CZ289600B6 - Izolovaná nukleová kyselina, replikovatelný vektor exprese, plazmid, savčí buňka nebo buněčná linie, polypeptid, způsob přípravy tohoto polypeptidu a farmaceutický přípravek s jeho obsahem - Google Patents

Abstract

Je pops na izolovan nukleov kyselina obsahuj c nukleotidovou sekvenci, kter k duje polypeptid sest vaj c ze sekvence aminokyselin zn zorn n v SEQ ID NO: 2, a kter² m enzymatickou aktivitu stratum corneum chymotryptick ho enzymu, d le replikovateln² vektor exprese pS507 DSM 8282, stejn jako sav bu ka nebo bun n linie, kter nese tento vektor, a plazmid pS500 DSM 8281. Tak je pops n v podstat ist² polypeptid sest vaj c ze sekvence aminokyselin zn zorn n v SEQ ID NO: 2, jako i zp sob p° pravy polypeptidu, spo vaj c v (a) vlo en nukleov kyseliny do replikovateln ho vektoru exprese, (b) transformaci vhodn ho hostitelsk ho organismu vektorem takto z skan²m, (c) kultivaci tohoto organismu za podm nek vhodn²ch pro expresi polypeptidu, (d) odb r polypeptidu a (e) pop° pad podroben polypeptidu post-transla n modifikaci. Farmaceutick² p° pravek pro pou it p°i l b chorob k e obsahuje uveden² polypeptid.\

Description

Izolovaná nukleová kyselina, replikovatelný vektor exprese, plazmid, savčí buňka nebo buněčná linie, polypeptid, způsob přípravy tohoto polypeptidu a farmaceutický přípravek s jeho obsahem

Oblast techniky

Předložený vynález se týká izolované nukleové kyseliny, replikovatelného vektoru exprese, plazmidu, savčí buňky nebo buněčné linie, polypeptidu, způsobu přípravy tohoto polypeptidu a farmaceutického přípravku sjeho obsahem pro různé kosmetické a terapeutické účely.

Dosavadní stav techniky

Kůže, jako orgán, je zajímavá z biologického, medicinálního a kosmetického pohledu. Existuje mnoho kožních onemocnění, které jsou buď specifické pro tento orgán, např. lupénka a ekzémy, nebo manifestují celou nemoc, jako celkové alergické reakce. Skutečnost, že specifické kožní nemoci mohou být považovány za důkaz existence molekulárních mechanismů, je pro kůži jedinečná. Analogicky, studie specifických kožních molekulárních procesů jsou důležité pro pochopení a léčení kožních onemocnění. Zdá se rozumné předpokládat, že část těchto procesů na jedné nebo druhé straně se vztahuje k nejspecializovanější funkci kůže, kterou je vytvoření fyzikálněchemické bariéry mezi vnějším a vnitřním prostředím těla. Fyzikálně-chemická kožní bariéra je lokalizována do nejzevnější vrstvy kůže, stratům comeum. Stratům comeum je nejvíce specializovaná struktura kůže. Je konečným produktem diferenciačního procesu pokožky, kterým je vrstevnatý dlaždicový epitel, který je považován za nejzevnější část kůže. Většina z buněk epidermis sestává z keratinových buněk v rozdílných stavech diferenciace. Nejnižší keratocyty, základní buňky, zůstávají na bazální vrstvě v kontaktu s dermis, což je pojivová tkáň kůže, a jsou pouze keratocyty, které mají oddělovací schopnost. Frakce bazálních buněk kontinuálně opouští bazální membránu a prochází diferenciačním procesem, při němž se případně stávají z buněk stavební bloky stratům comeum. V tomto procesu procházejí keratinové buňky mnoha adaptivními změnami. Vzrůstá obsah buněčné kostry sestávající ze specifických keratinových buněk epidermis. Intermediální vlákna přilehlých buněk jsou spojena s funkční jednotkou zvětšených počtem desmosomů. Největší změny se dějí během přechodu z nejhořejší živé buněčné vrstvy, stratům granulosum, do životaneschopné stratům comeum v procesu obvykle nazývaném keratinizace - zrohovatění. Kovalentně zesíťované proteiny jsou uloženy uzavřené do vnitřní strany membrány plazmy, a tvoří velice odolný buněčný obal. Dále, substance bohatá na tuky, tvořící se v keratocytech - specifických buněčných organelách, se uvolňuje do extracelulámího prostoru a tvořením lipidových lamel, které sousedí s buňkami stratům comeum, vytváří permeabilní bariéru pro hydrofilní substance. Konečně, všechny intracelulámí struktury, vyjma hustě shluknutých cytokeratinových vláken, zmizí.

Buňky stratům comeum, komeocyty, jsou životaneschopné. To znamená, že regulace různých procesů ve stratům comeum musí být výsledkem „programování“ ve stavu, kdy jsou keratocyty ještě životaschopné. Přeměna epidermis, která normálně probíhá přibližně 4 týdny, během nichž jsou buňky částí stratům comeum asi 2 týdny, končí ubýváním buněk z povrchu kůže procesem odlupování. Tento postup je příkladem „programování“ stratům comeum.

Předpokladem pro funkci stratům comeum jako fyzikálně-chemické bariery je, že jeho jednotlivé buňky jsou drženy pohromadě mechanicky odolnými strukturami, desmosomy. Odbourávání desmosomů, které je předpokladem pro buněčné odlupování, musí být regulováno tak, aby byla rovnováha mezi buňkami ubývajícími z povrchu kůže snovým vznikem stratům comeum, bez přerušení bariérových funkcí tkáně.

Poruchy keratinizace

Poruchy v keratinizačním procesu o různé síle jsou ve velkém počtu patologických stavů kůže. Při psoriáze je, spolu s typickým chronickým zánětem, nadprodukce nezralého stratům comeum, 5 čehož výsledkem je typické oškrabávání tohoto onemocnění. Skupina dědičných kožních chorob je charakterizována ztenčeným stratům comeum, což vede ke vzniku „rybích šupin“, tzv. ichtyóze. Při některých ichtyózách dochází ke snížení rychlosti odlupování a uvolňování buněk. Ačkoliv méně častá, než ichtyóza, je také „suchá kůže“ (xeroderma) charakterizovaná stratům comeum, z něhož opadávají komeocyty, nějako za normálních podmínek jako jednotlivé buňky 10 nebo jako malé shluky buněk, ale jako velké, makroskopicky viditelné šupiny. Tato choroba je velice rozšířená mezi staršími lidmi a mezi atopiky, což jsou individua se sníženou odolností ke kožnímu podráždění a s dispozicí k rozvinutí charakteristické formy endogenního ekzému. Při chorobách akné je keratinizace porušena v kanálcích mazových žláz, což vede k tvorbě komedonů a zátek. Vznik komedonů předchází a má se za to, že podněcuje, zánětlivá poranění 15 akné.

Proteolytické enzymy jsou přítomny keratinizaci

Jsou různé stupně v keratinizačních procesech a během přeměny stratům comeum, kde zřejmě 20 hrají proteolytické enzymy důležitou roli. Samozřejmě zmizení všech intracelulámích struktur, vyjma cytokeratinových vláken vyskytujících se během přechodu mezi životaschopnou azrohovatělými epidermálními vrstvami, musí zahrnovat proteolýzu. Přeměna profilagrinu na filagrin, protein, který má zřejmě funkci při speciálním typu agregace cytokeratinových vláken při keratinizaci, mohou být katalyzovány specifickou proteinázou. Ve stratům comeum je filagrin dále 25 štěpen na nízkomolekulámí komponenty, které jsou pravděpodobně důležité jako „přírodní zvlhčovadlo“.

Mimo to probíhají při keratinizačním procesu proteolytické modifikace cytokeratinových polypeptidů. Nakonec, proteolytická Činnost pravděpodobně hraje rozhodnou roli při rozpadu interce30 lulámích kohezních struktur ve stratům comeum, v krocích vedoucích případně k odlupování a uvolňování buněk.

Soudržnost a uvolňování buněk stratům corneum

Úloha desmosomů

Intercelulámí soudržnost ve stratům comeum, stejně jako v životaschopných částech epidermis, je zprostředkována signifikantním rozsahem desmosomů. Desmosomy sestávají ze dvou symetrických polovin, z nichž každá je tvořena dvěma přilehlými buňkami. Každá desmosomální polo40 vina má jednu intracelulámí část spojenou k cytokeratinovým vláknům a jednu část vytvořenou glykoproteiny vázanými intracelulámě a s transmembránovými a extracelulárními částmi. Extracelulámí části těchto proteinů, desmogleiny, jsou adhezní molekuly, a prostřednictvím jejich vzájemné interakce v extracelulámím prostora je tvořena kohezní struktura. Štěpení desmosomů zdá se následuje poněkud odlišnými způsoby ve stratům comeum dlaní a chodidel ve srovnání se 45 stratům comeum non-palmo-plantar (ne chodidel a dlaní). V pozdější tkáni zmizí kolem 85 % desmosomů dříve, než buňky zcela zrohovatí. Zbývající desmosomy, které jsou přednostně umístěny na okrajích pokrytých klky extrémně zploštěných buněk, zjevně setrvávají neporušené na úrovni, kde probíhá odlupování a uvolňování buněk. V palmo - plantámím (dlaně a chodidla) stratům comeum jsou komeocyty mnohem méně zploštěné, extenzivní degradace desmosomů 50 v hlubších vrstvách tkáně není. V obou tkáních je odlupování buněk spojeno s desmosomální degradací. V ichtyotické pleti, stejně jako v „suché kůži“, počet desmosomů v superficiální vrstvě stratům comeum, zdá se, vzrůstá.

-2CZ 289600 B6

Intercelulárni lipidy stratům corneum

Rozdíl v desmosomální degradaci mezi palmo-plantámím a non-palmo-plantámím stratům corneum se může vztahovat k rozdílům v množství extracelulámích lipidů v obou typech tkání. Lipidický obsah je značně vyšší v non-palmo-plantámím stratům corneum. Vrcholem schopnosti této tkáně jako permeabilní bariéry pro vodu a jiné hydrofilní substance je nejvrchnější stratům corneum dlaní a chodidel. Poněvadž desmosomy zabírají významný objem, a poněvadž neporušené desmosomy brání rozšiřování extracelulámího prostoru, desmosomální degradace může být mechanismem, díky němuž je více extracelulámího prostoru dostupno lipidům. Extracelulámí lipidy stratům corneum se týkají odlupování buněk také v noha dalších případech. Jelikož jsou většinovou složkou extracelulámího prostoru, dá se předpokládat, že mají důležitý vliv na aktivitu enzymů funkčních v této lokalitě, jako jsou např. enzymy zaměřené na desmosomální degradaci. Opravdu se ukázalo, že různé poruchy metabolismu tuků jsou pravděpodobnými příčinami některých typů ichtyóz. Je také pravděpodobné, že lipidy samy o sobě přispívají k určitému stupni koheze buněk stratům corneum. Avšak sekrece lipidů do extracelulámího prostoru stratům corneum je pravděpodobně také spojena se sekrecí mnoha enzymů. Prekurzory lipidů jsou uloženy v horních životaschopných keratocytech ve specifických organelách. Ukázalo se, že tyto tzv. lamelámí tělesa obsahují množství hydrolytických enzymů. Uvažuje se, že enzym odpovídající za desmosomální degradaci ve stratům corneum, je syntetizován, pravděpodobně v inaktivní „proformě“ keratocyty, uloženými v lamelámích tělesech, a uvolňován do extracelulámího prostoru stratům corneum v průběhu keratinizace, kde může být aktivován, a jeho aktivita je dále regulována, kromě jiných faktorů, složením extracelulámích lipidů.

Poruchy buněčné koheze v životaschopné epidermis

Je mnoho kožních poruch, kde je narušena koheze mezi keratocyty v nezrohovatělých, životaschopných epidermálních vrstvách. Tyto nemoci jsou charakterizovány jevem, zvaným akantolýza, což znamená rozpad desmosomálních spojení mezi jinak zdánlivě normálními keratocyty. Proces je zřejmě zprostředkován proteinázami, které doposud nebyly zcela identifikovány. Akantolýza vede, pokud je extenzivní, k tvorbě puchýřů, a je charakteristická autoimunní poruchou puchýřinou prostou (pemfigus vulgaris) a puchýřinou listovitou (pemfigus foliaceus), s dědičnou benigní rodinnou puchýřinou (Hayley-Hayleyova nemoc), a dědičnou folikulámí diskeratózou (Darierova nemoc).

Epidermis se aktivně účastni imunologických a zánětlivých reakcí

Epidermis má, zároveň se svou funkcí jako fyzikálně-chemická bariéra mezi vnějškem a vnitřkem těla, také funkci jako aktivní imunologická bariéra. Keratocyty mají schopnost produkovat i reagovat na velké množství cytokináz a jiných zánětlivých mediátorů, jimiž komunikují a vzájemně působí s buňkami imunologických a zánětlivých systémů. To má největší význam v obraně hostitele proti mikrobiálním infekcím a při léčení zranění. Moderní průzkum také ukázal, že keratocyty jsou pravděpodobně aktivní při mnoha zánětlivých kožních chorobách, jako je psoriáza a ekzemy.

Epidermálníproteinázy mohou být důležité při zánětech

Jedním z cytokináz produkovaných keratocyty je interleukin 1 (II—1). II—1 existuje ve dvou formách, II—1 alfa a II—1 beta, přičemž oba jsou přítomny v epidermis. Zatímco Il-lalfa je po své syntéze zcela aktivní, Il-lbeta je syntetizován vinaktivní 31 kD pro-formě. Pro Il-lbeta je přeměněn na aktivní 17kD formu specifickou proteinázou přítomnou např. vmonocytech, ale doposud nezjištěných v normální epidermis. Jako pro-Il-lbeta aktivátory může však také sloužit řada serinových proteináz se specifikací substrátu jako chymotrypsin (pankreatický chymotrypsin a catepsin G z neutrofilních granulocytů).

-3CZ 289600 B6

Jak předpokládal Norris (1990), proteolytické enzymy, přítomné v intracelulámím prostoru stratům comeum, mohou za určitých podmínek konvertovat inaktivní formy cytokináz do aktivních forem. Částečná pozornost je věnována v kontextu biologicky inaktivnímu pro-interleukinu-lbeta, který, jak se ukázalo, je produkován keratocyty (Mizutani a kol., 1991). Doposud nebyly nalezeny epidermální enzymy schopné konvertovat pro-interleukin-lbeta na aktivní interleukin-lbeta. Jelikož však chymotrypsin a catepsin G (enzym podobný chymotrypsinu) mají schopnost katalyzovat konverzi inaktivního rekombinantního pro-interleukinu-lbeta s molekulovou hmotností 31 000 na plně aktivní formu s molekulovou hmotností 17 000, je možné, že také enzymy podobné epidermálnímu chymotrypsinu mohou tuto konverzi katalyzovat.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin znázorněné v SEQ ID NO: 2, a kteiý má enzymatickou aktivitu stratům comeum chymotryptického enzymu.

Předmětem tohoto vynálezu také je izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin od polohy -7 do polohy 224 nebo od polohy 1 do polohy 224 ze SEQ ID NO: 2.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž replikovatelný vektor exprese pS507 DSM 8282, stejně jako savčí buňka nebo buněčná linie, která nese takový replikovatelný vektor exprese.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je plazmid pS500 DSM 8281.

Předmětem tohoto vynálezu také je v podstatě čistý polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin znázorněné v SEQ ID NO: 2, v podstatě čistý polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin od polohy -7 do polohy 224 nebo od polohy 1 do polohy 224 ze SEQ ID NO: 2.

Předmětem vynálezu také je způsob přípravy zde uvedeného polypeptidu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje tyto kroky:

(a) vložení nukleové kyseliny uvedené výše nebo některého jejich dále popsaného provedení do replikovatelného vektoru exprese, (b) transformaci vhodného hostitelského organismu replikovatelným vektorem připraveným v kroku (a), (c) kultivaci hostitelského organismu vytvořeného v kroku (b) za podmínek vhodných pro expresi polypeptidu, (d) odběr polypeptidu a (e) popřípadě podrobení polypeptidu post-translační modifikaci.

Předmětem tohoto vynálezu konečně je farmaceutický přípravek pro použití při léčbě chorob kůže, který obsahuje polypeptid mající aktivitu stratům comeum chymotryptického enzymu (SCCE) v podstatě čistého polypeptidu sestávajícího ze sekvence aminokyselin znázorněné v SEQ ID NO: 2 nebo v podstatě čistého polypeptidu sestávajícího ze sekvence aminokyselin od polohy -7 do polohy 224 nebo od polohy 1 do polohy 224 ze SEQ ID NO: 2 v množství od 0,001 do 25 % hmotnostních, vztaženo na celkový přípravek.

-4CZ 289600 B6

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález popisuje enzym, pojmenovaný stratům comeum chymotryptický enzym (SCCE), jenž je považován za zodpovědný za desmosomální degradaci ve stratům comeum. Důkazy jsou předloženy v příkladu 1 a ukazují, že opadávání buněk z povrchu zrohovatělé povrchové vrstvy kůže zahrnuje degradaci desmosomálních proteinů, a zdá se, že odpovídající enzymy jsou serinové proteinázy podobné chymotrypsinu, které mohou být inhibovány zinečnatými ionty.

Příklad 2 popisuje nalezený stratům comeum chymotryptický enzym (SCCE), proteinázu, která plně splňuje kritéria odpovědnosti za degradaci intracelulámích kohezních struktur ve stratům comeum in vitro a pravděpodobně také in vivo.

Příklad 3 popisuje částečnou charakterizaci aktivity stratům comeum chymotryptického enzymu za použití chromogenních substrátů.

Výsledky dokazují, že SCCE se enzymologicky odlišuje od jiných chymotryptických proteináz. Inhibitorový profil a schopnost degradace obou rozdílných substrátů enzymů podobných chymotrypsinu je zřetelně odlišný pro SCCE ve srovnání s hovězím chymotrypsinem a lidským catepsinem G. SCCE se zdá být také odlišný od chymázy lidských žímých buněk. Posledně zmíněný enzym katalyzuje degradaci Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA efektivně (viz Schwartz a kol., 1987 a Schechter a kol., 1989) - zatímco SCCE nikoliv- a není inhibován aprotininem nebo SBTI (Schechter a kol., 1983 a Wintroub a kol., 1986), zatímco SCCE je.

Příklad 4 popisuje částečné čistění SCCE z KCl-extraktů komeocytů afinitní chromatografií na nerozpuštěném trypsinovém inhibitoru ze sóji (SBTI) a stanovení N-terminální sekvence aminokyseliny SCCE. Výtěžky s neredukovanými vzorky byly dobré v krocích 1 - 6, ale v krocích 7 a 9 klesaly k nule, a výtěžky v krocích následujících se zjevně snižovaly. Také s redukovanými vzorky žádné odvozené aminokyseliny nemohly být zjištěny v krocích 7 a 9, ale v následujících krocích, kdy deriváty mohly být zjištěny, nebyl ve výtěžcích strmý pokles. Tyto výsledky dokládají cysteiny na pozicích 7 a 9. V krocích 7 a 9 však nebylo možné stanovit karboxymethylovaný cystein po zredukování a zpracování s kyselinou jódoctovou (100 mM). Získaná sekvence (Obr. 13, SEQ ID NO:3) byla identická pro redukované i neredukované vzorky.

Příklad 5 popisuje přípravu SCCE- specifických monoklonálních protilátek a polyklonálních SCCE-specifíckých protilátek kuřat a králíků, stejně jako imunohistochemické studie s monoklonálními protilátkami.

Příklad 6 popisuje klonování a sekvencování cDNA kódující lidský SCCE. Nejprve, cDNA banka připravená z mRNA odvozené z epidermálních keratinocytů dospělých lidí byla vyšetřována s anti-SCCE polyklonálními protilátkami králíků. Jedna z protilátek dala vysoký zpětný signál a byla v ranném stadiu vyloučena z extenzivní vyšetřující studie. Použitím jiné polyklonální protilátky (D-5) byla obohacena řada imunoreaktivních plaků pro správné pozitivní plaky. S monoklonálními protilátkami moAb4 a moAb9 však nebyla zjištěna žádná reaktivita pro kterýkoliv plak. Extenzivní restrikční charakterizace enzymu a PCR charakterizace jedenácti izolovaných plaků ukázala, že mezi různými plaky nemohou být žádné podobnosti. S ohledem na tento nedostatek definování peptidové mapy („finger-print“) pravděpodobné SCCE cDNA sekvence musí být strategie modifikována.

Navzdory preferenční detekci SCCE imunoreaktivního materiálu v suprabazálních keratinocytech byla používána pro výzkum SCCE cDNA knihovna cDNA, připravená z kultivovaných lidských keratocytů. Lze očekávat, že taková knihovna obsahuje cDNA pouze zbazálních keratocytů. Tento pokus byl založen na sledování slabého, ale pravděpodobně signifikantního imuno-zbarvování při použití SCCE monoklonálních protilátek také z bazálních keratocytů.

-5CZ 289600 B6

Plak byl zkoumán použitím syntetického 17-memího oligonukleotidu sondou navrženou na bázi nej spolehlivější části aminokyselinové sekvence Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO:10,aa 1 -aa6) z experimentálně stanovené amino-terminální sekvence nativního SCCE enzymu, jak je popsáno v Příkladu 4. Díky nejistotě s experimentálně stanovenou aminokyselinovou sekvencí, byl tento hexapeptid stanoven jako reprezentant jedné z nejspolehlivějších částí. Dále, možné kodony kódující tento hexapeptid se získaly v nejdelší možné degeneraci DNA sondy. Delší experimentálně stanovené sekvence Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-GlnLeu (SEQ IDNO:3, aa 15 -aa 24) byly vyloučeny díky vysokému stupni degenerace sekvence kódující tuto peptidovou sekvenci. V primárním výzkumu bylo identifikováno čtrnáct pozitivních plaků. Tyto pozitivní plaky byly přezkoumány za použití stejných sond a metodami, jak jsou popsány výše. Po přezkoumání byly identifikovány dva pozitivní plaky. Dva vybrané plaky byly ještě jednou přečištěny, a velikost inzertů byla stanovena PCR použitím SYM 1600 a SYM 1601, které byly doplněny do dvou ramének fágů, jako primery, a izolované fágy jako matrice. Tento klonovaný fragment byl podroben parciálním sekvenčním analýzám.

Translace získané DNA sekvence měla za výsledek sekvenci aminokyseliny, která byla homologní k experimentálně stanovené proteinové sekvenci. Avšak sekvence postrádala translační startovací kodon. K izolování cDNA o plné délce byl získaný fragment DNA separován v gelu agarózy a použit jako vzorek podrobený hybridizaci za přísných podmínek. K získání CDNA o plné délce byla cDNA knihovna dvakrát přezkoumána touto sondou použitím stejné výše popsané metody, stou výjimkou, že hybridizace byla za přísných podmínek, při 65 °C. Tyto experimenty končily v identifikaci a izolování 45 pozitivních plaků, které byly na začátku zkoumány PCR analýzou použitím SYM 1600 nebo SYM 1601 v kombinaci se SYM 3208 jako PCR primerů pro identifikaci plaku obsahujícího vstupní 5'-otevřený čtecí rámec.

