ES2256669T3

ES2256669T3 - Anticuerpos monoclonales contra la enzima quimotriptica del estrato corneo (scce) recombinante.

Info

Publication number: ES2256669T3
Application number: ES03078393T
Authority: ES
Inventors: Egelrud Torbjorn; Lennart Hansson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-20
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2014-06-20
Also published as: CN100457908C; AU684518B2; NO322728B1; HU220339B; SK158695A3; DE69433280D1; US5981256A; CZ333595A3; ATE252884T1; JP3542804B2; CA2165197C; NO955110L; ATE315584T1; HU9503618D0; FI956075L; AU6935294A; UA45314C2; EP0703985A1; CZ289600B6; DE69434612D1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un polipéptido que en su forma activa es capaz de descomponer el sustrato MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), siendo inhibida la descomposición por el polipéptido por la aprotinina, quimostatina y sulfato de cinc, y cuyo polipéptido: a) tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos 1-224 en el SEQ ID NO: 2; b) tiene una secuencia de aminoácidos de la cual una cadena constitutiva de 20 aminoácidos es homóloga en un grado de al menos 95% con una cadena de aminoácidos de la misma longitud seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2; o c) es una subsecuencia del polipéptido en a) que comprende de 50 a 250 aminoácidos.

Description

Anticuerpos monoclonales contra la enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE) recombinante.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un polipéptido que en su forma activa es capaz de descomponer el sustrato MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), siendo inhibida la descomposición por el polipéptido por la aprotinina, quimostatina y sulfato de cinc, y cuyo polipéptido:

a) tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos 1-224 en el SEQ ID NO: 2;

b) tiene una secuencia de aminoácidos de la cual una cadena constitutiva de 20 aminoácidos es homóloga en un grado de al menos 95% con una cadena de aminoácidos de la misma longitud seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2; o

c) es una subsecuencia del polipéptido en a) que comprende de 50 a 250 aminoácidos.

Breve descripción de la invención

La piel como órgano tiene interés desde el punto de vista biológico, médico y cosmético. Hay un gran número de enfermedades de la piel que son específicas del órgano, por ejemplo psoriasis y eczemas, o son manifestaciones de enfermedad general, tal como reacciones alérgicas generales. El hecho de que haya enfermedades específicas de la piel se puede considerar como una prueba de la existencia de mecanismos moleculares que son únicos para la piel. Análogamente, los estudios de procesos moleculares específicos de la piel son importantes para la comprensión y el tratamiento de los trastornos de la piel. Parece razonable suponer que varios de estos procesos de una forma u otra están relacionados con la función más especializada de la piel, es decir la formación de una barrera fisicoquímica entre el exterior y el interior del cuerpo. La barrera fisicoquímica de la piel está localizada en la capa más externa de la piel, el estrato córneo.

El estrato córneo es la estructura más especializada de la piel. Es el producto final del proceso de diferenciación de la epidermis, es decir el epitelio escamoso estratificado que representa la mayor parte de la piel. La mayoría de las células de la epidermis consisten en queratinocitos en diferentes estados de diferenciación. Los queratinocitos más interiores, las células basales, residen en una membrana basal en contacto con la dermis, que es el tejido conjuntivo de la piel, y son los únicos queratinocitos que tienen capacidad de división. Una fracción de las células basales abandona continuamente la membrana basal y pasa por un proceso de diferenciación que finalmente hace que las células se conviertan en bloques de construcción del estrato córneo. En este proceso los queratinocitos pasan por una serie de cambios de adaptación. Hay un mayor contenido de citoesqueleto que consta de citoqueratinas específicas de la epidermis. Los filamentos intermedios de células contiguas se reúnen en una unidad funcional por un mayor número de desmosomas. Los cambios más espectaculares se producen durante la transición de la capa de células vivas superior, el estrato granuloso, al estrato córneo no viable en un proceso llamado normalmente queratinización. Las proteínas reticuladas de forma covalente son depositadas cerca de la cara interior de la membrana plasmática, formando una envoltura celular muy resistente. Además, es secretada al espacio extracelular una sustancia rica en lípidos, que se origina en un organelo celular específico de los queratinocitos, y formando laminillas de lípidos que rodean las células del estrato córneo, constituyen la barrera de permeabilidad para las sustancias hidrófilas. Finalmente, desaparecen todas las estructuras intracelulares excepto los filamentos de citoqueratina densamente empaquetados.

Por lo tanto, las células del estrato córneo, los corneocitos, no son viables. Esto significa que la regulación de diferentes procesos en el estrato córneo debe ser el resultado de una "programación" en un estado en el que los queratinocitos todavía son viables. La renovación de la epidermis, que normalmente transcurre en aproximadamente cuatro semanas, durante las cuales las células son parte del estrato córneo durante aproximadamente dos semanas, termina mediante el desprendimiento de las células de la superficie de la piel en el proceso de descamación. Este proceso es un ejemplo de "programación" del estrato córneo. Un requisito previo para la función del estrato córneo como una barrera fisicoquímica es que sus células individuales se mantengan juntas mediante estructuras mecánicamente resistentes, es decir los desmosomas. La degradación de los desmosomas, que es un requisito previo para la descamación, debe estar regulada para dar así un desprendimiento celular de la superficie de la piel que equilibre la nueva producción del estrato córneo sin interferir con las funciones de barrera del tejido.

Trastornos de queratinización

En un gran número de estados patológicos de la piel de diferente gravedad, hay alteraciones del proceso de queratinización. En la psoriasis, además de una inflamación crónica típica, hay sobreproducción de un estrato córneo inmaduro que da como resultado la típica descamación de esta enfermedad. Hay un grupo de enfermedades de la piel hereditarias caracterizadas por un estrato córneo engrosado que conduce a la formación de "escamas de pescado", la llamada ictiosis. En varias de las ictiosis hay una velocidad de descamación menor. Aunque menos grave que la ictiosis, la "piel seca" (xeroderma) también se caracteriza por un estrato córneo en el que los corneocitos se desprenden, no como en las condiciones normales como células solas o como pequeños agregados de células, si no como escamas grandes, macroscópicamente visibles. Este trastorno es muy común entre la gente mayor y entre atópicos, es decir individuos con una menor resistencia a los irritantes de la piel y con una disposición a desarrollar una forma característica de eczema endógeno. En las enfermedades de acné hay una queratinización alterada en los conductos de las glándulas sebáceas que conduce a la formación de comedones y tapones. La formación de comedones precede y se cree que provoca la lesión inflamatoria del acné.

Las enzimas proteolíticas están implicadas en la queratinización

Hay varias etapas en el proceso de queratinización y durante la renovación del estrato córneo donde parece que las enzimas proteolíticas juegan papeles importantes. Con toda certeza, la desaparición de todas las estructuras intracelulares excepto los filamentos de citoqueratina, que se produce durante la transición entre capas epidérmicas viables y cornificadas debe implicar proteolisis. La transformación de profilagrina en filagrina, una proteína que se cree que funciona en el tipo especial de agregación de filamentos de citoqueratina durante la queratinización, puede ser catalizada por una proteinasa específica. En el estrato córneo la filagrina además es degradada a componentes de bajo peso molecular que probablemente son importante como "hidratantes naturales". Además hay modificaciones proteolíticas de los polipéptidos de citoqueratina durante el proceso de queratinización. Finalmente, es probable que los sucesos proteolíticos jueguen papeles cruciales en la degradación de las estructuras cohesivas intercelulares en el estrato córneo en procesos que finalmente conducen a la descamación.

Cohesión y descamación de las células del estrato córneo. El papel de los desmosomas

La cohesión intercelular en el estrato córneo así como en las partes viables de la epidermis es mediada en gran medida por los desmosomas. Un desmosoma consta de dos mitades simétricas, cada una de las cuales está formada por dos células contiguas. Cada mitad de desmosoma tiene una parte intracelular unida a los filamentos de citoqueratina y una parte compuesta de glucoproteínas anclada intracelularmente y con partes de transmembrana y extracelulares. Las partes extracelulares de estas proteínas, las desmogleinas, son moléculas de adhesión, y mediante la interacción entre ellas en el espacio extracelular se forma una estructura cohesiva. La degradación de los desmosomas parece que sigue rutas algo diferentes en el estrato córneo de las palmas y plantas comparado con el estrato córneo que no es palmo-plantar. En este último tejido alrededor de 85% de los desmosomas desaparecen poco después de que las células se hayan cornificado completamente. El resto de los desmosomas, que se localizan preferentemente en los bordes vellosos de las células extremadamente aplanadas, aparentemente permanecen intactos hasta el nivel en el que se produce la descamación. En el estrato córneo palmo-plantar los corneocitos están mucho menos aplanados y no hay una degradación extensa de los desmosomas en las capas más profundas del tejido. En ambos tejidos la descamación está asociada con degradación de desmosomas. Se ha mostrado que en la piel con ictiosis así como en la "piel seca", el número de desmosomas en las capas superficiales del estrato córneo ha aumentado.

Lípidos intercelulares del estrato córneo

La diferencia de degradación de los desmosomas entre el estrato córneo palmo-plantar y el que no es palmo-plantar, puede estar relacionada con la diferencia de las cantidades de lípidos extracelulares en los dos tipos de tejidos. El contenido de lípidos es considerablemente mayor en el estrato córneo no palmo-plantar. Como corolario, la eficacia de este tejido como barrera de permeabilidad al agua y otras sustancias hidrófilas es superior a la del estrato córneo de las palmas y plantas. Puesto que los desmosomas ocupan un volumen significativo y puesto que los desmosomas intactos evitan un ensanchamiento del espacio extracelular, la degradación de los desmosomas puede ser un mecanismo por el cual quede disponible más espacio extracelular para los lípidos. Los lípidos extracelulares del estrato córneo también están relacionados con la descamación en varias formas distintas. Puesto que son constituyentes mayoritarios del espacio extracelular, se puede esperar que tengan importantes influencias en las actividades de las enzimas con función en este lugar, por ejemplo, en las enzimas responsables de la degradación de los desmosomas. De hecho, se ha mostrado que diferentes alteraciones del metabolismo de lípidos son las causas probables de diferentes tipos de ictiosis. También es probable que los propios lípidos contribuyan en cierta medida a la cohesión celular del estrato córneo. Además, es probable que la secreción de lípidos al espacio extracelular del estrato córneo esté asociada con la secreción también de una serie de enzimas. Los precursores de los lípidos se almacenan en los queratinocitos superiores viables en los orgánulos específicos. Se ha mostrado que estos llamados cuerpos laminares contienen una serie de enzimas hidrolíticas. Por lo tanto se contempla que una enzima responsable de la degradación de los desmosomas en el estrato córneo, sea sintetizada por los queratinocitos, posiblemente en una proforma inactiva, almacenada en los cuerpos laminares, y secretada al espacio extracelular del estrato córneo durante la queratinización, donde puede ser activada y su actividad puede ser después regulada, entre otros factores, por la composición de los lípidos extracelulares.

Trastornos de la cohesión celular en la epidermis viable

Hay una serie de enfermedades de la piel donde está dañada la cohesión entre queratinocitos en las capas epidérmicas viables, no cornificadas. Estas enfermedades se caracterizan por un fenómeno llamado acantolisis, que es una rotura de los contactos de desmosomas entre queratinocitos que por lo demás parecen normales. Es probable que el proceso sea mediado por proteinasas, que hasta ahora no se han identificado completamente. La acantolisis, que cuando es extensa conduce a la formación de ampolla, es una característica de las enfermedades autoinmunes pénfigo vulgar y pénfigo foliáceo, el pénfigo benigno familiar hereditario (enfermedad de Hayley-Hayley), y la disqueratosis folicular hereditaria (enfermedad de Darier).

La epidermis participa de forma activa en reacciones inmunológicas e inflamatorias

Además de su función como productor de la barrera fisicoquímica entre el interior y exterior del cuerpo, la epidermis también funciona como una barrera inmunológica activa. Los queratinocitos también son capaces de producir, así como de responder a un gran número de citoquinas y otros mediadores inflamatorios mediante los cuales se comunican e interaccionan con células de los sistemas inmunológico e inflamatorio. Esto tiene una importancia fundamental en la defensa del hospedante frente a infecciones microbianas y en la curación de heridas. La investigación moderna también ha mostrado que es probable que los queratinocitos participen activamente en muchas enfermedades inflamatorias de la piel tales como la psoriasis y eczemas.

Las proteinasas epidérmicas pueden ser importantes en la inflamación

Una de las citoquinas producidas por los queratinocitos es la interleuquina 1 (IL-1). La IL-1 existe en dos formas, IL-1\alpha e IL-1\beta, y ambas están presentes en la epidermis. Mientras que la IL-1\alpha es completamente activa como es sintetizada, la IL-1\beta es sintetizada como una proforma inactiva de 31 kD. La Pro-IL-1\beta se convierte en la forma activa de 17 kD por una proteinasa específica presente, por ejemplo, en monocitos, pero no detectada hasta ahora en la epidermis normal. Sin embargo, una serie de serina-proteinasas con especificidad de sustrato de tipo quimotripsina (quimotripsina pancreática y catepsina G de granulocitos neutrófilos), también pueden servir como activadores de la pro-IL-1\beta.

Tal como sugiere Norris (1990), las enzimas proteolíticas presentes en el espacio intracelular del estrato córneo, en ciertas condiciones pueden convertir formas inactivas de citoquinas en formas activas. En este contexto es particularmente interesante la pro-interleuquina-1\beta biológicamente inactiva, que se ha mostrado que es producida por queratinocitos (Mizutani et al., 1991). Hasta ahora no se han encontrado enzimas epidérmicas con la capacidad de convertir la pro-interleuquina-1\beta en la interleuquina-1\beta activa. Sin embargo, puesto que la quimotripsina y catepsina G (una enzima de tipo quimotripsina) son capaces de catalizar la conversión de la pro-interleuquina 1\beta recombinante inactiva de 31 kD en una forma totalmente activa de 17 kD, también es posible que las enzimas epidérmicas de tipo quimotripisina puedan catalizar esta conversión.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente una enzima que se ha denominado enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE, por sus siglas en inglés) que se cree es responsable de la degradación de desmosomas en el estrato córneo. En el Ejemplo 1 se presentan pruebas que muestran que el desprendimiento de células de la superficie de la capa superficial cornificada de la piel implica la degradación de las proteínas de los desmosomas, y que parece que la enzima responsable es una serina-proteinasa de tipo quimotripsina que puede ser inhibida por iones cinc.

El Ejemplo 2 describe el descubrimiento de la enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE); una proteinasa que cumple los criterios de ser responsable de la degradación de las estructuras cohesivas intracelulares en el estrato córneo in vitro y posiblemente también in vivo. El Ejemplo 3 describe la caracterización parcial de la actividad de la enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE) usando sustratos cromógenos.

Los resultados demuestran que la SCCE difiere enzimológicamente de otras proteinasas quimotrípticas. El perfil inhibidor y la capacidad de degradar dos sustratos diferentes de las enzimas de tipo quimotripsina es significativamente diferente para la SCCE cuando se compara con la quimotripsina bovina y catepsina G humana. La SCCE también parece que difiere de la quimasa de células cebadas humanas. Esta última enzima cataliza eficazmente la degradación de Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (véase Schwarts et al., 1987 y Schechter et al., 1989) - lo cual no hace la SCCE - y no es inhibida por la aprotinina o SBTI (Schechter et al., 1983, y Wintroub et al., 1986), pero si lo es la SCCE.

El Ejemplo 4 describe la purificación parcial de la SCCE a partir de extractos en KCl de corneocitos mediante cromatografía de afinidad en inhibidor de tripsina de soja insolubilizada (SBTI, por sus siglas en inglés) y la determinación de la secuencia de los aminoácidos N-terminales de la SCCE. Con muestras sin reducir los rendimientos fueron buenos en las etapas 1-6, pero cayeron a cero en las etapas 7 y 9, y los rendimientos en las etapas posteriores fueron notablemente menores. Tampoco con muestras reducidas se pudieron detectar derivados de aminoácido en las etapas 7 y 9, pero para las etapas posteriores donde se pudieron detectar los derivados, no hubo disminución pronunciada de los rendimientos. Estos resultados sugieren que hay cisteínas en las posiciones 7 y 9. Sin embargo, no se pudo detectar cisteína carboximetilada en las etapas 7 y 9 después de reducción y tratamiento con ácido yodoacético (100 mM). La secuencia obtenida (Fig. 13, SEQ ID NO: 3) era idéntica para las muestras reducidas y sin reducir.

El Ejemplo 5 describe la preparación de anticuerpos monoclonales específicos para SCCE y anticuerpos policlonales de conejo y pollo específicos para SCCE, así como estudios inmunohistoquímicos con los anticuerpos monoclonales.

