RU2585960C1 - Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи - Google Patents
Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2585960C1 RU2585960C1 RU2015105290/15A RU2015105290A RU2585960C1 RU 2585960 C1 RU2585960 C1 RU 2585960C1 RU 2015105290/15 A RU2015105290/15 A RU 2015105290/15A RU 2015105290 A RU2015105290 A RU 2015105290A RU 2585960 C1 RU2585960 C1 RU 2585960C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- barrier function
- flg
- cag
- nucleotide sequence
- chain reaction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 title abstract description 12
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 title abstract 3
- 102100037009 Filaggrin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 101710095953 Filaggrin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 17
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 3
- 101150035468 phi gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 abstract 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 abstract 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 25
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 18
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 3
- 108700041153 Filaggrin Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000878281 Homo sapiens Filaggrin-2 Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 description 2
- 101150063233 FLG gene Proteins 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 241000223229 Trichophyton rubrum Species 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001869 cobalt compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000917159 Homo sapiens Filaggrin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 101150073465 fil gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи. Сущность способа состоит в том, что из венозной крови осуществляют выделение генетического материала. Проводят полимеразную цепную реакцию синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 филаггрина. При проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры: «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3'; «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', размер ампликона - 205 пар оснований, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера «FLG-2 S1» 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-AC3'. Детекцию нуклеотидной последовательности осуществляют с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 2282 с референсными последовательностями. При выявлении на полученной пирограмме отсутствия делеции в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют низкую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи. При выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта ins/del в положении 2282 гена филаггрина определяют высокую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия. 2 ил., 1 табл., 2пр.
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи.
Известен способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 гена филаггрина (см. Хантимерова Э.Ф., Нуртдинова Г.М., Карунас А.С., Гималова Г.Ф. Клинико-генетическая характеристика больных атопическим дерматитом и крапивницей с мутациями в гене филаггрина // Фундаментальные исследования. - 2014. - №10 (4). - С. 752-756).
Однако данный способ имеет низкую пропускную способность ввиду невысокой скорости проведения обследования пациентов (время анализа 1-2 дня), ввиду сложности, трудоемкости используемых лабораторных технологий, являющихся вредными для медицинского персонала, проводящего их. Это затрудняет определение наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение возможности определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи за короткие (сжатые) сроки времени (3÷5) час, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда.
Техническим результатом изобретения является повышение скорости проведения определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Указанная задача достигается тем, что в известном способе определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 филаггрина, при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры: «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3'; «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', размер ампликона - 205 пар оснований, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера «FLG-2 S1» 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-AC3' и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 2282 с референсными последовательностями, после этого при выявлении на полученной пирограмме отсутствия делеции в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют низкую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта ins/del в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют высокую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи.
Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".
Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных широко используемым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.
Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.
Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить повышение скорости проведения определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, что, в свою очередь, позволит повысить достоверность определения низкой наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи при воздействии на организм вредных производственных факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
В таблице 1 представлена последовательность использованных праймеров.
Предлагаемый способ пояснен на чертеже.
На фиг. 1 изображена пирограмма с вариантом гетерозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему делецию в положении 2282 (ins/del) (пример 1). На фиг. 2 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, не имеющему замены делеции, в положении 2282 (ins/ins) в нуклеотидной последовательности - соответствует норме (пример 2).
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
У пациентов осуществляют забор венозной крови. Из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мкл конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.
Объем смеси для полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом используют реагенты производства ФБУН «Центрального НИИ Эпидемиологии»: «2,5×ПЦР-буфер-2-blue», «Смесь dNTPs», праймеры «FLG2-F1» и «FLG2-R1». Количество праймеров в реакцию - 7 пмоль. Для амплификации исследуемого генетического локуса используют специфические олигонуклеотидные праймеры «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3' и «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', один из которых мечен биотином (последовательность используемых праймеров представлена в табл. 1). Количество праймеров «FLG-2 Fl» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3' и «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3' в полимеразной цепной реакции - 7 пмоль.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе.