Po dalším zkoumání a sekvenční analýze byly získané PCR zesílené fragmenty odvozené od těchto fágů klonovány způsobem popsaným podrobně v Příkladu 6 a výsledky ukázaly, že jeden z fágů, 205.2.1, obsahoval plnou délku inzertu. Byla stanovena kompletní nukleotidová sekvence cDNA fragmentu. Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 1) obsahovala otevřený čtecí rámec vhodný k zakódování celé sekvence aminokyseliny SCCE proteinového prekurzoru sestávajícího z 253 aminokyselin včetně signálního peptidů a prepolypeptidu (SEQ ID NO:2).

Příklad 7 popisuje detekci dvou SCCE mRNA-druhů v lidské epidermis, které jsou schopné hybridizace s DNA vzorky připravenými na bázi SCCE cDNA sekvence.

Příklad 8 popisuje expresi rekombinantního SCCE v E.coli. Výsledky ukazují, že je možné produkovat rekombinantní SCCE v bakterii.

Příklad 9 popisuje expresi rekombinantního lidského SCCE v buňkách savců. Jsou produkovány tři proteiny, které ukazují reakci se všemi schopnými polyklonálními SCCE protilátkami králíka a kuřete, stejně jako s uloženými monoklonálními protilátkami. Rekombinantní proteiny, které jsou reaktivní s protilátkami působícími proti nativní SCCE, vykazují zřejmou molekulovou hmotnost asi o 1 kDa vyšší, než čištěný nativní lidský SCCE. Rekombinantní protein nevykazuje žádnou proteolytickou aktivitu.

Čištění, aktivace, a další charakterizace rekombinantního SCCE jsou popsány v Příkladu 10. Inaktivní pro-formy rekombinantního SCCE mohou být aktivovány proteolytickým štěpením trypsinem nebo endopeptidázou Lys-C. Uvažuje se, mnoho z dalších proteáz, které štěpí peptidy po základní aminokyselinu, jako je endoproteináza Lys-C, papain a plasmin, bude schopno aktivovat pro SCCE na aktivní SCCE. Bylo zjištěno, že signální peptid sestává z 22 aminokyselin a založen na N-terminální sekvenci aminokyseliny nativního aktivního SCCE, sestává propeptid ze sedmi aminokyselin. Dále se ukazuje, že připravený rekombinantní SCCE existuje ve dvou N-glykosylovaných formách a jedné neglykosylované formě, která je analogická s výsledky získanými s aktivním nativním SCCE.

-6CZ 289600 B6

Termínem „chymotryptický enzym stratům comeum (SCCE)“, nebo „polypeptid s SCCE aktivitou“ je míněna, ze širšího hlediska, serinový proteáza nebo její proforma, jako je proenzym (proSCCE) nebo spojení proteinu, který může být aktivován proteolytickým štěpením, přičemž řečený enzym ve své aktivní formě je inhibován stejnými inhibitory a za podobných podmínek, jako spontánní buněčná disociace, která může být vyvolána v modelových systémech se vzorky zrohovatělé vrstvy kůže, inkubované při neutrálním nebo téměř neutrálním pH při fyziologické teplotě.

Ještě přesněji, termín „polypeptid s SCCE aktivitou“ takto definuje polypeptid, který je odlišný od chymotrypsinu a cathepsinu G, a který je ve své aktivní formě schopný rozložit substrát MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2568), rozklad polypeptidu je inhibován aprotininem, chymostatinem a síranem zinečnatým, jak je popsáno v příkladu 3 a 13 a znázorněno na Obr. 9 a v Tabulce 5.

Dokonce ještě přesněji, termín „polypeptid s SCCE aktivitou „zahrnuje polypeptid, který je schopný způsobit proteolytickou degradaci desmosomálního proteinu desmogleinu I v průběhu in vitro inkubace plantar stratům comeum.

Takový polypeptid bude také obecně reagovat s protilátkami vyvolanými proti nativnímu SCCE, který je čištěný z extraktu disociovaných buněk plantámího stratům comeum. Příklady takových protilátek jsou polyklonální protilátky produkované jak je popsáno v 5.2, a monoklonální protilátky produkované jak je popsáno v 5.2, a monoklonální protilátky TE4b a TE9b, připravené jak je popsáno v Příkladu 5.1. Monoklonální protilátky jsou produkovány hybridomy TE4b a TE9b uloženými v Evropské Sbírce živočišných buněčných kultur, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie, pod vstupním číslem ECACC 93061817 aECACC 93061816, podle ustanovení Budapešťské smlouvy.

Klonování a sekvenování cDNA kódující lidský SCCE je popsáno v Příkladu 6. Byla nalezena nukleotidová sekvence obsahující otevřený čtecí rámec vhodný k zakódování celé aminokyselinové sekvence SCCE prekurzorového proteinu sestávajícího z 253 aminokyselin včetně signálního peptidů a prepolypeptidu. Nukleotidová sekvence je ukázána vSEQID NO:1 a odvozená sekvence aminokyseliny „stratům comeum chymotryptického enzymu (SCCE)“ je uvedena v SEQ IDNO:2.

Termínem „pro-SCCE nebo jeho analog nebo jeho varianta“ je míněn polypeptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ IDNO:2 nebo analog nebo varianta řečené sekvence, která je produkována, když je nukleotidová sekvence vynálezu exprimována ve vhodném expresivním systému, a která během proteolytické aktivace zvyšuje serinovou proteinázu, jež může být inhibována stejnými inhibitory jako spontánní buněčná disociace, která může být vyvolána v modelových systémech se vzorky zrohovatělé vrstvy kůže, inkubované při neutrálním nebo téměř neutrálním pH při fyziologické teplotě, tj. kolem 37 °C. Obecně, protein bude reagovat s protilátkami vyvolanými proti čištěnému nativnímu nebo rekombinantnímu SCCE.

Termínem “SCCE nebo jeho analog nebo jeho varianta“ je míněn polypeptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2 nebo analog nebo varianta řečené sekvence, která je produkována, když je nukleotidová sekvence vynálezu vyjádřena ve vhodném expresivním systému, a který je serinovou proteinázou, jež může být inhibována stejnými inhibitory jako spontánní buněčná disociace, která může být vyvolána v modelových systémech se vzorky zrohovatělé vrstvy kůže, inkubované při neutrálním nebo téměř neutrálním pH při fyziologické teplotě, tj. kolem 37 °C. Obecně, protein bude reagovat s protilátkami vyvolanými proti čištěnému nativnímu nebo rekombinantnímu SCCE.

Termínem „analog nebo jeho varianty“ je míněn polypeptid, který nemá přesnou sekvenci aminokyselin, uvedenou v SEQ ID NO:2, ale má ještě „SCCE aktivitu“ definovanou výše. Obecně, takovými polypeptidy mohou být polypeptidy, které se liší např. v určitém rozsahu,

-7CZ 289600 B6 složení aminokyselin, nebo v post-translačních modifikacích, např. glykosylaci nebo fosforylaci, jak je porovnáno s proteinem SCCE, popsaným v příkladech.

Zde používaný termín „analog nebo „varianta“ v uvedeném kontextu značí protein nebo polypeptid podobného složení aminokyselin nebo sekvence, jako je charakteristická sekvence aminokyselin SEQ ID NO:2 odvozená od SCCE proteinu, jak je popsáno v Příkladu 6, který je pro druhořadé variace, které mění aminokyselinové sekvence, jako jsou delece, místně cílené mutace, inzerce zvláštních aminokyselin, nebo jejich kombinace, k vytvoření SCCE proteinových analogů. Tyto modifikace mohou poskytovat zajímavé a užitečné nové vlastnosti analogu. Analogy polypeptidů nebo proteinů mohou pocházet od lidí nebo zvířat nebo mohou být částečně nebo zcela syntetického původu. Analog také může být také odvozen použitím technik rekombinantní DNA.

Výhodné provedení podle předloženého vynálezu tak popisuje polypeptid, ve které je nejméně jeden zbytek aminokyseliny substituován odlišným zbytkem aminokyseliny a/nebo ve kterém je nejméně jeden zbytek aminokyseliny odstraněn nebo přidán, tak, aby byl získaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci odlišný od sekvence aminokyseliny v SEQ ID NO:2 nebo subsekvence, jak je dále definována, ale v podstatě s SCCE aktivitou definovanou výše.

Zajímavé provedení vynálezu se týká polypeptidů, který je analogem nebo subsekvencí polypeptidu podle vynálezu, a skládá se z 50 až 250 aminokyselin, např. nejméně 70 aminokyselin, nejméně 100 aminokyselin, nejméně 150 aminokyselin nebo nejméně 200 aminokyselin.

Zvláště důležitými provedeními podle vynálezu jsou polypeptid s aminokyselinovou sekvencí -7-224 v SEQ ID NO:2 (pro-SCCE) a polypeptid s aminokyselinovou sekvencí 1-224 v SEQ IDNO:2 (SCCE).

Termín „enzymaticky aktivní subsekvence“ označuje sekvenci polypeptidů, která obsahuje pouze část polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2, a která má enzymatickou aktivitu. Zahrnuty jsou také polypeptidické subsekvence, které byly analogovány zde vysvětlenými modifikacemi. Za zvláště zajímavý je považován specifický polypeptid (nebo polypeptidy), který obsahuje enzymaticky aktivní místo.

Předpokládaná sekvence aminokyseliny SEQ ID NO:2 byla porovnána s aminokyselinovými sekvencemi enzymů lidského chymotrypsinu (Touha a kol., 1989), lidského catepsinu G (Salvesen a kol., 1987) a lidských žímých buněk chymázy (Caughey a kol., 1991). Ačkoliv odvozená aminokyselinová sekvence obsahuje udržované aktivní oblasti proteáz šeřinu, stupeň homologu je poměrně nízký, asi 33 - 38 %. Z tohoto pohledu se zdá, že SCCE pouze moderoval podobnost s dříve známými serinovými proteinázami. Na druhou stranu, SCCE je typickou serinovou proteinázou vzhledem khistidinu, aspartátu, a serinovým zbytkům aktivního místa, a udržuje v těchto místech oblasti uzavřené. Stejné je to pro většinu z cysteinových reziduí a ostatní vysoce uzavřené části serinových proteináz. Na základě primární specificity pouzdra (zbytek 189 v chymotrypsinu) je serinový zbytek v lidském chymotrypsinu, žímých buňkách chymázy, a specifický antigen prostaty a zbytek alaninu v lidském catepsinu G. V SCCE je, na druhou stranu, tato pozice obsazena asparaginovým zbytkem. Tím lze vysvětlit zjištění, že ačkoliv má SCCE nepochybně chymotryptickou aktivitu, jeho relativní aktivita k různým chromogenním peptidovým substrátům se liší od chymotrypsinu a cathepsinu G, což způsobuje účinnost inhibitoru chymostatinu, nízkomolekulámího inhibitoru enzymů podobných chymotrypsinu.

Srovnání mezi sekvencemi lidského chymotrypsinu, lidského catepsinu G a chymázy lidských žímých buněk a SCCE je uvedeno v následujícím srovnání sekvencí.

-8CZ 289600 B6

SCCE HUMCTRP HUMCHTG HUMCHYM	IIDGAPCARGSHPWOVALLSGNOLHH...CGGVLVNERWVLTAAHCKMN ÍVNGEDAVPGSWPWOVSLODKTGFHF...CGGSLISEDWVVTAAHCGVR ÍIGGRESRPHSRPYMAYLOIOSPAGOS.RCGGFLVREDFVLTAAHCWGS ÍIGGTECKPHSRPYMAYLEIVTSNGPSKFCGGFLIRRNFVLTAAHCAGR • · 20 50
SCCE HUMCTRP HUMCHTG HUMCHYM	EYTV..HLGSDTLGDRRA...QRIKASKSFR.HPGYSTQTHVNDLMLVKLN TSDVWAGEFDQGSDEENI.QVLKIAKVFK.NPKFSILTVNNDITLLKLA NINV..TLGAHNIQRRENT.QQHITARRAIRHPQYNQRTIQNDIMLLQLS SITV..TLGAHNITEEEDTWQKLEVIKQF.RHPKYNTSTLHHDIMLLKLK •

SCCE SQARLSSMVKK.VRLPSRC..E..PPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMC

HUMCTRP TPARFSQTVSAVCLPSADDDF..PAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQ HUMCHTG RRVRRNRNVNPVALPRAQ..EGLRPGTLCTVAGWGRVSMRRGTDTLREVQ HUMCHYM EKASLTLAVGT..LPFPSQFNFVPPGRMCRVAGWGRTGVLKPGSDTLQEV

110

140

SCCE

HUMCTRP HUMCHTG HUMCHYM

SCCE HUMCTRP HUMCHTG HUMCHYM

VDVKLISPQDCTEVYKDLLENSMLCAGIPDSKKNA.CNGDSGGPLVCRGT AALPLLSNAECKKSWGRRITDVMICAGA—GVSS.CMGDSGGPLVCOKD LRVORDRO..CLRIFGSYDPRROICVGDRRERKAAFK.GDSGGPLLCNNV KLRLMDPOA.CSHFRDFDHNL.OLCVGNPRKTKSAFK.GDSGGPLLCAGV

Ť .

170

200

LQ....GLVSWGTFPCGQ.PNDPGVYTQVCKFTKWINDTMKKHR

GAWTLVGIVSWGSDTCST.SS.PGVYARVTKLIPWVQKILAAN

AH....GIVSYGKSSGVP....PEVFTRVSSFLPWIRTTMRSFKLLDQMETPL

AO....GIVSYGRSDAKP....PAVFTRISHYRPWINOILOAN

230

Řazení se provádí ručně.

HUMCTRP = lidský chymotrypsin (Touita a kol., BBRC 158:569-575, 1989)

HUMCHTG = lidský catepsin G (Salvesen a kol., Biochemistiy 26:2289-2293,1987)

HUMCHYN = chymáza lidských žímých buněk (Caughey a kol., J. Biol. Chem. 266:12956 -12963,1991)

Homology:

HUMCTRP/SCCE HUMCHTG/SCCE HUMCHYM/SCCE : 85/224 = 38 % : 74/224 = 33 % : 74/224 = 33 %

HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48 %

-9CZ 289600 B6

Počítání se týká chymotrypsinu

Podtržené:

Udržované oblasti blízko aktivních míst (lle 15, His 57, Asp 102, Ser 195 v chymotrypsinu) a přimámí specificity váčku chymotrypsinu (Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226 v chymotrypsinu).

Hvězdička: Možné místo N-glykosylace v SCCE

Důležité provedení vynálezu tak popisuje polypeptid se sekvencí aminokyselin, z nichž po sobě jdoucí řada 20 aminokyselin je homologní se stupněm nejméně 80 % řady aminokyselin stejné délky aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2.

Polypeptidové sekvence podle vynálezu, které mají homologii z nejméně 80 %, jako je nejméně 85 %, např. 90 %, s polypeptidy uvedenými v SEQ ID NO:2 tvoří důležitá provedení. Jelikož sekvence uvedená v SEQ ID NO:2 se zdá být zcela jedinečná, rozsah vynálezu zahrnuje polypeptidy, v nichž stupeň homologie s podobnou řadou po sobě jdoucích aminokyselin vybraných z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 nesmí být více než 55 %, ačkoliv přednostně ne více než 70 %. Tyto sekvence mohou být odvozeny z podobných proteinů jiných druhů, např. jiných savců, jako myš, krysa, králík, guinejské prase, prase nebo kráva. Jelikož menší části sekvence mohou vykazovat význačnou shodu s jinými serinovými proteázami, rozsah vynálezu také zahrnuje peptidy se stupněm homologie s podobným po sobě jdoucím řetězcem 20 aminokyselin, vybraných ze sekvence aminokyselin uvedené SEQ ID NO:2.

Termínem „sekvenční homologie“ se míní identita v sekvenci aminokyselin v segmentech dvou nebo více aminokyselin souhlasně s ohledem na identitu a pozici aminokyselin polypeptidů.

Termín „homologní“ se zde používá pro ilustraci stupně identity mezi aminokyselinovou sekvencí daného polypeptidů a aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:2. Aminokyselinová sekvence, která se porovnává s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:2 může být odvozena z nukleotidové sekvence, jako je DNA nebo RNA sekvence, např. získané dále definovanou hybridizaci, nebo může být získána běžnými způsoby sekvencování aminokyselin. Stupeň homologie je přednostně určen v aminokyselinové sekvenci zralého polypeptidů, např. bez vzetí v úvahu vedoucí sekvence. Obecně, při porovnávání nukleotidových sekvencí z důvodu determinace jejich vnitřní homologie se používají pouze kódující oblasti.

V daném kontextu se předpokládá, že termín „polypeptid, který je poznán nejméně jednou z uložených protilátek“ zahrnuje sekvenci aminokyseliny, která obsahuje aminokyseliny tvořící podstatně konsekutivní napětí v termínech lineární nebo prostorové konformace jakékoliv subsekvence polypeptidů uvedeného v SEQ ID NO:2, která je zjištěna nejméně jednou z uložených protilátek. Jak je dobře známo z dosavadního stavu techniky, také sekundární nebo terciární konformace mohou mít zajímavé a užitečné vlastnosti a mohou tvořit epitopy. Zdá se, že uložené protilátky TE4b a TE9b rozpoznají konformační epitopy SCCE.

Bylo uvedeno, že polyklonální protilátka králíka připravená podle Příkladu 5.2.2. tvoří v imunofluorescenčním mikroskopu granulámí zbarvení zrnité vrstvy stratům granulosum a spíše neohraničené zbarvení dolní stratům comeum.

Protilátky vyvolané proti purifikovanému nativnímu nebo rekombinantnímu SCCE se obecně pojí na suprabazální buňky v keratinizovaném (zrohovatělém) lidském dlaždicovém epitelu, ale ne na epitelové buňky v nezrohovatělém dlaždicovém epitelu. Tyto protilátky se také pojí do intracelulámího prostoru zrohovatělé vrstvy lidské kůže.

Protilátky reagující s polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné pro řadu následně uvedených použití:

-10CZ 289600 B6

Pro purifikaci proteinů: Protilátky mohou být použity pro čištění polypeptidu (ů) nebo jeho analogů z biologických vzorků, použitím afinitní chromatografie nebo imunoprecipitačními způsoby.

Pro diagnózy a terapii: Monoklonální protilátky proti polypeptidu (ům) nebo jeho analogům mohou být použity při diagnostice nebo léčení nemocí u zvířat a lidí. Diagnostickým činidlem může být protilátka se specifícitou na polypeptidy podle vynálezu. Protilátka může být spojena s jiným proteinem nebo pevným nosičem a/nebo může být použita v aglutinačních testech nebo testech pro stanovení barvy. Tyto protilátky mohou také být použity ke kvantitativnímu vyjádření SCCE polypeptidů nebo jejich analogů v biologických vzorcích za použití standardní technik histochemie a imunochemie.

V jednom ze svých aspektů popisuje vynález nukleotidovou sekvenci kódující výše definovaný polypeptid podle vynálezu. Zejména se vynález týká nukleotidové sekvence podstatně obsahující sekvence uvedené v SEQ ID NO:1. Jiná důležitá provedení se týkají nukleotidové sekvence kódující polypeptid se subsekvencí aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:2, jako je nukleotidová sekvence, která kóduje polypeptid obsahující sekvence aminokyselin -7-224 ze SEQ ID NO:2 nebo polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyseliny 1-224 ze SEQ ID NO:2.

Předložený vynález se také týká nukleotidové sekvence, která hybriduje s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1 za vysoce přísných podmínek, jak je popsáno v Příkladech 7 a Příkladu 9.

Podle dalšího aspektu popisuje vynález nukleotidovou sekvenci s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1 nebo jeho analog nebo jejich subsekvencí, která

1) má homologii se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1 z nejméně 90 %, a/nebo

2) kóduje polypeptid, sekvenci aminokyseliny, ze které je nejméně 80 % homologních s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:2, a/nebo

3) kóduje polypeptid, který je spojen monoklonální protilátkou produkovanou buněčnou linií hybridomu TE4b, který byl umístěn 18. června 1993 vECACC a obdržel prozatímní depozitní číslo ECACC 93061817, nebo monoklonální protilátkou produkovanou buněčnou linií hybridomu TE9b, který byl umístěn 18. červena 1993 v ECACC a získal prozatímní depozitní číslo 93061816, a/nebo

4) kóduje polypeptid, který je spojen polyklonálním antisérem vyvolaným proti nativnímu SCCE, který byl purifikován z extraktu disociovaných plantámích buněk stratům comeum.

V rozsahu předloženého vynálezu je také modifikovaná nukleotidová sekvence, která se liší od výše definované nukleotidové sekvence, ve které byl nejméně jeden nukleotid odstraněn, substituován nebo modifikován, nebo byl nejméně jeden přídavný nukleotid vložen tak, aby se získala nukleotidová sekvence, která kóduje polypeptid se SCCE aktivitou.

V předloženém popisu a nárocích znamená termín „subsekvence“ sekvenci, která má přednostně velikost nejméně 15 nukleotidů, ještě výhodněji nejméně 18 nukleotidů, nejvýhodněji nejméně 21 nukleotidů. Ve výčtu provedení podle vynálezu obsahuje subsekvence nebo analog nukleotidové sekvence ve vynálezu nejméně 48 nukleotidů, jako je nejméně 75 nukleotidů nebo nejméně 99 nukleotidů. „Subsekvence“ se řídí nejméně jedním z výše uvedených kritérií 1) až 4) nebo se může hybridizovat nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1.

Je velice dobře známo, že malé fragmenty jsou vhodné pro zde popsané techniky PCR. Tyto fragmenty jsou vhodné pro zde popsané techniky PCR. Tyto fragmenty a subsekvence mohou být

-11 CZ 289600 B6 použity, kromě jiných použití, jako sondy při identifikaci mRNA fragmentů nukleotidové sekvence podle vynálezu, jak je uvedeno v Příkladu 7.

Termín „analog“ s ohledem na DNA fragmenty podle vynálezu je zamýšlený k indikování nukleotidové sekvence, která kóduje identický polypeptid, nebo v podstatě identický, s polypeptidem kódovaným DNA fragmentem podle vynálezu. Je velmi dobře známo, že stejná aminokyselina může být kódována různými kodony, použití kodonu se vztahuje, inter alia, k preferenci organismu v otázce týkající se nukleotidové sekvence. Takto tedy může být jeden nebo více nukleotidů nebo kodonů DNA fragmentu podle vynálezu vyměněn jinými, které, pokud jsou vyjádřeny, poskytují polypeptid identický nebo v podstatě identický s polypeptidem kódovaným DNA fragmentem v dané otázce.