El Ejemplo 6 describe la clonación y secuenciación de un cDNA que codifica la SCCE humana. Inicialmente, se cribó una biblioteca de cDNA preparada a partir de mRNA obtenido de queratinocitos humanos adultos de origen epidérmico, con anticuerpos policlonales anti-SCCE de conejo. Uno de los anticuerpos dio una señal de fondo grande y se excluyó del estudio de cribado exhaustivo en una etapa temprana. Usando otro anticuerpo policlonal (D-5), se enriquecieron una serie de calvas inmunorreactivas, como se preveía para calvas positivas verdaderas. Sin embargo, no se observó reactividad con los anticuerpos monoclonales moAb 4 y moAb 9 para ninguna de las calvas. Una caracterización exhaustiva con enzimas de restricción y caracterización por PCR de once calvas aisladas, reveló que no se podían detectar similitudes entre las diferentes calvas. Basándose en ese fracaso, para definir una "huella dactilar" de una secuencia probable de cDNA de la SCCE, se tuvo que modificar la estrategia.

A pesar de la detección preferente del material inmunorreactivo de la SCCE en los queratinocitos suprabasales, se usó una biblioteca de cDNA preparada a partir de queratinocitos humanos cultivados para el cribado del cDNA de SCCE. Se puede esperar que dicha biblioteca contenga cDNA sólo de queratinocitos basales. Este intento se basó en la observación de una inmunotinción débil pero probablemente significativa usando anticuerpos monoclonales de SCCE sólo de queratinocitos basales.

Las calvas se cribaron usando una sonda de oligonucleótido 17-mero sintético diseñada basándose en la parte más segura de la secuencia de aminoácidos, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 10, aa 1 - aa 6), de la secuencia de aminos terminales determinada experimentalmente de la enzima SCCE nativa, como se describe en el Ejemplo 4. Debido a la incertidumbre en la secuencia de aminoácidos determinada experimentalmente, se consideró que este hexapéptido representaba una de las partes más seguras. Además, los posibles codones que codifican este hexapéptido dieron como resultado la menor degeneración posible de la sonda de DNA. La secuencia determinada experimentalmente más larga Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (SEQ ID NO: 3, aa 15 - aa 24), se excluyó debido al alto grado de degeneración de una secuencia que codifica esta secuencia peptídica. Se identificaron catorce calvas positivas en el cribado principal. Estas calvas positivas se volvieron a cribar usando la misma sonda y métodos descritos antes. Después del procedimiento de recribado, se identificaron dos calvas positivas. Las dos calvas seleccionadas se purificaron una vez más, y se determinó el tamaño de los insertos por PCR usando SYM 1600 y SYM 1601, que eran complementarios de los dos brazos del fago, como cebadores y fagos aislados como moldes. Este fragmento clonado se sometió a un análisis de secuencia parcial.

La traducción de la secuencia de DNA obtenida dio como resultado una secuencia de aminoácidos que era homóloga a la secuencia de la proteína determinada experimentalmente. Sin embargo, la secuencia carecía de una codón de iniciación de traducción. Para aislar un cDNA de longitud completa, el fragmento de DNA obtenido se separó en gel de agarosa y se usó como sonda permitiendo la hibridación en condiciones restrictivas. Para obtener un cDNA de longitud completa, la biblioteca de cDNA se volvió a cribar dos veces con esta sonda usando los mismos métodos descritos antes, excepto que la hibridación fue en condiciones restrictivas, a 65ºC. Estos experimentos dieron como resultado la identificación y aislamiento de 45 calvas positivas individuales, que inicialmente se cribaron por análisis de PCR usando SYM 1600 o SYM 1601 combinado con SYM 3208 como cebadores de la PCR para la identificación de una calva que contenía el marco de lectura abierto 5' entero.

Después de un cribado y análisis de secuencia adicionales, los fragmentos amplificados de la PCR resultantes obtenidos de estos fagos, se clonaron como se describe con detalle en el Ejemplo 6, y los resultados indicaron que uno de los fagos, 205.2.1, contenía un inserto de longitud completa. Se determinó la secuencia de nucleótidos completa del fragmento de cDNA. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) contenía un marco de lectura abierto suficiente para codificar la secuencia de aminoácidos completa de una proteína precursora de la SCCE, que constaba de 253 aminoácidos que incluía un péptido señal y un prepolipéptido (SEQ ID NO: 2).

El Ejemplo 7 describe la detección en la epidermis humana de dos especies de m-RNA de SCCE que podían hibridar con sondas de cDNA preparadas basándose en una secuencia de cDNA de la SCCE.

El Ejemplo 8 describe la expresión de la SCCE recombinante en E. coli. Los resultados muestran que se puede producir SCCE recombinante en bacterias.

El Ejemplo 9 describe la expresión de la SCCE recombinante humana en células de mamíferos. Se producen tres proteínas que muestran reacción con todos los anticuerpos policlonales de SCCE de conejo y pollo disponibles, así como con los anticuerpos monoclonales depositados. Las proteínas recombinantes que son reactivas con los anticuerpos cultivados frente a SCCE nativa muestran un peso molecular aparente que es aproximadamente 1 kDa mayor que la SCCE humana nativa purificada. La proteína recombinante no muestra ninguna actividad proteolítica.

La purificación, activación y posterior caracterización de la SCCE recombinante se describe en el Ejemplo 10. La proforma inactiva de la SCCE recombinante se puede activar por escisión proteolítica con tripsina o endopeptidasa Lys-C. Se contempla que una serie de proteasas distintas que escinden un péptido después de un aminoácido básico, tal como la endoproteinasa Lys-C, papaína y plasmina, podrán activar la por-SCCE en SCCE activa. Se ha encontrado que el péptido señal consta de 22 aminoácidos, y basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminales de la SCCE activa nativa, el propéptido consta de siete aminoácidos. Además, se muestra que la SCCE recombinante producida existe en dos formas N-glicosiladas y una forma no glicosilada, lo cual es análogo a los resultados obtenidos con la SCCE nativa activa.

Por la expresión "enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE)" o "un polipéptido que tiene actividad de SCCE" se entiende, en su aspecto más amplio, una serina-proteasa o una de sus proformas, tal como una proenzima (pro-SCCE) o una proteína de fusión que puede ser activada por escisión proteolítica, siendo inhibida dicha enzima en su forma activa por los mismos inhibidores y de una forma similar a la disociación celular espontánea que se puede inducir en sistemas modelo con muestras de capa cornificada de la piel incubada a pH neutro o casi neutro a temperatura fisiológica.

Más específicamente, la expresión "un polipéptido que tiene actividad de SCCE" define así un polipéptido que es diferente de la quimotripsina y catepsina G, y que en su forma activa puede descomponer el sustrato MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), siendo inhibida la descomposición por el polipéptido por aprotinina, quimostatina y sulfato de cinc, esencialmente como se describe en los Ejemplos 3 y 13 y se ilustra en la Fig. 9 y Tabla 5.

Incluso más específicamente, la expresión "un polipéptido que tiene actividad de SCCE" comprende un polipéptido que puede causar la degradación proteolítica de la proteína de los desmosomas desmogleina I durante la incubación in vitro de estrato córneo plantar.

Dicho polipéptido en general también reaccionará con anticuerpos cultivados frente a SCCE nativa que ha sido purificada de un extracto de células de estrato córneo plantar disociadas. Ejemplos de dichos anticuerpos son los anticuerpos policlonales producidos como se describe en 5.2 y los anticuerpos monoclonales TE4b y TE9b producidos como se describe en el Ejemplo 5.1. Los anticuerpos monoclonales son producidos por los hibridomas TE4b y TE9b depositados con los números de acceso en el "European collection of Animal Cell Cultures", Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, ECACC 93061817 y ECACC 93061816, respectivamente de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest.

La clonación y secuenciación de un cDNA que codifica la SCCE humana se describe en el Ejemplo 6. Se ha encontrado una secuencia de nucleótidos que contiene un marco de lectura abierto suficiente para codificar la secuencia de aminoácidos entera de una proteína precursora de la SCCE que consta de 253 aminoácidos que incluye un péptido señal y un prepolipéptido. La secuencia de nucleótidos se muestra en el SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos deducida de la "enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE)" se muestra en el SEQ ID NO: 2.

Por la expresión "pro-SCCE o uno de sus análogos o variantes" se entiende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o un análogo o variante de dicha secuencia, que es producido cuando una secuencia de nucleótidos de la invención es expresada en un sistema de expresión adecuado, y el cual después de activación proteolítica da lugar a una serina-proteinasa que puede ser inhibida por los mismos inhibidores de la disociación celular espontánea que se puede inducir en sistemas modelo con muestras de capa de piel cornificada incubadas a pH neutro o casi neutro, a temperatura fisiológica, es decir, aproximadamente 37ºC. En general, la proteína reaccionará con anticuerpos cultivados frente a SCCE recombinante o nativa purificada.

Por la expresión "una SCCE o uno de sus análogos o variantes" se entiende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o un análogo o variante de dicha secuencia, que es producido cuando una secuencia de nucleótidos de la invención es expresada en un sistema de expresión adecuado, y el cual es una serina-proteinasa que puede ser inhibida por los mismos inhibidores de la disociación celular espontánea que se puede inducir en sistemas modelo con muestras de capa de piel cornificada incubadas a pH neutro o casi neutro a temperatura fisiológica, es decir, aproximadamente 37ºC. En general, la proteína reaccionará con anticuerpos cultivados frente a SCCE recombinante o nativa purificada.

Por la expresión "uno de sus análogos o variantes" se entiende, por lo tanto, un polipéptido que no tiene exactamente la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, pero que todavía tiene "actividad de SCCE" como se ha definido antes. En general, dichos polipéptidos serán polipéptidos que varían, por ejemplo, en cierto grado en la composición de aminoácidos, o las modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glicosilación o fosforilación, comparado con la proteína SCCE descrita en los ejemplos.

Por lo tanto, el término "análogo" o "variante" se usa en el presente contexto para indicar una proteína o polipéptido de una composición o secuencia de aminoácidos similar a la secuencia de aminoácidos característica SEQ ID NO: 2 obtenida de la proteína SCCE como se describe en el Ejemplo 6, que permite variaciones poco importantes que alteran la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, deleciones, mutaciones dirigidas al sitio, inserciones de aminoácidos extra, o sus combinaciones, para generar análogos de la proteína SCCE. Estas modificaciones pueden dar nuevas propiedades del análogo interesantes y útiles. El polipéptido o proteína análoga se puede obtener de un animal o un ser humano, o puede ser de origen parcial o completamente sintético. El análogo también se puede obtener usando técnicas de DNA recombinante.

Por lo tanto, una realización importante se refiere a un polipéptido en el que se ha sustituido al menos un resto aminoácido por un resto aminoácido diferente y/o en el que se ha suprimido o añadido al menos un resto aminoácido, de forma que resulta un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es diferente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una subsecuencia de dicha secuencia de aminoácidos como se define a continuación, pero que tiene esencialmente actividad de SCCE como se ha definido antes.

Una realización interesante se refiere a un polipéptido que es un análogo o subsecuencia del polipéptido de la invención, que comprende de 50 a 250 aminoácidos, por ejemplo, al menos 70 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos.

Las realizaciones particularmente importantes son el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos -7-224 de la SEQ ID NO: 2 (pro-SCCE) y el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos 1-224 de la SEQ ID NO: 2 (SCCE).

La expresión "subsecuencia enzimáticamente activa" indica una secuencia de polipéptido que comprende sólo una parte de la secuencia de polipéptido mostrada en la SEQ ID NO: 2, y que tiene actividad enzimática. También se incluyen subsecuencias de polipéptidos que se han hecho análogas por modificaciones como se explica en la presente memoria. El polipéptido específico (o polipéptidos) que comprende el sitio enzimáticamente activo, se considera particularmente interesante.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 predicha se ha comparado con las secuencias de aminoácidos de las enzimas quimotripsinas humanas (Toulta et al., 1989), catepsina G humana (Salvesen et al., 1987) y quimasa de células cebadas humanas (Caughey et al., 1991). Aunque la secuencia de aminoácidos deducida contiene las regiones activas conservadas de las serina-proteasas, el grado de homología es bastante bajo, aproximadamente 33-38%. En relación con esto, parece, por lo tanto, que la SCCE sólo tiene una similitud moderada con las serina-proteinasas previamente conocidas. Por otra parte, la SCCE es una serina-proteinasa típica en lo que se refiere a los restos histidina, aspartato y serina del sitio activo y regiones conservadas cerca de estos sitios. Esto también es cierto para la mayor parte de los restos cisteína y otras regiones altamente conservadas de las serina-proteinasas. En la parte inferior de la bolsa de especificidad principal (resto 189 en la quimotripisina) hay un resto serina en la quimotripisina humana, quimasa de células cebadas, y el antígeno específico para la próstata, y un resto alanina en la catepsina G humana. Por otra parte, en la SCCE, esta posición está ocupada por un reto asparagina. Esto podría explicar el descubrimiento de que aunque indudablemente la SCCE tiene actividad quimotríptica, su actividad relativa frente a diferentes sustratos peptídicos cromógenos difiere de la de la quimotripsina y catepsina G, así como la eficacia inhibidora de la quimostatina, un inhibidor de bajo peso molecular de las enzimas de tipo quimotripsina.

En la siguiente alineación de secuencias se muestra una comparación entre las secuencias de la quimotripisina humana, catepsina G humana y quimasa de células cebadas humanas y la de la SCCE.

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1

Alineación llevada a cabo manualmente.

HUMCTRP = quimotripsina humana (Touita et al., BBRC 158:569-575, 1989).

HUMCHTG = catepsina G humana (Salvesen et al., Biochemistry 26:2289-2293, 1987).

HUMCHYM = quimasa de células cebadas humanas (Caughey et al., J. Biol. Chem. 266:12956-12963, 1991).

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Homologías:

HUMCTRP/SCCE: 85/224 = 38%

HUMCHTG/SCCE: 74/224 = 33%

HUMCHYM/SCCE: 74/224 = 33%

HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48%

La numeración se refiere al quimotripsinógeno.

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Subrayados:

Regiones conservadas cerca del sitio activo (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 en la quimotripsina) y de la bolsa de especificidad principal de la quimotripsina (Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226 en la quimotripsina).

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Asterisco: Posible sitio de N-glicosilación en la SCCE.

Por lo tanto, una realización importante se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la que una cadena de 20 aminoácidos consecutivos es homóloga en un grado de al menos 80% con una cadena de aminoácidos de la misma longitud seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2.

Las secuencias de polipéptidos que tienen una homología de al menos 80% tal como al menos 85%, por ejemplo 90%, con el polipéptido mostrado en el SEQ ID NO: 2, constituyen realizaciones importantes. Puesto que la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 2 parece que es bastante especial, el alcance comprende los polipéptidos para los que el grado de homología con una cadena de 20 aminoácidos consecutivos similar seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 no puede ser más de 55%, aunque preferiblemente no más de 70%. Dichas secuencias se pueden obtener de proteínas similares de otras especies, por ejemplo, otros mamíferos tales como ratón, rata, conejo, cobayo, cerdo o vaca. Puesto que partes minoritarias de la secuencia pueden mostrar similitudes considerables con otras serina-proteasas, el alcance también incluye péptidos con un grado de homología de al menos 95%, y más preferiblemente al menos 99% de homología con una cadena similar de 20 aminoácidos consecutivos seleccionada de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

Por la expresión "homología de la secuencia" se entiende la identificación en la secuencia de aminoácidos en segmentos de dos o más aminoácidos, en la correspondencia con respecto a la identificación y posición de los aminoácidos de los polipéptidos.

Por lo tanto, el término "homólogo" se usa aquí para ilustrar el grado de identificación entre la secuencia de aminoácidos de un polipéptido dado y la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos que se va a comparar con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, se puede deducir de una secuencia de nucleótidos tal como una secuencia de DNA o RNA, por ejemplo, obtenida por hibridación como se define a continuación, o se puede obtener por métodos convencionales de secuenciación de aminoácidos. El grado de homología preferiblemente se determina en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido maduro, es decir, sin tener en cuenta ninguna secuencia líder. En general, sólo se usan regiones de codificación cuando se comparan secuencias de nucleótidos con el fin de determinar su homología interna.

En el presente contexto la expresión "polipéptido que es reconocido por al menos uno de los anticuerpos depositado" se pretende que incluya una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos que constituyen un tramo sustancialmente consecutivo en términos de conformación lineal o espacial de cualquier subsecuencia del polipéptido mostrada en el SEQ ID NO: 2, que es reconocida por al menos uno de los anticuerpos depositados. Como es bien sabido en la técnica, la conformación secundaria o terciaria también puede tener propiedades interesantes y útiles y puede constituir epítopos. Los anticuerpos depositados TE4b y TE9b parece que reconocen epítopos conformacionales de la SCCE.

Se ha mostrado que un anticuerpo policlonal de conejo preparado como se describe en el Ejemplo 5.2.2 producía un teñido granular del estrato granuloso y un teñido bastante difuso del estrato córneo inferior en miscroscopía de inmunofluorescencia.

Los anticuerpos cultivados frente a SCCE nativa purificada o recombinante, en general se unirán a células suprabasales en el epitelio escamoso humano queratinizado (cornificado), pero no a células epiteliales en el epitelio escamoso no cornificado. Estos anticuerpos también se unirán al espacio intercelular de la capa de piel humana cornificada.

Los anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 1 son adecuados para una serie de propósitos como se lista a continuación:

Para purificación de proteínas: Los anticuerpos se pueden usar para purificar el(los) polipéptido(s) o sus análogos de muestras biológicas, usando la cromatografía de afinidad o las técnicas de inmunoprecipitación.