При использовании, например, амплификатора «Т 100 Thermal Cycler» (фирма Bio Rad, США), когда температура достигнет 95°C (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95°C - 15 мин. Далее выдерживают пробирки 45 циклов 95°C - 15 секунд, 65°C - 15 секунд, 72°C - 20 секунд.
После проведения амплификации осуществляют пробоподготовку образцов для секвенирования. Продукт амплификации иммобилизируют с 1 мкл частиц «Streptavidin Sepharose» («GE Healthcare», Швеция) в 40 мкл «Буфера для связывания» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). После иммобилизации проводят серию отмывок с помощью станции для пробопродготовки «PyroMark Q24 Workstation)) («Qiagen», Германия) и набора реагентов «Пиро-преп» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии», регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13246 от 19 марта 2012 г.). В результате пробоподготовки получают амплифицированный с биотинилированного праймера одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который используют в качестве матрицы в реакции пиросеквенирования.
Пиросеквенирование проводят с использованием праймера «FLG2-S1» в количестве 7,5 пмоль и набора реагентов «PyroMark® Gold Q96 Reagents» («Qiagen», Германия) на приборе «PyroMark Q24» («Qiagen», Германия). Последовательность праймера для секвенирования «FLG-2 S1» следующая: 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-АС3'. Последовательность добавления нуклеотидов в реакцию пиросеквенирования: GACACAGATCAGTGTCA.
Далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями с помощью программного обеспечения «PyroMark Q24 2.0.6» и по полученной пирограмме определяют, какой вариант мутации имеет место в нуклеотидной последовательности (см., например, фиг. 1 и 2).
При выявлении на полученной пирограмме отсутствия делеции в положении 2282 гена FLG и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют низкую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта ins/del в положении 2282 гена FLG и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют высокую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи, при которой облегчается проникновение аллергенов и инфекционных агентов через эпидермис, последние инициируют развитие местной и системной аллергической реакции организма, что приводит к развитию профессиональных аллергодерматозов.
Пример 1. Больная Т., 48 лет
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больная Т. работала с 1986 г. по настоящее время гальваником в контакте с соединениями хрома, никеля, кобальта. Считает себя больной с 1987 г., когда впервые появились высыпания на тыльных поверхностях кистей, сопровождавшиеся зудом. Обращалась к дерматологу по месту жительства, получала лечение с временным эффектом. В выходные дни, во время отпуска отмечает улучшение. Впервые направлена в клинику института ФГБНУ «НИИ МТ» для решения вопроса о связи заболевания кожи с профессией в 2002 г. При обследовании была выявлена повышенная чувствительность к солям хрома, никеля, кобальта и дано заключение о профессиональном характере кожного заболевания.
При биохимическом анализе крови обнаружено умеренное повышение уровня печеночных ферментов АЛТ 56 Ед/л (N 0-35 Ед/л), ACT 45 U/1 (N 0-35 U/1), превышение уровня холестерина в сыворотке крови 6,8 ммоль/л (N 3,0-6,2 ммоль/л). При иммунологическом исследовании было определено умеренное повышенное содержание Ig Е к Trichophyton rubrum 1,42 кЕд/л (N до 0,35 кЕд/л). При изучении состояния барьерной функции кожи с помощью прибора "Skin-o-mat" производства фирмы "Cosmomed GmbH", Германия показатели гидратантности были снижены 25,54 (N от 35), уровень рН повышен 6,54 (N 4,5-5,5), содержание липидов на поверхности кожи снижено 2,83 мкг/см2 (N 6,0-6,5 мкг/см2).
Кровь исследовали согласно предлагаемому способу.
Из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1÷3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем смеси для полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом использовали реагенты производства ФБУН «Центрального НИИ Эпидемиологии»: «2,5×ПЦР-буфер-2-blue», «Смесь dNTPs», праймеры «FLG2-F1» и «FLG2-R1». Количество праймеров в реакцию - 7 пмоль. Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3' и «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', один из которых мечен биотином (последовательность используемых праймеров представлена в табл. 1). Количество праймеров «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3' и «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3' в полимеразной цепной реакции - 7 пмоль.
Реакцию амплификации проводили по следующей программе.