Termín „analog“ je také v předloženém kontextu užíván při označení DNA fragmentu, nebo DNA sekvence podobné nukleotidové kompozice nebo sekvence, jako charakteristické DNA sekvence SEQ ID NO:1 kódující aminokyselinovou sekvenci tvořící SCCE polypeptidy, dejme tomu pro menšinové variace, které nemají významný nepříznivý účinek na enzymatickou aktivitu analogu ve srovnání s aktivitou nativního SCCE proteinu, jak je popsáno v Příkladu 3. Termín „významný nepříznivý účinek“ znamená, že enzymatická aktivita analogu by měla být nejméně 50%, výhodněji nejméně 60 %, nejvýhodněji nejméně 70%, jako je nejméně 75% enzymatické aktivity nativního SCCE, přičemž je vymezen např. jako v Příkladu 3. Analogické DNA fragmenty nebo DNA sekvence mohou být odvozeny z organismů, zvířat nebo lidí, nebo mohou být částečně nebo zcela syntetického původu. Analog může také být odvozen použitím rekombinantních DNA technik.

Dále, termíny „analog“ a „subsekvence“ jsou uvažovány pro variace sekvencí, jako je substituce, inzerce (včetně intronů), adice a přeskupení jednoho nebo více nukleotidů, přičemž variace nemájí podstatný nepříznivý vliv na polypeptid kódovaný DNA fragmentem nebo její subsekvenci.

Termín „substituce“ je uvažována, že znamená nahrazení jednoho nebo více nukleotidů v úplné nukleotidové sekvenci jedním nebo více odlišnými nukleotidy, „adice“ se rozumí, že znamená adici jednoho nebo více nukleotidů na každém konci úplné nukleotidové sekvence, „inzerce“ se uvažuje, že znamená vnesení jednoho nebo více nukleotidů s úplnou nukleotidovou sekvencí, „delece“ se uvažuje, že označuje, že jeden nebo více nukleotidů byly vypuštěny z úplné nukleotidové sekvence buď na každém konci sekvence, nebo na kterémkoliv vhodném místě uvnitř, a „přeskupení“ znamená, že dva nebo více nukleotidových zbytků byly zaměněny s DNA nebo resp. polypeptidovou sekvencí. DNA fragment však může také být modifikován mutagenezí buď před, nebo po vložení do organismu.

Termíny „fragment“, “sekvence“, „subsekvence“, a „analog“ se používají v předloženém popise a nárocích s ohledem na fragmenty, sekvence, subsekvence a analogy podle vynálezu, a samozřejmě se rozumí, že neobsahují tyto fenomény v jejich přírodním prostředí, ale spíše např. v izolované, purifikované, in vitro nebo rekombinantní formě.

V jednom z provedení podle vynálezu může být detekce a/nebo stanovení množství SCCE polypeptidu mRNA stanovena extrahováním RNA z buněk nebo tkání a její přeměnou na cDNA pro následné použití v polymerázové řetězové reakci (PCR).

PCR primer/y může být syntetizován na základě fragmentu DNA podle vynálezu jako je DNA fragment uvedený v SEQ ID NO:1. Tento způsob důkazu a kvantitativního stanovení může být použit při diagnostikování chorobných stavů, ve kterých je SCCE mRNA vyjádřena ve vyšším nebo nižším množství než normálně.

V rozsahu předloženého vynálezu je rovněž diagnostické činidlo obsahující nukleotidovou sondu, která je schopná detekovat nukleotidovou sekvenci podle vynálezu, stejně jako způsob určení diagnózy nemocí, ve kterých je exprese SCCE deregulována a/nebo nemocí, kde je gen SCCE

-12CZ 289600 B6 mutován, a zahrnuje podrobení vzorku od pacienta, u něhož se předpokládá, a nebo má, nemoc, při níž je přítomno vyšší množství SCCE než normálně neboje přítomna mutovaná forma SCCE, PCR analýzám, kdy je vzorek uveden do kontaktu s výše popsaným diagnostickým činidlem, ponechání nukleotidové sekvence zvětšit se a stanovení přítomnosti identických nebo homologních nukleotidových sekvencí ve vzorku.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být připraveny použitím rekombinantní DNA technologie. Důležité provedení předloženého vynálezu se týká exprese systému obsahujícího nukleotidovou sekvenci podle vynálezu.

Organismus, který je použit pro produkci polypeptidu podle vynálezu, může být vyšší organismu, např. zvíře, nebo nižší organismus, např. mikroorganismus jako je E.coli. Bez ohledu na typ použitého organismu je fragment DNA podle vynálezu zaveden do organismu buď přímo, nebo způsobem vhodného vektoru. Alternativně mohou být polypeptidy produkovány v buněčné linie savců zavedením fragmentu DNA nebo analogu nebo její subsekvence podle vynálezu buď přímo, nebo prostřednictvím expresivního vektoru.

Fragment DNA nebo její analog nebo subsekvence mohou být také klonovány vhodný stabilním expresivním vektorem a potom vloženy do vhodné buněčné linie. Buňky produkující požadované polypeptidy jsou poté rozděleny na základě hladin produktivity za podmínek vhodných pro použitý vektor a buněčnou linii. Vybrané buňky dále rostou a tvoří velmi důležitý a nepřetržitý zdroj požadovaných polypeptidů.

Příkladem specifického analogu sekvence DNA podle vynálezu je sekvence DNA, která obsahuje sekvenci DNA uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo její část, a která je zejména adaptovaná pro expresi v E.coli. Tato DNA sekvence je jedna, která, pokud je vložena do E. coli spolu s vhodným sekvenčním regulátorem, končí v expresi polypeptidu, majícího v podstatě aminokyselinovou sekvenci uvedenou vSEQIDNO:2 nebo její část. Takto tato DNA sekvence obsahuje specifické kodony rozeznatelné E.coli. Příklad tohoto provedení je popsán v Příkladu 8.

V daném kontextu je termín „gen“ používán k indikaci DNA sekvence, která je obsažena v produkovaném polypeptidovém řetězci, a která zahrnuje oblasti, které předcházejí a následují kódující oblasti (5'-sekvence proti směru a 3'-sekvence po směru exprese genu), stejně jako zasahující sekvence, introny, které jsou umístěny mezi individuální kódující segmenty, exony, nebo v oblasti 5'-proti směru nebo 3'-po směru exprese genu. Oblast 5'-proti směru exprese genu zahrnuje regulační oblast, která kontroluje expresi genu, typicky promotoru. Oblast 3'-po směru exprese genu zahrnuje oblasti, které jsou zapojeny do terminace transkripce genu, a výhodně sekvence zodpovědné za polyadenylaci transkriptu a 3'-nepřenesené oblasti.

Spolu s výše uvedeným se vynález týká systému exprese obsahujícího výše popsané nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle vynálezu, systém zahrnující 5'-lemovací sekvenci schopnou zprostředkovat expresi řečené nukleotidové sekvence.

Vynález se zejména týká replikace schopného vektoru exprese, který nese a je schopný zprostředkovat expresi nukleotidové sekvence podle vynálezu. Zvláštní provedení vynálezu se týká replikovatelného vektoru exprese označeného pS507, který byl uložen 11. května 1993 ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmbH (DSM) pod přístupovým číslem DSM 8282 podle podmínek Budapešťské smlouvy, vektorů exprese vyjadřujících nukleotidové sekvence odlišné od nukleotidové sekvence uvedeného uloženého expresivního vektoru, ale které kódují stejný polypeptid nebo jeho analog nebo variant, který má SCCE aktivitu.

Jinými slovy, rozsah vynálezu také zahrnuje replikace schopný expresivní vektor popsaný výše, kde vyjádřená nukleotidová sekvence je jedna, která se liší od nukleotidové sekvence uloženého vektoru v tom, že nejméně jeden nukleotid byl odstraněn, substituován nebo modifikován, nebo

-13CZ 289600 B6 byl vložen nejméně jeden přídavný nukleotid tak, aby byla výsledkem nukleotidová sekvence, která kóduje polypeptid mající SCCE aktivitu.

Mimoto se vynález týká plazmidu označeného pS500, který byl uložen 11. května 1993 ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmbH (DSM) pod přístupovým číslem DSM 8281 podle podmínek Budapešťské smlouvy, a plazmidy s nukleotidovou sekvencí, která se liší od nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, ale který kóduje polypeptidy uvedené v SEQ ID NO:2 nebo jeho analog nebo variant, který má SCCE aktivitu, nebo který se hybridizuje nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo její částí za přísných podmínek hybridizace.

V rozsahu předloženého vynálezu je také ne-lidský organismus, který nese expresivní systém podle vynálezu. Organismy, které mohou být z tohoto hlediska podle vynálezu použity, zahrnují mikroorganismy, jako jsou bakterie rodu Bacillus, Escherichia nebo Salmonella, kvasinky jako jsou Saccharomyces, Pichia, protozoa, nebo buňky odvozené z mnohobuněčných organismů jako jsou houby, buňky hmyzu, rostlinné buňky, savčí buňky nebo buněčné linie. Pokud je organismem bakterie, pak je preferován rod bakterie Escherichia, např. E.coli.

Vynález se dále týká plazmidového vektoru obsahujícího sekvenci DNA kódující polypeptid podle vynálezu nebo zde definovanou fůzi polypeptidu. Ve zvláště důležitém provedení může být fragment nebo analog nebo subsekvence podle vynálezu nebo fragment fuze DNA podle vynálezu, jak je zde definován, nesen replikovatelným expresivním vektorem, který je způsobilý k replikování v organismu hostitele nebo buněčné linii.

Vektorem může být zejména plazmid, fág, kosmid, mini-chromozóm nebo virus. V zajímavém provedení podle vynálezu může být vektorem takový vektor, který, pokud je zaveden do buňky hostitele, je integrován do buněčného genomu hostitele.

Pokud je použito vyšších organismů, pak mohou být použity pro produkci polypeptidů transgenní techniky. Příklady vhodných zvířat jsou ovce, hovězí dobytek, prasata atd. DNA fragment kódující polypeptid podle vynálezu je exprimován v požadované tkáni pod kontrolou tkáňových specifických regulačních prvků. Získaný protein potom může být podroben post-translačním modifikacím, aby se získal polypeptid podle vynálezu.

Transgenní savci, ale ne lidé, jsou ve vynálezu připraveni zavedením „transgenu“ do embiyonální terčovité buňky zvoleného zvířete. Z jednoho hlediska podle vynálezu je transgenem DNA sekvence, která je schopná produkovat požadovaný fenotyp až je obsažen v genomu buněk transgenních ne-lidských savců. Ve specifických provedeních obsahuje transgen DNA sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, transgen je schopný být exprimován k produkci polypeptidu.

Zavedení systému exprese do zárodečné linie savce může být provedeno použitím jakékoliv vhodné techniky, např. jak je popsáno Hoganem a kol., 1986, nebo ve WO 93/04172.

V jednom zvláštním aspektu vynálezu může nukleotidové sekvence podle vynálezu obsahovat jinou nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, odlišnou od, nebo identickou s polypeptidem podle vynálezu, fúzovanou v rámci na nukleotidovou sekvenci sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 nebo její analog kódující SCCE polypeptid s úmyslem produkovat fúzovaný polypeptid, přičemž polypeptid představuje ještě další zajímavý aspekt vynálezu, viz např. Příklad 8. Při použití technologie rekombinantní DNA mohou být fúzované sekvence DNA vloženy do vhodného vektoru nebo genomu. Alternativně, jedna z nukleotidových sekvencí je vložena do vektoru nebo genomu již obsahujícího jinou nukleotidovou sekvenci. Fúze polypeptidu může také být provedena vložením dvou nukleotidových sekvencí jednotlivě, a ponecháním proběhnutí exprese. Organismus hostitele, který může být eukaryotického nebo prokaryotického původu, je kultivován za podmínek zajišťujících expresi fúzovaných sekvencí. Fúzovaný polypeptid je potom purifikován a polypeptid podle vynálezu oddělen vhodným způsobem od svého partnera ve fúzi.

-14CZ 289600 B6

Jeden aspekt vynálezu se tedy týká způsobu přípravy polypeptidu podle vynálezu, zahrnujícího následující kroky:

(a) vložení nukleotidové sekvence podle vynálezu do vektoru exprese, (b) transformaci organismu vhodného hostitele vektorem připraveným v kroku (a), (c) kultivaci hostitelského organismu připraveného v kroku (b) za podmínek vhodných pro expresi polypeptidu, (d) odběr polypeptidu, a (e) popřípadě podrobení polypeptidu post-translační modifikaci.

V rozsahu předloženého vynálezu je také výše popsaný způsob, kdy je připravený polypeptid izolován způsobem obsahujícím jeden nebo více kroků, jako je afinitní chromatografie používající imobilizovaný nativní nebo rekombinantní SCCE polypeptid nebo protilátku reagující s řečeným polypeptidem a/nebo jiné chromatografícké nebo elektroforetické postupy.

Polypeptid připravený výše popsaným způsobem může být podroben post-translačním modifikacím tepelnému zpracování, chemickému zpracování (formaldehydem, glutaraldehydem atd.) nebo enzymatickému zpracování (peptidázami, proteinázami a enzymy modifikujícími protein). Polypeptid produkovaný v organismu může být zpracováván odlišným způsobem ve srovnání s jeho přirozeným produkčním prostředím. Jako příklad lze uvést glykosylaci, která se často provádí, pokud je polypeptid vyjádřen buňkou vyššího organismu, jako jsou kvasinky nebo přednostně savci. Glykosylace se běžně objevuje ve spojení se zbytky aminokyselin, Asn, Ser, Thr nebo hydroxylyzinem. Je otázkou, zda může nebo nemusí být výhodné odstranit nebo pozměnit procesní charakteristiky vyvolané hostitelským organismem.

Následně po expresi polypeptidu podle vynálezu v organismu nebo buněčné linii může být polypeptid buď použit jako takový, nebo může být nejprve purifikován z organismu nebo buněčné linie. Pokud je polypeptid vyjádřen jako vyloučený produkt, může být purifikován přímo. Pokud je polypeptid vyjádřen jako asociovaný produkt, může vyžadovat před purifikací částečné nebo úplné roztržení hostitele. Příklady postupů používaných pro purifikací polypeptidů jsou:(i) imunoprecipitace nebo afinitní chromatografie s protilátkami, (ii) afinitní chromatografie s vhodným ligandem, (iii) jiné chromatografícké postupy jako je gelová filtrace, výměna iontů, nebo vysoce účinná kapalinová chromatografie nebo z nich odvozené postupy, (iv) elektroforetické postupy jako jsou polyakrylamidová gelová elektroforéza, denaturační polyakrylamidová gelová elektroforéza, agarózová gelová elektroforéza a isoelektrické zaostřování, (v) další specifické solubilizační a/nebo purifikační postupy.

Předložený vynález se také týká v podstatě čistých SCCE polypeptidů. V uvedeném kontextu se termínem „v podstatě čistý“ rozumí, že polypeptid je podstatně volný od dalších komponent, např. jiných polypeptidů nebo uhlohydrátů, které mohou vyplývat z přípravy a/nebo regenerace polypeptidu nebo jiným způsobem mohou být nalezeny spolu s polypeptidem. Čistota proteinu může být stanovena SDL gelovou elektroforézou provedenou, jak je popsáno v Příkladu 3.

Polypeptidy mohou být čištěny, jak je uvedeno v Příkladu 4. SBTI afinitní chromatografií nebo afinitní chromatografií na imobilizované protilátce, jako je protilátka TE4b, způsoby známými odborníkovi ze stavu techniky. Vysoká čistota polypeptidu podle vynálezu může být prospěšná při použití polypeptidu ve farmaceutických nebo kosmetických prostředcích. Také díky své vysoké čistotě je možné použít v podstatě čisté polypeptidy v menších množstvích pro více účelů, než polypeptidy běžné nižší čistoty.

-15CZ 289600 B6

Z hlediska vynálezu mohou být čisté polypeptidy získány z vhodných buněčných linií, které vyjadřují polypeptid podle vynálezu, jak je popsáno v Příkladu 9. Polypeptidy podle vynálezu mohou být také připraveny známými způsoby syntéz kapalné nebo tuhé fáze peptidu použitím úspěšné interakce individuálních aminokyselin polypeptidové sekvence. Alternativně mohou být polypeptidy syntetizovány vázáním individuálních aminokyselin tvořících fragmenty polypeptidové sekvence, které jsou později spojeny, a tím se získá požadovaný polypeptid. Tyto postupy tak tvoří další zajímavý aspekt vynálezu.

Velmi důležitý aspekt vynálezu se týká farmaceutické kompozice, kosmetické kompozice nebo kompozice chránící pleť, skládající se zpolypeptidu s SCCE aktivitou a farmaceuticky a/nebo kosmeticky přijatelného excipientu. Prostředek může obsahovat purifikovaný nativní protein nebo rekombinantní polypeptid podle vynálezu, nebo proenzym nebo fúzní proteinovou formu polypeptidu podle vynálezu, která může být aktivována proteolytickým štěpením. Forma proenzymu polypeptidů podle vynálezu může být považována za „předléčivo“, např. sloučenina, která se během příslušného proteolytického štěpní přeměňuje na aktivní formu.

Zejména, ale ne výlučně, se předložený vynález týká kompozice vhodné pro topické použití, např. k aplikaci na pleť.

Farmaceutickými prostředky podle vynálezu vhodnými pro topická podání mohou být krémy, masti, pleťové vody, mazání, gely, roztoky, suspenze, pasty, tyčinky, spraye, šampony, mýdla, vlasové kondicionéry nebo pudry.

Topické podání může být podání na nebo blízko k částem těla poskytujících patologické změny, např. na vnější část těla, jako je povrch těla. Aplikace má být jednoduchým rozetřením kompozice, nebo může zahrnovat zařízení vhodné pro zvýšení kontaktu mezi prostředkem a patologickým poškozením, jako je použití uzavřených obvazů, např. uzavřené náplasti opatřené prostředkem podle vynálezu. Prostředky mohou být impregnovány nebo rozděleny na vložky, náplasti, proužky, gázy, savé materiály, bavlněné vlněné díly, atd. Výhodně může být použita injekční forma kompozice na nebo blízko k poranění.

Topické prostředky podle předloženého vynálezu mohou obsahovat 1 - 80 % hmotnostních účinné látky, vztaženo na celkovou hmotnost přípravku, jako je 0,001-25 % hmotn./hmotn. účinné látky, např., 0,1-10%, 0,5-5%, nebo 2-5%. Do prostředku může být zapojena více než jedna účinná sloučenina, např. kompozice zahrnující SCCE, pro-SCCE nebo SCCE inhibitor v kombinaci s jinými farmaceutickými a/nebo kosmetickými sloučeninami jsou také v rozsahu vynálezu.

Prostředky jsou běžně aplikovány 1-10 krát denně v závislosti na typu, množství a lokalizaci poškozeních.

Pro topické použití může být prostředek tvořen běžnými farmaceutickými postupy s farmaceutickými excipienty běžně používanými pro topické aplikace. Povaha nosiče použitého při přípravě jednotlivých kompozicí závisí na zamýšleném způsobu podání tohoto prostředku. V prostředcích mohou být použita vehikula jiná než je voda, a mohou zahrnovat pevné i kapalné látky jako jsou změkčovadla, rozpouštědla, zvlhčovadla, zahušťovadla a pudry. Příklady každého z těchto typů přísad, které mohou být použity jednotlivě nebo jako směs jednoho nebo více vehikulí, jsou následující:

změkčovadla, jako je steaiylalkohol, monoricinoleát glycerylu, monostearát glycerylu, propan1,2—diol, butan-l,3-diol, cetylalkohol, isopropyl isostearát, kyselina stearová, isobutylpalmitát, isocetylstearát, oleylalkohol, isopropyl laurát, hexyl laurát, decyloleát, oktadekan-2-ol, isocetylalkohol, cetylpalmitát, dimethylpolysiloxan, di-n-butylsebakát, isopropylmyristát, isopropylpalmitát, isopropylstearát, butylstearát, polyethylenglykol, triethylenglykol, lanolin, ricínový olej,

-16CZ 289600 B6 acetylované alkoholy lanolínu, ropa, minerální olej, butylmyristát, kyselina isostearová, kyselina palmitová, isopropyl linoleát, lauryl laktát, myristyl laktát, decyl oleát, myristyl myristát;

rozpouštědla, jako je voda, methylenchlorid, isopropanol, ricínový olej, ethylenglykol monoethylether, diethylenglykol monoethylether, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, rostlinné a živočišné oleje, glycerol, ethanol, propanol, propylenglykol a další glykoly nebo alkoholy, vázané oleje;

zvlhčovadla nebo vlhčící činidla, jako je glycerin, sorbitol, 2-pyrrolidon-5-karboxylát sodný, rozpustný kolagen, dibutyl ftalát, želatina;

pudry, jako je křída, talek, kaolin, škrob a jeho deriváty, gumy, koloidní silikon dioxid, polyakrylát sodný, chemicky modifikovaný hlinitokřemičitan hořečnatý, hydratovaný aluminosilikát, karboxyvinylový polymer, sodná karboxymethylcelulóza, ethylenglykol monostearát;

činidla pro gelování a nadouvadla, jako je pektin, želatina a jejich deriváty, deriváty celulózy jako je methylcelulóza, karboxymethylcelulóza nebo oxidovaná celulóza, guma celulózy, guarová klovatina, arabská guma, karajská guma, tragant, bentonit, agar, algináty, karbomer, želatina, řasa měchýřnatá, ceratonia, dextran a jejich deriváty, ghatti guma, hectorit, lusk ispaghuly, xantanová guma;

polymery, jako jsou polymery nebo kopolymery kyseliny polymléčné nebo polyglykolové, parafín, polyethylen, polyethylenoxid, polyethylenglykol, polypropylenglykol, polyvinylpyrrolidon;

povrchově aktivní látky, jako jsou neiontová povrchově aktivní činidla, např. glykol a glycerolester, makrogol ethery a estery, ethery a estery cukrů, jako jsou estery sorbitanu, iontové povrchově aktivní činidla, jako jsou aminová mýdla, kovová mýdla, sulfatované alkoholy tuků, alkylether sulfáty, sulfatované oleje, a amfolytická povrchově aktivní činidla a lecitiny;

ústojná činidla, jako jsou sodné, draselné, hlinité, hořečnaté a vápenaté soli (jako chlorid, uhličitan, hydrogenuhličitan, citrát, glukonát, laktát, acetát, gluseptát nebo tartrát).

Pro topické použití může být pH kompozice v podstatě ve velmi širokém rozmezí 3-9. Ve výhodném provedení vynálezu je pH, při kterém se dosáhne vyhovující proteolytické aktivity, preferováno např. asi 4 až 8. K získání požadovaného pH mohou být použity běžné dříve popsané pufry.

Přípravky podle vynálezu mohou také obsahovat další aditiva jako jsou stabilizační činidla, ochranné látky, solubilizátory, barvicí činidla, chelatační činidla, činidla pro tvorbu gelu, masťové báze, regulátory pH, antioxidanty, vonné látky a činidla chránící pleť, atd. Pokud je kompozice ve formě šampónu nebo mýdla, může kompozice dále obsahovat pěnicí činidla, perleťová činidla a/nebo kondicionéry.

Typické ochranné/konzervační prostředky zahrnují parabeny, formaldehyd, Kathon CG, Bronidox, Bronopol, p-chlor-m-kresol, chlorhexidin, benzalkoniumchlorid, atd.