Para diagnóstico y terapia: Los anticuerpos monoclonales frente al(los) polipéptido(s) o sus análogos, se pueden usar en el diagnóstico y terapia de estados patológicos en animales y seres humanos. El agente de diagnóstico puede ser un anticuerpo con especificidad por el polipéptido de la invención. El anticuerpo se puede acoplar a otra proteína o a un soporte sólido y/o se puede usar en ensayos de aglutinación o ensayos de desarrollo de color. Dichos anticuerpos también se pueden usar para cuantificar polipéptidos de SCCE o sus análogos en muestras biológicas usando técnicas de histoquímica o inmunoquímica patrón.

La memoria describe una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se ha definido antes. En particular, la memoria describe una secuencia de nucleótidos que comprende sustancialmente la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1. Otras realizaciones importantes se refieren a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una subsecuencia de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos -7-224 del SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos 1-224 del SEQ ID NO: 2.

La memoria también describe una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 en condiciones muy restrictivas como se describe en el Ejemplo 7 y Ejemplo 9.

En otro aspecto, la memoria describe una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 o un análogo o subsecuencia suya, que

1) presenta una homología con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1 de al menos 90%, y/o

2) codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos presenta una homología de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2, y/o

3) codifica un polipéptido que se une al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma TE4b, que ha sido depositada el 18 de junio de 1993 en ECACC y ha obtenido el número de deposición ECACC provisional 93061817, o al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma TE9b, que ha sido depositada el 18 de junio de 1993 en ECACC y ha obtenido el número de deposición provisional en ECACC 93061816, y/o

4) codifica un polipéptido que se une a un antisuero policlonal obtenido frente a SCCE nativa que se ha purificado a partir de un extracto de células disociadas del estrato córneo plantar.

El alcance también incluye una secuencia de nucleótidos modificada que difiere de la secuencia de nucleótidos antes definida en que se ha delecionado, sustituido o modificado al menos un nucleótido o se ha insertado al menos un nucleótido adicional de tal manera que resultara una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta actividad SCCE.

El término "análogo" en relación con los fragmentos de DNA de la invención se pretende que indique una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido idéntico o sustancialmente idéntico al polipéptido codificado por un fragmento de DNA de la invención. Es bien sabido que el mismo aminoácido puede ser codificado por diferentes codones, estando relacionado el codón que se usa, entre otros, con la preferencia del organismo en cuestión que expresa la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, se pueden intercambiar uno o más nucleótidos o codones del fragmento de DNA de la invención por otros que, cuando son expresados, dan como resultado un polipéptido idéntico o sustancialmente idéntico al polipéptido codificado por el fragmento de DNA en cuestión.

También, el término "análogo" se usa en el presente contexto para indicar un fragmento de DNA o una secuencia de DNA de una composición o secuencia de nucleótidos similar a la secuencia de DNA característica de SEQ ID NO: 1 que codifica la secuencia de aminoácidos que constituyen los polipéptidos de la SCCE, permitiendo variaciones poco importantes que no tienen un efecto adverso significativo en la actividad enzimática del análogo comparado con la actividad de la proteína de SCCE nativa como se describe en el Ejemplo 3. Por la expresión "efecto adverso significativo" se entiende que la actividad enzimática del análogo debe ser al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, incluso más preferiblemente al menos 70%, tal como al menos 75% de la actividad enzimática de la SCCE nativa, cuando se determina, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3. El fragmento de DNA o secuencia de DNA análogo se puede obtener de un organismo tal como un animal o un ser humano, o puede ser parcialmente o completamente de origen sintético. El análogo también se puede obtener usando técnicas de DNA
recombinante.

Además, los términos "análogo" y "subsecuencia" se pretende que permitan variaciones en la secuencia tales como sustitución, inserción (incluyendo intrones), adición y transposición de uno o más nucleótidos, cuyas variaciones no tienen ningún efecto adverso sustancial en el polipéptido codificado por el fragmento de DNA o sus subsecuencias.

El término "sustitución" se pretende que signifique la sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia completa de nucleótidos por uno o más nucleótidos diferentes, "adición" se entiende que significa la adición de uno o más nucleótidos en cualquier extremo de la secuencia completa de nucleótidos, "inserción" se pretende que signifique la introducción de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia completa de nucleótidos, "deleción" se pretende que indique que uno o más nucleótidos han sido eliminados de la secuencia completa de nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia o en cualquier punto adecuado dentro de ella, y "transposición" se pretende que signifique que dos o más restos de nucleótidos se han intercambiado dentro de la secuencia de DNA o de polipéptido, respectivamente. Sin embargo, el fragmento de DNA también se puede modificar por mutagénesis antes o después de insertarlo en el organismo.

Los términos "fragmento", "secuencia", "subsecuencia" y "análogo", usados en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones con respecto a los fragmentos, secuencias, subsecuencias y análogos de acuerdo con la invención, se deben entender por supuesto, como si no comprendieran este fenómeno en su entorno natural, si no más bien, por ejemplo, en forma aislada, purificada, in vitro o recombinante.

Los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden producir usando tecnología de DNA recombinante. Una realización importante se refiere a un sistema de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos.

El organismo que se usa para producir el polipéptido puede ser un organismo superior, por ejemplo, un animal o un organismo inferior, por ejemplo un microorganismo tal como E. coli. Sin tener en cuenta el tipo de organismo usado, el fragmento de DNA se introduce en el organismo directamente o mediante un vector adecuado. Alternativamente, los polipéptidos se pueden producir en líneas celulares de mamíferos introduciendo el fragmento de DNA o uno de sus análogos o subsecuencia directamente o mediante un vector de expresión.

El fragmento de DNA o uno de sus análogos o subsecuencias también se puede clonar en un vector de expresión estable adecuado y después poner en una línea celular adecuada. Después se seleccionan las células que producen los polipéptidos deseados basándose en los niveles de productividad en condiciones adecuadas para el vector y la línea celular usados. Las células seleccionadas se hacen crecer más y forman una fuente muy importante y continua de los polipéptidos deseados.

Un ejemplo de un análogo específico de la secuencia de DNA de la invención, es una secuencia de DNA que comprende la secuencia de DNA mostrada en el SEQ ID NO: 1 o una de sus partes y que está particularmente adaptada para la expresión en E. coli. Esta secuencia de DNA es una que, cuando se inserta en E. coli junto con secuencias reguladoras adecuadas, da como resultado la expresión de un polipéptido que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 o una de sus partes. Por lo tanto, esta secuencia de DNA comprende codones específicos reconocidos por E. coli. Se describe un ejemplo de esta realización en el Ejemplo 8.

En el presente contexto, el término "gen" se usa para indicar una secuencia de DNA que está implicada en la producción de una cadena polipeptídica y que incluye regiones que preceden y siguen a la región de codificación (secuencias corriente arriba de 5' y corriente abajo de 3'), así como secuencias interpuestas, intrones, que están situadas entre segmentos de codificación individuales, exones, o en la región corriente arriba de 5' o corriente abajo de 3'. La región corriente arriba de 5' comprende una secuencia reguladora que controla la expresión del gen, típicamente un promotor. La región corriente abajo de 3' comprende secuencias que están implicadas en la terminación de la transcripción del gen y opcionalmente secuencias responsables de la poliadenilación del transcrito y de la región no traducida 3'.

De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere a un sistema de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos como se ha descrito antes, que codifica un polipéptido, comprendiendo el sistema una secuencia flanqueadora de 5' capaz de mediar la expresión de dicha secuencia de nucleótidos.

En particular, la memoria describe un vector de expresión replicable que lleva y es capaz de mediar la expresión de una secuencia de nucleótidos. Una realización específica se refiere a un vector de expresión replicable denominado pS507 que ha sido depositado el 11 de Mayo de 1993 con el número de acceso en la colección de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) DSM 8282, de acuerdo con las disposiciones del tratado de Budapest, y a vectores de expresión que expresan secuencias de nucleótidos que difieren de la secuencia de nucleótidos de dicho vector de expresión depositado, pero que codifican el mismo polipéptido o uno de sus análogos o variantes que tiene actividad de SCCE.

En otras palabras, la memoria también describe un vector de expresión replicable como se ha descrito antes, en el que la secuencia de nucleótidos expresada es una que difiere de la secuencia de nucleótidos del vector depositado, en que al menos un nucleótido se ha eliminado, sustituido o modificado, o al menos se ha insertado un nucleótido adicional, a fin de dar como resultado una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de SCCE.

Además, la memoria describe un plásmido denominado pS500, que ha sido depositado el 11 de Mayo de 1993 con el número de acceso en la colección de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) DSM 8281, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, y a plásmidos que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, pero que codifica el polipéptido mostrado en el SEQ ID NO: 2 o uno de sus análogos o variantes, que tiene actividad de SCCE, o que hibrida con la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1, o una de sus partes en condiciones de hibridación restrictivas.

Dentro del alcance también está un organismo no humano que lleva un sistema de expresión de acuerdo con la invención. Los organismos que se pueden usar en este aspecto de la invención comprenden un microorganismo tal como una bacteria del género Bacillus, Escherichia o Salmonella, una levadura tal como Saccharomyces, Pichia, un protozoo, o célula obtenida de un organismo multicelular tal como un hongo, una célula de insecto, una célula de planta, una célula de mamífero o una línea celular. Si el organismo es una bacteria, se prefiere que la bacteria sea del género Escherichia, por ejemplo E. coli.

La memoria además describe un vector plásmido que contiene una secuencia de DNA que codifica un polipéptido o un polipéptido de fusión como se define en la presente memoria. En una realización particular importante, el fragmento de DNA o uno de sus análogos o subsecuencias, o un fragmento de DNA de fusión como se define en la presente memoria, lo puede llevar un vector de expresión replicable que es capaz de replicarse en un organismo hospedante o una línea celular.

El vector puede ser en particular, un plásmido, fago, cósmido, minicromosoma o virus. En una realización interesante, el vector puede ser un vector que, cuando se introduce en una célula hospedante, es integrado en el genoma de la célula hospedante.

Si se usa un organismo superior, se pueden usar técnicas transgénicas para la producción de los polipéptidos. Ejemplos de animales adecuados son ovejas, ganado, cerdos, etc. Un fragmento de DNA que codifica un polipéptido es expresado en el tejido deseado controlado por elementos reguladores específicos del tejido. Después, la proteína resultante se puede someter a modificaciones postraduccionales a fin de obtener el polipéptido.

Los mamíferos transgénicos no humanos de la invención son producidos introduciendo un "transgén" en una célula diana embrionaria del animal elegido. En un aspecto, un transgén es una secuencia de DNA que es capaz de producir un fenotipo deseable cuando está contenido en el genoma de células de un mamífero no humano transgénico. En realizaciones específicas, el transgén comprende una secuencia de DNA que codifica un polipéptido, siendo capaz el transgén de ser expresado para producir el polipéptido.

La incorporación del sistema de expresión en la línea germinal del mamífero se puede llevar a cabo usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo como describen Hogan et al., 1986, o en el documento WO 93/04172.

Por lo tanto, un aspecto se refiere a un método para producir un polipéptido de la invención, que comprende las siguientes etapas:

(a) insertar una secuencia de nucleótidos en un vector de expresión,

(b) transformar un organismo hospedante adecuado con el vector producido en la etapa (a),

(c) cultivar el organismo hospedante producido en la etapa (b) en condiciones adecuadas para expresar el polipéptido,

(d) recoger el polipéptido, y

(e) opcionalmente someter el polipéptido a modificación postraduccional.

Dentro del alcance también está un método como se ha descrito antes, en el que el polipéptido producido se aísla por un método que comprende una o más etapas tales como cromatografía de afinidad usando un polipéptido de SCEE recombinante o nativo inmovilizado o anticuerpos reactivos con dicho polipéptido y/u otros procedimientos cromatográficos y electroforéticos.

El polipéptido producido como se ha descrito antes se puede someter a modificaciones postraduccionales como resultado de tratamiento término, tratamiento químico (formaldehído, glutaraldehído, etc.) o tratamiento con enzimas (peptidasas, proteinasas y encimas de modificación de proteínas). El polipéptido se puede procesar de una forma diferente cuando se produce en un organismo, comparado con su entorno de producción natural. Como un ejemplo, se logra con frecuencia la glicosilación cuando el polipéptido es expresado por una célula de un organismo superior tal como levaduras o preferiblemente un mamífero. Normalmente la glicosilación se encuentra en relación con los restos de los aminoácidos Asn, Ser, Thr o hidroxilisina. Puede ser ventajoso o no, eliminar o alterar las características del procesamiento causado por el organismo hospedante en cuestión.

Posteriormente a la expresión del polipéptido en un organismo o una línea celular, el polipéptido se puede usar como tal o se puede purificar primero del organismo o línea celular. Si el polipéptido es expresado como un producto secretado, se puede purificar directamente. Si el polipéptido es expresado como un producto asociado, puede ser necesaria la disrupción parcial o completa del hospedante antes de la purificación. Ejemplos de los procedimientos usados para la purificación de polipéptidos son: (i) inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad con anticuerpos, (ii) cromatografía de afinidad con un ligando adecuado, (iii) otros procedimientos de cromatografía tales como filtración en gel, cromatografía líquida de alta eficacia o de intercambio iónico, o derivados de cualquiera de los anteriores, (iv) procedimientos electroforéticos tipo electroforesis en gel de poliacrilamida, electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, electroforesis en gel de agarosa, e isoelectroenfoque, (v) cualesquiera otras técnicas específicas de solubilización y/o purificación.

La presente memoria también describe un polipéptido de SCCE sustancialmente puro. En el presente contexto, la expresión "sustancialmente puro" se entiende que significa que el polipéptido en cuestión no tiene sustancialmente otros componentes, por ejemplo, otros polipéptidos o carbohidratos, que pueden resultar de la producción y/o recuperación del polipéptido o encontrarse de otra forma junto con el polipéptido. La pureza de una proteína se puede evaluar por electroforesis en gel de SDS realizada como se describe en el Ejemplo 3.

El polipéptido se puede purificar como se describe en el Ejemplo 4 por cromatografía de afinidad en SBTI, o por cromatografía de afinidad con un anticuerpo inmovilizado, tal como el anticuerpo TE4b, de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Una alta pureza del polipéptido puede ser ventajosa cuando el polipéptido se va a usar en una composición farmacéutica o cosmética. También debido a su alta pureza, el polipéptido sustancialmente puro se puede usar en una cantidad menor que un polipéptido de una pureza menor convencional para la mayoría de los propósitos.

En un aspecto, el polipéptido puro se puede obtener de una línea celular adecuada que expresa un polipéptido como se describe en el Ejemplo 9. También, se puede preparar un polipéptido por los métodos conocidos de síntesis de péptidos en fase líquida o sólida, usando el acoplamiento sucesivo de los aminoácidos individuales de la secuencia de polipéptidos. Alternativamente, el polipéptido se puede sintetizar por el acoplamiento de los aminoácidos individuales que forman fragmentos de la secuencia del polipéptido que después se acoplan para dar como resultado el polipéptido deseado. Estos métodos constituyen así otro aspecto interesante.

Se contempla que existe un "sistema de cascada" de enzimas proteolíticas en el entorno cutáneo que es similar al sistema de activación del plasminógeno. Se supone que la SCCE es uno de los productos finales de este sistema. Se contempla que la actividad de la SCCE se puede inhibir mediante un "inhibidor de la SCCE".

En una serie de enfermedades de la piel, tales como enfermedades de pénfigo autoinmune o enfermedades acantolíticas, por ejemplo pénfigo familiar y enfermedad de Darier, hay una deficiencia de la cohesión entre queratinocitos en la capa epidérmica viable no cornificada (véase trastornos de la cohesión celular en la epidermis viable). Se contempla que este procedimiento es mediado por proteinasas y por lo tanto, que se pude tratar por administración de un compuesto que es capaz de inhibir la actividad enzimática de la SCCE nativa. También puede ser ventajoso administrar un inhibidor de SCCE para el tratamiento de la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias de la piel, en estados donde un componente inflamatorio es la característica predominante.

Por lo tanto, en otro aspecto la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de la SCCE que tiene un efecto inhibidor en la actividad enzimática de la SCCE nativa para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de enfermedades de pénfigo autoinmune o enfermedades acantolíticas tales como pénfigo familiar y enfermedad de Darier.

En el presente contexto, la expresión "inhibidor de la SCCE" se refiere a un compuesto existente o nuevo que puede interaccionar con una secuencia o subsecuencia de polipéptido enzimáticamente activa de la invención o uno de sus análogos, de forma que disminuya la actividad de la SCCE. Una disminución se puede medir, por ejemplo, llevando a cabo un experimento como se resume en el Ejemplo 3.2, usando el potencial inhibidor de la SCCE como inhibidor. Dichos compuestos pueden ser moléculas orgánicas, péptidos pequeños o polipéptidos grandes o derivados de cualquiera de los anteriores. Dicho enfoque puede ser útil en un programa de cribado de fármacos para identificar inhibidores de la SCCE.

