de acuerdo con el procedimiento de PCR de Higuchi (Recombinant PCR. En PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, por MA Innis y otros, Academic Press, San Diego, págs. 177-183, 1990). Se amplificaron dos productos de PCR, cada uno de los cuales solapa el sitio de mutación. Los cebadores de la región de solapamiento contenían la mutación. Los fragmentos amplificados de PCR de solapamiento se combinaron, desnaturalizaron y se dejó que se reanillaran conjuntamente, produciéndose dos posibles productos heterodúplex que separan los extremos 3'. Los extremos 3' separados se extendieron por Taq DNA-polimerasa para producir un fragmento que era la suma de los dos productos de PCR de solapamiento que contenían la mutación deseada. Una posterior reamplificación de este fragmento con sólo los dos cabadores "externos" dio por resultado el enriquecimiento del producto de longitud entera. El producto que contenía la mutación se reintrodujo en el gen de AHAS de Arabidopsis en el vector pGEX-2T.

Ejemplo 3 Expresión y purificación de variantes de AHAS A. Procedimientos

Células de E. coli (DH5\alpha) transformadas con el vector pGEX-2T que contenía gen de AHAS de tipo salvaje de maíz (designación del vector pAC751), el mutante Ser653Asn de Arabidopsis o el mutante Ile401Phe de Arabidopsis se dejaron crecer durante la noche en un caldo de cultivo que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. El cultivo nocturno de E. coli se diluyó 1:10 en 1 l de LB, 50 \mug/ml de ampicilina y 0,1% v/v de antiespumante A. El cultivo se incubó a 37ºC con sacudidas hasta que OD_{600} alcanzó aproximadamente el valor 0,8. Se añadió isopropiltiogalactosa (IPTG) a un volumen final de 1 mM y el cultivo se incubó durante 3 horas más.

Las células se cosecharon por centrifugación a 8.670 xg durante 10 min en una centrifugadora JA-10 y se pusieron nuevamente en suspensión en una centésima parte del volumen original de cultivo en MTPBS (Na_{2}HPO_{4} 16 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3). Se añadió Triton X-100 y lisozima a una concentración final de 1% v/v y 100 \mug/ml, respectivamente. Las células se incubaron a 30ºC durante 15 min, se enfriaron a 4ºC sobre hielo y se lisaron por sonicación durante 7 segundos a nivel 7 con un disruptor de células Branson Sonifier equipado con una sonda de micropunta. El extracto exento de células se centrifugó a 35.000 xg durante 10 min a 4ºC. Se decantó la sustancia sobrenadante y se repitió la etapa de sonicación.

La purificación de las proteínas de fusión expresadas se realizó según la modificación de Smith y Johson (Gene 67:31-40, 1988). El material sobrenadante se calentó a temperatura ambiente y se hizo pasar a través de una columna de 2 ml de perlas de glutationa-agarosa (unión por azufre, Sigma) equilibrada en MTPBS. La columna se lavó seguidamente con MTPBS a temperatura ambiente hasta que la A_{280} del eluyente casaba con la de MTPBS. La proteína de fusión se eluyó luego usando una solución que contenía glutationa reducida 5 mM en Tris HCl 50 mM, pH 8,0.La proteína de fusión eluida se trató con aproximadamente 30 unidades NHD de trombina y se dializó frente a citrato 50 mM pH 6,5 y NaCl 150 mM.

La proteína de fusión se mantuvo en digestión durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras digeridas se dializaron frente a MTPBS y se hicieron pasar dos veces a través de una columna de glutationa-agarosa equilibrada en MTPBS para eliminar la proteína glutationa transferasa liberada. Se recogió la fracción de proteína que no se unió a la columna y se concentró por ultrafiltración en un filtro YM10 (Amicon). La muestra concentrada se cargó en una columna de filtración en gel Sephacryl S-100 de 1,5 x 95 cm equilibrada en tampón de filtración (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). Se recogieron fracciones de 2 ml a un caudal de 0,14 ml/min. La estabilidad de la enzima se ensayó almacenando la enzima a 4ºC en gel de filtración con la adición de 0,02% de azida sódica en presencia o ausencia de pirofosfato de tiamina 2 mM y dinucleótido de flavina adenina (FAD) 100 \muM.