Pokud jsou prostředky podle vynálezu ve formě šamponu nebo mýdla, mohou být použity běžné přísady, a typické mýdlové a šamponové báze zahrnují takové komponenty, jako betain, lauiylsíran sodný, nonylfenol, imidazol, sulfosukcinát, výživová činidla, zvlhčovadla a kondicioneiy.

Dále může být výhodné připravovat modifikované přípravky, v nichž je účinná složka zabudována do polymemí matrice, nebo nanočástic, nebo lipozomů, nebo micel, nebo adsorbována na iontoměničové pryskyřice, nebo nesena polymerem.

Kompozice mohou být tvořeny v souladu s běžnou farmaceutickou praxí, a mohou to být:

-17CZ 289600 B6 polotuhé přípravky : gely, pasty, směsi, kapalné přípravky : roztoky, suspenze, koupele, emulze.

Jak bylo uvedeno, farmaceutická kompozice podle vynálezu může obsahovat polypeptid podle vynálezu jako takový, nebo jeho funkční deriváty, nebo kombinaci těchto sloučenin. Příklady vhodných funkčních derivátů zahrnují farmaceuticky přijatelné soli, zvláště tyto vhodné pro použití v prostředí kůže. Příklady zahrnují farmaceuticky přijatelné soli s aminofunkcí, např. soli kyselin poskytujících farmaceuticky přijatelné anionty, zvláště v prostředí kůže. Příklady zahrnují fosforečnany, sírany, dusičnany, jodidy, bromidy, chloridy, boráty, stejně jako anionty odvozené z karboxylových kyselin, zahrnujících acetáty, benzoáty, stearáty atd.

Další deriváty aminofunkce zahrnují amidy, imidy, močoviny, karbamáty atd.

Další vhodné deriváty zahrnují deriváty karboxylových skupin polypeptidů podle vynálezu, včetně solí, esterů a amidů. Příklady zahrnují soli s farmaceuticky přijatelnými kationty, např. lithia, sodíku, draslíku, hořčíku, vápníku, zinku, hliníku, železitými, železnatými, amonnými a nižší(Ci_é)-alkylamonné soli. Estery zahrnují nižší alkylestery.

Příklady prostředků v Příkladu 11 ilustrují příklady farmaceutických kosmetických prostředků a prostředků pro péči o pleť podle vynálezu, ale žádným způsobem neomezují rozsah kompozicí podle vynálezu.

Předpokládá se, že kosmetické prostředky nebo prostředky pro péči o pleť obsahující nativní nebo rekombinantní SCCE, jsou účinné proti akné, xerodermě nebo jiným hyperkeratózním stavům, jako jsou mozolnatost a keratóza pilaris. Existují rozdílné stavy akné vulgaris. Uvažuje se, že je vhodné podávat SCCE ve stupni, kdy je narušeno zrohovatění v kanálcích mazových žláz, což vede ke tvorbě komedonů a ucpání, zatímco výhodné by mohlo být podání substance, která inhibuje SCCE, ve stupních, kdy je poranění zánětlivého akné převládajícím znakem.

Jeden z aspektů vynálezu se tak týká použití polypeptidu pro léčení nebo profylaxi akné, xerodermy nebo jiných hyperkeratózních stavů, jako je mozolnatost a keratóza pilaris.

Na základě výše popsaných vědeckých nálezů se uvažuje, že farmaceutické kompozice obsahující nativní nebo rekombinantní SCCE jsou vhodné pro léčení nebo profylaxi různých ichtyózy, akné, lupenky nebo dalších zánětlivých kožních onemocnění jako jsou ekzémy s hyperkeratózou, mikrobiální infekce a hojená zranění, zejména při topické aplikaci.

Další aspekt vynálezu se týká použití polypeptidu s SCCE aktivitou pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení nebo profylaxi různých ichtyózy, akné, lupénky nebo jiných zánětlivých kožních onemocnění s hyperkeratózou jako jsou ekzémy.

Další aspekt vynálezu se týká způsobu léčení a/nebo prevence různých ichtyózy, akné, lupénky nebo jiných zánětlivých kožních onemocnění s hyperkeratózou jako jsou ekzémy, způsob zahrnuje podání pacientovi při potřebě terapeuticky nebo profylakticky účinného množství polypeptidu, který má SCCE aktivitu. Působení může být profylakční, zmírňující nebo léčebné.

Uvažuje se, že v prostředí kůže existuje „kaskádový systém“ proteolytických enzymů, kteiý je podobný aktivačnímu systému plazminogenu. SCCE je předpokládaným jedním z konečných produktů tohoto systému. Uvažuje se, že aktivita SCCE může být inhibována způsobem „SCCE inhibitoru“.

Ve velkém počtu nemocí, jako jsou autoimunní puchýřnatá onemocnění nebo akantolytická onemocnění např. rodinná puchýřina a Darierova nemoc, je narušena koheze mezi keratocyty v nezrohovatělé živé epidermální vrstvě (viz Poruchy buněčné koheze v životaschopné epider

-18CZ 289600 B6 mis). Uvažuje se, že tento proces je zprostředkován proteinázami, a tak tedy může být léčen podáváním sloučeniny, která je schopná inhibovat enzymatickou aktivitu SCCE. Také může být výhodné podávat SCCE inhibitor pro léčení lupénky a dalších zánětlivých kožních nemocí za podmínek kdy zánětlivá složka je predominantním znakem.

Z dalšího hlediska se týká předložený vynález použití SCCE inhibitoru, který má inhibiční účinek na enzymatickou aktivitu nativního SCCE pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení nebo profylaxi autoimunních puchýřnatých onemocnění nebo akantozních nemocí, jako je rodinná puchýřina a Darierova nemoc.

V předloženém kontextu se termín „SCCE inhibitor“ týká existujících nebo nových sloučenin, které jsou schopné interakce s enzymaticky aktivní polypeptidovou sekvencí nebo subsekvencí podle vynálezu, nebo s jejich analogy v tom případě, že se SCCE aktivita snižuje. Snížení může být měřeno např. provedením zkoušky, jak je naznačena v Příkladu 3.2., za použití možného SCCE inhibitoru jako inhibitoru. Uvedené sloučeniny mohou být organické molekuly, malé peptidy nebo velké polypeptidy, nebo deriváty výše uvedených. Takový přístup může najít použití v programu lékových vyšetření pro identifikaci SCCE inhibitorů.

Další provedení vynálezu tak popisuje způsob identifikace sloučeniny, která působí na enzymatickou aktivitu nativního SCCE a zahrnuje použití rekombinantního polypeptidu podle vynálezu.

Zejména se předložený vynález týká způsobu identifikace sloučeniny s inhibičním účinkem na enzymatickou aktivitu nativního SCCE.

Z jiného hlediska se předložený vynález týká způsobu identifikace sloučeniny schopné zvyšovat enzymatickou aktivitu nativního nebo rekombinantního SCCE.

Důležité použití rekombinantních polypeptidů podle předloženého vynálezu je v lékové vyšetřovací zkoušce. Polypeptidy podle vynálezu mohou být použity v lékovém vyšetřovacím systému. Vynález se tak také týká způsobu identifikace sloučeniny schopné přeměnit proenzymovou formu SCCE na aktivní SCCE při použití polypeptidu podle vynálezu.

Součástí obsahu tohoto vynálezu je také použití aminokyselinové sekvence, jak je definována výše, pro stanovení trojrozměrné struktury SCCE polypeptidu pro provedení substance schopné navázání na SCCE polypeptid, a zejména pro použití při plánování látky, která se napojí na aktivní místo enzymu.

Důležitými aspekty vynálezu jsou nakonec různé způsoby regulace aktivity vynaložené SCCE polypeptidem. Tato aktivita může mít důležitý vliv na různé výše uvedené chorobné stavy.

DNA nebo RNA fragmenty, doplňkové k nejméně části mRNA odpovídající polypeptidu podle vynálezu nebo jejich analogu, mohou být účinné při zastavení translace SCCE mRNAs v lidských buňkách, a tím inhibovat syntézy polypeptidu/ů. Tento přístup, který může být zajímavý u stavů nemoci, kdy je zjištěna exprese SCCE vyšší než normálně, jako je autoimunní puchýřnaté onemocnění nebo akantózní choroby, jako rodinná puchýřina a Darierova nemoc, je obecně známější jako oligoterapie proti smyslu, a proto předložený vynález zahrnuje takovéto postupy.

-19CZ 289600 B6

Vysvětlení k obrázkům

Obr. 1.

Homopolámí buněčné olupování zplantar stratům comeum in vitro. Povrch tkáně, který byl zevně in vivo je nahoře na obrázku. Zaznamenána progresivní buněčná disociace na povrchu v průběhu inkubace, ale na jiných površích buněčná disociace není.

Obr. 2.

Doba postupu a účinek aprotininu v buňce uvolněné z plantar stratům comeum inkubované bez (kroužky) a s (trojúhelníčky) aprotininem. Jsou zaznamenány střed (kumulativní hodnoty pro čtyři vzorky tkáně) a rozmezí.

Obr. 3.

Reaktivní složky anti-desmoglein (anti-DG I) v koherentním plantámím stratům comeum a disociovaných buňkách. A.Coomassie modré vybarvení SDS - PAGE. B. Immunoblot.

1-3: Koherentní tkáň, nezředěná (1), zředění 1/3 (2), zředění 1/9 (3).

4-5: Disociované buňky, nezředěné (4), zředění 1/3 (5).

Zaznamenán pouze zdánlivě intaktní DG I s Mr 160 kD v koherentní tkáni, a pouze degradační produkty DG I s Mr 95 a 80 kD v disociovaných buňkách.

Obr. 4.

Doba postupu a vliv aprotininu na degradaci desmogleinu I (DG I) v plantámím stratům comeum podrobených buněčnému odlupování in vitro. Denzitometrická sledování imunoblotů extraktů plantar stratům comeum inkubovaných za nepřítomnosti (A) a přítomnosti (B) aprotininu (15 μΜ). Maximum při 160 kD koresponduje s intaktním DG I. Maxima při 95 a 80 kD odpovídají degradaci produktů tohoto proteinu (Obr. 3). Zaznamenána značná inhibice aprotininem při degradaci DG I.

Obr. 5.

Vliv zinečnatého iontu (A), chymostatinu a leupeptinu (B) na degradaci desmogleinu I (DG I) v plantar stratům comeum v průběhu buněčného odlupování in vitro. Zaznamenána inhibice transformace anti-DG I pozitivních komponent od 160 kD na 95 a 80 kD zinečnatými ionty a chymostatinem, ale ne leupeptinem.

Obr. 6.

Peptid hydrolyzační aktivity spojený s buňkami plantar stratům comeum. Po hydrolýzách dvou substrátů následovala měření změny absorbance při 405 nm. Postup inkubace ve třech vyhotoveních. Čtverce = S-2586. Kroužky = S-2288.

Obr. 7.

pH-závislost komeocytů -asociovaných S-2586 hydrolyzační aktivity. Postupy inkubace ve třech vyhotoveních. Čtverce = acetát sodný, kroužky = fosforečnan sodný, trojúhelníky = Tris-HCl.

-20CZ 289600 B6

Obr. 8.

Zymograf, ukazující kaseinolytickou aktivitu v extraktech disociovaných buněk plantar stratům comeum. Viz také text u Příkladu 2.2 pro experimentální detaily.

A: Srovnání enzymu z plantámích komeocytů extrahovaných Laemmliho vzorkem pufru bez redukčního činidla (sc/s) a KC1 (sc/k) s chymotrypsinem bovinu, 0,125 ng (c) a trypsinem bovinu, 0,5 ng (t). Před elektroforézou byl KC1 extrakt dialyzován proti 5 nM Tris-HCl, pH 6,8, a byl přidán SDS a glycerol za vzniku konečných koncentrací jako ve vzorku pufru: 10 μΐ se přidá do všech proužků. Molekulová hmotnost označuje nalevo.

B: Závislost na pH při inkubaci pufru. Zdroj enzymu = SDS-extrakty disociovaných plantárních komeocytů. Pufry pro předběžné zpracování s Triton X-100 a inkubace: 0,1 M acetát sodný (pH 4,0 a pH 5,5), a 0,1 M Tris-HCl (pH 7,0 a pH 8,0). Ostatní podmínky jako v A.

C: Vliv inhibitorů. sc= SDS-extrakt plantámích komeocytů, c= chymotrypsin bovinu, t = trypsin bovinu. Inhibitory byly přítomny v průběhu předběžného zpracování Tritonem X-100 a následné inkubaci. Konečná koncentrace leupeptinu byla 160 μΜ, aprotininu 15μΜ, chymostatinu 40 μΜ, a zinečnatých iontů (jako síranu) 100 μΜ. Leupeptin a chymostatin byly přidány jako roztoky v dimethylsulfoxidu (DMSO). Pufr pro předběžné zpracování a inkubaci = 0,1 M TrisHCl pH 8 s konečnou koncentrací DMSO 1 % (obj ./obj.). Ostatní podmínky jako v A.

Obr. 9.

Porovnání SCCE, chymotrypsinu bovinu, a lidského catepsinu vzhledem k vlivům inhibitorů (A,aprotinin, B,chymostatin, C,síran zinečnatý) a specifitě substrátu (D).V A-C enzymová aktivita bez přítomnosti inhibitoru byla standardizována na 100%. VD enzymová aktivita s MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNa byla standardizována na 1 libovolnou jednotku.

Obr. 10.

Afinitní chromatografie kovalentně vázaného inhibitoru sojového trypsinu (SBTI). Tečkovaná čára : Absorbance při 280 nm, zrcadlová proteinová koncentrace eluátu. Plná čára s nevyplněnými čtverci: Hydrolyzační aktivita peptidu s S-2586 jako substrátem, dána jako změna v absorbanci při 405 nm. Plná čára s nevyplněnými kroužky: hydrolyzační aktivita peptidu sS 2288 jako substrátem, dána jako změna v absorbanci při 405 desetinásobného lomu.

Obr. 11.

SDS-PAGE a Coomassie modré zbarvení (A) a zymograf po SDS-PAGE s kopolymerovaným kaseinem (B) frakcí 2,6 a 10 z chromatogramu uvedeného na obr. 10. Molekulová hmotnost označená nalevo. V B: Skupina kaseinolytických složek, která může být inhibována leupeptinem (160 μΜ). C: Skupina kaseinolytických složek, která může být inhibována chymostatinem (40 μΜ).

Obr. 12.

SDS-PAGE SCCE purifikovaná afinitní chromatografií na SBTI-Affigelu 15. 12,5 % gel. 1: Nerozpustný vzorek. 2: Redukovaný vzorek. Molekulová hmotnost označená nalevo.

Obr. 13.

N-terminální sekvence aminokyseliny SCCE. Hvězdička označuje nejistoty v předpokládaných cysteinech na pozicích 7 a 9. Otazníky označují pozice, kde deriváty aminokyselin nemohou být detekovány, ale s žádným poklesem výtěžků v následujících krocích.

-21 CZ 289600 B6

Obr. 14.

Charakterizace monoklonálních protilátek TE4b a TE9b způsoby imunoprecipitace a imunoblotting.

a: Coomassie-vybarvený 12,5 % SDS-PAGE, neredukční podmínky.

linie 1: Molekulová hmotnost linie 2: KCl-extrakt připravený, jak je popsáno v Příkladu 3,1 disociovaných plantámích komeocytů.

linie 3: SCCE purifikovaná, jak je popsáno v Příkladu 4,1 afinitní chromatografií v nerozpuštěném inhibitoru sojového trypsinu.

b: Zymograf imunoprecipitátů ve 12,5 % SDS-PAGE s 0,1 % kopolymerovaným teplým denaturovaným kaseinem, Coomassie-barevný gel.

linie 1: Molekulová hmotnost linie 2: KCl-extrakt, dialyzovaný jako v a.

linie 3-6: Solubilizované precipitáty s (zleva doprava) moab TE4b (20 pg), moab TE9b (10 pg), moab PZ (10pg), a fosfátový solný pufr. Moab PZ je monoklonální protilátka myši typu IgGl-kappa pregnantní proteinové zóny a byla použita jako nepoměrná negativní kontrola.

c: Imunoblot od 12,5 % SDS-PAGE (neredukční podmínky).

linie 1: biotinylová molekulová hmotnost detekovaná s avidinem konjugovaným alkalickou fosfatázou (BioRad). Elektroforetické vzorky v křivkách 2,4 a 6 stejné jako ve 2 v a, a v křivkách 3,5 a 7 stejné jako ve 3 v a.

linie 2 a 3: První protilátka = moab TE4b, 0,2 pg per ml.

linie 4 a 5: První protilátka = moab TE9b, 0,1 pg per ml.

linie 6 a 7: První protilátka = moab PZ, 0,1 pg per ml.

Šipky v a-c označují relativní molekulovou hmotnost (shora dolů) 93,66,46,31,22 a 14 kD, resp.

Obr. 15.

Obrázek 15 ukazuje plazmid pS500. Tento plazmid obsahuje plnou délku lidského SCCE cDNA klonované na pUC19. Detaily viz Příklad 6.

Obr. 16.

Nothemové bloty s mRNA připravené z lidské epidermis. Poly-T-purifikovaná RNA odpovídající přibližně 100 g celkové RNA byla aplikovaná v každé linii. 1: Hybridizace se prováděla sondou připravenou z 1070 bp Hinc 2/Hinc2 fragmentu SCCE-cDNA. 2: Hybridizace se prováděla sondou připravenou z 655 bp Hinc2/Bgl 2 fragmentu SCCE-cDNA.

Obr. 17.

a Coomassie vybarvený SDS-PAGE, 12,5% gel. 1 a 2: PBS-Triton X-100 nerozpustné pelety sonifikovaných TG 2 buněk transformovaných spS510 a pS511 resp., a indukovaných IPTG. 3: SCCE purifikovaná z lidské plantar stratům comeum.

-22CZ 289600 B6 b Imunobloty s kuřecím pre-imunoserem (1-3) a kuřecími anti-SCCE (4-6). 1 a 4 : TG 2-buňky transformované s IPTG. 2 a 5: TG 2-buňky transformované s pS511 a indukované s IPTG. 3 a 6: SCCE purifíkovaný z lidské plantar stratům comeum.

Vzorky byly připraveny varem ve vzorku pufru s merkaptoethanolem.

Obr. 18.

Obrázek 18 zobrazuje kružnicovou mapu expresivního vektoru pS507, vytvořeného podle Příkladu 9. Vektor pS507 zprostředkovává expresi rekombinantního lidského SCCE v buňkách savců.

Obr. 19.

Obrázek 19 zobrazuje analýzu exprese rekombinantního lidského SCCE genu pS507 v buňkách savců.

linie 1: RNA z buněk C127 linie 2: RNA z izolovaného klonu, 1:24, z buněk C127 transfektovaných pS507.

linie 3: RNA z populační směsi Cl27 klonů transfektovaných pS50.

linie 4 a 5: RNA z buněk C127 transf. expresivním vektorem, pS147, který je identický s pS507 vyjma toho, že chybí SCCE cDNA sekvence. Velikost je označena nalevo.

Obr. 20.

SDS-PAGE následovaná imunobloting SCCE exprimované v buňkách Cl27.

linie 1 a 6: Přebarvená značka molekulové hmotnosti (Bio-RAI 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5, a 18.5 kDa) linie 2: pS507/C 127, směs, T-baňka linie 3: pS507/C 127, směs, válec A linie 4: pS507/C127, směs, válec B linie 5: negativní kontrola pS522/C 127 linie 7: původní SCCE připravený ze stratům comeum linie 8: pS507/C127, klon 24, T-baňka linie 9: pS507/C 127, klon 24, válec A linie 10: pS507/C127, klon 24, válec B

Obr. 21.

SDS-PAGE (A) a imunobloting (B) rekombinantního SCCE purifíkovaného ze střední buněčné kultury C127 s buňkami nesoucími plazmid pS507.

linie 1 a 5: Přebarvená značka molekulové hmotnosti (Bio-Rad, 106, 80,49.5, 32.5,27.5 a 18.5 kDa) linie 2: Buněčné médium před purifíkací linie 3: Volný materiál spojený z chromatografie linie 4: Vázaný materiál eluovaný pufrem s nízkým pH.

Obr. 22.

Nativní SCCE a aktivovaný rekombinantní SCCE zkoušené na aktivitu na kaseinovém polyakrylamidovém gelu.

linie 1 a 10: Označují molekulovou hmotnost (Pharmacia 14-94 kDa).

linie 2: Nativní SCCE

-23CZ 289600 B6 linie 3: Nativní SCCE linie 4-6: Rekombinantní SCCE štěpený 1 h 3 h a přes noc, resp. (460 ng/well).

linie 7: Trypsin ve stejném množství jako ve vzorcích v křivkách 4-6, ale za nepřítomnosti

APMSF.

linie 8: Trypsin ve stejném množství jako ve vzorcích v křivkách 4-6 za přítomnosti stejného množství APMSF jako ve vzorcích.

linie 9: Stejně jako 3.

Obr. 23.

Imunoblot N-glykosidázj^ zpracovaný nativním a rekombinantním SCCE. Vzorky byly separovány na 8 - 18 % SDS-PAGE a imunoblotovány jak je uvedeno výše.

linie 1: Označena molekulová hmotnost. Molekulární hmoty, shora-dolů: 106, 80, 49.5,

32.5,27.5, a 18,5 kDa.

linie 3 a 3: Rekombinantní SCCE, 0.3 a 3 pg, linie 4 a 5: Nativní SCCE, 1.5 a 1.8 pg. Vzorky ve 3 a 5 byly zpracovány N-Glykosidázou F^R.

Příklady provedení

Příklad 1

Důkaz, že buněčné odlupování z povrchu zrohovatělé povrchové vrstvy kůže zahrnuje degradaci desmosomálních proteinů, a že odpovědný enzym je podobný serinové proteináze chymotrypsinu, která může být inhibována zinečnatými ionty.

1.1. Odlupování a uvolňování buněk ve stratům comeum

Cílem studie bylo objasnit povahu mechanismů odpovědných za buněčnou kohezi a disociaci povrchových buněk (desquamation) ve zrohovatělé vrstvě kůže, stratům comeum. Plátek stratům comeum, 0,3-0,6 mm silný, byl seříznut paralelně s povrchem kůže zespodu paty dobrovolníka s normální kůží. Kousek tkáně byl namočen ve fosfátovém pufrovém solném roztoku s 0,1 % azidem sodným po dobu 3 hodiny při teplotě místnosti a volně vázané buňky z povrchu, které byly na vnější straně in vivo, byly seškrábnuty. Jeden mm silné plátky seříznuté kolmo k povrchu tkáně byly vloženy do prostředí obsahující 0,lM tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA 0,1% azidu sodného, a 0,45 % agarózy, právě před zgelováním média díky přítomnosti agarózy. Po inkubační době 0, 5 a 15 hodin při 37 °C byly kousky gelu s tkání zmrazený v suchém ledu. 20pm řezů kryoastatu bylo seříznuto kolmo k povrchu tkáně v kryostatu, uzavřeno a podrobeno průzkumu ve fázovém kontrastním mikroskopu. Bylo pozorováno spojené unipolámí odlupování buněk z dílků plantámího stratům comeum inkubovaném in vitro (Obr. 1). Buňky byly sloupnuty pouze z povrchové tkáně, která byla zevně in vivo. Pozorovaný postup tak simuloval deskvamaci.