Leyendas de las figuras

Figura 1

Desprendimiento de células unipolares del estrato córneo plantar in vitro. La superficie del tejido que está de cara al exterior in vivo está hacia arriba en la figura. Obsérvese que había una disociación celular progresiva en esta superficie durante la incubación, pero no había disociación celular en las otras superficies.

Figura 2

Transcurso del tiempo y efecto de la aprotinina en la liberación de células del estrato córneo plantar incubadas sin (círculos) y con (triángulos) aprotinina. Se da la media (valores acumulativos para cuatro trozos de tejido) y rango.

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Figura 3

Componentes reactivos anti-desmogleina (anti-DG I) en estrato córneo plantar coherente y en células disociadas. A. SDS-PAGE teñido con azul Coomassie. B. Inmunotransferencia 1-3: tejido coherente, sin diluir (1), diluido 1/3 (2), diluido 1/9 (3). 4-5: células disociadas, sin diluir (4), diluido 1/3 (5). Hay que indicar que sólo hay DG I aparentemente intacta con Mr 160 kD en el tejido coherente, y sólo productos de degradación de la DG I con Mr 95 y 80 kD en las células disociadas.

Figura 4

Transcurso del tiempo y efecto de la aprotinina en la degradación de la desmogleína I (DG I) en estrato córneo plantar que experimenta desprendimiento de células in vitro. Barridos densitométricos de inmunotransferencias de extractos de estrato córneo plantar incubado en ausencia (A) y presencia (B) de aprotinina (15 \muM). El máximo a 160 kD corresponde a DG I intacta. Los máximos a 95 y 80 kD corresponden a los productos de degradación de esta proteína (véase la Figura 3). Obsérvese la inhibición eficaz por la aprotinina de la degradación de la
DG I.

Figura 5

Efecto del ion cinc (A), quimostatina y leupeptina (B) en la degradación de la desmogleína I (DG I) en estrato córneo plantar durante el desprendimiento de células in vitro. Obsérvese la inhibición de la transformación de los componentes positivos anti-DG I de 160 kD a 95 y 80 kDa por los iones cinc y la quimostatina, pero no por la leupeptina.

Figura 6

Actividad de hidrólisis del péptido asociada con células del estrato córneo plantar. La hidrólisis de los dos sustratos se siguió mediante mediciones del cambio de absorbancia a 405 nm. Media de las incubaciones por triplicado. Cuadrados = S-2586; Círculos = S-2288.

Figura 7

Dependencia del pH de la actividad de hidrólisis de S-2586 asociada a los corneocitos. Media de las incubaciones por triplicado. Cuadrados = acetato sódico, círculos = fosfato sódico, triángulos = Tris-HCl.

Figura 8

Zimografía que muestra la actividad caseinolítica en extractos de células de estrato córneo plantar disociadas. Véase también, el texto en el Ejemplo 2.2 para los detalles experimentales.

A: Comparación de la enzima de los corneocitos plantares extraída con tampón de muestra de Laemmli sin agente de reducción (sc/s) y KCl (sc/k) con quimotripisina bovina, 0,125 ng (c) y tripsina bovina, 0,5 ng (t). Antes de la electroforesis el extracto en KCl se dializó frente a Tris-HCl 5 mM, pH 6,8 y se añadió SDS y glicerol para dar concentraciones finales como en el tampón de muestra; se añadieron 10 \mul a todas las calles. Marcadores de peso molecular a la izquierda.

B: La dependencia del pH en el tampón de incubación. Fuente de enzima = extractos en SDS de corneocitos plantares disociados. Tampones para el pretratamiento con Triton X-100 e incubación: acetato sódico 0,1 M (pH 4,0 y pH 5,5), y Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0 y pH 8,0). Otras condiciones como en A.

C: El efecto de los inhibidores. sc = extracto en SDS de corneocitos plantares; c) quimotripsina bovina; t = tripsina bovina. Los inhibidores estaban presentes durante el pretratamiento con Triton X-100 y la posterior incubación. La concentración final de leupeptina era 160 \muM, de aprotinina 15 \muM, de quimostatina 40 M, y de iones cinc (en forma de sulfato) 100 \muM. La leupeptina y quimostatina se añadieron en forma de soluciones de dimetilsulfóxido (DMSO). Tampón para el pretratamiento e incubación = Tris-HCl 0,1 M pH 8, con una concentración final de DMSO de 1% (vol/vol). Otras condiciones como en A.

Figura 9

Comparación de la SCCE, quimotripsina bovina, y catepsina G humana, en relación con los efectos de inhibidores (A; aprotinina, B; quimostatina, C; sulfato de cinc) y especificidad del sustrato (D). En A-C se normalizó la actividad de la enzima sin inhibidor presente a 100%. En D la actividad de la enzima con MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA se normalizó a 1 unidad arbitraria.

Figura 10

Cromatografía de afinidad en inhibidor de tripsina de soja covalentemente unida (SBTI). Línea de puntos: absorbancia a 280 nm, que refleja la concentración de proteína del eluato. Línea negra con cuadrados vacíos: Actividad de hidrólisis del péptido con S-2586 como sustrato, dado como cambio de absorbancia a 405 nm. Línea negra con círculos vacíos: actividad de hidrólisis del péptido con S-2288 como sustrato, dado como cambio de la absorbancia a 405 nm multiplicado diez veces.

Figura 11

SDS-PAGE y teñido con azul Coomassie (A) y zimografía después de SDS-PAGE con caseína copolimerizada (B) de las fracciones 2, 6 y 10 del cromatograma mostrado en la Figura 10. Marcadores del peso molecular a la izquierda. En B: 1: Grupo de componentes caseinolíticos que podían ser inhibidos por la leupeptina (160 \muM). c: grupo de componentes caseinolíticos que podían ser inhibidos por quimostatina (40 \muM).

Figura 12

SDS-PAGE de SCCE purificada por cromatografía de afinidad en SBTI-Affigel 15. gel al 12,5%. 1: muestra sin reducir. 2: muestra reducida. Marcadores del peso molecular a la izquierda.

Figura 13

Secuencia de aminoácidos N-terminal de la SCCE. Los asteriscos indican incertidumbres para las supuestas cisteínas en las posiciones 7 y 9. Los signos de interrogación indican posiciones donde no se pudieron detectar derivados de aminoácidos, pero sin disminuciones de rendimiento en las posteriores etapas.

Figura 14

Caracterización de los anticuerpos monoclonales TE4b y TE9b mediante inmunoprecipitación e inmunotransferencia.

a: SDS-PAGE al 12,5% teñido con Coomassie, condiciones no reductoras.

Calle 1: marcadores de peso molecular

Calle 2: extracto en KCl preparado como se describe en el Ejemplo 3.1 de corneocitos plantares disociados.

Calle 3: SCCE purificada como se describe en el Ejemplo 4.1 por cromatografía de afinidad en inhibidor de tripsina de soja insolubilizado.

b: Zimografía de inmunoprecipitados en SDS-PAGE al 12,5% con caseína desnaturalizada con calor copolimerizada al 0,1%, gel teñido con Coomassie.

Calle 1: marcadores de peso molecular

Calle 2: extracto en KCl, dializado como en a.

Calles 3-6: Inmunoprecipitados solubilizados (de izquierda a derecha), moAb TE4b (20 \mug), moAb TE9b (10 \mug), moAb PZ (10 \mug), y solución salina tamponada con fosfato. MoAb PZ es un anticuerpo monoclonal de ratón de tipo IgG1-kappa de proteína de la zona de embarazo, y se usó como un testigo negativo no relacionado.

c: inmunotransferencia en SDS-PAGE al 12,5% (condiciones no reductoras)

Calle 1: marcadores de peso molecular biotinilados detectados con avidina conjugada con fosfatasa alcalina (BioRad). Muestra de la electroforesis en las calles 2, 4 y 6, igual que en la calle 2 en a, y en las calles 3, 5 y 7 igual que en la calle 3 en a.

Calles 2 y 3: Primer anticuerpo = moAb TE4b, 0,2 \mug por ml

Calles 4 y 5: Primer anticuerpo = moAb TE9b, 0,1 \mug por ml

Calles 6 y 7: Primer anticuerpo = moAb PZ, 0,1 \mug por ml. Las cabezas de flecha en a-c indican pesos moleculares relativos (de arriba a abajo) de 93, 66, 45, 31, 22 y 14 kD, respectivamente.

Figura 15

La Figura 15 muestra el plásmido pS500. Este plásmido contiene el cDNA de SCCE humana de longitud completa clonado en pUC19. Para los detalles véase el Ejemplo 6.

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Figura 16

Transferencias Northern con mRNA preparado a partir de epidermis humana. Se aplicó en cada calle RNA purificado en poli-T correspondiente a aproximadamente 100 g de RNA total. 1: Hibridación llevada a cabo con una sonda preparada con un fragmento Hinc 2/Hinc 2 de 1070 pb del cDNA de la SCCE. 2: Hibridación llevada a cabo con una sonda preparada con un fragmento Hinc 2/Bgl 2 de 655 pb del cDNA de la SCCE.

Figura 17

a. SDS-PAGE teñido con Coomassie, gel al 12,5%. 1 y 2: sedimentos insolubles en PBS-Triton X-100, de células TG 2 tratadas con ultrasonidos transformadas con pS510 y pS511 respectivamente e inducidas con IPTG. 3: SCCE purificada de estrato córneo plantar humano.

b. Inmunotransferencias con pre-inmunosuero de pollo (1-3) y anti-SCCE de pollo (4-6). 1 y 4: células TG 2 transformadas con pS510 e inducidas con IPTG. 2 y 5: células TG 2 transformadas con pS511 e inducidas con IPTG. 3 y 6: SCCE purificada de estrato córneo plantar humano.

Las muestras se prepararon hirviendo un tampón de muestra con mercaptoetanol.

Figura 18

La Figura 18 muestra un mapa circular del vector de expresión pS507, construido como se describe en el Ejemplo 9. El vector pS507 media la expresión de la SCCE humana recombinante en células de mamífero.

Figura 19

La Figura 19 muestra el análisis de la expresión del gen de la SCCE humana recombinante de pS507 en células de mamíferos.

Calle 1: RNA de células C127

Calle 2: RNA de un clon aislado, 1:24, de células C127 transfectadas con pS507.

Calle 3: RNA de una mezcla de población de clones de C127 transfectados con pS506.

Calles 4 y 5: RNA de células C127 transfectadas con un vector de expresión, pS147, que es idéntico a pS507, excepto que carece de la secuencia de cDNA de la SCCE. Los marcadores de tamaño se indican a la izquierda.

Figura 20

SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia de SCCE expresada en células C127.

Calles 1 y 6: Marcador de peso molecular previamente teñido (Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 y 18,5 kDa)

Calle 2: pS507/C127, mezcla, matraz en T

Calle 3: pS507/C127, mezcla, botella giratoria A

Calle 4: pS507/C127, mezcla, botella giratoria B

Calle 5: Testigo negativo de pS507/C127

Calle 7: SCCE nativa preparada a partir de estrato córneo

Calle 8: pS507/C127, clon 24, matraz en T

Calle 9: pS507/C127, clon 24, botella giratoria A

Calle 10: pS507/C127, clon 24, botella giratoria B.

Figura 21

SDS-PAGE (A) e inmunotransferencia (B) de SCCE recombinante purificada del medio de cultivo de células C127 con células que llevan el plásmido pS507.

Calles 1 y 5: Marcador de peso molecular previamente teñido (Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 y 18,5 kDa)

Calle 2: Medio celular antes de purificación

Calle 3: Material no unido recogido de la cromatografía

Calle 4: Material unido eluido con el tampón de pH bajo.

Figura 22

SCCE nativa y SCCE recombinante activada, ensayada la actividad en un gel de caseína-poliacrilamida.

Calles 1 y 10: Marcadores de peso molecular (Pharmacia, 14-94 kDa)

Calle 2: SCCE nativa

Calle 3: SCCE nativa

Calles 4-6: SCCE recombinante escindida durante 1 hora, 3 horas y toda la noche, respectivamente (460 ng/pocillo).

Calle 7: Tripsina en la misma cantidad que en las muestras en las calles 4-6, pero en ausencia de APMSF.

Calle 8: Tripsina en la misma cantidad que en las muestras en las calles 4-6, en presencia de la misma cantidad de APMSF que en las muestras.

Calle 9: Igual que la calle 3.

Figura 23

Inmunotransferencia de SCCE nativa y recombinante tratada con N-Glycosidase F®. Las muestras se separaron en SDS-PAGE al 8-18% y se realizó la inmunotransferencia como se ha descrito antes.

Calle 1: Marcador de peso molecular. Masas moleculares desde arriba: 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 y 18,5 kDa.

Calles 2 y 3: SCCE recombinante, 0,3 y 3 \mug, respectivamente.

Calles 4 y 5: SCCE nativa, 1,5 y 1,8 \mug, respectivamente. Las muestras de las calles 3 y 5 se trataron con Glycosidase F®.

Ejemplos Ejemplo 1

Demostración de que el desprendimiento celular de la superficie de la capa de piel superficial cornificada implica la degradación de las proteínas de los desmosomas, y que la enzima responsable parece que es una serina-proteinasa de tipo quimotripsina, que puede ser inhibida por iones cinc.

1.1. Descamación en el estrato córneo

El objetivo del estudio era elucidar la naturaleza de los mecanismos responsables de la cohesión celular y disociación celular de la superficie (descamación) en la capa cornificada de la piel, el estrato córneo. Se cortó una escama de estrato córneo, de 0,3-0,6 mm de grosor, paralela a la superficie de la piel de debajo de un talón de un voluntario con piel normal. El trozo de tejido se sumergió en solución salina tamponada con fosfato con azida sódica al 0,1% durante 3 horas a temperatura ambiente, y se rasparon las células ligeramente unidas de la superficie que había estado de cara al exterior in vivo. Después se pusieron cortes de un mm de grosor cortados perpendiculares a la superficie del tejido, en un medio que contenía Tris-HCl 0,1 M, pH 8, EDTA 5 mM, azida sódica al 0,1%, y agarosa al 0,45%, justo antes de gelificar el medio debido a la presencia de agarosa. Después de incubar durante los tiempos 0, 5 y 15 horas a 37ºC, se congelaron en hielo seco trozos de gel con tejido. Se cortaron secciones criostáticas de 20 mm perpendiculares a la superficie de la piel en un criostato, y se montaron y examinaron en un microscopio de contraste de fase. Se observó un desprendimiento unipolar continuo de células de los trozos de estrato córneo plantar incubados in vitro (Fig. 1). Las células se desprendieron sólo de la superficie de tejido que había estado de cara al exterior in vivo. Por lo tanto el proceso observado imita la descamación.

1.2. Efectos de la temperatura, pH e inhibidores de enzimas

Después se desarrolló un método para cuantificar el desprendimiento de células, que permitía estudios de los efectos de diferentes parámetros tales como temperatura, pH e inhibidores de enzimas. Se prepararon cilindros de estrato córneo de 3 mm de diámetro con un punzón para biopsia, de las escamas de tejido cogidas y soltadas de las células de la superficie ligeramente unidas como se ha descrito antes en 1.1. Los cilindros (con un área de la superficie definida que había estado de cara al exterior in vivo) se incubaron en 0,5 ml de medio que contenía Tris-HCl 0,1 M pH 8, EDTA 5 mM, azida sódica al 0,1% y con o sin aprotinina (4 x 10^{-6} mol/l) (Boehringer Mannheim, Alemania) en tubos Eppendorf de 1,5 ml a 37ºC durante 5, 10 y 20 horas, y después se agitaron 10 segundos en una mezcladora vortical para liberar las células de la superficie disociadas. Se separó el resto del tejido y se puso en medio reciente para continuar la incubación. Los tubos con las células liberadas se centrifugaron durante 2 min a 5000 g para recoger las células. Los sedimentos celulares se lavaron una vez con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato y después se trataron a 60ºC durante 1,5 horas con 0,6 ml de hidróxido sódico 1 M. La proteína soluble en álcali se cuantificó de acuerdo con Lowry
et al., 1951, y se tomó como una medida de la cantidad de células liberadas. Los resultados se muestran en la Fig. 2.

De una forma similar, se investigó el efecto de diferentes inhibidores potenciales (aprotinina, inhibidor de tripsina de soja, pepstatina (Boehringer Mannheim, Alemania) y yodoacetamida (Sigma, St. Louis, MO)). Se prepararon cilindros de tejido de 2 mm solos, y se incubaron con medio con o sin diferentes inhibidores potenciales, con las concentraciones indicadas en la siguiente Tabla 1, durante 16 horas a 37ºC, y se cuantificaron las células liberadas como se ha descrito antes. Hay que indicar que se incluyó EDTA (que es un inhibidor de metaloproteinasas) en el medio de incubación para dar tasas de liberación de células óptimas.