B. Resultados

E. coli transformados con el plásmido pAC751 que contenía gen de AHAS de tipo salvaje fusionado corriente abajo y en marco con el gen de GST expresaron una proteína de 91 kD cuando se indujeron con IPTG. La proteína de 91 kD tenía la masa molecular predicha de una proteína de fusión de GST/AHAS (la suma de 26 kD y 65 kD, respectivamente). Cuando el extracto libre de células de DH5\alpha/pAC751 se hizo pasar a través de gel de afinidad de glutationa-agarosa, se lavó y se eluyó con la glutationa libre, resultó una preparación enriquecida en la proteína de 91 kD (Figura 6, carril C). El sitio de reconocimiento de trombina de seis aminoácidos tratado por ingeniería en la unión de GST y AHAS fue escindido con éxito por la trombina (Figura 6, carril D). La preparación de la proteína de fusión escindida estaba constituida por la proteína GST de 26 kD esperada y la proteína de AHAS de maíz de 65 kD. La AHAS de maíz se purificó hasta homogeneidad por una segunda pasada a través de la columna de glutationa-agarosa al sustrato GST de afinidad y se sometió a una etapa final de filtración en gel Sephacryl S-100 para eliminar la trombina (Figura 6, carril E). La proteína de 65 kD es reconocida en manchas western por un anticuerpo monoclonal generado frente a un péptido de AHAS de maíz.

La AHAS de tipo salvaje purificada se analizó por espectrometría de masas por electroproyección y se determinó que tenía una masa molecular de 64.996 daltons (datos no presentados). La masa predicha, calculada a partir de la secuencia de aminoácidos deducida del gen insertado en el vector pGEX-2T, es de 65.058. La discrepancia de 0,096% entre la masa determinada empíricamente y la predicha estaba dentro de la variabilidad de ajuste del espectrómetro de masas. La estrecha proximidad de las dos determinaciones de la masa sugiere que no había nucleótidos mal incorporados durante la construcción del vector de expresión ni cualesquiera modificaciones postranslacionales a la proteína que causaran cambios grandes de la masa molecular. Además, la falta de picos espúreos en la preparación de la enzima purificada indicaba que la muestra estaba exenta de contaminación.

Ejemplo 4 Propiedades enzimáticas de variantes de AHAS

Las propiedades enzimáticas de AHAS de tipo salvaje y de AHAS variante producidas en E. coli se midieron por el procedimiento de Singh y otros modificado (Anal. Biochem. 171:173-179) como sigue

Se obtuvo una mezcla de reacción que contenía tampón de ensayo 1X de AHAS (HEPES 50 mm pH 7,0, piruvato 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, pirofosfato de tiamina (TPP) 1 mM y dinucleótido de flavina adenina (FAD) 50 \muM) por dilución de la enzima en tampón de ensayo 1X de AHAS o por adición de enzima concentrada al tampón de ensayo 1X de AHAS. Todos los ensayos que contenían imazetapir y controles asociados contenían una concentración final de 5% de DMSO debido a la adición de imazetapir a las mezclas de ensayo como solución al 50% en DMSO. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 250 \mul a 37ºC en placas de microtitulación. Después de dejar que la reacción transcurriera durante 60 min, se midió colorimétricamente la acumulación de acetolactato como lo describen Singh y otros, Anal. Biochem. 171:173-176, 1988.

La AHAS de maíz expresada y purificada de pAC751 como se describe en el Ejemplo 3 es activa en la conversión de piruvato en acetolactato. La actividad total de la AHAS depende de la presencia de los cofactores FAD y TPP en el medio de ensayo. No se detectó actividad sólo cuando se añadió únicamente FAD al medio de ensayo. La actividad de la enzima purificada con sólo TPP, o sin cofactores, era inferior a 1% de la actividad detectada en presencia de TPP y FAD. Normalmente, la AHAS presente en extractos en bruto de plantas es muy lábil, en particular en ausencia de sustrato y cofactores. A diferencia, la AHAS purificada del sistema de expresión bacteriano no presentaba pérdida de la actividad catalítica cuando se almacenó durante un mes a 4ºC en HEPES 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, 0,02% de NaN_{3} en presencia o ausencia de FAD y TPP. Además, no eran visibles productos de degradación de estas preparaciones almacenadas cuando se resolvieron en geles de SDS-PAGE.