1.2. Vliv teploty, pH a inhibitorů enzymu

Byl použit způsob kvantifikace buněčného odlupování, který umožnil studovat vlivy různých parametrů, jako je teplota, pH, a inhibitory enzymů. Válečky ze stratům comeum o průměru 3 mm byly připraveny biopsií otvorů z vloček odebrané tkáně a bez volně napojených povrchových buněk, jak je výše popsáno v 1.1. Válečky (s definovanou povrchovou plochou, která je zevně in vivo) byly inkubovány v 0,5 ml média, obsahujícího 0,1 M tris-HCl pH 8, 5mM EDTA, 0,1 % azidu sodného a snebo bez aprotininu (4xl0”⁶mol/l) (Boehringer Mannheim, Germany) v 1,5 ml Eppendorfově zkumavce při 37 °C po dobu 5, 10 a 20 hodin, a potom byly míchány 10 sec v mixem Vortex, aby byl disociován povrch buněk. Zbývající tkáň byla odebrána a umístěna do čerstvého média pro pokračování inkubace. Zkumavky s uvolněnými buňkami byly odstře

-24CZ 289600 B6 ďovány 2 minuty na 5000 g shromáždění buněk. Buněčné pelety byly promyty jednou 0,5 ml fosfátového pufrového slaného roztoku a potom zpracovány při 60 °C po dobu 1,5 h 0,6 ml hydroxidu sodného. Alkalicky rozpustný protein byl kvantifikován podle Lowryho a kol., 1951, a vzat jako měřítko množství vyloučených buněk. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 2.

Podobným způsobem byl zkoumán vliv různých potenciálních inhibitorů (aprotinin, sojový trypsinový inhibitor, pepstatin (Boehringer Mannheim, Germany) a jodoacetamidu (Sigma, St. Louis, Mo). Jednotlivé 2 mm válečky tkáně byly připraveny a inkubovány s médiem s nebo bez různých potenciálních inhibitorů v koncentracích uvedených dále v Tabulce 1 po dobu 16 hodin při 37 °C, a uvolněné buňky byly kvantifikovány, jak je uvedeno výše. Bylo zaznamenáno, že EDTA (který je inhibitorem metaloproteináz) byl zahrnut do inkubačního média za vzniku optimálních poměrů uvolněných buněk.

Tabulka 1

Vliv proteázových inhibitorů na uvolňování buněk ze stratům comeum in vitro.

Střed a SD pro pět inkubovaných kousků tkáně

Inhibitor	koncentrace (mol/1)	inhibice (%)
žádný	-	0±8
Aprotinin (Trasy lol®)	1,5 x 10’7	18±8
Aprotinin (Trasy lol®)	4x 10~7	53 ± 13
Aprotinin (Trasylol®)	1,5 x 10“*	90 ±5
Aprotinin (Trasylol®)	4x 10~*	98 ±2
Sojový trypsin, inhib.	5x10“*	81±9
Pepstatin	1 x 10^	8±4
Jodoacetamid	1 x 10’3	6± 13

Bylo zjištěno, serinové proteinázové inhibitory aprotinin a sojový trypsinový inhibitor účinně inhibují buněčné odlupování (Obr. 2 a Tabulka 1 výše). Jelikož tyto dvě substance byly inhibitory, zatímco inhibitory metaloproteinázy (EDTA), thiolproteinázy (jodoacetamid) aaspartové proteázy (pepstatin) nikoliv, byl učiněn závěr, že serinové proteázy se účastní zkoumaného postupu. Dále byl učiněn závěr, že buněčná koheze ve stratům comeum závisí na struktuře proteinů, a že mechanismy podobné zkoumaným in vitro musí být také zpracované v průběhu deskvanace in vivo (Lundstróm a Egelrud 1988).

Při dalším zkoumání buněčného odlupování in vitro z plantámího stratům comeum bylo zjištěno, že postup může být rozdělen do dvou oddělených kroků. První krok je bez ohledu zdaje či není přítomná EDTA v inkubačním médiu. Druhý krok je pouze v přítomnosti EDTA. První krok může být inhibován chymostatinem a zinečnatými ionty, s přidáním aprotininu. Druhý krok může být inhibován aprotininem a chymostatinem (Lundstróm a Egelrud 1990). Chymostatin je nízkomolekulámí inhibitor proteináz se specifičností jako chymotrypsinový substrát. Bylo zjištěno (Lundstróm a Egelrud 1990 a), že lupeptin, nízkomolekulámí inhibitor proteináz se substrátovou specifičností jako trypsin, neměl žádný vliv na buněčné odlupování in vitro.

Proteinové struktury, které jsou nejvíce odpovědné za buněčnou kohezi ve stratům comeum, a tím jsou možnými kandidáty na degradaci v buněčném odlupování, podobnému deskvanaci, popsané výše, jsou desmosomy. Desmosom sestává ze dvou symetrických polovin, které jsou umístěny v přiléhajících buňkách. Dvě poloviny jsou vázány v extracelulámím prostoru transmembránovými proteiny zvanými desmogleiny.

-25CZ 289600 B6

1.3. Osud desmogleinu I (DG I) v průběhu buněčného odlupování in vitro.

Byl studován osud desmogleinu I (DG I) v průběhu buněčného odlupování z plantar stratům comeum in vitro. Plantámí stratům comeum byl inkubován, jak je popsáno výše v 1.1, a ještě kohezní tkáň byla oddělena z disociovaných buněk. Buňky a tkáň byly extrahovány v pufru obsahujícím 0,1 M tris-HCl pH 9, 9 M močoviny, 2 % dodecylsulfátu sodného, 1 % merkaptoethanolu, 1 ml pufru na 20 mg tkáně, po dobu 15 hodin při 37 °C. Extrakty byly připraveny pro polyakiylamidovou gelovou elektroforézou v 7,5 % gelů za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) podle Laemmliho, 1970), následovanou elektroforetickým transferem (Towbin a kol., 1979) na nitrocelulózové membráně (Bio-Rad, Richmond, CA), který byl zkoumán s polyklonálním antisérem králíka připraveným proti DG I purifikovanému z kravského čenichu (Gorbsky a kol, 1985). Spojení protilátek bylo zjišťováno alkalickou fosfatázou konjugovanou kozími protikráličími imunoglobulíny (Bio-Rad, Richmond, CA) (Blake a kol. 1984).

Výsledky jsou uvedeny na Obr. 3. Množství vzorků dodaných do imunoblotů byl upraven na přibližně stejné koncentrace proteinů (jak lze odhadnout vizuálně z Coomassie modrého vybarvení SDS-PAGE gelů) pro koherentní tkáň a disociované buňky. Několik ředění extraktů bylo měřeno pro možnost semikvantitativního srovnání množství rozdílných anti-DG reaktivních složek v koherentním stratům comeum a disociovaných buňkách.

Bylo zjištěno, že když byla ještě kohezní tkáň a disociované buňky extrahované samostatně, že zatímco kohezní tkáň obsahovala pouze zjevný neporušený DG I, disociovaný povrch buněk obsahoval pouze zdánlivé degradační produkty tohoto proteinu (Obr. 3).

Na Obr. 4 a 5 jsou zobrazeny vlivy aprotininu, zinečnatých iontů, chymostatinu (Boehringer, Mannheim, Německo) a leupeptinu (Boehringer, Mannheim, Německo) na degradaci DG I v průběhu in vitro buněčného odlupování z plantámího stratům comeum.

Nejprve byla zkoumána doba zkoušky a vliv aprotininu na degradaci desmogleinu (DG I) v plantámím stratům comeum spodním buněčném odlupování in vitro. Extrakty plantámího stratům comeum byly inkubovány jak je uvedeno výše v 1.2 (ale bez separace koherentní tkáně z disociovaných buněk před extrakcí) za nepřítomnosti nebo přítomnosti aprotininu (15 μΜ), a extrahovány po 0, 6, 12 nebo 24 hodinách. SDS-PAGE a imunoblotingy byly provedeny jak popsáno výše. Densitometrické snímání imunoblotů se provádělo ve Shimadzu CS-9000 letmém kapkovém snímači (Shimadzu, Kyoto, Japonsko), se zrcadlovým světlem při 560 nm v cikcak modu. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 4. Je zaznamenána vhodná inhibice aprotinem na degradaci DG I.

Poté byl zkoumán vliv zinečnatých iontů, chymostatinu a leupeptinu na degradaci desmogleinu I (DG I) v plantámím stratům comeum během ubývání buněk in vitro. Experimentální návrh byl načrtnut výše. Inkubace se prováděly po dobu 24 hodiny se síranem zinečnatým v koncentracích 0, 1 nebo 5 mM, a s koncentrací chymostatinu nebo leupeptinu 330 μΜ. Výsledky vykazovaly inhibicí transformace anti-DG I pozitivních složek od 160 kD do 95 kD zinečnatými ionty a chymostatinem, ale ne leupeptinem.

Z těchto výsledků je zřejmé, že aprotinin, zinečnaté ionty a chymostatin byly inhibitory, zatímco leupeptin nebyl. Takto inhibitorový profil pro degradaci DG I byl stejný jako pro buněčné ubývání z plantámího stratům comeum in vitro (Lundstróm a Egelrud 1990).

Bylo považováno za důležité demonstrovat, že mechanismy podobné těm, které odpovídají za ubývání buněk z palmo-plantámího stratům comeum, jsou také přítomny ve stratům comeum kůže z jiných míst těla, než jsou dlaně a chodidla. Takahashi a kol. (Takahashi a kol., 1987) uvedl, že směs detergentů Ν,Ν'-dimethyldodecylamino oxidu (Sigma, St. Louis, MO) a dodecylsulfátu sodného (Bio. Rad, Richmond, CA) v molámím poměru 8 : 2 způsobuje buněčnou disociaci v ne palmo-plantámím stratům comeum, připraveném trypsinizací celé epidermis. Aby se vyhnulo kontaminaci exogenním trypsinem, biopsií v normální lidské kůži z hýžďové oblasti byly

-26CZ 289600 B6 inkubovány při pH 8 výše uvedená směs detergentů a EDTA (Egelrud a Lundstrom, 1990). Bylo zjištěno, že za těchto podmínek se zrohovatělá vrstva dělí na jednotlivé buňky. Přídavek aprotininu do inkubačního média bránil této buněčné disociaci. Byl učiněn závěr, že také v non-palmoplantámím stratům comeum závisí buněčná koheze na struktuře proteinů, že deskvamace v této tkáni závisí na proteolýze, a že tkáň obsahuje proteinázu, která může katalyzovat tuto proteolýzu. Jelikož buněčná disociace zahrnuje pouze stratům comeum a ne hlubší, nezrohovatělé epidermální vrstvy, bylo vyvozeno, odpovídající proteinázy se zdrží v hlubších vrstvách v inaktivním nebo inhibovaném stavu.

Příklad 2

Objev chymotryptického enzymu stratům comeum (SCCE):

proteináza, která splňuje kritéria na odpovědnost za degradaci intracelulámích kohezních struktur ve stratům comeum in vitro a případně také in vivo.

Z experimentů předložených v Příkladu 1 byl učiněn závěr, že proteináza zodpovědná za jednopolámí disociaci povrchu buněk v in vitro modelu odlupování buněk v plantámím stratům comeum musí mít následující vlastnosti:

1. Musí být přítomna ve stratům comeum.

2. Musí být serinovou proteinázou.

3. Měla by mít specifičnost substrátu jako chymotrypsin a inhibitorový profil podobný zkoumanému pro in vitro ubývání buněk a pro spojenou degradaci desmogleinu I.

4. Měla by mít extracelulámí lokalizaci ve stratům comeum.

5. Měla by mít závislost na pH takovou, aby byly aktivní za fyziologických podmínek, pH stratům comeum je kolem 4,5-6.

6. Zatímco ubývání buněk z plantámího stratům comeum in vitro probíhá kontinuelně během prodloužené inkubační doby, dokonce pokud je objem inkubačního média velmi velký ve srovnání s objemem inkubované tkáně, nebo jestliže se inkubační médium opakovaně mění během inkubace, zdá se být rozumné předpokládat, že odpovědný enzym je spojen s tkání způsobem, že neumožňuje být extrahován do inkubačního média během inkubace.

Následující dva experimenty vedly k nálezu SCCE (Egelrud a Lundstrom 1991):

2.1. Aktivita enzymu spojená s disociovanými plantámími komeocyty.

Disociované plantámí buňky stratům comeum (komeocyty) byly připraveny způsobem inkubace plantámí stratům comeum v Příkladu 1. Buňky byly filtrovány přes nylonovou síťku s velikosti ok 100 pm a promyty třikrát v deseti objemech 0,1 M Tris-HCl pH 8, 5mM EDTA a třikrát v 0,1 M Tris-HCl pH 8. Buňky byly potom inkubovány se dvěma typy chromogenních proteinázových substrátů S-2288 nebo S-2586 (Kabi Diagnostica, Stockholm, Švédsko):

Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288) je štěpen širokým rozmezím serinových proteináz se specifičností argininu (např. trypsin). Arg-Pro-Tyr-p-nitroanilid (S-2586) je substrát pro proteinázy jako chymotrypsin.

V celkovém objemu 120 μΐ každé reakční směsi obsahující 0,07 M Tris-HCl pH 8, 0,1% azidu sodného, 1, 2.5, 5 nebo 10 μΐ 25 % suspenze promytých plantámích komeocytů a 1,04 mM (S

-27CZ 289600 B6

2586) nebo 1,25 mM (S-2288) substrátu. Po inkubaci 5 hodin při 37 °C v mikrotitračních miskách byla reakce zastavena přídavkem 125 μΐ 10% kyseliny octové. Buňky byly ponechány sedimentovat a 200 μΐ každého supematantu bylo přemístěno do nové misky. Hydrolýzy dvou substrátů byly provedeny způsobem měření změny absorbance při 405 nm, poté když byly buňky odstraněny v Boehring Elisa Procesoru (Behringwerke, Marburg, Německo).

Jak je vidět na Obr. 6, enzymová aktivita byla doprovázena disociovanými plantámími konreocyty, že katalyzovaly hydrolýzu S-2586. Ve srovnání aktivita vzhledem k S-2288 byla nízká.

Dále byla zkoumána hydrolyzační aktivita S-2586 v závislosti na pH. Experimentální návrh byl jako výše použitím 10 μΐ 25 % suspenze promytých plantámích komeocytů a pufrů s různým pH (acetát sodný, fosforečnan sodný nebo Tris-HCl). Konečné koncentrace pufrů byly 0,07 M. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 7, z něhož vyplývá, že aktivita byla optimální při pH 7-8, ale významná také při pH 5,5.

V dalším experimentu byl zkoumán vliv EDTA, kovových iontů a proteinázových inhibitorů na hydrolýzu S-2586 při pH 8 proteinázou asociovanou se suspendovanými buňkami plantámí stratům corneum. Experimentální údaje jsou uvedeny dále v Tabulce 2.

Tabulka 2

Vlivy EDTA, kovových iontů a proteinázových inhibitorů na hydrolýzu S-2586 proteinázou asociovanou s buňkami plantámí stratům corneum (zdroj enzymu: suspendované buňky).

Inhibitor	koncentrace	aktivita (%) (±SD, =3)
žádný	-	100
EDTA*	4,2 mM	10± 1
PMSFb	1 mM	8±3
Aprotinin*	3 μΜ	10± 1
sojový trypsinový
inhibitor*	0,16 μΜ	6±1
Chymostatin*’0	11 μΜ	66±9
	55 μΜ	32 ±0
	275 μΜ	15±3
Leupeptin*’0	325 μΜ	93 ±3
ZnSO4*	100 μΜ	10±3
HgCl2*	100 μΜ	84 ±2
CuSO4*	100 μΜ	85 ±2

Substance představuje ve zkoušce směs.

25% suspenze buněk plantar stratům corneum připravených, jak je uvedeno v textu, bylo předinkubováno po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě za přítomnosti 1 mM PMSF (Sigma, St. Louis, MO) rozpuštěno ve 2-propanolu (konečná koncentrace 2-propanolu 4% obj./obj.). Kontroly byly předinkubovány pouze se 4 % 2-propanolem.

Inhibitor rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO). Všechna média, včetně kontrolních, obsahovala 5 % (obj ./obj.) DMSO.

Jak je patrné z Tabulky 2 výše, fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, základní inhibitor serinových proteináz), aprotinin, sojový trypsinový inhibitor, chymostatin (inhibitor chymotrypsinu), a zinečnaté ionty, ale nikoliv leupeptin (inhibitor trypsinu) inhibovaly hydrolyzační aktivitu S-2586. Bylo tak velice jednoduché zkoumat inhibitorový profil buněčného ubývání in vitro a asociovanou degradaci desmogleinu I.

-28CZ 289600 B6

2.2 Zymografie disociované plantámí stratům comeum

Bylo zjištěno, že enzym zodpovědný za hydrolyzační aktivitu S.2586, popsanou ve 2.1, může být solubilizován, pokud jsou komeocyty extrahovány 1 M KC1 v 0,1 M Tris-HCl pH 8. Takto byly prováděny experimenty se zymografií. Z tohoto důvodu byly připraveny KC1 extrakty komeocytů elektroforézou podle Laemmliho (Laemmli 1970), ale bez redukčního činidla ve vzorku pufru, a bez zahřívání vzorků. Vzorky byly také připraveny extrakcí disociovaných plantámích komeocytů s Laemmliho vzorkem pufru bez redukčního činidla při pokojové teplotě. Po zymografíi byla převzata modifikace způsobu dle Horie a kol. (Horie a kol., 1984). Polyakrylamidová gelová elektroforéza byla provedena za přítomnosti dodecylsulfátu sodného podle Laemmliho ve 12,5 % gelech s 1 % kopolymerovaným teplem denaturovaným kaseinem. Po elektroforéze byly gely nasáknuty pufrem obsahujícím 2 % Tritonu X-100 po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě pro odstranění SDS, a potom inkubovány při 37 °C po dobu 15 hodin. Gely byly vybarveny Coomassie modří. Oddělené kasinolytické enzymy se vykázaly jako jasné pruhy oproti modrému pozadí. Viz také legendu k Obr. 8 pro experimentální detaily.

Výsledky jsou vidět na Obr. 8. Extrakty z plantámích komeocytů obsahovaly jeden větší kaseinolytický enzym se zřejmou molekulovou hmotností kolem 25 kD. Byly zde také menší kaseinolytické enzymy s molekulovou hmotností kolem 30 kD. (Tyto menší složky nejsou jasně vidět na obrázku. Později bylo zjištěno, že mohou být inhibovány leupeptinem, ale nikoliv chymostatinem). Enzym s 25 kD měl významnou aktivitu při pH 5.5-8. Byl inhibován aprotinem, zinečnatými ionty a chymostatinem, ale nikoliv leupeptinem. Takto tedy měl stejný inhibitorový profil jako S-2586 hydrolyzační aktivitu uvedenou výše. V příkladech s gelovou vylučovací chromatografií (není ukázána) byl stanoven 25 kD kaseinolytický enzym jako ko-chromatograf s S-2586 hydrolyzační aktivitou.

V dalších příkladech (nejsou uvedeny) bylo stejnou technikou, jako popsáno výše ve 2.2, nalezeno, že non-palmoplantámí stratům comeum obsahuje enzym s vlastnostmi zjevně identickými s vlastnostmi 25 kD proteinázy asociované s plantárními komeocyty, od nynějška zvaný stratům comeum chymotryptický enzym (SCCE)-(Lundstróm a Egelrud 1991).

Bylo by také možné získat důkaz, že SCCE je sdružen s plantárními komeocyty, způsobem, kdy se ponechá aktivita v extracelulámím prostoru stratům comeum. Toto bylo provedeno prvním demonstrováním, že disociované komeocyty jsou nepropustné pro peroxidázu křenu selského (Mr 44 kD). Potom bylo ukázáno, že lidský fibrinogen (mr 340 kD) může být degradován suspenzí komeocytů, a že tato degradace může být inhibována stejnými inhibitory jako SCCE. Bylo možné vyloučit, že degradace fibrinogenu byla díky solubilizovanému enzymu (Egelrud 1992).

Příklad 3

Částečná purifikace stratům comeum chymotryptického enzymu (SCCE) a zkoušky proteinázy s chromogenními substráty

3.1. Příprava KC1 extraktů plantámích komeocytů

Produkce disociovaných plantámích komeocytů, popsaná v Příkladu 1 byla rozšířena a byly připraveny KCl-extrakty promytých plantámích komeocytů obsahujících SCCE, jak je popsáno v Příkladu 2.

Příprava KC1 extraktů plantámích komeocytů je schematicky naznačena dále v Tabulce 3. Hyperplastické lidské plantámí stratům comeum bylo sloučeno díky spolupráci se Society for Swedish Pedicyrists. Byl použit pouze materiál získaný odstřihnutím nebo odříznutím. Materiál nebyl sebrán z nohou se škrabavými nemocemi. Před odesláním bylo stratům comeum usušeno vzduchem a zabaleno do plastových sáčků. V laboratoři bylo uskladněno při -20 °C do použití.

-29CZ 289600 B6

Tabulka 3

Schematické znázornění přípravy KC1 extraktů obsahujících SCCE z disociovaných plantámích komeocytů.

Plantámí stratům comeum _________50 g______________________

Inkubace při 37 °C po dobu 24 h v 1000 ml 0,1 M Tris-HCl pH 8, mM EDTA, 0,1 % Na-azidu

Supematant Centrifuga 740 x g, 5 min.

Výplachy Promývání pelet 5 x 600 ml

0,1 M Tri-HCl pH 8. Odstředění jako výše

Extrakce pelet s 1 objemem 2 M KCI v 0,1 M Tris-HCl pH 8, 30 min při 4 °C. Odstředění jako výše.

Promývání pelet s 1 objemem 1 M KC1 v 0,1 M Tris-HCl pH 8 _______________Odstředění jako výše________ Peleta

Extrakt 1 (asi 250 ml)

Extrakt 2 (asi 150 ml)

Pro každý následující krok afinitní chromatografie byly jímány extrakty 1 a 2 ze dvou přípravků každý z 50 g plantámího stratům comeum.

3.2. Proteinázové zkoušky s chromogenními substráty

Bylo provedeno srovnání SCCE, hovězího chymotrypsinu a lidského katepsinu z hlediska účinnosti inhibitorů aprotininu, chymostatinu, síranu zinečnatého a substrátové specifičnosti.

Byl připraven zásobní roztok MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2568) v destilované vodě, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe pNA (Boehringer, Mannheim, Německo) v l-methyl-2-pyrroIidonu (konečná koncentrace rozpouštědla v inkubačních směsích 4 %) a chymostatinu v dimethylsulfoxidu (konečná koncentrace rozpouštědla v inkubačních směsích 1 %). Catepsin G z hnisavého lidského sputa byl získán z E.Lotti, Ženeva, Švýcarsko. Zdrojem SCCE byl KC1 extrakt disociovaných plantámích komeocytů připravený jak je popsáno výše. Zdroje inhibitorů aprotininu, chymostatinu a síranu zinečnatého byly jak popsáno výše.