TABLA 1 Efecto de los inhibidores de proteasas en la liberación de células del estrato córneo plantar in vitro Media y SD para cinco trozos de tejido incubados

Inhibidor	Concentración (mol/l)	Inhibición (%)
Ninguno	-	0 \pm 8
Aprotinina (Trasylol®)	1,5 x 10^{-7}	18 \pm 8
Aprotinina (Trasylol®)	4 x 10^{-7}	53 \pm 13
Aprotinina (Trasylol®)	1,5 x 10^{-6}	90 \pm 5
Aprotinina (Trasylol®)	4 x 10^{-6}	98 \pm 2
Inhibidor de tripsina de soja	5 x 10^{-6}	81 \pm 9
Pepstatina	1 x 10^{-4}	8 \pm 4
Yodoacetamida	1 x 10^{-3}	6 \pm 13

Se encontró que los inhibidores de serina-proteinasa, la aprotinina e inhibidor de tripsina de soja, inhibían eficazmente el desprendimiento de células (Fig. 2 y Tabla 1 anterior). Puesto que estas dos sustancias eran inhibidoras, pero no lo eran los inhibidores de metaloproteinasas (EDTA), tiol-proteinasas (yodoacetamida), y aspártico-proteasas (pepstatina), se concluyó que una serina-proteasa toma parte en el proceso observado. También se concluyó que la cohesión celular en el estrato córneo depende de las estructuras de las proteínas y que también debe operar un mecanismo similar al observado in vitro durante la descamación in vivo (Lundström y Egelrud, 1988).

En estudios adicionales del desprendimiento in vitro de células del estrato córneo plantar, se encontró que el proceso se podía separar en dos etapas separadas. La primera etapa se produce independientemente de que haya o no EDTA presente en el medio de incubación. La segunda etapa se produce sólo en presencia de EDTA. La primera etapa podía ser inhibida por la quimostatina y por iones cinc, además de por la aprotinina. La segunda etapa podía ser inhibida por aprotinina y quimostatina. (Lundström y Egelrud, 1990 a). La quimostatina es un inhibidor de proteinasas, de bajo peso molecular con especificidad por sustratos de tipo quimotripsina. Además se ha encontrado (Lundström y Egelrud, 1990 a) que la leupeptina, un inhibidor de proteinasas, de bajo peso molecular con especificidad por sustratos de tipo tripsina, no tiene efecto en el desprendimiento de células in vitro.

Las estructuras de proteínas con más probabilidad de ser responsables de la cohesión celular en el estrato córneo, y por lo tanto posibles candidatas a ser degradadas en el desprendimiento de células de tipo descamación descrito antes, son los desmosomas. Un desmosoma consta de dos mitades simétricas que están situadas en células contiguas. Las dos mitades están conectadas en el espacio extracelular por proteínas de transmembrana llamadas desmogleinas.

1.3. Destino de la desmogleina I (DG I) durante el desprendimiento de células in vitro

Se estudió el destino de la desmogleina I (DG I) durante el desprendimiento de células in vitro del estrato córneo plantar. Se incubó estrato córneo plantar como se ha descrito antes en 1.1, y se separó tejido todavía cohesivo de las células disociadas. Las células y los tejidos se extrajeron en un tampón que contenía Tris-HCl 0,1 M, pH 9, urea 9 M, dodecilsulfato sódico al 2%, mercaptoetanol al 1%, 1 ml de tampón por 20 mg de tejido, durante 15 horas a 27ºC. Los extractos se prepararon para electroforesis en gel de poliacrilamida en geles en presencia de dodecilsulfato sódico al 7,5% (SDS-PAGE) de acuerdo con Laemmli (Laemmli, 1970), seguido de transferencia eletroforética (Towbin et al., 1979) a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Richmond, CA) que se sondeó con un antisuero policlonal de conejo contra DG I purificado de hocico bovino (Gorbsky et al., 1985). Los anticuerpos unidos se detectaron con inmuno-
globulinas anti-conejo de cabra conjugadas con fosfatasa alcalina (Bio-Rad, Richmond, CA), (Blake et al., 1984).

Los resultados se muestran en la Fig. 3. Las cantidades de muestra añadidas a la inmunotransferencia se ajustaron para dar aproximadamente las mismas concentraciones de proteína (calculada por inspección visual de geles SDS-PAGE teñidos con azul Coomassie) para tejido coherente y células disociadas. Se llevaron a cabo varias diluciones de los extractos para permitir una comparación semi-cuantitativa de las cantidades de los diferentes componentes reactivos anti-DG I en estrato córneo coherente y células disociadas.

Cuando se extrajeron por separado el tejido todavía cohesivo y las células disociadas, se encontró que mientras que el tejido todavía cohesivo contenía sólo aparentemente DG I intacta, las células de superficie disociadas contenían sólo productos de degradación putativos de esta proteína (Fig. 3).

En las Figuras 4 y 5 se muestran los efectos de la aprotinina, iones cinc, quimostatina (Boheringer, Mannheim, Alemania) y leupeptina (Boheringer, Mannheim, Alemania) en la degradación de la DG I durante el desprendimiento in vitro de células del estrato córneo plantar.

Primero, se investigó el transcurso de tiempo y el efecto de la aprotinina en la degradación de la desmogleina I (DG I) en estrato córneo plantar que experimenta desprendimiento de células in vitro. Se incubaron extractos de estrato córneo plantar como se ha descrito antes en 1.2 (pero sin separar el tejido coherente de las células disociadas antes de la extracción), en ausencia o presencia de aprotinina (15 \muM), y se extrajeron después de 0, 6, 12 ó 24 horas. Se llevó a cabo la SDS-PAGE e inmunotransferencia como se ha descrito antes. Se llevaron a cabo barridos densitométricos de las inmunotransferencias en un escáner de transferencia de vuelo Shimadzu CS-9000 (Shimadzu, Kyoto, Japón) con luz reflejada a 560 nm en el modo de zigzag. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Obsérvese la eficaz inhibición de la degradación de la DG I por la aprotinina.

Después, se investigó el efecto del ion cinc, quimostatina y leupeptina en la degradación de la desmogleina I (DG I) en el estrato córneo plantar durante el desprendimiento de células in vitro. El diseño experimental era como se ha resumido antes. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 24 horas con sulfato de cinc con concentraciones 0, 1 ó 5 mM, y con quimostatina o leupeptina con concentración 330 \muM. Los resultados mostraron inhibición de la transformación de los componentes positivos anti-DG I de160 kD a 95 y 80 kD por los iones cinc y quimostatina, pero no por la leupeptina.

Es evidente a partir de estos resultados, que la aprotinina, los iones cinc y la quimostatina eran inhibidores, mientras que la leupeptina no lo era. Por lo tanto, el perfil inhibidor para la degradación de la DG I era el mismo que para el desprendimiento de células del estrato córneo plantar in vitro. (Lundström y Egelrud, 1990 b).

Se consideró importante demostrar que también se encuentran mecanismos similares a los responsables del desprendimiento de células del estrato córneo palmo-plantar, en el estrato córneo de la piel de otros sitios del cuerpo que no fueran las palmas y plantas. Takahashi et al. (Takahasi et al., 1987) han descrito que una mezcla de los detergentes óxido de N,N-dimetildodecilamina (Sigma, St. Louis, MO) y dodecilsulfato sódico (Bio-Rad, Richmond, CA) en una relación molar 8:2 producía disociación celular en el estrato córneo que no es palmo-plantar preparado por tripsinización de la epidermis entera. Para evitar la contaminación por tripsina exógena las biopsias con punzón de la piel humana normal de la región glútea se incubaron a pH 8 con la mezcla de detergentes mencionada y EDTA (Lundström y Egelrud, 1990). Se encontró que en estas condiciones la capa cornificada se disociaba en células individuales. La adición de aprotinina al medio de incubación prevenía está disociación celular. Se concluyó que en el estrato córneo que no es palmo-plantar la cohesión celular también depende de las estructuras de las proteínas, que la descamación en este tejido depende de la proteolisis, y que el tejido contiene una proteinasa que puede catalizar esta proteolisis. Puesto que la disociación celular implicaba sólo el estrato córneo y no las capas epidérmicas no cornificadas más profundas, se concluyó que la proteinasa responsable reside en las capas más profundas en un estado inactivo o inhibido.

Ejemplo 2

El descubrimiento de la enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE): una proteinasa que cumple los criterios de ser responsable de la degradación de las estructuras cohesivas intracelulares en el estrato córneo in vitro y posiblemente también in vivo.

A partir de los experimentos presentados en el Ejemplo 1, se concluyó que la proteinasa responsable de la disociación celular de la superficie unipolar en el modelo de descamación in vitro del estrato córneo plantar, debería tener las siguientes propiedades:

1. Debe estar presente en el estrato córneo.

2. Debe ser una serina-proteinasa.

3. Debería tener una especificidad de sustrato de tipo quimotripsina y un perfil inhibidor similar al observado para el desprendimiento de células in vitro y para la degradación asociada a la desmogleina I.

4. Debería tener una localización extracelular en el estrato córneo.

5. Debería tener una dependencia del pH que le permita ser activa en condiciones fisiológicas, siendo el pH del estrato córneo alrededor de 4,5-6.

6. Puesto que el desprendimiento de células del estrato córneo plantar in vitro transcurre continuamente durante tiempos de incubación prolongados incluso si el volumen de medio de incubación es muy grande comparado con el volumen de los trozos de tejido incubados, o si el medio de incubación se cambia repetidamente durante la incubación, parece razonable suponer que la enzima responsable está unida al tejido de forma que no permite ser extraída al medio de incubación durante la incubación.

Los siguientes dos experimentos condujeron al descubrimiento de la SCCE (Egelrud y Lundström, 1991):

2.1. Actividad enzimática asociada con los corneocitos plantares disociados

Las células disociadas del estrato córneo plantar (corneocitos) se prepararon mediante incubación del estrato córneo plantar como se describe en el Ejemplo 1. Las células se filtraron por una malla de nailon con un tamaño de malla de 100 \mum, y después se lavaron tres veces con diez volúmenes de Tris-HCl 0,1 M pH 8, EDTA 5 mM y tres veces en Tris-HCl 0,1 M, pH 8. Después las células se incubaron con dos tipos de sustratos de proteinasa cromógenos S-2288 o S-2586 (Kabi Diagnostica, Estocolmo, Suecia):

Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288) es escindido por una amplia variedad de serina-proteinasas con especificidad por la arginina (por ejemplo, tripsina). Arg-Pro-Tyr-p-nitroanilida (S-2586) es un sustrato para proteinasas de tipo quimotripsina.

En un volumen total de 120 \mul, cada mezcla de reacción contenía Tris-HCl 0,07 M pH 8, azida sódica al 0,1%, 1, 2,5, 5 ó 10 \mul de una suspensión al 25% de corneocitos plantares lavados y sustrato (S-2586) 1,04 mM o (S-2288) 1,25 mM. Después de incubar durante 5 horas a 37ºC en placas de microvaloración, la reacción se detuvo por adición de 125 \mul de ácido acético al 10%. Las células se dejaron sedimentar y se transfirieron 200 \mul de cada líquido sobrenadante a nuevos pocillos. Se siguió la hidrólisis de los dos sustratos mediante medición del cambio de absorbancia a 405 nm después de haber separado las células en un Behring Elisa Processor (Behringwerke, Marburg, Alemania).

Como se muestra en la Figura 6, había una actividad enzimática asociada con los corneocitos plantares disociados que catalizaba la hidrólisis de S-2586. En comparación la actividad frente a S-2288 era baja.

Después se investigó la dependencia con el pH de la actividad de hidrólisis de S-2586. El diseño experimental fue como se ha resumido antes usando 10 \mul de una suspensión al 25% de corneocitos plantares lavados, y tampones con diferentes pH (acetato sódico, fosfato sódico o Tris-HCl). Las concentraciones de tampón finales eran 0,07 M. Los resultados se muestran en la Figura 7, a partir de los cuales parece que la actividad era óptima a pH 7-8, pero significativa también a pH 5,5.

En un experimento adicional, se investigaron los efectos de EDTA, iones metálicos e inhibidores de proteinasas en la hidrólisis de S-2586 a pH 8 por la proteinasa asociada con las células del estrato córneo plantar suspendidas. El diseño experimental fue como se ha resumido antes y en la Tabla 2.

TABLA 2 Efectos de EDTA, iones metálicos e inhibidores de proteinasas en la hidrólisis de S-2586 por la proteinasa asociada con las células del estrato córneo plantar (fuente de enzima: células suspendidas)

Inhibidor	Concentración	Actividad (%)
		(\pmSD, n = 3)
Ninguno	-	100
EDTA^{a}	4,2 mM	109 \pm 1
PMSF^{b}	1 mM	8 \pm 3
Aprotinina^{a}	3 \muM	10 \pm 1
Inhibidor de tripsina de soja^{a}	0,16 \muM	6 \pm 1
Quimostatina^{a,c}	11 \muM	66 \pm 9
	55 \muM	32 \pm 0
	275 \muM	15 \pm 3
Leupeptina^{a,c}	325 \muM	93 \pm 3
ZnSO_{4}^{a}	100 \muM	10 \pm 3
HgCl_{2}^{a}	100 \muM	84 \pm 2
CuSO_{4}^{a}	100 \muM	85 \pm 2
^{a} Sustancia presente en la mezcla de ensayo
^{b} \begin{minipage}[t]{150mm} Se preincubó una suspensión al 25% de células del estrato córneo plantar preparadas como se describe en el texto, durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia de PMSF 1 mM (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en 2-propanol (concentración final de 2-propanol 4% en vol/vol). Los testigos se preincubaron sólo con 2-propanol al 4%.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{150mm} Inhibidor disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO). Todos los medios, incluyendo los testigos, contenían DMSO al 5% (vol/vol).\end{minipage}

Como se muestra en la Tabla 2 anterior, el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF; un inhibidor general de serina-proteinasas), aprotinina, inhibidor de tripsina de soja, quimostatina (un inhibidor de quimotripsina), y los iones cinc, pero no la leupeptina (un inhibidor de tripsina) inhibían la actividad de hidrólisis de S-2586. Por lo tanto, el perfil inhibidor era muy similar al observado para el desprendimiento de células in vitro y la degradación de desmogleina I asociada.

2.2. Zimografía de estrato córneo plantar disociado

Se encontró que la enzima responsable de la actividad de hidrólisis de S-2586 descubierta en 2.1, podía ser solubilizada cuando los corneocitos se extraían en KCl 1 M en Tris-HCl 0,1, M pH 8. Por lo tanto, se llevaron a cabo experimentos con zimografía. Por esta razón se prepararon extractos en KCl de corneocitos para electroforesis de acuerdo con Laemmli (Laemmli, 1970) pero sin agente de reducción en el tampón de muestra y sin calentamiento de las muestras. Las muestras también se prepararon mediante extracción de corneocitos plantares disociados con tampón de muestra de Laemmli sin agente de reducción a temperatura ambiente. Para la zimografía se adoptó una modificación del procedimiento de Horie et al. (Horie et al., 1984). La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) se llevó a cabo de acuerdo con Laemmli en geles al 12,5% con caseína térmicamente desnaturalizada copolimerizada al 1%. Después de electroforesis los geles se empaparon en un tampón que contenía Triton X-100 al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente, para separar el SDS, y después se incubaron a 37ºC durante 15 horas. Después los geles se tiñeron con azul Coomassie. Las enzimas caseinolíticas separadas se pusieron de manifiesto como bandas claras frente a un fondo azul. Véase también la leyenda de la Figura 8 para detalles experimentales.

Los resultados se muestran en la Figura 8. Los extractos de corneocitos plantares contenían un enzima caseinolítica mayoritaria con peso molecular aparente alrededor de 25 kD. También había enzimas caseinolíticas minoritarias con pesos moleculares alrededor de 30 kD. (Estos componentes minoritarios no se ven claramente en la figura. Más tarde se encontró que podían ser inhibidas por leupeptina pero no por quimostatina). La enzima de 25 kD tenía una actividad significativa a pH 5,5-8. Era inhibida por aprotinina, iones cinc, y quimostatina, pero no por leupeptina. Por lo tanto tenía el mismo perfil inhibidor que la actividad de hidrólisis de S-2586 antes descrita. En experimentos con cromatografía de exclusión en gel (no se muestra), la enzima caseinolítica de 25 kD se encontró que se co-cromatografiaba con la actividad de hidrólisis de S-2586.

En experimentos posteriores (no se muestra) con la misma técnica que la descrita antes para 2.2, se encontró que el estrato córneo que no es palmo-plantar contiene una enzima con propiedades aparentemente idénticas a las propiedades de la proteinasa de 25 kD asociada con los corneocitos plantares, desde ahora en adelante denominada enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE) (Lundström y Egelrud, 1988).

También se pudieron obtener pruebas de que la SCCE está asociada con los corneocitos plantares de forma que le permite ser activa en el espacio extracelular del estrato córneo. Esto se hizo demostrando primero que los corneocitos disociados son impermeables para la peroxidasa de rábano picante (Mr 44 kD). Después se mostró que el fibrinógeno humano (Mr 340 kD) podía ser degradado por una suspensión de corneocitos, y que dicha degradación podía ser inhibida por los mismos inhibidores que la SCCE. Se podía descartar que la degradación del fibrinógeno se debiera a la enzima solubilizada (Egelrud, 1992).

Ejemplo 3

Purificación parcial de la enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE) y ensayos de proteinasas con sustratos cromógenos.