Las actividades específicas de AHAS de tipo salvaje y las variantes M124E, R199A y F206R se presentan en la siguiente Tabla 2. Determinada a partir del alineamiento de la Figura 5, la mutación de M124E en AHAS de Arabidopsis es la equivalente de la mutación M53E de maíz, la mutación de R199A en Arabidopsis es la equivalente de la mutación de R128A de maíz y la mutación de F206R en Arabidopsis es la equivalente de la mutación de F135R de maíz. Las mutaciones diseñadas en el modelo estructural de AHAS de maíz se usaron para identificar el aminoácido equivalente en el gen de AHAS de Arabidopsis dicotiledónea y se incorporaron y ensayaron en el gen de AHAS de Arabidopsis. Esta translación e incorporación de mutaciones de herbicidas diseñadas racionalmente en el gen de AHAS de Arabidopsis dicotiledónea puede facilitar la evaluación de la resistencia a herbicidas en plantas de una especie dicotiledónea.

TABLA 2 Actividad específica

12

La mutación de R199A mantiene un nivel alto de actividad catalítica (Tabla 2) mientras que presenta un nivel significativo de resistencia al imazetapir (Figura 7). Notablemente, esta variante retiene una sensibilidad completa a sulfonilureas (Figura 8). Así, la variante satisface los criterios de alta actividad específica y resistencia selectiva a herbicidas. A diferencia, la sustitución de M124E dio por resultado una resistencia casi completa al imazetapir (Figura 7), pero también presentaba una actividad catalítica severamente reducida (Tabla 2). En cuanto a la resistencia a la imidazolinona, esta variante presenta una mayor sensibilidad a la sulfonilurea, lo que sugiere que este resto es un buen candidato para crear una mutación que confiera resistencia selectiva. La sustitución de un aminoácido que no sea el ácido glutámico puede ayudar a mantener la actividad catalítica. La sustitución de F206R dio resultados similares con la variante M124E, pero carecía de selectividad de la resistencia.

Ejemplo 5 Mejora iterativa de una variante de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea usando criterios de diseño racional

El cambio del resto 124 en AHAS de Met a Glu como se ha descrito en el Ejemplo 4 confirió resistencia a la imidazolinona, pero también redujo la actividad catalítica a 9,2% del valor de la de tipo salvaje. El modelo de la estructura de AHAS de maíz descrito antes sugería que Met53 (equivalente al resto Met124 de Arabidopsis) interacciona con una serie de restos hidrófobos en la cara de una hélice \alpha que deriva de una subunidad separada pero que están próximos a Met 53. Así, la interacción hidrófoba entre Met53 y los restos en la hélice puede estabilizar tanto la asociación de subunidad/subunidad como la conformación del sitio activo. Se creyó que la sustitución del resto Met hidrófobo con un resto glutamato cargado muy probablemente desestabiliza la interacción hidrófoba intersubunidades y da por resultado una pérdida de actividad catalítica.

Sobre la base de este análisis de estructura/función, la actividad de la enzima mutante Met124Glu original de Arabidopsis (equivalente a Met53 Glu de maíz) se mejoró luego iterativamente sustituyendo un aminoácido más hidrófobo (Ile) en esta posición. La naturaleza hidrófoba de la cadena lateral de Ile dio por resultado la restauración de la actividad a niveles de la de tipo salvaje (la actividad específica de 102, equivalente a 102% de la actividad del tipo salvaje), pero la mayor masa de la cadena lateral de Ile era todavía capaz de mantener un nivel significativo de resistencia a la imidazolinona (Figura 9).

Comparativamente, la sustitución de un resto de histidina en esta posición dio por resultado una variante de AHAS que presentaba una actividad específica de 42,5, equivalente a 42,6% de la actividad de la de tipo salvaje. Este mutante, sin embargo, presentaba un grado alto de resistencia a PURSUIT® (Figura 10).