Inkubace se prováděly při 37 °C v mikrotitračních miskách. Celkový inkubační objem byl 135 μΐ. Každá inkubační směs obsahovala Tris-HCl pH 8,0 (konečná koncentrace 0,08 M), KC1 (konečná koncentrace 0,2 Μ), 100μ1 roztoku substrátu, 25 μΐ enzymového zdroje (přiměřeně rozpuštěného v 0,1 M Tris-HCl pH 8,0,1.0 M KC1) a 10 μΐ inhibičního roztoku.

Na obr. 9, A-C, byla použita jako substrát MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2568, původní koncentrace 1.2 mM). V D byla iniciační koncentrace obou substrátů 1.2 mM.

Na konci inkubací (1,5 h) bylo přidáno 125 μΐ 10% kyseliny octové do každé nádobky, a byla odečtena absorbance při 405 nm s inkubační směsí bez přídavku enzymů jako slepých pokusů.

-30CZ 289600 B6

Množství přidaných enzymů bylo upraveno tak, aby změna v absorbanci byla při 405 nm na konci inkubací 0,3 - 0,7.

Výsledky jsou shrnuty na Obr. 9, A-D. Pro studium vlivů inhibitorů byl použit S-2586 jako substrát. Účinnost aprotininu jako inhibitoru SCCE a chymotrypsinu byla vysoká a přibližně stejná pro dva enzymy. Účinek catepsinu G byl, na druhou stranu, mnohem nižší (Obr. 9A). Chymostatin vykazoval inhibici všech tří enzymů, ale koncentrace inhibitoru, která dokázala 50 % inhibice, byla více než tři řády veličiny vyšší pro SCCE než pro chymotrypsin a catepsin G (Obr. 9B). Síran zinečnatý byl účinným inhibitorem SCCE, ale nikoliv chymotrypsinu a catepsinu G (Obr. 9C). Aktivity tří enzymů oproti substrátům MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2568) a Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA jsou porovnány na Obr. 9 D. Poněvadž bylo předmětem najít podobnosti nebo rozdíly mezi zkoumanými enzymy, byly tyto experimenty prováděny pouze při jedné iniciační koncentraci pro každý substrát. Zatímco Suc-Ala-Ala-Pro-Phe pNA se jeví být výrazně lepším substrátem než S-2586 pro chymotrypsin a catepsin G, pro SCCE byl nalezen opak.

Příklad 4

Purifíkace N-terminální aminokyselinové sekvenční determinace chymotryptického enzymu stratům comeum.

4.1. Purifíkace SCCE z KCl-extraktů komeocytů afmitní chromatografíi na insolubilizovaném sojovém trypsinovém inhibitoru (SBTI).

Obr. 10 ukazuje výsledky afmitní chromatografie na SBTI. Afinitní gel byl připraven navázáním 50 mg SBTI (Boehringer, Mannheim, Německo) na 12 ml sedimentovaného Affigelu 15(BioRad, Richmond, Ca.) podle doporučení výrobců. Zbývající aktivní skupiny v gelu byly blokovány ethanolaminem. Spojené KCÍ-extrakty ze 100 g (suchá hmotnost) plantar stratům comeum (celkový objem 700 ml) protékaly skrz 0,8x2 cm lože SBTI-Affigelu 15 ve skleněné koloně, průtoková rychlost 42 ml/h, s kontinuálním záznamem absorbance eluátu při 280 nm. Kolona byla promývána 0,1 M Tris-HCl pH 8, 1 M KC1, dokud byla absorbance eluátu pod 0,01, a potom 10 ml Tris-HCl pH 8. Stupňová eluce spojeného materiálu se prováděla HC1 v 1, 10 a 100 mM. Eluent byl vyměněn, když absorbance eluátu klesla pod 0.01. 3 ml frakcí se spojily v testované zkumavce, která obsahovala Tris-HCl pH 8, celkový objem 0,4 ml, v množství, vypočteném k dostačujícími nastavení pH eluátu nad 7. pH každé frakce se bezprostředně měnilo, a pokud to bylo nezbytné, upravovalo se na asi 7 malým objemem 1 M Tris-HCl, pH 8. Analýzy hydrolyzační aktivity peptidů s S-2568 (substrát pro SCCE) a S-2288 (substrát pro enzymy jako trypsin) byly prováděny podle Příkladu 2.1. Původní koncentrace obou substrátů ve zkoumané směsi byla 1.1 mM. Přibližně 90 % S-2586 hydrolyzační aktivity bylo navázáno na gel. Během stupňové eluce promývaného gelu 10-100 mM HC1 přibližně 60 % z celkově S-2586 hydrolyzační aktivity v použitém KCl-extraktu může být obnoveno. Z celkově S-2288 hydrolyzační aktivity kolem 20 % bylo vázáno na afinitní gel a 10 % mohlo být obnoveno v eluátu.

Obr. 11. znázorňuje analýzy eluátu SBTI-afmitní chromatografíi s polyakrylamidovou gelovou elektroforézou za přítomnosti SDS (SDS-PAGE) a zymografíí. Byly použity nezredukované vzorky 12,5 % gelů. Viz také Egelrud a Lundstróm 1991 a Příklad 2, 2.2 pro experimentální detaily. Před přípravou pro elektroforézou byly vzorky koncentrovány asi 20-krát v A způsobem centrifugové filtrace s Ultrafree-MC-fíltry (hrana lOkD, Millipore, Bedford, MA) a zředěny 10-krátvB.

Na Obr. 12 je znázorněno srovnání SDS-PAGE nezredukovaných a redukovaných vzorků z SBTI afinitní chromatografie.

-31 CZ 289600 B6

Jak je patrné z Obr. 10 a 11, SBTI-afinitní chromatografií se získá protein svíce než 90% čistotou (jak lze usoudit zCoomassie modře vybarvených SDS-PAGE gelů), se zřejmou molekulovou hmotností kolem 25 kD v neredukované formě a kolem 28 kD v redukované formě. Jako přídavná zde byla menší Coomassie modře-pozitivní složka se zjevnou molekulovou hmotností přibližně 1 kD vyšší než větší složka. Na gelu zymografie byl jeden větší a jeden menší pruh se stejnou elektroforetickou mobilitou, jako dva pruhy detekované na Coomassie modře vybarvených gelech s neredukovanými vzorky. Obě tyto kaseinolytické složky mohou být inhibovány chymostatinem. Dále zymografie vykazuje menší složky se zřejmou molekulovou hmotností kolem 30 kD, které mohou být inhibovány leupeptidem. Byl učiněn závěr, že menší purifikovaný protein byl SCCE.

4.2. Analýza N-terminální aminokyselinové sekvence SCCE.

Dvěstě mikrolitrů frakce z chromatografií s SBTI-Affigelem 15, A₂₈₀ nm 0.2 bylo připraveno pro SDS-PAGE s nebo bez redukce a prováděno na 12,5 % polyakrylamidovém gelu (tloušťka 1 mm, šířka štěrbiny 73 mm). Po elektroforéze byly separované proteiny přeneseny elektroforeticky na Immobilon filtr (Millipore) a vybarveny Coomassie modří podle Matsuidaira, 1987. Větší proteinový pás byl uříznut a zpracován v Applied Biosystems 477A pulzním kapalinovým analyzátorem aminokyselinové sekvence son-line PTH 120A analyzerem (Applied Biosystems lne., Foster City, CA, USA). Sekvenování bylo prováděno běžnými cyklickými programy a chemikáliemi z továrny. Původní a opakované výtěžky, přepočtené na standardní proteiny, byly 25 % resp. 97 %. Výtěžky aminokyselinových derivátů byly srovnatelné s pouze jedním peptidem, který byl sekvenován. S neredukovanými vzorky byly výtěžky dobré v krocích 1-6, ale klesající až k nule v krocích 7 a 9. Výtěžky v následujících krocích zřetelně klesaly. Také s redukovanými vzorky nebyly aminokyselinové deriváty detekovány v krocích 7 a 9, ale pro následující kroky, kdy deriváty mohly být detekovány, nebyl ve výtěžcích žádný příkrý pokles. Tyto výsledky připomínají, že na pozicích 7 a 9 jsou cystiny. Nebylo však možné detekovat karboxymethylovaný cystein v krocích 7 a 9 po redukci a zpracování s kyselinou jódoctovou (lOOmM). Získaná sekvence (Obr. 13, SEQ ID NO:3) byla identická pro redukované i neredukované vzorky.

Příklad 5

5.1. Příprava SCCE- specifických monoklonálních protilátek

BALB/c myším (Bomholtgaard, Dánsko) bylo dáno přibližně 30 pg nativního SCCE, čištěného jak je popsáno v Příkladu 4.1, ve Freundově kompletním adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI) jako podkožní injekce. Injekce se stejným obsahem SCCE ve Freundově neúplném adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI) byly opakovány po jednom měsíci. Čtyři měsíce po první injekci byla dána jedné myši intravenózní posilovači injekce ve třech následujících dnech, 30 pg antigenů v injekci. Hybridomy byly produkovány způsobem popsaným v Carlsson a kol., 1985, s buňkami SP2/0 buněčné linie myelomu (ATCC CRL 1581). Identifikace protilátek reagujících s purifikovaným SCCE-přípravkem byla prováděna technikou ELISA. Kultivační supematanty pozitivních klonů byly dále analyzovány způsobem imunoblotting po SDS-PAGE. Klony produkující protilátky reagující s SCCE v tomto testu byly množeny na ascites tekutině myši, a protilátky byly purifikovány Proteinem A afinitní chromatografií a klasifikovány postupem popsaným v Carlsson a kol., 1985. Byly získány dvě vhodné protilátky, moab TE4b a moab TE9b, obě klasifikované jako IgGj-kappa.

Charakterizace moab TE4b a TE9b imunoprecipitací a imunobloting je znázorněna na Obr. 14.

Obr. 14 a (linie 2) ukazuje Coomassie vybarvený SDS-PAGE gel s koncentrovaným KCl-extraktem disociovaných plantámích komeocytů, připravených jako je popsáno v Příkladu 3,1. Vzorek byl dialyzován 4 hodiny proti 0,1 M octanu sodného, pH4, a koncentrován přibližně 100-krát

-32CZ 289600 B6 ultrafiltrací předtím, než byl připraven pro elektroforézu. Obr. 14 a (linie 3) ukazuje přípravu SCCE, purifikovaného, jak je popsáno v Příkladu 4,1.

Obr. 14 b uvádí výsledky imunoprecipitačního experimentu, kdy byly protilátky inkubovány KCl-extraktem komeocytů, a potom regenerovány nerozpuštěným Proteinem A. Resolubilizované a disociované komplexy antigen-protilátka byly analyzovány zymografií popsanou v Příkladu 2.

250 μΐ KC1 extraktu disociovaných plantámích komeocytů, které byly koncentrovány 5-krát ultrafiltrací, dialyzovány proti fosfátovému solnému pufru, a do nichž byl přidán hovězí sérový albumin (Sigma, St. Louis, MO) na konečnou koncentraci 10 mg na ml, bylo smíseno s 10 μΐ roztoku protilátky nebo fosfátového solného pufru, a inkubováno 15 h při 4 °C. 25 μΐ sedimentovaného Proteinu A Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) potom bylo přidáno do zkumavek a inkubace pokračovala za opatrného třepání při pokojové teplotě po 2 hodiny. Gel byl odstraněn na centrifuze a promyt 5 krát 1 ml 0,05 % Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) v 0,05 M Tris-HCl, pH 7.5, 0,5M NaCl. Po závěrečném promytí byl gel extrahován 100μ1 Laemmliho vzorku pufru bez redukčního činidla po 1 hodinu při pokojové teplotě. Extrakty byly vyčeřeny na centrifuze a použity na gel.

Moab TE4b a TE9b oba vysrážely kaseinolytický enzym se stejnou Mr jako purifikovaný SCCE a odpovídající větší kaseinolytický enzym v KCl-extraktu. Protilátky nevysrážely menší kaseinolytické enzymy v extraktu s Mr kolem 30 kDa, které byly ukázány jako inhibované leupeptinem, inhibitorem serinových proteináz podobných trypsinu. Při přídavku k 25 kDa kaseinolytickému enzymu se zdálo, že se protilátky pojí s menší proteolytickou složkou s Mr kolem 80 kDa. Tato složka je obvykle přítomna v KCl-extraktech plantámích komeocytů připravených z tkáně, která byla před preparací sušena, ale není nalezena v přípravcích čerstvé tkáně (T. Egelrud, nepublikovaný výzkum). Není přítomna v SCCE-přípravcích purifikovaných afinitní chromatografií a může představovat agregační produkt. Nebylo možné detekovat odpovídající složku reagující s protilátkami na imunoblotech.

Na imunoblotech SDS-PAGE gelů probíhaly za neredukujících podmínek (Obr. 14 c) moab TE4b a TE9b reagovaly se složkou přítomnou v KCl-extraktech plantámích komeocytů (Obr. 14 c linie 2 a 4) a v purifikovaných SCCE-přípravcích (Obr. 14 c linie 3 a 5), obě se stejnou Mr jako většího purifikovaného proteinu a větší kaseinolytickou složkou na zymogramech. Protilátky byly nereaktivní se vzorky, které se redukovaly za přítomnosti SDS, za připomínky, že jsou řízeny proti epitopům závislým na konformaci.

Spolu s větším proteinem s Mr kolem 25 kD v neredukované formě obsahuje purifikovaný SCCE přípravek menší Coomassie-pozitivní složku s Mr kolem 26 kD (neredukovaný, viz Příklad 3). Na zymogramech je odpovídající kaseinolytická složka přítomna a může být inhibována chymostatinem způsobem podobným, jako větší 25 kD kaseinolytická složka (viz. Příklad 3). Při vyšších koncentracích moab TE4b a TE9b (výsledky nejsou uvedeny) lze vidět také tuto menší složku, že reaguje s protilátkami na imunoblotech. Obdobné výsledky (nejsou uvedeny) byly získány s polyklonovou králičí protilátkou vyvolanou proti větší Coomassie-pozitivní složce purifikované preparativní elektroforézou. Přesný vzájemný vztah mezi dvěma proteiny s SCCE-podobnou aktivitou, a zjevné imunologické vzájemné reakce nejsou známy.

5.2. Polyklonální SCCE-specifické protilátky

5.2.1. Kuřecí anti-SCCE pg SCCE, purifikovaného SBTI-afinitní chromatografií popsanou v Příkladu 4.1, ve 0,2 ml 0,1 M Tris-HCl bylo za tepla denaturováno po dobu 60 minut při 60 °C a homogenizováno ve stejném objemu Freundova kompletního adjuvans (Difco Laboratories). Získaná emulze byla aplikována podkožně injekcí kuřeti Derco, přibližně 20 týdnů starému, jemuž byl odebrán vzorek

-33CZ 289600 B6 krve pro přípravu pre-imuno séra. Kuřatům byly dále aplikovány podkožně injekce emulzí, připravených, jak je popsáno výše, ale s Freundovým nekompletním adjuvans a s 30 pg purifikovaného, teplem denaturovaného SCCE (celkový objem každé emulze 250 μΐ) po 3,5 a 7 týdnech. Kuřata byla vykrvácena 2 týdny po poslední injekci. Krev byla neprodleně smísena se 2 objemy Alserverova roztoku (na 100 ml: 100 ml 1.87 g glukózy, 0,8 g citrátu sodného, 0.62 g chloridu sodného, kyselina citrónová na pH6.1), a odstředěna. Kuřecí anti-SCCE výběr byl pro další studování v experimentech s imunobloting použit ve zředění 1/2000. Viz Obr. 17, Příklad 8 pro ilustraci specifity antiséra.

5.2.2. Králičí anti-SCCE

SCCE purifíkovaný SBTI-afinitní chromatografií byl podroben SDS-PAGE bez redukce popsané v Příkladu 4,1 na gelech tloušťky 15 mm podle Laemmliho, 1970. Větší proteinový pás předběžně označený za SCCE byl detekován chloridem měďnatým vybarvující metodou podle Lee a kol., 1987 a odříznut. Po odebrání chloridu měďnatého EDTA podle Lee a kol. byly řezy gelu homogenizovány ve fosfátovém solném pufrovém roztoku. Vzorky homogenizovaných gelových plátů byly suspendovány ve stejném objemu Freundova adjuvans. Přibližně 30 pg čistého SCCE připraveného tímto způsobem bylo v kompletním adjuvans podáno podkožně králíkovi. Po 3, 5 a 7 týdnech byly injekce opakovány se stejným obsahem SCCE, ale s nekompletním adjuvans. Králík byl vykrvácen dva týdny po poslední injekci.

Získaný králičí anti-SCCE (D-5) byl použit ve zředěních 1/500-1/1000 v imunoblotových experimentech s alkalickou fosfatázou konjugovanou anti-králičími imunoglobulíny jako druhou protilátkou.

Ve všech experimentech imunobloting byl detekován pás druhých protilátek podle Blake a kol. 1984 (odkaz na Příklady 5, 8 a 9).

Králičí anti-SCCE Bo-1 byl připraven stejným způsobem, ale s SCCE, který byl redukován před SDS-PAGE jako antigen.

5.3. Imunohistochemické studie s monoklonálními protilátkami

V imunohistochemických studiích se SCCE-specificky monoklonálními protilátkami může být SCCE detekován ve vysokých suprabazálních buňkách lidského rohovatěj šího šupinatého epitelu (epidermis, vnitřní kořenové listy vlasových váčků, tvrdé patro), ale ne v nekeratinizujícím šupinatém epitelu (vnitřní kořenové listy vlasového váčku, sliznice rtu a lícní sliznice). Tak může být SCCE specificky exprimován v keratinizujícím šupinatém epitelu.

Dále bylo zjištěno, že SCCE je exprimován ve vysokých suprabazálních buňkách lidské epidermis rekonstruovaných in vitro a pěstovaných na rozhraní vzduch - voda. Když se přidala do média kyselina retinová v koncentraci, která stimulovala proliferaci keratocytů, ale inhibovala vytváření stratům comeum, SCCE nebyl dále exprimován. Tato připomíná, že SCCE-exprese může být částí epidermálního diferenciačního programu.

Výsledky imunoelektromikroskopických experimentů s SCCE-specifickými monoklonálními protilátkami jsou kompatibilní s úlohou SCCE v desmosomální degradaci, a takto v odlupování a uvolňování buněk. Protilátky specificky označovaly lamelámí látky podstupující sekreci do intracelulámího prostoru mezi nejvyššími granulámími buňkami a nejnižšími buňkami stratům comeum, poněvadž ve stratům comeum protilátky rozeznaly epitopy v uzavřených asociacích s desmosomy v extracelulámím prostoru.

-34CZ 289600 B6

Příklad 6

Klonování a sekvenování cDNA kódující lidský SCCE

Restrikční enzymy byly získány z Promega, Madison, MI a TAQ-polymeráza z Perkin-ElmerCetus, Norwalk, CT. Xgtl 1 lidský ketarinocyt cDNA knihovny připravený z mRNA odvozené od dospělých lidských keratocytů epidermálního původu byly získány zClontech Laboratories, Palo Alto, CA (Katalog #HL 1045 b). Původně byla knihovna zkoumána s anti-SCCE králičím polyklonálním sérem D-5 a Bo-1 (viz Příklad 5.2.2). Jelikož Bo-1 polyklonální anti - SCCE sérum dalo vysoké zpětné signály, bylo vyloučeno z extenzivního zkoumání v ranném stádiu. Při použití D-5 antiséra počet imunoreaktivních plaků vzrostl, jak bylo očekáváno pro správné pozitivní plaky. Žádná reaktivita s monoklonálními protilátkami moAb 4 a moAb9 nebyla zkoumána pro žádný z plaků. Extenzivní charakterizace restrikčního enzymu a PCR charakterizace jedenácti izolovaných plaků odhalila, že mezi různými plaky nemohly být detekovány žádné podobnosti. Přítomnost takových částečných podobností indikuje, že plaky obsahují homologní DNA vložené ze stejné cDNA sekvence. Na základě nedostatku při definování peptidové mapy „fingerprint“ pravděpodobné SCCE cDNA sekvence, byla strategie modifikována.

Plaky byly zkoumány v E.coli Y 1090 (Clontech) hybridizací plaků při použití degenerovaných syntetických oligonukleotidů jako sondy. Oligonukleotidová sonda byla stanovena na bázi experimentálně determinované amino-terminální sekvence nativního SCCE enzymu popsaného v Příkladu 4.2. Nejspolehlivější část aminokyselinové sekvence, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO:3, aa 1 -aa 6), byla vybrána pro konstrukci syntetického 17-meru oligonukleotidové sondy 5-ATHATHGAYGGNGCNCC-3' (H=A nebo C nebo T, Y=C nebo T, N=A nebo C nebo G nebo T), označený SYM 3067, SEQ ID NO:4. Oligonukleotidová sonda byla syntetizována použitím Beckmanova 200 A DNA syntezéru při použití fosforamiditové techniky podle instrukcí prodávajícího.

Bakterie E.coli Y 1090 byla kultivována přes noc v LB médiu (Sambrook a kol., 1989) obsahujícím 0,2 % maltózy a 10 mM MgSO₄. 0,4 ml kultury potom bylo smíseno se zředěnou zásobní bankou fágu a adsorbováno po 20 minut při 37 °C. Infikovaná kultura byla smí sena se 6 ml vlhké agarózy (0,75 % agarózy vLB a 10 mM MgSO₄). Vlhká agarózová směs byla nalita na deset 150 mm LA misek. Misky byly inkubovány při 37 °C po 5 hodin, a uloženy při 4 °C přes noc. Celkově obsahovaly misky přibližně 4 x 10³ plaků.

Pro imobilizaci plaků byla každá miska překryta horní vrstvou z „NEN Du Pont Colony/Plaque Screen“ membránám (Du Pont, Wilmington, DE) po 2 minuty. Membrány byly nasáknuty 2 krát 2 minuty v 0,5 M NaOH, 2 krát 2 minuty v Tris-HCl pH 7,5, a ponechány ve vzduchu uschnout. Tyto membrány potom byly použity v hybridizačním experimentu, jak je popsaný dále. Membrány byly prehybridizovány v 10 % síranu dextranu, 1 M NaCl, 1 % SDS roztoku obsahujícím 100 mg/ml denaturovaného spermatu DNA sledě (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 5 hodin při 65 °C. Sonda, SYM 3067, byla [λ—³²p] dATP označená použitím T4 polynukleotidové kinázy (Promega, Madison, WI) a přidána do prehybridizační směsi. Hybridizace se prováděla po 12-18 hodin při 42 °C.