3.1. Precipitación de extractos de corneocitos plantares en KCl

Se aumentó la escala de producción de corneocitos plantares disociados como se describe en el Ejemplo 1, y se prepararon extractos en KCl de corneocitos plantares lavados que contenían SCCE como se describe en el Ejemplo 2.

La preparación de los extractos en KCl de corneocitos plantares se resume esquemáticamente en la siguiente Tabla 3. Se recogió estrato córneo plantar humano hiperplásico mediante una cooperación con la Sociedad Sueca de pedicuros. Sólo se usó material obtenido mediante cortes y recortes. No se recogió material de piel con trastornos de descamación. Antes de mandarlo el estrato córneo se secó al aire y se empaquetó en bolsas de plástico. En el laboratorio se almacenó a -20ºC hasta su uso.

TABLA 3 Resumen esquemático de la preparación de extractos en KCl que contienen SCCE de corneocitos plantares disociados

2

Para cada etapa de cromatografía de afinidad posterior, se agruparon los extractos 1 y 2 de las dos preparaciones de 50 g cada una de estrato córneo plantar.

3.2. Ensayos de proteinasa con sustratos cromógenos

Se hizo una comparación de la SCCE, quimotripsina bovina y catepsina G humana en relación con los efectos de los inhibidores aprotinina, quimostatina, sulfato de cinc, y la especificidad de sustrato.

Se preparó una solución madre de MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) en agua destilada, de Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Boehringer, Mannheim, Alemania) en 1-metil-2-pirrolidona (concentración final del disolvente en mezclas de incubación 4%) y de quimostatina en dimetilsulfóxido (concentración final del disolvente en mezclas de incubación 1%). La catepsina G de esputo humano purulento se obtuvo de E. Lotti, Ginebra, Suiza. La fuente de SCCE fue extracto en KCl de corneocitos plantares disociados preparados como se ha descrito antes. La fuente de los inhibidores aprotinina, quimostatina y sulfato de cinc, fueron como las descritas antes.

Las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC en placas de microvaloración. El volumen total de incubación era 135 \mul. Cada mezcla de incubación contenía Tris-HCl pH 8,0 (concentración final 0,08 M), KCl (concentración final 0,2 M), 100 \mul de solución de sustrato, 25 \mul de fuente de enzima (adecuadamente diluida en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, KCl 1,0 M) y 10 \mul de solución de inhibidor.

En la Fig. 9, A-C, se usó MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNa (S-2586, concentración inicial 1,2 mM) como sustrato. En D, la concentración inicial de ambos sustratos era 1,2 mM.

Al final de las incubaciones (1,5 horas), se añadieron 125 \mul de ácido acético al 10% a cada pocillo y se leyó la absorbancia a 405 nm con mezclas de incubación sin enzimas añadidas como blancos. Las cantidades de enzimas añadidas se ajustaron para dar un cambio de absorbancia a 405 nm al final de las incubaciones de 0,3-0,7.

Los resultados se resumen en la figura 9, A-D. Para los estudios de los efectos de los inhibidores, se usó S-2586 como sustrato. La eficacia la de aprotinina como inhibidor de la SCCE y quimotripsina era alta y aproximadamente la misma para las dos enzimas. Por otra parte, el efecto en la catepsina G era mucho menor (Figura 9A). La quimostatina producía inhibición de las tres enzimas, pero la concentración de inhibidor que producía 50% de inhibición era más de tres órdenes de magnitud mayor para la SCCE que para la quimotripsina y catepsina G (Fig. 9B). El sulfato de cinc era un eficaz inhibidor de la SCCE, pero no de la quimotripsina y catepsina G (Fig. 9C). La actividad de las tres enzimas frente a los sustratos MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) y Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA se compara en la Fig. 9D. Puesto que el objetivo era encontrar similitudes y diferencias entre las enzimas examinadas, estos experimentos sólo se llevaron a cabo a una concentración inicial para cada sustrato. Mientras que Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA parecía que era un sustrato significativamente mejor que S-2586 para la quimotripsina y catepsina G, se encontró lo contrario para la SCCE.

Ejemplo 4

Purificación y determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminales de la enzima quimotríptica del estrato córneo

4.1. Purificación de la SCCE de extractos de corneocitos en KCl mediante cromatografía de afinidad en inhibidor de tripsina de soja insolubilizada (SBTI)

La figura 10 muestra los resultados de la cromatografía de afinidad en SBTI. El gel de afinidad se preparó uniendo 50 mg de SBTI (Boehringer, Mannheim, Alemania) a 12 ml de Affigel 15 sedimentado (BioRad, Richmond, Ca.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El resto de los grupos activos en el gel se bloquearon con etanolamina. Los extractos en KCl combinados de 100 g (peso seco) de estrato córneo plantar (volumen total 700 ml) se desarrollaron en un lecho de 0,8 x 2 cm de SBTI-Affigel 15 empaquetado en una columna de vidrio, caudal 42 ml/h, con registro continuo de la absorbancia del eluato a 280 nm. La columna se lavó con Tris-HCl 0,1 M pH 8, KCl 1 M, hasta que la absorbancia del eluato estaba por debajo de 0,01, y después con 10 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8. La elución por pasos del material unido se llevó a cabo con HCl 1, 10 y 100 mM. El eluyente se cambió cuando la absorbancia del eluato había disminuido por debajo de 0,01. Se recogieron fracciones de 3 ml en tubos de ensayo que contenían Tris-HCl pH 8, volumen total 0,4 ml, en una cantidad calculada para ser suficiente para ajustar el pH del eluato por encima de 7. Se comprobó inmediatamente el pH de cada fracción, y si era necesario, se ajustó a aproximadamente 7 con pequeños volúmenes de Tris-HCl 1 M, pH 8. Los análisis de la actividad de hidrólisis de péptidos con S-2586 (sustrato para SCCE) y S-2288 (sustrato para enzimas de tipo tripsina), se llevaron a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 2.1. La concentración inicial de ambos sustratos en las mezclas de ensayo era 1,1 mM. Aproximadamente 90% de la actividad de hidrólisis de S-2586 estaba unida al gel. Por elución por pasos del gel lavado con HCl 10-100 mM se pudo recuperar aproximadamente 60% de la actividad de hidrólisis de S-2586 total en el extracto en KCl aplicado. De la actividad de hidrólisis de S-2288 total, alrededor de 20% estaba unida al gel de afinidad y 10% se pudo recuperar en el eluato.

La Figura 11 muestra los análisis del eluato de la cromatografía de afinidad en SBTI con electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) y con zimografía. Se desarrollaron muestras no reducidas en geles al 12,5%. Véase también Egelrud y Lundström 1991, y Ejemplo 2, 2,2 para los detalles experimentales. Antes de ser preparadas para electroforesiss, las muestras se habían concentrado aproximadamente 20 veces en A mediante filtración centrífuga con filtros Ultrafree-MC (corte de exclusión 10 kD; Millipore, Bedford, MA), y diluido 10 veces en B.

En la Figura 12 se muestra una comparación por SDS-PAGE de una muestra no reducida y una muestra reducida de la cromatografía de afinidad en SBTI.

Como se muestra en las figuras 10 y 11 la cromatografía de afinidad en SBTI dio un proteína que era más de 90% pura (considerado por geles de SDS-PAGE teñidos con azul Coomassie), con peso molecular aparente alrededor de 25 kD en una forma no reducida y alrededor de 28 kD en forma reducida. Además había un componente positivo en azul Coomassie minoritario con peso molecular aparente aproximadamente 1 kD mayor que el componente mayoritario. En los geles de zimografía había una banda mayoritaria y una minoritaria con las mismas movilidades electroforéticas que las dos bandas detectadas en los geles teñidos con azul Coomassie con muestras no reducidas. Ambos componentes caseinolíticos podían ser inhibidos por quimostatina. Además, la zimografía mostró componentes minoritarios con pesos moleculares aparentes alrededor de 30 kD, que podían ser inhibidos por leupeptina. Se concluyó que la proteína mayoritaria purificada era la SCCE.

4.2. Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminales de la SCCE

Se prepararon doscientos microlitros de una fracción de un cromatograma con SBTI-Affigel 15, A_{280 \ nm} 0,2, para SDS-PAGE, con o sin reducción y desarrollo en un gel de poliacrilamida al 12,5% (grosor 1 mm, ancho de ranura 73 mm). Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a un filtro Immobilon (Millipore) y se tiñeron con azul Coomassie de acuerdo con Matsuidaira, 1987. La banda de proteína mayoritaria se cortó y se procesó en un analizador de secuencia de aminoácidos de fase líquida de pulsos, Applied Biosystems 477A en conexión con un analizador PTH 120A (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE.UU.). La secuenciación se llevó a cabo con programas cíclicos normales y productos químicos del fabricante. Los rendimientos iniciales y repetitivos, calculados a partir de proteínas patrón, eran 25% y 97%, respectivamente.

Los rendimientos de los derivados de aminoácidos eran compatibles siendo secuenciado sólo un péptido. Con muestras no reducidas los rendimientos eran buenos en las etapas 1-6, pero caían a cero en las etapas 7 y 9. Los rendimientos en posteriores etapas eran notablemente menores. Con muestras reducidas tampoco se pudieron detectar derivados de aminoácidos en las etapas 7 y 9, pero para etapas posteriores donde se podían detectar derivados no había disminuciones bruscas de rendimientos. Estos resultados sugieren que hay cisteínas en las posiciones 7 y 9. Sin embargo, no fue posible detectar la cisteína carboximetilada en las etapas 7 y 9 después de reducción y tratamiento con ácido yodoacético (100 mM). La secuencia obtenida (Fig. 13, SEQ ID NO: 3) era idéntica para muestras reducidas y no reducidas.

Ejemplo 5 5.1. Preparación de anticuerpos monoclonales específicos para SCCE

Se dieron aproximadamente 30 \mug de SCCE nativa a ratones BALB/c (Bomholtgaard, Dinamarca), purificada como se describe en el Ejemplo 4.1, en adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI) en forma de inyecciones subcutáneas. Después de un mes, se repitieron las inyecciones con la misma cantidad de SCCE en adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI). Cuatro meses después de la primera inyección, a un ratón se le dieron inyecciones de refuerzo en 3 días consecutivos, 30 \mug de antígeno por inyección. Los hibridomas se produjeron por el método descrito por Carlsson et al. 1985, con células de la línea celular de mieloma SP2/0 (ATCC CRL 1581). La identificación de los anticuerpos que reaccionaban con la preparación de SCCE purificada se llevó a cabo con un técnica ELISA. Los líquidos sobrenadantes de cultivos de clones positivos se analizaron más mediante inmunotransferencia después de SDS-PAGE. Los clones que producían anticuerpos que reaccionan con la SCCE en este ensayo se propagaron en líquido ascítico de ratón, y los anticuerpos se purificaron por cromatografía de afinidad en proteína A y se clasificaron por el método descrito por Carlsson et al. 1985. Se obtuvieron dos anticuerpos útiles, moAb TE4b y moAb TE9b, y ambos se clasificaron como IgG_{1}-kappa.

La caracterización de los moAb TE4b y TE9b mediante inmunoprecipitación e inmunotransferencia se muestra en la Figura 14. La Figura 14 a (calle 2) muestra un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie con un extracto en KCl concentrado de corneocitos plantares disociados, preparados como se describe en el Ejemplo 3.1. La muestra se dializó 4 horas frente a acetato sódico 0,1 M, pH 4, y se concentró aproximadamente 100 veces por ultrafiltración, antes de prepararla para electroforesis. La Fig. 14 a (calle 3) muestra una preparación de SCCE, purificada como se describe en el Ejemplo 4.1.

La Figura 14 b muestra los resultados de un experimento de inmunoprecipitación donde se han incubado anticuerpos con extractos en KCl de corneocitos, y después recuperado con Proteína A insolubilizada. Los complejos de antígeno-anticuerpo resolubilizados y disociados se analizaron por zimografía como se describe en el Ejemplo 2.

Se mezclaron 250 \mul de un extracto en KCl de corneocitos plantares disociados que se habían concentrado 5 veces por ultrafiltración, dializado frente a solución salina tamponada con fosfato, y al que se había añadido albúmina de suero bovino (Sigma, St. Louis, MO) hasta una concentración final de 10 mg por ml, con 10 \mul de solución de anticuerpo o solución salina tamponada con fosfato, y se incubaron 15 horas a 4ºC. Después se añadieron 25 \mul de Proteína A-Sepharosa sedimentada (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a los tubos, y las incubaciones se continuaron con agitación suave a temperatura ambiente durante 2 horas. El gel se recuperó por centrifugación y se lavó cinco veces con 1 ml de Tween 20 al 0,05% (Sigma, St. Louis, MO) en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 0,5 M. Después del lavado final, el gel se extrajo con 100 \mul de tampón de muestra de Laemmli sin agente de reducción durante 1 hora a temperatura ambiente. Los extractos se clarificaron por centrifugación y se aplicaron en el gel.

Ambos moAb TE4b y TE9b precipitaron una enzima caseinolítica con el mismo Mr que la SCCE purificada y la correspondiente enzima caseinolítica mayoritaria en el extracto en KCl. Los anticuerpos no precipitaron las enzimas caseinolíticas minoritarias en el extracto con Mr alrededor de 30 kDa, que se había mostrado que eran inhibidas por leupeptina, un inhibidor de serina-proteinasas de tipo tripsina. Además de la enzima caseinolítica de 25 kDa, los anticuerpos parecía que se unían a un componente proteolítico minoritario con Mr alrededor de 80 kDa. Este componente está normalmente presente en los extractos en KCl de corneocitos plantares preparados a partir de tejido que se ha secado antes de la preparación, pero no se encuentra en preparaciones de tejido reciente (T. Egelrud, observación no publicada). No está presente en las preparaciones de SCCE purificada por cromatografía de afinidad, y puede representar un producto de agregación. No se ha podido detectar un componente correspondiente que reaccione con los anticuerpos en inmunotransferencias.

En las inmunotransferencias de geles de SDS-PAGE desarrolladas en condiciones no reductoras (Fig. 14 c) los moAb TE4b y TE9b reaccionaban con un componente presente en los extractos de corneocitos plantares en KCl (Fig. 14 c, calles 2 y 4) y en la preparación de SCCE purificada (Fig. 14 c, calles 3 y 5), y ambos tenían el mismo Mr que la proteína purificada mayoritaria y el componente caseinolítico mayoritario en los zimogramas. Los anticuerpos no eran reactivos con muestras que se habían reducido en presencia de SDS, sugiriendo que son dirigidos contra epítopos dependientes de la conformación.

Además de la proteína mayoritaria con Mr alrededor de 25 kD en la forma no reducida, la preparación de SCCE purificada contiene un componente minoritario positivo con Coomassie con Mr alrededor de 26 kD (no reducido; véase Ejemplo 3). En los zimogramas hay presente un componente caseinolítico correspondiente y que puede ser inhibido por quimostatina en una forma similar al componente caseinolítico de 25 kDa mayoritario (véase Ejemplo 3). Con concentraciones mayores de los moAb TE4b y TE9b (no se muestran los resultados) también se podía ver que este componente minoritario reaccionaba con los anticuerpos en las inmunotransferencias. Se han obtenido resultados similares (no se muestran) con un anticuerpo de conejo policlonal cultivado contra el componente mayoritario positivo con Commassie purificado por electroforesis preparativa. No se conoce la relación exacta entre las dos proteínas con actividad de tipo SCCE y la aparente reacción cruzada inmunológica.

5.2. Anticuerpos policlonales específicos para SCCE 5.2.1. anti-SCCE de pollo

Se desnaturalizaron térmicamente 45 \mug de SCCE, purificada por cromatografía de afinidad en SBTI como se ha descrito en el Ejemplo 4,1, en 0,2 ml de Tris-HCl 0,1 M, durante 60 minutos a 60ºC, y se homogenizaron en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories). La emulsión obtenida se inyectó por vía subcutánea en pollos Derco, de aproximadamente 20 semanas de edad, de los cuales se había extraído una muestra de sangre para preparar el suero preinmune. A los pollos se les dieron inyecciones subcutáneas adicionales de emulsiones preparadas como se ha descrito antes pero con adyuvante incompleto de Freund, y con 30 \mug de SCCE purificada y desnaturalizada térmicamente (volumen total de cada emulsión 250 \mul) después de 3, 5 y 7 semanas. Los pollos se desangraron 2 semanas después de la última inyección. La sangre se mezcló inmediatamente con 2 volúmenes de solución de Alsever (por 100 ml: 100 ml de 1,87 g de glucosa, 0,8 g de citrato sódico, 0,62 g de cloruro sódico, ácido cítrico hasta pH 6,1) y se centrifugó. El anti-SCCE de pollo escogido para estudios adicionales se usó con una dilución 1/2000 en experimentos con inmunotransferencia. Véase la figura 17, Ejemplo 8, para una ilustración de la especificidad del antisuero.