Ejemplo 6 Mejora iterativa de una variante de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea usando un enfoque de diseño racional

Otro ejemplo de afino iterativo usando los procedimientos de la presente invención implica la variante Arg128Ala. El modelo estructural de AHAS de maíz sugirió que el resto Arg128, que reside en el labio de la bolsa de unión del herbicida, contribuye a canalizar sustratos cargados y herbicidas a la bolsa de unión del herbicida y al sitio activo. El resto Arg 128 está distante del resto de TPP, que une la molécula de piruvato inicial en el mecanismo de reacción de AHAS, lo que explica por qué la sustitución de Arg199 de AHAS de Arabidopsis (equivalente a Arg128 de maíz) en alanina tenía un efecto pequeño sobre la actividad catalítica de la enzima. El modelo estructural indicaba además que se podía hacer más de un cambio radical en esta posición para aumentar el nivel de resistencia a la vez que se mantenían niveles altos de actividad catalítica. Sobre esta base, se hizo una mejora iterativa de la mutación para sustituir el resto de arginina cargado positivamente con un resto de glutamato cargado negativamente. La enzima así mutada tenía niveles mejorados de resistencia a PURSUIT®, mientras que se mantenían niveles altos de actividad (actividad específica de 114, equivalente a 114% de actividad de la de tipo salvaje). (Figura 11).

Ejemplo 7 Intercambiabilidad de AHAS derivada de diferentes especies en diseño racional basado en la estructura de variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea

Un modelo estructural de la estructura tridimensional de AHAS se construye con una secuencia de AHAS monocotiledónea tal como la derivada de maíz, como se ha descrito antes. Para introducir mutaciones en AHAS derivada de una especie dicotiledónea tal como Arabidopsis, las secuencias de AHAS derivada de la especie de monocotiledóneas y dicotiledóneas se alinean usando los programas GAP y PILEUP (Genetics Computer Group, 575 Sequence Drive, Madison, WI 53711). Se determinan posiciones equivalentes a partir del alineamiento generado con ordenador. Las mutaciones se introducen luego en el gen de AHAS de dicotiledónea según se ha descrito antes. Después de la expresión de la proteína de AHAS mutante en E. coli y evaluación de propiedades bioquímicas (esto es, actividad específica y resistencia a herbicidas), el gen mutante se introduce en una planta dicotiledónea por procedimientos de transformación de plantas como se ha descrito antes.

Ejemplo 8 Producción de plantas resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea por transformación con genes de AHAS diseñada racionalmente Construcciones de DNA

Se usaron genes de variantes de AHAS diseñadas racionalmente en vectores de expresión de E. coli como fuente de fragmentos de restricción de DNA para reemplazar el fragmento de restricción equivalente en un gen de AHAS de Arabidopsis. Este gen está presente en un fragmento de DNA genómico de 5,5 kb que también contiene el promotor de AHAS de Arabidopsis, la secuencia terminal de AHAS de Arabidopsis y el DNA de los flancos 5' y 3'. Después de haber secuenciado DNA a través de los sitios de mutación para confirmar la presencia de la mutación apropiada, el fragmento de 5,5 kb de cada plásmido se insertó en un vector de transformación de plantas basado en pBIN (Mogen, Leiden, Holanda). El vector de transformación de plantas contiene también el gen de resistencia a la canamicina de neomicinfosfotransferasa II (nptII) impulsado por el promotor del virus mosaico de coliflor 35S. La construcción final del vector se presenta en la Figura 12. Los vectores que contienen genes de AHAS de Arabidopsis con mutaciones de Met124Ile, Met124His y Arg199Glu (que corresponden a mutaciones de Met53Ile, Met 53His y Atg128Glu en la secuencia de AHAS de maíz según se presentado en la Figura 1) se marcaron pJK002, pJK003 y pJK004, respectivamente.

Cada uno de estos vectores se transformó en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (R&D Life Technologies, Gaithersburg, MD) usando el procedimiento de transformación descrito por An y otros, en Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19 (1988).