Po hybridizací byly membrány promyty 4 krát 5 minut ve 2 x SSC při pokojové teplotě, 2 krát 30 minut ve 2 x SSC, 1% SDS při 42 °C, a konečně v 0,1 SSC při pokojové teplotě po 30 minut. Membrány byly autoradiografovány na rentgenový film (Hyperfilm-MP, Amersham, UK). 14 pozitivních plaků bylo identifikováno v primárním zkoumání. Tyto pozitivní plaky byly přezkoumány použitím stejné sondy a metod, popsaných výše. Po přezkoumání byly identifikovány dva pozitivní plaky. Dva vybrané plaky byly purifikovány pro jinou dobu, a velikost inzertů byla determinována PCR použitím SYM 1600 a SYM 1601 jako primerů, a izolovanými fágy jako matric. Tyto dva primery jsou komplementární sXgt 11 levé a pravé paže. Zesílený DNA fragment přibližně 0,9 kb vytvořený z fágu A 6.2.2. byl potom natráven s EcoRI a klonován na EcoRI natrávený pUC19 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko), pS496. Klonový fragment byl podroben

-35CZ 289600 B6 parciální sekvenční analýze použitím sekvence primerů komplementárních spUC19. Nukleotidové sekvence byla určena použitím T7 sekvencování kitů (Pharmacia, Uppsala, Švédsko nebo USB, Cleveland, Ohio).

Translace získané DNA sekvence měla za následek aminokyselinovou sekvenci, která byla homologní s experimentálně stanovenou proteinovou sekvencí. Avšak sekvence postrádala translační startovací kodon. K izolování plné délky cDNA byl získaný DNA fragment separován na agarózovém gelu a použit jako sonda schopný hybridizace za přísných podmínek. Tato sonda byla ³²p-označená použitím „multiprime DNA“ značícího systému (Amersham, UK) následujícím postupem. Byla přidána voda v poměru 3 ml na gram gelu, a umístěna v lázni vroucí vody na 7 minut k roztavení gelu a denaturaci DNA. Zkumavky se potom přemístily do vodní lázně 37 °C na nejméně 10 minut. Objem roztoku DNA/agaróza obsahující přibližně 25 ngDNA byl přidán do značkovací reakce, v souladu s instrukcemi dodavatele.

K získání plné délky cDNA byla cDNA banka přezkoumána touto sondou dvakrát, použitím stejných metod popsaných výše, vyjma toho, že hybridizace se prováděla za přísnějších podmínek, při 65 °C. Tyto experimenty vedly k identifikaci a izolaci 45 individuálních pozitivních plaků, které byly iniciačně zkoumány PCR analýzou použitím SYM 1600 (5'-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3'; SEQ ID NO:5) nebo SYM 1601 (5'-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3'; SEQ ID NO:6) v kombinaci se SYM 3208 jako PCR primerů pro identifikaci plaků obsahujícího celý 5' otevřený čtecí rámec. SYM 3208, 5-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3', SEQ ID NO:7, který je nejméně částečně komplementární s 5' částí SCCE cDNA, byl designován vztažením na DNA informační sekvenci získanou z pS496. Po tomto zkoumání byly vybrány čtyři fágy pro další analýzy. Pro sekvenční analýzu výsledné PCR zesílené fragmenty odvozené z těchto fágů byly klonovány v pUC19, jak je popsáno výše. Získané výsledky indikují, že jeden z fágů, 205.2.1. obsahoval inzert plné délky.

DNA z fágu izolace 205.2.1 byla připravena podle Sambrooka a kol., 1989, a DNA přípravek byl štěpen s EcoRI. Natrávené DNA byla separována agarózovou elektroforézou a fragment asi 1 kb byl izolován a klonován na EcoRI štěpený pUC19. Výsledný plazmid byl designován pS500 (Obr. 15). Kompletní nukleotidové sekvence cDNA fragmentu byla determinována, jak je popsáno výše. Jako primery byly pro sekvenční reakce použity specifické oligonukleotidy komplementární spUC19 nebo SCCE sekvence. Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO: 1) obsahovala otevřený čtecí rámec vhodný ke kódování celé aminokyselinové sekvence SCCE prekurzoru proteinu sestávajícího z 253 aminokyselin včetně signálního peptidu a prepolypeptidu (SEQ ID NO:2).

Další fág, nazvaný 106.1.2, byl nalezen, že obsahuje SCCE cDNA sekvenci, kterému chybí 5'-netranslační sekvence a první tři kodóny. Tento inzert byl izolován jako 954 bp EcoRI fragment a klonován na EcoRI linearizovaný pUC19, čehož výsledkem je plazmid pS498. Tento plazmid byl částečně sekvenován.

Třetí fág označený 108.1.2. byl nalezen, že obsahuje SCCE cDNA sekvenci, která také postrádá 5'-netranslační sekvenci, a sedm nukleotidů oblasti translace. Tento cDNA inzert má delší variantu 3'-netranslační oblasti, rozšiřující 1057 bp po směru exprese terminačního kodónu. Tento 1884 bp EcoRI fragment byl izolován a klonován na EcoRI linearizovaný pUC19. Výsledný plazmid byl kompletně sekvenován a označen pS501.

-36CZ 289600 B6

Příklad Ί

Detekce SCCE mRNA v lidské epidermis

Příprava úplné RNA z lidské epidermis

Tato byla prováděna podle Chomczynski a Sacchi, 1987. Plastickou chirurgií byla získána zdravá lidská kůže z břicha. Bezprostředně po odstranění byla ochlazena v ledu. Během méně než 15 minut byla epidermis odebrána způsobem tuhého stěru skalpelem, ponořena do roztoku D (Chomczynski a Sacchi, 1987) a homogenizována ve skleněném homogenizéru. Bylo postupováno podle postupu popsaného Chomczynski a Sacchi. Peletovaná totální RNA byla uložena při -20 °C v 70 % ethanolu před dalšími analýzami.

Příprava matricové RNA

Pětset mikrogramů totální epidermis bylo zpracováno Póly A Tract-kitem (Promega) podle pokynů dodavatele.

RNA-elektroforéza a blotting

Gely agarózy (1,4 %) byly připraveny s 0,66M formaldehydem v 1 xMOPS pufru a 0,6g/ml ethidium bromidu (Sigma, St. Louis, MO). mRNA odpovídající 100 pg totální RNA byla rozpuštěna v pufru vzorku RNA (50 % formamid, 2.2M formaldehyd, 3% Ficoll, 1 x MOPS) a zahřívána na 60 °C po dobu 5 minut před použitím. RNA-značky (BRL, Gaithersburg, MD) byly zpracovány obdobně. Po elektroforéze byly gely nasyceny destilovanou vodou po 5 minut, následně 50 mM NaOH po dobu 30 minut a 0,lM Tris-HCl pH 7.5 po 30 minut. Bloting na GeneScreein Plus membránách (NEN Du Pont, Wilmington, DE) se provádělo na zařízení Vacu-Gene (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) po dobu 1 hodiny v 10 x SSC. Membrány byly poté promyty v 3 x SSC, sušeny přes noc, a vypalovány po 2 hodiny při 80 °C. RNA byla zviditelněna na membránách pod UV-Iampou.

cDNA-sondy

Plazmid pS501, připravený podle Příkladu 6, byl štěpen s HincII a BglII. Tato cDNA obsahuje jedno HincII-místo na bp No 1060 a jedno BglII místo na bp NO 1715. 1070 bp fragment (HincII-místo v pUC19 násobném klonovacím místě - endogenní HincII-místo) obsahuje SCCE kódující oblast s výjimkou pro Ί bp na 5' konci, a netranslační oblast, zahrnující polyadenylační místo na bp 944-951, které je společné pro všechny SCCE-cDNA, které byly izolovány. 655 bp HincII-BglII fragment, který neobsahuje póly A-kraj, je jedinečný pro SCCE cDNA 108-1-2. Fragmenty byly puntíkovány agarózovou elektroforézou a použity pro přípravu ³²PdCTP-značící sondy s „Multiprime DNA“ značícím kitem (Amersham, Buckinghamshire, UK).

Hybridizace

Membrány byly vařeny po 30 minut v 1% SDS v 1 x TE a předhybridizovány při 60 °C v 1% SDS, 1 M NaCl, 10% dextran sulfátu, DNA sperma sledě 0,1 mg/ml, po 3 hodiny. Hybridizace se prováděla ve stejném roztoku při 60 °C přes noc. Promývání se provádělo 2x30 minut při 60 °C v 1% SDS ve 2 x SSC, a 3 hodiny v 0,1 x SCC při teplotě místnosti. Membrány byly podrobeny autoradiografii.

Výsledky:

Přítomnost v lidské epidermis dvou mRNA-druhů s velikostí kolem 1.2 kb, resp. 2,0 kb byla prokázána (Obr. 16). To je dobrá shoda s důkazem získaným z experimentů klonování, kdy byly nalezeny dva typy cDNA.

-37CZ 289600 B6

Příklad 8

Exprese rekombinantního SCCE v E.coli

Konstrukce pGEX-2T/SCCE-plazmidů

1. Smysl PCR-primerů

l.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT (SYM 3367; SEQ ID NO:8, podtržená 3'- část kódující N-terminální aminokyseliny IIDGAPC aktivního nativního S CCE, 5'-část s BamHI-místem a přídavnou sekvenci kódující faktor Xa místo IEGR.

1. b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM 3368; SEQ ID NO:9, podtržená 3'-část odpovídající párům bází 76-96 v kompletní SCCE-cDNA-sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci LETAGEE, 5'-část jako v la.

2. Antimediátorové PCR-primery

TGATCCTCTGAGCTCTCCTG (SYM 3317, komplementární k párům báze 285-304 v kompletní SCCE-cDNA-sekvenci, SEQ ID NO:1, s Sacl-místem na bp 294).

Sekvence pS498 (Příklad 6) byla zesílena PCR sprimery la/2 a lb/2. Získané produkty byly purifikovány extrakcí fenolem a srážením ethanolem, štěpeny s BamHI/SacI, a purifikovány agarózovou elektroforézou. Potom byly klonovány v TG2 - buňkách na pGEX-2T (Pharmacia) štěpené sBamHI/EcoRI společně s 3'673 páry bází SCCE 106-1-2 získaných štěpením pS498 s Sací a EcoRI. Z bakteriálních klonů použitých pro studium exprese byly izolovány plazmidy (pS510 kódující nativní N-terminál vedle místa faktoru Xa, a pS511 kódující navrhovaný propeptid vedle místa faktoru Xa), a nukleotidové sekvence odpovídající inzertům odvozených zPCRproduktů byly zkoušeny dideoxyřetězovou terminační metodou použitím T7 sekvenujícího kitu (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Expresivní studie

Kultury (přes noc) TG 2 buněk s pS510 a pS511 v LB médiu obsahujícím 50 pg/ml Carbenicillin (Sigma, St. Louis, MO) byly zředěny desetinásobně v čerstvém mediu a kultivovány 3 hodiny při 37 °C. IPTG (Sigma, St. Louis, MO) byl přidán na konečnou koncentraci 0,lmM a kultury byly kultivovány při 37 °C po další 3 hodiny. Bakteriální pelety byly ošetřeny ultrazvukem v PBS 1% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Po odstředění při 10 000 x g po 15 minutách byly supematanty a pelety analyzovány SDS-PAGE a imunobloting s polyklonálním SCCE-specifíckým kuřecím antisérem.

V peletách nerozpustných vPBS-Triton X-100 bylo nalezeno velké množství IPTG-indukovatelných proteinů s Mr přibližně 50 kD (pS510) a 52 kD (pS511) s imunoreaktivitou jako SCCE (viz Obr. 17).

Supematanty po sonifíkaci v PBS-Triton X-100 obsahovaly GST/SCCE fúzi proteinů se stejnou velikostí jako v nerozpuštěných peletách, ale množství byla nízká ve srovnání s nerozpuštěnými peletami.

Tyto výsledky ukazují, že je možná exprese SCCE jak fúze proteinu s GST, a sekvence, korespondující se specifickým místem štěpení proteázy v pre-pro-SCCE aminokyselinové sekvenci budou vytvářet možnost opakování tohoto experimentu s úmyslem produkovat rekombinantní SCCE v bakterii. Produkovaný protein může být rozpuštěn v močovině nebo guanidinhydro

-38CZ 289600 B6 chloridu a potom purifikován kationtovou výměnnou chromatografií vzhledem k vysokému isoelektrickému bodu SCCE. Purifikovaný protein může být renaturován dialýzou proti pufrům s nízkou koncentrací denaturačního činidla a potom štěpen Faktorem Xa za vzniku GST polypeptidu z SCCE nebo pro-SCCE. Fúze proteinů GST/SCCE může být také využita jako imunogeny pro produkci SCCE-specifických protilátek, a jako imunosorbenty v protilátkové purifikaci.

Příklad 9

Exprese rekombinantního lidského SCCE v savčích buňkách

Z důvodů vytvoření expresivního vektoru pro výrobu rekombinantního SCCE byly lidské cDNA sekvence izolovány z plazmidu pS500 jako 897 bp EcoRI/Dral fragment. Tento fragment byl subklonován na EcoRI a Smál štěpený pUC19, získaný vpS502. Plazmid pS502 byl potom štěpen s EcoRI a Sáli k izolování SCCE cDNA sekvencí jako 0,9 kb fragment, který byl opět subklonován na pUC19 variantu postrádající HindlI místo, poskytující plazmid pS503. Tato pUC19 varianta byla vytvořena štěpením pUC19 s HindlII, naplněným použitím Klenow enzymu a propojením. Z důvodů usnadnění klonování na expresivní vektor, bylo Hind III místo zavedeno do 5'konce SCCE cDNA. Toto bylo provedeno štěpením pS503 s EcoRI a inzercí spojovníku, který konvertuje místo na HindlII, SYM3603 5'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3', SEQ ID NO: 10. Výsledný plazmid, který kotví protein kódující část SCCE cDNA z HindlII místem na 5' konci a Sall místo na 3'konci, byl označen pS505.

Finální vektor exprese byl získán spojením tří rozdílných DNA fragmentů. První, pS505, byl štěpen s HindlII a Sall, a bylo izolováno 0,9kb fragmentu.

Druhý, k poskytnutí distální části myšího metalothioneinu, proti směru regulačního prvku, hovězí papillomavirové sekvence, králičí beta-globin genomový fragment poskytující mRNA zpracovatelné signály a sekvence plazmidů, pML2d, povolující selekci a replikaci v E.coli (Waldenstróm a kol., 1992), vektor pS147 byl štěpen s Sací a Sall, a byl izolován fragment kolem 12 kb.

Třetí, k izolování nejbližší části promotoru myšího metalothioneinu plazmid pS42, ve kterém byl nativní BglII umístěný ve vedoucí sekvenci přeměněn na HindlII místo, byl štěpen s Sací a HindlII, a bylo izolováno přibližně 220 bp fragmentu.

Spojení těchto tří fragmentů poskytlo SCCE expresivní vektor pS507 (viz Obr. 18).

Expresivní vektor pS507 byl kontraferován s vektorem obsahujícím resistentní gen neomycinu vedený Harvey sarkomavirem 5'dlouhým terminálním opakováním a s SV40 polyadenylačními signály (Lusky a Botchan, 1984) do myších Cl27 buněk (ATCC CRL 1616). Transfekční experimenty byly prováděny kalcium-fosfátovou srážecí metodou (Graham a Van der Eb, 1973). Buňky byly kultivovány v „Ham's F12/Dulbecco's modifikovaném Eagle médiu (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) (1:1), doplněným 10% plodovým sérem telete (HyClone, Logan, UT). Neomycinové resistentní buněčné klony byly odděleny s 1,5 mg/ml G418 (Gibco-BRL), a po ΙΟΙ 5 dnech selekce byly rezistentní buněčné klony identifikovány a izolovány ze základních misek, a postoupeny následujícím analýzám.

K analýze exprese rekombinantních SCCE genů byla úplná RNA připravena z izolovaných buněčných linií. Úplná RNA byla připravena zC127 buněk a separována v 1% formaldehydagarózovém gelu, přenesena na nitrocelulózovou membránu a hybridizována na ³²P-značící SCCE sondě. Sonda byla 1070 bp HincII fragment SCCE cDNA izolovaným HincII štěpením pS500, a agarózovou elektroforézou. Experimentální postupy byly podle Ausubel a kol., 1992. Nothemové přenosové experimenty a hybridizace s ³²P-značeným SCCE cDNA ukazují, že

-39CZ 289600 B6 rekombinantní SCCE mRNA byl stanovitelný v mnoha buněčných liniích poutajících SCCE vektor, pS507. Žádná hybridizace nebyla nalezena v kontrolních vzorcích odvozených zC127 buněčných linií obsahujících identický vektor vyjma SCCE cDNA (Obr. 19). Velikost 1.4 kB odpovídá předpokládané velikosti.

Vzorky upravených buněčných kultivačních medií byly odebrány a analyzovány imunoblotingem. SDS-PAGE byla provedena podle Laemliho (1970) a pro imunobloting byl použit jako detekční protilátka kuřecí antinativní SCCE. Alkalickou fosfatázou značený anti-kuřecí IgG (Sigma, St. Louis, MO) byl použit pro značení enzymu. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 20.

K analýze exprese rekombinantního SCCE byla připravena úplná RNA zC127 buněk transfektovaných expresivním vektorem pS507. Jako kontrolní vzorek byla připravena úplná RNA zobou, ne-transfektovaných Cl27 buněk a zC127 buněk transfektovaných expresivním vektorem pS147. Vektor pS147 je podobný vektoru pS507 stou výjimkou, že obsahuje cDNA pro lidskou žlučovou sůl stimulující lipázu (Nilsson a kol., 1990) jako náhradu pro lidský SCCE cDNA. RNA byla připravena podle Ausubela a kol. (1992). Nothemové blotové experimenty a hybridizace s ³²P-značeným SCCE cDNA ukázaly, že rekombinantní SCCE mRNA kolem 1,4 kb je detekovatelný v C127 buňkách poutajících SCCE vektor, pS507 (Obr. 19). Žádná hybridizace nebyla nalezena v kontrolních vzorcích odvozených od Cl27 buněčných linií obsahujících pS147 nebo ne-transfektované C127 buňky. Délka rekombinantního SCCE mRNA je jak byla očekávána.

Vzorky upravených buněčných kultivačních médií byly odebrány a analyzovány SDS-PAGE a imunoblotingem. Blot byl zpracován popsaným způsobem v Blake a kol., 1984. Získané výsledky ukazují (Obr. 20), že C127 buňky poutající pS507 jsou produkovány třemi proteiny, které vykazují reaktivitu se všemi dostupnými polyklonálními králičími i kuřecími SCCE protilátkami, stejně jako s monoklonálními anti-SCCE, připravenými podle Příkladu 5. Rekombinantní SCCE reagující proteiny ukazují zřejmou molekulovou hmotnost, která je kolem lkDa vyšší, než purifikovaný nativní lidský SCCE. Rekombinantní protein nevykazuje žádnou proteolytickou aktivitu. Srovnáním odvozené SCCE aminokyselinové sekvence s experimentálně stanoveným NH-2 koncem nativního lidského SCCE a se sekvencemi jiných proteáz podobných chymotrypsinu může být konstatováno, že rekombinantní SCCE, produkovaný v Cl27 buňkách, je ve své proenzymové formě. Sekvenční data indikují, že tento pro-enzym může být aktivován proteolytickým štěpením na C-terminální straně lysinu v sekvenci ...AQGDKIIDGAP.....podtržená sekvence je NH-2 sekvence aktivního nativního lidského SCCE (SEQ ID NO:2, aa 5 - aa 6).

Příklad 10

Purifikace a charakterizace rekombinantního SCCE

Purifikace

1,3 mg monoklonální protilátky TE4b vedené proti nativnímu SCCE bylo spojeno s 1,5 ml CNBr-aktivované Sepharose (Pharmacia-LKB Biotech., Uppsala, Švédsko) použitím postupu doporučeného výrobcem. 40 ml média obsahujícího SCCE bylo zfiltrováno přes 0,45 pm filtr a potom vloženo do kolony. Kolona byla několikrát promyta s lOmM síranu sodného, 150 mM NaCl, pH 7,2, a potom eluována 0,1 M glycerin-HCl, pH 2,5. Eluovaný protein byl bezprostředně eluován přidáním 0,1 objemu 1M Tris-HCl, pH 8,0.

Aktivace

Rekombinantní SCCE (4,6 pg ve 200 pl), purifikovaný použitím gelu se spojenými monoklonálními protilátkami (viz výše) byl štěpen s 4,6 pl 0,1 mg/ml trypsinu (poměr hmot. 10:1) při 37 °C. Vzorky (50 pl) byly odebírány po 20 minutách, 1 hod, 3 hod a 20 hod; a 5pl z lOpM (4-amidino

-40CZ 289600 B6 fenyl)methansulfonylu (APMSF, Boehringer Mannheim, Německo) bylo přidáno k ukončení reakce. Aktivita štěpených SCCE byla zkoušena neredukujícím SDS-PAGE v kaseinovém gelu, popsaném v Příkladu 2.2. Aktivita získaných natrávených forem SCCE byla zkoušena redukující SDS-PAGE, následovanou imunoblotingem s použitím kuřecího anti-nativního SCCE, a následovaný alkalickou fosfatázou značeným anti-kuřecí IgG a nitro modrým tetrazolem a 5-brom-4— chlor-3-indolylfosfátem jako substrátem pro alkalickou fosfatázu.

N-terminální sekvencování

Afinita purifikovaného (dle popsaného výše) SCCE, přibližně 35 pg, byla blotována štěrbinou použitím Bio-Dot SF jednotky (Bio-Rad, Richmond, CA) na „Immobilon“ membráně (Millipore, Bedford, MA). Membrána potom byla promyta několikrát destilovanou vodou k odstranění veškeré Tris a glycinu. Část membrány, kde byl navázán protein, byla odříznuta, a sekvencována použitím „Applied Biosystem“ (Foster City, CA) 477A pulzním kapalinovým fázovým sekvencerem s on-line PTH 120A analyzerem. Sekvencování se provádělo běžnými cyklickými programy a chemikáliemi od výrobce. Sekvence získaná na prvních šesti pozicích byla glu-glu-alagln-gly-asp korespondující s aminokyselinami -7—2 ze SEQIDNO:2. Z tohoto výsledku lze vyvodit, že signální peptid sestává z 22 aminokyselin, a vztažen na N-terminální aminokyselinovou sekvenci nativního aktivního SCCE, sestává propeptid ze sedmi aminokyselin.

Deglykosylace

Purifikovaný rekombinantní SCCE (5pg) a nativní SCCE (20 pg) se vařil po 3 minuty ve 20pl 0,5% SDS a 0,lM beta-merkaptoethanolu. Potom byly vzorky naředěny sodným fosfátovým pufrem, pH 8,6, a Nonidet P-40 na konečnou koncentraci 0,2M, a resp. 1,25% Byla přidána N-Glykosidase F® (Boehringe Mannheim), (pro rekombinantní protein 0,6 jednotek a pro nativní protein 1,2 jednotky enzymu), a reakční směs byla inkubována přes noc při 37 °C. Konečná koncentrace SDS při zkoušce vzorku byla 0,17%. N-Glykosidase F® zpracovaná SCCE byla analyzována na 8-18% SDS-PAGE, následně výše popsaným imunoblotingem. Získané výsledky vykázaly redukci zřejmé molekulové hmotnosti dvou horních pásů, zatímco zjevná molekulová hmotnost nejnižšího pásu se nezměnila (Obr. 23). To dokazuje, že rekombinantní SCCE produkovaný v Cl 27 buňkách existuje ve dvou N-glykosylovaných formách a v jedné neglykosylované formě. Tento výsledek je analogický s tím, co je vidět s aktivním nativním SCCE (Obr. 23).