При использовании амплификатора «Т 100 Thermal Cycler» (фирма Bio Rad, США), когда температура достигла 95°C (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95°C - 15 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов 95°C - 15 секунд, 65°C - 15 секунд, 72°C - 20 секунд.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Продукт амплификации иммобилизировали с 1 мкл частиц «Streptavidin Sepharose» («GE Healthcare», Швеция) в 40 мкл «Буфера для связывания» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). После иммобилизации проводили серию отмывок с помощью станции для пробопродготовки «PyroMark Q24 Workstation («Qiagen», Германия) и набора реагентов «Пиро-преп» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии», регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13246 от 19 марта 2012 г.). В результате пробоподготовки получали амплифицированный с биотинилированного праймера одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который использовали в качестве матрицы в реакции пиросеквенирования.
Пиросеквенирование проводили с использованием праймера «FLG2-S1» в количестве 7,5 пмоль и набора реагентов «PyroMark® Gold Q96 Reagents» («Qiagen», Германия) на приборе «PyroMark Q24» («Qiagen», Германия). Последовательность праймера для секвенирования «FLG-2 S1» следующая: 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-АС3'. Последовательность добавления нуклеотидов в реакцию пиросеквенирования: GACACAGATCAGTGTCA.
Далее провели сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями с помощью программного обеспечения «PyroMark Q24 2.0.6» и по полученной пирограмме определили делецию в гетерозиготном состоянии в положении 2282 (ins/del) гена филаггрин (см. фиг. 1), т.е. синтез белка филаггрина нарушен.
Вывод: у больной В. был выявлен гетерозиготный вариант 2282 (ins/del) гена филаггрин, имеющий делецию в гетерозиготном состоянии, свидетельствующий о нарушении синтеза белка филаггрина, что приводит к нарушению в процессе конечной дифференцировки эпидермиса, приводящего к выраженному нарушению барьерной функции кожи (снижены 25,54 (N от 35), уровень pH повышен 6,54 (N 4,5-5,5), содержание липидов на поверхности кожи снижено 2,83 мкг/см2 (N 6,0-6,5 мкг/см2)).
Это, в свою очередь, привело к развитию профессионального аллергодерматоза через 1 год от начала работы с веществами раздражающего и сенсибилизирующего действия. Время определения наследственной предрасположенности больной Т. к нарушению барьерной функции кожи составило 4,5 часа.
Пример 2. Больной К., 64 года
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больной К. работал с 1969 г. по 2007 г. токарем в контакте с соединениями хрома, никеля, кобальта. Считает себя больным с 2005 г., когда впервые появились высыпания на тыльных поверхностях кистей и предплечий, сопровождавшиеся зудом, далее высыпания распространились на голени. Обращался к дерматологу по месту жительства, получал лечение с временным эффектом. В выходные дни, во время отпуска отмечал улучшение. Впервые направлен в клинику института ФГБНУ «НИИ МТ» для решения вопроса о связи заболевания кожи с профессией в 2008 г. При обследовании была выявлена повышенная чувствительность к солям хрома, никеля, кобальта и дано заключение о профессиональном характере кожного заболевания.
При биохимическом анализе крови не было обнаружено отклонений от норм.
При иммунологическом исследовании не было определено повышенное содержание Ig Е к Trichophyton rubrum 0,1 кЕд/л (N до 0,35 кЕд/л).
При изучении состояния барьерной функции кожи с помощью прибора "Skin-o-mat" производства фирмы "Cosmomed GmbH", Германия, показатели гидратантности были в норме 36,05 (N от 35), уровень pH в пределах нормы 5,3 (N 4,5-5,5), содержание липидов на поверхности кожи снижено 5,5 мкг/см2 (N 6,0-6,5 мкг/см2).
Кровь исследовали согласно предлагаемому способу.
Из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1÷3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем смеси для полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом использовали реагенты производства ФБУН «Центрального НИИ Эпидемиологии»: «2,5×ПЦР-буфер-2-blue», «Смесь dNTPs», праймеры «FLG2-F1» и «FLG2-R1». Количество праймеров в реакцию - 7 пмоль. Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3' и «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', один из которых мечен биотином (последовательность используемых праймеров представлена в табл. 1). Количество праймеров «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3' и «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3' в полимеразной цепной реакции - 7 пмоль.