Transformación de la planta

La transformación de discos de hojas de Nicotinum tabacum cv Wisconsin 38 se realizó de conformidad con lo descrito por Horsch y otros (Science 227:1229-1231, 1985) con ligeras modificaciones. Se cortaron discos de hojas de plantas crecidas en condiciones estériles y cocultivadas mantenidas de arriba- abajo en medio de Murashige Skoog (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 2-3 días a 25ºC en la oscuridad con cepas de Agrobacterium tumefaciens que contenían los plásmidos pJK002, pJK003 y pJK004. Los discos se transfirieron en seco y se pasaron a medio de Murashige Skoog con vitaminas B5 que contenían 1 mg/ml de benciladenina y 0,1 mg/l de ácido 1-naftilacético, 100 mg/l de canamicina y 500 mg/l de cefotaxima (todos obtenidos de Sigma).

Inicialmente, los transformantes se seleccionaron atendiendo a la resistencia a la canamicina conferida por el gen nptII presente en el vector de transformación. Se cortaron retoños derivados de los discos de hoja y se pusieron en medio fresco de Murashige Skoog exento de hormonas que contenía cefotaxima y canamicina.

Resistencia a herbicidas in vivo

Retoños resistentes a canamicina se pasaron a un medio que contenía imazetapir 0,25 \muM. A esta concentración del herbicida de imidazolinona, los retoños de tabaco no transformados (que contenían AHAS de tipo salvaje endógena) no eran capaces de iniciar la formación de raíz. A diferencia, en retoños de tabaco transformados con cada uno de los genes de AHAS mutantes se observó la iniciación de la raíz y el crecimiento. En la Figura 1 se presentan las raíces desarrolladas en los retoños transformados con los genes mutantes de Met124Ile y Arg199Glu junto con el tipo salvaje. Además, las plantas transformadas con los genes mutantes de Met124Ile y Arg199Glu eran resistentes a la proyección de dos veces la cuantía de campo (100 g/Ha) de imazetapir (Figura 13). Las configuraciones del crecimiento de la raíz en plantas transformadas frente a las no transformadas en presencia de herbicida, así como el comportamiento después de la proyección de herbicida sugieren que la expresión de los genes de resistencia a herbicidas diseñados racionalmente confiere resistencia a herbicidas in vivo.

Detección de los genes diseñados racionalmente en tabaco resistente a herbicidas

Se aisló DNA genómico de plantas de tabaco transformadas con AHAS y se verificó por análisis por PCR la presencia de genes de variantes de AHAS de Arabidopsis. Las diferencias entre las secuencias de nucleótidos del gen de AHAS de Arabidopsis y los dos genes de AHAS de tabaco se explotaron para diseñar cebadores por PCR que amplifican sólo el gen de Arabidopis en un fondo de DNA genómico. Se detectaron los genes diseñados racionalmente de resistencia a herbicidas, según lo revelaba la amplificación de un fragmento de DNA del tamaño apropiado, en la mayoría de plantas resistentes a herbicidas. No se vio señal de PCR alguna de plantas de tabaco no transformadas.

Segregación de genes de AHAS transformadas

Para controlar la segregación de genes de AHAS diseñados racionalmente en plantas transformadas, se realizaron ensayos de germinación. Las semillas se pusieron en medio de Murashige-Skoop exento de hormona que contenía hasta PURSUIT 2,5 \muM y canamicina 100 \muM. Los plantones resultantes se puntuaron visualmente en cuanto a la resistencia o susceptibilidad al herbicida.

\newpage

Puesto que las plantas de tabaco son diploides, era de esperar que la progenie de plantas autopolinizadas segregara 3:1 resistentes:susceptibles, reflejando la existencia de 1 plantón homozigótico para el gen de AHAS resistente, 2 plantones heterozigóticos para el gen de AHAS resistente y 1 plantón que carecería del gen de AHAS resistente.

Los resultados indican que los genes de AHAS están segregando en la relación 3:1 esperada, lo que soporta la conclusión de que la resistencia a herbicidas la confiere una copia individual dominante de un gen de AHAS racionalmente diseñado.

Esto resultados indican que el diseño racional de genes de AHAS resistentes a herbicidas se puede usar para producir plantas que presentan un crecimiento resistente a herbicidas in vivo.