Příklad 11

Kompozice obsahující SCCE

Kompozice mohou být připraveny běžnými farmaceutickými technikami včetně smísení aktivních sloučenin spolu s dalšími přísadami.

Všechna procenta jsou hmotnostní.

Kompozice obsahující více než jednu aktivní sloučeninu jsou také v rozsahu vynálezu. Následující příklady tak mohou být také uskutečněny, jako by obsahovaly více než jednu účinnou složku. Podobně, termín „SCCE“ může být nahrazen termínem „pro-SCCE“. Kompozice, které obsahují SCCE stejně jako pro-SCCE, jsou také v rozsahu vynálezu.

SCCE = nativní nebo rekombinantní stratům comeum chymotryptický enzym, volitelně s dalšími účinnými sloučeninami

q.s. = quantum satis

-41 CZ 289600 B6

Krém o/w	%
SCCE	0,01-20
Polysorbát 80	0,5
Emulgační vosk	5
Minerální olej	4
Dimethicon	1
Glycerylstearát	6
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Konzervační prostředek	q.s.
Glycerin 85 %	4
Propylenglykol	7
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Voda	65-76

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, emulgační systémy (proporce mezi olejovou a vodnou fází a obsah emulgačních činidel a dalších vhodných 5 excipientů).

Krém w/o	%
SCCE	0,01-20
Cetylalkohol	0,5
Lanolin	5
Bílá technická vazelína	10
Minerální olej	45
Antioxidant	q.s.
EDTA	1
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Konzervační prostředek	q.s.
Voda	15-25

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, emulgační systémy (proporce mezi olejovou a vodnou fází a obsah emulgačních činidel a dalších vhodných 10 excipientů).

Mast	%
SCCE	0,01-20
Emulgační vosk	4
Glycerylstearát	3
Minerální olej	15
Polysorbát 80	0,6
Glycerin 85 %	3
Propylenglykol	5
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Konzervační prostředek	q.s.
Voda	59-69

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, emulgační systémy (proporce mezi olejovou fází a vodnou fází a obsah emulgačních činidel a dalších vhodíš ných excipientů).

-42CZ 289600 B6

Gel

SCCE

Triethanolamin

Ethylalkohol Cetylalkohol Celulózová guma EDTA

Konzervační prostředek Voda %

0,01-20

1-5

0,1

q.s.

59-74

Příklady proměnných činitelů: Činidlo tvořící gel, antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky.

Roztok, voda	%
SCCE	0,01-20
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Cetylalkohol	4
Propylenglykol	5
Konzervační prostředek	q.s.
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Voda	37-89

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, výživová činidla, zvlhčovadla.

Roztok, ethylalkohol	%
SCCE	0,01-20
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Propylenglykol	5
Cetylalkohol	3
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Ethylalkohol	50-95

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, zvlhčovadla.

Suspenze	%
SCCE	0,01-20
Carbomer	0,5
Celulózová guma	0,5
Polysorbát 80	0,1
Propylenglykol	5
Kyselina askorbová	0,05
Cetylalkohol	4
Polysorbát	q.s.
EDTA	0,1
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Voda	72-80

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, suspenzační 15 činidla.

-43CZ 289600 B6

Pasta	%
SCCE	0,01-20
Technická vazelína	45-55
Oxid zinečnatý	40
Minerální olej	5
Antioxidant	q.s.

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, pastové základy.

Tyčinka	%
SCCE	0,01-20
Cutina LM	70-80
Myristylalkohol	5
Ricínový olej	2
Včelí vosk, bílý	10
Technická vazelína	3
Antioxidant	q.s.
Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, tyčinkové základy.
Spray-ruční	%
SCCE	0,01-20
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Ethylalkohol	30
Glycerin 85	5
Propylenglykol	5
Cetylalkohol	3
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Konzervační prostředky	q.s.
Voda	22-57

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, výživová 10 činidla, zvlhčovadla.

Sprayový aerosolový roztok	%
SCCE	0,01-20
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Isopropylmyristát	3
Propylenglykol	5
Ethylalkohol	48-92
Hnací látka	q.s.

Příklady proměnných činitelů: Výživová činidla, zvlhčovadla.

Spray - aerosolová pěna SCCE

Vosk

Ethylalkohol Antioxidant EDTA Voda Hnací látka %

0,01-20

50-55

q.s.

0,1

20-35

q.s.

-44CZ 289600 B6

Příklady proměnných činitelů: Hnací látky, antioxidanty, chelatační činidla.

Sprayová aerosolová emulze	%
SCCE	0,01-20
Deriváty celulózy	1-3
Tween® 60	1,0
Glycerylstearát	2,5
Sorbát draselný	0,2
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Konzervační látka	q.s.
Činidlo pro úpravu pH	0,01-10
Voda	50-95
Hnací látka	q.s.

Příklady proměnných činitelů: Antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prostředky, emulgační systémy (proporce mezi olejovou fází a vodnou fází a obsah emulgačního činidla a dalších relevantních excipientů).

Šampón

SCCE

Laurylsíran sodný

Cetylalkohol

Pěnicí činidlo nebo kondicionér Chlorid sodný

Antioxidant

EDTA

Konzervační prostředek Voda %

0,01-20 40

q.s.

0,1

q.s.

43-53

Příklady proměnných faktorů: Šamponové báze, antioxidanty, chelatační činidla, ochranné prosto tředky, zvlhčovadla, kondicionéry.

Tělový šampón	%
SCCE	0,01-20
Laurylsíran sodný	40
Cetylalkohol	4
Pěnicí činidlo nebo kondicionér	3
Perleťové činidlo	10
Antioxidant	q.s.
EDTA	0,1
Konzervační prostředek	q.s.
Voda	40-50

Příklady proměnných faktorů: Šamponové báze, antioxidanty, chelatační činidla, ochranné pros-

tředky, aditiva, kondicionéry.
Medicinální mýdlo	%
SCCE	0,01-20
Kyselina 1-hydroxyethan-l, 1-difosforečná	0,2
Glycerin	0,8
Sodné mýdlo z kokosového oleje a lůj	88-98
Aditiva	0,7

Příklady proměnných faktorů: Zvlhčovadla, mýdlové báze.

-45CZ 289600 B6

Pudr

SCCE

Talek

Kaolin

Oxid titaničitý

Uhličitan vápenatý

Stearát hořečnatý

Kukuřičný nebo ovesný škrob %

0,01-20 65-70

5-10

Příklady proměnných faktorů: Pudrové báze, ochranné prostředky, poměry hmot.

Vlasový kondicionér	%
SCCE	0,01-20
Cetylalkohol	2,2
Alkyltrimethylamoniumchlorid	1,25
Oktyldodekanol	1
Kyselina citrónová	1
EDTA	0,1
Ochranné prostředky	q.s.
Antioxidant	q.s.
Voda	do 100

Příklady proměnných faktorů: Kondicionéry, ochranné prostředky, chelatační činidla, antioxidanty.

Obdobným způsobem mohou být připraveny topické kompozice zahrnující v sobě sloučeninu, která je schopná inhibovat nebo zvýšit aktivitu SCCE.

Příklad 12

Aktivita rekombinantního SCCE štěpení desmozomu

Komeocyty obsahující neporušené desmosomy byly odstraněny z kůže odtrháváním proužků hlubokých vrstev stratům comeum, a šupiny byly odděleny hexanem a sušeny v podílech. Korneocytové podíly (3 mg) byly extrahovány 1 M chloridem sodným při 4 °C, aby se solubilizovaly vnitřní proteázy, a potom byly rozsáhle promyty inkubačním pufrem (0,1 M Tris/HCl pH 8,0) k odstranění endogenní proteolytické aktivity z přípravků. Inkubace byly prováděny v 0,1 M Tris pH 8,0 s nebo bez 10 pg rekombinantního SCCE po dobu 24 hodin při 37 °C. Důkaz desmozomálního štěpení enzymem byl doložen měřením hladiny desmozomálního signálního znaku proteinu desmogleinu I (DG I). Ten byl izolován ze šupin extrahováním v 8 M pufru močovina/2%SDS/|3-merkaptoethanol s následnou purifikací DG I glykoproteinu použitím konkanavalin A afmitní chromatografie. Eluát konkanavalinu A byl frakcionován SDS-PAGE a elektroforeticky převeden na PDVF membránu pro imunosavost. DG I byl identifikován použitím specifického antiséra a detekován zvýšenou chemiluminiscencí. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4.

Tabulka 4

	Kontrola	+rSCCE, 10pg
DG I (libovolná jednotka/mg šupin)	7950 ± 4992	4059 ±2360

Výsledky uvedené v Tabulce 4 ukazují, že rekombinantní SCCE je schopen degradovat intracelulámí kohezní struktury ve stratům comeum v in vitro zkoušce.

-46CZ 289600 B6

Příklad 13

Účinky inhibitorů na aktivitu rekombinantního SCCE

Byly zkoumány účinky inhibitorů aprotininu, chymostatinu, a síranu zinečnatého na S-2586 hydrolyzační aktivitu rSCCE. Experimentální návrh byl takový, jak je naznačeno v Příkladu 3.2. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 5.

Tabulka 5

Inhibitor	Koncentrace (μΜ)	Aktivita (%)
Aprotinin	0	100
	0,35	51,6
	1,4	21,2
	5,7	7,4
Chymostatin	0	100
	0,64	74,9
	2,56	33
	41	1,9
ZnSO4	0	100
	15,6	50,7
	62,5	19,4
	250	5,1

Jak je patrné z výše uvedené Tabulky 5, aprotinin, chymostatin, a zinečnaté ionty inhibovaly S-2586 hydrolyzační aktivitu rekombinantního SCCE podobným způsobem, jako nativního enzymu.

REFERENCE

- Ausubel et al. (1992). Current protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons

- Blake et al. (1984). Anal Biochem 136:175-179

- Carlsson et al. (1985). Molec Immun 22:1073-1080

- Caughey et al. (1991). J. Biol Chem 266:12956-12963

- Chomczynski and Sacchi (1987). Anal Biochem 162:156-159

- Egelrud a Lundstrom (1990). J Invest Dermatol 95:456-459

- Egelrud a Lundstrom (1991). Arch Derm Res 283:108-112

- Egelrud (1992). Eur J. Dermatol 2:50-55

- Gorbsky et al. (1985). Proč Nati Acad Sci USA 82:810-814

- Graham and Van der Eb (1973). Virology 52:456-467

- Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986).

Manipulating the Mouše Embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press

- Horie et al. (1984). Comp Biochem Physiol 77B:349-354

- Laemmli (1970). Nátuře 227-680-685

- Lee et al. (1987). Anal Biochem 166:308-312

- Lowry et al. (1951). J Biol Chem 193:265-275

Lundstrom a Egelrud (1988). J Invest Dermatol 91:340-343

Lundstrom a Egelrud (1990 a). Arch Derm Res 282:234-237

- Lundstrom a Egelrud (1990 b). J Invest Dermatol 94:216-220

- Lundstrom a Egelrud (1991). Acta Derm Venereol (Stockh) 71:471-474

-47CZ 289600 B6

- Lusky a Botchan (1984). Cell 36:391^401

- Matsudaira P (1987). JBiol Chem 262:10035-10038

Mizutani et al. (1991). J Clin Invest 87:1066-1071

- Nilsson et al. (1990) Eur J Biochem 192:543-550

Norris (1990). J Invest Dermatol 95:371

- Salvesen et al. (1987). Biochemistry 26:2289-2293

Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor

- Schechter et al. (1983). J Biol Chem 258:2973-2978

- Schechter et al. (1989). J Biol Chem 264:21308-21315

- Schwartz et al. (1987). J Immunol 138-2611-2615

- Takahashi et al (1987). J Soc Cosmet Chem 38:21-28

- Toulta et al. (1989). BBRC 158:569-575

- Towbin et al. (1979). Proč Nati Acad Sci USA 76:4350-4354

- Waldenstróm et al. (1992) Gene 120:175-181

- Wintroub et al. (1986). J Clin Invest 77:196-201

- WO 93/04172 (filed by Symbicom Aktiebolag on 19 August 1992)

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: SYMBICOM AB (B) Ulice: PO BOX 1451 (C) Město: Umea (E) Země: Švédsko (F) Poštovní kód (ZIP): S- 901 24 (ii) Název vynálezu: Rekombinantní stratům comeum chymotiyptický enzym (SCCE) (iii) Počet sekvencí: 10 (iv) Počítačem zpracovatelná forma:

(A) Typ média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, Verze #1,25 (EPO) (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence: ..

I (A) Délka: 986 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: jednořetězcové (D) Typologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: není (iii) Antimediátorový: není

-48CZ 289600 B6 (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Homo sapiens (ix) Znak:

(A) Název/klíč: CDS (B) Umístění: 25 .. 786 (ix) Znak:

(A) Název/klíč: sig peptid (B) Umístění: 25 .. 90 (ix) Znak:

(A) Název/klíč: mat_peptid (B) Umístění: 112 .. 783 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1

29

25

CAG

ATC

CTA

CTG

CTA

TCC

TTA

GCC

TTG

GAA

ACT

GCA

GGA

GAA

GAA

GCC

Gin

lle

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Ala

Leu

Glu

Thr

Ala

Gly

Glu

Glu

Ala

-20

-15

-10

-5

CAG

GGT

GAC

AAG

ATT

ATT

GAT

GGC

GCC

CCA

TGT

GCA

AGA

GGC

TCC

CAC

Gin

Gly

Asp

Lys

Zle

Zle

Asp

Gly

Ala

Pro

cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

1

5

10

CCA

TGG

CAG

GTG

GCC

CTG

CTC

AGT

GGC

AAT

CAG

CTC

CAC

TGC

GGA

GGC

Pro

Trp

Gin

Val

Ala

Leu

Leu

Ser

Gly

Asn

Gin

Leu

His

Cys

Gly

Gly

15

20

25

GTC

CTG

GTC

AAT

GAG

CGC

TGG

GTG

CTC

ACT

GCC

GCC

CAC

TGC

AAG

ATG

Val

Leu

Val

Asn

Glu

Arg

Trp

Val

Leu

Thr

Ala

Ala

His

Cys

Lys

Met

30

35

40

AAT

GAG

TAC

ACC

GTG

CAC

CTG

GGC

AGT

GAT

ACG

CTG

GGC

GAC

AGG

AGA

Asn

Glu

Tyr

Thr

Val

His

Leu

Gly

Ser

Asp

Thr

Leu

Gly Asp

Arg Arg

45

50

55

60

GCT

CAG

AGG

ATC

AAG

GCC

TCG AAG

TCA

TTC

CGC

CAC

CCC

GGC

TAC

TCC

Ala

Gin

Arg

Zle

Lys

Ala

Ser Lys

Ser

Phe

Arg

His

Pro Gly Tyr

Ser

65

70

75

-49CZ 289600 B6

ACA CAG ACC CAT GTT AAT GAC CTC ATG CTC GTG AAG CTC AAT AGC CAG

387

Thr

Gin Thr

His Val Asn Asp Leu Met

Leu Val Lys

Leu Asn 90

Ser Gin

80

85

GCC

AGG

CTG

TCA

TCC

ATG

GTG

AAG

AAA

GTC

AGG

CTG

CCC

TCC

CGC

TGC

435

Ala

Arg

Leu

Ser

Ser

Met

Val

Lys

Lys

Val

Arg

Leu

Pro

Ser

Arg Cys

95

100

105

GAA

CCC

CCT

GGA ACC

ACC

TGT

ACT

GTC

TCC

GGC

TGG

GGC

ACT

ACC

ACG

483

Glu

Pro

Pro

Gly

Thr

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly Trp

Gly

Thr

Thr

Thr

110

115

120

AGC

CCA

GAT

GTG

ACC

TTT

CCC

TCT

GAC

CTC

ATG

TGC

GTG

GAT

GTC

AAG

531

Ser

Pro

Asp

Val

Thr

Phe

Pro

Ser

Asp

Leu

Met

Cys

Val

Asp

Val

Lys

125

130

135

140

CTC

ATC

TCC

CCC

CAG

GAC

TGC

ACG

AAG

GTT

TAC

AAG

GAC

TTA

CTG

GAA

579

Leu

lle

Ser

Pro

Gin

Asp

Cys

Thr

Lys

Val

Tyr Lys Asp

Leu

Leu

Glu

145

150

155

AAT

TCC

ATG

CTG

TGC

GCT

GGC

ATC

CCC

GAC

TCC

AAG

AAA

AAC

GCC

TGC

627

Asn

Ser

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

lle

Pro

Asp

Ser

Lys

Lys

Asn

Ala

Cys

160

165

170

AAT

GGT

GAC

TCA

GGG

GGA

CCG

TTG

GTG

TGC

AGA

GGT

ACC

CTG

CAA

GGT

675

Asn

Gly Asp

Ser

Gly Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Arg

Gly

Thr

Leu

Gin

Gly

175

180

185

CTG

GTG

TCC

TGG

GGA

ACT

TTC

CCT

TGC

GGC

CAA

CCC

AAT

GAC

CCA

GGA

723

Leu

Val

Ser

Trp

Gly

Thr

Phe

Pro

cys

Gly

Gin

Pro

Asn

Asp

Pro

Gly

190

195

200

GTC

TAC

ACT

CAA

GTG

TGC

AAG

TTC

ACC

AAG

TGG

ATA

AAT

GAC

ACC

ATG

771

Val

Tyr

Thr

Gin

Val

Cys

Lys

Phe

Thr

Lys

Trp

lle

Asn

Asp

Thr

Met

205

210

215

220

AAA AAG CAT CGC TAACGCCACA CTGAGTTAAT TAACTGTGTG CTTCCAACAG823

Lys Lys His Arg

225

AAAATGCACA GGAGTGAGGA CGCCGATGAC CTATGAAGTC AAATTTGACT TTACCTITCC883

TCAAAGATAT ATTTAAACCT CATGCCCTGT TGATAAACCA ATCAAATTGG TAAAGACCTA943

AAACCAAAAC AAATAAAGAA ACACAAAACC CTCAACGGAA TTC986 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 253 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

-50CZ 289600 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:

Met

Ala

Arg

Ser

Leu

Leu

Leu

Pro

Leu

Gin

Zle

Leu

Leu

Leu

Ser Leu

-29

-25

-20

-15

Ala

Leu

Glu

Thr

Ala

Gly

Glu

Glu

Ala

Gin

G ly Asp

Lys

Zle

Zle Asp

-10

-5

1

Gly

Ala

Pro

Cys

Ala

Arg

Gly

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Val

Ala

Leu Leu

5

10

15

Ser

Gly

Asn

Gin

Leu

His

Cys

Gly Gly Val

Leu

Val

Asn

Glu

Arg Trp

20

25

30

35

Val

Leu

Thr

Ala

Ala

His

Cys

Lys Met

Asn

Glu

Tyr

Thr

Val

His Leu

40

45

50

Gly

Ser

Asp

Thr

Leu

Gly Asp

Arg Arg

Ala

Gin

Arg

Zle

Lys

Ala Ser

55

60

65

Lys

Ser

Phe

Arg

His

Pro

Gly Tyr

Ser

Thr

Gin

Thr

His

Val

Asn Asp

70

7S

80

Leu

Met

Leu

Val

Lys

Leu

Asn

Ser

Gin

Ala

Arg

Leu

Ser

Ser

Met Val

85

90

95

Lys

Lye

Val

Arg

Leu

Pro

Ser

Arg

Cys

Glu

Pro

Pro

Gly

Thr

Thr Cys

100

105

110

115

Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro

120

125

130

Ser

Asp

Leu

Met

Cys

Val

Asp

Val

Lys

Leu

Zle

Ser

Pro

Gin

Asp

Cys

135

140

145

Thr

Lys

Val

Tyr

Lys

Asp

Leu

Leu

Glu

Asn

Ser

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

150

155

160

Zle

Pro

Asp

Ser

Lys

Lys

Asn

Ala

Cys

Asn

Gly Asp

Ser

Gly Gly

Pro

165

170

175

Leu

Val

Cys

Arg

Gly

Thr

Leu

Gin

Gly

Leu

Val

Ser

Trp

Gly

Thr

Phe

180

185

190

195

Pro

Cys

Gly

Gin

Pro

Asn

Asp

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Gin

Val

Cys

Lys

200

205

210

Phe

Thr

Lys

Trp

Ile

Asn

Asp

Thr

Met

Lys

Lys

His

Arg

215 220

-51 CZ 289600 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetický: není (iv) Typ fragmentu: N-terminální (vi) Původní zdroj:

(A) Organismus: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:

Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Cys Gly Ser Xaa Pro Xaa

5 10

Gin Val Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gin Leu

20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 17 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: jednořetězcové (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

ATHATHGAYG GNGCNCC 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: Jednořetězcové (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:

GTGGCGACGA CTCCTGGAGC C 21

-52CZ 289600 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: Jednořetězcové (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

AC ACCAGACC AACTGGTAAT G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: Jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQIDNO:7:

TGGGTGGGAG CCTCTTGCAC A 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 42 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: Jednořetězcové (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:8:

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TATTATTGAT GGCGCCCCAT GT 42 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 42 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina

-53CZ 289600 B6 (C) Řetězce: Jednořetězcové (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9:

CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TTTGGAAACT GCAGGAGAAG AA 42 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 18 párů báze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězce: Jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:10:

AATTGTGGAA GCTTCC AC 18

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (11)

1. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin znázorněné v SEQ ID NO: 2, a který má enzymatickou aktivitu stratům comeum chymotryptického enzymu.

2. Nukleová kyselina podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 1.

3. Nukleová kyselina podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí znázorněnou v SEQ ID NO: 1 za přísných hybridizačních podmínek.

4. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin od polohy -7 do polohy 224 nebo od polohy 1 do polohy 224 ze SEQ ID NO: 2.

5. Replikovatelný vektor exprese pS507 DSM 8282.

6. Plazmid pS500 DSM 8281.

7. Savčí buňka nebo buněčná linie, která nese replikovatelný vektor exprese podle nároku 5.

8. V podstatě čistý polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin znázorněné v SEQ ID NO: 2.

-54CZ 289600 B6

9. V podstatě čistý polypeptid sestávající ze sekvence aminokyselin od polohy -7 do polohy 224 nebo od polohy 1 do polohy 224 ze SEQ ID NO: 2.

10. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že se (a) vloží nukleová kyselina definovaná v některém z nároků 1 až 4 do replikovatelného vektoru exprese, (b) transformuje se vhodný hostitelský organismus replikovatelným vektorem připraveným v kroku (a), (c) kultivuje se hostitelský organismus vytvořený v kroku (b) za podmínek vhodných pro expresi polypeptidu, (d) odebere se polypeptid a (e) popřípadě se polypeptid podrobí post-translační modifikaci.

11. Farmaceutický přípravek pro použití při léčbě chorob kůže, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje polypeptid mající aktivitu stratům comeum chymotryptického enzymu podle nároku 8 nebo 9 v množství od 0,001 do 25 % hmotnostních, vztaženo na celkový přípravek.