Реакцию амплификации проводили по следующей программе.
При использовании амплификатора «Т 100 Thermal Cycler» (фирма Bio Rad, США), когда температура достигла 95°C (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95°C - 15 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов 95°C - 15 секунд, 65°C - 15 секунд, 72°C - 20 секунд.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Продукт амплификации иммобилизировали с 1 мкл частиц «Streptavidin Sepharose» («GE Healthcare», Швеция) в 40 мкл «Буфера для связывания» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). После иммобилизации проводили серию отмывок с помощью станции для пробопродготовки «PyroMark Q24 Workstation («Qiagen», Германия) и набора реагентов «Пиро-преп» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии», регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13246 от 19 марта 2012 г.). В результате пробоподготовки получали амплифицированный с биотинилированного праймера одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который использовали в качестве матрицы в реакции пиросеквенирования.
Пиросеквенирование проводили с использованием праймера «FLG2-S1» в количестве 7,5 пмоль и набора реагентов «PyroMark® Gold Q96 Reagents» («Qiagen», Германия) на приборе «PyroMark Q24» («Qiagen», Германия). Последовательность праймера для секвенирования «FLG-2 S1» следующая: 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-АС3'. Последовательность добавления нуклеотидов в реакцию пиросеквенирования: GACACAGATCAGTGTCA.
Далее проводили сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями с помощью программного обеспечения «PyroMark Q24 2.0.6» и по полученной пирограмме определили отсутствие делеции в положении 2282 (ins/ins) гена филаггрин (см. фиг. 2), соответствующего норме, т.е. белок филаггрин синтезируется нормально.
Вывод: у больного К. был выявлен гомозиготный вариант FLG (ins/ins) полиморфизма 2282del4, не имеющий делецию в положении 2282, свидетельствующий о нормальном синтезе этого белка, при этом наблюдали умеренное снижение барьерной функции кожи, которое проявляется лишь в снижении содержания липидов на поверхности кожи, что может быть вызвано большим стажем работы с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия (хром, никель, кобальт). При этом профессиональный аллергодерматоз развился через 38 лет от начала работы с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия (хром, никель, кобальт). Время определения наследственной предрасположенности больного К. к нарушению барьерной функции кожи составило 3,0 часа.
Предлагаемый способ прогнозирования наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи позволяет повысить точность полученных результатов за счет снижения до минимума ошибки при интерпретации результатов путем использования компьютерной обработки полученных результатов и скорость проведения анализа (1-2 дня в известном способе и 3-5 часов в предлагаемом способе) по сравнению с прототипом за счет применения новой лабораторной технологии - метода пиросеквенирования, использование которого позволяет в единицу времени проводить большее количество анализов, по результатам которых определяют наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
Предложенный способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи может быть использован в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.
Claims (1)
- Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 филаггрина, отличающийся тем, что при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры: «FLG-2 F1» 5'Biotin -TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3'; «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3", размер ампликона - 205 пар оснований, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера «FLG-2 S1» 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-АС3' и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 2282 с референсными последовательностями, после этого при выявлении на полученной пирограмме отсутствия делеции в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют низкую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта ins/del в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют высокую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015105290/15A RU2585960C1 (ru) | 2015-02-17 | 2015-02-17 | Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015105290/15A RU2585960C1 (ru) | 2015-02-17 | 2015-02-17 | Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2585960C1 true RU2585960C1 (ru) | 2016-06-10 |
Family