Ejemplo 9 Producción de plantas resistentes a diferentes herbicidas por transformación de genes de AHAS diseñados racionalmente

Plantas de tabaco transformadas con genes de AHAS diseñados racionalmente como se ha descrito en el Ejemplo 8 anterior se ensayaron en cuanto a resistencia por cruce a otro herbicida, CL 299.263 (también conocido como imazamox). Los ensayos de germinación se realizaron con semillas cosechadas de transformantes primarios que contenían los genes variantes Met124Ile, Met124His y Arg19Glude AHAS de Arabidopsis en ausencia o presencia de CL 299.263 2,5 \muM (Figura 15). Esta concentración del herbicida causa atrofia y blanqueo severos de plantas de tabaco de tipo salvaje. Las plantas de tabaco transformadas con el gen de AHAS Met124His presentaban el máximo nivel de resistencia. (Figura 15). Los transformantes Arg199Glu presentaban un nivel intermedio de resistencia, mientras que Met124Ile presentaba una resistencia pequeña (Figura 15).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Kakefuda, Genichi

\hskip3.9cm

Ott, Karl-Heinz

\hskip3.9cm

Kwagh, Jae-Gyu

\hskip3.9cm

Stockton, Gerald W.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: productos resistentes a herbicidas diseñados sobre la base de la estructura

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): CONSIGNATARIO: Darby & Darby

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 805 Third Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO: 10022-7513

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC - DOS/MS - DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release n° 1.0, Versión n° 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: ESTADOS UNIDOS 08/426.125

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de abril de 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Robinson, Joseph

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.448

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 0646/0A674

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212)- 527-7783

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212)- 753-6237

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 236687

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 599 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 585 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Lactobacillus plantarum

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 599 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DE POLARIDAD OPUESTA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 638 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

26

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 638 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 667 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 7:

\vskip0.500000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 664 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 671 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 652 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Brassica napus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 637 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Brassica napus

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

43

44

45

Claims

1. Un procedimiento para la producción de una proteína de una variante de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea usando información basada en la estructura, procedimiento que comprende:

(a): alinear una proteína de AHAS diana sobre un molde de ^{} piruvato oxidasa para derivar la estructura tridimensional de la mencionada proteína de AHAS diana;

(b): modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en la mencionada proteína de AHAS diana;

(c): seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la mencionada bolsa de unión;

(d): mutar DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada; y

(e): expresar el mencionado DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la mencionada AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que además comprende:

(g): purificar las proteínas de la mencionada AHAS de tipo salvaje y de la mencionada AHAS variante de las mencionadas células,

(h): ensayar las proteínas de la mencionada AHAS de tipo salvaje y de la mencionada AHAS variante cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y presencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea; y

(i): en ausencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea,

(b): una actividad catalítica en combinación con una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; en la que la mencionada célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

(ii): una actividad catalítica que es más resistente a un herbicida basado en imidazolina y/o sulfonilurea que la HAAS de tipo salvaje.

3. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 2, en el que la mencionada actividad catalítica en ausencia de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea es de más de 20% de la actividad catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje en ausencia de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea.

4. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 3, el que el herbicida es un herbicida basado en imidazolinona y/ sulfonilurea y la mencionada proteína de la variante de AHAS resistente a herbicidas tiene:

(i): una actividad catalítica en ausencia del mencionado herbicida de más de 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje;

(ii): una actividad catalítica que es más resistente a la presencia de herbicidas de imidazolinona en comparación con AHAS de tipo salvaje, y

(iii): una actividad catalítica que es más sensible a la presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con herbicidas de imidazolinona.

5. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 1, en el que la mencionada proteína de AHAS diana se deriva de Arabidopsis thaiana.

6. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 1, en el que la mencionada primera célula es
E. Coli.

7. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 2, en el que las mencionadas primera célula y segunda células son E. Coli.

8. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 1, en el que la mencionada proteína de AHAS diana comprende una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o la secuencia de aminoácidos de una proteína de AHAS de otra planta.

9. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 1, en el que la mencionada mutación es una sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente en un resto de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el grupo constituido por F135, M53, R128 y un resto de aminoácido de proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido alineado con cualquiera de los anteriores, y cualquier combinación de cualesquier de los anteriores.

10. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 9, en el que la mencionada sustitución se selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg o una combinación de cualesquier de los anteriores.

11. Un procedimiento para la producción de una proteína de variante de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea usando información basada en la estructura, procedimiento que comprende:

(a): alinear una proteína de AHAS diana en un primer molde de AHAS derivada de un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:º o la secuencia de aminoácidos de AHAS de otra planta para derivar la estructura tridimensional de la mencionada proteína de AHAS diana;

(b): modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en la mencionada proteína de la AHAS diana;

(d): mutar DNA que codifica la mencionada proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición mencionada; y

(e): expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada.

12. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 11, que además comprende:

(g): purificar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y la proteína de AHAS variante mencionada de las células;

(h): ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y la proteína de AHAS variante mencionada en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y presencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea;

(i): repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica la AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una primera proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene

(i): en ausencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea

(b): una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

13. Un procedimiento para la producción de una proteína de variante de AHAS resistente a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea usando información basada en la estructura, procedimiento que comprende:

(a): alinear una proteína de AHAS diana sobre un primer molde de AHAS que tiene una bolsa identificada de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 para derivar la estructura tridimensional de la mencionada proteína de AHAS diana;

(b): seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la mencionada proteína de AHAS diana, en la que la mencionada mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la mencionada bolsa de unión;

(c): mutar DNA que codifica la mencionada proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada; y

(d): expresar el mencionada DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada.

14. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 13, que además comprende:

(e): expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;

(f): purificar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y la proteína de AHAS variante mencionada de las mencionadas células;

(g): ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y proteína de AHAS variante mencionada en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y presencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, y

(h): repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica la variante de AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una primera proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene

(b): una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la mencionada célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;

: en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

(ii): una actividad catalítica que es más resistente a al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.

15. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 12 o 14, en el que la mencionada actividad catalítica en ausencia de al menos el mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea es de más de 20% de la actividad catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje.

16. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 15, en el que el mencionado herbicida es un herbicida basado en imidazolinona y una primera proteína de una primera variante de AHAS resistente a herbicida tiene:

(i): una actividad catalítica en ausencia del mencionado herbicida de más de 20% de la actividad catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje;

(iii): actividad catalítica que es más sensible a la presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con herbicidas basados en imidazolinona.

17. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 16, en el que la mencionada proteína de AHAS diana se deriva de Arabidopsis thaliana.

18. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 11 o 13, en el que la mencionada célula es E. coli.

19. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 12 o 14, en el que las mencionadas células primera y segunda son E. coli.

20. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 11 o 13, en el que la mencionada mutación es una sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente en un resto de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el grupo constituido por F135, M53, R128 y un resto de aminoácido de proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido alineado con cualquiera de los anteriores, y cualquier combinación de cualesquier de los anteriores.

21. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 20, en el que la mencionada sustitución se selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Alq, Arg128Glu, Phe135Arg, un resto de aminoácido de proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido alineado con cualquiera de los anteriores, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

22. Un DNA aislado que codifica una proteína variante de acetohidroxiácido sintasa (AHAS), proteína variante que comprende una proteína de AHAS modificada por sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente en un resto de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el grupo constituido por M53, R128, F135 y cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

23. DNA según se ha definido en la reivindicación 22, en el que la mencionada modificación altera la capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea de inhibir la actividad enzimática de la mencionada proteína.

24. DNA según se ha definido en la reivindicación 23, en el que la mencionada proteína de AHAS deriva de arabidopsis thaliana.

25. DNA según se ha definido en la reivindicación 24, en el que la mencionada sustitución se selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

26. DNA según se ha definido en la reivindicación 25, en el que la mencionada proteína de AHAS variante tiene:

(a): en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sufonilurea que inhibe AHAS,

(i): una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa; o

(ii): una actividad catalítica en combinación con cualquier segunda proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la mencionada célula, que puede ser la misma proteína variante de AHAS mencionada o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;

: en la que la mencionada célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y

(b): una actividad catalítica que es más resistente a al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje,

27. DNA según se ha definido en la reivindicación 22, en el que la mencionada AHAS variante tiene más de 20% de la actividad catalítica que la AHAS de tipo salvaje.