5.2.2. Anti-SCCE de conejo

La SCCE purificada por cromatografía de afinidad en SBTI se sometió a SDS-PAGE sin reducción como se ha descrito en el Ejemplo 4.1, en geles con un grosor de 15 mm de acuerdo con Laemmli 1970. La banda de proteína mayoritaria que se ha mostrado previamente que era la SCCE se visualizó con el método de teñido de cloruro de cobre de acuerdo con Lee et al. (1987), y se cortó. Después de eliminar el cloruro de cobre con EDTA de acuerdo con Lee et al., los cortes de gel se homogeneizaron en solución salina tamponada con fosfato. Las muestras de los cortes de gel homogeneizados se suspendieron en volúmenes iguales de adyuvante de Freund. Se dio a un conejo aproximadamente 30 \mug de SCCE pura preparada de esta forma en adyuvante completo por vía subcutánea. Después de 3, 5 y 7 semanas, la inyección se repitió con la misma cantidad de SCCE, pero con adyuvante incompleto. El conejo se desangró dos semanas después de la última inyección.

El anti-SCCE de conejo obtenido (D-5) se usó con dilución 1/500-1/1000 en experimentos de inmunotransferencia con anti-inmunoglobulinas de conejo conjugadas con fosfatasa alcalina como segundo anticuerpo.

En todos los experimentos de inmunotransferencia, se detectaron los segundos anticuerpos unidos de acuerdo con Blake et al. 1984 (se remite a los Ejemplos 5, 8 y 9).

El anti-SCCE Bo-1 de conejo se preparó de una forma similar, pero con SCCE que se había reducido antes de SDS-PAGE, como antígeno.

5.3. Estudios inmunohistoquímicos con los anticuerpos monoclonales

En estudios inmunohistoquímicos con anticuerpos monoclonales específicos para la SCCE, se pudo detectar la SCCE en células suprabasales superiores de epitelio escamoso queratinizado humano (epidermis, cubierta de la raíz interna de los folículos pilosos, paladar duro), pero no en el epitelio escamoso no queratinizado (cubierta de la raíz interna del folículo piloso, mucosa labial y bucal). Por lo tanto, la SCCE puede ser expresada específicamente en epitelio escamoso queratinizado. Además, se encontró que la SCCE era expresada en células suprabasales superiores de epidermis humana reconstruida in vitro y hecha crecer en la interfase de aire-agua. Cuando se añadió ácido retinoico al medio con una concentración que estimulaba la proliferación de queratinocitos pero inhibía la formación de un estrato córneo, la SCCE ya no fue expresada. Esto sugiere que la expresión de la SCCE puede ser parte del programa de diferenciación epidérmico.

Los resultados de los experimentos inmunoelectromicroscópicos con anticuerpos monoclonales específicos para SCCE, son compatibles con una papel de la SCCE en la degradación de desmosomas, y por lo tanto en la descamación. Los anticuerpos marcaban específicamente cuerpos lamelares que experimentaban secreción al espacio intercelular entre las células granulares de la capa más superior y las células del estrato córneo más inferior, mientras que en el estrato córneo los anticuerpos reconocían epítopos en estrecha asociación con los desmosomas en el espacio extracelular.

Ejemplo 6 Clonación y secuenciación de cDNA que codifica la SCCE humana

Las enzimas de restricción se obtuvieron de Promega, Madison, MI, y la TAQ-polimerasa de Perkin-Elmer-Ctus, Norwalk, CT. Se obtuvo una biblioteca de cDNA de queratinocitos humanos \lambdagt11 preparada a partir de mRNA obtenido de queratinocitos humanos adultos de origen epidérmico, de Clonotech Laboratories, Palo Alto, CA (Catálogo # HL 1045 b). Inicialmente, la biblioteca se cribó con los sueros policlonales de conejo anti-SCCE D-5 y Bo-1 (véase Ejemplo 5.2.2). Puesto que el suero anti-SCCE policlonal Bo-1 dio señales de fondo altas, se excluyó del estudio de cribado amplio en una etapa temprana. Usando el antisuero D-5, se enriquecieron una serie de calvas inmunoreactivas como se esperaba para calvas positivas verdaderas. No se observó reactividad con los anticuerpos monoclonales moAb 4 y moAb 9 para ninguna de las calvas. Una caracterización con enzimas de restricción extensa y caracterización por PCR de once calvas aisladas, puso de manifiesto que no se podían detectar similitudes entre las diferentes calvas. La presencia de dichas similitudes parciales indica que las calvas contienen inserto de DNA homólogo de la misma secuencia de cDNA. Basándose en el fracaso para definir una "huella dactilar" de una secuencia de cDNA de la SCCE probable, se modificó la estrategia.

Las calvas se cribaron con E. coli Y 1090 (Clontech) por hibridación en calva usando un oligonucleótido sintético degenerado como una sonda. La sonda de oligonucleótido se diseñó basándose en la secuencia de amino terminal determinada experimentalmente para la enzima SCCE nativa como se ha descrito en el Ejemplo 4.2. Se seleccionó la parte más fiable de la secuencia de aminoácidos, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 3, aa 1 - aa 6), para la construcción de una sonda de oligonucleótido 17-mero sintético 5'-ATHATHGAYGGNGCNCC-3' (H = A o C o T; Y =
C o T; N = A o C o G o T), denominado SYM3067, SEQ ID NO: 4. La sonda de oligonucleótido se sintetizó usando un sintetizador de DNA Beckman 200A, usando la técnica de la fosforamidita de acuerdo con las instrucciones del vendedor.

Las bacterias E. coli Y 1090 se hicieron crecer toda la noche en medio LB (Sambrook et al. 1989) que contenía maltosa al 0,2% y MgSO_{4} 10 mM. Después se mezclaron 0,4 ml del cultivo con solución madre diluida de fago de la biblioteca y se adsorbieron durante 20 minutos a 37ºC. El cultivo infectado se mezcló con 6 ml de agarosa blanda (agarosa al 0,75% en LB y MgSO_{4} 10 mM). La mezcla de agarosa blanda se vertió en diez placas LA de 150 mm. Las placas se incubaron a 37ºC durante 5 horas, y se pusieron a 4ºC toda la noche. En total, las placas contienen aproximadamente 4x10^{5} calvas.

Para inmovilizar las calvas, cada placa se cubrió con membranas de cribado de colonia/calva NEN DuPont (Dupont, Wilmington, DE) durante dos minutos. Las membranas se sumergieron 2 veces durante 2 minutos en NaOH 0,5 M, 2 veces dos minutos en Tris-HCl pH 7,5, y se dejaron secar al aire. Después, estas membranas se usaron en un experimento de hibridación como se describe a continuación. Las membranas se hibridaron previamente en sulfato de dextrano al 10%, NaCl 1 M, solución de SDS al 1% que contenía DNA de esperma arenque desnaturalizado 100 mg/ml (Sigma, St. Louis, MO) durante 5 horas a 65ºC. La sonda, SYM 3067, era [\lambda-^{32}P] dATP marcada usando polinucleótido-quinasa T4 (Promega, Madison, WI), y se añadió a la mezcla de prehibridación. La hibridación se llevó a cabo durante 12-18 horas a 42ºC.

Después de la hibridación, las membranas se lavaron cuatro veces 5 minutos en 2xSCC a temperatura ambiente, dos veces 30 minutos en 2xSCC, SDS al 1% a 42ºC, y finalmente en SCC 0,1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las membranas se autorradiografiaron sobre una película de rayos X (Hyperfilm-MP, Amersham, UK). Se identificaron catorce calvas positivas en el cribado principal. Las calvas positivas se volvieron a cribar usando la misma sonda y métodos como se ha descrito antes. Después del procedimiento de recribado, se identificaron dos calvas positivas. Las dos calvas seleccionadas se purificaron durante otro periodo de tiempo y se determinó el tamaño de los insertos por PCR usando SYM 1600 y SYM 1601 como cebadores y fagos aislados como moldes. Estos dos cebadores son complementarios de los brazos izquierdo y derecho del fago \lambdagt 11, respectivamente. Después, el fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 0,9 kb generado a partir del fago A 6.2.2 se hizo digerir con EcoRI y se clonó en pUC19 digerido con EcoRI (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pS496. Este fragmento clonado se sometió a un análisis de secuencia parcial usando cebadores de secuencia complementarios de pUC19. La secuencia de nucleótidos se determinó usando kits de secuenciación T7 (Pharmacia, Uppsala, Suecia, o USB, Cleveland, Ohio).

La traducción de la secuencia de DNA obtenida dio como resultado una secuencia de aminoácidos que era homóloga a la secuencia de proteína determinada experimentalmente. Sin embargo, la secuencia carecía de un codón de inicio de traducción. Para aislar un cDNA de longitud completa, el fragmento de DNA obtenido se separó en gel de agarosa y se usó como una sonda permitiendo la hibridación en condiciones restrictivas. Esta sonda se marcó con ^{32}P usando el sistema de marcaje de DNA de multicebador (Amersham, Reino Unido) por el siguiente procedimiento. Se añadió agua en una proporción de 3 ml por gramo de gel, y se puso en un baño de agua hirviendo durante siete minutos para fundir el gel y desnaturalizar el DNA. Después el tubo se transfirió a un baño de agua a 37ºC durante al menos 10 minutos. Se añadió un volumen de solución de DNA/agarosa que contenía aproximadamente 25 ng de DNA, a la reacción de marcaje, de acuerdo con las instrucciones del suministrador.

Para obtener un cDNA de longitud completa, se volvió a cribar la biblioteca de cDNA dos veces con esta sonda usando los mismos métodos que se han descrito antes, excepto que la hibridación fue en condiciones restrictivas, a 65ºC. Estos experimentos dieron como resultado la identificación y aislamiento de 45 calvas positivas individuales, que inicialmente se cribaron por análisis por PCR usando SYM 1600 (5'-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3'; SEQ ID NO: 5) o SYM 1601 (5'-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3'; SEQ ID NO: 6) en combinación con SYM 3208 como cebadores de la PCR para identificar una calva que contuviera el marco de lectura abierto 5' entero. SYM 3208, 5'-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3', SEQ ID NO: 7, que es al menos parcialmente complementaria de la parte 5' del cDNA de la SCCE, se diseñó basándose en la información de la secuencia de DNA obtenida de pS496. Después de este cribado, se seleccionaron cuatro fagos para posterior análisis. Para el análisis de la secuencia, los fragmentos amplificados por la PCR resultantes obtenidos de estos fagos, se clonaron en pUC19, como se ha descrito antes. Los resultados obtenidos indicaban que uno de los fagos, 205.2.1., contenía el inserto de longitud completa.

El DNA del aislado de fago 205.2.1 se preparó de acuerdo con Sambrook et al., 1989, y la preparación de DNA se hizo digerir con EcoRI. El DNA digerido se separó por electroforesis en agarosa, y se aisló un fragmento de aproximadamente 1 kb y se clonó en pUC19 digerido con EcoRI. El plásmido resultante se denominó pS500 (Fig.15). La secuencia de nucleótidos completa del fragmento de cDNA se determinó como se ha descrito antes. Como cebadores para las reacciones de secuenciación, se usaron oligonucleótidos específicos complementarios de las secuencias de pUC19 o SCCE. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) contenía un marco de lectura abierto suficiente para codificar la secuencia de aminoácidos entera de una proteína precursora de la SCCE que constaba de 253 aminoácidos, que incluía un péptido señal y un prepolipéptido (SEQ ID NO: 2).

Se encontró que otro fago llamado 106.1.2 contenía una secuencia de cDNA de SCCE que carecía de la secuencia 5' no traducida y de los tres primeros codones. Este inserto se aisló como un fragmento de EcoRI de 954 pb y se clonó en pUC19 linealizado con EcoRI, dando como resultado el plásmido pS498. Este plásmido se secuenció parcialmente.

Se encontró que un tercer fago denominado 108.1.2 contenía un secuencia de cDNA de SCCE que también carecía de la secuencia 5' no traducida y de siete nucleótidos de la región traducida. Este inserto de cDNA tenía una variante más larga de la región 3' no traducida, que se extendía 1057 pb corriente abajo del codón de parada. Este fragmento de EcoRI de 1884 pb se aisló y clonó en pUC19 linealizado con EcoRI. El plásmido resultante se secuenció completamente y se denominó pS501.

Ejemplo 7 Detección de mRNA de SCCE en epidermis humana Preparación del RNA total de epidermis humana

Ésta se llevó a cabo de acuerdo con Chomczynski and Sacchi, 1987. Se obtuvo piel abdominal humana no enferma de cirugía plástica. Inmediatamente después de quitarla se enfrió en hielo. En menos de 15 minutos se recuperó la epidermis mediante corte firme con un escalpelo sumergido en solución D (Chomczynski y Sacchi, 1987) y se homogenizó con un homogenizador de vidrio. Después se siguió el protocolo descrito por Chomczynski y Sacchi. El RNA total sedimentado se almacenó a -20ºC en etanol al 70% hasta que se analizó posteriormente.

Preparación de RNA mensajero

Se procesaron quinientos microgramos de RNA de epidermis total con el kit de Poli A Tract (Promega) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Electroforesis y transferencia de RNA

Los geles de agarosa (1,4%) se prepararon con formaldehído 0,66 M en tampón 1 x MOPS y bromuro de etidio 0,6 g/ml (Sigma, St. Louis, MO). Se disolvió mRNA correspondiente a 100 \mug de RNA total en tampón de muestra de RNA (formamida al 50%, formaldehído 2,2 M, Ficoll al 3%, 1 x MOPS) y se calentó a 60ºC durante 5 minutos antes de la aplicación. Los marcadores de RNA (BRL, Gaithersburg, MD) se trataron igual. Después de la electroforesis los geles se sumergieron en agua destilada durante 5 minutos seguido de NaOH 50 mM durante 30 minutos y Tris-HCl 0,1 M pH 7,5 durante 30 minutos. La transferencia a membranas GeneScreen Plus (NEN DuPont, Wilmington, DE) se llevó a cabo con el equipo Vacu-Gene (Pharmacia, Uppsala, Suecia) durante 1 hora en 10 x SSC. Después las membranas se lavaron en 3 x SCC, se secaron toda la noche, y se pusieron en el horno durante 2 horas a 80ºC. El RNA se visualizó en las membranas con luz UV.

Sondas de cDNA

El plásmido pS501, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 6, se hizo digerir con HincII y BglII. Este cDNA contiene un sitio HincII en el pb nº 1060 y un sitio BglII en el pb nº 1715. El fragmento de 1070 pb (sitio HincII en el sitio de clonación múltiple de pUC19 - sitio HincIII endógeno) contiene la región que codifica la SCCE excepto el pb 7 en el extremo 5', y una región no traducida, incluyendo el sitio de poliadenilación en los pb 944-951, que es común a todos los cDNA de SCCE que se han aislado. El fragmento HincII - BglII de 655 pb, que no contiene la cola de poli A, es único para el cDNA de SCCE 108-1-2. Los fragmentos se purificaron por electroforesis en agarosa y se usaron para preparar sondas marcadas con ^{32}P-dCTP con el kit de marcaje de DNA multicebador (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).

Hibridación

Las membranas se hirvieron durante 30 min en SDS al 1% en 1 x TE y se prehibridaron a 60ºC en SDS al 1%, NaCl 1 M, sulfato de dextrano al 10%, DNA de esperma de arenque 0,1 mg/ml, durante 3 horas. La hibridación se llevó a cabo en la misma solución a 60ºC durante toda la noche. Se llevaron a cabo lavados 2 x 30 min a 60ºC en SDS al 1% en 2 x SCC, y 3 horas en 0,1 x SCC a temperatura ambiente. Después las membranas se sometieron a autorradiografía.

Resultados

Se pudo demostrar la presencia en epidermis humana de dos especies de mRNA con tamaños alrededor de 1,2 kb y 2,0 kb respectivamente (Fig. 16). Esto está de acuerdo con las pruebas obtenidas de los experimentos de clonación donde se encontraron dos tipos de cDNA.

Ejemplo 8 Expresión de SCCE recombinante en E. coli Construcción de plásmidos pGEX-2T/SCCE 1. Cebadores de la PCR homosentido

1.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT (SYM 3367; SEQ ID NO: 8), parte 3' subrayada que codifica los aminoácidos N-terminales IIDGAPC de la SCCE nativa activa, parte 5' con un sitio BamHI y una secuencia adicional que codifica el sitio IEGR del factor Xa.

1.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM 3368; SEQ ID NO: 9), parte 3' subrayada que corresponde a los pares de bases 76-96 en la secuencia de cDNA de SCCE completa que codifica la secuencia de aminoácidos LETAGEE, la parte 5' es como en 1a.

2. Cebadores de la PCR antisentido

TGATCCTCTGAGCTCTCCTG (SYM 3371; complementario a los pares de bases 285-304 en la secuencia de cDNA de SCCE completa, SEQ ID NO: 1, con el sitio SacI en el pb 294).