ID=56115213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015105290/15A RU2585960C1 (ru) | 2015-02-17 | 2015-02-17 | Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2585960C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2160312C2 (ru) * | 1993-06-18 | 2000-12-10 | Астра Актиеболаг | Выделенная нуклеиновая кислота, плазмида, реплицируемый вектор экспрессии, трансформированная линия клеток мыши 127, полипептид, способ получения предшественника полипептида, обладающего активностью scce, фармацевтическая композиция для лечения нарушений, связанных с кератинизацией |
| RU2304170C1 (ru) * | 2006-02-08 | 2007-08-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Университетская медицина" | Способ одновременного днк-тестирования на наличие полиморфизмов н63d и c282y в гене hfe, связанных с наследственным гемохроматозом |
-
2015
- 2015-02-17 RU RU2015105290/15A patent/RU2585960C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2160312C2 (ru) * | 1993-06-18 | 2000-12-10 | Астра Актиеболаг | Выделенная нуклеиновая кислота, плазмида, реплицируемый вектор экспрессии, трансформированная линия клеток мыши 127, полипептид, способ получения предшественника полипептида, обладающего активностью scce, фармацевтическая композиция для лечения нарушений, связанных с кератинизацией |
| RU2304170C1 (ru) * | 2006-02-08 | 2007-08-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Университетская медицина" | Способ одновременного днк-тестирования на наличие полиморфизмов н63d и c282y в гене hfe, связанных с наследственным гемохроматозом |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ПАППА И.В. Роль полиморфизма гена филлаггрина в семейной предрасположенности к атопическому дерматиту // Клиническая дерматология и венерология, 2, 2014, стр.24-26. ЗУЕВА М.И. и др. Мутации R501Х и 2282 del4 гена FLG у больных аллергодерматозами// Вестник Харьковского Национального Университета имени В.Н. КАРАЗИНА. 2011.Серия: биология, стр. 93-97. * |
| ХАНТИМЕРОВА Э.Ф. и др. Клинико-генетическая характеристика больных атопическим дерматитом и крапивницей с мутациями в гене филаггрина // Фундаментальные исследования.- 2014, 10(4), с.752-756. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pallisgaard et al. | Controls to validate plasma samples for cell free DNA quantification | |
| Wong et al. | Cell-free DNA in maternal plasma and serum: A comparison of quantity, quality and tissue origin using genomic and epigenomic approaches | |
| Zhang et al. | Comprehensive one-step molecular analyses of mitochondrial genome by massively parallel sequencing | |
| CN101918589B (zh) | 糖尿病的诊断生物标志物 | |
| EP3561074B1 (en) | Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample | |
| JP6987393B2 (ja) | 血液中の無細胞ｄｎａを用いた血液学的障害の検出 | |
| Allanach et al. | Comparing microarray versus RT-PCR assessment of renal allograft biopsies: similar performance despite different dynamic ranges | |
| AU2016228508A1 (en) | Methods for diagnosis of sepsis | |
| Glossop et al. | Epigenome-wide profiling identifies significant differences in DNA methylation between matched-pairs of T-and B-lymphocytes from healthy individuals | |
| JP2008537474A (ja) | 血液リンパ球における子宮内膜症に関する分子診断マーカーの同定 | |
| Abdelal et al. | Levels of plasma cell-free DNA and its correlation with disease activity in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus patients | |
| KR20240114848A (ko) | 뇌졸중 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| EP3146076A2 (en) | Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection | |
| Sata et al. | Quantitative polymerase chain reaction analysis with allele-specific oligonucleotide primers for individual IgH VDJ regions to evaluate tumor burden in myeloma patients | |
| AU2021221905B2 (en) | Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection | |
| CN116194595A (zh) | 婴幼儿特应性皮炎的检测方法 | |
| RU2585960C1 (ru) | Способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи | |
| CN107653311B (zh) | 与血脂水平相关的单核苷酸多态性rs4883263检测系统及相关应用 | |
| CN105112415A (zh) | 用于2型糖尿病患病风险评估的遗传位点rs780092及检测试剂盒 | |
| CN107988361A (zh) | 诊断子宫颈癌或评估子宫颈癌风险的方法和试剂盒 | |
| RU2467330C1 (ru) | Способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов | |
| JP7199045B2 (ja) | 乳癌の予後に関する情報の取得方法、乳癌の予後の判定装置及びコンピュータプログラム | |
| RU2645089C1 (ru) | Способ экстракции днк, пригодной для проведения количественной пцр в реальном времени, из сухих пятен крови новорожденных | |
| RU2564914C2 (ru) | Способ определения наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами | |
| Neuser et al. | The refined recurrence risk of de novo variants due to parental mosaicism |