28. DNA según se ha definido en la reivindicación 27, en el que la mencionada AHAS variante es más resistente a herbicidas basados en imdazolinona que a herbicidas basados en sulfonilurea.

29. Un vector de DNA que comprende la secuencia de DNA de la reivindicación 22 unido operativamente a un elemento regulador de transcripción.

30. Una célula que comprende una AHAS que codifica una secuencia de DNA derivada de un vector de DNA según se ha definido en la reivindicación 29, célula que se selecciona entre el grupo constituido por células bacterianas, de hongos, plantas, insectos y mamíferos.

31. Una célula según se ha definido en a reivindicación 30, que comprende una célula de una planta.

32. Una semilla que comprende una célula según se ha definido en la reivindicación 31.

33. Una proteína de AHAS variante que comprende una proteína codificada por un DNA según se ha definido en la reivindicación 22.

34. Una proteína de AHAS variante que comprende una proteína de AHAS modificada por sustitución de al menos un resto de un aminoácido diferente en un resto de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el grupo constituido por M53, R128, F135, un resto de aminoácido de proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido alineado con cualquiera de los anteriores, y cualquier combinación de cualesquier de los anteriores.

35. Una proteína de AHAS variante según se ha definido en la reivindicación 34, en la que la modificación mencionada altera la capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/ sulfonilurea de inhibir la actividad enzimática de la mencionada proteína.

36. Una proteína de AHAS variante según se ha definido en la reivindicación 35, en la que la mencionada proteína de AHAS deriva de Arabidopsis thaliana.

37. Una proteína de AHAS variante según se ha definido en la reivindicación 33, en la que la mencionada sustitución se selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

38. Una proteína de AHAS variante según se ha definido en la reivindicación 33, proteína variante de AHAS que tiene:

(a): en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sufonilurea que inhibe AHAS mencionado,

(i): una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; o

(ii): una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la mencionada célula, que puede ser la misma proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;

39. Una proteína de AHAS variante según se ha definido en la reivindicación 33, en la que la AHAS variante tiene más de 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje.

40. Un procedimiento para conferir en una célula resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, procedimiento que comprende:

(a): clonar un DNA según se ha definido en la reivindicación 22 en un vector de expresión compatible, y

(b): transoformar el mencionado DNA en la mencionada célula, en condiciones en las que el gen mencionado se expresa a niveles suficientes para conferior a la mencionada célula resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.

41. Una célula preparada de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 40.

42. Una planta que comprende una célula según se ha definido en la reivindicación 41.

43. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 40, en el que el mencionado gen mutado codifica un aminoácido diferente, al menos uno de las posiciones 53, 128, 135 o combinaciones de ellos.

44. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 43, en el que el mencionado gen de AHAS comprende el gen de AHAS de Arabidopsis thaliana.

45. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 43, en el que la mencionada célula es una célula de una planta.

46. Un procedimiento según se ha definido en la reivindicación 45, en el que la mencionada célula es una semilla.

\newpage

47. Un procedimiento para controlar malas hierbas en un cultivo, procedimiento que comprende cultivar un campo que incluye plantas resistentes a herbicidas basados en diazolinona y/o sulfonilurea según se define en la reivindicación 42, y tratar el mencionado cultivo con el mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea.

48. Un procedimiento para controlar malas hierbas en un cultivo, procedimiento que comprende cultivar un campo que incluye plantas resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea según se define en la reivindicación 42, y tratar el mencionado cultivo con la mencionada composición herbicida basada en imidazolinona y/o sufonilurea que incluye el mencionado herbicida.

49. Una célula transformada con un DNA según se ha definido en la reivindicación 22, en la que el mencionado DNA se expresa en la mencionada célula de manera que confiere a la mencionada célula resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.

50. Una planta transformada con un DNA según se ha definido en la reivindicación 23, en la que el mencionado DNA se expresa en la mencionada célula de manera que confiere a la mencionada planta resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.