Se amplificó por la PCR una secuencia de pS498 (Ejemplo 6) con los cebadores de 1a/2 y 1b/2. Los productos obtenidos se purificaron por extracción en fenol y precipitación con fenol, se hicieron digerir con BamHI/SacI, y se purificaron por electroforesis en agarosa. Después se clonaron en células TG2 en pGEX-2T (Pharmacia), se hicieron digerir con BamHI/EcoRI junto con los 673 pares de bases de 3' de SCCE 106-1-2 obtenido por digestión de pS498 con SacI y EcoRI. Se aislaron de los clones bacterianos usados para estudios de expresión (pS510 que codifica el extremo N-terminal nativo cercano al sitio del factor Xa, y pS511 que codifica el propéptido propuesto cercano al sitio del factor Xa), y las secuencias de nucleótidos correspondientes a los insertos obtenidos de productos de la PCR se controlaron
por el método de terminación de la cadena didesoxi usando un kit de secuenciación T7 (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

Estudios de expresión

Los cultivos durante toda la noche de células TG 2 con pS510 y pS511 en medio LB que contenía Carbenicilina 50 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), se diluyeron diez veces en medio reciente, y se hicieron crecer durante 3 horas a 37ºC. Se añadió IPTG (Sigma, St. Louis, MO) hasta una concentración final de 0,1 mM, y los cultivos se hicieron crecer a 37ºC durante 3 horas adicionales. Los sedimentos bacterianos se trataron con ultrasonidos en PBS al 1% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Después de centrifugar a 10.000 x g durante 15 minutos, se analizaron los líquidos sobrenadantes y sedimentos por SDS-PAGE e inmunotransferencia con un antisuero de pollo específico para SCCE policlonal.

Se encontraron grandes cantidades de proteínas inducibles con IPTG con Mr aproximadamente 50 kD (ps510) y 52 kD (pS511) con inmunorreactividad de tipo SCCE, en los sedimentos insolubles en PBS-Triton X-100 (véase Fig. 17).

Después de tratamiento con ultrasonidos en PBS-Triton X-100, los líquidos sobrenadantes contenían proteínas de fusión GST/SCCE con el mismo tamaño que en los sedimentos insolubles, pero las cantidades eran pequeñas comparadas con los sedimentos insolubles.

Estos resultados muestran que se puede expresar la SCCE en forma de una proteína de fusión con GST, y las secuencias correspondientes al sitio de escisión de la proteasa específica en la secuencia de aminoácidos de pre-pro-SCCE permitirán repetir este experimento con intención de producir SCCE recombinante en bacterias. La proteína producida se puede solubilizar en urea o hidrocloruro de guanidinio y después purificar por cromatografía de intercambio catiónico debido al alto punto isoeléctrico de la SCCE. La proteína purificada se puede renaturalizar por diálisis frente a tampones con menor concentración de agente desnaturalizante, y después se puede escindir con Factor Xa para liberar el polipéptido GST de SCCE o pro-SCCE. Las proteínas de fusión GST/SCCE también se usarán como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para SCCE, y como inmunoabsorbentes en purificación de anticuerpos.

Ejemplo 9 Expresión de la SCCE humana recombinante en células de mamíferos

Con el fin de generar un vector de expresión para producir la SCCE recombinante, se aislaron secuencias de cDNA humano del plásmido pS500 en forma de un fragmento EcoRI/DraI de 897 pb. Este fragmento se subclonó en pUC19 digerido con EcoRI y SmaI, dando como resultado pS502. Después, el plásmido pS502 se hizo digerir con EcoRI y SalI para aislar las secuencias de cDNA de SCCE en forma de un fragmento de 0,9 kb, el cual se volvió a subclonar en una variante de pUC19 que carecía del sitio HindIII, dando como resultado el plásmido pS503. Esta variante de pUC19 se generó por digestión de pUC19 con HindIII, se rellenó usando enzima klenow y se volvió a ligar. Con el fin de facilitar la clonación en un vector de expresión, se introdujo un sitio HindIII en el extremo 5' del cDNA de SCCE. Esto se hizo mediante digestión de pS503 con EcoRI e inserción de un conector que convierte el sitio en HindIII, SYM3603 5'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3', SEQ ID NO: 10. El plásmido resultante que alberga la parte de cDNA de SCCE que codifica la proteína con un sitio HindIII en el extremo 5' y un sitio SalI en el extremo 3' respectivamente, se denominó pS505.

El vector de expresión final se obtuvo ligando tres fragmentos de DNA diferentes. Primero, pS505 se hizo digerir con HindIII y SalI, y se aisló un fragmento de 0,9 kb.

Segundo, para proporcionar la parte distal del elemento regulador corriente arriba de la metalotioneina murina, las secuencias del virus de papiloma bovino, el fragmento genómico beta-globina de conejo que proporciona señales de procesamiento de mRNA y las secuencias de plásmido pML2d, para permitir la selección y replicación en E. coli (Waldenström et al., 1992), se hizo digerir el vector pS147 con SacI y SalI, y se aisló un fragmento de aproximadamente 12 kb.

Tercero, para aislar la parte proximal del promotor de metalotioneina murina, el plásmido pS42, en el que BglII nativo situado en la secuencia líder se había convertido en un sitio HindIII, se hizo digerir con SacI y HindIII, y se aisló un fragmento de aproximadamente 220 pb.

La ligación de estos tres fragmentos dio como resultado el vector de expresión de la SCCE pS507 (véase Fig. 18).

El vector de expresión pS507 se cotransfectó con un vector que contenía el gen de resistencia a la neomicina que llevaba la repetición terminal larga 5' del sarcomavirus Harvey, y con señales de poliadenilación SV40 (Lusky and Botchan, 1984) en células murinas C127 (ATTC CRL 1616). Los experimentos de transfección se llevaron a cabo de acuerdo con el método de precipitación con fosfato cálcico (Graham and Van der Eb, 1973). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado con Ham F12/Dulbecco (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) (1:1) complementado con suero de ternero fetal al 10% (HyClone, Logan, UT). Se seleccionaron clones de células con resistencia a la neomicina con G418 1,5 mg/ml (Gibco-BRL), y después de 10-15 días de selección, se identificaron clones de células resistentes y se aislaron de las placas madre y se pasaron al análisis posterior.

Para analizar la expresión de los genes de SCCE recombinante, se preparó RNA total a partir de las líneas celulares aisladas. Se preparó RNA total a partir de células C127 y se separó en un gel de formaldehído al 1%-agarosa, se transfirió a membrana de nitrocelulosa y se hibridó con una sonda de SCCE marcada con ^{32}P. La sonda era el fragmento HincII de 1070 pb del cDNA de SCCE aislado por digestión de pS500 con HincII, y electroforesis en agarosa. Los procedimientos experimentales estaban de acuerdo con Ausubel et al., 1992. Los experimentos de transferencia Northern e hibridación con cDNA de SCCE marcado con ^{32}P mostraron que el mRNA de SCCE recombinante era detectable en varias líneas celulares que albergaban el vector de SCCE, pS506. No se encontró hibridación en las muestras testigo obtenidas de líneas celulares C127 que contenían un vector idéntico excepto por el cDNA de SCCE (Fig. 19). El tamaño de 1,4 kb corresponde al tamaño esperado.

Se recogieron las muestras del medio de cultivo celular condicionado, y se analizaron por inmunotransferencia. Se llevó a cabo SDS-PAGE de acuerdo con Laemmli (1970) y para la inmunotransferencia se usó anti-SCCE nativo de pollo como anticuerpo de detección. Se usó una anti-IgG de pollo marcada con fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO) para marcaje de la enzima. Los resultados se muestran en la Fig. 20.

Para analizar la expresión de la SCCE recombinante, se preparó RNA total a partir de células C127 transfectadas con el vector de expresión pS507. Como muestras testigo, se preparó RNA total a partir tanto de células C127 no transfectadas como de células C127 transfectadas con el vector de expresión pS147. El vector pS147 es similar a pS507 excepto que contiene el cDNA de lipasa estimulada por sales biliares humana (Nilsson et al., 1990) en lugar del cDNA de la SCCE. El RNA se preparó de acuerdo con Ausubel et al. (1992). Los experimentos de transferencia Northern e hibridación con cDNA de SCCE marcado con ^{32}P mostraron que el mRNA de la SCCE recombinante de aproximadamente 1,4 kb era detectable en células C127 que albergaban el vector de SCCE, pS507 (Fig. 19). No se encontró hibridación en las muestras testigo derivadas de líneas celulares C127 que contenían pS147 o células C127 no transfectadas. La longitud del mRNA de SCCE recombinante es como se esperaba.

Se recogieron muestras de medio de cultivo celular condicionado, y se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia. La transferencia se desarrolló como describen Blake et al., 1984. Los resultados obtenidos (véase Fig. 20) muestran que las células C127 que albergan pS507 están produciendo tres proteínas que presentan reacción con todos los anticuerpos de SCCE de pollo y conejo policlonales, así como con los anti-SCCE monoclonales preparados como se ha descrito en el Ejemplo 5. Las proteínas reactivas de SCCE recombinante muestran un peso molecular aparente que es aproximadamente 1 kDa mayor que la SCCE humana nativa purificada. La proteína recombinante no muestra ninguna actividad proteolítica. Por comparación de la secuencia de aminoácidos de la SCCE deducida con el extremo NH-2 terminal determinado experimentalmente de la SCCE humana nativa y con secuencias de otras proteasas de tipo quimotripsina, se puede concluir que la SCCE recombinante producida en células C127 está en su forma de pro-enzima. Los datos de secuencias indican que esta pro-enzima se puede activar por escisión proteolítica en el lado C-terminal de la lisina en la secuencia ...AQGDKIIDGAP...., la secuencia subrayada es la secuencia NH-2 de la SCCE humana nativa activa (SEQ ID NO: 2, aa 5 - aa 6).

Ejemplo 10 Purificación y caracterización de la SCCE recombinante Purificación

Se acoplaron 1,3 mg de anticuerpo monoclonal TE4b dirigido contra SCCE nativa con 1,5 ml de Sepharosa activada con CNBr (Pharmacia-LKB Biotech., Uppsala, Suecia) usando el método descrito por el fabricante. Se filtraron 40 ml de medio que contenía SCCE por un filtro de 0,45 mm y después se aplicaron a la columna. La columna se lavó varias veces con fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, y después se eluyó con glicina 0,1 M-HCl, pH 2,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente añadiendo 0,1 volúmenes de Tris-HCl 1 M, pH 8,0.

Activación

La SCCE recombinante (4,6 \mug en 200 \mul), purificada usando el gel con el anticuerpo monoclonal acoplado (véase antes) se hizo digerir con 4,6 \mul de tripsina 0,1 mg/ml (relación en masa 10:1) a 37ºC. Se extrajeron muestras (50 \mul) a los 20 minutos, 1 hora, 3 horas y 20 horas, y se añadieron 5 \mul de (4-amidinofenil)metanosulfonilo 10 \muM (APMSF; Boehringer Mannheim, Alemania) para terminar la reacción. Se ensayó la actividad de la SCCE escindida mediante SDS-PAGE no reductor en geles de caseína como se ha descrito en el Ejemplo 2.2. Se ensayó la identidad de las formas de SCCE escindidas obtenidas reduciendo el SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia usando anti-SCCE nativa de pollo seguido de una anti-IgG de pollo marcada con fosfatasa alcalina y azul de nitro-tetrazolio y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo como sustrato para la fosfatasa alcalina.

Secuenciación N-terminal

La afinidad de la SCCE purificada (como se ha descrito antes), aproximadamente 35 \mug, se ensayó por transferencia en ranura usando una unidad Bio-Dot SF (Bio-Rad, Richmond, CA) sobre una membrana Immobilon (Millipore, Bedford, MA). Después las membranas se lavaron varias veces con agua destilada para eliminar todo el Tris y glicina. Se cortó la parte de la membrana donde estaba unida la proteína, y se secuenció usando un secuenciador en fase líquido de pulsos 477A Applied Biosystems (Foster City, CA) con un analizador PTH 120A en conexión. La secuenciación se llevó a cabo con programas cíclicos regulares y productos químicos del fabricante. La secuencia obtenida en las primeras seis posiciones era glu-glu-ala-gln-gly-asp que correspondía a los aminoácidos -7 - -2 del SEQ ID NO: 2. Como puede concluirse de este resultado, el péptido señal consta de 22 aminoácidos, y basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminales de la SCCE activa nativa, el propéptido consta de siete aminoácidos.

Desglicosilación

Se hirvieron durante 3 minutos SCCE recombinante purificada (5 \mug) y SCCE nativa (20 \mug) en 20 \mul de SDS al 0,5% y \beta-mercaptoetanol 0,1 M. Las muestras se diluyeron con tampón de fosfato sódico, pH 8,6, y Nonidet P-40 hasta concentraciones finales de 0,2 M y 1,25%, respectivamente. Se añadió N-Glycosidase F® (Boehringer Mannheim) (0,6 unidades de enzima para la proteína recombinante y 1,2 unidades para la proteína nativa) y la mezcla de reacción se incubó toda la noche a 37ºC. La concentración final de SDS en la muestra de ensayo era 0,17%. Se analizó la SCCE tratada con N-Glycosidase F® en SDS-PAGE al 8-18%, seguido de inmunotransferencia como se ha descrito antes. Los resultados obtenidos mostraron una reducción del peso molecular aparente de las dos bandas superiores, mientras que el peso molecular aparente de la banda inferior no cambió (Figura 23). Esto mostró que la SCCE recombinante producida en células C127 existe en dos forma N-glicosiladas y una forma no glicosilada. Este resultado es análogo a lo que puede verse con la SCCE nativa activa (Figura 23).

Ejemplo 11 Actividad de digestión de desmosomas de la SCCE recombinante

Se quitaron corneocitos que contenían desmosomas intactos de piel tirando de las capas más profundas del estrato córneo, y las escamas se desprendieron con hexano y se secaron en partes alícuotas. Las partes alícuotas de corneocitos (3 mg) se extrajeron con cloruro sódico 1 M a 4ºC para solubilizar las proteasas intrínsecas, y después se lavaron a fondo con tampón de incubación (Tris/HCl 0,1 M pH 8,0) para eliminar la actividad proteolítica endógena de las preparaciones. Las incubaciones se llevaron a cabo en Tris 0,1 M pH 8,0, con o sin 10 \mug de SCCE recombinante durante 24 horas a 37ºC. La prueba de la digestión de los desmosomas por la enzima se demostró midiendo los niveles de la proteína marcadora de desmosomas, la desmogleina I (DG I). Ésta se aisló de las escamas por extracción en un tampón de urea (SDS al 2%/\beta-mercaptoetanol 8 M, con posterior purificación de la glucoproteína DG I usando cromatografía de afinidad en concanavalina A. El eluato de concanavalina A se fraccionó por SDS-PAGE y se transfirió electroforéticamente a una membrana PDVF para la inmunotransferencia. DG I se identificó usando un antisuero específico y se detectó usando quimioluminiscencia potenciada. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

	Testigo	+ rSCCE, 10 \mug
DG I (unidades arbitrarias/mg de escamas)	7950 \pm 4992	4059 \pm 2360

Los resultados presentados en la Tabla 4 muestran que la SCCE recombinante puede degradar las estructuras cohesivas intracelulares en el estrato córneo en un ensayo in vitro.

Ejemplo 12 Efectos de los inhibidores en la actividad de la SCCE recombinante

Se investigó el efecto de los inhibidores aprotinina, quimostatina y sulfato de cinc en la actividad de hidrólisis de S-2586 de la rSCCE. El diseño experimental fue como se ha expuesto en el Ejemplo 3.2. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

Inhibidor	Concentración (\muM)	Actividad (%)
Aprotinina	0	100
	0,35	51,6
	1,4	21,2
	5,7	7,4
Quimostatina	0	100
	0,64	74,9
	2,56	33
	41	1,9
ZnSO_{4}	0	100
	15,6	50,7
	62,5	19,4
	250	5,1

Como se muestra en la Tabla 5 anterior, la aprotinina, quimostatina e iones cinc inhibían la actividad de hidrólisis de S-2586 de la SCCE recombinante de una forma similar que para la enzima nativa.

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- Towbin et al. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354

- Waldenström et al. (1992) Gene 120:.175-181

- Wintroub et al. (1986). J. Clin. Invest. 77:196-201

- WO 93/04172 (presentado por Symbicom Aktiebolag el 19 de Agosto, 1992).

3

4

5

6

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: SYMBICOM AB

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: PO BOX 1451

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: UMEA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: SUECIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): S-901 24

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Enzima quimotríptica del estrato córneo recombinante (SCCE)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMATO DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 986 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 25..786

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 25..90

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat-peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 112..783

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 253 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATHATHGAYG GNGCNCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGCGACGA CTCCTGGAGC C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACCAGACC AACTGGTAAT G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGTGGGAG CCTCTTGCAC A

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TATTATTGAT GGCGCCCCAT GT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TTTGGAAACT GCAGGAGAAG AA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTGTGGAA GCTTCCAC

\hfill

Claims

1. Un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente un polipéptido que en su forma activa es capaz de descomponer el sustrato MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), siendo inhibida la descomposición por el polipéptido por la aprotinina, quimostatina y sulfato de cinc, y cuyo polipéptido:

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 que está acoplado a una proteína o a un soporte sólido.

3. Anticuerpo monoclonal como se define en la reivindicación 1 para el tratamiento de estados patológicos en animales y seres humanos.

4. Anticuerpo monoclonal como se define en la reivindicación 1 para uso en el diagnóstico de estados patológicos en animales y seres humanos.